WO2005054301A1

WO2005054301A1 - 架橋多糖微粒子およびその製造方法

Info

Publication number: WO2005054301A1
Application number: PCT/JP2004/016948
Authority: WO
Inventors: Sei Kwang Hahn; Tsuyoshi Shimoboji
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2004-11-15
Publication date: 2005-06-16
Also published as: US8575332B2; EP1683812B1; US20070134334A1; TW200526253A; KR101233564B1; JP4745826B2; KR20060132581A; EP1683812A1; TWI369215B; EP1683812A4; JPWO2005054301A1

Abstract

　タンパク質、ペプチド等の薬物の生物活性を阻害せずに高封入率で封入でき、インジェクタブルで、完全に生分解性で安全なタンパク質またはペプチド等の薬物の長期徐放製剤を提供する。　架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸などの多糖誘導体またはその塩と薬物との溶液を微粒子状態で架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に脱水することで、濃縮中に架橋反応を起こし、薬物を多糖架橋体中に封入した薬物担持微粒子にすることで、タンパク質、ペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを効率よく封入、長期間徐放できるインジェクタブルな徐放製剤を実現できる。

Description

明細書

架橋多糖微粒子およびその製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、薬物、特に薬効を有するタンパク質またはペプチドを徐放する架橋多糖薬物徐放微粒子担体、及びその製造方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短ぐまたその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。

[0003] 薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤においては、製剤調製時または徐放中の、タンパク質またはペプチドの変性あるいは凝集による回収率低下力実用化への大きな障害となって、る。ポリ乳酸ーポリグリコール酸共重合体 (PLGA)等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、 pHの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている (非特許文献 1および 2を参照)。一方、こうした問題が低減される親水性のハイド口ゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っていない。また、安全性の面力もは、徐放基材として用いる素材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放型製剤の実現は難しい。

[0004] 近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告もある。その中でも、ヒアルロン酸 (HA)は、 1934年、 K. Meyerによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖)であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。 HAは、 D ーグルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが β (1→3)グリコシド結合により連結された二糖単位力成るダルコサミドダリカンの一種である。 [0005] HAは、化学的、物理的構造に種差が無ぐヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料 (Biomaterial)の一つである。近年、微生物による高分子量 HAの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。

[0006] HAを基材に用いた架橋方法、 HAゲルからのタンパク質やペプチド薬物の徐放も多数報告されている。 HAをィ匕学架橋でゲルイ匕させる方法としては、カルポジイミド法 (特許文献 1参照）、ジビニルスルフォン法 (特許文献 2参照）、グリシジルエーテル法 (特許文献 3参照)等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する場合は、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、 HAとタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、 in situ架橋を行う方法には、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうした in situ架橋により、 H Aゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤につ!ヽて報告されている（例えば、特許文献 4参照)。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはぺプチド存在下で HAを in situ架橋することにより得られる徐放型製剤は、回収率の点で問題を有して、る。例えば、ヒドラジド基 (HZ)を導入した HA誘導体 (HA— HZ)を N—ハイドロキシスクシンイミド (NHS)からなる架橋剤で架橋する方法 (特許文献 5参照）が報告されており、ここでは生理条件下での in situ架橋を目的として pH7.4— p H8. 5で架橋形成反応を行っているが、この方法で得られる HAゲル力のタンパク質またはペプチドの回収率もやはり低いことが本発明者らの検討により確認されている。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基)が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であるにもかかわらず、タンパク質またはペプチドを反応させずに HAをィ匕学架橋、ゲルイ匕させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール (PEG)を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが (特許文献 6参照）、生分解性でなヽ PEG断片が残存する問題がある。

[0007] また、実際、こうした薬物徐放性物質を注射可能な製剤とするには、これを微粒子化する必要がある。こうした検討にスプレードライヤーは広く使用されており、インシュリン (非特許文献 3、非特許文献 4参照)、 rh抗 IgE抗体 (非特許文献 5参照)を微粒子化した報告、ヒアルロン酸の微粒子中に薬物を封入した報告 (特許文献 7参照、特許文献 8)はあるが、共に短時間に皮下で溶解してしまうため薬物徐放期間は非常に短ぐ徐放目的としての実用性は低い。また、スプレードライ中にキトサンの架橋反応を行い、低分子薬物を封入する報告 (非特許文献 6参照)もあるが、放出期間は数分と短ぐ架橋剤に用いるアルデヒドがアミノ基などの官能基と高い反応性を有するため、タンパク質、ペプチド、その他のアミノ基などの官能基を有する低分子薬物には使用することができない。

特許文献 1：国際公開 WO94Z02517号パンフレット

特許文献 2 :特開昭 61—138601号公報

特許文献 3：特開平 5— 140201号公報

特許文献 4:米国特許第 5827937号明細書

特許文献 5:国際公開 W095Z15168号パンフレット

特許文献 6:国際公開 WO00Z44808号パンフレット

特許文献 7：特許第 3445283号公報

特許文献 8:国際公開 W096Z18647号パンフレット

非特許文献 1 : Pharm. Sci. 第 88卷、第 166— 173頁、 1999年

非特許文献 2 :J. Microencapsulation 第 15卷、第 699— 713頁、 1998年非特許文献 3 : Int. J. Pharm. 233, 227-237, 2002年

非特許文献 4 :J. Control. Rel. 91, 385—394, 2003年

非特許文献 5 : Biotech, and Bioeng. 60, 301—309, 1998年

非特許文献 6 :Int. J. Pharm. 187, 53—65, 1999年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 上述した如ぐタンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したまま in si tUで化学架橋、乾燥、微粒子化し、薬物を封入することで、高封入率、高回収率、安全性を満たすインジェクタブルな生分解性ゲル微粒子の調製方法、これを用いたタンパク質またはペプチド等の長期薬物徐放製剤は知られて、な!、。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、カゝかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、架橋形成反応が可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物との溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に HA間に架橋反応を起こさせ、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入することで、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを効率よく封入できることを見出した。また、この方法により得られた架橋ヒアルロン酸微粒子はインジェクタブルであり、生分解性で安全な長期薬物徐放微粒子担体としてタンパク質またはペプチド等の薬物を封入するのに最適であることを見出し、本発明を完成させた。

[0010] すなわち、本発明は、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを in situで架橋、微粒子形成、および乾燥することにより得られる、ゲル中に封入したインジェクタブルなタンパク質またはペプチド等の薬物徐放製剤、及びその製造方法に関する。

[0011] すなわち本発明の一つの側面によれば、架橋多糖微粒子の製造方法であって、 a)架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程； b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程を含む前記製造方法が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記ェ程 b)が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、前記製造方法が提供される。

[0012] 本発明のさらにその他の側面によれば、前記製造方法により調製することができる架橋多糖微粒子もまた提供される。

[0013] 以下、本発明を更に具体的に説明する。

[0014] 本発明で用いられる多糖誘導体は、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体であれば特に制限されないが、好ましくは、グリコサミドダリカン (酸性ムコ多糖;例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン 4 硫酸、コンドロイチン 6—硫酸、デルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸など）の誘導体のうち架橋反応可能な官能基を有するものであり、特に好ましくは、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体である。

[0015] 従って、本発明のさらに別の側面によれば、架橋ヒアルロン酸微粒子の製造方法であって、

a)架橋可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体を含む希薄溶液を調製する工程 b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸誘導体の架橋反応を進行させる工程を含む前記製造方法が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記工程 b)力前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、前記製造方法が提供される。また、本発明のさらにその他の側面によれば、前記製造方法により調製することができる架橋ヒアルロン酸微粒子もまた提供される。

