WO2003091429A1 - Polypeptide microbicide et ses utilisations - Google Patents

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WO2003091429A1
WO2003091429A1 PCT/JP2003/005225 JP0305225W WO03091429A1 WO 2003091429 A1 WO2003091429 A1 WO 2003091429A1 JP 0305225 W JP0305225 W JP 0305225W WO 03091429 A1 WO03091429 A1 WO 03091429A1
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amino acid
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nls
polypeptide
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PCT/JP2003/005225
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Tetsuhiko Yoshida
Masayoshi Kume
Yoshinao Yamada
Yoko Matsuda
Hiroki Kourai
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Toagosei Co.,Ltd.
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an antibacterial polypeptide comprising an independent peptide chain in a form not occurring in nature and an antibacterial agent (pharmaceutical composition) containing the polypeptide as a main component.
  • Antibacterial polypeptides have a broad spectrum of antibacterial activity and are considered to be resistant to drug-resistant bacteria, so they prevent or treat bacterial and infectious diseases in humans and animals, or produce foodstuffs.
  • the use of antimicrobial polypeptides is expected to provide antimicrobial properties to such products.
  • Many antibacterial polypeptides have been isolated from animals and plants.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-63400 describes an antibacterial polypeptide derived from a Chinese beetle and an antibacterial agent containing the antibacterial polypeptide as an active ingredient.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-188687 describes an antibacterial polypeptide derived from scorpion venom and an antibacterial agent containing the antibacterial polypeptide as an active ingredient.
  • International Publication No. WO98519794 discloses an antibacterial polypeptide derived from human being one of defensin superfamily and an antibacterial agent containing the antibacterial polypeptide as an active ingredient. Is described.
  • International Publication No. WO099Z2691 describes antibacterial polypeptides derived from casein and antibacterial agents containing the antibacterial polypeptides as active ingredients (specifically, dentifrices, mouthwashes). Oral composition such as etc.) is described.
  • International Publication No. WO 00/09553 describes an antibacterial polypeptide derived from akagaeru.
  • International Publication No. WO01Z009175 describes a modified cysteine-containing antibacterial polypeptide derived from plant defensin.
  • each of the antibacterial polypeptides described in each of the above publications has been found and isolated from those originally existing as antibacterial polypeptides in nature (or the amino acid sequence of the natural antibacterial polypeptide has been reduced to one). Partially modified polypeptide). Therefore, as long as the main component is a peptide that originally exists as an antibacterial polypeptide, the antibacterial activity and antibacterial spectrum that the peptide originally exhibited in nature are higher. 2 It is difficult to develop antibacterial agents with bacterial performance. Disclosure of the invention
  • the antimicrobial polypeptides disclosed herein are polypeptides developed by a different approach than previously known antimicrobial polypeptides. That is, the present invention is based on an amino acid sequence contained in a peptide that is different from the peptide present as an antibacterial polypeptide in the natural world, and is created by using an artificially synthesized antibacterial that does not exist in nature. A sex polypeptide is provided. The present invention also provides a method for producing the antimicrobial polypeptide disclosed herein. Further, the present invention relates to polynucleotide sequences encoding the antimicrobial polypeptides disclosed herein and artificially synthesized non-naturally-occurring (typically substantially composed of) such sequences. Provided polynucleotides. Further, the present invention provides an antibacterial agent (pharmaceutical composition) containing such an antibacterial polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide as a main component.
  • an antibacterial agent pharmaceutical composition
  • the antimicrobial polypeptide disclosed herein may contain one or more kinds of nuclear-transferable IJ ⁇ nuclear localization signal sequences (hereinafter, referred to as NLS) and / or a part of the NLS in the peptide chain. It contains one or two or more units that have undergone a typical modification. Typically, the total number of amino acid residues (ie, amino acid residues constituting the sequence) included in the NLS and / or the modified NLS sequence of one or more units is at least 5, and the peptide This corresponds to 30% or more (preferably 40% or more) of the total number of amino acid residues constituting the chain.
  • NLS nuclear-transferable IJ ⁇ nuclear localization signal sequences
  • NLS is a nuclear translocating sequence isolated from various species and viruses, and is a partial sequence originally present in various polypeptides that translocate to the nucleus in cells.
  • the present inventors have found that NLS in an independent form has antibacterial properties against bacteria and the like, and have completed the present invention.
  • the antibacterial polypeptide of the present invention can exhibit high antibacterial activity by having NLS as a main component. In particular, it can have a broad antibacterial spectrum against Gram-negative and Gram-positive bacteria.
  • the antibacterial polypeptide of the present invention preferably comprises all aminos constituting a peptide chain.
  • the number of acid residues is 5 or more and 100 or less. With a polypeptide of this length, a high antibacterial activity can be stably exhibited. In addition, the synthesis is easy and economical because the peptide chain is relatively short. Further, a peptide in which the total number of amino acid residues included in the NLS and / or the modified sequence of NLS is 90% or more (for example, 100%) of the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is particularly preferable. Such NLS-based peptides may have particularly high antibacterial activity.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide chain are basic amino acid residues (typically, arginine and lysine). If the ratio of the number of basic amino acid residues is high, higher antibacterial activity can be obtained.
  • One preferred antibacterial polypeptide is characterized in that the modified sequence of NLS and / or NLS is arranged in two or more units close to each other. When two or more NLSs are present in one peptide chain, the antibacterial activity is improved. Those present in tandem adjacent to each other are particularly preferred.
  • NES nuclear export signal sequence
  • Preferred as the antibacterial polypeptide of this embodiment is that at least one unit of the NES or the modified sequence of NES is located close to the N-terminal or C-terminal end of the NLS or the modified sequence of NLS. It is characterized by having been done.
  • a polypeptide (peptide chain) in which NE S (or its modified sequence) and NLS (or its modified sequence) are adjacent to each other has high antibacterial activity against bacteria, particularly Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus. Can demonstrate.
  • the present invention also provides an antibacterial agent (ie, a pharmaceutical composition) containing the antibacterial polypeptide disclosed herein as a main component.
  • an antibacterial agent ie, a pharmaceutical composition
  • the antimicrobial agent may contain, in addition to the antimicrobial polypeptide of the present invention, a variety of pharmaceutically acceptable carriers.
  • the present invention also provides a nucleotide sequence encoding the antimicrobial polypeptide disclosed herein and a nucleotide sequence complementary to the sequence. Further, there is provided a non-naturally occurring artificially synthesized polynucleotide (which may be in the form of a DNA segment or an RNA segment) comprising or substantially consisting of the nucleotide sequences.
  • the present invention provides a method for suitably producing the antibacterial polypeptide disclosed herein.
  • the method disclosed herein comprises selecting at least one amino acid sequence consisting of five or more amino acid residues, known as a nuclear localization sequence (NLS), the selected NLS and / or
  • the NLS contains one or more units of a partially modified sequence, and the total number of amino acid residues contained in the one or more units of NLS and / or the modified NLS sequence is all amino acid residues. It includes designing a peptide chain so that the number is 30% or more (preferably 40% or more) of the number, and synthesizing an antibacterial polypeptide having the designed peptide chain.
  • Preferred methods for partially modifying NLS include (a) deleting at least one non-basic amino acid residue of native NLS, and (b) removing at least one basic amino acid residue from native NLS. And (c) replacing at least one non-basic amino acid residue contained in the native NLS with a basic amino acid residue.
  • FIG. 1 is a photograph showing the result of fractionating a sample containing the polypeptide synthesized by the cell-free protein synthesis system by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • FIG. 2 is a mass spectrum showing molecular ion peaks obtained by analyzing a polypeptide synthesized by the cell-free protein synthesis system using MALDI-TOF MS.
  • the horizontal axis is the mass-to-charge ratio (m / z), and the vertical axis is the relative intensity.
  • Figure 3 shows the fragment ion peaks obtained when MALDI-TOF MS was used to analyze the polypeptide synthesized by the cell-free protein synthesis system. ⁇
  • FIG. 5 is a mass spectrum.
  • the horizontal axis is the mass-to-charge ratio (m / z), and the vertical axis is the relative intensity.
  • FIG. 4 (FIG. 4) is a schematic diagram showing a state where the synthetic polynucleotide disclosed herein is inserted into a commercially available expression vector (pET-41a (+)).
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of fractionating a sample obtained by purifying a recombinant protein derived from Escherichia coli by several processes by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • FIG. 6 is a close-up chromatogram showing the results of reverse phase chromatography analysis of a purified sample obtained by treating a recombinant protein derived from Escherichia coli by several processes.
  • the horizontal axis is the retention time (min), and the vertical axis is the peak intensity ( ⁇ V).
  • FIG. 7 is a mass spectrum showing the molecular ion peaks obtained when MALDI-TOF MS was used to analyze a polypeptide obtained by purifying a recombinant protein derived from Escherichia coli by several processes. It is torr.
  • the horizontal axis is the mass-to-charge ratio (m / z), and the vertical axis is the relative intensity.
  • FIG. 8A is a chromatogram showing the results of reverse phase chromatographic analysis of a sample obtained by treating a recombinant protein derived from Escherichia coli by several processes.
  • the horizontal axis is the retention time (minutes) and the vertical axis is the peak intensity (// V).
  • FIG. 8B is a chromatogram showing the results of analyzing a chemically synthesized polypeptide sample by reversed-phase chromatography.
  • the horizontal axis is the retention time (min)
  • the vertical axis is the peak intensity (/ zV).
  • SEQ ID NO: 8 3 designed antibacterial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 8 4 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 85 designed antibacterial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 8 6 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 8 designed antimicrobial polypeptide
  • SEQ ID NO: 8 8 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 8 9 Antibacterial polypeptide designed.
  • SEQ ID NO: 90 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 9 1 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 9 2 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 94 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 95 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 96 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 9 7 Designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 98 designed antimicrobial polypeptide
  • SEQ ID NO: 100 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 101 designed antibacterial polypeptide containing an amide group at the terminus.
  • SEQ ID NO: 102 designed antibacterial polypeptide containing an amide group at the terminus.
  • SEQ ID NO: 103 designed antimicrobial polypeptide containing an amide group at the terminus.
  • SEQ ID NO: 104 Antimicrobial polypeptide designed.
  • SEQ ID NO: 106 designed antimicrobial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 108 designed antibacterial polypeptide.
  • SEQ ID NO: 110 Antimicrobial polypeptide designed.
  • SEQ ID NO: 1 1 1 Synthetic DNA encoding the designed antimicrobial polypeptide sequence.
  • SEQ ID NO: 1 13 Synthetic DNA encoding the designed antimicrobial polypeptide sequence.
  • SEQ ID NO: 114 Antimicrobial polypeptide designed.
  • SEQ ID NO: 1 17 Synthetic DNA used as primer.
  • SEQ ID NO: 1 18 Synthetic DNA used as primer.
  • SEQ ID NO: 1 19 Synthetic DNA used as primer.
  • SEQ ID NO: 20 synthetic DNA used as primer.
  • SEQ ID NO: 1 2 1 Synthetic DNA encoding the designed antimicrobial polypeptide sequence.
  • SEQ ID NO: 122 designed polypeptide.
  • “artificially synthesized antimicrobial polypeptide or polynucleotide that does not exist in nature” means that the peptide chain or nucleotide chain (full length) does not exist alone in nature, but Antimicrobial polypeptides or polynucleotides that have been chemically synthesized or biosynthesized (ie, produced based on genetic engineering).
  • Polypeptide is a term that refers to an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain. So-called oligonucleotides having less than 10 amino acid residues (for example, having 5 to 7 total amino acid residues) are also encompassed by the polypeptides herein.
  • Polynucleotide is a general term that refers to a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by phosphodiester bonds, and is not limited by the number of nucleotides. DNA and RNA fragments of various lengths are encompassed by the polynucleotide.
  • amino acid residue is a term that includes the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • nuclear localization sequence is not limited to a specific amino acid sequence unless otherwise specified, and is a nuclear localization (nuclear localization) sequence. Refers to the entire amino acid sequence known as Especially limited ⁇
  • NES or "nuclear export sequence” is not limited to a specific amino acid sequence unless otherwise specified, and is known as a nuclear export sequence. Refers to the entire amino acid sequence. Although not intended to be particularly limiting, typical examples of NES are listed in the Sequence Listing (SEQ ID NOs: 81, 82) herein.
  • an antibacterial polypeptide containing a sequence in which NLS (or NES) is partially modified refers to a given NLS (or NES).
  • a sequence in which one or several amino acid residues of the NLS (or NES) are modified so as to exhibit substantially the same or higher antibacterial activity as that of the polypeptide comprising Or a modified NLS (or NES) formed by substituting, deleting and Z or adding one or several amino acid residues to the NLS (or NES). refers to an antibacterial polypeptide containing S).
  • a modified sequence or the like having a methionine residue (including the case where an amino group is formylated) added to the terminal is included in the term “antimicrobial polypeptide containing a partially modified sequence” as used herein. This is a typical example.
  • one unit (unit) for NLS and NESS refers to one array constituting NLS or NESS. Therefore, when a peptide chain contains two units of NLS, regardless of whether they are the same or different, the sequence recognized as NLS (or NES) independently from the peptide chain It means that there are two of them. ⁇
  • amino acid residues constituting the peptide chain are represented by one-letter code (but three-letter code in the sequence listing) based on the nomenclature for amino acids indicated in the IUPAC-IUB guidelines.
  • NLS includes “partially modified sequence” (ie, a modified NLS sequence) based on the above definition. The same applies to NES.
  • the antimicrobial polypeptide provided by the present invention is an artificially synthesized polypeptide that does not exist in nature and has a primary structure incorporating NLS or consisting solely of NLS. That is, the ratio of NLS to the entire amino acid sequence is significantly larger than that of the natural nuclear-translocating polypeptide (peptide chain) containing NLS in the -portion.
  • the total number of amino acid residues included in the NLS is at least 5 amino acids (preferably 7 amino acids or more), and the number of amino acid residues is the total number of amino acid residues constituting the entire length of the peptide chain. Is at least 30% (preferably at least 40%).
  • those in which 70% or more of the total number of amino acid residues constituting the peptide chain are contained in the NLS portion are preferred, and those in which 90% or more of the total number of amino acid residues are contained in the NLS portion are particularly preferred.
  • the antimicrobial peptide of the present invention is preferably one in which all amino acid residues are L-type amino acids, but as long as the antibacterial activity is not lost, some or all of the amino acid residues are substituted with D-amino acids. It may be something.
  • a part or all of the polypeptide can be composed of D-type amino acid residues.
  • Polypeptide chain length (in other words, ⁇
  • the number of amino acid residues is not particularly limited because it may vary depending on the length of the NLS or NES contained, but is preferably composed of about 5 to 100 amino acid residues. Those composed of about 50 to 50 amino acid residues are more preferred, and those composed of about 9 to 30 amino acid residues (see Table 1) are particularly preferred.
  • the conformation (three-dimensional structure) of the polypeptide is not particularly limited as long as it exhibits antibacterial properties in the environment in which it is used, but it is linear or non-linear because it is unlikely to become an immunogen (antigen).
  • a mixture in the form of a mixture is preferred.
  • a polypeptide having such a shape is unlikely to constitute an epitope.
  • the polypeptide applied to the antimicrobial agent is linear and has a relatively low molecular weight (typically, the total number of amino acid residues: 5 to 30, preferably, the total number of amino acid residues: 5 to 20). Are preferred.
  • An amino acid sequence which does not contain a cysteine residue or has a small proportion thereof is preferred.
  • NLS for constructing the polypeptide of the present invention, any of native NLS discovered from various organisms and viruses can be selected and used as it is. Specific examples include NLS shown in SEQ ID NOS: 1 to 80, respectively. Those having a high content of basic amino acid residues are preferred. For example, those in which 40% or more (more preferably 50% or more) of amino acid residues are basic amino acid residues (lysine and / or arginine) are suitable. Polypeptides containing one or more of these NLSs are preferred.
  • NLS which constitutes one unit with about 5 to 25 amino acid residues.
  • RRMKWKK SEQ ID NO: 1
  • RVHPYQR SEQ ID NO: 2
  • P KKKRKV SEQ ID NO: 4
  • GKKRSKA SEQ ID NO: 5
  • RGRRRRQR SEQ ID NO: 7
  • RKKRRQ RRR SEQ ID NO: 20
  • PRRRK SEQ ID NO:
  • Polypeptides containing 1 or more units of NLS composed of 5 amino acid residues or more (such as 26) (typically, the total number of amino acid residues is 5 to 100) are preferred.
  • Such a polypeptide consisting of only one NLS unit may be used.
  • N such as RKRR (SEQ ID NO: 27) ⁇
  • L S alone does not constitute the polypeptide of the present invention.
  • an amino acid sequence having a total of 5 amino acid residues or more is designed in combination with the same or different NLS. That is, it is preferable to design an amino acid sequence containing 2 or more units (typically 2, 3, or 4 units) of NLS in which 1 unit is 4 amino acid residues or less.
  • RKRR SEQ ID NO: 27
  • RKRRRKRR 8 amino acid residues
  • NLS for constructing an antimicrobial polypeptide from available information sources such as databases
  • 40% or more, preferably 50% or more, particularly preferably 70% or more of the total number of amino acid residues are arginine residues and Z or lysine residues.
  • NLS may be a good candidate.
  • an amino acid sequence is designed so as to contain 2 or 3 or more units of NLS, it is preferable to design such that these NLSs are arranged adjacently in a peptide chain.
  • a form in which the C-terminal amino acid of one adjacent NLS and the N-terminal amino acid of the other NLS are directly bonded is preferable.
  • one or several amino acid residues may be interposed as a linker between two adjacent NLSs.
  • the antimicrobial polypeptide of the present invention may be one in which the entire amino acid sequence is composed of only one or two or more types of NLS. It may contain amino acid residues (amino acid sequences) that are not included.
