KR101900574B1

KR101900574B1 - 신규한 n-히드록시벤즈아미드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101900574B1
Application number: KR1020160175022A
Authority: KR
Inventors: 한상배; 김영수; 홍진태; 하이 남 응우옌; 티 란 흐엉 트란; 티 마이 덩 두
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2018-09-19
Also published as: KR20180071889A

Abstract

본 발명은 신규한 N-히드록시벤즈아미드 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제로 유용한 신규한 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 화합물은 암의 치료 및 예방을 위한 약제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 N-히드록시벤즈아미드 및 이의 용도{Novel N-hydroxybenzamide and Use Thereof}

본 발명은 신규한 N-히드록시벤즈아미드 및 이의 용도에 관한 것이다.

히스톤 탈아세틸화 효소 (HDAC, histone deacetylases)는 히스톤 단백질의 꼬리에서 라이신 잔기로부터 아세틸기의 제거를 촉매하는 효소의 군을 말한다 [1-3]. 현재까지 18 가지의 상이한 HDAC의 아이소폼(isoform)이 진핵 생물에서 동정되었다 [4]. 서열간의 상대적인 유사성에 기초하여, 이들 아이소폼은 4 개의 클래스로 분류된다. HDAC 클래스 I은 HDAC1, 2, 3 및 HDAC8을 포함하는 4 종의 효소로 구성되고, HDAC 클래스 II는 HDAC4, 5, 6, 7, 9 및 HDAC10을 포함한 6 종의 효소로 구성된다. 또한 시르투인(Sirtuin)이라고도 알려진 HDAC 클래스 III는 7 종의 효소가 있다 (Sirt1-7). 시르투인은 NAD+ 의존적 효소이다. 마지막으로 HDAC 클래스 IV에는 단 하나의 효소(HDAC11)만이 있다. 이 아이소폼은 클래스 II와 클래스 I의 HDAC2의 특성을 모두 갖는 것으로 알려져 있다 [3].

서로 다른 HDAC 아이소폼, 특히 클래스 I 및 II의 아이소폼은 세포와 관련된 여러 가지 프로세스에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, HDAC 1, 2, 3 및 8은 세포 증식을 촉진하는 반면, HDAC 1-4, 5 및 8은 세포 사멸 및 분화를 예방한다. HDAC 4, 6, 7 및 10을 포함한 몇 가지 다른 아이소폼 (isoforms)은 암세포 전이에 있어서 중요한 두 가지 과정인 혈관 신생(angiogenesis) 및 세포 이동(cell migration)을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 [4,5]. 각각의 HDAC 아이소폼의 억제는 많은 유형의 종양 세포에서 분화(differentiation), 세포 사멸(apoptosis) 및 세포주기 정지(cell cycle arrest)와 관련된 효과를 나타낸다. 또한, HDAC 억제의 종양 세포의 성장에 대한 선택적 효과는 시험관 내(in vitro)뿐만 아니라 수많은 생체 내(in vivo) 전임상 모델 및 임상 환경에서도 분명하게 입증되었다 [6,7]. 따라서 HDAC의 억제는 최근 암 치료 방법에 있어서 매우 흥미로운 접근법이 되었다 [8]. 이에 따라 지난 수년 동안 많은 수의 HDAC 억제제가 보고되었다.

지금까지 개발된 HDAC 억제제는 부틸레이트(butyrate), 페닐부틸레이트(phenylbutyrate) 또는 발프로익산(valproic acid)과 같은 짧은 사슬 지방산에서부터 다양한 형태의 히드록삼산(hydroxamic acid), 또는 벤즈아미드까지 다양하다. 이 중 보리노스타트(vorinostat, 상품명 Zolinza®) (SAHA 또는 suberoylanilide hydroxamic acid라고도 함)는, 피부의 T 세포 림프종 (CTCL, cutaneous T cell lymphoma) 치료를 위해 2006년 10월 미국 FDA에서 승인한 최초의 HDAC 억제제이다. 두 번째로 FDA 승인을 받은 HDAC 억제제인 로미뎁신(romidepsin, 상품명 Istodax®)은 2009년 미국 FDA의 승인을 받았다. 최근에는 파노비노스타트(panobinostat) (LBH-589, 상표명 Farydak®)가 다발성 골수종의 치료를 위해 2015년 2월 미국 FDA로부터 허가를 받았고 [16], 또한 2015년에는 치다마이드(chidamide, 상품명 Epidaza®)가 재발성 또는 난치성 말초 T 세포 림프종에 대해 중국 FDA로부터 승인을 받았다. 이밖에도 PXD-01 (Belinostat), MS-27-527 (Entinostat)와 같은 여러 다른 HDAC 억제제가 현재 여러 단계의 임상 시험 중에 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

P.A. Marks, R.A. Rifkind, V.M. Richon, R. Breslow, T. Miller, W.K. Kelly. Nature Rev. Cancer. 1 (2001) 194-202. O. Witt, H.E. Deubzer, T. Milde, I. Oehme. Cancer Lett. 277 (2009) 8-21. A.J.M. De Ruijter, A.H.V. Gennip, H.N. Caron, S. Kemp, A.B.P.V. Kuilenburg. Biochem. J. 370 (2003) 737-739. J.E. Bolden, M.J. Peart, R.W. Johnstone. Nat. Rev. Drug Disc. 5 (2006) 769-784. M. Dokmanovic, P.A. Marks. Expert Opin. Investig. Drug. 14 (2005) 1497-1511. R.W. Johnstone. Nature Rev. Drug Disc. 1 (2002) 287-299. K.B. Glaser. Biochem. Pharmacol. 74 (2007) 659-671. A.C. West, R.W. Johnstone. J. Clin. Invest. 124 (2014) 30-39. S. Dallavalle, R. Cincinelli, R. Nannei, L. Merlini, G. Morini, S. Penco, C. Pisano, L. Vesci, M. Barbarino, V. Zuco, M. De Cesare, F. Zunino. Eur J. Med. Chem. 44 (2009) 1900-1912. T.U. Bracker, A. Sommer, I. Fichtner, H. Faus, B. Haendler, H. Hess-Stumpp. Int. J. Oncol. 35 (2009) 909-920. M.S. Finnin, J.R. Donigian, A. Cohen, V.M. Richon, R.A. Rifkind, P.A. Marks, R. Breslow, N.P. Pavietich. Nature 401 (1999) 188-193. S. Valente, A. Mai. Expert. Opin. Ther. Pat. 24 (2014) 401-415. J. Li, G. Li, X. Xu. Curr. Med. Chem. 20 (2013) 1858-1886. K. Ververis, A. Hiong, T.C. Karagiannis, P.V. Licciardi. Biologics 7 (2013) 47-60. T. Qiu, L. Zhou, W. Zhu, T. Wang, J. Wang, Y. Shu, P. Liu. Future Oncol. 9 (2013) 255-269. FDA approves Farydak for treatment of multiple myeloma. fda.gov. Retrieved 6 October 2015. G. Malini. Nature Reviews Drug Dis. 14 (2015) 225-226. D.T.K. Oanh, H.V. Hai, V.T.M. Hue, S.H. Park, H.J. Kim, B.W. Han, H.S. Kim, J.T. Hong, S.B. Han, N.H. Nam.Bioorg. Med. Chem. Lett. 21 (2011) 7509-7512. T.T. Tung, D.T. Oanh, P.T. Dung, V.T. Hue, S.H. Park, B.W.Han, Y. Kim, J.T. Hong, S.B. Han, N.H. Nam. Med. Chem. 9 (2013) 1051-1057. N.H. Nam, T.L. Huong, D.T.M. Dung, D.T.K. Oanh, P.T.P. Dung, K.R. Kim, B.W. Han, Y.S. Kim, J.T. Hong, S.B. Han. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 29 (2014) 611-618. N.H. Nam, T.L. Huong, D.T.M. Dung, D.T.K. Oanh, P.T.P. Dung, D. Quyen, K.R. Kim, B.W. Han, Y.S. Kim, J.T. Hong, S.B. Han. Eur. J. Med. Chem. 70 (2013) 477-486. H.R. Pelzel, C.L. Schlamp, R.W. Nickells. BMC Neuroscience 11 (2010) 62-69. B.E. Lauffer, R. Mintzer, Fong, R. Fong, S. Mukund, C. Tam, I. Zilberleyb, B. Flicke, A. Ritscher, G.; Vallero, R. Fedorowicz, D.F. Ortwine, J. Gunzner, Z. Modrusan, L. Neumann, C.M. Koth, P.J. Lupardus,J.S.; Heise, C.E. Kaminker, P. Steiner. J. Biol. Chem. 288 (2013) 26926-26943. P. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero, A. Monk, J. MacMahon, D. Vistica, J.T. Warren, H. Bokesch, S. Kenney, M.R. Boyd. J. Natl. Cancer Inst. 82 (1990) 1107-1112. Y.J. You, Y. Kim, N.H. Nam, S.C. Bang, B.Z. Ahn. Eur. J. Med. Chem. 39 (2004) 189-193. Y. Kim, Y.J. You, N.H. Nam, B.Z. Ahn. Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 3435-3438. L. Wu, A.M. Smythe, S.F. Stinson, L.A. A. Mullendore, D.A. Monks, K.D. Scudiero, A.D. Koutsoukos, L.V. Rubinstein, M.R. Boyd, R.H. Shoemaker. Cancer Res. 52 (1992) 3029-3034. Chemical Computing Group Inc. Molecular Operating Environment (MOE). https://www.chemcomp.com. J. Pottel, E. Thierrein, J.L. Gleason, N. Moitessier. J. Chem. Inf. Model. 54 (2014) 254265. R. Wu, Z. Lu, Z. Cao, Y. Zang. J. Am. Chem. Soc. 133 (2011) 6110-6113. A.D. Mackerell, M. Feig, C.L. Brooks. J. Comput. Chem. 25 (2004) 1400-1415. Discovery Studio, version 3.5. Accelrys, Inc; San Diego, CA, USA: 2014. http://accelrys.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio.