[0016] 本発明の工程 a)における希薄溶液は、架橋反応に必要な基質および試薬などを含む溶液であるが溶媒により高度に希釈されているために反応の進行しないかまたは進行が極めて遅い溶液であり、その濃度は特に限定はされないが、例えば 0. 1 % 一 5%、特に 0. 2%— 3%である。また本発明に用いる溶媒としては、当該技術分野にお、て通常用いられて、る溶媒またはそれらの混合物を用いることができ、特に限定はされないが、例えば水、 DMSO、エタノール、 N メチルピロリドン、超臨界炭酸液などである。

[0017] 本発明の工程 b)における希薄溶液を微粒子状の液滴に分散する方法には、当該技術分野で通常用いられる方法であれば特に限定されないが、当該希薄溶液を噴霧する方法、当該希薄溶液を別の液体と混合することによりェマルジヨンを形成する方法などが含まれる。ここで微粒子状の液滴は、特に限定されないが例えば 0. 04 μ m— 1. 5mm、好ましくは 0. 1 μ m— 500 μ mの平均粒子径を有することができる。

[0018] 本発明の工程 c)における溶液の濃縮の方法は、架橋反応の進行をより早める濃度まで濃縮することができる手段であれば特に限定されない。また当該濃縮には、例えば、当該架橋反応が固相反応として進行するような溶媒が完全に除去された状態も含まれる。

[0019] なお、前記工程 b)及び c)は一連の工程として行ってもよい。具体的には、前記ェ程 b)及び c)を一連の工程として、スプレードライ、エマルシヨン液中乾燥法、溶媒拡散法などにより行うことができる。この中でも、前記工程 b)及び c)を一連の工程としてスプレードライにより行うのが好まし!/、。

[0020] 本発明の架橋多糖微粒子は、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体を含む溶液を、架橋反応の進行の遅!、希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に多糖誘導体を架橋することにより製造することができる。また、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体と薬物とを含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋反応を起こさせ、架橋反応と乾燥を同時に行うことで薬物を多糖架橋体中に封入した薬物担持微粒子とすることを特徴とする。

[0021] 本発明により提供される、製造方法および当該製造方法により得られた、例えば架橋ヒアルロン酸微粒子などの架橋多糖微粒子は、好ましくは以下に示す特徴を有している。

1.完全生分解性であり、生体に対する高い安全性を確保できる。

2. HAなどの多糖に架橋形成が可能な官能基をグラフトすることで、架橋点間距離を非常に小さく（例えば HAの場合、グルクロン酸当たり 33モル％グラフトで約 3nm) することが可能であり、長期徐放を実現する上で有利である。

3.高架橋密度である。

4.タンパク質を薬剤として用いる場合、タンパク質の変性を防ぐことができる。

5.微粒子化、乾燥化、架橋化を一製造工程で行える。

[0022] 本発明でいう架橋または化学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋結合を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋結合を有する場合もある

[0023] 本発明で使用される架橋反応は、薬物、例えば、タンパク質やペプチドの共存下で架橋を形成しても薬物を変性させない架橋結合形成方法であれば特に限定されない。こうした反応としては、例えば、メルカプト基間のジスルフイド結合形成、メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応、ヒドラジド基と活性カルボン酸エステル間の反応等が挙げられる。

[0024] 架橋時の pHは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに架橋形成の促進し、タンパク質またはペプチド等の薬物の含有アミノ基との反応を防ぐ pHが好ましい。そのような pHは当業者が適宜選択することが可能であるが、例えば pH3. 0— pH9. 0、好ましくは pH4. 5— pH9. 0である。

[0025] 本発明に用いる多糖誘導体は、上記したような架橋反応が可能なものであれば特に限定されないが、具体的には HAに架橋可能な官能基を導入したヒアルロン酸誘導体 (HA誘導体)が挙げられる。本発明にお、て用いられる架橋可能な官能基は、特に限定されないが、例えば、メルカプト基、不飽和結合を有する基 (例えば、メタクリル基、アクリル基、ビュルスルフォン基、アセチレンカルボ-ル基等）、ヒドラジド基（ HZ基)等が挙げられる。

[0026] 架橋反応が、メルカプト基同士のジスルフイド結合形成に由来する場合は、例えばメルカプト基を導入した HA誘導体などの多糖誘導体のみを用いて架橋を形成することができ、もしくはこれに架橋剤としてメルカプト基を 2つ以上有する化合物（例えば、ジチオトレイトール（DTT)、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システィンを 2つ以上含むペプチド等）を添加して架橋を形成することもできる。また、架橋反応速度を高める目的で、テトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate: ST T)、ジピリジルジスルヒド（Dipyridyl disulfide)、エルマン試薬（Ellman's reagent : DT NB)等の化合物を添加しても良い。この際、未反応のメルカプト基がゲル中に残存するとタンパク質やペプチドの変性に繋がる可能性があるため、反応効率をできるだけ上げるためにこれら化合物を反応性を有するメルカプト基に対して 0. 1モル倍一 2 モル倍、さらに好ましくは 0. 5モル倍一 1. 5モル倍添カ卩するのが好ましい。

[0027] メルカプト基を導入した多糖誘導体の調製方法は、特に限定されな!、が、例えば、 HAを 3級アンモ-ゥム塩にして、 DMSO等の極性有機溶媒に溶解し、カップリング剤存在下、メルカプト基を有するァミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。メルカプト基を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、 2 アミノエタン 1ーチオール、 3—ァミノプロパン 1ーチオール、チォグリコール酸ヒドラジド、などを挙げることができる。

[0028] また、 HAにメルカプト基を導入する場合、まずアミノ基ゃヒドラジド基を導入し、その後このアミノ基ゃヒドラジド基にメルカプト基を導入する方法も好ま、。例えば HA のカルボン酸と、アジピン酸ジヒドラジド（ADH)またはエチレンジァミン、エチレンジォキシビスェチルァミン等の 2価の HZまたはアミノ基含有ィ匕合物とをカップリング剤で縮合させ、ヒドラジド基を導入した HA誘導体 (HA— HZ)またはアミノ基を導入した HA誘導体 (HA-アミノ基)を合成し、これに例えば N-スクシンィミジル 3— [2—ピリジルジチォ]プロピオネート（SPDP)を反応させ、 DTT等の還元剤で還元、メルカプト基とする方法、あるいは 2—イミノチオラン (Trout's Reagent)をヒドラジド基、あるいはァミノ基と反応させる方法などが挙げられる。

[0029] カップリング剤としては、例えば、ベンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（BOP)、ベンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリスピロリジノホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（PyBOP)、 N, N '一カルボ-ルジイミダゾール（CDI)、 N, N'—ジシクロへキシルカルボジイミド（DCC) 、 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC)、 EDCZ 3, 4ージヒドロ一 3—ヒドロキシー 4 ォキソ 1, 2, 3—べンゾトリアジン（HODhbt)、 N— エトキシカルボ-ルー 2 エトキシー 1, 2—ジヒドロキノリン（EEDQ)、 4— (4, 6—ジメトキシ— 1, 3, 5—トリアジンー 2 ィル) 4 メチルモルホリウムクロリド n—水和物（DMT — MM)、 2— (1H—ベンゾトリアゾール 1 ィル） 1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥムテトラフルォロボレート (TBTU)等を挙げることができる。

