JP5865347B2 - ポリアミド化合物及びミトコンドリア遺伝子疾患治療用医薬組成物 - Google Patents
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Description
更に、本発明のポリアミド化合物は、A3236G変異、A3243T変異、G3244A変異、G3249A変異、T3250C変異、A3251G変異、A3252G変異、C3254A変異、C3254G変異、G3255A変異、C3256T変異、T3258C変異、又はA3260Gを原因とするミトコンドリア遺伝子疾患においても、有効であることを見出した。
更に、前記PNAによる治療は、生細胞内における効果が確認できていなかった。しかしながら本発明のポリアミド化合物を用いた医薬組成物によれば、生細胞内における効果が確認されており、細胞膜、及びミトコンドリア二重膜を通過してミトコンドリアDNAに、到達できるものと考えられる。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
すなわち、本発明は、
[1]5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’で表される塩基配列からなるセンス鎖DNA及び5’−TTATGCGATTACCGGGCTCTGCCAT−3’で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖DNAからなる式(1):
(1)標的2本鎖DNAの一方の端のA/T対又はT/A対に対応するポリアミド化合物は、γ−アミノ酪酸残基、(R)2,4ジアミノ酪酸残基、及び5−アミノ吉草酸残基からなる群から選択されるターン構造であり、それらの残基の水素原子は、炭素数1〜4のアルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は−NH3に置換されてもよく、
(2)前記一方の端のA/T対又はT/A対を除く標的2本鎖DNAに対するポリアミド化合物の結合領域は、
(a)G/C対に対応するIm残基/Py残基、又はIm残基/β残基、
(b)C/G対に対応するPy残基/Im残基、又はβ残基/Im残基、
(c)A/T対に対応するPy残基/Py残基、Py残基/Hp残基、Py残基/β残基、β残基/Py残基、又はβ残基/β残基、及び
(d)T/A対に対応するPy残基/Py残基、Hp残基/Py残基、Py残基/β残基、β残基/Py残基、又はβ残基/β残基
(ここで、ImはN−メチルイミダゾール、PyはN−メチルピロール、Hpは3−ヒドロキシN−メチルピロール、及びβはβ−アラニンであり;
G/CがIm残基/β残基に、及びC/Gがβ残基/Im残基に対応できる場合は、GC/GC対に対応するIm残基・β残基/Im残基・β残基の場合、又はCG/CG対に対応するβ残基・Im残基/β残基・Im残基の場合であり;
そしてIm残基、Py残基、Hp残基、β残基の水素原子は、炭素数1〜4のアルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基に置換されてもよい)
からなり、
(3)標的2本鎖DNAの他方の端の5’端に対応するポリアミド化合物の末端は、Im、Py、Hp、若しくはβ−アラニンのアミノ基、又は水素原子、炭素数1〜4のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、若しくは炭素数1〜4のアシル基であり、そして
3’末端に対応するポリアミド化合物の末端は、Im、Py、Hp、若しくはβ−アラニンのカルボキシル基、N,Nジメチルアミノプロピル、又はβ−アラニン・N,Nジメチルアミノプロピルである、
前記ポリアミド化合物、
[2]式(2):
式(11):
からなる群から選択される式で表される、[1]に記載のポリアミド化合物、
[3]式(12):
[4][1]〜[3]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤、
[5][1]〜[3]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物、
[6]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の1番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む、[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3236G変異を有する孤発性両側性視神経症の治療又は予防用医薬組成物、
[7]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む、[1]〜[3]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3243G変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、糖尿病+難聴、ミトコンドリア筋症、リー症候群、感音性難聴、慢性進行性外眼筋麻痺、母系遺伝する難聴を伴う糖尿病、又は巣状分節性糸球体硬化症の治療又は予防用医薬組成物、
[8]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含み、前記A/T対のTに対応する残基がHp残基である、[1]〜[3]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3243T変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、ミトコンドリア筋症、感音性難聴、又は慢性進行性外眼筋麻痺の治療又は予防用医薬組成物、
[9]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の9番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む、[1]〜[3]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3244A変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群の治療又は予防用医薬組成物、
[10]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の14番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む、[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3249A変異を有するカーンズ・セイヤー症候群の治療又は予防用医薬組成物、
[11]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の15番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、T3250C変異を有するミトコンドリア筋症又は慢性進行性外眼筋麻痺の治療又は予防用医薬組成物、
