JP4873510B2 - 標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤 - Google Patents
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Description
さらにヒストンアルギニンのメチル化は幹細胞の多能性に関与していることも報告されており(非特許文献3)、ヒストンアルギニンメチル化酵素阻害剤は、幹細胞の多能性の機序解明にも利用できる(特許文献6)。
すなわち、本発明は、以下の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤等を提供する。
(2)ヒストン修飾制御剤が、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、SUMO化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびADPリボシル化からなる群から選択される少なくとも1つのヒストン修飾をゲノム上の部位特異的に制御するものである、上記(1)に記載の制御剤。
(3)ヒストン修飾制御剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、上記(2)に記載の制御剤。
(4)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体、または脂肪族酸である、上記(3)に記載の制御剤。
(5)ヒドロキサム誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン酸またはトリコスタチンAである、上記(4)に記載の制御剤。
(6)環状テトラペプチドが、トラポキシンA、またはトラポキシンBである、上記(4)に記載の制御剤。
(7)ベンズアミド誘導体が、MS-275である、上記(4)に記載の制御剤。
(8)脂肪族酸が、ブチラートまたはNaBである、上記(4)に記載の制御剤。
(9)ヒストン修飾制御剤がヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である、上記(2)に記載の制御剤。
(10)ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤が、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体である、上記(9)に記載の制御剤。
(11)芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体が、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である、上記(10)に記載の制御剤。
(12)ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物が、AMI-1、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)である、上記(11)に記載の制御剤。
(13)アゾ化合物を基本骨格に有する化合物が、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75である、上記(11)に記載の制御剤。
(14)標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、上記(1)〜(13)のいずれか一項に記載の制御剤。
(15)細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、上記(14)に記載の制御剤。
(16)細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子である、上記(14)に記載の制御剤。
(17)癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Transcription factors)遺伝子である上記(15)に記載の制御剤。
(18)癌抑制遺伝子が、p16INK4a(CDKN2A)遺伝子、p21(CDKN1A)遺伝子、APC遺伝子、RASSF1遺伝子、RB遺伝子、NF1遺伝子、NF2遺伝子、p19(CDKN2D) 遺伝子、WT1遺伝子、VHL遺伝子、BRCA1遺伝子、BRCA2遺伝子、CHEK2遺伝子、Maspin 遺伝子、p73遺伝子、DPC4(SMAD4) 遺伝子 、MSH2遺伝子、MLH1遺伝子、PMS2遺伝子、DCC遺伝子、PTEN遺伝子、p57KIP2(CDKN1C) 遺伝子、PTC遺伝子、TSC1遺伝子、TSC2遺伝子、EXT1遺伝子、EXT2遺伝子、またはp53遺伝子である、上記(15)に記載の制御剤。
(19)幹細胞または前駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子が、LIF (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、OCT3/4遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子、MYC遺伝子、MYCN遺伝子、または p16INK4a(CDKN2A) 遺伝子である、上記(16)に記載の制御剤。
(20)複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または(5)で表されるものである、上記(1)に記載の制御剤。
(22)ヒストン修飾制御剤が、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、SUMO化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびADPリボシル化からなる群から選択される少なくとも1つのヒストン修飾をゲノム上の部位特異的に制御するものである、上記(21)に記載の方法。