  • a partial sequence other than NLS is preferably a sequence that can maintain the linear shape of the peptide chain.
  • amino acid sequence so as to include another sequence having an effect of enhancing the antibacterial activity of endogenous NLS.
  • NES is a suitable sequence candidate for this purpose.
  • the peptide chain is constructed such that NE S is adjacent to the N-terminal side or C-terminal side of NLS.
  • the polypeptide of this form for example, a polypeptide arranged in tandem from the N-terminal side in the order of NLS and NES, or a polypeptide arranged in tandem in the order of NES and NLS from the N-terminal side, or The polypeptides are arranged in tandem from the N-terminal side in the order of NLS, NES, and NLS (in this case, the N-terminal NLS and the C-terminal NLS may be the same or different from each other across the NES). Is mentioned.
  • the NLS or NES constituting the antimicrobial polypeptide of the present invention not only a sequence of a native type but also a sequence partially or variously modified as long as the antibacterial property is not impaired. Can be used. In other words, by designing an amino acid sequence (peptide chain) containing a sequence suitably modified to native NLS, a polypeptide capable of exhibiting higher antibacterial activity can be obtained. .
  • Typical modifications of this type include the conservative substitution of one to three amino acid residues in the sequence and the addition of a methionine residue to the N-terminus of the peptide chain (NLS) (design It is suitable when the synthesized peptide chain is biosynthesized using the recombinant DNA technology.).
  • Other preferred modifications to enhance antimicrobial activity include deletion of at least one non-basic amino acid residue (neutral or acidic amino acid residue) of native NLS; Adding at least one basic amino acid (typically argiene or lysine) to the native NLS; and replacing at least one non-basic amino acid residue in the native NLS with a basic amino acid residue. Substitution with a group. Further, it is also a preferable modification to amidate the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the peptide chain or to acylate (typically, acetylate) the amino group at the N-terminal.
  • a polysaccharide having one or two or more units of the sequence RKKKRKV obtained by substituting the proline of PKKKRKV (SEQ ID NO: 4), a typical NLS consisting of 7 amino acid residues, with a basic amino acid residue.
  • Peptides are one of the novel antimicrobial polypeptides provided by the present invention.
  • C0NH 2 (SEQ ID NO: 102) and R KKKR K VR KKKR K V-C0NH 2 (SEQ ID NO: 103) are suitable novel antibacterial polypeptides provided by the present invention.
  • Specific examples of the novel amino acid sequence (designed peptide chain) provided by the present invention include: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1 07, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 116 (or 1, 2 or (An altered sequence in which amino acid residues are substituted (conservative substitution and the like), deleted and / or added).
  • a polypeptide substantially composed of these amino acid sequences has high antibacterial activity against Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria (see Examples described later).
  • Each of these polypeptides is composed of 30 amino acid residues or less (specifically, 5-28 amino acid residues), and is suitable for maintaining a linear shape. Also, because of its low immunogenicity, it is suitable as the main component (antibacterial component) of antibacterial agents.
  • a peptide chain (that is, the antibacterial polypeptide of the present invention) can be synthesized according to the amino acid sequence by various conventionally known methods.
  • an antibacterial polypeptide can be easily produced according to a general chemical synthesis method. Either a conventionally known solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be employed.
  • B oc (t- butyloxycarbonyl) ⁇ some Rere as a protecting group of ⁇ Mi amino group is F moc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ applied solid-phase synthesis method is preferred.
  • the antimicrobial polypeptide of the present invention can be prepared by a solid-phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.) to obtain the desired amino acid sequence, modification ( A peptide chain having a moiety can be easily synthesized.
  • a commercially available peptide synthesizer available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.
  • the antimicrobial peptide of the present invention may be biosynthesized based on a genetic engineering technique.
  • This approach is suitable for producing a polypeptide having a relatively long chain length. That is, DNA (structural gene) is converted to include a nucleotide sequence (typically including an ATG initiation codon) determined to encode a desired antibacterial polypeptide (amino acid sequence designed based on NLS). Combine.
  • DNA structural gene
  • a recombinant vector having the gene construct is constructed according to the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, a yeast, an insect cell, a plant cell, or a mammalian cell) by a general technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is transfected under a predetermined condition. Incubate.
  • a predetermined host cell eg, a yeast, an insect cell, a plant cell, or a mammalian cell
  • the desired antimicrobial polypeptide can be obtained by isolating and purifying the polypeptide from the host cell (in the medium if secreted).
  • a fusion protein expression system can be used to efficiently produce large quantities in host cells. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the target polypeptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, from Novagen).
  • fusion protein expression vectors such as the provided pET series and the ⁇ GEX series provided by Amersham Biosciences. I do.
  • a host cell typically, Escherichia coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare a target fusion protein.
  • the protein is then extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the liberated target peptide fragment (designed antibacterial polypeptide) is recovered by a method such as affinity mouth chromatography.
  • the antibacterial polypeptide of the present invention is produced by using such a conventionally known fusion protein expression system (for example, a GST / His system provided by Amersham Biosciences can be used). be able to.
  • a type III DNA for a cell-free protein synthesis system ie, a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of an antibacterial polypeptide; see Examples described later
  • various types of peptides necessary for peptide synthesis are prepared.
  • the compounds ATP RNA polymerase, amino acids, etc.
  • the target polypeptide can be synthesized in vitro using a so-called cell-free protein synthesis system.
  • cell-free protein synthesis systems see, for example, Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001)) and Madin et al. (Madin et al., Proc. Natl.
  • the desired polypeptide can be easily produced by the cell-free protein synthesis system according to the amino acid sequence.
  • the polypeptide of the present invention can be easily produced based on Pure System (registered trademark) of Post Genome Research Institute, Japan.
  • Nucleotide sequence encoding antimicrobial polypeptide of the present invention A single-stranded or double-stranded polynucleotide substantially consisting of a nucleotide sequence complementary to the above can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. That is, by selecting codons corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the antimicrobial polypeptide is easily determined and provided. Then, once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single-stranded) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, using the obtained single-stranded DNA as type I, various enzymatic synthesis means (typically, PCR) can be employed to obtain the desired double-stranded DNA.
  • various enzymatic synthesis means typically, PCR
  • the polynucleotide provided by the present invention may be in the form of DNA,
  • the DNA can be provided in double stranded or single stranded. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a sequence complementary thereto.
  • polynucleotides provided by the present invention can be used as recombinant genes to express polypeptides in various host cells or in cell-free protein synthesis systems.
  • various regulatory elements promoter, ribosome binding site, terminator enhancer, etc.
  • Various cis elements that control the expression level are included.
  • the construction of the vector and the type of regulatory elements used in its construction may vary depending on the type of host cell desired.
  • the method for constructing the recombinant vector and the method for introducing the constructed recombinant vector into host cells may be the same as the method conventionally used in this field, and I ⁇
  • polynucleotides provided by the present invention encode antibacterial polypeptides of the novel amino acid sequence.
  • an antimicrobial polypeptide with the following requirements (a) and (b):
  • a non-naturally occurring artificially synthesized polynucleotide is provided.
  • a non-naturally occurring, artificially synthesized polynucleotide comprising (or consisting essentially of) Z or a nucleotide sequence complementary to the sequence is provided.
  • the antibacterial polypeptide of the present invention has a relatively wide antibacterial spectrum and is suitably used as a main component of an antibacterial agent (pharmaceutical composition).
  • an antibacterial agent pharmaceutical composition
  • it can be used for the treatment of bacterial infections, disinfection of wound surfaces, prevention of eye diseases, mouthwash (gargle), preservation and freshness preservation of foods, deodorization, sterilization or bacteriostatic of furniture and sanitary equipment surfaces, etc. .
  • the carrier contained in the antimicrobial agent may vary depending on the use and form of the antimicrobial agent.
  • a secondary component typically, a pharmaceutically acceptable substance
  • antibacterial agent there is no particular limitation on the form of the antibacterial agent.
  • typical forms of internal or external preparations include ointments, solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, and capsules.
  • it since it is used for injection, etc., it can be dissolved in physiological saline or the like immediately before use to prepare a lyophilized product or granulated product for preparing a drug solution.
  • the antibacterial agent provided by the present invention can be used in a method and dosage depending on its form and purpose.
  • solutions can be administered to patients by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or intraperitoneal injection or enema.
  • Solid forms such as tablets can be administered orally.
  • spray a liquid containing a relatively large amount for example, l to 100 mg / itil
  • the surface of the object may be wiped with a cloth or paper wet with the liquid.
  • the antimicrobial polypeptide provided by the present invention can exhibit antimicrobial activity selectively on bacteria. Therefore, the antibacterial polypeptide according to the present invention is useful as a main component of an antibacterial agent.
  • the polynucleotide encoding the antimicrobial polypeptide of the present invention can be used as a material for so-called gene therapy.
  • a gene encoding an antimicrobial polypeptide typically, a DNA segment or an RNA segment
  • the antimicrobial polypeptide according to the present invention can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antibacterial polypeptide of the present invention provided by the present invention can be used to prevent or treat bacterial infection in the above-mentioned patients and the like. It is useful as a drug to do.
  • the antibacterial polypeptide provided by the present invention has extremely low toxicity to mammalian cells and tissues (see Examples described later), and selectively exhibits antibacterial activity against bacteria. Therefore, it is extremely useful as an agent for preventing bacterial infection of cultured organs and the like.
  • culture is carried out by adding an antibacterial polypeptide of the present invention alone or an antibacterial agent containing one of the polypeptides as a main component to a culture solution at an appropriate concentration. Bacterial infection of internal organs can be prevented.
  • a polynucleotide encoding the antibacterial polypeptide of the present invention can be used as a material for gene therapy for cultured cells or tissues.
  • a gene typically, a DNA segment or an RNA segment
  • encoding the antimicrobial polypeptide of the present invention is integrated into an appropriate vector and introduced into a target culture tissue, so that the gene is always or at a desired time. It is possible to express the antimicrobial polypeptide according to the present invention in cultured tissues (cells). Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antibacterial polypeptide of the present invention provided by the present invention prevents bacterial infection of cultured tissues. I ⁇
  • polypeptides A total of 36 types of polypeptides (samples 1-33, comparative samples 1-3) were produced using a peptide synthesizer described later. Table 1 lists the amino acid sequences of these polypeptides.
  • RKKKRKVLALKLAGLDI (SEQ ID NO: 90) 17 sanf. Le 15 LALKLAGLDIRKKKR V (SEQ ID NO: 91) 17 sanfre 16 PKKKRKVPKKKRKV (SEQ ID NO: 92) 14 sanf. 17 17 RIRKKLRRIRKKLR (SEQ ID NO: 93) 1 sample 18 PRRRKPRRRK (SEQ ID NO: 95) 10 samples'; 1 1 9 PK KVPPRKK TW (SEQ ID NO: 97) 16 samples; 20 RKKKRKVRKKKRKV (SEQ ID NO: 98) 14 samples 21 RKKKRKVRKKKRKVRKKKRKV (SEQ ID No.
  • Sample 7 is a polypeptide comprising a modified sequence (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) in which the N-terminal amino acid proline in the amino acid sequence of Sample 1 (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) has been substituted with arginine.
  • Samples 8 to 11 are polypeptides consisting of a sequence in which NLS and general NES are linked in tandem. That is, in sample 8, NE S (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81) is adjacent to the C-terminal side of NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4). Conversely, in sample 9, NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) is adjacent to the C-terminal side of NES (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81). In sample 10, NELS (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81) is adjacent to the C-terminal side of NLS (RQARRNRRRRWR: SEQ ID NO: 21), and one aspartic acid is added to the C-terminal.
  • NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) is adjacent to the C-terminal side of NES (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81), and NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) is adjacent to the C-terminal side. ing.
  • Samples 12 to 15 are polypeptides comprising a sequence in which the modified NLS of Sample 7 (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) and general NES are linked. That is, in Sample 12, NES (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81) is adjacent to the C-terminal side of the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83). Conversely, in sample 13, the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) is adjacent to the C-terminal side of NES (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81).
  • Samples 16 to 22 and 30 are polypeptides comprising a sequence in which two or more NLS or modified NLS are linked. That is, in sample 16, two units of NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) are linked. In sample 17, two units of NLS (RIRKKLR: SEQ ID NO: 43) are linked. In sample 18, two units of NLS (PRRRK: SEQ ID NO: 26) consisting of 5 amino acid residues are linked. sample one
  • NLS NLS
  • PKKRKV SEQ ID NO: 4
  • PPRKKRTVV SEQ ID NO: 28
  • Samples 20, 21 and 22 are each composed of the above-mentioned modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) in which 2, 3, and 4 units are linked.
  • Sample 23 is obtained by amidating the carboxyl group of the C-terminal amino acid of NLS (PRRRK: SEQ ID NO: 26).
  • Sample 24 is obtained by amidating the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83).
  • Sample 25 is a sequence (RKKKRKVRKKKRKV: SEQ ID NO: 98) obtained by linking two units of the above-mentioned modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83), in which the carboxyl group of the C-terminal amino acid is amidated.
  • Sample 26 is a polyamino acid sequence (PKKKRRV: SEQ ID NO: 104) consisting of the amino acid sequence of sample 1 (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) in which the sixth amino acid residue from the N-terminal side, “lysine”, is conservatively substituted for “arginine”. Is a peptide.
  • Sample 28 is a polypeptide in which 7 amino acid residues rich in basic amino acids have been added to the C-terminal side of the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) of Sample 7. Specifically, a sequence (VKRKKKR) obtained by inverting the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) was added.
  • Sample 29 is a polypeptide obtained by adding 6 amino acid residues (KRKKKR), which are all basic amino acids, to the C-terminal side of the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) of Sample 7.
  • Sample 31 is a polypeptide obtained by adding 10 amino acid residues (ALGKLALGKL) to the C-terminal side of NLS (PKKKRKV: SEQ ID NO: 4) of Sample 1.
  • Sample 32 is a polypeptide obtained by adding 5 amino acid residues (IAGKI) to the C-terminal side of NLS (RQARRNRRRRWR: SEQ ID NO: 21) of Sample 2.
  • Sample 33 is a polypeptide obtained by linking two units of the modified NLS (RKKKRKV: SEQ ID NO: 83) of Sample 7, and further adding a methionine residue to the N-terminal side.
  • RKKKRKV modified NLS
  • Comparative Sample 1 is a polypeptide consisting of only one unit of short NLS (RKRR: SEQ ID NO: 27) consisting of four amino acid residues.
  • Comparative Samples 2 and 3 are polypeptides composed of only one unit of NES (LPPLERLTL: SEQ ID NO: 81, LALKLAGLDI: SEQ ID NO: 82), and do not contain NLS.
  • the peptide chain is extended from the Fmoc-amino acid bound to the resin by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction according to the synthesis program of the above-mentioned peptide synthesizer, and a synthetic peptide having a desired chain length is obtained. Obtained. Specifically, 20% piperidine Z-dimethylformamide (DMF) (a grade for peptide synthesis, manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) cuts and removes Fmoc, which is an amino acid protecting group, and is washed with DMF. Then, 4 eq of Fmoc-amino acid (-0H) was reacted, and the operation of washing with DMF was repeated. Then, after all the elongation reactions of the peptide chain were completed, the Fmoc group was cleaved with 20% piperidine / DMF, and the reaction product was washed in the order of DMF and methanol.
  • DMF piperidine Z-dimethylform
  • the synthesized peptide chain was transferred to a centrifuge tube together with the resin, and 1.8 mL of ethanediol, 0.6 mL of m-creso-inole, 3.6 mL of thioazole-sol, and 2 mL of trifonoloacetic acid were added. 4 mL was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Thereafter, the resin bound to the peptide chain was removed by filtration.
  • a pre-column S-Water Waters Co., Ltd. product, Guard-Pak Deltapak C18 A300
  • a C18 reverse phase column (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. product, Wakopak WS-DHA 4.6 X 150mm 0DS-C18)
  • TFA trifluoroacetic acid
  • acetonitrile trifluoracetic acid was used as an eluent. That is, while increasing the amount of the trifluoroacetic acid acetonitrile solution contained in the eluate with time (providing a concentration gradient from 10% to 80% by volume), a flow rate of 1.5 mL / min.
  • the separation and purification were performed for 30 to 40 minutes using the above column.
  • the peptide eluted from the reversed phase column is detected at a wavelength of 220 nm using an ultraviolet detector (490E Detector: a product of Waters), and is shown as a peak on a recording chart.
  • the molecular weight of each eluted polypeptide was determined by using a Voyager DE RP (trademark) manufactured by PerSeptive Biosystems, Inc., using MALDI-T0F MS (Matrix-Assisted Baser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry: Matrix-Assisted Racer ⁇ ! Time-of-flight mass spectrometry). As a result, it was confirmed that the target polypeptide was synthesized and purified.
  • the antimicrobial polypeptides of the present invention (samples 1-33) and the polypeptides of comparative samples 1-3 were tested against gram-negative bacteria (E. coli: coif) and gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus: 5. aureus).
  • the activity (minimum inhibitory concentration: MIC) was determined by liquid medium dilution using a 96-well microplate.
  • a liquid broth culture medium (DIFC0 product “NUTRIENT BROTH Dehydratedj”) of 0.5 M was prepared and filled into a 96-well microplate, while LB Broth, Lennox (DIFC0 product) was used for 18 hours, 3 hours.
  • a bacterial solution (approximately 2 ⁇ 10 6 cells / mL) cultured at 7 ° C is added to each well of an 96-well microplate in the same amount as the drug solution (the above broth medium containing the polypeptide). After inoculation, culture was started in a 37 ° C incubator, 24 hours later and 48 hours later one
  • the minimum polypeptide concentration at which no increase in turbidity due to bacteria was observed at the time of the measurement was defined as MIC in this example.
