JPH10509696A - 生分解性ポリマーを介する標的化送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質をコードする生体活性分子（例えば、核酸分子）の送達は、ポリマー物質中の生体活性分子を送達が所望される細胞の近傍に固定化することにより顕著に増強され得る。ここで、上記生体活性分子は、標的化組織への生体活性分子の伝達を容易にするビヒクル（例えば、リポソーム）中にカプセル化される。生体活性分子の標的化はまた、適切なサイズのカプセル化媒体の選択により達成され得、それにより、媒体は分子を特定の標的に送達するのに役立つ。例えば、核酸分子または生物学的活性タンパク質の、適切なサイズにされて毛細血管床および肺胞内に浸透するが、その中にトラップされたままである生分解性の生体適合性ポリマーマイクロパーティクル中へのカプセル化は、注入または注射による患者への投与後に、身体のこれらの領域への標的化送達に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 生分解性ポリマーを介する標的化送達 発明の背景 本発明は概して、薬物送達および遺伝子治療デバイスの分野にあり、そしてよ り具体的には薬物の送達および、ポリマーマトリックス中のリポソームを包含す るポリマーマイクロパーティクルを介する遺伝子移入の分野にある。 種々の物質が、薬物、核酸、および生物物質（biologics）の送達のために開 発されている。例は、生分解性ポリマーまたは非生分解性ポリマーから形成され るマイクロスフェア、マイクロカプセル、およびマイクロパーティクルを包含し 、これらは取り込まれる物質を経時的にまたは特定の条件への曝露の後に放出す る。標的化される部位での直接的な投与を介する以外の物質の標的化は、非常に 困難であった。複数の放出部位が必要な場合、大部分は全身的に投与される。 より最近は、ポリマーゲルまたはフィルムが、特にアンチセンスのような小さ いオリゴヌクレオチドの薬物送達および遺伝子治療のために利用されている。リ ポソームもまた、遺伝子物質の送達のために利用されているが、主にリポソーム の本質的な不安定性および短い半減期のために、成功の程度は様々である。 遺伝子治療は代表的には、特定の内因性遺伝子の発現を制御する核酸分子の送 達、または外因性遺伝子（これは欠損または消失した内因性遺伝子に加えてまた はその代わりに機能する）の送達および発現に適応するために使用される。 ３つの方法が、遺伝子治療のための主な機構として開発されている：カチオン 性脂質（例えば、リポソームまたは小胞の形態にある）、分子結合体（molecula r conjugate）、および組換えウイルスベクターを介する送達。これらの方法は 最近、Morgan，Ann ．Rev．Biochem.，62:191(1993)、Mulligan，Science 260:92 6(1993)、およびTolstoshev，Ann ．Rev．Pharm．Toxicol.，32:573(1993)により 概説された。 遺伝子の形質導入方法のこれら３つの主な群は比較的効率的であるが、インビ ボにおいて形質導入され得る標的化細胞の割合は、比較的低いままである。より 高い割合の遺伝子の形質導入を必要とする症状を処置するためには、形質導入さ れる細胞の割合を増加させるための新たな技術が非常に有用となる。 さらに、局所投与を介してまたは特定の型の細胞（例えば、複製している細胞 ）のみに感染するウイルスベクターの選択を介して以外で、遺伝子の送達のため に細胞を標的化することは、非常に困難である。局所送達は、有効な局所的な濃 度が、全身投与により通常達成され得るよりもずっと高く、一方、全身的な濃度 は非常に低いままであり、その結果、重篤な副作用を回避し得るという点で、有 利性を有する。しかし、身体中の分散した領域を標的化して、全身的な関与なし に局所的な放出を達成することを可能にする利用可能な方法はほとんど存在しな い。 血管壁において組換え遺伝子を発現させる能力が、血管疾患の遺伝子治療のた めの期待を起こした。血管壁への遺伝子の導入に対する２つの一般的なアプロー チが研究された。１つのアプローチ（直接遺伝子移入という）においては、標的 細胞をまず単離し、そして遺伝子移入をインビトロにおいて達成し；次いで、組 換え遺伝子産物を発現する細胞を選択し、そして宿主の血管壁中に移植する。第 ２のアプローチにおいては、遺伝子を「インサイチュ」で血管壁内の細胞に送達 する；この直接的なインビボにおける遺伝子の送達へのアプローチは、治療法の 様式（therapeutic modality）として魅力的である。なぜなら、このアプローチ は患者から血管細胞を取り出す必要を軽減するからである。しかし、直接遺伝子 移入は陽性のトランスフェクタントについて選択する機会を排除するので、適切 な量のDNAが導入され、そして標的組織により発現されることが必須である。血 管平滑筋細胞が、直接遺伝子移入アプローチのための適切な標的であり得る。な ぜなら、血管平滑筋細胞は、管腔表面に近く、そして血管壁において豊富である からである。さらに、平滑筋細胞の異常な蓄積は、アテローム性動脈硬化および 特定の促進された型の血管疾患（例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄）の特 徴である。 血管壁内の平滑筋細胞をトランスフェクトする１つの可能な手段は、カチオン 性リポソームの使用を介する。リポソーム媒介性遺伝子移入は、組換えDNAの細 胞への移入の便利な方法であり、そして生存する動物の動脈壁を直接的にトラン スフェクトするために使用されている。しかし、カチオン性リポソームを用いて 成功する遺伝子移入の効率は変化し、そして細胞型に高度に依存する。現在まで の大部分のインビトロにおける経験は、連続的／不死動物細胞株を用いていた。 しかし、これらの型の細胞を用いて研究された結果は、患者における直接動脈遺 伝子移入の成功の可能性についての、不確かな暗示を与える。 増殖因子の局所送達が、いくつかの方法で試みられている。Takeshitaら、J ． Clin ．Invest. ，93:662-670，(1994)は、ウサギに増殖因子VEGFのための形質転 換ベクターのボーラスを送達した。不運なことに、送達は局所的領域に限定され なかった。米国特許第5,238,470号Nabelらは、ダブルバルーンカテーテルを介す る動脈への形質転換ベクターの投与を開示する。この方法に対する主な制限は、 遺伝子物質がすべて１回で投与され、非効率的な形質導入を生じることである。 さらなる制限は、Nabelが実質的な点滴注入時間（約30分）を必要とし、延長さ れた動脈遮断を生じることである。 それゆえ、核酸分子およびその他の薬物、または生物活性分子（bioactive mo lecule）のための改善された、特異的な送達手段の必要が存在する。 それゆえ、本発明の目的は、生物活性分子、特に核酸分子の、患者中の組織ま たは細胞への標的化送達のための方法および手段を提供することである。 本発明のさらなる目的は、生物活性分子をプロテアーゼおよびヌクレアーゼか ら保護する送達手段を提供することである。 本発明のなおさらなる目的は、生物活性分子の、患者中の組織または細胞への 、制御された持続性の様式での局所投与のための手段を提供することである。 発明の要旨 タンパク質をコードする核酸分子のような生物活性分子の送達は、送達が所望 される細胞に隣接したポリマー物質中の生物活性物質の固定化により顕著に増強 され得る。ここで生物活性分子は、生物活性分子の標的組織への移入を促進する 、リポソームのようなビヒクル中にカプセル化される。生物活性分子の標的化は また、適切なサイズのカプセル化媒体の選択により達成され得る。これにより、 この媒体は分子を特定の標的に送達するように作用する。例えば、浸潤はするが 、 毛細血管床および肺の肺胞内にトラップされたままであるために適切なサイズで ある、生分解性、生体適合性ポリマーマイクロパーティクル内の、核酸分子また は生物学的に活性なタンパク質のカプセル化が、患者への注入または注射による 投与の後の、身体のこれらの領域への標的化送達のために使用され得る。 実施例は、ポリマーゲルを介するDNAの送達、およびポリマーゲル中に固定化 されたリポソーム内にカプセル化されたDNAの送達を示す。