[12]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の16番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3251G変異を有するミトコンドリア筋症の治療又は予防用医薬組成物、
[13]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の17番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3252G変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群の治療又は予防用医薬組成物、
[14]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の19番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、C3254A変異を有する妊娠糖尿病、又はC3254G変異を有するミトコンドリア筋症の治療又は予防用医薬組成物、
[15]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の20番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3255A変異を有するMERRF/KSSオーバーラップ症候群の治療又は予防用医薬組成物、
[16]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の21番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、C3256T変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群の治療又は予防用医薬組成物、
[17]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の23番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、T3258C変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/ミオパチーの治療又は予防用医薬組成物、
[18]前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の25番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む[1]又は[2]に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3260G変異を有する成人母系遺伝性ミオパチー及び心筋症の治療又は予防用医薬組成物
に関する。
前記PNAを用いた変異型mtDNAの複製抑制による治療は、基本的に1つの変異に対して1つのPNAを作製する必要があるが、本発明のポリアミド化合物を用いた医薬組成物による治療は、正常型mtDNAターゲットとしているため、1つのポリアミドにより、複数のミトコンドリアDNAの変異を原因とするミトコンドリア遺伝子疾患を治療することができる。
また、前記PNAを用いた変異型mtDNAの複製抑制による治療は、変異型mtDNAを減少させることを目的としており、直接的に正常型mtDNAを増加させることができない。従って、ミトコンドリア遺伝子疾患によって減少している細胞のエネルギー産生を回復させることができない。しかしながら、本発明の医薬組成物による治療は、正常型mtDNAを増加させることができるため、ミトコンドリア遺伝子疾患の原因を根本的に改善することができる。
本発明のポリアミド化合物は、5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’(配列番号1)で表される塩基配列からなるセンス鎖DNA及び5’−TTATGCGATTACCGGGCTCTGCCAT−3’(配列番号2)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖DNAからなる式(1):
前記式(1)で表される2本鎖DNAは、ミトコンドリアDNAの塩基番号3236〜3260に相当する2本鎖DNAであり、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)遺伝子上に存在している。本明細書においては、前記2本鎖DNAのうち、5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’をセンス鎖DNAと称し、そして5’−TTATGCGATTACCGGGCTCTGCCAT−3’をアンチセンス鎖DNAと称する。
前記2本鎖DNAは、ミトコンドリア遺伝子疾患の変異が存在する領域であり、ミトコンドリア遺伝子疾患の原因となる変異としては、ミトコンドリア塩基番号3236番におけるアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換であるA3236G変異、ミトコンドリア塩基番号3243番におけるアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換であるA3243G変異、ミトコンドリア塩基番号3243番におけるアデニン(A)からチミン(T)への一塩基置換であるA3243T変異、ミトコンドリア塩基番号3244番におけるグアニン(G)からアデニン(A)への一塩基置換であるG3244A変異、ミトコンドリア塩基番号3249番におけるグアニン(G)からアデニン(A)への一塩基置換であるG3249A変異、ミトコンドリア塩基番号3250番におけるチミン(T)からシトシン(C)への一塩基置換であるT3250C変異、ミトコンドリア塩基番号3251番におけるアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換であるA3251G変異、ミトコンドリア塩基番号3252番におけるアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換であるA3252G変異、ミトコンドリア塩基番号3254番におけるシトシン(C)からアデニン(A)への一塩基置換であるC3254A変異、ミトコンドリア塩基番号3254番におけるシトシン(C)からグアニン(G)への一塩基置換であるC3254G変異、ミトコンドリア塩基番号3255番におけるグアニン(G)からアデニン(A)への一塩基置換であるG3255A変異、ミトコンドリア塩基番号3256番におけるシトシン(C)からチミン(T)への一塩基置換であるC3256T変異、ミトコンドリア塩基番号3258番におけるチミン(T)からシトシン(C)への一塩基置換であるT3258C変異、ミトコンドリア塩基番号3260番におけるアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換であるA3260G変異を挙げることができる。
