WO2002101038A1 - Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere - Google Patents

Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere Download PDF

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WO2002101038A1
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Hideki Thoda
Yuko Hama
Hiromichi Kumagai
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Asahi Glass Company, Limited
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a host in which the genome of a eukaryotic microorganism has been modified for the purpose of improving the efficiency of production of a heterologous protein by a transformant of the eukaryotic microorganism host, a method for constructing the host,
  • the present invention relates to a transformant and a method for producing protein using the transformant.
  • S. pombe Schizosaccharomyces pombe
  • fission yeast is preferable.
  • Heterologous protein production systems using eukaryotic microbes such as yeast can be easily implemented using known microbiological methods and recombinant DNA technology, and have high production capacity. Cultivation has also been practiced and is rapidly being used for actual production. In actual production, the high production efficiency per cell obtained in the laboratory is maintained after the scale-up.
  • Eukaryotic cells unnecessary or harmful to the production of heterologous proteins in the transformant under the culture environment of the above-described transformant.
  • Eukaryotic cells characterized by deleting or inactivating part or all of the genome portion of a microbial host.
  • yeasts are suitable, of which S. pombe is particularly preferred.
  • genes in the genomic portion unnecessary or harmful to the production of heterologous proteins in S. pombe include genes related to energy metabolism (such as pyruvate decarboxylase gene) and genes related to protease (such as serine protease gene).
  • genes selected from endopeptidases and exopeptidases such as aminopeptidase and lipoxypeptidase.
  • fungi are preferred as eukaryotic microbes, and unicellular fungi (that is, yeasts) are particularly preferred.
  • yeast yeast of the genus Saccharomyces such as the baker's yeast, yeast of the genus Schizosaccharomyces such as S. pombe, and yeast of the genus Pichia are preferable.
  • Aspergillus, Rhizobium, Penicillium, and other eukaryotic microorganisms are particularly preferred eukaryotic microbes in the present invention.
  • Particularly preferred eukaryotic microbes in the present invention are yeasts of the genus Schizosaccharomyces, especially S. pombe.
  • the host refers to a host composed of these eukaryotic microorganisms unless otherwise specified.
  • a gene encoding a protein not originally possessed by the host ie, a heterologous protein (hereinafter referred to as a heterologous gene) is introduced into the host by a genetic recombination method.
  • a method of producing a heterologous protein in a host ie, a transformant
  • collecting the heterologous protein has been widely used.
  • a transformant is cultured to produce a heterologous protein, a portion of the genome that is unnecessary or harmful to the production of the heterologous protein exists in the culture environment of the transformant. This genomic portion may be a gene or a non-gene portion.
  • the genes of the protease-related genes are likely to be inhibitors to the production of heterologous proteins.
  • Transformants tend to degrade the produced heterologous protein by protease, since the heterologous protein is not an essential product for the host. Degradation of heterologous protein depends on production efficiency of heterologous protein Therefore, the efficiency of producing heterologous protein can be improved by deleting or inactivating the gene that produces such a protease.
  • genes related to ethanol fermentation are preferable.
  • a typical example of a gene related to ethanol enzyme is a gene encoding pyruvate decarboxylase (pyruvate decarboxylase gene). Deleting or inactivating the pyruvate decarboxylase gene makes it difficult to produce an ethanol enzyme in the culture of the transformant, which makes it easier to allocate energy to synthetases and the like to produce heterologous proteins. It is thought that efficiency is improved.
  • [AAAAGTTTCGTCAATATCACACTGTATATAAATCTTTTCT] and [CAGGGMGAACGTTCCAAGA] were prepared as primers by PCR amplification. Furthermore, these DNA fragments and the ura4 gene fragment 1.8 kbp, which is a marker gene, are ligated by a PCR amplification method using the nucleotide sequences [CGTATTAGCGAT TGAACTG] and [CAGGGMGAACGTTCCAAGA] as primers. A gene disruption vector corresponding to the genomic DNA sequence in which the ORF of the peptidase gene was replaced with the ura4 gene was prepared.
  • This vector was used to transform S. pombe leul-32, ura4-D18) strain.
  • a strain that does not require peracil that forms a colony in the minimal medium was obtained, and genomic DNA was examined by a method in which a DNA fragment was amplified only when the target gene was disrupted by PCR amplification, and carboxypeptidase was found.
  • SPBC16G5.09 had been torn.
  • the above transformant was transformed with an expression vector obtained by introducing a green fluorescent protein into an expression vector for fission yeast (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-163373). After screening, the expression medium was changed to lOOmgZL.
  • Primers (four types A to D) were selected from the 5'-side and 3'-side 400 bp genomic DNA sequences adjacent to 0RF of various genes of fission yeast S. pombe (Nature 415, 871-880 (2002)). And by PCR amplification method. Furthermore, a 1.8-kbp ura4 gene fragment, a marker gene, was ligated to this DNA fragment by PCR amplification using primers (A and D of the above 4 types), and the ORF of the gene was A gene disruption vector corresponding to the genomic DNA sequence replaced with the ura4 gene was prepared. Using this vector, S.pombe (leul-32, ura4-D18) strain was transformed. A strain that does not require periracil that forms a colony in the minimal medium was obtained, and genomic DNA was examined by a method in which a DNA fragment was amplified only when the target gene was disrupted by PCR amplification. Had been destroyed.
