WO2004048605A1

WO2004048605A1 - 特定リポ蛋白中の脂質測定法

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Publication number: WO2004048605A1
Application number: PCT/JP2003/015080
Authority: WO
Inventors: Shoko Yamamoto; Mitsuaki Yamamoto; Kazuo Nakanishi; Kazunori Saito
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2004-06-10
Also published as: JPWO2004048605A1; US20060014207A1; KR101216051B1; MXPA05005708A; AU2003284453A1; KR20050086781A; AU2010200171A1; EP1580279A4; US20110091917A1; US7682831B2; EP2194142A1; EP1580279A1; JP2009282044A; CA2507725A1; US20100136591A1

Abstract

本発明は特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で、多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法に関する。

Description

明細書

特定リポ蛋白中の脂質測定法技術分野

本発明は、少ない試料で簡便な操作により効率良く特定画分に存在する脂質を分離定量する方法及び試薬に関する。背景技術

コレステロール、中性脂肪、リン脂質は、血漿中においてアポ蛋白と結合し、リポ蛋白を形成している。リポ蛋白は物理的な性状の違いにより、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白（VLDL 低比重リポ蛋白（LDL)、高比重リポ蛋白（ HDD 等に分類される。 LDLは更に中間型リポ蛋白（IDL) と LDLに細分される場合があり、またリポ蛋白の分解産物（レムナント）もリポ蛋白の一つとして取り扱われることがある。これらのリポ蛋白のうち、 LDLは動脈硬ィ匕を引き起こす原因物質の一つであり、一方 HD Lは抗動脈硬化作用を示す事が知られている。

疫学的には、 LDL中のアポ蛋白やコレステロール値は、動脈硬化性疾患の発症頻度と正相関を示し、一方、 HDL中のアポ蛋白やコレステロール値は動脈硬化性疾患の発症頻度と逆相関を示す事が知られており、今日では、虚血性心疾患の予防や診断を目的として L D L中や HDL中のアポ蛋白ゃコレステロールの測定が行われている。

L D Lや HD L中の脂質の測定法としては、例えば超遠心分離によって L D L や HDLを、他のリポ蛋白と分離した後、それぞれの脂質測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質染色を行って、その発色強度を測定する方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも、操作が煩雑で多数の検体を処理できないなどの問題があり、日常的にはほとんど用いられていなかつた。

リポ蛋白中の脂質測定で最も一般的なものは、 HD L中のコレステロ一ルの測定である。 H D Lコレステロ一ル測定方法として、臨床検査の領域で用いられている方法には、検体に沈殿剤を加えて HD L以外のリポタンパクを凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離された HD Lのみを含む上清中のコレステロールを測定する沈殿法がある。この方法は比較的多量の検体量を要し、全分析工程を完全に自動化する事はできなかった。近年、酵素的に HD Lコレステロ一ルを分別定量する方法も検討されている。例えば、胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、酵素反応を行う方法（特開昭 6 3 - 1 2 6 4 9 8号公報）、 HD L以外のリポ蛋白をあらかじめ凝集させておき、 HD L中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集を再溶解して吸光度を測定する方法（特開平 6— 2 4 2 1 1 0号公報）、 HD L以外のリポタンパクを沈殿させる沈殿試薬とコレステロール測定試薬を組み合わせて使用し、沈殿しない HD L中のコレステロールを測定する方法（特許第 2 6 0 0 0 6 5号公報）、抗体を使用するもの（特開平 9— 9 6 6 3 7号公報）、糖化合物を使用するもの（特開平 7 _ 3 0 1 6 3 6号公報）、第一反応中に、特殊な界面活性剤の存在下でコレステロ一ルォキシダ一ゼ及びコレステロールエステラーゼを HD L 以外のリポ蛋白に作用させ、これらに含まれるコレステロールを、優先的に作用させたのち、 H D L以外のコレステロールに対する反応を抑制しながら H D L中のコレステロールを測定する方法（特開平 9一 2 9 9号公報）、特定の群から選ばれる界面活性剤とコレステロール測定用酵素試薬を使用して、 HD L中のコレステロールがコレステロール測定用酵素試薬と優先的に反応する時間内に測定する方法（特開平 1 1一 5 6 3 9 5号公報）、コレステロールォキシダ一ゼ及びコレステロ一ルエステラーゼを HD L中のコレステロールに特異的に作用する界面活性剤と組み合わせる方法（特開 2 0 0 1 - 1 0 3 9 9 8号公報）がある。

HD Lコレステロールに次いで測定される L D Lコレステロール測定においては、臨床的な意義は大規模疫学研究を通じ広く知られていたものの、 HDLコレステロ一ル測定における沈殿法のような方法が開発されなかったことから、超遠心分離法の結果を基に考案された「推定値」を求める換算式法（Freidewald法。以下 F式法と略）が利用されていた。 F式法の LDLコレステロールは総コレステロールから HDLコレステロ一ルと VLDLコレステロールを差し引いて算出され、 V L D Lコレステロールとして中性脂肪濃度の 1 / 5の値が使用されている。 VLDLコレステロールを中性脂肪から推定するため、中性脂肪濃度が 40 Omg/dlを越える人や、 III型高脂血症患者には使用できず、また食事により一過性に中性脂肪が増加している時には負の影響が出るなどの問題があった。これに対し、 LDLコレステロールの酵素法も開発され、 LDLコレステロールを含む試料から HDLコレステロールを消去したのち、残存する LDLコレステロールを測定する方法 (特再平 8— 828734号公報)、糖化合物及び又は蛋白可溶化剤の存在下、試料中の LDLコレステロールを測定する方法（特再平 8— 829 599号公報）がある。特定構造を有する界面活性剤を使用する方法（特開平 9 - 313200号公報）ゃァミンを含む緩衝液中で LDL以外に作用する界面活性剤を使用する方法（特開平 10— 38888号公報）もある。

