CN1650005B - 抗菌性多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自然中不存在的人工合成抗菌性多肽及以该多肽为主成分抗菌剂。该多肽的肽链中含有1单位或2单位以上的1种或2种以上的核定位信号序列NLS和/或对该NLS实施局部变异的序列,该1单位或2单位以上的NLS和/或NLS的变异序列中所含氨基酸残基的总数至少为5个,且占构成肽链的全部氨基酸残基数的30%以上。
Description
技术领域
本发明涉及含有自然中不存在的形态的独立肽链结构的抗菌性多肽以及以该多肽为主成分的抗菌剂(药用组合物)。
背景技术
据悉,抗菌性多肽具有很宽的抗菌谱,难以出现抗药性菌,因此,有望用于以人类和动物的细菌感染性疾病的预防和治疗和赋予食材等物品抗菌性为目的的抗菌性多肽的应用。迄今为止,从动植物中已分离出众多抗菌性多肽。
例如,在日本特开2000-63400号公报中,就揭示了源自台湾甲虫的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而日本特开2001-186887号公报则揭示了源自蝎毒的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而国际公开WO98/51794号公报则揭示了源自防卫素总科之一的人类抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而国际公开WO99/26971号公报中则揭示了源自酪蛋白的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂(具体有牙膏、口腔清洁剂等口腔用组合物)。而国际公开WO00/09553号公报则揭示了源自蛙科动物的抗菌性多肽。另外,国际公开WO01/009175号公报揭示了源自植物防卫素的含修饰半胱氨酸的抗菌性多肽。
上述各公报中所述的抗菌性多肽,都是在发现自然界所固有的抗菌性多肽后,从中分离出来的抗菌性多肽(或天然抗菌性多肽的氨基酸序列局部变异抗菌性多肽)。因此,只要是以固有的抗菌性多肽而存在的肽为主成分,就难以开发出具有超过自然界固有的肽所起到的抗菌活性和抗菌谱的抗菌性能的抗菌剂。
发明内容
本发明所揭示的抗菌性多肽是利用不同于已知的抗菌性多肽的工艺开发出的多肽。即,本发明提供利用不同于自然界中所存在的抗菌 性多肽的肽中所含的氨基酸序列创造出的自然中不存在的人工合成抗菌性多肽。本发明还提供上述抗菌性多肽的制造方法。并提供对上述抗菌性多肽编码的多核苷酸序列和含该序列(典型例为基本上由该序列构成)的自然中不存在的人工合成多核苷酸。还有以该抗菌性多肽或对该多肽进行编码的多核苷酸为主成分的抗菌剂(药用组合物)。
本发明所揭示的抗菌性多肽,其肽链中含1单位或2单位以上的1种或2种以上的核定位信号序列(下称NLS)和/或该NLS序列局部变异的序列。典型例为,上述1单位或2单位以上的NLS和/或NLS变异序列所含氨基酸残基(即构成本发明序列的氨基酸残基)的总数至少为5个,且相当于构成肽链的全部氨基酸残基的30%以上,优选为40%以上。
NLS是由各生物种和病毒中分离出的核定位信号序列,是原本存在于向细胞内移动的各种肽中的部分序列。而本发明人发现独立形态的NLS本身对细菌等有抗菌性,从而实现本发明。
本发明的抗菌性多肽因含有主要构成要素的NLS,从而表现出高抗菌活性。特别是对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有广谱抗菌性。
本发明的抗菌性多肽优选为,构成肽链的所有氨基酸残基数大于等于5,小于等于100。多肽达到该长度左右,就能表现出稳定的高抗菌活性。且由于肽链较短,易于合成,所以经济效益好。更优选为上述NLS和/或NLS变异序列中所含氨基酸残基总数占构成肽链的全部氨基酸残基数的90%以上(例如100%)的肽。该NLS主体的肽具有极高的抗菌活性。
且优选为,构成肽链的全部氨基酸残基数的40%以上为碱性氨基酸(典型例为精氨酸和赖氨酸)。碱性氨基酸残基数的存在比例高,则可达到更高的抗菌活性。
而优选之一的抗菌性多肽的特征在于,上述NLS和/或NLS变异序列有2单位以上相接近。一个肽链中存在2单位以上的NLS,则抗菌活性提高。更优选为相邻串接。
本发明所提供的其它优选抗菌性多肽,含可提高NLS的抗菌活性的其它序列。关于这一点,本发明人发现核转出信号序列(下称NES)的现有已知序列有望增大肽的抗菌活性。因此通过本发明提供增加 NLS和/或NLS的变异序列,在肽链中至少含有1单位NES或对该NES实施部分变异序列的抗菌性多肽。
这种方式的抗菌性多肽优选为,特征为NES或NES变异序列的至少1单位配置于接近NLS或NLS变异序列的N末端侧或C末端侧。NES或其变异序列和NLS或其变异序列相邻接配置的多肽(肽链)表现出对细菌,特别是金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的高抗菌活性。
且本发明还提供以所述抗菌性多肽为主成分的抗菌剂(即药用组合物)。就典型抗菌剂而言,根据用途,除作为主成分的本发明的抗菌性多肽之外,还可含有可药用的各种载体(辅料)。
本发明提供对所述抗菌性多肽编码的核苷酸序列及与该序列互补的核苷酸序列。还提供含这些核苷酸或基本上由这些序列构成的自然中不存在的人工合成多核苷酸(可以DNA片段或RNA片段形式存在)。
本发明还提供适于制造所述抗菌性多肽的方法。本发明所揭示的典型方法包括:选择至少1种包括已知是核定位信号序列(NLS)的5氨基酸残基以上的氨基酸序列;设计含1~2单位的所选NLS和/或NLS局部变异序列,且含于该1~2单位的所选NLS和/或NLS局部变异序列中的氨基酸残基总数占全部氨基酸残基数的30%以上、优选为40%的肽链;以及合成具有该设计而成的肽链的抗菌性多肽。
NLS局部变异的优选方法,可以举出(a)使天然NLS非碱性氨基酸残基中的至少1个缺失;(b)至少添加1个碱性氨基酸残基至天然NLS;及(c)将NLS中所含非碱性氨基酸残基中的至少1个置换为碱性氨基酸残基。
附图说明
图1为用丙烯酰胺凝胶电泳对含有无细胞蛋白质合成系统合成的多肽的样品分级的结果照片。
图2为用MALDT-TOF MS解析由无细胞蛋白质合成系统合成的多肽时所得分子离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z),纵轴为相对强度。
图3为用MALDT-TOF MS解析由无细胞蛋白质合成系统合成的多肽时所得片段离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z),纵轴为相对强度。
图4为向市售表达载体(pET-4la(+))插入本发明的合成多核苷酸的示意图。
图5为用丙烯酰胺凝胶电泳对以一道或多道工序精制源自重组大肠杆菌的融合蛋白而得的样品进行分级的结果照片。
图6为以一道或多道工序处理源自重组大肠杆菌的融合蛋白所得精制样品的逆相色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分),纵轴为峰强(μV)。
图7为用MALDT-TOF MS解析以一道或多道工序精制源自重组大肠杆菌的融合蛋白而得的多肽时所得分子离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z),纵轴为相对强度。
图8A为以一道或多道工序处理源自重组大肠杆菌的融合蛋白所得精制样品的逆相色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分),纵轴为峰强(μV)。图8B为化学合成多肽样品的逆向色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分),纵轴为峰强(μV)。
序列表列表:
序列号83 设计出的抗菌性多肽;
序列号84 设计出的抗菌性多肽;
序列号85 设计出的抗菌性多肽;
序列号86 设计出的抗菌性多肽;
序列号87 设计出的抗菌性多肽;
序列号88 设计出的抗菌性多肽;