  • Methionine metallopeptidase gene SPBC C8.03 (putative me iiiionine metal lopeptidase)
  • ORF length 504 bp A; TCCATAGCATGATTAGGCAA

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Description

明 細 書 宿主の構築方法および異種タンパク質の製造方法
<技術分野 >
本発明は、 真核細胞微生物宿主の形質転換体による異種タンパク質の産生効 率を向上させることを目的として真核細胞微生物のゲノム部分を改変した該宿 主、 該宿主の構築方法、 該宿主の形質転換体、 および該形質転換体を用いた夕 ンパク質の製造方法に関する。 該真核細胞微生物としては、 分裂酵母と呼ばれ るシゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombe、 以下 S. pombe という）が好ましい。
<背景技術 >
組換え D N A技術を用いた異種タンパク質の生産はエツシェリシァ ·コリ (Escher ichi a col i、 以下 E. col iという） をはじめとした様々な微生物や動物 細胞を宿主として行われている。 また様々な生物由来のタンパク質 （本明細書 では、 ポリペプチドを含む意味で使用する） が生産対象とされ、 既に多くのも のが工業的に生産され、 医薬品等に用いられている。
異種タンパク質生産のための種々の宿主が開発されてきた中で酵母は真核細 胞であるため、 転写、 翻訳などの点で動植物と共通性が高く動植物のタンパク 質発現が良好であると考えられ、 パン酵母 (Saccharomyces cerevis i ae) など が宿主として広く使用されている。 酵母のうちでも特に S. pombeは進化過程で 他の酵母とは早い時期に分かれ、 別の進化をとげた結果、 出芽ではなく分裂と いう手段で増殖することからもわかるように、 動物細胞に近い性質を持つこと 力 s、知られている。 このため異種タンパク質を発現させる宿主として S. pombeを 用いることによって、 動物細胞の場合と同様の、 より天然体に近い遺伝子産物 が得られることが期待される。
S. pombeを用いた遺伝子発現に関する研究は遅れていたが、 最近 S, pombeで働 く強力なプロモータ一の発見がなされたため、 S. pombeを宿主とした発現系の 開発が急速に進み、 さらにより安定な効率の良い発現システムを開発するため に発現ベクターに種々の改良が加えられている （特許 2776085、 特開平 07- 1633 73、 特開平 10- 215867、 特開平 10-234375、 特開平 11-192094、 特開平 2000- 1361 99、 特開平 2000- 262284等参照） 。 その結果、 現在 S. pombeを宿主とした発現系 としては高い生産能力を示すに至った。
酵母などの真核細胞微生物を用いた異種タンパク質生産系は、 既に知られて いる微生物学の方法と組換え D N A技術を用いて容易に実施でき、 かつ高い生 産能力を示すため、 既に大容量の培養も実施されて実生産に急速に利用されて きている。 実生産にあたり、 実験室で得られた菌体あたりの高い産生効率はス ケ一ルァップ後も維持される。
しかしながら、 実生産の場合にしばしば求められる、 より低コストの生産法 を考えた場合、 菌体の増殖効率そのものの向上、 目的異種タンパク質の分解の 抑制、 真核細胞微生物特有の修飾の効率的実施、 栄養源の利用効率の向上、 な どの異種タンパク質の産生効率を向上させる方策が必要と考えられる。 たとえ ば、 生育のために培地に添加した炭素源から目的とする異種タンパク質への変 換効率をより高めることができれば、 菌体増殖ひいては異種夕ンパク質の産生 効率が格段に上昇することが期待される。 なぜなら、 菌体自身の生育や目的異 種タンパク質の産生に不要である代謝系 （たとえばエタノール醱酵系） に培地 中の炭素源が消費 （たとえばエタノール生産に使用） されることにより、 目的 異種タンパク質の産生のための炭素源の利用効率が低下していると考えられる からである。 く発明の開示 >
本発明者は以上の点に鑑み検討を行った結果、 形質転換体の異種タンパク質 産生に不要または有害な宿主ゲノム部分の一部または全部を削除または不活化 することにより異種夕ンパク質の産生効率を向上させうることを見い出した。 本発明は、 異種タンパク質の産生効率を向上させることを目的とした、 真核細 胞微生物宿主の構築方法、 その構築方法により構築された宿主、 その宿主に異 種タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体、 およびその形質転換 体を用いた異種タンパク質の製造方法にかかわる下記の発明である。
( 1 ) 遺伝子組換え法により導入した遺伝子がコ一ドする異種タンパク質を 産生させるための真核細胞微生物宿主を構築する方法において、 異種タンパク 質の産生効率を向上させることを目的として、 前記宿主の形質転換体の培養環 境下において該形質転換体の異種タンパク質産生に不要または有害な真核細胞 微生物宿主のゲノム部分の一部または全部を削除または不活化することを特徴 とする真核細胞微生物宿主の構築方法。
( 2 ) 上記の構築方法で構築された、 遺伝子組換え法により導入された遺伝 子がコードする異種タンパク質を産生させるための真核細胞微生物宿主。