中性脂肪は、血漿中の多くが V L D L中に存在する事から先述の F式法による L D Lコレステロール推定において VL D Lコレステロ一ル値推定に用いられている（VLDLコレステロール ==TG/5) 。一般に中性脂肪測定は、第一反応で遊離ダリセロールを消費した後、第二反応でリポ蛋白リパ一ゼにより生成する遊離グリセロールをリン酸ィ匕し、更にグリセ口リン酸酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素をパ一ォキシダ一ゼ、 4—ァミノアンチピリン、トリンダー色素と反応させて発色させる方法が用いられる。遊離グリセロールの消費にはいわゆる無色発色法が用いられ、パーォキシダーゼとその基質の一方やカタラーゼ、及びその組み合わせが汎用される。特定リポ蛋白中の中性脂肪測定は、従来超遠心分離法や凝集剤を用いた分画法、ゲル濾過による分画法などが知れられている、また特定リポ蛋白以外のリポ蛋白の反応を阻害する界面活性剤や H L B 1 5以上の界面活性剤を用いる方法（国際公開第 0 0 / 4 3 5 3 7号）がある。発明の開示

しかしながら、従来用いられている添加剤では特定リポ蛋白に対する特異性や脂質測定に用いられる酵素活性への影響などの点で十分満足できるものではなかつた。また条件に適った添加剤を探索するためには、超遠心分離装置のような高価な機器を用いて新鮮な人血液から少なくとも主要なリポ蛋白である HD L、 L D L、 V L D Lを分離調製して、それぞれを評価、選抜する必要があり、多くの時間と経費を必要としていた。

したがって、本発明の目的は、簡便な操作で効率良く種々の自動分析装置に適用できる特定画分中の脂質測定法を提供することにある。

そこで、本発明者は、鋭意研究を行った結果、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程において特定の界面活性剤を用いることによって試料中の測定対象リポ蛋白中の脂質が特異的に測定できること、更にこれらの界面活性剤が共通の構造的特徴を有していることを見出して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法を提供するものである。

また本発明は、特定リポ蛋白に作用する多環型ポリオキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定試薬を提供するものである。

本発明によれば、数多くの界面活性剤の中から効率よく有用な界面活性剤を選択でき、これを用いて遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率良く特定画分中の脂質を定量する事ができる。また、少ない試料で、簡便な操作により、特異的な測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域においても極めて有用である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明方法と従来法（コレステスト N HD L使用）との相関関係を示す図である。

図 2は、本発明方法と従来法（コレステスト L D L使用）との相関関係を示す図である。

図 3は、本発明方法と従来法（コレステスト N HD L使用）との相関関係を示す図である。

図 4は、本発明方法と従来法（コレステスト L D L使用）との相関関係を示す図である。

図 5は、本発明方法による L D L中性脂肪の測定結果を示す図である。

図 6は、本発明による HD L中性脂肪の測定結果を示す図である。

図 7は、本発明の界面活性剤の H L Bと相関係数の関係を示す図である。図 8は、本発明の界面活性剤のァリ一ル基数と相関係数の関係を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明で用いられる多環型ポリオキシアルキレン誘導体としては、多環型、すなわち 2個以上のァリ一ル基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤が挙げられる。当該ァリール基としては、フエニル基、ナフチル基、アルキルフエニル基、フエニルアルキル基、フエニルァルケニル基等が挙げられる。アルキルフエニル基としては、ノエルフェニル基等の C！一 C₂。アルキルフエニル基が挙げられる。フエニルアルキル基としては、ベンジル基等のフエ二ルー（^ _ ( ₆アルキル基が挙げられる。フエニルアルケニル基としては、スチリル基等のフエニル C₂— C_sアルケニル基が挙げられる。これらのァリール基の数は 2 ~ 1 0、特に 2〜8が好ましい。但し、縮合物の場合はこの限りでない。また多環性基の好ましい例としては、フエニル基上にフエニル基、ナフチル基、アルキルフエニル基、フエニルアルキル基及びスチリル基から選ばれるァリール基が 1〜 5個、より好ましくは 1〜 3個が置換した基が挙げられる。

当該界面活性剤のポリオキシアルキレン基としては、ポリオキシエチレン基、ポリォキシェチレンポリォキシプロピレン基、ポリォキシプロピレン基などが挙げられ、ポリォキシエチレン基が特に好ましい。ボリォキシアルキレン付加モル数は、測定対象である目的脂質、ポリオキシアルキレン基の種類によっても異なるが 2〜1 0 0、更に 5〜5 0、特に 1 0〜5 0が好ましい。

多環型ポリォキシアルキレン誘導体のうち、非ィオン性界面活性剤としてはポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。また非イオン性界面活性剤の場合、その H L Bは 1 2〜1 8が好ましい。また陰イオン性界面活性剤としてはスルホン酸エステル系、リン酸エステル系又はスルホサクシネート系の陰ィォン性界面活性剤が好ましい。