前記2本鎖DNAは、本発明のポリアミド化合物が結合する標的2本鎖DNAを含む。標的2本鎖DNAは、前記A3236G変異、A3243G変異、A3243T変異、G3244A変異、G3249A変異、T3250C変異、A3251G変異、A3252G変異、C3254A変異、C3254G変異、G3255A変異、C3256T変異、T3258C変異、又はA3260G変異に対応する正常型mtDNAの塩基対を含む。具体的には、センス鎖DNAの1番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、センス鎖DNAの9番目のG及びそれと対のCからなるG/C対、センス鎖DNAの14番目のG及びそれと対のCからなるG/C対、センス鎖DNAの15番目のT及びそれと対のAからなるT/A対、及びセンス鎖DNAの16番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、17番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、19番目のC及びそれと対のGからなるC/G対、20番目のG及びそれと対のCからなるG/C対、21番目のC及びそれと対のGからなるC/G対、23番目のT及びそれと対のAからなるT/A対、又は25番目のA及びそれと対のTからなるA/T対からなる群から選択される少なくとも1つの対を含む。本発明のポリアミド化合物は、正常型mtDNAに優先的に結合し、変異型mtDNAに結合しないか、又は結合しにくいものである。
で表される8bpの標的2本鎖DNA、
下記式(14):
で表される11bpの標的2本鎖DNA、又は
下記式(15):
で表される12bpの標的2本鎖DNA、を挙げることができる。
で表される8bpの標的2本鎖DNA、又は
下記式(17):
で表される9bpの標的2本鎖DNAを挙げることができる。
で表される7bpの標的2本鎖DNA、又は
下記式(19):
で表される8bpの標的2本鎖DNAを挙げることができる。
で表される9bpの標的2本鎖DNAを挙げることができる。
で表される8bpの標的2本鎖DNAを挙げることができる。
で表される8bpの標的2本鎖DNAを挙げることができる。
2番目のT及びそれと対のAからなるT/A対、3番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、4番目のT及びそれと対のAからなるT/A対、8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対、9番目のT及びそれと対のAからなるT/A対を挙げることができる。これらのT/A対、又はA/T対を含む標的2本鎖DNAは、T/A対又はA/T対を含む3bp〜16bpの標的2本鎖DNAである。
ポリアミド化合物の標的2本鎖DNAとの結合領域は、前記標的2本鎖DNAに対応するポリアミド化合物の芳香族アミノ酸残基からなる領域である。
ポリアミド化合物に用いるN−メチルピロール残基(以下、Py残基と称することがある)はT、A、C塩基と選択的に結合することができる。また、N−メチルイミダゾール残基(以下、Im残基と称することがある)は、G塩基に選択的に結合することができる。3−ヒドロキシル−N−メチルピロール残基(以下、Hp残基と称することがある)はチミン塩基に選択的に結合することができる。更に、β−アラニン残基(以下、β残基と称することがある)は、T、A、C塩基を認識することができる。β残基は、柔軟性があり、ポリアミドの配向構造をB−DNAの曲率に合わせることができる。
ポリアミドは、残基数が5つ以下であれば、B型DNAへリックスのピッチとほぼ合致し、B型DNAのマイナーグルーブ(副溝)と結合することができる。しかしながら、ポリアミドが5つより大きくなると結合が困難となることがある。このような場合、ポリアミドの中に柔軟性があるβ残基を挿入することにより、ポリアミドの配向構造をB型DNAの曲率に合わせることができる。
本明細書において、N−メチルイミダゾール残基(Im残基)とは、式(24):
本明細書において、3−ヒドロキシル−N−メチルピロール残基(Hp残基)とは、式(25):
本明細書において、β−アラニン残基(β残基)とは、式(26):
本明細書において、γ−アミノ酪酸残基とは、式(27):
本明細書において、(R)2,4ジアミノ酪酸残基とは、式(28):
本明細書において、5−アミノ吉草酸残基とは、式(29):
前記のように、標的2本鎖DNAの一方の端はA/T対又はT/A対であり、それらの塩基対に対応するポリアミド化合物の残基は、γ−アミノ酪酸残基、(R)2,4ジアミノ酪酸残基、及び5−アミノ吉草酸残基からなる群から選択される残基であり、ポリアミド化合物のターン構造を形成する。すなわち、本発明のポリアミド化合物は、γ−アミノ酪酸残基、(R)2,4ジアミノ酪酸残基、又は5−アミノ吉草酸残基により折りたたまれ、ポリアミド全体としてU字型の構造をとる。このU字型の構造により、ポリアミド化合物のそれぞれの残基とDNA塩基とが対応するように結合することができる。
一方、標的2本鎖DNAの他方の端の塩基対は、前記のように、特に限定されるものではなく、T/A対、A/T対、G/C対、又はC/G対のいずれでもよい。従って、ポリアミド化合物の末端構造は、それらの塩基対に対応する残基、すなわち、Im残基、Py残基、Hp残基、又はβ残基のアミノ基、又はカルボキシル基でもよく、更に、標的2本鎖DNAと、ポリアミドとの結合を阻害しない限り、他の残基を有していてもよい。
具体的には、標的2本鎖DNAの他方の端の5’端に対応するポリアミド化合物の末端は、特に限定されるものではないが、Im、Py、Hp、若しくはβ−アラニンのアミノ基、炭素数1〜4のアルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、又は炭素数1〜4のアシル基であり、好ましくは、炭素数1〜4のアシル基であり、より好ましくは、下記式(30):
また、標的2本鎖DNAの他方の端の3’端に対応するポリアミド化合物の末端は、Im、Py、Hp、若しくはβ−アラニンのカルボキシル基、N,Nジメチルアミノプロピル残基、又はβ−アラニン・N,Nジメチルアミノプロピル残基であり、好ましくは下記式(31):
で表されるポリアミド化合物(以下、態様A1と称することがある)を挙げることができる。態様A1の更に好ましい態様として、図2の(a1)に示したAc−Py−Py−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Dp(式中、γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様a1」と称することがある)を挙げることができる。
更に、態様A1のうち、R2がヒドロキシル基であるポリアミドを、特に態様A1−A3243Tと称し、好ましい態様として、Ac−Py−Hp−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Dp(式中、γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様a1−A3243T」と称することがある)を挙げることができる。