( 3 ) 異種タンパク質の産生効率を向上させることを目的として、 形質転換 体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質産生に不要または有害 なゲノム部分の一部または全部を削除または不活化した真核細胞微生物宿主に 異種タンパク質をコードする構造遺伝子を導入してなる形質転換体。
( 4 ) 真核細胞微生物宿主が本来有しない異種タンパク質をコードする遺伝 子を導入した該宿主の形質転換体に該異種夕ンパク質を産生させ、 該異種夕ン パク質を採取する方法において、 前記形質転換体の培養環境下において該形質 転換体の異種タンパク質産生に不要または有害なゲノム部分の一部または全部 を削除または不活化した真核細胞微生物宿主を用いて該形質転換体の異種タン パク質産生効率を向上させることを特徴とする異種タンパク質の製造方法。 上記異種タンパク質産生に不要または有害なゲノム部分としては、 エネルギ 一代謝関連遺伝子群、 プロテアーゼ関連遺伝子群、 減数分裂関連遺伝子群、 転 写関連遺伝子群、 細胞の成長、 分裂、 D N A合成に関連する遺伝子群、 タンパ ク質合成関連遺伝子群、 膜輸送関連遺伝子群、 細胞構造維持関連遺伝子群、 情 報伝達関連遺伝子群またはイオン恒常性関連遺伝子群が好ましい。
真核細胞微生物としては、 酵母が適当であり、 そのうちでも S. pombeが特に 好ましい。 さらに、 S. pombeにおける異種タンパク質の産生に不要または有害 なゲノム部分における遺伝子としては、 エネルギー代謝関連遺伝子群 （ピルビ ン酸デカルポキシラーゼ遺伝子など） およびプロテア一ゼ関連遺伝子群 （セリ ンプロテアーゼ遺伝子などのェンドぺプチダーゼおよびアミノぺプチダーゼや 力ルポキシぺプチダ一ゼなどのェキソぺプチダーゼ） から選ばれる遺伝子が好 ましい。 ぐ発明を実施するための最良の形態 >
本発明において、 真核細胞微生物としては菌類が好ましく、 特に単細胞性菌 類 （すなわち、 酵母） が好ましい。 酵母としては、 前記パン酵母などのサッカ ロマイセス属の酵母、 S. pombeなどのシゾサッカロマイセス属の酵母、 ピキア 属の酵母などが好ましい。 その他、 ァスペルギルス属、 リゾ一ブス属、 ぺニシ リウム属、 その他の真核細胞微生物がある。 本発明において特に好ましい真核 細胞微生物はシゾサッカロミセス属の酵母、 特に S. pombeである。 以下の説明 において宿主とは特に言及しない限りこれら真核細胞微生物からなる宿主をい ■5。
宿主にその宿主が本来有しないタンパク質 （すなわち、 異種タンパク質） を コードする遺伝子 （以下、 異種遺伝子という） を遺伝子組換え法により導入し. 異種遺伝子を導入した宿主 （すなわち、 形質転換体） にその異種タンパク質を 産生させ、 その異種タンパク質を採取する方法は近年広く行われている。 形質 転換体を培養して異種タンパク質を産生させる場合、 形質転換体の培養環境下 において異種タンパク質の産生に不要または有害なゲノム部分が存在する。 こ のゲノム部分は遺伝子であってもよく非遺伝子部分であってもよい。 好ましく は、 ゲノムの遺伝子部分であり、 その遺伝子を削除または不活性化して形質転 換体の異種タンパク質の産生効率を向上させる。 このような不要または有害な 遺伝子はゲノムに多数存在すると考えられる。 本発明においてはこのような多 数の遺伝子の一部を削除または不活性化することによつて充分目的を達成しう る。
形質転換体の異種タンパク質の産生に不要または有害なゲノム部分は宿主が 野生の環境下において生存、 増殖するために必須の遺伝子であってもよい。 そ のような必須の遺伝子は、 形質転換体培養環境下においては必ずしも必須とさ れないからである。 例えば、 炭素源からある栄養源に転換するために必要な遺 伝子は、 培養環境 （培養液） にその栄養源を添加することにより不要となる場 合がある。 また、 酵母などにおいては、 増殖は出芽や分裂によって行われ、 減 数分裂を経ることなく増殖可能である。 したがって、 減数分裂に関連する遺伝 子群は形質転換体の培養環境下においては必ずしも必要とされない。 このよう な不要な遺伝子の存在は形質転換体の増殖や異種タンパク質の産生に負荷とな り、 したがって、 このような遺伝子を削除または不活性化することにより負荷 が低減され、 異種タンパク質の産生効率を向上できる。
一方、 例えば、 プロテアーゼ関連遺伝子群の遺伝子は、 異種タンパク質の産 生に対し阻害要因となりやすい。 異種タンパク質は本来宿主にとって不要な産 生物であることより、 形質転換体は産生した異種タンパク質をプロテア一ゼに より分解する傾向がある。 異種タンパク質の分解は異種タンパク質の産生効率 を低下させる要因の一つと考えられ、 したがって、 このようなプロテアーゼを 産生する遺伝子を削除または不活性化することにより異種夕ンパク質の産生効 率を向上できる。
上記のような異種タンパク質の産生に不要または有害な遺伝子としては、 ェ ネルギー代謝関連遺伝子群、 プロテアーゼ関連遺伝子群、 減数分裂関連遺伝子 群、 転写関連遺伝子群、 細胞の成長、 分裂、 D NA合成に関連する遺伝子群、 タンパク質合成関連遺伝子群、 膜輸送関連遺伝子群、 細胞構造維持関連遺伝子 群、 情報伝達関連遺伝子群またはイオン恒常性関連遺伝子群などの遺伝子が好 ましい。 特に好ましい遺伝子はエネルギー代謝関連遺伝子群およびプロテア一 ゼ関連遺伝子群から選ばれる遺伝子である。