また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用する H L B 1 2〜 1 8の非ィォン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤の HL B値に依存せず、専らァリール基の数に支配される界面活性剤を使用するのが好ましい。

また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用する H L B 1 2〜1 8の非イオン性界面活性剤であって、ァリール基を 2個以上有する界面活性剤（但し、 L D L中のコレステロ —ルを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響される H L B 1 3〜1 5のものを除く）を使用するのが好ましい。

更に、目的脂質が HD L中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシァルキレン誘導体として、 HD Lに優先的に作用する H L B 1 4. 1〜1 8、特に H L B 1 4. 3〜1 8の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質が L D L中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、 LDL以外に優先的に作用する HLB 1 5. 1〜18、特に HL B 15. 3〜18の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪である場合、多環型ポリォキシアルキレン誘導体として、 LDL以外に優先的に作用する HLBが 12〜18であって 2個以上のァリ一ル基を有する非ィオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。目的脂質が L D L中の中性脂肪である場合、多環型ポリォキシアルキレン誘導体が L D L以外に優先的に作用する HLBが 12〜15であって 2個以上のァリール基を有する非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。ここで、優先的に作用するとは、特定のリポ蛋白に対して他のリポ蛋白に優先して作用することをいう。特に好ましいポリオキシアルキレン誘導体としては、複数のフエ二ル基を有するポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフエ二ルェ一テル、ポリォキシアルキレンポリスチリルフエ二ルェ一テル、ポリォキシアルキレンフエニルフエノールエーテル、ポリォキシアルキレンポリスチリルフエ二ルェ一テル縮合物、ポリォキシアルキレンアルキルフエ二ルェ一テル縮合物、ポリオキシアルキレンジスチレン化フエニルエーテル、ポリオキシァルキレンスチリル化フエニルエーテル、ポリオキシアルキレンァリルフエニルェ一テル、ポリオキシアルキレン多環フエニルスルホサクシネートなどが挙げられる。

これらポリオキシアルキレン誘導体の市販品としては、ポリオキシアルキレン多環フエ二ルェ一テルとしてぺグノール 005 (HLB 14. 6、東邦化学工業社製）；ニュ一コール 610 (HLB 13. 8) 、ニューコール 710 (HLB 13. 6) 、ニューコール 7 10 F (HLB 13. 5) 、ニュ一コ一ル 714 ( HLB 15. 0) 、ニューコール 714F (HLB 14. 4) 、ニュ一コール 7 40 (HLB 17. 9) 、ニューコール 2600 FB (HLB 13. 4) 、ニュ —コール 2608 F (HLB 13. 0) 、ニューコール 2609 (HLB 13. 0) (以上、日本乳化剤社製）；ポリオキシアルキレンポリスチリルフエ二ルェ —テルとしてバイオニン D— 61' 12W (HLB 13. 0) 、パイォニン D— 6 115 X (HLB 14. 5) 、バイオニン D— 6115 Z (HLB 15. 5) ( 以上、竹本油脂社製）；ポリオキシアルキレンフエニルフエノールェ一テルとしてソルポール T— 15 (HLB 12. 0) 、ソルポール T— 20 (HLB 13. 3) 、ソルポール T— 26 (HLB 14. 4) (以上、東邦化学工業社製）；ポ

ェニルエーテル縮合物としてパイォニン D—

6320 (HLB 13. 0) (竹本油脂社製）；ポリオキシアルキレンアルキルフエ二ルェ一テル縮合物としてパイォニン D— 640 (HLB 14. 3) (竹本油脂社製）、 R— 1020 (HLB 18. 0) (日光ケミカルズ）；ポリオキシアルキレンジスチレン化フエニルエーテルとしてエマルゲン A— 90 (HLB 1 4. 5) (花王社製）；ポリオキシアルキレンスチリル化フエニルエーテルとしてサンモ一ル 2 S P— 180 (HLB 14. 5) (日華化学社製）； TSP— 1 6 (HLB 12. 7) (青木油脂社製）；ポリオキシアルキレンァリルフエニルエーテルとしてはニューカルゲン FS— 12 (HLB 13) (竹本油脂社製）；ポリォキシアルキレン多環フエニルスルホサクシネ一トとしてエアロール T一 1 500 (東邦化学工業社製）などがある。

これらの多環型ポリオキシアルキレン誘導体は単独でも、混合しても、他の界面活性剤と組み合わせても用いることができる。また、本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は複数の多環型ポリォキシアルキレン誘導体の混合体であつてもよい。例えばベンジル基を有するフエニルエーテルでは、モノベンジル、ジベンジル、トリベンジルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。またスチリル基を有するフエニルエーテルでは、モノスチリル、ジスチリル、トリスチリルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。各形態の混合比も特に制限はないが、モノ体が 1〜 20 %、ジ体が 10〜 40 %、トリ体が 4 0〜 90 %が好適であり、更にモノ体が 2 ~ 15%、ジ体が 10〜40 %、トリ体が 50〜 90 %が好適で、これらの混合物の市販品の例としてはぺグノール 0 05 (およその混合比の中心はモノ体が 7 %、ジ体が 20%、トリ体が 73%) がある。これらの各成分の使用量は化合物によってことなり、特に制限されるものではないが 0. 0001質量％〜10質量％ (以下、単に％で示す）で、好ましくは 0. 001%〜5%で使用される。また本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程にあればよい。本発明は特定リポ蛋白中の目的脂質を測定する方法及びその試薬であり、特定リポ蛋白には HDL、 LDL、 IDL、 VLDL、カイロミクロン及びこれらの分解物が含まれる。また目的脂質にはコレステロール、中性脂肪、リン脂質が含まれる。従って測定対象としては HDL中のコレステロール、 LDL中のコレステロール、 VLDL中のコレステロール、 I DL中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール、これらの分解物中のコレステロール、 HDL中の中性脂肪、 LDL中の中性脂肪、 VLDL中の中性脂肪、 IDL中の中性脂肪、力イロミクロン中の中性脂肪、これらの分解物中の中性脂肪、 H D L中のリン脂質、 LDL中のリン脂質、 VLDL中のリン脂質、 IDL中のリン脂質、カイロミクロン中のリン脂質、これらの分解物中のリン脂質が挙げられる。これらの多くは動脈硬化性疾患との関連が深く分離定量する必要性が高レ ^。

