KR20110063731A - 펩티딜아르기닌 디이미나아제(ｐａｄ) 억제제 - Google Patents

펩티딜아르기닌 디이미나아제(ｐａｄ) 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RA와 같은 자가면역 질병에 대한 약제로 사용되기에 적절한 PAD 억제제에 관한 것이다.

Description

펩티딜아르기닌 디이미나아제(ＰＡＤ) 억제제{PEPTIDYLARGININE DEIMINASE (PAD) INHIBITORS}
본 발명은 의약에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 자가면역 질환, 특히 류마티스성 관절염(RA)의 예방 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 효소학에 관한 것이다. 본 발명은 효소 억제제 개발에 관한 것으로, 펩티딜아르기닌 디이미나아제(EC 3.5.3.15) 효소의 강력한 억제제를 개시한다. 이러한 PAD 억제제는 자가면역 질환의 치료, 특히 RA, 건선 및 다발성 경화증(MS)의 치료를 위한 의약품의 제조에 사용될 수 있다.
RA는 전 세계 인구의 약 1%가 걸려있는 질병이다. 이는 본래 다인성이며, 관절의 활주운동의 염증으로 특징지어지며, 관절이 붓고 통증을 유발한다. 염증 프로세스는 종종 연골 파괴 및 비가역적 뼈 침식을 일으킨다.
안티-CCP 자가항체는 RA의 시작 및 영구화에 중요한 역할을 한다. 첫째, 안티-CCP 항체는 RA에 고 특이적인 것으로 입증된 바 있다. 여러 연구의 결과, 이러한 항체에 대해 혈청 반응 양성인 각 개체는 이미 RA를 갖거나 향후에 이러한 질병으로 발달하는 것으로 나타났다. 안티-CCP 항체의 존재(특히, 높은 타이터로 존재하는 경우)는 침식성 질병 결과의 예측치이다{Nijenhuis et al., 2004}. 최종적으로, 안티-CCP 항체는 염증 부위에서 국부적으로 생성되는 것으로 나타났다. RA 환자에서 활액 물질에서 발견되는 총 IgG에 대한 안티-CCP 항체의 비율은 동일한 환자의 혈청에서 발견되는 것보다 현저히 높은 것으로 나타났다{Masson-Bessiere et al, 2000, Reparon-Schuijt et al, 2001}. 활액막에서 안티-CCP를 생성하는 플라스마 세포의 존재는 염증 부위에서 CCP-특이 B 세포의 항원-유도 성숙의 표지이다. 관절염의 발생시 안티-CCP 항체의 역할에 대한 증거는 FcγRIIB 녹아웃 마우스에서의 연구로부터 비롯된다. 활성 RA를 갖는 환자로부터 혈장 또는 혈청의 면역글로블린은 이러한 마우스에서 염증 및 조직학적 병변을 유도하는 것으로 입증되었다{Petkova et al, 2006}. 콜라겐-유도 관절염 모델에서, 시트룰린화 단백질에 대한 항체는 조직 손상을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 이는 자가면역 관절염의 발생시 이러한 항체의 직접적인 역할을 입증한다{Kuhn et al, 2006}. 최근 논문으로 Hill과 동료들은 시트룰린화 피브리노겐이 DR4-IE 트랜스제닉 마우스에서 활액막 과형성 후 관절유착증을 유발하는 것으로 특징지어지는 관절염을 유도할 수 있음을 보고하였다. T-세포 에피토프 스캐닝 및 항체 마이크로어레이 분석으로 비변형 피브리노겐으로 면역화된 DR4-IE 트랜스제닉 마우스에서 또는 시트룰린화 피브리노겐으로 면역화된 와일드 타입 C57BL/6 마우스에서 발견되지 않은 시트룰린-특이 반응성의 독특한 패턴을 확인하였다. 이러한 관찰은 RA-관련 MHC 클래스 II 분자와 관련해서 관절염 유발원으로서 시트룰린 피브리노겐이 직접적으로 연루됨을 보여준다{Hill et al, 2008}.
이러한 항원-유도 메카니즘과 일치하여, 염증이 생긴 RA 활액막에서 시트룰린화 단백질의 존재가 입증되었다. 피브린의 α- 및 β- 사슬의 시트룰린화 형태는 RA 환자의 활액막에서 거의 발생하는 것으로 보고된 바 있다{Masson-Bessiere et al, 2001}. Sa 항원의 분자 특성화는 Sa를 시트룰린화 비멘틴으로 확인되었다. Sa 항원은 RA 자가항체에 의해 특이적으로 표적화되며, 이는 염증이 생긴 활액막내에 존재하는 것으로 보고된 바 있다. 염증이 생긴 활액막내에 풍부하게 존재하는 모노사이트-유래 마크로파지에서 칼슘 인플럭스는 비멘틴의 시트룰린화를 이끌며, 그리고 비멘틴이 선-염증성 신호전달 경로에 반응하여 마크로파지에 의해 분비될 수 있다는 사실은 RA의 발달시 시트룰린화 비멘틴에 대한 역할과 일관되는 것이다{Vossenaar and van Venrooij, 2004}. 피브린 및 비멘틴에 부가적으로, 다른 시트룰린화 자가항원이 염증이 생긴 관절에서 생성될 수 있다. 단백질체학 접근법을 이용하여 피브리노겐을 포함하는 13 자가항원 시트룰린화 단백질이 RA 환자의 활액막 조직에서 확인되었다{Matsuo et al, 2006}. 시트룰린화하는 효소 PAD4(하기 참조)는 죽어가는 과립성 백혈구에서 활성화되며, 이는 핵 단백질의 시트룰린화를 이끄는 것으로 보고되었다{Nakashima et al., 2002}. 염증이 생긴 활액막에서 아포토틱 과립성 백혈구는 적절히 제거되지 않을 가능성이 높으며, 이는 전신성 홍반성 루프스 환자에서 기존에 관찰된 현상이며{Ren et al, 2003}, 결과적으로 시트룰린화 단백질은 면역 시스템에 노출될 수 있다.
시트룰린화는 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 번역후 전환이며, 이는 펩티딜아르기닌 디이미나아제(PAD)에 의해 촉진된다. 펩티딜아르기닌 디아미나아제(PAD; EC 3.5.3.15) 효소는 단백질에서 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 전환을 촉진한다. 시트룰린에 대해 tRNA가 존재하지 않는 경우, 단백질에서 시트룰린 잔기의 존재는 오직 번역후 변형의 결과이다. 포유류에서(사람, 마우스 및 랫트), 개별적인 유전자에 의해 각각 암호화되는 5 PAD 아이소타입(PAD1 - PAD6; 'PAD4' 및 'PAD5'는 동일한 아이소타입에 대해 사용된다)이 확인되었다{Vossenaar et al, 2003b}. 이러한 모든 효소들은 활성에 대해 Ca2+의 존재에 크게 의존하며, 프리 L-아르기닌을 프리 L-시트룰린으로 전환하는 것이 불가능하다. 프리 L-아르기닌은 진핵생물에서 산화 질소 합성효소(EC 1.14.13.39)에 의해 또는 박테리아에서 아르기닌 디이미나아제(EC 3.5.3.6)에 의해 프리 L-시트룰린으로 전환될 수 있다. 이러한 효소는 Ca2+ 의존성이 아니다.
고 상동성 PAD 효소들간에 가장 확연한 차이는 이들의 조직 특이적 발현이다. 표피에서 PAD1(동의어: PAD I, PAD 타입 I)은 케라티노사이트 분화의 최종 단계도중 케라틴 필라멘트의 시트룰린화에 포함되며, 이는 각질세포막의 재편성에 중요하다. 표피에서 시트룰린화의 다른 부위는 모낭이며, 이는 PAD3(동의어: PAD III, PAD 타입 III) 및 이의 천연 기질 트리코히알린(THH)을 함유한다. THH는 내부 근초 세포 및 모낭의 수질층의 주요 구조 단백질이며, 보다 적은 정도로 다른 특수화된 피막에 존재한다. 가장 최근에 확인된 PAD 아이소타입, PAD6(동의어: ePAD)은 마우스 난모세포의 세포질 시트에서 발견되었으며, 이는 초기 배발생에서 중요한 역할을 한다. 이의 인간 오르톨로그(서로 다른 종간에서 같은 기능을 하는 유전자)의 발현은 난소, 고환 및 말초 혈 백혈구에 대해 제한적인 것으로 발견되었다{Chavanas et al., 2004}. 본래, 이러한 PAD 아이소타입은 지정된 ePAD이나, 다른 PADs의 체계적인 넘버링에 기초하며, 이러한 아이소타입은 PAD6로 재명명되었다{Vossenaar et al., 2003b}. 가장 널리 발현되는 아이소타입, PAD2(동의어: PAD II, PAD 타입 II, PAD-H19)는 골격 근육, 뇌, 비장, 분비선 및 마크로파지와 같이 다수의 다른 조직에 존재한다. 이러한 광범위한 발현 패턴에도 불구하고, 단지 미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 비멘틴만이 천연 기질로서 밝혀졌다. MS 환자는 MBP에 대해 자가면역 반응이 일어난다. MBP는 미엘린초가 풍부한 단백질이며, 이의 시트룰린화는 중추신경계의 발달도중에 일어난다. 비멘틴의 시트룰린화는 인간 및 마우스 마크로파지의 칼슘운반체 유도 아포토시스도중에 관찰되었으며, 그리고 상기한 바와 같이 시트룰린화 비멘틴은 RA-특이 안티-Sa 자가항체의 표적인 것으로 나타났다. 세포의 세포질에 주로 모두 국소화되는 상기 PADs와 상반적으로, PAD4 아이소타입(동의어: PAD IV, PAD 타입 V, PADI4)은 핵내에 국소화된다. PAD4의 핵 국소화 신호는 단백질의 N-말단 리전에서 발견되었다. PAD4는 주로 말초 혈 과립성 백혈구 및 모노사이트에서 발현된다. 핵내에서 PAD4의 기질은 히스톤 코어 단백질(H2A, H3 및 H4) 및 뉴클레오포스핀/B23, 핵인 단백질이며, 이는 리보좀 어셈블리, 핵세포질 수송 및 중심체 복제에 작용한다.
이러한 발현 프로필에 기초하여, 두 PAD 아이소타입, PAD2 및 PAD4는 RA에서 면역반응과 관련된 단백질 시트룰린화에서 역할을 하는 시트룰린화 효소에 대한 후보물이다. PAD2 및 PAD4는 염증이 생긴 활액막에 풍부하게 존재하는 세포들인 모노사이트, 마크로파지 및 과립성 백혈구에 존재한다{Chapuy-Regaud et al., 2003}.
PADs는 일반적으로 시토졸 또는 핵원형질내에 불활성 효소로서 존재하며, 그 이유는 국소적 칼슘 이온 농도가 이들의 활성에 필요한 농도보다 낮기때문이다. 그러나, 세포 사멸 도중에, 혈장막의 본래 상태가 소실되어 세포외 공간으로부터 Ca2+가 밀려들어오게 되며(세포외 Ca2+ 농도는 PAD 활성에 충분한 10-3 M이하임), 세포내 PAD의 후속적인 활성화가 일어난다. 택일적으로 또는 동시에, 활성화된 PAD 효소는 죽어가는 세포들을 유출시키고 세포외 단백질의 시트룰린화를 촉진시킬 수 있다.
수년전에 인간 PAD4 단백질의 결정체 구조가 기술되었다{Arita et al., 2004}. 칼슘 이온의 존재 및 부재하에서 PAD4의 결정체 구조와 기질이 결합되어 있거나 결합되어 있지 않은 촉매반응적으로 불활성적인 돌연변이의 비교를 통해 5개의 Ca2+ 바인딩 부위가 밝혀졌으며, Ca2+ 바인딩은 활성 부위 클레프트(옴폭 들어간 부분)를 생성하는 입체 배좌(conformational) 변화를 유도한다. 구조적 데이타로 촉매 트리아드, Cys-His-Glu/Asp의 위치를 확인하였으며, 이는 종전에는 활성 부위 클레프트에서 다른 아르기닌-변형 효소의 구조적 정보에 기초하여 부분적으로 촉매 부위의 코어를 나타내는 것으로 제시되었던 것이다. 이러한 보존 패턴 및 기질 바인딩 방식이 디메틸아르기닌 디메틸아미노하이드롤라아제 및 L-아르기닌 디이미나아제와 같은 다른 아르기닌-전환 효소와 유사하다는 추정에 기초하여, 상기 촉매 메카니즘이 제안되었다{Shirai et al., 2001}. 주요 플레이어는 아르기닌의 구아니디늄기의 탄소원자에 대한 친핵성 공격을 보호하는 Cys-645 및 일반적인 염기로 작용하는 His-471이다.
상술한 바와 같이, RA의 병리 생리학에서 안티-CCP 항체에 대한 역할 및 이들의 항원성 표적을 뒷받침하는 증거들이 늘어나고 있다. RA의 병인론으로 시트룰린화 단백질에 대한 역할은 RA-관련 HLA 일배체형과 시트룰린화 펩타이드의 시트룰린-의존적 상호작용에 의해 더욱 뒷받침된다{Hill et al, 2003}. 상기한 바와 같이, 동일한 그룹에서의 최근 데이타는 DR4-IE 트랜스제닉 마우스에서 관절염은 결국 시트룰린화 피브리노겐에 의해 유도되는 것으로 나타났다{Hill et al, 2008}. 이를 함께 고려하면, 이러한 데이타는 RA에서 안티-CCP 항체의 특이적 생성은 면역 시스템 및/또는 면역 시스템에 의한 시트룰린화 항원의 인식에 대한 시트룰린화 항원의 노출 수준으로 조정됨을 보여준다. 안티-CCP 항체가 생성되면, 활액막내에서 시트룰린화 단백질을 갖는 면역 복합체의 형성은 염증 반응을 측발시킬 수 있다. RA의 발병시 안티-CCP 항체에 대한 역할은 RA에 걸린 환자에서 B 림프구 결핍 실험의 결과에 의해 뒷받침된다{Cambridge et al., 2003}.
