CN116472269A - 用于治疗肌营养不良症的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及增加肌长蛋白表达的化合物。本公开进一步涉及治疗有需要的受试者的与肌营养不良蛋白相关复合物的减少或功能障碍相关的疾病的方法。
Description
相关申请
本申请要求于2020年9月11日提交的美国临时申请第63/077,329号和于2021年2月12日提交的美国临时申请第63/148,823号的权益,所述美国临时申请的内容全部以引用方式并入本文。
政府支持
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号HL126204、AR048179和AR065972下的政府支持产生的。政府对本发明具有一定权利。
背景技术
肌营养不良症涵盖大约三十种遗传性病症,所述遗传性病症的特征为肌肉组织的虚弱和日渐消瘦,伴有或不伴有神经组织破坏。有九种主要类型的肌营养不良症,所述肌营养不良症中的每种肌营养不良症都涉及最终失去力量、增加残疾和可能的身体畸形。杜氏肌营养不良症(DMD)是最众所周知类型的肌营养不良症,全世界每5,700名男新生儿中约1名受到影响。DMD是由细胞外基质的肌纤维膜粘附力丧失引起的。
随着最近eteplirsen在2016年的加速批准以及私营企业对罕见病项目的资助增加,用于DMD的疗法的发展势头越来越好。然而,现有的FDA批准的DMD药物不足以显著减缓疾病进展。虽然皮质类固醇抑制炎症并延长行走达数年,但它们未解决粘附复合体和膜稳定性缺陷。反义寡核苷酸外显子跳读疗法eteplirsen增加了截短的肌营养不良蛋白的产生,但仅适用于约14%的突变受外显子51跳读作用的DMD患者。仍然需要确定更稳健的用于肌营养不良症和其他肌肉消耗性疾病的治疗。
发明内容
在某些实施方案中,本公开提供了由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是CR7或N;
Y是S、O或SO2;
Z是N或CR6;
R1、R2、R3、R4、R5和R7各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H或烷基;
Q是C=O、SO或SO2;
Cy是芳基或杂芳基;并且
m是1-3。
在某些实施方案中,本公开提供了由式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是O、N或NR9;
R1、R2、R3、R4、和R5各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H、=O或烷基;
Cy是芳基或杂芳基;
R7和R8各自独立地为H或烷基,或与它们所附接的N原子一起形成杂环基;并且
R9是H或烷基。
在某些实施方案中,本公开提供了治疗或预防与肌营养不良蛋白相关复合物功能障碍相关的疾病的方法。
附图说明
图1.用于针对肌长蛋白(SSPN)调节剂的高通量筛选的流水线。(a)使用hSSPN-EGFP C2C12报告细胞系(n=1)筛选大型化学文库。在hSSPN-EGFP和hSSPN-荧光素酶C2C12报告细胞系两者(每个n=3)中重新筛选前1000个命中。所述1000种化合物中的63种化合物增加了两种细胞系中的报告基因表达并且因此被认为是确认的命中。基于以下共同结构特征将确认的命中分为3组:药效团1(PC1)、药效团2(PC2)和没有统一结构主题的其他。用5.5μM的(b)药效团1(PC1)或(c)其他化合物处理肌营养不良蛋白缺陷型H2K mdx细胞48小时。将所有细胞在分化的第2天进行处理并在处理后48小时收获。将基因表达归一化为管家基因β-肌动蛋白和经媒介物处理的细胞(0.5%DMSO)。数据代表个别重复和平均值。n=3-8。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图2.确认的命中增加了mdx肌管中的肌长蛋白基因和蛋白质表达。(a)在用0.5μM至50μM的药效团1或其他化合物处理48小时的肌营养不良蛋白缺陷型H2K mdx细胞中的相对肌长蛋白基因表达。将基因表达归一化为管家基因β-肌动蛋白和经媒介物处理的细胞(0.2% DMSO)。数据表示为平均值+SEM。n=3-6。(b-c)用2.5μM至10μM的化合物处理48小时的肌营养不良蛋白缺陷型H2K mdx细胞的肌长蛋白免疫印迹。将所有细胞在分化的第2天进行处理并在处理后48小时收获。将肌长蛋白蛋白水平在ImageJ中进行定量并归一化为GAPDH和经媒介物处理的细胞(0.2% DMSO)。在独立的蛋白质印迹中探测到细胞裂解物介于2-4倍之间。示出了代表性印迹。免疫印迹下面示出的定量包括所有实验。数据代表个别重复和平均值。每浓度n=3。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图3.OT-9增加小鼠WT肌管中的肌长蛋白基因表达。用5μM的OT-9和PC1-36处理48小时的C2C12肌管表现出肌长蛋白基因表达增加。将基因表达归一化为β-肌动蛋白和经媒介物处理的细胞(0.1% DMSO)。数据代表个别重复和平均值。n=3-27。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。****p<0.0001。
图4.OT-9增加细胞表面处的结合层粘连蛋白的粘附复合物。将用媒介物或5μM的OT-9处理48小时的C2C12肌管在胺反应性生物素中孵育以标记细胞表面蛋白。使用亲和素来亲和纯化经标记的蛋白质,之后使用(a)识别α-肌营养不良蛋白聚糖(α-DG(聚糖))或核心α-肌营养不良蛋白聚糖的结合层粘连蛋白的糖基表位的抗体进行免疫印迹分析。(b)在经OT-9处理的细胞中,细胞表面的糖基化α-肌营养不良蛋白聚糖和核心α-肌营养不良蛋白聚糖均增加。(c至d)免疫印迹的定量。(e)将经媒介物或5μM的OT-9处理48小时的mdx肌管在生物素中孵育以标记细胞表面蛋白并用亲和素进行亲和纯化。免疫印迹分析显示与生物素标记的细胞表面蛋白相关联的肌营养不良蛋白相关蛋白上调。(f)肌营养不良蛋白相关蛋白免疫印迹的定量。数据代表个别重复和平均值。n=3。α-DG代表α-肌营养不良蛋白聚糖;UTRN代表肌营养不良蛋白相关蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05。
图5.OT-9部分地通过上调肌长蛋白来提高肌营养不良蛋白缺陷型肌管的膜稳定性。(a)肌酸激酶(CK)释放测定需要使肌管经受渗压震扰,所述渗压震扰会导致细胞肿胀和膜损伤,从而允许细胞内CK从细胞释放到周围介质中。CK释放是通过取CK胞外/(CK胞外+CK胞内)的比率来计算的。第2天(b)将经处理的mdx用5μM的OT-9处理48小时并用范围为28.5-224.5毫渗摩尔(mosmol)的溶液进行渗压震扰。(c)将mdx肌管用24nM或48nM的乱序siRNA或靶向肌长蛋白的siRNA转染。在48小时后,用45mosmol的溶液对肌管进行渗压震扰。相对于乱序对照,24nM SSPN siRNA转染不影响CK释放。相对于乱序对照,48nM浓度的肌长蛋白siRNA增加CK释放,表明肌长蛋白有助于膜稳定性,而无论处理如何,(d)用24nM的肌长蛋白siRNA和10μM的OT-9并行处理的mdx肌管表明耗竭肌长蛋白降低了OT-9提高膜稳定性的能力。数据代表平均值+SEM。n=3。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图6.OT-9和OT-9m在体外和体内增加了mdx肌肉中的肌长蛋白mRNA。(a)用于测试肌长蛋白mRNA体外稳定性的实验装置的示意性概览。将C2C12肌管在分化的第二天用5μM的OT-9处理。4小时后,去除含有OT-9的培养基并换成不含化合物的新鲜培养基。在更换培养基后(0h)和4h、24h和48h后立即收获细胞进行基因表达分析。(b)OT-9在处理4小时后(0h)诱导肌长蛋白基因表达。在化合物的延长去除后(4-48h),用媒介物和用OT-9处理的细胞中的肌长蛋白mRNA水平是相同的。(c)向20周大的雄性mdx同窝出生仔畜的胫骨前肌中注射媒介物(5% DMSO、95% PBS)或3mg/kgμg的OT-9。在4小时后,收获肌肉并经处理以进行基因表达分析。(d)向19-22周大的mdx雄性的两个胫骨前肌中注射媒介物(5% DMSO、95% PBS)或3mg/kg和10mg/kg的OT-9m。在4小时后,收获肌肉并经处理以进行基因表达分析。(e)向13周大的mdx雄性皮下注射媒介物(4% PEG-200在羟丙基-b-环糊精中的溶液)或20mg/kg/天的OT-9m。在处理13天后,收获肌肉并经处理以用于基因表达分析。将基因表达归一化为β-肌动蛋白和经媒介物处理的细胞。数据代表个别重复和平均值。对于体外研究n=3并且对于体内研究n=2。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。**p<0.01。
图7.板品质。使用稳健的严格标准化均值差(SSMD*)来评定板品质和命中选择。
图8.OT-9增加了mdx肌管中的分化。将mdx肌管在分化的第2天用1μM、5μM和10μM的OT-9处理并在分化的第4天进行测定。(a-b)如通过融合指数所测量的,OT-9诱导H2K mdx肌管分化的轻微增加,和(c)肌细胞生成素基因表达所测量。数据代表个别重复和平均值。n=3。比例尺=200μm。MYOG代表肌细胞生成素;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01。
图9.OT-9对多种成肌细胞系有效。(a)C2C12、(b)H2K WT和(c)H2K mdx成肌细胞对OT-9有反应,但对PC1-36没有反应。用1μM、5μM和10μM的OT-9或PC1-36处理成肌细胞24小时。将基因表达归一化为β-肌动蛋白和经媒介物处理的细胞(0.1% DMSO)。数据代表个别重复和平均值。n=3-6。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图10.C2C12SSPN-HiBiT蛋白报告测定的创建和验证。10(a)肌纤维膜中肌长蛋白的拓扑结构的示意图,其中11个氨基酸的HiBiT融合到肌长蛋白的N末端。10(b)SSPN-HiBiT蛋白水平随着分化而增加。10(c)SSPN-HiBiT肌管对阳性对照c-raf抑制剂GW5074有反应。使用GW5074作为阳性对照,使用稳健的严格标准化平均偏差(SSMD*)计算板品质产生了为2.48的SSMD*,表明GW5074是出色的适度对照。10(d)SSPN-HiBiT 12孔和384孔格式测定检测在用OT-9处理后报告基因表达的增加。将SSPN-HiBiT细胞在分化的第2天进行处理,并在分化的第4天收获。R.U.=归一化为媒介物对照(DMSO)的相对单位、12孔测定的蛋白质浓度、或384孔测定的细胞核计数。显示的数据代表平均值±SEM值。n=6。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图11.OT-9增加总裂解物中的结合层粘连蛋白的粘附蛋白。在免疫印迹分析前将C2C12肌管用媒介物或5μM的OT-9处理48小时。(a)经OT-9处理的细胞没有表现出完全糖基化的、结合层粘连蛋白的α-肌营养不良蛋白聚糖(α-DG(聚糖))的增加,但确实表现出核心α-肌营养不良蛋白聚糖的增加。GAPDH示出为负载对照。(b-c)免疫印迹的定量。数据代表个别重复和平均值。n=3。R.U.代表归一化为GAPDH和媒介物对照的相对单位。
图12.siRNA介导的SSPN敲低导致76%的敲低效率。将mdx肌管用1μM、5μM和10μM的OT-9和24nM的乱序对照siRNA或靶向SSPN mRNA的siRNA并行处理。将基因表达归一化为β-肌动蛋白和经媒介物和乱序siRNA处理的细胞。数据代表平均值+SEM。n=3。SSPN代表肌长蛋白;R.U.代表相对单位。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。
图13.1μM的OT-9和PC1-36在CD-1小鼠血浆中的半衰期。
图14.1μM的OT-9和PC1-36在PBS pH 7.4中的半衰期。
具体实施方式
突变的异质性和递送至肌肉的困难性是开发治疗DMD的疗法的主要挑战。迫切需要能够克服这些挑战的改进疗法。肌长蛋白(SSPN)通过以下方式减少DMD鼠类模型中肌营养不良症的病理学:增加肌营养不良蛋白相关蛋白-糖蛋白复合物(UGC)和α7β1D-整合素粘附复合物的膜定位,从而有效增加层粘连蛋白结合以补偿肌营养不良蛋白的损失。
增加SSPN表达的小分子疗法的开发可导致独立或组合疗法来治疗DMD和由膜蛋白缺乏引起的其他形式的肌营养不良症。小分子疗法是理想的,因为它们能够绕过使用基于病毒的方法和基于细胞的方法所见的递送和免疫应答的限制。
在某些实施方案中,本公开提供了由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是CR7或N;
Y是S、O或SO2;
Z是N或CR6;
R1、R2、R3、R4、R5和R7各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H或烷基;
Q是C=O、SO或SO2;
Cy是芳基或杂芳基;并且
m是1-3。
在某些实施方案中,本公开提供了由式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是O、N或NR9;
R1、R2、R3、R4、和R5各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H、=O或烷基;
Cy是芳基或杂芳基;
R7和R8各自独立地为H或烷基,或与它们所附接的N原子一起形成杂环基;并且
R9是H或烷基。
在某些实施方案中,所述化合物选自:
药学上可接受的盐。
在另一方面中,本公开提供了一种组合物,所述组合物包含本公开的化合物和药学上可接受的赋形剂。
在又一方面中,本公开提供了治疗或预防有需要的受试者中与肌营养不良蛋白相关复合物功能障碍相关的疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用本公开的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中,与肌营养不良蛋白相关复合物功能障碍相关的疾病是肌营养不良症。
药物组合物
本发明的组合物和方法可用于治疗有需要的个体。在某些实施方案中,所述个体是哺乳动物,诸如人类或非人哺乳动物。当施用于动物(诸如人)时,所述组合物或化合物优选作为包含例如本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物施用。药学上可接受的载体是本领域中众所周知的并且包括例如水溶液(诸如水或生理缓冲盐水)或其他溶剂或媒介物(诸如二醇类、甘油、油诸如橄榄油、或可注射的有机酯)。在优选实施方案中,当此类药物组合物用于人类施用,特别是用于侵入性施用途径(即,避免通过上皮屏障的运输或扩散的途径,诸如注射或植入)时,水溶液是无热原的,或基本上无热原的。赋形剂可经选择例如以影响药剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是诸如片剂、胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊剂)、颗粒剂、用于重构的冻干剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等剂量单位形式。所述组合物也可以存在于经皮递送系统,例如皮肤贴剂中。所述组合物也可以存在于适合于局部施用的溶液剂,诸如洗剂、乳膏剂或软膏剂中。
药学上可接受的载体可包含生理学上可接受的剂,所述生理学上可接受的剂例如作用以稳定化、增加溶解度或以增加化合物(诸如本发明化合物)的吸收。此类生理学上可接受的剂包括例如糖类物质(诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。包括生理学上可接受的剂在内的药学上可接受的载体的选择取决于例如组合物的施用途径。所述制备物或药物组合物可以是自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制备物)也可以是其中可掺入例如本发明的化合物的脂质体或其他聚合物基质。例如包含磷脂或其他脂质的脂质体是无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体,所述载体的制备和施用相对简单。
术语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物,诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上,每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些示例包括(1)糖,诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)黄芪粉;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石;(8)赋形剂,诸如可可脂和栓剂用蜡;(9)油,诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二醇,诸如丙二醇;(11)多元醇,诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯类,诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,诸如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液(Ringer's solution);(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲溶液;和(21)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。