本発明の方法は目的脂質を測定する工程及び目的脂質測定の特異性を決定する工程を有するが、目的脂質測定の特異性を決定する工程は目的脂質を測定するェ程と別個に行なわれても、同時に行なわれても良い。またこれらの工程は試薬等を段階に分けて用いることを示すものではなぐ系中でこれらが進行すれば良い。目的脂質測定の特異性を決定する工程としては、特定リポ蛋白以外のリポ蛋白を前処理する工程、予め前処理された反応液中から目的リポ蛋白中の目的脂質を測定用酵素に反応させる工程等が挙げられる。また、目的脂質を測定する工程には、目的脂質測定用試薬が用いられ、当該試薬にはリポ蛋白から目的脂質を遊離させる酵素、例えばエステル分解酵素が含まれる。

検体としては、ヒトを含む動物、特に哺乳類の体液、体成分を用いることができるが、全血、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、特に血清、血漿が好ましい。検体はそのままでも希釈してもよく、また分離のための装置で分離されたものでも、乾燥したものでも良い。

特定リポ蛋白以外のリポ蛋白とは、例えば目的脂質が HD L中の脂質の場合には、 HD L以外のリポ蛋白、すなわち、 L D L、 V L D L、 I D L、カイロミクロン及びこれらの分解物であり、目的リポ蛋白が L D Lの場合は HD L , V L D L、 I D L、カイロミクロン及びこれらの分解物である。本発明の界面活性剤は、特定リポ蛋白に高い親和性を有する場合と反対に特定リポ蛋白に対して他のリポ蛋白より低い親和性を有する場合があり、目的脂質により使い分けることができる。

本発明において、目的脂質測定用試薬に用いられるエステル分解酵素は、リポ蛋白を構成する脂質測定に用いられる酵素で、例えばコレステロールエステラーゼ、リポ蛋白リパーゼ、リン脂質リパーゼなどエステル結合分解酵素ならばいずれでも差し支えない。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。

これらの酵素は必要に応じて、目的脂質測定のために他の酵素、補酵素、発色剤を組み合わせて使用することができる。他の酵素としてはコレステロール脱水素酵素、コレステロール酸化酵素、グリセロールリン酸化酵素、グリセロールリン酸酸化酵素、グリセロールリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ピルビン酸リン酸化酵素、乳酸脱水素酵素、コリン酸化酵素、アルカリフォスファタ —ゼ、パーォキシダーゼ、カタラーゼ、ジァホラーゼなどが用いられる。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。補酵素としては二コチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD) 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型 (NADH) 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸

(NAD P ). 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸（NAD P H) 、チォ NAD、チォ NAD Pなどが、発色剤としては P〇Dゃジァホラーゼの作用で色素を形成するものならいずれでもよく、 4ーァミノアンチピリン、トリンダ一色素類、ホルマザン色素類などが使用できる。これらの酵素は、単独で、或いは 2種以上を組み合わせて用いる事ができ、またその使用量は酵素によって異なり、特に制限されるものではないが 0 . 0 0 1単位〜 1 0 0 0単位 ZmLで、好ましくは 0 . 1単位〜 1 0 0 0単位 ZmLで使用される。本発明における 2つの工程は、それぞれ個別に実施されても、同一試薬内で実施されてもよい。

本発明における酵素を含む試薬には、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整する目的で他の酵素や塩、 pH調整のための緩衝剤、界面活性剤類、防腐剤、ァルブミンなどの蛋白質類、抗生物質、サポニン、レクチン、ポリア二オン類（リンタングステン酸の塩、デキストラン硫酸、ポリビニル硫酸、硫酸化シクロデキストリンなど）、 2価金属の塩、ポリエチレングリコール類、リン脂質など特定のリポ蛋白に親和性を有する試薬、防腐剤や力タラ一ゼ阻害剤としてアジ化物の塩も配合できる。このうち、ポリア二オン類又は 2価金属の塩は、目的脂質測定試薬の反応を制御する成分であり、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤である多環型ポリオキシアルキレン誘導体と併用してもよい。

緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、リン酸、トリス、フタル酸、クェン酸塩をはじめ、一般に pH 5〜 9の範囲で使用できる緩衝液及びこの範囲で緩衝作用を有するものなら何れも使用できる。その使用量は、特に制限されるものではないが 0 . 0 0 5 M〜2 M、特に 0 . 0 1〜1 Mが好ましい。本発明で用いる多環型ポリォキシアルキレン誘導体は、例えばその反応性が緩衝液に依存するものではない。反応温度は、前記 2つの工程が同一でも異なっても良く、本発明の試薬が溶液状態である温度、例えば 1 0〜4 0 °Cが好ましい。多環型ポリォキシアルキレン誘導体と併せて使用する界面活性剤は、例えば多環型ポリォキシアルキレン誘導体により、既に目的以外のリポ蛋白中脂質が前処理された後に、目的脂質を測定するために使用されるもの、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整して目的脂質測定試薬の反応を制御するものなどである。これらは特異性を決定する工程で用いられる前記多環型ポリオキシアルキレン誘導体のような特異性は必要ない。これらの界面活性剤としては、ァリール基を持たない界面活性剤、ァリール基を 1個しか持たない界面活性剤を使用できる。これらは非イオン性でもイオン性でもよく、非イオン性としてはァリ一ル基を持たないポリォキシエチレンアルキルエーテル類、ポリォキシエチレンポリォキシプロピレン縮合物、フエニル基 1個を持つポリォキシエヂレンアルキルフエニルェ一テル類が使用できる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル類としてはェマルゲン 7 0 9 (花王社製）など、ポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル類としてはトリトン X I 0 0 (シグマ社製) など、ポリオキシエチレンポリォキシプロピレン縮合物類としてはプル口ニック F— 1 0 8 (旭電化社製）などが用いられる。イオン性としては胆汁酸類が使用できる。これらの界面活性剤は 0 . 0 0 0 1〜5 %、特に 0 . 0 0 1〜5 %となるように使用するのが好ましい。これらの脂質測定用酵素試薬を添加した後、最終的に目的脂質を検出する方法は特に制限されず、例えばパ一ォキシダ一ゼやジァホラーゼと色原体を更に組み合わせて行う吸光度分析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法、金属等の酸化還元を測定する方法なども利用することができる。また本発明の試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態、ゲル状態でも提供できる。各製剤は、ガラスビン、プラスチック容器ほか、様々な不溶性担体、例えばラテックス、ガラス、コロイドなど粒子 ·球状担体、半導体やガラスなど平板状、紙やニトロセルロースなど膜状担体、繊維状担体への塗布、含浸など様々な形態で提供できる。

本発明における HD L或いは L D Lコレステロール測定においては、多環型ポリォキシアルキレン誘導体の存在下、例えばコレステロールォキシダ一ゼとコレステロールエステラーゼを反応させる。また、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下で HD L或いは L D L以外のリポ蛋白中コレステロールを前処理し、次工程で残つている HD L或いは L D Lにコレステロ一ルォキシダ一ゼとコレステロ一ルエステラーゼを反応させても良い。

また HD L或いは L D L中性脂肪測定においては第一工程で遊離グリセロールを前処理し、次工程でリポ蛋白リパーゼを作用させ、一般の中性脂肪測定試薬反応させて測定する。このとき、多環型ポリオキシアルキレン誘導体は、第一工程に用いても第二工程に用いてもよい。好ましい態様としては、遊離のグリセ口一ルが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、多環型ポリォキシアルキレン誘導体の存在下でリポ蛋白リパーゼと特定リポ蛋白の中性脂肪を反応させる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法；及び遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、 H L B 1 2〜 1 5の多環型ポリォキシアルキレン誘導体の存在下で遊離のグリセ口ールと特定リポ蛋白以外の中性脂肪を前処理する特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法が挙げられる。なお、遊離グリセロールを前処理する工程は、検体中の遊離グリセ口一ルを別途測定する場合や検体中のグリセ口ールが特定リポ蛋白中の中性脂肪に比べて無視できる場合、遊離グリセロールを前処理する工程或はその試薬類を省略しても差し支えない。

これらの基本的な工程は、血清中 HD Lコレステロール、 L D Lコレステロ一ル、中性脂肪などの測定法として既に一般化しているものである。実施例

次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例においては多環型ポリオキシアルキレン誘導体を本発明の界面活性剤ということがある。

実施例 1 (HDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 HDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の HD Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 Lに、 0. 01% 4ーァミノアンチピリン、 l O OmM P I P E S緩衝液（p H 6. 5 ) を含む試薬 240 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後、本発明の界面活性剤 1 %、 1単位/ mL コレステロールォキシダーゼ（オリエンタル酵母）、 1単位 ZmL コレステロールエステラーゼ (旭化成) 、 1単位/ mL パーォキシダーゼ、 0. 04% N, N—ジスルホブチルメタ卜ルイジン、 l O OmM P I PES緩衝液（pH6. 5) を含む試薬 80 Lを加え、 37°Cで副波長 700 nm/主波長 60 Onmにおける吸光度変化量を測定した。市販の HDLコレステロール測定試薬としては、コレステスト N HDL (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表 1に示す。表 1に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフエ二ル基を 1個有する界面活性剤（トリトン XI 00) を用いて同様に測定した。

表 1

相関係数比較

実施例 2 (HDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 HDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の HD Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 1 5例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 Lに、 0. 01 4ーァミノアンチピリン、 45 M ジギトニン（東京化成）、 100 mM P I PES緩衝液（pH6. 5 ) を含む試薬 240 Lを加え、 37でで 5分加温後、本発明の界面活性剤 1%、 1単位/ mL コレステロールォキシダ —ゼ（オリエンタル酵母）、 1単位 ZmL コレステロールエステラーゼ（旭化成）、 1単位 ZmL パーォキシダーゼ、 0. 04重量％ N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 l O OmM P I PES緩衝液（pH6. 5) を含む試薬 80 Lを加え 37 °Cで副波長 700 nm/主波長 600 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の HD Lコレステロール測定試薬としては、コレステスト N HDL (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表 1に示す。表 2に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に変えフエ二ル基を 1個有する界面活性剤（トリトン XI 00) を用いて同様に測定した。

表 2

相関係数比較

実施例 3 (HDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 HDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の HD Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. に、 0.

