JP2003508450A

JP2003508450A - 分子のカップリング方法

Info

Publication number: JP2003508450A
Application number: JP2001520148A
Authority: JP
Inventors: マイケルジョンゲイト; ドミトリーステツェンコ
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2003-03-04
Also published as: CA2382499A1; WO2001015737A2; EP1207909A2; WO2001015737A3; AU6853900A

Abstract

(57)【要約】第一分子M¹-NH₂を第二分子M²-OHと連結する方法であって、次式（I）M¹-NH-CO-A-CO-SR¹ （I）（式中、M¹は、アミノ基を有する分子の残基であり、Aは、アルキレン又はアリーレン基であり、R¹は、アルキル又はアリールである）で示される化合物を、次式（II）【化１】（式中、M²は、ヒドロキシ基を有する分子の残基であり、Bは、リンカーであり、Dは、C_1-4アルキレン基又はC_3-12アリーレン基であり、R²は、水素又はチオール保護基である）で示される化合物と反応することを特徴とする方法である。更に、本発明は、カップリング反応のコンジュゲート生成物、M¹-NH₂及びM²-OHの変性のための試薬、及びこれらの試薬を含むキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ペプチド及びオリゴヌクレオチドのような分子をカップリングする
方法、それらの合成中間体及びカップリング剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】

コンジュゲート、例えば、ペプチド及びオリゴヌクレオチドは、多くの潜在的
な用途を有する。最近、多くのペプチドがオリゴヌクレオチドやDNAの細胞への
キャリヤーとして提案されている。これらのペプチドは、適切なリンカーを介し
てオリゴヌクレオチドに共有結合できる。ペプチド及びオリゴヌクレオチドのような分子のコンジュゲーションには、組
成において実質的に変化するコンジュゲートに広範囲に適用できる、確実なカッ
プリングの化学的性質が必要である。現在のところ、これらの基準に合致したコ
ンジュゲートの合成に利用できる方法は殆ど無い。ペプチド及びオリゴヌクレオ
チドのような分子をカップリングするための幾つかの戦略には、合成及び/又は
固体支持体の上にカップリング成分の１つ又は両方を接着することが含まれる。
固相でカップリング反応を行なう利点の一つは、製品の容易な精製である。従っ
て、この技術は、自動化された合成に合わせ易い。

【０００３】ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成に対して最も熱望される
ルートは、おそらく、単一の固体支持体上での全体的で段階的な固相のアプロー
チである。しかしながら、このようなルートは、技術的にも化学的にも、重要な
困難を起こす。第一に、ペプチドとオリゴヌクレオチドの一連の組立を行なう、
十分に広範囲の試薬を取り扱うことのできる自動化された装置が全く存在しない
。第二に、組立の化学、特に、保護基の選択及び脱保護条件において、適合性の
厳しい問題がある。このような問題は、相対的に短いペプチドに対するこのアプ
ローチを制限し、このような方法によって製造された、最も長い報告されている
コンジュゲートは、ホスホロチオエート15-マーに結合したIGF1の13-マー Dペ
プチドである（Basuら、Tetrahedron Lett.,36(1995)4943）。ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲーションにおける、より一般的な戦
略は、ペプチドとオリゴヌクレオチドの一部が、それら自身の固体支持体上でば
らばらに組み合わさり、支持体から切断される反応的機能性を伴い、十分な脱保
護が行なわれるように設計される。精製に従って、ペプチド及びオリゴヌクレオ
チドの一部は、水溶性又は不溶性溶液中で、反応的機能性を通じて結びつく。こ
のような機能化されたペプチド及びオリゴヌクレオチドをカップリングできる一
般に可能な方法は、幾分制限される。水溶液中のコンジュゲーション反応の中で
、Bongartzら（Nucleic Acids Res., 22(1994)4681）、Vivesら（Tetarhedro
n Lett., 38(1997)1183）及びEritjaら（Tetrahedron Lett., 47(1991)4113
）は、ジスルフィド結合の形成を通じたカップリングを報告している。Eritjaら
（Tetrahedron, 47(1991)4113）は、マレイミドペプチドとのチオールオリゴヌ
クレオチドの反応を通じたカップリングを報告している。Harrisonら（Nucleic
Acids Res., 26(1998)3136）及びTungら（Bioconj. Chem., 2(1991)464）
は、マレイミドオリゴヌクレオチドとのシステインペプチドのカップリングにつ
いて報告している。Ararら（Bioconj. Chem., 6(1995)573）は、チオール機能
化オリゴヌクレオチドとのブロモアセチルペプチドのカップリングについて報告
する。Soukchareunら（Bioconj. Chem.,9(1998)466）は、3'-システイン機能化
オリゴヌクレオチドとのマレイミドペプチドのカップリングについて報告してい
る。 McMinnとGreenbergは、3'-アミノ機能化オリゴヌクレオチドへの、ペプチドの
カルボキシル末端を介して又はアリールイソシアネート誘導体として部分的に保
護されたペプチドの不溶性コンジュゲートを報告している（McMinn及びGreenber
g、J．Amer. Chem. Soc., 120(1998)3289）。

【０００４】公表されている手順による、水溶性又は不溶性溶液中のコンジュゲーション反
応を行なう幾つかの不利な点は、（ａ）オリゴヌクレオチドを、しばしば、支持
体からの放出後に更に機能化させる必要がある、（ｂ）カップリング成分の１つ
又は両方を、しばしば、コンジュゲーションよりも先に精製する必要がある、（
ｃ）ペプチド配列の制限（例えばシステインに対して必要）、（ｄ）第二構造、
又はペプチド又はオリゴヌクレオチド成分の劣った溶解性による、効果のないコ
ンジュゲーション、及び（ｅ）生成コンジュゲートからのカップリング成分の分
離の困難性、特にコンジュゲーションの収率が悪い場合、である。固相フラグメントコンジュゲーション方法には、他溶液中に成分が残っている
間、コンジュゲーション中の固体支持体上の１種の成分の保持が含まれる。例え
ば、Grandasらは、ヘキサヌクレオチドが結合している支持体への、アミドホス
ホラミダイト誘導体としてのトリペプチドのフラグメントコンジュゲーションを
報告している（Grandasら、Nucleoside and Nucleotides、14(1995)825）。Pe
yrottesらは、5'-アミノ機能化したオリゴヌクレオチドが結合した支持体への、
カルボキシ末端を介した幾つかのペプチドのコンジュゲーションを報告している
（Peyrottesら、Tetrahedron,54(1998)12513；Nucleosides and Nucleotides
、18(1999)1443）。この方法は、液相の戦略を超えた幾つかの利点を有する。１
つの利点は、１種の成分の過剰（例えばペプチド）を、完成への反応を制御する
のに使用でき、次に、過剰な未コンジュゲートのペプチドを、単純な濾過及び洗
浄で除去できる。これは、コンジュゲーションに続く製品の精製を単純化して援
助する。

【０００５】高い効果と一般的に適用可能なコンジュゲーション反応は、液相及び固相フラ
グメントカップリングの両方の成功に必須である。液相のコンジュゲーションの
収率は、支持体に装填されたカップリング成分の性質と溶液のカップリング成分
の性質によって大きく影響され得る。両方の成分は、高い溶媒和を維持するのに
必要であり、これは、適切に変化させる溶媒和条件（例えば、水溶性、水溶性有
機混合物、変性剤の存在下での水溶性等）を可能にするコンジュゲーションの方
法を必要とする。大きいペプチド及び小さいタンパク質の合成に使用される最近の方法には、２
つの十分に保護されていないペプチドフラグメントの「未変性ライゲーション」
が含まれ（Dawsonら、Science,266(1994)776； Wilkenら、Curr.Opinion Biot
ech.,9(1998)412）、１つには、C末端チオエステル及びその他N末端システイン
が含まれる。ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲーションの場合、Bruickら（Chem．
& Biol.,3(1996)49）は、DNAテンプレート上に整列したペプチドチオエステル
オリゴヌクレオチドへの3'-アミノオリゴヌクレオチドのライゲーションを報告
しているが、様々な成分の合成は厄介であり、この方法は、3'-ペプチドのコン
ジュゲートされたオリゴヌクレオチドに限定され、DNAテンプレートを要求する
。従って、広範囲の基質に適用できるペプチドやオリゴヌクレオチドのようなカ
ップリング分子の方法を開発することが必要とされている。本発明の目的は、高い効果及び広範囲に適用可能なカップリング化学を使用す
る、ペプチド及びオリゴヌクレオチドのような分子のカップリング方法を提供す
ることである。本発明の更なる目的は、液相及び固相に使用でき、かつ成分の溶
媒和を維持する広範囲の溶媒条件下で、ペプチド及びオリゴヌクレオチドのよう
な分子のカップリング方法を提供することである。本発明の更なる目的は、ペプ
チド及びオリゴヌクレオチドのような分子を、互いに結合できるように、変更す
るための方法及び試薬を提供することである。

【０００６】本発明によれば、第一分子M¹-NH₂を、第二分子M²-OHに連結する方法であって
、次式（I） M¹-NH-CO-A-CO-SR¹ （I）（式中、 M¹は、アミノ基を有する分子の残基であり、 Aは、アルキレン又はアリーレン基であり、 R¹は、アルキル又はアリールである）で示される化合物を、次式（II）