  • Table 2 shows the antibacterial activity (MIC) of each sample and the comparative sample based on the antibacterial test.
  • the unit of MIC in Table 2 is ⁇ .
  • polypeptides of the present invention (samples 1 to 33) all showed higher antibacterial activity than the polypeptide of the comparative control (comparative samples 1 to 3).
  • polypeptides that contain one or more units of NLS or modified NLS and are rich in (preferably eight or more) basic amino acid residues (for example, samples 2, 5, 16 to 22, 28, 29) It showed high antibacterial activity.
  • polypeptide having an amidated C-terminus (sample 24) exhibited higher antibacterial activity than the polypeptide having the same sequence without the amidated C-terminus (sample 7). From the results shown in Table 2, it was confirmed that the antibacterial polypeptide according to the present invention had excellent antibacterial activity and a broad antibacterial spectrum.
  • Example 3 the same antibacterial test (MIC measurement test) as in Example 2 was performed on various polypeptides (see Table 3) on the polypeptides of Samples 16, 17, 17, 10, 14 and 20.
  • the antimicrobial spectrum of the polypeptide was evaluated.
  • Table 3 it was confirmed that the antibacterial polypeptide of the present invention had an antibacterial activity against a wide range of gram-positive bacteria and duram-negative bacteria.
  • a toxicity test on mammalian cells was performed as follows.
  • the antimicrobial polypeptide tested here was LD 5 . Were all greater than 150 mg / kg. That is, it was confirmed that the toxicity of the antibacterial polypeptide according to the present invention to mammals was extremely low.
  • nucleic acid synthesizer (“ABI 3900” manufactured by Applied Biosystems) in accordance with the manual, a nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, 11, 13 or 11 in the sequence listing was used. Single-stranded DNA was synthesized.
  • a primer for forming a double-stranded DNA based on the DNA one type of primer (SEQ ID NO: 117) and three types of reverse primer (SEQ ID NO: 118, 11) 9 and 120) were chemically synthesized.
  • the reverse primers of SEQ ID NOs: 118, 119 and 120 were used to synthesize double-stranded DNA having the sequences shown in SEQ ID NOs: 111, 113 and 115, respectively. Is done.
  • SEQ ID NOs: 11, 11, 13 and 11 encode the antibacterial polypeptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 112, 114 and 116, respectively. It has a promoter sequence upstream (5, end) of the coding region and a termination codon downstream (3 'end).
  • ImM each amino acid, 12 picomoles of ribosome, and various enzymes with His-tag A class of factors (ie, 18 initiation factors 1 (IF 1), 2 / ig IF 2, 0.75 / zg IF 3, 1 / ig elongation factor 1 G (EF—G), 2 / xg EF—Tu, lg EF_T s, 0.5 // g termination factor 1 (RF 1), 0.5 xg RF 3, 0.RRF, each 30-300 units of aminoacid—t RN A synthetase (total 20 And methionyl-tRNA transamylase, 0.2 / ig creatine kinase (Roche), 0.15 / g myokinase (Sigma), 0.054 ⁇ g of Nuku Reoshidoji phosphate kinase, 0.1 units of pyrophosphatase (Sigma's products) ⁇ Pi 0.5 8 Ding 7 RNA polymerase);
  • a reaction solution containing 50 / l (pH 7.3) was prepared. The reaction was incubated at 37 ° C for 5 minutes. Thereafter, the above type I DNA was added to this reaction solution, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the reaction solution was transferred to ice to stop the peptide synthesis reaction. Next, the reaction solution was loaded into an ultrafiltration device (Atnicon (registered trademark) Centricon (registered trademark) YM-100 device, manufactured by Millipore) and centrifuged to collect the eluate. Next, the recovered solution was purified by affinity chromatography using Ni-NTA agarose (manufactured by Qiagen).
  • the target polypeptide was synthesized. That is, a part of the recovered purified solution (including the target peptide) was placed on a polyacrylamide gel having a acrylamide concentration gradient of 125%, and electrophoresis was performed at 300 V for 50 minutes. . Note that, in addition to the final purified solution, a part of the reaction solution immediately after the peptide synthesis reaction described above, that is, a part of the reaction solution immediately after the incubation at 37 ° C for 1 hour, and the gel after the ultrafiltration A portion of the eluate was also loaded.
  • the reaction solution immediately after incubating at 37 ° C for 1 hour was obtained by performing the same process except that the above-mentioned type I DNA (SEQ ID NO: 115) was not added.
  • the eluate from the ultrafiltration and the purified solution were loaded on the same gel.
  • a polypeptide (MPKKKRKVL PP LERLTL PKKKRK V) of SEQ ID NO: 116 which was separately synthesized by a peptide synthesizer (PEPTIDE SYNTHESIZER 9050 described above), was loaded on the same gel.
  • the gel After electrophoresis, the gel is immersed in a staining solution (7.5% acetic acid) containing a fluorescent stain (Amersham Biosciences, Inc. product: SYPR0 TM Orange) for 40 minutes, and the peptide band contained in the gel is removed. Stained. Thereafter, the gel was immersed in 7.5% acetic acid to remove excess stain.
  • the images were analyzed using an image analyzer (trade name “Typhoon”) manufactured by Amersham Pharmacia Co., Ltd. (excitation wavelength: 532 nm, fluorescence filter: 580 BP 30). The result (image after staining) is shown in FIG. Lane 1 shown in Fig.
  • Lane 1 shows the migration pattern of the LMW marker (product name: LMW Marker Kit, product code: 17-0446-01) of Amersham Biosciences Co., Ltd. 14. 4 kDa 20.l kDa 30 kDa 45 kDa 66 kDa 97 kDa band is observed.
  • Lane 2 shows the electrophoresis pattern of the peptide marker kit (product name: Peptide Marker Kit, product code: 80-1129-83) of Amersham Biosciences Co., Ltd., which is approximately 6.2 kD from the downstream of the lane. a 8.2 kD a and 10.7 kD a14.4 The band of kDa16.9 kDa is seen.
  • Lanes 3 and 4 show the migration patterns of the reaction solution immediately after the peptide synthesis reaction, respectively, with and without type III DNA. Lanes 5 and 6 show the migration patterns of the eluate of the above ultrafiltration with and without type III DNA, respectively. Lane 7 shows the electrophoresis pattern of the purified solution containing Ni-NTA agarose in the case of containing type III DNA. Lane 8 shows the migration pattern (70 ng / 3.4 ⁇ 1) of the polypeptide of the target sequence (SEQ ID NO: 116) synthesized by the peptide synthesizer. Lane 9 shows the electrophoresis pattern of the purified solution that had flowed through the Ni-NTA agarose without Type III DNA. Lane 10 shows the migration pattern of dihydrofolate reductase (DHFR) after synthesis by the same cell-free protein synthesis system (see Shimizu et al., Supra) and purification by the same process. .
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the target band in lane 7 (the band indicated by the arrow in FIG. 1) was cut out, and a matrix-assisted ionization-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF) manufactured by Amersham Biosciences was used.
  • MS Using a product name "Voyager RPdej", PMF analysis (Peptide Mass Finger printing analysis) of 7 teds was carried out on the horizon, and as a result, peaks of molecular ions as shown in Fig. 2 were observed.
  • the MALDI-TOF MS was operated in the PSD mode to perform a PSD (post-source decay) analysis (that is, a method of detecting excited molecular ions fragmented while flying in the TOF MS).
  • a PSD post-source decay
  • peaks of fragment ions as shown in Fig. 3 were obtained.
  • GS ⁇ fusion protein Glutathione S-transferase / His-Tag fusion protein
  • sequence of the target polypeptide (sample 17 above) was expressed in E. coli and the recovered GST
  • the fusion protein was digested with an enzyme to isolate and purify the desired polypeptide (fragment).
  • SEQ ID NO: 121 is a sequence encoding the amino acid sequence of the polypeptide of this example, and SEQ ID NO: 123 is its complementary sequence.
  • SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 122 The amino acid sequences of the polypeptides encoded in this synthetic polynucleotide are shown in SEQ ID NO: 121 and SEQ ID NO: 122.
  • This amino acid sequence is composed of the amino acid sequence of sample 17 (SEQ ID NO: 93) described above and one methionine residue, six consecutive histidine residues, and one glutamic acid residue arranged on the N-terminal side. It is composed of The methionine residue is inserted so that the target amino acid sequence can be cleaved with cyanogen bromide from the fused GST when the fusion protein described later is expressed as insoluble. Further, the six histidine sequences are tag portions for affinity recovery of the target polypeptide (fragment) after cleaving the fusion GST. In addition, a glutamate residue adjacent to histidine has been inserted to excise the tag portion from the desired polypeptide.
  • both ends of the synthetic polynucleotide are recognized by the recognition sites of the restriction enzymes EcoRI and Pstl, respectively. Is included.
  • This double-stranded DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and Pstl.
  • the restriction enzyme digest was subjected to agarose gel electrophoresis to purify a DNA fragment having EcoRI3 ⁇ 4l cut sites and Pstl cut sites at both ends.
  • the GST fusion protein expression vector (pET-41a (+) DNA: Catalog No. 70556-3) purchased from Novagen was digested with restriction enzymes EcoRI and Pstl. The double-stranded DNA (SEQ ID NO: 121) was ligated (inserted) into EcoRI and Pstl sites.
  • the cloning of the used GST fusion protein expression vector “pET-41a (+)” (total nucleotide sequence: 5933 bp) A detailed map of the expression region is described in detail in the catalog of Novagen.
  • Combinent cells (E. coli JM109) were transformed with the ligated plasmid.
  • the resulting transformant is cultured at 37 ° C in LB medium (Km +) containing kanamycin, and a clone transformed with the plasmid into which the double-stranded DNA is inserted is isolated from the culture. did.
  • the clone was cultured, and the plasmid into which the double-stranded DNA was inserted was isolated and recovered from the culture.
  • the recovered recombinant plasmid was used to transform E. coli BL21 (DE3) for high expression of the fusion protein.
  • the resulting transformant was cultured at 37 ° C in LB medium (Km + ), and a clone transformed with the plasmid into which the double-stranded DNA was inserted was isolated from the culture. did.
  • the clones isolated above were cultured at 30 ° C. using 3 liters of LB medium (Km +). OD 6 . . When the value was 0.9, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM to induce the production of the fusion protein. After 6 hours, the culture was centrifuged, and about 11.6 g of cells (wet state) were collected and stored frozen.
  • the cryopreserved cells were suspended in about 100 ml of PBS, and 20% TritonX-100 was added to a final concentration of 1%.
  • the suspension was subjected to ultrasonic treatment to disrupt the cells, and then centrifuged to collect about 110 ml of the supernatant.
  • This supernatant was applied to a 1 ml volume of Glutathione Sepharose 4B column, the column was washed with PBS containing 1% TritonX-100, and further washed with PBS.
  • 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM reduced glutathione was passed through the column to elute the target fusion protein from the column. This gives approximately 60 ⁇ ⁇
  • the recovered fusion protein solution was treated with thrombin. That is, a predetermined titer of thrombin (ie, about 0.01 U per 20 ⁇ g of the fusion protein) was added to the fusion protein solution, and the mixture was allowed to stand at 20 overnight. By this reaction, the fusion protein was divided into a GST part and a peptide part containing the amino acid sequence of interest.
  • a predetermined titer of thrombin ie, about 0.01 U per 20 ⁇ g of the fusion protein
  • This proteolytic enzyme-treated solution was then applied to a glutathione Sepharose 4B column, and the pass fraction was collected. Further, the column was washed with PBS containing 1% TritonX-100, and a part (the initial elution fraction) was collected. By subjecting the recovered solution to SDS-PAGE, it was confirmed that the target polypeptide was recovered. That is, a part of the recovered purified solution (including the target peptide) is converted to a polyacrylamide gel (Multigel 1525: a product of Daiichi Kagaku Co., Ltd.) having a acrylamide concentration gradient of 15 to 25%. And electrophoresed at 3 OmA for about 2 hours. Figure 5 shows the results.
  • Lane M of the gel shows the migration pattern of the peptide marker (Benchark Protein Ladder, Invitrogen), Lane 1 shows the migration pattern of the fusion protein solution before the above-mentioned thrombin treatment, and Lane 2 shows the migration pattern of the fusion protein solution before the thrombin treatment.
  • the lane 3 is a migration pattern of a pass fraction from the column
  • the lanes 4 and 5 are a migration pattern of a fraction obtained by collecting a washing solution obtained by washing the column.
  • Lanes 6 to 11 show the migration patterns of the eluted fractions collected from the column. As shown in the figure, in lanes 2 to 5, a band of a peptide fragment containing the target amino acid sequence (SEQ ID NO: 122) separated from GST was observed.
  • the enzyme treatment solution was applied to a 4.6 x 250 mm reversed-phase column (Wakosil-II 5C18 HG: a product of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and RP-HP LC of JASCO Corporation was applied.
  • JASCO Pump System pump: PU_980, UV detector: UV-970
  • the enzyme treatment solution obtained above was applied to a reversed-phase column (Lichrospher RP-18: a product of Agilent Technologies) with a size of 4.6 X 15 Omm, and RP—HP LC (JASCO Solution A: distilled water containing 0.15 vol% TFA, solution B: acetonitrile containing 0.1 vol% TFA, using Pump System, pump: PU-980, UV detector: UV-970)
  • Reversed-phase chromatography was performed under the following conditions: gradient: 100% eight liquids ⁇ 50% liquid A, 50% liquid B, 40 minutes), flow rate: 1 m.
  • gradient 100% eight liquids ⁇ 50% liquid A, 50% liquid B, 40 minutes
  • flow rate 1 m.
  • the technical elements described in the present specification exhibit technical utility independently or in various combinations, and are not limited to the combinations described in the claims at the time of filing. Further, the technology exemplified in the present specification achieves a plurality of objects at the same time, and has technical utility by achieving one of the objects.