01% 4—ァミノアンチピリン、 0. 04% リンタングステン酸 Na (キシダ）、 0. 2% 塩化マグネシウム、 l O OmM P I PES緩衝液（pH6. 5 ) を含む試薬 240 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後、本発明の界面活性剤 1 %、 1単位 ZmL コレステロールォキシダーゼ（オリエンタル酵母）、 1単位 ZmL コレステロールエステラーゼ (旭化成) 、 1単位 ZmL パーォキシダ —ゼ、 0. 04重量％ N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 l O OmM

P I PES緩衝液（pH6. 5) を含む試薬 80 Lを加え、 37°Cで副波長 700 nmZ主波長 600 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の HDL コレステロール測定試薬としては、コレステスト N HDL (第一化学薬品社製 )を使用して、添付の使用法に従って測定し本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表 3に示す。表 3に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフエ二ル基を 1個有する界面活性剤（トリトン XI 00) を用いて同様に測定した。表 3

相関係数比較

実施例 4 (LDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 LDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の L D Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 Lに、 1単位 mL コレステロールォキシダーゼ（東洋紡）、 1単位/ mL コレステロールエステラーゼ（旭化成）、 1単位/ mL パーォキシダーゼ、 0. 02%

N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 l O OmM P I PES緩衝液（p H 6. 5 ) 、本発明の界面活性剤 1 %からなる第一試薬 240 Lを加え、 37 °Cで 10分加温後に、 0. 02% 4—ァミノアンチピリン、 l O OmM P I PES緩衝液（pH6. 5) 、 1 % ェマルゲン 709を含む試薬 80 j Lを加え 37 °Cで副波長 660 nmZ主波長 546 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の LDLコレステロール測定試薬としては、コレステスト LDL (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表 4に示す。表 4に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法との間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフエ二ル基を 1個有する界面活性剤（トリトン XI 00) を用いて同様に測定した。表 4

相関係数比較

実施例 5 (HDLコレステロールと LDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 HDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の HD Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清 50例を用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4^Lに、 1単位 Z mL コレステロ一ルォキシダ一ゼ (東洋紡) 、 1単位 ZmL パーォキシダーゼ、 0. 02% N, N—ジスルホブチルメ夕トルィジン、 0. 2mM フルフェナム酸（シグマ）、 50mM NaC l、 5 OmM B i s_Tr i s緩衝液 ( p H 6 ) を含む試薬 240 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後、 1単位 ZmL コレステロールエステラ一ゼ（旭化成）、 1 % ぺグノール 005、 0. 02 % 4ーァミノアンチピリン、 5 OmM B i s— T 1- i s緩衝液（pH6) を含む試薬 80 Lを加え 37 °Cで副波長 700 nmZ主波長 600 nmにおける P及光度変化量を測定した。市販の HDLコレステロール測定試薬としては、コレステスト N HDL (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図 1に示す。図 1に示したように本発明の方法は、相関係数 r = 0. 999と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。

次に、.本発明方法により、 LDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の L D Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清 50例を用いた。本発明の試薬は、血清 2. に、 1単位/ mL コレステロールォキシダーゼ (旭化成) 、 1単位/ mL コレステロールエステラーゼ（旭化成）、 1% ぺグノール 005 (東邦化学工業）、 1単位 ZmL パ一ォキシダーゼ、 0. 01% 4—ァミノアンチピリン、 20 OmM NaC 5 OmM MES緩衝液（pH6. 5) からなる第一試薬 2 40 ^iLを加え、 37°Cで 5分加温後に、 0. 04% N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 1 % ェマルゲン 709、 5 OmM MES緩衝液（pH6. 5 ) を含む試薬 80 zLを加え 3.7 °Cで副波長 660 nmZ主波長 546 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の LD Lコレステロール測定試薬としては、コレステスト LDL (第一化学薬品社製）を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図 2に示す。図 2に示したように本発明の方法は相関係数 R =0. 999と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。

以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定リポ蛋白中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。

実施例 6 (HDLコレステロールと LDLコレステロールの測定）

本発明方法により、 HDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の HD Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 20例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 Lに、 0. 01% 4一ァミノアンチピリン、 10 OmM P I P E S緩衝液（p H 6. 5 ) を含む試薬 240 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後、 1単位 ZmL コレステロールォキシダーゼ (オリエンタル酵母) 、 1単位, mL コレステロールエステラ一ゼ（旭化成）、 1% ェマルゲン A 90、 1単位 ZmL パーォキシダ一ゼ、 0. 04% N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 10 OmM P I P ES緩衝液（pH6. 5) を含む試薬 80 iLを加え、 37 °Cで副波長 700 n mZ主波長 600 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の HDLコレステ口一ル測定試薬としては、コレステスト N HDL . (第一ィ匕学薬品社製）を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図 3に示す。図 3に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数 r = 0. 952と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。