序列号89 设计出的抗菌性多肽;
序列号90 设计出的抗菌性多肽;
序列号91 设计出的抗菌性多肽;
序列号92 设计出的抗菌性多肽;
序列号93 设计出的抗菌性多肽;
序列号94 设计出的抗菌性多肽;
序列号95 设计出的抗菌性多肽;
序列号96 设计出的抗菌性多肽;
序列号97 设计出的抗菌性多肽;
序列号98 设计出的抗菌性多肽;
序列号99 设计出的抗菌性多肽;
序列号100 设计出的抗菌性多肽;
序列号101 末端含氨基的设计出的抗菌性多肽;
序列号102 端含氨基的设计出的抗菌性多肽;
序列号103 末端含氨基的设计出的抗菌性多肽;
序列号104 设计出的抗菌性多肽;
序列号105 设计出的抗菌性多肽;
序列号106 设计出的抗菌性多肽;
序列号107 设计出的抗菌性多肽;
序列号108 设计出的抗菌性多肽;
序列号109 设计出的抗菌性多肽;
序列号110 设计出的抗菌性多肽;
序列号111 对设计出的抗菌性多肽序列编码的合成DNA;
序列号112 设计出的抗菌性多肽;
序列号113 编码设计出的抗菌性多肽序列的合成DNA;
序列号114 设计出的抗菌性多肽;
序列号115 对设计出的抗菌性多肽序列编码的合成DNA;
序列号116 设计出的抗菌性多肽;
序列号117 用作引物的合成DNA;
序列号118 用作引物的合成DNA;
序列号119 用作引物的合成DNA;
序列号120 用作引物的合成DNA;
序列号121 对设计出的抗菌性多肽序列编码的合成DNA;
序列号122 设计出的多肽;
序列号123 合成DNA。
具体实施方式
本发明的“自然中不存在的人工合成抗菌性多肽或多核苷酸”是指自然界中不单独存在全长的该肽链或核苷酸链,而是通过人工化学合成或生物合成(即根据遗传工程生成)该抗菌性多肽或多核苷酸。
“多肽”这一术语是指具有多个肽键的氨基酸聚合物,不受限于肽 链所含氨基酸残基数,氨基酸残基数小于10(例如全部氨基酸残基数5~7)的低聚肽也属于本发明所述的多肽。
“多核苷酸”这一常用术语是指多个核苷酸通过磷酸二酯键结合而成的聚合物(核酸),不受限于核苷酸数量。各种长度的DNA片段和RNA片段也属于本发明所述的多核苷酸。
“氨基酸残基”这一术语除特别指明外,包括肽链的N末端氨基酸和C末端氨基酸。
在本说明书中,提到“NLS”或“核定位信号序列”时,除特别指明外,并不限于特定的氨基酸序列,而是指所有已知的作为核定位信号序列的氨基酸序列。就NLS而言,本说明书的序列表(序列号1~80)栏中列出了氨基酸序列的典型例,但这并非为了特别限定。
在本说明书中,提到“NES”或“核转出信号序列”时,除特别指明外,并不限于特定的氨基酸序列,而是指所有已知的作为核转出信号序列的氨基酸序列。本说明书的序列表(序列号81,82)中列出了NES的典型例,但这并非为了特别限定。
就含NES或NLS的抗菌性多肽而言,“含NLS(或NES)局部变异的序列的抗菌性多肽”是指,该NLS(或NES)的一个至多个氨基酸残基经修饰的序列(例如C末端氨基酸的羧基酰胺化的序列),或该NLS(或NES)的一个至多个氨基酸残基被置换、缺失和/或添加而形成的含变异NLS(或NES)的抗菌性多肽,以便能达到与含指定NLS(或NES)的多肽的抗菌性基本相同甚至更高的抗菌性。本发明所述的含局部实施了变异的序列的抗菌性多肽包括例如:(i)指定NLS中1~5个左右氨基酸残基经保守置换,即同类氨基酸置换(conservative amino acid substitutions)生成的变异序列(例如1或2、3个碱性氨基酸残基分别置换为其它碱性氨基酸残基的序列);(ii)在指定NLS中添加1~3个左右的氨基酸残基,优选为碱性氨基酸残基的变异序列;(iii)使指定NLS中缺失1~3个左右的氨基酸残基,优选为非碱性氨基酸残基的变异序列;(iv)在天然NLS的氨基末端添加蛋氨酸残基(包括氨基甲酰化的情况)的变异序列等。
此外,1单位(unit)NLS和NES是指构成NLS或NES的1个序列。因此,当提高肽链含2单位NLS时,其意为,在该肽链中存在2 个被看作相互独立的NLS(或NES)的序列,无论其种类相同与否。
下面说明本发明的优选实施方式。且除非本发明特别声明,例如抗菌性多肽的一级结构和链长,实施本发明所必需的事项,例如多肽合成、多核苷酸合成、以肽为成分的药剂的调制等所涉及的事项,均被认为是本领域技术人员基于有机化学、生化学、遗传工学、蛋白质工学、分子生物学、药学、医学等领域的现有技术的应掌握设计事项。本发明可根据本说明书所揭示的内容以及本领域技术常识进行实施。本说明书还结合了说明书所引用的专利文献、专利申请文件及其它刊物的全部内容,以便于参考。
在下述说明中,构成肽链的氨基酸残基以IUPAC-IUB指南所示氨基酸命名法为基准的单字表示(在序列表中用三个字母表示)。且,除非特别声明,否则,本说明书中记为NLS时,包括根据上文而定义的“实施局部变异的序列(即变异NLS序列)”,NES亦同。
本发明的抗菌性多肽为自然中不存在的人工合成多肽。具有组合了NLS或仅由NLS构成的一级结构。即,与含部分NLS的天然核定位多肽(肽链)相比,NLS占全体氨基酸序列的比例明显增加。典型例是,NLS所含氨基酸残基总数至少为5氨基酸,优选为大于等于7氨基酸,这些氨基酸残基数基本上是构成肽链全长的氨基酸残基总数的30%以上,优选为40%以上。且优选为构成肽链的全部氨基酸残基数的70%以上含于NLS部分,更优选为构成肽链的全部氨基酸残基数的90%以上含于NLS部分。
本发明的抗菌性多肽优选为全部氨基酸残基为L型氨基酸,但只要未失去抗菌活性,部分或全部氨基酸残基也可由D型氨基酸置换。例如,在化学合成本发明所述氨基酸序列形成的多肽时,其部分或全部可由D型氨基酸残基构成。由于多肽(即氨基酸残基数)根据所含NLS或NES的长度而得到不同的链长,而无特别限制,优选为由5~100个左右的氨基酸残基构成,更优选为由7~50个左右的氨基酸残基构成,特别优选为由9~30个左右的氨基酸残基构成(参照表1)。
多肽的立体结构无特别限制,只要在使用环境下能表现出抗菌性即可,但为难形成免疫原(抗原),优选为直链状或螺旋状。因该形状多肽难于形成抗原决定位。根据该观点,适用于抗菌剂的多肽,优选 为直链状低分子量多肽,典型例为全部氨基酸残基数为5~30,优选为全部氨基酸残基数为5~20。优选为不含半胱氨酸残基或其存在比例小的氨基酸序列。
构成本发明的多肽的NLS,可从现有各种生物和病毒中发现的天然NLS中选择,可直接利用其序列。具体例可举出序列号1~80所示各NLS。优选为碱性氨基酸残基含率高的的NLS。例如,优选为40%以上、更优选为50%以上的氨基酸残基为碱性氨基酸残基(赖氨酸和/或精氨酸),优选为包含其中的1种或2种以上的NLS的多肽。
优选为,与构成肽链的全部氨基酸残基数的40%以上相当,且至少5个氨基酸残基属于NLS部分。优选为由5~25个左右的氨基酸残基构成1单位NLS。例如,优选为含1单位或2单位以上的RRMKWKK(序列号1)、RVHPYQR(序列号2)、PKKKRKV(序列号4)、GKKRSKA(序列号5)、RGRRRRQR(序列号7)、RKKRRQRRR(序列号20)及PRRRK(序列号26)等5个以上氨基酸残基的NLS的多肽,典型例为氨基酸残基总数5~100。也可为仅1单位NLS的多肽。
而如RKRR(序列号27)等1单位有4个以下氨基酸残基的NLS,仅由其1单位不能构成本发明的多肽。此时,可将相同或不同的NLS组合,设计出全体而言,有5个以上氨基酸残基的氨基酸序列。即,可设计含2单位以上(典型例为2单位、3单位或4单位)的1单位有4个以下氨基酸残基的NLS的氨基酸序列。例如,当NLS选择RKRR(序列号27)时,将两单位该序列串接,即能设计成8个氨基酸残基的序列(RKRRRKRR)。
而当由可利用数据库等信息源选择构成抗菌性多肽的NLS时,优选从富含碱性氨基酸残基的NLS中选择。例如,全部氨基酸残基数的40%以上、优选为50%以上、特别优选为70%以上为精氨酸残基和/或赖氨酸残基的NLS为优选替代物。