본 발명자들은 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC)와 항암제의 잠재적인 억제제로서 새로운 히드록삼산을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 2-옥소인돌린(2-oxoindoline) 성분(moiety)을 포함하는 신규한 N-히드록시벤즈아미드가 매우 강력한 HDAC 저해 활성뿐만 아니라 암세포에 대한 세포 독성을 가진다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시 벤즈아미드 계 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시벤즈아미드계 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 N-히드록시 벤즈아미드 계 화합물을 제공한다.

[일반식 1]

상기 R₁은 수소원자, 할로겐원자, C_1-6 저급 알킬기, C_1-6 저급 알콕시기 및 니트로기로 구성된 군으로부터 선택되고,

상기 R₂는 다음 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 치환기 중 어느 하나이다.

[화학식 1]

,

[화학식 2]

상기 일반식 1에서 R₁은 구체적으로 수소원자, 할로겐원자, C_1-3 저급 알킬기, C_1-3 저급 알콕시기 및 니트로기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 일반 식1에서 R₁은 보다 구체적으로 수소원자, 할로겐원자, 메틸기, 메톡시기 및 니트로기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 일반식 1로 표시되는 화합물 군 중 가장 구체적인 화합물로서,

상기 R₂가 화학식 1로 표시되는 치환기인 화합물로는 N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4a), 4-((4-((5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4b), 4-((4-((5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4c), 4-((4-((5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4d), N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-5-메틸-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4e), N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-5-메톡시-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4f), 또는 4-((4-((7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4g)이 있고;

상기 R₂가 화학식 2로 표시되는 치환기인 화합물로는 N-히드록시-4-((3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)벤즈아미드 (6a), 4-((5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (6b), 4-((5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (6c), 4-((5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메닐)-N-히드록시벤즈아미드 (6d), N-히드록시-4-((3-(히드록시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메일)벤즈아미드 (6e), N-히드록시-4-((3-(히드록시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)벤즈아미드 (6f), 4-((7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (6g), 또는 N-히드록시-4-((3-(히드록시이미노)-5-니트로-2-옥소인돌린-1-일)메틸)벤즈아미드 (6h)가 있다.

상기 일반식 1로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 일반식 1의 구조를 갖는 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 1의 구조를 갖는 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 상기의 일반식 1의 구조를 갖는 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 일반 1의 구조를 갖는 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 여러 화합물들은 반응식 1 및 2의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다.

본 발명의 몇몇 화합물들은 반응식들의 범주에 포함되지 않는 과정에 따라 합성되었으며, 이러한 화합물들에 대한 상세한 합성 과정은 이들 각각의 실시예에 설명되어 있다.

[반응식 1]

트리아졸 ( triazole ) 연결을 통한 2- 옥소인돌린 (2- oxoindoline ) 성분을 포함하는 N- 히드록시벤즈아미드 (N-hydroxybenzamide)의 합성

제 1 단계에서, 이사틴(isatin) 또는 이의 5- 또는 7- 치환 유도체를 알칼리 조건 (K₂CO₃)하에 디메틸포름아미드 중에서 프로파르길 브로마이드(propargyl bromide)와 몰 당량으로 반응시키면 프로파르길 중간체(propargyl intermediate) 2a-g가 갈색 고형물로서 거의 정량적인 수율로 수득된다. 이어서, 아세토니트릴 용매 중 CuI에 의해 촉매화 된, 프로파르길 중간체 2a-g와 메틸 4-아지도메틸벤조에이트(4-azidomethylbenzoate) 사이의 클릭 반응에 의해 에스테르 3a-g이 양호한 수율로 수득된다. 최종적으로, N-히드록시벤즈아미드 4a-g는 용매계로서 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofurane)과 메탄올의 혼합물에서 알칼리 조건하에 에스테르 3a-g와 염화히드록실 암모늄(hydroxylamine hydrochloride) 사이의 친핵성 아실 치환에 의해 수득된다. 상기 반응을 통하여 본원 발명의 목적 화합물인 N-히드록시벤즈아미드(4a-g)를 적당한 총 수율로 수득할 수 있다.

[반응식 2]

2- 옥소인돌린 (2- oxoindoline ) 성분을 포함하는 신규한 N- 히드록시벤즈아미드 (N- hydroxybenzamide )의 합성

본원발명의 N-히드록시벤즈아미드 6a-h는 반응식 2에 기재된 바와 같이 2-단계 경로를 사용하여 합성할 수 있다.

제 1 단계에서, 이사틴(isatin), 또는 이의 5- 또는 7- 치환 유도체를 몰 당량으로 4-브로모메틸벤조에이트와 디메틸포름아미드에서 염기성 조건 하에(K₂CO₃) 촉매량의 KI와 반응시키면 거의 정량적인 수율로 갈색 오일로서 에스테르 중간체 5a-h가 수득된다.

에스테르 중간체 5a-h는 4a-g의 합성을 위해 적용된 것과 유사하게 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofurane)과 메탄올의 혼합물에서 알칼리 조건하에 히드록실아민 염화히드록실 암모늄(hydroxylamine hydrochloride)과의 반응에 추가로 더 적용되어 중급 내지는 우수한 수율로 본원 발명의 목적 화합물인 히드록삼산 (6a-h)을 수득할 수 있다.

따라서 본 발명에서는 상기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시벤즈아미드계 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 상기 제조방법으로 얻어진 일반식 1의 화합물들은 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC, histone deacetylase)에 대한 강력한 억제작용을 나타내므로, 암을 치료 또는 예방할 수 있는 치료제로서의 유용함을 확인하였다.