(23)ヒストン修飾制御剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、上記(22)に記載の方法。
(24)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体、または脂肪族酸である、上記(23)に記載の方法。
(25)ヒドロキサム誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン酸またはトリコスタチンAである、上記(24)に記載の方法。
(26)環状テトラペプチドが、トラポキシンA、またはトラポキシンBである、上記(24)に記載の方法。
(27)ベンズアミド誘導体が、MS-275である、上記(24)に記載の方法。
(28)脂肪族酸が、ブチラートまたはNaBである、上記(24)に記載の方法。
(29)ヒストン修飾制御剤がヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である、上記(22)に記載の方法。
(30)ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤が、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体である、上記(29)に記載の方法。
(31)芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体が、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である、上記(30)に記載の方法。
(32)ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物が、AMI-1、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)である、上記(31)に記載の方法。
(33)アゾ化合物を基本骨格に有する化合物が、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75である、上記(31)に記載の方法。
(34)標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、上記(21)〜(33)のいずれか一項に記載の方法。
(35)細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、上記(34)に記載の方法。
(36)細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子である、上記(34)に記載の方法。
(37)癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Transcription factors)遺伝子である上記(35)に記載の方法。
(38)癌抑制遺伝子が、p16INK4a(CDKN2A)遺伝子、p21(CDKN1A)遺伝子、APC遺伝子、RASSF1遺伝子、RB遺伝子、NF1遺伝子、NF2遺伝子、p19(CDKN2D) 遺伝子、WT1遺伝子、VHL遺伝子、BRCA1遺伝子、BRCA2遺伝子、CHEK2遺伝子、Maspin 遺伝子、p73遺伝子、DPC4(SMAD4) 遺伝子 、MSH2遺伝子、MLH1遺伝子、PMS2遺伝子、DCC遺伝子、PTEN遺伝子、p57KIP2(CDKN1C) 遺伝子、PTC遺伝子、TSC1遺伝子、TSC2遺伝子、EXT1遺伝子、EXT2遺伝子、またはp53遺伝子である、上記(35)に記載の方法。
(39)幹細胞または前駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子が、LIF (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、OCT3/4遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子、MYC遺伝子、MYCN遺伝子、または p16INK4a(CDKN2A) 遺伝子である、上記(36)に記載の方法。
(40)複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または(5)で表されるものである、上記(21)に記載の方法。
(42)癌治療のための、上記(41)に記載の医薬組成物。
(43)上記(1)〜(20)のいずれか1項に記載の複合体を投与することを含む、癌の治療方法。
(44)上記(1)〜(20)のいずれか1項に記載の複合体を含む、細胞機能研究用試薬。
配列番号3:合成DNA、
配列番号4:合成DNA、
配列番号5:合成DNA、
配列番号8:合成DNA、
配列番号9:合成DNA、
配列番号10:合成DNA、
配列番号11:合成DNA、
配列番号12:合成DNA、
配列番号13:合成DNA。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願2008−172795号に記載の明細書、請求の範囲及び/又は図面の内容を包含する。