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Description

明細書
抗菌性ポリぺプチド及びその利用
技術分野
本発明は、 天然には存在しない形態の独立したぺプチド鎖から成る抗菌性ポリ ペプチド及び該ポリペプチドを主成分とする抗菌剤 （薬学上の組成物） に関する。 背景技術
抗菌性ポリペプチドは幅広い抗菌スぺク トルを有し、 薬剤耐性菌が出現し難い と考えられていることから、 ヒ ト及び動物の細菌感染性疾患の予防や治療、 或い は、 食材等の物品に抗菌性を付与する目的に抗菌性ポリべプチドの利用が期待さ れている。 これまでに多くの抗菌性ポリべプチドが動植物から単離されている。 例えば、 特開 2 0 0 0— 6 3 4 0 0号公報には、 タイワン力ブトムシ由来の抗 菌性ポリべプチド及び当該抗菌性ポリべプチドを有効成分とする抗菌剤が記載さ れている。 また、 特開 2 0 0 1— 1 8 6 8 8 7号公報には、 サソリ毒由来の抗菌 性ポリべプチド及び当該抗菌性ポリべプチドを有効成分とする抗菌剤が記載され ている。 また、 国際公開第 WO 9 8 5 1 7 9 4号には、 デフェンシンスーパ一 フアミ リーの一つであるヒ ト由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリぺプ チドを有効成分とする抗菌剤が記載されている。 また、 国際公開第 W0 9 9 Z 2 6 9 7 1号には、 カゼイン由来の抗菌性ポリペプチド及び当該抗菌性ポリべプチ ドを有効成分とする抗菌剤 （具体的には歯磨剤、 口内洗浄液等の口用組成物） が 記載されている。 また、 国際公開第 WO .0 0 / 0 9 5 5 3号には、 ァカガエル由 来の抗菌性ポリペプチドが記載されている。 また、 国際公開第 WO 0 1 Z O 0 9 1 7 5号には、 植物デフェンシン由来の修飾システィン含有抗菌性ポリペプチド が記載されている。
上記の各公報に記載の抗菌性ポリペプチドは、 何れも自然界において元々抗菌 性ポリべプチドとして存在していたものを発見し単離したもの （或いは天然型抗 菌性ポリペプチドのアミノ酸配列を一部改変したポリペプチド） である。 従って、 本来的に抗菌性ポリペプチドとして存在するペプチドを主成分とする限り、 自然 界において元来そのべプチドが奏していた抗菌活性や抗菌スぺク トルを上回る抗 2 菌性能を有する抗菌剤を開発することは困難である。 発明の開示
ここに開示される抗菌性ポリぺプチドは、 従前知られている抗菌性ポリぺプチ ドとは異なるアプローチにより開発されたポリペプチドである。 すなわち、 本発 明は、 き然界において抗菌性ポリぺプチドとして存在するぺプチドとは異なるぺ プチドに含まれるアミノ酸配列を利用して創出された、 天然に存在しない人為的 に合成された抗菌性ポリペプチドを提供する。 また、 本発明は、 ここに開示され る抗菌性ポリペプチドの製造方法を提供する。 さらに本発明は、 ここに開示され る抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び該配列を含む （典 型的にはそれら配列により実質的に構成される） 天然に存在しない人為的に合成 されたポリヌクレオチドを提供する。 さらには、 そのような抗菌性ポリペプチド 又は該ポリべプチドをコードするポリヌクレオチドを主成分とする抗菌剤 （薬学 上の組成物） を提供する。
ここで開示される抗菌性ポリペプチドは、 そのペプチド鎖中に、 1種類又は 2 種類以上の核移 ίί了性配歹 IJ ^nuclear localization signal sequence：以下、 N L Sという） 及び/又は該 N L Sに部分的な改変が施された配列を 1単位又は 2単 位以上含んでいる。 典型的には、 上記 1単位又は 2単位以上の N L S及び /又は N L Sの改変配列に包含されるアミノ酸残基 （即ち当該配列を構成するアミノ酸 残基） の総数は少なくとも 5であり、 且つ、 ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残 基数の 3 0 %以上 （好ましくは 4 0 %以上） に相当する。
N L Sは種々の生物種やウィルスから単離された核移行性配列であり、 本来は 細胞内で核に移行する種々のポリペプチド中に存在する部分的な配列である。 し かし、 本発明者は、 独立した形態の N L Sそれ自体が細菌等に対して抗菌性を有 することを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、 主要構成要素として N L Sを有することによ つて、 高い抗菌活性を発揮し得る。 特にグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対 して幅広い抗菌スぺク トルを有し得る。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、 好ましくは、 ペプチド鎖を構成する全ァミノ 酸残基数が 5以上 1 00以下である。 この程度の長さのポリべプチドであると、 高い抗菌活性を安定して発揮させることができる。 またべプチド鎖が比較的短い ために合成が容易であり、 経済的でもある。 また、 上記 NL S及び/又は NL S の改変配列に包含されるアミノ酸残基の総数がぺプチド鎖を構成する全アミノ酸 残基数の 90%以上 （例えば 100%) であるペプチドが特に好ましい。 かかる NL S主体のぺプチドは、 特に高い抗菌活性を有し得る。
また、 ぺプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 40%以上が塩基性アミノ酸 残基 （典型的にはアルギニン及びリジン） であることが好ましい。 塩基性ァミノ 酸残基数の存在比率が高いと、 より高い抗菌活性が得られ得る。
また、 好ましい一つの抗菌性ポリペプチドは、 上記 NL S及び ^ /又は NL Sの 改変配列が 2単位以上相互に近接して配置されていることを特徴とする。 一つの ペプチド鎖に NL Sが 2単位以上存在すると、 抗菌活性が向上する。 相互に隣接 してタンデムに存在するものが特に好ましい。
本発明によって提供される他の好ましい抗菌性ポリべプチドは、 NL Sの抗菌 活性を高め得る他の配列を含む。 このことに関し、 本発明者は核外移行性配列 (nuclear export signal sequence：以下、 N E Sとレヽう） として従来より知ら れていた配列が、 ぺプチドの抗菌活性を増大させることに寄与し得ることを見出 した。 従って、 NL S及び 又は NL Sの改変配列に加えて、 ペプチド鎖中に更 に NE S若しくは該 NE Sに部分的な改変が施された配列を少なく とも 1単位含 む抗菌性ポリべプチドが本発明によって提供される。
この態様の抗菌性ポリべプチドとして好ましいものは、 NE S又は NE Sの改 変配列の少なくとも 1単位が、 NL S又は NL Sの改変配列の N末端側又は C末 端側に近接して配置されていることを特徴とする。 NE S (又はその改変配列） と NL S (又はその改変配列） とが相互に隣接するポリペプチド （ペプチド鎖） は、 バクテリア、 特に黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌に対して高い抗菌 活性を発揮し得る。
また、 本発明は、 ここで開示される抗菌性ポリペプチドを主成分とする抗菌剤 (即ち薬学上の組成物） を提供する。 典型的には、 抗菌剤は、 用途に応じて、 主 成分たる本発明の抗菌性ポリべプチドの他に、 薬学的に許容され得る種々の担体 _
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(副成分） を含有し得る。
また、 本発明は、 ここで開示される抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列及び該配列と相補的なヌクレオチド配列を提供する。 さらに、 それらヌ クレオチド配列を含むか或いはそれら配列により実質的に構成される、 天然に存 在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド （D N Aセグメント又は R N Aセ グメントの形態であり得る） を提供する。
さらに本発明は、 ここで開示される抗菌性ポリぺプチドを好適に製造する方法 を提供する。 典型的には、 ここで開示される方法は、 核移行性配列 （N L S ) と して知られている 5アミノ酸残基以上から成るアミノ酸配列を少なくとも 1種類 選択すること、 該選択した N L S及び 又は該 N L Sに部分的な改変が施された 配列を 1単位又は 2単位以上含み、 該 1単位又は 2単位以上の N L S及び/又は N L Sの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数が全アミノ酸残基数の 3 0 %以 上 （好ましくは 4 0 %以上） となるようなペプチド鎖を設計すること、 ならびに、 該設計したべプチド鎖を有する抗菌性ポリぺプチドを合成することを包含する。 好ましい N L Sの部分的な改変方法として、 （a ) ネイティブな N L Sの非塩 基性アミノ酸残基を少なく とも一つ欠失させること、 （b ) ネイティブな N L S に少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基を付加させること、 および、 （c ) ネィ ティブな N L Sに含まれる少なく とも一つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミ ノ酸残基に置換すること、 等が挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1 (FIG. 1 ) は、 無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリぺプチ ドを含む試料をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動によって分画した結果を示す写 真である。
図 2 (FIG. 2 ) は、 無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリべプチ ドを MALDI- TOF MS を用いて解析した際に得られた分子イオンのピークを示すマ ススペク トルである。 横軸は質量電荷比 （m/z)、 縦軸は相対強度である。
図 3 (FIG. 3 ) は、 無細胞タンパク質合成システムにより合成したポリぺプチ ドを MALDI - TOF MS を用いて解析した際に得られたフラグメントイオンのピーク ^ 一
5 を示すマススぺク トルである。 横軸は質量電荷比 （m/z)、 縦軸は相対強度である。 図 4 (FIG. 4 ) は、 ここで開示された合成ポリヌクレオチドを市販の発現べク タ一（pET- 41a (+) )に挿入した状態を示す模式図である。
図 5 (FIG. 5 ) は、 組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセス によって精製した試料をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動によって分画した結果 を示す写真である。
図 6 (FIG. 6 ) は、 組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセス によって処理し、 精製した試料を逆相クロマトグラフで分析した結果を示すク口 マ トグラムである。 横軸はリテンションタイム （分）、 縦軸はピーク強度 ( μ V ) である。
図 7 (FIG. 7 ) は、 組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロセス によって精製したポリペプチドを MALDI-TOF MS を用いて解析した際に得られた 分子イオンのピークを示すマススぺク トルである。 横軸は質量電荷比 （m/z)、 縦 軸は相対強度である。
図 8 A (FIG. 8 A ) は、 組換え大腸菌由来の融合タンパク質をいくつかのプロ セスによって処理した試料を逆相クロマトグラフで分析した結果を示すクロマト グラムである。 横軸はリテンションタイム （分）、 縦軸はピーク強度 （// V ) で ある。 図 8 B (FIG. 8 B ) は、 化学合成したポリペプチド試料を逆相クロマトグ ラフで分析した結果を示すクロマトグラムである。 横軸はリテンションタイム (分）、 縦軸はピーク強度 （/z V ) である。 配列表フリーテキスト
配列番号 8 3 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 8 4 設計された抗菌性ポリべプチド。
配列番号 8 5 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 8 6 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 8 7 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 8 8 設計された抗菌性ポリべプチド。
配列番号 8 9 設計された抗菌性ポリペプチド。 配列番号 9 0 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 9 1 設計された抗菌性ポリベプチド。
配列番号 9 2 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 9 3 設計された抗菌性ポリべプチド。
配列番号 9 4 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 9 5 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 9 6 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 9 7 設計された抗菌性ポリべプチド。
配列番号 9 8 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 9 9 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 0 0 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 0 1 末端にアミ ド基を含む、 設計された抗菌性ポリペプチド。 配列番号 1 0 2 末端にアミ ド基を含む、 設計された抗菌性ポリペプチド。 配列番号 1 0 3 末端にアミ ド基を含む、 設計された抗菌性ポリペプチド。 配列番号 1 0 4 設計された抗菌性ポリべプチド。
配列番号 1 0 5 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 0 6 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 0 7 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 0 8 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 1 0 9 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 1 0 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 1 1 設計された抗菌性ポリべプチドの配列をコードする合成 D N A。
配列番号 1 1 2 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 1 3 設計された抗菌性ポリぺプチドの配列をコードする合成 D N A。
配列番号 1 1 4 設計された抗菌性ポリぺプチド。
配列番号 1 1 5 設計された抗菌性ポリべプチドの配列をコードする合成 D N
A。 ^ _
7 配列番号 1 1 6 設計された抗菌性ポリペプチド。
配列番号 1 1 7 プライマーとして使用される合成 DNA。
配列番号 1 1 8 プライマーとして使用される合成 DNA。
配列番号 1 1 9 プライマーとして使用される合成 DNA。
配列番号 1 20 プライマーとして使用される合成 DNA。
配列番号 1 2 1 設計された抗菌性ポリペプチドの配列をコードする合成 DN A。
配列番号 1 22 設計されたポリペプチド。
配列番号 1 23 合^ DNA。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において 「天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリべプチド 又はポリヌクレオチド」 とは、 そのペプチド鎖又はヌクレオチド鎖 （全長） がそ れ単独で自然界に存在するものではなく、 人為的に化学合成或いは生合成 （即ち 遺伝子工学に基づく生産） された抗菌性ポリべプチド又はポリヌク レオチドをい ラ。
「ポリペプチド」 とは、 複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す 用語であり、 ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。 ァ ミノ酸残基数が 1 0未満 （例えば全アミノ酸残基数が 5〜 7) の所謂オリゴぺプ チドも本明細書におけるポリべプチドに包含される。
「ポリヌクレオチド」 とは、 複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結 ばれたポリマー （核酸） を指す一般的な用語であり、 ヌクレオチドの数によって 限定されない。 種々の長さの DNAフラグメント及び RNAフラグメントがポリ ヌクレオチドに包含される。
「アミノ酸残基」 は、 特に言及する場合を除いて、 ペプチド鎖の N末端アミノ 酸及び C末端アミノ酸を包含する用語とする。
また、 本明細書において 「NL S」 または 「核移行性配列」 というときは、 特 に言及している場合を除き、 特定のアミノ酸配列に限定されず、 核移行性 （核局 在性） 配列として知られているアミノ酸配列全般を指す。 特に限定することを意 ^
8 図したものではないが、 NL Sとして知られるアミノ酸配列の典型例を本明細書 の配列表 （配列番号 1〜80) の欄に列記してある。
また、 本明細書において 「NE S」 または 「核外移行性配列」 というときは、 特に言及している場合を除き、 特定のアミノ酸配列に限定されず、 核外移行性配 列として知られているアミノ酸配列全般を指す。 特に限定することを意図したも のではないが、 NE Sの典型例が本明細書の配列表 （配列番号 8 1 , 8 2) に列 記してある。
NL S又は NE Sを含む抗菌性ポリペプチドについて、 「NL S (又は NE S) に部分的な改変が施された配列を含む抗菌性ポリペプチド」 とは、 所定の N L S (又は NE S) を含むポリペプチドが奏する抗菌性と実質的に同等又はそれ 以上の抗菌性を奏するように、 当該 NL S (又は NE S) の 1〜数個のアミノ酸 残基が修飾された配列 （例えば C末端アミノ酸のカルボキシル基がアミ ド化され た配列）、 或いは当該 NL S (又は NE S) について 1〜数個のアミノ酸残基が 置換、 欠失及び Z又は付加されて形成された改変 NL S (又は NE S) を含む抗 菌性ポリペプチドをいう。 例えば、 （i)所定の NL Sのうちの 1〜5個程度のァ ミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類アミノ酸置換 （conservative amino acid substitutions) によって生じた改変配列 （例えば 1個又は 2， 3個の塩基 性ァミノ酸残基がそれぞれ別の塩基性ァミノ酸残基に置換した配列）、 (ii)所定 の NL Sに 1〜 3程度のアミノ酸残基 （好ましくは塩基性アミノ酸残基） が付加 された改変配列、 （iii)所定の N L Sから 1〜 3程度のアミノ酸残基 （好ましく は非塩基性アミノ酸残基） が欠失した改変配列、 （iv)ネイティブな NL Sのアミ ノ末端にメチォニン残基 （ァミノ基がホルミル化された場合を含む） が付加され た改変配列等は、 本明細書でいう 「部分的な改変が施された配列を含む抗菌性ポ リペプチド」 に包含される典型例である。
また、 N L S及び NE Sについて 1単位 （unit) とは、 NL S又はNE Sを構 成する一つの配列を指す。 従って、 あるペプチド鎖に NL Sが 2単位含まれると いうときは、 それらが同種であるか異種であるかを問わず相互に独立して N L S (又は NE S) と認められる配列が当該ペプチド鎖中に二つ存在することを意味 する。 ^
9 以下、 本発明の好適な実施形態を説明する。 なお、 本明細書において特に言及 している事項 （例えば抗菌性ポリペプチドの一次構造や鎖長） 以外の事柄であつ て本発明の実施に必要な事柄 （例えばペプチド合成、 ポリヌクレオチド合成、 ぺ プチドを成分とする薬剤の調製に関するような一般的事項） は、 有機化学、 生化 学、 遺伝子工学、 タンパク質工学、 分子生物学、 薬学、 医学等の分野における従 来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。 本発明は、 本明細書に開 示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができ る。 本明細書中に引用された特許文献、 特許出願書類及び他の刊行物の全内容は 参考として本明細書中に組み入れられている。