PAD 효소 및 이의 산물, 시트룰린화 단백질은 여러 가지 다른 인간 질병들, 특히 건선, MS 및 전신성 홍반성 루프스와 같은 자가면역 질병에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
건선에서, 케라티노사이트는 매우 신속히 증식하며 단지 약 4일내에 기저층으로부터 표면으로 이동한다. 피부는 이러한 세포들을 충분히 신속히 떨어뜨리지 못하여, 결국, 두껍고, 건조한 팻치 또는 플라크로 축적된다. 일반적인 케라티노사이트에서, 케라틴 K1은 말단 분화 도중에 PAD1에 의해 시트룰린화된다. 이러한 프로세스는 케라틴 필라멘트를 보다 치밀하게 하며, 이는 표피의 일반적 각질화 프로세스에 필수적인 것이다. 건선 과증식성 플라크에서 케라티노사이트는 시트룰린화 케라틴 K1을 함유하지 않는다{Ishida-Yamamoto et al., 2000}. 증가된 세포 증식이 PAD에 의한 적절한 시트룰린화를 억제하는지 또는 PAD의 불활성화가 케라티노사이트의 과증식 및 축적을 가능케 하는지는 불명료하다. 그 메카니즘이 알려져 있지 않으나, 건선 표피에서 일탈적인 시트룰린화는 PAD1과 관련된다.
MS는 미엘린초의 자가면역성 매개 파괴로 특징지어지는 CNS의 만성 염증 질환이다. 미엘린초의 세포는 액손 주위에 약 3:1의 비율로 지질-단백질 복합체로 구성된 다중이중층 구조를 형성한다. 두 주요 단백질, MBP 및 단백지질 단백질은 단백질 분획의 85%를 차지한다. MBP는 고 양이온 단백질이며, 포스파티딜세린과 같이 음으로 하전된 인지질과 강한 상호작용을 형성할 수 있다. 건강한 성인의 약 18%의 MBP 분자에서 6개 아르기닌(19개의 아르기닌중)이 시트룰린화된다{Wood et al., 1989, Wood et al., 1996}. 나머지 MBP 분자들은 시트룰린을 함유하지 않는다. MS 환자에서 MBP-cit6의 비율은 총 MBP의 45%로 증가된다. MBP-cit6의 감소된 순 양전하는 MBP 분자의 부분적 펼침을 일으키며, 이들의 인지질과의 상호작용을 약화시킨다{Boggs et al., 1999, Pritzker et al., 2000}. MBP-cit6가 시트룰린화되지 않은 MBP보다 신속하게 지질 복합체를 형성할 수 있음에도 불구하고, 형성된 그 복합체는 시트룰린화되지 않은 MBP로 형성된 것에 비하여 밀도있게 패키징되지 않는다{Boggs et al, 1999, Beniac et al, 2000}. MBP-cit6는 시트룰린화되지 않은 MBP에 비해 카텝신에 의해 4배 보다 신속하게 분해된다{Cao et al., 1999}. 급성 전격성 MS(Marburg 타입)의 드문 경우에, MBP 분자의 80%는 심하게 시트룰린화된다(MBPcit18){Wood et al., 1996}. 심하게 언폴딩된 MBP-cit18은 일반 MBP에 비해 45배 보다 신속히 분해된다{Cao et al., 1999}. 항암 약물 탁솔의 활성 성분인 파클리탁셀을 이용한 임상 시험이 진행중이다{O'Connor et al., 1999}. 저 투여량의 파클리탁셀은 시험관내에서 PAD2에 의한 MBP의 시트룰린화를 억제할 수 있다{Pritzker et al., 1998}. 파클리탁셀을 이용한 치료는 임상적 증상을 약화시키고 손상된 쉬스(sheaths)의 재마이엘린화를 유도하며{Moscarello et al., 2002}, 탈수질환에서 후보 인자로서 PAD의 가능한 중요성을 분명히 보여준다{Moscarello et al., 2002 2x}.
RA, MS, SLE 또는 건선과 같은 다른 자가면역 질환의 치료에 적절한 특정 PAD 억제제가 현재 개시되어 있지 않다. 본 발명의 목적은 PAD 효소, 특히 인간 PAD2 및 PAD4 효소의 가역적인 또는 바람직하게는 비가역적인 억제가 가능한 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 화합물은 바람직하게 PAD의 활성을, 보다 바람직하게 PAD2 및/또는 PAD4의 활성을 억제할 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게 펩타이드 부 및 친전자성 기, 바람직하게는 아미노산 Ω에 의해 운반되는 티올-반응성 친전자성 기를 포함하며, 여기서
(a) 상기 펩타이드는 적어도 약 5 아미노산 내지 약 20 이하의 아미노산을 포함하며,
(b) 상기 펩타이드 부는 모티프 (b1), (b2), (b3) 또는 (b4) 중 적어도 하나를 포함하며:
(b1) G/S/T - D/S - Ω - D/G/S - G/S
(b2) H/K/F/L/W - S/D/H - Ω - D/E - H/Y/F/W
(b3) Y/A/K/H/L - F/Y/H - Ω - N/G/H/Y - K/A/F
(b4) Y - D/S - Ω - D/G/S - G/S
여기서, Ω는 친전자성 기, 바람직하게는 티올-반응성 친전자성 기를 운반하는 아미노산을 나타내며,
(c) 임의로 상기 펩타이드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단은 변형된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 어느 화합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 PAD의 활성을 억제할 수 있으며, 이는 RA와 같은 자가면역 질병을 예방, 치료 및/또는 지연시키는데 사용되는 의약으로 작용하는 것으로 예측된다.
도 1. 인간 PAD2 또는 PAD4 단백질을 발현하는 COS-1 세포의 용해물을 10mM CaCl2의 존재하에 30분간 37℃에서 인큐배이팅하였다. 용해물내 단백질의 시트룰린화는 SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅 후, 시트룰린 잔기의 변형 및 항-변형 시트룰린 항체와 함께 인큐배이팅하여(래인 1 및 4) 가시화되었다. 시트룰린화 단백질은 Ra3 scFv 항체(래인 3 및 6) 및 네가티브 컨트롤로서 관련이 없는 scFv(GST에 대한 항체)를 이용한 면역친화성 정제에 의해 용해물로부터 분리되었으며, 이를 동시에 분석하였다.
도 2. 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제를 이용한 블롯 디벨로핑.
다양한 양의 바이오티닐레이티드 억제제 펩타이드(바이오틴-Ahx-D-S-K-K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-아미드, O(FA) = 오르니틴 플루오로아미딘, Ahx = 6-아미노헥사노익 산)와 고정된 양의 His-태그드 PAD4의 혼합물을 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 단백질들을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하고 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제 접합체로 디벨로핑한 후, NBT/BCIP를 이용하여 가시화하였다. 표 18에 시료들을 나타내었다.
도 3. 1 마우스 항-His, 2 염소 항 마우스-알칼린 포스파타아제를 이용한 블롯 디벨로핑.
다양한 양의 바이오티닐레이티드 억제제 펩타이드(바이오틴-Ahx-D-S-K-K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-아미드, O(FA) = 오르니틴 플루오로아미딘, Ahx = 6-아미노헥사노익 산)와 고정된 양의 His-태그드 PAD4의 혼합물을 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 단백질들을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하고 마우스-항-His 항체, 그 다음 염소-항-마우스 알칼린 포스파타아제 접합체로 디벨로핑한 후, NBT/BCIP를 이용하여 가시화하였다. 표 18에 시료들을 나타내었다.
도 4. 상기 PAD에 의한 벤조일아르기닌 에틸 에스테르의 벤조일시트룰린 에틸 에스테르로의 전환을 억제하는 다양한 화합물들의 성능을 벤조일시트룰린 에틸 에스테르를 변형시키는 DAMO 및 안티피린을 이용한 비색 시험법에 의해 측정하였다. 어느 억제 화합물의 부재하에서 BAEE의 전환율은 100%로 설정되었다.
도 5. 이 도면은 펩타이드 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D(0708-33, MH22 +calc = 800.39, MH33 + calc = 533.93)의 이의 시트룰린 변이체(ΔM = 0.98Da)로의 PAD-맥 전환에 대한 질량분석 데이타를 나타낸 것이다.
A: PAD에 의한 100% 전환에서 기질 펩타이드 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D(상부) 및 산물 펩타이드 D-S-K-K-F-H-Cit-G-F-L-Y-S-D(하부)의 질량 스펙트럼.
B: 3+-신호의 확장.
C: 2+-신호의 확장.
도 6. 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델(MQR; 18.101)이 PAD-억제제 CXP5.7-011(SEQ ID NO:143)의 치료 효과를 시험하는데 사용되었다. 0일에서, 마우스에 2.8mg 항콜라겐 항체를 i.p.로 주사하였다. LPS(25㎍/마우스)를 i.p. 주사를 통해 3일에 투여하였다. 상기 억제제(20mM 소디움 포스페이트를 함유하는 200㎕ PBS에 용해된 0.5mg CXP5.7-011) 또는 플라시보로서 20mM 소디움 포스페이트를 함유하는 200㎕ PBS)를 3일부터 11일까지(9일째 제외) 매일 투여하였다. 동물들은 염증 정도에 대해 14일까지 매일 평가되었다. 실험 그룹(5 마리 마우스)당 평균 관절염 스코어를 각 시점에서 나타내었다.
시트룰린화 단백질(의 수준에서 변형)과 관련된 자가면역 질병에서 간섭을 위한 일 잠재적인 표적은 PAD이다. 예를 들어, RA 염증이 생긴 활액막에서와 같은 염증 부위에서 시트룰린화 단백질의 생성을 차단하는 것은 면역 복합체의 형성을 방해할 것이며, 이에 따라 발병 관절에서 염증 반응의 진행을 억제하는 것으로 예측된다. 활액막에서 시트룰린화 단백질에 대한 생리학적 역할은 자명하지 않기 때문에, 이들의 생성을 방해하는 것은 심한 부작용을 유도한다고 예측되지 않는다.
따라서, 예를 들어, 염증이 생긴 활액막에서와 같은 원치않는 자가면역 반응 부위에 바람직한 PAD 활성의 특이적 억제를 목적으로 하는 치료적 간섭은 RA 환자에서 관절 파괴 프로세스에 매우 특이적일 것이다.
RA와 마찬가지로, 또한 MS로 고통받는 환자에서 미엘린 베이직 단백질(MBP)의 과잉 또는 일탈적 시트룰린화는 PAD 억제제의 투여에 의해 방해될 수 있으며, 이는 마이엘린 시트에서 지질 복합체가 보다 밀도있게 패키징되도록 하며, MBP의 보다 나은 폴딩을 형성하며, 그리고 MBP를 카텝신 D에 의한 분해에 보다 덜 민감하게 한다. 현재 저 투여량의 파클리탁셀이 임상 시험에서 PAD2에 의한 MBP의 시트룰린화를 억제하는데 사용되고 있다. 파클리탁셀을 이용한 치료는 임상적 증상을 약화시키고 손상된 쉬스의 재마이엘린화를 유도한다{Moscarello et al., 2002}. 그러나, 파클리탁셀은 저 투여량에서도 많은 해로운 부작용을 갖는 고 독성 약물이다. 파클리탁셀 및 탁솔 화합물은 특이적 PAD 억제 분자가 아니다.
RA, MS, SLE 또는 건선과 같은 다른 자가면역 질환의 치료에 적절한 특정 PAD 억제제가 현재 개시되어 있지 않다. 본 발명의 목적은 PAD 효소, 특히 인간 PAD2 및 PAD4 효소의 가역적인 또는 바람직하게는 비가역적인 억제가 가능한 분자를 제공하는 것이다.
벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르(BAEE)는 PAD 활성을 검출하기 위한 기질로서 널리 사용되어 왔다. 관련 화합물, 벤조일-L-아르기닌 아미드는 PAD4-기질 복합체의 결정체 구조를 검출하기 위한 기질로서 사용되었다. 이는 PADs가 프리 L-아르기닌을 L-시트룰린으로 전환하지 않음에도 불구하고, 화학적으로 BAEE와 관련된 화합물이 활성 부위 클레프트에 적합할 수 있으며, 기질 분자의 바인딩을 위해 경합할 수 있다. 이러한 관점에서 특히 관심있는 것은 촉매 트리아드의 일부이며 친핵성 촉매에 필수적인 역할을 하는 것으로 제시된 시스테인이다. 촉매 클레프트에서 테트라헤드럴 부가물을 안정화시킴으로써, 시트룰린화 산물의 형성이 억제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 성공적으로, 바람직하게는 억제제의 저투여량으로 억제를 달성하기 위해 활성 부위 시스테인의 공유 변형에 기초한 PAD 억제제를 제공한다. 개시되는 억제제들은 가역적 방식으로 PAD를 억제할 수 있으나, 바람직하게는 비가역적으로 그리고/또는 공유적으로 PAD 효소에 바인딩하며, 가장 바람직하게는 활성 부위 촉매 시스테인 잔기에 바인딩한다.
화합물
제 1 견지로, 본 발명은 펩티딜아르기닌 디이미나아제(PAD)를 억제할 수 있는 새로운 분자 또는 화합물을 제공한다. PAD의 억제는 본 명세서에서 실시예 4, 5, 6 및/또는 7 중 어느 하나에서 제공되는 바와 같은 시험법을 이용하여 시험관내에서 PAD의 활성을 억제하는 화합물의 능력으로 정의된다. 용어 "억제"는 당 기술분야에서 널리 인식되는 것으로, PAD 활성(PAD2 및/또는 PAD4 활성)에 대해 상기 두 활성을 함께 또는 각각 하향 조절 또는 억제하는 것을 칭한다. 이러한 억제는 바람직하게 상기 화합물을 바람직하게 적어도 0.0000001mM 또는 0.000001, 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 또는 10mM의 최소 농도를 사용하여 상기 화합물을 사용하지 않은 상기 효소의 초기 활성의 적어도 5%를 억제시키는 것을 의미한다. PAD 효소의 활성은 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된다. 보다 바람직하게, 억제는 적어도 10%, 보다 바람직하게 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상의 억제를 의미한다. 가장 바람직하게, PAD2 및/또는 PAD4 활성이 검출되지 않는 것이다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 어느 화합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 PAD의 활성을 억제할 수 있으며, 이는 RA와 같은 자가면역 질병을 예방, 치료 및/또는 지연시키는데 사용되는 의약으로 작용하는 것으로 예측된다.