而当设计含2或3单位以上的NLS的氨基酸序列时,优选使这些NLS在肽链中邻接。此时,优选为邻接一方的NLS的C末端氨基酸和另一NLS的N末端氨基酸直接结合的形态(参照实施例)。也可为邻接的两NLS之间,还存在作为连接链的一个至多个氨基酸残基。
本发明的抗菌性多肽可仅由1种或2种以上的NLS构成全体氨基酸序列,而只要不失去抗菌活性,也包括不含NLS的氨基酸残基(氨基酸序列)。NLS之外部分的序列优选为可维持肽链的直链状的序列,尽管对此并无特殊限定。
此外,所设计的氨基酸序列优选含有起到提高内在的NLS的抗菌活性的作用效果奏效的其它序列。如上所述,适于该目的的候选序列可举出NES。
典型的NES序列可举出LPPLERLTL(序列号81)、LALKLAGLDI(序列号82)。氨基酸序列通过组合现有的已知各种NES和NLS,即可构建高抗菌活性多肽。优选构建为NES邻接NLS的N末端或C末端侧的多肽。该形式的多肽,例如可举出,从N末端一侧以NLS、NES的顺序串接的多肽;从N末端一侧以NES、NLS的顺序串接的多肽;从N末端一侧以NLS、NES、NLS的顺序串接的多肽(此时,使NES位于中间的N末端侧NLS和C末端侧NLS种类可相同也可不同)。
构成本发明的抗菌性多肽的NLS或NES不仅由天然型序列组成,只要无损于抗菌性,还可使用各种局部变异序列。即,通过设计含天然NLS经适当变异的序列的氨基酸序列(肽链),能得到可表现出更高抗菌活性的多肽。
典型的这类变异可举出,序列中的1~3氨基酸残基的同类置换及肽链(NLS)N末端添加蛋氨酸残基(适于重组设计的肽链,采用DNA技术进行生物合成的情况)。此外,用于提高抗菌活性的适当变异可举出,使天然NLS的非碱性氨基酸残基(中性或酸性氨基酸残基)至少缺失1个,给天然NLS至少添加1个碱性氨基酸(典型例为精氨酸和赖氨酸),以及将天然NLS所含至少一个非碱性氨基酸残基置换为碱性氨基酸残基。此外,优选变异还包括,将肽链C末端的氨基酸的羧基酰化,或将N末端的氨基酸的羧基酰化(典型例为乙酰化)。
本发明所提供的新型抗菌性多肽之一为,例如,7个氨基酸残基的典型NLS,PKKKRKV(序列号4)的脯氨酸置换为碱性氨基酸残基的序列RKKKRKV(序列号83)有1个或2单位以上的多肽。
本发明所提供的优选新型抗菌性多肽为由上述变异序列构成的多肽,以及其C末端羧基酰化修饰而成的多肽,如PKKKRKV-CONH2(序列号102)和RKKKRK,VRKKKRKV-CONH2(序列号103)。
本发明所提供的优选新型抗菌性多肽(设计的肽链)的具体例为序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92、序列号93、序列号94、序列号95、序列号96、序列号97、序列号98、序列号99、序列号100、序列号101、序列号102、序列号103、序列号104、序列号105、序列号106、序列号107、序列号108、序列号109、序列号110、序列号112、序列号114、序列号116所示的各氨基酸序列或其1、2或多个氨基酸残基被置换(同类置换等)、缺失及或添加的变异序列。基本上由这些氨基酸序列构成的多肽,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有高抗菌活性(参照参考例)。
该多肽由任30个以下氨基酸残基,具体为5~28个氨基酸残基构成,优选为可维持直链状。且因免疫原性低,适于用作抗菌剂主成分。
而且,本发明提供含1种或2种以上选自序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92、序列号93、序列号94、序列号95、序列号96、序列号97、序列号98、序列号99、序列号100、序列号101、序列号102、序列号103、序列号104、序列号105、序列号106、序列号107、序列号108、序列号109、序列号110、序列号112、序列号114、序列号116所示各氨基酸序列的氨基酸序列,或其1、2或多个氨基酸残基被置换(同类置换等)、缺失及/或添加的变异序列的自然中不存在的人工合成多肽,且整体不超过100个氨基酸残基,优选为不超过50个氨基酸残基。
一旦如上所述设计成氨基酸序列,根据其氨基酸序列,用现有公知方法能够合成肽链(即本发明的抗菌性多肽)。例如,根据一般的化学合成法容易制造抗菌性多肽。也可以采用此现有公知的固相合成法或液相合成法。以Boc(叔丁氧羟基)或Fmoc(9-亚芴基甲氧羰基)为适用的氨基保护基的固相合成法。
本发明的抗菌性多肽可易于通过使用市售多肽合成机(可由PerSeptive Biosystems、Applied Biosystems等公司购入)的固相合成法合成具有预期氨基酸序列和修饰(C末端酰化等)部分的肽链。
也可根据遗传工学方法,生物合成本发明的抗菌性多肽。该方法 适于制造长链多肽。即合成含通过编码预期抗菌性多肽(以NLS为基质设计的氨基酸序列)而决定的核苷酸序列(典型例为含ATG起始密码子)的DNA(结构基因)。根据宿主细胞,构建具有由该DNA和用于在宿主细胞内表达该氨基酸序列的各种调节成分(包括启动子、核糖体结合部位、终止子、增强子、各种控制表达程度的顺式元件等)构成的表达用基因构建物的重组媒介。
利用常用方法,向预定宿主细胞中导入该重组媒介(例如酵母菌、昆虫细胞、植物细胞、哺乳类细胞),在预定条件下培养该宿主细胞或含该细胞的组织或个体。由此就能在细胞内表达、生产目标多肽。再从宿主细胞(分泌时的培养基)中分离出多肽,精制后,就能得到目标抗菌性多肽。例如,为在宿主细胞内高效大量生产,可利用融合蛋白表达系统。即,化学合成对目标多肽氨基酸序列编码的基因(DNA),将该合成基因导入适当的融合蛋白表达用媒介,例如Novagen提供的pET序列和由Amersham Biosciences提供的pGEX序列等GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合蛋白表达用媒介的适当位置。然后通过该媒介对宿主细胞(典型例为大肠杆菌)进行转化。培养所得转化体、调制目标融合蛋白。再提取精制该蛋白质,将所得精制融合蛋白用特定酶(蛋白酶)切断,用亲和层析等方法回收游离的目标多肽片段(设计的抗菌性多肽),通过使用该公知融合蛋白表达系统,例如,可利用由Amersham Biosciences提供的GST/His系统,就能制成本发明的抗菌性多肽。
也可通过构建无细胞蛋白质合成系统用模版DNA(即,含有对抗菌性多肽的氨基酸序列编码的核苷酸序列的合成基因片段,参照后述参考例),使用合成肽所必需的各种化合物,如ATP、RNA聚合酶、氨基酸类等,采用无细胞蛋白质合成系统体外合成目标多肽。无细胞蛋白质合成系统可参考例如Shimizu等人的论文(Shimizu et al.,NatureBiotechnology,19,751-755(2001))、Madin等人的论文(Madin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(2),559-564(2000))。在本发明申请时,已有很多企根据这些论文所述技术生产了蛋白质(多肽),且无细胞蛋白质合成用仪器(例如,可由日本东洋纺织(株)购入的PROTEIOS(商标)小麦芽胚无细胞蛋白质合成系统)已有市售品。
因此,一旦决定并设计好上述抗菌性多肽的氨基酸序列,则根据其氨基酸序列,利用无细胞蛋白质合成系统即能很容易生产出目标多肽,例如,根据日本的POST GENOME INSTITUTE CO.,LTD.的PURESYSTEM(注册商标),即能很容易的生产出目标多肽。
由对本发明的抗菌性多肽编码的核苷酸序列和/或与该序列互补的核苷酸序列构成的基本上为单链或双链核苷酸可很容易地利用现有公知方法制造合成。即,通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子,可很容易地确定和提供相应于抗菌性多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。因此,一旦确定核苷酸序列,就可很容易地利用DNA合成机等得到与预期核苷酸序列相应的多肽(单链)。进而将所得单链DNA用作模版,采用各种酶合成方法(典型例为PCR),就能得到目标双链DNA。
