WO2006018967A1

WO2006018967A1 - ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤

Info

Publication number: WO2006018967A1
Application number: PCT/JP2005/014079
Authority: WO
Inventors: Noboru Fukuda; Takahiro Ueno; Hiroshi Sugiyama
Original assignee: Nihon University; Gentier Biosystems Incorporation
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-02
Publication date: 2006-02-23
Also published as: CA2573974A1; US7888516B2; EP1779850A4; US20080255368A1; JP2007176795A; EP1779850A1; JPWO2006018967A1

Abstract

　Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ－β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列－４５０～－３１０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤。

Description

明細書

TGF- β遺伝子発現抑制剤

技術分野

[0001] 本発明はトランスフォーミング増殖因子 (TGF— β )遺伝子発現抑制剤及び TGF β関連疾患の治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる TGF— β遺伝子発現抑制剤に関する。

背景技術

[0002] 本態性高血圧症は脳卒中、虚血性心疾患及び腎硬化症等の重篤な合併症を引き起こすが、これらの合併症は、基本的には血管平滑筋細胞 (VSMC)の過剰増殖による血管障害と関連しており、高血圧症の治療の対象となっている。また、狭心症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成術 (PTCA)後の約 4割、さらにステント挿入後の約 3割に冠動脈の再狭窄が起こる。病理組織的には、高血圧症性血管疾患のような動脈増殖性疾患、血管形成術後及びステント内の新生内膜形成及びァテローム性動脈硬化には、 TGF— βが関連していることが知られている。力かる病態における細胞増殖は種々の作用機構によって抑制することができると考えられるが、そのうちの 1つが、トランスフォーミング増殖因子 (TGF)発現を抑制することである。

[0003] TGFは当初、 Molony肉腫ウィルス (MSV)によりトランスフォームされたマウス 3T 3細胞が正常細胞を悪性に変える因子として見出され、主として TGF— αと TGF— βに大別される。 TGF— βは、前駆体として合成された 390〜412個のアミノ酸からなる分子量約 40, 000のタンパク質の C末端側の 112個のアミノ酸力もなる部分が、ジスルフイド結合を介して二量体（25kDa)を構成して活性を持ったものである。

[0004] TGF- βは、細胞の成長と発生を調節する蛋白質の一つのファミリーを構成し (非特許文献 1)、血管、血小板、肝臓、腎臓、心筋、肺、脾臓、皮膚、胎盤、骨髄などの種々の組織で産生され、細胞の増殖、細胞外マトリックスの形成、免疫能の調節作用をもつ。

[0005] TGF- βは殆んどの細胞に対して増殖抑制に働くが、線維芽細胞、血管平滑筋細胞 (VSMC)などの間葉系細胞に対しては二相性増殖作用をもつ。つまりこれらの細胞では通常状態では増殖抑制に働くが、炎症、機械的ストレスなどが加わると増殖刺激に働く。これらのことから、 TGF— βは VSMC増殖とフイブロネクチン、コラーゲンなどの細胞外基質増生を促進することにより血管傷害後の新生内膜形成に関与している。 TGF- βはまた、動脈硬化症の病巣の形成にも関与している。このような情報に基づいて、 TGF- βの効果を調節することに向けられた局所血管療法が上記の血管増殖性疾患の軽減に有効と考えられる。

[0006] また、 TGF- βは経皮的腎動脈形成術後の腎動脈の再狭窄にも関与していると考えられている。これらの事実から、本発明の TGF— |8遺伝子発現抑制薬は、上記の各種血管増殖'狭搾性疾患に対する治療薬として有効である。

[0007] 逆遺伝学による遺伝子機能の不活性ィ匕の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解祈するために用いられるものであるが、一方でウィルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性ィ匕を、相同的組換えにより DNAレベルで、又はアンチセンスオリゴデォキシヌクレオチドゃリボザィムにより RNAレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデォキシヌクレオチドやリボザィムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、糸且織、細胞への移行が悪ぐリボヌクレアーゼにより分解されやす、と、う課題があった。

[0008] 一方、アンチセンス試薬ゃリボザィムのような (デォキシ)リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、 Py—Imポリアミドとも言う）類力 DNA の塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されて、る。

[0009] ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環である N—メチルピロール単位（以下 Pyとも言う）及び N—メチルイミダゾール単位（以下 Imとも言う）力構成されてヽる（非特許文献 2— 4)。 Py及び Imは連続してカップリングし折りたたむことにより γ—ァミノ酪酸の存在下で U字型のコンフオメーシヨンを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、 Ν—メチルビロール単位（Py)、 N—メチルイミダゾール単位 (Im)及び γ—ァミノ酪酸単位 ( γリンカ一とも言う）は互ヽにアミド結合（ C ( = O) NH )で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献 1〜3)。