エネルギー代謝関連遺伝子群の遺伝子としては、 エタノール醱酵に関連した 遺伝子が好ましい。 ェタノ一ル醱酵に関連した遺伝子の代表例としてピルビン 酸デカルポキシラーゼをコ一ドする遺伝子 （ピルビン酸デカルポキシラーゼ遺 伝子） がある。 ピルビン酸デカルポキシラ一ゼ漳伝子を削除または不活性化す ることにより、 形質転換体の培養においてエタノ一ル醱酵が生じにくくなり、 その分エネルギーがシンテターゼ等に配分されやすくなつて異種タンパク質の 産生効率が向上すると考えられる。
プロテアーゼ関連遺伝子群の遺伝子としては、 セリンプロテアーゼ、 力ルポ キシルプロテアーゼ、 メタルプロテアーゼなどのェンドぺプチダーゼをコード する遺伝子ゃァミノぺプチダ一ゼ、 カルボキシぺプチダーゼなどのェキソぺプ チダーゼをコードする遺伝子がある。 特にセリンプロテア一ゼをコ一ドする遺 伝子 （セリンプロテア一ゼ遺伝子） 、 アミノぺプチダーゼをコードする遺伝子 (アミノぺプチダーゼ遺伝子） 、 力ルポキシぺプチダーゼをコードする遺伝子 (カルボキシぺプチダ一ゼ遺伝子） が好ましい。 このようなプロテアーゼ関連 遺伝子の削除または不活性化は、 前記のように異種タンパク質の分解を抑制し て異種タンパク質の産生効率を向上させると考えられる。
宿主のゲノム部分の削除や不活性化は公知の方法で行うことができる。 また 削除や不活性化を行う部分はゲノムの 1ケ所であってもよく、 2ケ所以上の部 分であってもよい。 削除や不活性化を行う部分が遺伝子の場合、 1つの遺伝子 について削除や不活性化を行ってもよく、 2以上の遺伝子のそれぞれについて 削除や不活性化を行ってもよい。 また遺伝子の削除や不活性化を行う部分は構 造配列部分であってもよく、 調節配列部分であってもよい。
遺伝子の削除は遺伝子の全体を削除してもよく、 遺伝子の一部を削除して遺 伝子を不活性化してもよい。 また遺伝子の不活性化は、 遺伝子の一部を削除す ることに限られず、 遺伝子を削除なしに改変する場合も意味する。 また、 不活 性化の対象である遺伝子の配列の中に他の遺伝子や D NAを揷入して遺伝子を 不活性化することもできる。 いずれの場合も、 対象遺伝子を活性のないタンパ ク質をコードするものとしたり、 対象遺伝子が転写や翻訳できないものにした りして、 不活性なものとする。
異種タンパク質としては、 限定されるものではないが、 多細胞生物である動 物や植物が産生するタンパク質が好ましい。 特に哺乳動物 （ヒトを含む） の産 生するタンパク質が好ましい。 このような夕ンパク質は E. col iなどの原核細胞 微生物宿主を用いて製造した場合活性の高いタンパク質が得られない場合が多 く、 また C HOなどの動物細胞を宿主として用いた場合には通常産生効率が低 い。 本発明における遺伝子改変した真核細胞微生物を宿主とする場合はこれら の問題が解決されると考えられる。 実施例
以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。
[実施例 1 ] (ピルビン酸デカルポキシラ一ゼ遺伝子 Pdclの不活化による、 ォ ワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質の産生効率の向上）
分裂酵母 S. pombeのピルビン酸デカルポキシラーゼをコ一ドする遺伝子 pdc 1 (SPAC1F8.07C) の〇RF (タンパク質をコードする部分） 1785 bp内に S. pombeのォロチジンリン酸デ力ルポキシラ一ゼ遺伝子断片 1. 8 k b pを挿入 し、 該遺伝子破壊ベクターを作製した。 本べクタ一を用いてゥラシル要求性緑 色螢光タンパク質生産株 （特開 2000-262284公報記載の 8重組込み 型生産系における酵母菌株に対してそのォロチジンリン酸デカルポキシラ一ゼ 活性を遺伝子破壊法によって不活性化したもの） を形質転換した。 最小培地に コロニーを形成するゥラシル非要求性の株を取得し、 PCR増幅法によってそ のゲノム D N Aを調べたところ、 ピルビン酸デ力ルポキシラ一ゼ遺伝子が破壊 されていた。
この形質転換体を用いた緑色螢光タンパク質生産試験を、 培地を YPD液体 (酵母エキス （DIFC0社製） 1%、 バクトペプトン （DIFC0社製） 2%、 ブドウ 糖 （和光純薬社製） 2%) とし、 培養器の形状を試験管にて行ったところ、 単 位菌体あたりの生産量が元株に比べて増加していた。 すなわち、 マイクロプレ ートリーダー （コロナ社製 MTP- 32+MTPF2) を用いた励起波長 490 nm螢光波 長 530 nmの観察において、 その値が上昇した。
[実施例 2] (セリンプロテアーゼ遺伝子 isp6の不活化による、 ォワンクラゲ 由来の緑色蛍光夕ンパク質の産生効率の向上）
分裂酵母 S. pombeのセリンプロテアーゼ遺伝子をコードする遺伝子 isp6 (SPA C4A8.04) の ORF (1404 b p) 内に S. pombeのォロチジンリン酸デカルポ キシラーゼ遺伝子断片 1. 8 kbpを挿入し、 該遺伝子破壊ベクターを作製し た。 本ベクターを用いて実施例 1と同じゥラシル要求性緑色螢光タンパク質生 産株を形質転換した。 最小培地にコロニ一を形成するゥラシル非要求性の株を 取得し、 PCR増幅法によってそのゲノム DNAを調べたところ、 セリンプロ テア一ゼ遺伝子が破壊されていた。
この形質転換体を用いた緑色螢光タンパク質生産試験を、 実施例 1と同様に 培養したところ、 単位菌体あたりの生産量が元株に比べて増加していた。 すな わち、 マイクロプレートリ一ダ一 （コロナ社製 MTP- 32+MTPF2) を用いた励起波 長 490 nm螢光波長 530 nmの観察において、 その値が上昇した。
