WO2002086119A1 - Ver a soie transforme produisant du collagene humain - Google Patents

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WO2002086119A1
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silkworm
collagen
human
polynucleotide
polynucleotide encoding
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PCT/JP2001/004906
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Katsutoshi Yoshizato
Masahiro Tomita
Tsutomu Satou
Hajime Mori
Toshiki Tamura
Takahiro Adachi
Hiroto Munetsuna
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Japan Science And Technology Corporation
Hiroshima Industrial Technology Organization
Terumo Kabushiki Kaisha
Koken Co., Ltd.
National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins

Definitions

  • the invention of this application relates to a transgenic silkworm that produces recombinant human collagen. More specifically, the invention of this application relates to a transgenic silkworm that produces recombinant human collagen, a recombinant vector for producing the transgenic silkworm, and a method for producing recombinant human collagen. Things.
  • Collagen is a typical protein that constitutes the extracellular matrix.It provides various functions that control cell growth, differentiation, migration, etc. Has physiological functions. Therefore, collagen is used as a biomaterial for repairing biological damage ( ⁇ Surg. Res. 10: 485-491, 1970) and as a carrier for the sustained release of certain drugs ( ⁇ Controlled Release 33: 307). -315, 1995), widely used in the medical field. However, most of the collagen currently used is derived from animal tissues such as pigs, and it is known that if these collagens are transplanted into humans, about 3% of patients will have an allergic reaction. (J. Immunol. 136: 877-882, 1986; Biomaterials 11: 176-180, 1990).
  • a method for producing human collagen using mammalian cells or yeast has been devised (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-501937).
  • methods for producing recombinant human collagen include methods using insect cells, mammalian cells, yeast, and the like.However, methods using insect cells or mammalian cells are used in the medical field. It is difficult to increase production to the extent possible.
  • purification of recombinant human collagen is not always easy because a recombinant product is produced in the cells.
  • the invention of this application has been made in view of the following circumstances, and solves the problems of the conventional technology, and provides a recombinant human collagen having both high productivity and easy purification. The task is to provide a production method and genetic engineering materials for it.
  • the first invention of this application has a polynucleotide encoding human collagen in genomic DNA, and produces recombinant human collagen as a part of a protein in a cocoon or silk gland.
  • Transgenic silkworm The second invention of this application is to provide a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a fusion protein of human collagen and silkworm in genomic DNA, wherein the fusion protein is a protein of cocoon or silk gland. It is a transgenic silkworm produced as a part.
  • These transformed silkworms according to the first and second inventions include silkworm adults, larvae, Includes pupae and eggs.
  • the transgenic silkworms of the first and second inventions have a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase ⁇ -subunit and ⁇ -subunit in genomic DNA.
  • the third invention of this application is characterized by isolating and purifying recombinant human collagen from the cocoon or silk gland of the transgenic silkworm of the first invention. Is the way.
  • a fourth invention of this application is to isolate a fusion protein of collagen and silkworm silk protein from the cocoon or silk gland of the transformed silkworm of the second invention, and to obtain a recombinant human protein from this fusion protein. This is a method for producing recombinant human collagen, which comprises separating and purifying collagen.
  • the fifth invention of this application is a fusion protein of the recombinant human collagen and silkworm silk protein produced by the transformed silkworm of the second invention.
  • the sixth invention of this application is a targeting vector derived from Autographs californica nucleopolyhedrovirus. This vector homologously recombines a polynucleotide encoding human collagen with an arbitrary region of the silkworm genome, Used to create transgenic silkworms that produce human and collagen.
  • polynucleotide encoding human 'collagen is a human nucleic acid molecule that expresses collagen, and human genomic DNA, mRNA transcribed from genomic DNA, mRNA And cDNA synthesized from the same.
  • One embodiment of the targeting vector of the sixth aspect of the present invention is as follows: a genome encoding silkworm silk protein is added to both ends of a polynucleotide encoding human; It has a DNA sequence homologous to any region of DNA (silkworm silk protein gene). This targeting vector homologously recombines the polynucleotide encoding human collagen downstream of the (ie, endogenous) expression control sequence (promoter Z promoter sequence) of the silk protein gene of the silkworm genome. .
  • Another embodiment of the targeting vector of the sixth invention is that the human-collagen expression cassette has, at both ends thereof, a DNA sequence homologous to an arbitrary region of silkworm genomic DNA.
  • This targeting vector homologously recombines the human / collagen expression cassette into any region of the silkworm genome.
  • the “expression cassette” refers to a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding human collagen is linked under the control of the expression control sequence of the silkworm silk protein gene.
  • the seventh invention of this application is directed to an autographa californica nucleopolyhedrovirus for homologous recombination of a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase ⁇ -subunit and ⁇ -subunit with an arbitrary region of a silkworm genome. It is a targeting vector derived from Yuichi.
  • the eighth invention of this application is a recombinant plasmid vector having a human / collagen expression cassette in a region sandwiched between a pair of inverted repeat sequences of an insect DMA-type transposon.
  • the ninth invention of this application is directed to a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase ⁇ -subunit and ⁇ -subunit in a region sandwiched between a pair of inverted repeats of an insect DNA-type transposon.
  • a recombinant plasmid vector having The tenth invention of this application is a recombinant plasmid vector comprising the recombinant plasmid vector of the eighth invention and a polynucleotide encoding the transposase of transposon.
  • This is a vector set consisting of a plasmid vector.
  • the eleventh invention of this application is a vector set comprising the recombinant plasmid vector of the ninth invention and a recombinant plasmid vector having a polynucleotide encoding a transposase of transposon.
  • a transgenic silkworm producing human collagen in which proline has been oxidized is produced.
  • the twelfth invention of this application is a polynucleotide encoding a silkworm proline hydroxylase ⁇ -subunit having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and specifically, a DNA fragment having the base sequence of SEQ ID NO: 1. It is.
  • the polynucleotide encoding proline hydroxylase ⁇ -subunit is at least a coding region of a DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the human collagen expression cassette is a fusion polynucleotide in which a human-collagen-encoding polynucleotide is linked under the control of the expression control sequence of the silkworm silk protein gene;
  • a preferred embodiment is a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a silkworm silk protein and a polynucleotide encoding human collagen are linked under the control of an expression control sequence.
  • FIG. 1 is a restriction map of the translana vector pMOSRA-1
  • FIG. 2 is a restriction map of the minicollagen genes (pMOSRA-4B, pOSRA-5, and pOSRA-6) integrated in the piggyBac plasmid vector.
  • FIG. 3 is a diagram showing an electrophoresis image of an amplified product obtained by performing PCR using genomic DNA extracted from a positive F1 silkworm adult as ⁇ type. 1 and 2 represent the numbers of the positive silkworms. Lane M is a 100 bp ladder marker.
  • FIG. 1 is a restriction map of the translana vector pMOSRA-1
  • FIG. 2 is a restriction map of the minicollagen genes (pMOSRA-4B, pOSRA-5, and pOSRA-6) integrated in the piggyBac plasmid vector.
  • FIG. 3 is a diagram showing an electrophoresis image of an amplified product obtained by performing PCR using genomic DNA extracted from a positive F1 silk
  • FIG. 4 is a diagram showing an electrophoresis image of an amplification product obtained by performing RT-PCR using RNA extracted from the silk gland of a fifth-instar larva of a positive F1 silkworm.
  • Lanes 1 and 2 the RT-PCR product of the positive silkworm was electrophoresed, and in Lane C, the RT-PCR product of the wild type silkworm was electrophoresed.
  • Lane M is 100bp ladder power.
  • collagen is a trimer molecule formed from three subunits ( ⁇ chains), and is characterized by having a triple helical structure within the molecule.
  • Some collagen is first synthesized as a precursor, procollagen, and then converted to mature collagen molecules.
  • fibrillar collagen such as collagen type I and type III has a non-triple helix aminopropeptide and a carboxyl propeptide at the amino terminal and carboxyl terminal sides of its triple helix region. It is synthesized as collagen and becomes mature collagen after both propeptides are cleaved by specific proteases.
  • Collagen undergoes various post-translational modifications during its biosynthesis, including proline hydroxylation, lysine hydroxylation, and lysine and hydroxylated lysine oxidation (aldehyde conversion).
  • proline hydroxylation by proline hydroxylase Is very important in achieving stability at physiological temperatures.
  • the human collagen targeted by the invention of this application is all collagens including type I to type XIX collagen, and also includes partial amino acid sequences of these collagens. Also included are those in which a part of the amino acid sequence of these collagens has been modified, and those in which an amino acid sequence not derived from collagen has been added. In addition to mature collagen, it also includes precursors of procollagen and propeptide that have been partially cut.
  • the invention of this application also covers immature collagen molecules in which post-translational modifications including proline hydroxylation are incomplete or triple helical structures are incomplete.
  • the main component of this silk thread is silk protein, which contains fibrous mouth, P25 and sericin, and the synthesis of these silk proteins is enormous, averaging about 0.5 g per silkworm.
  • Silk proteins are synthesized in an organ called the silk gland.
  • the silk gland is composed of the posterior, central, and anterior silk glands, and the posterior silk gland specifically synthesizes and secretes fibrous mouth and P25, and the central silk gland specifically synthesizes and secretes sericin.
  • Fiber mouth is a complex composed of heavy chain and short chain, and P25 is associated with this complex ( ⁇ Biol. Chem. 275: 4051 7-40528, 2000).
  • the fibrillin and P25 secreted from the posterior silk gland are gradually sent to the central silk gland by peristaltic movement of the silk gland, where they are coated around by the secreted sericin, and then to the anterior silk gland. It is sent and spun as silk thread.
  • the silkworm silk gland is an organ having an excellent ability to synthesize proteins, and if recombinant human collagen is expressed in this organ, very high productivity can be expected.
  • the polynucleotide encoding human collagen is integrated into an AcNPV vector or into a plasmid vector prepared based on a DNA-type transposon.
  • the polynucleotide encoding collagen may be human-collagen genomic DNA, cDNA synthesized from mRNA or mRNA, and preferably cDNA.
  • the human collagen cDNA may be any type 1 to type XIX collagen cDNA. The nucleotide sequences of these cDNAs can be obtained from the information described in the literature (eg, Essays Biochem. 27: 49-67, 1992; Annu. Rev. Biochem.
  • Each type of human type I to type XIX cDNA can be obtained by the PCR method or the RT-PCR method using the RNA extracted from human cells as type II.
  • Utilization of expression control sequences (promoter and enzyme) derived from silk protein gene including fibroin H chain, fiproin L chain, P25 and sericin to express human collagen cDNA in silkworm silk gland cells can do.
  • recombinant human collagen can be expressed in a large amount in a silk gland-specific manner.
  • human collagen can be expressed in the posterior silk gland, and the promoter and enhancer of sericin can be used to express human collagen.
  • Human ⁇ Collagen can be expressed in the middle silk gland.
  • the human collagen expression cassette is also used to facilitate the secretion and spinning of silk gland cells.
  • a fusion protein of human-collagen and silkworm silk protein may be synthesized by preparing a fusion polynucleotide with sericin-containing silk protein cDNA and incorporating this fusion polynucleotide into the silkworm genome sequence.
  • the protein to be fused may be a partial amino acid sequence of the silk protein or a full-length amino acid sequence.