본 발명의 화합물은 바람직하게 PAD의 활성을, 보다 바람직하게 PAD2 및/또는 PAD4의 활성을 억제할 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게 펩타이드 부 및 친전자성 기, 바람직하게는 아미노산 Ω에 의해 운반되는 티올-반응성 친전자성 기를 포함하며, 여기서
(a) 상기 펩타이드는 적어도 약 5 아미노산 내지 약 20 이하의 아미노산을 포함하며,
(b) 상기 펩타이드 부는 모티프 (b1), (b2), (b3) 또는 (b4) 중 적어도 하나를 포함하며:
(b1) G/S/T - D/S - Ω - D/G/S - G/S
(b2) H/K/F/L/W - S/D/H - Ω - D/E - H/Y/F/W
(b3) Y/A/K/H/L - F/Y/H - Ω - N/G/H/Y - K/A/F
(b4) Y - D/S - Ω - D/G/S - G/S
여기서, Ω는 친전자성 기, 바람직하게는 티올-반응성 친전자성 기를 운반하는 아미노산을 나타내며,
(c) 임의로 상기 펩타이드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단은 변형된다.
상기 펩타이드 부는 펩타이드 서열로 나타내어진다. 본 발명에 의해 포함되는 펩타이드 서열은 이에 따라 상기 정의된 바와 같은 (b1), (b2), (b3) 및/또는 (b4) 모티프를 갖는 서열로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 이에 따라 본 발명에 의해 포함되는 펩타이드 서열은 상기 (b1), (b2), (b3) 및 (b4) 모티프 중 둘 또는 셋 또는 그 이상의 병치일 수 있다. 그러나, 바람직한 펩타이드 서열은 (b1) 또는 (b2) 또는 (b3) 또는 (b4) 모티프, 보다 바람직하게는 단일 (b1) 또는 (b2) 또는 (b3) 또는 (b4) 모티프를 포함하거나 이로 구성된다. 보다 바람직한 펩타이드 서열은 (b1) 또는 (b2) 또는 (b4) 모티프로 구성되거나 이를 포함한다.
바람직한 화합물은 SEQ ID NO:12-21, 107-143, 바람직하게 20-21, 120, 122, 127-143, 보다 바람직하게 20, 21, 127, 128, 136-143, 보다 바람직하게 138, 141, 142, 143을 포함하거나 이로 구성된다.
(b1) 모티프를 포함하거나 이로 구성되는 보다 바람직한 펩타이드 서열은 실시예 1에서 발견된다: 컨트롤로서 사용된 L1을 제외하고 표 2의 모든 펩타이드 서열을 참조바람(SEQ ID NO: 1-10, L1은 SEQ ID NO: 11임). 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 해당 억제제를 얻기위한 상기 표의 각 펩타이드 서열에서, R은 Ω로 대체되어야 한다. 따라서, 바람직한 펩타이드 서열은 SEQ ID NO: 1-10을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 R은 Ω로 대체된다. 바람직한 억제제는 또한 실시예 1에서 발견된다(SEQ ID NO: 12-20). 따라서, 바람직한 억제제는 SEQ ID NO 12-20, SEQ ID NO:126, 127, 142를 포함하거나 이로 구성된다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:20, 127, 142를 포함하거나 이로 구성된다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO: 20을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 C-말단은 아미드의 첨가에 의해 변형된다. 가장 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:142를 포함하거나 이로 구성된다.
(b2) 모티프를 포함하거나 이로 구성되는 바람직한 펩타이드 서열은 표 5에 나타내었으며, 적어도 PAD4를 특이적으로 억제하는 화합물을 형성하는 것으로 예측된다: 표 5의 모든 펩타이드 서열을 참조바람(SEQ ID NO: 47-71). 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 해당 억제제를 얻기위한 상기 표의 각 펩타이드 서열에서, R은 Ω로 대체되어야 한다. 따라서, 바람직한 펩타이드 서열은 SEQ ID NO: 47-71을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 R은 Ω로 대체된다. 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:107-125, 129-141을 포함하거나 이로 구성된다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:120, 122, 129-141을 포함하거나 이로 구성된다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:136, 137, 138, 139, 140을 포함하거나 이로 구성된다. 가장 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:138을 포함하거나 이로 구성된다.
(b3) 모티프를 포함하거나 이로 구성되는 보다 바람직한 펩타이드 서열은 표 9에 나타내었으며, 적어도 PAD2를 특이적으로 억제하는 화합물을 형성하는 것으로 예측된다: 컨트롤로서 사용된 L1을 제외하고 표 9의 모든 펩타이드 서열을 참조바람(SEQ ID NO: 92-106, 컨트롤 L1으로서 SEQ ID NO: 11). 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 해당 억제제를 얻기위한 상기 표의 각 펩타이드 서열에서, R은 Ω로 대체되어야 한다. 따라서, 바람직한 펩타이드 서열은 SEQ ID NO:92-106을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 R은 Ω로 대체된다.
(표 5 및 9에 이미 나타낸 것들중에서 선택된) 표 10에 나타낸 바람직한 펩타이드 서열들은 PAD2 및 PAD4를 특이적으로 억제하는 화합물을 형성하는 것으로 예측된다: 컨트롤로서 사용된 L1 및 L2를 제외하고 표 10의 모든 펩타이드 서열을 참조바람. 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 해당 억제제를 얻기위한 상기 표의 각 펩타이드 서열에서, R은 Ω로 대체되어야 한다.
바람직한 억제제는 (b4) 모티프를 포함하거나 이로 구성되며, SEQ ID NO:21, 128, 143을 포함하거나 이로 구성되는 서열로 표현되는 펩타이드 부를 포함한다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:143을 포함하거나 이로 구성되는 서열로 표현된다. 보다 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:21을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 C-말단은 아미드의 첨가에 의해 변형된다. 이러한 억제제는 생체내 동물 모델에서 현저한 억제 활성을 나타내는 것으로 나타났기때문에 바람직하다(참조 실시예 10).
본 발명의 바람직한 화합물은 이의 (b1) 모티프내에 두 D 잔기를 갖는다. 이에 상응하는 펩타이드 서열은 G/S/T-D-Ω-D-G/S로 구성되거나 이를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 화합물은 이의 (b2) 모티프내에 두 D 잔기를 갖는다. 이에 상응하는 펩타이드 서열은 H/K/F/L/W-D-Ω-D-H/Y/F/W로 구성되거나 이를 포함한다.
보다 바람직한 화합물은 펩타이드 서열이 표 4, 5, 9 또는 10 중 어느 하나로 나타낸 바와 같은 것들이다(컨트롤로서 사용된 L1 및 L2를 제외하고 이러한 표의 모든 펩타이드 서열을 참조바람. 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 해당 억제제를 얻기위한 상기 표의 각 펩타이드 서열에서, R은 Ω로 대체되어야 한다).
보다 바람직한 화합물은 (컨트롤로서 사용된 L2로부터 유래된 것을 제외하고) 표 11, 12 또는 15 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 것들이다. 표 15의 억제제는 SEQ ID NO: 107-111로 나타내어진다. 바람직한 억제제는 SEQ ID NO:107-111을 포함하거나 이로 구성된다.
각각의 이러한 화합물은 PAD2 및/또는 PAD4 억제제인 것으로 분명하게 특징지어진다.
본 발명에 따른 화합물은 적어도 약 5 및 약 35이하, 바람직하게 약 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7 아미노산의 펩티드 부(peptide part)를 포함하며, PAD 효소와 상호작용할 수 있으며, 그리고 1nM 내지 1mM, 바람직하게 1nM 내지 100μM, 바람직하게 1nM 내지 10μM의 친화도(Km)를 가질 수 있다. 본 발명에서, 본 발명자들은 7아미노산의 길이가 상기 화합물에 대해 특이성을 부여하는데 충분하였으며(단지 PAD 효소, 바람직하게 PAD2 및/또는 PAD4만이 억제되며, 다른 효소 부류는 억제되지 않음), 그리고 강력한 PAD2 및/또는 PAD4 억제제임을 분명히 입증하였다. 이러한 길이는 이러한 화합물이 화학적으로 합성되기에 용이하므로 상당히 매력적이다. 이에 따라, 본 발명에 따른 화합물은 적어도 5 아미노산의 펩타이드 부 및 35이하, 바람직하게 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 아미노산의 펩타이드 부를 포함하며, 그리고 상기 정의한 바와 같이 PAD 효소와 상호작용할 수 있다. 바람직한 화합물은 7 아미노산의 길이를 포함하는 펩타이드 부를 포함한다. 여기서 펩타이드 서열은 좌에서 우로 읽혀지며, 좌측에 위치한 아미노(N-) 말단 및 우측에 위치한 카르복시(C-) 말단을 갖는다.
친전자성 기
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게 친전자성 기, 보다 바람직하게 티올 반응성 친전자성 기를 포함하며, 이는 임의로 스페이서 부(spacer moiety)를 통해 상기 펩티드 부에 연결된다. 친전자성 기는 저 전자 밀도를 갖는 부(친전자성으로도 불림)이며 이는 고 전자 밀도를 갖는 다른 부(친핵성으로도 불림)와 반응할 수 있다. 이러한 정황에서, 저 전자 밀도를 갖는 부는 이러한 부가 고 전자 밀도를 갖는 부에 비해 보다 낮은 전자 밀도를 갖는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 고 전자 밀도를 갖는 부는 저 전자 밀도를 갖는 부에 비해 보다 높은 전자 밀도를 갖는 부인 것으로 의미할 수 있다. 본 발명의 티올-반응성 친전자성 기, 바람직하게 플루오로아미딘 또는 클로로아미딘의 구조 및 특성은, 실온(또는 37℃)에서 상기 억제제의 티올-반응성 친전자성 기와 PAD 효소의 활성중심부내의 티올 기 사이에 화학 반응이 가능하여, 공유결합된 효소-억제제 복합체를 생성한다.
상기 친전자성 기 또는 바람직하게 티올-반응성 친전자성 기는 바람직하게 본 발명의 화합물에 나타낸 바와 같은 아미노산 Ω에 의해 운반된다. Ω는 어느 아미노산일 수 있다. Ω는 변형 아미노산일 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 PAD 효소, 바람직하게는 PAD2 및/또는 PAD4와 상호작용할 수 있으며, 이의 활성을 억제할 수 있으며, 바람직하게는 이에 한정하는 것은 아니나 PAD 효소상의 촉매 부위(또는 클레프트)에서 시스테인 잔기의 티올 부와 상호작용하거나 바인딩함으로써 활성을 억제할 수 있는 것으로 예측된다. 그 억제는 본 발명의 실시예에서 폭넓게 입증되었다.
티올 반응성 친전자성 기 또는 친전자성 기 또는 친전자성 트랩은 분자의 펩타이드 부에 연결되며, 임의로 스페이서 기 또는 부를 통해 연결되며, 그리고 당 기술분야의 숙련자에 의해 쉽게 선택될 수 있는 당 기술분야에 알려진 어느 티올 반응성, 친전자성 기일 수 있다. 본 명세서에서 하기 티올 반응성 친전자성 기는 생리학적 pH에서 수성 조건하에서 티올(SH) 기와, 특히 시스테인의 티올 기와 공유결합을 형성할 수 있는 어느 기를 의미한다. 바람직하게 티올 반응성 친전자성 기는 할로메틸 케톤, α,β-불포화 케톤, α,β-불포화 에스테르, α,β-불포화 설폰, α,β-불포화 아미드, α,β-불포화 설폰아미드, α,β-불포화 시아나이드, 비닐포스포네이트, 비닐포스포닉 산, 아지리딘, 말레이미드, 디아조메틸 케톤, 에폭시드 및 아미드로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
보다 바람직한 구현으로, 티올 반응성 또는 친전자성 기는 할로게노-아미딘 기이다. 본 명세서에서 용어 할로게노-아미딘은 구성 엘리먼트 -NH-C (=NH)-CH2-X(여기서, X는 할로겐임)를 갖는 기를 의미한다. 결과적으로, O(FA) 또는 플루오로아미딘은 하기 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다: -CH2-CH2-CH2-NH-C(=NH)-CH2-F. 그리고 O(CA) 또는 클로로아미딘은 하기 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다: -CH2-CH2-CH2-NH-C(=NH)-CH2-Cl. 할로게노아미딘기는 플루오로아미딘, 클로로아미딘, 요오드아미딘 또는 브로모아미딘일 수 있다. 최상의 결과는 플루오로아미딘으로 획득되었다.
보다 바람직한 구현으로, 티올 반응성 친전자성 기는 본 명세서에 나타낸 아미노산 Ω에 의해 운반된다. 따라서, 가장 바람직한 화합물로, 오르니틴은 친전자성 기 또는 트랩을 운반하며, 이는 할로게노-아미딘 기이며, 상기 할로게노아미딘 기는 플루오로아미딘, 클로로아미딘, 요오드아미딘 또는 브로모아미딘이다. 상기 오르니틴이 플루오로아미딘 또는 클로로아미딘을 운반하는 화합물이 보다 바람직하다. 상기 오르니틴이 플루오로아미딘을 운반하는 화합물이 가장 바람직하다.
예를 들어, 펩타이드내에서 흔하게 발견되는 카르복실산, 히드록실, 티올 및 아민 기에 스페이서를 커플링시키는 것과 같이, 펩타이드에 스페이서를 결합시키는 것은 일상적인 작업임은 당 기술분야의 숙련자의 범주내에 포함된다. 보통 프리 아민 기는 스페이서를 결합시키기에 매우 적합하다. 또한 친전자성 기를 스페이서에 커플링시키는 것은, 바람직하게 티올 기와 반응하는 티올-반응성 친전자성 기에 스페이서를 커플링시키는 것은 일상적인 실험에 지나지 않으며, 여기서 더 이상 자세한 설명은 필요로 하지 않는다.