次に、本発明方法により、 LDLコレステロールを日立 7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販の L D Lコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清 20例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 zL に、 1単位 ZmL コレステロールォキシダ一ゼ（東洋紡）、 1単位/ mL コレステロールエステラーゼ（旭化成）、 1単位 ZmL パ一ォキシダーゼ、 0. 02% N, N—ジスルホブチルメタトルイジン、 l OOmM P I PES緩撺 ί 液（ρΗ6. 5)、 1% ェマルゲン Α90からなる第一試薬 240 xLを加え、 37°Cで 10分加温後に、 0. 02% 4—ァミノアンチピリン、 l O OmM

P I PE S緩衝液（pH6. 5) 、 1% ェマルゲン 709を含む試薬 80 Lを加え、 37 °Cで副波長 660 nm/主波長 546 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の LDLコレステロール測定試薬としては、コレステスト LD L (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図 4に示す。図 4に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数 r = 0. 987と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。

以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定脂質中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。

実施例 7 (LDLコレステロールの測定）

各種緩衝液を用いて本発明方法の L D Lコレステロール試薬を調製し、その測定値を比較した。測定は日立 7Ί 70形自動分析装置を用い、ヒト血清 15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清 2. 4 Lに、 1単位/ mL コレステロールォキシダーゼ (東洋紡) 、 1単位 /mL コレステロールエステラーゼ (旭化成）、 1単位 ZmL パーォキシダーゼ、 0. 02% N, N—ジスルホブチルメタトルィジン、 1 % ぺグノール 005を含む 10 OmM 各種緩衝液からなる第一試薬 240 /zLを加え、 37 で 5分加温後に、 0. 02% 4— アミノアンチピリン、 1 % ェマルゲン 709、 100 mM 各種緩衝液を含む試薬 80 ^ Lを加え、 37 °Cで副波長 660 nm/主波長 546 nmにおける吸光度変化量を測定した。市販の LDLコレステロール測定試薬としては、コレステスト LDL (第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表 5に示す。表 5に示したように本発明の方法は緩衝液の種類によらず従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。

表 5

相関係数比較

実施例 8· (LDL中性脂肪の測定）

血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総コレステロールを測定し図 5にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図 5にプロットした。測定は日立 7150形自動分析装置を用いて行い、総コレステロール測定にはピュアオート S T-CHO (第一化学薬品製）を用いた。本発明の LDL中性脂肪測定試薬は、血清 3 Lに 0. 5単位 ZmL グリセロールキナーゼ（旭化成）、 3単位 ZmL グリセ口 3リン酸ォキシダ一ゼ（東洋紡）、 1. 5単位 ZmL パーォキシダーゼ（東洋紡）、 1単位/ mL LPL (東洋紡）、 1% ぺグノール 005 (東邦化学工業）、 3m M 塩化マグネシウム、 0. 5mM 塩化カルシウム、 2. 5mM ATP, 0. 02% ェチルスルホブチルメタトルィジン、 5 OmM 3緩衝液（ト16. 3 )からなる第一試薬 300 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後に、 0. 01% 4 一ァミノアンチピリン、 1% ェマルゲン 709、 5 OmM MES緩衝液（p H 6. 3) を含む試薬 100 を加え、 37 °Cで副波長 700 n 主波長 5 46 nmにおける吸光度変化量を測定した。図 5に示したように本発明の方法は L D L中の T Gを特異的に測定している。

実施例 9 (HDL中性脂肪の測定）

血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総中性脂肪を測定し図 6にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図 6にプロットした。測定は日立 7170形自動分析装置を用いて行い、総中性測定にはピュアオート S TG-N (第一化学薬品製）を用いた。本発明の HDL中性脂肪測定試薬は、血清 2. 8 1に3単位7111 グリセ口ールキナーゼ（旭化成）、 3単位 ZmL グリセ口 3リン酸ォキシダ一ゼ（東洋紡）、 500単位/1111^ カタラーゼ、 3mM 塩化マグネシウム、 3mM A TP、 2mM ェチルスルホブチルメタトルィジン、 10 OmM P I PES緩衝液（pH7) からなる第一試薬 210 Lを加え、 37 °Cで 5分加温後に、 5 0 omt L リパーゼ（旭化成）、 1単位/ mL モノグリセリドリパーゼ (旭化成) 、 10単位 ZmL パーォキシダ一ゼ (東洋紡) 、 1. 5% ぺグノ —ル 005 (東邦化学工業）、 0. 04% 4ーァミノアンチピリン、 ImM 塩化カルシウム、 10 OmMP I PES緩衝液（pH7) を含む試薬 70 Lを加え、 37 °Cで副波長 700 nmZ主波長 546 nmにおける吸光度変化量を測定した。図 6に示したように本発明の方法は HDL中の TGを特異的に測定している。

実施例 10 (界面活性剤の H L Bと相関係数の関係）

本発明の界面活性剤については、 HLB値は特に重要な意味を持たないが、好ましくは 12以上としている。図 7は本発明の実施例 1から実施例 4に示した相関係数と本発明の界面活性剤の HL Bの関係を示したものである。図 7は本発明の界面活性剤の HLB値と相関係数の関係に一定の傾向を認めないことを示している。

