WO2003000683A1

WO2003000683A1 - Method of the solid phase synhesis of pyrrole-imidazole polyamide

Info

Publication number: WO2003000683A1
Application number: PCT/JP2002/001775
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Sugiyama; Hirokazu Iida; Isao Saito; Takashi Saito
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2001-06-25
Filing date: 2002-02-27
Publication date: 2003-01-03
Also published as: JP4012145B2; US20040171799A1; US7067622B2; CA2450773A1; JPWO2003000683A1; CA2450773C

Description

明細書ピロ一ルーィミダゾールポリアミドの固相合成法ピロール-イミダゾールポリアミドの固相合成法技術分野

本発明は、近年の活発な研究により、配列特異的に D N Aと結合させることが出来ることが明らかとなり、遺伝子発現の制御等に有用な化合物として注目されているピロ一ルーイミダゾールポリアミドの新規な合成法に関する。背景技術

近年の活発なゲノム解析研究により、約 3 0億のデォキシリポ核酸（D N A ) の連なりから構成されているヒトゲノムの解明はほぼ終了した。今や時代は遗伝情報の元となる遺伝子の発見と解明、更には個人の体質の差を左右する遺伝子の —塩基変異多型（S N P s ) の解明へと移ってきている. この研究の中で様々な遺伝子や遺伝情報が明らかとなっており、それらの遺伝情報を特異的に制御する化合物を合成することは、新時代の創薬技術として有用な手法であると考えられる。

本発明者らは、 D N Aの A T塩基対に富む部位に選択的に結合することが知られている抗生物質デイスタマイシンに着目し研究を続けてきているが、その一環として、ディスタマイシンの構成単位であるピロールアミドとその誘導体であるィミダゾ一ルアミドとを組み合わせたシステマティックなディスタマイシン誘導体の合成を行い、得られた化合物の生化学的な検討を行っている。そして、その結果として、本発明者らは、これらの化合物は D N Aのある特定部位に対して選択的に結合できる化合物であり、その選択性はピロールアミド（P y ) とイミダゾールアミド（ I m) の順序により決定できることを明らかにした。

更に本発明者らは、合成したピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドを用いて既存の癌細胞に対する細胞毒性試験を行うシステマティックなスクリーニング法を見出した。この手法は、ヒトゲノム計画の中で明らかにされるであろう、ある特定の癌細胞に特有の D N A配列を標的とする化合物群の一斉簡易スクリーニング法である。構成単位であるピロ一ルーィミダゾールアミドが 8アミド存在する場合、その組み合わせは 2 5 6種類に及ぶ. それらの化合物を同時にスクリ一ニングすることで、システマティックに細胞毒性を有する化合物を選択できる。無数の組み合わせの D N A選択的化合物ピロ一ルーィミダゾールポリアミドから、その標的遺伝子に合わせて唯一の有用物質を導き出すことが出来禧るようになる画期的なシステムであり、この発明に対して本発明者らは既に特許出願を行なっている (特開 2 0 0 1 — 1 3 6 9 7 4号公報）。

ピロ一ル―ィミダゾ一ルポリアミドの合成は、これまで液相法により行っていたが、この方法は他種類の合成に不向きであった。

一方、ピロール—ィミダゾ一ルポリアミドの固相合成法は米国力リフォルニァ工科大学のダーバン教授により t — B 0 C法が開発されているが（J.Am. Chem. So ， 1996， 118, 6141- 6146) 、反応条件が厳しいため長鎖ピロ一ル—イミダゾ一ルポリアミドの合成は困難であり、また、応用性にも乏しい。更に市販の蛋白（ぺプチド）合成機を利用した合成法ではないため蛋白質（ペプチド）の導入も容易ではない。また、末端に力ルポキシル基を有するポリアミドの合成が難しく、末端をカルボン酸残基として固相から切り出す効率も悪いため、得られた長鎖ピロ一ルーィミダゾールポリアミドを直接修飾して新たな反応性を持たせることも困難である。

また、スペインのマスカレナス教授や米国力リフォルニァ大学ブル一ス教授によりポリピロールの Fm o c合成法も報告されているが（Tetrahedron Lett. , 19 99, 40, 3621-3624 ； J.Am. Chem. So , 2001, 123, 2469-2477) 、ィミダゾ一ルアミドを導入できていないため D Ν Αの配列を正確に識別することができない。発明の開示

本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、より長いピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドを簡便に合成することが出来、蛋白質（ペプチド）の導入も容易なピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの製造法であって、固相担体から切り出すことが可能なカルボン酸残基を末端に有し、種々の官能基を直接導入することが可能で、 D N Aの配列を正確に識別することができるピロ一ルーィミダゾールポリアミドを効率よく製造することが出来る該ポリアミドの製造法を提供することを目的とする。本発明は、ペプチド合成機を使用し、固相 F m o c法による自動合成法により合成することを特徴とする、ピロール一ィミダゾ一ルポリアミドの合成法の発明である。

また、本発明は、末端にカルボキシル基を有するピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの発明である。

更に、本発明は、上記ピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの末端のカルボキシル基に D N Aアルキル化剤を導入してなるピロ一ル―ィミダゾールポリアミドの発明である。

更にまた、本発明は、 D N Aアルキル化剤を導入した上記ピロ一ルーイミダゾールポリアミドを用いることを特徴とする、配列特異的 D N Aアルキル化方法の発明である。

また、本発明は、末端にカルボキシル基を有する F I T C (フルォレセィンィソチオシァネート）ーピロール—イミダゾ一ルポリアミドコンジュゲートの発明である。

即ち、本発明者らは、より長いピロール—イミダゾ一ルポリアミドを簡便に合成する手法として固相 F m o c法 ( F m o c = 9—フルォレニルメトキシカルボニル）による自動合成法を開発した。無数の組み合わせのピロ一ルーイミダゾールポリアミドを固相 F m o c法によるコンビナトリアル自動合成手法と、上で述ベた本発明者らが開発したスクリ一ニング法を組み合わせることにより、生理活性をもつピロ一ル—イミダゾ一ルポリアミドを素早く選択することが出来る。また、本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロール—ィミダゾ一ルポリアミドに導入することが可能である。例えば、 D N Aに対してアルキル化能をもつデュオカルマイシン、ピロ口べンゾジァゼピン、ブレオマイシン、 Xンジィン化合物、ナイトロジェンマスタード、またそれらの誘導体を導入することが可能である。また、この手法は市販の蛋白（ペプチド）合成機を利用した自動合成であるため、天然に存在する蛋白質とピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドとのコンジュゲート、更には非天然蛋白質とのコンジユゲー卜の合成をも自動合成法で可能とする合成手法なのである。更にまた、 Fm 0 c法は t一 B 0 C法に比べて反応条件が緩和なため、蛋白質以外の有機化合物の中でも酸性条件で不安定な官能基を持つ化合物の導入も可能であり、その応用は幅広い。例えば、ピロ一ル―ィミダゾ一ルポリァミドと DNAや RNAとのコンジュゲート、それらの誘導体とのコンジュゲートを自動合成することも可能である。

先に述べた如く、従来の方法は、例えば液相法は他種類の合成に不向きであり , また、 t — B O C法は、反応条件が Fm o c法に比べて厳しいため長鎖ピロール —イミダゾールポリアミドの合成は困難であり、また、応用性にも乏しい、更には市販の蛋白合成機を利用した合成ではないため蛋白質の導入も容易ではない、また、末端をカルボン酸残基として固相から切り出すのが難しいため、得られた長鎖ピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドを直接修飾して新たな反応性を持たせることも困難である等の問題点を有しており、更に、ポリピロ一ルの F m o c合成法も、イミダゾールアミドを導入できていないため D N Aの配列を正確に識別することができない等、何れも問題点を有しているが、本発明者らが開発した手法はこれらの問題点を全て解決した画期的な手法である。図面の簡単な説明