で表されるポリアミド化合物(以下、態様A2と称することがある)を挙げることができる。態様A2の更に好ましい態様として、図2の(a2)に示したAc−Im−Im−Im−β−Py−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Py−Py−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様a2」と称することがある)を挙げることができる。
更に、態様A2のうち、R2がヒドロキシル基であるポリアミドを、特に態様A2−A3243Tと称し、好ましい態様として、Ac−Im−Im−Im−β−Hp−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Py−Py−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様a2−A3243T」と称することがある)を挙げることができる。
で表されるポリアミド化合物(以下、態様A3と称することがある)を挙げることができる。態様A3の更に好ましい態様としては、図2の(a3)に示したAc−Py−Im−Im−Im−β−Py−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Py−Py−Im−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、態様「a3」と称することがある)を挙げることができる。
更に、態様A3のうち、R2がヒドロキシル基であるポリアミドを、特に態様A3−A3243Tと称し、好ましい態様として、Ac−Py−Im−Im−Im−β−Hp−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Py−Py−Im−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、態様「a3−A3243T」と称することがある)を挙げることができる。
で表されるポリアミド(以下、「態様B1」と称することがある)を挙げることができ、より好ましくは、Ac−Py−Py−β−Im−Im−Im−Py−γ−Im−Py−Py−β−Im−Im−Py−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様b1」と称することがある)を挙げることができる(図2(b1))。
で表されるポリアミド(以下、「態様B2」と称することがある)を挙げることができ、より好ましくは、Ac−Py−Py−Py−β−Im−Im−Im−Py−γ−Im−Py−Py−β−Im−Im−Py−Py−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様b2」と称することがある)を挙げることができる(図2(b2))。
で表されるポリアミド(以下、「態様C1」と称することがある)を挙げることができ、より好ましくは、Ac−Py−Im−Im−β−Py−Im−γ−Py−Py−Im−β−Py−Py−β−Dp(式中γはγ−アミノ酪酸残基を意味し、DpはN,Nジメチルアミノプロピル残基を意味し、便宜的に「残基」を省略している;以下、「態様c1」と称することがある)を挙げることができる(図2(c1))。
前記態様A1の好ましい態様である「態様a1」は、下記式(12):
本発明のポリアミド化合物は、Fmoc法により合成することが可能である。Fmoc法は、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)を用いた固相法であり、市販のペプチド合成機を用いて合成することができる。
例えば、NovaPEG Wang Resinを固相として用い、脱水縮合(アミド結合)によってPy、Im、又はβ−アラニン等を付加し、順次伸長させていく。目的とするポリアミドの合成が終わったら、N,N−ジメチルー1,3−プロパンジアミンを加え、60℃前後の条件下で固相表面から切り出してポリアミドを回収する。
本発明の正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤は、本発明のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有するものである。
本発明の正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤に含まれるポリアミド化合物は、前項の「[1]ポリアミド化合物」に記載のポリアミドであれば、特に限定されるものではなく、すべてのポリアミド化合物を用いることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明の正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品(飲料を含む)、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有するものである。本発明の医薬組成物に含まれるポリアミド化合物は、前記「[1]ポリアミド化合物」に記載のポリアミドであれば、特に限定されるものではなく、すべてのポリアミド化合物を用いることができる。
本発明の医薬組成物は、前記ポリアミド化合物を1種又は2種以上含むことができる。また、本発明の医薬組成物は、1剤形でも2剤形以上でもよい。例えば、ポリアミド化合物を2種以上含む場合、2種以上のポリアミドを1剤形で提供してもよく、2剤形以上で提供することもできる。
本発明の医薬組成物は、ミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用の医薬組成物として用いることができる。MELASなどのミトコンドリア遺伝子疾患においては、同一の細胞に変異型mtDNAと、正常型(野生型)mtDNAとが共存しており、この状態をヘテロプラスミー(heteroplasmy)という。そして、細胞内において変異型mtDNAが一定の割合(60−95%)を超えた時に、MELAS等のミトコンドリア遺伝子疾患が発症する。本発明の医薬組成物は、正常型(野生型)mtDNAの複製を促進することによって、ヘテロプラスミーを正常型mtDNAに傾けることができる。そしてヘテロプラスミーが正常型mtDNAに傾くことによって、ミトコンドリア遺伝子疾患の発症を治療することができる。また、変異型mtDNAの割合が閾値を超えず、ミトコンドリア遺伝子疾患が発症していない段階において、本発明の医薬組成物を投与することによって、ヘテロプラスミーが変異型mtDNAに傾くことを抑制することができる。従って、本発明の医薬組成物は、ミトコンドリア遺伝子疾患の発症の予防に有効である。
A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、孤発性両側性視神経症(Sporadic bilateral optic neuropathy)の症状を呈する。
A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の1番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様C2のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群(MELAS)、糖尿病+難聴、ミトコンドリア筋症、リー症候群、感音性難聴、慢性進行性外眼筋麻痺、母系遺伝する難聴を伴う糖尿病、又は巣状分節性糸球体硬化症の症状を呈する。