药物组合物(制备物)可以通过多种施用途径中的任何一种施用途径施用至受试者,所述施用途径包括例如口服(例如,在水性或非水性溶液或悬浮液中的灌服剂、片剂、胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于施加至舌头的糊剂);通过口腔粘膜吸收(例如,舌下);皮下;透皮(例如施加至皮肤的贴剂);和局部(例如,作为施加至皮肤的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂)。该化合物也可以配制用于吸入。在某些实施方案中,化合物可简单地溶解或悬浮于无菌水中。合适的施用途径和适用于所述施用途径的组合物的详细信息可以在例如美国专利号6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896,以及所述美国专利中所引用的专利中找到。
制剂可方便地以单位剂型存在,并且可通过药学领域中众所周知的任何方法来制备。可与载体物质组合以产生单剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、具体施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效应的化合物的量。通常,在百分之一百中,这种量的范围为约1%至约99%,优选地约5%至约70%,最优选约10%至约30%的活性成分。
制备这些制剂或组合物的方法包括将活性化合物(诸如本发明的化合物)与载体和任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常,制剂是通过以下方式制备的:使本发明的化合物与液体载体或细碎固体载体或两者均匀并紧密地缔合,然后使产物成形(如果需要的话)。
适用于口服施用的本发明制剂可以是胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基料,通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)、冻干剂、粉末剂、颗粒剂的形式,或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液,或作为水包油或油包水液体乳剂,或作为酏剂或糖浆剂,或作为糖果锭剂(使用惰性碱,诸如明胶和甘油,或蔗糖和阿拉伯树胶)和/或作为漱口水等,每种都含有预定量的本发明化合物作为活性成分。组合物或化合物也可以作为大丸药、药糖剂或糊剂施用。
为了制备用于口服施用的固体剂型(胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、片剂、丸剂、糖衣丸剂、粉末剂、颗粒剂等),将所述活性成分与一种或两种药学上可接受的载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下中的任何一者进行混合:(1)填充剂或增量剂,诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和/或硅酸;(2)粘合剂,诸如例如,羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶;(3)保湿剂,诸如甘油;(4)崩解剂,诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠;(5)溶液延迟剂,诸如石蜡;(6)吸收加速剂,诸如季铵化合物;(7)润湿剂,诸如例如,鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯;(8)吸收剂,诸如高岭土和膨润土黏土;(9)润滑剂,诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及它们的混合物;(10)络合剂,诸如改性和未改性的环糊精;以及(11)着色剂。在胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、片剂以及丸剂的情况下,所述药物组合物还可以包含缓冲剂。在使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子量聚乙二醇等的软填充和硬填充的明胶胶囊中还可以采用类似类型的固体组合物作为填充剂。
片剂可以任选地与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制来制备。压制片剂可以使用粘合剂(例如,明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如,羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。
片剂和药物组合物的其他固体剂型,诸如糖衣丸剂、胶囊剂(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒剂,可以任选地刻痕或制备成有包衣和壳,诸如肠溶衣和在药物配制领域中众所周知的其他包衣。它们也可以经配制以提供其中活性成分的缓慢或受控释放,例如使用用于提供所需释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球体。它们可以例如通过滤过细菌截留过滤器或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌,所述无菌固体组合物可在使用前溶解于无菌水或某种其他无菌可注射介质中。这些组合物也可任选地含有遮光剂并且可以为这样的组合物,即它们在胃肠道的某一部位,任选地以延迟的方式,仅释放活性成分或优先地释放活性成分。可以使用的包埋组合物的示例包括聚合物质和蜡。活性化合物也可以呈微囊化形式,在适当的情况下,该微囊化形式含有上述赋形剂中的一种或多种赋形剂。
可用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、用于重构的冻干剂、微型乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除所述活性成分之外,所述液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂,诸如例如,水或其他溶剂、环糊精及其衍生物、增溶剂和乳化剂,诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地说,棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇以及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯,以及它们的混合物。
除惰性稀释剂外,口服组合物还可包含佐剂,诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。
除所述活性化合物之外,混悬剂还可包含悬浮剂,例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶,以及它们的混合物。
用于局部或经皮施用的剂型包括粉末剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将所述活性化合物与药学上可接受的载体,和与可能必需的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂进行混合。
除活性化合物之外,所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可以包含赋形剂,诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌,或它们的混合物。
除活性化合物之外,粉末剂和喷雾剂还可包含赋形剂,诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混合物。喷雾剂可以额外地包含常规推进剂,诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃(诸如丁烷和丙烷)。
透皮贴剂具有提供本发明化合物至身体的受控递送的额外优点。此类剂型可以通过将活性化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。如上文所论述,还可使用吸收增强剂来增加化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式,通常通过注射,并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适用于胃肠外施用的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水性溶液、分散体、混悬剂或乳剂、或恰好在使用之前可重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末剂的组合,所述无菌可注射溶液或分散体可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质,或悬浮剂或增稠剂。
本发明的药物组合物中可采用的合适水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及它们的合适混合物、植物油(诸如橄榄油)、以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如,可以通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物也可含有佐剂,诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。还可能需要在组合物中包含等渗剂,诸如糖、氯化钠等。此外,可以通过包含延迟吸收的剂(单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
在一些情况下,为了延长药物的效应,需要使来自皮下或肌内注射的药物的吸收减缓。这可通过使用水溶性不良的结晶或非晶材料的液体混悬剂来达成。药物的吸收速率则取决于其溶解速率,所述溶解速率继而可取决于晶体大小和结晶形式。或者,肠胃外施用的药物形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成的。
可注射贮库形式是通过在生物可降解聚合物(聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊化基质来制备的。取决于药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质,可控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的示例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微型乳剂中来制备贮库型可注射制剂。
为了在本发明的方法中使用,活性化合物可以本身或作为药物组合物给予,所述药物组合物含有例如0.1%至99.5%(更优选地,0.5%至90%)的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
引入方法也可通过可再装填装置或生物可降解装置提供。近年来,已经开发了各种缓释聚合物装置并在体内进行了测试以用于药物(包括蛋白质生物药物)的受控递送。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶),包括可生物降解的聚合物和不可降解的聚合物两者,可用于形成植入物以在特定靶部位处持续释放化合物。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化,以便获得活性成分的某一量,该量有效实现对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应,而对患者没有毒性。
所选剂量水平将取决于各种因素,包括所采用的特定化合物或化合物组合或其酯、盐或酰胺的活性;施用途径;施用时间;所采用的特定化合物的排泄速率;治疗的持续时间;与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料;所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和既往病史,以及医学领域中众所周知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定所需药物组合物的治疗有效量并开具其处方。例如,医师或兽医可以比实现所需治疗效应所需要的水平更低的水平开始所述药物组合物或化合物的剂量,并逐步增加所述剂量直至实现期望的效应。“治疗有效量”意指足以引发所需治疗效应的化合物浓度。通常理解的是化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可包括但不限于患者病症的严重程度、所治疗的病症、化合物的稳定性,以及如果需要的话,与本发明的化合物一起施用的另一种类型的治疗剂。可以通过多次施用所述药剂来递送更大的总剂量。用于确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的(Isselbacher等人(1996)Harrison’s Principlesof Internal Medicine第13版,1814-1882,该参考文献以引用方式并入本文)。
通常,在本发明的组合物和方法中使用的活性化合物的合适日剂量将是有效产生治疗效应的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。
如果需要的话,则活性化合物的有效日剂量可以任选地以单位剂型,作为在一天中以适当的间隔单独施用的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在本发明的某些实施方案中,活性化合物可以每天施用两次或三次。在优选的实施方案中,活性化合物将每天施用一次。
接受这种治疗的患者是任何有需要的动物,包括灵长类动物,尤其是人类;和其他哺乳动物,诸如马、牛、猪、绵羊、猫和狗;家禽;以及一般的宠物。
在某些实施方案中,本发明的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。
本公开包括本发明化合物的药学上可接受的盐在本发明的组合物和方法中的用途。在某些实施方案中,本发明的预期的盐包括但不限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方案中,本发明的预期的盐包括但不限于L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青霉素、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、海巴明、1H-咪唑、锂、L-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施方案中,本发明的预期的盐包括但不限于Na盐、Ca盐、K盐、Mg盐、Zn盐或其他金属盐。在某些实施方案中,本发明的预期的盐包括但不限于1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸盐、l-抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、(+)-樟脑酸、(+)-樟脑-10-磺酸、癸酸(capric acid/decanoic acid)、己酸(caproic acid/hexanoic acid)、辛酸(caprylic acid/octanoic acid)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、d-葡庚糖酸、d-葡糖酸、d-葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、l-苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、l-酒石酸、硫氰酸(thi ocyanic acid)、对甲苯磺酸、三氟乙酸和十一碳烯酸的盐。
药学上可接受的酸加成盐还可以作为各种溶剂化物,诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等的溶剂化物存在。也可以制备此类溶剂化物的混合物。此类溶剂化物的来源可以来自结晶溶剂、是制备或结晶溶剂中固有的、或是这种溶剂的外来物。