[実施例 3] (アミノぺプチダ一ゼ遺伝子 SPAC4F10.02 (aminopeptidase I) の不活性化による、 ォワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質の産生効率の向上） 分裂酵母 S.pombeのアミノぺプチダ一ゼをコ一ドする遺伝子 SPAC4F10.02 (Na ture 415, 871-880 (2002))の OR F (1500bp) に隣接する 5'側および 3'側の 400 b ρのゲノム DNA配列をそれぞれ、 塩基配列 [ACMGCAGATCTCCCAGTCA ] と [AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTTTTCCATGTAATTGCATTT] および塩基配列 [AAAAGT TTCGTCAATATCACTTTACCAAGTTTGTTTATGT] と [GCTTTCGTTGAAAGACTTG] をプライ マ一として P C R増幅法で作製した。 さらに塩基配列 [ACAAGCAGATCTCCCAGTCA ] と [GCTTTCGTTGAAAGACTTG] をプライマーとした P C R増幅法によってこれ らの DN A断片とマーカー遺伝子である u r a 4遺伝子断片 1. 8 kbpとを 連結することにより、 ァミノぺプチダ一ゼ遺伝子の O R Fが u r a 4遺伝子と 入れ替わったゲノム DNA配列に相当する遺伝子破壊べクタ一を作製した。 本べクタ一を用いて S.pombeGeul- 32， ura4-Dl 8)菌株を形質転換した。 最少 培地にコロニーを形成するゥラシル非要求性の株を取得し、 P CR増幅法によ り目的遺伝子が破壊されていた場合のみ DN A断片が増幅する方法でゲノム D NAを調べたところ、 アミノぺプチダーゼ遺伝子 SPAC4F 10.02が破壊されてい た。
さらに、 分裂酵母用発現ベクター （特開平 7-163373) にォワンクラゲ由来緑 色螢光タンパク質遺伝子を挿入してできた発現べクタ一で上記形質転換体を形 質転換し、 スクリーニング後、 発現培地を lOOmgZLの抗生物質 G418を 含んだ YPD液体とし、 培養器の形状を試験管にて培養を行なったところ、 単 位菌体あたりの生産量が元株に比べて増加していた。 すなわち、 マイクロプレ —トリ—ダ— （コロナ社製 MTP- 32+MTPF2) を用いた励起波長 490 nm螢光波 長 530 nmの観察において、 その値が 231を示し、 非破壊株に同じ遺伝子 を導入した株での発現量の 2倍程度上昇した。
[実施例 4] (カルボキシぺプチダーゼ SPBC16G5.09 (carboxypeptidase) の 不活性化による、 ォワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質の産生効率の向上） 分裂酵母 S.pombeの力ルポキシぺプチダーゼをコ一ドする遺伝子 SPBC16G5.09
(Nature 415， 871-880 (2002))の ORF (1647 b p) に隣接する 5'側お よび 3'側の 400 b pのゲノム DN A配列をそれぞれ塩基配列 [CGTATTAGCGAT TGAACTG] と [AGCCAGTGGGATTTGTAGCTGCTCTCACAATCMATCGAC] および塩基配列
[AAAAGTTTCGTCAATATCACACTGTATATAAATCTTTTCT] と [CAGGGMGAACGTTCCAAGA] をプライマーとして PC R増幅法で作製した。 さらに塩基配列 [CGTATTAGCGAT TGAACTG] と [CAGGGMGAACGTTCCAAGA] をプライマ一とした P C R増幅法によ つてこれらの DN A断片とマーカー遺伝子である u r a 4遺伝子断片 1. 8 k bpとを連結することにより、 力ルポキシぺプチダーゼ遺伝子の OR Fが u r a 4遺伝子と入れ替わつたゲノム D N A配列に相当する遺伝子破壊べクタ一を 作製した。
本ベクターを用いて S.pombe leul- 32, ura4-D18)菌株を形質転換した。 最少 培地にコロニーを形成するゥラシル非要求性の株を取得し、 PCR増幅法によ り目的遺伝子が破壊されていた場合のみ DNA断片が増幅する方法でゲノム DN Aを調べたところ、 カルボキシぺプチダーゼ SPBC16G5.09が破壌されていた。 さらに、 分裂酵母用発現べクタ一 （特開平 7- 163373) に緑色螢光タンパク質 を揷入してできた発現ベクターで上記形質転換体を形質転換し、 スクリーニン グ後、 発現培地を lOOmgZLの抗生物質 G418を含んだ YPD液体とし、 培養器の形状を試験管にて培義を行なったところ、 単位菌体あたりの生産量が 元株に比べて増加していた。 すなわち、 マイクロプレートリーダ一 （コロナ社 製 MTP- 32+MTPF2) を用いた励起波長 490 nm螢光波長 530 nmの観察にお いて、 その値が 215を示し、 非破壊株に同じ遺伝子を導入した株での発現量 の 1. 6倍程度上昇した。
[実施例 5]
分裂酵母 S.pombeの各種遺伝子 (Nature 415, 871-880 (2002))の 0 R Fに隣 接する 5'側および 3'側 400 b ρのゲノム DNA配列をプライマー （A〜Dの 4種） を用いて PCR増幅法で作製した。 さらに、 プライマ一 （上記 4種の内 の Aおよび Dの 2種） を用いた PCR増幅法によってこの DNA断片にマーカ —遺伝子である u r a 4遺伝子断片 1. 8 kbpを連結し、 遺伝子の ORFが u r a 4遺伝子と入れ替わったゲノム DNA配列に相当する遺伝子破壊べクタ —を作製した。 本べクタ一を用いて S.pombe(leul- 32, ura4- D18)菌株を形質転 換した。 最少培地にコロニーを形成するゥラシル非要求性の株を取得し、 PC R増幅法により目的遺伝子が破壊されていた場合のみ DN A断片が増幅する方 法でゲノム DN Aを調べたところ、 当該遺伝子が破壊されていた。