DNAのゲル中の固定化 は、送達を約300％増加させる；DNAの浸透増強物質（penetration enhancer）（ 例えば、リポソーム）中の固定化（これを次いで、ポリマーゲル中に固定化する ）は、送達を約600〜700％増加させる。これは、ルシフェラーゼ発現およびTurn er Light単位の検出に基づいて測定される。 発明の詳細な説明 生物学的活性分子の標的化された、増強された送達は、この分子の特定の領域 への標的化のためのポリマーキャリアの使用により増強される。１つの実施態様 において、ポリマーキャリアは、生物活性分子を放出部位に固定化するように作 用するヒドロゲルである。別の実施態様において、ポリマーキャリアは、サイズ 特性および分解特性ならびに、身体の特定の領域（特に肺胞および毛細血管）へ の放出特性により標的化されるマイクロパーティクルの形態にある。 ポリマーキャリア ポリマー物質の選択 ポリマーキャリアは、生分解性であり、生物学的活性分子の流出を可能にする ために十分に多孔性であり、そして炎症応答が生物学的活性分子の組織への送達 を妨げないように十分に非炎症性かつ生体適合性でなければならない。キャリア がまた、生物学的活性分子のプロテアーゼおよびヌクレアーゼの悪影響からの少 なくとも部分的な保護を提供するのであれば、有利である。さらに、ポリマーキ ャリアを使用して制御された、持続性の送達を得ることができれば、有利である 。 多数のポリマーを、キャリアを形成するために利用し得る。それらは、ヒドロ ゲル、オルガノゲル、フィルム、またはマイクロパーティクルであり得る。マイ クロパーティクルは、マイクロスフェア、マイクロカプセル、および本明細書に おいて用いられるリポソームを包含し、これらはさらにポリマーマトリックス内 にカプセル化され得る。ポリマーマトリックスは特定の部位でマイクロパーティ クルを固定化し、カプセル化された生物学的活性分子の標的化された送達を増強 するように作用する。 使用され得る適切なポリマーは、可溶性および不溶性、生分解性および非生分 解性ポリマーを包含する。これらは、ヒドロゲルまたは熱可塑性物質、ホモポリ マー、コポリマーまたはブレンド、天然または合成であり得る。 迅速な生物侵食性（bioerodible）ポリマー（例えば、ポリ[ラクチド-コ-グリ コリド]、ポリ無水物、およびポリオルトエステル、これらのカルボキシル基は 、それらの平滑な表面が侵食されるときに外部の表面に曝されている）が、薬物 送達システムのための優れた候補である。さらに、不安定な結合を有するポリマ ー（例えば、ポリ無水物およびポリエステル）は、それらの加水分解的反応性に ついて周知である。これらの加水分解的分解速度は、一般にポリマー骨格の簡単 な変更により変化され得る。 代表的な天然ポリマーは、タンパク質（例えば、ゼイン、改変ゼイン、カゼイ ン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、またはコラーゲン）および多糖（例 えば、セルロース、デキストラン、ポリヒアルロン酸、アクリル酸エステルおよ びメタクリル酸エステルのポリマー、ならびにアルギン酸）を包含する。代表的 な合成ポリマーは、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド 、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレング リコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニ ルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハリド、ポリビニルピロリドン、 ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、およびそれらのコポリマーを 包含する。合成で改変された天然ポリマーは、アルキルセルロース、ヒドロキシ アルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトリ セルロースを包含する。その他の目的のポリマーは、メチルセルロース、エチル セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ ース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロース プロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタ レ ート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロースサ ルフェートナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタク リレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート ）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポ リ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチ ルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアク リレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレ ン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレン テレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルクロリド、ポリスチ レン、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルフェノールを包含するが、これ らに限定されない。代表的な生物侵食性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコ リドおよびそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸 ）（poly（butic acid））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド-コ-カプロラクト ン）、ポリ[ラクチド-コ-グリコリド]、ポリ無水物、ポリオルトエステル、これ らのブレンドおよびコポリマーを包含する。 これらのポリマーは、Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO.、Polysciences， Warrenton，PA、Aldrich，Milwaukee，WI、Fluka，Ronkonkoma，NY、およびBioR ad，Richmond，CA,のような供給源から入手し得るか、またはこれらの供給業者 から得られたモノマーから標準的な技術を用いて合成し得る。 好ましくは、適切なポリマー組成物は、固有のそして制御可能な生分解性を有 し（その結果それらは約１週間から約６ヶ月持続する）；無毒で、有意な有毒モ ノマーを含まず、そして無毒な成分に分解し；生体適合性であり；送達されるべ き物質と化学的に適合性であり、そして活性物質を変性させない傾向にあり；生 物学的活性分子の取り込み、および拡散、侵食またはそれらの組み合わせによる ポリマーからのそれらのその後の遊離を可能にするために十分に多孔性であり； 接着によるかまたは幾何学的要素により（例えば、きっちりと形成されるか、ま たは軟化されそしてその後マイクロパーティクル（これは所望の位置にトラップ される）に成形または形成されることにより）適用部位に留まり得；最小の侵襲 の技術により（例えば、カテーテル、腹腔鏡または内視鏡により）送達され得る 。 使用され得るモノマー、マクロマー、およびポリマーの型は以下により詳細に記 載される。 ヒドロゲル ヒドロゲルは、直接送達のための組織への適用についての、好ましい実施態様 である。なぜなら、ヒドロゲルは固有にこれらの所望される特性の大部分を有し ているからである。特に好ましいヒドロゲルは、主にポリエチレングリコールか らなるゲルである。 