[0010] このような合成ポリアミドは二重らせん DNAの副溝（マイナーグループ）中の特定の塩基対に高、親和性と特異性を以つて結合することができる。塩基対の特異的認識は Pyと Imとの 1対 1の対形成に依存している。即ち、 DNAの副溝内での U字型コンフオメーシヨンにおいて、 PyZlm対は C— G塩基対を標的とし、 ImZPyは G— C塩基対を標的とし、そして PyZPyは A— T塩基対及び T A塩基対の両方を標的とする（非特許文献 3—4)。最近の研究によれば A—T縮合は PyZPy対の一つのピロ一ル環を 3—ヒドロキシピロール (Hp)で置換した結果として HpZPyが優先的に TZA 対に結合することによって克服することができることがわ力つて、る（非特許文献 5)。

[0011] 一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説は in vitro及び in vivoの実験で証明されている。ジンタフインガーの認識部位 (TFIIIAの結合部位）の内部に結合した 8員環 Py— Imポリアミドは 5SRNA遺伝子の転写を阻害した (非特許文献 6)。ヒト免疫不全ウィルス 1型 (HIV— 1)プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞における HIV—1複製を阻害する。これらの配列には TATAボックス、リンパ系ェンハンサ一因子 LEF— 1配列、及び ETS— 1配列が包含される（非特許文献 7)。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リブレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する (非特許文献 8— 10)。ヒトサイトメガロウィルス（CMV) UL122仲介初期タンパク質 2 (IE86)は、プロモータに RN Aポリメラーゼ IIを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する (非特許文献 8)。合成ポリアミドは IE86の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる (非特許文献 9)。 Mappらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する (非特許文献 10)。

[0012] 特許文献 1：特許第 3045706号特許文献 2：特開 2001— 136974

特許文献 3 :WO 03/000683 A1

非特許文献 l : Piek et al.、 FASEB J, 13,2105- 2124(1999)

非特許文献 2 : Trauger et ahNature.1996;382:559-61

非特許文献 3 : White et ahChem Biol.1997;4:569-78

非特許文献 4 : Dervan:Bioorg Med Chem.2001;9:2215- 35

非特許文献 5 : White at ahNature.1998;391:468-71

非特許文献 6 : Gottesfeld et ahNature.1997;387:202-5

非特許文献 7 : Dickinson et ahProc Natl Acad Sci U S A.1998;95:12890- 5 非特許文献 8 : Lee et ahProc Natl Acad Sci U S A.1996;93:2570- 5

非特許文献 9 : Dickinson et ahBiochemistry.1999;38:10801-7

非特許文献 10 : Mapp et ahProc Natl Acad Sci U S A.2000;97:3930- 5

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 先に述べたアンチセンスオリゴデォキシヌクレオチドやリボザィムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、糸且織、細胞への移行が悪ぐリボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、 hTGF- βの遺伝子塩基配列に結合するピロ一ルーイミダゾールポリアミドを用いた TGF— β遺伝子発現抑制剤又は TG F- β関連疾患の治療薬についての報告はない。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは、ヒト TGF— β (hTGF- β 1)のプロモータの特定の領域に特異的に結合してヒト TGF— β遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、 hT GF- β 1遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るベぐ hTGF- β 1プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、プ口モータ領域の 450〜一 310の領域のうち、 API結合領域を含む領域、好ましくは— 430〜― 400の領域又は— 380〜― 350の領域、より好ましくは— 416〜― 41 0の領域又は 373〜一 366の領域に結合する化合物力 hTGF- β 1プロモータの活性を有意に阻害し、培養ヒト血管平滑筋細胞 (VSMC)において hTGF— β 1遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。

(1) Ν—メチルビロール単位（以下 Pyとも言う）、 N—メチルイミダゾール単位（以下 I mとも言う）及び γ—ァミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、 h TGF- β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 450〜一 310 (配列番号 2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域 (以下標的領域と言う）の副溝内において、前記 γ—ァミノ酪酸単位の部位で折りたたまれて U字型のコンフォメーシヨンをとることができ、 C G塩基対に対しては PyZlm対力 G— C塩基対に対しては ImZPy対が、 A— T塩基対及び T A塩基対に対しては、ずれも PyZPy対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる TGF— |8遺伝子発現抑制剤。