润湿剂、乳化剂和润滑剂,诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁,以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的示例包括:(1)水溶性抗氧化剂,诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂,诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
定义
除非本文另有定义,否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常,在本文中描述的与以下结合使用的命名法和以下的技术是本领域中众所周知的和常用的那些:化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学。
除非另外指明,否则本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法以及如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的那样执行。参见例如,“Principles of Neural Science”,McGraw-Hill Medical,New York,N.Y.(2000);Motulsky,“Intuitive Biostatistics”,Oxford University Press,Inc.(1995);Lodish等人,“Molecular Cell Biology,第4版”,W.H.Freeman&Co.,New York(2000);Griffiths等人,“Introductio n to Genetic Analysis,第7版”,W.H.Freeman&Co.,N.Y.(1999);和Gilbert等人,“Developmental Biology,第6版”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(2000)。
除非本文另有定义,否则本文所用的化学术语均根据本领域的常规用法使用,如“The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms”,Parker S.编辑,McGraw-Hill,SanFrancisco,C.A.(1985)中所例示。
本申请中所引用的所有上述和任何其他出版物、专利和公布的专利申请以引用方式明确并入本文。在冲突的情况下,以本说明书,包括其具体定义为准。
术语“剂”在本文中用于表示化合物(诸如有机或无机化合物、化合物的混合物)、生物大分子(诸如核酸、抗体,包括其部分,以及人源化、嵌合和人抗体和单克隆抗体、蛋白质或其部分,例如肽、脂质、碳水化合物),或由生物材料(诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织)制成的提取物。药剂包括例如结构已知的药剂和结构未知的药剂。此类药剂抑制AR或促进AR降解的能力可使它们适合作为本公开的方法和组合物中的“治疗剂”。
“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用,并且是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物,诸如人类、灵长类动物、牲畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如,犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。
“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果,包括临床结果。如本文所用,并且如在本领域中很好理解的,“治疗(treatment)”是用于获得患有益或所需结果(包括临床结果)的途径。有益的或期望的临床结果可包括但不限于,一种或多种症状或病症的减轻或改善、疾病范围的减小、稳定化的(即,不恶化)疾病状态、防止疾病传播、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解、以及缓解(无论是部分的还是全部的),无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指相比于如果不接受治疗时的预期生存,延长存活期。
术语“预防”是本领域中公认的,并且当关于与诸如局部复发(例如,疼痛)的病症、诸如癌症的疾病、诸如心衰的证候或任何其他医学病症使用时,是本领域中熟知的,并且包括施用组合物,相对于未接受所述组合物的受试者,所述组合物降低了受试者中的医学病症的症状的频率或延迟了其发作。因此,癌症的预防包括例如减少相对于未治疗的对照群体,接受预防性治疗的患者群体中可检测到的癌性生长的数量;和/或延迟相对于未治疗的对照群体,经治疗的群体中可检测到的癌性生长的出现,例如达统计上和/或临床上显著的量。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种方法将物质、化合物或药剂“施用(Administering/administration of)”给受试者。例如,化合物或药剂可以静脉内地、动脉内地、皮内地、肌内地、腹膜内地、皮下地、经眼地、舌下地、口服地(通过摄取)、鼻内地(通过吸入)、脊柱内地、脑内地和透皮地(通过吸收,例如,通过皮肤导管)施用。化合物或药剂也可以适当地通过可再装填或可生物降解的聚合物装置或其他装置(例如,贴片和泵)或制剂引入,所述装置或制剂提供化合物或药剂的延时释放、缓释或控释。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内执行施用。
向受试者施用物质、化合物或药剂的适当方法也将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或药剂的化学和生物学性质(例如,溶解度、消化率、生物利用度、稳定性和毒性)。在一些实施方案中,化合物或药剂例如通过摄取被口服施用至受试者。在一些实施方案中,口服施用的化合物或药剂在延时释放或缓释制剂中,或使用用于此类缓释或延时释放的装置施用。
如本文所用,短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何施用形式,使得第二药剂在先前施用的治疗剂在体内仍然有效时施用(例如,两种药剂在患者中同时有效,这可包括两种药剂的协同效应)。例如,不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在分开的制剂中同时或顺序地施用。因此,接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的联合效应。
药物或药剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当施用于受试者时将具有预期治疗效应的药物或药剂的量。完全治疗效应不一定通过施用一次剂量发生,并且可以在仅施用一系列剂量之后发生。因此,治疗有效量可以按一次或多次施用形式施用。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的体型、健康和年龄,以及所治疗的病症(诸如癌症或MDS)的性质和程度。技术人员可以通过常规实验容易地确定给定情况下的有效量。
如本文所用,术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可发生或可不发生,并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和所述事件或情况不发生的实例。例如,“任选取代的烷基”是指烷基可以被取代以及烷基未被取代的情况。
应当理解的是,本领域的普通技术人员可以选择本发明化合物的取代基和取代模式,以得到化学稳定的化合物,所述化合物可以通过本领域这已知的技术以及下文所述的那些方法从容易获得的起始材料容易地合成。如果取代基本身被多于一个基团取代,则应理解这些多个基团可以在相同的碳或不同的碳上,只要产生稳定的结构即可。
如本文所用,术语“任选取代的”是指给定结构中的一到六个氢基被指定取代基的基团取代,所述指定取代基的基团包括但不限于:羟基、羟烷基、烷氧基、卤素、烷基、硝基,甲硅烷基、酰基、酰氧基、芳基、环烷基、杂环基、氨基、氨基烷基、氰基、卤代烷基、卤代烷氧基、-OCO-CH2-O-烷基、-OP(O)(O-烷基)2或-CH2-OP(O)(O-烷基)2。优选地,“任选取代的”是指给定结构中的一到四个氢基被上述取代基取代。更优选地,一到三个氢基被如上所述的取代基取代。应当理解的是,取代基可以进一步被取代。
如本文所用,术语“烷基”是指饱和脂肪族基团,包括但不限于C1-C10直链烷基或C1-C10支链烷基。优选地,“烷基”基团是指C1-C6直链烷基基团或C1-C6支链烷基基团。最优选地,“烷基”基团是指C1-C4直链烷基基团或C1-C4支链烷基基团。“烷基”的示例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、1-己基、2-己基、3-己基、1-庚基、2-庚基、3-庚基、4-庚基、1-辛基、2-辛基、3-辛基或4-辛基等。“烷基”基团可以任选地被取代。
术语“酰基”是本领域公认的并且是指由通式烃基C(O)-,优选地烷基C(O)-表示的基团。
术语“酰基氨基”是本领域中公认的并且是指被酰基基团取代的氨基基团,并且可以例如由式烃基C(O)NH-表示。
术语“酰氧基”是本领域中公认的并且是指由通式烃基C(O)O-,优选地烷基C(O)O-表示的基团。
术语“烷氧基”是指具有与其附接的氧的烷基基团。代表性烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基基团取代的烷基基团,并且可以由通式烷基-O-烷基表示。
术语“烷基”是指饱和脂肪族基团,包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在优选的实施方案中,直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如,对于直链为C1-30,对于支链为C3-30),并且更优选地为20个或更少的碳原子。
此外,在整个说明书、实施例和权利要求书中使用的术语“烷基”旨在包括未取代和经取代的烷基基团,后者是指具有取代基取代烃主链的一个或多个碳上的氢的烷基部分,包括卤代烷基基团,诸如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。
当与诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基的化学部分结合使用时,术语“Cx-y”或“Cx-Cy”意欲包括在链中含有x个至y个碳的基团。C0烷基表示氢(在基团在末端位置中的情况下),如果基团在内部则表示键。C1-6烷基基团例如在链中含有1个至6个碳原子。
如本文所用,术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基基团取代的氨基基团。
如本文所用,术语“烷硫基”是指被烷基基团取代的硫醇基基团,并且可以由通式烷基S-表示。
如本文所用的术语“氨基”是指以下基团:
其中R9和R10各自独立地表示氢或烃基基团,或者R9和R10与它们所附接的N原子一起完成在环结构中具有4个至8个原子的杂环。
术语“胺”和“氨基”是本领域中公认的并且是指未取代的和经取代的胺及其盐,例如,可以由以下表示的部分
其中R9、R10和R10'各自独立地表示氢或烃基基团,或者R9和R10与它们所附接的N原子一起完成在环结构中具有4个至8个原子的杂环。
如本文所用,术语“氨基烷基”是指被氨基基团取代的烷基基团。
如本文所用,术语“芳烷基”是指被芳基基团取代的烷基基团。
如本文所用的术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团,其中环的每个原子都是碳。优选地,所述环是5元至7元环,更优选地6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环环系,其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有,其中所述环中的至少一个环是芳族的,例如,其他环可以是环烷基、环烯基,环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基基团包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。
术语“氨基甲酸酯”是本领域中公认的,并且是指以下基团
其中R9和R10独立地表示氢或烃基基团。
如本文所用,术语“碳环烷基”是指被碳环基基团取代的烷基基团。
术语“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环中的每个环可选自饱和环、不饱和环和芳族环。碳环包括双环分子,其中两个环之间共享一个、两个或三个或更多个原子。术语“稠合碳环”是指双环碳环,其中所述环中的每个环与其他环共享两个相邻原子。稠合碳环中的每个环可选自饱和环、不饱和环和芳族环。在示例性实施方案中,芳族环(例如,苯基)可以与饱和或不饱和环(例如,环己烷、环戊烷或环己烯)稠合。在化合价允许的情况下,饱和、不饱和和芳族双环的任何组合都被包括在碳环的定义中。示例性“碳环”包括环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性稠合碳环包括萘烷、萘、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可以在任何一个或多个能够带有氢原子的位置处被取代。
如本文所用,术语“碳环烷基”是指被碳环基基团取代的烷基基团。
术语“碳酸根”是本领域中公认的并且是指基团-OCO2-。
如本文所用的术语“羧基”是指由式-CO2H表示的基团。
如本文所用的术语“酯”是指基团-C(O)OR9,其中R9表示烃基基团。
如本文所用的术语“醚”是指通过氧与另一个烃基基团连接的烃基基团。因此,烃基基团的醚取代基可以是烃基-O-。醚可以是对称的或不对称的。醚的示例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”基团,其可由通式烷基-O-烷基表示。
如本文所用的术语“卤基”和“卤素”意指卤素,并且包括氯、氟、溴和碘。
如本文所用的术语“杂芳烷基(hetaralkyl/heteroaralkyl)”是指被杂芳基基团取代的烷基基团。
术语“杂芳基(heteroaryl/hetaryl)”包括取代或未取代的芳族单环结构,优选地5元至7元环,更优选地5元至6元环,所述环的环结构包括至少一个杂原子,优选地一个至四个杂原子,更优选地一个或两个杂原子。术语“杂芳基(heteroaryl/hetaryl)”还包括具有两个或更多个环的多环环系,其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有,其中所述环这的至少一个环是杂芳族的,例如,其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基基团包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
如本文所用的术语“杂原子”意指除碳或氢之外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。
如本文所用的术语“杂环烷基”是指被杂环基取代的烷基基团。
术语“杂环基”、“杂环(heterocycle)”和“杂环(heterocyclic)”是指取代或未取代的非芳族环结构,优选地3元至10元环,更优选地3元至7元环,所述环的环结构包括至少一个杂原子,优选地一个至四个杂原子,更优选地一个或两个杂原子。术语“杂环基(heterocyclyl/heterocyclic)”还包括具有两个或更多个环的多环环系,其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有,其中所述环这的至少一个环是杂环的,例如,其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。
如本文所用的术语“烃基”是指通过不具有=O或=S取代基的碳原子键合的基团,并且通常具有至少一个碳-氢键和主要碳主链,但是可以任选地包含杂原子。因此,出于本申请的目的,如甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基和甚至三氟甲基的基团被认为是烃基,但是诸如乙酰基(其在连接碳上具有=O取代基)和乙氧基(其通过氧,而不是碳连接)的取代基不被认为是烃基。烃基基团包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基以及它们的组合。
如本文所用,术语“羟烷基”是指被羟基基团取代的烷基基团。