これらは、以下に記載するような開始剤を用いる直接光重合により、過酸素（ peroxygen）を用いる化学重合により、またはコーティングされるべき組織へ吸 着した色素を用いる「界面」光重合により適用され得る。 これらのマクロマーの例は、Hill-Westら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5 967-5971，1994; Obst．& Gynecol．83:59-64，1994に記載されるPEG-オリゴラ クチル-アクリレートである。適切なエンドキャップの選択は、迅速な光重合お よびゲル化を可能にし；アクリレートはいくつかの開始システム（例えば、エオ シン色素）を用いて、紫外線または可視光への短時間の曝露により重合され得る 。ポリ（エチレングリコール）またはPEGの中心構造単位（コア）は、優れた生 体適合性を伴う、その高い親水性および水溶性に基づいて有用である。ポリグリ コール酸のような短いポリ（α-ヒドロキシ酸）が、好ましい鎖伸長物である。 なぜなら、これはエステル結合の加水分解により無害な代謝物であるグリコール 酸に迅速に分解するからである。高度に結晶性のポリグリコール酸は水および大 部分の一般的な有機溶媒に不溶性であるが、全体のマクロマーは水溶性であり、 そして水溶性の組織流体（tissue fluid）と接触しながら生分解性の網目（netw ork）に迅速にゲル化され得る。このような網目を用いて水溶性の薬物および酵 素を混入しそして均質に分散させ得、そしてそれらを制御された速度で送達し得 る。その他の好ましい鎖伸長物は、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリオルト エステル、およびポリ無水物である。ポリペプチドもまた使用され得る。 これらの物質は、特に親水性物質の制御された送達のために、特に有用である 。なぜなら、ポリマーの水溶性領域は水のポリマー内に混入された物質への接近 を可能にするからである。さらに、物質を有機溶媒に曝すことなしに混入される べ き物質を含有するマクロマーを重合することが可能である。放出は、分解の前の ポリマーからの物質の拡散により、および／または分解する際のポリマーからの 物質の拡散により、ポリマー内の特徴的なポアサイズ（これは架橋間の分子量お よび架橋密度により制御される）に依存して、生じ得る。混入された物質の不活 性化はゲルの固定化および保護的効果により軽減され、そしてその他の制御放出 システムに関連するカタストロフィー的破裂効果（catastrophic burst effect ）は回避される。混入される物質が酵素である場合、基質がゲルを透過すること を可能にするようにゲル比率が選択されれば、この酵素は酵素が混入される間に 基質に曝され得る。ポリマーの分解は、末端エステル結合が徐々に加水分解され ることにより、インビボにおいて、遊離巨大分子の結果としての制御放出を促進 する。 これらのマクロマーの有利性は、それらが水性の環境において迅速に重合され 得ることである。従って、正確に配座された、半透過性の、生分解性のフィルム または膜は、組織上でインサイチュで形成されて、生分解性バリアとして、生存 細胞またはその他の生物学的活性物質のためのキャリアとして、および手術用接 着剤として作用し得る。特に好ましい実施態様において、マクロマーはそれに結 合した光開始剤を有する組織に適用され、そして重合して超薄コーティングを形 成する。これは、（再狭窄に関する懸念が存在する）血管のような組織管腔の内 部でのコーティングの形成において、およびそれによって接着を形成から防止す る手術の間の組織バリアの形成において特に有用である。 一般的な用語で、マクロマーは、水溶液、またはほぼ水性の溶液（例えば、添 加されたジメチルスルホキシドを含有する水）に可溶性であるポリマーである。 これは、生分解性領域（好ましくは、インビボ条件下で加水分解可能である）、 水溶性領域、および少なくとも２つの光重合可能領域を包含する３つの成分を有 する。用語「少なくとも実質的に水溶性」は、可溶性が少なくとも約５g/100ml 水溶液であるべきであることを示す。用語「重合可能」は、その領域がマクロマ ー間結合（例えば、アクリレート型分子の炭素−炭素２重結合）を生じるさらな る共有結合を形成する能力を有することを意味する。このような重合は、最終的 にフリーラジカルを生成する特定の色素および化合物の光子吸収から生じるフリ ーラジカル形成により特徴的に開始される。 好ましい実施態様において、ヒドロゲルは、コア、コアの各末端における伸長 、および各伸長におけるエンドキャップを含む、生分解性の、重合可能なマクロ マーから形成される。コアは親水性ポリマーまたはオリゴマーであり；各伸長は 生分解性オリゴマーであり；そして各エンドキャップは、マクロマーを架橋し得 るオリゴマー、ダイマーまたはモノマーである。特に好ましい実施態様において 、コアは、約400と30,000 Daとの間の分子量の親水性ポリ（エチレングリコール ）オリゴマーを包含し；各伸長は、約200と1200 Daとの間の分子量の生分解性ポ リ（α-ヒドロキシ酸）オリゴマーを包含し；そして各エンドキャップは、コポ リマー間の架橋および重合をし得る、約50と200 Daとの間の分子量のアクリレー ト型モノマーまたはオリゴマー（すなわち、炭素-炭素二重結合を含む）を包含 する。より具体的には、好ましい実施態様は、約10,000 Daの分子量のポリ（エ チレングリコール）オリゴマーからなるコア；約250 Daの分子量のポリ（グリコ ール酸）オリゴマーからなる伸長；および約100 Daの分子量のアクリレート部分 からなるエンドキャップを取り込む。 コア水溶性領域としての使用のために適切な物質の例は、ポリ（エチレングリ コール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニ ルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）-コ- ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、多糖または炭水化物（例えば 、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン 、またはアルギネート）、あるいはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲン 、アルブミン、またはオバルブミン）である。 生分解性領域は、ポリマーまたはモノマーから、生分解されやすい結合（例え ば、エステル結合、ペプチド結合、酸無水（anhydride）結合、オルトエステル 結合、およびホスホエステル結合）を用いてポリマーまたはモノマーから構築さ れ得る。 加水分解可能である生分解性成分の例は、グリコリド、ラクチド、ε-カプロ ラクトン、その他のα-ヒドロキシ酸のポリマーおよびオリゴマー、および無毒 である物質を生じるかまたは体内に通常の代謝物として存在するその他の生物学 的分解性ポリマーである。好ましいポリ（α-ヒドロキシ酸）は、ポリ（グリコ ール酸）、ポリ（DL-乳酸）およびポリ（L-乳酸）である。その他の有用な物質 は、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポ リ（ホスホエステル）を包含する。例えば、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ （ε-カプロラクトン）、ポリ（δ-バレロラクトン）、およびポリ（γ-ブチロ ラクトン）のようなポリラクトンもまた有用である。 重合領域は好ましくは、光開始剤により生成されたフリーラジカルを用いて重 合される。光開始剤は好ましくは、可視光放射線または長波長紫外線放射線を用 いる。好ましい重合可能領域は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリ レート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、またはその他の生物学的に 受容可能な光重合可能基である。好ましい、第３級アミンは、トリエタノールア ミンである。 有用な光開始剤は、細胞毒性なしに、そして短い時間枠内に（長くて分、好ま しくは秒）、マクロマーのフリーラジカル重合を開始する光開始剤である。