(2)更に βーァラニン単位を含む上記（1)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(3)前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 430〜一 4 00 (配列番号 5)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（1)又は（2)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(4)前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 416〜一 4 10 (配列番号 3)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（1)又は（2)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(5)前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 380〜一 3 50 (配列番号 6)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（1)又は（2)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(6)前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 373〜一 3 66 (配列番号 4)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（1)又は（2)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(7)前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成して V、る上記（1)〜（6)の、ずれか一項記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

(8)前記アミドカ^チルァミノプロピルアミン又は Ν, Ν—ジメチルァミノプロピルアミンとのアミドである上記（1)〜（7)の、ずれか一項記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤

(9)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（1)〜 (4)記載の TGF ι8遺伝子発現抑制剤。

[化 1]

(10)前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（1)、（2)、（5)又は ( 6)記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[化 2]

(11)下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。

[化 3]

又は

[化 4]

発明の効果

[0016] 本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるのでィ匕学療法剤のような副作用がなぐまたィ匕合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、 TGF- β遺伝子発現抑制剤を得ることができる。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにお、て、 Ν—メチルビロール単位（以下 Pyとも言う）、 Ν—メチルイミダゾール単位（以下 Imとも言う）及び γ—ァミノ酪酸単位（γリンカ一とも言う）は互いにアミド結合（-C ( = 0)— ΝΗ-)で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献 1〜3参照)。

[0018] 例えば、ピロールイミダゾールポリアミドは Fmoc (9—フルォレニルメトキシカルボ二ル)を用いた固相法（固相 Fmoc法）による自動合成法によって製造することができる (特許文献 3)。固相 Fmoc法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体力切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロ口べンゾジァゼピン、ブレオマイシン、ェンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、 DNAに対してアルキルィ匕能を有するィ匕合物を必要に応じて導入することもできる。固相 Fmoc法は市販のタンパク (ペプチド )合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンノク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体 (コンジュゲート）を合成することもできる。また、 Fmoc法は t—BOC法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物 (酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む)の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドと DNAや RNA (又はそれらの誘導体)との共役体を自動的に合成することも可能である。

[0019] 上記公知の Fmoc法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端に j8—ァラニン残基（j8—ァミノプロピオン酸残基)や γ—ァミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端に j8—ァラニン残基又は γ ァミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれ Fmocでアミノ基を保護した、アミノビロールカルボン酸、ァミノイミダゾールカルボン酸、 j8—ァラニン又は yーァミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相 Fmoc 法により合成することができる。

[0020] アミノビロールカルボン酸の具体例としては、例えば、 4 アミノー 2 ピロールカルボン酸、 4 アミノー 1—メチル 2 ピロ一ルカルボン酸、 4 アミノー 1—ェチルー 2 ピロ一ルカルボン酸、 4 アミノー 1—プロピル— 2 ピロ一ルカルボン酸、 4 ァミノー 1 ブチル 2—ピロ一ルカルボン酸等が挙げられる。ァミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、 4 アミノー 2 イミダゾールカルボン酸、 4ーァミノ 1ーメチルー 2 イミダゾールカルボン酸、 4 ァミノ 1 ェチルー 2 イミダゾールカルボン酸、 4 アミノー 1 プロピル 2 イミダゾールカルボン酸、 4 アミノー 1 ブチルー 2—イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。

[0021] 固相 Fmoc法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドと FITC (フルォレセインイソチオシァネート）との共役体を合成することもできる。 FITCは従来力も抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定の DNA配列を認識することを証明するために用いることができる。

[0022] 本発明の TGF— β遺伝子発現抑制剤は、 Ν—メチルビロール単位 (Py)、 N—メチルイミダゾール単位 (Im)及び γ ァミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、 hTGF— β 1プロモーターの塩基配列—450〜一 310 (配列番号 2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域 (以下標的領域と言う）の副溝内において、前記 0 —ァミノ酪酸単位の部位で折りたたまれて U字型のコンフオメーシヨンをとることができ、 C— G塩基対に対しては PyZlm対力 G— C塩基対に対しては ImZPy対力 A— T塩基対及び T A塩基対に対してはいずれも PyZP y対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。

[0023] 通常 DNAのらせんの骨格は 2種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝 (メジャーグループ）、狭くて浅い溝を副溝 (マイナーグループ）と呼んでいる。ここで上記ピロ一ルイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝 (マイナーグループ）に高い親和性と特異性を以つて非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝の C G塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドの PyZlm対が、 G— C 塩基対に対しては ImZPy対が、 A T塩基対及び T A塩基対に対してはヽずれも PyZPy対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中の γ—ァミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれて U字型のコンフオメーシヨンをとる。

[0024] 副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドの Pyと Imの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対と Py— Im対が上述のように対応してヽな、ピロ一ルイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。