前述のように、ヒストンは真核生物染色体の遺伝子の転写制御に深く関わっている。ヒストンが修飾を受けるとDNAとヒストンとの結合状態が変化したりDNAの修飾状態が変化したりし、その結果、遺伝子の転写が促進され、または抑制される。ヒストンの修飾としては、例えばヒストンのアセチル化が挙げられる。ヒストンのアセチル化は、細胞内では、ヒストンアセチル化酵素(HAT: Histone Acetyltransferase)とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC: Histone Deacetylase)によって制御されていることが知られており、近年、いくつかのHATおよびHDACが同定されている。このヒストンのアセチル化は、ヒストン蛋白に負の電荷をもつアセチル基を付加し、ヒストンを負に荷電し、ヒストン間およびDNAヒストン間の乖離を促す。このことでヒストンのアセチル化は遺伝子の転写調節に深く関わっていると考えられる。例えば、ヒストンのアセチル化が進むとヌクレオソームの縮合が緩んでDNAの脱メチル化が促される。遺伝子調節領域で縮合が緩み、DNAの脱メチル化がすすむとその調節領域に転写因子が結合できるようになり遺伝子の発現が促されると考えられている。そこで、ヒストンのアセチル化を促し、例えば、癌抑制遺伝子p16の調節領域の脱メチル化を促すことができれば、p16の発現が促されるので、癌を予防・治療することも可能になる。このような目的でヒストンのアセチル化を促す試薬としてHDAC阻害剤が知られている。HDAC阻害剤は、細胞内のHDACの働きを阻害することでヒストンのアセチル化を促すものである。しかし、従来のHDAC阻害剤は細胞中でランダムに働くため、目的の遺伝子をほとんど発現させることができなかったり、目的以外の遺伝子の発現の方をより促してしまったりするということがあった。
本発明の複合体は、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを有する。
複合体を構成するヒストン修飾制御剤としては、ヒストンのアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、SUMO化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびADPリボシル化からなる群から選択される少なくとも1つの修飾を制御するもの、またはヌクレオソームに働きかけるヒストンシャペロンを阻害もしくは活性化するものであるのが好ましい。より好ましくは、ヒストン修飾制御剤はヒストンのアセチル化、リン酸化、またはメチル化を制御するものであり、さらに好ましくは、ヒストンのアセチル化もしくはメチル化を制御するものである。アセチル化、リン酸化、メチル化、およびユビキチン化などの種々の修飾をヒストンが受けるとDNAとヒストンの結合状態が変化したりDNAの修飾状態が変化するなどし、その結果、遺伝子の転写が促されたり抑えられたりする。そこで、ヒストン修飾制御剤を利用して癌遺伝子や癌抑制遺伝子などの疾患に関連する遺伝子の転写を制御することで癌などの疾患を予防・治療することができる。
ヒストンの修飾によるヌクレオソーム構造の形成と崩壊の制御機構の詳細は不明な点はあるものの、ヒストンの修飾が、遺伝子の発現や転写因子、細胞分裂、減数分裂、細胞死、染色体の複製、および遺伝子の修復などに関与していることが徐々に解明されている。このように遺伝子の制御や様々な細胞の制御機構にヒストンの修飾が関わることより、様々な病態と関わっていると考えられる。前述した癌化、脳神経系の疾患(自閉症、双極性障害、統合失調症、癲癇など)、あるいは様々な生活習慣病の発症、幹細胞を利用した再生医療にヒストンの修飾が関与することが判明しており、ヒストンの修飾を遺伝子部位特異的に制御することは、細胞機能の詳細な解析を可能にし、難知性の疾患の機序解明、治療法の開発のための試薬としても使用可能となる。
ここで、ヒストン脱イミノ化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。
p53遺伝子のプロモータ領域付近のヒストンおよび転写因子非結合部を認識するPIPの設計は、後述の設計例に具体的に記載した。MYCN遺伝子のプロモータ領域付近のヒストンおよび転写因子非結合部を認識するPIPの設計は、後述の設計例に具体的に記載した。そして、このように設計したPIPは、例えば、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)を用いた固相法(固相Fmoc法)による自動合成法によって簡便に製造することができる。ここで、固相Fmoc法によれば、例えば、PIPとFITC(フルオレセインイソチオシアネート)などの標識物質との共役体を合成することもできる。得られる共役体は、PIPが特定のDNA配列を認識することを確認するために用いることができる。
「結合」は、直接でもよいし、リンカーを介してもよい。リンカーとしては、ヒストン修飾制御剤の作用を妨げず、かつ標的認識ポリアミドの遺伝子領域の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合などを例示することができる。
<p16遺伝子特異的複合体(1)(2)(5)、p53遺伝子特異的複合体(3)、およびMYCN遺伝子特異的複合体(4)>
本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤は上記本発明の複合体を含む。また、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾方法は、上記本発明の複合体を用いる方法である。ここで、「標的遺伝子特異的」とは、標的とする1つ以上(ヒトでは、ゲノム領域としては約100000個の遺伝子があるとされており、遺伝子発現に関与する配列としてはひとつの転写因子が数千個から数百個の領域で特異的配列を認識し発現調節するとされている。このため、例えば、このうちの1〜数千個(例、1〜5000、1〜4000、1〜3000、1〜2000または1〜1000)、1〜数百個(例、1〜500、1〜400、1〜300、1〜200または1〜100)、または1〜50個、好ましくは、1〜10個、さらに好ましくは、1〜5個(5個、4個、3個、2個または1個))の遺伝子に特異的であることを意味する。例えば、転写因子によっては、5塩基の認識配列で、数百〜数千個の遺伝子群の発現を調節することで生物現象を調節する場合もあるため(例えば、MYC遺伝子は、3000〜4000個の下流遺伝子群をもつ。)、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤が特異性の低い配列(数千個〜数百個の遺伝子に共通する配列)を認識する場合でも、生物現象を調節し、例えば、疾患治療や再生治療に有効である場合がある。尚、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤は、例えば、ポリアミドが認識する配列の塩基数を増やすこと、ポリアミドが認識する配列として特異性の高い配列を選択することなどによって、標的とする遺伝子の数を減らすことができる。