본 발명에서 상기 암은 간암, 위암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 및 폐암 등을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시벤즈아미드계 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 일반식 1로 표시되는 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “히스톤 탈아세틸화 효소 억제제(HDAC inhibitor, HDACi, histone deaceylase inhibitor)”는 히스톤의 ε-N-아세틸 라이신 아미노산에서 아세틸 그룹(O=C-CH₃)을 제거하여 히스톤이 DNA를 더 단단히 감쌀 수 있도록 하는 효소군인 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC, histone deaceylase)를 억제하는 화합물을 말한다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 신경 안정제와 항 경련제와 같은 정신과 및 신경계에서 오랫동안 사용되어 왔으나, 최근에는 암, 기생충성 질환 및 염증성 질환에 대한 가능한 치료제로서 사용되고 있다.

이와 관련하여 많은 연구들에서 암세포에서 유전자 지놈 수준에서 단일 아세틸화와 삼중 메틸화의 전체적인 감소가 나타나고, 암 종양에서 HDAC의 비정상적 발현이 발견되며 HDAC1, 5, 7이 종양의 바이오마커로 이용되었다는 결과를 나타내고 있다. 또한 여러 암종(전립선, 대장암, 유방암, 폐암, 간암, 위암 등)에서 HDAC 과발현이 무병율(disease-free), 전체 생존율(overall survival)을 상당히 감소시켰고, 예후가 상당히 좋지 않다는 결과들이 제시되고 있다. 따라서 히스톤의 탈아세틸화는 다양한 암종의 발병에 중요한 메커니즘으로 인식되고 있으며, 이의 활성을 억제하는 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제(HDACi)는 다양한 암종의 항암제로서 사용될 수 있음이 일반적으로 인식되고 있다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 화합물이 작용하여 암을 치료 및 예방하는 정확한 기작은 아직까지 분명하지 않지만, 후성(epigenetic) 유전학적 경로가 제안된다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 p53 종양 억제 인자 활성의 조절자인 p21 (WAF1) 발현을 유도 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 최근 자료에 따르면 HDAC 및 DNA 메틸화를 매개로하는 염색질 불활성화가 인간 유방암 세포에서 ERα 사일런싱(ERα silencing)의 중요한 구성 요소임을 나타낸다.

"고전적(Classical)" 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 HDAC의 아연 함유 촉매 도메인에 결합함으로써 클래스 I, II 및 클래스 IV HDAC에서만 독점적으로 작용한다. 이러한 고전적 HDI는 아연 이온에 결합하는 화학적 부분에 따라 여러 그룹으로 분류할 수 있고(티올 그룹으로 아연 이온에 결합하는 고리 형 테트라 펩타이드 제외), 전형적인 아연 결합 친화력이 감소하는 순서의 일부 예로는 다음과 같은 것들이 있다:

1. 히드록시 아마이드 산 (또는 히드삼산), 예컨대 트리코 스타틴 A

2. 시클릭 테트라 펩타이드 (트라톡신 B 등) 및 뎁시펩티드,

3. 벤즈아미드,

4. 친전자성 케톤 및

5. 페닐 부티레이트 및 발프로익 산과 같은 지방산 화합물.

"2 세대" 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 하이드록삼산인 보리노스타트 (SAHA), 베리노스타트 (PXD101), LAQ824 및 파노비노스타트 (LBH589); 및 벤즈아미드인 엔티노스타트 (MS-275), CI994, 및 모세티노스타트 (MGCD0103) 등이 있다.

또한, 시르투인 클래스 III HDAC는 NAD+에 의존적이어서 니코틴아미드 뿐만 아니라 NAD, 다이히드로쿠마린(dihydrocoumarin), 나프토피라논(naphthopyranone) 및 2- 시드록시나프트알데하이드(hydroxynaphthaldehydes)의 유도체에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 “예방”이란 본 발명의 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 암의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물의 투여로 암을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 인간뿐만 아니라 암이 발병할 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물에게도 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제로 유용한 신규한 N-히드록시벤즈아미드 계 화합물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 화합물은 암의 치료 및 예방을 위한 약제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 현재까지 알려진 HDAC 억제제의 종류를 나타낸 도이다.
도 2는 SAHA의 X 선 구조(적색)와 재-도킹 구조(노란색)의 중첩 및 HDAC2 결합 사이트와의 잠재적 상호 작용을 나타낸 도이다. SAHA와 재-도킹 된 SAHA의 아연 이온 (진회색 구슬)에서 카보닐 산소까지의 거리는 각각 2.33과 2.39A이며 수산기의 산소까지의 거리는 각각 1.96과 2.33A이다.
도 3은 HDAC2 결합 부위에 도킹된 본 발명의 화합물 4a-g, 6a-h 및 참조 화합물 SAHA를 중첩하여 나타낸 도이다. 화합물은 스틱 모델로 표현하였다.
도 4는 수소 결합의 접촉 표면으로 나타낸 HDAC2의 결합 포켓에 대한 화합물 4d 및 4e의 시뮬레이션 된 도킹 포즈를 나타낸 도이다. 아연 이온은 어두운 회색 구체로 표시되고, 활성 부위의 잔기는 스틱 모델로 표시되며, 수소 및 π-π 결합은 각각 검은 색 및 검은 색 점선으로 표시된다.
도 5는 수소 결합의 접촉 표면으로 나타낸 HDAC2의 결합 포켓에 대한 화합물 6f 및 6g의 시뮬레이트 된 도킹 포즈를 나타낸 도이다. 아연 이온은 어두운 회색 구체로 표시되고, 활성 부위의 잔기는 막대기 표현으로 표시되며, 수소 및 π-π 결합은 각각 검정색 및 자주색 점선으로 표시된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료

화학시약 및 장비

모든 시약 및 용제는 시그마 알드리치사, 플루카 케미컬사(Fluka Chemical Corp., Milwaukee,WI,USA) 또는 머크사(Merck)에서 구입하였다. 용매는 달리 명시하지 않은 한 구매한 그대로 사용하였다. 박막 크로마토그래피는 Whatman® 250 μm Silica Gel GF Uniplates를 사용하여 수행하였고, 254 및 365 nm의 자외선 하에서 가시화하여 반응의 진행 및 화합물의 동질성(homogeneity)에 대해 예비 평가하였다. 모든 경우에서, 생성된 화합물은 HPLC 방법으로 추정한 결과 97 % 이상의 순도를 달성하였다. 융점(melting point)은 Gallenkamp Melting Point Apparatus (LabMerchant, London, United Kingdom)를 사용하여 측정하였으며 보정하지 않았다. 화합물의 정제는 결정화 방법 및/또는 머크 실리카 겔 60 (240 내지 400 메쉬)을 고정상으로 사용하는 오픈 플래쉬 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 핵 자기공명 스펙트럼 (¹H NMR)은 달리 명시하지 않는 한, 용매로 DMSO-d₆을 사용하여 Bruker 500 MHz 분광기상에서 기록하였으며, 테트라메틸실란(tetramethylsilane)을 내부 표준으로 사용하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 테트라메틸실란을 기준으로 백만 분의 1(ppm) 단위로 보고하였다. 전자 이온화 (EI, electron ionization), 전자 스프레이 이온화 (ESI, electrospray ionization)를 포함하는, 서로 다른 이온화 방식에 따른 질량스펙트럼(mass spectra)은 PE Biosystems API2000 (Perkin Elmer, Palo Alto, CA, USA)과 Mariner® (Azco Biotech, Inc.Oceanside, CA, USA) 질량 분석기(mass spectrometer)를 각각 사용하여 기록하였다.