[0025] hTGF- β 1遺伝子調節領域の塩基配列は図 1及び配列番号 1に示す通りである (Journal of Biological Chemistry, Vol.264, No.l, 402—408 (1989))。

本発明のピロールイミダゾールポリアミド GBPl 105及び GBPl 106は下記に示す通りである。

[化 5]

GBP1105

Mol. Wt.: 1667.75

C, 54.73; H, 5.68； N, 25.20; O, 14.39 又は

[化 6]

GBPl 106

GBP1105は、分子式 C H N O 、分子量 1667. 75を有し、その標的配列は h

76 94 30 15

TGF- 1遺伝子調節領域の— 450 ― 380の領域のうち、 API結合領域を含む 430〜一 400 (配列番号 5)の領域であり、直接的には gactctc (— 416〜一 410) (配列番号 3)の 7塩基に結合することにより、 hTGF- β 1遺伝子の発現を抑制する

[0027] GBP1106は、分子式 C Η Ν Ο 、分子量 1912. 00を有し、その標的配列は

88 106 34 17

hTGF- β 1遺伝子調節領域の— 380〜― 310の領域のうち、 API結合領域を含む 380〜一 350 (配列番号 6)の領域であり、直接的には gtgtctc ( 373〜一 36 6) (配列番号 4)の 8塩基に結合することにより、 hTGF- β 1遺伝子の発現を抑制する。

[0028] Py Imポリアミドは in vitro研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である（非特許文献 6〜 10)。特異的なポリアミドでショウジョゥバエ (Drosophila)を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりする力これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である (Janss en et al:Mol Cell.2000;6: 1013-24, Janssen at al:Mol Cell.2000;6:999- 1011.)。本発明者らは hTGF— β 1プロモータの特定の領域を標的とする Py—Imポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に 48時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性 (低濃度、トランスフエクシヨン媒体不要）とより高い安定性を培養 hVSMC にお、て示した。ポリアミドの高、透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。

[0029] 最近まで Py Imポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子 DNA複合体の構造的特性に基づヽて、た。 TATAボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、 TATAボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。 TATAボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子にぉ、て転写開始部位の上流 25〜35塩基対に位置している。転写介在因子 D (TAF D)は TATAボ

II

ッタスに特異的に結合する TATAボックス結合タンパク質 (TBP)を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（PIC)を形成する。 PICは遺伝子転写を開始してァクチベータ又はサブレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。 TBPも二重らせん DNAの副溝 (マイナーグループ）に結合するので（Lee et al:Cell.l991 Dec 20;67(6): 1241-50, Starr et al:Cell.l991;67:1231- 40 , Courey et al:Cell.l988;55:887- 98)、合成ポリアミドは TATA結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、 TATAボックスを標的とするものが常に機能することが知られている（非特許文献 7、 8)。

[0030] TATAボックスもイニシエータ一領域（Inr)も含んで!/ヽな、種類のプロモータもある

(Javahery et al:Mol Cell Biol.l994;14: 116-27;Lo et al:Gene.l996 Dec 5;182(1- 2): 1 3-22;Romeo et al:Gene.l997;189:289- 95.)。高度に発現し特化された遺伝子のプロモータは TATAボックスを有して!/、る傾向にあるが、ハウスキーピング遺伝子のプロモータにはそれが欠如している傾向がある。 TATAのないプロモータは、低レベルで発現される遺伝子や、増殖の間に厳密なダウンレギュレーションを要求する遺伝子にとっては必要力もしれないが、そのメカニズムはなお今後の研究を要する。 hTGF- β 1プロモータはこの種類に属する。これは転写開始部位の上流の様々な領域にいくつもの陽性及び陰性の配列を含んでいる（Kim et al:J Biol Chem.1989;264:402-8. ) o転写開始部位の近傍にはいくつかの SP— 1配列と二つの AP— 1配列が存在する。様々なウィルス性及び細胞性プロモータが SP— 1タンパク質によって活性ィ匕されるので、プロモータが SP— 1により刺激されるためには単一の SP— 1配列で十分のようである（Kadonaga et al:Cell.l987;51: 1079- 90, Courey et al:Cell.l988;55:887- 98 )。 AP— 1配列 ίお unホモダイマー又は FosZjunヘテロダイマー複合体の!/、ずれか力もなる AP—1転写因子に応答する。 AP— 1配列を介して TPA、 V— src遺伝子産物及び hTGF— β 1自身のようないくつかの物質が hTGF— β 1遺伝子の発現を刺激する（Kim et al:J Biol Chem.l989;264:7041-5, Kim et al:J Biol Chem. l989;264:19 373-8, Kim et al:Mol Cell Biol.l990;10:1492- 7, BirchenaU- Roberts et al:Mol Cell B iol.l990;10:4978- 83)。