「本発明の複合体を用いる」とは、例えば、本発明の複合体をin vitroで細胞に接触させて用いることのほか、哺乳動物(例えば、ヒトを除く)や実験生物(例えば、ヒトを除く)などに投与して用いること(in vivoで用いること)などを含む。「接触」とは、本発明の複合体と細胞とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に本発明の複合体を添加すること、細胞と本発明の複合体とを混合すること、細胞を本発明の複合体の存在下で培養することなどを含む。
本発明の修飾剤または修飾方法の標的遺伝子としては、細胞制御に関わる遺伝子を例示することができる。細胞制御に関わる遺伝子としては、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、神経細胞制御物質をコードする遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を挙げることができる。好ましくは、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子である。
また、本発明は、本発明の複合体を含む、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御用キットを含む。本発明のキットは、本発明の複合体の他、上記修飾剤で説明した、担体や添加物を含んでも良い。さらに、本発明のキットは、必要に応じて、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書などを含んでもよい。
さらに、本発明は、本発明の複合体を含む、細胞機能研究用試薬を提供する。また、本発明の細胞機能研究方法は、上記本発明の複合体を用いる方法である。ここで、「本発明の複合体を用いる」とは、例えば、本発明の複合体をin vitroで細胞に接触させて用いることのほか、哺乳動物(例えば、ヒトを除く。例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)や実験生物(例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など)などに投与して用いること(in vivoで用いること)などを含む。「接触」とは、本発明の複合体と細胞とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に本発明の複合体を添加すること、細胞と本発明の複合体とを混合すること、細胞を本発明の複合体の存在下で培養することなどを含む。本発明のある態様では、本発明の複合体により、ヒストン修飾を遺伝子部位特異的に制御することで、細胞機能の詳細な解析が可能となり、難知性の疾患の機序解明、または治療法の開発などに役立つ。本発明の研究試薬および/または研究方法は、哺乳動物(例えば、ヒトを除く。例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)やその他の実験生物(例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など)などを対象とすることができる。本発明の研究用試薬および/または研究方法では、本発明の複合体の他、上記修飾剤で説明した、担体や添加物を含んでも良い。本発明の研究試薬および/または研究方法における本発明の複合体の使用量は、使用目的によって異なる。当業者であれば、使用目的に応じて、本発明の複合体の使用量を適宜選択することができる。
本発明の医薬組成物は、上記本発明の複合体を含む。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を予防・治療することができる。本発明の医薬組成物の対象疾患としては、癌、神経疾患/精神性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、甲状腺ホルモン不応症、老化、嚢胞性線維症、ならびに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうち癌としては、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌、大腸癌(結腸癌、直腸癌)、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫(例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など)、白血病(例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)及び急性リンパ性白血病(ALL)、リンパ腫、多発性骨髄腫(MM)など)、小児固形腫瘍(神経芽細胞腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫など)、網膜芽細胞腫およびメラノーマなどを挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病などを挙げることができる。皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症などを挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症などを挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着などを挙げることができる。神経疾患/精神性疾患としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡眠障害、痴呆などを挙げることができる。
これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