長波 長紫外線光放射線を用いる開始のために好ましい開始剤は、エチルエオシン、2, 2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン、その他のアセトフェノン誘導体、お よびショウノウキノンである。すべての場合において、架橋および重合は、コポ リマー間で、例えば、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノンまたはエチル エオシン（10^-4〜10^-2mM）とトリエタノールアミン（0.001〜0.1 M）との組み合 わせのような光活性化フリーラジカル重合開始剤により開始される。 別の実施態様において、プロセスは、少なくとも一時的に、体温に適合性であ る物質（しかし、これは沈着プロセスの完了後に非適合性にされ得る）（例えば poloxamer^TM（ポリエチレンオキシド-ポリエチレングリコールブロックコポリマ ー））を提供することにより実施される。poloxamer^TMが選択され得、これは室 温で液体であり、そして体温で固体である。 ペービング（paving）またはフィルム 他の実施態様において、Slepian米国特許第5,231,580号に記載のようなポリマ ーペービングまたはフィルムが、カテーテル、腹腔鏡、または内視鏡を用いて組 織に適用される。好ましいポリマーは、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ乳酸、 ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマー）、ポリカプロラクトン、ポリ無 水物、ポリオルトエステル、および移植または縫合に一般的に使用されるその他 の物質を包含する。 このプロセスにおいて使用されるべき物質のための基本的な要求は、生体適合 性およびインビボにおいて達成され得る条件下で化学的または物理的に再形成（ reconfigure）される能力である。このような再形成条件は、好ましくは光重合 を包含するが、加熱、冷却、機械的変形（例えば、引き延ばし）、または化学反 応（例えば、重合または架橋）を包含し得る。 それらの適合性の状態において、コーティング物質は、広範な形態を示し得る 。これらは、ポリマー、モノマー、マクロマーまたはそれらの組み合わせとして 存在し得、溶液、懸濁液、または分散物として維持され得る。 マイクロパーティクル 好ましい実施態様において、マイクロパーティクルは身体の特定の領域に留ま るように選択される直径を有する。器官または領域内に留まるマイクロスフェア の使用は、血流の研究において知られているが（Flaimら、J Pharmacol．Meth． 11:1-39，1984; Heymannら、Prog．Cardiovasc．Dis．20:55-79，1977）、活性 物質の送達においては知られていない。例えば、毛細血管中に留まるように選択 されるマイクロパーティクルは、代表的には10ミクロンと25ミクロンとの間、最 も好ましくは15ミクロンと20ミクロンとの間の直径を有する。多数の方法が任意 の特定のサイズ範囲のマイクロパーティクルを調製するために公知である。本発 明の種々の適用において、サイズは0.2ミクロンから100ミクロンまでの範囲であ り得る。ゲルマイクロパーティクルのための、または溶融物質製のマイクロパー ティクルのための合成方法は公知であり、そしてエマルジョンにおける、噴霧粒 （sprayed drop）における、および分離相における重合方法を包含する。固体物 質または予備形成ゲルについての、公知の方法は、湿式または乾式の摩砕法また は磨砕法、微粉砕法、エアジェットまたはふるいによる分別法などを包含する。 マイクロパーティクルを、当業者に公知の種々の異なる方法を用いて、異なる ポリマーから製造し得る。例示的な方法は、以下に記載の方法を包含する。 ポリ乳酸ブランクマイクロパーティクルが以下の３つの方法を用いて製造され た：溶媒蒸発法（E．Mathiowitzら、J ．Scanning Microscopy，4，329(1990);L. R．Beckら、Fertil ．Steril.，31，545(1979);およびS．Benitaら、J ．Pharm．S ci. ，73，1721(1984)により記載される）；ホットメルトマイクロカプセル化法 （E．Mathiowitzら、Reactive Polymers，6，275(1987)により記載される）、な らびにスプレードライ法。ビスカルボキシフェノキシプロパンおよびセバシン酸 から、モル比20：80 P(CPP-SA)（20：80）（Mw 20,000）で作製されたポリ無水 物が、ホットメルトマイクロカプセル化法により調製された。ポリ（フマリック -コ-セバシック）（20：80）（Mw 15,000）ブランクマイクロパーティクルをホ ットメルトマイクロカプセル化法により調製した。ポリスチレンマイクロパーテ ィクルが、溶媒蒸発法により調製された。 ヒドロゲルマイクロパーティクルは、ポリマー溶液を、リザーバーから、微小 滴形成デバイスを通って、撹拌されたイオン浴に滴下することにより調製された 。アルギネート、キトサン、アルギネート／ポリエチレンイミド（PEI）および カルボキシメチルセルロース（CMC）についての特異的な条件を表１に列挙する 。 a．溶媒蒸発法。この方法においては、ポリマーを塩化メチレンのような揮発 性有機溶媒中に溶解する。薬物（可溶性であるかまたは微粒子として分散されて いるかのいずれか）を溶液に添加し、そして混合物をポリ（ビニルアルコール） のような界面活性剤を含有する水溶液中に懸濁する。生じるエマルジョンを、大 部分の有機溶媒が蒸発し、固体のマイクロパーティクルを残すまで撹拌する。い くつかの異なるポリマー濃度を使用した：0.05〜0.20 g/ml。この溶液を薬物と 混合（load）し、そして１％（w/v）ポリ（ビニルアルコール）（Sigma）を含有 する激しく撹拌される蒸留水200 ml中に懸濁する。４時間の撹拌の後、有機溶媒 はポリマーから蒸発し、そして生じるマイクロパーティクルを水で洗浄し、そし て凍結乾燥機中で一晩乾燥する。異なるサイズ（１〜1000ミクロン）および形態 を有するマイクロパーティクルが、この方法により得られ得る。この方法は、ポ リエステルおよびポリスチレンのような比較的安定なポリマーのために有用であ る。 しかし、不安定性ポリマー（例えば、ポリ無水物）は、水の存在のために製造 プロセスの間に分解し得る。これらのポリマーについては、以下の２つの方法 （これらは完全に無水の有機溶媒中で実施される）がより有用である。 b．ホットメルトマイクロカプセル化法。この方法においては、ポリマーをま ず溶解し、そして次いで50ミクロン未満にふるい分けておいた色素または薬物の 固体粒子と混合する。混合物を非混和性溶媒（シリコンオイルのような）中に懸 濁し、そして、連続的に撹拌しながらポリマーの融点の５℃上まで加熱する。一 旦エマルジョンが安定化されると、これをポリマー粒子が固化するまで冷却する 。生じるマイクロパーティクルを石油エーテルを用いるデカンテーションにより 洗浄して、自由流粉末を得る。１〜1000ミクロンの間のサイズを有するマイクロ パーティクルがこの方法を用いて得られる。この技術を用いて調製されたスフェ アの外部表面は、通常円滑かつ密である。この手順は、ポリエステルおよびポリ 無水物からなるマイクロパーティクルを調製するために使用される。しかし、こ の方法は、1000〜50,000の間の分子量を有するポリマーに限定される。 c．溶媒除去法。この技術は、主にポリ無水物のために設計される。この方法 においては、薬物を塩化メチレンのような揮発性有機溶媒中の選択されたポリマ ーの溶液中に分散または溶解する。この混合物を有機油（例えばシリコンオイル ）中で撹拌することにより懸濁して、エマルジョンを形成する。溶媒蒸発とは異 なり、この方法は、高い融点および異なる分子量を有するポリマーからマイクロ パーティクルを作製するために使用され得る。１〜300ミクロンの間の範囲のマ イクロパーティクルが、この手順により得られ得る。この技術を用いて生成され たスフェアの外部形態は、使用されるポリマーの型に大きく依存する。 d．スプレードライ法。この方法においては、ポリマーを塩化メチレン中に溶 解する（0.04 g/ml）。既知量の活性薬物を、ポリマー溶液中に、懸濁（不溶性 薬物）または同時溶解（可溶性薬物）する。