본 발명에 따른 PAD 억제 분자의 펩타이드 부를 친전자성 기에, 바람직하게는 티올-반응성 친전자성 기에 연결시키는 스페이서는 1-12 탄소원자를 함유하는 선형 또는 분지형, 포화 또는 (다중) 불포화 사슬로 구성되는 연결기를 나타낼 수 있으며; 여기서 임의로 4-6 원자는 함께 포화 또는 방향족 고리를 형성할 수 있으며; 그리고/또는 여기서 임의로 1-6 탄소원자가 1-4 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 스페이서는 3-8 탄소원자를 함유하는 분지형 또는 선형 포화 또는 (다중)불포화 사슬로 구성되는 기이며; 여기서 임의로 4-6 원자는 함께 포화 또는 방향족 고리를 형성할 수 있으며; 그리고/또는 여기서 임의로 1-3 탄소원자는 1-3 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환될 수 있다.
바람직한 구현으로, 펩타이드 백본과 친전자성 트랩 또는 친전자성 기 또는 티올-반응성 친전자성 기 사이의 스페이서는 3-6 탄소원자를 포함하는 선형 포화 지방족 사슬이다.
시험관내 및 생체내에서 PAD 활성을 억제할 수 있는 본 발명에 따른 분자의 충분한 반감기를 보장하기 위해, 상기 분자의 펩타이드 부는 바람직하게 감소된 생분해성 및 충분한 생체이용률을 보장하도록 변형된다. 택일적으로, 상기 펩타이드는 예를 들어 말단에서의 펩티다아제 분해를 회피하도록 원형화될 수 있다. 또한 비자연발생 아미노산 및/또는 아미노산들은 일반적으로 인체에 존재하지 않으며, 또는 펩타이드-미메틱스가 분해 억제를 위해 그리고/또는 화학적 또는 생물학적 안정성 및 생체이용률을 증진시키기위해 상기 분자의 펩타이드 부에 사용될 수 있다. PAD 억제 분자의 펩타이드 부는 치료받는 대상자에게 상기 화합물의 투여 후에 생분해를 억제, 지연 또는 저해하기 위해 D-아미노산, β-아미노산, α-메틸 아미노산 및/또는 α-알케닐 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드 부의 C- 및/또는 N-말단의 변형
본 발명에 따른 화합물에서, 펩타이드의 카르복시 말단은 효소적 분해를 억제하며 그리고/또는 화학 안정성 및/또는 수용액에서의 용해도를 증가시키는 보호기로 변형되거나 연장될 수 있다. 본 발명의 화합물은 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 또는 알킬아릴 기인 C-말단 보호기를 포함할 수 있으며, 임의로 총 3 내지 약 25 원자를 포함하는 N, O, S 또는 할로겐 치환 부를 함유한다.
바람직하게, C-말단 보호기는 NH2, NH-NH2, NHR1-8, NH-NHR1-8, CH2CN, R1-8, CHR1-8R1-8, CR1-8R1-8R1-8, NR1-8R1-8 및 CH2-NR1-8R1-8로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 여기서 각 R1-8에 대해 독립적으로 다음과 같은 하나의 R1 내지 R8 이 선택되며, 그리고 여기서;
- R1은 1-12 탄소원자를 함유하는 분지형 또는 선형 포화 또는 (임의로 다중) 포화 사슬을 나타내며;
- R2는 탄소원자의 4-8이 고리부를 형성하는 1-12 탄소원자를 함유하는 알킬 기를 나타내며;
- R3는 위쪽 1-4 탄소원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환되는 R1 또는 R2를 나타내며;
- R4는 6-12 고리 탄소원자를 함유하는 아릴, 비스아릴 또는 융합 아릴 기를 나타내며;
- R5는 1-4 탄소원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환된 R4를 나타내며;
- R6은 알킬 부가 선형, 분지형 또는 고리형이며 1-6 탄소원자로 구성되며, 그리고 아릴 부는 6 탄소원자로 구성되는 알킬아릴 기를 나타내며;
- R7은 알킬 부내 1-3 원자 및/또는 아릴 부내 1-4 원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환된 R6을 나타내며; 그리고
- R8은 4-6 고리원자를 가지며, 이중 1-5는 탄소원자이며, 1-3은 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합인 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)티오알콕시, 니트로, 할로겐 및 헤테로시클릭 기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1-4 부가 치환체로 치환된 R1 내지 R7을 나타낸다.
본 발명에 따른 화합물의 펩타이드 부는 또한 상기 펩타이드의 아미노 말단에서 보호될 수 있다. 상기 아미노 말단은 보호기로 변형되거나 연장될 수 있으며, 여기서 N-말단 보호기는 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 또는 알킬아릴 기일 수 있으며, 임의로 총 3 내지 약 25 원자를 포함하는 N, O, S 또는 할로겐 치환 부를 함유하는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 N-보호기는 R1-8-C(O), R1-8-O-C(O), R1-8, R1-8-SO2로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 또는 동일하거나 다른 이러한 보호기가 둘 존재할 수 있으며, 여기서 각 R1-8에 대해 독립적으로 다음과 같은 R1 내지 R8중 하나가 선택되며, 여기서:
- R1은 1-12 탄소 원자를 함유하는 분지형 또는 선형 포화 또는 (임의로 다중) 불포화 사슬을 나타내며;
- R2는 4-8의 탄소원자가 고리 부를 형성하는 1-12 탄소원자를 함유하는 알킬 기를 나타내며;
- R3는 위쪽 1-4 탄소원자가 1-4 탄소원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환된 R1 또는 R2를 나타내며;
- R4는 6-12 고리 탄소원자를 함유하는 아릴, 비스아릴 또는 융합 아릴 기를 나타내며, 바람직하게 R4가 10 탄소원자를 갖는 아릴기(즉, 나프틸 기)인 R4-SO2 또는 2-나프틸설포닐 기이며;
- R5는 1-4 탄소원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환된 R4를 나타내며;
- R6은 알킬 부가 선형, 분지형 또는 고리형이며 1-6 탄소원자로 구성되며, 그리고 아릴 부는 6 탄소원자로 구성되는 알킬아릴 기를 나타내며;
- R7은 알킬 부내 1-3 원자 및/또는 아릴 부내 1-4 원자가 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합으로 치환된 R6을 나타내며; 그리고
- R8은 4-6 고리원자를 가지며, 이중 1-5는 탄소원자이며, 1-3은 N-, O- 또는 S-원자 또는 이의 조합인 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)티오알콕시, 니트로, 할로겐 및 헤테로시클릭 기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1-4 부가 치환체로 치환된 R1 내지 R7을 나타낸다.
바람직한 구현으로, 본 발명의 화합물은 펩타이드 서열의 N-말단이 아세틸 기로 변형되고 그리고/또는 C-말단이 아미드인 것이다. 이러한 화합물은 억제제로서 증가된 안정성을 갖는 것으로 발견되었다.
다른 바람직한 구현으로, 본 발명의 화합물은 펩타이드 서열의 N-말단이 2-나프틸설포닐 기의 첨가에 의해 변형된 것이다. 이러한 화합물은 억제제로서 증가된 안정성을 가지며, 그리고 PAD2 및 PAD4의 억제제로서 향상된 억제 활성 또는 향상된 효능을 갖는 것으로 예기치 않게 발견되었기 때문에(참조 실시예 9) 매력적인 특성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 화합물은 실시예 9에서 표 23으로 나타낸 바와 같은 서열 SEQ ID NO: 115 또는 119를 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 부를 포함한다.
다른 바람직한 구현으로, 본 발명의 화합물은 펩타이드 서열의 C-말단이 D-아미노산의 첨가에 의해 변형되는 것이다. 이러한 화합물은 억제제로서 증가된 안정성을 가지며, 그리고 이러한 변형에 의해 영향을 받지 않는 억제 활성을 갖는 것으로 예기치 않게 발견되었다(참조 실시예 9). 본 발명의 바람직한 화합물은 실시예 9에서 표 26으로 나타낸 바와 같은 서열 SEQ ID NO: 120-127을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 부를 포함한다.
보다 바람직한 구현으로, 본 발명의 화합물은 펩타이드 서열의 N-말단이 2-나프틸설포닐 기의 첨가에 의해 변형되고, 펩타이드 서열의 C-말단이 D-아미노산의 첨가에 의해 변형되는 것이다. 본 발명의 바람직한 화합물은 실시예 9에서 표 28로 나타낸 바와 같은 서열 SEQ ID NO: 128-135를 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 부를 포함한다.
여러 무극성 아미노산이 존재할 경우 용해도가 충분치 못할 수 있는 상기 펩타이드 부의 용해성을 증가시키기 위해, 상기 펩타이드 부는 용해도를 증진시키는 극성 기를, 특히 펩타이드 부의 N- 및/또는 C-말단에 첨가함으로써 변형될 수 있다. 이러한 가용화 기는 바람직하게 펩타이드 부의 N- 및/또는 C-말단과 N- 또는 C-말단 보호기 사이에 위치한 스페이서 부이다. 가장 바람직한 구현으로, 가용화 기는 구조식 NH-(CH2-CH2-O-)m-(CH2)n-C(O)(여기서, m=1-6이며, n=0, 1 또는 2임)을 갖는 극성 스페이서 부를 나타낸다.
PAD 활성은 세포외 공간에서 억제될 수 있음에도 불구하고, PAD 억제는 또한 예를 들어 유전자 발현을 변환시키기 위한 것과 같이, 예를 들어, 히스톤 및 다른 물질들의 시트룰린화를 억제하기 위해서 세포내에서 일어날 수 있다. 본 발명에 따른 PAD 억제 분자의 세포 흡수를 촉진 또는 증가시키기 위해, 다른 구현으로 상기 억제 펩타이드 분자는 단백질 트랜스덕션 도메인에 융합되거나 세포 침투 펩타이드에 융합될 수 있다. 여러 단백질 및 소 펩타이드는 생물학적 멤브레인을 통해 트랜스덕션되거나 이동하는 능력을 갖는다. 이러한 단백질의 예는 HIV-1 TAT 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1(HSV-1) DNA-바인딩 단백질 VP22, 및 드로조필라 안텐나페디아(Antp) 항상성 전사인자를 포함한다. 이러한 단백질의 소 단백질 트랜스덕션 도메인(PTDs)은 다른 마크로분자, 펩타이드 또는 단백질에 융합되어, 이들을 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 변형 폴리펩타이드를 포함하는 세포내로 성공적으로 이송시킨다. 트랜스덕션 도메인의 서열 정렬은 고 염기 아미노산 함량(Lys 및 Arg)을 나타내며, 이는 이러한 리전과 멤브레인내 음으로 하전된 지질의 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 2차 구조 분석 결과, 세 도메인 모두에서 일정한 구조가 발견되지 않았다.
본 발명에 따른 화합물은 시험관내에서 그리고/또는 생체내에서, 세포내에서 그리고/또는 세포외에서 PAD 효소를 억제할 수 있다. PAD2 및/또는 PAD4는 이러한 효소들이 자가면역 관련 시트룰린화 프로세스에 연루되는 효소들이기 때문에 가장 바람직하다.
조성물
다른 견지로, 본 발명은 본 명세서에 앞서 정의한 바와 같은 화합물 및 적어도 하나의 부형제를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 바람직하게 자가면역 질환, 바람직하게 인간에서 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물 또는 의약이다. 상기 조성물 또는 화합물은 또한 이러한 질병의 발달을 지연시키는데 사용될 수 있다. 자가면역 질병은 면역시스템이 내생성 항원을 표적하여 조직에 손상을 수반하는 질병이다. 일탈적인 시트룰린화는 종종 대상자의 면역 시스템에 의한 자가항원의 인지에 역할을 한다. 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물은 PAD 관련 및/또는 시트룰린화 관련 질병이나 질환, 또는 PAD 악화 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 PAD 억제 화합물 또는 조성물은 이에 한정하는 것은 아니나, RA, MS, 건선, 전신성 홍반성 루프스(SLE), 하시모토의 갑상선염, 그레이브병, 전신성 경화증(경피증), 신생아 루프스 증후군, 특발성 염증성 근질환, 청소년 만성 관절염, 건선성 관절염, 자가면역 간염, 혼합결합조직병(Mixed Connective Tissue Disease, MCTD), 쇼그렌 증후군 및 베게너 육아종증과 같은 자가면역 질환의 치료를 위한 의약 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물 및 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 다양한 투여 방식, 비경구 또는 경구용으로 적절한 약학적 조성물의 제형화는 당 기술분야에 알려져 있으며, Remminton Pharmaceutical Sciences, Mack publishing co., 1989에서와 같이 다양한 텍스트북에 기재되어 있다. 약학 조성물은 본 발명에 따라 주어진 화합물에 대해 및/또는 치료하고자 하는 자가면역 질병에 대해, 및/또는 체내로의 투여방식/위치에 대해 당 기술분야의 숙련자에 의해 적절히 맞추어질 수 있다. 본 발명의 PAD 억제 화합물을 면역억제제 및/또는 염증 저해제와 같은 다른 활성 화합물과 함께 약학 조성물 또는 제형으로 혼합하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 PAD 억제 분자와 혼합하여 사용될 수 있는 바람직한 면역억제 화합물의 예는 아자티오프린(Imuran), 시클로스포린(A), 머캅토퓨린(Purinethol, 6-MP)이며, 염증 저해제의 바람직한 예는 NSAIDs(비스테로이드 항염증 약물) 또는 프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드이다.
바람직한 구현으로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 RA의 치료용 조성물이며, 비경구용 조성물, 바람직하게는 염증이 생긴 관절상에 국부적으로 적용될 ㅅ 있는 연고 또는 부착 제형과 같은 국부 투여용 조성물이다. 가장 바람직하게 이러한 조성물은 예를 들어, 리포좀내 제형과 같이 PAD 억제 화합물의 경피 투여가 가능한 부형제를 포함한다. 다른 바람직한 구현으로, 본 발명에 따른 조성물은 RA의 치료를 위한 조성물이며 비경구용 조성물이며, 바람직하게 RA 발병된 그리고/또는 염증이 생긴 관절내로, 바람직하게 관절의 활액 유체내로 직접적으로 주입에 의한 국부 투여, 또는 임의로 단일 투여로 주입당 1㎍ 내지 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10mg의 농도로 관절내 활액 유체를 대체함으로써 국부 투여되며, 이는 화합물의 친화력 및 활성, 대상자의 관절 크기 및 염증의 강도에 따라 달라진다. 그러나, 본 발명의 억제 분자 또는 화합물의 고 특이성을 고려해 볼 때, 부작용은 거의 없을 것으로 예상되며, 경구 섭취 또는 정맥내 또는 근육내 주사를 통한 PAD 억제제의 전신성 투여가 다른 실행가능한 투여 경로이다.