[0031] SP— 1及び Z又は AP— 1配列が hTGF— β 1遺伝子発現の活性化を仲介すると仮定されている。重要なポリアミドは応答性の転写因子の結合を遮断するために、異なる AP—1及び SP—1配列に隣接する塩基対を標的とするように設計されている。しかし、これらのポリアミドが hTGF— β 1プロモータの活性を阻害することができるか、又は活性ィ匕することができるかを示すに十分なデータはない。これらの結果は、設計したポリアミドが DNA等の副溝 (マイナーグループ）中で占有する位置が不適切だつたため力もしれない。本発明者らは標的配列を hTGF— β 1プロモータの上流にまで拡張した。一つのポリアミドは hTGF— β 1プロモータを標的としており、これはインビトロでプロモータの活性を阻害し、培養 hVSMCでは hTGF— β 1 mRNAとタンパク質を阻害することが示されている。 TATAボックスを含むコアプロモータからは転写を抑制する転写リプレッサーは見つかってはいる力 TATAのないプロモータからは見つかつていない（Aso et ahEMBO J.1994;13:435-45, Mack et al:Nature. l993;3 63:281-3, Merino et al:Nature. l993;365:227- 32)。ほとんどの哺乳類遺伝子の発現はプロモータとェンノヽンサ一配列に結合した莫大な数のタンパク質の作用の組合せに依存している傾向が高いので、今回の結果を説明する最も簡単なモデルは、本発明のピロールイミダゾールポリアミドが転写因子— DNA相互作用を遮断し、 hTGF - β 1プロモータ活性に対して阻害効果を示すと、うことである。

プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデ-レーシヨン、スプライシング、 mRNA安定性、翻訳開始等を包含するものである（Berger et al:M ol Cell.2001;5:263-8, McKeown Annu Rev Cell Biol.l992;8:133- 55, Decker et al:Tr ends Biochem Sci.l994;19:336— 40, Kozak Annu Rev Cell Biol.l992;8: 197- 225)。合成ポリアミドはヌクレオノームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合'脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Gottesfeld et al:J Mol Biol.2002;321:249-63;Gottesfeld et al:J Mol Biol.20 01 ;309:615-29.)。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、 GAFの結合を可能とし、その結果 drosophila melanogasterにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的には hTGF— β 1遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。

本発明に係る Py—Imポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これが hTGF— β 1遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。

[0033] また、肝臓の繊維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生にぉ、て重要な役割を果たしている（Bataller R et al.Gastroenterology 118,1149,2000)。星細胞の活性化は TGF— β 1により行われ、更に活性ィ匕星細胞により、傷害肝では炎症細胞からの TGF— β 1の分泌が引き起こされる。同時に活性ィ匕星細胞の TGF— β 1受容体発現が亢進し、 TGF- β 1によるオートクライン機序により細胞外基質蛋白を増加させる（渡辺久剛ら、現代医療、第 35卷 (第 2号)、 2003年)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、上記の各種肝疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0034] また、 IgA腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症等の腎疾患のモデル動物、又は糸球体腎炎や糖尿病性腎症患者の腎生検組織で TGF— βの発現が細胞外基質と並行して増加している（Yamamoto T et ahKidney Int 49:461,19 96、 Border WA et ahKidney Int 51:1388,1997)また同時に Borderらは、抗 TGF— β を Thy— 1腎炎ラットに投与すると、腎糸球体の細胞外基質の蓄積を抑制することを報告した（Border WA et ahKidney Int 51:1388,1997)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、上記の各種腎疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0035] また、動物の心筋梗塞モデルにお!ヽては、瘢痕形成期の梗塞巣で、 TGF- βの発現が持続的に亢進し、心筋繊維化の促進に関与している（Ono et al: Circulation 9 8:149,1998)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、心筋梗塞後の心筋繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0036] また、肺繊維症モデル動物に抗 TGF— β抗体や TGF— β可溶性レセプターを投与することにより肺繊維症が改善する（Giri SN ahThorax 1993)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制薬は、肺繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0037] また、ヒト慢性脾炎における TGF— β 1の高発現については多数報告されているが、再発性急性脾炎のモデル動物に組換え TGF— βを投与すると、脾の炎症部分の繊維化ゃフイブロネクチン mRNAの高発現を引き起こし、逆に脾炎のモデル作成時に TGF— β 1の中和抗体を投与すると、細胞外マトリックスの産生及び Ι·ΠΙ型コラーゲンゃフイブロネクチンの mRNA発現が抑制されることが明らかにされている（槟野直彦他：現代医療 Vol.35,No.2,2003)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、慢性脾炎における繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0038] また、強皮症の原因とし TGF— βが提唱され、森らは皮膚繊維化モデルマウスにおいて、 TGF- βが皮膚繊維化を誘導することを報告した (Mori et al:J Cell Physiol 181:153,1999)。これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、各種皮膚繊維化疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる

[0039] また、骨髄繊維症の患者の巨核球では TGF— |8 mRNAの発現が亢進しており（ Reilly J et ahClin Haematol:11751- 767,1998)、血小板内 TGF— β濃度は高値（Mar tyre M C et al:Br J Haematol 77:80- 86,991)で、患者の血漿中 TGF— β濃度は有意に高い（Rameshwar P et al:Am J Haematol 59:133-142,1998)と報告されている。 R ameshwarらによると骨髄繊維症の患者の単球は粘着によって NF— kが活性化して IL—1産生を誘導し、 IL—1は TGF— 産生を亢進させて骨髄の繊維化を惹起している（Rameshwar et al:J Immunol 165:2271-2277,2000) ₀これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、骨髄繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

[0040] また、男性型前頭部脱毛患者の培養細胞系にお、て、男性ホルモンが皮膚乳頭細胞から TGF— β 1が誘導され、この TGF— β 1が表皮細胞増殖を抑制させることが報告されている（Shigeki et ahFASEB J 16:1967-1969,2002) ₀これらの事実から、本発明の TGF— β 1遺伝子発現抑制剤は、男性型前頭部脱毛に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。

実施例

[0041] I.材料及び方法 (l) hTGF- β 1プロモータに対応する Py— Imポリアミドの設計

Py—Imポリアミドとして、 hTGF— β 1プロモータの一 416〜一 410又は一 373〜 — 366の塩基対に結合するように、上記のような GBP3102又は GBP3103を設計した。

[0042] (2) Fmoc法を用いた Py—Imポリアミドのマシンアシスト (機械補助）自動合成

ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機 Pioneer (商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて 0. lmmolスケール（20 Omgの Fmoc— β—ァラニン一 CLEAR酸レジン、 0. 50meqZg、 Peptide Instit ute, Inc. )で実施した。自動固相合成は DMF洗浄、 Fmoc基の 20%ピぺリジン Z DMFによる除去、メタノール洗浄、 HATU及び DIEA (それぞれ 4当量）の存在下でのモノマーとの 60分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸 Zピリジンによる保護、及び最終的な DMF洗浄力もなつている。 Py— Imポリアミドは一般に中程度の収率（10— 30%)で得られた。

[0043] FITCカップリング： 4倍過剰のフルォレセイン（0. 40mmol)及び DIEA (HATU なし)を DMFに溶解したものをカラムを通して 60分間フラッシュした。

一般的手順： Fmoc- β—ァラニン—Wang榭脂の Fmoc基を除去した後、榭脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程を Fmocアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じて N末端アミノ基を保護するか又は FI TCでカップリングし、 DMFで洗浄し、反応容器を取りはずした。

[0044] カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷ェチルエーテル沈澱により分解工程

(91%TFA—3%ZTIS— 3%DMS— 3%水の混合物5mlZ榭脂0. lmmol)の後に単離した。

ァミンとしての分解：合成ポリアミドを冷ェチルエーテル沈澱により分解工程 (N, N—ジメチルァミノプロピルアミン 5mLZ榭脂 0. lmmol、 50°C、ー晚）の後に単離した。

精製：最終精製は、 lOmLZminの流速の分析用 RP—HPLCで、緩衝液 A(0. 1 %TFAZ水又は 0. 1 %ACOHZ水）中 B (ァセトニトリル）の直線勾配を用いて、 3 50nmの UV検出により行った。 GBP1105及び GBP1106の RP— HPLCのチヤ一トを図 2 (a)及び (b)にそれぞれ示す。

[0045] (3) hVSMC細胞培養

hVSMC (Clonetics)を 10%仔ゥシ血清（Invitrogen)、 lOOUZmLペニシリン、及び lOOmgZmLストレプトマイシンを含む Dulbecco変性 Eagle培地（DMEM)にて培養した。細胞を Ca²⁺, Mg²⁺フリーのリン酸緩衝食塩水（PBS)中 0. 05%トリプシン（Invitrogen)でのトリプシン処理により継代し、 75— cm²組織培養フラスコで培養した。培地は 4〜5日毎〖こ交換し、 5〜： L0継代の間の細胞について実験を行った。 (4)培養 hVSMCにおける FITC—標識ポリアミド類のインキュベーション