本发明的多核苷酸,既可为DNA形态,也可为RNA(mRNA)形态。DNA既可为单链,也可为双链。单链时,可为密码链(有义链),也可为其互补序列的非密码链(反义链)。
例如,可使用具有对本发明的抗菌性多肽编码的核苷酸序列的多核苷酸和用于在宿主细胞内表达该氨基酸序列的各种调节成分(包括启动子、核糖体结合部位、终止子、增强子、各种控制表达程度的顺式元件等)构建具有外来肽表现用基因构建物的重组媒介。用于构成和构建媒介的调节成分的种类根据目标宿主细胞的类型而不同。重组媒介的构建,可采用由基因工程学领域易于理解的各种控制酶进行的多核苷酸链切断法(restriction)及多核苷酸片段连接法(ligation)。这些方法可很容易地利用市售各种装置进行。
此外,重组媒介的构建方法和向宿主细胞导入所构建的重组媒介的方法等,可直接采用该领域内的现有各种方法,由于这些方法本身并不给本发明带来特别的特征,因此省略其详细说明。
本发明的一或多个多核苷酸对新型氨基酸序列的抗菌性多肽进行编码。
例如,本发明提供含有对具备下述(a)和(b)的要件
(a)构成肽链的全部氨基酸残基数在5~100;
(b)含有选自序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序 列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92、序列号93、序列号94、序列号95、序列号96、序列号97、序列号98、序列号99、序列号100、序列号101、序列号102、序列号103、序列号104、序列号105、序列号106、序列号107、序列号108、序列号109、序列号110、序列号112、序列号114、序列号116所示各氨基酸序列中至少1种氨基酸序列或该序列的一或多个氨基酸残基被置换、缺失及/或添加而形成的变异氨基酸序列的抗菌性多肽编码的核苷酸序列和/或该序列的互补核苷酸序列(或基本上由这些序列构成)的自然中不存在的人工合成多核苷酸。
并且,提供含有对基本上由选自序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92、序列号93、序列号94、序列号95、序列号96、序列号97、序列号98、序列号99、序列号100、序列号101、序列号102、序列号103、序列号104、序列号105、序列号106、序列号107、序列号108、序列号109、序列号110、序列号112、序列号114、序列号116所示各氨基酸序列中至少1种氨基酸序列或该序列的一个至多个氨基酸残基被置换、缺失及/或添加而形成的变异氨基酸序列构成的抗菌性多肽进行编码的核苷酸序列和/或与该序列互补的核苷酸序列的(或基本上由这些序列构成)自然中不存在的人工合成多核苷酸。
本发明的抗菌性多肽具有较广抗菌谱,适用作抗菌剂(药用组合物)的主成分。例如,可用于细菌感染症的治疗、创伤面的消毒、眼病预防、口腔内清洁(漱口)、食品防腐和保鲜、除臭、家具和卫生器具表面的杀菌和消毒等目的。
除抗菌性多肽之外,可根据抗菌剂的用途和形态选择抗菌剂所含载体,即副成分(典型例为制药可用物质),例如各种填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、表面活性剂、赋形剂、色素、香料等。
抗菌剂的形态无特别限制,可为内服剂和外用剂的各种典型剂型,例如软膏、液体制剂、悬浊剂、乳剂、气雾剂、泡沫剂、颗粒剂、粉末、片剂、胶囊等。而为用于注射等情况,也可为在用前将其溶于生理盐水,以便调制成药液的冷冻干燥剂和造粒剂。
此外,以抗菌性多肽(主成分)和各种载体(副成分)为材料, 调制各种形态的药剂工艺本身可根据现有公知方法进行,由于这些制剂方法本身不能给本发明带来特别的特征,因此,在此不作详细说明。
配方的详细资料,可以举出例如Corwin Hansch编撰的Comprehensive Medicinal Chemistry,Pergamon Press发行(1990)。
本发明的抗菌剂可根据其形态和目的,采用不同的用法和用量。例如,液体制剂可采用静脉内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内注射或经灌肠而给患者服用。片剂等固体形态的制剂可口服。而用于卫生陶器表面的消毒(杀菌)和食品防腐时,可直接将含大量(例如1~100mg/ml)肽的液体制剂喷在对象物表面,也可用布或纸等将该液体制剂擦拭在对象物表面。它们能以与现有肽类抗生素和以肽为构成成分的农药、准药品等相同的形态和用法使用,为此,本发明不再举例。
例如,对接受放射治疗的癌症和艾滋病患者而言,细菌感染症的预防和治疗非常重要。本发明所提供的抗菌性多肽对细菌表现出选择性抗菌作用。因此,本发明的抗菌性多肽可有效用作抗菌剂主成分。
并且,对本发明的抗菌性多肽编码的多核苷酸可用作基因治疗材料。例如,将对抗菌性多肽编码的基因(典型例为DNA片段或RNA片段)与媒介适当组合,导入目标部位,就可在生物体(细胞)内持续表达本发明的抗菌性多肽。因此,编码本发明的抗菌性多肽的多核苷酸(DNA片段或RNA片段等)就是对上述患者有效的细菌感染预防和治疗药剂。
在再生医疗领域,培养皮肤、骨、各种内脏时,预防细菌感染尤其重要。本发明提供的抗菌性多肽对哺乳动物和组织的毒性极低(参照后述实施例),对细菌表现出选择性抗菌作用。因此,作为防止培养脏器等时的细菌感染的药剂非常有效。例如,如后述实施例所述,通过单独将本发明的抗菌性多肽或该多肽主成分之一的抗菌剂以适当的浓度添加到培养液中,能够防止培养中的脏器等的细菌感染。
并且,对本发明的抗菌性多肽编码的多核苷酸可用作对培养细胞和培养组织进行基因治疗的材料。例如,将对本发明的抗菌性多肽编码的基因(典型例为DNA片段或RNA片段)与适当媒介组合,导入目标培养组织,就能经常或在预期时期在培养组织(细胞)内表达本发明的抗菌性多肽。因此,对本发明的抗菌性多肽编码的核苷酸(DNA 片段或RNA片段等)可用作非常有效的防止培养组织细菌感染的药剂。
下面说明本发明的几个实施例,但本发明的主旨并不仅限于所述
实施例。
实施例1:抗菌性多肽的化学合成
使用后述肽合成机制造出总计36种多肽(样品1~33,参照品1~3)。表1列举了这些多肽的氨基酸序列。
表1
样品编号 | 氨基酸序列 | 氨基酸残基总数 |
样品1 | PKKKRKV(序列号4) | 7 |
样品2 | RQARRNRRRRWR(序列号21) | 12 |
样品3 | RIRKKLR(序列号43) | 7 |
样品4 | PPRKKRTVV(序列号28) | 9 |
样品5 | RKKRRQRRR(序列号20) | 9 |
样品6 | PRRRK(序列号26) | 5 |
样品7 | RKKKRKV(序列号83) | 7 |
样品8 | PKKKRKVLPPLERLTL(序列号84) | 16 |
样品9 | LPPLERLTLPKKKRKV(序列号85) | 16 |
样品10 | RQARRNRRRRWRLPPLERLTLD(序列号86) | 22 |
样品11 | PKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV(序列号87) | 23 |
样品12 | RKKKRKVLPPLERLTL(序列号88) | 16 |
样品13 | LPPLERLTLRKKKRKV(序列号89) | 16 |
样品14 | RKKKRKVLALKLAGLDI(序列号90) | 17 |
样品15 | LALKLAGLDIRKKKRKV(序列号91) | 17 |
样品16 | PKKKRKVPKKKRKV(序列号92) | 14 |
样品17 | RIRKKLRRIRKKLR(序列号93) | 14 |
样品18 | PRRRKPRRRK(序列号95) | 10 |
样品19 | PKKKRKVPPRKKRTVV(序列号97) | 16 |
样品20 | RKKKRKVRKKKRKV(序列号98) | 14 |
样品21 | RKKKRKVRKKKRKVRKKKRKV(序列号99) | 21 |