[0030] 本発明における架橋可能な官能基は、例えば多糖の分子内に含まれるカルボキシル基を以下のようなメルカプト基、不飽和結合、アミノ基またはヒドラジル基を含むェステル基もしくは置換アミド基に変換することにより導入することができる：

-CO-N (-R )— Y— Q— Y— N (-R )— Y— Q— SH；

1 1 1 2 2 3 2

-CO-N (-R )— N (-R )— Y— Q -SH；

1 2 3 2

-CO-N (-R )— Y— Q— Y— N (-R )— Y— Q ；

1 1 1 2 2 3 4

-CO-N (一 R ) N (— R )-Y -Q；または -CO-N (— R )— Y— Q— Y— NH；

1 1 1 2 2

(式中、 Rは、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル基、直鎖または分枝 C ヒド

1 1-10 1-10 ロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

Yは、単結合、 N (— R ) CO N (— R ) — CO—、または CH CO—であり、

1 3 3 2

Yは、単結合、 CON (— R )—、または N (— R )—、であり、

2 4 4

Qは、直鎖または分枝 C ァノレキレン基、直鎖または分枝 C ヒドロキシァノレキレ

1 1-10 1-10

ン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、 R Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル

2 3 4 1-10 基、直鎖または分枝 C ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリべ

1-10

プチド基、またはポリエステル基であり、

Yは、単結合、 CO— CO -CH— CH (OH)—、または CONH—であり、

3 2 2

2 1-10 1-10

ン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、 Qは、直鎖もしくは分枝 C ァルケ-ル基、または、直鎖もしくは分枝 C アルキ-

4 2-10 2-10 ル基である。 ) o

メルカプト基を導入した多糖誘導体の例には、好ましくは式 (I)：

[化 1]

(式中、 Xは、 Y Q Y— N (-R )— Y Q SH、または— N (― R )— Y Q SH

2 1 1 2 2 3 2 2 3 2 であり、

Rは、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル基、直鎖または分枝 C ヒドロキシ

1 1-10 1-10 アルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R R R R および R は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C a2 a3 a4 a5 ao 1-6 アルキル基、直鎖または分枝 C アルケニル基、直鎖または分枝 C アルキ-ル基、

1-6 1-6

直鎖または分枝 C アルキルカルボ-ル基、直鎖または分枝 C アルケニルカルボ

1-6 1-6 ニル基、直鎖または分枝 C アルキニルカルボニル基、または SO OHであり、

1-6 2

Yは、単結合、 N (— R ) CO N (— R ) —CO—、または CH CO—であり、

1 3 3 2

Yは、単結合、 CON (— R )—、または N (— R ) であり、

2 4 4

1 1-10 1-10

2 3 4 1-10 基、直鎖または分枝 C ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリべプチド基、またはポリエステル基である。

[0034] Yは、単結合、 CO— CO -CH— CH (OH)—、または CONH—であり、

3 2 2

2 1-10 1-10

ン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体が含まれる。

[0035] また式 (I)中、ポリアルキレンオキサイド基とは、 -(CH (-R) CH O) H (式中、 R

2 n

は水素原子、または c アルキル基)で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンォ

1-5

キサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1一 20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1一 20個力もなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

[0036] さらに、式 (I)において、 Rは、好ましくは水素原子であり、 Xは、好ましくは Y— Q

1 2 1 Y— N (— R )-Y Q SHである。さらに式（II)において、 Υは、好ましくは単結合

1 2 2 3 2 1

または、 Ν (— R ) であり、 Υは、好ましくは単結合であり、 Qは、好ましくは直鎖ま

3 2 1

たは分枝 C アルキレン基である。さらに式 (Π)において、 Rおよび Rは、好ましくは

1-4 2 3

水素原子であり、 Υは、好ましくは CO—であり、好ましくは Qは、直鎖または分枝 C

3 2

ァノレキレン基である。

1-4

[0037] メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応を架橋反応として利用する場合は、不飽和結合を有する基を導入した HA誘導体などの多糖誘導体とメルカプト基を 2っ以上有する化合物（例えば、ジチオトレイトール（DTT)、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システィンを 2つ以上含むペプチド、メルカプト基を導入した HA誘導体等）を混和してもよいし、逆に、メルカプト基を導入した多糖誘導体と不飽和結合を有する基を 2つ以上有する化合物（例えば、エチレングリコールジメタタリレート、エチレンビスアクリルアミド、トリス— 2 マレイミドエチルァミン、 1, 8 ビスマレイミドトリエチレングリコール、 1, 4 ビスマレイミジル— 2, 3—ジヒドロキシブタン、不飽和結合を導入した HA誘導体等)を混和してもよい。また、この場合、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為にトリエタノールァミン等の塩基性ィ匕合物を添加することが好ましい。この際好ましい濃度としては、 10 /z L/ mL— 20 /z L/mLである。メルカプト基を 2つ以上有する化合物には、例えば、直鎖または分枝鎖の C アルキレンジチオール (ここでアルキレン部分は 1以上の酸素原

2-10

子が挿入されて、てもよく、および Zまたは 1以上の水酸基で置換されて、てもよ、）も含まれる。

[0038] 不飽和基を導入した多糖誘導体の調製方法は、特に限定されな!、が、例えば、メタクリル酸グリシジルエーテルや、無水メタクリル酸等を HAの水酸基に直接反応させる方法 (J. Biomed. Mat. Res. 54, 115— 121, 2001)では高い導入率は得難い。これは、 HAが水溶液中で水素結合、疎水性相互作用による高次構造を形成し、ヒドロキシル基、カルボン酸基等の官能基の反応性が低いためと考えられる。タンパク質やペプチドの徐放期間を延ばすには、高い架橋密度が望ましい。このためには、ダルクロン酸部分のカルボキシル基に置換基を導入するのが望ましい。例えば、 HAを 3級アンモ-ゥム塩にして、 DMSO等の極性有機溶媒に溶解し、 1ーェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド（EDC)、ベンゾトリァゾールー 1 ィルォキシ—トリス (ジメチルァミノ）ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（BOP)、ベンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリスピロリジノホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェート（PyBO P)等のカップリング剤存在下、不飽和結合を有するァミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。不飽和結合を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、ァリルァミン、ジァリルァミン、 4—ァミノ— 1ーブテン、アクリルヒドラジド、メタクリルヒドラジド等を挙げることができる。

[0039] また上述の、アミノ基ゃヒドラジド基を導入し、その後、このアミノ基ゃヒドラジド基に不飽和結合を有する基を導入する方法も好ましい。例えば HAのカルボン酸と、アジピン酸ジヒドラジド（ADH)またはエチレンジァミン、エチレンジォキシビスェチルアミン等の 2価の HZまたはアミノ基含有ィ匕合物とを、 EDC、 BOP、 PyBOP等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾された HA誘導体 (HA— HZ)またはアミノ基修飾された HA誘導体 (HA—ァミノ基)を合成し、これに不飽和結合を有するカルボン酸誘導体、例えば R — COOHの酸無水物または活性ィ匕エステル (ここで、 R は直鎖または分

10 10

枝 C アルケニル基である）、好ましくは無水メタクリル酸、 N—ヒドロキシスクシンイミド (NHS)活性ィ匕アクリル酸またはメタクリル酸等を反応させる方法などが挙げられる。

[0040] HAなどの多糖に不飽和結合を有する基を導入後、メルカプト基で架橋する場合、メルカプト基の不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能である力タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基:不飽和結合を有する基 =3:1— 1:2が好ましい。更に好ましくは、 2:1— 1:1である。