【０００７】

【化７】

【０００８】（式中、 M²は、ヒドロキシ基を有する分子の残基であり、 Bは、リンカーであり、 Dは、C_1-4アルキレン基又はC_3-12アリーレン基であり、 R²は、水素又はチオール保護基である）で示される化合物と反応する方法が提供される。本発明の方法は、アミノ基を有する分子を、ヒドロキシ基を有する分子とカッ
プリングするのに一般的に適用できる。従って、M¹は、アミノ基を有する分子の
残基であればよく、M²は、ヒドロキシ基を有する分子の残基であればよい。特に
、M¹及びM²は、独立して、ペプチド又はオリゴヌクレオチド残基を含んでも良い
。好ましくは、M¹は、ペプチド残基を含む。好ましくは、M²は、オリゴヌクレオ
チド残基を含む。

【０００９】ここで使用される、用語「ペプチド」は、５００までのアミノ酸又はペプトイ
ド（ペプチド様）ユニットの分子をいう。アミノ酸は、天然の、変性された又は
合成のアミノ酸でよい。ペプチドは、十分に保護され、部分的に保護され、又は
保護されてなくてもよい。ここで使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、５００までのヌクレオチ
ドユニットの分子をいう。ヌクレオチドユニットは、天然の、変性された、又は
合成のヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）でよい。オリゴヌクレオチドは、1
種以上の化学的に変更されたリン酸残基（例えば、チオホスフェート等）及び非
リン主鎖置換（例えば、カルボキサミド等）を含んでもよい。オリゴヌクレオチ
ドは、十分に保護され、部分的に保護され、又は十分に保護されていなくてもよ
い。ここで使用される、用語「アルキル」は、分枝又は非分枝の、環状又は非環状
の、飽和又は不飽和の（例えば、アルケニル又はアルキニル）ヒドロカルビル基
を意味する。非環状の場合、アルキル基は、好ましくは、C₁〜C₁₈であり、より
好ましくは、C₁〜C₁₀であり、更に好ましくは、C₁〜C₄の鎖である。環状の場合
、アルキル基は、好ましくは、C₃〜C₁₂であり、より好ましくは、C₅〜C₁₀であり
、更に好ましくは、C₅、C₆又はC₇の環である。アルキル鎖又は環は、１種以上の
ヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄又は窒素を含んでも良い（即ち、任意に、ヘテ
ロ原子で中断及び/又は終結する）。

【００１０】ここで使用される、用語「アルキレン」は、分枝又は非分枝の、環状又は非環
状の、飽和又は不飽和の二価のヒドロカルビル基を意味する。非環状の場合、ア
ルキレン基は、好ましくは、C₁〜C₁₈、より好ましくは、C₁〜C₁₀、更に好ましく
は、C₁〜C₄の鎖である。環状の場合、アルキレン基は、好ましくは、C₃〜C₁₂、
より好ましくは、C₅〜C₁₀、更に好ましくは、C₅、C₆又はC₇の環である。アルキ
レン鎖又は環は、１種以上のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄又は窒素を含んで
もよい（即ち、任意に、ヘテロ原子で中断及び/又は終結する）。ここで使用される、用語「アリール」は、C₃〜C₂₆、好ましくは、C₃〜C₁₂、芳
香族基、例えば、フェニル又はナフチル、又は１種以上、好ましくは1種のヘテ
ロ原子を含む芳香族複素基、例えば、ピリジル、ピロリル、フラニル、チエニル
を意味する。ここで使用される、用語「アリーレン」は、C₃〜C₂₆、好ましくは、C₃〜C₁₂の
芳香族基（例えば、o-、m-又はp-フェニレン）又は１種以上の、好ましくは１種
のヘテロ元素を含む芳香族複素基（例えば、ピリジン-2,3-ジイル基）から成る
二価のヒドロカルビル基を意味する。

【００１１】アルキル、アリール、アルキレン及びアリーレン基は、更に、置換又は非置換
にできる。例えば、C₁（メチル）基は、更に、フェニル基で置換されて、ベンジ
ル基を与えてもよい。置換基は、以下を含むことができる。アルキル、アリール、アラルキル（例えば、置換及び非置換フェニル、置換及び非置換ベンジル）のような、炭素含有基、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）のような、ハロゲン元素及びハロゲン含有基、アルコール（例えば、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール（ヒドロキ
シ）アルキル）、エーテル（例えば、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキ
ル）、アルデヒド（例えば、カルボキサルデヒド）、ケトン（例えば、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アリー
ルカルボニル、アリールアルキルアルボニル、アリールカルボニルアルキル）、酸（例えば、カルボキシ、カルボキシアルキル）、エステルのような酸誘導体（例えば、アルコキシカルボニル、アルコキシカル
ボニルアルキル、アルキルカルボニルイオキシ（alkycarbonylyoxy）、アルキル
カルボニルイオキシアルキル(alkycarbonylyoxyalkyl）、アミドのような酸誘導体（例えば、アミノカルボニル、モノ又はジアルキルア
ミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、モノ又はジアルキルアミノカルボ
ニルアルキル、アリールアミノカルボニル）、カルバメートのような酸誘導体（例えば、アルコキシカルボニルアミノ、アリ
ールオキシカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、モノ又はジアルキルア
ミノカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニルオキシ）尿素のような酸誘導体（例えば、モノ又はジアルキルアミノカルボニルアミノ
又はアリールアミノカルボニルアミノ）のような、酸素含有基、アミン（例えば、アミノ、モノ又はジアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ
又はジアルキルアミノアルキル）アジド、ニトリル（例えば、シアノ、シアノアルキル）、ニトロ、のような、窒素含有基、チオール、チオエステル、スルホキシド、及びスルホン（例えば、アルキルチ
オ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオアルキル、アル
キルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、アリールチオ、アリ
ールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオアルキル、アリールスル
フィニルアルキル、アリールスルホニルアルキル）、のような、硫黄含有基、及び、１種以上の、好ましくは、１種のヘテロ原子を含む複素環基（例えば、チエニ
ル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾ
リル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピロリジニル、ピロ
リニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフ
ラニル、ピラニル、ピロニル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピペリジ
ル、ピペラジニル、モルホリニル、チアナフチル、ベンゾフラニル、イソベンゾ
フラニル、インドリル、オキシインドリル、イソインドリル、インダゾリル、イ
ンドリニル、7-アザインドリル、ベンゾピラニル、クマリニル、イソクマリニル
、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、シンノリニル、キナゾリニル
、ピリドピリジル、ベンゾキサジニル、キノキサリニル、クロメニル、クロマニ
ル、イソクロマニル、フタルアジニル及びカルボリニル）ここで使用される、用語「アルコキシ」は、アルキル-O-を意味し、「アルカ
ノイル」は、アルキル-COを意味する。アルキル置換基又はアルキル含有置換基
は、１種以上の更なる置換基を含むことができる。ここで使用される、用語「アリールオキシ」は、アリール-O-を意味し、「ア
リロイル」は、アリール-COを意味する。アリール置換基又はアリール含有置換
基は、１種以上の更なる置換基を含むことができる。ここで使用される、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素の基
を意味し、好ましくは、フッ素又は塩素の基である。

【００１２】本発明の更なる特徴に従って、式（I）の化合物が提供される。式（I）の化合
物は、M¹-NH₂をM²-OHとカップリングする方法に使用するのに適切である。好ま
しくは、M¹は、ペプチド残基を含む。M¹がペプチド残基の場合、M¹-NH₂のアミノ
基は、N末端アミノ基、内部のアミノ基でよく、又はペプチドのC末端の終わりに
導入されたアミノ基でもよい。好ましくは、アミノ基は、N-末端アミノ基である
。 N-末端チオエステルの調製の１つの利点は、チオエステル基が、末端アミノ基
から間隔が置かれていることである。これは、スレオニン、イソロイシン、バリ
ン又はプロリンのようなC末端に立体的に妨害されるアミノ酸を含むペプチドのC
末端チオエステルは、未変性のライゲーション反応でゆっくりと結合することが
知られる助けになっている（Hackengら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、(
96)、1999、10068-10073）。第二の利点は、コンジュゲーション反応の間、ペプ
チドのラセミ化が不可能であることである。ペプチド残基は、固体支持体に接着できる。ペプチド残基が固体支持体に接着
すると、固体支持体を、本質的に、C末端、又はペプチド残基のN-末端に接着す
ることができる。好ましくは、固体支持体は、ペプチド残基のC末端を介して接
着される。本発明の化合物を調製することができ、本発明の方法を、液相又は固体支持体
で、好ましくは、固体支持体で行なった。