第 1図は、実施例 4の（ 1 ) の D N Aアルキル化実験における、 DNAアルキル化剤の D N Aに対する反応性を 4 5 0 m e rの DNAフラグメントを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。

第 2図は、実施例 4の（2) の D N Aアルキル化実験における、 DNAアルキル化剤の D N Aに対する反応性を 4 5 0 m e rの DNAフラグメントを用いてポリアクリルァミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。

第 3図は、実施例 4の（ 3) の D N Aアルキル化実験における、 DNAアルキル化剤の D N Aに対する反応性を 4 5 0 m e rの DNAフラグメントを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の合成法によれば、末端にカルボキシル基を有するピロ一ル—イミダゾ —ルポリアミドを簡便に且つ効率的に合成することが出来る。

末端にカルボキシル基を有するピロ一ルーィミダゾールポリアミドの具体例としては、例えば、末端に i3—ァラニン残基を有するピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドゃ末端に r 一アミノ酪酸残基を有するピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミド等が挙げられる。

末端に βーァラン残基を有するピロール—ィミダゾ一ルポリアミド或いは末端にァーアミノ酪酸残基を有するピロ一ル―ィミダゾールポリアミドは、例えば， F m o cでアミノ基を保護したアミノピロ一ルカルボン酸類と、 F m o cでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類と、 F m o cでアミノ基を保護した i3—ァラニン又は F m o cでアミノ基を保護したァ一ァミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相 F m o c法による自動合成法により合成することが出来る。

ァミノピロ一ルカルボン酸類の具体例としては、例えば、 4—アミノー 2 —ピロールカルボン酸、 4—ァミノ一 1 一メチル一 2 —ピロ一ルカルボン酸、 4 - 7 ミノー 1 —ェチルー 2 —ピロ一ルカルボン酸、 4 一アミノー 1—プロピル一 2— ピロ一ルカルボン酸、 4 —ァミノ— 1—プチルー 2 —ピロ一ルカルボン酸等が挙げられ、ァミノイミダゾールカルボン酸類の具体例としては、例えば、 4—アミノー 2 —イミダゾールカルボン酸、 4ーァミノ— 1 ーメチルー 2—イミダゾ一ルカルボン酸、 4—アミノー 1 一ェチル— 2 —イミダゾールカルボン酸、 4 一アミノー 1 —プロピル— 2ーィミダゾ一ルカルボン酸、 4 一アミノー 1 一プチルー 2 —イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。

F m o cでアミノ基を保護したァミノピロ一ルカルボン酸類及び F m o cでァミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類の合成法を N—メチルピロ一ル又は N—メチルイミダゾールを出発原料として用いた場合を例にして反応スキームで示すと以下の如くなる。なお、参考までに、 F m o cでアミノ基を保護したァ—アミノ酪酸の合成法の反応スキームも以下に併せて示す。 - 9

SLLlO/ZOdT/lDd C89000/C0 OAV なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。

本発明におけるペプチド合成機での固相合成法は、通常、 HATU' [0— （ 7 ーァゾベンゾトリアゾ一ルー 1一ィル） — 1， 1， 3 , 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート] /D I EA (N, N—ジイソプロピルェチルァミン）系で行われる。

ペプチド合成機としては、例えば、 Continuous Flow法を採用した Appl ied Bio systems社のぺプチド合成機 Pioneer等が用いられる。

本発明に係るピロ一ル―ィミダゾールポリアミドの固相合成法を反応スキームで示すと以下の如くなる。

i) 2 0 %ピぺリジン/ DMF溶液、 ii)モノマーユニット、 HATU/D I EA iii) 2 0 %ピぺリジン/ DMF溶液、 iv)モノマ一ユニット、 HATU/D I EA V) 2 0 %ピぺリジン/ DM F溶液、 vi) 5 %無水酢酸、 5 %ピリジン/ DM F液 vii)取り出し、減圧乾燥、 viii) 9 5 %T FA (トリフルォロ酢酸）， 2.5 %T I S (トリイソプロビルシラン）， 2. 5 %水。

なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。

本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロ一ルーィミダゾールポリアミドに導入することが可能であるが、例えば D Ν Αァルキル化剤を導入する場合を例にして記すと以下の如くなる。

即ち、固相担体から切り出したカルボン酸末端に対して、例えば、 DNAアルキル化剤の DU— 8 6 ( 2—メチルー 3—メトキシカルボニル— A環ピロ一ルー DUMA) の活性中心である A環部（D u 8 6 ) を導入する場合、先ず、カルボン酸末端を有するピロ一ル―ィミダゾ一ルポリアミドを例えば DM F等の溶媒に溶解し、この溶液に室温下、カルボエルジイミダゾ一ル（CD I ) を加え、同温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下留去し、残查をジェチルエーテル等で適宜洗浄し、ィミダゾールエステル体を得る。

D u 8 6を DMF等の溶媒に溶解し、この溶液に冷却下（例えば一 1 5°C) 、水素化ナトリウムを加え、 3 0分程度撹拌した後、この溶液に、上で得られたィミダゾ一ルエステルの DM F溶液を滴下し、同温度でー晚撹拌する。これにリン酸ナトリウムバッファ一（p H 6. 8 6) 等を加えて p Hを調整した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一及び HP L C等による精製を行ない、カップリング体（D N Aアルキル化剤を導入したピ口一ルーイミダゾ一ルポリアミド）を得る。

かくして得られた、 DN Aアルキル化剤を導入したピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドを用いることにより、配列特異的 DN Aアルキル化が可能となる。なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。

F I TC (フルォレセインイソチオシァネート）は古くから抗体の蛍光標識試薬として知られている。今回本発明者らが開発した Fmo c法によるピロ一ルーィミダゾールポリァミド合成の発展として、 F I T Cをピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドに導入してコンジユゲー卜を合成することも可能である。得られてくるコンジユゲートは、特定の DNA配列を認識出来る蛍光標識試薬として用いることが出来、がんを含めた遗伝病に関係する DNA配列を容易に識別出来る。これは、ピロ一ルーイミダゾールポリアミドを用いた治療を行なう前段階に利用出来るだけでなく、診断薬としての利用も可能である。

合成は先に示したピロ一ルーイミダゾールポリアミドの固相合成法と同じ手法、即ち、 Continuous Flow法を採用した Appl ied Bi osys t emsのペプチド合成機 P i one er等を用いて固相 Fmo c法による自動合成法により合成することが出来る。なお、上記合成法の詳細については後記実施例の記載参照。実施例

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。実施例 1 モノマーユニットの合成（上記 [化 1 ] の反応スキーム参照）

固相合成に用いるモノマーュニット J^、 1 2及び 1 4は次に示した方法により合成した。また、 ]3-ァラニンの Fmo c保護体は市販されているものを用いたなお、反応及び精製に用いた試薬、溶媒は市販のものを用いた。匪 Rは日本電子 JNM- A 5 0 0を使用した。

試薬の略号は以下のように用いた。ジメチルホルムアミド（DMF) 、ジイソプロピルェチルァミン（D I EA) ，トリイソプロビルシラン（T I S ) 、トリフルォロ酢酸（T FA) 、カルボニルジイミダゾ一ル（CD I ) 、 4ージメチルアミノビリジン（ D M A P ) 。

(1 ) 1—メチリレ— 2—卜リク口ロアセチルピロ一ル（）の合成

トリクロロアセチルクロリド（2 0 0.0 g， 1.1 0 mo 1)の塩化メチレン（6 0 0 ml)溶液中に丄 (9 0.3 g, 1.1 0 mo 1)の塩化メチレン（ 2 0 0 ml)溶液を 3時間かけて滴下した。この際に、窒素ガスを溶液中に噴霧し、反応の際に発生する塩化水素を除去した。一晩撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸ェチルーへキサン（1 : 1 0 , v/v)溶出部よりトリクロロアセチル体 (1 8 9. 7 g, 7 6 «を得た。