术语“低级”当与化学部分(诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基)结合使用时意在包括其中取代基中有十个或更少的原子,优选地六个或更少的原子的基团。例如,“低级烷基”是指含有十个或更少的碳原子、优选地六个或更少的碳原子的烷基基团。在某些实施方案中,本文所定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基,而无论它们单独出现还是与其他取代基组合出现,例如在羟烷基和芳烷基的叙述中(在这种情况下,例如,当计算烷基取代基中的碳原子时,不计算芳基基团内的原子)。
术语“多环基”、“多环(polycycle)”和“多环(polycyclic)”是指两个或更多个环(例如,环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基),在所述环中两个或更多个原子为两个相邻环所共有,例如,所述环是“稠环”。所述环这的每个环可以是取代的或未取代的。在某些实施方案中,多环的每个环在环中包含3个至10个原子,优选地5个至7个原子。
术语“硫酸根”是本领域公认的并且是指-OSO3H基或其药学上可接受的盐。
术语“磺酰胺”是本领域公认的并且是指由以下通式表示的基团
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
术语“亚砜”是本领域公认的并且是指基团-S(O)-。
术语“磺酸根”是本领域公认的并且是指基团SO3H或其药学上可接受的盐。
术语“砜”是本领域公认的,并且是指基团-S(O)2-。
术语“取代的”是指具有取代基取代主链的一个或多个碳上的氢的部分。应当理解的是,“取代”或“被……取代”包括的隐含前提条件是,此类取代符合被取代原子和取代基的允许化合价,并且该取代导致稳定的化合物,例如不会自发进行转化(诸如通过重排、环化、消除等)的化合物。如本文所用,术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面中,可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。对于适当的有机化合物,可允许的取代基可以为一个或多个以及相同或不同的。出于本发明的目的,杂原子(诸如氮)可以具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所述的有机化合物的任何可允许的取代基。取代基可包括本文所述的任何取代基,例如卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯,氨磺酰基、亚磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将理解,如果合适的话,烃链上被取代的部分本身可以被取代。
如本文所用,术语“硫代烷基”是指被硫醇基取代的烷基基团。
如本文所用,术语“硫酯”是指基团-C(O)SR9或-SC(O)R9
其中R9表示烃基。
如本文所用,术语“硫醚”等同于醚,其中氧被硫取代。
术语“脲”是本领域公认的并且可以由以下通式表示
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
如本文所用的术语“调节”包括功能或活性(诸如细胞增殖)的抑制或阻遏以及功能或活性的增强。
术语“药学上可接受的”是本领域中公认的。在某些实施方案中,所述术语包括在合理医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的组合物、赋形剂、佐剂、聚合物和其他材料和/或剂型。
“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中用于指适用于或与患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
如本文所用的术语“药学上可接受的酸加成盐”是指由式I表示的任何碱化合物的任何无毒有机或无机盐。形成合适盐的说明性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸,以及金属盐,诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适盐的示例性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸,诸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸,以及磺酸,诸如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐,并且此类盐可以以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。通常,式I化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂,并且与其游离碱形式相比通常表现出更高的熔点。合适的盐的选择将是本领域技术人员已知的。其他非药学上可接受的盐,例如草酸盐,可用于例如用于实验室使用的式I化合物的分离,或用于随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
如本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指由式I表示的任何酸化合物或其任何中间体的任何无毒有机或无机碱加成盐。形成合适盐的说明性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适盐的说明性有机碱包括脂肪族、脂环族或芳族有机胺,诸如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。合适的盐的选择将是本领域技术人员已知的。
可用于本公开的方法和组合物的化合物中的许多化合物在其结构中具有至少一个立体异构中心。此手性中心可以R构型或S构型存在,所述R符号和S符号与PureAppl.Chem.(1976),45,11-30中描述的规则一致地使用。本公开涵盖化合物、盐、前药或它们的混合物(包括所有可能的立体异构体混合物)的所有立体异构形式,诸如对映异构和非对映异构形式。参见例如,WO 01/062726。
此外,某些含有烯基基团的化合物可能作为Z(顺式(zusammen))或E(反式(entgegen))异构体存在。在每种情况下,本公开包括混合物和单独的个别异构体。
所述化合物这的一些化合物也可能以互变异构形式存在。虽然在上述式中并没有明确地指出,但是此类形式也旨在被包括在本公开的范围内。
“前药”或“药学上可接受的前药”是指在施用后在宿主中代谢(例如水解或氧化)以形成本公开的化合物(例如,式I的化合物)的化合物。前药的典型示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定或可切割(保护)基团的化合物。前药包括可以被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基、水解、脱水解、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或脱磷酸化以产生活性化合物的化合物。在美国专利6,875,751、7,585,851和7,964,580中公开了使用酯或氨基磷酸酯作为生物不稳定或可切割(保护)基团的前药的示例,所述美国专利的公开内容以引用方式并入本文。本公开的前药经代谢以产生式I的化合物。本公开在其范围内包括本文所述的化合物的前药。用于选择和制备合适的前药的常规程序描述于例如“Design of Prodrugs”编辑H.Bundgaard,Elsevier,1985中。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物,诸如可用于配制用于药物或治疗用途的药物的液体或固体滤光剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。
如本文所用的术语“溶解度对数”、“LogS”或“logS”在本领域中用于定量化合物的水溶性。化合物的水溶性显著影响其吸收和分布特性。低溶解度往往伴随着吸收不良。LogS值是以摩尔/升测量的溶解度的单位去除对数(unit stripped logarithm)(以10为底)。
实施例
现已一般性地描述本发明,通过参考以下实施例将使本发明得到更清楚的理解,包括所述实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的,而不旨在限制本发明。
方法
报告基因细胞系
如由Shu等人,Skelet Muscle.2019;9(1):32所述地使用人肌长蛋白EGFP报告基因C2C12细胞系(hSSPN-EGFP)。使用相同的方法,创建人肌长蛋白荧光素酶(hSSPN-luc)C2C12细胞系并用于二次筛选。
小分子
筛选库由加州大学洛杉矶分校(University of California Los Angeles)的分子筛选共享资源(Molecular Screen Shared Resource)提供。后续研究中使用的市售化合物购自Asinex和Life Chemicals Inc.。
高通量筛选
使用Multidrop 384(Thermo Fisher Scientific)将hSSPN-EGFP成肌细胞以500个细胞/孔接种在384孔黑色透明底微孔板(Greiner)中的50μl生长培养基中,并孵育3天以使细胞达到融汇。在达到融汇后,使用EL406组合洗涤剂分配器(Biotek)将生长培养基替换为由含2%马血清(Sigma-Aldrich)的DMEM组成的50μl分化培养基。在分化第2天,抽吸掉细胞上的培养基,留下10μl的残留体积,并更换为30μl的新鲜分化培养基。使用Biomek Fx(Beckman)将0.5μl的小分子的DMSO溶液或单独的DMSO(用于媒介物和阳性对照孔)添加到每个孔中。为了确保DMSO的正确混合,将50μl附加分化培养基添加到除经阳性对照处理的孔以外的所有孔中,所述经阳性对照处理的孔替代地接受50μl含有胰岛素转铁蛋白硒(ITS)(Gibco)的培养基以达到1% ITS的终浓度。对于经媒介物处理的孔和经阳性对照处理的孔,每个经处理的孔中化合物的终浓度为在0.55% DMSO中5.5μM的溶液和仅0.55%DMSO。在孵育48小时后,将培养基更换为Fluorobrite DMEM(Gibco),并使用ImageXpressMicro共焦高含量成像系统(Molecular Devices)对每个板进行成像。使用MetaXpress分析软件(Molecular Devices)中的定制模块分析确定经成像的细胞的荧光强度。分析设置如下:顶帽(大小:12,过滤器形状:圆形),自适应阈值(来源:顶帽,最小宽度:10,最大宽度:800,高于局部背景的强度:500),过滤器掩模(过滤器类型:最小面积过滤器,最小值:500)。
荧光素酶测定
如上所述培养hSSPN-荧光素酶成肌细胞。在处理48小时后,使板平衡至室温。使用EL406组合洗涤剂分配器抽吸每个孔中的细胞培养基。使用Multidrop 384将Bright-Glo荧光素酶测定系统试剂(Promega)和分化培养基以1:2的稀释度添加到细胞中。在室温下孵育3分钟后,使用Envision酶标仪(PerkinElmer)对发光信号进行定量。分析相对发光单位以确定经处理的细胞相对于经媒介物处理的细胞的倍数变化。
细胞培养
使C2C12细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))在含有DMEM(Gibco)和20% FBS(Sigma-Aldrich)的生长培养基中于37℃和5% CO2下生长。在达到90-100%融汇后,通过用由含2%马血清(Sig ma-Aldrich)的DMEM组成的分化培养基替换培养基来诱导成肌细胞分化。条件永生化的H2K WT和在肌营养不良蛋白的外显子23中具有无义突变的md x成肌细胞,是来自Terrance Partridge博士(Children'sNational Medical Cent er,Washington,D.C.)的礼物。参见,Morgan等人,DevBiol.1994;162(2):486-98,使成肌细胞在0.01%明胶(Sigma-Aldrich)包被的平板上于33℃、5%CO2下用含有DMEM、20% HI-FBS(Invitrogen)、2% L-谷氨酰胺(Sigma-Al drich)、2%鸡胚提取物(Accurate Chemical)、1%青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich)和20U/ml的新鲜干扰素γ(Gibco)的生长培养基增殖。为了分化,将H2K成肌细胞接种在包被有在DMEM中稀释的0.1mg/ml基质胶(Corning)的平板上,并在增殖条件下生长。达到90-100%融汇后,使细胞在含有DMEM和5%马血清(Sigma-Aldrich)、2% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的分化培养基中于37℃和5% CO2下使用已确立的方案生长。
基因表达分析
使用基于Trizol的(Thermo Fisher Scientific)相分离从细胞中提取来自处理了48小时的肌管的RNA,Chomczynski等人,Biotechniques.1993;15(3):532-4,6-7。使用NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)测定RNA浓度,并将20μl反应中750ng的RNA使用iScript cDNA合成(Bio-Rad)逆转录,循环条件如下:25℃达5min,42℃达30min,85℃达5min。对于小鼠qPCR,SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad),将各400nM的经优化的正向引物和反向引物(SSPN F:5'TGCTAGTCAGAGATACTCCGTTC 3',SSPN R:5'GTCCTCTCGTCAACTTGGTATG 3',BACT F:5'GAGCACCCTGT GCTGCTCACCG 3',BACT R:5'CAATGCCTGTGGTACGACCA 3')和对应于37.5ng RNA的cDNA用于扩增通过QuantStudio 5实时PCR系统(Ther mo Fisher Scientific)在以下反应条件下测量的cDNA:55℃达2min,95℃达2min,40个循环的95℃达10秒和62℃达30秒,以及解离阶段。对于人类样品的qPCR,使用TaqMan检测定量SSPN(测定ID Hs01025520m_1)和ACTB(测定ID Hs01060665_g1),反应条件如下:50℃达2min,95℃达10min,40个循环的95℃达15秒和62℃达1分钟。每个样品一式三份运行。使用ddCT方法分析数据,并使用经媒介物处理的样品作为校准器(媒介物对照的相对表达=1)归一化为参考基因ACTB。
免疫印迹
使用含有暂停蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific)的RIPA缓冲液(Thermo Fisher Scientific)裂解处理了48小时的肌管。将RIPA缓冲液中的细胞裂解物于4℃振荡1小时,并于4℃以1,000RPM离心30min。收集上清液,使用DC蛋白质测定(Bio-Rad)对蛋白质浓度进行定量,并归一化为在水和终浓度为10%甘油(Sigma-Aldrich)、5%β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、3%十二烷基硫酸钠(Sigma-Aldrich)和0.05%溴酚蓝(Sigma-Aldrich)的Laemmli样品缓冲液中为2mg/ml。对于SDS-PAGE,将样品加热至95℃达2min,然后将40μg上样到4-12%tris-甘氨酸或双-tris聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上,在100伏特在室温下电泳2小时,并转移至硝酸纤维素膜于100伏特和4℃下达2小时。执行丽春红S染色以可视化蛋白质负载并验证蛋白质转移。在室温下用5%脱脂奶粉在含0.1%tween-20(Sigma-Aldrich)(TBST)的tris缓冲盐水pH 7.4中封闭膜1小时,并在摇床上于4℃孵育过夜,除非另有说明,否则在含有5%脱脂奶粉(Carnation)的封闭缓冲液中稀释以下一抗:SSPN(sc-393187,Santa Cruz Biotechnology,1:200),糖基化α-肌营养不良蛋白聚糖(IIH6C4,Developmental Studies Hybridoma Bank,在1%牛奶中1:100,核心α-肌营养不良蛋白聚糖(Beadle Lab,1%牛奶中的1:1000),UTRN(MANCHO3,Developmental Studies HybridomaBank,1:100)和GAPDH(Mab374,Millip ore,1:10,000)。在用TBST洗涤3次,每次10分钟后,将膜在山羊抗小鼠IgG HRP(ab6789,Abcam,对于所有均1:5000,对于GAPDH在5%牛奶为1:10,000)或山羊抗兔IgG HRP(ab6721,Abcam,在1%牛奶中1:10,000)中在室温下孵育1小时。然后将膜用TBST洗涤3次,每次10min,在SuperSignal West Pico化学发光底物(ThermoFisher Scientific)中在定轨摇床上在室温下孵育5min,并曝光为放射自显影胶片(Agfa)。使用SRX-101A桌面处理器(Konica Minolta)使放射自显影胶片显影,扫描成数字文件,并使用ImageJ 1.51s版通过条带密度测定法进行分析。使用经媒介物处理的细胞作为校准器样品(媒介物对照的相对蛋白质水平=1),将靶蛋白条带归一化为负载对照GAPDH。