특히, 본 발명에 따른 의약은 대상자에서, 바람직하게 인간에서 그리고 가장 바람직하게 RA 및 MS의 치료를 위해 상술한 바와 같은 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 정황상, 치료하고자 하는 유기체 또는 개체 또는 대상자는 동물 또는 인간일 수 있다. 바람직하게, 상기 유기체는 인간이다. 바람직하게, 치료되는 유기체는 예를 들어, 잠재적 유전적 성향, 및/또는 대상자의 연령 및/또는 대상자의 생활방식(예, 영양적 습관 및/또는 육체적 활동의 부재)에 기인하여 RA와 같은 자가면역 질병을 발달시키는 고 위험을 갖는 것으로 의심된다.
용어 "예방"은 완전한 예방, 예방 뿐만 아니라 상기 질병 또는 컨디션을 가진 병에 걸릴 개체의 위험을 낮추는 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 상기 용어는 또한 이미 발달된 증상의 완화를 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용된 용어 "지연"은 유기체, 즉 환자에게 상기 화합물을 투여하여, 치료하고자 하는 해당 컨디션의 예비적 형성이 당 기술분야에 알려진 방법에 의해 진단된 환자에서 환자가 치료하고자 하는 컨디션의 전단계에 있도록 하는 것을 의미한다. 바람직하게, 상기 질병의 증상의 출현이 적어도 수 개월 내지 1년 이상 지연된다.
용어 "치료"는 질병, 컨디션 또는 질환과 싸우는 목적으로 환자의 관리 및 보살핌을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 정의된 본 발명의 각 화합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 자가면역 질병을 예방, 지연 및/또는 치료하기 위해 사용되는데 적절하다.
따라서, 바람직한 구현으로, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 상술한 바와 같이 정의된 의약으로 사용된다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 동사활용형은 이에 따르는 아이템이 포함되며, 또한 특별히 언급되지 않은 아이템이 배제되지 않는 것을 의미하는 비제한적 견지로 사용된다. 또한, 부정관사 "a" 또는 "an"를 이용한 구성요소에 대한 언급은, 정황상 분명히 하나의 구성요고가 존재하고 단지 하나의 구성요소만이 존재한다는 것을 요구하지 않는 이상, 하나 이상의 구성요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "a" 또는 "an"은 보통 "적어도 하나"를 의미한다. 또한, 동사 "구성하다(to consist)"는 "필수적으로 구성하다(to consist essentially of)"로 대체될 수 있으며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같은 화합물 또는 조성물이 특별히 나타내지 않은 것들 이외에 부가 성분(들)을 포함할 수 있으며, 상기 부가 성분(들)은 본 발명의 독특한 특성을 변화시키지 않는 것이다. 발명의 정황상, 화합물에 대해 용어 "약"이 사용될 경우 (즉, 약 5 아미노산), 이는 5 내지 6 아미노산이 존재함을 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌들은 이의 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 어느 방식으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예:
실시예 1: 천연 기질에 기초한 억제제
PAD에 대한 여러 기질이 단백질 수준에서 확인되었다. 생체내에서 특히 단백질내의 아르기닌이 시트룰린(Cit)으로 전환될 수 있으며, 한편 다른 아르기닌들은 시트룰린으로의 전환에 대해 완전히 저항적인 것으로 나타났다. 이러한 관찰로부터 아르기닌 잔기 주위의 화학은 이의 기질 특성을 결정짓는 것으로 분명히 알 수 있다. PAD 효소에 의해 전환되는 아르기닌 주위에서 가장 빈번하게 발견되는 측면 아미노산의 정체를 조사하기 위해, 인간 PAD2 및 PAD4를 암호하는 cDNAs를 VSV-G 태그를 암호하는 서열을 프레임내에 갖는 진핵생물 발현 벡터 pCI-NEO(Promega, Leiden, The Netherlands)에서 클로닝하였다. 배양된 COS-1 또는 HEK293 세포는 그 결과 형성된 구성물로 트랜스펙팅되고, 이러한 세포에서 PADs의 발현은 트랜스펙션 후 48시간에 제조된 세포의 추출물 및 토끼에서 증가된 모노특이성 항-PAD 면역혈청을 이용한 면역블롯팅에 의해 입증되었다. 그 결과, PAD2 및 PAD4 모두 이러한 세포들에서 효율적으로 발현된 것으로 나타났다. 펩티딜시트룰린을 변형시키는 시약을 이용한 웨스턴 블롯의 처리{Senshu et al., 1992} 후, 항-변형 시트룰린 항체(AMC)를 이용한 이러한 세포들의 추출물을 분석한 결과, 세포에서 저 칼슘 농도에 기초하여 예측되는 바와 같이 시트룰린화 단백질이 검출될 수 없었다. 세포성 단백질의 시트룰린화가 일어나도록 하기 위해, 세포들은 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM β-머캅토에탄올, 100mM NaCl, 10% 글리세롤 및 EDTA-프리 프로테아제 억제제를 함유하는 버퍼에서 용해되고, 그 용해물은 후속적으로 10mM의 최종 농도로 칼슘 클로라이드 첨가 후 37℃에서 30분간 배양되었다. 컨트롤로서, 용해물은 5mM EDTA의 존재하에서 동시에 배양되었다. 화학적 변형 혼합물이 함유된 강화 니트로셀룰로즈 멤브레인 상에 단백질 전기-트랜스퍼 처리 후, AMC 항체를 이용한 면역블롯 분석 결과, 이러한 방법은 용해물내 다중 세포성 단백질의 칼슘- 및 PAD-의존성 시트룰린화를 형성한 것으로 나타났다(도 1).
중요하게, 다른 PAD 효소에 대해 획득된 시트룰린화 단백질의 패턴에서 차이가 관찰되었으며, 이는 PAD2 및 PAD4의 기질 특이성에 있어서 차이가 존재함을 나타내는 것이다. 후속적으로, 시트룰린화 단백질은 시트룰린화 에피토프에 특이적인 RA3 단일 사슬 항체 프레그먼트(scFv)를 이용한 면역친화 정제에 의해 세포 용해물로부터 분리되었다{Raats et al., 2003}. 정제된 단백질을 트립신으로 분해한 후, 그 결과 얻어진 펩타이드의 아미노산 서열을 탠덤 질량 분석에 의해 검출하였다. 질량 분석 데이타에 기초하여, 시트룰린화 잔기를 함유하는 펩타이드가 확인되었다. 총 90 및 57 시트룰린화 펩타이드는 각각, PAD2 및 PAD4를 발현하는 COS-1 세포로부터 유래된 단백질에서 확인되었으며, 그리고 107 및 38 시트룰린화 펩타이드는 각각, PAD2 및 PAD4에 대해 HEK-293 세포로부터 획득되었다. 시트룰린화 잔기의 5 잔기 N-말단 및 5 잔기 C-말단 사이의 각 위치에서 아미노산의 빈도는 이러한 부위의 조합 서열로부터 유래되었으며, 표 1에 나타내었다. 이러한 데이타 에 기초하여, 중심 위치에 아르기닌을 함유하는 PAD2- 및 PAD4-특이 13-mer 펩타이드가 합성되었다(표 2). 이러한 펩타이드가 인간 PAD2 및 PAD4 효소에 의해 시트룰린화된 효율은 이들을 박테리아에 의해 발현되는 His6-태그되고 IMAC 정제된 재조합 효소와 함께 인큐배이팅한 다음, MALDI-TOF 및 ESI-Q-TOF 질량 분석에 의해 산물을 분석하여 조사되었다. 이러한 펩타이드의 시트룰린화의 효율을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
시트룰린화 세포 용해물로부터 정제된 단백질 면역친화성은 시트룰린화 부위를 확인하기 위해 질량 분석에 적용되었다. 시트룰린화 펩타이드의 서열은 정렬되고, 시트룰린 측면 부위(시트룰린의 5 잔기 N-말단 내지 C-말단)에서 발견되는 아미노산의 빈도를 검출하고 인간 단백질에서 아미노산의 자연 발생에 대해 정상화되었다. 따라서, 1을 초과하는 값은 각 아미노산의 오버리프리젠테이션을 나타내며, 1미만의 값은 이러한 아미노산이 시트룰린화 부위에서 보다 덜 자주 발견되는 것을 나타낸다.
Figure pct00003
표 2는 하기 서열 SEQ ID NO:1-10으로 나타낸 펩타이드들을 포함한다. SEQ ID NO: 11은 컨트롤 L1을 나타낸다.
하기 아미노산 서열들이 억제제들의 합성을 위해 선택되었다:
PAD2에 대해
I-E-I-M-T-D-R-G-S-G-K-K-R(SEQ ID NO 5) 및
I-G-S-R-G-D-R-S-G-F-G-K-F(SEQ ID NO 6)
PAD4에 대해
D-D-Y-S-S-S-R-D-G-Y-G-G-S(SEQ ID NO 1) 및
G-G-Y-S-G-D-R-S-G-G-G-Y-G(SEQ ID NO 2)
이러한 서열로부터 유래된 초기 8 펜타펩타이드 억제제들을 평가하였다:
T-D-O(FA)-G-S(SEQ ID NO:12)
G-D-O(FA)-S-G(SEQ ID NO:13)
S-S-O(FA)-D-G(SEQ ID NO:14)
G-S-O(FA)-D-G(SEQ ID NO:15)
T-D-O(CA)-G-S(SEQ ID NO:16)
G-D-O(CA)-S-G(SEQ ID NO:17)
S-S-O(CA)-D-G(SEQ ID NO:18)
G-S-O(CA)-D-G(SEQ ID NO:19)
이러한 8 펜타펩타이드 억제제들은 SEQ ID NO:12-19로 나타내어진다.
(O(FA)는 오르니틴 플루오로아미딘을 나타내며, O(CA)는 오르니틴 클로로아미딘을 나타낸다.)
인간 PAD2 및 4 뿐만 아니라 마우스 PAD2 및 4에 대한 IC50을 Zendman 등{Zendman et al., 2007}에 의해 개발된 시험으로 측정하였다. 이러한 시리즈 중에서 억제제 T-D-O(FA)-G-S(CXP5-10)가 가장 우수한 PAD2 및 PAD4 억제제이었다. 후속적으로, 여러 변형으로 이러한 리드 화합물을 형성하였다. 제 2 라운드의 스크리닝 결과, G-D-O(CA)-G-S(CXP5.2-078)(SEQ ID NO:20) 및 Y-D-O(CA)-G-S(CXP5.2-081)(SEQ ID NO:21)이 T-D-O(FA)-G-S보다 더 강력한 것으로 나타났다. 또한, Ac-G-D-O(CA)-G-S-아미드(CXP5.7-012)(SEQ ID NO:142) 및 Ac-Y-D-O(CA)-G-S-아미드(CXP5.7-011)(SEQ ID NO:143)를 합성하였으며, 그 이유는 이들이 보다 높은 생체내 안정성을 갖는 것을 기대되었기 때문이다(참조 실시예 10).
최근에 공개된 PAD4 불활성화제인 Cl-아미딘{Luo et al., 2006}에 대해 가장 우수한 억제제와 비교하기 위해, 비색 시험법이 이용되었다(참조 실시예 6).
실시예 2: 비자연 기질에 기초한 억제제
앞선 시험으로부터, D-S-Q-F-A-F-R-G-A-S-A-S-D(여기서 L1:SEQ ID NO:11로 명명됨)는 PAD2 및 PAD4에 대한 기질임을 알아내었다. 보다 우수한 기질을 얻기위해, 그리고 강력한 억제제를 얻기위해, 본 발명자들은 기질 특성을 향상시키는 구조적 구성요소를 확인하려 하였다. 152개의 개별적인 유사 펩타이드의 셋트를 생성하였으며, 이는 포지션 -4 내지 -1 또는 1 내지 4 중 하나에서 하나의 아미노산이 L1과 차이가 났다.
표 3에서, 각 유사체의 전환(R에서 Cit 전환)이 표기되었다. 유사체의 값은 표준 조건하에서 L1의 전환과 비교한 유사체의 전환에 관한 것이다(100은 L1과 동등한 전환을 의미하며, 50은 L1의 50% 전환을 의미하며, 175는 L1의 175%의 전환을 의미한다). 100 이상의 수치는 따라서 기질 특성을 향상시키는 아미노산 치환에 관한 것이다.
Figure pct00004
상기 결과에 근거하여, 본 발명자들은 기질 특성을 향상시키는 다중 아미노산을 함유하는 25 펩타이드를 디자인하였다(참조 표 4). 나타낸 펩타이드들은 합성되고 이러한 그룹에서 가장 우수한 기질을 확인하기 위해 시험되었다.
Figure pct00005
표 4의 펩타이드는 하기 서열 SEQ ID NO:22-31 및 33-46으로 나타내어진다. 컨트롤 펩타이드는 컨트롤 L1으로서 하기 서열 SEQ ID NO:11 및 컨트롤 L2로서 SEQ ID NO:32로 나타내어진다. 불행히도, 설계된 펩타이드의 대다수는 본 발명자들의 LC-MS 시스템상으로 분석하기에는 너무 극성이었다(컬럼상에 포집되지 않은 n.t.로서 표 4에 나타냄). 본 발명자들은 따라서 소수성을 증가시키기 위해 두 부가적인 N-말단 F-잔기를 함유하는 이러한 펩타이드들을 생성하고 시험하였다. 이러한 형태에서 펩타이드들은 컬럼상에 포집되었으며 분석될 수 있었다(참조 표 5).
Figure pct00006
표 5의 펩타이드는 하기 서열 SEQ ID NO:47-71로 나타내어진다.
이러한 결과로부터, 이러한 일련의 펩타이드가 L1(0308-29)과 비교하여 향상된 기질 특성을 갖는 PAD4 기질을 함유함을 분명히 알 수 있다. 또한, 두 F-잔기의 편입은 특정 케이스에서 기질 특성을 향상시키는 것으로 여겨진다.
펩타이드 0608-31(L2로 명명됨)은 PAD4에 대해 보다 우수한 기질을 확보하기 위한 리드 화합물로서 선택되었다.