次いで、この溶液または分散物をス プレードライする。ミニスプレードライヤー（mini-spray drier）（Buchi）の ための代表的なプロセスパラメーターは以下のとおりである：ポリマー濃度＝0. 04 g/mL、入口温度＝-24℃、出口温度＝13〜15℃、アスピレーター設定＝15、ポ ンプ設定＝10 mL/分、スプレー流＝600 Nl/時、およびノズル直径＝0.5 mm。 １〜10ミクロンの間の範囲のマイクロパーティクルが、使用されるポリマーの 型に依存する形態を有して得られる。この方法は、主に、腸管の画像化を改善す るために設計されたマイクロパーティクルを調製するために使用される。なぜな ら、この適用のためには、粒子サイズは10μを越えるべきでないからである。 e．ヒドロゲルマイクロパーティクル法。ゲル-タイプポリマーからなるマイク ロパーティクル（例えば、アルギネート）は、従来のイオンゲル化技術により作 製される。ポリマーをまず水溶液中に溶解し、硫酸バリウムまたはなんらかの生 物活性剤と混合し、そして次いで微小滴形成デバイスを通して押し出し、これは 場合によっては、小滴を止める（break off）ために窒素ガス流を用いる。ゆっ くりと撹拌される（約100〜170 RPM）イオン硬化浴を押し出しデバイスの下に設 置して形成される微小滴を受ける。マイクロパーティクルを、浴中で20〜30分、 ゲル化が生じるために十分な時間を可能にするために、インキュベートしたまま にする。マイクロパーティクルの粒子サイズは、種々のサイズの押し出し機を用 いることにより、または窒素ガスまたはポリマー溶液の流速のいずれかを変化さ せることにより、制御される。 マトリックスは、好ましくはマイクロスフェアのようなマイクロパーティクル （ここで、生物学的活性分子は固体ポリマーマトリックス中に分散される）また はマイクロカプセル（ここで、生物学的活性分子はポリマーシェルのコア中にカ プセル化される）の形態にある。ポリマーデバイスのサイズおよび組成は、組織 における好ましい放出速度を生じるように選択される。サイズはまた、使用され るべき送達方法に従って選択される。送達方法は、代表的には組織中への注射あ るいは懸濁物のエアロゾルによる鼻領域および／または肺領域への投与であり、 適切な場合には、放出が所望される部位での混入である。マトリックス組成は、 好ましい分解速度を有するようにだけではなく、生体接着性である物質から形成 されるように、粘膜表面に投与された場合に移入の有効性をさらに増加させるよ うに選択され得るか、または最初は分解せず、拡散により延長された期間にわた って放出するように選択される。 リポソームは種々の供給業者から市販されている。あるいは、リポソームは、 例えば、米国特許第4,522,811号（その全体が参考として本明細書中に援用され る）に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。例えば、 リポソーム処方物は、適切な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノ ールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジル コリン、およびコレステロール）を無機溶媒中に溶解し、これを次いで蒸発させ 、容器の表面上の乾燥した脂質の薄いフィルムの後ろに置くことにより調製され 得る。次いで、活性化合物またはその一リン酸塩、二リン酸塩、および／または 三リン酸塩誘導体の水溶液を容器に導入する。次いで、容器を手でゆらして、脂 質物質を容器の側面から遊離させ、そして脂質凝集物を分散させ、それによって リポソーム懸濁物を形成させる。 生物学的活性分子 ポリマーキャリアに直接的および／または間接的（すなわち、キャリア中に固 定化されるマイクロパーティクル内）に取り込まれ得る生物学的活性分子として は、タンパク質、核酸分子、炭水化物、脂質、およびそれらの組み合わせが挙げ られる。タンパク質の例としては、サイトカイン（例えば、インターフェロンお よびインターロイキン）、ポエチン（poetin）、およびコロニー刺激因子、増殖 因子、血管新生因子ならびにそれらのフラグメントが挙げられる。核酸分子の例 としては、タンパク質をコードする遺伝子およびcDNA、発現ベクター、アンチセ ンスおよび他のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現を調節するか、または 防止するために使用され得るリボザイム）が挙げられる。炭水化物としては、セ レクチンに対するレセプターに結合して炎症を阻害することが示されているSial yl Lewis^xが挙げられる。幅広い意味における増殖因子は、好適な生物学的活性 分子である。「送達可能な増殖因子等価体」（DGFEと省略される）は、細胞また は組織に対する増殖因子であり、これは、広義に解釈すれば、増殖因子、サイト カイン、インターフェロン、インターロイキン、タンパク質、コロニー刺激因子 、ジベレリン、オーキシン、およびビタミンを包含し；さらに上記のペプチドフ ラグメントまたは他の活性フラグメントを包含し；そしてさらにベクター（すな わち、形質転換または一時的発現のいずれかにより、標的細胞中のこのような因 子を合成し得る核酸構築物）を包含し；そしてさらに組織中のこのような因子の 合成を刺激するか、または低下させるエフェクター（天然のシグナル分子、アン チセンスおよび３重鎖核酸などを包含する）を包含する。特に好適なDGFEは、血 管 内皮増殖因子（VEGF）、内皮細胞増殖因子（ECGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子 （bFGF）、骨形態形成タンパク質（BMP）、および血小板由来増殖因子（PDGF） 、ならびにそれらをコードするDNAである。好適な凝血溶解剤は、組織プラスミ ノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびヘパリンであ る。 ポリマーキャリアへの生物学的活性分子の取り込み 一般に、生物学的活性分子は、物質が重合されるか、あるいはポリマーがマイ クロパーティクルまたはリポソーム中に形成される時点のいずれかで、患者の標 的化部位で有効量を放出する濃度で、ポリマーと混合される。例えば、ヒドロゲ ルの場合、マクロマー、光開始剤、およびカプセル化されるべき生物学的活性分 子は、水性混合物中で混合される。混合物の粒子は、標準技術を用いて、例えば 、オイル中で混合してエマルジョンを形成することにより、ノズルを用いてオイ ル中で小滴を形成することにより、またはノズルを用いて空気中で小滴を形成す ることにより、形成される。懸濁液または小滴は、マクロマーの光重合に適切な 光を照射される。 送達されるべき生物学的活性分子は、所望の活性分子の用量に依存して、任意 の種々の比でポリマー物質と混合され得る。ゲル中のポリマーは、代表的には、 ５〜25％の体積濃度（重量/体積）、すなわち50〜250mg/mlである。生物学的活 性体（active）は、DNAなどについては１〜10μg/mlまたはそれ以下の濃度で存 在し、そして活性タンパク質などについては10〜50mg/mlまでの範囲であり得る 。正確な濃度は、特定の活性分子、および達成されるべき効果に依存する。 カプセル化特性およびマイクロパーティクルの形態学的特性を調査するための 特徴付けの研究は、異なる負荷で実施され得る。粒子サイズは、準弾性的単一散 乱（QELS）により測定され得る。薬物負荷は、凍結乾燥したマイクロパーティク ルを適切な溶媒に溶解し、そして生物学的活性分子の量を分光光度的にアッセイ することによるか、または他の適切な方法により測定され得る。 ポリマーキャリアの投与 ポリマーキャリアは、例えば、溶液の噴霧または塗布により直接的に、あるい はカテーテル、内視鏡、または腹腔鏡を介して間接的に投与され得る。中空器官 の内部に送達する場合、適用プロセスは、器官を介する流動の長期の遮断による 側副損傷を引き起こしてはならない。 好適な送達方法は、被検体に対する侵襲性または破壊性が最小である方法であ る。これらは、マイクロパーティクルの投与、ならびにポリマーコーティング、 フィルム、ゲル、またはステントの中空器官の内部または天然体腔への経皮塗布 を包含する。