  • synthesizing a fusion protein in which the signal peptide of human collagen is replaced with the signal peptide of silk protein secretion of human and collagen from silk gland cells can be facilitated.
  • the gene transfer system is a gene targeting method using an AcNPV vector
  • a targeting vector is constructed by incorporating human collagen cDNA into AcNPV genomic DNA by a standard method, and this is used to infect silkworm larvae for homology.
  • Silkworm cDNA can be incorporated into silkworm genomic DNA by recombination.
  • the site where the human collagen cDNA is incorporated by homologous recombination may be, for example, in the silk protein gene containing the fibrin-in H chain, the fibrin-inlinking chain, P25 and sericin, or in a region other than the silk protein gene. Any genomic DNA region may be used.
  • the integration site is in the silk protein gene, construct an AcNPV targeting vector by ligating DNA sequences homologous to two arbitrary regions in the silk protein gene before and after the human and collagen cDNAs, respectively. .
  • human collagen cDNA is incorporated downstream of the expression control sequence endogenous to the silkworm, and human collagen is expressed from the cDNA by the action of the endogenous silk protein promoter / enhancer.
  • the human-collagen is synthesized so that a fusion protein of the human collagen cDNA and the silk protein is synthesized.
  • Lagen cDNA can also be incorporated into the silk protein gene.
  • incorporation of human collagen cDNA so that the amino acid frame is continued immediately before the stop codon in the 7th exon of the fiproin L chain gene, and a fibrin-inlet chain is synthesized to synthesize a human-collagen fusion protein. be able to.
  • DNA sequences homologous to genomic DNA upstream and downstream from the seventh exon of the fiber chain are inserted into the AcNPV vector before and after the collagen cDNA in an amount of about 0.5 kb to 6.0 kb, respectively.
  • human collagen protein promoter linked upstream of human collagen cDNA should be used.
  • the expression cassette is homologously recombined. DNA sequences homologous to the upstream and downstream of the silkworm genomic DNA region, about 0.5 kb to 6.0 kb, are ligated before and after the expression cassette, and this is incorporated into an AcNPV vector for targeting. Build a Kuta.
  • the human and collagen cDNAs are simultaneously integrated with the same gene, and the next generation (F1) It is also possible to facilitate the selection of transgenic silkworms in the next generation (F2).
  • marker genes include fluorescent protein genes such as GFP, and examples of promoters for expressing marker genes include silkworm actin promoter and Drosophila HSP70 promoter. And the like.
  • Another mode for producing transgenic silkworms incorporating human collagen cDNA is transformation using an insect-derived DMA-type transposon. Insect-derived DNA-type transposons such as piggyBac, mariner (Insect Mol. Biol.
  • a human / collagen expression cassette in which a promoter derived from the silk protein gene containing sericin and an enhancer are linked.
  • an expression cassette in which a promoter and an enhancer derived from a silk protein gene are linked upstream of the fusion polynucleotide is prepared.
  • the nature of piggyBac and the method of introducing a human / collagen expression cassette will be described below with reference to piggyBac as an example.
  • the insect-derived DNA-type transposon used in the present invention is not limited to piggyBac. Other DNA-type transposons, including Minos, may be used.
  • piggyBac is a DNA transposon isolated from ⁇ -368, a cultured cell derived from the lepidopteran insect Trichoplusia ⁇ / '. It is composed of a transposase ORF in the center and 13 bp inverted repeats at both ends, and is about 2.5 kb in length.
  • a transposase protein is synthesized from the transposase ORF, and by the action of this enzyme, a region sandwiched between inverted repeats (piggyBac itself) is transferred to the target sequence TTAA (Virology 161).
  • a human-collagen expression cassette into the silkworm genome sequence using the properties of piggyBac, for example, a method similar to the method of Tamura et al. (Nat. Biotechnol. 18: 81-84, 2000) can be used. Can be done by any method. That is, a pair of inverted piggyBac The repeat sequence is inserted into a suitable plasmid vector, and the human / collagen expression cassette is inserted so as to be surrounded by a pair of inverted repeat sequences. Then, a small amount of this plasmid vector is injected into the silkworm egg together with the piggBac transposase expression vector (helper plasmid).
  • This helper plasmid is a recombinant plasmid vector which lacks one or both of the inverted repeat sequences of piggyBac and substantially incorporates only the transposase gene region of piggyBac.
  • an endogenous transposase promoter may be used as it is as a promoter for expressing the transposase, or a silkworm actin promoter, Drosophila HSP70 promoter, or the like. May be used.
  • a marker gene can be simultaneously inserted into a vector into which a collagen expression cassette has been inserted.
  • a promoter sequence such as the silkworm actin promoter or the Drosophila HSP70 promoter is incorporated upstream of the marker gene, and the marker gene is expressed by its action.
  • transgenic silkworms from the silkworm of the F1 generation and from the silkworm of the F2 generation when using the AcNPV vector is performed using, for example, the PCR method or the Southern blot method.
  • a marker-gene is incorporated, it is possible to select using the phenotype.
  • a fluorescent protein gene such as GFP is used as a marker gene, it can be performed by irradiating F1 or F2 generation silkworm eggs or larvae with excitation light and detecting the fluorescence emitted by the fluorescent protein.
  • the silkworm thus selected is a transgenic silkworm in which human collagen cDNA has been integrated into its chromosome.
  • human collagen cDNA is transmitted without loss, and human collagen or collagen and silk protein are transmitted throughout the generation. Can be produced. Proline hydroxylation was added to the above-mentioned transformed silkworms producing human and collagen.
  • the proline hydroxylase polynucleotide (for example, cDNA) to be introduced may be a polynucleotide derived from human or other animal, or a proline hydroxylase polynucleotide derived from silkworm.
  • Proline hydroxylase is a complex of ⁇ -subunit and ⁇ -subunit, and the enzyme activity does not occur unless this complex is formed.
  • the ⁇ subunit is a subunit having catalytic activity and is originally present in cells that produce collagen.
  • ⁇ -subunit is the same polypeptide as protein disulfide isomerase, which is an enzyme that catalyzes the structural change of protein disulfide bonds, and is present universally and in relatively large amounts in all cells. Bombyx mori silk gland cells are not cells that produce large amounts of collagen, so the amount of ⁇ -subunits is small, but the amount of ⁇ -subunits is relatively large.
  • a method using a proline hydroxylase polynucleotide derived from an animal such as a human as described above is used.
  • a method using a silkworm proline hydroxylase polynucleotide is used.
  • two types of polynucleotides encoding ⁇ -subunit and ⁇ -subunit, respectively, are required.
  • This polynucleotide is a cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a DNA fragment and an RNA fragment isolated and purified from genomic DNA. Genomic DNA and RNA fragments are the salts of SEQ ID NO: 1. It can be obtained by screening PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence. In order to introduce a polynucleotide encoding proline hydroxylase into the silkworm chromosome and express the enzyme in the silkworm silk gland, a promoter capable of expressing the gene in the silk gland is used.
  • Examples of a promoter that satisfies this condition include a promoter for a silk protein containing a fibrillin, P25, and sericin that can express a gene only in a silk gland, and a silkworm that is a promoter that can be expressed in any tissue. Promoters include actin, Drosophila HSP70, and AcNPV IE1. To introduce a proline hydroxylase polynucleotide into a dynamic chromosome, a method similar to the above-mentioned method for introducing human collagen cDNA, that is, a gene targeting method using AcNPV, or a method such as piggyBac is used.
  • the method can be performed by microinjecting a plasmid vector prepared based on a DNA-type transposon into a silkworm egg.
  • a proline hydroxylase polynucleotide may be introduced into a transformed silkworm having a human collagen collagen polynucleotide.
  • human collagen polynucleotides may be introduced into transformed silkworms having a proline hydroxylase polynucleotide.
  • transgenic silkworm having only the human 'collagen polynucleotide and a transgenic silkworm having the proline hydroxylase polynucleotide are separately prepared and crossed to obtain a transgenic silkworm having both polynucleotides. You may select. Both polynucleotides can be introduced using an AcNPV vector, and both polynucleotides can be introduced using a DNA-type transposon vector. A collagen polynucleotide may be introduced, and a proline hydroxylase polynucleotide may be introduced using a DNA transposon type plasmid vector, or vice versa.
  • the transgenic silkworm having the human collagen cDNA When the transgenic silkworm having the human collagen cDNA reaches the age of 5 years of age, it synthesizes human collagen with endogenous silk proteins and secretes the human collagen into the cocoon as part of the silk thread.
  • Human collagen in cocoons can be easily extracted with, for example, 0.5M acetic acid.
  • human collagen when human collagen is synthesized as a fusion protein with a silkworm-fibre mouth and a chain, the disulfide bond between the fusion protein and the fibrous mouth-in H chain is cleaved by reducing to a reduced state. Can be extracted.
  • the cocoon protein is treated with a protease such as pepsin.
  • a protease such as pepsin.
  • human collagen can be extracted and purified from the silk gland of the transformed silkworm in the same manner as in the case of the cocoon. Silk glands can be easily separated by dissecting silkworms.Since most of the protein contained is silk protein, it is easy to extract and purify human collagen as in the case of cocoons. It is possible.
  • the cDNA encoding human type III procollagen was obtained by cloning the cDNA cloned by the inventors of the present application (Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-23979: GeneBank database registration number X14420). And the downstream silkworm.
  • the genomic DNA sequence was determined by the following method based on the base sequence of a known silkworm-five-mouth-in-chain gene (Gene 100: 151-158, 1992: GeneBank database registration number M76430). Was isolated.
  • the nucleotide numbers of the human type III procollagen cDNA and the silkworm-to-five in-chain gene are in accordance with the nucleotide numbers described in the GeneBank database.
  • the site of the restriction enzyme Xhol was also introduced into the nucleotide sequence encoding the aminopropeptide of the type 111 procollagen cDNA by using the same site-directed mutagenesis method as described above.
  • the nucleotide sequence of the mutation-introducing primer corresponds to nucleotides 292 to 324 of the outgrown procollagen cDNA, and has a restriction enzyme Xhol site (positions 17-22 of SEQ ID NO: 7) inserted. .
  • a fragment of the insert sequence (EcoRV-Xhol) was cut out from the previously completed mutant plasmid Mut pRISphl-Xhol and ligated to the Xhol site of the type III procollagen cDNA (construction of a mutation).
  • the SV40 polyA-added signal sequence amplified from PCEP4 (invitrogen) by PCR was inserted downstream of the collagen cDNA (Bgll site).
  • the completed five-mouth-in-collagen / polyA-added signal sequence fragment (EcoRV-Bgll) was added. It was ligated to the EcoRV-Bgll site of pBacPAKhsEGFP.
  • a part of the intron 2 of the strand gene and a part of exon 7 were inserted into the EcoRV site (pBacPAKhsEGFP-FibD).
  • Recombinant virus was produced by co-transfection of the prepared targeting vector pMOSRA-1 and baculovirus DMA to cultured Spodoptera mosquitoes Sf9.
  • pMOSRA-1 0.4 ⁇ g / pl for 7 ⁇ and linear baculovirus D NA
  • Two types of probes were used: a probe that recognized the chain gene and a probe that recognized procollagen cDNA.
  • virus clones derived from four plaques were positive.
  • 1 ⁇ 10 6 Sf9 cells were infected with these positive viruses, and the culture supernatant was collected 3 days later. The virus in the culture supernatant was infected again to Sf9 cells in the same manner to obtain a high titer virus stock.