なお、 以下の説明では、 ぺプチド鎖を構成するアミノ酸残基を IUPAC-IUBガイ ドラインで示されたァミノ酸に関する命名法に準拠した 1文字表記 （但し配列表 では 3文字表記） で表す。 また、 特に断らない限り、 N L Sと記す場合は、 上記 の定義に基づく 「部分的な改変が施された配列」 （即ち改変 N L S配列） が包含 されるものとする。 N E Sについても同様である。
本発明によって提供される抗菌性ポリペプチドは、 天然に存在しない人為的に 合成されたポリべプチドであり、 N L Sが組み込まれた又は N L Sのみから成る 一次構造を有する。 すなわち、 N L Sがー部分に含まれている天然の核移行性ポ リペプチド （ペプチド鎖） と比較して、 全体のアミノ酸配列に対する N L Sの占 める割合が著しく大きくなつている。 典型的には、 N L Sに包含されるアミノ酸 残基の総数は少なく とも 5アミノ酸 （7アミノ酸以上が好ましい） であり、 それ らアミノ酸残基の数はべプチド鎖全長を構成するアミノ酸残基の総数の実に 3 0 %以上 （好ましくは 4 0 %以上） である。 さらには、 ペプチド鎖を構成する全 アミノ酸残基数の 7 0 %以上が N L S部分に含まれるものが好ましく、 全ァミノ 酸残基数の 9 0 %以上が N L S部分に含まれるものが特に好ましい。
本発明の抗菌性ペプチドは、 全てのアミノ酸残基が L型アミノ酸であるものが 好ましいが、 抗菌活性を失わない限りにおいて、 アミノ酸残基の一部又は全部が D型ァミノ酸に置換されているものであってもよい。 例えばここで開示されるァ ミノ酸配列から成るポリべプチドを化学合成する場合において、 その一部又は全 部を D型アミノ酸残基で構成することができる。 ポリペプチドの鎖長 （換言すれ ^
10 ばアミノ酸残基数） は、 含有する NL Sや NE Sの長さに応じて異なり得るので 特に限定されないが、 5〜1 00個程度のアミノ酸残基で構成されるものが好ま しく、 7〜50個程度のアミノ酸残基で構成されるものがさらに好ましく、 9〜 30個程度のアミノ酸残基で構成されるもの （表 1参照） が特に好ましい。
ポリペプチドのコンホメーシヨン （立体構造） については、 使用する環境下で 抗菌性を発揮する限りにおいて、 特に限定されるものではないが、 免疫原 （抗 原） になり難いという観点から直鎖状又はへリ ックス状のものが好ましい。 この ような形状のポリペプチドはェピトープを構成し難い。 かかる観点から、 抗菌剤 に適用するポリペプチドとしては、 直鎖状であり比較的低分子量 （典型的には全 アミノ酸残基数： 5〜30、 好ましくは全アミノ酸残基数： 5〜20) のものが 好適である。 システィン残基を含まないか或いはその存在割合の小さいアミノ酸 配列が好ましい。
本発明のポリペプチドを構成するための NL Sとしては、 従来、 各種の生物や ウィルスから発見されたネイティブな NL Sの何れかを選択し、 その配列のまま 利用することができる。 具体例として配列番号 1〜配列番号 80にそれぞれ示さ れる NL Sが挙げられる。 塩基性ァミノ酸残基の含有率が高いものが好ましい。 例えば、 40%以上 （更に好ましくは 50%以上） のアミノ酸残基が塩基性アミ ノ酸残基 （リジン及び 又はアルギニン） であるものが好適である。 それらのう ちの 1種類又は 2種類以上の NL Sを含むポリべプチドが好ましい。
但し、 ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 40%以上に相当し且つ少な くとも 5個のアミノ酸残基が NL S部分に属するようにする。 5〜25個程度の アミノ酸残基で 1単位を構成する NL Sが好適である。 例えば、 RRMKWKK (配列番号 1)、 RVHPYQR (配列番号 2)、 P KKKRKV (配列番号 4)、 GKKRSKA (配列番号 5)、 RGRRRRQR (配列番号 7)、 RKKRRQ RRR (配列番号 20) 及び PRRRK (配列番号 26) のような 5アミノ酸残 基以上で構成される NL Sを 1単位又は 2単位以上含むポリべプチド （典型的に はァミノ酸残基の総数が 5〜 1 00 ) が好ましい。 斯かる N L S 1単位のみから 成るポリべプチドであってもよい。
一方、 RKRR (配列番号 27) のような、 1単位が 4アミノ酸残基以下の N ^
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L Sは、 それ 1単位のみでは本発明のポリペプチドを構成しない。 この場合には、 同種又は異なる NL Sと組み合わせ、 全体で 5ァミノ酸残基以上となるアミノ酸 配列を設計する。 すなわち、 1単位が 4アミノ酸残基以下の NL Sを 2単位以上 (典型的には 2単位、 3単位又は 4単位） 含むアミノ酸配列を設計するとよい。 例えば NL Sとして RKRR (配列番号 2 7) を選択した場合、 その配列を二単 位タンデムに繋いだ 8アミノ酸残基から成る配列 （RKRRRKRR) を設計す ることができる。
また、 利用可能なデータベース等の情報源から抗菌性ポリべプチドを構築する 為の NL Sを選択するにあたっては、 塩基性アミノ酸残基に富む NL Sを選択す ることが好ましい。 例えば、 全ァミノ酸残基数の 40 %以上、 好ましくは 50 % 以上、 特に好ましくは 70%以上がアルギニン残基及び Z又はリジン残基である
NL Sが好適な候補であり得る。
また、 2単位又は 3単位以上の NL Sを含むようにアミノ酸配列を設計する場 合、 好ましくは、 これら NL Sがペプチド鎖中で隣接して配置されるように設計 する。 この場合、 隣接する一方の NL Sの C末端アミノ酸と他方の NL Sの N末 端アミノ酸とが直接結合した形態 （後述する実施例参照） が好ましい。 しかし、 隣接する二つの NL Sの間にリンカーとして 1〜数個のァミノ酸残基が介在して もよい。
本発明の抗菌性ポリベプチドは、 1種又は 2種以上の N L Sのみで全体のァミ ノ酸配列が構成されているものであってもよいが、 抗菌性を失わない限りにおい て、 NL Sに含まれないアミノ酸残基 （アミノ酸配列） を含み得る。 特に限定す るものではないが、 NL S以外の部分配列としてはぺプチド鎖の直鎖形状を維持 し得る配列が好ましい。
また、 内在する NL Sの抗菌活性を高める作用効果を奏する別の配列を含むよ うにアミノ酸配列を設計することが好ましい。 上述のとおり、 この目的に好適な 配列の候補として NE Sが挙げられる。
典型的な1^£ 3の配列として ？？ 1^£1¾し丁し （配列番号 8 1)、 L A L K LAG LD I (配列番号 82) が挙げられる。 アミノ酸配列が既に知られている 種々の NE Sを NL Sと組み合わせることにより、 抗菌活性の高いポリぺプチド 一
12 を構築することができる。 好ましくは、 NE Sが NL Sの N末端側又は C末端側 に隣接するようにしてぺプチド鎖を構築する。 この形態のポリべプチドとしては、 例えば、 N末端側から NL S、 NESの順にタンデムに配置されたポリペプチド、 或いは、 N末端側から NE S、 NLSの順にタンデムに配置されたポリペプチド、 或いは、 N末端側から NL S、 NE S、 N L Sの順にタンデムに配置されたポリ ペプチド （この場合、 NE Sを挟んで N末端側 NL Sと C末端側 NL Sとは同種 でも異種でもよい。） が挙げられる。
本発明の抗菌性ポリべプチドを構成する NL Sや NE Sとして、 天然タイプ (native type) の配列のみならず、 抗菌性を損なわない限りにおいて、 種々の 部分的な改変が施された配列を用い得る。 換言すれば、 ネイティブな NL Sに好 適な改変を施した配列を含むアミノ酸配列 （ペプチド鎖） を設計することによつ て、 より高い抗菌活性を発揮し得るポリぺプチドを得ることができる。
この種の改変として、 典型的なものに、 配列中の 1〜3アミノ酸残基を同類置 換すること、 および、 ペプチド鎖 （NL S) の N末端にメチォニン残基を付加さ せること （設計したペプチド鎖を組換え DN A技術を用いて生合成する場合に好 適である。） が挙げられる。 これらの他、 抗菌活性を高めるために行う好適な改 変としては、 ネイティブな NL Sの非塩基性アミノ酸残基 （中性若しくは酸性ァ ミノ酸残基） を少なく とも一つ欠失させること、 ネイティブな NL Sに少なくと も一つの塩基性アミノ酸 （典型的にはアルギェン又はリジン） を付加させること、 および、 ネイティブな NL Sに含まれる少なくとも一つの非塩基性アミノ酸残基 を塩基性アミノ酸残基と置換すること、 が挙げられる。 また、 ペプチド鎖の C末 端アミノ酸のカルボキシル基をアミ ド化すること、 或いは N末端のアミノ基をァ シル化 （典型的にはァセチル化） することも好ましい改変である。
例えば、 7アミノ酸残基から成る典型的な NL Sである PKKKRKV (配列 番号 4) のプロリンを、 塩基性アミノ酸残基に置換した配列 RKKKRKV (配 列番号 83) を 1単位又は 2単位以上有するポリペプチドは、 本発明によって提 供される新規な抗菌性ポリべプチドの一つである。
このような改変配列から構成されたポリべプチドであって、 さらにその C末端 のカルボキシル基をアミ ド化した修飾ポリペプチド、 例えば RKKKRKV- 一 ―
13
C0NH2 (配列番号 1 0 2) や R KKKR K VR KKKR K V- C0NH2 (配列番号 1 03) は、 本発明によって提供される好適な新規の抗菌性ポリペプチドである。 本発明によって提供される新規なアミノ酸配列 （設計されたペプチド鎖） の具 体例として、 配列番号 8 3、 配列番号 84、 配列番号 85、 配列番号 86、 配列 番号 8 7、 配列番号 88、 配列番号 8 9、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番 号 92、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 95、 配列番号 96、 配列番号
97、 配列番号 98、 配列番号 99、 配列番号 1 00、 配列番号 1 0 1、 配列番 号 1 0 2、 配列番号 103、 配列番号 1 04、 配列番号 1 05、 配列番号 1 06、 配列番号 1 07、 配列番号 1 08、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 14及び配列番号 1 1 6に示されるアミノ酸配列 （又は該配 列の 1、 2又は数個のアミノ酸残基が置換 （同類置換等）、 欠失及び 又は付加 されたような改変配列） が挙げられる。 これらアミノ酸配列から実質的に構成さ れるポリペプチドは、 グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して高い抗菌活性 を有する （後述する実施例参照）。
これらポリペプチドは、 何れも 30アミノ酸残基以下 （具体的には 5〜28ァ ミノ酸残基） で構成されており、 直鎖形状を維持するのに好適である。 また、 免 疫原性も低いために抗菌剤の主成分 （抗菌成分） として好適である。
さらに、 配列番号 83、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 86、 配列番 号 87、 配列番号 88、 配列番号 89、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 92、 配列番号 93、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 96、 配列番号 9 7、 配列番号 98、 配列番号 99、 配列番号 1 00、 配列番号 10 1、 配列番号
102、 配列番号 1 03、 配列番'号 1 04、 配列番号 1 05、 配列番号 106、 配列番号 1 07、 配列番号 1 08、 配列番号 109、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 14及び配列番号 1 1 6の各々に示されるアミノ酸配列のう ちの 1種又は 2種以上のアミノ酸配列 （又は該配列の 1、 2又は数個のアミノ酸 残基が置換 （同類置換等）、 欠失及び 又は付加されたような改変配列） を含む 天然に存在しない人為的に合成されたポリペプチド （伹し、 全体で 1 00ァミノ 酸残基を越えない、 好ましくは全体で 50アミノ酸残基を越えない） が本発明に よって提供される。 _
14
上述のようにしてひとたびアミノ酸配列を設計しさえすれば、 そのアミノ酸配 列に従い、 従来公知の種々の方法でペプチド鎖 （即ち本発明の抗菌性ポリべプチ ド） を合成することができる。 例えば、 一般的な化学合成法に準じて容易に抗菌 性ポリぺプチドを製造することができる。 従来公知の固相合成法又は液相合成法 のいずれを採用 して も よい。 ァ ミ ノ 基の保護基と して B o c ( t- butyloxycarbonyl) Λ 或レヽは F m o c (9-fluorenylmethoxycarbonyl) ·¾τ適用し た固相合成法が好適である。
本発明の抗菌性ポリペプチ ドは、 市販のペプチ ド合成機 （PerSept ive Biosystems社、 Appl ied Biosystems社等から入手可能である。） を用いた固相合 成法により、 所望するアミノ酸配列、 修飾 （C末端アミ ド化等） 部分を有するぺ プチド鎖を容易に合成することができる。
或いは、 遺伝子工学的手法に基づいて本発明の抗菌性ぺプチドを生合成しても よい。 このアプローチは、 比較的鎖長の長いポリペプチドを製造する場合に好適 である。 すなわち、 所望する抗菌性ポリペプチド （N L Sをベースに設計したァ ミノ酸配列） をコードするように決定されたヌクレオチド配列 （典型的には A T G開始コドンを含む） を含むようにして D N A (構造遺伝子） を合成する。 この D N Aと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント (プロモータ 、 リボゾーム結合部位、 ターミネータ一、 ェンハンサー、 発現レ ベルを制御する種々のシスエレメントを包含する） とから成る発現用遺伝子構築 物を有する組換えベクターを、 宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、 この組換えベクターを所定の宿主細胞 （例えばィース ト、 昆虫細胞、 植物細胞、 哺乳類細胞） に導入し、 所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。 このことにより、 目的とするポリべプチ ドを細胞内で発現、 生産させることができる。 そして、 宿主細胞 （分泌された場 合は培地中） からポリペプチドを単離し、 精製することによって、 目的の抗菌性 ポリペプチドを得ることができる。 例えば、 宿主細胞内で効率よく大量に生産さ せるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。 すなわち、 目 的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子 （D N A ) を化学合成し、 該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター （例えばノバジェン社から ―
15 提供されている p E Tシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供さ れている ρ G E Xシリーズのような G S T (Glutathione S-transf erase)融合タ ンパク質発現用べクタ一） の好適なサイ トに導入する。 そして該ベクターにより 宿主細胞 （典型的には大腸菌） を形質転換する。 得られた形質転換体を培養して 目的の融合タンパク質を調製する。 次いで、 該タンパク質を抽出及び精製する。 次いで、 得られた精製融合タンパク質を所定の酵素 （プロテアーゼ） で切断し、 遊離した目的のペプチド断片 （設計した抗菌性ポリペプチド） をァフィ二テイク 口マトグラフィ一等の方法によって回収する。 このような従来公知の融合タンパ ク質発現システム （例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供される G S T / H i sシステムを利用し得る。） を用いることによって、 本発明の抗菌性ポ リぺプチドを製造することができる。
或いは、 無細胞タンパク質合成システム用の铸型 D N A (即ち抗菌性ポリぺプ チドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片、 後述 する実施例参照） を構築し、 ペプチド合成に必要な種々の化合物 （A T P R N Aポリメラーゼ、 アミノ酸類等） を使用し、 いわゆる無細胞タンパク質合成シス テムを採用して目的のポリべプチドをインビトロ合成することができる。 無細胞 タンパク質合成システムについては、 例えば Shimizu らの論文（Shimizu et al. , Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001) )、 Madin らの論文（Madin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2) , 559- 564 (2000) )が参考になる。 これら論 文に記載された技術に基づいて、 本願出願時点において既に多くの企業がタンパ ク質 （ポリペプチド） の受託生産を行っており、 また、 無細胞タンパク質合成用 キット （例えば、 日本の東洋紡績 （株） から入手可能な PR0TEI0S (商標） Wheat germ cel l-free protein synthesis kit; 市 |Rされ レヽる。
従って、 上述のようにしてひとたび抗菌性ポリべプチドのァミノ酸配列を決 定 '設計しさえすれば、 そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システ ムによって目的のポリペプチドを容易に生産することができる。 例えば、 日本の (株） ポス トゲノム研究所のピュアシステム （登録商標） に基づいて本発明のポ リぺプチドを容易に生産することができる。
本発明の抗菌性ポリべプチドをコードするヌクレオチド配列及びノ又は該配列 と相補的なヌクレオチド配列から実質的に構成される一本鎖又は二本鎖のポリヌ クレオチドは、 従来公知の方法によって容易に製造 （合成） することができる。 すなわち、 設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを 選択することによって、 抗菌性ポリべプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオ チド配列が容易に決定され、 提供される。 そして、 ひとたびヌクレオチド配列が 決定されれば、 D N A合成機等を利用して、 所望するヌク レオチド配列に対応す るポリヌクレオチド （一本鎖） を容易に得ることができる。 さらに得られた一本 鎖 D N Aを铸型として用い、 種々の酵素的合成手段 （典型的には P C R ) を採用 して目的の二本鎖 D N Aを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、 D N Aの形態であってもよく、
R N A (m R N A等） の形態であってもよい。 D N Aは、 二本鎖又は一本鎖で提 供され得る。 一本鎖で提供される場合は、 コード鎖 （センス鎖） であってもよく、 それと相補的な配列の非コード鎖 （アンチセンス鎖） であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、 種々の宿主細胞中で又は無細 胞タンパク質合成システムにて、 ポリペプチドを発現させるための組換え遺伝子
(発現カセット） を構築するための材料として使用することができる。
例えば、 本発明に係る抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有 するポリヌクレオチドと、 該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々 の調節エレメント （プロモーター、 リボゾーム結合部位、 ターミネータ ェン ハンサー、 発現レベルを制御する種々のシスエレメント等を包含する。） とを用 いて外来べプチド発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを構築することが できる。 ベクターの構成やその構築に使用される調節エレメントの種類は、 目的 とする宿主細胞のタイプに依存して異なり得る。 組換えベクターの構築には、 遺 伝子工学分野でよく理解されている種々の制限酵素によるポリヌクレオチド切断 技法 （restrict ion) やポリヌクレオチド断片連結技法 （l igation) が採用され る。 これら技法は、 市販されている種々の装置類を利用することによって容易に 行うことができる。
なお、 組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への 導入方法等は、 当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、 一 ―
17 かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、 詳細な説明は省略 する。 '
本発明によって提供されるポリヌクレオチドのいくつかは、 新規なァミノ酸配 列の抗菌性ポリべプチドをコ一ドする。
例えば、 以下の （a ) 及び （b) の要件を備えた抗菌性ポリペプチド：
(a) ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 5以上 1 0 0以下である ；