A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様A1、態様A2、態様A3、態様B1、態様B2、態様C1、又は態様C2のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群(MELAS)、ミトコンドリア筋症、感音性難聴、又は慢性進行性外眼筋麻痺の症状を呈する。
A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含み、前記前記A/T対のTに対応する残基がHp残基であるポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様A1−A3243T、態様A2−A3243T、又は態様A3−A3243Tのポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群(MELAS)の症状を呈する。
G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の9番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様A1、態様A2、態様A3、態様B1、又は態様B2のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、カーンズ・セイヤー症候群の症状を呈する。
G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の14番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様B1、又は態様B2のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア筋症又は慢性進行性外眼筋麻痺の症状を呈する。
T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の15番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様B1、態様B2、又は態様D1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア筋症の症状を呈する。
A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の16番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様B2、態様D1、又は態様E1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群(MELAS)の症状を呈する。
A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の17番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、又は態様E1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、妊娠糖尿病(GDM Gestational Diabetes)の症状を呈する。
C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の19番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、態様E1、又は態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア筋症の症状を呈する。
C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の19番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、態様E1、又は態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、MERRF/KSSオーバーラップ症候群の症状を呈する。
G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の20番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、態様E1、又は態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群の症状を呈する。
C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の21番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、態様E1、又は態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/ミオパチーの症状を呈する。
T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の23番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様D1、態様E1、又は態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
A3260G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患は、成人母系遺伝性ミオパチー及び心筋症(Adult MMC Maternal Myopathy and Cardiomyopathy)の症状を呈する。
T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患に対しては、前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の25番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含むポリアミド組成物を含む医薬組成物を用いることによって、治療又は予防を行うことができる。例えば、前記態様F1のポリアミド化合物を含む医薬組成物によって、A3260G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を治療又は予防することができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。更に、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、又はカチオン脂質法を用いて目的の組織、又は細胞内に導入することが可能である。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品(飲料を含む)、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明の医薬を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品(飲料を含む)、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