  • F F1 eggs (100-300 eggs) produced by one mescaico were grouped into one group, and about 50 eggs were sampled from each group, and the remaining eggs were kept.
  • DNA was extracted from the sampled eggs by a standard method, and the presence or absence of a foreign gene was determined by PCR.
  • PCR was performed to detect the SV40 polyA added signal using the primer set (SEQ ID NOS: 8 and 9) or to detect the HSP70 promoter using the primer set (SEQ ID NOs: 10 and 11).
  • a total of 1800 eggs were screened, 15 of which were positive. The remaining eggs of these groups were hatched and the hatched F1 larvae were reared to age five. On the third day of the fifth instar, about 100 ⁇ of body fluid was collected from each larva, and the body fluid cells were separated from these body fluids by centrifugation, DNA was extracted, and screening was performed by PCR. A total of 3400 5th instar larvae were screened, 8 of which were positive. These silkworms continued to be bred, and the emerged silkworms were bred to normal silkworms to lay eggs.
  • the dinitrocellulose membrane onto which the protein was transferred was treated with a blocking solution (3% BSA / 50 mM Tris-HCl buffer ⁇ 7.5 / 50 mM NaCI) at 4 ° C for 16 hours, and then 200 times with the blocking solution.
  • a blocking solution 3% BSA / 50 mM Tris-HCl buffer ⁇ 7.5 / 50 mM NaCI
  • the proteins to which these antibodies reacted were detected using the Vectastine ABC Kit (Vector Laboratory).
  • Vectastine ABC Kit Vector Laboratory
  • Mini river type by digesting human type III procollagen cDNA (base No. 92-4550: GeneBank database registration number X14420) with Xhol to remove the region of base No. 1075-3545, and connecting the cut ends by self-ligation.
  • collagen cDNA was prepared.
  • This minicollagen cDNA is composed of an aminopropeptide, a part of a triple helix region (about 1/5 of the full length collagen triple helix region), and a nucleotide sequence encoding a carboxypropeptide. Based on this, the following three types of vectors were constructed. i) pMOSRA-4B
  • the insert DNA fragment contained in this vector is composed of the silkworm sericin promoter, the minicollagen cDNA, and the silkworm-fiproin chain polyA-added signal.
  • Silkworm genome using primer (SEQ ID NO: 12) and primer (SEQ ID NO: 13) obtained by adding a Bglll cleavage sequence to the 5 ′ end of the silkworm sericin promoter (base number 1299-1622: GeneBank database registration number AB007831)
  • the DNA was isolated by PCR using type II and ligated to the upstream of the minicollagen cDNA.
  • the silkworm-Five mouth L chain polyA addition signal base Nos. 14141-14624: GeneBank Data Base No.
  • pPIGA3GFP vector obtained by cleaving both ends of the insert DNA fragment thus obtained with Bglll, further blunting the cleaved ends with T4 DNA polymerase, cutting with Xhol and then blunting the cleaved ends. (Nat. Biotechnol. 18: 81-84, 2000).
  • the pPIGA3GFP vector contains an EGFP cDNA as a marker and a silk-actin (A3) promoter for expressing this cDNA.
  • the insert DNA fragment contained in this vector is composed of Bombyx mori's mouth-in L chain promoter, Bombyx mori invain chain signal peptide cDNA, minicollagen cDNA, and Bombyx mori-fiproin chain polyA addition signal.
  • Bombyx mori five-in-chain signal peptide cDNA (nucleotide numbers 28-160: GeneBank database entry No. X17291) was isolated by PCR using silkworm gland-derived cDNA as type III using a primer (SEQ ID NO: 16) and a primer (SEQ ID NO: 17) incorporating an Xhol cleavage sequence at the 5 ′ end.
  • Example 2 In addition, in the same manner as described in Example 1 (2), an Xhol cleavage sequence was introduced into the region encoding the procollagen amino propeptide, and the region from the 5 ′ end of the cDNA to the Xhol cleavage site was ligated into a fiber. Mouth-in-chain signal peptide was replaced with cDNA.
  • a primer (SEQ ID NO: 18) and a primer (SEQ ID NO: 19) having a silkworm-five-mouth in-chain promoter (nucleotide numbers 428 to 1061: GeneBank database accession number M76430) having an Xbal and Bglll cleavage sequence added to the 5 'end are added. ⁇ ⁇ ) and isolated by PCR using genomic DNA as ⁇ , and ligated to the upstream of the silkworm-in-chain signal peptide cDNA. The signal was ligated downstream of the minicollagen cDNA ( Figure 2). Both ends of the thus obtained insert DNA fragment were cut with Bglll, the cut ends were blunted with T4 DNA polymerase, then cut with Xhol, and then inserted into the pPIGA3GFP vector whose cut ends were blunted.
  • the insert DMA fragment contained in this vector is composed of the silkworm-fibre-mouthed-chain promoter, silkworm, and the silkworm-fibre-mouthed full-length cDNA, minicollagen cDNA, and the silkworm-fibre-mouthed L-chain polyA addition signal.
  • Silkworm-Five mouth in L chain full length cDNA base Nos. 30-820: GeneBank database registration number X17291
  • the cDNA from silkworm silk gland was isolated by PCR using type II.
  • this cDNA was replaced with the region from the 5 'end of the minicollagen cDNA to the Xhol cleavage site introduced into the amino peptide as in the case of pMOSRA-5.
  • a silkworm's fiber-inlet-chain promoter was ligated upstream of the silkworm-ligand-in L chain cDNA, and a silkworm-fibre-inlet-chain polyA addition signal was ligated downstream of the minicollagen cDNA (Fig. 2).
  • RNA is extracted by the guanidine phenol-clonal-form method, and 200 ng of the RNA is reverse-transcribed to form C-DNA.
  • PCR was performed 30 cycles under the reaction conditions of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute (RT-PCR).
  • RT-PCR RT-PCR
  • one set of the above primers SEQ ID NOS: 22 and 23 was used.
  • SEQ ID NOS: 22 and 23 was used as a result, it was possible to detect minicollagen mRNA, and it was confirmed that the minicollagen gene integrated into the silkworm genomic DNA was expressed in the silk gland cells (Fig. 4).
  • the electrophoresed protein was transferred to a nitrocellulose membrane BA85 (S & S). Then, after 16 hours at 4 ° C in two Bok Russia cellulose membrane blocking solution proteins were transferred (3 0/0 BSA / 50 mM Bok squirrel-HCl buffer PH7.5Z150 mM NaCI), in blocking solution
  • the cells were reacted with a 200-fold diluted anti-human / pishi type III collagen antibody for 1 hour at room temperature.
  • the proteins to which these antibodies reacted were detected using the Vectastine ABC Kit (Vector Laboratory). As a result, recombinant minicollagen protein was detected from the cocoon.
  • Example 3 Silkworm 'Proline hydroxylase ⁇ -subunit cDNA
  • a partial sequence of silkworm-pron hydroxylase ⁇ -subunit cDNA was cloned by degenerate PCR using mixed primers. Compare the amino acid sequences of the previously reported human, Drosophila, and nematode proline hydroxylase ⁇ -subunit genes and deduce from the amino acid sequence based on the conserved regions between species.
  • the mixed primers (3 (SEQ ID NO: 26) and ⁇ 5 ⁇ (SEQ ID NO: 27) having the nucleotide sequences to be determined were designed.
  • ⁇ indicates a, c, g or t, r indicates a / g, y indicates c or t, sc or g, and w indicates a or t.
  • RNA was extracted from BmN4 cells, a silkworm cultured cell, and the second instar larvae of the silkworm, respectively, to obtain a type II PCR.
  • the cDNA obtained by reverse transcription of 200 ng of the RNA was subjected to PCR for 40 cycles under the reaction conditions of 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • an amplification product of about 150 bp was confirmed by electrophoresis in both the BmN4 cell and the second instar larva of the silkworm, and the amplification product was subcloned into PCR2.1 of Invitrogen and the base sequence was determined by the didexy method.
  • this cDNA fragment had high homology to proline hydroxylase ⁇ -subunit of other animals at both the nucleotide sequence level and the amino acid sequence level predicted therefrom. It turned out that there was.
  • the upstream and downstream of the obtained silkworm proline hydrolase ⁇ -subunit cDNA fragment were isolated by the RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) method. Based on the nucleotide sequence of the cDNA fragment, a 5 ′ RACE primer GSP1 (SEQ ID NO: 28) and a 3 ′ RACE primer GSP2 (SEQ ID NO: 29) were designed.
  • RACE was performed using the Clontech SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit. As a result of RACE, a cDNA fragment of about 1.7 kb in the 5 'region and about 1.2 kb in the 3' region could be confirmed by electrophoresis. Subclone these cDNA fragments as described above. When the nucleotide sequence was analyzed, it was found that all the sequences encoding silkworm proline hydroxylase ⁇ -subunit were included. The nucleotide sequence of the obtained full-length cDNA is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of silkworm proline hydroxylase ⁇ -subunit encoded by this cDNA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a transgenic silkworm that produces recombinant human or collagen as a part of a protein contained in a cocoon or a silk gland, and a silkworm that is produced by the silkworm Recombinant human collagen is provided. Since the recombinant human-collagen is recovered from the cocoon or silk gland of the transgenic silkworm, the collagen can be easily extracted and high-purity collagen can be easily obtained. In addition, the recombinant human collagen produced by the transgenic silkworm has no danger of contaminating pathogens such as viruses and prions, and is a safe human collagen with no antigenicity to humans. It can be used in various industrial fields such as food, food and cosmetics.