12孔板格式的C2C12SSPN-HiBiT测定
将C2C12SSPN-HiBiT成肌细胞以25,000个细胞/孔接种在12孔板中的2ml生长培养基中,并孵育3天。达到融汇后,将生长培养基替换为2ml分化培养基。在分化的第2天,将细胞上的培养基替换为2ml含有终浓度为在0.06% DMSO中5.5μM的化合物的分化培养基。对于经媒介物对照处理的细胞,将0.06% DMSO添加到细胞中。在48小时后,用PBS洗涤细胞并冷冻2-24小时。将含有细胞的板在冰上解冻,并将含有1% Triton X-100、0.05%DOC、0.05% SDS和暂停蛋白酶抑制剂的100μl冰冷的改良RIPA缓冲液添加到每个孔中。划取细胞,转移到1.5ml试管中,并于4℃以16,000x g离心20min。将细胞裂解物转移到新试管中。对细胞裂解物执行DC测定以确定蛋白质浓度。将白壁白底384孔微孔板(Greiner)预装15μl的PBS,并一式三份地向每孔中添加15μl的细胞裂解物。然后向每个孔中加入30μl的Nano-Glo HiBiT Lytic检测工作溶液,并在室温下振荡孵育30min。在EnVision酶标仪上测量发光,并将信号归一化为蛋白质浓度和来自经媒介物处理的对照的信号。
384孔微孔板格式的C2C12SSPN-HiBiT测定
将C2C12SSPN-HiBiT成肌细胞以500个细胞/孔接种在384孔白色透明底微孔板(Greiner)中的50μl生长培养基中,并孵育3天。在达到融汇后,使用EL406组合洗涤剂分配器(Biotek)将生长培养基替换为50μl的由不含酚红的DMEM和2%马血清(Sigma-Aldrich)组成的分化培养基。在分化第2天,抽吸掉细胞上的培养基,留下10μl的残留体积,并更换为30μl的新鲜分化培养基。使用Biomek Fx(Beckman)将0.5μl的小分子的DMSO溶液或单独的DMSO(用于媒介物和阳性对照孔)添加到每个孔中。为了确保DMSO的正确混合,将50μl附加分化培养基添加到除经阳性对照处理的孔以外的所有孔中。对于媒介物,每个经处理的孔中化合物的终浓度为在0.55% DMSO中0.5-10μM的溶液和仅0.55% DMSO。在孵育48小时后,用无酚红DMEM洗涤板,抽吸,并使用EL406组合洗涤剂分配器留下5μl的残留体积。在洗涤后,加入25μl的含12μM DRAQ5核染色剂的分化培养基,以使每孔中达到10μM的终浓度,并于37℃、5% CO2下孵育15min。使用ImageXpress Micro共焦高含量成像系统(MolecularDevices)对细胞进行成像。使用MetaXpress分析软件(Molecular Devices)中的定制模块分析确定经成像的细胞的细胞核计数。在成像和分析后,将板抽吸,留下5μl的残留体积,并在-80℃下放置2-24小时。将板在室温下解冻并加入25μl PBS,之后加入30μl的根据制造商建议制备的Nano-Glo HiBiT Lytic检测工作溶液。使用EnVision酶标仪测量发光,并将每个孔的信号归一化为细胞核计数和来自经媒介物处理的对照的信号。
细胞表面蛋白分析
在处理48小时后,用含有0.1g/L的CaCl2(0.9mM)和MgCl2(1.05mM)(Corning)两者的冰冷PBS洗涤肌管三次,并在0.5mg/ml的EZ-连接磺基-NHS-SS-生物素(Thermo FisherScientific)中于4℃轻轻旋转孵育30min以标记细胞表面蛋白。除非另外提及,否则所有步骤均于4℃执行。在轻轻旋转下用PBS中的冰冷100mM甘氨酸洗涤细胞三次,每次5min,以去除未反应的生物素。在PBS洗涤后,将细胞在由50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、1%毛地黄皂苷(Biosynth)和暂停蛋白酶和磷酸酶抑制剂构成的增溶缓冲液中裂解。将样品于4℃旋转10min,并于4℃以14,000rpm离心20min以沉淀碎片。使用DC测定(Bio-Rad)来测定上清液(总裂解物)的蛋白质浓度。将Pierce高容量中性抗生物素蛋白琼脂糖(Thermo FisherScientific)珠粒用增溶缓冲液洗涤,然后与等浓度的总裂解物组合,并于4℃旋转孵育过夜。将珠粒于4℃以2,500rpm离心5min,并用含有0.1%毛地黄皂苷的增溶缓冲液洗涤。这重复达总共4次洗涤。使用2x Laemmli样品缓冲液(LSB)和50mM DTT,将生物素化的细胞表面蛋白从生物素-亲和素切割下来,在室温下旋转60min,并于95℃加热5min。将样品于4℃以2,500rpm离心5min,并收集上清液(膜级分)用于免疫印迹分析。
膜稳定性测定
膜稳定性测定根据先前描述的方法[32]进行了修改。由含有5mM HEPES、5mM KCl、1mM MgCl2、5mM NaCl、1.2mM CaCl2和1mM葡萄糖的基础溶液制备渗压震扰溶液。将蔗糖添加到基础溶液中以达到50mosmol、80mosmol、100mosmol、280mosmol和300mosmol的摩尔渗透压浓度(osmolarity)。使用VAPRO蒸气压渗透压计(Wescor Inc.)确定实际摩尔渗透压浓度。将肌管处理48小时,并在分化的第4天使用28.5毫渗摩尔(mosmol)至223.5mosmol的溶液于37℃进行20min的渗压震扰。收集上清液并离心以分离细胞碎片。在用水裂解和3次冻融循环之前,将贴壁细胞用胰蛋白酶消化并沉淀。使用肌酸激酶测定(SekisuiDiagnostics)来测量上清液和裂解物级分两者中的肌酸激酶(CK)水平。在96孔板中,一式三份地每孔加载4μl的各样品和140μl的试剂。CK的U/L计算如下:(mOD/min)(以mL计的总体积)(稀释因子)/(6.22M-1cm-1)(以cm计的光程)(以mL计的样品体积)。CK释放百分比计算如下:CK细胞外/(CK细胞外+CK细胞内)*100。
siRNA介导的敲低
使用脂质转染胺RNAiMAX转染试剂(Life Technologies)来用24nM或48nM的Silencer Select SSPN siRNA(siRNA ID s68932,Life Technologies)或MISSION siRNA荧光通用阴性对照#1、在Opti-MEM低血清培养基(Thermo Fisher Scientific)中稀释的花菁3(Sigma Aldrich)转染H2K mdx肌管。将转染试剂和稀释的siRNA加入到24孔细胞培养板中每孔1ml的生长培养基中。
肌管融合指数
将96孔板中的成肌细胞从分化第2天开始处理72小时,用4%多聚甲醛固定20min,用0.2% Triton X-100(Sigma)透化10min,并用1% BSA封闭30min。使用在1% BSA中过夜的10μg/ml的MF-20(Developmental Hybridoma Studies Bank)和在1% BSA中的10μg/ml山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 594(Thermo Fisher Scientific)检测肌球蛋白重链(MHC)达1小时。在上述各步骤之间执行PBS清洗。在成像前将细胞核用5μg/ml Hoechst(ThermoFisher Scientific)染色20min。每个处理在三个孔中执行,每个孔捕获三个场。使用ImageJ来对总细胞核数和MHC阳性细胞内的细胞核数进行计数。融合指数计算为MHC阳性细胞中的细胞核数/总细胞核数。
半衰期分析
由Eurofins Panlabs Inc.使用1μM的最终DMSO浓度为0.5%的化合物执行半衰期分析。将PBS或来自CD-1小鼠的血浆预热至37℃达5min,然后加入测试化合物并于37℃继续孵育。在0min、30min、60min、120min、240min和1440min时,将含有化合物的溶液的等分试样与乙腈/甲醇混合、混合并离心。将上清液用于HPLC-MS/MS分析。
体内治疗
对于OT-9的初步安全性评顶,我们对6个月大的C57/Bl6雄性执行了腹腔注射(IP)。向小鼠注射100μl的媒介物(5% DMSO(Sigma),95% PBS)、100μl的30mg/kg OT-9在媒介物中的溶液、或100μl的50mg/kg的OT-9在媒介物中的溶液(每次治疗n=1只小鼠)。观察小鼠达72小时,然后处死以目视评估注射部位和内部器官(数据未显示)。为了评定活性,将媒介物(5% DMSO、95% PBS)或86μg的OT-9注射到20周龄雄性mdx同窝出生仔畜的两条胫骨前肌中。向两只小鼠的两个TA中注射媒介物,并向三只小鼠的两个TA中注射20μl的OT-9(含有86μg的OT-9的9.4mM溶液)。在4小时后,收获肌肉并经处理以用于基因表达分析。为了评估局部施用后OT-9m的活性,向19-22周龄的mdx雄性的两条胫骨前肌注射媒介物(5%DMSO、95% PBS)或3mg/kg和10mg/kg的OT-9m。在4小时后,收获肌肉并经处理以用于基因表达分析。为了评估全身施用后OT-9m的活性,向13周龄的mdx雄性皮下注射媒介物(4% PEG-200的羟丙基-b-环糊精溶液)或20mg/kg/天的OT-9m。在处理13天后,收获肌肉并经处理以用于基因表达分析。
数据分析
使用稳健的严格标准化均值差(SSMD*)来评定板品质和命中选择。SSMD*=XP-XN/1.4826其中XP、XN、SP和SN分别是阳性对照和阴性对照的中值和中值绝对偏差。[33]对于板品质,SSMD*≥1表示品质良好的中度阳性对照。对于初始命中选择,相较于媒介物的1.4倍增加和SSMD*>0.25被视为命中。使用用于Mac OS X的Prism 7.0版(GraphPadSoftware),使用双尾非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnov)测试执行统计分析。数据报告为平均值+SEM。p值<0.05被认为是统计学上显著的。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
结果
我们之前创建并验证了基于肌细胞的高通量测定,以鉴定人类SSPN基因表达的小分子增强剂。Shu等人,Skelet Muscle.2019;9(1):32。使用该测定,我们筛选了临床化合物,并证明该测定能够鉴别在野生型和肌营养不良蛋白缺陷型肌管两者中增加SSPN基因和蛋白质表达的小分子。Id。在这项当前研究中,我们筛选了大型化学文库,目的是鉴别可以开发成SSPN的新化学实体增强剂的化合物。精选文库经开发以基于Lipinski的5法则最大化药物相似性,该法则定义了可用于预测人类最佳口服生物利用度的参数。
200,000个小分子的高通量筛选
使用基于细胞的人SSPN基因表达测定对来自精选文库的超过200,000个小分子进行高通量筛选。测定中使用的报告基因细胞是用包含人SSPN启动子区域后跟增强型绿色荧光蛋白(hSSPN-EGFP)的编码序列的构建体稳定转染的C2C12鼠成肌细胞。使用hSSPN-EGFP测定,我们筛选了浓度为5.5μM(n=1)的化合物(图1a)。使用稳健的严格标准化均值差(SSMD*)计算板品质(图7)。为了排除测定特异性假阳性,我们使用含有用于人类SSPN启动子活性的荧光素酶报告基因(hSSPN-luc)的稳定转染的报告基因细胞系进行反筛选。在hSSPN-EGFP(n=3)和hSSPN-荧光素酶启动子报告基因肌管(n=3)中重新筛选前1000个命中。在1000次命中中,63种化合物增加了两种报告基因细胞系中的报告基因表达,并且因此被认为是确认的命中。确认的命中基于共同的结构特征被分为三组:药效团1、药效团2和没有统一的结构特征的其他类别。药效团2化合物由扁平多环结构组成,所述扁平多环结构已知插入DNA中,这被认为是不利因素。因此,我们专注于药效团1和其他类别的化合物。
使用肌营养不良蛋白缺陷型鼠肌细胞进行命中先导(hit-to-lead)选择
对于最初的命中先导选择,所有市售的确认命中都在肌营养不良蛋白缺陷型mdx肌管中以5.5μM的浓度进行测试,以确定所述化合物在相关疾病模型中是否具有活性。在药效团1组中,十六个命中中的九个命中使SSPN基因表达相对于媒介物对照增加介于1.1倍至1.8倍之间(图1b)。对于另一组,其他二十三个命中中的八个命中将SSPN基因表达增加了介于1.2倍至2.0倍之间(图1c)。最初的命中先导选择表明,使用两个单独的报告基因细胞系进行顺序筛选使得能够鉴定出增加野生型和肌营养不良蛋白缺陷型鼠肌细胞中的SSPNmRNA水平的化合物。
在排除在溶液中不稳定或产生高度可变结果的化合物后,剩下九种化合物。将这九种化合物在mdx肌管中以范围为0.5μM至50μM的六种不同浓度进行测试,以确定在广泛浓度范围内的活性。除PC1-41外的所有化合物在至少一种浓度下均表现出活性(图2a)。PC1-36、PC1-42和OT-9诱导在5.5μM处出峰的浓度依赖性反应。为了确定SSPN mRNA的增加是否在蛋白质水平上也很明显,我们用2.5μM至10μM的OT-9、PC1-36和PC1-42处理mdx肌管,并通过用SSPN抗体进行免疫印迹来分析总蛋白质裂解物。我们发现PC1-42没有诱导SSPN蛋白的增加(数据未显示)。本发明的化合物OT-9和PC1-36使mdx肌管中的SSPN蛋白水平增加了1.5倍,表明这些化合物增加了肌营养不良蛋白缺陷型肌细胞中的SSPN基因和蛋白质丰度两者(图2b至图2c)。
以前,我们分析了分化肌管中的SSPN基因表达,并且发现SSPN mRNA在分化的第三天开始增加,并在分化的第五天达到10倍的增加水平,表明SSPN水平随着细胞分化而增加[26]。为了确定化合物诱导的SSPN表达的增加是否是由于分化增强,我们用OT-9处理mdx肌管并评定融合指数和分化标志物肌原性转录因子MYOG的表达。OT-9诱导mdx肌管中融合指数和MYOG基因表达的轻微增加,表明SSPN的增加可增加分化率,或者OT-9可能部分地通过分化途径起作用(图8)。
为了验证确认的命中不仅以细胞系特异性方式作用于营养不良细胞系,我们在野生型C2C12肌管中测试了OT-9和PC1-36。我们发现这两种化合物都增加了C2C12肌管中的SSPN mRNA水平。(图3)。C2C12、H2K WT和H2K mdx鼠成肌细胞的处理显示,OT-9,而非PC1-36,增加了所有成肌细胞系中的SSPN mRNA水平。OT-9增加成肌细胞中的SSPN的独特能力表明OT-9和PC1-36可具有不同的生物学靶标(图9)。
为了有效地测试新的类似物,我们创建了检测细胞中SSPN蛋白的方法,例如SSPN-HiBiT。SSPN-HiBiT基于鼠C2C12细胞系,该细胞系表达内源性SSPN蛋白与被称为HiBiT的N末端融合蛋白(荧光素酶的11个氨基酸亚基)(图10a)。将SSPN-HiBiT蛋白通过加入底物和荧光素酶的较大亚基来催化发光信号的形成来定量。C2C12SSPN-HiBiT细胞在整个分化过程中以增加的水平表达报告基因蛋白,这由我们的先前发现支持,所述先前发现为SSPNmRNA随分化而增加(图10b)。我们鉴定出了c-raf抑制剂GW5074,以用作测定的阳性对照。用5μM的GW5074处理的SSPN-HiBiT C2C12肌管显示SSPN-HiBiT水平增加1.35倍(图10c)。为了验证报告基因在用我们的先导化合物处理后检测SSPN蛋白水平变化的能力,我们用0.5-10μM的OT-9处理了12孔板和384孔板格式两者的SSPN-HiBiT细胞。所述测定检测SSPN的剂量敏感增加(图10d)。这些结果表明,SSPN-HiBiT C2C12测定是在我们的先导化合物的SAR分析中的可用工具。
OT-9化合物增加细胞表面处的结合层粘连蛋白的粘附复合物
在横纹肌中,SSPN是将细胞膜(肌纤维膜)连接至细胞外基质的三种主要结合层粘连蛋白的粘附复合物的支架:DGC、UGC和α7β1D-整合素。SSPN在mdx肌肉中的过表达增加了UGC和α7β1D-整合素复合物的定位。为了确定OT-9是否影响SSPN在肌管细胞膜处的定位,我们用胺反应性生物素标记细胞表面蛋白。将经OT-9处理的C2C12肌管在细胞不可渗透的生物素中孵育,裂解以溶解蛋白质,用亲和素进行亲和纯化,并用LSB洗脱以获得细胞表面蛋白质。使用识别α-DG(聚糖)的结合层粘连蛋白的糖基表位和核心α-DG蛋白的抗体(图4a),我们对生物素化的细胞表面蛋白和总裂解物执行了免疫印迹分析。OT-9使细胞表面处的糖基化的α-DG增加了1.8倍,并且使核心α-DG增加了1.6倍(图4b至图4d)。总蛋白裂解物的免疫印迹分析显示OT-9没有增加糖基化α-DG的水平,但确实使核心α-DG增加了1.5倍(图11)。糖基化α-DG的细胞表面和总裂解物水平的差异表明OT-9增加了结合层粘连蛋白的α-DG的膜定位。
在过表达SSPN的mdx小鼠中,肌营养不良蛋白旁系同源物肌营养不良蛋白相关蛋白在肌纤维膜处上调,并有助于增加细胞膜与ECM的粘附。使用相同的生物素化实验方法,我们评定了OT-9是否影响细胞表面膜处的肌营养不良蛋白相关蛋白表达。虽然肌营养不良蛋白相关蛋白是细胞内的并且因此没有被直接生物素化,但是增溶缓冲液含有温和的去污剂,所述温和的去污剂保留粘附复合物内的相互作用,包括肌营养不良蛋白相关蛋白、β-肌营养不良蛋白聚糖和细胞表面α-DG的相互作用。用OT-9处理的mdx肌管表现出膜相关肌营养不良蛋白相关蛋白增加1.6倍(图4e至图4f)。总之,我们的研究结果表明OT-9增加了α-DG和肌营养不良蛋白相关蛋白的肌纤维膜定位,表明了结合层粘连蛋白的肌营养不良蛋白相关蛋白糖蛋白复合物的上调。