'H-NMR (CDCls) (5： 3.9 5 ( 3 H, s)， 6.2 0 ( 1 H， s), 6.9 5 ( 1 H， s)， 7. 8 ( 1 H, s)； ¹³C-腿 R (CDCls) δ： 3 8. 5 , 9 6.3， 1 0 8.9， 1 2 1.8， 1 2 4.0 , 1 3 3.6， 1 7 2.9 ; IR (KBr) v： 1 6 5 7 , 1 4 0 4, 1 3 6 3, 1 3 34, 1 1 0 2 , 1 0 6 9 , 8 4 5 , 8 0 8 , 7 4 5 , 6 9 0 cm—

(2 ) 1 -メチル -4 -ニトロ- 2 -トリクロロアセチルピロ一ル（互）の合成

3.(4 5.2 g, 0.2 0 0 mo 1)の無水酢酸（2 0 0 ml)溶液を— 4 0°Cに冷却し、 . 同温下発煙硝酸（1 8.5ml, 0.3 6 Omol)を滴下した。室温で 2時間撹拌した後. イソプロパノ一ルを加え、析出した固体をろ取し、ニトロ体（2 7.2 g)を得た。更にろ液を減圧下留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一に付し、酢酸ェチル—へキサン（1 : 1 0 , v/v)溶出部より更に（1 0. 7 g)を得た。（総収率 7 0%)

^-NMR (CDCls) δ： 4.0 6 (3Η, s)， 7. 7 2 ( 1 H, s)， 7.9 3 ( 1 H, s) ； 1³C-NMR (CDCls) δ 3 9.7， 9 4.8 , 1 1 7. 5 , 1 2 1.4, 1 3 0.2， 1 3 5.3， 1 7 3. 6 ; IR (KBr) v： 1 6 9 8 , 1 40 6 , 1 3 2 5， 1 2 2 6， 1 1 8 5 , 1 1 1 2， 9 9 8 , 8 5 7 , 8 1 0， 7 5 2， 7 1 6， 6 8 3 cm" ¹

( 3 ) 1 -メチル -4 -二トロ- 2 -トリクロロアセチルイミダゾ一ル（）の合成

トリクロロアセチルクロリド（ 3 6.3 g, 0.2 0 mol)の塩化メチレン（ 1 2 0 m 1)溶液中に！ _ ( 1 6.4 g, 0.2 0 mol)の塩化メチレン（8 0 ml)溶液を 2時間かけて滴下した。 4時間撹拌した後、氷冷下トリエチルァミン（2 0.2 g, 0.2 0m ol) を滴下した。溶媒を減圧下留去した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一に付し、酢酸ェチルーへキサン（ 1 : 1， v/v)溶出部よりトリクロロアセチル体 A (2 3.2 g， 5 1%)を得た。 'H-NMR (CDCla) δ 4.0 3 ( 3 H, s) , 7. 1 4 ( 1 H， s) ' 7.3 2 ( 1 H, s)； 1³C-龍 R (CDC1₃) δ : 3 7. 1 , 9 4.8， 1 2 8. 5， 1 3 0. 5， 1 3 6. 1 , 1 7 2.3 ; IR (KBr)レ： 1 6 5 7 , 1 5 1 8， 1 4 6 6 , 1 4 0 8 , 1 3 5 2 , 1 3 1 3, 1 2 7 8 , 8 1 0 , 7 7 9 ¹。

無水酢酸（2 0 0 ml)溶液を氷冷し、同温下発煙硝酸（ 1 8.5 ml, 0.3 6 0 mo 1)を滴下した。更に同温下で濃硫酸（0.5ml)を加え、同温で (34.0 g, 0. 1 5 0 mol)を少量づっ 2時間かけて加えた後、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残査をクロ口ホルムで洗浄して (1 6.0g)を得た。同様の操作を二度繰り返して更に（8.6 g)を得た。（総収率 6 0%)

^-NMR (CDCla) (5： 4. 1 0 (3 H, s)， 7. 9 0 ( 1 H， s)； ¹³C-NMR (CDCI3) d： 3 8.2， 9 3. 5， 1 2 6.0， 1 3 3.6 , 1 4 5. 8， 1 7 2.8 ; IR (KBr) レ： 1 7 0 9， 1 54 1， 1 5 1 4, 1 4 9 1， 1 4 6 4, 1 344, 1 3 1 7 , 1 1 3 5， 1 0 2 3， 1 0 0 0， 8 1 6， 74 3， 6 3 8 cm -¹。

(4 ) メチル 4 -ニトロ- 1 -メチルピロ一ル- 2 -カルボン酸エステル（丄）の合成 5_(3 2.4 g, 0.1 2 mol)のメタノール（1 40 ml)溶液中に D M A P (0. 5 0 g, 4. 5 5 mmol)を加えた、 4 0分撹拌した。その後沈殿をろ別し、メタノールで洗浄し丄（1 8. 9g)を得た。ろ液は溶媒を減圧下留去した後、同様の操作を繰り返し、更に 1 (2.3 g)を得た。（総収率 9 7 %)

^- MR (CDC ) δ 3.8 4 ( 3 Η, s)， 3. 9 7 ( 3 H， s), 7.3 9 ( 1 H, d， J= 2.0 Hz), 7. 5 7 ( 1 H， d， /- 2.0 Hz)； IR (KBr) v： 1 7 1 1 , 1 5 4 1， 1 5 1 0， 1 4 2 5 , 1 3 1 5 , 1 2 5 7 , 1 1 9 5， 1 1 1 8 , 1 0 8 9， 7 5 2 CUT

(5) メチル 4-二ト口- 1 -メチルイミダゾ一ル- 2 -カルボン酸エステル（_§_)の合成

6_(7 0.0 g, 2 5 6腿 ol)のメタノール（5 0 0 ml)溶液中にをに D M A P (0. 5 0 0 g, 4. 5 5 mmol)を加えた後、 2時間撹拌した。その後沈殿をろ別し、ジェチルエーテルで洗浄し 8を得た。ろ液は減圧下留去した後、同様の操作を 2回繰り返し、 (4 6. 0 g， 9 7 %)を得た。

Ή-NMR (CDCla) δ： 3. 9 6 ( 3 H， s)' 4. 1 0 (3 H, s)， 7. 8 2 ( 1 H, s)； 1³C-NMR (CDCh) δ 3 7. 0， 5 2. 8 , 1 2 4. 2 , 1 3 4. 6 , 1 4 5. 8 , 1 5 8.4 ; IR (KBr) v： 1 7 2 9， 1 6 4 3 , 1 4 9 7 , 1 4 6 0 , 1 3 7 7， 1 3 5 0 , 1 3 1 3 , 1 2 6 5 , 1 1 4 7 , 1 1 2 9 , 9 9 8 , 8 4 5， 8 1 4， 6 5 6 cm^-1。

(6 ) 1 -メチル -4-アミノピロール- 2 -カルボン酸メチルエステル塩酸塩（）の合成

7_( 1 5. 3 g, 8 3. 0 mmol)をメタノールとジクロロメタン（1 5 Oml， 1 : 2， v/v)混合溶媒に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素（3 g)を加え懸濁させ、水素雰囲気下で 2 日間撹拌した。その後、セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に 1 0 %塩酸を加えた。生じた沈殿をろ別し、 (4. 7 1 g)を得た。更にろ液を減圧下留去した後、酢酸ェチルーメタノールで再結晶を行い (6. 8 6 g)を得た。（総収量 1 1. 6 g， 7 3 %)

^-NMR (DMS0-d₆) δ： 3. 7 4 ( 3 Η, s) , 3. 8 5 (3 Η, s), 6. 8 0 ( 1 Η, s), 7.