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Description

明細 ¾F ヒ卜■コラーゲンを産生する形 S転換カイ
技術分野 この出願の発明は、 組換えヒ卜 ·コラーゲンを産生する形質転換カイコに関す るものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 組換えヒ卜 ·コラーゲンを 産生する形質転換カイコと、 この形質転換カイコを作製するための組換えべクタ 一、 並びに組換えヒ卜■ コラーゲンの製造方法に関するものである。
背景技術 コラーゲンは細胞外基質を構成する代表的タンパク質であり、 細胞の足場とな つて生体の構造を維持するといつた機械的機能の他、 細胞の増殖、 分化、 移動な どを制御する様々な生理的機能を有している。 そのためコラーゲンは生体の損傷 を修復するためのバイオマテリアルとして （丄 Surg. Res. 10:485-491 , 1970) 、 またある種の薬剤を徐放するためのキャリア一として （丄 Controlled Release 33:307-315, 1995) 、 医療分野で広く利用されている。 しかし、 現在用いられて いるコラーゲンの大部分はゥシゃブタ等の動物組織由来のものであり、 これらの コラーゲンをヒ卜に移植した場合、 約 3 %の患者にアレルギー反応が生じること が知られている ( J. Immunol.136:877-882, 1986 ； Biomaterials 11 :176-180, 1990) 。 また、 動物組織由来コラーゲンにおけるウィルスやブリオン等病原体混 入の危険性は近年大きな問題となっている。 そのため抗原性が無く、 また病原体 混入の危険性が無い組換え型ヒ卜 ·コラーゲンを生産するシステムが望まれてい る。 そこで、 この出願の発明者らは、 ヒ卜 ■ コラーゲンをコードする cDNAを揷 入した組換えウィルスを昆虫細胞に感染させることにより、 ヒ卜生体内のものと 同等な三重らせん構造を有する組換えヒ卜 ·コラーゲンを製造する方法を発明し、 特許出願している （特開平 8-23979号公報） 。 また、 哺乳動物細胞や酵母を用い てヒ卜■ コラーゲンを製造する方法も考案されている （特表平 7-501937 公報） 。 前記のとおり、 組換えヒ卜 ·コラーゲンを生産する方法として、 昆虫細胞、 哺 乳動物細胞、 酵母を用いる方法等が考案されているが、 昆虫細胞や哺乳動物細胞 を用いる方法では医療分野で用いることが可能なほどの高い生産量を上げること は難しい。 また、 酵母を用いる方法は、 組換え産物が菌体内に産生されるため、 組換えヒ卜■コラーゲンの精製は必ずしも容易ではない。 この出願の発明は、 以土のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、 従来技 術の問題点を解消し、 高い生産性と精製の容易さを兼ね備えた組換えヒ卜 · コラ 一ゲン生産法と、 そのための遺伝子工学材料を提供することを課題といている。
発明の開示 この出願の第 1の発明は、 ヒ卜■ コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを ゲノム DNA 内に有し、 組換えヒ卜 · コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク 質の一部として産生する形質転換カイコである。 この出願の第 2の発明は、 ヒ卜 ■ コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タ ンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、 前記融合タン パク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコで ある。 これらの第 1発明および第 2発明の形質転換カイコには、 カイコ成虫、 幼虫、 蛹および卵が含まれる。 また、 これら第 1発明および第 2発明の形質転換カイコにおいては、 プロリン 水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードする ポリヌクレオチドをゲノム DNA内に有することを好ましい態様としている。 この出願の第 3の発明は、 前記第 1発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺か ら組換えヒト■ コラーゲンを単離、 精製することを特徴とする組換えヒ卜 ■ コラ 一ゲンの製造方法である。 この出願の第 4発明は、 前記第 2発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から 組換えヒ卜 ·コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、 こ の融合タンパク質から組換えヒ卜■コラーゲンを分離、 精製することを特徴とす る組換えヒ卜 ·コラーゲンの製造方法である。 この出願の第 5発明は、 前記第 2発明の形質転換カイコが産生する組換えヒ 卜 · コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質である。 この出願の第 6の発明は Autographs californica 核多角体ウィルス由来のター ゲティングベクターであり、 このべクタ一は、 ヒト · コラーゲンをコードするポ リヌクレオチドをカイコ ■ゲノムの任意領域と相同組換えし、 ヒ卜 ·コラーゲン を産生する形質転換カイコを作成するために使用する。 なお、 この出願の発明に おいて、 「ヒ卜 ' コラーゲンをコードするポリヌクレオチド」 とは、 コラーゲン を発現するヒ卜核酸分子であり、 ヒ卜 ·ゲノム DNA、 ゲノム DNAから転写され る mRNA、 mRNAから合成される cDNA等である。 この第 6発明のターゲティングベクターの 1つの態様は、 ヒ卜 ■コラーゲンを コードするポリヌクレオチドの両端に、 カイコ絹タンパク質をコードするゲノム DNA (カイコ絹タンパク質遺伝子） の任意領域と相同の DNA 配列を有すること である。 このターゲティングベクターは、 ヒ卜 .コラーゲンをコードするポリヌ クレオチドを、 カイコ ·ゲノムの絹タンパク質遺伝子の （すなわち、 内在性の） 発現制御配列 （プロモーター Zェン八ンサー配列） の下流に相同組換えする。 この第 6発明のターゲティングベクタ一の別の態様は、 ヒ卜 . コラーゲン発現 カセッ卜の両端に、 カイコ 'ゲノム DNAの任意領域と相同の DNA配列を有する ことである。 このタ一ゲティングベクターは、 ヒ卜 · コラーゲン発現カセットを、 カイコ ·ゲノムの任意領域に相同組換えする。 なお、 この 「発現カセット」 とは、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 · コラーゲンをコード するポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを意味する。 この出願の第 7の発明は、 プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュ ニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドをカイコ ■ゲノムの任意 領域と相同組換えするための、 Autographa californica 核多角体ウィルス由来の 夕一ゲティングベクターである。 この出願の第 8の発明は、 昆虫由来 DMA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反 復配列に挟まれた領域に、 ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を有する組換えプラス ミドベクターである。 この出願の第 9の発明は、 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反 復配列に挟まれた領域に、 プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニ ッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミド ベクターである。 この出願の第 1 0 の発明は、 前記第 8発明の組換えプラスミドベクターと、 卜 ランスポゾンの卜ランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換え プラスミドベクターとからなるベクターセッ卜である。 このべクタ一セッ卜の使 用によって、 ヒ卜 · コラーゲン発現カセットがカイコ ·ゲノムに転移され、 ヒ 卜 -コラーゲンを産生する形質転換カイコが作成される。 この出願の第 1 1 の発明は、 前記第 9発明の組換えプラスミドベクターと、 卜 ランスポゾンのトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換え プラスミドベクターとからなるベクターセットである。 この第 1 1 発明のベクタ 一セットと、 前記第 10 発明のベクターセットとの使用によって、 プロリンが水 酸化されたヒ卜■コラーゲンを産生する形質転換カイコが作成される。 この出願の第 12 の発明は、 配列番号 2のアミノ酸配列を有するカイコ ·プロ リン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチドであり、 具体的に は、 配列番号 1の塩基配列を有する DNA断片である。 なお、 この出願の各発明においては、 プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコ ードするポリヌクレオチドが、 配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少な くともコード領域であることを好ましい態様としている。 また、 ヒ卜 'コラーゲ ン発現カセッ卜が、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであ ること、 またはカイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、 カイコ絹 タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 · コラーゲンをコードするポリ ヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであることを好ましい態様として いる。
図面の簡単な説明 図.1 は、 卜ランスラファ一ベクター pMOSRA-1の制限酵素地図である, 図 2は、 piggyBac プラスミドベクターに組み込まれたミニコラーゲン遺伝子 (pMOSRA-4B, p OSRA-5, p OSRA-6) の制限酵素地図である。 図 3は、 陽性 F1 カイコ成虫から抽出したゲノ厶 DNAを錶型'として PCRを行 い、 その増幅産物の電気泳動像を示す図である。 1および 2は陽性カイコの番号 を表す。 レーン Mは 100bpラダーマーカ一である。 図 4は、 陽性 F1カイコ 5齢幼虫の絹糸腺から抽出した RNAを用いて RT-PCR を行い、 その増幅産物の電気泳動像を示す図である。 レーン 1および 2には陽性 カイコの RT-PCR産物を、 レーン Cには野生型カイコの RT-PCR産物を泳動し た。 レーン Mは 100bpラダ一マ一力一である。
発明を実施するための最良の形態 コラーゲンには現在までに I型から XIX型までの 19種の異なった型のものが 存在することが知られている。 これらのコラーゲンはいずれも 3つのサブュニッ 卜 （α 鎖） から形成される三量体分子で、 その分子内に三重らせん構造をもつこ とが特徴である。 コラーゲンの中には、 先ず前駆体であるプロコラーゲンとして 合成された後、 成熟型のコラーゲン分子に変換されるものがある。 例えばし Iし III型コラーゲン等の線維性コラーゲンは、 その本体である三重らせん領域のアミ ノ末端側およびカルボキシル末端側に非三重らせん構造のァミノプロペプチドお よびカルボキシルプロべプチドを有したプロコラーゲンとして合成され、 両方の プロペプチドが特異的なプロテア一ゼにより切断された後、 成熟したコラーゲン となる。 また、 コラーゲンはその生合成過程で、 プロリンの水酸化、 リジンの水 酸化、 リジンおよび水酸化リジンの酸化 （アルデヒド化） 等を含む様々な翻訳後 修飾を受ける。 特にプロリン水酸化酵素によるプロリンの水酸化は、 コラーゲン が生理的温度での安定性を獲得する上で非常に重要である。 この出願の発明が対象とするヒ卜 ·コラーゲンは、 I型から XIX型コラーゲン を含むすべてのコラーゲンであり、 これらコラーゲンの部分アミノ酸配列も含む。 また、 これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、 コラーゲン に由来しないアミノ酸配列を付加したものも含む。 また、 成熟したコラーゲンに 加え、 前駆体であるプロコラーゲンやプロペプチドの一部が切断されたのもの含 む。 さらに、 この出願の発明では、 プロリンの水酸化を含む翻訳後修飾が不完全 であったり、 三重らせん構造が不完全である未成熟なコラーゲン分子も対象とす る。 カイコは吐糸期にはいると、 大量の絹糸を吐き出して繭を作る。 この絹糸の主 成分はフイブ口イン、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質であり、 これら絹 タンパク質の合成量は 1頭のカイコあたり平均で約 0.5 g にも達するほど莫大で ある。 絹タンパク質は絹糸腺と呼ばれる器官で合成される。 絹糸腺は後部絹糸腺、 中部絹糸腺および前部絹糸腺より構成され、 後部絹糸腺ではフイブ口インおよび P25が、 中部絹糸腺ではセリシンがそれぞれ特異的に合成 ·分泌される。 フイブ 口インは H鎖およびし鎖から構成される複合体で、 さらにこの複合体に P25が 会合している （丄 Biol. Chem. 275:4051 7-40528， 2000) 。 後部絹糸腺から分泌さ れたフイブ口インおよび P25 は、 絹糸腺の蠕動運動によって徐々に中部絹糸腺 へと送られ、 そこで分泌されたセリシンによって周りを被覆され、 さらに前部絹 糸腺へと送られ絹糸として吐糸される。 このように、 カイコ絹糸腺は優れたタン パク質合成能力を有した器官であり、 この器官で組換えヒ卜 · コラーゲンを発現 させた場合、 非常に高い生産性が期待できる。 さらに、 絹糸は体外に排出される こと、 絹糸を構成する絹タンパク質の種類が少ないこと、 および絹タンパク質の 中で最も存在量の多いフィプロインは水溶液に不溶性であることから、 合成され た組換えヒ卜 ·コラーゲンをカイコが吐き出した繭から、 または絹糸腺内のタン パク質から回収および精製することは著しく容易である。 カイコにおける一過性の外来遺伝子発現システムはカイコ核多角体ウィルス