【００１３】ここで使用される、用語「固体支持体」は、当業者に直ちに明白であろう適切
なタイプの固体支持体でもよい。本発明で使用できる固体支持体の幾つかの例は
、ポリスチレン-コ-ジビニルベンゼン樹脂のようなポリスチレンベースの樹脂、
PEGA樹脂のようなポリアクリルアミドベースの樹脂、Tengagel（登録商標）樹脂
、PEG-PS樹脂及びNovaGel（商標出願中）樹脂のようなポリエチレングリコール
グラフトポリスチレン樹脂、機能付与されたポリエチレン／ポリプロピレンのピ
ン及びクラウンのようなポリエチレン／ポリプロピレンベースの樹脂、又はコン
トロールされた細孔ガラス（CPG）のようなシリカベースの支持体である。好ま
しくは、ペプチド残基に接着するのに使用される固体支持体は、PAL-PEG-PS又は
NovaGel樹脂である。

【００１４】別の態様において、M¹−NH₂は、C末端にアミノ基の導入によって変性されたペ
プチド残基を含む（例えば、ジアミノアルキレンリンカーとのC末端カルボキシ
ル基の反応により、任意に固体支持体に結合し、脱保護でペプチドC末端アミノ
アルキルアミドを生ずる（例えば、Breipohlら、Tetrahedron Lett.、28(1987)
5647を参照のこと））。更に別の態様において、M¹-NH₂は、アミノ官能基を結合して変性されたオリゴ
ヌクレオチド残基を含むことができる。例えば、アミノ基を、アルキレン又はア
リーレンリンカーを介して、及びリン酸又は他のオリゴヌクレオチドヒドロキシ
ル官能基を介して結合した基(例えば、５’又は３’ヒドロキシル)を介して導入
することができる。加えて、オリゴヌクレオチドを、固体支持体に結合できる。
このようなアプローチは、Nelsonら、Nucl. Acids Res.,17(1989)7179、Wacht
erら、Nucl. Acids Res.,14(1986)7985、Agrawalら、Nucl. Acids Res.、14
(1986)6227）に例示される。更に、オリゴヌクレオチドを、脱保護されると遊離
する組み込まれたアミノ基を特徴とする固体支持体に結合させることができる（
Nelsonら、Nucl. Acids Res.,17(1989)7187、Nelsonら、Nucl. Acids Res.,
20(1992)6253）。本発明において、Aは、前述で定義したアルキレン又はアリーレン基を含む。
好ましくは、Aは、C_1-18アルキレン基、より好ましくは、C₂〜C₄アルキレン基、
更に好ましくは、エチレン又はn-プロピレン基を含む。 R¹は、前述で定義したアルキル又はアリール基を含むことができる。好ましく
は、R¹は、C_1-18アルキル又はC_3-10アリール基を含む。より好ましくは、式（I
）の化合物は、R¹が、t-ブチル、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、置換フェ
ニル、2-ピリジル、4-ピリジルシアノメチル、カルボキサミドメチル、2-カルボ
キサミドエチル又はトリフルオロエチルである。最も好ましくは、R1は、ベンジ
ルである。チオエステルの反応性が、R¹の変化によって変更できることは、当業者にとっ
て直ちに明白であろう。例えば、R¹がフェニル基の化合物の場合、R¹がベンジル
基である化合物よりも反応性が一般的に高い。更に、化合物（I）のチオエステ
ルは、式（II）の分子とカップリング反応する間に、現場で、トランス移転反応
が可能である。チオエステルは、例えば、溶媒に溶解したチオフェニルによって
、トランス移転できる。

【００１５】別の態様において、R¹は、更に、固体支持体を含む。固体支持体の供給によっ
て式（I）の分子の固相の合成又は変更が可能であり、例えば、従来の固相ペプ
チド合成技術のペプチド残基M¹の鎖伸長によることは、明白である。本発明の更なる特徴に従えば、式（II）の化合物を提供できる。式（II）の化
合物は、M¹-NH₂をM²-OHとカップリングする方法に適切である。好ましくは、M²は、オリゴヌクレオチド残基を含む。M²は、オリゴヌクレオチ
ド残基である場合に、M²-OHのヒドロキシ基は、5'-末端ヒドロキシ基、3'-末端
ヒドロキシ基または他の好適な内部のヒドロキシ基でもよい。好ましくは、オリ
ゴヌクレオチドは、その5'-OH末端を介して結合する。オリゴヌクレオチド残基は、ここで前に定義されたように、固体支持体と接着
することができる。オリゴヌクレオチド残基が固体支持体に接着する場合、3'-O
H末端、内部又はその5'-OH末端を介して接着する。好ましくは、オリゴヌクレオ
チド残基が、分子（II）の一部である場合、3'-OH末端を介してコントロールさ
れた細孔ガラス又はポリオキシエチレン−ポリスチレンコポリマーのような固体
支持体に接着される。基Bは、好適なリンカーを含む。好ましくは、基Bは、次式、 -X-J- （式中、Jは、アルキレン又はアリーレン基であり、Xは、ヒドロキシ基と反応可
能な、官能基の残基である）で示される基を含む。好ましくは、Jは、C_1-18アルキレン又はC_3-12アリ-レン基であり、Jは、機能
化でき、好ましくは、カルボキサミド、ウレタン又はスルホンアミド基を含む機
能分化ができる。好ましくは、Jは、trans-4-アミノシクロヘキサノール又は4-
ヒドロキシピペリジンから誘導された部分を含む。 Xは、ヒドロキシ官能基が存在するM²-OHと反応できる好適な基の残基であれば
よい。好ましくは、Xは、ホスフェート（ホスホラミデートを含む）、チオホス
フェート（チオホスホラミデートを含む）、ホスホネート又は亜リン酸エステル
（ホスホラミダイト、チオ亜リン酸エステル及びチオホスホラミダイト）残基で
ある。水素ホスホネート及び亜リン酸エステル残基の場合、例えば、水溶性ヨー
ド溶液、t-ブチルヒドロペルオキシド等によって、任意に、酸化してもよく（Le
tsingerら、J. Am. Chem. Soc.,97(1975)3278）、例えば、分子硫黄溶液や、
好適なチオネート化（thionating）試薬を使用して、硫化してもよく（Stecら、
J. Am．Chem.Soc.,106(1984)6077）、又は、例えば、アミン−四塩化炭素溶液（
Froeher,Tet.Lett.,27(1986)5575）によって、アミノ化してもよい。より好まし
くは、Xは、以下の基、

【００１６】

【化８】

【００１７】（式中、R³は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びこれらの塩、アルキル、アルコ
キシ、アリールオキシ、チオール、チオキシアニオン及びこれらの塩、S-アルキ
ル、S-アリール、ジアルキルアミノ及びN-アゾリル基から成る群より選択される
）から選択される基を含む。好ましくは、R³は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びこれらの塩、アルキル（
例えばメチルや置換メチル）メトキシ、エトキシ及び置換エトキシ（例えば、2-
シアノエトキシ、2-ニトロフェニルエトキシ及び4-ニトロフェニルエトキシ）、
アリルオキシ及び置換アリル、プロパルギルオキシ及び置換プロパルギル、ベン
ジルオキシ及び置換ベンジル、O-9-フルオレニルメチル、プロピルロキシ及び置
換プロピロキシ（例えば、1,1,1,3,3,3ヘキサフルオロイソプロピロキシ）、ジ
メチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、メチルイソプロピルアミ
ノ、エチルイソプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ-n-プロピルアミノ
、ジ-n-ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジシクロヘキシルアミノ、ピロリ
ジノ、ピペリジノ、2,6-ジメチルピペリジノ、2,2,6,6,-テトラメチルピペリジ
ノ、モルホリノ、2,6-ジメチルモルホリノ、ヘキサメチレンアミノ、ヘプタメチ
レンアミノ、N-イミダゾリル、置換イミダゾリル、N-ベンゾトリアゾリル、N-1,
2,4-トリアゾリル、置換トリアゾリル、N-テトラゾリル、置換テトラゾリル、2-
クロロフェノキシ、4-クロロフェノキシ、2-ニトロフェノキシ、4-ニトロフェノ
キシ、ペンタフルオフェノキシ、1-ベンゾトリアゾリルオキシ、チオール、チオ
キシアニオン及びそれらの塩、S-t-ブチル、S-フェニル、S-2,4-ジクロロベンジ
ル、又はS-2,4-ジニトロベンジルから成る群より選択される。好ましくは、R³は、2-シアノエトキシである。 Dは、C₁〜C₄のアルキレン基又はC₃〜C₁₂のアリーレン基である。前述のアルキ
レン及びアリーレン基の定義に従えば、これらの基は、１種以上の酸素、硫黄、
窒素、カルボキサミド等のヘテロ原子及び/又はへテロ原子基を含むことができ
る。好ましくは、Dは、メチレン又はエチレン基である。 R²は、水素又はチオール保護基である。好ましくは、R²は、水素、アルキル、
S-アルキルスルフェニル、S-アリールスルフェニル、アルキルカルボキサミドア
ルキル、アルコキシカルボニル及びアシル基から成る群より選択される。好ましくは、R²は、水素、9-フルオレニルメチル、2-(2,4-ジニトロフェニル)
エチル、t-ブチル、l-アダマンチル、ベンジル、置換ベンジル、ベンズヒドリル
、トリアリールメチル、エチルスルフェニル、t-ブチルスルフェニル、トリチル
スルフェニル、2-ニトロベンゼンスルフェニル、2,4-ジニトロベンゼンスルフェ
ニル、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル、アセトアミドエメチル、トリメチル
、アセトアミドメチル、ベンズアミドメチル、ベンジルオキシカルボニル、アセ
チル又はベンゾイルである。最も好ましくは、R²は、水素、t-ブチルスルフェニ
ル、トリチル又は4-メトキシトリチルである。 R²が、水素以外の場合、チオール基は、式（I）の分子とカップリング反応す
る間、現場で、アンマスキングすることができる。現場での脱保護条件は、当業
者に直ちに明らかであろう。例えば、R²がt-ブチルスルフェニルの場合、チオー
ル基を、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）ジチオスレイトール
（DTT）又は他の好適な還元剤を使用してジスルフィド結合の還元開裂によって
アンマスキングできる。