(b) 配列番号 8 3、 配列番号 8 4、 配列番号 8 5、 配列番号 8 6、 配列番号 8 7、 配列番号 8 8、 配列番号 8 9、 配列番号 9 0、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 9 6、 配列番号 9 7、 配 列番号 9 8、 配列番号 9 9、 配列番号 1 0 0、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 0 3、 配列番号 1 04、 配列番号 1 0 5、 配列番号 1 0 6、 配列番号 1 0 7、 配列番号 1 0 8、 配列番号 1 0 9、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 4及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なくとも 1種類のアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァ ミノ酸残基が置換、 欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含 む；
をコードするヌクレオチド配列及び 又は該配列と相補的なヌクレオチド配列. を含む （又はそれら配列から実質的に構成された）、 天然に存在しない人為的に 合成されたポリヌクレオチドが提供される。
また、 配列番号 8 3、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 8 6、 配列番号 8 7、 配列番号 8 8、 配列番号 8 9、 配列番号 9 0、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 9 6、 配列番号 9 7、 配列番号 9 8、 配列番号 9 9、 配列番号 1 00、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 0 3、 配列番号 1 04、 配列番号 1 0 5、 配列番号 1 0 6、 配列 番号 1 0 7、 配列番号 1 0 8、 配列番号 1 0 9、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 4及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配 列番号で示される少なく とも 1種類のァミノ酸配列又は該配列において 1〜数個 のアミノ酸残基が置換、 欠失及び 又は付加されて形成された改変アミノ酸配列 から実質的に構成される抗菌性ポリべプチドをコードするヌクレオチド配列及び ^
18
Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む （又はそれら配列から実質的に 構成された）、 天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチドが提供さ れる。
本発明の抗菌性ポリペプチドは、 比較的広い抗菌スペク トルを有しており、 抗 菌剤 （薬学上の組成物） の主成分として好適に用いられる。 例えば、 細菌感染症 の治療、 創傷面の消毒、 眼病予防、 口腔内洗浄 （うがい）、 食品の防腐や鮮度保 持、 脱臭、 家具や衛生機器表面の殺菌又は静菌等の目的に用いられ得る。
抗菌性ポリペプチドの他、 抗菌剤に含まれる担体すなわち副次的成分 （典型的 には製薬上許容されるもの） としては、 抗菌剤の用途や形態に応じて適宜異なり 得るが、 種々の充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 表面活性剤、 賦形剤、 色素、 香料等が挙げられる。
抗菌剤の形態に関して特に限定はない。 例えば、 内用剤若しくは外用剤の典型 的な形態として、 軟膏、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 エアロゾル、 泡沫剤、 顆粒剤、 粉 末剤、 錠剤、 カプセルが挙げられる。 また、 注射等に用いるため、 使用直前に生 理食塩水等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、 造粒物とすることもで きる。
なお、 抗菌性ポリペプチド （主成分） 及び種々の担体 （副成分） を材料にして 種々の形態の薬剤を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、 か かる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。 処方に関する詳細な情報源と して、 例えば Comprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修， Pergamon Press刊（1990)力 S挙げられる。
本発明によって提供される抗菌剤は、 その形態及び目的に応じた方法や用量で 使用することができる。 例えば、 液剤は、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内若しくは 腹腔内への注射或いは浣腸によって患者に投与することができる。 また、 錠剤等 の固体形態のものは経口投与することができる。 また、 衛生陶器表面の消毒 （殺 菌） や食品の防腐目的に使用する場合は、 比較的多量 （例えば l〜100mg/itil ) の ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、 或いは、 当該液 剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。 これらは例示にすぎず、 従来の ぺプチド系抗生物質やべプチドを構成成分とする農薬、 医薬部外品等と同じ形態、 ―
19 使用方法を適用することができる。
例えば、 放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者にとって、 細菌感染症 の予防及び治療は重大な関心事である。 本発明によって提供される抗菌性ポリべ プチドは、 細菌に選択的に抗菌作用を示し得る。 このため、 本発明に係る抗菌性 ポリペプチドは、 抗菌剤の主成分として有用である。
また、 本発明の抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 いわゆ る遺伝子治療に使用する素材として用い得る。 例えば、 抗菌性ポリペプチドをコ ードする遺伝子 （典型的には D N Aセグメント、 或いは R N Aセグメント） を適 当なベクターに組み込み、 目的とする部位に導入することにより、 常時生体 （細 胞） 内で本発明に係る抗菌性ポリペプチドを発現させることが可能である。 従つ て、 本発明によって提供される本発明の抗菌性ポリべプチドをコ一ドするポリヌ クレオチド （D N Aセグメント、 R N Aセグメント等） は、 上述した患者等に対 し、 細菌感染を予防し又は治療する薬剤として有用である。
再生医療の分野において、 皮膚、 骨、 各種の臓器の培養時の細菌感染を防止す ることは重要である。 本発明によって提供される抗菌性ポリペプチドは、 哺乳動 物細胞及び組織に対する毒性が極めて低く （後述する実施例参照）、 細菌に選択 的に抗菌作用を示す。 このため、 培養臓器等の細菌感染を防止する薬剤として極 めて有用である。 例えば、 後述する実施例に示すように、 適当な濃度で本発明の 抗菌性ポリべプチド単独又は当該ポリべプチドを主成分の一つとする抗菌剤を培 養液中に添加することにより、 培養中の臓器等の細菌感染を防止することができ る。
また、 培養細胞や培養組織に対して、 本発明の抗菌性ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。 例 えば、 本発明の抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子 （典型的には D N Aセグ メント又は R N Aセグメント） を適当なベクターに組み込み、 目的とする培養組 織に導入することにより、 常時或いは所望する時期に培養組織 （細胞） 内で本発 明に係る抗菌性ポリペプチドを発現させることが可能である。 従って、 本発明に よって提供される本発明の抗菌性ポリべプチドをコードするポリヌクレオチド ( D N Aセグメント、 R N Aセグメント等） は、 培養組織の細菌感染を防止する 一 ―
20 薬剤として有用である。 以下、 本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、 本発明をかかる実施例 に示すものに限定することを意図したものではない。
ぐ実施例 1 ：抗菌性ポリペプチドの化学合成 >
計 3 6種類のポリペプチド （サンプル 1〜3 3、 比較サンプル 1〜3 ) を後述 するペプチド合成機を用いて製造した。 表 1には、 これらポリペプチドのァミノ 酸配列を列挙している。
(以下余白）
n
丄 表 1 試料 No. アミノ酸配列 総ァミノ酸残基数 サンフ。レ 1 PK KRKV (配列番号 4) 7 サンフ'ル 2 RQARRNRRRRWR (配列番号 21 ) 12 サンフ'ル 3 RIRKKL (配列番号 43) 7 サンダル 4 PPRKKRTW (配列番号 28 ) 9 サンフ。ル 5 RKKRRQR R (配列番号 20 ) 9 サン ル 6 PRRRK ほ己列番号 26 ) 5 サンフ。ル 7 RKKKRKV (配列番号 83 ) 7 サンフ';レ 8 PKKKRKVLPPLERLTL (配列番号 84 ) 16 サン,；レ 9 LPPLERLTLPKKKRKV (配列番号 85 ) 16 サンフ'ル 10 ROARRNRRR WRLPPLERLTLD (配列番号 86 ) 22 サンフ 'ル 1 1 PKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV (配列番号 87) 23 サン,ル 1 2 RKKKRKVLPPLERLTL (配列番号 88 ) 16 サン ル 1 3 LPPLERLTLRK KRKV (配列番号 89 ) 16 サンフ。ル 14 RKKKRKVLALKLAGLDI (配列番号 90 ) 17 サンフ。ル 15 LALKLAGLDIRKKKR V (配列番号 91 ) 17 サンフ レ 16 PKKKRKVPKKKRKV (配列番号 92) 14 サンフ。レ 17 RIRKKLRRIRKKLR (配列番号 93 ) 1 サンフ°ル 18 PRRRKPRRRK (配列番号 95 ) 10 サンフ';レ 1 9 P K KVPPRKK TW (配列番号 97 ) 16 サン;°ル 20 RKKKRKVRKKKRKV (配列番号 98 ) 14 サン,ル 21 RKKKRKVRKKKRKVRKKKRKV (配列番号 99 ) 21 サン,ル 22 RKKKRKVR KRKV KK RKVRKKKRKV ほ己列番号 100) 28 サン ル 23 PRRRK (配列番号 101) 5 サン,ル 24 RKKKRKV (配列番号 102) 7 サン,ル 25 RKKKRKVRKKKRKV (配列番号 103) 14 サンフ'ル 26 PKKKRRV (配列番号 104) 7 サン,ル 27 LKRKLQR (配列番号 50 ) 7 廿1ンフ° 1レ 9 S RKKKRKWKRKKKR (配列番号 105) 14 サン,ル 29 RKKKRKVKRKKKR (配列番号 106) 13 サンフ'ル 30 L RKLO LK KLOR (配列番号 107) 14 サンフ レ 31 PKKKRKVALGKLALGKL (配列番号 108) 17 サンフ° 32 RQARRNRRRRWRIAGKI (配列番号 109) 17 サンフ 33 MRKKKRKVRKKKRKV (配列番号 1 10) 15 比較サンフ'ル 1 RKRR (配列番号 27 ) 4 比較サンフ' 'レ 2 LPPLERLTL (配列番号 8 1 ) 9 比較サンフ'ル 3 LALKLAGLDI (配列番号 82 ) 10 表 1に記すサンプル 1〜 6及び 27は、 各々異なるネイティブタイプの N L S 1単位のみから成るポリべプチドである。
サンプル 7は、 サンプル 1のアミノ酸配列 （PKKKRKV:配列番号 4) における N 末端アミノ酸のプロリンをアルギニンに置換した改変配列 （RKKKRKV:配列番号 8 3) から成るポリペプチドである。
サンプル 8〜1 1は、 NL Sと一般的な NE Sとをタンデムに連結した配列か ら成るポリペプチドである。 すなわち、 サンプル 8では、 NL S (PKKKRKV:配列 番号 4) の C末端側に NE S (LPPLERLTL：配列番号 8 1 ) が隣接している。 逆 にサンプル 9では、 NE S (LPPLERLTL： 配列番号 8 1 ) の C末端側に N L S (PKKKRKV:配列番号 4 ) が隣接している。 サンプル 1 0では、 N L S (RQARRNRRRRWR:配列番号 2 1 ) の C末端側に N E S (LPPLERLTL：配列番号 8 1) が隣接しており、 更にその C末端にはァスパラギン酸が一つ付加している。 サンプル 1 1では、 N L S (PKKKRKV:配列番号 4 ) の C末端側に N E S ( LPPLERLTL ： 配列番号 8 1 ) が隣接し、 さ らにその C末端側に N L S (PKKKRKV:配列番号 4) が隣接している。
サンプル 1 2〜 1 5は、 サンプル 7の改変 N L S (RKKKRKV:配列番号 8 3 ) と 一般的な NE Sとを連結した配列から成るポリペプチドである。 すなわち、 サン プル 1 2では、 改変 N L S (RKKKRKV:配列番号 8 3 ) の C末端側に N E S (LPPLERLTL：配列番号 8 1 ) が隣接している。 逆にサンプル 1 3では、 NE S (LPPLERLTL：配列番号 8 1 ) の C末端側に改変 N L S (RKKKRKV:配列番号 8 3) が隣接している。 サンプル 14では、 改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3) の C末端側に別の NE S (LALKLAGLDI：配列番号 82) が隣接している。 逆にサ ンプル 1 5では、 N E S (LALKLAGLDI：配列番号 82 ) の C末端側に改変 N L S (RKKKRKV:配列番号 8 3) が隣接している。
サンプル 1 6〜22及び 30は、 N L S又は改変 N L Sを 2単位以上連結した 配列から成るポリペプチドである。 すなわち、 サンプル 1 6では、 N L S (PKKKRKV:配列番号 4 ) が 2単位連結している。 サンプル 1 7では、 N L S (RIRKKLR:配列番号 43) が 2単位連結している。 サンプル 1 8では、 5ァミノ 酸残基から成る NL S (PRRRK:配列番号 26) が 2単位連結している。 サンプル 一
23
30では、 NL S (LKRKLQR:配列番号 50) が 2単位連結している。 サンプル 1 9では、 二つの異なる NL S (PKKKRKV:配列番号 4及び PPRKKRTVV:配列番号 2 8) が 1単位ずつタンデムに連結している。
また、 サンプル 20、 2 1及び 22は、 各々、 上記改変 NL S (RKKKRKV:配列 番号 83) が 2単位、 3単位及び 4単位連結したものである。
サンプル 23は、 NL S (PRRRK:配列番号 26) の C末端アミノ酸のカルボキ シル基がアミ ド化されたものである。
サンプル 24は、 上記改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3) の C末端アミノ酸 のカルボキシル基がアミ ド化されたものである。
サンプル 25は、 上記改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3) を 2単位連結した 配列 （RKKKRKVRKKKRKV:配列番号 98 ) の C末端アミノ酸のカルボキシル基がァ ミ ド化されたものである。
サンプル 26は、 サンプル 1のアミノ酸配列 （PKKKRKV:配列番号 4) の N末端 側から第 6番目のアミノ酸残基 「リジン」 を 「アルギニン」 に同類置換した配列 (PKKKRRV:配列番号 104) から成るポリペプチドである。
サンプル 28は、 サンプル 7の改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3) の C末端 側に塩基性アミノ酸に富む 7アミノ酸残基を付加したポリペプチドである。 具体 的には、 改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3 ) を反転させた配列 （VKRKKKR) を 付加した。
サンプル 29は、 サンプル 7の改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3 ) の C末端 側に全て塩基性アミノ酸である 6アミノ酸残基 （KRKKKR) を付加したポリべプチ ドである。
サンプル 3 1は、 サンプル 1の NL S (PKKKRKV:配列番号 4) の C末端側に 1 0アミノ酸残基 （ALGKLALGKL) を付加したポリペプチドである。
サンプル 3 2は、 サンプル 2の NL S (RQARRNRRRRWR:配列番号 2 1 ) の C末 端側に 5アミノ酸残基 （IAGKI) を付加したポリペプチドである。
サンプル 33は、 サンプル 7の改変 NL S (RKKKRKV:配列番号 8 3) を 2単位 連結し、 さらにその N末端側にメチォニン残基を付加したポリべプチドである。 本実施例では、 後述する抗菌活性に関して上記各サンプルのポリべプチドの比 ―
24 較対照とするため、 本発明の範疇に属しないポリべプチドを 3種類合成した。
すなわち、 比較サンプル 1は、 4アミノ酸残基から成る短い N L S (RKRR :配 列番号 2 7 ) 1単位のみから成るポリペプチドである。
また、 比較サンプル 2及び 3は各々異なる N E S (LPPLERLTL：配列番号 8 1、 LALKLAGLDI：配列番号 8 2 ) 1単位のみから成るポリペプチドであり、 N L Sを 含まない。
上述した各ポリペプチド （個々のアミノ酸配列は表 1及び配列表を参照） は、 市販のぺプチド合成機 （PEPTIDE SYNTHESIZER 9050、 PerSeptive Biosystems 社 製品） を用いて固相合成法 （F m o c法） により合成した。 なお、 縮合剤として H A T U (Appl ied Biosystems 社製品） を使用し、 固相合成法に用いた樹脂及 びアミノ酸は NOVA biochem 社から購入した。 アミノ酸配列の C末端をアミ ド化 する場合には、 固相担体として 「Rink Amide resin (100〜200mesh)」 を使用し た。
而して、 上記べプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合 反応を反復して樹脂に結合する Fmoc—アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、 目的の鎖長の合成ペプチドを得た。 具体的には、 2 0 %ピぺリジン Zジメチルホ ルムアミ ド（DMF) (ペプチド合成用グレード、 関東化学 （株） 製品） によって、 アミノ酸のァミノ保護基である Fmoc を切断除去し、 D M Fで洗浄し、 Fmoc—ァ ミノ酸（-0H)各 4 e qを反応させ、 D M Fで洗浄する操作を反復した。 そして、 ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、 2 0 %ピぺリジン/ D M Fにより Fmoc基を切断し、 D M F、 メタノールの順で上記反応物を洗浄した。
固相合成後、 合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、 エタンジオール 1 . 8 m L、 m—クレゾ一ノレ 0 . 6 m L、 チオア-ソール 3 . 6 m L及びトリフノレ ォロ酢酸 2 4 m Lを加え、 室温で 2時間撹拌した。 その後、 ペプチド鎖に結合し ていた樹脂を濾過して除去した。
次いで、 濾液に冷却エタノールを加え、 水冷水で冷却してペプチド沈澱物を得 た。 その後、 遠心分離 （2500rpm で 5分間） によって上澄みを廃棄した。 沈殿物 に冷ジェチルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、 上記と同じ条件で遠心 分離を行った。 この撹拌と遠心分離の処理を計 3回反復して行った。 一 ―
25 得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、 高速液体クロマトグラフ （Waters 600： Waters社製品） を用いて精製を行った。
具体的には、 プレカラム （S本 Waters (株） 製品、 Guard-Pak Deltapak C18 A300) 及び C 1 8逆相カラム （和光純薬工業 （株） 製品、 Wakopak WS-DHA 4.6 X 150mm 0DS-C18) を使用し、 0. 1 %トリフルォロ酢酸（TFA)水溶液と 0. 1 %ト リフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。 すなわち、 溶 離液に含まれる上記トリフルォロ酢酸ァセ トニトリル溶液の分量を経時的に増大 させつつ （容積比で 1 0%から 8 0%への濃度勾配を設ける）、 1. 5mL/分 の流速で上記カラムを用いて 3 0〜4 0分間の分離精製を行った。 なお、 逆相力 ラムから溶離したペプチドは紫外線検出器 （490E Detector： Waters 社製品） を 用いて波長： 2 2 0 nmで検出され、 記録チヤ一ト上にピークとして示される。 また、 溶離した各ポリペプチドの分子量を PerSeptive Biosystems 社製の Voyager DE RP (商標） を用レヽて MALDI-T0F MS ( Matrix-Assisted baser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry： マトリ ックス支援レーサー^! オン化—飛行時間型一質量分析）に基づいて決定した。 その結果、 目的のポリぺ プチドが合成 ·精製されていることが確認された。