また、本発明は、本発明の複合体を含む、癌治療用キットを含む。本発明のキットは、本発明の複合体の他、上記医薬組成物で説明した、医薬的に許容される担体や添加物を含でも良い。さらに、本発明のキットは、必要に応じて、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書などを含んでもよい。
p16は、細胞周期調節因子であるCDKを阻害して細胞周期を停止する働きをもつ腫瘍抑制因子である。癌細胞中ではp16遺伝子の調節領域のDNAがメチル化しp16遺伝子の発現が抑制されている。本実施例では、p16遺伝子の調節領域を認識するPIPにSAHAを結合した化合物(複合体)を作製した。この複合体を用いて、HDAC活性測定、細胞増殖アッセイ等を行ったところ、合成した複合体が、癌細胞においてp16遺伝子の発現を促すこと、および癌細胞の増殖抑制効果があること等が認められた。ここでSAHAによりヒストンのアセチル化が誘導され、遺伝子調節領域に脱メチル化が誘導されること、および抗がん作用があることが報告されているが、SAHAによるP16遺伝子の再発現は起きないことは一般的に知られている。
p16遺伝子のプロモータ領域のGCBoxに近いCGCACTCAAACACGCCTTTGCTGGCAGGCGのシークエンスをPIポリアミド合成のターゲットとした。すなわち、上記配列下線部のTGCTGGCA配列(−436〜−429)を認識するようにポリアミドを設計した。p16遺伝子は癌抑制遺伝子であり、p16遺伝子のプロモータ領域はがん細胞では高頻度にメチル化している。p16遺伝子のプロモータ領域が高頻度にメチル化しているとき、プロモータ部位にはヌクレオソーム構造が見られヒストン蛋白が結合している。この状態ではヒストンが脱アセチル化しており、DNAが縮合してプロモータ領域に転写因子が結合できない状態を生み、p16遺伝子の転写が抑制される。p16遺伝子のプロモータ領域のヒストンの結合状態は、M.SssIフットプリンティング法で同定可能である(Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e176)。図1にp16遺伝子のプロモータ領域(−450 〜+110)の配列を示す(配列番号1)。図1の配列中、アンダーラインボールドの配列は癌細胞ではヒストン蛋白と結合しないリンカー部分と考えられる配列である。リンカー部分ではPIポリアミドがDNAに結合することができるが、ヒストン結合部分では既にヒストン蛋白がDNAと結合しているためポリアミドがDNAに結合できない可能性が高い。また、GCBoxは転写因子の結合する領域であると考えられることから、図1の配列中、四角で囲んだ二つのGCBoxに近いCGCACTCAAACACGCCTTTGCTGGCAGGCGのリンカーシークエンスは、転写因子が結合する領域に近いと考えられる。よって、この領域でヒストンのアセチル化を導くことが出来ればヒストン間が開き、プロモータへの転写因子の結合が促されると考えられる。このため図1中で中央灰色で覆った配列TGCTGGCAをターゲットにして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。この配列を認識するポリアミドとHDAC阻害剤との複合体であれば、標的特異的にヒストンのアセチル化を促すことができ、より効果的にヌクレオソーム構造の変化を誘導できると期待された。このようにしてヌクレオソームの構造の変化を誘導することでp16癌抑制遺伝子を癌細胞で再発現させることができると考えられる。そして、p16癌抑制遺伝子を再発現させることにより、がん細胞の増殖抑制、がん細胞の老化細胞死を導くことができると予想された。このように設計したSAHA+p16PIPの構造式を下記に示す。
尚、下記合成において、使用した測定装置は次の通りである。
測定装置
NMR specrometer : JEOL JNM-AL400、
ESI-MS : PESCIEX API165、
UV-Vis spectrometer : Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer、
HPLC unit : JASCO PU-2080 Plus、
HPLC detector : JASCO 807-IT、
HPLC column : Chemcobond 5- ODS-H column (4.6 × 150 mm)(解析用)、
: Chemcobond 5-ODS-H coloumn (10 × 150 mm)(分取用)、
Column chromatograph : Merck Silica gel 60、
TLC plate : Merck Silica gel 60 F254 。
methyl 4-aminobenzoate 1は、Sigma-Aldrichで入手した。
Yield: 2.4 g(94%),1H NMR (CDCl3, 400 MHz, δ ): 7.93(d, J= 8.4 Hz, 2 H; CH), 7.53(d, J = 8.4 Hz,2 H; CH), 7.31(brs,1 H; NH), 3.83(s,3 H; CH3), 3.60(s,3 H; CH3), 2.39-2.22(m, 4 H; CH2), 1.72-1.61(m,2 H; CH2), 1.59- 1.55(m,2 H; CH2), 1.37-1.30(m,4 H; CH2).
Yield:59.8 mg ( 28%).1H NMR ( CDCl3, 400 MHz, δ):10.3(brs,1 H; NH), 7.96(d, J = 8.8 Hz ,2 H; CH), 7.79(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 3.88(s,3 H; CH3), 2.39-2.22(m,4 H; CH2), 1.72-1.61(m,2 H; CH2), 1.59-1.55(m,2 H; CH2), 1.40-1.33(m,4 H; CH2).