【００１８】本発明の更なる特徴において、アミノ基が保護された、式IIの化合物を提供で
きる。好適な保護基R⁴を使用できる。好ましくは、保護基R⁴は、ウレタニル、ア
ルキル、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル及びスルホニル(sulphon
yl)保護基から成る群より選択される。好ましくは、R⁴は、9-フルオレニルメトキシカルボニル、アリールオキシカル
ボニル、プロパルギロキシカルボニル、t-ブチロキシカルボニル、ベンジロキシ
カルボニル、2-(2-ニトロフェニル)エトキシカルボニル、2-(4-ニトロフェニル)
エトキシカルボニル、2-(2,4-ジニトロフェニル)エトキシカルボニル、ヘテロア
リールメトキシカルボニル、ジアリールメチル、トリアリールメチル、トリチル
、2,6-ジオキソシクロヘキシリデン-1-イルメチル、置換2,6,-ジオキソシクロヘ
キシリデン-1-イルメチル、2-ニトロベンゼンスルフェニル、2,4-ジニトロベン
ゼンスルフェニル、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル、置換アレーンスルホニ
ル、2-ニトロベンゼンスルホニル、2,4-ジニトロベンゼンスルホニルである。最
も好ましくは、R⁴は、9-フルオレニルメトキシカルボニルである。 R⁴が水素以外の場合、アミノ基を、式（I）の分子とカップリング反応する間
に、現場で、アンマスキングできる。現場での脱保護条件は、当業者に直ちに明
らかであろう。例えば、R⁴が、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）の場
合、アミノ基を、ジメチルホルムアミド中の２０％（量/量）ピリジンのような
、穏やかな基本条件の下でアンマスキングできる。式（I）又は（II）の化合物の、両方ではなく、いずれかを、カップリング反
応の間に、固体支持体に接着できる。結果として生じたコンジュゲートを、公知
の技術の方法によって、固体支持体から切断できる。あるいは、分子（I）又は（II）のカップリングは、溶液中で行うことができ
る。この溶液は、水溶性又は不溶性のどちらでもよく、又は尿素又は塩化グアニ
ジウムのような変性剤あり又はなしで、水溶性及び不溶性溶媒の混合物を含んで
もよい。溶液は、任意に、好適なバッファーで緩衝できる。溶液は、任意に分子
（I）のチオエステルのエステル転移反応のためのチオフェノールのような試薬
、及び/又は、分子（II）のチオール基の脱保護のためのTCEPのような試薬を含
むことができる。溶液中の分子（I）及び（II）のカップリングは、溶液、分子（I）及び（II）
の濃度、及びｐHの適切な選択によって最適化できる。例えば、補助溶剤として
アセトニトリル又はDMFの使用、高濃度のオリゴヌクレオチド（0.1mMよりも高い
が、0.001〜0.1mMの低い濃度も使用できる）及び約pH６．５に緩衝された溶液は
、環化副反応に影響されやすいペプチドとのオリゴヌクレオチドをカップリング
するのに好ましい条件である。起こり得る望ましくない環化副反応には、チオエ
ステルカルボニル基に、ペプチドの脱保護されたN末端アミノ基が作用すること
が含まれる。このような副反応は、例えば、N末端プロリン又はN末端N-メチルグ
リシン（サルコシン）の場合には起こらず、各場合のアミノ基は、二次的で、酸
性の水素原子を含まないからである。

【００１９】本発明の更なる特徴に従えば、式（III）の化合物、及びM¹-NH₂との反応によ
る式（I）の化合物を生成する方法での式（III）の化合物の使用を提供できる。 R⁵-CO-A-CO-SR¹ （III）（式中、 A及びR¹は、以前に定義され、 R⁵は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びそれらの塩、アルコキシ、アリールオ
キシN-スクシンイミジルオキシ、N-（ノルボルネンジカルボキシミド）オキシ、
N-ベンゾトリアゾリルオキシ、N-(1,2-ジヒドロ-1-オキソ-2,3,4-ベンゾトリア
ジン-2-イル)オキシ、ハロゲン及びN-アゾリル基から成る群から選択され、又は
隣接するCO基と共に無水物を形成する）好ましくは、R⁵は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びこれらの塩、アルコキシ
（例えば2-シアノエトキシ）、置換又は非置換アリールオキシ（例えば、2-ニト
ロフェノキシ、4-ニトロフェノキシ、2,4,5-トリクロロフェノキシ、ペンタクロ
ロフェノキシ、2,3,5,6-テトラフルオロフェノキシ及びペンタフルオロフェノキ
シ）、置換又は非置換N-（スクシンイミジル）オキシ（例えば、N-(2-スルホス
クシンイミジル)オキシ（特に、水溶性及び水溶性有機溶液での溶解性を改良し
反応性を維持することが好ましい）、及びN-（ノルボルネンジカルボキサミド）
オキシ、N-（ベンゾトリアゾリル）オキシ、置換N-（ベンゾトリアゾリル）オキ
シ(例えば、N-(7-アザベンゾトリアズジル)オキシ、N-(1,2-ジヒドロ-1-オキソ-
2,3,4-ベンゾトリアジン-2-イル)オキシ、置換N-(1,2-ジヒドロ-1-オキソ-2,3,4
-ベンゾトリアジン-2-イル)オキシ、ハロゲン（例えば、フッ素及び塩素）、N-
アゾリル基（例えば、N-イミダゾリル及び置換イミダゾリル、N-ベンゾトリアゾ
ルイル、N-1,2,4-トリアゾリル、置換トリアゾリル、N-テトラゾリル、置換テト
ラゾリル及びアジド）から成る群から選択され、又は隣接したCO基と一緒に、対
称の無水物、又はカルボン酸（例えば、トリメチル酢酸、1-アダマンタンカルボ
ン酸又はイソ吉草相酸）と混合した無水物、カルボン酸リン酸又チオリン酸（例
えば、ジメチルリン酸、ジエチルリン酸又はジフェニルリン酸）、ホスホン酸（
例えば、n-プロピルホスホン酸）、ホスフィン又はチオホスフィン酸（例えば、
ジメチルホスフィン、ジメチルチオホスフィン、ジフェニルホスフィン又はジフ
ェニルチオホスフィン酸）、スルホン酸（例えば、ベンゼン及び置換ベンゼンス
ルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロエ
タン-スルホン酸及び重合体ポリ（フルオロカーボン）スルホン酸）又はヒドロ
シアン酸から成る群から選択される。式（III）のカップリング剤とペプチド残基又はアミノ変性オリゴヌクレオチ
ド残基のアミノ基との間の反応は、R⁵の全体的な置換によって、アミノ基とカッ
プリング剤（III）間のアミド結合を化学選択的に形成するであろう。従って、R ⁵ は、隣接するカルボニルが、チオエステルのカルボニルよりもアミノ基に対し
て、より反応性があるように選択されるべきである。所望の化学選択性を達成す
るためのR¹及びR⁵の選択は、当業者に直ちに明らかであろう。また、R⁵の選択は
、M¹-NH₂との反応のための意図する媒体によって影響される。例えば、M¹が、R⁵ のペプチド残基の選択であり、N-スクシンイミジルオキシ基（例えばN-(2-スル
ホスクシンイミジル)オキシ）の場合は、水溶性有機混合物の溶解性を改良する
ことが特に好ましい。不溶性の媒体において、R¹はベンジルであるときに、R⁵は
ペンタフルオロフェノキシが好ましい。

【００２０】一般式（I）及び（II）の分子の調製とカップリングを、反応スキーム１に例
示する。一般式（I）及び（II）の分子の調製とカップリングを、従来の合成有
機化学に従って、反応スキーム１に示した手順の変更によって行なうことができ
ることは明白であろう。