組織表面上へポリマーコーティングまたはポリマー層を提供するに 適切な送達デバイスは、PathakらによるPCT/US94/94824に定義されるようなカテ ーテル、腹腔鏡、および内視鏡である。 ヒドロゲルの適用 上記のマクロマーを用いるヒドロゲルの光重合は、携帯用低パワー長波UV（LW UV）発光源を用いて10秒間程度実施され得る。可視レーザー光もまた、光重合に 有用である。低強度および短時間の曝露により、可視レーザー光を生存細胞に対 して実質的に無害にする。なぜなら、放射線は、適切な発色団の非存在下では強 力に吸収されないからである。レーザー光はまた、光ファイバーを用いて輸送さ れ得、そして非常に小さな領域に集中され得る。例えば、0.2mlの30％ w/v感光 性オリゴマー溶液は、エチルエオシン（10^-4M）およびトリエタノールアミン（0 .01〜0.1M）と混合され、そしてこの溶液を、アルゴンイオンレーザー（514nmで 発光するAmerican argon ion laser model 905）を用いて0.2〜0.5W/cm²のパワ ーで照射する。光線は直径３mmまで拡張され、そしてサンプルはゲル化が起こる までゆっくりとスキャンされる。 これらの物質の特に好適な適用において、超薄コーティングが組織表面に、最 も好ましくは血管のような組織内腔に塗布される。光開始剤が組織表面に塗布さ れ、反応および組織への結合を可能にし、非結合光開始剤が希釈またはリンスに より除去され、そしてマクロマー溶液が塗布され、重合される。この方法により 、厚さ10ミクロンと500ミクロンとの間、より代表的には50ミクロンと200ミクロ ンとの間の均一なポリマーコーティングを作製し得、このコーティングは血栓ま たは限局性炎症を喚起しない。 ペービングまたはコーティングの適用 ポリマー物質の局所投与は、組成物をバルーンカテーテルにロードし、次いで この組成物を、カテーテルのバルーンにより閉塞される区域内の組織内腔の内側 に直接塗布することにより、実施され得る。組織表面は、内部表面または外部表 面であり得、そして天然に存在するか、あるいは外科手術、経皮技術、外傷また は疾患の結果として生じるかのいずれかの組織内腔の内部または中空空間を含み 得る。次いで、ポリマー物質は再形成され、実質的にコーティングまたは「ペー ビング」層を形成し得、そして表面との接触を適合させる。得られるペービング 層は、必要に応じてシーリング機能を有し得る。本明細書で使用される用語「シ ーリング」または「シール」は、コーティングがバリア機能を提供するように十 分に低い多孔性のコーティングを意味する。用語「ペービング」は、一般に、コ ーティングが多孔または有孔であるか、あるいは低多孔性「シーリング」の変形 であるコーティングをいう。コーティングは、好ましくは組織表面上で0.001〜1 .0mmのオーダーの厚さを有するが、この範囲外の厚さを有するコーティングも同 様に使用され得る。使用する物質およびペービング物質の形状の適切な選択によ り、プロセスは調整され、広範な種々の生物学的または臨床状況を満足させ得る 。 この適用に使用され得るモノマー、マクロマーおよびポリマーは、マイクロパ ーティクルの形成について上記した群と同一の群から選択される。好ましくは、 ポリマー物質は、刺激に応答して、変化し得る程度の適合性を有する。物質は、 好ましくは、コーティングプロセスの完了時に、実質的にインビボで非適合性で ある。その適合性形態において物質は、コーティングされるべき組織または細胞 表面と接触して配置され得、次いで刺激されて非適合性になり得る。物質は、好 ましくは、光化学刺激の適用により非適合性になるが、必要に応じて単に化学刺 激または熱刺激により達成され得る。物質は、内部または外部処置位置のいずれ かに配置され、そしてペービングされるか、またはシールされるべき組織または 細胞表面と接触し、次いで物質は、非適合性状態に変換され、組織表面上に生体 適合性コーティングを形成する。 コーティングは、カテーテル（例えば、改変PTCAカテーテル）を用いて塗布さ れ得る。物質は、好ましくは、１つまたは多数のバルーンおよび内腔を有する１ つのカテーテルを用いて塗布される。カテーテルは、比較的小さな断面積である べきである。蛍光透視鏡のガイダンスを用いて操作される長い薄い管状カテーテ ルは、器官または血管領域の内部への接近を提供するために好ましい。物質はま た、１つまたは多数の内腔を有する長い可撓性の管状デバイスを介して適合性形 態の物質を噴霧、押出し、またはそうでなければ内部に送達することにより、コ ーティングされるべき表面に塗布され得る。 所望の位置に物質を配置する工程の間、侵襲性外科技術または比較的非侵襲性 の技術（例えば、腹腔鏡手順または経皮トランスルミナル（transluminal）手順 ）のいずれかにより、その位置に接近し得る。物質の形状を固定するプロセスは 、最初の物質の特性に応じていくつかの方法によりなされ得る。例えば、その適 合性状態において物質は、バルーンカテーテルのバルーン部分を用いて形成され 得、その後、その条件は、物質を非適合性にするように調節される。好適な実施 態様において、ゲルを、物質に対する赤外線、可視、UV、または超音波放射線を 用いる光重合により、処置部位で非適合性にする。必要に応じて、ポリマーは、 局部的加熱または化学的方法により非適合性にされ得る。熱制御は、例えば、バ ルーンを介する、またはバルーン中への流体流動を用いて、あるいは部分的に有 孔のバルーンを用いて提供され得、温度制御流体がバルーンを通り抜けて内腔へ 入る。熱制御はまた、抵抗性発熱体と接触してカテーテル本体の長さに沿って延 びるワイヤを介する電気抵抗加熱を用いて提供され得る。この型の発熱体は、DC またはラジオ周波数（RF）の電流または外部RFあるいはマイクロ波放射線を使用 し得る。温度制御を達成する他の方法もまた用いられ得、これは内部光ファイバ ー（むき出しまたはレンズ化（lensed）された）を用いる光誘導加熱を含む。 １つの実施態様において、適合性物質を組織表面と接触させる工程は、「成形 」手順と考えられ得、ここで、適合性物質は、非適合性になる前に、体組織との 接触を実質的に適合するように成形される。適合状態から非適合状態への物質の 転移は、物質の相変化を含み得るが、このような相変化は必ずしも必要ではない ことに注目する。例えば、特定の実施態様において、用語「適合性」および「非 適合性」は、主として実際の相変化を受けることなく、粘性および流動性が顕著 に変化する物質の相対的記載である。あるいは、その適合状態と非適合状態との 間の物質の転移は、物質の実際の相変化の結果であり得、その結果、物質からの エネルギーの付加または除去のいずれかを生じる。 ポリマー物質は、種々の厚さ、長さ、および３次元幾何形状（例えば、点、星 形、線状、円筒状、弧状、らせん状）で注文設計され、種々の最終幾何形状を達 成し得る。さらに、このプロセスを用いて、単層または多層形状のいずれかで、 物質を中空、空洞、または管状の生物学的構造体（天然または人工的のいずれか で形成された）の内部表面に塗布し得る。このプロセスは、適切であれば、組織 内腔を完全に閉塞するためにも使用され得る。 ペービングコーティングは、孔を有するか、または有しないかのいずれかの連 続層として適用され得る。ペービングコーティングが孔を有しないで適用される 場合、それは「シール」と呼ばれ、組織表面上のバリア層として機能する。この コーティングはまた、例えば、個々の細胞または多数の細胞をコーティングまた はカプセル化するために、細胞表面に塗布され得る。 マイクロパーティクルの投与 注射可能なマイクロパーティクルは、静脈内、筋肉内、または皮下あるいは所 望の治療効果に適切な他の公知の方法（肺に対するエアロゾルまたは噴霧として 、またはオリフィスを介した直接洗浄による方法を含む）で、患者に投与され得 る。粒子は、使用前に凍結乾燥され得、次いでマイクログラム/ml〜100mg/mlの 範囲で水性懸濁液中に処方され得る。 ポリマーキャリア中の生物学的活性分子の所望の濃度は、薬物の吸収、不活性 化、および排泄速度ならびにキャリアからの分子の送達速度に依存する。投薬値 もまた、緩和されるべき状態の重篤度と共に変化することに注目すべきである。 特定の被験体にとって、特定の投薬レジメンは、個々の必要、および組成物の投 与を施行するかまたは監督する人物の専門的判断に従って期間にわたって調節さ れるべきであることがさらに理解されるべきである。 