OT-9通过上调肌长蛋白改善肌营养不良蛋白缺陷型肌管中的膜稳定性
为了确定细胞膜处肌营养不良蛋白相关蛋白和肌营养不良蛋白聚糖的增加是否会导致膜稳定性的功能改善,我们使用了经修改的体外肌酸激酶(CK)释放测定方案[32]。该测定需要使肌经受渗压震扰,这会导致细胞肿胀和膜损伤,从而使细胞内CK从细胞释放到周围介质中(图5a)。为了确定导致CK释放的可检测变化的最佳渗压震扰条件,我们用媒介物或5μM的OT-9处理mdx 48小时,然后使用范围为28.5毫渗摩尔(mosmol)至223.5mosmol的溶液诱导渗压震扰,其中223.5mosmol最接近生理摩尔渗透压浓度(280mosmol)。mdx肌管表现出更高的CK释放和更低、更具破坏性的摩尔渗透压浓度(图5b)。用28.5mosmol的溶液进行渗压震扰导致30-40%的CK释放,而45mosmol和63mosmol的溶液导致10-15%的CK释放,表明膜损伤相对较小。在使用45mosmol、63mosmol和223.5mosmol的溶液进行渗压震扰的细胞中,OT-9显著减少CK释放,表明OT-9稳定化膜并保护所述膜免受渗压震扰引起的损伤。用OT-9处理不会减少用28.5mosmol的溶液进行渗压震扰的细胞中的CK释放,表明OT-9不能稳定化膜,可能是由于极低摩尔渗透压浓度引起的严重膜损伤。
为了确定OT-9诱导的膜稳定化效应是否依赖于SSPN,我们与化合物处理并行地执行了siRNA介导的SSPN敲低。为了评定敲低效率,我们首先用1μM、5μM或10μM的OT-9和24nM的乱序siRNA或靶向SSPN mRN A的siRNA(SSPN siRNA)处理mdx肌管。在用媒介物对照处理的细胞中,相对于乱序对照,SSPN siRNA使SSPN mRNA减少了76%(图12)。在用乱序siRNA和OT-9处理的细胞中,SSPN mRNA相对于媒介物对照增加了高达1.4倍。在用SSPN siRNA和OT-9处理的细胞中,SSPN水平相对于其相应的乱序siRNA对照有所降低。然而,即使使用SSPNsiRNA,OT-9也会由于不完全敲低升高SSPN mRNA水平,从而导致我们在后续实验中使用更高的siRNA浓度。
为了评定在没有任何化合物处理的情况下SSPN敲低对膜稳定性的影响,我们用24nM和48nM的乱序和SSPN siRNA转染mdx肌管,并用45mosmol溶液对细胞进行渗压震扰。在用24nM的siRNA转染的细胞中,SSPN的敲低不影响CK释放(图5c)。然而,在用48nM的siRNA转染的细胞中,SSPN的敲低使CK释放从9%增加到13%,表明SSPN本身的损失使肌纤维膜更易受到膜损伤。为了防止将数据与SSPN敲低引起的基线CK释放的变化混淆,我们选择24nM的siRNA浓度进行后续研究,因为它不影响基线CK释放。在渗压震扰前,我们用10μM的OT-9和24nM的乱序或SSPN siRNA并行处理mdx肌管48小时,并且发现SSPN的耗竭使CK释放从6.5%增加到8%(图5d)。结果显露,SSPN的敲低降低了OT-9稳定化肌纤维膜的能力,表明OT-9的全膜稳定化效应需要SSPN表达。
OT-9和OT-9m增加mdx小鼠中的SSPN基因表达
在证明OT-9的增加膜处的SSPN蛋白和结合层粘连蛋白的粘附复合物的能力后,这继而导致肌营养不良蛋白缺陷型肌管的膜稳定性提高,我们接下来询问了OT-9增加体内SSPN基因表达的能力。OT-9稳定性的估计显露了化合物在小鼠血浆(7.7小时)对比PBS(49min)中的巨大半衰期差异(图13和图14)。因为细胞培养基不同于这两种溶液,所以我们定量了用5μM的OT-9处理4小时的C2C12肌管中的SSPN mRNA稳定性,以确定短期处理是否可以诱导SSPN表达。在用OT-9处理4小时后,去除含有该化合物的培养基并更换成新鲜培养基。在去除化合物后的0小时、4小时、24小时和48小时收获细胞(图6a)。去除化合物后(0h),SSPN mRNA水平与媒介物对照相比升高了1.5倍,表明OT-9在处理仅4小时后诱导SSPN基因表达(图6b)。然而,化合物去除后4小时、24小时和48小时,SSPN mRNA水平恢复到基线水平,这表明SSPN mRNA在OT-9诱导后被上调达至多4小时。
为了评估OT-9的体内安全性和活性,我们在野生型C57/Bl6和mdx小鼠中执行了两项初步研究。对于OT-9的初步安全性评顶,我们对6个月大的C57/Bl6雄性执行了腹腔注射(IP)。向小鼠注射媒介物、30mg/kg的OT-9或50mg/kg的OT-9(n=1)。在注射部位处没有观察到炎症、坏死或化合物积聚的迹象。肝脏、肾脏、胰腺和肠道似乎具有正常的重量和大小。由于在50mg/kg的OT-9溶液中观察到一些不溶性颗粒,因此选择30mg/kg浓度用于评定体内活性。
在初步安全性评估后,我们测试了OT-9体内增加SSPN基因表达的能力。我们选择基于图8b中显示的发现评定处理4小时后的活性,这表明用OT-9处理4小时足以显著提高体外SSPN mRNA水平。对五只20周龄的雄性mdx同窝出生仔畜的胫骨前肌(TA)进行肌内注射。两只小鼠在两个TA中注射媒介物,并且两只小鼠注射3mg/kg的OT-9(安全性评估中使用的摩尔当量为9.4mM)。在处理4小时后,收获TA并经处理以用于基因表达分析。在小鼠中局部注射OT-9后未观察到副作用。OT-9诱导相对于经媒介物对照处理的组,SSPN基因表达的1.7倍增加,证明了OT-9能够增加mdx小鼠中的SSPN基因表达(图6c)。在确定OT-9能够增加体内SSPN基因表达后,我们评估了OT-9衍生物中的一种衍生物OT-9m增加mdx小鼠中的SSPN表达的能力。OT-9m是基于其与OT-9相比改进的体外活性(比较,表1,条目1和14)选择的。为了评估局部施用后OT-9m的体内活性,对十一只19-22周龄的雄性mdx小鼠的两个胫骨前肌(TA)进行肌内注射。四只小鼠在两个TA中注射媒介物,三只小鼠注射3mg/kg的OT-9m,并且四只小鼠注射10mg/kg的OT-9m。在处理4小时后,收获TA并经处理以用于基因表达分析。在小鼠中局部注射OT-9m后未观察到副作用。与OT-9类似,在mdx小鼠中肌内注射OT-9m证明3mg/kg和10mg/kg剂量的OT-9m在短短4小时内增加了SSPN基因表达(图6d)。
随后进行局部施用,我们评估了OT-9m在全身治疗后增强mdx小鼠中的SSPN表达的能力。向13周龄的mdx雄性皮下注射媒介物(4%PEG-200的羟丙基-b-环糊精溶液)或每天20mg/kg的OT-9m。在处理13天后,收获四头肌、TA和心肌,并处理四头肌以进行基因表达分析。用OT-9m全身治疗导致SSPN转录物增加2倍(图6e)。我们之前通过表达不同肌长蛋白水平的小鼠品系的可用性,调查了挽救mdx小鼠中的疾病病理所必需的肌长蛋白水平。我们确定过表达肌长蛋白达1.5倍的小鼠未被挽救,而过表达肌长蛋白达3倍的小鼠被挽救。这表明挽救mdx小鼠所需的肌长蛋白过表达水平介于1.5倍至3倍之间的某处。用OT-9和OT-9m处理mdx小鼠表明,这两种化合物都能够以接近所需的1.5倍至3倍增加的水平增加mdx小鼠中的SSPN基因表达。
实施例1:示例性化合物的制备
合成方案A
合成方案B
1.1 2-氯-6,7-二甲基喹啉-3-甲醛。步骤1.于0℃将POCl3(13.7mL,147mmol,6当量)滴加至DMF(5.7mL,73.5mmol,3当量)中并在室温下搅拌30分钟。然后,在室温下加入N-(3,4-二甲基苯基)乙酰胺(4g,24.5mmol,1.0当量),然后将反应加热至80℃并搅拌16h。在完成后,将混合物冷却至室温,然后倒入冷水中。然后将水层用EtOAc萃取并将有机层用盐水洗涤,过滤,经硫酸钠干燥,然后浓缩。然后使用柱色谱法(2% EtOAc:氯仿)纯化粗产物以产生呈白色固体的纯产物(2.85g,52%)。
1.2(E)-2-氯-6,7-二甲基喹啉-3-甲醛肟。步骤2.于0℃向盐酸羟胺(609mg,8.77mmol,1.2当量)和甲醇(15mL)的溶液中加入氢氧化钠溶液(409mg,10.23mmol,1.4当量在5.37mL水中的溶液),之后在10分钟的时段内分批加入化合物2(1.605g,7.31mmol,1当量)。然后使反应混合物于65℃回流1h。当通过TLC确认起始材料消耗时,将反应混合物冷却至室温,过滤,并用冰冷水和己烷洗涤。在真空下蒸发己烷层以提供呈灰白色固体的所需产物(1.6g,94%)。将剩余的1.2g起始材料推进通过条件以产生产物(1.19g,94%)。
1.3 2-氯-6,7-二甲基喹啉-3-腈。步骤3.使化合物3在乙酸酐(17mL)中的溶液于130℃回流3h。一旦通过TLC(10% EtOAc:己烷)确认反应完成,就使混合物冷却至室温并蒸发过量溶剂。将剩余的固体在EtOAc中搅拌1h,然后将固体过滤并用EtOAc(2×20mL)洗涤。然后使用柱色谱法(0-100% DCM:己烷)纯化该固体以产生呈白色固体的纯产物。滤液也用40mL冰冷水洗涤,经硫酸钠干燥,并蒸发以得到粗材料。然后通过柱色谱法(0-100% DCM:己烷)纯化这种材料以得到呈白色固体的纯产物。将两种固体合并(461mg,31%)。将附加的1.19g化合物3推进通过反应以产生呈白色固体的产物(620mg,56%)。
1.4 6,7-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-腈。步骤4.将化合物4(274mg,1.27mmol,1当量)和浓盐酸(25.4mL)在甲醇(12.6mL)中的混合物回流4h。在反应完全后,使混合物冷却至室温,并且产物从混合物中析出。将产物过滤并用丙酮(2×20mL)洗涤以产生呈灰白色固体的产物(100mg,40%)。将附加的620mg化合物4推进通过反应以产生呈蓬松的灰白色固体的产物(267mg,47%)。
1.5用于获取2-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-7-甲基喹啉-3-腈的程序。步骤5.向化合物5(50mg,0.25mmol,1.0当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入无水碳酸钾(52.3mg,0.375mmol,1.5当量),然后加入酮(58mg,0.25mmol,1.0当量)。然后将所得混合物于60℃搅拌过夜。在通过TLC(5%MeOH:DCM)确认反应完全后,将反应混合物冷却至室温并用水稀释。然后将水层用乙酸乙酯萃取。然后将有机层用冷水和盐水洗涤。然后将有机层过滤,经硫酸钠干燥,并浓缩。然后通过柱色谱法(40% EtOAc:己烷)纯化粗材料以产生纯产物。
1.6用于获取2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)-2-氧代乙氧基)-6,7-二甲基喹啉-3-腈的程序。步骤5.向化合物5(75mg,0.38mmol,1.0当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入无水碳酸钾(78.4mg,0.568mmol,1.5当量),然后加入酮(91.6mg,0.38mmol,1.0当量)。然后将所得混合物于60℃搅拌过夜。在通过TLC(5% MeOH:DCM)确认反应完全后,将反应混合物冷却至室温并用水稀释。然后将水层用乙酸乙酯萃取。然后将有机层用冷水和盐水洗涤。然后将有机层过滤,经硫酸钠干燥,并浓缩。然后通过柱色谱法(40% EtOAc:己烷)和制备型HPLC纯化粗材料以产生纯产物。
1.7用于获取2-((2-(4-氟苯基)-2-氧代乙基)硫基)-6,7-二甲基喹啉-3-腈的程序。步骤5.于60℃将化合物5(169mg,0.79mmol,1.0当量)溶于无水DMF(6.76mL)中,然后使其冷却至室温。然后,加入乙酸钾(155mg,1.58mmol,2.0当量)和2-溴-1-(4-氟苯基)乙-1-酮(342mg,1.58mmol,2.0当量),并使反应在室温下搅拌过夜。在通过TLC(100% DCM)确认反应完全后,向反应中加入20mL的水。然后过滤析出的浅黄色固体。然后将固体重溶于DCM:MeOH(10%)中并经无水硫酸钠干燥。然后将固体溶于40mL的DCM:MeOH(5%)中并使用DCM流过塞子以产生呈淡黄色固体的产物(185mg,69%)。[M+H]+=351.4。1H NMR(300MHz,CHLOROFORM-d)δ=8.23(s,1H),8.20-8.12(m,2H),7.48(s,1H),7.35(s,1H),7.23(d,J=8.2Hz,2H),4.75(s,2H),2.39(d,J=2.3Hz,6H)。
合成方案C:
2.1 2-(2,4-二硝基亚苄基)丙二酸二甲酯。步骤1.向2,4-二硝基苯甲醛(500mg,2.55mmol,1.0当量)在乙酸酐(1.09mL)中的混合物中加入丙二酸二甲酯(336.8mg,2.55mmol,1.0当量),然后加入无水碳酸钾(528.5mg,3.82mmol,1.5当量)。将所得反应混合物加热至80℃并搅拌4h。在通过TLC(100% DCM)确认反应完全后,将冷水倒入混合物中并用乙酸乙酯萃取。然后将有机层用盐水溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤,并浓缩以产生粗产物。然后通过柱色谱法(90% DCM:己烷)纯化产物以产生纯产物(575mg,73%)。
2.2 7-氨基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酸甲酯。步骤2.在室温下向化合物2(540mg,1.74mmol,1.0当量)在AcOH(5.8mL)中的溶液中加入铁粉(1.94g,34.81mmol,20当量)。将所得混合物加热至80℃并搅拌4h。在通过TLC(5%MeOH:DCM)确认反应完全后,将反应混合物滤过硅藻土并用乙酸乙酯洗涤。将混合物使用碳酸氢钠碱化,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤,并减压蒸发以产生产物(207mg,54%),该产物不经纯化就直接用于下一步骤。
2.3 7-(二乙基氨基)-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酸甲酯。步骤3.在室温下向化合物3(200mg,0.95mmol,1.0当量)在甲醇(2.37mL)中的溶液中加入乙醛(0.46mL,8.3mmol,8.75当量),然后加入乙酸(0.46mL)和氰基硼氢化钠(46.5mg,0.73mmol,0.78当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌16h。在通过TLC(10% MeOH:DCM)确认反应完全后,将反应混合物用DCM稀释并用冷水和盐水溶液洗涤。将有机层过滤,经硫酸钠干燥,并蒸发以产生粗产物,然后将所述粗产物通过柱色谱法(30% EtOAc:DCM)纯化以产生产物(30mg,13%)。
2.4 7-(二乙基氨基)-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酸。步骤4.于0℃向化合物4(30mg,0.109mmol,1.0当量)在EtOH(0.9mL)中的溶液中加入NaOH溶液(21.9mg,0.547mmol,5.0当量在0.6mL水中的溶液)。然后将反应于80℃搅拌2h。在反应完全后,将混合物倒入冷水中并使用5%柠檬酸溶液将pH调节至5。通过过滤收集所形成的固体,并用水和乙醚洗涤以产生产物(18mg,48%)。
2.5用于获取最终产物的程序。步骤5.向起始材料(18mg,0.069mmol,1.0当量)和(4-氨基苯基)(1,4-氧氮杂环庚烷-4-基)甲酮(18.3mg,0.083mmol,1.2当量)在10℃的无水DMF(0.54mL)中的溶液中加入HATU(39.4mg,0.104mmol,1.5当量)和三乙胺(0.115mL,0.083mmol,1.2当量)。将混合物在室温下搅拌2h。在起始材料耗尽后,将反应混合物倒入冷水中并用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。使用制备型HPLC纯化粗材料以产生纯产物(17.9mg,56%)。[M+H]+=463.5。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=12.33(s,1H),11.96(s,1H),8.68(s,1H),7.72(dd,J=8.8,11.1Hz,3H),7.38(d,J=8.2Hz,2H),6.79(dd,J=2.3,8.8Hz,1H),6.54(s,1H),3.66(br s,6H),3.51-3.36(m,6H),1.72(br s,2H),1.14(t,J=6.7Hz,6H)。
合成方案D:
3.1 7-溴喹啉-3-甲酸乙酯。步骤1.向4-溴-3-硝基苯甲醛(2.42g,10.51mmol,1.0当量)在乙醇(80.8mL)中的混合物中加入3,3-二乙氧基丙酸乙酯(4g,21.02mmol,2.0当量),随后加入氯化锡水合物(10.68g,47.3mmol,4.5当量)。使反应于80℃回流12h。在反应完全后,减压浓缩去除乙醇。然后将混合物用EtOAc和碳酸氢钠稀释并搅拌30分钟。然后将混合物经硅藻土过滤以去除未溶解的盐。分离有机层,然后将水层用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机层过滤,并经硫酸钠干燥并浓缩。然后将粗产物用己烷洗涤,过滤并减压干燥以产生纯产物(1.5g,51%)。