2 5 (1 Η, s)， 1 0. 0 7 (3H,br) ； ESI MS: /e calcd for Cyl oNa (M-HC1

+H) 1 5 4. 1， found 1 5 4. 1。

(7 ) 1 -メチル -4 -ァミノイミダゾール- 2 -カルボン酸メチルエステル塩酸塩 (1 0 )の合成

8.(2 0. 0 g, 1 0 8 mmol)のジクロロメタン（3 0 0 ml)溶液に 1 0 ¾パラジウム炭素（5 g)を加え懸濁させ、水素雰囲気下で 1 日間撹拌した。その後セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に 1 0 %塩酸を加え酸性にした。沈殿物をろ取し、 (1 9. 8 g, 9 6 %)を得た。

- NMR (DMSO-de) δ： 3. 8 3 ( 3 Η, s) , 3. 9 3 ( 3 H, s)， 7. 3 7 ( 1 H, s) , 9. 9 6 (3H， br. s) ； ESI MS: m/e calcd for C₆H₉N ₃0₂ (M-HC1+H) 1 5 6. 1 , found 1 5 6. 1。 (8 ) 4 - [(9 -フルォレニルメトキシカルボニル）ァミノ]- 1 -メチル -2 -ピロールカルボン酸 (1 1)の合成

( 1 0 . 9 g， 5 7. 2 mmol)を蒸留水（8 0 ml)に溶解させ、水酸化ナトリウム (9. 2 g)を加えた。一晩撹拌した後、 1 N 塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルェ一テルの混合溶媒（1 0 0 ml, 1 : 1 , v/v) に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸ナトリウム（5. 3 g)を溶解させた後、 9 -フルォレニルメチルクロロホ一メート（1 7 . 8 g， 6 8. 6 mmol)加えた。一晩撹拌した後、沈殿をろ別し、 ϋ ( 1 2 . 3 g, 3 4. 1誦 ol)を得た。更にろ液を 1 M炭酸ナトリゥム水溶液とジェチルエーテルの混合溶液（1 ： 1 ， v/v)に加えた。沈殿はろ別し、更に 1 1 (3. 4 g)を得た。水層は 1 0 %塩酸で酸性にした後、酢酸ェチルで抽出した。その有機層を減圧下留去し、へキサン一ジォキサンで再結晶し、 H ( 1 . 6 g)を得た。（総収量 1 7. 3 g， 8 4 %)

^- MR (DMSO-de) <5 ： 3. 7 7 ( 3 H, s)， 4. 2 7 ( 1 H， t， /= 6. 0 Hz), 4.

4 3 (2 H， d， 7-6. 0 Hz), 6 . 6 0 ( 1 H， s), 7 . 0 2 ( 1 H, s), 7 . 3 2 (2 H, t, 1= 7 . 5 Hz) , 7 . 4 1 ( 2 H, t， 7 . 5 Hz) , 7. 7 0 ( 2 H, d， /= 7.

5 Hz), 7. 8 9 (2 H, d, /= 7 . 5 Hz), 9. 0 ( 1 H， s)； ¹³C-NMR (DMSO-de) δ： 3 6 . 1 , 4 6. 7 , 6 5 . 4 , 1 0 7 . 6 , 1 1 8. 8 , 1 1 9 . 9， 1 2 0 . 1 , 1 2 2 . 4 , 1 2 5. 0 , 1 2 7 . 1 , 1 2 7 . 6 , 1 4 0 . 8， 1 4 3. 8 , 1 5 3. 3， 1 6 1 . 8。 '

(9 ) 4 - [( 9 -フルォレニルメトキシカルボニル）ァミノ]- 1 -メチル -2 -イミダゾ —ルカルボン酸（1 2)の合成

1 0 (8. 2 4 g, 4 1 . 9 mmol)を蒸留水（6 0 ml)に溶解させ、水酸化ナトリウム

(4. 2 g)を加えた。一晩撹拌した後、 1 N 塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（2 0 0 ml， 1 : 1 , v/v) に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸水素ナトリウム（1 4. 1 g)を溶解させた後、 9 -フルォレニルメチルスクシンィミジルカルボナ一ト（1 6 . 9 g, 5 0 . l mmol)を加えた。ー晚撹拌した後、沈殿をろ別し、 ( 1 0 . 8 g, 2 9. 7 mmol)を得た。更にろ液を 1 0 % 塩酸で酸性にした後、生じた沈殿をろ別し、その沈殿を酢酸ェチルで洗浄して ( 1 . 2 g, 3. 3 0 mmol)を得た。（総収量 1 2. 0 g, 7 9 %)

^-NMR (DMSO-de) δ ： 3. 8 7 ( 3 Η, s)， 4. 2 7 (1 Η, t, 7 =6. 0 Hz), 4. 5 1 (2H, d， 7 =6. 0 Hz), 6. 8 0 ( 1 H, s) ， 7. 3 2 ( 2 H， t， 7 =7. 5 H z), 7.4 1 (2 H, t, 7 =7. 5 Hz), 7. 7 0 ( 2 H, d， 7 -7. 5 Hz), 7. 8 9 (2H， d， / = 7. 5Hz), 9. 5 0 ( 1 H, s)； ¹³C-NMR (DMS0-d₆) δ 3 5.4， 4 6. 5 , 6 6. 1， 1 1 3.4 , 1 2 0. 1， 1 2 5.4 , 1 2 7. 1 , 1 2 7. 7， 1 3 2. 0 4, 1 3 7.4, 1 4 0. 7， 1 3. 7 , 1 5 3. 3， 1 5 9. 9 ;

MSスペクトルはメチルエステルに変換して測定した。 HRMS (EI+) : m/e calcd for C₂1H19N3O4 ( ) as methyl ester 3 7 7. 1 3 7 6 , found 3 7 7. 1 3 8 0。

(1 0 ) 4 -(9 -フルォレニルメトキシカルボニル）ァミノ酪酸 (14)の合成

1 3 (5. 0 g, 4 8. 5睡 1)を、水とエチレングリコールジメチルェ一テルの混合溶媒（2 0 0 ml, 1 ： 1 , v/v)に溶解させた後、 9 -フルォレニルメチルスクシンィミジルカルポナ一ト（1 6. 4g， 4 8. 6mmol)を加えた。更に炭酸ナトリゥム (1 0 g, 9 4. 4匪 ol)を加え、一晩撹拌した。生じた沈殿をろ別し、 (1 0. 3 g)を得た。更にろ液を 1 N塩酸で酸性にした後、生じた沈殿をろ別し、 UL (4 4g)を得た。（総収量 1 4. 7 g, 9 4 %)

^-NMR (DMSO-de) δ ： 1. 6 1 ( 2 Η, t， J= 7. 0 Hz) , 2. 1 9 ( 2 H, t， /= 7. 0 Hz) , 2. 9 8，（2H， dd, /= 1 3. 0 , 6. 0 Hz) , 4. 2 0 ( 1 H, t, /= 6. 5 Hz), 4. 2 8 (2H， d, /= 6. 5 Hz), 7. 3 2 (2 H, t， /= 7. 5 Hz) , 7.4 0 (2H, t, 7=7. 5 Hz), 7. 6 7 ( 2 H, d, /- 7. 5 Hz), 7. 8 7 ( 2 H, d， /= 7. 5 Hz), 1 1. 0 (1H， br. s) ; MSスペクトルはメチルエステルに変換して測定した。 HRMS (EI+)： m/e calcd for C19H19NO4 as methyl ester 3 3 9. 1 4 7 1， found 3 3 9. 1 4 7 5。実施例 2 ピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの固相合成（上記 [化 2 ] の反応スキーム参照）実施例 1で得られた化合物， 1 2 , 1 4並びに市販品の ]3-ァラニン Fmo c保護体を用いて、各種ピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの合成を行った。合成プロ卜コールを表 1に示す。

表 1

： ~~合成ステップ

1 ,脱保護― 2(J%ピぺリジン/ DMF 5^

2，洗浄メタノール 50秒

3，縮合 HATU^ IEA 60分 .