[0041] HAにメルカプト基を導入後、不飽和結合を有する基で架橋する場合、不飽和結合を有する基のメルカプト基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、不飽和結合を有する基:メルカプト基 =3:1— 1:2が好ましい。更に好ましくは、 2:1— 1:1である。

[0042] 不飽和結合を有する基を導入した多糖誘導体の例には、好ましくは式 (Π)：

[0043] [化 2]

(式中、 Xは、 Y Q Y— N (— R )-Y Q、または Ν (— R )-Υ Qであり、

3 1 1 2 2 3 4 2 3 4

1 1-10 1-10 アルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、 R、 R、 R、 R および R は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C a2 a3 a4 a5 a6 l~o アルキル基、直鎖または分枝 C アルケニル基、直鎖または分枝 C アルキ-ル基、

1-6 1-6

ニル基、直鎖または分枝 C アルキニルカルボニル基、または SO OHであり、

1-6 2

Yは、単結合、 N (— R ) CO N (— R ) —CO—、または、 -CH CO—であり、

1 3 3 2

Yは、単結合、 CON (— R )—、または N (— R ) であり、

2 4 4

Yは、単結合、 CO—、または、 -CH CO—であり、

3 2

1 1-10 1-10

ン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、 R

2、 Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル 3 4 1-10 基、直鎖または分枝 C ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリべ

1-10

プチド基、またはポリエステル基であり、

Qは、直鎖もしくは分枝 C ァルケ-ル基、または、直鎖もしくは分枝 C アルキ-

4 2-10 2-10 ル基である。 )

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体などが含まれる。

[0045] ここで式 (Π)中、ポリアルキレンオキサイド基とは、 -(CH (-R) CH O) H (式中、

2 n

Rは水素原子、または C アルキル基)で示される基であり、好ましくは、ポリエチレン

1-5

オキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1一 20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1 個一 20個力もなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではない力好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

[0046] さらに、式 (Π)において、 Rは、好ましくは水素原子であり、 Xは、好ましくは Y—

1 3 1

Q -Y -N (-R )-Y -Qである。さらに式 (Π)において、 Υは、好ましくは単結合、 -

1 2 2 3 4 1

Ν (— R ) CO—、または、 N (— R ) であり、さらに好ましくは N (— R ) CO—である。

3 3 3 また Yは、好ましくは単結合、 CON (— R ) であり、さらに好ましくは CON (— R )

2 3 3 一であり、 Yは好ましくは単結合、 CO—、または、 N (— R ) であり、さらに好ましく

3 3

は、 CO—である。さらに式 (Π)において、 Qは好ましくは直鎖または分枝 C アルキレン基であり、 Rおよび Rは、好ましくは水素原子であり、 Qは好ましくは直鎖または

2 3 4

分枝 C アルケニル基である。

2-10

[0047] また、メルカプト基を導入した多糖誘導体の例には、上述の式 (I)で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体などが含まれる。

[0048] 架橋反応に、ヒドラジド基を導入した HA酸誘導体などの多糖誘導体と活性カルボン酸の反応を利用することもできる。多糖へのヒドラジド基の導入は当業者に公知の方法で行うことができ、例えばヒアルロン酸のカルボキシル基と 2価のヒドラジド含有ィ匕合物 (ジヒドラジドィ匕合物）を、縮合剤を用いて縮合させることにより合成することができる。ジヒドラジドィ匕合物としては、コハク酸ジヒドラジド、ダルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジドが挙げられる。また、縮合剤としては、 1, 3- ジシクロへキシルカルボジイミド、 1, 3—ジイソプロピルカルボジイミド、 1ーェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル)カルボジイミドなどが挙げられる。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド (ADH)を 1ーェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド (EDC)で縮合させ、ヒドラジド基で修飾されたヒアルロン酸 (HA HZ)を合成することが可能である。架橋剤としては、 HZ基と反応しうる官能基であれば特に限定されないが、例えば、 NHSで活性ィ匕されたエステル基、ペンタフルォ口フエノキシカルボ-ル基、 p—二トロフヱノキシカルボ-ル基、イミダゾリルカルボ-ル基、イソチオシアナト基、スルホユルクロリド基、スルホ-ルフルオリド基、ホルミル基、ビニルスルホニル基、酸無水物、 4一二トロフエニルホルメート基等の官能基を同一分子内に 2つ以上持つ分子が挙げられる。当該架橋剤の例には、ビス [スルホスクシンィミジル]スべレート、ジスクシンィミジルグルタレート、ジスクシンィミジルタルトレート、エチレングリコールビス [スクシンイミジルスクシネート]などが含まれる。

[0049] アミノ基に対する HZ基との選択的反応性、タンパク質の変性等を考慮すれば、架橋時の pHiま、 pH3. 0— pH6. 0力 ^好まし!/ヽ。さらに好ましく ίま、 ρΗ4.0— ρΗ6. 0である。架橋反応中の ρΗをこの範囲に保っため、用いるバッファ一は揮発性の低いもの、例えばクェン酸等が好ましい。架橋剤中のヒドラジド基と反応する化合物官能基は、ゲル調製液中のヒドラジド基に対して 40モル％以下であることが好ましぐさらに好ましくは 20モル％以下、特に好ましくは 10モル％以下である。 [0050] 架橋反応可能な官能基の HAへの導入率は、特に限定されな!、が、生体内で流動性のな、ゲルを得るために HAのグルクロン酸当たり 5モル％以上が好ましぐ 10モル％以上が特に好ましい。また、薬物の徐放性能は架橋された HA誘導体の架橋密度に大きく依存するため、この導入率を制御することで薬物の徐放期間を制御することがでさる。

[0051] ヒドラジド基が導入された多糖酸誘導体の例には、式 (ΠΙ)：

[0052] [化 3]

[0053] (式中、 Rは、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル基、直鎖または分枝 C ヒド

1 1-10 1-10 ロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

Xは、 Y -Q Y -NHNHであり、

1 1 1 2 2

R R R R および R は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C a2 a3 a4 a5 a6 l~o アルキル基、直鎖または分枝 C アルケニル基、直鎖または分枝 C アルキ-ル基、

1-6 1-6

1-6 2

1 3 3 2

Qは、単結合、直鎖または分枝 C アルキレン基、直鎖または分枝 C ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

Yは、単結合、 N (— R ) CO または、 -CH CO—であり、

2 4 —、— CO—、

2

Rおよび Rは、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C アルキル基、

3 4 1-10

直鎖または分枝 C ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリべプチ

1-10

ド基、ポリエステル基である。 )

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体が含まれる。

[0054] さらに、式 (ΠΙ)において、 Rは、好ましくは水素原子であり、 R

1 a2、R

a3、R

a4、R およ a5 び R は、好ましくは水素原子であり、 Yは、好ましくは単結合、または、—CO—であり a6 1

、 Qは、好ましくは直鎖または分枝 C アルキレン基であり、 Yは、好ましくは、単結

1 1-10 2

合、または、 CO—であり、 Rは、好ましくは水素原子であり、 Rは、好ましくは水素原

3 4

子である。

[0055] また式 (III)中、ポリアルキレンオキサイド基とは、 -(CH (-R) CH O) OH (式中、

2 n

Rは水素原子、または直鎖または分枝 C アルキル基)で示される基であり、好ましく

1-5

は、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また nは、好ましくは 1一 20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1一 20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