3.2 7-(二乙基氨基)喹啉-3-甲酸乙酯。步骤2.向化合物2(1.4g,4.998mmol,1.0当量)在甲苯(139mL)中的溶液中加入二乙胺(1.8mL,17.5mmol,3.5当量)。将混合物用氩气吹扫15min,之后加入Pd2(dba)3(458mg,0.4998mmol,0.1当量)、RuPhos(466mg,0.9996mmol,0.2当量)和碳酸铯(5.94g,18.24mmol,3.65当量)。将反应混合物加热至回流并搅拌2h。在反应完全后,将反应混合物用乙酸乙酯稀释并过滤。将滤液用水和盐水洗涤。然后将有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发以产生粗材料。然后通过柱色谱法(0-20% EtOAc:己烷)纯化所述粗材料以产生纯产物(779mg,57%)。
3.3 7-(二乙基氨基)喹啉-3-甲酸。步骤3.在室温下向化合物3(779mg,2.86mmol,1当量)在THF(7.6mL)中的溶液中加入NaOH溶液(629mg,15.7mmol,5.5当量在7.6mL水中的溶液)。将所得混合物回流搅拌4h。在通过TLC(10% MeOH:DCM)确认反应完全后,将过量的THF蒸发,将剩余的残留物用水稀释并用乙酸乙酯洗涤。使用10%柠檬酸水溶液将水层pH调节至5,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩以产生呈黄色固体的产物(431mg,62%产率)。
3.4用于获取最终产物的一般程序。步骤4.向化合物4(50mg,0.205mmol,1.0当量)在DCM(2.1mL)中的溶液中加入胺(0.184mmol,0.9当量),之后加入DIPEA(0.071mL,0.409mmol,2.0当量)、HOBt(34.5mg,0.225mmol,1.1当量)和EDCI(43.2mg,0.225mmol,1.1当量)。将所得混合物在室温下搅拌3h。在通过TLC(5% MeOH:DCM)确认反应完全后,将混合物用DCM稀释并用冷水、盐水溶液洗涤,过滤,经硫酸钠干燥,并蒸发以得到粗化合物。将所述产物通过快速柱色谱法(2% MeOH:EtOAc)纯化。
方案1.N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺的合成方案
N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺:向化合物-1.1(50.0mg,0.246mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入化合物-1.2(42.6mg,0.221mmol),之后于20℃加入EDCI(51.9mg,0.271mmol)、HOBt(36.6mg,0.271mmol)和DIPEA(0.0857mL,0.492mmo l),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。将水层用乙酸乙酯萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至10%)洗脱以得到呈白色固体的所需产物(63mg,67.8%)。(+esi)[M+H]+=378.2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=12.00(s,1H),10.55(s,1H),7.82(d,J=7.6Hz,1H),7.73(d,J=8.2Hz,2H),7.62-7.52(m,1H),7.39-7.15(m,4H),3.42-3.14(m,4H),2.43(s,3H),1.09(br s,6H)。
方案2.N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-7-氟-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺的合成方案
N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-7-氟-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺:于20℃向化合物-2.1(50mg,0.241mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入化合物-1.2(41.8mg,0.217mmol),之后加入EDCI(50.9mg,0.265mmol)、HOBt(35.9mg,0.265mmol)和DIPEA(0.0841mL,0.483mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。将水层用乙酸乙酯萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至10%)洗脱以得到所需产物以及一些杂质。最后,将化合物与30%己烷的DCM溶液一起研成粉末,以得到呈灰白色固体的所需产物(32mg,35%)。(+esi)[M+H]+=382.2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=12.74(s,1H),12.11(s,1H),8.99(s,1H),8.12(dd,J=6.4,8.8Hz,1H),7.76(d,J=8.2Hz,2H),7.36(d,J=8.2Hz,2H),7.28-7.11(m,2H),3.47-3.16(m,4H),1.09(brs,6H)。
方案3.化合物N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺的合成方案
N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺:向化合物-3.1(50mg,0.228mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入化合物-3.2(45.2mg,0.205mmol),之后于20℃加入EDCI(48.1mg,0.251mmol)、HOBt(33.9mg,0.251mmol)和DIPEA(0.0795mL,0.456mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。在反应完全后,将反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。将水层用乙酸乙酯萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至5%)洗脱以得到所需产物以及一些苯胺(3.2)。最后使用DCM:丙酮:己烷(40:40:20)通过PLC纯化并干燥以得到呈浅黄色固体的所需产物(49mg,51%),(+esi)[M+H]+=422.2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=12.64(s,1H),12.42(s,1H),8.95(s,1H),7.77(brd,J=8.2Hz,2H),7.57(d,J=2.3Hz,1H),7.46-7.28(m,4H),3.81(s,3H),3.73-3.41(m,8H),1.92-1.66(m,2H)。
方案4.化合物N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-甲基喹啉-3-甲酰胺的合成方案
N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-甲基喹啉-3-甲酰胺:于20℃向化合物-4.1(53.0mg,0.244mmol)在无水二氯甲烷(2.12mL)中的溶液中加入化合物-3.2(48.4mg,0.220mmol),之后加入EDCI(51.4mg,0.268mmol)、HOBt(36.3mg,0.268mmol)和DIPEA(0.085mL,0.488mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。TLC和LCMS显示没有任何产物形成的迹象。因此,加入HATU(139mg,0.366mmol,1.5当量)并在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。将水层用乙酸乙酯萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至30%)洗脱,将所需级分浓缩,溶于DCM中并用饱和NaHCO3溶液洗涤,将有机层经无水硫酸钠干燥,过滤,并浓缩。将化合物再次通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至10%)洗脱以得到呈淡黄色固体的所需产物(37mg,36%)。(+esi)[M+H]+=420.2。1H NMR(300MHz,CHLOROFORM-d)δ=8.14(s,1H),7.95(d,J=9.4Hz,1H),8.04-7.83(m,1H),7.70(s,1H),7.52-7.28(m,3H),7.03(d,J=2.3Hz,1H),3.93(s,3H),3.87-3.53(m,9H),2.84(s,3H),1.94-1.55(m,2H)。
方案5.化合物7-氨基-N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)喹啉-3-甲酰胺的合成方案
7-((叔丁氧基羰基)氨基)喹啉-3-甲酸乙酯。步骤1:向化合物-5.1(100mg,0.462mmol)在四氢呋喃(1mL)和H2O(8.33mg,0.462mmol)中的搅拌溶液中加入碳酸钾倍半水合物(128mg,0.925mmol)。在约五分钟后,加入二碳酸二叔丁酯(118mg,0.541mmol),并将反应混合物在室温下搅拌3h。将混合物用水稀释,并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩。将产物通过快速色谱法(0-20% EtOAc:己烷)纯化以得到呈浅黄色固体的化合物-5.2(25mg,17%)以及50mg未反应的起始材料。
7-((叔丁氧基羰基)氨基)喹啉-3-甲酸。步骤2:向化合物-5.2(105mg,332mmol)在四氢呋喃(2mL)中的溶液中加入氢氧化钠(26.6mg,0.665mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌56h。通过减压蒸馏去除过量溶剂,使用0.1M HCl将残余物pH调节至4,用乙酸乙酯萃取化合物,并将有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发以产生化合物-5.3(62mg,64%)。(+esi)[M+H]+=289.2。
(3-((4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)氨基甲酰基)喹啉-7-基)氨基甲酸叔丁酯。步骤3:向化合物-5.3(62mg,0.22mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液中加入化合物-1.2(41mg,0.22mmol)、DIPEA(83mg,0.65mmol)和HATU(120mg,320mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释,用冷水洗涤并经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发以得到粗化合物,将所述粗化合物通过combi-flash纯化以得到呈黄色固体的纯化合物-5.4(46mg,46%),(+esi)[M+H]+=463.3。
7-氨基-N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)喹啉-3-甲酰胺。步骤4:将4M HCl水溶液(1mL)加入化合物-5.4(46mg)中并在室温下搅拌5-10min,随后超声处理20min。LCMS分析表明形成了产物以及未反应的起始材料。向反应混合物中加入甲醇(2mL)并进行超声处理,之后去除甲醇。将残余物冻干以获得吸湿性黄色粉末(3.2mg,9%)。(+esi)[M+H]+=363.2。1HNMR(300MHz,CD3OD)δ=9.20(s,1H),9.16(d,J=1.8Hz,1H),8.04(d,J=9.4Hz,1H),7.89(d,J=8.8Hz,2H),7.44(d,J=8.8Hz,2H),7.36(dd,J=2.1,9.1Hz,1H),7.00(d,J=1.8Hz,1H),3.67-3.48(m,2H),3.45-3.33(m,2H),1.34-1.10(m,6H)。
方案6.化合物N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-氨基喹啉-3-甲酰胺盐酸盐的合成方案
6-((叔丁氧基羰基)氨基)喹啉-3-甲酸甲酯。步骤1:向化合物-6.1(150mg,0.742mmol)在无水四氢呋喃(6.0mL)中的溶液中加入硫脲(5.65mg,0.0742mmol)和DIPEA(0.0646mL,0.371mmol),将所得反应将混合物在室温下搅拌5min,然后加入Boc酸酐(178mg,0.816mmol)并在室温下搅拌过夜。通过LCMS监测反应的进展,并且显示只有25%的转化率。将这种反应混合物浓缩并加入另外5当量的Boc酸酐和1.5mL的无水THF,将反应混合物加热至70℃并搅拌3h,并且LCMS显示95%转化为产物。蒸发掉过量的THF;向混合物中加入水(5mL),用乙酸乙酯(3X10mL)萃取,经无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过预装硅胶柱(12g)纯化,用己烷的乙酸乙酯溶液(0%至50%)洗脱以得到呈白色粉末的所需化合物-6.2(180mg,80%)。
6-((叔丁氧羰基)氨基)喹啉-3-甲酸。步骤2:向密封管中装入化合物-6.2(180mg,0.595mmol)和氢氧化钠(131mg,3.27mmol)在四氢呋喃(1.80mL)和水(1.80mL)中的溶液,并于70℃搅拌3h。LCMS表明有51%的所需产物和45%的脱boc产物。然后减压去除THF并将粗物质用水稀释,用乙酸乙酯(2X5mL)洗涤。用10%柠檬酸溶液将水层pH调节至5,然后用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩。将粗化合物通过预装硅胶柱(12g)纯化,用DCM的MeOH溶液(0%至10%)洗脱,以得到所需化合物-6.3(132mg,39%)。
(3-((4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氨基甲酸叔丁酯。步骤3:在经火焰干燥的密封管中装入化合物-6.3(65mg,0.225mmol)和化合物-3.2(59.6mg,0.271mmol)在无水二甲基甲酰胺(1.95mL)中的溶液。然后加入HATU(129mg,0.338mmol)和DIPEA(0.0471mL,0.271mmol),并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水稀释,用乙酸乙酯萃取,然后将有机层用水洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用24g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:CHCl3洗脱以得到所需化合物-6.4并用于下一步骤。
N-(4-(1,4-氧氮杂环庚烷-4-羰基)苯基)-6-氨基喹啉-3-甲酰胺盐酸盐。步骤4:将4M HCl水溶液(1mL)加入到从步骤3获得的化合物6.4中并超声处理20min,之后冻干以产生呈黄色固体的所需产物盐酸盐(46mg;2步产率为48%)。(+esi)[M+H]+=391.2。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.27(d,J=1.6Hz,1H),9.17(d,J=1.8Hz,1H),8.03(d,J=9.2Hz,1H),7.92(d,J=8.0Hz,2H),7.71(dd,J=9.1,2.4Hz,1H),7.52(d,J=7.9Hz,2H),7.31(d,J=2.5Hz,1H),3.88-3.63(m,8H),2.05-2.00(m,1H),1.88-1.83(m,1H)。
方案7.化合物6-氨基-N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)喹啉-3-甲酰胺盐酸盐的合成方案