【００２１】

【化９】

【００２２】本発明の更なる特徴に従って、式（IV）の化合物及びM²-OHとの反応による式
（II）の化合物の製造での式（IV）の化合物の使用を提供できる。

【００２３】

【化１０】

【００２４】（式中、D、J、R²、R³及びR⁴は、前述に定義され、 R⁶は、ジアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチル
エチルアミノ、メチルイソプロピルアミノ、エチルイソプロピルアミノ、ジイソ
プロピルアミノ、ジ-n-プロピルアミノ、ジ-n-ブチルアミノ、ジイソブチルアミ
ノ、ジシドネキシルアミノ（dicydonexylamino）、ピロリデノ、ピペリジノ、2,
6-デメチルピペリジノ、2,2,6,6,-テトラメチル-ピペリジノ、モルホリノ及び2,
6-ジメチルモルフホリノ）、イミノ（例えば、ヘキサメチレンイミノ及びヘプタ
メチレンイミノ）、ハロゲン（例えば、フッ素及び塩素）、N-アゾルイル（例え
ば、N-イミダゾリル及び置換イミダゾリル、N-ベンゾトリアゾリル、N-1,2,4-ト
リアゾリル及び置換トリアゾリル、N-テトラゾリル及び置換N-トリアゾリル）、
アルコキシ（例えば、1,1,1,3,3,3,-ヘキサフルオロイソプロポキシ）、アリー
ルオキシ（例えば、2-ニトロフェノキシ、4-ニトロフェノキシ、ペンタフルオロ
フェノキシ、1-ベンゾトリアゾリルオキシ）、アルキルチオ（例えば、S-tert-
ブチル）及びアリールチオ（例えば、S-フェニル）から成る群より選択される。
好ましくは、R⁶は、ジアルキルアミノ基であり、より好ましくは、ジイソプロピ
ルアミノ基である。）

【００２５】カップリング剤（IV）のR⁶で示される基は、M²-OHの求核性ヒドロキシ基（例
えば、オリゴヌクレオチドヒドロキシル残基）によって置換され、式（II）で示
される分子を形成する。好ましくは、求核性基は、オリゴヌクレオチド残基の5'
-OH末端である。カップリング剤（III）及び（IV）を、反応スキーム２及び３に述べたような
手順によって調製することができる。一般式（III）及び（IV）のカップリング
剤を、従来の合成有機化学に従って、反応スキーム１及び２に示した手順の変更
によって製造できることは明白であろう。

【００２６】本発明の１つの特徴において、式（IV）の化合物は、第２分子M²-OHとの反応
によって式（II）の化合物を製造するのに使用できる。次に、式（II）の化合物
は、式（I）の化合物と結合する。あるいは、式（IV）の化合物は、タイプM²-OHの分子を変性するのに使用でき
、次に、公知のルート、例えば、Eritjaら（Tetrahedron,47(1991)4113）及びSo
ukchareunら（Bioconj.Chem.9(1998)466）によって報告されたマレイミド基によ
って変性されたタイプM¹-NH₂の分子と結合させる。本発明の更なる態様に従って、カップリング剤（III）及び/又は（IV）を含む
キットを提供できる。キットは、M¹-NH₂及びM²-OHのような分子を変性するのに
使用でき、次に、ここで述べられた未変性ライゲーション反応によって結合でき
る。キットは更に、カップリング反応に使用できる他の構成要素を含ませること
ができる。これには、チオフェノール、TCEP、尿素、塩化グアニジニウム及びリ
ン酸ナトリウムバッファーから選択される１つ以上の構成要素が含まれる。また
、キットは、未変性ライゲーションカップリング反応を行うための説明及び/又
はM¹-NH₂及びM²-OHのような分子を変性するための説明を含ませることができる
。

【００２７】

【化１１】

【００２８】

【化１２】

【００２９】本発明に従って、カップリング反応は、式（V）の構造単位を含む化合物を提
供する。

【００３０】

【化１３】

【００３１】（式中、A、B及びDは、前述で定義される。）特に、式（VI）の化合物を提供できる。

【００３２】

【化１４】

【００３３】（式中、M¹、M²、A、B及びDは、前述で定義される。） M¹及びM²がそれぞれペプチド及びオリゴヌクレオチド残基であると、このよう
な化合物は、治療有用性を有する。例えば、ペプチド残基は、細胞の取り込み又
は治療ためのオリゴヌクレオチドの細胞内活性を促進できる。ペプチドは、細胞
内のオリゴヌクレオチドの場所の同定のため又は特定の細胞の場所へのオリゴヌ
クレオチドの送達のためのシグナル分子として働くことができ、又はアンチセン
ス又は三つの部分からなる治療や診断の用途における細胞RNA又はDNAに向かうオ
リゴヌクレオチドの標的とする能力を高めることができる。式（VI）の化合物のチオール基は、特に、更なる誘導又は機能化に適し、例え
ば、ラベリング、レポーター又はエフェクター基の接着のための部位を提供でき
る。従って、本発明は更に、次式（VII）

【００３４】

【化１５】

【００３５】（式中、M¹、M²、A、B及びDは、前述で定義され、Yは、ラベリング、レポーター
又はエフェクター基である）で示される化合物を提供できる。本発明は、以下の例を参照して詳細に説明される。本発明は、例として説明さ
れるだけであって、詳細の変更は本発明の範囲からはずれることなく行うことが
できることは明白であろう。

【００３６】

【実施例】

例１：カップリング剤の調製１）S-ベンジルチオ琥珀酸ベンジルメルカプタン（22mmol、2595ml）を、25mlの無水アセトニトリル−ピ
リジン（９：１量/量）の無水琥珀酸（20mmol、20014g）及び4-ジメチルアミ
ノピリジン（1mmol、122.2g）の攪拌した溶液に、窒素下で加えた。攪拌を、室
温で３時間続けて、蒸発させて乾燥に近づけ、重炭酸ナトリウム溶液pH8.5に再
溶解し、ジエチルエーテルで２回抽出した。次に、水相をアイスバスで冷却し、
5N塩酸でpH2に酸性化し、白い沈殿物を濾過し、氷冷水で洗浄し、五酸化リン上
で一晩、真空デシケーターで乾燥した。白い粉の収量は、3.5985g（80%）であっ
た。¹H-NMR(CDCl₃,＊,ppm):7.29-7.26(m,5H,Ph),4.16(s,2H,CH₂S),2.94-2.90(t,
2H,CH₂COS),2.77-2.72(t,2H,CH₂CO₂H)

【００３７】２）ペンタフルオロフェニルS-ベンジルチオスクシネート 15mlのジクロロメタンのジシクロヘキシルカルボジイミド(11mmol、2.2696g)
の溶液を、25mlのジクロロメタンのS-ベンジルチオ琥珀酸(2,243g、10mmol)及び
ペンタフルオロフェノール（11.5mmol、2.117g）の、攪拌及び冷却（アイスバス
）した溶液に、１滴ずつ加えた。反応混合物を、アイスバスで０．５時間攪拌し
て、次に室温でゆっくりと暖め、４時間攪拌して、冷蔵庫で一晩置いた。ジクロ
ロヘキシルウレアの沈殿物を濾過し（2.148g、96%収率）、溶液を真空内で濃縮
し、最少量のエチルアセテートで再溶解し、再び濾過して、ヘキサンを添加した
。冷凍庫で一晩置いた後、結晶を濾過して、冷たいエチルアセテート−ヘキサン
（１：９量/量）で洗浄し、真空内で一晩乾燥した。白い針状結晶の収量は、3
.4376g(88%)であった。母液の蒸発と更なる追加のヘキサンで処理した後、0.183
gのタイトルの化合物が得られた。２つの収穫の全収量は、3.6206g（92%）であ
った。¹H-NMR(CDCl₃,＊,ppm):7.30-7.27(m,5H,Ph),4.18(s,2H,CH₂S),3.05(s,4H,
CH₂CH₂)

【００３８】例２：カップリング剤（IV）の調製１）N-Fmoc-S-トリチル-L-システイン 4-ヒドロキシピペリジド 4-ヒドロキシピペリジン（2.3mmol、232.6mg）を、25mlの無水アセトニトリル
のN-Fmoc-S-トリチル-L-システインペンタフルオロフェニルエステル（2mmol、1
.504g）の溶液に攪拌しつつ添加し、続いてトリエチルアミン（0.5mmol、0.07ml
）を添加した。TLCが完了した反応を示すまで、反応混合物を室温で４時間攪拌
した。次に、混合物を蒸発させて乾燥させ、エチルアセテートに再溶解して、氷
冷した５質量％のクエン酸、水、重炭酸ナトリウム及びブラインで引き続いて洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて薄茶色の結晶にした。残留物を
、クロロホルムの１５−３０％アセトニトリルで溶出されるシリカゲルカラムで
クロマトグラフし、適切なフラクションをプールし、蒸発させて、白い結晶とし
てタイトルの生成物1.3126g（98%）を得た。

【００３９】２）N-Fmoc-S-トリチル-L-システイン 4-ヒドロキシ-trans-シクロヘキシルア
ミド 25mlの無水DMFのtrans-4-アミノシクロヘキサノール塩化水素(2.1mmol、318.4
mg)及びN-Fmoc-S-トリチル-L-システインペンタフルオロフェニルエステル(2mmo
l、1.504g)のスラリーに、トリエチルアミンを加え（2.2mmol、0.307ml）、TLC
が完了した反応を示すまで、生じた溶液を室温で3時間攪拌した。反応混合物を
、蒸発させて乾燥させ、エチルアセテートに再溶解し、氷冷した５質量％のクエ
ン酸、水、重炭酸ナトリウム及びブラインで引き続いて洗浄し、硫酸ナトリウム
上で乾燥させ、蒸発させて薄茶色の結晶にした。残留物をエチルアセテートの１
５−５％ヘキサン−０．５％トリエチルアミンで溶出されるシリカゲルカラムで
クロマトグラフし、適切なフラクションをプールし、蒸発させて、白い結晶とし
てタイトルの生成物1.3045g（95%）を得た。