4-aminobenzoic acid 4は、東京化成工業より得た。
Yield: 3.79 g (80%), 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ ):10.2 (s,1 H; NH) , 7.85(d, J= 8.8 Hz ,2 H; CH), 7.69(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 3.60(s, 3 H; CH3), 2.34-2.18(m,4 H; CH2), 1.57-1.50(m, 4 H; CH2), 1.28-1.09(m,4 H; CH2). ESI-MS m/z calcd for C16H22NO5;+[M+H]+ 308.1, found 308.2.
ESI-MS m/z calcd for C51H70N21O10 +[M+H]+1136.5, found 1137.0.
ESI-MS m/z calcd for C79H102N33O16 +[M+H]+1768.9, found 1769.2.
ESI-MS m/z calcd for C85H113N34O19 +[M+H]+1913.9, found 1914.2.
Yield:8.0 mg (38%). ESI-MS m/z calcd for C95H121N34O20 +,[M+H]+2058.9, found 2059.2.
Yield: 5.0 mg(61%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ): ESI-MS m/z calcd for C94H120N35O20 +. [M+H]+ 2059.9, found 2060.2.
Yield:6.8 mg (12%). ESI-MS m/z calcd for C101H131N35O24 +,[M+H]+2203.0, found 2204.2.
Yield: 0.8 mg(7.6%). ESI-MS m/z calcd for C100H1301N36O23 +. [M+H]+ 2204.0, found 2205.4.
合成されたSAHA誘導体とポリアミドを結合させた化合物によりヒストン脱アセチル化酵素(histone deacetylase: HDAC)の活性が阻害されるかどうかを確認するため、HDAC Fluorimetric Assay/Drug Discovery Kit(BIOMOL international)を用いて実験を行った。詳細はキット作成者の指示に従い、種々の濃度の合成された化合物またはポジティブコントロールとして用いたトリコスタチンA(以下TSA)存在下でアセチル化基質に対してHDACを含むHeLa細胞(ヒト子宮頸癌細胞株)核画分を添加、37℃で1時間培養後付属のデベロッパーを添加してHDACの触媒反応を停止した。その後96ウェルの測定用プレートに移し360nmの励起光により460nmで呈色する反応生成物の発光をARVO EX (Perkin Elmer)により測定した。結果を図2に示す。
次に、合成された化合物の癌細胞に対する増殖抑制能をWST-8アッセイにより検証した。
HeLa(ヒト子宮頸癌細胞株)、LOVO、 RKOそしてSW480(いずれもヒト大腸癌細胞株)の各細胞株は全て10% 牛胎児血清(FBS: JRH bioscience, USA)と抗生剤(50U/ml:Penicillin及び50 ug/ml: Streptomycin)、そして1mMピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、ナカライテスク)を用いて37℃、5% 二酸化炭素条件下で培養し、10cmの細胞培養皿上で80-90%コンフルエントに達した単層細胞をD‐PBS(‐)(ナカライテスク)で洗浄後、フェノールレッド含有2.5g/L‐Trypsine/1m mol/L EDTA solution (ナカライテスク)で処理し、剥離させた後、新しい培地で調整、維持した。
p16遺伝子の発現に対する作用を確認するため、リアルタイムRT‐PCRを行った。1ウェルあたり1.5×104細胞となるよう24ウェルプレートに播種したHeLa細胞を種々の濃度のポリアミド存在下で48時間培養した後、ISOGEN(ニッポンジーン、東京)を用いてRNAを回収した。その際の手順は作成者の指示に従った。単離されたtotal RNAはNanodrop(NanoDrop、アメリカ)にてその濃度を測定しPrimescript RT reagent kit(TAKARA BIO 滋賀)を用いたcDNA合成に使用した。作製されたcDNAはSYBR premix EX Taq(TAKARA BIO、 滋賀)を用いてThermal Cycler Dice Realtime System TP‐800(TAKARA BIO、 滋賀)により、p16 RNA発現量を確認した。この時p16の増幅には次のプライマーを使用して、PCR反応を行った。
5’-GGCACCAGAGGCAGTAACCA-3’(配列番号2)、
リバース:
5’-GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA-3’(配列番号3)。
フォワード:
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(配列番号4)、
リバース:
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(配列番号5)。