(BmNPV) をべクタ一として利用する方法が確立されている （特公平 7-97995 号公報） 。 しかし、 この方法ではウィルスの感染によりカイコは致死するため、 次世代以降に外来遺伝子を伝達することはできず、 有用タンパク質の発現は一代 限りである。 そのため、 外来遺伝子を発現させる度にウィルス接種を行う必要が ある。 一方、 森らは iogf/"ap/7a ca//7o/Y7/'ca核多角体病ウィルス （AcNPV) を力 ィコ幼虫に感染させることにより、 カイコを致死させることなく遺伝子を導入し、 メスに感染させた場合には生殖細胞を通じて次世代まで外来遺伝子を伝達するこ とが可能な方法を開発した （特開平 6-277051 号公報） 。 さらに、 山尾らはフィ プロイン L鎖遺伝子配列の一部を組み込んだ AcNPVをカイコ幼虫に感染させ、 遺伝子ターゲティングにより外来遺伝子をカイコゲノムのフイブ口イン L鎖遺伝 子に挿入した形質転換カイコを作製することに成功している （Genes Dev. 13: 51 1 -516， 1999) 。 また、 田村ら （Nat. Biotechnol. 18:81 -84, 2000) は、 鱗翅目昆虫 7>7'c 7op/us/'a mに由来する DNA型トランスポゾンである piggyBacを組み込んだプラスミドべ クタ一をカイコ卵に微量注射することにより、 外来遺伝子を挿入した形質転換力 ィコを作製することに成功している。 これらの方法で作出された形質転換カイコにおいて、 挿入された外来遺伝子は 脱落することなく染色体内に維持され、 世代を通じて永続的に組換えタンパク質 を発現する。 この出願の発明では、 ヒ卜 · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを AcNPVベクターへ、 または DNA型卜ランスポゾンをもとに作製したプラスミド ベクターへ組み込み、 これらのベクターを用いてカイコ ·ゲノム配列内にヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを挿入した形質転換カイコを作製する, ヒ卜 ■コラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、 ヒ卜 ·コラーゲンのゲノ 厶 DNA、' mRNAまたは mRNAから合成した cDNA等を用いることができるが、 好ましくは cDNAを使用する。 以下では、 cDNAを使用した場合について主に説 明するが、 この発明に使用するポリヌクレオチドは cDNAに限定されるものでは ない。 ヒ卜■コラーゲン cDNAは 1型から XIX型コラーゲンのいずれの cDNAであ つてもよい。 これらの cDNA の塩基配列は文献 （例えば、 Essays Biochem. 27:49-67, 1992； Annu.Rev. Biochem. 64:403-434, 1995) に記載された情報から 入手可能である。 例えば、 これらの cDNA配列に基づいて作製したオリゴヌクレ 才チドをプローブとしてヒ卜 cDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、 あるいは cDNA配列の両端に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、 ヒ 卜の遺伝子を錶型とする PCR法、 またはヒ卜細胞から抽出した RNAを錶型とす る RT-PCR法によって、 ヒ卜 I型〜 XIX型コラーゲンの各 cDNAを得ることがで さる。 カイコ絹糸腺細胞にてヒ卜 · コラーゲン cDNAを発現させるために、 フイブ口 イン H鎖、 フィプロイン L鎖、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子 由来の発現制御配列 （プロモーターおよびェン八ンサ一） を利用することができ る。 これら絹タンパク質のプロモーターおよびェンハンサーを利用して発現カセ ッ卜を構築することにより、 組換えヒ卜 · コラーゲンを絹糸腺特異的に大量に発 現させることができる。 例えば、 フイブ口イン H 鎖、 フイブ口イン L鎖、 P25 のプロモータ一およびェンハンサーを利用すれば、 ヒ卜 ·コラーゲンを後部絹糸 腺で発現させることができ、 セリシンのプロモーターおよびェンハンサーを利用 すれば、 ヒ卜 · コラーゲンを中部絹糸腺で発現させることができる。 ヒ卜 · コラ 一ゲン発現カセットはまた、 絹糸腺細胞からの分泌や吐糸を容易にするために、 ヒ卜 ■ コラーゲン cDNAとフイブ口イン H鎖、 フイブ口インし鎖、 P25および セリシンを含む絹タンパク質 CDNAとの融合ポリヌクレオチドを作製し、 この融 合ポリヌクレオチドをカイコ ·ゲノム配列内に組み込むことにより、 ヒ卜 - コラ 一ゲンとカイコ絹タンパク質の融合タンパク質を合成させても良い。 この場合、 融合させるタンパク質は絹タンパク質の部分アミノ酸配列であっても良いし、 全 長アミノ酸配列であっても良い。 例えば、 ヒト ·コラーゲンのシグナルペプチド を絹タンパク質のシグナルペプチドと置換した融合タンパク質を合成させれば、 ヒ卜， コラーゲンの絹糸腺細胞からの分泌を容易にすることができる。 また、 例 えばフイブ口イン L鎖全長とヒ卜■コラーゲンの融合タンパク質を合成させれば、 合成されたフイブ口イン L鎖とヒト 'コラーゲンの融合タンパク質は、 フイブ口 イン H鎖とジスルフィ ド結合により複合体を形成し、 より効率良く分泌させるこ とができる。 遺伝子導入系が AcNPV ベクターを用いた遺伝子ターゲテイング法である場合、 ヒ卜■コラーゲン cDNAを定法により AcNPVゲノム DNA内に組み込んでター ゲティングベクターを構築し、 これをカイコ幼虫に感染させることにより、 相同 組換えによりカイコ ■ゲノム DNA内にヒ卜 ·コラーゲン cDNAを組み込むこと ができる。 相同組換えによりヒ卜■コラーゲン cDNAを組み込む部位は、 例えば フイブ口イン H鎖、 フイブ口イン し鎖、 P25およびセリシンを含む絹タンパク 質遺伝子内であっても良いし、 あるいは絹タンパク質遺伝子以外の任意のゲノム DNA領域であっても良い。 組み込み部位が絹夕ンパク質遺伝子内の場合は、 その絹タンパク質遺伝子内の 2箇所の任意領域と相同の DNA配列を、 それぞれヒ卜 ·コラーゲン cDNAの前 後に連結して AcNPV ターゲテイングベクターを構築する。 このタ一ゲティング ベクターの感染によって、 カイコ内在性の発現制御配列の下流にヒト ·コラーゲ ン cDNAが組み込まれ、 内在性絹タンパク質プロモーター/ェンハンサ一の作用 によって cDNAからヒ卜 ·コラーゲンが発現される。 またこの場合、 ヒ卜 · コラ 一ゲン cDNAと絹タンパク質との融合タンパク質が合成されるように、 ヒ卜 - コ ラーゲン cDNAを絹タンパク質遺伝子内に組み込むこともできる。 例えば、 フィ プロイン L鎖遺伝子第 7ェクソン内の終始コドン直前にアミノ酸フレームが一続 きになるようにヒ卜 ·コラーゲン CDNAを組み込み、 フイブ口インし鎖とヒ卜 - コラーゲンの融合タンパク質を合成させることができる。 この場合の AcNPV ベ クタ一内には、 コラーゲン cDNAの前後に、 フイブ口インし鎖第 7ェクソンから 上流および下流のゲノム DNAと相同の DNA配列をそれぞれ 0.5 kb〜6.0 kb程度 挿入する。 また、 絹タンパク質遺伝子以外の任意のゲノム DNA 配列内にヒ卜 ·コラーゲ ン cDNAを相同組換えする場合には、 ヒト ·コラーゲン cDNAの上流に絹タンパ ク質遺伝子プロモーターを連結したヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を作製する。 そして発現カセットを相同組換えするカイコ ·ゲノム DNA領域から上流および 下流のそれぞれ 0.5 kb〜6.0 kb程度に相同の DNA配列を発現カセッ卜の前後に 連結し、 これを AcNPV ベクターに組み込んでターゲテイングべクタ一を構築す る。 相同組換え部位が絹タンパク質遺伝子内の場合、 および絹タンパク質遺伝子 以外の任意のゲノム配列のどちらの場合でも、 ヒ卜 · コラーゲン cDNAと共にマ 一力一遺伝子を同時に組み込み、 次世代 （F1 ) さらに次の世代 （F2) での形質 転換カイコの選抜を容易にさせることも可能である。 マ一カー遺伝子としては、 例えば GFP等の蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができ、 また、 マーカー遺 伝子を発現させるためのプロモー夕一としては、 例えばカイコ ·ァクチンプロモ 一夕—やショウジヨウバエ HSP70プロモーター等を挙げることができる。 ヒ卜 ·コラーゲン cDNAを組み込んだ形質転換カイコを作製するための別の態 様は、 昆虫由来 DMA 型卜ランスポゾンを利用した形質転換である。 piggyBac、 mariner (Insect Mol. Biol. 9: 145-155, 2000) 、 および Minos (Insect Mol. Biol. 9： 277-281 , 2000) 等の昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンは、 カイコ細胞内で転移 活性を示すことが知られており、 これらの DNA型卜ランスポゾンをもとに作製 したプラスミドベクターによりカイコを形質転換させることが可能である。 特に piggyBac をもとに作製したプラスミドベクターは、 カイコ卵に微量注入するこ とにより、 実際にカイコを形質転換させることに成功している （Nat. Biotechnol. 1 8： 81 -84, 2000) 。 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンを利用する場合、 外来遺伝 子はカイコ ·ゲノム内の任意の配列に組み込まれる。 従って、 カイコ ■ゲノム配 列内に組み込んだヒ卜 ·コラーゲン cDNAを絹糸腺にて発現させるために、 あら かじめヒ卜 ·コラーゲン cDNAの上流にフイブ口イン H鎖、 フイブ口イン L鎖、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子由来のプロモーターおよびェンハ ンサ一を連結したヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜を作製しておく必要がある。 また、 ヒ卜 · コラーゲンと絹タンパク質の融合ポリヌクレオチドを組み込む場 合には、 この融合ポリヌクレオチドの上流に絹タンパク質遺伝子由来のプロモ一 ターおよびェンハンサーを連結した発現カセッ 卜を作製しておく。 以下に piggyBac を例に挙げて、 その性質およびヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を導入 する方法を説明するが、 この発明で使用する昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンは piggyBacに限定するものではなく、 marinerおよび Minosを含む他の DNA型卜 ランスポゾンを使用しても良い。 これら piggyBac 以外の卜ランスポゾンを用い た場合のヒト · コラーゲン発現カセッ 卜を導入する方法は、 以下に記した piggyBacを用いた方法と基本的に同様である。 piggyBacは、 鱗翅目昆虫 Trichoplusia π/'由来の培養細胞である ΤΝ-368から単 離された DNA型トランスポゾンである。 中央部にある卜ランスポゼース ORFと、 その両端に存在する 13 bpの逆向き反復配列から構成されており、 長さは約 2.5 kbである。 