4,洗浄メタノール 40秒

5， .保護無水酢酸/ピリジン 10分

— 6，切出 95%TFA， 2.5% TIS, 2.5% 水 30分

固相合成は Continuous F.l ow法を採用した Appl i ed Bi osys t ems社のペプチド合成機 Pioneerを用いて行った。固相担体は Fmo c— j3—ァラニンがプレロードされた市販の Wang resinを用いた。また、 HATU、 D I E A及びモノマーユニットは、固相担体の活性末端に対して 4当量用いた。合成前に固相担体を DM Fに 3 0分膨潤させた後、 Pioneerの合成力ラムに詰めた。合成はまず、担体にプレ口一ドされている /3—ァラニンの Fmo c基を、 2 0 %ピぺリジンの DMF溶液で 5 分間処理することにより脱保護した。その後、担体をメタノールで 5 0秒間洗浄し、導入したいモノマーユニット、 H ATU及び D I E Aをカラムに通し、 6 0 分間サイクルさせた後、メタノールで再度 4 0秒間洗浄した。この脱保護、伸長というサイクルを一サイクルとして、モノマーュニットを目的とするポリアミドの配列通りに順に縮合させた。その後、脱保護を同様に行った後、 5 %無水酢酸、 5 %ピリジンの DM F溶液でァセチル化を行った。反応終了後、固相担体を力ラムから取り出し、減圧乾燥を行った後、 5 0m 1 のナスフラスコ中に移し、 9 5 %T FA、 2. 5 %T I S、 2. 5 %水を 5 m 1加えて 3 0分間撹拌し、担体から切り出しを行った。精製は 0. 1 %T F A水溶液とァセトニトリルを用いた H P L Cにより行った。

得られたピロ一ルーイミダゾールポリアミドの構造式と収率及び各種スぺク卜ルデータ等を以下に示す。

なお、以下の記載において、 Im は 1 -メチル - 4 -ァミノイミダゾール- 2 -カルボン酸残基を、 Py は 1 -メチル -4 -ァミノピロ一ル- 2 -カルボン酸残基を、 Ac はァセチル基を、ァ—butyl はァ一ァミノ酪酸残基を、 ]3— ala— C00H は 3—ァラニンをそれぞれ表す。

Ac-Im— Py- i3 - ala- COOH ：収率 1 9 % ; ^JH NMR (CD₃0D) 6： 2. 1 5 ( 3 H, s)， 2. 6 3 (2 H, t, /= 6. 5 Hz), 3. 6 0 (2 H, t, 7-6. 5 Hz), 3. 9 0 (3 H, s), 4. 0 4 (3 H, s)， 6. 7 1 ( 1 H, d， / = 1. 5 Hz) , 7. 2 4 ( 1 H, d， / = 1. 5 Hz), 7. 3 5 (1H, s)， 4 つのプロトン（3 NHs and 1 CO OH) は CD₃ OD に変えたことにより検出されなかった。； ESI MS m/e calcd for C₁₆H₂₁0₅N₆ (M+H) 3 7 7. 2 , found 3 7 7. 2。

Ac-Py-Py-Py-j8 -al a-COOH ：収率 1 8 % ； ^lR NMR (CDsOD) δ： 2. 0 7 ( 3 H, s), 2. 6 0 (2H， t， =7. 0 Hz), 3. 5 5 ( 2 H, t, /- 7. 0 Hz), 3. 8 7 (3 H, s), 3. 8 9 (3H, s), 3. 9 0 ( 3 H, s), 6. 7 6 ( 1 H, s), 6. 8 2 (1 H， s)， 6. 9 1 (1 H, s)， 7. 1 1 ( 3 H， s)， 7. 1 8 ( 2 H, s)， 5つのプ口トン（4 NHs and 1 CO OH) は Cl OD に変えたことにより検出されなかった。； ESI MS /e calcd for

SOBNT (M+H) 4 9 8. 2 , found 4 9 8. 3。

Im-Im-j3 -ala-Py-Py-i3 -ala-COOH ：収率 3 1 % ； ^:H NMR (CD₃0D) d： 2. 5 9 (2H， t， 7=7. 0 Hz), 2. 6 2 ( 2 H， t， /- 7. 0 Hz), 3. 5 4 ( 2 H， t, J=

7. 0 Hz), 3. 6 7 (2 H, t， /= 7. 0 Hz), 3. 8 3 ( 3 H， s), 3. 8 6 ( 3 H， s), 4. 0 1 ( 3 H, s), 4. 1 1 ( 3 H， s)， 6. 7 4 ( 1 H, d, 7 =2. 0 Hz),

6. 7 9 ( 1 H, d， 7 =2. 0 Hz), 7. 1 3 ( 1 H, d, / = 2. 0 Hz) , '7. 1 4 (1

H， d， / =2. 0Hz), 7. '5 1 ( 1 H, s) , 7. 5 4 ( 1 H, s), 7. 6 2 ( 1 H, s)， 6つのプロトン（5 NHs and 1 COOH) は CD₃0D に,変えたことにより検出されなかった。； ESI MS m/e calcd for C29H34O7 11 (M+H) 6 3 6. 3 , found 6 3 6.

3„

O

Ac-Py-Py-Py-/3 -ala-Py-Py-Py- ]3 -ala-COOH ：収率 1 8 % ； 'Ή. NMR (CD₃OD) δ ： 2. 0 6 (3 H, s)， 2. 5 9 ( 2 H， t， /= 7. 0 Hz), 2. 6 2 ( 2 H， t， /- 7. 0 Hz), 3. 5 5 (2 H, t, /= 7. 0 Hz), 3. 6 3 ( 2 H, t, /= 7. 0 Hz), 3. 8 5 (3H, s), 3. 8 6 (6 H, s)， 3. 8 7 ( 3 H， s)， 3. 8 8 ( 3 H， s), 3. 8 9 (3 H, s), 6. 7 5 (1 H， d, J=2. 0 Hz), 6. 7 6 ( 1 H, d， 7 =2. 0 Hz)，

6. 8 1 (1 H， d， / = 2. 0 Hz), 6. 8 3 ( 1 H， d, / - 2. 0 Hz), 6. 8 8 (1 H, d, 7 =2. 0 Hz), 6. 8 9 ( 1 H, d， /= 2. 0 Hz), 7. 1 1 ( 1 H， d， /= 2. 0 Hz), 7. 1 4-7. 1 6 (4H， m) , 7. 1 7 ( 1 H， d, /= 2. 0 Hz) , 9つのプロトン（8 NHs and 1 CO OH) は CD₃OD に変えたことにより検出されなかった。； ESI

MS m/e calcd for C₄4H₅i0₁oN₁ 4 (M+H) 9 3 5.4， found 9 3 5.4。

- QZ -

SLLlO/ZOdt/Ud C89000/C0 OAV Ac-Im-Py-Py-r -butyl-Py-Py-j3 -ala-COOH ：収率 1 8¾ ； Ή NM (CDsOD) δ： 1. 7 8 (2 H, t, /-7. 5 Hz), 2.0 1 ( 3 H, s)， 2. 2 7 ( 2 H, t, /= 7.5 Hz), 3.2 1 (2 H, dd, /= 7. 5 , 1 2. 5 Hz), 3. 7 9 (3 H, s), 3.8 0 ( 3 H, s)， 3.8 2 (3 H, s), 3.8 3 (3 H, s), 3.84 (3 H, s) , 3. 9 4 (3 H, s), 6. 8 4 ( 1 H, d, 1. 5), 6.8 6 ( 1 H, d， /= 1.5 ) , 6.8 9 ( 1 H, d， /= 1. 5), 7. 02 (1 H, d， =1. 5), 7. 1 2 ( 1 H, d, ゾ =1. 5)， 7. 1 6-7. 1

7 (3 H, m), 7.2 2 ( 1 H, d, /= 1. 5 ) , 7.2 6 ( 1 H, d, =1.5)， 7.4 1 ( 1 H, s), 7.9 9 ( 1 H, t， /= 6. 5 ) , 8.0 3 ( 1 H, t， /= 6. 5 ) , 9.8 1

( 1 H, s)， 9.8 7 ( 1 H, s), 9.8 8 ( 2 H, s), 9. 9 3 ( 1 H， s)， 1 0.2 1 ( 1 H, s), 3つのプロトン（N- CH2 - CH2 _C00， and COOH)は検出されなかった。 (重なったため）； ESI MS ffl/e calcd for C₃₈H₄₈( ₃N₉ (M+H) 8 2 8.3， found

8 2 8.3。

-

Ac-Im-Py-Py-r -butyl-Py-Py-Py-y3 -ala-COOH ：収率 1 0 % ; ^lE 丽 R ( SO-d 6) (5 ： 1. 7 8 (2 H, t, /= 7. 5 Hz), 2. 0 1 ( 3 H, s), 2. 2 7 (2 H, t, J = 7. 5 Hz), 3. 2 1 (2 H, dd, /= 1 2. 5 , 7. 5 Hz), 3. 7 9 ( 3 H, s)， 3.