本発明のミトコンドリア遺伝子疾患の治療又は予防方法は、前記ポリアミド化合物をミトコンドリア遺伝子疾患の治療が必要な対象に有効量で投与することを含む。投与されるポリアミドは、前記「[1]ポリアミド化合物」に記載のポリアミドであれば、特に限定されるものではなく、すべてのポリアミド化合物を用いることができる。本発明の治療又は予防方法においては、前記ポリアミド化合物を1種又は2種以上投与することができる。
前記ミトコンドリア遺伝子疾患としては、A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、又はA3260G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を挙げることができ、それぞれの変異に応じて、前記「[3]医薬組成物」の欄に記載のポリアミド組成物を選択して用いることができる。
本発明のミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用ポリアミド化合物は、ミトコンドリア遺伝子疾患の治療に用途が限定されたポリアミド化合物である。本発明のミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用ポリアミドは、前記「[1]ポリアミド化合物」に記載のポリアミドであれば、特に限定されるものではなく、すべてのポリアミド化合物含む。本発明のミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用ポリアミド化合物は、ミトコンドリア遺伝子疾患患者に、1種を単独で、又は2種以上混合して投与することができる。
前記ミトコンドリア遺伝子疾患としては、A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、又はA3260G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を挙げることができ、それぞれの変異に応じて、前記「[3]医薬組成物」の欄に記載のポリアミド組成物を選択して用いることができる。
本発明の使用は、ミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用医薬の製造のためにポリアミド化合物を使用することである。試用されるポリアミドは、前記「[1]ポリアミド化合物」に記載のポリアミドであれば、特に限定されるものではなく、すべてのポリアミド化合物を使用することができる。本発明のミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用医薬の製造においては、前記ポリアミド化合物を1種又は2種以上使用することができる。
前記ミトコンドリア遺伝子疾患としては、A3236G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3243T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3244A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3249A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3250C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3251G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、A3252G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3254G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、G3255A変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、C3256T変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、T3258C変異によるミトコンドリア遺伝子疾患、又はA3260G変異によるミトコンドリア遺伝子疾患を挙げることができ、それぞれの変異に応じて、前記「[3]医薬組成物」の欄に記載のポリアミド組成物を選択してミトコンドリア遺伝子疾患治療又は予防用医薬の製造に用いることができる。
前記標的2本鎖DNAは、ミトコンドリアDNAの塩基番号3236〜3260に相当する2本鎖DNAであり、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)遺伝子上に存在している。本発明のポリアミド化合物は、正常型mtDNAの配列に従ってデザインされている。従って、正常型mtDNA及び変異型mtDNAが共存しているヘテロプラスミー(heteroplasmy)の状態において、正常型mtDNAに選択的に結合すると考えられる。本発明のポリアミド化合物が、変異型mtDNAと比較して、正常型mtDNAに選択的に結合することによって、正常型mtDNAの複製を促進しているものと考えられる。また、ミトコンドリアDNAの塩基番号3229〜3256には、mTERF(mitochondrial transcription termination factor)と呼ばれるタンパク質が結合する領域が存在している。本発明のポリアミドが正常型mtDNAの複製を促進している機構は、限定されるものではないが、このミトコンドリアDNAとmTERFとの結合を阻害していることが考えられる。
従って、本発明のポリアミド化合物の代わりに、ミトコンドリアDNAの塩基番号3236〜3260のヌクレオチドに結合する物質、又はミトコンドリアDNAの塩基番号3229〜3256のヌクレオチドに結合する物質によっても、本発明の効果を得ることができる。ポリアミド化合物以外のヌクレオチド結合物質としては、例えばPNA、又は低分子化合物を挙げることができる。本発明のポリアミド化合物は、変異型mtDNAに結合せず、正常型mtDNAに結合する。前記PNA又は低分子化合物も変異型mtDNAに結合せず正常型mtDNAに結合することによって、本発明のポリアミド化合物と同じ効果を得ることができる。また、ヌクレオチド結合物質の結合する領域としては、塩基番号3230〜3260の任意の3ヌクレオチド以上であれば限定されるものではなく、好ましくは4ヌクレオチド以上であり、より好ましくは5ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは6ヌクレオチド以上である。
なお、本発明のポリアミド化合物の効果は、ミトコンドリアDNAの塩基番号3236〜3260、又は3229〜3256に相当する2本鎖DNAの変異型mtDNAに対する正常型mtDNAの複製においてみられる現象であり、他の領域の変異型mtDNAに対する正常型mtDNAに結合するポリアミド化合物では見られない現象であり、この塩基番号3236〜3260の領域における正常型mtDNAに本発明のポリアミド化合物が選択的に結合することにより、変異型mtDNAと比較して正常型mtDNAの複製効率を上昇させているものである。