卜ランスポゼース ORFからは卜ランスポゼースタンパク質が合成さ れ、 この酵素の作用により、 逆向き反復配列にはさまれた領域 （piggyBac 自 体） を標的配列である TTAAに転移させる （Virology 1 61 : 8-17, 1 989) 。 このよ うな piggyBac の性質を利用してカイコ ·ゲノム配列内にヒ卜 -コラーゲン発現 カセッ トを挿入するには、 例えば田村らの方法 （Nat. Biotechnol. 18: 81 -84, 2000) と同様な方法によって行うことができる。 即ち、 piggyBac の一対の逆向 き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、 ヒ卜 · コラーゲン発現カセ ッ卜を一対の逆向き反復配列で夾むように挿入する。 そしてこのプラスミドべク ターを、 piggBac の卜ランスポゼース発現ベクター （ヘルパープラスミド） と共 にカイコ卵へ微量注入する。 このヘルパープラスミドは、 piggyBac の逆向き反 復配列の片方または両方を欠いた、 実質的には piggyBac の卜ランスポゼース遺 伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。 このへルパ 一プラスミドにおいて、 トランスポゼースを発現させるためのプロモータ一は、 内在性の卜ランスポゼースプロモータ一をそのまま利用しても良いし、 あるいは、 カイコ ■ァクチンプロモーターやショウジヨウバエ HSP70 プロモーター等を利 用してもよい。 次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、 コラーゲン 発現カセットを組み込んだベクター内に同時にマ一カー遺伝子を組み込んでおく こともできる。 この場合、 マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ ·ァクチンプロ モーターやショウジヨウバエ HSP70 プロモーター等のプロモーター配列を組み 込み、 その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
F1 世代のカイコからの、 および AcNPVベクターを用いた場合はさらに F2世 代のカイコからの形質転換カイコの選抜は、 例えば PCR法やサザンブロッ卜法 を用いて行う。 また、 マーカ一遺伝子を組み込んだ場合には、 その表現形質を利 用して選抜することも可能である。 例えばマーカー遺伝子として GFP等の蛍光 タンパク質遺伝子を利用した場合には、 F1 や F2世代のカイコ卵や幼虫に励起光 を照射し、 蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。 このようにして選抜されたカイコは、 その染色体内にヒ卜■ コラーゲン cDNAが 組み込まれている形質転換カイコである。 従って、 これらのカイコを野生型カイ コと、 あるいは形質転換カイコどうしで交配させた子孫においてもヒ卜 ·コラー ゲン cDNAは消失することなく伝達され、 世代を通じてヒ卜 · コラーゲンまたは コラーゲンと絹タンパク質との融合タンパク質を産生させることができる。 上記のヒ卜 · コラーゲンを産生する形質転換カイコに、 さらにプロリン水酸化 酵素をコードするポリヌクレオチドを絹糸腺で発現しうる形態で導入すれば、 生 理的温度において完全に熱安定なヒ卜 'コラーゲンを生産させることができる。 導入するプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチド （例えば cDNA) は、 ヒ卜ゃ他の 動物に由来するポリヌクレオチドであっても良いし、 カイコ由来のプロリン水酸 化酵素ポリヌクレオチドでも良い。 プロリン水酸化酵素は αサブユニットと βサ ブュニッ卜の複合体であり、 この複合体を形成しなければ酵素活性は生じない。 α サブユニットは触媒活性を有するサブユニットであり、 本来コラーゲンを産生 する細胞に存在する。 一方、 β サブュニッ卜はタンパク質のジスルフィド結合の 構造変換を触媒する酵素であるプロテインジスルフィ ドイソメラーゼと同一のポ リペプチドであり、 全ての細胞に普遍的にかつ比較的多量に存在する。 カイコ絹 糸腺細胞は、 コラーゲンを多量に産生する細胞ではないので αサブュニッ卜の存 在量はわずかであるが、 β サブユニットは比較的多量に存在する。 カイコにプロ リン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入し、 カイコ絹糸腺にてプロリン水酸化酵 素を発現させるには、 上記のようにヒ卜等の動物由来のプロリン水酸化酵素ポリ ヌクレオチドを用いる方法と、 カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを 用いる方法がある。 ヒ卜等動物由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用 いる場合、 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜のそれぞれをコードする 2種類 のポリヌクレオチドが必要である。 昆虫の βサブュニッ卜はヒ卜等動物由来の α サブユニットとほとんど活性型の複合体を形成しないため、 ヒト等動物由来の α サブユニットの発現のみでは活性型の酵素を合成させることができない。 一方、 カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合は、 α サブユニット のものだけでよい。 絹糸腺にて発現する αサブユニットは、 比較的多量に存在す る内在性の βサブュニッ卜と活性型の複合体を形成することができるからである。 この出願は、 カイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブユニット （配列番号 2 ) をコ ードする新規なポリヌクレオチドを提供する。 このポリヌクレオチドは、 配列番 号 1の塩基配列を有する cDNA、 およびゲノム DNAから単離 ·精製された DNA 断片および RNA断片である。 ゲノム DNA断片や RNA断片は、 配列番号 1の塩 基配列に基づいて作成したオリゴヌクレ才チド等を用いたスクリ一二ングゃ PCRによって得ることができる。 プロリン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをカイコ染色体内に導入し てカイコ絹糸腺で酵素を発現させるためには、 絹糸腺で遺伝子を発現させること が可能なプロモーターを利用する。 この条件を満たすプロモーターとしては、 例 えば絹糸腺だけで遺伝子を発現させることができるフイブ口イン、 P25、 および セリシンを含む絹タンパク質のプロモーターや、 どの組織でも発現可能なプロモ 一ターであるカイコ ·ァクチン、 ショウジヨウバエ HSP70、 AcNPVの IE1 等の プロモーターを挙げることができる。 プロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを力 ィコ染色体に導入するには、 前記のヒ卜■コラーゲン CDNAを導入するための方 法と同様な方法、 即ち、 AcNPV を用いた遺伝子ターゲティング法あるいは、 piggyBac等の DNA型トランスポゾンを基に作製したプラスミドベクターをカイ コ卵にマイクロインジェクションする方法によって行うことができる。 ヒ卜 -コ ラーゲンとプロリン水酸化酵素の両方のポリヌクレオチドを有するカイコを作製 するためには、 ヒ卜 ' コラーゲン ポリヌクレオチドを有する形質転換カイコに プロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入しても良いし、 逆にプロリン水酸化 酵素ポリヌクレオチドを有する形質転換カイコにヒ卜 · コラーゲン ポリヌクレ 才チドを導入しても良い。 あるいは、 ヒ卜 'コラーゲン ポリヌクレオチドのみ を有する形質転換カイコと、 プロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを有する形質 転換カイコを別々に作製し、 これらを交配させることによって、 両方のポリヌク レオチドを有する形質転換カイコを選抜しても良い。 なお、 AcNPV ベクタ一に よって両方のポリヌクレオチドをそれぞれ導入し、 あるいは DNA 型卜ランスポ ゾンベクターによって両方のポリヌクレオチドをそれぞれに導入することができ るが、 AcNPV夕一ゲティングベクターを用いてヒ卜 . コラーゲン ポリヌクレオ チドを導入し、 DNA 卜ランスポゾン型のプラスミドベクターを用いてプロリン 水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入してもよく、 あるいはその逆であってもよい ヒ卜 · コラーゲン cDNAを有する形質転換カイコは、 5齢期に達すると、 内在 性の絹タンパク質と共にヒ卜 · コラーゲンを合成し、 絹糸の一部として繭中にヒ ト ·コラーゲンを分泌する。 繭中のヒ卜 ·コラーゲンは例えば 0.5M 酢酸等によ つて簡単に抽出することができる。 また、 例えばヒ卜 · コラーゲンをカイコ ·フ イブ口インし鎖との融合タンパク質として合成させた場合には、 還元状態にする ことにより融合タンパク質とフイブ口イン H鎖間のジスルフィ ド結合を切断し抽 出することができる。 また、 繭中に含まれるヒ卜 ·コラーゲンが線維性コラーゲ ンであり、 三重らせん領域部分 （ァテロコラーゲン） のみを精製する場合には、 繭のタンパク質をペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する。 この操作により 夕ンパク質分解酵素で消化されることのないァテロコラーゲンが抽出でき、 かつ 他の多くのタンパク質はペプシンの消化を受けるため、 その後の精製を容易に行 うことができる。 また、 ヒ卜 ·コラーゲンを形質転換カイコの絹糸腺から繭の場 合と同様の方法で抽出■精製することもきる。 絹糸腺はカイコを解剖することに より簡単に分離することができ、 含まれる夕ンパク質のほとんどが絹夕ンパク質 であるため、 繭の場合同様、 容易にヒ卜 ' コラーゲンを抽出 ·精製することが可 能である。
実施例 以下に、 ヒ卜 III型コラーゲンの製造方法に関する実施例を挙げてこの出願の発 明をより具体的に説明するが、 この出願の発明はこの例に限定されるものではな い。 実施例 1
AcNPVベクターを用いた »伝子タ一ゲティング法による
形質転換カイコの作製 ヒ卜 III型プロコラーゲンをコードする cDNAは、 この出願の発明者らがクロー ニングした cDNA (特開平 8-23979 号公報： GeneBank データベース登録番号 X14420) を、 また、 カイコ - フイブ口インし鎖遺伝子およびその下流のカイ コ 'ゲノム DNA 配列は、 既知のカイコ · フイブ口インし鎖遺伝子の塩基配列 (Gene 100:151-158, 1992： GeneBankデータべ-ス登録番号 M76430) を基に 以下の方法で単離した。 なお、 以下の記載において、 ヒト III型プロコラーゲン cDNAおよびカイコ -フ イブ口インし鎖遺伝子の塩基番号は、 前記 GeneBankデータベースに記載記され ている塩基番号に準じている。
(1 ) カイコ ·フイブ口インし鎖遺伝子およびその下流域ゲノム D N A配列の単離 PCR 法を用いてフイブ口インし鎖イン卜ロン 6内の遺伝子断片の増幅を行つ た。 PCR プライマーは、 前記データベースの配列を基に合成したオリゴヌクレ ォチド （配列番号 3 および配列番号 4) を用い、 铸型にはカイコ tokai x asahi strainのゲノム DMAを使用した。 次いで、 得られた DNA断片をプローグに用い て、 λΕΜΒΙ_3により構築されているカイコ kinshu x showa strainゲノムライブラ リ一を定法に従いスクリーニングした。 その結果フイブ口イン L鎖遺伝子の塩基 番号 9600 から下流に約 15kb の領域を含んでいるカイコ 'ゲノム DNA 断片 (pRI/ 0k) を得た。
(2) 部位特異的突然変異導入による制限酵素認識配列の作製
フイブ口イン L鎖遺伝子ェクソン 7内に III型プロコラーゲン cDNAを繋ぐため、 部位特異的突然変異導入によりフイブ口イン遺伝子に新たな制限酵素サイ卜を設 けた。 突然変異導入はクロンテック社の Mutagenesお Kitを使用した。 突然変異 導入用プライマー （配列番号 5) はフイブ口イン L鎖遺伝子ェクソン 7のス卜ッ プコドン直前に制限酵素 Xho I部位 （配列番号 5の位置 8— 12) を設けるように 設計した。 錶型プラスミドには、 pRI/10k から EcoRI— Sphl 断片 （塩基番号 12000- 14800) を PUC18 にサブクロ一ニングしたもの （pRISphl/2.9k) を使用 した （Mut pRISphl-Xhol) 。 同様にして、 フイブ口インし鎖遺伝子下流領域フラ グメン卜 （塩基番号 14200— 18900) を挿入するため、 突然変異導入により Xbal 部位を新たに設けた。 突然変異導入用プライマー （配列番号 6) はフイブ口イン し鎖遺伝子ェクソン 7のストップコドン直前に Xbal部位 （配列番号 6の位置 12 - 17) を設けるように設計した。 錶型プラスミドには、 先と同様の pRISphl/2.9k を使用した (Mut pRISphl-Xhol) 。