6-((叔丁氧基羰基)氨基)喹啉-3-甲酸甲酯。步骤1:向化合物-7.1(150mg,0.742mmol)在四氢呋喃(4mL)中的溶液中加入硫脲(5.6mg,0.074mmol)、DIPEA(47.9mg,0.371mmol)和boc酸酐(177mg,0.816mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌16h。通过LCMS监测反应的进展,并且显示有25%的产物形成。从反应混合物中去除溶剂,加入另外5当量的boc酸酐和1.5mL的THF,并将反应混合物加热至70℃并搅拌3h,并且LCMS分析指示95%的产物形成。然后减压去除溶剂并将残余物溶于乙酸乙酯中,用水洗涤并经无水硫酸钠干燥,过滤并减压蒸发以产生粗化合物,将所述粗化合物通过含0-50%EA:Hex的12g快速柱纯化以洗脱产物,然后用100% EA洗脱掉未反应的起始材料。将产物级分减压蒸馏以产生呈白色化合物-7.2(180mg,80%)的纯化合物。(+esi)[M+H]+=303.2。
6-((叔丁氧基羰基)氨基)喹啉-3-甲酸。步骤2:向化合物-7.2(180mg,0.595mmol)在四氢呋喃(1.8mL)中的溶液中加入氢氧化钠(130mg,3.27mmol)和水(1.8mL),并将所得反应混合物于70℃搅拌3h。通过LCMS监测反应的进展,并且指示形成了51%的所需产物和45%的脱boc产物。在这个阶段停止反应并在减压去除过量的四氢呋喃,并且将粗残余物溶于水中并用水洗涤。然后使用10%柠檬酸溶液将水层酸化至pH 5并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水溶液洗涤并经无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩以产生化合物-7.3(132mg,39.2%;51%纯度)。(+esi)[M+H]+=289.2。
(3-((4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氨基甲酸叔丁酯。步骤3:向化合物-7.3(65mg,0.225mmol)在无水DMF(1.95mL)中的溶液中加入化合物-1.2(52mg,0.271mmol)、DIPEA(0.047mL,0.271mmol)和HATU(129mg,0.338mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌4h。将反应混合物用水稀释,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩以产生粗化合物,并将所述粗化合物通过24g硅胶柱,通过用氯仿和甲醇洗脱来纯化,以得到化合物-7.4并用于下一步骤。(+esi)[M+H]+=463.4。
6-氨基-N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)喹啉-3-甲酰胺盐酸盐。步骤4:将4M HCl水溶液(1mL)加入从步骤3获得的化合物-7.4中并超声处理20min。LCMS指示反应完全。通过冻干去除过量试剂并将所得固体用醚洗涤并干燥,以产生呈黄色固体的所需产物(18mg,2步产率为25%)。(+esi)[M+H]+=363.3(-HCl)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ=9.28(s,1H),9.18(s,1H),8.03(d,J=9.3Hz,1H),7.91(d,J=8.5Hz,2H),7.71(dd,J=2.1,9.1Hz,1H),7.45(d,J=8.5Hz,2H),7.33(d,J=2.3Hz,1H),3.57(br s,2H),3.37(br s,2H),1.27(br s,3H),1.18(br s,3H)。
方案8.化合物N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-2-甲基喹啉-3-甲酰胺的合成方案
2-甲基喹啉-3-甲酸。步骤-1:向密封管中装入化合物-8.1(100mg,0.465mmol)和氢氧化钠(102mg,2.56mmol)在四氢呋喃(1mL)和水(1mL)中的溶液,并于100℃搅拌4h。TLC表明SM完全转化为产物。然后减压去除四氢呋喃并将粗物质用水稀释,用乙酸乙酯(2X5mL)洗涤。用10%柠檬酸溶液将水层pH调节至5,然后用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩。将粗化合物-8.2不经进一步纯化即用于下一步骤。
N-(4-(二乙基氨基甲酰基)苯基)-2-甲基喹啉-3-甲酰胺。步骤2:向化合物-8.2(70.0mg,0.374mmol)在无水二氯甲烷(2.8mL)中的溶液中加入化合物-2(64.7mg,0.337mmol),然后于20℃加入EDCI(78.9mg,0.411mmol)、HOBt(55.6mg,0.411mmol)和DIPEA(0.130mL,0.748mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。TLC和LCMS显示没有任何产物形成的迹象。因此,加入HATU(213mg,0.561mmol)并在室温下搅拌过夜。LCMS显示只有6%的转化率。在常规后处理后,将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至10%)洗脱,以得到不纯的所需产物。将这种不纯的产物通过制备型HPLC再次纯化,以提供呈白色固体的纯化合物(6mg,2步产率为3.5%)。(+esi)[M+H]+=362.2。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ=8.64(s,1H),8.12-8.03(m,2H),7.90(t,J=7.9Hz,1H),7.85(d,J=8.3Hz,2H),7.75-7.66(m,1H),7.44(d,J=8.5Hz,2H),3.57(br s,2H),3.37(br s,2H),2.89(s,3H),1.27(br s,3H),1.18(br s,3H)。
方案9.化合物N-(4-(氮杂环庚烷-1-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-甲基喹啉-3-甲酰胺的合成方案
6-甲氧基-2-甲基喹啉-3-甲酸。步骤1:向密封管中装入化合物-9.1(200mg,0.815mmol)和氢氧化钠(179mg,4.48mmol)在四氢呋喃(2.00mL)和水(2.00mL)中的溶液,并于100℃搅拌5h。TLC表明SM完全转化为产物。然后减压去除THF并将粗物质用水稀释,用乙酸乙酯(2X5mL)洗涤。用10%柠檬酸溶液将水层pH调节至5,然后用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤,经无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩。将粗化合物-9.2(163mg,92%)不经进一步纯化即用于下一步骤。
N-(4-(氮杂环庚烷-1-羰基)苯基)-6-甲氧基-2-甲基喹啉-3-甲酰胺。步骤2:向化合物-9.2(50.0mg,0.230mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中加入化合物-9.3(45.2mg,0.207mmol),之后于20℃加入EDCI(48.5mg,0.253mmol)、HOBt(34.2mg,0.253mmol)和DIPEA(0.0802mL,0.460mmol),并将所得反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。将水层用乙酸乙酯萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用MeOH:DCM(0%至10%)洗脱,以得到呈浅黄色固体的所需产物(51mg,53%)。(+esi)[M+H]+=418.2。1H NMR(300MHz,CHLOROFORM-d)δ8.14(s,1H),8.01-7.90(m,1H),7.68(br d,J=8.2Hz,2H),7.48-7.33(m,4H),7.04(d,J=2.9Hz,1H),3.93(s,3H),3.68-3.58(m,2H),3.40(br s,2H),2.84(s,3H),1.87-1.73(m,2H),1.60(br s,6H)。
方案10.化合物2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)-2-氧代乙氧基)-4,6-二甲基烟腈的合成方案
2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)-2-氧代乙氧基)-4,6-二甲基烟腈:向经火焰干燥的小瓶中装入化合物-10.1(200mg,1.35mmol)在无水二甲基甲酰胺(6mL)中的溶液,加入碳酸钾(205mg,1.48mmol)和碘化钾(246mg,1.48mmol)。将这种反应混合物在室温下搅拌15min,将化合物-10.2(327mg,1.35mm ol)加入到上述反应混合物中并于150℃搅拌30min并在室温下搅拌过夜。TLC和LCMS显示完全转化为产物形成。将反应混合物倒入水(10mL)中,用乙酸乙酯(3X10mL)萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用己烷的乙酸乙酯溶液(0%至30%)洗脱,将所需级分浓缩,与二乙醚一起研成粉末。最后,将化合物通过制备型HPLC纯化,以得到所需产物(70mg,17%)。(+esi)[M+H]+=310.2。1H NMR(300MHz,CHLOROFORM-d)δ7.88(d,J=8.79Hz,2H)6.64-6.71(m,3H)5.59-5.65(m,2H)3.07(s,6H)2.45(s,3H)2.30(s,3H)。
方案11.化合物2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)-2-氧代乙氧基)-6,8-二甲基喹啉-3-腈的合成方案
(E)-6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲醛肟。步骤1:于10℃向盐酸羟胺(50mg,0.72mmol)在水(0.15mL)中的溶液中加入4M氢氧化钠水溶液(0.2mL)并在室温下搅拌10min,并在室温下加入到化合物-11.1(50mg,0.25mmol)在乙醇(1.16mL)中的溶液中,并将所得反应混合物加热至90℃并搅拌3h。在反应完全(通过TLC确认;5% MeOH:DCM;Rf为约0.2)后,将反应混合物冷却至室温并倒入冷水中。使用4N盐酸水溶液将溶液的pH调节至2。将分离的固体过滤并用水洗涤并减压干燥以产生化合物-11.2(54mg,100%)。
6,8-二甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-腈。步骤2:将乙酸酐(1.8g,18mmol)加入化合物-11.2(54mg,0.25mmol)中,并加热至140℃并搅拌3h。在反应完全(通过TLC确认;5%MeOH:DCM)后,将反应混合物冷却至室温并用水稀释。然后使用4N氢氧化钠水溶液将混合物碱化至pH=10。将分离的固体过滤出,用水洗涤,并减压干燥以产生化合物-11.3(50mg;定量产率)。
2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)-2-氧代乙氧基)-6,8-二甲基喹啉-3-腈。步骤3:向经火焰干燥的小瓶中装入化合物-11.3(50mg,0.25mmol)在无水二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液,加入碳酸钾(38mg,0.27mmol)和碘化钾(42mg,0.27mmol)。将这种反应混合物在室温下搅拌15min,之后将化合物-11.4(60mg,0.25mmol)加入到上述反应混合物中并于150℃搅拌30min并在室温下搅拌过夜。TLC和LCMS显示完全转化为产物形成。将反应混合物倒入水(5mL)中,用乙酸乙酯(3X10mL)萃取,并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将所得粗化合物通过使用12g二氧化硅快速柱纯化,用己烷的乙酸乙酯溶液(0%至30%)洗脱,将所需级分浓缩,与二乙醚一起研成粉末。最后,将化合物通过制备型HPLC纯化,以得到呈固体的所需产物(40mg,44%)。(+esi)[M+H]+=360.2。1H NMR(300MHz,CD2Cl2)δ8.28(s,1H),7.87-7.83(m,2H),7.33-7.31(m,2H),6.75-6.72(m,2H),5.63(s,2H),2.99(s,6H),2.34(s,3H),2.28(s,3H)。
体外肌长蛋白蛋白水平的增加
用上述SSPN-HiBiT测定测定本发明化合物相对于媒介物增加SSPN蛋白水平的(相对于媒介物的变化倍数)(*p<0.05)。
表1
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表2
以引用方式并入
本文提及的所有出版物和专利据此全文以引用方式并入,如同每个单独的出版物或专利具体地和单独地被指示为以引用方式并入一样。在冲突的情况下,以本申请,包括本文中的任何定义为准。
等效方案
虽然已经讨论了本发明的具体实施方案,但以上说明是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求书后,本发明的许多变化对本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明的全部范围应参照权利要求及其等同物的全部范围、说明书以及此类变型来确定。
Claims (23)
1.一种由式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是CR7或N;
Y是S、O或SO2;
Z是N或CR6;
R1、R2、R3、R4、R5和R7各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H或烷基;
Q是C=O、SO或SO2;
Cy是芳基或杂芳基;并且
m是1-3。
2.如权利要求1所述的化合物,其中X是N。
3.如权利要求1或2所述的化合物,其中Y是O。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中Z是N。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中Cy是芳基。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中Cy被氨基烷基、卤基、烷氧基或OH取代。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为H或烷基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中R1、R4、R5和R7是H。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中R2和R3是甲基。
10.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中m是1。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物,其中Q是C=O。
12.一种由式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中
X是O、N或NR9;
R1、R2、R3、R4、和R5各自独立地为H、烷基、烷氧基、卤素、腈、氨基或氨基烷基;
R6是H、=O或烷基;
Cy是芳基或杂芳基;
R7和R8各自独立地为H或烷基,或与它们所附接的N原子一起形成杂环基;并且
R9是H或烷基。
13.如权利要求12所述的化合物,其中Cy是芳基。
14.如权利要求12或13所述的化合物,其中所述化合物由式(IIa)表示:
15.如权利要求12-14中任一项所述的化合物,其中X是N。
16.如权利要求12-15中任一项所述的化合物,其中R1、R4和R5是H。
17.如权利要求12-16中任一项所述的化合物,其中R7和R8一起形成杂环基。
18.如权利要求12-17中任一项所述的化合物,其中所述化合物由式(IIb)表示:
其中
Y是O或NR10,
R10是H、烷基或酰基;并且
m是1或2。
19.一种化合物,所述化合物选自:
或其药学上可接受的盐。
20.一种化合物,所述化合物选自:
或其药学上可接受的盐。
21.一种药物组合物,所述药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。
22.一种治疗或预防有需要的受试者的与肌营养不良蛋白相关复合物功能障碍相关的疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用前述权利要求中任一项所述的化合物。
23.如权利要求22所述的方法,其中与肌营养不良蛋白相关复合物功能障碍相关的所述疾病是肌营养不良症。
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US63/077,329 | 2020-09-11 | ||
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