상기 방법과 매우 유사한 형식으로, L2가 리드 펩타이드로 취하여졌다. 또한 152 단일 아미노산 치환 펩타이드가 생성 및 시험되었다. 결과를 표 6에 나타내었다(설명을 위해 표 3을 참조바람).
Figure pct00007
상기 결과에 근거하여, 본 발명자들은 기질 특성을 향상시키는 다중 아미노산을 함유하는 20 펩타이드들을 디자인하였다(참조 표 7). 나타낸 펩타이드들은 이러한 그룹으로부터 가장 우수한 기질을 확인하기 위해 합성 및 시험되었다. 여기서 본 발명자들은 상기 실험과 비교하여 보다 적은 효소(3배 적음)를 갖는 시험 시스템을 사용하였다.
Figure pct00008
표 7의 펩타이드는 하기 서열 SEQ ID NO: 72-91 및 컨트롤(L2)로서 SEQ ID NO: 32로 나타내어진다.
이러한 결과는 제 2 최적화 라운드가 현저히 향상된 기질 특성을 갖는 펩타이드 기질을 제공하지 못하였음을 나타낸다.
PAD4와 유사한 방식으로, 본 발명자들은 PAD2에 대해 향상된 펩타이드 기질을 확인하였다. 또한 L1은 리드 화합물로서 사용되었다. 표 3의 일련의 152 펩타이드들이 사용되고 상술한 바와 같이 시험되었다.
Figure pct00009
상기 결과에 근거하여, 본 발명자들은 기질 특성을 향상시키는 다중 아미노산을 함유하는 15 펩타이드들을 디자인하였다(참조 표 9). 나타낸 펩타이드들은 이러한 그룹으로부터 최상의 기질을 확인하기 위해 합성 및 시험되었다.
Figure pct00010
표 9의 펩타이드들은 하기 서열 SEQ ID NO: 92-106 및 컨트롤(L1)로서 SEQ ID NO:11로 나타내어진다.
이러한 결과로부터, 이러한 일련의 펩타이드가 L1(0308-29)에 비해 향상된 기질 특성을 갖는 PAD 기질을 함유함을 분명히 알 수 있다.
PAD2 및 PAD4에 대해 최적화된 펩타이드 기질을 확보하기 위해, 표 4, 5, 7 및 9에 기재된 펩타이드들 중 36개를 선택하여 PAD2 및 PAD4에 대한 기질로 시험하였다. 후속적으로, **으로 표시된 5 펩타이드들이 추가 조사를 위해 선택되었다.
Figure pct00011
상기 나타낸 5 펩타이드들의 서열과 L2의 서열에 기초하여, PAD 억제제들을 생성하고 시험하였다. 억제제들은 기질 서열에서 R이 친전자성 트랩 또는 기(플루오로아미딘 또는 클로로아미딘)를 운반하는 오르니틴에 의해 대체되는 방식으로 생성되었다. 또한, 본 발명자들은 억제제들의 안정성을 증가시키기 위해 아세틸 기(Ac)로 N-말단을 변형하고 아미드로서 C-말단을 변형하였다. 참조 표 11 및 12.
Figure pct00012
O(FA)=Orn(플루오로-아미딘)
Figure pct00013
O(CA) = Orn(클로로-아미딘)
상기 억제제들은 PAD2 및 PAD4에 대한 이들의 억제 성능에 대해 시험되었다. 간략히, 다양한 농도의 억제제들을 일정한 농도의 기질(펩타이드 0708-30)과 혼합하였다. 후속적으로, PAD를 첨가하고, 배양한 후, 기질의 전환율을 검출하였다. 따라서, 전환율이 낮을 수록 보다 우수한 억제제이다. 그 결과를 표 13 및 14에 나타내었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
표 13 및 14의 결과는 이러한 그룹에서 O(FA)를 함유하는 억제제들이 O(CA)를 함유하는 이들의 카운터파트에 비해 PAD2 및 PAD4를 억제하는데 보다 효과적임을 나타낸다.
펩타이드 길이가 펩타이드의 억제 활성에 중요한지 조사하기 위해, 상기 펩타이드들은 또한 억제제들의 중간부로부터 이에 상응하는 7-mer로서 생성되고 시험되었다. 참조 표 15.
Figure pct00016
이러한 단축된 변이체들은 상기한 바와 같이 PAD2 및 PAD4에 대한 억제제로서 시험되었다. 그 결과를 표 16 및 17에 나타내었다.
Figure pct00017
Figure pct00018
이러한 결과는 7-mer 억제제가 예를 들어, 13-mer 및 15-mer 펩타이드에 비해 PAD2 및 PAD4에 대해 대략 동등하게 효과적인 억제제일 수 있음을 보여준다.
실시예 3: PAD에 대한 억제제의 바인딩 메카니즘
하기 실험에서, 다양한 양의 바이오티닐레이티드 억제제 펩타이드(바이오틴-Ahx-D-S-K-K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-아미드, O(FA) = 오르니틴 플루오로아미딘, Ahx = 6-아미노헥사노익 산)와 고정된 양의 His-태그 PAD4의 혼합물을 분석하였다. 간략히, 10㎕ PAD4 용액을 10㎕ 억제제 용액과 혼합하고, 37℃에서 3시간동안 배양하였다. SDS를 함유하는 로딩 버퍼를 첨가한 후, 시료를 5분간 끓이거나 실온으로 유지하였다. 시료를 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 전기영동하였다(약 1시간). 단백질을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하고 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제 접합체(도 2) 또는 마우스-항-His 항체로 그 다음, 염소-항-마우스 알칼린 포스파타아제 접합체(도 3)로 디벨로핑한 다음, NBT/BCIP를 이용하여 가시화하였다. 표 18에 시료들을 나타내었다.
Figure pct00019
도 2에서 억제제의 바이오틴기가 가시화된다. 바이오티닐레이티드 억제제가 존재하는 경우의 래인에서만 착색된 밴드가 나타났다. 밴드의 위치는 PAD4(77kDa)의 예측 분자량 주변이었다. 이는 PAD4에 바이오티닐레이티드된 펩타이드의 바인딩을 나타낸다. 이러한 바인딩은 SDS의 존재하에서 시료의 가열에 의해 깨지지 않는다.
도 3에서, PAD4의 His-태그가 가시화되었다. PAD4가 존재하는 경우의 래인에서만 착색된 밴드가 나타났다. 억제제만을 함유하는 래인 19는 이러한 밴드를 나타내지 않았다. 밴드의 위치는 PAD4(77kDa)의 예측 분자량 주변이었으며, 도 2에서와 동일한 위치이었다. 이는 두 블롯팅에서 밴드가 동일한 분자량을 나타냄을 보여주는 것이다. 결론적으로, 바이오티닐레이티드된 억제 펩타이드는 PAD4에 바인딩하는 것으로 나타났으며, 이러한 바인딩은 SDS의 존재하에서 시료의 가열에 대해 내성적이며, 이는 PAD4에 대한 억제제의 공유결합을 나타내는 것이다.
실시예 4: 억제 PAD 활성을 측정하기 위한 HPLC 어세이
이러한 어세이로 PAD 활성의 억제를 측정하였다. 형광 기질 Dns-Gly-Arg이 사용되었으며, 이는 PAD2 또는 PAD4(Dns=dansyl)에 의해 Dns-Gly-Cit로 전환되는 것이다.
PAD2 또는 PAD4는 고정된 농도의 기질과 다양한 농도의 억제제를 함유하는 혼합물과 함께 배양되었다. 전환율은 HPLC를 이용하여 정량화되고, 억제제의 효능을 나타내었다.
간략히, PAD, 기질 및 억제제를 함유하는 반응 혼합물(25㎕)을 37℃에서 배양하였다. 그 다음, 125㎕ 아세트산/물 15/85(v/v)를 첨가하여 전환을 종료하였다. 이러한 혼합물 중 75㎕를 형광 검출기가 장착된 HPLC에 적용하였다. 크로마토그래프 조건은 다음과 같았다:
컬럼: Vydac 218TP5415 C18-컬럼. 버퍼 A: 물/아세토니트릴 3/1(v/v)에 용해된 75mM 소디움 아세테이트 및 3.3mM 소디움 옥탄설포테이트, pH 4.0. 버퍼 B: 아세토니트릴. 구배: t=0분, 100% A; t=13분, 100% A; t=15분, 0% A; t=17분, 0% A; t=17.5분, 100% A, t=23분, 100% A. 검출: 형광 Ex 333nm, Em 533nm, 흐름 0.8ml/분.
실시예 5: PAD 활성 억제를 측정하기 위한 ABAP 어세이
PAD2 및 PAD4 활성의 억제를 측정하기 위해, 상업적으로 이용가능한 항체 기반 PAD 효소 활성 어세이(ModiQuest Research(cat no: MQ17.101)를 제조자 지시에 따라 사용하였다.
PAD 효소(최대 디이민화)는 다음과 같은 농도(4.9, 9.8, 19.5, 39, 78.1, 156, 313, 625, 1250, 2500 및 5000 μM)로 PAD 억제제와 혼합되고, 37℃에서 30분간 예비배양되었다. 예비배양후, PAD 효소와 억제제의 혼합물을 상기 웰에 첨가하여 75분의 추가 배양을 하였다. 이러한 96-웰 플래이트를 PBS로 완전히 세정한 후, 코팅에서 아르기닌을 시트룰린으로 전환시키는 비율을 적절한 항시트룰린항체를 사용하여, 그 다음 상기 항시트룰린항체를 인지하는 제 2 HRP-표지 항체를 사용하여 측정하였다. 두 항체와의 배양은 37℃에서 1시간동안 수행되었다. PAD 억제는 그 다음 PAD 활성을 50% 감소시키는 억제제의 농도인 IC50으로 계산될 수 있다.
표 19 및 20은 첫번째 8 펩타펩타이드 억제제 및 제 2 라운드 스크리닝(실시예 1)의 펩타이드 억제제로 얻어진 PAD2 및 PAD4의 억제에 대한 결과를 나타낸다.
PAD2 및 PAD4의 억제제로서 시험된 첫번째 8 펜타펩타이드 억제제
SEQ ID NO: 억제제들의 아미노산 서열 IC50 값(μM)
PAD2 PAD4
12 TDO(FA)GS 19 58
13 GDO(FA)SG 17 178
14 SSO(FA)DG 14 177
15 GSO(FA)DG 18 443
16 TDO(CA)SG 34 153
17 GDO(CA)SG 76 189
18 SSO(CA)DG 55 203
19 GSO(CA)DG 172 816
제 2 라운드의 스크리닝에서 최상의 억제제들의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 억제제들의 아미노산 서열 IC50 값(μM)
PAD2 PAD4
12 TDO(FA)GS 49 129
20 GDO(FA)SG 38 60
21 YDO(CA)GS 58 44
124 KFDO(FA)DFI 17 122
125 KWHO(FA)DFF 16 161
실시예 6: PAD 활성의 억제를 측정하기 위한 비색 어세이
억제제에 의한 PAD의 억제를 조사하기 위해 사용된 어세이중 하나는 종래에 기술된 비색 어세이이다{Sugawara et al. 1998}. 이러한 어세이에서, 벤조일아르기닌 에틸 에스테르(BAEE)는 50mM Tris-HCl, pH 7.6, 10mM CaCl2, 2mM 디티오트레이톨을 함유하는 버퍼에서 상기한 바와 같은 정제된 재조합 PAD 효소와 함께 37℃에서 3시간동안 배양하였다. BAEE를 벤조일시트룰린 에틸 에스테르로의 전환율을 모니터하기 위해, 반응 산물은 15% 황산, 12% 인산 및 0.16mg/ml FeCl3의 존재하에서 1.5mg/ml DAMO(디아세틸 모녹심) 및 1.0mg/ml 안티피린과 함께 100℃에서 10분간 배양되었다. 실온으로 냉각한 후, 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
본 시험에서 시험된 선택된 억제제들
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 서열
CXP5.3-014 - Bz-O(CA)-아미드
CXP5.3-015 - Bz-O(FA)-아미드
CXP5-101 126 MeO2C-T-D-O(FA)-G-S-메틸에스테르
CXP5.2-078 127 Ac-G-D-O(CA)-G-S
CXP5.2-081 128 Ac-Y-D-O(CA)-G-S
CXP5.2-097 129 Ac-F-D-O(FA)-D-F
0743-58FA 122 Ac-K-F-D-O(FA)-D-F-I-아미드
0741-03FA 109 Ac-F-F-D-S-H-K-F-D-O(FA)-D-F-I-Y-S-D-아미드
Bz = 벤조일, Ac = 아세틸, O(CA) = Orn(클로로아미딘), O(FA) = Orn(플루오로아미딘)
본 어세이에서 억제제들(참조 표 21)의 효능을 시험하기 위해, 표시된 바와 같은 재조합 PAD 효소를 다양한 농도의 억제 화합물과 함께 37℃에서 15분간 예비배양하였다.
이러한 비색 어세이에서 인간 PAD2(0.12μM) 및 PAD4(0.2μM)을 억제하는 다양한 화합물의 성능을 도 4에 나타내었다.
실시예 7: 질량 분석을 이용한 PAD 활성 측정 어세이
질량 분석을 이용한 PAD2 또는 PAD4에 의한 기질 펩타이드에서 아르기닌의 시트룰린으로의 전환은 다음과 같이 수행되었다. 후보 기질 펩타이드는 37℃에서 7시간동안 표시된 바와 같은 PAD와 함께 배양되었다. 반응은 아세트산의 첨가로 종료되었다. 시료를 Qtof 질량 분석기(Micromass, UK)로 분석하였으며, 질량 스펙트럼을 PAD로 처리하지 않은 동일한 펩타이드와 비교하였다. 보통 2+ - 및 3+ - 이온이 검출된다. 전환율(ΔM = 0.98Da)은 각각 2+ - 및 3+ - 이온에서 계산되었으며, 후속적으로 2+ - 및 3+ - 신호의 상대적 피크 높이를 고려하여 평균을 내었다(참조 도 5).
실시예 8: PAD 2/4에 대한 억제제들의 특이성을 측정하기 위한 어세이
PAD 효소에 대한 억제제들의 특이성을 모니터하기 위해, 화합물들은 또한 유사 PAD 효소가 활성 중심부에 시스테인(또는 Cys-His-Asp 트리아드)을 함유하는 일련의 효소들에 대해 시험되었다.