8 0 (6H， s), 3. 8 2 ( 3 H, s), 3. 8 3 ( 3 H， s) , 3. 8 5 (3 H, s)， 3.

9 4 (3H, s), 6 . 8 4 ( 1 H, d, J=2. 0 Hz), 6. 8 6 ( 1 H, d, =2. 0 H z), 6. 8 9 ( 1 H, d, / =2. 0 Hz) , 7. 0 2 ( 1 H, d, / =2.0 Hz), 7. 1 2

( 1 H， d, J = 2. 0- Hz), 7. 1 6 -7. 1 7 ( 2 H， m) , 7. 2 2 ( 1 Η，· d， 1 =2. 0 Hz), 7. 2 6 ( 1 H， d, / = 2. 0 Hz)， 7. 9 9 ( 1 H, t, =6. 0 Hz), 8. 0 3 (1 H, t， / = 6 . OHz), 9. 8 1 ( 1 H， s), 9. 8 7 ( 2 H, s), 9. 8 8 (2 H, s)， 9. 9 3 ( 1 H, s), 1 0. 2 1 ( 1 H, s)， 4つのプロトン（N— - Cg₂-C ₂ - CO 0) は DMSO溶媒のピークの一つがォ一バーラップするため確認できない。 ESI M S ffl/e calcd for C 0₁ o i₅ (M+H) 9 5 0.4 , found 9 5 0. 3。実施例 3 ピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドのカルボン酸末端への DN Aアルキル化剤の導入

DN Aアルキル化剤である DU— 8 6の售造式及び DU— 8 6の活性中心である A環部（D u 8 6 ) の構i式を以下に示す。

2—メチル一3—メトキシカルポ二ルー A環ピロ一ルー DUMA ( D U - 86 )

COOCH3

Du86 (15) 固相担体から切り出したカルボン酸末端に対して、 DN Aアルキル化剤である DU— 8 6の活性中心である A環部（D u 8 6 ) ϋを導入した。操作手順は以下の通りである。

実施例 2で得られた、カルボン酸末端を有するピロ一ル—イミダゾールポリァミド（ 0. 0 5mmo l ) の DMF ( 1. 5 m L ) 溶液に室温下、カルボニルジィミダゾ一ル（CD I、 24. 3 mg， 0. 1 5 mm o 1 ) ¾加え、同温で一晚撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残査をジェチルエーテルで 2回洗浄し、イミダゾールエステル体（ 3 0— 7 0 %) を得た。

1 5 (6. 2 m g , 0. 0 2 4 mm o 1 ) の DMF ( 2 m L ) 溶液を一 1 5 °C に冷却し、 6 0 %水素化ナトリウム（2 : 0 m g , 0. 0 5 mm o 1 ) を加え、同温下 3 0分撹拌した。その溶液に、上で得られたイミダゾ一ルエステル（0. 0 2 4 mmo 1 ) の DMF ( 1. 5mL) 溶液を滴下し、同温度で一晩撹拌した。リン酸ナトリウムバッファー（pH 6. 8 6) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、更に、 HP L Cによる精製を行ない、カップリング体（ 2 0— 5 0 %) を得た。

得られたイミダゾ一ルエステル体及びカツプリング体の構造式と得量、収率及び各種スペクトルデータ等を以下に示す。

なお、以下の記載において、 Im'はイミダゾリル基を表し、 ala - COは /3— ァラニン残基を表し、 c, Im, Py 及びァー butylは前記と同じ。

Ac-Im-Py- 3 -ala-CO-Ii.' ： 5 . 6 mg (4 5 ¾) ; ^JH NMR (DMSO-ds) δ ： 2. 0 1 ( 3 H, s), 3 . 7 8 (3H, s), 3 . 9 2 ( 3 H， s)， 6 . 9 3 ( 1 H， d， /= 1. 5 H z), 7 . 0 6 ( 1 H, s)， 7. 2 1 ( 1 H， d, /= 1 . 5 Hz) , 7. 4 0 .( 1 H， s)， 7 .

7 2 ( 1 H， s)， 8. 1 4 (1 H, t, /= 5 . 5 Hz), 8 . 4 2 ( 1 H, s)， 9 . 9 2 ( 1 H, s)， 1 0. 2 3 ( 1 H, s)， 4つのプロトン（N- Cg₂- C ₂- COO) は DMSO溶媒のピークがオーバ一ラップするため確認できない。； ESI MS Bi/e calcd for Ci ₉Η ₄Ν (M+H) 4 2 7 . 2 , found 4 2 7. 2。

Ac-Im-Py-j3 -ala-C0-Du86 ： 0 . 5 6 mg ( 9 ¾) ; NMR (DMS0-d₆) <3 ： 1 . 2 8 ( 1 H, s), 2. 0 1 (3 H, s) , 2. 0 9 ( 1 H, s)， 2 . 4 5 ( 3 H, s)， 3. 3 8 -3. 4 4 (2 H, m), 3. 7 0 -3. 7 5 ( 1 H, m) , 3. 7 1 (3 H, s), 3. 8 0 ( 3 H, s) , 3 . 9 2 (3 H, s), 4. 0 8 ( 2 H， s), 6. 9 3 ( 2 H, s), 7. 2 2 ( 1 H, s), 7 . 4 0 (1 H, s)， 8 . 0 3 ( 1 H, t, /= 5 . 5 Hz), 9 . 8 9 ( 1 H, s)， 1 0 . 2 2 ( 1 H， s)， 1 2 . 3 5 ( 1 H， S)， 2·つのプロトン（N- CH₂ - Cg₂- CO 0) は DMSO溶媒のピークの一つがオーバーラップするため確認できない。； ESI M S m/e calcd for CsoHsnO Ns (M+H) 6 1 7 . 2 , found 6 1 7 . 3。

Im-Im- /3 -ala-Py-Py-^ -ala-CO-Im' ： 6. 3 mg (7 4 ； Ή NMR (DMSO-de) δ ： 3. 4 9 (2H, q, 6. 5 Hz) , 3. 5 3 ( 2 H, q, J=6. 5 Hz), 3. 7 8 (3 H, s)， 3. 8 3 (3H， s)， 3. 9 6 ( 3 H， s)， 4. 0 0 (3 H, s)， 6. 8 3 (1 H, s), 6. 8 5 ( 1 H, s)， 7. 0 5 ( 1 H， s)， 7. 0 6 ( 1 H, s), 7. 1 5 (2 H, s), 7.4 6 (1 H, s)， 7. 7 1 ( 1 H, s), 8. 0 9 ( 1 H, s)， 8. 2 3 (1 H, s)， 8.4 2 (1 H， s), 8. 6 1 ( 1 H, s)， 9. 7 5 ( 1 H, s) , 9. 8 4 (1 H, s), 9. 8 9 (1 H, s)， 4つのプロトン（2 o f N-CH₂- C ₂ s)は DMSO溶媒のピ —クの一つがオーバ一ラップするため確認できない。