化合物を疾患の治療に用いるためには、その化合物が投与される対象(ヒト又はヒト以外の動物)に対して副作用を示さないことが重要である。本発明のポリアミド化合物は、後述の実施例4に示したように、143B細胞、及びHeLa細胞に対して、細胞毒性を示さなかった。すなわち、本発明のポリアミド化合物を含む正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤、又は医薬組成物は、ヒトなどに対して副作用を示さないと考えられる。
本発明のポリアミド化合物が結合すると考えられる標的二本鎖DNAの領域は、前記mTERFの結合配列28bpのヌクレオチド配列とオーバーラップしている。mTERFは、16SrRNAとtRNALeu(UUR)との境界付近に存在する28bpの配列と結合し、転写終結に関連していると考えられる。mTERFの主要な機能はミトコンドリアrRNAの効率的な合成だと考えられ、本発明のポリアミド化合物の結合領域と、mTERFの結合領域とがオーバーラップするため、mTERFの機能(ミトコンドリアrRNAの合成)を阻害し細胞に悪影響を与える可能性が考えられた。しかしながら、本発明のポリアミド化合物は、細胞毒性を示さず、正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤、又は医薬組成物としても副作用を示さないと考えられる。
本実施例では、ML1ポリアミドをFmoc法により固相合成した。ML1ポリアミドの配列は、Ac−Py−Py−Py−β−Im−Py−Py−γ−Im−Im−Py−β−Im−Py−Im−β−Dpである。
合成は、NovaPEG Wang Resinを固相として用い、脱水縮合(アミド結合)によってPy(N−メチルピロール)、Im(N−メチルイミダゾール)、β(β−アラニン)、又はγ(γ−アミノ酪酸)を付加し、順次伸長させた。最後にN,N−ジメチルー1,3−プロパンジアミンを加え、60℃前後の条件下で固相表面から切り出してPIポリアミドを回収した。得られたML1ポリアミドの分子量は質量分析装置(島津製作所)で確認した。
<溶媒がddH2Oの場合>
濃度(M)=吸光度/[8600x12]
<溶媒がDMSO、DMFの場合>
濃度(M)=吸光度/[9800x12]
本実施例では、ML1ポリアミドとターゲット配列とのin vitroでの塩基配列特異的結合を確認した。解析は、EMSA(electrophoretic mobility shift assay)により行った。A3243G変異の存在する3243番を含む21塩基の正常型オリゴDNA及びA3243G変異型オリゴDNAを合成した。5’末にFITCを結合させたセンス鎖DNAとアンチセンスDNAとをサーマルサイクラーにて熱変成させた後、徐冷、アニーリングを行い、以下の配列のdsDNAを作成した。
<正常型(野生型)mtDNA template>
5’−FITC−TGTTAAAGATGGCAGAGCCCG−3’
3’−ACAATTTCTACCGTCTCGGGC−5’
(配列番号23及び24)
<A3243G変異型mtDNA template>
5’−FITC−TGTTAAAGATGGCAGGGCCCG−3’
3’−ACAATTTCTACCGTCCCGGGC−5’
(配列番号25及び26)
下線の配列はML1ポリアミドの認識領域を示している。
dsDNA(50pmol/10μL)にddH2Oを40μL加え、1pmol/μLまで希釈した。このdsDNAの4pmolを、10−4Mの濃度になるようにML1ポリアミド溶液と混合し、37℃、1時間インキュベートした。その後サンプルをloading bufferと混合し、350V、10分プレランした20%非変性アクリルアミドゲル(0.5XTBE)にアプライした。4℃、100VでBPBがゲルの下端3/4に来るまで泳動し、バンドのシフトをLAS−3000(FujiFilm)で検出した。
EMSAに使用した非変成アクリルアミドの組成を以下に示す。
<EMSA用ゲルの組成>
30%アクリルアミド 16.5mL
10XTBE 2.5mL
10%APS 188μL
グリセロール 878μL
ddH2O 14.0mL
TEMED 11.3μL
25.0mL
図3に示すように、ML1ポリアミド10−4MでML1ポリアミドと正常型dsDNAとの結合に伴うバンドの明確なシフトが見られた。この実験結果は、ML1ポリアミドはin vitroにおいてターゲットdsDNAと、速やかに且つ強固結合することを示している。また、このアッセイで、ターゲット配列dsDNAとの結合に伴うバンドのシフトが見られる濃度(10−4M)において、変異型dsDNAとML1ポリアミドとの結合に伴う顕著なバンドのシフトは確認出来なかったことから、ML1ポリアミドは一塩基の差異を認識して、実際にin vitroにおいて塩基配列特異的に結合することを示した。
本実施例では、細胞内におけるML1ポリアミドの正常型mtDNAの複製促進効果を確認した。
培養MELASサイブリッド細胞にML1ポリアミドを投与し、正常型mtDNAの積極的な複製が、細胞内で起こるかを確認した。
10cmディッシュに2SDサイブリッド細胞を播き、complete DMEMの培地中に50%DMSOに溶解させたML1ポリアミドを、最終濃度1μM、5μM、又は10μMとなるように添加した。ML1ポリアミドを添加した培地の交換は3日ごとに行った。コントロールには同じ希釈率のDMSOを培地に加えた。なおDMSOの培地中の濃度は0.1%以下(最大0.05%)になるように、50%DMSO溶液に溶解させたポリアミド溶液をddH2Oで希釈した。
ML1ポリアミドで処理したサイブリッド細胞から14日後にトータルDNAを抽出し、PCR−RFLPを行った後、マイクロチップ泳動装置(MCE−202 MultiNA;島津製作所)でバンドの定量を行い、サイブリッド細胞の変異率を解析した。
その結果、1μM、500nM、100nMの濃度で処理した全ての細胞で、PCR−RFLP後のagaroseゲル電気泳動で、コントロールに対し、肉眼で確認出来る程の野生型mtDNAの増加が認められた。図5は、15日後の野生型mtDNAの増加を示したものである。
更にML1ポリアミド濃度500nMでの2SDサイブリッド細胞の培養を35日間続けたが、継続的な野生型mtDNAの増加を認めた(図6)。
本実施例では、本発明の医薬組成物等の副作用の確認のために、ML1ポリアミドの細胞毒性の有無を検討した。呼吸鎖欠損細胞が生存出来ない、10%FBS添加DMEM培地(ピルビン酸ナトリウム不含、ウリジン不含)に、1μMのML1ポリアミドを添加し、143B細胞又はHeLa細胞を培養した。ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質合成は細胞の生命維持に必須な為、僅かな機能不全でも細胞は死に至ることになる。