실험방법

본 발명의 화합물 4a-g의 합성

1 mmol의 화합물 1a-g를 DMF(diemethylformamide) (3 mL)에 용해시킨 용액에 K₂CO₃ (165.5 mg, 1.2 mmol)를 첨가 하였다. 생성된 혼합물을 80 ℃에서 1시간 동안 교반한 후, KI (8.3 mg, 0.05 mmol)를 첨가하였다. 추가로 15분 동안 교반한 후, 80% 농도의 프로파르길 브로마이드 톨루엔 용액 0.15 ml를 천천히 상기 혼합물에 적하하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 생성된 혼합물을 냉각시키고, 얼음물에 부은 다음, pH 약 4로 산성화시켰다. 형성된 오렌지색 고체를 여과하고 건조시켜 화합물 2a-g을 얻었으며, 이를 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

상기 화합물 2a-g 및 1 mmol의 메틸 4-아지도메틸벤조에이트를 아세토니트릴(2 mL)에 용해시킨 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, CuI (19.1 mg, 0.1 mmol)를 첨가하였다. 반응이 완료될 때까지(12-24 시간) 혼합물을 50 ℃에서 교반하였다. 생성된 혼합물을 감압 하에 증발시켜 잔류물을 수득하고, 이를 50 ml의 DCM(dichloromethane)에 재용해시켰다. 혼합물을 여과하고 DCM 층을 감압 하에 증발시켜 화합물 3a-g을 수득하였다. 화합물 3a-g을 메탄올/테트라하이드로퓨란 (2/1, 5 ml)의 혼합 용액에 용해시켰다. 이어서, 히드록실아민·HCl (685 mg, 10 mmol)을 첨가한 후, NaOH 용액 (1 mL의 물 중 400 mg)을 적하하였다. 반응이 완료될 때까지 혼합물을 실온에서 교반하였다. 생성된 혼합물을 얼음물에 넣고, pH 약 7로 중화시킨 뒤, HCl 5 % 용액으로 산성화시켜 침전을 유도하였다. 침전물을 여과하고, 건조한 뒤, 메탄올로부터 재결정화하여 본 발명의 화합물 4a-g을 수득하였다.

상기 화합물 4a-g의 화합물명 및 이들의 물성은 다음과 같다.

N - Hydroxy -4-((4-((3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl) benzamide (4a)

Yellow solid; Yield: 67.3%. mp: 176.5-178.0 ^oC. R _f = 0.34 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR (KBr, cm ^-1 ): 3381 (NH), 3170 (OH), 3036 (C-H, aren), 2954, 2853 (CH, CH₂),1694,1639(C=O),1604(C=C),1460(C-N).ESI-MS (m/z): 391 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 13.40 (1H, s, NOH); 11.19 (1H, s, NH); 9.05 (1H, s, OH); 8.19 (1H, s, H-9); 7.99 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’); 7.71 (2H, d, J = 7.75 Hz, H-2, H-6); 7.39 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6’); 7.31 (2H, d, J = 7.75 Hz, H-3, H-5); 7.11 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7’); 7.07 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’); 5.60 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.99 (2H, s, H-10a, H-10b). ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 163.55, 162.75, 143.40, 142.56, 142.27, 138.87, 132.55, 131.89, 127.77, 127.27, 126.85, 123.71, 122.73, 115.30, 109.60, 52.37, 34.64. Anal. Calcd. for C₁₉H₁₆N₆O₄(392.12):C, 58.16; H, 4.11; N, 21.42. Found: C, 58.21; H, 4.17; N, 21.35.

4-((4-((5- Fluoro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)- N- hydroxybenzamide (4b)

Yellow solid; Yield: 70%. mp: 190.0-191.5 ^oC. R _f = 0.40 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3419 (NH), 3197 (OH), 3045 (C-H, aren), 2921, 2852 (CH, CH₂),1695,1642(C=O),1619(C=C),1473(C-N).ESI -MS (m/z): 409 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 13.77 (1H, s, NOH); 11.20 (1H, s, NH); 9.04 (1H, s, OH); 8.19 (1H, s, H-9); 7.75 (1H, dd, J = 8.25 Hz, J’ = 2.75 Hz, H-4’); 7.71 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-2, H-6); 7.32 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-3, H-5); 7.28 (1H, td, J = 9.25 Hz, J’ = 2.75 Hz, H-6’); 7.13 (1H, dd, J = 8.5 Hz, J = 4.00 Hz, H-7’); 5.60 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.99 (2H, s, H-10a, H-10b). ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 163.79, 162.63, 158.96, 157.07, 143.13, 142.13, 138.88, 132.57, 127.80, 127.30, 123.75, 118.12, 115.80, 113.86, 110.69, 52.40, 34.79. Anal. Calcd. for C₁₉H₁₅FN₆O₄(410.11):C, 55.61; H, 3.68; N, 20.48. Found: C, 55.58; H, 3.63; N, 20.52.

4-((4-((5- Chloro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)- N- hydroxybenzamide (4c)

Yellow solid; Yield: 68%. mp: 198.0-199.0 ^oC. R _f = 0.43 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3429 (NH), 3204 (OH), 3040 (C-H, aren), 2856 (CH, CH₂),1696,1642(C=O),1610(C=C),1466(C-N).ESI -MS (m/z): 425 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 13.82 (1H, s, NOH); 11.19 (1H, s, NH); 9.03 (1H, s, OH); 8.19 (1H, s, H-9); 7.95 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-4’); 7.71 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-2, H-6); 7.48 (1H, dd, J = 8.5 Hz, J = 1.5 Hz, H-6’); 7.32 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-3, H-5); 7.15 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’); 5.60 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.99 (2H, s, H-10a, H-10b). ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 163.79, 162.42, 142.68, 142.04, 141.34, 138.84, 132.58, 131.36, 127.80, 127.30, 126.58, 126.13, 123.72, 116.43, 111.23, 52.40, 34.81. Anal. Calcd. for C₁₉H₁₅ClN₆O₄(426.08):C, 53.47; H, 3.54; N, 19.69. Found: C, 53.51; H, 3.52; N, 19.65.

4-((4-((5- Bromo -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)- N- hydroxybenzamide (4d)

Yellow solid; Yield: 65%. mp: 203.5-204.5 ^oC. R _f = 0.45 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3425 (NH), 3231 (OH), 2921, 2854 (CH, CH₂),1719,1637(C=O),1607(C=C),1464(C-N).ESI -MS (m/z): 469 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 13.82 (1H, s, NOH); 11.18 (1H, s, NH); 9.03 (1H, s, OH); 8.19 (1H, s, H-9); 8.08 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4’); 7.71 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6); 7.61 (1H, dd, J = 8.5 Hz, J = 2.0 Hz, H-6’); 7.32 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5); 7.10 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’); 5.59 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.99 (2H, s, H-10a, H-10b). ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 163.79, 162.31, 142.56, 142.03, 141.74, 138.85, 134.20, 132.58, 128.84, 127.82, 127.31, 123.73, 116.88, 114.24, 111.75, 52.41, 34.80. Anal. Calcd. for C₁₉H₁₅BrN₆O₄(471.27):C, 48.42; H, 3.21; N, 17.83. Found: C, 48.47; H, 3.24; N, 17.80.

N - Hydroxy -4-((4-((3-( hydroxyimino )-5-methyl-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)benzamide (4e)

Yellow solid; Yield: 59%. mp: 204.5-206.0 ^oC. R _f = 0.30 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3405 (NH), 3192 (OH), 3035 (C-H, aren), 2858 (CH, CH₂),1693,1643(C=O),1619(C=C),1476(C-N).ESI -MS (m/z): 429 [M+Na]⁺,407[M+H]⁺. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 9.04 (1H, s, OH); 8.16 (1H, s, H-9); 7.83 (1H, s, H-4’); 7.70 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6); 7.31 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5); 7.20 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-6’); 6.99 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-7’); 5.59 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.96 (2H, s, H-10a, H-10b); 2.27 (3H, s, CH₃). ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 162.79, 143.55, 142.34, 140.33, 138.88, 132.57, 132.09, 131.79, 127.80, 127.38, 127.28, 123.66, 115.36, 109.38, 52.37, 34.66, 20.50. Anal. Calcd. for C₂₀H₁₈N₆O₄(406.14):C, 59.11; H, 4.46; N, 20.68. Found: C, 59.14; H, 4.49; N, 20.71.