マイクロパーティクルは、粒子の放出速度、および所望の投薬量に依存して、 一度に投与され得るか、または種々の時間間隔で投与されるべき多数の少量の用 量に分割され得る。 静脈内、筋肉内、または局所適用、あるいは他の送達経路に使用される溶液ま たは懸濁液は、必要とされるように、以下の成分のいずれかを含み得る：無菌希 釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコー ル、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば 、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコル ビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四 酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）および張度の調 整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。親調製物は 、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジあるいは 多回用量バイアルに封入され得る。静脈内投与される場合、好ましいキャリアは 、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）である。 カテーテルは、任意の公知の物質（鋼鉄のような金属、および熱可塑性ポリマ ーを含む）から作製され得る。閉塞バルーンは、コンプライアントな物質（例え ば、ラテックスまたはシリコーン）、またはコンプライアントでない物質（例え ば、ポリエチレンテレフタレート（PET））から作製され得る。膨張可能な部材 は、好ましくはコンプライアントでない物質（例えば、PET、(PVC)、ポリエチレ ンまたはナイロン）から作製される。使用する場合、バルーンカテーテルの膨張 部分は、ポリマーコーティングの分離を助けるために、必要に応じてシリコーン 、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のような物質、水和ヒドロゲルのような 親水性物質および他の潤滑物質でコーティングされ得る。 血管に加えて、このプロセスは、他の適用（例えば、静脈、輸尿管、尿道、気 管支、胆管系および膵管系、腸、鼻涙管、洞腔（sinus cavity）、目、および欧 氏管、精液管（spermatic tube）ならびに卵管の内部のコーティング）に使用さ れ得る。同様に、このプロセスが用いられ、経肝（transhepatic）門脈体静脈シ ャント、透析移植片、動静脈フィステル、および大動脈瘤および他の動脈瘤の状 況においてペービング層を提供し得る。このプロセスのペービングおよびシーリ ング物質はまた、冠状動脈のレベルでさえ他の直接臨床適用に使用され得る。こ れらは、以下を包含するが、これらに限定されない：PCTA後の突然の血管再閉鎖 の処置、顕著な血管切開の「パッチング（patching）」、カテーテル損傷に対し て２次的であるかまたは自発的に起こるいずれかの血管壁「弁」のシーリング、 または種々の動脈炎（arteritidy）に関連する動脈瘤冠状拡張のシーリング。さ らに、この方法は、冠状動脈バイパス移植の間の血管吻合のシーリングのような 手術中の使用、および「包帯をした（bandaged）」滑らかなポリマー表面を提供 する能力を提供する。 特定の障害の処置 血管新生 老化における一般的な問題は、下肢の動脈に影響をおよぼすアテローム性動脈 硬化症である。これは、跛行、または歩行時の鋭い痛みを引き起こし得る。この 疾患は、増殖因子（例えば、VEGF（血管内皮増殖因子）、またはVEGFを発現し得 るDNA）を導入することにより疾患領域（この場合、脚）にさらなる側副循環の 作製を誘導することにより処置され得る。増殖因子またはDNAは、この因子を含 む薄いコーティングをこの領域に達する動脈の内部に作製するか、またはこの因 子を含むマイクロパーティクルを疾患四肢または領域に供給する動脈内に注入す ることのいずれかにより送達され得る。後者の場合、マイクロパーティクルは、 送達粒子を領域中に優先的に局在化させるために、好ましくは少なくとも直径15 ミクロン、好ましくは20ミクロン以上である。（いくつかのマイクロパーティク ルは、おそらく処置領域、および肺またはどこかのロッジ（lodge）を出ること に注目すべきである；この効果は、処置計画において考慮されなければならない 。） 別の適用としては、心組織（心筋層を含む）における血管再生、および発作ま たは虚血後の血管再生が挙げられる。 組織の再生または修復 さらに別の適用は、特定の器官の再生または修復においてである。種々の骨形 態発生タンパク質の送達は、制御された骨の再造形、あるいはデノボの骨または 軟骨形成に有用であり得、ここで、発生または形態発生効果は、厳密に標的部位 に制限され、そして生体の至る所で示されないことが重要である。生物学的活性 分子の局所沈着は、鼻道（nasal passage）および鼻洞（nasal sinus）のような 領域における骨の修復に有用であり得、ここで、位置決めの正確な制御が必要と される。 この方法で処置され得る他の組織の例としては、胃および腸が挙げられ、ここ で、増殖因子は、潰瘍形成の修復、皮膚の外部潰瘍形成の修復、および一般的な 創傷修復の促進を助ける。 処置に対して感受性の他の器官系としては、物質が供給源から器官を通って流 動し、その結果、因子が、コーティング中または粒子としてのいずれかで、流動 により処置されるべき器官への点滴注入のために、投与され得る任意の器官系が 挙げられる。例示的な器官としては、リンパ節、胆管、尿路、肺、脳脊髄液によ り占有される空間などが挙げられる。 本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。 実施例１： インビトロでのゲルからの遺伝子送達 遺伝子の動脈への伝達に関する以前の研究は、液体ビヒクル中のDNAの投与に 関係し、バルーンカテーテルを用いて液体を動脈壁の中にプレスする工程を包含 する。より有効な局所送達のために、薄い局所的に沈着したゲル（ここからDNA が標的組織に拡散し得る）を用いた。 トランスフェクション手順 カチオン性脂質アナログ（1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニウ ム)プロパン（DOTAP）^*）（^*別の命名法：N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロ ピル]-N,N,N,トリメチル-アンモニウムメチルスルフェート）を含む正に荷電し たリポソーム（トランスフェクション試薬、Boehringer Mannheim）を、トラン スフェクションのために用いた。プラスミドDNAを、塩化セシウム勾配を介する 遠心分離により精製した。５μgのDNAを、200μLのハンクスの平衡塩類溶液（HB SS、Gibco）中の30μgのリポソームと混合した。 発現ベクターおよび組換え遺伝子発現の分析 使用したルシフェラーゼ発現ベクターは、pRSVLUC（Dr．A．Brasier、Galvest on、TXの、Dr．Jeffrey M．Isner、St．Elizabeth's Hospital、Boston、MA（ベ クターを提供した）への寄贈）であった。これは、ラウス肉腫ウイルス長末端反 復プロモーターの制御下での転写を伴うホタルルシフェラーゼcDNAの5'欠失を含 む。このレポーター遺伝子の使用により、細胞溶解物中の遺伝子発現の定量化が 可能となる。細胞を、カルシウムを含まないHBSSで３回洗浄し、そして抽出液を １％Triton-X100^TMを含む細胞溶解剤（Promega、Madison WI）を用いて調製した 。この抽出液の半分を、総タンパク質含有量の分析のためにとり、Biorad Micro as say手順を用いて実施した。ウシ血清アルブミン（１mg/ml）を、抽出液のもう半 分にキャリアタンパク質として添加し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。 