样品22 | RKKKRKVRKKKRKVRKKKRKVRKKKRKV(序列号100) | 28 |
样品23 | PRRRK(序列号101) | 5 |
样品24 | RKKKRKV(序列号102) | 7 |
样品25 | RKKKRKVRKKKRKV(序列号103) | 14 |
样品26 | PKKKRKV(序列号104) | 7 |
样品27 | LKRKLQR(序列号50) | 7 |
样品28 | RKKKRKVVKRKKKR(序列号105) | 14 |
样品29 | RKKKRKVKRKKKR(序列号106) | 13 |
样品30 | LKRKLQRLKRKLQR(序列号107) | 14 |
样品31 | PKKKRKVALGKLALGKL(序列号108) | 17 |
样品32 | RQARRNRRRRWRIAGKI(序列号109) | 17 |
样品33 | MRKKKRKVRKKKRKV(序列号110) | 15 |
[0127]
参照品1 | RKRR(序列号27) | 4 |
参照品2 | LPPLERLTL(序列号81) | 9 |
参照品3 | LALKLAGLDI(序列号82) | 10 |
表1所述样品1~6及27为仅由各不相同的1单位天然型NLS组成的多肽。
样品7是由样品1的氨基酸序列(PKKKRKV:序列号4)的N末端氨基酸的脯氨酸置换成精氨酸的变异序列(RKKKRKV:序列号83)构成的多肽。
样品8~11是由NLS和普通NES串接的序列构成的多肽。即,样品8的NLS(PKKKRKV:序列号4)的C末端侧与NES(LPPLERLTL:序列号81)邻接。而样品9的NES(LPPLERLTL:序列号81)的C末端侧与NLS(PKKKRKV:序列号4)邻接。样品10的NLS(RQARRNRRRRWR:序列号21)的C末端侧与NES(LPPLERLTL:序列号81)邻接,且在其C末端添加有1个天冬氨酸。样品11的NLS(PKKKRKV:序列号4)的C末端侧与NES(LPPLERLTL:序列号81)邻接,且在其C末端侧与NLS(PKKKRKV:序列号4)邻接。
样品12~15是由样品7的变异NLS(RKKKRKV:序列号83)和普通NES连接的序列构成的多肽。即,样品12在变异NLS(RKKKRKV:序列号83)的C末端侧与NES(LPPLERLTL:序列号81)邻接。而样品13的NES(LPPLERLTL:序列号81)的C末端侧与NLS(RKKKRKV:序列号83)邻接。样品14在变异NLS(RKKKRKV:序列号83)的C末端侧与其它NES(LALKLAGLDI:序列号82)邻接。而样品15的NES(LALKLAGLDI:序列号82)的C末端侧与NLS(RKKKRKV:序列号83)邻接。
样品16~22及30由2单位或其以上NLS或变异NLS连接的序列构成的多肽。即,样品16为2单位NLS(PKKKRKV:序列号4)连接而成。样品17为2单位NLS(RIRKKLR:序列号43)连接而成。样品18为2单位的5氨基酸残基构成的NLS(PRRRK:序列号26)连接而成。样品30为2单位NLS(LKRKLQR:序列号50)连接而成。样品19为1单位的两个不同的NLS(PKKKRKV:序列号4及PPRKKRTVV:序列号28)串接而成。
且样品20、21及22分别由2单位、3单位及4单位上述变异NLS(RKKKRKV:序列号83)连接而成。
样品23由NLS(PRRRK:序列号26)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
样品24由上述变异NLS(RKKKRKV:序列号83)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
样品25是使由2单位的上述变异NLS(RKKKRKV:序列号83)连接而成的序列(RKKKRKVRKKKRKV:序列号98)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
样品26是由将样品1的氨基酸序列(PKKKRKV:序列号4)的N末端侧起第6个氨基酸残基“赖氨酸”置换为“精氨酸”的同类置换序列(PKKKRKV:序列号104)构成的多肽。
样品28是由样品7的变异NLS(RKKKRKV:序列号83)的C末端侧添加富含碱性氨基酸的7氨基酸残基而成的多肽。具体而言就是添加使变异NLS(RKKKRKV:序列号83)反转的序列(VKRKKKR)。
样品29是由在样品7的变异NLS(RKKKRKV:序列号83)的C末端侧添加全部是碱性氨基酸的6个氨基酸残基(KRKKKR)而成的多肽。
样品31是在样品1的NLS(PKKKRKV:序列号4)的C末端侧添加10个氨基酸残基(ALGKLALGKL)的多肽。
样品32是在样品2的NLS(RQARRNRRRRWR序列号:21)的C末端侧添加5个氨基酸残基(IAGKI)的多肽。
样品33是由2单位样品7的变异NLS(RKKKRKV:序列号83)连接而成,且其N末端添加有蛋氨酸残基的多肽。
在本实施例中,为比较参照上述各样品的多肽的抗菌活性,合成了3种不属于本发明范畴的多肽。
即,参照品1是由仅1单位的4氨基酸残基组成的短NLS(RKRR:序列号27)形成的多肽。
而参照品2和参照品3是由仅1单位的各不相同的NES(LPPLERLTL序列号:81、LALKLAGLDI序列号:82)组成的多肽,不含NLS。
上述各多肽(各氨基酸序列参照表1和序列表)用市售肽合成机(PEPTIDE SYNTHESIZER 9050,PerSeptive Biosystems制品),由固相合成法(Fmoc法)合成。缩合剂使用HATU(Applied Biosystems制品),固相合成用树酯及氨基酸从NOVA biochem公司购入。氨基酸序列的C末端酰化时,固相载体使用“Rink Amide resin(100~200目)”。
而根据上述肽合成机的合成程序反复进行脱保护基反应和缩合反应,结合在树脂上的Fmoc-氨基酸肽链被延伸,得到目标链长的合成肽链。具体而言,用20%的哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)(肽合成用级,关东化学(株)制品),切断除去氨基酸的氨基保护基Fmoc,用DMF清洗,使Fmoc-氨基酸(-OH)各4eq发生反应,再反复进行用DMF清洗的操作。然后,在肽链伸长反应完全结束后,用20%哌啶/DMF切断Fmoc基,按照DMF、甲醇的顺序清洗上述反应物。
固相合成后,将合成的肽链和树脂一起移至离心管,加入乙二醇1.8mL、间甲酚0.6mL、茴香硫醚3.6mL及三氟乙酸24mL,在室温下搅拌2小时。然后过滤除去与肽链结合的树脂。
再于滤液中加入冷却乙醇,用冰水冷却,得到肽沉淀物。然后利用离心分离(2500rpm,5分钟)弃去上清液。向沉淀物中再加入冷的二乙醚,充分搅拌,然后在同上条件下离心分离。将搅拌和离心分离处理反复3次。
真空干燥所得肽沉淀物,用高效液相色谱(Waters600:Waters制品)精制。
具体而言,使用预处理柱(日本Waters(株)制品,Guard-PakDeltapak C18 A300)和C18逆相柱(和光制药工业(株)制品、WakopakWS-DHA 4.6×150mm ODS-C 18),将0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和0.1%三氟乙酰乙腈溶液的混合液用作洗提液,即,随着洗提液中所含三氟乙酰乙腈溶液体积分率随时间的增大(容积比设为10%~80%的浓度梯度),使用上述处理柱,以1.5mL/分的流速进行30~40分钟的分离精制。对由逆向柱洗提出的肽,用紫外线检测器(490E Detector:Waters制品)在220nm波长下检测,在记录纸上出峰。
此外,洗提出的各多肽的分子量用PerSeptive Biosystems公司制Voyager DE RP(商标),根据MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laster Desorption Time of Flight Mass Spectrometry:基质辅助激光解吸附飞行时间质谱)确定。结果确认合成精制出目标多肽。