[0056] 本発明の架橋ヒアルロン酸微粒子の製造方法としては、微粒子の溶媒留去による乾燥と架橋反応が同時に進行する製造方法であれば良い。例えば、液体を噴霧乾燥するスプレードライヤーを用い、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む溶液を噴霧乾燥することで、濃縮乾燥中にヒアルロン酸誘導体を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ればよい。スプレ一ドライを用いる場合は、薬物の変性を防ぐために、乾燥温度は 100°C以下であることが好ましい。

[0057] あるいは、架橋反応可能な HA誘導体 (テトラプチルアンモ -ゥム塩）と薬物を DMS O等の極性有機溶媒に溶力しておき、二酸化炭素等の超臨界液体を添加、 DMSO を抽出することでヒアルロン酸濃縮中に架橋反応を起こさせ、微粒子を得ても良い。これらの微粒子化方法を用いる時は、 Tween_20、 Tween_80等の界面活性剤を添カロ (1%— 2%程度)することで、生成された微粒子の回収率を上げることができる。また、これらの製造方法を取る場合、濃縮前の架橋反応を起こさない調製液を用いる必要がある。架橋剤混合から濃縮までの時間、架橋性官能基の導入率、ヒアルロン酸分子量、濃度によって異なるが、架橋性官能基の導入率は、 5モル％—70モル％、ヒアルロン酸分子量は、 1万ダルトン一 200万ダルトン、ヒアルロン酸濃度は、 0. 1% 一 5%が好ましい。

[0058] また、別法としては、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む水溶液を脱水性を有する液体 (例えば、分子量 400ダルトンのポリエチレングリコール等）の中にェマルジヨンィ匕することで、脱水濃縮中にヒアルロン酸を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ることもできる。この方法を用いる時は、封入効率を上げるため、カチオン性カゾ-オン性の薬物が好ましい

[0059] また、微粒子形成後に熱処理をすることでさらに含水率を低下させ、架橋反応を完全に終了させたほうが好ましい。この場合、架橋密度も上がり、徐放期間の延長も期待できる。ここで、熱処理の温度は特に限定はされないが、例えば 30— 110°C、好ましくは 30— 60°Cで行うことができる。

[0060] 乾燥後の微粒子径は、用途によって最適化すればよいが、インジクタブルにするために通常、 0. 01 111ー150 111カ好まし1、。経鼻、経月巿投与の時 ίま、 0. Ol ^ m 一 5 μ mが吸入効率の点で好ましぐ静注投与の時には、 0. 01 μ m— 0. 2 μ m程度が血中動態の点から好ましい。

[0061] 本発明に用いられる HAは、どのようにして得られた HAでもよぐ動物組織から抽出された HA、発酵法で得られた HA、化学合成で得られた HAなど、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、 HAにさらなる処理を行ってもよい。本発明の HAには、様々な方法で修飾された修飾 HAや、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。 HAはカルボキシル基とハイド口キシル基が修飾されることが多!、が、本発明にお、て修飾 HAはどの部分が修飾されて、てもよ、。修飾 HAは特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化された HA (W095Z25751)、 N 硫酸化された HA (W098Z45335)、エステル化された HA (EP0216453、 WO98/08876, EP0341745)、過沃素酸酸ィ匕された HA、アミド修飾された HAなどを挙げることができる。

[0062] 本発明に用いられる原料 HAの分子量は特に限定されず、いかなる分子量の HA でも使用することが可能である力通常 5000ダルトン一 350万ダルトン、好ましくは 1 万ダルトン一 100万ダルトンの HAを用いることができる。また、 HAの分子量と濃度は、製造後の粒子径に影響するため、目的とする粒子径に応じて選択すればよい。

[0063] 薬効を持つタンパク質、ペプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロボェチン（EPO)、ダラ-ュロサイトコ口-一刺激因子（G— CSF)、インターフェロン a、 β、 γ、 (INF— α、 j8、 γ )、トロンボポェチン（ΤΡΟ)、シリアリー-ユートロフイクファクタ一（CNTF)、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（TNFbp)、インターロイキン 10 (IL-10)、 FMS類似チロシンカイネース（Fit— 3)、成長ホルモン（ GH)、インシュリン、インシュリン類似成長因子 1 (IGF-1)、血小板由来成長因子（ PDFG)、インターロイキン 1レセプターアンタゴ-スト（IL Ira)、ブレイン由来-ュ一口トロフイクファクター (BDNF)、ケラチノサイト成長因子 (KGF)、幹細胞因子（SC F)、メガカリオサイト成長分ィ匕因子 (MGDF)、ォステオプロテゲリン (OPG)、レプチン、副甲状腺ホルモン (PTH)、塩基性フイブロブラスト成長因子 (b— FGF)、骨形成タンパク質 (BMP)、心房性ナトリウム利尿ペプチド (ANP)、脳性ナトリウム利尿ぺプチド（BNP)、 C型ナトリウム利尿ペプチド（CNP)、グルカゴン様ペプチド 1 (GLP— 1)、抗体、ダイアポディー等が挙げられる。また本発明の薬物徐放担体は、低分子量ィ匕合物の薬剤にも使用することができる。低分子薬剤としては、制癌剤 (例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド）、免疫抑制剤、抗炎症剤 (例えば、ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤）、抗リウマチ剤、抗菌剤 (例えば、 |8—ラタタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤)などを挙げることができる。

[0064] 本発明の徐放担体は、 1種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよ、。

図面の簡単な説明

[図 1]架橋 HA— SH マイクロハイド口ゲル微粒子を顕微鏡で撮影した写真の一例である。

[図 2]PBS中での膨潤後の架橋 HA— SH マイクロハイド口ゲル微粒子を顕微鏡で撮影した写真の一例である。

[図 3]EPOを封入した架橋 HA— SH マイクロヒドロゲル〖こつ、て熱重量分析を行つた結果の一例である。

[図 4]実施例 1 4にお、て得られた架橋 HA— SH マイクロハイド口ゲル微粒子から回収された EPOの量を示す RP— HPLC分析の結果の一例を示すグラフであり、下からそれぞれ実施例 1、実施例 2、実施例 3、実施例 4で得られて微粒子を示すものである。

[図 5]実施例 3と比較例 1で得られた HAゲル力ゝらの EPOの放出性を示すグラフである。

[図 6]実施例 9 1で得られたヒアルロン酸誘導体 (HA— HZ)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 7]実施例 9 2で得られたヒアルロン酸誘導体（HA— HZ— SH)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 8]実施例 10で得られたヒアルロン酸誘導体（HA— HZ— MA)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 9]実施例 11—1で得られたヒアルロン酸誘導体 (HA— AM)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 10]実施例 11—2で得られたヒアルロン酸誘導体（HA— AM— SH)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 11]実施例 11—1で得られたヒアルロン酸誘導体（HA— AM— MA)の¹ H— NMRの測定結果の一例である。

[図 12]実施例 12により得られた粒子のキュアリングによる水分量の変化を示すグラフである。 [図 13]実施例 12により得られた粒子のキュアリングによる膨潤抑制効果を示すものである。

実施例

[0066] EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子の調製

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明する力本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0067] NMR測定は、核磁気共鳴装置 JNM— ECA500 (日本電子株式会社製)を用いて重水 (D O)を溶媒に用いて測定した。また置換基の導入率の決定は、導入した置

2

換基特有のピークとヒアルロン酸由来のピークの積分比より決定した。

[実施例 1]

〔実施例 1-1〕ヒドラジド基 (HZ基)が導入されたヒアルロン酸誘導体 (HA-HZ)の合成

[0068] [化 4]