<実施例 2 ：合成ポリペプチドの抗菌活性〉
本発明に係る抗菌性ポリペプチド （サンプル 1〜 3 3) 及び比較サンプル 1〜 3のポリペプチドについて、 グラム陰性細菌 （大腸菌 ： coif) 及びグラム陽 性細菌 （黄色ブドウ球菌 ： 5. aureus) に対する抗菌活性 （最小阻止濃度 ： M I C) を 9 6穴（well)マイクロプレートを用いた液体培地希釈法により求めた。
すなわち、 ポリぺプチド濃度が 5 0 0、 2 5 0、 1 2 5、 6 2. 5、 3 1. 3、 1 5. 6、 7. 8、 3. 9、 1. 9、 1. 0及び 0. 5 Mとなる液体肉汁培地 (DIFC0社製品 「NUTRIENT BROTH Dehydratedj) をそれぞれ作成し、 9 6穴マイ クロプレートに充填した。 一方、 LB Broth, Lennox (DIFC0 社製品） で 1 8時間, 3 7 °Cにて静置培養した菌液 （約 2 X 1 06cells/mL) を、 薬剤溶液 （上記ポ リペプチド含有肉汁培地） と等量、 9 6穴マイクロプレートの各ゥエル（well)に 接種した。 接種後、 3 7°Cの恒温器内で培養を開始し、 2 4時間後及び 4 8時間 一
26 後の濁度により菌発生の有無を調べた。 その計測時における菌による濁度の増加 が認められない最小ポリぺプチド濃度を本実施例における M I Cと定めた。
かかる抗菌試験に基づく各サンプル及び比較サンプルの抗菌活性 （M I C) を 表 2に示す。 なお、 表 2の M I Cの単位は μΜである。
(以下余白）
表 2 抗菌活性 ( u M)
coli s aureus 試料 No. 4 8 胡 ί O ?4時間後 48時間後 サンフ°ル 1 62.5 >500 62.5 125.0 サンフ' Jレ 2 3.9 3.9 ■j . Q 3.9 サンフ'ル 3 62.5 62.5 . j 62.5 サンフ'ル 4 ?50.0 >500 125.0 サン,ル 5 1 Q j . 1 J.0 15.6 サン, 'レ 6 リリ > on JU.U 500.0 サン, 'レ 7 ^πο n 1 J.D 31.3 サシズレ 8 ' 1
J L .J ■J j.y 3.9 サンフ'ル 9 31.3 31.3 3.9 3.9 サンフ。ル 1 0 j.y 1
j . Q 1.9 3.9 サンズ;レ 1 1 i .y 1.9 1.9 サンフ レ 1 2 1 J .O 3.9 3.9 サンフ 'ル 1 3 1 r.O £ 丄3 3.9 3.9 サンフ。ル 1 4 Π n 1.0 1.9 サン ル 1 5 j.y j .y 1.9 3.9 サンフ'ル 1 6 1 i . oy 7.8 15.6 サン ル 1 7 Λ Q 3.9 3.9 サン, 'レ 1 8 0 Q η /.δ 7.8 サンフ レ 1 9
Figure imgf000029_0001
3.9 Q 7.8 サンフ'ル 2 0 1.9 1.9 1.9 1.9 サンフ。ル 2 1 1.9 1.9 U. J 0.5 サン,ル 2 2 1.9 1.9 *リ 1.0 サン,ル 2 3 31.3 31.3 7,8 15.6 サンフ°ル 2 4 3.9 15.6 1 ο 1.0 サンフ'；レ 2 5 T, 9 3 9 1 Q 1.9 サンフ'ル 2 6 62.5 500.0 1 π 125.0 サンフ'ル 2 7 500.0 >500 125.0 125.0 サンフ'ル 2 8 1.0 1.0 3.9 7.8 サンフ。 /レ 2 9 1.0 1.0 3.9 7.8 サンフ°ル 3 0 3.9 3.9 3.9 3.9 サン,；レ 3 1 7.8 7.8 3.9 7.8 サンフ'ル 3 2 3.9 3.9 1.9 1.9 サン,ル 3 3 3.9 3.9 1.9 1.9 比較サンフ'ル 1 >500 >500 >500 >500 比較サンフ° レ 2 >500 >500 >500 >500 比較サンズル 3 >500 >500 >500 >500 ^
28
表 2に示す結果から明らかなように、 本発明に係るポリペプチド （サンプル 1 〜3 3) は、 比較対照のポリペプチド （比較サンプル 1〜3) と比べ、 いずれも 高い抗菌活性を示した。
NL Sと NE Sとが近接して配置されているポリペプチド （サンプル 1 0, 1 4， 1 5等） ではグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のいずれに対しても高い抗 菌活性が認められた。 そして、 NL Sが 2単位又はそれ以上タンデムに配置され ているポリペプチド （例えばサンプル 1 6〜 22) において、 特に高い抗菌活性 が認められた。
また、 NL S又は改変 NL Sを 1単位以上含み、 且つ、 塩基性アミノ酸残基に 富む （好ましくは 8以上有する） ポリペプチド （例えばサンプル 2， 5， 1 6〜 22, 28， 29) 力 特に高い抗菌活性を示した。 また、 C末端がアミ ド化さ れたポリペプチド （サンプル 24) は、 C末端がアミ ド化されていない同配列の ポリペプチド （サンプル 7) よりも高い抗菌活性を示すことが確かめられた。 表 2に示す結果より、 本発明に係る抗菌性ポリぺプチドが優れた抗菌活性と広 い抗菌スペク トルとを有することが確かめられた。
<実施例 3 ：抗菌スぺク トル〉
次に、 サンプル 1 6， 1 7， 1 0， 14及び 20のポリペプチドについて実施 例 2と同様の抗菌試験 （MI C測定試験） を種々の細菌 （表 3参照） を対象にし て行い、 これらポリペプチドの抗菌スペク トルを評価した。 その結果、 表 3に示 すように、 本発明の抗菌性ポリペプチドは、 広範囲のグラム陽性細菌およびダラ ム陰性細菌に対して抗菌活性を有することが確かめられた。
(以下余白） 表 3
Figure imgf000031_0001
<実施例 4 ：哺乳動物に対する安全性試験〉
哺乳動物細胞に対する毒性試験を以下のように行った。
すなわち、 A172 (ヒ ト神経膠腫） 細胞を前日に 96穴プレー トの 1ゥエル当た り 8 X 103個ずつまき、 3 7°Cで 50/。CO2の条件下、 静置培養した。 次の日、 培地を除去し、 ？85で1回洗浄後、 ポリペプチド （サンプル 1 ~ 26のいずれ 力、） を 0 0. 5 5 25 50 100 200 400 gZm lの濃度 で含む無血清培地 （血清無添加の GIBCO ERL 社製培地 「RPMI1640」） をゥエル当 たり 1 0 Ο μ 1ずつ添加した （ 1試料当たり ゥエル数 （η) = 1又は 2)。 その 後、 上記と同様の条件で 24時間静置培養した。
培養終了後、 培地を除去し、 ？83で1回洗浄した。 次いで、 5%WS T— 8 (細胞増殖測定用試薬： キシダ化学 （株） 製品） を含む GIBCO BRL社製 DMEM 培地 （1 0%FB S含有） をゥヱル当たり 1 00 1ずつ添加し、 上記と同様の 条件で 1時間静置培養した。 その後、 プレートリーダーを用い、 主波長 45 O n m、 参照波長 600 nmとして吸光度を測定した。 ポリペプチド 0 g /m l (即ち無添加） の試料の吸光度値を 1 00%とし、 各ポリペプチド濃度における 一
30 相対的細胞生存率を求めた。 ここで、 ポリペプチド濃度 1 00 μ gZm 1におけ る相対的細胞生存率が 8 0 %以上のものを 「毒性なし」、 8 0%未満のものを 「毒性あり」 とした。 その結果、 いずれのポリペプチド （サンプル 1〜26) に ついても 「毒性なし」 であった。
また、 サンプル 1 0， 1 2, 1 3, 14， 1 5及び 20を各々含む計 6種類の ペプチド含有注射液 （溶媒：生理食塩水） を調製した。 これらをそれぞれマウス に腹腔内注射し、 LD5。ィ直を求めた。
その結果、 ここで試験した抗菌性ポリペプチドの LD5。は、 いずれも 1 50m g/k gより大きかった。 すなわち、 本発明に係る抗菌性ポリペプチドの哺乳動 物に対する毒性が極めて低いことが確かめられた。
<実施例 5 ：顆粒剤の調製 >
サンプル 20のポリべプチド 5 'Omgと結晶化セルロース 5 Omg及ぴ乳糖 4 00m gとを混合した後、 エタノールと水の混合液 1 mLを加え混練した。 この 混練物を常法に従って造粒し、 抗菌性ポリべプチドを主成分とする顆粒剤を得た。 く実施例 6 ：抗菌性ポリペプチドの遺伝子工学的合成 （1) >
市販の核酸合成機 （Applied Biosystems 社製品 「AB I 3900」） を使用マ ニュアルに準じて使用して、 配列表の配列番号 1 1 1、 1 1 3及び 1 1 5に示す ヌクレオチド配列から成る一本鎖 DNAを合成した。 また、 それら DNAに基づ いて二本鎖 DNAを形成するためのプライマーとして、 1種類のフォヮ一ドプラ イマ一 （配列番号 1 1 7) 及び 3種類のリバースプライマー （配列番号 1 1 8、 1 1 9及び 1 20) を化学合成した。 なお、 配列番号 1 1 8、 1 1 9及び 1 20 の各リバースプライマーは、 それぞれ、 配列番号 1 1 1、 1 1 3及び 1 1 5に示 す配列の二本鎖 D N Aを合成するために使用される。
そして、 これらプライマーを使用した一般的なポリメラーゼ連鎖反応 （例えば 「 PCR Protocols: Current Methods and Applications, White 、 Humana Press 刊（1993)の記述が参考になる。） により、 配列表の配列番号 1 1 1、 1 1 3及び 1 1 5に示すヌクレオチド配列を含む二本鎖 DNAを合成した。 ^ ^
31 これら配列番号 1 1 1、 1 1 3及び 1 1 5に示す二本鎖 DN Aは、 それぞれ、 配列番号 1 1 2、 1 14及び 1 1 6に示すアミノ酸配列の抗菌性ポリペプチドを コードしており、 そのコード領域の上流側 （5， 末端側） にプロモータ配列を有 し、 下流側 （3 ' 末端側） に終止コ ドンを有している。
次に、 Shimizu らの論文（Shimizu et al. , Nature Biotechnology, 19， 751- 755(2001))に記載されるプロ トコルに準じて、 配列番号 1 1 5に示すヌクレオチ ド配列の D N Aを铸型にして無細胞タンパク質合成システム （無細胞発現システ ム） によって、 アミノ酸配列が MPKKKRKVL P P L ER LT L PKKKR KV (配列番号 1 1 6) のポリペプチドを合成した。
すなわち、 以下の成分： 9mM酢酸マグネシウム、 5mMリン酸カリウム、 9 5 mMグルタミン酸カリウム、 5 mM塩化アンモニゥム、 0. 5 mM塩化カルシ ゥム、 I mMスペルミジン、 8mMプト レツシン、 I mMジチオトレイ ト一ル (DTT), 2mMの ATP、 2mMの GT P、 I mMの CT P、 I mMの UT P、 1 0 mMリ ン酸ク レアチン、 2. 8ユニッ ト （A26。） の t RNA混合物 (Roche 社製品）、 0. 5 ;z gの 1 0—ホルミル一 5 , 6， 7, 8—テトラヒ ド 口葉酸、 0. ImMの各アミノ酸、 1 2ピコモルのリボソーム、 及び H i s— t a g付きの各種酵素及びファクタ一類 （即ち、 1 8の開始因子 1 ( I F 1)、 2 /i gの I F 2、 0. 7 5 /z gの I F 3、 1 /i gの伸長因子一 G (EF— G)、 2 /x gの E F— Tu、 l gの EF_T s、 0. 5 // gの終結因子 1 (RF 1 )、 0. 5 x gの RF 3、 0. の RRF、 それぞれ 30〜 300ユニッ トのァ ミノァシル— t RN Aシンテターゼ （計 20種類） 及びメチォ二ルー t RN Aト ランスフォーミラーゼ、 0. 2 /i gのク レアチンキナーゼ （Roche 社製品）、 0. 1 5 / gのミオキナーゼ （Sigma 社製品）、 0. 0 54 μ gのヌク レオシドージ ホスフェートキナーゼ、 0. 1ユニッ トのピロホスファターゼ （Sigma 社製品） 及ぴ 0. 5 8の丁 7 RNAポリメラーゼ） ；
を含む反応液 50 / l (pH7. 3) を調製した。 この反応液を 3 7 °Cで 5分 間インキュベートした。 その後、 上記铸型 DNAをこの反応液に添加し、 3 7°C で 1時間インキュベートした。 その後、 反応液を氷中に移すことにより、 ぺプチ ドの合成反応を停止させた。 次いで、 反応液を限外濾過用デバイス （Atnicon (登録商標） Centricon (登録 商標） YM- 100 デバイス、 ミ リポア社製品） に装填して遠心分離し、 溶出液を回 収した。 次いで、 回収液を Ni- NTAァガロース （Qiagen社製品） を用いたァフィ 二ティクロマトグラフィーにより精製した。 そして、 この精製液を SD S— PA GEに供することにより、 目的のポリペプチドが合成されていることを確認した。 すなわち、 回収した精製液 （目的のペプチドを含む。） の一部を 1 5 2 5% のアクリルアミ ド濃度勾配のあるポリアクリルアミ ドゲルに載せ、 300 Vで 5 0分間の電気泳動を行った。 尚、 このゲルには、 最終的な精製液の他に、 上述し たペプチド合成反応直後即ち上記 37°C1時間ィンキュベーシヨン直後の反応液 の一部、 および、 上記限外濾過後の溶出液の一部も同時に載せた。 また、 ネガテ イブコントロールとして、 上記铸型 DNA (配列番号 1 1 5) を添加しないこと を除いて同様のプロセスを実施して得た上記 3 7°C 1時間ィンキュベーション直 後の反応液、 上記限外濾過の溶出液および上記精製液を同じゲルに載せた。 さら に、 別途ペプチド合成機 （上述の PEPTIDE SYNTHESIZER 9050) で合成した配列 番号 1 16のポリぺプチド （MPKKKRKVL P P LERLTL PKKKRK V) を同じゲルに載せた。
電気泳動後、 蛍光染色剤 （アマシャムバイオサイエンス （株） 製品 ： SYPR0 (商標） Orange) を含む染色液 （7. 5 %酢酸） にゲルを 40分間浸漬し、 ゲル 中に含まれるペプチドのバンドを染色した。 その後、 7. 5%酢酸中にゲルを漬 けて余剰の染色剤を除去した。 そして、 アマシャムフアルマシア （株） 製品のィ メージアナライザー （商品名 「Typhoon」） を使用して解析した （励起波長： 5 3 2 nm、 蛍光フィルター ： 580 B P 30)。 結果 （染色後のイメージ） を図 1 に示す。 図 1に示すレーン 1は、 アマシャムバイオサイエンス （株） 製品の LM Wマーカー （製品名 ： LMW Marker Kit、 製品コード： 17-0446-01) の泳動パター ンを示しており、 レーン下流側から約 14. 4 k D a 20. l kD a 3 0 k D a 45 kD a 66 kD a 97 k D aのバンドがみられる。 レーン 2は、 アマシャムバイオサイエンス （株） 製品のペプチドマーカーキッ ト （製品名 ： Peptide Marker Kit, 製品コード： 80-1129-83) の泳動パターンを示しており、 レーン下流側から約 6. 2 kD a 8. 2 kD a及ぴ 1 0. 7 kD a 14. 4 k D a 1 6 . 9 k D aのバンドがみられる。 レーン 3及びレーン 4は、 それぞ れ、 铸型 D N Aを含む場合と含まない場合の上記ぺプチド合成反応直後の反応液 の泳動パターンを示している。 また、 レーン 5及びレーン 6は、 それぞれ、 铸型 D N Aを含む場合と含まない場合の上記限外濾過の溶出液の泳動パターンを示し ている。 また、 レーン 7は、 铸型 D N Aを含む場合の Ni- NTA ァガロースを流通 した上記精製液の泳動パターンを示している。 レーン 8は、 ペプチド合成機によ つて合成した目的配列のポリペプチド （配列番号 1 1 6 ) の泳動パターン （7 0 n g / 3 . 4 μ 1 ) を示している。 レーン 9は、 鎵型 D N Aを含まない場合の Ni-NTA ァガロースを流通した上記精製液の泳動パターンを示している。 なお、 レーン 1 0は、 同様の無細胞タンパク質合成システム （上記 Shimizuらの論文参 照） によって合成し、 同様のプロセスで精製した後のジヒ ドロ葉酸還元酵素 （D H F R ) の泳動パターンを示している。
図 1から明らかなように、 レーン 3 5及び 7 (矢印参照） には、 レーン 8 (矢印参照） と同じ位置に明確なバンドが存在している。 このバンドは、 鍩型 D N Aを添加していないレーン 4 6及び 9には認、められない。
次に、 上記ゲルを乾燥後、 レーン 7の目的のバンド （図 1において矢印で示し たバンド） を切り出し、 アマシャムバイオサイエンス社製のマトリックス支援ィ オン化—飛行時間型質量分析装置（MALDI- TOF MS： 商品名 「Voyager RPdej )を用 レヽて、 ホリへ 7テドの PMF 分析 (Peptide Mass Finger printing analysis)を τ つた。 その結果、 図 2に示すような分子イオンのピークが認められた。 観察され たピークの質量数 （[Μ+Η] +=2939. 94 [Μ+2Η] 2+=1470. 49 ) は、 計算上の質量数 ( [Μ+Η] +=2939. 89 [Μ+2Η] 2+=1470. 45) とほぼ一致していた。 また、 Ν末端及び /又は C末端が分解されたべプチド或いは側鎖に修飾を受けたアミノ酸残基を有 するぺプチドの存在を示すピークは認められなかった （但し Ν末端のメチォニン のアミノ基は正常にホルミル化されている。）。
次に、 上記 MALDI-TOF MS を P S Dモードで運転して P S D (post-source decay) 解析 （即ち TOF MS内を飛行中にフラグメント化した励起分子イオンを検 出する方法） を行った。 その結果、 図 3に示すようなフラグメントイオンのピー クを得た。 かかる解析により、 レーン 7の目的のポリペプチドのアミノ酸配列は、 ^
34
N末端から順に M-P-(K/Q)-(K/Q)- (K/Q)-R-(K/Q)- V- (L/I)と同定された。 この結 果は、 配列番号 1 1 6のポリぺプチドのァミノ酸配列 MPKKKRKVLと一致する。 以上の結果から、 鍀型 DNAを用いると、 上述の無細胞タンパク質合成システ ムによって、 本発明の抗菌性べプチドが容易に合成 ·製造し得ることが確かめら れた。
<実施例 7 ：抗菌性ポリペプチドの遺伝子工学的合成 （2) >
組換え DNA技法を用いて目的のポリペプチド （上述のサンプル 1 7) の配列 を含む G S Τ融合タンパク質 （Glutathione S-transferase/His-Tag 融合タンパ ク質） を大腸菌内で発現させ、 回収した GST融合タンパク質を酵素で消化して 目的のポリペプチド （断片） を分離 '精製した。
先ず、 市販の核酸合成機 （Applied Biosystems 社製品 「AB I 3 900」） を 使用マニュアルに準じて使用して、 配列番号 1 2 1及び 1 23に示す互いに相補 するヌクレオチド配列から成る一本鎖 DNAをそれぞれ合成した。 次いでこれら DN Aをアニーリングして二本鎖 DN Aを得た。 配列番号 1 2 1が本実施例に係 るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列であり、 配列番号 1 23がその 相補配列である。 この合成ポリヌクレオチドにコ一ドされているポリぺプチドの アミノ酸配列を、 配列番号 1 2 1及び配列番号 1 22に示している。 このアミノ 酸配列は、 上述のサンプル 1 7 (配列番号 93) のアミノ酸配列と、 その N末端 側に配置された 1つのメチォニン残基、 6つの連続するヒスチジン残基及び 1つ のグルタミン酸残基とから構成されている。 メチォニン残基は後述する融合タン パク質が不溶性として発現した場合に融合 GST部分から目的のァミノ酸配列部 分を臭化シアン切断できるようにするために挿入されている。 また、 6個のヒス チジン配列は、 融合 GSTを切断後に目的のポリペプチド （断片） をァフィニテ ィ回収するためのタグ部分である。 さらにヒスチジンに隣接するグルタミン酸残 基は、 目的のポリべプチドからタグ部分を切り取るために挿入されている。
配列番号 1 2 1に示す配列から明らかなように、 この合成ポリヌクレオチドの 両端 （即ちメチォニンに対応するコ ドンの上流及び終始コ ドンの下流） にはそれ ぞれ制限酵素 EcoRI及び Pstl の認識サイ トが含まれている。 この二本鎖 DN A を制限酵素 EcoRI 及び Pstl で切断した。 制限酵素消化物をァガロースゲル電気 泳動に供し、 両端に EcoRI¾l断サイ ト及び Pstl切断サイ トを有する DNA断片 を精製した。
次に、 図 4に示すように、 ノバジェン（Novagen)社から購入した G S T融合タ ンパク質発現ベクター（pET-41a(+)DNA：カタログ No.70556- 3)を制限酵素 EcoRI 及び Pstlで切断し、 EcoRI及び Pstlサイ トに上記二本鎖 DN A (配列番号 1 2 1) をライゲーシヨン （挿入） した。 なお、 使用した GST融合タンパク質発現 ベクター 「pET-41a(+)」 （全ヌクレオチド配列： 5933bp) のクローニング 発現 領域の詳細なマップはノバジェン（Novagen)社のカタログに詳細に記載してある。