实施例2:合成多肽的抗菌活性
用96孔(well)微量培养板,由液态培养基稀释法求得本发明的抗菌性多肽(样品1~33)及参照品1~3的多肽对革兰氏阴性菌(大肠肝菌:E.coli)及革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌:S.aureus)的抗菌活性(最小抑制浓度:MIC)。
即,分别制成多肽浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.9、1.0及0.5μM的液态肉汁培养基(DIFCO制品“NUTRIENTBROTH Dehydrated”),填入96孔微量培养板。另外,将用LB BrothLennox(DIFCO制品)在18小时、37℃下静置培养的菌液(约2×106cells/mL)与药剂溶液(上述含肽肉汁培养基)等量地接种于96孔微量培养板的各孔(well)中。接种后,在37℃的恒温箱内开始培养,根据24小时和48小时后的混浊度判断有无菌产生。将测量时确认因菌导致的混浊度无增加时的最小多肽浓度定为本实施例的MIC。
根据该抗菌试验得到得各样品及参照品的抗菌活性(MIC)如表2所示。表2的MIC的单位为μM。
表2
表2所示结果表明,与参照品多肽(参照品1~3)相比,均本发明的多肽(样品1~33)表现出高抗菌活性。
NLS和NES邻接配置的多肽(样品10、14、15等)对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均表现出高抗菌活性。而2单位或2单位以上的NLS串接多肽(样品16~22)则确认有极高的抗菌活性。
此外,含1单位以上NLS或变异NLS、且富含氨基酸残基,优选为8个以上的多肽,如样品2、5、16~22、28、29,表现出极高抗菌活性。而C末端酰化的多肽(样品24)比C末端未酰化的多肽(样品7)表现出更高的抗菌活性。
由表2所示结果可知,本发明的多肽具有极佳的广谱抗菌活性。
实施例3:抗菌多肽
然后,再以各种细菌(参照表3)为对象,对样品16、17、10、14及20的多肽进行与实施例2同样的抗菌试验(MIC测定试验),评价这些多肽的抗菌谱。其结果如表3所示,确认本发明的抗菌性多肽对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有广谱抗菌活性。
表3 24小时后的抗菌活性:MIC(μM)
试验菌 | 样品16 | 样品17 | 样品10 | 样品14 | 样品20 |
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)IFO3001 | >286.0 | >260.3 | 21.4 | 32.0 | >267.9 |
蜡状芽孢杆菌IFO15305 | >286.0 | >260.3 | 42.9 | 64.1 | 133.9 |
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)IFO3813 | 143.0 | 16.3 | 5.4 | 4.0 | 16.7 |
短芽孢杆菌(Bacillus brevis)IFO15304 | >286.0 | >260.3 | 21.4 | 128.2 | 133.9 |
枯草杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633 | 2.2 | 1.0 | 0.7 | 1.0 | 2.1 |
枯草杆菌IFO3134 | 8.9 | 0.5 | 0.7 | 1.0 | 4.2 |
藤黄微球菌(Micrococcus luteus)IFO12708 | 8.9 | 4.1 | 5.4 | 4.0 | 8.4 |
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)COL(MRSA) | >286.0 | 16.3 | 10.7 | 16.0 | 33.5 |
金黄色葡萄球菌RN450(<sup>*</sup>MSSA) | 71.5 | 32.5 | 10.7 | 16.0 | 33.5 |
金黄色葡萄球菌IFO12732 | 71.5 | 2.0 | 1.3 | **/ | 4.2 |
金黄色葡萄球菌IID1677(MRSA) | 35.7 | 8.1 | 10.7 | **/ | 8.4 |
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)IFO12713 | 8.9 | 8.1 | 10.7 | 8.0 | 8.4 |
大肠埃希氏菌O157:H7sakai | 17.9 | 8.1 | 10.7 | 8.0 | 8.4 |
大肠埃希氏杆菌O26:H11 | 17.9 | 8.1 | 10.7 | 16.0 | 8.4 |
肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC4352 | 8.9 | 8.1 | 10.7 | 32.0 | 4.2 |
普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC13315 | 8.9 | 8.1 | 10.7 | 64.1 | 8.4 |
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC10145 | 4.5 | 8.1 | 10.7 | 32.0 | 4.2 |
绿脓杆菌IFO3080 | 8.9 | 8.1 | 10.7 | 16.0 | 4.2 |
肠沙门氏菌(Salmonella enteritidis)IFO3313 | 2.2 | 4.1 | 10.7 | 32.0 | 4.2 |
鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurius)IFO1324 | 35.7 | 4.1 | 10.7 | >256.3 | 8.4 |
实施例4:对哺乳动物的安全性试验
对哺乳动物细胞的毒性试验如下所述进行
在试验前一天,将96孔微量培养板的每个孔植入8×103个A172(人神经胶质瘤)细胞,在37℃、5%的CO2的条件下静置培养。次日,除去培养基,用PBS清洗1次,然后逐个孔中添加含多肽(样品1~26之中任一)浓度为0、0.5、5、25、50、100、200、400μg/ml的无血清培养基(不添加血清的GIBCO BRL制培养基RPMI1640)100μl(每个样品植孔数(n)=1或2)。然后再于同上条件下静置培养24小时。
结束培养后,除去培养基,用PBS清洗1次。再在每个小孔中添加含5%WST-8(细胞繁殖测定用试剂:岸田化学(株)制品)的GIBCOBRL制DMEM培养基(含10%FBS)100μl,在同上条件下静置培养1小时。然后用平板读数器,在主波长450nm、参照波长600nm下测定吸光度。以多肽0μg/ml(即无添加)的样品吸光度值为100%,求出各多肽浓度下的相对细胞存活率。以多肽浓度100μg/ml时的相对细胞存活率在80%以上的情况为无毒,小于80%为有毒。结果,本发明的多肽(样品1~26)均无毒。
并且,将10、12、13、14、15及20总计6种样品调成含肽注射液(溶剂:生理盐水)。将其分别注入小白鼠腹腔。求LD50值。
结果,该试验的抗菌性多肽LD50值均大于150mg/kg。即,可确认本发明的抗菌性多肽对哺乳动物来讲,毒性极低。
实施例5:调制颗粒剂
将样品20的多肽50mg、结晶纤维素50mg及乳糖400mg混合,然后加入乙醇和水混合液1mL混炼。用常规方法将该混炼物制粒,得到以抗菌性多肽为主成分的颗粒剂。
实施例6:抗菌性多肽的基因工学合成(1)