- 28 - Im - Im-j8 - ala - Py - Py - j3 - ala - CO - Du86 ： 0. 1 0 mg ( 3 ¾) ; ^ NMR (CDsOD) δ ： 1. 0 4-1. 0 6 (1 H， m)， 2. 0 8 -2. 1 2 ( 1 H, m) , 2. 5 0 ( 3 H, s), 2 5 8 -2. 6 6 (4H, m) , 3. 5 6 (2 H, m), 3. 6 7 (2 H， m) , 3. 7 0 -3. 7 5 (1 H, m), 3. 7 7 ( 3 H, s) , . 3. 8 4 ( 3 H, s)， 3. 8 7 ( 3 H, s) ' 4. 0 1 (3 H, s)， 4. 0 2 -4. 0 5 ( 2 H, m) , 4. 0 5 ( 3 H, s), 6. 7 4 ( 1 H, s), 6. 8 1 ( 1 H, s), 7. 0 5 ( 1 H, s)， 7. 1 4 ( 2 H， s)， 7. 2 5 ( 1 H， s), 7. 4 7 ( 1 H, s)， 7. 8 8 ( 1 H, s), 6つのプロトン（6 Ms)は CD₃0D に変えたことにより検出されなかった。； ESI MS m/e calcd for C₄₂H₄₆0₉N₁₃ (M+ H) 8 7 6. 3 , found 8 7 6.4。

Ac-Im-Py-Py- r -butyl-Py-Py- β -ala-C0-Im' ： 2 2. 5 mg ( 6 8 ¾) ; 'Έ. NMR (DMS0-d_e) δ 1 . 7 2 -1. 7 8 ( 2 H, m) , 2. 0 1 ( 3 H, s), 2. 2 3 -2. 2 9 (2 H, m) , 3. 5 0— 3. 5 6 (2 H, m)， 3. 7 7 ( 3 H, s)， 3. 8 0 ( 3 H, s) , 3. 8 1 (3 H, s)， 3. 8 4 ( 3 H, s)， 3. 9 4 ( 3 H, s)， 6. 8 2 ( 2 H, s)， 6. 8 9 (1 H, s)， 7. 0 3 (1 H, s) , 7. 0 6 ( 1 H, s)， 7. 1 2 ( 1 H， s)， 7. 1 6 (1 H, s), 7. 2 6 ( 1 H， s)， 7.4 1 ( 1 H, s) , 7. 6 8 ( 1 H， s)， 7. 7 1 ( 1 H, s), 8. 0 0 -8. 0 4 (1 H， m) , 8. 0 4-8. 1 0 ( 1 H, m), 8. 4 2 (1H， s), 9. 8 0 (1 H, s)， 9. 8 2 ( 1 H, s)， 9. 8 7 ( 1 H， s) ' 9. 9 3 (1H， s)， 1 0. 2 1 (1 H, s), 4つのプロトン（N-CH₂- C旦 ₂ and N- C|₂-C H₂)は DMSO溶媒のピ一クの一つがオーバーラップするため確認できない。

Ac-Im-Py-Py-r -butyl-Py-Py-jS -ala-C0-Du86 ： 0. 7 0 m g (HP L C精製後 7 %) ； ^lE NMR (DMS0-d₆) δ ： 1. 0 4-1. 0 6 (1H, m) , 2. 0 8-2. 1 2 · (1H, m), 2. 5 8 -2. 6 6 (4H, m), 3. 5 6 (2H, m) , 3. 6 7 (2H, ID), 3. 7 7 (3H， s), 3. 8 4 (3H, s), 3. 8 7 (3H, s) , 4. 0 1 ( 3H, s) , 4. 0 2 -4. 0 5 (2H, m), 4. 0 5 (3H, s), 6. 7 4 (1H, s), 6. 8 1 (1H， s)， 7. 0 5 (1H, s), 7. 1 4 (1H, s), 7.4 7 (1H， s)， 7. 8 8 (ΊΗ, s)， 6ゥのプ口トン（N-C ₂-Cg₂ and N-CH2-CH2-CH2) は CD₃0D に変えたことにより検出されなかった。； ESI MS m/e calcd for C_S2Hs₈0ii i_S (M+H) 1 0 6 8.3, found 1 0 6 8.4。実施例 4 DN Aアルキル化剤を導入したピロ一ルーィミダゾールポリアミドによる配列特異的 D N Aアルキル化

( 1 ) 上で合成した Ac- Im- Py- j3- ala-CO- Du86を用いて D N Aアルキル化実験を行なった。その結果を第 1図に示す。

第 1図から明らかなように、本化合物は、 5 '— T AAA— 3 'を認識して、 3 '-末端のアデニンをアルキル化していることが分かった。 ( 2 ) また同様の実験を Im- Im- j3 - ala- Py- Py-j8 _ala- CO- Du86を用いて行なつた。その結果を第 2図に示す。この場合、 2つのイミダゾ一ル部が D N A中のグァニンを認識し、配列特異的な D N Aアルキル化が起こることが明らかとなった。即ち、本化合物は 5 ' — G G A G A A A— 3 'を認識して、 3 '-末端のアデニンをァルキル化していることが明らかとなつた。

これらの結果からも、本発明者らが開発したピロ一ルーイミダゾールポリァミドの F m o c法による自動合成法を用いることで、 D N Aを配列選択的にアルキル化する化合物が容易に得られることが明らかとなった。この技術により、がん細胞種特有の D N Aをターゲットとする薬物の開発、即ち、副作用のない杭がん剤の開発の進展が大いに期待される。

( 3 ) 次に、同様の実験を Ac- Im-Py- Py-r- buty卜 Py- Py-β- ala- Du86を用いて行つた。この化合物は、ピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミド部位が自らヘアピン構造を取り、一分子で D N Aの 2本鎖の両側を認識できうる。ヘアピン化合物は D N Aに結合する際に P y— P yペアが A Tまたは T Aを I m— P yペアが G Cを P y一 I mペアが C Gを選択的に認識して結合するというダーバン則に従うことが知られているが、この化合物は /3—ァラニンペア— I mという新たな分子認識の組み合わせを含んでいるので、新たな分子認識ル一ルの発見の可能性があり、 D N Aアルキル化実験を行なって確認した。その結果を第 3図に示す（D NA : P U C 1 8 ΠΙ 7 0 η M、試薬濃度： 1 0 n M〜 5 0 0 n M， 5サンプル、反応条件：リン酸ナトリウム緩衝液（ 1 . 4 6 mM) 3 7 V, 8時間）。

第 3図から明らかなように、この化合物の場合はヘアピン構造を取りながら一つの規則に従って D NAをアルキル化していることが分かった。即ち、ァー b u t y 1 ヘアピンカーブ部位は A Tに、 P y— P yペアが A Τまたは Τ Αを認識し. D u 8 6が Aまたは Gをアルキル化した。この際に、新たな分子認識ペアである j3—ァラニンペア一 I mペアは、選択的に C Gペアを認識し、配列特異的なアルキル化に重大な寄与をしていることが明らかとなった。この発見は今まで報告のない新たな発見である。

この結果、 Ac - Im - Py- Py -buty卜 Py -: Py - - ala - Du86は 5 '一（A/T) (A/T) (A /T) C (A/G) - 3 '部位を認識し、 3 '-末端のアデニンを選択的にアルキル化していると分かった。先にも述べたように、末端が /3—ァラニンカルボン酸基を持つピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドの合成は本発明者らが今回発見したぺプチド合成機を用いる手法により容易に調製できる。この発見により、本発明の合成手法は、新たな D N A認識性化合物の合成に寄与するところが極めて犬なる発明であるということが明らかとなった。実施例 5 F I T Cーピロール—イミダゾ一ルポリアミドコンジュゲートの固相合成