種々の濃度のポリアミド存在下で48時間培養されたHeLa細胞を回収した後20mM Tris‐HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、そして1%Nonidet P‐40とComplete protease inhibitor Cocktail Tablets(Roche)を含む抽出バッファーに再溶解し、13,500xg、4℃で15分遠心分離した後上清にSample buffer solution (2ME+,×4)(和光純薬)を加えてサンプル化した。このサンプルを15% ポリアクリルアミドゲルで展開しポリビニリデンジフルオライド膜(ミリポア アメリカ)に電気的に移した後に非特異的な結合を抑える目的で5%のスキムミルクを用いてブロッキングした。目的タンパク質検出のため一次抗体はp16にはPURIFIED ANTI‐HUMAN p16INK4 MONOCLONAL ANTIBODY(BD bioscience)を、内部標準に使用したα-チューブリンにはα‐tubulin(TU‐02) (SANTA CRUZ)を用いた。また二次抗体は双方とも、Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti‐Mouse IgG(H+L) Horseradish peroxidase Conjugate(BIO RAD)を使用した。抗体標識後はImmobilon western(MILLIPORE)を用いて発色させた後Las‐4000 mini(フジフィルム)で検出し、各バンドの面積と強度をMultigauge(フジフィルム)で測定、50%DMSOで処理したコントロールを100%として比較定量を行った。
合成した化合物(SAHA+p16PIP、若しくはSAHA+non‐targeting PIP)又はSAHAの最終濃度が150 nMとなるよう調整した10%牛胎児血清を含むDMEM培地で、HeLa細胞を、37℃、5%CO2存在下で7日間培養した後、直径100 mm 細胞培養皿コーニング430167にコンフルエントの5x106〜1x107細胞を回収した。そして、MILIPORE 17-295 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay kitを用いてクロマチン免疫沈降実験をおこなった。
尚、p16遺伝子に加えてLARP1遺伝子についても解析したのは、SAHA+p16PIPが認識するp16遺伝子の調節領域の配列と同様の配列が、LARP1遺伝子領域にも存在したためである。
p16リバース: 5'-CAAATCCTCTGGAGGGACCGC-3'(配列番号9)
LARP1フォワード:5'-TACCAACCACTGTCCCAGAG-3'(配列番号10)
LARP1リバース:5'-TGGGTTTGAACTGTGTCTTG-3'(配列番号11)
フォワード:
5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG -3’(配列番号12)
リバース:
5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA -3’(配列番号13)
HEK293細胞を用いてLARP1遺伝子の発現解析を行った。HEK293細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株である。LARP1遺伝子は、前記のように、SAHA+p16PIPが認識するp16遺伝子の調節領域の配列と同様の配列を、その遺伝子領域に有する。
具体的には、次のようにして発現解析を行った。HEK293細胞を、DMEM 10% 牛胎児血清(FCS)含有増殖培地にて培養した。このとき、最終濃度150 nMの合成化合物(SAHA+p16PIP;esterified SAHA +p16PIP;又はSAHA+non‐targeting PIP)を添加した培養液で2日毎に培地交換を行い、一週間、上記合成化合物を含む培地にて細胞の培養を続けた。一週間後、細胞を1mlのTRIzolに溶解させ、これに200μlのクロロホルムを混合し、12000xgにて、4℃で10分間の遠心を行った。次に、上清を等量のイソプロパノールに混和し、12000xgにて、4℃で10分間の遠心を行った。次に、ペレットを70%エタノール液にて洗浄し、5000xgにて5分間の遠心を行った後、上清を除去した。次に、ペレットを100μlの水に溶解させ、得られたRNA溶液をRNeasy kit(QIAGEN)のカラムにかけて、RNAを精製した。1μgのRNAを鋳型にcDNAを合成し、定量PCRを実施した。この時、増幅には、以下のプライマーを使用した。
LARP1フォワード:5'-TACCAACCACTGTCCCAGAG-3'(配列番号10)
LARP1リバース:5'-TGGGTTTGAACTGTGTCTTG-3'(配列番号11)
フォワード:
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(配列番号4)、
リバース:
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(配列番号5)。
また、図10に示したように、SAHA+p16PIPは、LARP1遺伝子のゲノム領域のヒストンH3のリシン9番のアセチル化を亢進する。ヒストンH3のリシン9番のアセチル化は特に遺伝子発現誘導と相関することが知られている。
これら図10および図11の結果を考慮すると、SAHA+p16PIPは、LARP1遺伝子領域においてもヒストン脱アセチル化酵素を阻害し、ヒストンのアセチル化を促し、このことにより遺伝子の発現を上昇させたものと類推された。よって標的ゲノム領域でヒストン脱アセチル化酵素阻害を導き、遺伝子発現を活性化させたものと考えられる。
上記複合体は次のように設計した。
図1のp16遺伝子のプロモーター領域の配列中、最上段のボールドの配列(AGGGTTGAGGGGGTAGGGGGACACTTTCTAGT)のリンカーシークエンスの領域は、転写因子結合部位に近く、ヒストンのアセチル化を導くことが出来ると考えられる。このため、図1中の配列中、最上段の灰色で覆った配列AGGGTTGAをターゲットにして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。
H2NββPyPyβPyPyPyγImImImβPyImβDp polyamide 8の合成:
ESI-MS m/z calcd for C80H102N32O16 +[M+H]+1767.9, found 1768.0
Yield:7.0 mg (33%). ESI-MS m/z calcd for C96H121N33O20 +,[M+H]+2057.2, found 2057.1.