実施例 3、 4と同様に、 ォワンクラゲ由来緑色螢光タンパク質を挿入してで きた発現べクタ一で上記遺伝子が破壊された S.pombeを形質転換し、 形質転換 体を培養してその緑色螢光タンパク質の生産量を励起波長 490 nm螢光波長 53 Onmの観察で測定することにより、 非破壊株に同じ遺伝子を導入した株 で得られた吸光度より高い値を得ることができる。
以下に、 破壊した各種遺伝子と使用したプライマ一 （4種） を示す。
(1)
遺伝子名：ァスパラギン酸プロテア一ゼ遺伝子 SPCCI795.09 (putative asp artic proteinase) 〇RFの長さ： 1566 b p
プライマー：
A； TTCATCTCGGACGTGTAG
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTTAATTAAATGTGTATTTTA
C ； AAAAGTTTCGTCAATATCACATCCTTAAATAATTAGAAGA
D； TCCACTTTCTGTTGTGGA
(2)
遺伝子名：細胞質アミノぺプチダーゼ遺伝子 SPAC13A11.05 (cyiosol amino peptidase)
ORFの長さ： 1542 b p
プライマー：
A； AATCTGCAATCGGACATCGC
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTGTACGTAAGAAAAAAAGCT
C ； AAAAGTTTCGTCAATATCACCTTATTTATTTTCTTGGCTA
D ； CAACATGAGACTTCAACCGA
(3)
遺伝子名：ジぺプチジルアミノぺプチダ一ゼ遺伝子 SPAC C4.15c (dipeptid yl aminopeptidase
ORFの長さ： 2606 b p
A； GGCCCATTAGCTATATGAGAC
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTAATAGAAAAGTTACGTTATT
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACTCATGCCACTGGAATAAGTG
D ； TACCCACCAACTTATAAGCC
(4) 遺伝子名：カルボキシぺプチダーゼ遺伝子 SPBC337.07C (putative carboxyp eptidase)
〇RFの長さ： 1665 b ρ
プライマー：
A； GACTATGTTGGTGGAGTGCAA
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTCCAAGAAAGATCAATAATT
C ； AAAAGTTTCGTCAATATCACGAGTTAGAAAGAGCAGTCTT
D ； TAGGCAATAGTGAGACCTGA
(5)
遺伝子名：液胞カルポキシラーゼ S遺伝子 SPAC24C9.08 (putative vacuolar carboxypept idase s)
ORFの長さ： 1791 b p
A； TCAGGTGTCATCACTCAC
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTGTCGTAGTTTTAGAAATTA
C ； AAAAGTTTCGTCAATATCACGCTCCTTTTTTGGATTTGCT
D； CCCTTCTAAACATACTACACGTTC
(6)
遺伝子名：亜鉛プロテアーゼ遺伝子 SPACUM4.12c (putative zinc-proteas e)
ORFの長さ： 2910 b p
プライマー：
A； TCTGGAAAATTGCTCGTTAG
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTTTTTATTTATGAAAGGAAA
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACTTTTTTTTCCCTAATCCGAT D； TGCAAGACTCCAATGCTC
(7)
遺伝子名：亜鉛プロテア一ゼ遺伝子 SPCC1442.07c (putative Zn- protease) ORFの長さ： 849 bp
プライマー：
A； TCCACCCTTTGTCCATGA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTGGATTCTTTACTACTTATA
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACGTGAATTTGGTAATTAGCAA
D； CTGGCTGTTCTTAGTCAG
(8)
遺伝子名：メタ口プロテア一ゼ遺伝子 SPCC965.04c (putative metal lopepti dase)
ORFの長さ： 2231 b ρ
Α； ACGATTTTCCACTTGTCCA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTGCCAAGACTGTTAGAGTCAT
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACAAATTTTGCAATACAAAAAG
D； TCAGGATATCGCTGTCACT
(9)
遺伝子名：亜鉛メタ口プロテアーゼ遺伝子 SPAC17A5.04c (putative zinc me tallopeptidase)
ORFの長さ： 1610 b p
A； GGGTACTCTCAAGAAGGATGT
B ； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTACGCCTTTTCGTTTCTTTTG C； AAAAGTTTCGTCAATATCACAGTATATCATATATTCTTTT
D； ATCCTTGGGTACGCGTAA
(10)
遺伝子名： CAAXプレニルプロテアーゼ I遺伝子 SPAC3H1.05 (putative CAAX prenyl protease)
ORFの長さ： 1495 b p
プライマ一：
A； GTTGTTGATGCAACGGCTAA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTAAATAGAGTTCAACTATCGA
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACGTTTCATGAGTGAATGAAAT
D； TATGCTCATACGTTCCCT
(11)
遺伝子名：ジぺプチジルぺプチダーゼ遺伝子 SPBC1711.12 (putative dipept idyl peptidase)
ORFの長さ： 2052 b p
A； GTTTTGTTGAGATGTCTTGG
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTCCAAAAAAATATATTCTTTG
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACATTAATTTTAATAATACAAC
D； GAATCTCGTATTCCGGCATT
(12)
遺伝子名：ジぺプチダ一ゼ遺伝子 SPCC965.12 (putative dipeptidase) ORFの長さ： 1251 b p
プライマー：
A； CGCTGTGCTAATCAACTG B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTTTCAACTATTATCAGCTTC
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACTATCATAAGGATCGTTGACT
D； ACACAATGTGGATACGAACT
(13)
遺伝子名：メチォニンメタロぺプチダ一ゼ遺伝子 SPBC C8.03 (putative me iiiionine metal lopeptidase)
ORFの長さ： 1281 b p
プライマ一：
A； GTTGCTTGATATCCGACTCA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTGTTTAAGATTGTTAAATCC
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACAAAAATTTTTTTTGTGCTGG
D ; CCGTTCATCGAATAGCTCAA
(14)
遺伝子名：メチォニンアミノぺプチダーゼ遺伝子 SPBC3E7.10 (putative met hionine aminopept idase)
ORFの長さ： 1301 b ρ
プライマー：
Α； TCCAAATACCAGCATACGCA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTATAAATACTTTGTCTTAAGG
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACATTTTGATATACCCAACATG
D； GCGCCAAACGAAAAGAGTGA
(15)
遺伝子名：シグナルぺプチダーゼ遺伝子 SPAC107L04c (putative signal pe ptidase)
ORFの長さ： 504 b p A； TCCATAGCATGATTAGGCAA
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTTTGAGCTCAATTTTTTTAAT
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACTTTTACTATTAGCTTAATTA
D； TTCAACAGTCATTGCGATTG
( 1 6 )
遺伝子名：ミトコンドリアプロセッシングべプチダーゼ j8サブュニット遺伝 子 SPBP23A10. 15c (mi tochondr i al process ing pept i dase beta subuni t) 〇R Fの長さ： 1 3 7 4 b p
プライマ一：
A； AGCAACCGACTTTGCACT
B； AGCCAGTGGGATTTGTAGCTACGCATTTTCTTGGGACTTT
C； AAAAGTTTCGTCAATATCACGCATAATCAATTCAAGCTCC
D； CGGTCATTCGTTTCCTTC
<産業上の利用可能性 >