【００４０】３）N-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイン 4-ヒドロキシ-trans-シクロヘキシルアミド 20ml無水DMFのtrans-4-アミノシクロヘキサノール塩化水素(2mmol、303.3mg)
及びN-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システインペンタフルオロフェニル
エステル（2mmol、1.195g）及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2mmol、270.3
mg)のスラリーに、トリエチルアミンを添加し（3.1mmol、0.446ml）、生じた溶
液を、TLCが完了した反応を示すまで、室温で3時間攪拌した。次に、反応混合物
を、蒸発させて乾燥させ、白い残留物を焼結したガラスフィルターに移し、少量
のDMF、エタノール及びジエチルエーテルで引き続いて洗浄し、真空内で乾燥し
た。白い粉の収量は、0.868g（82%）であった。

【００４１】４）N-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイン 4-ヒドロキシピペリジ
ド 4-ヒドロキシピペリジン(2.5mmol、253.1mg)を、攪拌しながら20mlの無水DMF
のN-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システインペンタフルオロフェニルエ
ステル(2mmol、1.195g)の溶液に加えた。反応混合物を、TLCが完了した反応を示
すまで室温で3時間攪拌した。次に、混合物を蒸発させて乾燥し、エチルアセテ
ートに再溶解し、５質量％のクエン酸、水、重炭酸ナトリウム及びブラインで引
き続いて洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて薄黄色の結晶にした
。残留物を、エチルアセテートの１０−０％ヘキサンで溶出されるシリカゲルカ
ラムでクロマトグラフし、適切なフラクションをプールして、蒸発させ、白い結
晶としてタイトルの生成物0.9831g(95%)を得た。

【００４２】５）4-trans-N-Fmoc-S-トリチル-L-システイニルアミドシクロヘキシル 2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト 75mg(1.5eq)のジイソプロピルアンモニウムテトラゾレートを含む10mlの無水
ジクロロメタンのN-Fmoc-S-トリチル-L-システイン 4-ヒドロキシ-trans-シク
ロヘキシルアミド（0.3444mmol、0.2352g）の溶液に、2-シアノエトキシ-N,N,N'
,N'-テトライソプロピルホスホルジアミダイト(1.15eq、0.126ml)を添加し、混
合物を、TLCが完全なコンバージョンを示すまで、室温で６時間混合した。次に
、ジクロロメタンを蒸発させ、残留物をエチルアセテートに取り、飽和重炭酸ナ
トリウムとブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、少量に蒸発さ
せた。残りをエチルアセテートの２５−１０％ヘキサン−３％トリエチルアミン
で溶出されるシリカゲルカラムでクロマトグラフし、適切なフラクションをプー
ルし、蒸発させて乾燥した。タイトルの生成物の収量は、1.3045g（95%）であっ
た。

【００４３】６）4-N-Fmoc-S-トリチル-L-システイニルピペリジル 2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト 3mmol(0.514ml)のジイソプロピルエチルアミンを含む10mlの無水ジクロロメタ
ンのN-Fmoc-S-トリチル-L-システイン 4-ヒドロキシピペリジド（0.668g、1mmo
l）の冷却した（アイスバス）溶液に、2-シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルア
ミノクロロホスフィン（1.3mmol、0.29ml）を、窒素下でシリンジを通して１滴
ずつ添加した。1時間の攪拌冷却後、混合物をだんだんと暖め、室温で2時間攪拌
を続けた。次に、混合物を0.1mlのメタノールでクエンチし、蒸発させて乾燥さ
せ、残留物をエチルアセテートに取り、飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗
浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、少量に蒸発させた。残りをジクロロメ
タンの３０−１５％ヘキサン−３％トリエチルアミンで溶出されるシリカゲルカ
ラムでクロマトグラフし、適切なフラクションをプールして、蒸発させ乾燥させ
た。タイトルの生成物の収量は、0.695g(80%)であった。

【００４４】７）4-trans-N-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイニルアミドシクロ
ヘキシル 2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト 0.785ml（３eq）のジイソプロピルエチルアミンを含む15mlの無水ジクロロメ
タンの4-trans-N-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイニルアミドシク
ロヘキサノール（0.834g、1.577mmol）の冷却した（アイスバス）溶液に、、2-
シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（1.5eq、0.529ml
）を、窒素下でシリンジを通して１滴ずつ添加した。１時間の攪拌冷却後、混合
物をだんだんと暖め、室温で2時間攪拌を続けた。次に、混合物を0.1mlのメタノ
ールでクエンチし、蒸発させて乾燥させ、残留物をエチルアセテートに取り、飽
和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、
少量に蒸発させた。残りをエチルアセテートの２５−１０％ヘキサン−２．５％
トリエチルアミンで溶出されるシリカゲルカラムでクロマトグラフし、適切なフ
ラクションをプールして、蒸発させ乾燥させた。タイトルの生成物の収量は、0.
7567g(66%)であった。

【００４５】８）4-N-α-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイニルピペリジル 2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト 0.329g（1.920mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを含む15ml
の無水CH₂CI₂のN-α-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル-L-システイン4-ヒドロキ
シピペリジド（1.536mmol、0.790g）の溶液に、、2-シアノエトキシ-N,N,N',N'-
テトライソプロピルホスホルジアミダイト（1.690mmol、0.537ml）を、N₂の雰囲
気下で添加し、混合物を、TLC(B)が完全な反応を示すまで、室温で3時間攪拌し
た。次に、溶媒を蒸発で除去し、残留物をEtOAcに取り、飽和NaHCO₃溶液（２回
）及びブラインで洗浄し、無水Na₂SO₄上で乾燥させ、コットンプラグを通して濾
過し、蒸発させて白い結晶にし、CH₂CH₂で数回再蒸発させ、真空内で乾燥させ、
少量の、ヘキサンの１０％EtOAcに溶解した。この溶液を２％のトリエチルアミ
ンを含むヘキサンの10-40%EtOAcで溶出されるシリカゲルカラムでクロマトグラ
フし、適切なフラクションをプールし、蒸発させて乾燥し、ヘキサンでリンスし
た。残りの蝋状の固形物を、ドライCH₂CH₂に溶解し、ドライCH₂CH₂で２回再蒸発
させ、白い結晶を得た。タイトルの生成物の収量は、0.455g(42%)であった。TLC
(B):R_f0.78. ¹H NMR(CD₃CN): δ1.15-1.19（m,12）,1.33(s,9),1.61(bm,2),1.8
2(bm,2),1.93-1.97(quintet,1),2.16(s,MeCN),2.61-2.67(t,2),2.81-2.88(m,1),
3.04-3.10(m,1),3.44(bm,2),3.57-3.80(bm,6),4.09(m,1),4.22-4.26(t,1),4.35-
4.37(d,2),4.86-4.88(quadruplet,1),6.12-6.17(t,1),7.32-7.37(t,2),7.40-7.4
5(t,2),7.66-7.68(d,2),7.83-7.85(d,2). ³¹P NMR(CD₃CN): δ 147.10(61%),147
.03(19%),146.94(20%)(回転異性体の混合物). MALDI-TOF MS:(M+H)715.7(715.9
calc.),(M+Na)737.0(737.9 calc.),(M+K)753.4(754.0 calc.)

【００４６】例３：変性ペプチド（I）の調製メーカーによって供給されるアクチベーションプロトコルを現場で媒介するHA
TU/DIEAによって、すべてのペプチドをPioneer(商標出願中)ペプチドシンセサイ
ザー（PEバイオシステムズ）で0.1mmolスケールで合成した。N-α-Fmocアミノ酸
は、スタンダードの側鎖保護を有する。アルギニンの2,2,4,6,7-ペンタメチルジ
ヒドロベンゾフラン-5-スルホニル、アスパラギン及びグルタミンのトリチル、
アスパラギン酸及びグルタミン酸、セリン、スレオニン及びチロシンのt-ブチル
、リジン及びトリプトファンのt-ブトキシカルボニル、及びリジンのトリフルオ
ロアセチルのそれぞれが、ダブルカップリングなしで、4倍超で使用され、すべ
ては市販品由来である。合成は、PAL-PEG-PS支持体（BEバイオシステムズ）又は
Rink amide NovaGel（CNバイオサイエンス）のいずれかで行われた。所望のシ
ークエンス及びN末端Fmoc脱保護の完成後、支持体（0.1mmol）をバイアルに移し
、次にペンタフルオロフェニルS-ベンジルチオスクシネートのカップリングを、
手動で、0.176g（4.5eq）の化合物及び触媒として14mg (1eq)の1-ヒドロキシ-7-
アザベンゾトリアゾール(HOAt)を使用して、2mlの新たな蒸留DMFで４時間室温で
行った。