111型プロコラーゲン cDNAのァミノプロペプチドをコードする塩基配列内にも、 上記同様の部位特異的突然変異法を用いて制限酵素 Xhol のサイ卜を導入した。 突然変異導入用プライマー （配列番号 7) の塩基配列は出型プロコラーゲン cDNAの塩基番号 292から 324に対応し、 制限酵素 Xhol部位 （配列番号 7の位 置 17-22) が揷入されている。 (3) 卜ランスファーベクターの構築
クロンテック社のバキュロウィルストランスファ一ベクター pBacPAK9 を制限 酵素 Smal および EcoRI で消化し、 pCaSepR-hsp ( GeneBank 登録番号 U59056) から切り出したショウジヨウバエ HSP70プロモーターと EGFP cDNA (クロンテック） を連結した DNA フラグメント （EcoRV— EcoRI) をライゲ一 シヨンした後、 大腸菌 DH5aに卜ランスフォームした （pBacPAKhsEGFP) 。 ラ ィゲ一シヨンは TaKaRa社 Ligation Kit Ver. 1を使用し、 卜ランスフォーメ一シ ョン等は定法に従い行った。
先に完成したミュータン卜プラスミド Mut pRISphl - Xholからインサー卜配列 のフラグメント （EcoRV— Xhol ) を切り出し、 III型プロコラーゲン cDNA の Xhol 部位 （突然変異導入にょリ搆築） に連結した。 続いて PCR によって PCEP4 (インビ卜ロジェン） より増幅した SV40 polyA付加シグナル配列をコラ —ゲン cDNAの下流 （Bgll部位） に挿入した。 そして、 完成したフイブ口イン - コラーゲン · polyA 付加シグナル配列フラグメン ト （ EcoRV― Bgll ) を pBacPAKhsEGFP の EcoRV—Bgll 部位に連結した。 次にフイブ口インし鎖遺伝 子のイン卜ロン 2の一部〜ェクソン 7の一部 （塩基番号約 10000— 13100) を EcoRV部位に挿入した (pBacPAKhsEGFP- FibD 。
続いてミュータントプラスミド Mut pRISphl -Xbalからインサー卜配列のフラ グメント EcoRV— Sphl 1.7kbp (塩基番号約 13100— 14800) を切り出し、 pRI/10k の Smai— Sphl (部分消化によって） 部位に挿入した。 完成した Mut Rl/10kから切り出した Xbal消化フラグメント （フイブ口イン遺伝子ェクソン 7 の一部およびその下流域/塩基番号約 14200—18900) を pBacPAKhsEGFP— Fib1 に挿入した （pM〇SRA-1 ：図 1 ) 。
(4) 組換えウィルスの作製
作製したターゲティングベクター pMOSRA-1 とバキュロウィルス DMAをョト ゥガ培養細胞 Sf9にコ · トランスフエクシヨンすることにより組換えウィルスの 作製を行った。 pMOSRA-1 0.4Mg/pl を 7 μし 線状バキュロウィルス D N A
(Pharmingen) Ο. Ι μς/μΙを 1 μΙにリポフエクチン (Gibco) 4μΚ 水 4μΙを加え良 く混合した後、 無血清培地 SF900— II (Gibco) に置き換えた Sf9 細胞 1 χ 105 cellsの上に滴下し培養した。 24時間後 10%血清入り Grace培地を 1 ml添加し てさらに 3日間培養した後培養上清を回収した。
(5) 組換えウィルスのスクリーニングおよび純化
1 x 10s個の Sf9細胞に上記のウィルス液 100μΙ を加え、 28°Cで 1時間感染さ せた。 上清を除き、 1 %低沸点ァガロース溶液 （SEAPLAQUE, FMC) を含む Grace培地 1 mlを加え固化させた。 培養 3日後、 生じたプラークに波長 360 nm の励起光を照射し、 緑色蛍光を発しているプラーク、 すなわち EGFPを発現して いる細胞のプラークを 10 個、 寒天ごと切り出した。 次にこれらのプラークから 回収した組換えウィルスを再び 1 O6個の Sf9細胞に感染させ、 細胞内の DNA を抽出し、 ドットプロットを行った。 プローブにはフイブ口インし鎖遺伝子を認 識するプローブとプロコラーゲン cDNAを認識するプローブの 2種類を用いた。 その結果、 4つのプラークに由来するウィルスクローンが陽性であった。 次にこ れら陽性ウィルスを 1 χ 106個の Sf9 細胞に感染させ、 3日後に培養上清を回収 した。 培養上清中のウィルスを同様にして再び Sf9細胞に感染させ、 高力価のゥ ィルスストックを得た。
(6) 組換えバキュロウィルスのカイコ 5齢幼虫への感染
カイコ 5齢 1 日目のメス幼虫に 50μΙ のウィルス液 （5 x 10 s pfu) を皮下注射 した。 接種した幼虫が踊化してから 3〜4日目にメタノールに溶解した 20- hydroxyecdysone (2 mg/ml) を 10μ1投与した。 羽化後、 正常カイコガの才スと 交配させ、 産卵させた。
(7) F1カイコのスクリーニング
Ί頭のメスカイコが生んだ F1卵 （100~300粒） を 1グループとし、 各グルー プから約 50 粒の卵をサンプリングし、 残りの卵については飼育を続けた。 サン プリングした卵から定法により DNAを抽出し PCR法により外来遺伝子の有無を 判定した。 PCR は、 プライマーセッ卜 （配列番号 8 および 9) を用いて SV40 polyA付加シグナルを検出するように、 またはプライマーセット （配列番号 10 および 11 ) を用いて HSP70プロモーターを検出するように行った。
合計 1800グループの卵をスクリーニングした結果、 15グループが陽性であり、 これらのグループの残りの卵を孵化させ、 孵化した F1 幼虫を 5齢まで飼育した。 5齢 3日目に各幼虫より約 100μΙの体液を採取し、 これらの体液から遠心操作に より体液細胞を分離し、 DNA を抽出した後、 PCR 法によりスクリーニングを行 つた。 合計 3400 匹の 5齢幼虫をスクリーニングした結果、 8匹が陽性であった。 これらのカイコは飼育を続け、 羽化したカイコガを正常カイ ガと交配させ産卵 させた。
(8) F2カイコのスクリ一二ング
F2 カイコのスクリーニングは緑色蛍光により行った。 1齢幼虫期に波長 360 nm の励起光をあて、 EG FP の緑色蛍光を発する個体、 すなわちマ一カー遺伝子 として挿入した EGFPを発現している個体を選別した。 8グループの F2卵をス クリーニングした結果、 2匹の陽性カイコを得ることが出来た。
(9) 組換えヒ卜コラーゲンの検出
陽性 F2 カイコを吐糸期まで飼育し、 繭中のタンパク質を SDS-サンプル緩衝 液 （0.125M 卜リス塩酸緩衝液、 pH 6.8Z 4 % S D S /10% 2—メルカプトエタ ノール/ 20%グリセロール） を加えて混合し 5分間 100°Cで熱処理することによ り抽出した。 この試料を S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （Nature 227:680-685, 1970) に供し、 Matudaira らの方法 (J. Biol. Che . 261 :10035- 10038, 1987) に準じて、 泳動されたタンパク質を二卜ロセルロース膜 B A 8 5 ( S & S社） に転写した。 次に、 タンパク質が転写された二卜ロセルロース膜を ブロッキング液 （3 % BSA/50 mM トリス塩酸緩衝液 ρΗ 7.5/ 50 mM NaCI) で 4 °Cにおいて 16時間処理した後、 ブロッキング液で 200倍に希釈した抗ヒ卜 Zゥシ III型コラーゲン抗体と室温で 1時間反応させた。 これらの抗体が反応する タンパク質をべクタスティン ABC キット （ベクターラボラトリー社） で検出し た。 その結果、 繭中からヒト III型コラーゲンを検出した。
実施例 2 piggyBacベクターの卵への微量注入法による
形 K転換カイコの作製 (1 ) piggyBacプラスミドベクターの作製
ヒト III型プロコラーゲン cDNA (塩基番号 92— 4550: GeneBankデータベース 登録番号 X14420) を Xholで消化し塩基番号 1075-3545の領域を取り除いた後、 切断末端をセルフライゲ一ションにより繋ぐことにより、 ミニ川型コラーゲン cDNAを作製した。 このミニコラーゲン cDNAは、 ァミノプロペプチド、 三重ら せん領域の一部 （全長コラーゲン三重らせん領域の約 1/5) 、 およびカルボキシ ルプロペプチドをコードする塩基配列から構成されるものであり、 これをもとに して、 以下の 3種類のベクターを構築した。 i) pMOSRA-4B
このベクターに含まれるインサー卜 DNA 断片は、 カイコ ·セリシンプロモー ター、 ミニコラーゲン cDNA、 およびカイコ -フィプロインし鎖 polyA付加シグ ナルより構成される。 カイコ ·セリシンプロモーター （塩基番号 1299-1622 : GeneBankデータベース登録番号 AB007831 ) を 5'末端に Bglll切断配列を付加 したプライマ一 （配列番号 12) およびプライマ一 （配列番号 13) を用いたカイ コ ·ゲノム DNA を錶型とする PCR によって単離し、 これをミニコラーゲン cDNA上流に連結した。 また、 カイコ · フイブ口イン L鎖 polyA付加シグナル (塩基番号 14141— 14624 ： GeneBankデ一夕ベース登録番号 M76430) をプラ イマ一 （配列番号 14) および 5'末端に Bglll切断配列を付加したプライマー （配 列番号 15) を用いたカイコ ·ゲノム DNAを錶型とする PCR によって単離し、 ミニコラーゲン cDNAの下流に連結した （図 2 ) 。 このようにして得られたイン サ一卜 DNA断片の両末端を Bglllで切断し、 さらに切断末端を T4DNAポリメラ ーゼで平滑化した後、 Xhol で切断した後切断末端を平滑化した pPIGA3GFP ベ クタ一 （Nat. Biotechnol. 18: 81 -84, 2000) に挿入した。 なお、 pPIGA3GFPべク 夕一には、 マーカーとしての EGFP cDNAとこの cDNAを発現させるためのカイ コ -ァクチン （A3) プロモーターが組み込まれている。 ii) pMOSRA-5
このベクターに含まれるインサ一卜 DNA断片は、 カイコ ' フイブ口イン L鎖 プロモーター、 カイコ ·フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNA、 ミニコラ一 ゲン CDNA、 およびカイコ ·フィプロインし鎖 polyA付加シグナルより構成され る。 カイコ 'フイブ口イン し鎖シグナルペプチド cDNA (塩基番号 28— 160 ： GeneBankデータベース登録番号 X17291 ) をプライマー （配列番号 16) および 5'末端に Xhol切断配列を組み込んだプライマー （配列番号 17) を用いたカイコ 絹糸腺由来 cDNAを錶型とする PCRによって単離した。 また、 実施例 1 (2)に記 した方法と同様にして、 プロコラーゲンァミノプロペプチドをコードする領域内 に Xhol 切断配列を導入し、 CDNA5'末端からこの Xhol切断部位までの領域を、 フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNAと置換した。 さらに、 カイコ - フイブ 口インし鎖プロモータ一 （塩基番号 428— 1061 ： GeneBankデータベース登録番 号 M76430) を 5'末端に Xbalおよび Bglll切断配列を付加したプライマー （配列 番号 18) およびプライマー （配列番号 19) を用いたカイコ ■ゲノム DNA を錶 型とする PCR によって単離した後、 これをカイコ ■フイブ口イン し鎖シグナル ペプチド cDNAの上流に連結し、 また、 カイコ ·フイブ口イン L鎖 polyA付加シ グナルをミニコラーゲン cDNAの下流に連結した （図 2 ) 。 このようにして得ら れたインサー卜 DNA断片の両末端を Bglllで切断し、 さらに切断末端を T4DNA ポリメラーゼで平滑化した後、 Xhol で切断した後切断末端を平滑化した pPIGA3GFPベクターに挿入した。
III) pMOSRA-6
このベクターに含まれるインサー卜 DMA断片は、 カイコ ·フイブ口インし鎖 プロモータ一、 カイコ ■フイブ口インし鎖全長 cDNA、 ミニコラーゲン cDNA、 およびカイコ ·フイブ口イン L鎖 polyA付加シグナルより構成される。 カイコ - フイブ口イン L鎖全長 cDNA (塩基番号 30—820 ： GeneBankデータベース登録 番号 X17291 ) は、 プライマー （配列番号 20) および 5'末端に Xhol切断配列を 組み込んだプライマー （配列番号 21 ) を用いたカイコ絹糸腺由来 cDNA を錶型 とする PCRによって単離した。 次にこの cDNAを、 pMOSRA-5の場合と同様に して、 ミニコラーゲン cDNA の 5'末端からァミノプロペプチド内に導入した Xhol切断部位までの領域と置換した。 さらに、 カイコ ·フイブ口イン L鎖 cDNA の上流にカイコ 'フイブ口インし鎖プロモータ一を、 ミニコラーゲン cDNAの下 流にカイコ ·フイブ口インし鎖 polyA付加シグナルを連結した （図 2 ) 。 このよ うにして得られたインサー卜 DNA断片の両末端を Xbalで切断し、 さらに切断末 端を T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、 Xholで切断した後切断末端を平滑化 した pPIGA3GFPベクターに挿入した。 (2) プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入