HA-HZ 分子量 1. 9 X 10⁵ダルトンのヒアルロン酸 (HA) (電気化学工業株式会社製） 200 mgを 0. 5%濃度で蒸留水に溶解し、 5N塩酸で pHを 4. 7-4. 8に調製した。 1ーェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド (EDC)とアジピン酸ジヒドラジド ( ADH)を、 HA:EDC :ADH= 1 : 0. 3 :40 (バッチ 1—1)、 1： 1 :40 (バッチ 1— 2)、 1 : 5 :40 (バッチ 1—3)モル比になるよう添カ卩し、 5N塩酸で pHを 4. 7-4. 8に保ちながら室温で攪拌下 2時間反応させた。 lOOmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール溶液で透析 (スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWCO) : 12k-14kダルトン）し、凍結乾燥して標題の HA— HZを得た。

[0070] 得られた HA— HZ中の HZ基導入率をプロトン NMR法で定量したところ、それぞれ、 HAのカルボン酸の 26% (バッチ 1—1)、 46% (バッチ 1—2)、69% (バッチ 1—3)が HZ化されていた（HAおよび HA— HZの N—ァセチル基（1. 9ppm、 3H)、 HA— HZ のアジピン酸由来部分のメチレン基（1. 6ppm、 2. 3ppm、各 2H)を比較)。

〔実施例 1—2〕メルカプト基 (SH)が導入されたヒアルロン酸誘導体 (HA-SH)の合成

[0071] [化 5]

HA-HZ

[0072] 実施例 1—1のバッチ 1一 3の HA— HZ、各々 lOOmgを 5mLの lOOmMリン酸バッファー pH8に溶かし（HA— HZ： 2%w/v)、イミノチオラン（ITL)を添加し（HZZlTL = 1Z2モル比）、室温で攪拌下 2— 4時間反応させた。エタノールで沈殿、 3回洗浄し、乾燥させた。また、得られた HA— SH中の SH基導入率をプロトン NMR法で定量した結果を表 1に示す。（HAおよび HA— SHの N—ァセチル基（1. 9ppm、 3H)、 HA— SHの ITL由来部分のメチレン基（2. lppmと 2. 7ppm、各 2H)を比較）。

[0073] [表 1] 表 1

対照バッチ 1 バッチ 2 バツチ 3

HZ基の導入率 0% 26% 46% 69%

SH基の導入率 0% 20% 35% 56%

〔実施例 1 3〕 EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子の調製

実施例 1—2のバッチ 1の、 SH基の導入率が 20モル⁰ /₀である HA— SH200mgと、エリスロポエチン（EPO) 2mgを 20mLの 10mMリン酸バッファー pH8 (PB)に溶かした（室温、 1時間攪拌)。これに、 4mgの Tween— 20、 SH基に対して 1モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate : STT) 22. 3mgをカ卩えた。この溶液を以下の条件でスプレードライし、微粒子を得た。

スプレードライヤー：ビュッヒ社製、ミニスプレードライヤー B—191

solution feed rate： 1.5 mL/min (Tygon tuoe, Pump speed = 15%)

Feed solution concentration： 10 mg/mL

Atomizing air flow rate： 650 L/hr

Drying air flow rate： 40 kL/hr (Aspiration speed = 65%)

Inlet temperature： 85一 95°C

Outlet temperature： 50一 60°C

[実施例 2]

実施例 1—3の実験操作において、ノツチ 2の SH基の導入率が 35モル⁰ /₀である H A— SHを 200mgと、テトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate： STT) 39.0mg ( SH基に対して 1モル倍)を使用したこと以外は実施例 1 3と同様の方法で EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[実施例 3]

実施例 1—3の実験操作において、ノツチ 3の SH基の導入率が 56モル⁰ /₀である H A— SHを 200mgと、テトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate : STT) 62. 4mg (SH基に対して 1モル倍)を使用したこと以外は実施例 1 3と同様の方法で EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。 [実施例 4]

実施例 1—3の実験操作において、ノツチ 3の SH基の導入率が 56モル⁰ /₀である H A— SHを 200mgと、 SH基に対して 0. 7モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate： STT) 38. 9mgを使用したこと以外は実施例 1—3と同様の方法で EP O封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[実施例 5]

実施例 1—3の実験操作において、ノツチ 3の SH基の導入率が 56モル⁰ /₀である H A— SHを 200mgと、 SH基に対して 0. 5モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Sodium tetrathionate： STT) 27. 8mgを使用したこと以外は実施例 1—3と同様の方法で EP O封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[実施例 6]

実施例 3の実験操作において、 4mgの Tween— 20の代わりに、 Tween— 80を 4m g使用したこと以外は実施例 3と同様の方法で EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[実施例 7]

実施例 3の実験操作にぉヽて、 Tween— 20をカ卩えずに行ったこと以外は実施例 3 と同様の方法で EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[実施例 8]

実施例 3の実験操作において、 STTを加えずに行ったこと以外は実施例 3と同様の方法で EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。

[比較例 1]

実施例 1—2で調製したバッチ 3の SH基の導入率が 56モル％である HA— SH 33 mgを 690 /z Lの 10mMリン酸バッファー（pH8. 0)に溶力し、 30 Lの EPO水溶液（ lOmg/mL)を添カ卩し、 10分攪拌した。これに、 SH基に対して 1モル倍の Sodium tetrathionate (STT) 9. 3mgを 30 Lの 10mMリン酸ノッファー pH8. 0に溶かした溶液を加え、 250 Lを lmLシリンジに詰めて 37°Cで 5時間反応させることで、円柱状の HAゲルを得た。

[比較例 2] 実施例 8で、 HA— SHではなく HAを使用したこと以外は実施例 8と同様の方法で E PO封入 HA微粒子を調製した。

[0075] なお、実施例 1一 8および比較例 2における各微粒子の回収率は 50%— 65%であつた o

[試験例 1] 粒子径、粒子含水率測定

実施例 3にお、て調製した微粒子の顕微鏡写真を図 1に示す (3000倍)。この微粒子を PBS中に分散させた時の顕微鏡写真を図 2に示す (3000倍)。当該微粒子の乾燥時の粒子径は約 1. 2 mであり、水膨潤時の粒子径は約 1. 8 mであった。

[0076] 熱重量分析 (TGA)を行ヽ、実施例 3で製造した微粒子の含水率を測定した（図 3) 含水率は約 15%であった。

[試験例 2] EPO封入架橋ヒアルロン酸微粒子の EPO回収率測定

実施例 1一 8、比較例 2の微粒子 5mgを 0.5mLの PBSに分散させ、 Hyaluronidas e SD (生化学工業製: HAse) 0. 25ユニットを添加、 25°Cで 3時間、酵素処理を行い、微粒子を完全に分解させた。また、比較例 1のゲル（0. 25mLゲル）に Hyaluro nidase SD (生化学工業製） 0. 5ユニットを含む PBSpH7. 4を 0. 75mL加え、 25 °Cで 1日、酵素処理を行い、ゲルを完全に分解させた。酵素処理後の溶液 0. 15mL を、試料溶液とした。試料溶液は、逆相クロマトグラフィー (RP— HPLC)測定を行い、 0. lmgZmLの EPO水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中 EPO濃度を算出した。添加した EPO量 (0. lmgZゲル 1個）に対して RP— HPLCより求めた EPO量を回収率として算出した。