合成は先に示したピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの固相合成法と同じ手法、即ち、 Continuous Flow法を採用した Appl ied Biosystemsのペプチド合成機 Pione erを用いて行った。固相担体は Fmo c— ァラニンがプレロードされた巿販の Wang resinを用いた。また、 HATU、 D I EA、 F I T C及びモノマーュニットは、固相担体の活性末端に対して 4当量用いた。反応終了後、固相担体を力ラムから取り出し、減圧乾燥を行った後、 5 0 m lのナスフラスコ中に移し、 9 5 %T FA、 2. 5 %T I S、 2. 5 % 水を 5m l加えて 3 0分撹拌し、担体から切り出しを行った。精製は、 0. 1 %TFA水溶液とァセトニトリルを用いた H P L Cにより行った。

得られた F I T C—ピロ一ルーイミダゾールポリアミドコンジュゲ一トの構造式と収率及び各種スぺクトルデータ等を以下に示す。

FITC-Py— Py-j3 -ala-COOH ：収率 1 4% ； ^XH NMR (DMSO- d₆) d ： 3. 7 9 (3 H， s)， 3. 8 7 (3H， s), 6. 5 4 -6. 6 2 ( 5 H, m) , 6. 6 6 ( 1 H, s), 6. 6 7 ( 1 H，' s)， 6. 8 3 ( 1 H, s) , 6. 9 7 1 H， s) , 7. 1 7 ( 1 H, d, 7=8. 0 Hz), 7. 1 8 (1 H, d, 1=1. 5 Hz), 7. 2 4 ( 1 H, br. s), 7. 8 2 ( 1 H, dd' .ゾ =8. 0， 1. 5 Hz), 7. 8 0 ( 1 H, t, /= 6. OHz), 8. 2 1 ( 1 H, s), 9 , 8 2 ( 1 H, s)， 9. 8 5 ( 1 H, s)， 1 0. 0 9 ( 2 H, s)， 1 2. 2 0 ( 1 H, br. s')， 4つのプロトン（N- Cg₂-Cg₂-COO) は DMSO溶媒のピークがオーバーラップするため確認できない。； ESI MS ffl/e calcd for Ca eHs xOeNsS (M+H) 7 2 3. 2， fo und 7 2 3. 2。産業上の利用可能性

本発明の方法によれば末端をカルボン酸残基として固相担体から切り出すことが可能なため、様々な官能基をピロ一ル―ィミダゾ一ルポリアミドに導入することが可能である。例えば、 D N Aに対してアルキル化能をもつデュオカルマイシン、ピロ口べンゾジァゼピン、ブレオマイシン、ェンジイン化合物、ナイトロジエンマスタード、またそれらの誘導体を導入することが可能である。即ち、本発明の方法を用いることで、 D N Aを配列選択的にアルキル化する化合物が容易に得られることが明らかとなった。この技術により、がん細胞種特有の D N Aを夕 —ゲットとする薬物の開発、即ち、副作用のない杭がん剤の開発の進展が期待できる。また、本発明の方法によれば、天然に存在する蛋白質とピロ一ルーイミダゾールポリアミドとのコンジュゲート、更には非天然蛋白質とのコンジュゲ一トの合成をも可能とする。更にまた、 F m 0 c法は t— B O C法に比べて反応条件が緩和なため、蛋白質以外の有機化合物の中でも酸性条件で不安定な官能基を持つ化合物の導入も可能であり、その応用は幅広い。例えば、ピロ一ルーイミダゾ —ルポリアミドと D N Aや R N Aとのコンジュゲート、それらの誘導体とのコンジュゲートを自動合成することも可能である。

また、 F I T Cをピロール—イミダゾールポリアミドに導入してコンジユゲートを合成することも可能であり、得られてくるコンジュゲ一トは、特定の D N A 配列を認識出来る蛍光標識試薬として用いることが出来、がんを含めた遺伝病に関係する D N A配列を容易に識別出来る。これは、ピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドを用いた治療を行なう前段階に利用出来るだけでなく、診断薬としての利用も可能である。

Claims

請求の範囲

1. ペプチド合成機を使用し、固相 Fmo c法による自動合成法により合成することを特徴とする、ピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドの合成法。

2. 末端にカルボキシル基を有するピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドを合成する請求の範囲第 1項に記載の合成法。

3. 末端にカルボキシル基を有するピロ一ル—イミダゾールポリアミドが、末端に 3—ァラニン残基又は Ύ -アミノ酪酸残基を有するピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドである請求の範囲第 2項に記載の合成法。

4. Fmo cでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類と、 Fmo c でアミノ基を保護したアミノイミダゾ一ルカルボン酸類と、 Fmo cでァミノ基を保護した j3—ァラニン又は Fmo cでアミノ基を保護した r一アミノ酪酸を担持した固相担体を用いる請求の範囲第 3項に記載の合成法。

5. Fmo cでアミノ基を保護したアミノピロールカルボン酸類が Fmo cでアミノ基を保護した 4一アミノー 1ーメチルー 2—ピロ一ルカルボン酸であり、 Fmo cでアミノ基を保護したアミノイミダゾ一ルカルボン酸類が Fm o cでァミノ基を保護した 4—アミノー 1ーメチルー 2—イミダゾールカルボン酸である請求の範囲第 4項に記載の合成法。

6. HATU [〇— （ 7—ァゾベンゾトリアゾール— 1—ィル） _ 1， 1， 3 , 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート] /D I EA (N, N ージィソプロピルェチルアミン）系によるべプチド合成機での固相合成法により合成する請求の範囲第 1項〜第 5項の何れかに記載の合成法。

7. 末端にカルボキシル基を有するピロール—イミダゾ一ルポリアミド。

8. 末端に —ァラニン残基又は末端にァ—アミノ酪酸残基を有する請求の範囲第 7項に記載のピロ一ルーィミダゾールポリアミド。

9. Fm o cでアミノ基を保護したァミノピロ一ルカルボン酸類と、 Fmo c でアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類と、 Fmo cでァミノ基を保護した i3—ァラニン又は Fmo cでアミノ基を保護したァ一ァミノ酪酸を担持した固相担体を用い、固相 Fmo c法による自動合成法により合成した請求の範囲第 8項に記載のピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミド。

1 0. Fmo cでアミノ基を保護したアミノピロ一ルカルボン酸類が Fmo c でアミノ基を保護した 4ーァミノ一 1—メチルー 2—ピロ一ルカルボン酸であり . Fmo cでアミノ基を保護したアミノイミダゾールカルボン酸類が Fm o cでァミノ基を保護した 4一アミノー 1—メチルー 2—イミダゾ一ルカルボン酸である請求の範囲第 9項に記載のピロ一ルーィミダゾールポリアミド。

1 1. 請求の範囲第 7項又は第 8項に記載のピロ一ルーイミダゾ一ルポリアミドの末端のカルボキシル基に D N Aアルキル化剤を導入してなるピロ一ル—イミダゾ一ルポリアミド。

1 2. D N Aアルキル化剤が D U - 8 6 ( 2—メチル一 3—メトキシカルボ二ルー A環ピロ一ルー DUMA) の活性中心である A環部（D u 8 6) である請求の範囲第 1 1項に記載のピロ一ル―ィミダゾ一ルポリアミド。

1 3. D N Aアルキル化剤を導入した請求の範囲第 1 1項又は第 1 2項に記載のピロ一ルーイミダゾールポリアミドを用いることを特徴とする、配列特異的 D N Aアルキル化方法。

1 4. D N Aアルキル化剤が D u— 8 6 ( 2—メチル— 3—メ卜キシカルボ二ル— A環ピロール— DUMA) の活性中心である A環部（D u 8 6 ) である請求の範囲第 1 3項に記載の配列特異的 DN Aアルキル化方法。

1 5. 末端にカルボキシル基を有する F I T C (フルォレセインイソチオシァネート）一ピロ一ルーィミダゾ一ルポリアミドコンジユゲート。