143B細胞、HeLa細胞をDMEM、complete DMEM(ピルビン酸ナトリウム0.1mg/mL、ウリジン50μg/mL)、complete DMEM with ML1ポリアミド、又はDMEM with ML1ポリアミドで一週間培養し、細胞の生死を観察した。
143B細胞では100nM、500nM、1μMの濃度のML1ポリアミドを添加し、またHeLa細胞では1μMの濃度のML1ポリアミドを添加した。図7に培養開始30時間後の、1μM処理の143B細胞(図7A)、500nM又は100nM処理の143B細胞(図7B)、及び1μM処理のHela細胞(図7C)を示す。ウリジン、ピルビン酸ナトリウムが含まれていないDMEMで培養した143B細胞、及びHeLa細胞は、30時間後、更に一週間の培養後でも、何ら形態学的な影響が無く、細胞毒性は見られなかった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (17)
- 5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’で表される塩基配列からなるセンス鎖DNA及び5’−TTATGCGATTACCGGGCTCTGCCAT−3’で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖DNAからなる式(1)
式(2):
式(11):
からなる群から選択される式で表されるポリアミド化合物。 - 式(12):
- 請求項1又は2に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする正常型ミトコンドリアDNAの複製促進剤。
- 請求項1又は2に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の1番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む、請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3236G変異を有する孤発性両側性視神経症の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む、請求項1又は2に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3243G変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、糖尿病+難聴、ミトコンドリア筋症、リー症候群、感音性難聴、慢性進行性外眼筋麻痺、母系遺伝する難聴を伴う糖尿病、又は巣状分節性糸球体硬化症の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の8番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含み、前記A/T対のTに対応する残基がHp残基である、請求項1又は2に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3243T変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、ミトコンドリア筋症、感音性難聴、又は慢性進行性外眼筋麻痺の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の9番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む、請求項1又は2に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3244A変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の14番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む、請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3249A変異を有するカーンズ・セイヤー症候群の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の15番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、T3250C変異を有するミトコンドリア筋症又は慢性進行性外眼筋麻痺の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の16番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3251G変異を有するミトコンドリア筋症の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の17番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3252G変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の19番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、C3254A変異を有する妊娠糖尿病、又はC3254G変異を有するミトコンドリア筋症の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の20番目のG及びそれと対のCからなるG/C対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、G3255A変異を有するMERRF/KSSオーバーラップ症候群の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の21番目のC及びそれと対のGからなるC/G対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、C3256T変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群の治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の23番目のT及びそれと対のAからなるT/A対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、T3258C変異を有するミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群/ミオパチーの治療又は予防用医薬組成物。
- 前記センス鎖DNA5’−ATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA−3’の25番目のA及びそれと対のTからなるA/T対に対応する残基を含む請求項1に記載のポリアミド化合物又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする、A3260G変異を有する成人母系遺伝性ミオパチー及び心筋症の治療又は予防用医薬組成物。
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