[0077] 逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（RP— HPLC)分析は、 Waters600S コントローラ、 717plusオートサンプラー、 486赤外光吸収測定器 (Waters社製）を用い、以下の測定条件より行った。

カラム： C4 (粒子径、サイズ 4. 6 X 250mm)

移動相：

A:水 Zァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸 =400Zl00Zl

Β：水 Ζァセトニトリル Ζトリフルォロ酢酸 = 100/400/1

流速： lmLZ分、移動相 AZB = 65Z35— 0Z100のグラジェント溶出カラム温度:室温付近

サンプル温度： 4°C

検出波長： UV 280nm

解析ソフト： Millenium32ver. 3. 21

上記方法で測定された EPOを仕込みに対する回収率は、以下のとおりであった。実施例 1一 4： 90%— 95%

実施例 5および 6： 80% - 85%

実施例 7および 8： 75% - 80%

比較例 1および 2： 90% - 95%

以上の結果より、 STT、界面活性剤を添加することで回収率が改善されることが確 f*i¾ れ。

[試験例 3] EPO封入 HAヒドロゲル調製からの EPO徐放

実施例 3のマイクロハイド口ゲル 20mgと比較例 1のバルタゲル（250 μ L)を 2mLの PBS中、 37°Cでインキュベートし、経時的に 200 Lサンプリングした。 RP— HPLC でバッファ一中に放出された EPOを定量した。

[0078] ゲル調製直後にヒアル口-ダーゼで分解、回収された EPOを 100%とした時のゲルからの EPO放出性を図 1に示す。尚、 9日後にヒアル口-ダーゼ（HAse)を添カロした。

[0079] ゲル内の EPOは変性せず、比較例 1のゲルは、架橋密度が低い為 EPOの放出が早ぐ実施例 3のマイクロゲルは架橋密度が高い為、 30%程度が 5日程度で徐放され、 40%の EPOが拡散では放出されずに酵素分解によって初めて放出されることが分かる。

[0080] 上記実施例に例示された、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を用いることで、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを in situ架橋、乾燥し、ゲル微粒子の中に封入したタンパク質またはペプチド等を長期間放出するインジヱクタブルな薬物徐放製剤を調製することが可能である。

[実施例 9]

〔実施例 9-1〕ヒドラジド基 (HZ)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA-HZの合成 ( 混合溶媒法)

[化 6]

HA-HZ 分子量 2 X 10⁵ダルトンの HA (電気化学工業株式会社製） 76. Omgを、 0. 1%濃度で蒸留水 ZEtOH = 50Z50に溶解し、 5N塩酸で pHを 4. 7-4. 8に調整した。 1—ェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド（EDC)とアジピン酸ジヒドラジド (ADH)を、 HAのユニット（1ユニット =繰り返し単位である N—ァセチルダルコサミンーグルクロン酸） ^0じ：八011= 1 :4 :40モル比になるょぅ添カ卩し、 5N塩酸で p Hを 4. 7-4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。大過剰量の lOOmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析 (スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWCO) : 12k-14kダルトン)し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基 (HZ基）が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) 57. Omgを得た。得られた HA— HZ中の HZ基導入率を ADH導入率としてプロトン NMR法で定量した (HA： N—ァセチル基（1. 8 5ppm)、 HZ :ADH由来の 4つのメチレン（1. 5、 2. 1および 2. 25ppm)を比較）。 H Z導入率は 47%であった。

〔実施例 9-2〕メルカプト基 (SH)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA-HZ-SHの合成 [0083] [ィ匕 7]

HA-HZ —

[0084] 実施例 9—1と同様の方法で合成した HA— HZ、 lOOmgを 5mLの lOOmMリン酸バッファー（PH8)に溶かし（HA— HZ： 2%w/v)、イミノチオラン（ITL)を添加し (HZ ZlTL= lZ2モル比）、室温で攪拌下 2時間反応させた。エタノールで沈殿、 3回洗浄し、乾燥させた。得られた HA— HZ—SH中の SH基導入率をプロトン NMR法で定量した結果、 SH導入率は 37. 5モル％であった。（HAおよび HA— HZ— SHの N—ァセチル基（1. 9ppm、 3H)、 HA— HZ— SHの ITL由来部分のメチレン基（2. Ippmと 2. 7ppm、各 2H)を比較)。

[実施例 10] メタクリロイル基 (MA)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA— HZ— M Aの合成

[0085] [化 8]

HA-HZ ——

[0086] HAの分子量を 2 X 10⁴ダルトンとしたこと以外は、実施例 1—1のバッチ 3と同様の方法で合成された HA— HZ (HAのカルボン酸が 63%HZ化）を蒸留水に溶解した後に、 1Mリン酸緩衝液 (pH8. 8)を添カ卩し、 HA濃度 50mg/mLの 0. 1Mリン酸緩衝液を調製した。メタクリル酸無水物を HZの 20倍当量を滴下して添加し、室温で攪拌下一晩反応させた。テトラヒドロフランで沈殿後、回収し乾燥させた。沈殿物を蒸留水に溶解し、再びテトラヒドロフランで沈殿、乾燥させた後、乾燥物を蒸留水に溶解し、凍結乾燥して標題の HA— HZ— MAを得た。

[0087] メタクリロイル基の導入率はプロトン NMRにより算出した (HA:N—ァセチル基のメチルプロトン（1. 8—1. 9ppm)、 MA:メタクリロイル基の CH = (5. 5—6. lppm)を

2

比較)。 MA導入率は 22%であった。

[実施例 11]

〔実施例 11—1〕アミノ基 (AM)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA— AMの合成 [0088] [化 9]

HA-AM

[0089] 分子量 2. 0 X 10⁵ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム (HA) (電気化学工業株式会社製)をテトラプチルアンモ -ゥムハイド口オキサイド (シグマ一アルドリッチ社）によりテトラブチルアンモ -ゥム（TBA)塩化した DOWEX 50WX8-400 (シグマ一アルドリツチ社)を用いて TBA塩化を行った。

[0090] ヒアルロン酸テトラブチルアンモ-ゥム塩（HA— TBA)を 2. OmgZmL濃度となるよう DMSO (和光純薬株式会社）に溶解後、 HAユニット ZBOP (和光純薬株式会社） Zエチレンジァミン（EDA) (シグマアルドリッチ社） = 1Z2. 5/50 (mol/mol/ mol)の当量比で EDA、 BOPの順で添カ卩し、室温下でー晚反応させた。その後 1M 塩ィ匕ナトリウム水溶液を反応溶液の 1Z2量カ卩えた後、 5N HC1をカ卩えて pHを 3まで低下させ、さらに 2N NaOHにて中和を行った。大過剰量の 0. 3M 塩化ナトリウム水溶液、蒸留水の順に透析精製し (スぺクトラポア 4、分画分子量 (MWCO) : 12k —14kダルトン）、限外ろ過後、凍結乾燥して標題のァミノ基が導入されたヒアルロン酸 (HA— AM)を得た。

[0091] ァミノ基の導入率はプロトン NMRにより算出した（HA:N—ァセチル基のメチルプロトン（1. 8—1. 9ppm)、 AM :エチレンジァミン部分のメチレンプロトン（2. 9—3. lp pm)を比較)。導入率はそれぞれ 88. 5%であった。

〔実施例 11—2〕メルカプト基 (SH)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA-AM-SH の合成

[0092] [化 10]