使用市售核酸合成机(Applied Biosystems制品ABI3900)根据操作手册,合成由序列表序列号111、113及115所示核苷酸序列形成的单链DNA。而以该DNA为基础,作为形成双链DNA的引物,化学合成1种正向引物(序列号117)及3种反向引物(序列号118、119及120)。序列号118、119及120的各反向引物分别用于合成序列号111、113及115所示序列的双链DNA。
然后利用使用这些引物的通常的聚合酶链反应(参考例如“PCRProtocols:Current Methods and Applications,White编撰,Humana Press发行(1993)),合成包括序列表中序列号111、113及115所示核苷酸序列的双链DNA。
序列号111、113及115所示双链DNA分别对序列号112、114及116所示氨基酸序列的抗菌性多肽编码,在其编码区域的上游(5′末端侧)有启动子序列,下游(3′末端侧)有终止密码。
然后,以Shimizu等人的论文(Shimizu et al.,Nature Biotechnology,19,751-755(2001))所述方案为准,以序列号115所示核苷酸的DNA为模版,由无细胞蛋白质合成系统(无细胞表达系统)合成氨基酸序列为MPKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV(序列号116)的多肽。
即,调制出含下述成分:9mM醋酸镁、5mM磷酸钾、95mM谷氨酸钾、5mM氯化铵、0.5mM氯化钙、1mM精脒、8mM腐胺、1mM硫苏糖醇(DTT)、2mM的ATP、2mM的GTP、1mM的CTP、1mM的UTP、10mM磷酸肌酸、2.8单位(A260)的tRNA混合物(Roche制品)、0.5μg的10-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸、0.1mM的各氨基酸、12皮 摩的核糖体、及带有His-tag的各种酶及因子类(即,1μg的起始子1(IF1)、2μg的IF2、0.75μg的IF3、1μg的延伸因子-G(EF-G)、2μg的EF-Tu、1μg的EF-Ts、0.5μg的终止子(RF1)、0.5μg的RF3、0.5μg的RRF、各30~300单位的氨基酰-tRNA合成酶(计20种)和甲硫氨酰-tRNA转甲酰酶、0.2μg的肌酸激酶(Roche制品)、0.15μg的肌激酶(Sigma制品)、0.054μg的核苷二磷酸激酶、0.1单位的焦磷酸酶(Sigma制品)以及0.5μg的T7RNA聚合酶)的反应液50μl(pH7.3)。将反应液在37℃下保温5分钟。再向反应液中添加上述模版DNA,在37℃下保温1小时。然后将反应液移至冰水中,使多肽合成反应停止。
然后将反应液填入超过滤用设备(Amicon(注册商标)Centricon(注册商标)YM-100设备,Millipore制品)进行离心分离,回收洗提液。然后将回收液用Ni-NTA琼脂糖(agalose,Qiagen制品)经亲和层析精制。将精制液供给SDS-PAGE,合成目标多肽。
即,将回收的部分精制液载入15~25%的丙烯酰胺浓度梯度的丙烯酰胺凝胶,在300V下进行50分钟的电泳。除最终精制液之外,向该凝胶中同时载入部分上述多肽合成反应后立即经上述37℃、1小时保温后的反应液以及部分上述超过滤后的洗提液。而反向控制,是将除不添加上述模版DNA(序列好115)之外,实施同样过程而得的立即经上述37℃、1小时保温后的反应液、上述超过滤的洗提液以及上述精制液载入同一凝胶。再将用其它肽合成机(上述PEPTIDE SYNTHE-SIZER 9050)合成的序列号116的多肽(MPKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV)载入同一凝胶。
电泳后,将凝胶浸入含荧光染色剂(Amersham Bioscence(株)制品:SYPRO(商标)Orange)的染色液(7.5%醋酸)内40分钟,对凝胶中所含肽进行染色。然后将凝胶浸入7.5%醋酸中,除去多余的染色剂。然后使用Amersham Pharmacia(株)制图像分析仪(商品名Typhoon)解析(激励波长:532nm,荧光过滤器:580BP30)。结果(染色后的影像)如图1所示。图1所示电泳泳道1为Amersham Biosciences(株)制LMW标记套件(制品名:LMW Marker Kit,制品编码:17-0446-01)的泳动图。从电泳泳道下侧起,可看到约14.4kDa、20.1kDa、30kDa、45kDa、66kDa、97kDa的横纹。电泳泳道2为Amersham Biosciences (株)制品的肽标记套件(制品名:Peptide Marker Kit,制品编码:80-1129-83)的泳动图。从电泳泳道下侧起,可看到约6.2kDa、8.2kDa、10.7kDa、14.4kDa、16.9kDa的横纹。电泳泳道3和电泳泳道4分别表示含和不含模版DNA的两种情况下,上述肽合成反应后的反应液的泳动图。而电泳泳道5和电泳泳道6分别表示含和不含模版DNA的两种情况下,上述超过滤的洗提液的泳动图。电泳泳道7为含模版DNA时的流通有Ni-NTA琼脂糖的上述精制液的泳动图。电泳泳道8为由肽合成机合成的目标序列多肽(序列号116)的泳动图(70ng/3.4μl)。电泳泳道9为不含模版DNA时的流通Ni-NTA琼脂糖的上述精制液的泳动图。电泳泳道10表示由同样的无细胞蛋白质合成系统(参照上述Shimizu等人的论文)合成,以同样过程精制后的二氢叶酸还原酶(DHFR)的泳动图。
如图1所示,电泳泳道3、5及7(参照箭头)在与电泳泳道8(参照箭头)相同的位置,存在明确的横纹。该横纹未见于未添加模版DNA的电泳泳道4、6及9中。
然后将上述凝胶干燥后,分离出电泳泳道7的目标横纹(图1箭头所示横纹),使用Amersham Biosciences制MALDI-TOF MS(商品名Voyager RPde)进行多肽的PMF分析(Peptide Mass Finger printinganalysis)。结果确认出现图2所示的分子离子峰。观测所得峰质量数([M+H]+=2939.94、[M+2H]2+=1470.49)与计算所得([M+H]+=2939.89、[M+2H]2+=1470.45)基本上一致。且未发现表示N末端和/或C末端被分解的多肽或侧链有经修饰的氨基酸残基的多肽存在的峰(N末端的蛋氨酸的氨基通常被甲酰化)。
然后,用PSD(post-source decay)方式转运上述MALDI-TOF MS,进行PSD解析(即在TOF MS内检测飞行中变成碎片的激励分子离子的方法)。结果得到如图3所示的片段离子峰。根据解析,电泳泳道7的目标多肽的氨基酸序列从N末端起,依次识别为M-P-(K/Q)-(K/Q)-(K/Q)-R-(K/Q)-V-(L/I)。其结果与序列号116的多肽的氨基酸序列MPKKKRKVL一致。
根据上述结果,可知,使用模版DNA,由上述无细胞蛋白质合成系统,很容易合成、制造本发明的抗菌性肽。
实施例7:抗菌性多肽的基因工学合成(2)
用重组DNA技术在大肠杆菌内表达含目标多肽(上述样品17)序列的GST融合蛋白(Glutathione S-transferase/His-Tag融合蛋白),将回收的GST融合蛋白酶用酶消化,对目标多肽(片段)分离精制。
首先,使用市售核酸合成机(Applied Biosystems制品ABI3900)根据操作手册,分别合成由序列号121及123所示的互补核苷酸序列组成的单链DNA。然后将该DNA链退火(anneal),得到双链DNA。序列号121为对本实施例的多肽的氨基酸序列编码的序列。序列号123为其互补序列。该编码合成多核苷酸的多肽的氨基酸序列如序列号121及序列号122所示。该氨基酸序列由上述样品17(序列号93)的氨基酸序列、配置在其N末端侧的1个蛋氨酸残基、6个连续组氨酸残基及1个谷氨酸残基构成。插入的蛋氨酸残基用于在后述融合蛋白表达不溶性时,使目标氨基酸序列能从融合GST部分被溴化氰切断。而6个组氨酸序列是用于在切断融合GST后,亲和回收目标多肽(片段)的标记部分。具体而言,插入与组氨酸邻接的谷氨酸残基用于由目标多肽切取标记部分。