このために、20μlのアリコートを、室温にて甲虫ルシフェリンを含む100μlの ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）と混合した。10秒間積分した光の発光 を、ルミノメーター（Turner Designs、Model 20e、Sunnyvale CA）を用いて測 定した。光単位（light unit）として読み取った結果は、既知量のルシフェラー ゼ（Sigma、Product No．L-9009）の一連の希釈物を用いて評価される検出シス テムの直線範囲内であった。リン酸緩衝化生理食塩水または非トランスフェクト 細胞の溶解物を用いて測定したバックグラウンド活性は、首尾一貫して０であっ た。 BostonのSt．Elizabeth's hospitalのDr．Jeffrey Isnerの研究室から得たプ ラスミドpRSVLUC（これは、SV40プロモーターの制御下で酵素ルシフェラーゼを コードする）を、ゲル化したプレポリマーに溶解した。プレポリマーは、Hubbel lらによるPCT US93/17669（本明細書中で参考として援用される）の教示に従っ て合成した、各末端に約５個の乳酸残基（各末端でアクリレート基によりキャッ プされた）を有する、ポリエチレングリコール（MW8000）のコアを有していた。 ポリマー濃度は10％であった。適用方法は、他の点ではHill-Westら、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 91:5967-5971、1994に記載の方法と本質的に同一であった。 組織表面を、１mMのEosin Yの塗付により染色し、そして洗浄した。DNA、ならび に100mMエタノールアミンおよび0.15％ n-ビニルピロリドンを含むポリマー溶液 を、本質的にHill-Westにおけるように重合した。送達ビヒクル中のプラスミド の量は、0.02μgと２μgとの間であった。上記のリポソームを、必要に応じて含 んだ。ウサギ動脈細片の管腔表面（これを、本質的にTakeshitaら、J ．Clin．In vest. 、93:652-661(1994)により記載されるように、組織培養物中に維持した） を、HubbellらによるPCT US93/01776に従って光開始色素（Eosin Y）で染色し、 そして培地中で洗浄した。DNAを含み、添加リポソーム（DNA１部あたりリポソー ムの重量で４部の比で）を含むか含まないプレポリマー溶液（生理食塩水中の23 ％wtプレポリマー溶液）を、染色した動脈細片にスポットとして塗付した。溶液 を緑色光を用いて光重合し、ヒドロゲルを形成した。コントロールとして、動 脈細片を、DNA/プレポリマー溶液で処理した。これは光照射によりゲル化しなか った。培養物中で７日後、ルシフェラーゼ発現を、標準方法により、組織１グラ ムあたりのTurner Light Unit（TLU/g）で測定した。 DNA塗布（２マイクログラム/用量）の最適レベルで、コントロールは3.3±3.3 TLU/gを有していた；リポソーム内にカプセル化されていないDNAを含むゲルで処 理した組織は、10.7±3.6TLU/gを有していた；そしてリポソーム内にカプセル化 されたDNAを含むゲルで処理した組織は、20.8±1.7TLU/gを有していた。 この結果は、遺伝子伝達および発現が、リポソームを含むかまたは含まないゲ ルを用いる送達により達成され得、そして送達の有効性が、DNAを単に組織表面 に塗布する場合よりも顕著に高いことを示す。しかし、この結果はまた、伝達の 有効性が、固定化前にDNAをリポソームに取り込むことにより非常に増加され得 ることを示す。 実施例２： 光重合性ヒドロゲルを介するインビボでのルシフェラーゼ遺伝子送 達 インビボ遺伝子送達を、ラット頸動脈モデルを用いて証明した。実施例１に記 載のように調製した、界面重合したゲルを、ラットの右頸動脈中に形成した。左 側は処置せず、コントロールとして用いた。ゲルは、プレポリマー溶液（10％w/ vプレポリマーを含む）１mlあたり25マイクログラムのDNAを含み、プレポリマー １mlあたり100マイクログラムのリポソーム中にカプセル化された。そしてそれ 以外はHill-Westらにより記載のように沈着させた。動脈に緑色光を照射してマ クロマーを重合させ、厚さ約100マイクロメートルの層が生じた。３日後、ラッ トを屠殺し、そして組織をルシフェラーゼ発現について試験した。 コントロール（非処置）動脈においては遺伝子発現は明らかではなかったが、 処置動脈は8.2±6.2TLU/gを有していた。 さらなるコントロールとして、DNA/マクロマー溶液を、動脈血管外膜（外側） 表面に塗布し、そして生理食塩水で洗い流した；または内部表面に塗布し、照射 しなかった。前者の処置は、0.85±0.21TLU/gを与え、そして後者は3.9±3.7TLU /gを与えた。 本発明の前述の詳細な説明から、特許請求されている発明の変形および改変は 、 当業者には明らかである。これらの変形および改変はすべて、添付の請求の範囲 の範囲内に包含される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞および組織への生物学的活性分子の標的化局所送達方法であって、以下 の工程： 生分解性マイクロパーティクルを選択する工程であって、該生分解性マイクロ パーティクルが、生物学的活性分子を含み、そして動物へ該マイクロパーティク ルを投与する際に、該動物の処置が必要な少なくとも１つの標的化遠位部位に該 マイクロパーティクルが留まるような直径を有する、工程；および 該マイクロパーティクルを該動物に投与する工程であって、それにより、放出 が所望される身体内の標的化遠位部位で治療的に有効量の該生物学的活性分子の 放出を制御するに十分な時間、該標的化部位に該マイクロパーティクルを留めさ せる、工程、 を包含する方法。 ２．前記マイクロパーティクルが、１〜100ミクロンの直径を有し、そして領域 または器官に投与され、該領域または器官内の遠位の位置に留まるかまたは付着 する、請求項１に記載の方法。 ３．前記マイクロパーティクルが、１〜100ミクロンの直径を有し、そして循環 に投与され、そして閉塞が起こる少なくとも１つの部位、または該マイクロパー ティクルが選択的に留まる領域にトラップされた後、前記生物学的活性分子を放 出する、請求項１に記載の方法。 ４．前記マイクロパーティクルが、リポソームの形態である、請求項１に記載の 方法。 ５．細胞および組織への生物学的活性分子の標的化局所送達のための薬剤の製造 における生分解性マイクロパーティクルの使用であって、該マイクロパーティク ルが生物学的活性分子を含み、そして動物へ該マイクロパーティクルを投与する 際に、該動物の処置が必要な少なくとも１つの標的化遠位部位に、該標的化部位 で治療的に有効量の該生物学的活性分子の放出を制御するに十分な時間、該マイ クロパーティクルが留まるような直径を有する、使用。 ６．前記マイクロパーティクルが、１〜100ミクロンの直径を有する、請求項５ に記載の使用。 ７．前記生物学的活性分子が、タンパク質、核酸分子、炭水化物、脂質、および それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 ８．前記タンパク質が、増殖因子、血管新生因子、サイトカイン、および免疫抑 制剤からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。 ９．前記増殖因子が血管内皮増殖因子である、組織の血管新生または血管再生を 促進するための、請求項８に記載の方法。 １０．前記マイクロパーティクルが、静脈内、筋肉内、皮下、直接洗浄およびエ アロゾル投与からなる群から選択される投与経路により、薬学的に受容可能なキ ャリア中で投与される、請求項１に記載の方法。 １１．前記マイクロパーティクルが、静脈内投与される、請求項１に記載の方法 。 １２．前記マイクロパーティクルが、血管内投与される、請求項１に記載の方法 。 １３．前記生物学的活性分子が、送達可能な増殖因子を含む、請求項１に記載の 方法。 １４．前記生物学的活性分子が、送達可能な増殖因子を含む、請求項５に記載の 使用。 １５．前記生物学的活性分子が、タンパク質、核酸分子、炭水化物、脂質、およ びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の使用。