分裂酵母 S. pombeのピルビン酸デカルポキシラーゼ遺伝子やプロテア一ゼ遺 伝子を不活性化することにより、 分裂酵母 S. pombeを宿主とする形質転換体の 異種タンパク質の産生効率が向上した。 このように、 真核細胞微生物を宿主と し、 遺伝子組換え法により異種タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質 転換体の異種タンパク質生産系において、 形質転換体の培養環境下において異 種タンパク質の産生に不要または有害なゲノム部分を削除または不活性化する ことにより、 異種タンパク質の産生効率が向上する。

Claims

請求の範囲
1 . 遺伝子組換え法により導入した遺伝子がコ一ドする異種タンパク質を産生 させるための真核細胞微生物宿主を構築する方法において、 異種タンパク質の 産生効率を向上させることを目的として、 前記宿主の形質転換体の培養環境下 において該形質転換体の異種タンパク質産生に不要または有害な真核細胞微生 物宿主のゲノム部分の一部または全部を削除または不活化することを特徴とす る真核細胞微生物宿主の構築方法。
2 . 形質転換体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質産生に不 要または有害なゲノム部分が、 真核細胞微生物宿主の、 エネルギー代謝関連遺 伝子群、 プロテア一ゼ関連遺伝子群、 減数分裂関連遺伝子群、 転写関連遺伝子 群、 細胞の成長、 分裂、 D NA合成に関連する遺伝子群、 タンパク質合成関連 遺伝子群、 膜輸送関連遺伝子群、 細胞構造維持関連遺伝子群、 情報伝達関連遺 伝子群またはイオン恒常性関連遺伝子群である、 請求項 1に記載の方法。
3 . 真核細胞微生物が、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ（Schizosaccharomyces pombe)である、 請求項 1または 2に記載の方法。
4. 形質転換体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質の産生に 不要または有害なシゾサッカロマイセス ·ボンべ（Schizosaccharomyces pomb e)のゲノム部分が、 エネルギー代謝関連遺伝子群およびプロテアーゼ関連遺伝 子群から選ばれる遺伝子である、 請求項 3に記載の方法。
5 . 請求項 1または 2に記載の構築方法で構築された、 遺伝子組換え法により 導入された遺伝子がコードする異種タンパク質を産生させるための真核細胞微 生物宿主。
6 . 真核細胞微生物が、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ（Schi zosaccharomyc es pombe)である、 請求項 5に記載の宿主。
7 . 異種タンパク質の産生効率を向上させることを目的として、 形質転換体の 培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質産生に不要または有害なゲ ノム部分の一部または全部を削除または不活化した真核細胞微生物宿主に、 異 種タンパク質をコ一ドする構造遺伝子を導入してなる形質転換体。
8 . 形質転換体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質産生に不 要または有害なゲノム部分が、 エネルギー代謝関連遺伝子群、 プロテア一ゼ関 連遺伝子群、 減数分裂関連遺伝子群、 転写関連遺伝子群、 細胞の成長、 分裂、 D N A合成に関連する遺伝子群、 タンパク質合成関連遺伝子群、 膜輸送関連遺 伝子群、 細胞構造維持関連遺伝子群、 情報伝達関連遺伝子群またはイオン恒常 性関連遺伝子群である、 請求項 7に記載の形質転換体。
9 . 真核細胞微生物が、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ（Schizosaccharomyces pombe)である、 請求項 7または 8に記載の形質転換体。
1 0 . 真核細胞微生物宿主が本来有しない異種タンパク質をコードする遺伝子 を導入した該宿主の形質転換体に該異種タンパク質を産生させ、 該異種タンパ ク質を採取する方法において、 前記形質転換体の培養環境下において該形質転 換体の異種タンパク質産生に不要または有害なゲノム部分の一部または全部を 削除または不活化した真核細胞微生物宿主を用いて該形質転換体の異種タンパ ク質産生効率を向上させることを特徴とする異種夕ンパク質の製造方法。
1 1 . 形質転換体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質の産生 に不要または有害なゲノム部分が、 エネルギ一代謝関連遺伝子群、 プロテア一 ゼ関連遺伝子群、 減数分裂関連遺伝子群、 転写関連遺伝子群、 細胞の成長、 分 裂、 D NA合成に関連する遺伝子群、 タンパク質合成関連遺伝子群、 膜輸送関 連遺伝子群、 細胞構造維持関連遺伝子群、 情報伝達関連遺伝子群またはイオン 恒常性関連遺伝子群である、 請求項 1 0に記載の方法。
1 2 . 真核細胞微生物が、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ（Schizosaccharomyc es pombe)である、 請求項 1 0または 1 1に記載の方法。
1 3 . 形質転換体の培養環境下において該形質転換体の異種タンパク質の産生 に不要または有害なゲノム部分が、 エネルギー代謝関連遺伝子群およびプロテ ァーゼ関連遺伝子群から選ばれる遺伝子である、 請求項 1 2に記載の方法。
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