実施例 1 1 (界面活性剤のァリール基数と相関係数の関係）

本発明の界面活性剤は、 2個以上のァリ一ル基を有することを特徴の 1つとしている（表 5 ) 。図 8は本発明の実施例 1から実施例 4に示した相関係数と本発明の界面活性剤のァリール基数の関係を示したものである。なお本発明の界面活性剤のうち縮合物系のものは除外している。図 8は界面活性剤のァリ一ル基数が 2個以上の場合、 1個の対照法より良好な相関係数が得られることを示している。なお本発明においてァリール基を数える際は、共通の構造的特徴であるベンゼン環を有するものの代表としてフエニル基の数として表している。

表 5

本発明の界面活性剤のァリール基数

本発明の界面活性剤ァリール基数

(フコニル基の数として）

ソルホ。ール T - 15 2

ソルホ。ール T- 20 2

ソルホ。—ル T-26 2

サンモール 2SP-180 2

ニューコール 610 3

ニュ一コール 710 3

二ユーコ一ル 710(F) 3

ニュ一コ一ル 714 3

ニューコール 714F 3

ニューコール 740 3

エマルケ'ン A90 3

へ。グノール 005 4

ニューコール 2608F 4

ニューコール 2600FB 4

ニュ一コール 2609 4

比較例

トリトン X100 1

Claims

請求の範囲

1. 特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で、多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法。

2. 特定のリポ蛋白が、 HDL、 LDL、 IDL、 VLDL、カイロミクロン又はそれらの分解物であって、目的脂質がコレステロール、中性脂肪又はリン脂質である請求項 1記載の測定法。

3. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、 2個以上のァリール基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤である請求項 1又は 2記載の測定法。

4. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フエニル基上にフエニル基、ナフチル基、アルキルフエニル基、フエニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる 1〜 5個が置換した多環性基を有するポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の測定法。

5. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用する HLB 12〜18の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤の H L B値に依存せず、専らァリール基の数に支配される界面活性剤である請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の測定法。

6. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用する HLB 12-18の非イオン性界面活性剤であつて、ァリ一ル基を 2個以上有する界面活性剤（但し、 LDL中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響される HLB 13〜15のものを除く）である請求項 1〜4のいずれか 1項記載の測定法。

7. 目的脂質が HDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が HD Lに優先的に作用する H LB 14. 1〜 18の非ィォン性界面活性剤である請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の測定法。

8. 目的脂質が LDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する HLB 15. 1〜18の非イオン性界面活性剤である請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の測定法。

9. 目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する、 HLB 12〜18であって、 2個以上のァリ一ル基を有する非イオン性界面活性剤である請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の測定法。

10. 目的脂質が LDL中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する、 HLB 12〜15であって、 2個以上のァリ一ル基を有する非イオン性界面活性剤である請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の測定法。

11. 測定系が、目的脂質測定の特異性を決定する工程と目的脂質を測定するェ程を有するものである請求項 1〜 10のいずれか 1項記載の測定法。

12. 目的脂質を測定する工程が、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤と目的脂質測定試薬の反応を制御する成分の存在下に行なわれるものである請求項 11記載の測定法。

13. 遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、 HLB 12〜18の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でリポ蛋白リパーゼと特定リポ蛋白の中性脂肪を反応させることを特徴とする特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法。

14. 遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、 HLB 12〜15の多環型リオキシアルキレン誘導体の存在下で遊離のグリセロールと特定リポ蛋白以外の中性脂肪を前処理することを特徴とする特定リボ蛋白中の中性脂肪測定方法。

15. 特定リボ蛋白に作用する多環型ポリォキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定試薬。

16. 特定のリポ蛋白が、 HDL、 LDL、 IDL、 VLDL、カイロミクロン又はそれらの分解物であって、目的脂質がコレステロール、中性脂肪又はリン脂質である請求項 15記載の測定試薬。

17. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、 2個以上のァリール基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤である請求項 15又は 16記載の測定試薬。

18. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フエニル基上にフエニル基、ナフチル基、アルキルフエニル基、フエニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる 1〜 5個が置換した多環性基を有するポリォキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項 15〜17のいずれか 1項記載の測定試薬。

19. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用する HLB 12〜18の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤の HL B値に依存せず、専らァリ一ル基の数に支配される界面活性剤である請求項 15〜： L 8のいずれか 1項記載の測定試薬。 ·

20. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用する HLB 12〜18の非イオン性界面活性剤であって、ァリール基を 2個以上有する界面活性剤（但し、 LDL中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響される HLB 13〜15のものを除く）である請求項 15〜18のいずれか 1項記載の測定試薬。

21. 目的脂質が HDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が H D Lに特異的に作用する H LB 14. 1〜 18の非ィォン性界面活性剤である請求項 15〜 20のいずれか 1項記載の測定試薬。

22. 目的脂質が LDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する HLB 15. ：!〜 18の非イオン性界面活性剤である請求項 15〜 20のいずれか 1項記載の測定試薬。

23. 目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する、 HLB 12〜18であって、 2個以上のァリ一ル基を有する多環型ポリォキシアルキレン誘導体である請求項 15 〜 20のいずれか 1項記載の測定試薬。

24. 目的脂質が LDL中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体が LDL以外に優先的に作用する、 HLB 12〜15であって、 2個以上のァリール基を有する多環型ポリオキシアルキレン誘導体である請求項 15〜20のいずれか 1項記載の測定試薬。