Yield: 4.0 mg(49%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ): ESI-MS m/z calcd for C95H120N34O20 +. [M+H]+ 2058.9, found 2059.2.
1x105細胞のMDA-MB231乳癌細胞を、最終濃度10%の牛胎児血清含有RPMI-1640 培地を用いて、直径6センチメートルディッシュにて培養した。このとき、以下に示した最終濃度の各ポリアミド(SAHA+p16NU PIP;又はSAHA+non‐targeting PIP)を培地に添加して、又はポリアミドを添加せずに培養をおこなった。
1μM SAHA+non‐targeting PIP
1μM SAHA+p16NU PIP
2μM SAHA+p16NU PIP
SAHA+p53PIP:
p53は、癌抑制遺伝子として最もよく知られる遺伝子で、高頻度にヒトがん腫で変異やDNAメチル化が認められる。p16癌抑制遺伝子同様に内因性のp53遺伝子の再発現によるがん治療を目的に本化合物が合成できる。
AMI-1+MYCNPIP:
MYCN遺伝子は、癌遺伝子として知られ特に予後の不良な小児固形腫瘍、神経芽細胞腫で高頻度に増幅が認められる遺伝子であり、この発現抑制による神経芽細胞腫の治療の試みがなされている。この発現を、ヒストンのメチル化により調節することは治療法の開発研究に結びつくとともに治療法に利用できる可能性がある。
Claims (9)
- スベロイルアニリドヒドロキサム酸であるヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを結合した複合体を含み、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの結合がアミド結合を介したものである、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
- 標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、請求項1に記載の制御剤。
- 細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、請求項2に記載の制御剤。
- 細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子である、請求項2に記載の制御剤。
- 癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Transcription factors)遺伝子である請求項3に記載の制御剤。
- 癌抑制遺伝子が、p16INK4a(CDKN2A)遺伝子、p21(CDKN1A)遺伝子、APC遺伝子、RASSF1遺伝子、RB遺伝子、NF1遺伝子、NF2遺伝子、p19(CDKN2D) 遺伝子、WT1遺伝子、VHL遺伝子、BRCA1遺伝子、BRCA2遺伝子、CHEK2遺伝子、Maspin 遺伝子、p73遺伝子、DPC4(SMAD4) 遺伝子 、MSH2遺伝子、MLH1遺伝子、PMS2遺伝子、DCC遺伝子、PTEN遺伝子、p57KIP2(CDKN1C) 遺伝子、PTC遺伝子、TSC1遺伝子、TSC2遺伝子、EXT1遺伝子、EXT2遺伝子、またはp53遺伝子である、請求項3に記載の制御剤。
- 幹細胞または前駆細胞の維持および/または分化に関わる遺伝子が、LIF (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、OCT3/4遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子、MYC遺伝子、MYCN遺伝子、または p16INK4a(CDKN2A) 遺伝子である、請求項4に記載の制御剤。
- 複合体が、下記式(1)、(2)、(3)または(5)で表されるものである、請求項1に記載の制御剤。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
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