ライグーショ ン処理したプラスミ ドを用いてコンビテントセル （E. coli JM109) を形質転換した。 得られた形質転換体をカナマイシンを含む L B培地 (Km+) を用いて 37°Cで培養し、 その培養物から上記二本鎖 DNAが挿入さ れたプラスミ ドで形質転換されたクローンを単離した。 このクローンを培養し、 その培養物から上記二本鎖 DNAが挿入されたプラスミ ドを単離 '回収した。 次 に、 回収した組換えプラスミ ドを使用し、 融合タンパク質高発現用大腸菌 (E. coli BL21(DE3))を形質転換した。 得られた形質転換体を L B培地 （Km+) を用いて 3 7°Cで培養し、 その培養物から上記二本鎖 DN Aが挿入されたプラス ミ ドで形質転換されたクローンを単離した。
次に、 上記単離したクローンを L B培地 （Km+) 3 リ ッ トルを用いて 3 0°C で培養した。 OD6。。が 0. 9のときに I PTGを終濃度 0. 5 mMとなるよう に添加し、 融合タンパクの産生を誘導した。 そして 6時間後に培養液を遠心分離 し、 約 1 1. 6 gの菌体 （ウエッ ト状態） を回収し、 凍結保存した。
後日、 凍結保存菌体を約 1 00m 1の P B Sに懸濁し、 20 %の TritonX-100 を最終濃度 1 %となるように添加した。 この懸濁液に超音波処理を施して菌体を 破砕した後、 遠心分離を行って上清約 1 1 0m l を回収した。 この上清を 1 m 1 容量のグノレタチオンセファロース（Glutathione Sepharose) 4 Bカラムにァプラ ィし、 1 %TritonX-100 を含む P B Sでカラム内を洗浄し、 更に PB Sで洗浄し た。 次いで、 1 0 mM還元型グルタチオンを含む 50 mMTris-HCl(pH8.0)を力 ラムに流し、 目的の融合タンパク質をカラムから溶出した。 これにより、 約 60 ^ ^
36 m gの融合タンパク質を得た。
次に、 回収した融合タンパク質溶液をトロンビンで処理した。 すなわち、 融合 タンパク質溶液に所定力価のトロンビン （即ち融合タンパク質 20 μ gあたり約 0. 0 1 U) を添加し、 20で一晩放置した。 この反応により、 融合タンパク質 を GST部分と目的のァミノ酸配列を含むぺプチド部分とに分断した。
このタンパク質分解酵素処理溶液を次いでグルタチオンセファロース 4 Bカラ ムにアプライし、 そのパス画分を回収した。 更にカラムを 1 %TritonX- 100 を含 む PB Sで洗浄し、 その一部 （初期の溶出画分） も回収した。 そして、 この回収 液を SD S— PAGEに供することにより、 目的のポリべプチドが回収されてい ることを確認した。 すなわち、 回収した精製液 （目的のペプチドを含む。） の一 部を 1 5〜25%のァクリルアミ ド濃度勾配のあるポリアクリルアミ ドゲル （マ ルチゲル 1 5 25 ：第一化学 （株） 製品） に載せ、 3 OmAで約 2時間の電気 泳動を行った。 その結果を図 5に示す。 ゲルのレーン Mはペプチドマーカ (Bench ark Protein Ladder, Invitrogen 社製品） の泳動パターンであり、 レ ーン 1は上記トロンビン処理前の融合タンパク質溶液の泳動パターンであり、 レ ーン 2はトロンビン処理後のタンパク質溶液の泳動パターンであり、 レーン 3は 上記カラムからのパス画分の泳動パターンであり、 レーン 4及び 5は上記カラム を洗浄した洗浄液を回収した画分の泳動パターンである。 なお、 レーン 6〜 1 1 は、 上記カラムから分取した溶出画分の泳動パターンである。 図示されるように、 レーン 2〜5において、 G S Tと分離した目的のアミノ酸配列 （配列番号 1 2 2) を含むペプチドフラグメントのバンドが認められた。
次に、 これら回収物を透析用パックに入れ、 0. 1M炭酸水素アンモニゥム (PH8.0)で透析した。 その後、 パック内の液を回収し、 エンドプロテアーゼ G 1 u— Cを適量添加した炭酸水素アンモニゥム緩衝液 （PH 7. 8) 中で 3 7°C、 1 8時間の酵素処理 （切断処理） を行った。 その後、 酵素処理液を回収し、 逆相 高速液体クロマトグラフィーに供した。 即ち、 サイズが 4. 6 X 2 50mmの逆 相カラム （Wakosil- II 5C18 HG：和光純薬工業 （株） 製品） に酵素処理液をァプ ライし、 日本分光 （株） の R P— HP L C (JASCO Pump System, ポンプ： PU_ 980、 UV検出器： UV-970) を用いて、 A溶液： 0. 05 vol% T F A含有蒸留水、 B液： 0. 05 vol%T F A含有 9 Ovol%ァセトニトリル溶液、 グラジェント ： 1 00 % 液→ 100 %B液、 40分）、 フローレ一ト ： 1 m 1 /分の条件で逆 相クロマトグラフィーを行った。 その結果、 溶出開始から概ね 20分経過した時 期にカラムから溶出してきた画分に目的のぺプチドフラグメントとみられるピー クを検出した （図 8A)。 すなわち、 このピークの位置 （溶出時期） は化学合成 品 （サンプル 1 7). のポリべプチド （0. l mgZm 1のサンプル 100 μ 1 ) を同カラムにアプライして同じ条件で溶出した場合と同じであった （図 8 Β)。 次いで、 当該ピーク画分を分取し、 さらに逆相クロマトグラフィーに供した。 即ち、 サイズが 4. 6 X 1 5 Ommの逆相カラム （Lichrospher RP- 18： Agilent Technologies 社製品） に上記分取した酵素処理液をアプライ し、 日本分光 (株） の R P— HP LC (JASCO Pump System, ポンプ： PU-980、 UV検出器： UV-970) を用いて、 A溶液 ： 0. 1 5 vol%T F A含有蒸留水、 B液 ： 0. 1 vol%T F A含有ァセ トニ ト リル、 グラジェント ： 1 00 %八液→ 50 %A液 50%B液、 40分）、 フローレート ： 1 m】ノ分の条件で、 逆相クロマトグラ フィーを行った。 その結果、 図 6に示すように、 溶出開始から概ね 20分経過し た時期にカラムから溶出してきた画分に目的のぺプチドフラグメントとみられる シングルピークを検出した。 さらに、 このピーク画分に含まれるペプチドの分子 量を PerSeptive Biosystems社製の Voyager DE RP (商標） を用いて MALDI- T0F MS に基づいて決定した （図 7)。 その結果、 決定された分子量（1920.78)はアミ ノ酸配列に基づく理論上の分子量（1920.51)と同等であった。
次に、 上述した実施例 2と同様の方法により、 上記逆相クロマトグラフィーに よって精製されたポリペプチドの抗菌活性 （MI C) を調べた。 結果を表 4に示 す。
表 4
抗菌活性 （μΜ)
料 E. coli S. aureus
24時間後 48時間後 24時間後 48時間後 精製ホ Ίへ' ,チド 3.9 3.9 3.9 7.8 サン ル 17 (化学合成品） 3.9 3.9 3.9 3.9 比較サンフ'ル 1 〉500 〉500 〉500 〉500 比較サンフ。ル 2 〉500 〉500 〉500 〉500 表 4に示す結果から明らかなように、 組換え大腸菌から分離精製したポリぺプ チドは、 比較対照のポリペプチド （上記実施例 2における比較サンプル 1及び 2 ) と比べ、 高い抗菌活性を示し、 その M I C値は化学合成によって製造した同 じアミノ酸配列のポリペプチド （上述のサンプル 1 7 ) と同程度であった。 以上、 本発明の具体例を詳細に説明したが、 これらは例示にすぎず、 請求の範 囲を限定するものではない。 請求の範囲に記載の技術には、 以上に例示した具体 例を様々に変形、 変更したものが含まれる。
また、 本明細書に説明した技術要素は、 単独であるいは各種の組み合わせによ つて技術的有用性を発揮するものであり、 出願時請求項記載の組み合わせに限定 されるものではない。 また、 本明細書に例示した技術は複数目的を同時に達成す るものであり、 そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つ ものである。

Claims

WO 03/091429 ― ― PCT/JP03/0522S
39 請求の範囲
1. 天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリべプチドであって、
そのペプチド鎖中に 1種類又は 2種類以上の核移行性配列 （NL S) 及び/又 は該 N L Sに部分的な改変が施された配列を 1単位又は 2単位以上含んでおり、 該 1単位又は 2単位以上の NL S及び Z又は NL Sの改変配列に含まれるアミ ノ酸残基の総数は、 少なくとも 5であり且つべプチド鎖を構成する全ァミノ酸残 基数の 30%以上である、 抗菌性ポリペプチド。
2. ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 1 00以下である、 請求項 1に記 載のポリペプチド。
3. ベプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 40%以上が塩基性アミノ酸残基 である、 請求項 1又は 2に記載のポリペプチド。
4. 前記 N L S及び Z又は NL Sの改変配列が 2単位以上相互に近接して配置さ れている、 請求項 1〜 3のいずれかに記載のポリぺプチド。
5. 前記 NL S及び Z又は NL Sの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数がぺ プチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 90%以上である、 請求項 1〜4のいず れかに記載のポリべプチド。
6. ペプチド鎖中に、 少なく とも 1単位の核外移行性配列 （NE S) 若しくは該 NE Sに部分的な改変が施された配列を含む、 請求項 1に記載のポリべプチド。 7. 前記 NE S又は NE Sの改変配列の少なく とも 1単位は、 前記 NL S又は N L Sの改変配列の N末端側又は C末端側に近接して配置されている、 請求項 6に 記載のポリべプチド。
8. 天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリべプチドであって、 配列番号 83、 配列番号 84、 配列番号 8 5.、 配列番号 86、 配列番号 8 7、 配列番号 88、 配列番号 89、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配 列番号 93、 配列番号 94、 配列番号 95、 配列番号 96、 配列番号 9 7、 配列 番号 98、 配列番号 99、 配列番号 1 00、 配列番号 10 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 03、 配列番号 1 04、 配列番号 1 0 5、 配列番号 106、 配列番号 107、 配列番号 1 08、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 4及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なく とも 1種類のアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァ ミノ酸残基が置換、 欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含 み、
該少なく とも 1種類のァミノ酸配列又は改変ァミノ酸配列に含まれるアミノ酸 残基の総数がぺプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 3 0%以上である、 抗菌 性ポリべプチド。
9. ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 1 0 0以下である、 請求項 8に記 載のポリべプチド。
1 0. 天然に存在しない人為的に合成された抗菌性ポリペプチドであって、 配列番号 8 3、 配列番号 8 4、 配列番号 8 5、 配列番号 8 6、 配列番号 8 7、 配列番号 8 8、 配列番号 8 9、 配列番号 9 0、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配 列番号 9 3、 配列番号 9 4、 配列番号 9 5、 配列番号 9 6、 配列番号 9 7、 配列 番号 9 8、 配列番号 9 9、 配列番号 1 0 0、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 0 3、 配列番号 1 04、 配列番号 1 0 5、 配列番号 1 0 6、 配列番号 1 0 7、 配列番号 1 0 8、 配列番号 1 0 9、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 4及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なく とも 1種類のアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァ ミノ酸残基が置換、 欠失及び 又は付加されて形成された改変ァミノ酸配列から 実質的に構成される、 抗菌性ポリペプチド。
1 1. ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸残基がァミ ド化されている、 請求項 1〜 1 0 のいずれかに記載のポリぺプチド。
1 2. 請求項 1〜1 1のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドと、 薬学的に許容 され得る担体とを含む、 抗菌剤。
1 3. 請求項 1〜8のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレ ォチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、 天然に存在し ない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
1 4. 以下の （a ) 及び （b) の要件を備えた抗菌性ポリペプチド：
(a) ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 5以上 1 0 0以下である ； (b) 配列番号 83、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 86、 配列番号 8
7、 配列番号 8 8、 配列番号 89、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 9 6、 配列番号 9 7、 配 列番号 98、 配列番号 9 9、 配列番号 100、 配列番号 1 01、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 03、 配列番号 104、 配列番号 1 05、 配列番号 1 06、 配列番号
107、 配列番号 1 08、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 14及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なく とも 1種類のアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァ ミノ酸残基が置換、 欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列を含 む；
をコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列 を含む、 天然に存在しない人為的に合成されたポリヌクレオチド。
1 5. 配列番号 83、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 86、 配列番号 8 7、 配列番号 88、 配列番号 8 9、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 9 6、 配列番号 9 7、 配 列番号 98、 配列番号 9 9、 配列番号 100、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 03、 配列番号 104、 配列番号 105、 配列番号 10 6、 配列番号 107、 配列番号 108、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 14及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なく とも 1種類のアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァ ミノ酸残基が置換、 欠失及び Z又は付加されて形成された改変アミノ酸配列から 実質的に構成される抗菌性ポリべプチドをコードするヌクレオチド配列及び Z又 は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、 天然に存在しない人為的に合成さ れたポリヌクレオチド。
1 6. 請求項 1〜1 0のいずれかに記載の抗菌性ポリペプチドをコードするヌク レオチド配列。
1 7. 配列番号 8 3、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 86、 配列番号 8 7、 配列番号 88、 配列番号 8 9、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 9 2、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 96、 配列番号 9 7、 配 列番号 98、 配列番号 9 9、 配列番号 100、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 02、 配列番号 1 03、 配列番号 1 04、 配列番号 10 5、 配列番号 1 06、 配列番号
1 07、 配列番号 1 08、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 14及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示されるアミノ酸配列又は該配列において 1〜数個のァミノ酸残基が置換、 欠失及び/又は付加されて形成された改変アミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列。
1 8. 抗菌性ポリペプチドを製造する方法であって、
核移行性配列 （NL S) として知られている 5アミノ酸残基以上から成るアミ ノ酸配列を少なく とも 1種類選択すること、
該選択した NL S及び 又は該 NL Sに部分的な改変が施された配列を 1単位 又は 2単位以上含み、 該 1単位又は 2単位以上の NL S及び 又は NL Sの改変 配列に含まれるアミノ酸酸基の総数が全ァミノ酸残基数の 30 %以上となるよう なべプチド鎖を設計すること、
該設計したべプチド鎖を有する抗菌性ポリぺプチドを合成すること、
を包含する方法。
1 9. 前記 N L Sの部分的な改変は、 以下の （a) 〜 （c) ：
(a) ネイティブな NL Sの非塩基性アミノ酸残基を少なくとも一つ欠失させる こと ；
(b) ネイティブな NL Sに少なく とも一つの塩基性アミノ酸残基を付加させる こと ；および
(c) ネイティブな NL Sに含まれる少なく とも一つの非塩基性ァミノ酸残基を 塩基性アミノ酸残基に置換すること ；
のうちの少なくとも一つの処置を包含する、 請求項 1 8に記載の方法。
20. 配列番号 83、 配列番号 84、 配列番号 8 5、 配列番号 86、 配列番号 8 7、 配列番号 88、 配列番号 89、 配列番号 90、 配列番号 9 1、 配列番号 92、 配列番号 9 3、 配列番号 94、 配列番号 9 5、 配列番号 96、 配列番号 9 7、 配 列番号 98、 配列番号 9 9、 配列番号 1 00、 配列番号 1 0 1、 配列番号 1 0 2、 配列番号 1 03、 配列番号 1 04、 配列番号 1 0 5、 配列番号 1 06、 配列番号 1 07、 配列番号 1 08、 配列番号 1 09、 配列番号 1 1 0、 配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 4及び配列番号 1 1 6から成る群から選択されるいずれかの配列番 号で示される少なく とも 1種類のァミノ酸配列を使用して前記べプチド鎖の設計 を行う、 請求項 1 8に記載の方法。
2 1. ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 100以下となるように該ぺプ チド鎖を設計する、 請求項 1 8〜20のいずれかに記載の方法。
22. 全ァミノ酸残基数の 40%以上がアルギユン及び/又はリジンで構成され るようなペプチド鎖を設計する、 請求項 1 8〜2 1のいずれかに記載の方法。
23. 前記 NL S及び/又は NL Sの改変配列が 2単位以上相互に近接して配置 されるペプチド鎖を設計する、 請求項 1 8〜22のいずれかに記載の方法。
24. 前記 NL S及び/又は NL Sの改変配列に含まれるアミノ酸残基の総数が ぺプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数の 90%以上となるように、 該ぺプチド 鎖を設計する、 請求項 18〜23のいずれかに記載の方法。
25. 化学合成法によって前記べプチド鎖を有する抗菌性ポリべプチドを製造す る、 請求項 1 8〜 24のいずれかに記載の方法。
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