【００４７】次に、樹脂を4mlのDMFで５回、3mlのメタノールで５回、2mlのジエチルエーテ
ルで５回洗浄し、真空内で乾燥させた。N-変性ペプチドを、6mlのトリフルオロ
酢酸−ベンジルメルカプタン−フェノール−水（９０：５：２．５：２．５量
/量/量/量）のカクテルを使用して、２〜６時間室温で、アルギニン成分依存で
、樹脂から切断して脱保護した。樹脂を濾過し、4mlのTFAで５回洗浄し、窒素を
パージすることによってcal.１〜２mlに量を減少させ、次に、40mlの冷ジエチル
エーテルを加えてペプチドを沈殿させた。スラリーを遠心して、エーテルをデカ
ントし、手順を３回繰り返してスカベンジャーを除去した。次に、ペプチドペレ
ットを真空内で乾燥させ、0.1%の水溶性TFA/アセトニトリル混合液に溶解し、0.
1%水溶性TFAのアセトニトリルのグラジエントによってC₈カラムでRP HPLC精製
にかけた。適切なフラクションを凍結乾燥し、基質としてα-シアノ-4-ヒドロキ
シ桂皮酸を使用して、MALDI-TOF MSで分析した。典型的な例を表１に示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】例４：変性オリゴヌクレオチド（II）の調製オリゴヌクレオチドを、０．１μmolスケールでABI 380B自動化DNA/RNAシン
セサイザー（PEバイオシステムズ）で合成した。標準の3'-ヌクレオシドスクシ
ネートLCAA-CPG 500A支持体を使用した。所望のシークエンスの組み立て及びジ
クロロメタンの２％ジクロロ酢酸溶液(量/量)による5'末端4,4-ジメトキシトリ
チル(Dmt)基の切断の完了後、支持体結合オリゴヌクレオチドを、無水アセトニ
トリルの1H-テトラゾール0.5M溶液と混合した無水アセトニトリルの変性ホスホ
ラミダイト試薬（t-ブチルスルフェニル又はトリチルS-保護）の0.15M溶液で、
１０分間室温で、装置で処理した。次に、支持体を標準酸化溶液（水溶性ピリジ
ン-テトラヒドロフランの0.1Mヨウ素）で洗浄し、アセトニトリルで洗浄して乾
燥させた。Fmocアミノ保護基を、ジメチルホルムアミドの２０％ピペリジン溶液
で支持体を室温で１５分間処理することによって、支持体結合オリゴヌクレオチ
ドから選択的に除去した。S-トリチル保護基を、１５分間硝酸銀の0.05M水溶性
溶液で、続いて、５分間0.05Mジチオスレイトール（DTT）で、固体支持体上で選
択的に除去した（Magら、Nucl. Acids Res., 19(1991)1437）。あるいは、S-
Trt保護を同様に硝酸銀で除去できる（Connolly及びRider、Nucl. Acids Res.
, 13(1985)4485）。

【００５０】また、S-t-ブチルスルフェニル基は、オリゴヌクレオチドの合成で日常的に使
用される、５５℃での濃縮されたアンモニア水の脱保護に十分に安定であり、S-
t-ブチルスルフェニル保護オリゴヌクレオチドの分離が可能であり、続いて、pH
7.0のtris-(2-カルボキシエチル)ホスフィンの0.1Mの水溶性溶液で室温で一晩処
理することによって脱保護できる。S-トリチル及びS-t-ブチルスルフェニルの両
方は、合成されたオリゴヌクレオチドの逆相精製のための従来の疎水性の手を提
供する。日常的には、S-保護システイン-変性オリゴヌクレオチドを、ｐH7.0の
、0.1Mのアンモニウム水又はトリエチルアンモニウムアセテート溶液のアセトニ
トリルのグラジエントによって溶出されるμBondapak C18カラムでRP HPLCに
従って分離し、Sephadex G-10又はG-25カラムで脱塩し、凍結乾燥して、基質と
して2,6-ジヒドロキシアセトフェノン−クエン酸アンモニウムを使用するMALDI-
TOF MSによって分析した。典型的な例を表２に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】例５：カップリング反応（液相）液相ペプチド−オリゴヌクレオチドカップリング反応を、４つの異なる実験手
順（方法A、B、C及びD）を使用して行なった。典型的な例を表３に示す。

【００５３】

【表３】

【００５４】例５ａ（方法Ａ） 5'を4-(S-tert-ブチルスルフェニル)システイニルアミド-trans-シクロヘキシ
ルホスフェートで変性した粗製のオリゴデオキシヌクレオチドTTT TT0.9μmol
を、７M尿酸及び0.1Mtris-(2-カルボキシエチル)ホスフィンを含む、pH7.5の、2
5%量/量N,N-ジメチルホルムアミド−0.1Mリン酸バッファー1mlに溶解し、凍結乾
燥したペプチドPTSQSRGDPTGPKEアミド4.5μmolであって、N-末端にS-ベンジルチ
オスクシニルで変性した部分を添加し、次いで４％量/量チオフェノールを添加
した。混合物を周囲温度で２４時間インキュベートし、次に、RP-HPLCで分析し
た（μBondapac C₁₈分析カラム、検出218及び254nm、流速１ml/min、バッファ
ーA:0.1Mアンモニウムアセテート、pH7.0、バッファーB：アセトニトリル、グラ
ジエント：５分2％B、20分40％B、25分100％B、滞留時間：出発S-tert-ブチルオ
リゴヌクレオチド16.608分、還元オリゴヌクレオチド14.575分、コンジュゲート
15.258分）。調製用HPLCによる分離後、コンジュゲートをMALDI-TOF MSで評価
した：計算3277.59、観測3376.72。収率：出発オリゴヌクレオチドでの計算で７
５％。

【００５５】例５ｂ（方法B） 5'を4-(S-tert-ブチルスルフェニル)システイニルアミド-trans-シクロヘキシ
ルホスフェートで変性した粗製のオリゴデオキシヌクレオチド0.6μmol GCTCCCA
GGCTCAAAを、0.1Mtris-(2-カルボキシエチル)ホスフィンを含む、pH7.5の、25%
量/量N,N-ジメチルホルムアミド−0.1Mリン酸バッファー1mlに溶解し、凍結乾燥
したペプチドPTSQSRGDPTGPKEアミド3μmolであって、 N-末端にS-ベンジルチオ
スクシニルで変性した部分を添加し、次いで４％量/量チオフェノールを添加し
た。混合物を周囲温度で２４時間インキュベートし、次に、RP-HPLCで分析した
（μBondapac C₁₈分析カラム、検出218及び254nm、流速１ml/min、バッファーA
:0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート、pH7.0、バッファーB：アセトニトリ
ル、グラジエント：５分2％B、20分40％B、25分100％B、滞留時間：出発S-tert-
ブチルオリゴヌクレオチド16.875分、還元オリゴヌクレオチド16.083分、ジスル
フィドオリゴヌクレオチド24.750分、コンジュゲート15.541分、ジスルフィドコ
ンジュゲート26.933分）。調製用HPLCによる分離後、コンジュゲートをMALDI-TO
F MSで評価した：計算6340.51、観測6340.17。収率：出発オリゴヌクレオチド
での計算で６５％。

【００５６】例５ｃ（方法C）カップリング反応を以下の条件下で行なった。0.05mM変性オリゴヌクレオチド
、１０当量変性ペプチド、0.1M TCEP、20%水酸化ナトリウム溶液の添加によっ
てpH6.5に滴定、２％PhSH(量/量)、２５％アセトニトリル、４８時間、室温。

【００５７】例５ｄ（方法D）カップリング反応を以下の条件下で行なった。0.01mM変性オリゴヌクレオチド
、0.2M TCEPで前処理、ｐH6.5、３時間室温、次に、等量の５０％水溶性DMFの
１０当量変性ペプチドをPhSH(２％量/量最終)と一緒に添加し、室温で４８時間
維持した。

【００５８】例６：カップリング反応（固相） 5'を4-(N-Fmoc-S-tert-ブチルスルフェニル)システイニルアミド-trans-シク
ロヘキシル2-シアノエチルホスフェートで変性した、粗製のオリゴヌクレオチド
CTCCCAGGCTCAAAT１μmolを有する固相オリゴヌクレオチド合成カラムを、支持体
に接着したままで、最初に、１５分間N,N-ジメチルホルムアミド(量/量)の２０
％ピペリジンで、シリンジで処理し、5mlDMFで洗浄し、次に、N,N-ジメチルホル
ムアミド−水（１：１量/量）の0.5Mジチオスレイトール溶液1mlで２時間、更
に10mlのDMF-水（１：１量/量）で洗浄した。次に、pH7.5で、４％量/量チオ
フェノールを含む、２５％DMF−0.1Mリン酸ナトリウムバッファーの５μmolの凍
結乾燥したペプチドGRK^TfaK^TfaRRQRRRアミド（Tfa-トリフルオロアセチル）の溶
液1mlであって、N末端をS-ベンジルチオスクシニルで変性した部分を、シリンジ
を通して添加した。カラムを2４時間周囲温度でインキュベートし、次に、10ml
の２５％アセトニトリル−水(量/量)で洗浄した。次に、pH7.5の４０％DMF-0.1M
リン酸ナトリウムバッファーの0.5Mヨードアセトアミド溶液１ｍｌを、シリンジ
を通して添加し、カラムを周囲温度で更に２4時間インキュベートした。10mlのD
MF-水（１：１量/量）で洗浄後、支持体を乾燥させ、スクリューキャップのバ
イアルに移し、２５％アンモニア水溶液で５５℃１６時間で処理した。ガラスビ
ーズをデカントし、２５％アンモニア水０．５ml及び水０．５mlで洗浄し、上澄
の量を２５０μｌに減らして、次に混合物をRP-HPLCで分析した（μBondapac C ₁₈ 分析カラム、検出218及び254nm、流速１ml/min、バッファーA:0.1Mアンモニウ
ムアセテート、pH7.0、バッファーB：アセトニトリル、グラジエント：５分2％B
、20分40％B、25分100％B、滞留時間：出発S-tert-ブチルオリゴヌクレオチド15
.025分、還元オリゴヌクレオチド13.338分、コンジュゲート14.016分）。収率：
HPLCでcal.４５％。