선택된 효소들은 펩티다아제 C1 패밀리 파파인의 시스테인 프로테아제(EC 3.4.22.2), 포유류 시스테인 엔도펩티다아제 카스파아제-3(EC 3.4.22.56), 포유류 칼슘 의존성 단백질-글루타민-γ-글루타밀트랜스퍼라아제 또는 트랜스글루타미나아제(TG)(EC 2.3.2.13), 포유류 ATP:크레아틴 N-포스포트랜스퍼라아제 또는 크레아틴 키나아제(CK)(EC 2.7.3.2) 및 마지막으로 구아니디노-기 변형 효소(GME) 인간 N(G), N(G)-디메틸-L-아르기닌 디메틸아미노히드롤라아제 아이소타입 1(hDDAH-1)(EC 3.5.3.18)을 포함하였다.
GME 상과는 (메틸레이티드) 구아니딘 기의 변형을 촉매하는 효소들로 구성된다. 이러한 상과의 구성원은 주요 촉매 잔기의 전환으로 특성화되며, 이러한 효소들의 특정 기질 및 산물이 상이함에도 불구하고, 이들의 촉매 메카니즘은 활성부 Cys 잔기의 친핵성 공격에 의해 형성되는 유사한 공유 S-알킬-티오우라늄 중간물을 통해 진행되는 것으로 제시된다{Shirai et al., 2006}. PAD 효소 및 hDDAH-1은 이러한 상과에 속한다.
인간 DDAH-1은 N(G)-메틸-L-아르기닌(MMA) 및 비대칭 N(G), N(G)-디메틸-L-아르기닌(ADMA)이 각각 L-시트룰린 및 메틸아민 또는 디메틸아민으로 가수분해되는 것을 촉매작용한다.
hDDAH-1 활성을 측정하는데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 L-시트룰린에서 우레이도기의 디아세틸 모녹심(DAMO) 유도화를 통한 착색 산물 형성에 의존한다. 이러한 어세이는 96-웰 포맷으로 DDAH 활성을 모니터하는 것으로 최적화되었다{Knipp et al., 2000}.
정제된 재조합 His6-태그 hDDAH-1은 어세이 버퍼(100mM Na2HPO4, pH 8.0)에서 이의 기질 ADMA와 함께 37℃에서 배양되었다. 반응은 0.3M 트리플루오로아세트산의 첨가로 종료되었다. 형성된 L-시트룰린은 15% 황산, 12% 인산 및 0.16mg/ml FeCl3의 존재하에서 100℃에서 10분간 1.5mg/ml DAMO(디아세틸 모녹심) 및 1.0mg/ml 안티피린으로 변형되었다. 실온으로 냉각한 후, 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
정제된 재조합 카스파아제-3를 이의 상업적으로 이용가능한 기질인 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-p-니트로아닐리드(Ac-DEVDpNA)과 함께 CFS 버퍼(220mM 만니톨, 68mM 수크로즈, 2mM NaCl, 2.5mM KH2PO4, 10mM HEPES, pH 7.4 + 프로테아제 인히비터의 칵테일)와 함께 배양시, 기질이 분할되고, pNA가 방출되고, 이의 405nM에서의 흡광도가 모니터될 수 있다.
파파인의 활성은 반응 버퍼(25mM Tris-HCl, pH 7.6; 150mM NaCl)에서 pGlu-Phe-Leu-pNA의 분할에 기초한 유사 실험 설정을 이용하여 평가되었다.
CK 및 TG(모두 Sigma-Aldrich(Schneldorf, 독일)로부터 구입)의 활성은 상업용 키트 CK NAC activated liquiUV test(Human GmbH, Wiesbaden, Germany) 및 TRANSGLUTAMINASE(Sigma-Aldrich(Schnelldorf, Germany))의 효소 어세이를 제조자의 지시에 따라 수행하여 평가되었다.
전형적으로, 상기 화합물들의 억제 특성은 효소들을 다양한 농도의 억제제들(50μM 내지 2.5mM)로 실온에서 10분간 처리한 다음 활성을 평가하는 것으로 평가되었다. 이러한 실험의 결과를 표 22에 나타내었다.
PAD 억제제들에 의한 다양한 효소들의 촉매 활성의 억제
IC50 값(μM)
억제제 CXP5-101 CXP5.2-078 CXP5.2-081 0748-09FA 0743-58FA
효소
hPAD2* 35 >500 200 nt** 35
hPAD4* 10 18 10 nt** 6
hDDAH-1 >2000 1200 1330 nt** >2000
Caspase-3 >1000 1000 >1000 >1000 920
크레아틴 키나아제 780 780 1000 1000 800
트랜스글루타미나아제 600 730 >1000 >1000 1000
파파인 >2000 1050 >2000 >2000 >2000
* 값들은 실시예 6에 기재된 비색 어세이로 측정되었다.
** 0748-09FA에 의한 hPAD2, hPAD4 및 hDDAH-1의 억제는 비색 어세이로 시험할 수 없었으며, 그 이유는 이러한 억제제는 본 시험에 사용된 시약들과 호환되지 않기 때문이었다.
표 22로부터, 시험된 억제제들은 이들의 활성 부위와 관련하여 PAD 효소와 유사한 점에 기초하여 선택된 효소 그룹의 멤버들과 비교하여 PAD2 및 PAD4에 대해 높은 특이성을 나타냄을 분명히 알 수 있다.
실시예 9: 변형 N-말단 및/또는 C-말단에서 선택된 D-아미노산을 갖는 향상된 억제제
상기 실시예 2에 기재된 억제제들은 N-말단에 아세틸 기 및 및 C-말단 아미드를 함유한다. 이러한 변형은 일부 엑소펩타다아제에 의한 단백질 가수분해에 대하여 억제제를 보호하지만, 특정 엑소펩티다아제는 아세틸레이티드 또는 아미데이티드 펩타이드를 가수분해할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 소 친수성 스페이서 기 2-(2-아미노에톡시)-에톡시-아세트산(AEEAc)을 억제제의 C-말단에 첨가하는 것은 카르복시펩티다아제에 의한 분해에 대해 보호를 제공할 것으로 가정하였다.
상기한 억제제들 0743-58FA 및 0748-09FA의 서열에 근거하여, 본 발명자들은 이러한 변형들 중 하나만 함유하거나 모두 함유하는 억제제들을 합성하고 시험하였다. 참조 표 23.
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 서열
0743-58FA 122 Ac-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-아미드
0837-13FA 130 Ac-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-X-아미드
0837-27FA 131 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-X-아미드
0837-29FA 132 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-아미드
0748-09FA 120 Ac-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-아미드
0837-14FA 133 Ac-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-X-아미드
0837-28FA 134 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-X-아미드
0837-30FA 135 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-아미드
Ac = 아세틸, Naf = 2-나프틸설포닐, X = AEEAc
변형 억제제들은 PAD2(표 24) 또는 PAD4(표 25)를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험되었다.
PAD2의 억제
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 억제제 농도
80μM 40μM 20μM 10μM 0μM
0743-58FA 122 9 15 26 39 74
0837-13FA 130 11 20 30 43 74
0837-27FA 131 4 7 14 24 74
0837-29FA 132 2 5 9 16 74
0748-09FA 120 4 8 14 25 76
0837-14FA 133 8 14 24 38 76
0837-28FA 134 2 4 8 17 76
0837-30FA 135 1 2 3 9 76
PAD4의 억제
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 억제제 농도
80μM 40μM 20μM 10μM 0μM
0743-58FA 122 13 18 36 46 71
0837-13FA 130 16 23 33 48 71
0837-27FA 131 7 12 20 35 71
0837-29FA 132 5 10 16 33 71
0748-09FA 120 18 27 38 51 67
0837-14FA 133 21 29 39 54 67
0837-28FA 134 9 17 23 37 67
0837-30FA 135 7 13 24 37 67
예기치 않게도, 효소 분해에 대해 향상된 안정성을 갖도록 디자인된 억제제들중 일부는 PAD2 및 PAD4의 억제제와 같은 향상된 효능을 나타낸 것이 주목되었다. 표 24 및 25로부터 알 수 있는 바와 같이, N-말단에 2-나프틸설포닐 기의 첨가는 억제제의 효능을 현저히 증가시키며, 한편 C-말단에 AEEAc 기의 첨가는 이러한 효과를 부분적으로 약화시킨다.
억제제의 C-말단에 AEEAc 기의 첨가는 효능을 감소시키기 때문에, 본 발명자들은 엑소펩티다아제 활성을 억제하는 것으로도 알려진 D-아미노산의 도입에 기초한 일부 다른 C-말단 변형에 대해 조사하였다. 표 26은 PAD2 억제를 위해 사용된 펩타이드를 나타내며, 표 27은 이러한 실험의 결과를 나타낸다. 표 28은 PAD4 억제에 사용된 펩타이드를 나타내며, 표 29는 이러한 실험의 결과를 나타낸다.
PAD2를 억제하는 억제제들의 C-말단에 D-아미노산의 도입의 효과를 시험하는데 사용된 펩타이드 서열(보다 낮은 케이스=D-아미노산)
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 서열
0743-58FA 122 Ac-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-아미드
0838-91FA 136 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-아미드
0838-88FA 137 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-y-아미드
0838-89FA 138 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-k-아미드
0748-09FA 120 Ac-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-아미드
0838-90FA 139 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-아미드
0838-86FA 140 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-y-아미드
0838-87FA 141 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-k-아미드
Ac = 아세틸, Naf = 2-나프틸설포닐
PAD2의 억제
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 억제제 농도
80μM 40μM 20μM 10μM 0μM
0743-58FA 122 9 15 24 37 72
0838-91FA 136 4 8 14 26 72
0838-88FA 137 6 11 21 38 72
0838-89FA 138 4 8 13 25 72
0748-09FA 120 4 8 12 22 73
0838-90FA 139 1 2 3 6 73
0838-86FA 140 2 3 7 11 73
0838-87FA 141 2 3 5 8 73
PAD4를 억제하는 억제제들의 C-말단에 D-아미노산의 도입의 효과를 시험하는데 사용된 펩타이드 서열(보다 낮은 케이스=D-아미노산)
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 서열
0837-29FA 132 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-I-아미드
0838-91FA 136 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-아미드
0838-88FA 137 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-y-아미드
0838-89FA 138 Naf-K-F-D-Orn(FA)-D-F-i-k-아미드
0837-30FA 135 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-F-아미드
0838-90FA 139 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-아미드
0838-86FA 140 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-y-아미드
0838-87FA 141 Naf-K-W-H-Orn(FA)-D-F-f-k-아미드
Naf = 2-나프틸설포닐
PAD4의 억제
펩타이드 코드 SEQ ID NO: 억제제 농도
80μM 40μM 20μM 10μM 0μM
0837-29FA 132 5 9 15 29 69
0838-91FA 136 5 8 14 25 69
0838-88FA 137 4 8 14 24 71
0838-89FA 138 8 13 19 31 71
0837-30FA 135 6 12 20 37 74
0838-90FA 139 6 11 18 31 74
0838-86FA 140 4 10 18 33 67
0838-87FA 141 10 14 23 40 67
상기 결과로부터, 카르복시펩티다아제에 의한 분해에 대해 억제제들을 보호하기 위해 억제제들의 C-말단에 D-아미노산을 도입하는 것은 C-말단 비변형 억제제들에 비해 감소되지 않은 억제 효능을 나타내는 억제제들을 제공함을 분명히 알 수 있다.
상기 결과는 PAD2 및 PAD4에 대한 바람직한 억제제들은 N-말단에 2-나프틸설포닐 기를 함유하며 C-말단에 선택된 D-아미노산을 함유하는 것임을 제시한다.
실시예 10: 생체내 동물 모델에서 두 PAD 억제제들의 억제 효과의 입증
인간 PAD2 및 PAD4 억제제에 기초한 펩타이드 중 하나를 상업적으로 이용가능한 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 마우스 모델(Modiquest research B.V., product number 18.101)에서 시험하였다. 실험 방법은 제조자 지시에 따라 수행되어 마우스에서 관절염을 유도하였다(http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf). 간략히, 0일에 8주령의 수컷 DBA/J1 마우스(5마리/그룹)에 8 항콜라겐 항체의 혼합물을 i.p. 주사를 행하였다(2.8mg/마우스). 3일에, (염증 반응을 자극시키고 동시에 발생시키기 위해) 마우스에 25μg LPS를 함유하는 또 다른 i.p. 주사를 행하였다.
3일부터 한 그룹의 마우스에 펩타이드계 억제제 CXP5.7-011(SEQ ID NO:143)를 11일까지 매일 i.v. 주사하였다. 단, 9일째에만 주사하지 않았다. 플라시보 그룹의 마우스에는 동일한 스킴에 따라 플라시보를 주사하였다(PBS내에 용해된 20mM 포스페이트).
동물들은 이들의 다리에서 염증 정도에 대해 매일 평가되었다. 평가는 표 30에 따라 다리에서 수행되었다. 동물에 대한 관절염 평가는 각 다리에 대한 4 점수들의 합이며, 이에 따라 각 동물에서 최대 관절염 평가점수는 8이 될 수 있다.
관찰된 붓기 각 다리에서의 평가점수
1-2 부운 발 0.25
3-4 부운 발 0.50
약간 부운 풋패드 또는 발목 0.50-0.75
부운 풋패드 또는 발목 +/- 발 1.00
부운 발 + 약간 부운 풋패드 1.25
부운 발 + 부운 풋패드 1.5
부운 풋패드 + 부운 발목 2.00
이러한 투여량 및 투여 경로를 통해서 억제제들의 투여가 동물들에 대해 이들의 다리에서 붓기를 완전히 보호할 수는 없었으나, 이러한 실험은 분명히 이러한 모델에서 억제제의 억제 가능성을 입증한다.