継代 hVSMCを 10⁵Zcm²の密度で 24時間、 24ゥエルのフラスコで培養した。 FIT C標識ポリアミドを 10^_9Mの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡で 1時間ごとに観

¾πίした。

[0046] (5)ゲノレシフトアツセィ

オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、 hTGF- β 1プロモーターの塩基対に対応する 12種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。二本鎖 DNAを [ γ — ³²P]— AT Pを用いた T4ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、 37°Cで 15分間、結合緩衝液 (40 mM Tris, pH7. 9, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 25mM DTT, lOOmM

KC1)中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を 20%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィ一で可視化した。

[0047] (6)RNA抽出及び成長因子 mRNAのための逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応 (R T—PCR)アツセィ

培養細胞を PBSで洗浄し、 1000 ;z Lの Trizol (Invitrogen)に溶解し、 100 /z Lのクロ口ホルムと混合し、遠心分離し、上部水相を等体積のイソプロパノールと混合して RNAを沈澱させた。 RNAペレットを 500 μ Lの 75%エタノールで二回洗浄し、乾燥後、 10 /z Lの ΤΕ緩衝液に溶かした。 65°Cで 15分間変性させた後、 RNA試料を室温で 45分間、 0. 5mlの DNァーゼ緩衝液（20mM Tris— HC1 pH 8. 3, 50mM

KC1, 2. 5mM MgCl )中、 0. 5U DNァーゼ（Gibco)で処理した。 DNァーゼは 0. 5mL 0. 5M EDTAを添カ卩し、 98°Cで 10分間加熱することによって不活化した。

[0048] 等量のRNA(l _iu gZ20 _iu L)を、 10mM Tris— HCl (pH 8. 3)、 5mM MgCl 、 50mM KC1、 ImM デォキシ NTP類、及び 2. 5 Mランダムへキサマー中、 2

2

. 5U/20 μ Lトリ骨髄芽腫ウィルス逆転写酵素（Takara Biochemicals, Osaka, Japan)を用いて一本鎖 cDNA中に逆転写させた。 2 μ Lの希釈 cDNA生成物を 10 mM Tris— HCl (pH 8. 3)、 50mM KC1、 4mM MgCl , 0. 025U/ μ L Ta

2

q DNAポリメラーゼ（Takara Biochemicals, Osaka, Japan)及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々 0. 2 Mとともに混合し合計 25 μ L とした。センスプライマー（5，一 ATCAGAGCTCCGAGAAGCGGTACC— 3，） ( 配列番号 7)及びアンチセンスプライマー（5， - GTCCACTTGC AGTGTTATCC TG- 3' ) (配列番号 8)を hTGF— β 1 mRNAの PCR増幅に使用した。ヒト 18Sリボゾーム RNAについてセンスプライマー（5， -TCAAGAACGAAAGTCGGAC G- 3 ' ) (配列番号 9)及びアンチセンスプライマー（5， - GGAC ATCTAAGGGC ATCACA- 3' ) (配列番号 10)を内部対照として使用した。 PCRをサーマルサイクラー（Perkin Elmer, Foster, CA)で行った。 PCR条件は 94°C2分の初期変性、次いで 30サイクルの変性 94°C1分、アニーリング 58°C1分、伸張 72°C1分を行い、最後に 72°C 10分の伸張反応を行うものであった。 18S rRNAについてのプライマ一による PCRを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノム DNA力 PCRによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照 RT— PC R実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しな力つた。 mRNAの半定量的分析のために、 PCR産物がゲル上で検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。連続した 10倍希釈の cDNA(100、 10及び lng)を増幅した。 PC R産物は cDNAの量を増加していくとより早いサイクルの段階で検出可能となった。標的 mRNAの各々に対応する PCR産物の量は 20〜35サイクルで直線的に増加した。 PCR産物の定量は、 Bio Analyzer (Agilent)を用いて行った。

[0049] (7)統計解析

結果は平均値士 SEMで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデント t検定により評価した。 0. 05未満の p値を有意であるとした。

[0050] II.結果

( 1)合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合

ゲルシフトアツセィにより GB1105及び GBP1106の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む 11塩基のセンス、ァンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖 DNAを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。 GBP1105及び GBP1106ともに二本鎖 DNA (DS)にピロ一ルイミダゾールポリアミド（Py—Im)をカ卩えると、 DSのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、 DSと Py— Imとの結合が証明された。結果を図 3に示す。

[0051] (2) GBP1 105による TGF— j8 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果

腎臓由来の培養ヒトメサンギゥム細胞を培養し、 1χ10^_6Μの PMA (12 - 0 - tetradec anoylpholbol- 13 -acetate)を添カ卩して刺激し、 Py— Im (GBP1105)を加えてその TG F— β 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果を検討した。