N - Hydroxy -4-((4-((3-( hydroxyimino )-5- methoxy -2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)benzamide (4f)

Yellow solid; Yield: 52%. mp: 172.5-174.0 ^oC. R _f = 0.41 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3393 (NH), 3193 (OH), 3037 (C-H, aren), 2920, 2850 (CH, CH₂),1707,1662(C=O),1598(C=C),1438(C-N).ESI -MS (m/z): 421 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 8.17 (1H, s, H-9); 7.71 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-2, H-6); 7.59 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4’); 7.31 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-3, H-5); 7.03-6.96 (2H, m, H-6’, H-7’); 5.59 (2H, s, H-7a, H-7b); 4.95 (2H, s, H-10a, H-10b); 3.73 (3H, s, OCH₃). ¹³ CNMR (125MHz,DMSO-d ₆ , ppm): δ 162.68, 155.22, 143.64, 142.37, 138.86, 136.12, 132.50, 129.29, 127.79, 127.27, 123.67, 116.75, 115.90, 113.01, 110.19, 52.64, 52.36, 34.68. Anal. Calcd. for C₂₀H₁₈N₆O₄(422.13):C, 56.87; H, 4.30; N, 19.90. Found: C, 56.85; H, 4.28; N, 19.92.

4-((4-((7- Chloro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)-1 H -1,2,3- triazol -1- yl )methyl)- N- hydroxybenzamide (4g)

Yellow solid; Yield: 67%. mp: 197-198.56 ^oC. R _f = 0.42 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR (KBr, cm ^-1 ): 3223 (OH), 3171 (C-H, aren), 2959, 2858 (CH, CH₂),1704,1635(C=O),1603(C=C),1469(C-N).ESI-MS (m/z): 425 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO -d ₆ , ppm): δ 11.20 (1H, s, NH); 9.06 (1H, s, OH); 8.15 (1H, s, H-9); 8.07 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’); 7.71 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-2, H-6); 7.39 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6’); 7.29 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-3, H-5); 7.10 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’); 5.60 (2H, s, H-7a, H-7b); 5.32 (2H, s, H-10a, H-10b). ¹³ CNMR(125MHz,DMSO-d ₆ , ppm): δ 163.68, 143.80, 142.17, 139.01, 138.35, 133.66, 132.50, 127.61, 127.26, 125.77, 124.23, 122.98, 118.34, 114.75, 52.38, 37.05. Anal. Calcd. for C₁₉H₁₅ClN₆O₄(426.08):C, 53.47; H, 3.54; N, 19.69. Found: C, 53.53; H, 3.50; N, 19.67.

본 발명의 화합물 6a-h의 합성

화합물 1a-g (147 mg, 1 mmol)을 DMF (3 mL)에 용해시킨 용액에 K₂CO₃ (165.5 mg, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 45분 동안 교반한 후, KI (8.3 mg, 0.05 mmol) 및 메틸 4-브로모메틸벤조에이트 (229 mg, 1 mmol)을 DMF (1 mL)에 용해시킨 용액을 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 생성된 혼합물을 냉각시키고, 얼음물(20 mL)에 부은 다음, pH 약 4로 산성화시켜 침전을 유도하였다. 침전물을 여과하고 건조시켜 주황색 고체 (화합물 5a-g)를 얻었으며, 이를 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

상기에서 얻은 주황색 고체 화합물 5a-g를 메탄올/테트라하이드로퓨란 혼합 용액(2/1, 10 ml)에 용해시키고 혼합물을 0 ℃로 냉각시켰다. 이어서, 히드록실아민·HCl (685 mg, 10 mmol)을 첨가한 후, NaOH 용액 (1 mL의 물 중 400 mg)을 적하하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 후, 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, pH 약 7로 중화시켜 황색 고체를 수득하였다. 침전물을 여과하고, 건조시킨 다음, 메탄올로부터 재결정화시켜 본 발명의 화합물 6a-h을 수득하였다.

상기 화합물 6a-h의 화합물명 및 이들의 물성은 다음과 같다.

N - Hydroxy -4-((3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl) benzamide (6a)

Yellow solid; Yield: 80 %, mp: 167.0-168.5 ^oC; R _f = 0.55 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3205 (OH), 3045 (C-H, aren), 2854 (CH, CH₂),1721(C=O),1606(C=C),1435(C-N).ESI -MS (m/z): 310 [M-H]^-. ¹ H-NMR(500MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 13.54 (1H, s, NOH), 11.17 (1H, s, NH), 8.01 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.71 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6), 7.39 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5), 7.36 (1H, td, J = 8.0 Hz, J’ = 1.0 Hz, H-6’), 7.08 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.97 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7’), 4.99 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 163.92, 163.23, 143.39, 142.61, 139.37, 132.03, 131.97, 127.30, 127.13, 126.97, 122.87, 115.35, 109.50, 42.28. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₃N₃O₄(311.09):C, 61.73; H, 4.21; N, 13.50. Found: C, 61.75; H, 4.24; N, 13.47.

4-((5- Fluoro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)- N - hydroxybenzamide (6b)

Yellow solid; Yield: 89 %, mp: 166.5-167.5 ^oC; R _f = 0.57 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3232 (OH), 3068 (C-H, aren), 2899 (CH, CH₂),1708,1652(C=O),1474(C-N).ESI -MS (m/z): 328 [M-H]^-. ¹ H-NMR(500MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 13.82 (1H, s, NOH), 11.17 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH), 7.90 (1H, d, J _H-4’-F=6.0Hz,H-4’),7.787.70(2H,m,H-2,H-6),7.437.40(2H,m,H-3,H-5),7.24(1H,s,H-6’),6.97(1H,s,H-7’),4.99(2H,s,H-7a,H-7b); ¹³ CNMR(125MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 166.98, 163.93, 163.13, 159.02, 157.13, 143.12, 141.05, 139.19, 138.93, 132.08, 130.02, 129.75, 127.33, 127.27, 127.15, 118.28, 118.09, 115.94, 115.86, 114.13, 113.92, 110.57, 110.51, 42.42. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₂FN₃O₄(329.08):C, 58.36; H, 3.67; N, 12.76. Found: C, 58.38; H, 3.68; N, 12.74.

4-((5- Chloro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)- N - hydroxybenzamide (6c)

Yellow solid; Yield: 82%, mp: 172.0-173.5 ^oC;R _f = 0.48 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3408 (NH), 3269 (OH), 2866 (CH, CH₂),1712,1666(C=O),1610(C=C),1466(C-N).ESI -MS (m/z): 346 [M+H]⁺. ¹ H-NMR(500MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 11.19 (1H, s, NH), 9.04 (1H, s, OH), 7.98 (1H, s, H-4’), 7.70 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6), 7.43 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6’), 7.38 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5), 6.98 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’), 4.99 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 163.04, 142.76, 141.41, 139.13, 132.11, 131.48, 129.69, 127.40, 127.20, 126.80, 126.31, 116.61, 111.15, 42.50. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₂ClN₃O₄(345.05):C, 55.58; H, 3.50; N, 12.15. Found: C, 55.56; H, 3.52; N, 12.19.

4-((5- Bromo -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)- N - hydroxybenzamide (6d)

Yellow solid; Yield: 75%, mp: 178.0-179.0 ^oC; R _f = 0.51 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3265 (NH), 3215 (OH), 3054 (C-H, aren), 2855 (CH, CH₂),1711,1664(C=O),1606(C=C),1463(C-N). ESI -MS (m/z): 388 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 13.88 (1H, s, NOH), 11.18 (1H, s, NH), 8.10 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4’), 7.70 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6), 7.55 (1H, dd, J = 8.25 Hz, J’ = 2.0 Hz, H-6’), 7.38 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5), 6.94 (1H, d, J = 8.25 Hz, H-7’), 4.98 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR(125MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 163.80, 162.81, 142.55, 141.76, 139.00, 134.23, 132.07, 128.97, 127.31, 127.10, 116.96, 114.35, 111.56, 42.41. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₂BrN₃O₄(389.00):C, 49.25; H, 3.10; N, 10.77. Found: C, 49.27; H, 3.17; N, 10.72.