如序列号121所示序列所示,该合成多肽的两端,即与蛋氨酸相应的密码子的上游及终止编码子的下游,分别含有各种控制酶EcoRI和PstI的认识点。该双链DNA被控制酶EcoRI及PstI切断。向琼脂糖凝胶电泳供给控制酶消化物,精制成两端具有EcoRI切断点及PstI切断点的DNA片段。
然后,如图4所示,将从Novagen公司购入的GST融合蛋白表达媒介(pET-4la(+)DNA:索引编号:70556-3)用控制酶EcoRI及PstI切断,在EcoRI及PstI点上连接(插入)上述双链DNA(序列号121)。此外,所用GST融合蛋白表达媒介pET-4la(+)(全核苷酸序列:5933bp)的克隆/表达区域的详细地图揭示于Noyagen社的索引中。
使用经连接处理的质体对优势细胞(E.coli JM109)进行转化,所得转化体用含卡那霉素的LB培养基(Km+)在37℃下培养,由该培养物中分离出由插入了双链的质体而转化的克隆体。培养该克隆体,由该培养物中分离、回收插入了双链DNA的质体。然后,使用回收的重组质体,转化融合蛋白高表达用大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)),对 所得转化体用LB培养基(Km+)在37℃下培养,由该培养物中分离出由插入了双链的质体而转化的克隆体。
然后,用3升LB培养基(Km+)在30℃下培养上述分离的克隆体。OD600为0.9时,添加IPTG,使最终浓度为0.5mM,诱导产生融合蛋白。再于6小时后离心分离培养液,回收得约11.6g菌体(湿态),冷冻保存。
此后的第二日,将冷冻保存菌体配成100ml的PBS悬浊液,添加20%的TritonX-100,使最终浓度为1%。对该悬浊液超声波处理,将菌体破碎,然后离心分离,回收得约110ml上清液,将上清液加入1ml容量的谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione Sepharose)4B柱中,用含1%TritonX-100的PBS清洗柱内,再用PBS清洗。然后将含10mM还原型谷胱甘肽的50mMTris-HCl(pH8.0)加入柱内,从柱内洗提目标融合蛋白。由此得到约60mg的融合蛋白。
然后将回收的融合蛋白溶液用凝血酶处理。即,向融合蛋白溶液中添加预定当量的凝血酶(即每20μg融合蛋白溶液约0.01U),在20℃下放置一晚。根据该反应,融合蛋白被分成GST部分和含目标氨基酸序列的肽部分。
然后将该蛋白质分解酶处理溶液注入谷胱甘肽琼脂糖4B柱,回收通过的组分。再用含1%TritonX-100的PBS将柱子洗净,回收其中的部分(初期洗提组分)。通过将向SDS-PAGE供给回收液,确认目标多肽的回收。即,回收的部分精制液(含目标多肽)载入15~25%的丙烯酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶(Multigel 15/25:第一化学(株)制品),在30mA下进行约2小时的电泳。结果如图5所示。凝胶电泳泳道M为肽标记(BenchMark Protein Ladder、Invitrogen制品)的泳动图,电泳泳道1为上述凝血酶处理前的融合蛋白溶液的泳动图,电泳泳道2为凝血酶处理后的蛋白质溶液的泳动图,电泳泳道3为柱中流出的组分的泳动图,电泳泳道4及5为洗净上述柱子的洗净液回收后的组分的泳动图,电泳泳道6~11为从上述柱中分离出的洗提组分的泳动图。如图所示,电泳泳道2~5中确认含有与GST分离的目标氨基酸序列(序列号122)的多肽片段横纹。
然后,将这些回收物装入透析用袋,用0.1M碳酸氢铵(pH8.0) 透析。然后回收袋内的溶液,在添加有适量内切蛋白酶Glu-C的碳酸氢铵缓冲液(PH7.8)中,在37℃下进行18小时的酶处理(切断处理)。然后回收酶处理液,供逆向高效液相色谱使用。即,将酶处理液用于规格为4.6×250mm的逆向柱(Wakosil-II 5C18 HG:和光纯药工业(株)制品),使用日本分光(株)的RP-HPLC(JASCO Pump System,泵:PU-980,UV检测器:UV-970),在A溶液为含0.05vol%TFA的蒸馏水、B溶液为含0.05vol%TFA的乙腈溶液、变化率为100%A→100%B溶液经40分钟、流速为1ml/分的条件下进行逆向色谱分析。结果,从溶出开始约经20分钟,从柱中洗提出的组分中检测到被认为是目标肽片段的峰(图8A)。即,该峰位置(溶出时间)与化学合成品(样品17)的多肽(0.1mg/ml的样品100μl)用于同一柱内,在相同条件下洗提的情况相同(图8B)。
然后分离该峰组分,进一步用于逆向色谱分析。即,将上述分离的酶处理液用于规格为4.6×150mm的逆向柱(LichrosherRP-18:Agilent Technologies社制品),使用日本分光(株)的RP-HPLC(JASCO Pump System,泵:PU-980,UV检测器:UV-970),在A溶液为含0.15vol%TFA蒸馏水、B溶液为含0.1vol%TFA的90vol%TFA乙腈溶液、变化率为100%A→50%A/50%B溶液经40分钟、流速为1ml/分的条件下进行逆向色谱分析。结果如图6所示,从溶出开始约经20分钟,从柱中洗提出的组分检测到被认为是目标肽片段的峰。该峰组分所含肽的分子量用PerSeptive Biosystems制Voyager DE RP(商标),根据MALDI-TOFMS确定(图7)。结果,确定的分子量(1920.78)与根据氨基酸序列的理论分子量(1920.51)同等。
然后,根据同上述实施例2所述的方法,研究由逆向色谱法精制的多肽的抗菌活性(MIC)。结果如表4所示。
表4
如表4所示,由重组大肠杆菌分离精制的多肽与参照的多肽(上述实施例2中的参照品1和2)相比,表现出高抗菌活性。其MIC值与化学合成制成的相同氨基酸序列的多肽(上述样品17)有同等程度。
以上详细说明了本发明的具体例,但本发明并不受限于所述实施例。本发明所要求保护的技术,还包括上述所示具体例的各种变形和变更例。
且本说明书所述技术要素为单独或通过其各种组合发挥有效性,但也不受限于所述组合。且本说明书所示技术能同时达成多个目的,达成其中之一的目的的技术本身,在技术上即具有有益性。
Claims (6)
1.一种抗菌剂,其特征在于,含有自然中不存在的人工合成抗菌性多肽和可用于制药的载体,所述多肽由选自序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88和序列号89中任一序列号所示氨基酸序列的至少1种氨基酸序列构成。
2.如权利要求1所述的抗菌剂,其特征在于,所述多肽的肽链的C末端氨基酸残基被酰化。
3.以抗菌性多肽为主成分的抗菌剂的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
设计由选自序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88和序列号89所示各氨基酸序列中的至少一种氨基酸序列组成的多肽;
合成所述多肽。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,由化学合成法制造由所述多肽组成的抗菌性多肽。
5.自然中不存在的人工合成抗菌性多肽,其特征在于,
所述多肽由序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88和序列号89中任一序列号所示氨基酸序列组成。
6.自然中不存在的人工合成多核苷酸,其特征在于,由以下核苷酸序列组成:编码由选自序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88和序列号89中任一序列号所示氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列和/或与该序列互补的核苷酸序列。
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