【００５９】例７：別のカップリング反応 3'-フルオレセイニル15-マーオリゴデオキシリボヌクレオチドdCTCCCAGGCTCAA
ATを、市販のフルオレセイン誘導体化したコントロールされた細孔(poor)ガラス
支持体を使用して１μmoleスケールで合成した。次に、システイニルピペリジン
ホスホラミダイト試薬(t-ブチルスルフェニル保護)を結合させ、標準のヨウ素酸
化後、末端Fmoc基をピペリジンで短時間処理によって除去した。標準のアンモニ
ア水脱保護と溶液への放出に続いて、生じた5'-S-tert-ブチルチオシステイン3'
-フルオレセインオリゴヌクレオチド誘導体は、逆相HPLCで１８．３分の溶出時
間で単一のメインピークを示した。HPLC精製後、収量は、２０．７A₂₆₀ユニット
であった。生成物はHPLCで単一のピークと、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
単一のバンドを示した。MALDI-TOF質量スペクトルは、質量5424Da（計算で5422
）を示した。このオリゴヌクレオチドを0.2M TCEP溶液(pH6.5)で３０分室温で
処理し、遊離のチオールが、HPLC（溶出時間16.7分）によって観測され、量的に
得られた。先に報告された（Soukchareunら、Bioconj. Chemistry, 9, 1998,
466-475）のと同様の方法によって、水溶液での、この5'-システイン-3'-フル
オレセインオリゴデオキシヌクレオチドのマレイミドペプチドとのコンジュゲー
ト反応は、オリゴヌクレオチドが、各ケースにおいて１６時間以内で完全に消費
されることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡＣ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡ 14/00 14/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C076 AA95 CC41 EE41 EE59 FF68 4C084 AA13 MA05 NA10 NA13 ZC022 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA02 MA03 MA05 MA10 NA10 NA13 ZC02 4H045 AA10 AA20 BA10 BA54 FA10 FA30 FA33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一分子M¹-NH₂を第二分子M²-OHと連結する方法であって、
次式（I） M¹-NH-CO-A-CO-SR¹ （I）（式中、 M¹は、アミノ基を有する分子の残基であり、 Aは、アルキレン又はアリーレン基であり、 R¹は、アルキル又はアリールである）で示される化合物を、次式（II）【化１】（式中、 M²は、ヒドロキシ基を有する分子の残基であり、 Bは、リンカーであり、 Dは、C_1-4アルキレン基又はC_3-12アリーレン基であり、 R²は、水素又はチオール保護基である）で示される化合物と反応することを特徴とする方法。
【請求項２】請求項１で定義された式（I）で示されることを特徴とする
化合物。
【請求項３】前記M¹が、ペプチド残基を含む、請求項２記載の化合物。
【請求項４】前記Aが、C_1-4アルキレン基を含む、請求項２又は３記載の
化合物。
【請求項５】前記Aが、エチレン（-CH₂-CH₂-）又はn-プロピレン(-CH₂-CH ₂ -CH₂-)基を含む、請求項４記載の化合物。
【請求項６】前記R¹が、C_1-18アルキル又はC_3-10アリール基を含む、請求
項２〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】前記R¹が、t-ブチル、置換又は非置換ベンジル、置換又は非
置換フェニル、2-ピリジル、4-ピリジル、シアノメチルカルボキサミドメチル、
2-カルボキサミドエチル及びトリフルオロエチルから成る群より選択される、請
求項６記載の化合物。
【請求項８】請求項１で定義された式（II）で示されることを特徴とする
化合物。
【請求項９】前記M²が、オリゴヌクレオチド残基を含む、請求項８記載の
化合物。
【請求項１０】前記リンカーBが、次式 -X-J （式中、 Jは、アルキレン又はアリーレン基であり、 Xは、ヒドロキシ基と反応可能な官能基の残基である）で示される基を含む、請求項８又は９記載の化合物。
【請求項１１】前記Jが、C_1-18アルキレン基又はC_3-12アリーレン基であ
る、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】前記Jが、トランス-4-アミノシクロヘキサノール又は4-ヒ
ドロキシピペリジン由来の部分を含む、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】前記Xが、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホネー
ト又はホスフィット残基である、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の化合物
。
【請求項１４】前記Xが、次式【化２】（式中、 R³は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びそれらの塩、アルキル、アルコキシ、
アリールオキシ、チオール、チオキシアニオン及びそれらの塩、S-アルキル、Ｓ
-アリール、N-アゾルイル、ジアルキルアミノ基から成る群より選択される）から成る群より選択される、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】前記R³が、2-シアノエトキシ基である、請求項１４記載の
化合物。
【請求項１６】前記Dが、メチレン又はエチレン基である、請求項８〜１
５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】前記R²が、水素、アルキル、S-アルキルスルフェニル、S-
アリールスルフェニル、アルキルカルボキサミドアルキル、ウレタニル及びアシ
ル基から成る群より選択される、請求項８〜１６記載の化合物。
【請求項１８】前記R²が、水素、tert-ブチル、スルフェニル又はトリチ
ルである、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】前記式（II）の化合物のアミノ基が保護されている、請求
項８〜１８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２０】前記アミノ基が、ウレタニル、アルキル、アルキルスルフ
ェニル、アリールスルフェニル及びスルホニル保護基から成る群から選択される
保護基R⁴で保護されている、請求項２０記載の化合物。
【請求項２１】次式（III） R⁵-CO-A-CO-SR¹ （III）（式中、 A及びR¹は、請求項１〜１９のいずれか１項で定義されており、 R⁵は、ヒドロキシ、オキシアニオン及びそれらの塩、アルコキシ、アリールオ
キシN-スクシニミジルオキシ、N-（ノルボルネンカルボキシミド）オキシ、N-ベ
ンゾトリアゾリルオキシ、N-(1,2-ジヒドロ-1-オキソ-2,3,4-ベンゾトリアジン-
2-イル)オキシ、ハロゲン及びN-アゾルイル基から成る群から選択され、又は隣
接するCO基と共に無水物を形成する）で示されることを特徴とする化合物。
【請求項２２】前記R⁵が、ペンタフルオロフェノキシ基である、請求項２
１記載の化合物。
【請求項２３】次式（IV）【化３】（式中、 D、J、R²、R³及びR⁴は、請求項１〜２２のいずれか１項で定義され、 R⁶は、ジアルキルアミノ、イミノ、ハロゲン、N-アゾルイル、アルコキシ、ア
リールオキシ、アルキルチオ、アリールチオアリール基から成る群より選択され
る）で示されることを特徴とする化合物。
【請求項２４】前記R⁶が、ジアルキルアミノ基である、請求項２３記載の
化合物。
【請求項２５】前記R⁶が、ジイソプロピルアミノ基である、請求項２４記
載の化合物。
【請求項２６】次式（V）【化４】（式中、 A、B及びDは、請求項１〜２５のいずれか１項で定義される）で示される構造単位を含むことを特徴とする化合物。
【請求項２７】前記式（VI）【化５】（式中、 M¹、M²、A、B及びDは、請求項１〜２６のいずれか１項に定義される）で示される、請求項２６記載の化合物。
【請求項２８】固体支持体に連結されている、請求項２〜２７のいずれか
１項記載の化合物。
【請求項２９】前記M¹、M²、A、B、D、R¹及びR²が、請求項４〜２３のい
ずれか１項に定義される、請求項１記載の方法。
【請求項３０】次式（VII）【化６】（式中、 M¹、M²、A、B及びDは、請求項１〜２９のいずれか１項で定義され、 Yは、ラベリング、レポーター又はエフェクター基である）で示されることを特徴とする化合物。
【請求項３１】ペプチド及びオリゴヌクレオチドを連結する方法における
、請求項２〜２８のいずれか１項の化合物の使用。
【請求項３２】治療に使用するための請求項２７又は３０記載の化合物。
【請求項３３】次式 M¹-NH₂ で示される化合物を、請求項２１又は２２記載の化合物と反応させることを含み
、式中のM¹、A、R¹及びR⁵は、請求項１〜３２のいずれか１項で定義される、式
（I）の化合物を製造する方法。
【請求項３４】次式 M²-OH で示される化合物と請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の化合物を反応させ
ることを含み、式中のM²、B、D、R²、R³、R⁴及びR⁶は、請求項１〜３３のいずれ
か１項で定義される、式IIの化合物を製造する方法。
【請求項３５】請求項２１又は２２記載の化合物及び/又は請求項２３〜
２５のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とするキット。