N - Hydroxy -4-((3-( hydroxyimino )-5-methyl-2- oxoindolin -1- yl )methyl) benzamide (6e)

Yellow solid; Yield: 77%, mp: 159.5-160.5 ^oC; R _f = 0.53 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3227 (OH), 3073 (C-H, aren), 2920, 2863 (CH, CH₂),1712(C=O),1616(C=C),1479(C-N). ESI -MS (m/z): 324 [M-H]^-. ¹ H-NMR(500MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 13.50 (1H, s, NOH), 11.16 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH), 7.85 (1H, s, H-4’), 7.69 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, H-6), 7.37 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5), 7.16 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-6’), 6.85 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-7’), 4.96 (2H, s, H-7a, H-7b), 2.26 (3H, s, CH₃); ¹³ CNMR (125MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 163.95, 163.25, 143.53, 140.39, 139.45, 132.16, 131.94, 129.72, 127.52, 127.29, 127.10, 115.40, 109.29, 42.29, 20.05. Anal. Calcd. for C₁₇H₁₅N₃O₄(325.11):C, 62.76; H, 4.65; N, 12.92. Found: C, 62.73; H, 4.68; N, 12.94.

N - Hydroxy -4-((3-( hydroxyimino )-5- methoxy -2- oxoindolin -1- yl )methyl) benzamide (6f)

Yellow solid; Yield: 65%, mp: 165.5-167.5 ^oC; R _f = 0.48 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3212 (OH), 2897 (CH, CH₂),1704,1630(C=O),1437(C-N).ESI -MS (m/z): 340 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 13.59 (1H, s, NOH), 11.17 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH); 7.70 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-2, H-6), 7.60 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-4’), 7.38 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-3, H-5), 6.94 (1H, dd, J = 8.5 Hz, J’ = 2.5 Hz, H-6’), 6.87 (1H, d, J = 8.5 Hz); 4.95 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 163.98, 163.13, 155.33, 143.667, 139.47, 136.23, 132.02, 129.73, 127.31, 127.13, 116.90, 115.94, 113.29, 110.14, 55.67, 42.35. Anal. Calcd. for C₁₇H₁₅N₃O₅(341.10):C, 59.82; H, 4.43; N, 12.31. Found: C, 59.85; H, 4.46; N, 12.28.

4-((7- Chloro -3-( hydroxyimino )-2- oxoindolin -1- yl )methyl)- N - hydroxybenzamide (6g)

Yellow solid; Yield: 73%, mp: 167.0-168.5 ^oC; R _f = 0.54 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3384 (NH), 3298 (OH), 3104 (C-H, aren), 2923, 2853 (CH, CH₂),1710,1648(C=O),1603(C=C),1444(C-N).ESI -MS (m/z): 344 [M-H]^-. ¹ H-NMR( 500MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 13.91 (1H, s, NOH), 11.16 (1H, s, NH), 9.00 (1H, s, OH), 8.10 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4’), 7.70 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-2, H-6), 7.38 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6’), 7.28 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-3, H-5), 7.12 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5’), 5.32 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 164.04, 163.92, 142.13, 140.78, 138.41, 133.80, 131.65, 127.24, 125.98, 125.88, 124.43, 118.30, 114.56, 44.02. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₂ClN₃O₄(345.05):C, 55.58; H, 3.50; N, 12.15. Found: C, 55.56; H, 3.52; N, 12.19.

N - hydroxy -4-((3-( hydroxyimino )-5-nitro-2- oxoindolin -1- yl )methyl) benzamide (6h)

Yellow solid; Yield: 72 %, mp: 182.0-183.0 ^oC;Rf = 0.40 (DCM : MeOH = 9 : 1). IR ( KBr , cm ^-1 ): 3315 (NH), 3209 (OH), 2879 (CH, CH₂),1716,1655(C=O),1614(C=C),1470(C-N).ESI -MS (m/z): 355 [M-H]^-. ¹ H-NMR(500MHz,DMSO-d ₆ ,ppm): δ 14.22 (1H, s, NOH), 11.18 (1H, s, NH), 8.72 (1H, s, H-4’), 8.31 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-6’), 7.72 (2H, d, J = 7.75 Hz, H-2, H-6), 7.42 (2H, d, J = 7.75 Hz, H-3, H-5), 7.20 (1H, d, J = 7.75 Hz, H-7’), 5.08 (2H, s, H-7a, H-7b); ¹³ CNMR ( 125MHz,DMSO - d ₆ ,ppm ): δ 168.47, 163.47, 147.73, 142.65, 142.06, 138.56, 132.13, 128.24, 127.31, 127.09, 126.88, 121.52, 115.30, 109.74, 42.74. Anal. Calcd. for C₁₆H₁₂BrN₃O₄(356.08):C, 53.94; H, 3.39; N, 15.73 Found: C, 53.91; H, 3.37; N, 15.73.

상기 최종 생성물의 구조는 IR, MS, ¹H NMR 및 ¹³C NMR을 포함한 분광법을 사용하여 직접 결정하였다. 히드록실 아민은 에스테르 3-g 및 5a-h의 인돌린 부분에서 3 번 위치의 에스테르 및 3- 옥소 그룹 모두에서 반응하여 3-하이드록시이미노-2-옥소인돌린 N-히드록시벤즈아미드(3-hydroxyimino-2-oxoindoline N-hydroxybenzamide) 4a-g 및 6a-h를 생성하는 것이 발견되었다. 이것은 질량 분광 데이터뿐만 아니라 NMR 분광 광도 데이터로부터도 입증되었다. 화합물 4a-g 및 6a-h의 ¹³C NMR 스펙트럼에서, 인돌린 고리상의 3-옥소 탄소에 대해 할당 가능한 피크는 관찰되지 않았다. 인돌린 고리상의 3-옥소기가 여전히 존재한다면, ¹³C NMR 스펙트럼에서 δ- 184.00-188.00 ppm 부근에 대응하는 3- 옥소 카본이 나타나야한다 [21]. 한편, 화합물 4 및 6에서는 범위 내 피크 아마이드 및 옥심 부분에 기인하는 162.00-168.00 ppm의 양이 관찰되었다. 화합물 4a-g 및 6a-h의 1H NMR 스펙트럼에서, H-4 '의 하향 이동 (δ 8.04-7.75 ppm)이 명확하게 관찰되었다. H-4의 하향 이동은 인돌린 고리상의 3 번 위치에 히드록시 이미노기가 존재함을 나타낸다 [21]. 추가적으로, DMSO-d₆에서 측정 된 화합물 4a-g 및 6a-h의 ¹H NMR 스펙트럼은 일반적으로 δ 13.82-13.50, 11.18-11.15 및 9.02-9.00 ppm 부근에 3 개의 넓은 단일항을 나타내었는데(showed three broad singlets around), 이는 -OH (인돌린 고리상의 3-히드록시이미노 잔기의) 및 NH, -OH (히드록삼산 잔기의)이다. 이 모든 증거들은 인돌린 부분에 3-히드록시 이미노기가 존재함을 확인시켜 주었다. 인돌린 고리상의 3-옥소기와 에스테르기에서 히드록실아민의 동시 반응은 이전에 동일한 조건 하에서 관찰되었다 [21]. 인돌린 고리상의 3- 옥소기와 히드록실 아민의 축합 반응은 히드록실아민 대 화합물 3a-g 또는 5a-h의 몰 당량이 사용되는 경우에도 쉽게 진행되었다. 히드록실아민 HCl은 상응하는 에스테르 중간체에 대해 1 : 1 몰 당량으로 사용하면, 미반응 출발 물질 (에스테르)과 함께 많은 생성물의 혼합물이 관찰되어, 본원 발명의 목적 생성물 4a- g 및 6a-h를 분리하기 어려워짐을 알 수 있었다.