HA-AM

HA-AM-SH

[0093] 上記で得られた HA— AMを炭酸緩衝溶液 (pH9)に 2mg？ mLで溶解させた後、ィミノチオラン (ピアス社)を HAユニットに対して 0. 5、もしくは 1倍等量カ卩え、 45分間室温で反応させた。反応後、 0. 005N HC1水溶液で平衡ィ匕した PD-10カラム (アムシャム'バイオサイエンス株式会社）にて精製を行った。その後凍結乾燥により溶媒を除、た後、得られたポリマーを過剰のエタノールで洗浄し減圧乾燥を行、HA— AM — SHを得た。

[0094] メルカプト基の導入率は還元剤であるトリス（2—カルボキシェチルホスフィン)塩酸塩 (TCEP)を含んだ状態でのプロトン NMRにより算出した (HA： N—ァセチル基のメチルプロトン（1. 8—1. 9ppm)、 SH :メルカプト基の隣のメチレンプロトン（2. 4—2. 7ppm)を比較)。導入率はそれぞれ 16. 5%、 23. 5%であった。〔実施例 11—3〕メタクリロイル基 (MA)が導入されたヒアルロン酸誘導体 HA— AM MAの合成

[化 11]

HA-AM -

HA-AM- A

[0096] 上記で得られた HA— AMをリン酸緩衝溶液 (pH7)に lOmg？ mLで溶解させた後、 1ーェチルー ₃— (₃—ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド (EDC)で活性化したメタクリル酸を HAユニットに対し 0. 5、 1. 0、 2. 0倍当量添加し 2時間室温で反応させた。反応後、 0. 3M 塩ィ匕ナトリウム水溶液、蒸留水の順に透析を行い (スぺクトラポア 4 、分画分子量 (MWCO)： 12k-14kダルトン）、精製を行った。その後、凍結乾燥を行、上記のポリマーを得た。

[0097] メタクリロイル基の導入率はプロトン NMRにより算出した (HA:N—ァセチル基のメチルプロトン（1. 8—1. 9ppm)、 MA:メタクリロイル基の CH = (5. 5—6. lppm)を

2

比較)。導入率はそれぞれ 14. 8%、 31. 9%、 68. 9%であった。

[実施例 12] 微粒子の熱処理効果 (SweU抑制）

実施例 9 2で合成した SH基の導入率が 37. 5モル⁰ /₀である HA— HZ— SHIOOm gを 8. 5mLの蒸留水に溶解した。これに、 lOOmMリン酸バッファー pH7(PB)lmL を添加し、さらに 5mgの Tween- 80を溶解し、 SH基に対して 1/10モル倍の STT2 . 3mgをカ卩えた。この溶液を実施例 1—3と同様の条件（Solution feed rate 0.5mL/min Aspiration speed = 100%)でスプレードライし、微粒子を得た。この微粒子を 50°C恒温槽 (ャマト科学製 DN— 42)でキュアリングし 24時間後、 72時間後にサンプリングした。

[試験例 4] 実施例 12においてサンプリングした各試料の粒子の水分量を TGAにより計測した。この結果を図 12に示す。また、顕微鏡を用いた画像解析により、各試料の 30個の粒子をランダムに選択し、そのフェレ一径を計測した (乾燥時の粒子径)。さらに、サンプリングした粒子に Tween— 80 (0. 05%)を含む PBS溶液を添カ卩して膨潤させ、湿潤時の粒子の粒子径を同様に計測した。この結果を図 13に示す。その結果、 24 時間のインキュベーションにより膨潤率が抑制されることが確認された。これは、 50°C 、 24時間のインキュベーションで粒子内の架橋が増加したことによると考えられる。

[実施例 13] HA— HZ— MA架橋マイクロゲルの調製

実施例 10で合成した HA— HZ— MAlOOmgを 6mLの蒸留水に溶解し、これに DT Tを l lmg、TEAを 32. 5 L溶解させた lOOmMリン酸バッファー pH8. 5 (PB)を 1 mL加え、さらに蒸留水 3mLを加えて混合した。この溶液を実施例 12と同様の条件（排気温度 65°C)でスプレードライし、微粒子を得た。この微粒子を 50°C恒温槽 (ャマト化学 DN-42)で約 72時間キュアリングし、粒子を得た。

[試験例 5]

実施例 13により得られた粒子をプレパラート上に置き、これに pH7の PBS溶液を添カロしてその粒子状態を顕微鏡で観察したところ、粒子は PBS溶液には溶解しなかつた。この観察結果より、実施例 13において得られた微粒子における、メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応による架橋の形成が確認された。

産業上の利用可能性

本発明の薬物徐放担体は、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを in situ化学架橋、乾燥、 HAゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク質、ペプチド等の薬物の長期徐放を可能にするインジヱクタブルな微粒子を提供する。

Claims

請求の範囲

[I] 架橋多糖微粒子の製造方法であって、

a)架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程； b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

c)当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程

を含む前記製造方法。

[2] 多糖がヒアルロン酸である請求項 1に記載の製造方法。

[3] 前記工程 b)が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項 1または 2に記載の製造方法。

[4] 得られる微粒子の平均粒子径が 0. 01 μ m— 150 μ mである、請求項 1一 3のいずれか 1項に記載の製造方法。

[5] 得られる微粒子が薬物担体である、請求項 1一 4のいずれか 1項に記載の製造方法。

[6] 得られる微粒子が薬物徐放担体である、請求項 1一 5のいずれか 1項に記載の製造方法。

[7] 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されてヽる、請求項 1一 6のヽずれか 1項に記載の製造方法。

[8] 前記架橋反応が、薬物共存下でも薬物を変性させな!/、架橋方法である請求項 7に記載の製造方法。

[9] 前記架橋可能な官能基がメルカプト基であり、前記架橋反応がジスルフイド結合形成により架橋を形成する反応である、請求項 1一 8のいずれか 1項に記載の製造方法

[10] 前記架橋反応がメルカプト基と不飽和結合との間の付加反応により架橋を形成する反応である、請求項 1一 8のいずれ力 1項に記載の製造方法。

[II] 前記架橋反応がヒドラジド基と活性カルボン酸エステルとの間の反応により架橋を形成する反応である、請求項 1一 8のいずれ力 1項に記載の製造方法。

[12] 架橋多糖微粒子であって、 a)架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程； b)当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および

を含む製造方法により調製することができる前記架橋多糖微粒子。

[13] 多糖がヒアルロン酸である請求項 12に記載の架橋多糖微粒子。

[14] 前記工程 b)が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項 12または 13に記載の微粒子。

[15] 平均粒子径が、 0. 01 m— 150 /z mである請求項 12— 14のいずれ力 1項に記載の微粒子。

[16] 薬物担体である請求項 12— 15のいずれか 1項に記載の微粒子。

[17] 薬物徐放担体である請求項 12— 16のいずれか 1項に記載の微粒子。

[18] 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されて、る、請求項 12— 17の、ずれか 1項に記載の微粒子。

[19] 前記架橋反応が、薬物共存下でも薬物を変性させな!/、架橋方法である請求項 18 に記載の微粒子。

[20] 前記架橋可能な官能基がメルカプト基であり、前記架橋反応がジスルフイド結合形成により架橋を形成する反応である、請求項 12— 19のいずれか 1項に記載の微粒子。

[21] 前記架橋反応がメルカプト基と不飽和結合との間の付加反応により架橋を形成する反応である、請求項 12— 19のいずれ力 1項に記載の微粒子。

[22] 前記架橋反応がヒドラジド基と活性カルボン酸エステルとの間の反応により架橋を形成する反応である、請求項 12— 19のいずれ力 1項に記載の微粒子。