細胞はサブコンフルェントの状態で無血清培地に交換して 24時間培養し、 1x10" 6Mの PMAと各濃度の Py—Imを加えてさらに 12時間無血清で培養した。細胞は gu anidium thiocyanate法にてメッセンンャ ~~ RNAを力、し、 avian myeloolastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、 PCR法にて増幅した。 PCR産物は Agilen t Bioanalyzerにより定量した。 TGF jS 1遺伝子、 18S rRNAに対する特異的プライマーを作成して PCRを行い、 TGF |8 1遺伝子発現量は 18sにて補正した。

TGF jS 1遺伝子発現量は 1χ10^_6Μの PMA刺激により 20%増加し、 GBP1105 添カ卩により 1χ10^_6Μで最大 50%以下に抑制された（図 4)。

[0052] (3) GBP1 106による TGF— j8 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果

腎臓由来の培養ヒトメサンギゥム細胞を培養し、 1χ10^_6Μの PMA (12 - 0 - tetradec anoylpholbol- 13 -acetate)を添カ卩して刺激し、 Py— Im (GBP1106)を加えてその TG F - β 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果を検討した。細胞はサブコンフルェントの状態で無血清培地に交換して 24時間培養し、 1x10" 6Mの PMAと各濃度の Py—Imを加えてさらに 12時間無血清で培養した。細胞は gu anidium thiocyanate法にてメッセンンャ ~~ RNAを力、し、 avian myeloolastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、 PCR法にて増幅した。 PCR産物は Agilen t Bioanalyzerにより定量した。 TGF jS 1遺伝子、 18S rRNAに対する特異的プライマーを作成して PCRを行い、 TGF |8 1遺伝子発現量は 18Sにて補正した。

TGF jS 1遺伝子発現量は 1χ10^_6Μの PMA刺激により 20%増加し、 GBP1106 添カロにより 1χ10^_6Μで最大 50%以下に抑制された（図 5)。

産業上の利用可能性

[0053] 本発明の TGF— β遺伝子発現抑制剤は TGF— βの産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。

図面の簡単な説明

[0054] [図 1]ヒト TGF— β 1遺伝子の調節領域の塩基配列を示す。

[図 2]本発明のピロールイミダゾールポリアミド GBP1105及び GBP1106の RP— HP LCチャート (a)及び (b)をそれぞれ示す。

[図 3]Py—Imポリアミドオリゴヌクレオチド錯体のゲルシフトアツセィを示す写真である。

[図 4]GBP1105による TGF— β 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果を示すグラフである。

[図 5]GBP1106による TGF— β 1メッセンジャー RNAの発現抑制効果を示すグラフである。

配列表フリーテキスト

[0055] 配列番号 7 センスプライマー

配列番号 8 アンチセンスプライマー

配列番号 9 センスプライマー

配列番号 10 アンチセンスプライマー

Claims

請求の範囲

[1] N—メチルビロール単位（以下 Pyとも言う）、 N—メチルイミダゾール単位（以下 Imとも言う）及び γ—ァミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子 j8 1 (以下 hTGF— β 1とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列— 450〜― 310 (配列番号 2)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域 (以下標的領域と言う）の副溝内において、前記 γ—ァミノ酪酸単位の部位で折りたたまれて U字型のコンフオメーシヨンをとることができ、 C— G塩基対に対しては PyZlm対が、 G— C塩基対に対しては ImZPy対が、 A— T塩基対及び T A塩基対に対してはヽずれも PyZPy対がそれぞれ対応する、上記ピロ一ルイミダゾールポリアミドを含んでなる TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[2] 更に β—ァラニン単位を含む請求項 1記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[3] 前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 430〜一 40 0 (配列番号 5)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項 1又は 2記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[4] 前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列—416〜一 41 0 (配列番号 3)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項 1又は 2記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[5] 前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 380〜一 35 0 (配列番号 6)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項 1又は 2記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[6] 前記標的領域が hTGF— β 1プロモーターの以下に示す塩基配列 373〜一 36 6 (配列番号 4)の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項 1又は 2記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[7] 前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成してヽる請求項 1〜6のいずれか一項記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[8] 前記アミドカ^チルァミノプロピルアミン又は Ν, Ν ジメチルァミノプロピルァミンとのアミドである請求項 1〜7のいずれか一項記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[9] 前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項 1〜4の!、ずれか一項記載の TGF— β遺伝子発現抑制剤。

[化 1]

前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項 1、 2、 5又は 6記載の TGF- β遺伝子発現抑制剤。

[化 2]

[11] 下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド,

[化 3]