세포독성 시험 방법( Cytotoxicity assay)

SW620 (결장암), PC3 (전립선 암) 및 AsPC-1 (췌장암)을 포함하는 세 가지 인간 암 세포주에 대하여 합성된 화합물의 세포 독성을 평가하였다. 상기 세포주는 한국생명공학연구원 (KRIBB)의 암세포 은행 (Cancer Cell Bank)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용된 배지, 혈청 및 기타 시약은 GIBCO Co. Ltd. (Grand Island, New York, USA)에서 입수하였다. 상기 세포들은 콘플루언시(confluency)를 이룰 때까지 DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 트립신 처리하고 3x10⁴ 세포/mL의 개수로 세포 배양 배지에 현탁시켰다. 0일째에, 96-웰 플레이트의 각 웰에 180 μL의 세포 현탁액을 분주하였다. 그런 다음 96-웰 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 화합물(4a-g 및 6a-h)은 초기에 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 뒤, 배양 배지(DMEM)를 이용해 적절한 농도로 희석시켜 준비하였다. 그런 다음 세포현탁액을 접종하여 24 시간 동안 배양한 96-웰 플레이트의 각 웰에 준비한 각 화합물 시료 20 μL를 다양한 농도로 첨가하였다. 96-웰 플레이트는 48 시간 동안 추가 배양하였다. 화합물의 세포 독성은 선행문헌 [24]에서 사용한 방법을 약간 변형한 비색법(colorimetric method)에 의해 측정하였다 [25,26]. IC₅₀ 값은 Probits 방법 [27]을 사용하여 계산하였고 세 가지 독립적인 측정 값의 평균값(SD ≤ 10 %)이었다.

HDAC2 효소 시험 방법( HDAC2 enzyme assay)

HDAC2 효소는 BPS Bioscience (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. HDAC 효소 시험은 Fluorogenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. HDAC2 효소를 비히클과 함께 또는 분석된 샘플이나 SAHA의 다양한 농도에서 HDAC 형광측정용 기질(fluorimetric substrate)의 존재 하에 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. HDAC assay developer(반응 혼합물에서 형광물질을 생성)를 첨가하고 VICTOR3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 360 nm에서 여기하고, 460 nm에서 방출되는 형광을 측정하였다. 측정된 활성을 비히클-처리된 대조군 효소 활성도에서 뺀 다음, GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

도킹 시험 방법(Docking studies)

도킹 시험는 MOE 2009.10 소프트웨어 [28]를 사용하여 수행하였다. SAHA와 복합체를 이룬 HDAC2 단백질의 3차원 결정 구조는 Protein Data Bank (PDB ID : 4LXZ)에서 입수하였다. 복합체 구조(complex structure)로부터 SAHA를 제거한 후, ICM-pro 3.8-3을 이용하여 효소의 구조를 제작하였다. 효소의 활성 부위는 Pottel et al. [29]에 의해 기술된 아연 금속효소(Zinc metalloenzyme)의 일반적인 촉매적 변형(catalytic transformation)에 따라 적절히 양성자화(protonated) 된 중요한 아미노산 잔기 His145, His146, Asp181, His183 및 Asp269를 포함하였다. 그 후, MOE (0.01A의 RMSD (Root-mean-square deviation)의 수렴 기준)에서 절단된 Newton 방법(truncated Newton method)을 기반으로 AMBER99 force field를 적용하여 결합 사이트를 에너지 최소화하였다. 리간드 준비 절차는 선행문헌 [18-21]에서 언급한 것과 동일한 절차를 따랐다. Zn² ⁺와 착화된 히드록삼산의 이온화 상태가 음성 히드록사메이트 배위(negative hydroxamate coordination)[30]로서 강력히 제안되었기 때문에, 여기에서 그들의 히드록시기는 탈 양성자화(deporotonated) 되었다. 도킹 실험은 MOE Triangle Matcher placement method를 기반으로 수행되었으며 다른 매개 변수는 기본 설정으로 하였고, 각 리간드마다 50 개의 포즈를 보유하도록 하였다. 최소 결합 에너지를 가진 최적의 리간드 배열(형태)을 선택하는 주요 기준으로는 런던 dG 스코어(London dG Score with refinement)를 사용하였다. 또한, 선택된 배열(혈태)은 친화성 dG 스코어링 기능(affinity dG scoring function) [28]을 사용하여 재점수화(rescrored)하였다. 상호작용의 시각화를 위해 모든 수치는 BIOVIA Discovery Studio v.3.5 프로그램 [32]에서 찍은 스냅 샷을 사용하여 작성하였다.

실험결과

본 발명의 화합물의 HDAC2 억제 및 세포독성 결과

합성된 화합물은 상술한 바와 같이 SW620 (결장암), PC3 (전립선암), AsPC-1 (췌장암) 및 NCI-H23 (폐선암종)을 포함하는 4 개의 인간 암 세포주에 대한 세포 독성을 평가 하였다. 이와 병행하여, HDAC2를 사용하여 히스톤 탈아세틸화 효소 억제효과에 대해 평가하였다.

결과는 표 1에 나타내었다.

<합성된 화합물의 HDAC2 활성 저해 및 암세포 주에 대한 세포독성>

¹ChemDraw 9.0 소프트웨어로 계산; ²효소 활성 또는 세포 성장을 50 % 감소시키는 화합물의 농도 (mM)는 10 % 미만의 편차를 갖는 3 회의 실험의 평균 결과를 나타냅니다. ³세포주 : SW620, 결장암; PC3, 전립선암; AsPC-1, 췌장암; NCI-H23, 폐선암종; ⁴SAHA, suberoylanilide acid, 양성 대조군.

HDAC2 억제 결과

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 6a를 제외하고, 모든 다른 화합물은 양성 대조군인 SAHA와 비교할 때 HDAC2에 대해 동등하거나 심지어 우수한 억제 효과를 나타냈다. 또한, 2-옥소인돌린의 5 또는 7 위치에 전자 흡인(electron-withdrawing) 또는 전자 공여 치환기(electron-donating substituent)를 도입하면 모두 유사한 방식으로 HDAC2 억제가 향상된다는 것이 관찰되었다. 나아가 위치 5에서의 치환은 위치 7에서의 치환 (예 : 화합물 6c vs. 화합물 6g, 화합물 4c vs. 화합물 4g)보다 세포 독성에 유리한 것으로 보였다. 표 1에 나타낸 결과로부터, 화합물, 특히 6a-g의 화합물의 세포 독성이 HDAC2 억제와 비교적 상관 관계가 있음을 알 수 있었다. 합성된 화합물 중 가장 활성이 우수한 HDAC2 억제제 중 하나인 화합물 6d는 세포 독성의 IC₅₀ 수치가 1.15에서 1.61 μM 로 나타나 모든 4 가지 암세포주에 대해 가장 우수한 세포 독성 프로파일을 보여주었으며, 이는 SAHA의 세포 독성의 IC₅₀ 수치에 비해 2배 내지 3배 낮은 정도였다. 6b, 6c 및 6e를 포함하는 다른 합성된 화합물들도 또한 우수한 세포 독성을 나타내었다.

이들 화합물을 설계함에 있어서, 본 발명자들은 화합물 6a-g에서 히드록삼산기는 벤질 링커만을 통해 2-옥소인돌린계에 연결되어 있으므로, 화합물 4a-g의 2-옥소인돌린과 히드록삼산 부분(moiety) 사이의 링커의 길이가 화합물 6a-g 보다는 SAHA에서 페닐기와 히드록삼산 부분(moiety) 사이의 링커의 길이와 더 유사하기 때문에, 화합물 4a-g이 화합물 6a-g보다 더 강한 효과를 나타낼 것이라고 예측했었다. 그러나 상기에서 확인한 바와 같이, 화합물 6a-g의 HDAC2 억제 효과는 화합물 6a만을 제외하고 화합물 4a-g의 HDAC2 억제 효과보다 더 강력한 것으로 나타났다. 그와 유사하게, 화합물 6a-g는 일반적으로 세포 독성의 관점에서도 화합물 4a-g보다 더 강력하였다.