실시예 11: 펩타이드의 생성을 위한 합성 방법
모든 펩타이드들은 하기 일반적인 방법들을 이용하여 제조되었다:
일반 방법 I: 링크 AM 수지에 N-Fmoc-아미노산의 결합(필요시)
드라이 DMF(2ml)로 1시간동안 붓게한 후, 링크 AM 수지(150mg, 이론치 0.68mmol/g, 0.10mmol)을 DMF로 세정하고(2×2ml), DMF내에 용해된 50% 피페리딘으로 15분간 처리하였다(2×2ml). 그 수지를 DMF로 세정하고(4×2ml), 드라이 DMF(3ml)에 용해된 Fmoc-보호된 아미노산(4당량, 0.4mmol), PyBOP(4당량, 0.4mmol) 및 NMM(4당량, 0.4mmol)의 용액으로 실온에서 3시간동안 처리하였다. 그 수지를 DMF로 세정하였다(5×2ml). 최종적으로, 그 수지를 진공 하에 건조하여 수지-결합된 N-Fmoc 아미노산을 생성하였다.
일반 방법 IIa: Fmoc 보호
Fmoc-보호 수지를 DMF에 용해된 20% 피페리딘의 용액에 서스펜딩시키고(3×2ml), 3, 10 및 10분간 교반하였다. 그 수지를 DMF로 세정하였다(6×2ml).
일반 방법 IIb(합성기): Fmoc 보호
적절한 Fmoc-보호 아미노산(10μmol)을 운반하는 미리 로딩된 Tentagel S Ac 수지 또는 Tantagel S AM 수지를 NMP로 세정하고(3×0.8ml), NMP에 용해된 20% 피페리딘으로 처리하였다(3×3분, 0.8ml). 그 수지를 NMP로 세정하였다(6×0.8ml).
일반 방법 IIIa: PyBOP/NMM을 이용한 커플링
Fmoc-아미노산(4당량), PyBOP(4당량), 및 NMM(4당량)을 DMF(2ml)에 용해하고, 상기 수지에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 90분간 쉐이킹하고 DMF로 세정하였다(5×2ml).
일반 방법 IIIb(합성기): PyBOP/NMM을 이용한 커플링
상기 수지에 Fmoc-아미노산(6당량, NMP내에 0.6M), PyBOP(6당량, NMP내에 0.67M) 및 NMM(12당량, NMP내에 33% 용액)을 첨가하였다. 커플링 반응은 이따금씩 쉐이킹하면서 90분간 수행되었으며, 커플링의 마지막에 수지를 NMP로 세정하였다(6×0.8ml).
일반 방법 IVa: 아세틸 말단기의 도입
아세틱 안하이드라이드(5당량) 및 DIPEA(10당량)을 DMF에 용해하여 0.5M 용액을 생성하였으며, 이는 상기 수지에 첨가되었다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 쉐이킹하고 DMF(3×2ml) 및 DCM(2×2ml)로 세정하였다.
일반 방법 IVb(합성기): 아세틸 말단기의 도입
Fmoc-아미노산 대신에 아세트산을 이용하여 노말 커플링을 수행하였다.
일반 방법 Va: Mmt 탈보호
상기 수지를 DCM, 트리플루오로에탄올과 아세트산의 혼합물로(7:2:1, 2ml) 15분간 처리하였다. 이 공정을 7회 반복하였다. 후속적으로, 그 수지를 DCM(2×2ml), DMF(2×2ml), DMF내에 용해된 10% NMM(2×2ml) 및 DMF(2×2ml)로 세정하였다.
일반 방법 Vb(합성기): Mmt 탈보호
상기 수지를 DCM, 트리플루오로에탄올, 및 아세트산(7:2:1)의 혼합물 1.5ml로 4×25분 처리하였다. 후속적으로, 상기 수지를 DCM(2×1.5ml), NMP(2×1.5ml) 및 NMP내에 용해된 10% NMM(2×1.5ml, 3분)으로 세정하였다.
일반 방법 VIa: 할로-아미딘 부의 도입
에틸 2-클로로아세트이미데이트 하이드로클로라이드(5당량) 및 DIPEA(10당량)를 DMF(2ml)에 용해하고, 상기 수지에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 4시간동안 쉐이킹하고, DMF(4×2ml)로 세정하였다.
일반 방법 VIb(합성기): 할로-아미딘 부의 도입
에틸 2-클로로아세트이미데이트 하이드로클로라이드(10당량) 및 DIPEA(20당량)을 NMP(0.2ml)에 용해하고, 상기 수지에 첨가하였다. 그 반응은 1시간동안 이따금씩 쉐이킹하면서 수행되었다. 상기 수지를 NMP, DCM 및 에테르로 세정하였다.
일반 방법 VIIa: 트리플루오로아세트산을 이용한 분할
상기 수지를 TFA, 물 및 트리이소프로필실란(95:2.5:2.5, 2ml)의 혼합물로 실온에서 2시간동안 처리하였다. 상기 수지를 TFA(2×2ml)로 세정하고, 그 혼합 여액을 N2의 스트림하에 농축하고, 톨루엔(3×2ml)으로 공동증발시켰다. 조 산물을 MeOH와 Et2O의 혼합물로 침전하여 황백색 고형물로서 산물이 생성되었다.
일반 방법 VIIb 펩타이드(합성기로부터 얻어짐): 트리플루오로아세트산을 이용한 분할
상기 수지를 5% 물을 함유하는 1ml TFA로 2.5시간동안 처리하였다. W가 펩타이드에 존재하는 경우, 5% 트리에틸실란을 또한 분할 혼합물에 첨가하였다. 펩타이드를 9ml 에테르/펜탄 1/1로 침전시키고, 원심분리에 의해 분리하였다. 침전물을 분리하고, 물 또는 물/아세트산에 용해하고 동결건조시켜 백색 고형물이 생성되었다.
Fmoc-Orn(Mmt)-OH·DIPEA의 합성
DCM(300ml)내에 담긴 Fmoc-Orn-OH·HCl(5g, 12.79mmol)의 서스펜션에 클로로트리메틸실란(5.07ml, 39.7mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류로 가열하고 1시간동안 교반하였다. 반응을 0℃로 냉각한 후, DIPEA(12.26ml, 70.4mmol)를 서서히 첨가하고, 그 혼합물을 1시간의 기간에 걸쳐 실온으로 데워지도록 하였다. Mmt-Cl(4.35g, 14.07mmol)를 첨가하고, 그 오렌지색 용액을 4.5시간동안 교반하였다. 그 다음, MeOH(85ml)를 첨가하고, 그 반응을 40℃로 20분간 가열하였다. 이렇게 얻어진 연노랑색의 용액을 염수/H2O(2:1, 2×200ml)로 세정하였다. 수상을 DCM(150ml)으로 추출하고, 혼합 유기상은 Na2SO4를 통해 건조되고 진공하에서 농축되었다. 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(용리액으로서 EtOAc:톨루엔:MeOH:DIPEA = 10:10:3:0.2, 그 다음 EtOAc:톨루엔:MeOH:DIPEA = 10:10:4:0.2 를 사용함)에 의한 정제, 그 다음 DCM(3×100ml)으로 공동증발시켜 백색 고형물(8.66g, 90%)로서 산물이 생성되었다.
에틸 2-클로로아세트이미데이트 하이드로클로라이드의 합성
이 화합물은 Stillings et al.{Stillings, 1986}에 의해 기술된 방법에 따라 합성되었다.
에틸 2-플루오로아세트이미데이트 하이드로클로라이드의 합성
이 화합물은 Hughes et al.{Hughes, 1990}에 의해 기술된 방법에 따라 합성되었다.
참고문헌
Figure pct00020

Figure pct00021

Figure pct00022

Figure pct00023

Figure pct00024

Figure pct00025
<110> Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Modiquest bv Chiralix bv <120> Peptidylarginine Deiminase (PAD) inhibitors <150> EP 08158330.4 <151> 2008-06-16 <150> US 61/061,754 <151> 2008-06-16 <160> 143 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Asp Asp Tyr Ser Ser Ser Arg Asp Gly Tyr Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Gly Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Ser Gly Gly Gly Tyr Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Asp Gly Tyr Gly Gly Ser Arg Asp Ser Tyr Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Asp Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Asp Gly Tyr Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 5 Ile Glu Ile Met Thr Asp Arg Gly Ser Gly Lys Lys Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 6 Ile Gly Ser Arg Gly Asp Arg Ser 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<220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for Ornithine fluoroamidine <400> 13 Gly Asp Xaa Ser Gly 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 14 Ser Ser Xaa Asp Gly 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 15 Gly Ser Xaa Asp Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 16 Thr Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 17 Gly Asp Xaa Ser Gly 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 18 Ser Ser Xaa Asp Gly 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 19 Gly Ser Xaa Asp Gly 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 20 Gly Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 21 Tyr Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 22 Asp Ser Lys His His Ser Arg Asp His Leu Glu Ser Asp 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 23 Asp Ser Lys His Lys Asp Arg Glu Tyr Val Phe Ser Asp 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> 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Ala Phe Ala Ser Asp 1 5 10 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 106 Asp Ser Lys Phe Ala Phe Arg Gly Gly Ile Ala Ser Asp 1 5 10 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 107 Phe Phe Asp Ser Lys His Phe Asp Xaa Glu Trp Ile Trp Ser Asp 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 108 Phe Phe Asp Ser His Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Tyr Ser Asp 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands ornithine fluoroamidine <400> 109 Phe Phe Asp Ser His Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Tyr Ser Asp 1 5 10 15 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 110 Phe Phe Asp Ser His Lys Leu His Xaa Glu Trp Met Trp Ser Asp 1 5 10 15 <210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 111 Asp Ser His Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> MISC_FEATURE, X stands for ornithin fluoroamidine <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 112 Asp Ser Lys Lys His Asp Xaa Asp Phe Leu Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 113 Phe Phe Asp Ser Lys His Phe Asp Xaa Glu Trp Ile Trp Ser Asp 1 5 10 15 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 114 Phe Phe Asp Ser His Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Tyr Ser Asp 1 5 10 15 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 115 Phe Phe Asp Ser His Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Tyr Ser Asp 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 116 Phe Phe Asp Ser His Lys Leu His Xaa Glu Trp Met Trp Ser Asp 1 5 10 15 <210> 117 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 117 Asp Ser His Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 118 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 118 Asp Ser Lys Lys His Asp Xaa Asp Phe Leu Tyr Ser Asp 1 5 10 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 119 His Phe Asp Xaa Glu Trp Ile 1 5 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 120 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 121 Lys Leu His Xaa Glu Trp Met 1 5 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 122 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile 1 5 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 123 Lys His Asp Xaa Asp Phe Leu 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 124 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 125 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe 1 5 <210> 126 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 126 Thr Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 127 Gly Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 128 Tyr Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 129 Phe Asp Xaa Asp Phe 1 5 <210> 130 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for AEEAc <400> 130 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Xaa 1 5 <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for AEEAc <400> 131 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Xaa 1 5 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 132 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile 1 5 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for AEEAc <400> 133 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Xaa 1 5 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for AEEAc <400> 134 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Xaa 1 5 <210> 135 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 135 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe 1 5 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 136 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 137 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Tyr 1 5 <210> 138 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 138 Lys Phe Asp Xaa Asp Phe Ile Lys 1 5 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 139 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe 1 5 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 140 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Tyr 1 5 <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine fluoroamidine <400> 141 Lys Trp His Xaa Asp Phe Phe Lys 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 142 Gly Asp Xaa Gly Ser 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> MISC_FEATURE, Xaa stands for ornithine chloroamidine <400> 143 Tyr Asp Xaa Gly Ser 1 5

Claims (15)

  1. 펩타이드 부 및 아미노산 Ω에 의해 운반되는 티올-반응성 친전자성 기를 포함하며, 여기서
    (a) 상기 펩타이드 부는 적어도 약 5 아미노산 내지 약 20 이하의 아미노산을 포함하며,
    (b) 상기 펩타이드는 모티프 (b1), (b2), (b3) 또는 (b4) 중 적어도 하나를 포함하며:
    (b1) G/S/T - D/S - Ω - D/G/S - G/S
    (b2) H/K/F/L/W - S/D/H - Ω - D/E - H/Y/F/W
    (b3) Y/A/K/H/L - F/Y/H - Ω - N/G/H/Y - K/A/F
    (b4) Y - D/S - Ω - D/G/S - G/S
    여기서, Ω는 티올-반응성 친전자성 기를 운반하는 아미노산을 나타내며,
    (c) 임의로 상기 펩타이드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단이 변형된,
    PAD의 활성을 억제할 수 있는 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 티올-반응성 친전자성 기는 할로게노-아미딘 기, 바람직하게는 플루오로아미딘 또는 클로로아미딘인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Ω는 오르니틴인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정의된 모티프에서
    (b1)은 G/S/T-D-Ω-D-G/S 이며,
    (b2)는 H/K/F/L/W-D-Ω-D-H/Y/F/W
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모티프는 (b4)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 7 아미노산을 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 서열의 N-말단은 아세틸 기에 의해 변형되며 그리고/또는 C-말단은 아미드로서 변형된 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 서열의 N-말단은 2-나프틸설포닐 기의 첨가에 의해 변형되며 그리고/또는 임의로 C-말단은 D-아미노산의 첨가에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 SEQ ID NO: 47-71, 92-106에 해당하는 표 4, 5, 9 또는 10 중 어느 하나로 나타낸 펩타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 R은 Ω로 대체된 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 표 11, 12 또는 15중 어느 하나, 또는 실시예 1에 나타낸 바와 같으며, 다만 컨트롤 펩타이드 서열 L2로부터 유래된 화합물은 제외하며, 바람직하게 상기 화합물은 SEQ ID NO:12-21, 107-143, 바람직하게 20-21, 120, 122, 127-143, 보다 바람직하게 20, 21, 127, 128, 136-143, 보다 바람직하게 138, 141, 142, 143을 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 부는 실시예 9에서 표 28에 나타낸 서열 SEQ ID NO: 128-135를 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 정의된 화합물 및 적어도 하나의 부형제를 포함하며, 바람직하게 국소 투여용으로 적절하며, 바람직하게 관절 또는 국소 경피 투여시 주사용으로 적절한 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 면역억제제 및/또는 염증 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 의약으로 사용되는, 바람직하게는, 자가면역 질병, 바람직하게는 RA의 예방, 지연 및/또는 치료를 위한 의약으로 사용되는, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 12항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  15. 자가면역 질병, 바람직하게는 RA의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조용으로 사용되는, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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