도킹 시험 결과

히스톤 -H3 및 히스톤 -H4 탈 아세틸화는 주로 HDAC2와 HDAC3에 의해 조절된다는 것이 입증된 바 있으므로, 본원발명의 화합물과 HDAC 결합 부위 사이의 상호 작용에 대하여 알아보기 위하여 HDAC2와의 도킹 시험을 수행하였다. SAHA (PDB ID : 4LXZ)와 복합체를 이루는 HDAC2의 결정 구조가 기존에 보고된 바 있어(Lauffer et al. [21]), 이 결정 구조를 도킹 템플릿으로 사용하였다.

먼저, 이 화합물과 효소 간의 RMSD(root-mean-square deviation) 값의 평가 및 상호작용에 근거하여 SAHA를 HDAC2 효소의 결합 부위에 재 도킹시킴으로써 리간드 제조 절차 및 도킹 프로토콜의 적합성을 검사 하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 공동-결정화(co-crystallized) 된 SAHA 화합물과 도킹 된 SAHA 화합물의 차이는 크지 않았으며, RMSD 값은 매우 낮았다(수소 결합에 관련된 원자 배위의 경우 0.672, 모든 중금속 배위의 경우 1.127). 또한, Asp104, His145, His146, Asp181 및 Tyr308 잔기와의 수소 결합의 상호작용이 보존됨을 관찰할 수 있었으며, HDAC 억제제의 아연 결합 모티프에서 중요한 역할을 하는 히드록삼산 그룹과 아연 이온 사이의 거리가 유사하게 가까이(<2.5A) 유지됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 프로토콜이 추가 도킹 실험에 사용하기에 적합함을 알 수 있었다.

다음으로 본 발명의 두 종류의 합성된 화합물(4a-g, 6a-h)을 HDAC2 단백질에 도킹시켰다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 도킹 결과는 본 발명의 화합물(4a-g, 6a-h)과 참조 리간드(SAHA) 사이에 유사한 상호 작용 프로필을 나타내었다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 N-히드록시벤즈아미드 구조의 대부분과 수소 결합 네트워크를 형성하는, His145, His146, Asp181 및 Tyr308와 같은, 몇 가지 일반적인 아미노산 잔기가 있음을 알 수 있다. 중요하게, 모든 경우에 히드록삼산기는 HDAC2의 X 선 구조의 활성 부위에서 SAHA와 유사한 방향성(orientation)을 나타내었다. 카르보닐기과 수산기의 산소 원자와 아연 이온 사이의 평균 거리는 약 2.5A이며, 이는 금속을 킬레이트화시키고 효소를 불활성화 시키는 데 유리하다.

소수성 상호 작용에 있어서, 본원발명의 화합물들은 SAHA와는 다른 결과를 나타내었다. 히드록삼산기에 부착 된 방향족 고리와, 모든 화합물 4a-g 및 6a-h는, Phe155 및 Phe210과 같은 터널의 좁은 공동을 구성하는 잔기들과 결합 포켓(binding pocket)에서의 반 데르 발스 상호 작용을 최대화하는 동일한 위치를 선호 하였다. 또한, 캡핑 기의 2 개의 방향족 고리는 Pro34 및 Leu276과 같은 활성 부위의 가장자리에서 다양한 소수성 아미노산과 고도로 상호 작용하였다. 일반적으로 모든 화합물은 SAHA와 비교하여 더 높은 상호 작용을 나타내었다.

한편, SAHA 및 본 발명의 화합물(4a-g, 6a-h)의 도킹 점수는 표 2에 나타내었다.

<합성된 화합물(4a-g 및 6a-h)의 인간 HDAC2에 대한 도킹 결과>

*SAHA: suberoylanilidehydroxamic acid; **아연 이온과 히드록삼산 그룹의 산소 원자(=O and OH)의 거리; ***MOE 소프트웨어의 런던(with refinement) 및 친화성 스코어링 기능으로부터 계산된 도킹 스코어(the docking score, kcal/mol).

표 2에 나타낸 바와 같이, 화합물 4a-g에 대해 런던(London)에 의해 계산된 결합 점수(IC₅₀ 값)는 화합물 4d (-83.5kcal / mol) 및 4e (-80.4kcal / mol)에서 가장 우수한 것으로 나타났다. 친화력 점수(binding affinity)에 대해서도 동일한 결과가 관찰되었다.

화합물 4d 및 4e의 수소 결합 상호 작용에 대해서는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 4d 및 4e는 모두 다수의 수소 결합 상호 작용(Glu208, His145, His146, Tyr308 및 Gly154와 4d 및 Arg275, His145, His146, Tyr308 및 4e)을 수반한다. 흥미롭게도, 화합물 4f 및 4g는 그들의 실험 결과와 일치하는 SAHA (-7.1 kcal / mol)보다 낮은 친화성(Binding affinity) 에너지 (-6.4 kcal / mol)를 나타내었다.

이와 대조적으로, MOE London 또는 친화도 dG 스코어링 방법을 사용하여도 화합물 6a-h는 유의성이 없는 차이를 보였으며 이는 도 4에서 화합물 6a-e가 완벽하게 중첩되는 것으로부터도 확인할 수 있었다. 가장 높은 런던 점수를 가진 화합물 6g만이 매우 다른 결합 친화성을 보였으며, His145, His146, Asp181, His183 및 Tyr308을 비롯한 수많은 아미노산과 수소 결합을 형성하여 SAHA와 매우 유사한 양상을 나타내었다.

또한, 화합물 6f, 6g와 효소 간의 중요한 상호 작용의 이미지는 도 5에 나타내었다.

일반적으로 상술한 도킹 점수는 효소활성에 대하여 중대한 의미를 지니는 것은 아니며 제한된 화학 공간에서의 구조-활성 관계만을 반영하므로 주의해서 해석하여야 한다. 화합물 4a-g 및 6a-h의 히드록사메이트기의 히드록실 산소로부터 아연 이온까지의 거리에 대한 분석한 결과 화합물 4d 및 4e를 제외하고, 4a-g 시리즈의 모든 화합물은 화합물 6a-h보다 유의하게 더 긴 -OH-Zn 거리를 나타내었e. 이로부터 화합물 4a-g과 비교하여 화합물 6a-h가 높은 억제 효능을 가지는 이유를 추측해볼 수 있었다.

따라서, 더 짧은 링커 사슬 및 고도로 소수성의 캡핑기를 갖는 N-히드록시벤즈아미드 부분은 포켓 주변의 빈 공간에서 유연성을 상실 할 수 있지만, 활성 부위의 터널에 보다 잘 침투 할 수 있으므로, 본 발명의 화합물의 HDAC2 억제 활성과 관련된 중요한 특성인 HDAC 효소에서의 아연 이온과 히드록삼산의 킬레이션을 용이하게 할 가능성이 있음을 예측할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 일반식 1로 표시되는 N-히드록시 벤즈아미드 계 화합물:
[일반식 1]

상기 R₁은 수소원자, 할로겐원자, C_1-6 저급 알킬기, C_1-6 저급 알콕시기 및 니트로기로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 R₂는 다음 화학식 1로 표시되는 치환기임:
[화학식 1]

.
제 1 항에 있어서,
상기 R₁은 수소원자, 할로겐원자, 메틸기, 메톡시기 및 니트로기로 구성된 군으로부터 선택된 치환기인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4a), 4-((4-((5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4b), 4-((4-((5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4c), 4-((4-((5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4d), N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-5-메틸-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4e), N-히드록시-4-((4-((3-(히드록시이미노)-5-메톡시-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤즈아미드 (4f), 및 4-((4-((7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 (4g)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
삭제
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 암은 간암, 위암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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