上記の 3種類のミニコラーゲンベクター （ pMOSRA-4B， pMOSRA-5, pMOSRA-6) を塩化セシウム超遠心法で精製した後、 この 3種類のベクタ一とへ ルパープラスミドである pHA3PIG (Nat. Biotechnol. 18: 81 -84， 2000) を混合し、 さらにエタノール沈殿を行った後、 ミニコラ一ゲンベクターそれぞれの濃度が 66.7 g/mi (合計で 200 pg/ml) 、 pHA3PIGの濃度が 200 g/mlなるようにイン ジェクシヨンバッファ一 （0.5 mMリン酸バッファー pH 7.0, 5 mM KCI) に溶解 した。 この DNA 溶液を、 産卵後 2 ~ 8時間の前胚盤葉期のカイコ卵 （カイコ 胚） に、 一つの卵あたり約 15~20 nlの液量で微量注入した。 合計 1078個の卵 に微量注入を行った。
(3) F1幼虫のスクリ一二ング
ベクター DNAを微量注入した卵を 25°Cでインキュベートしたところ 518個の 卵が孵化した。 孵化したカイコの飼育を続け、 413 頭の生殖可能な成虫が得られ たためこれらを交配し、 213グループの F1卵塊を得た。 次に、 これら F1卵を孵 化させ、 孵化した幼虫をグループ毎に蛍光顕微鏡で観察した。 その結果、 26 グ ループから緑色蛍光を発する幼虫を得ることができた。 陽性グループに含まれる 陽性カイコの数は、 1グループあたり 1 頭〜 30 頭であり、 これらを合計すると 240頭であった。 これら陽性 F1 カイコを飼育し野生型カイコと交配させ、 さら に次の世代 （F2) カイコを得た。 F2 カイコのうち約 1/2 のカイコは緑色蛍光を 発しており、 組み込まれた EGFPおよびミニコラーゲン遺伝子は、 脱落すること なく、 メンデルの法則に従って次世代へ伝達されることが確認された。 さらに、 産卵後の F1カイコ成虫からゲノム DNAを抽出し、 プライマーセット （配列番号 22および 23) を用いた PCRによりミニコラ一ゲン DNA断片を、 またプライマ 一セット （配列番号 24および 25) を用いた PCRにより EGFP断片を増幅した ところ、 緑色蛍光を発する陽性カイコからミニコラ一ゲンおよび EGFP DNA 断 片を検出することができた （図 3 ) 。 さらにサザンプロット解析を行い、 これら 外来遺伝子がカイコ ·ゲノム DNA内に組み込まれていることを確認した。
(4) ミニコラーゲン mRNAおよび組換えミニコラーゲンの検出
5齢期に達した陽性 F1 幼虫を解剖して絹糸腺を取りだし、 酸グァニジンフエ ノールクロ口ホルム法により total RNAを抽出し、 そのうちの 200 ng分の RNA を逆転写して得られた CDNAを錶型とし PCRを 94°C 1 分、 60°C 1 分、 72°C1 分 の反応条件で 30 サイクル行った （RT-PCR) 。 プライマーは、 上記のプライマ 一セット （配列番号 22および 23) を用いた。 その結果、 ミニコラーゲン mRNA を検出することができ、 カイコ 'ゲノム DNA に組み込まれたミニコラーゲン遺 伝子が、 絹糸腺細胞内で発現していることが確かめられた （図 4 ) 。
次に、 組換えミニコラーゲンタンパク質の検出を試みた。 陽性 F1 カイコを吐 糸期まで飼育し、 吐き出した繭中のタンパク質を SDS-サンプル緩衝液 （0.125M 卜リス塩酸緩衝液、 pH 6.8 4 0/0 503 θ% 2—メルカプトエタノール/ 20%グ リセロール） を加えて混合し 5分間 100°Cで熱処理することにより抽出した。 こ の試料を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 （Nature 227:680-685, 1 970) に 供し、 Matudairaらの方ミ去 (J . Biol. Chem. 261 :10035-1 0038, 1 987) に準じて、 泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜 BA85 (S&S社） に転写した。 次に、 タンパク質が転写された二卜ロセルロース膜をブロッキング液 （3 0/0 BSA/50 mM 卜リス塩酸緩衝液 PH7.5Z150 mM NaCI) で 4 °Cにおいて 16時間処理した 後、 ブロッキング液で 200倍に希釈した抗ヒ卜/ゥシ III型コラーゲン抗体と室温 で 1 時間反応させた。 これらの抗体が反応するタンパク質をべクタスティン ABC キット （ベクターラボラトリー社） で検出した。 その結果、 繭中から組換 えミニコラーゲンタンパク質を検出することが出来た。 実施例 3 カイコ 'プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜 cDNA
のクローニング 先ず、 混合プライマーを用いた degenerate PCR法によって、 カイコ ·プロり ン水酸化酵素 αサブュニッ卜 cDNAの部分配列をクローニングした。 すでに報告 されているヒ卜、 ショウジヨウバエ、 および線虫のプロリン水酸化酵素 αサブュ ニット遺伝子のアミノ酸配列を比較し、 種間で保存されている領域をもとに、 ァ ミノ酸配列から推定される塩基配列をもつ混合プライマー Ρ3 (配列番号 26) 、 Ρ5ΙΙ (配列番号 27) を設計した。 なお、 混合プライマー配列中、 ηは a、 c、 gま たは t、 rは aま/こは g、 yは cまたは t、 s cまたは g、 wは aまには tである ことを示す。 続いて PCRの錶型とするため、 カイコ培養細胞である BmN4細胞 とカイコ 2齢幼虫からそれぞれ total RNAを抽出した。 そのうちの 200 ng分の RNAを逆転写して得られた cDNAを錶型とし PCRを 94°C 1分、 58°C 1分、 72°C 1 分の反応条件で 40サイクル行った。 その結果、 BmN4細胞とカイコ 2齢幼虫 ともに電気泳動で約 1 50bp の増幅産物が確認でき、 その増幅産物をインビ卜ロ ジェン社 PCR2.1 にサブクロ一ニングし、 ジデ才キシ法によって塩基配列を決定 したところ、 この cDNA断片は塩基配列レベル、 そこから予想されるアミノ酸配 列レベルともに他動物のプロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜と高い相同性をもち、 カイコ ■プロリン水酸化酵素 cDNAの部分断片であることが明らかになった。 続いて、 全長 cDNAをクローニングするため、 得られたカイコ ·プロリン水酸 化酵素 α サブュニッ卜 cDNA 断片の上流、 下流を RACE (Rapid Amplification cDNA Ends)法によって単離した。 cDNA 断片の塩基配列から 5'RACE 用プライ マー GSP1 (配列番号 28) 、 3'RACE用プライマー GSP2 (配列番号 29) を設計 した。 RACEはクロンテック社 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitを使用 して行った。 RACE の結果、 電気泳動で、 5'領域約 1 .7kb、 3'領域約 1 .2kb の cDNA断片を確認することができた。 これらの cDNA断片を上記同様にサブクロ 一二ングし、 その塩基配列を解析したところ、 カイコ ·プロリン水酸化酵素 αサ ブュニッ卜をコードする配列を全て含んでいた。 得られた全長 cDNAの塩基配列 を配列番号〗に、 この cDNAがコードするカイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブュ ニッ卜のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 組換えヒ卜，コラーゲ ンを繭または絹糸腺に含まれるタンパク質の一部として生産する形質転換カイコ と、 このカイコが生産する組換えヒ卜 ·コラーゲンが提供される。 組換えヒ卜 - コラーゲンは、 形質転換カイコの吐き出す繭または絹糸腺から回収するため、 抽 出しやすく、 純度の高いコラーゲンを容易に得ることができる。 また、 形質転換 カイコの生産する組換えヒ卜 ·コラーゲンは、 ウィルスやプリオン等の病原体混 入の危険が無く、 またヒ卜に対して抗原性の無い安全ヒ卜 · コラーゲンであるた め、 医療、 食品、 化粧品等の様々な産業分野で利用することが可能である。

Claims

請求の範囲
1 . ヒ卜 ■コラーゲンをコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、 組換えヒ卜 ■コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する 形質転換カイコ。
2 . プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一 方をコードするポリヌクレオチドを、 さらにゲノム DNA 内に有する請求項 1の 形質転換カイコ。
3 . プロリン水酸化酵素 αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、 配 列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少なくともコード領域である請求項 2 の形質転換カイコ。
4 . ヒ卜 'コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質をコードする ポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、 前記融合タンパク質を繭または絹糸 腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコ。
5 . プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一D 方をコードするポリヌクレオチドをさらにゲノム DNA 内に有する請求項 4の形 質転換カイコ。
6 . プロリン水酸化酵素 αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、 配 列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少なくともコード領域である請求項 55 の形質転換カイコ。
7 . 請求項 1 、 2または 3の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒ 卜■コラーゲンを単離、 精製することを特徴とする組換えヒ卜 · コラーゲンの製 造方法。
8 . 請求項 4、 5または 6の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒ 卜 · コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、 この融合夕 ンパク質から組換えヒ卜 · コラーゲンを分離、 精製することを特徴とする組換え ヒ卜■ コラーゲンの製造方法。
9 . 請求項 4、 5または 6の形質転換カイコが産生する組換えヒ卜 · コラーゲ ンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質。
1 0. ヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを有する、 Autographs ca//fo 77/ca核多角体ウィルス由来のターゲティングベクター。
1 1 . ポリヌクレオチドがヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜である請求項 1 0 の夕 ーゲティングベクター。
1 2. ヒ卜 ·コラーゲン発現カセットが、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御 配列の支配下にヒ卜 ·コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合 ポリヌクレオチドである請求項 1 1のターゲティングベクター。
D
13- ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜が、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御 配列の支配下に、 カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 · コ ラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである 請求項 1 1のターゲティングベクター。
5
1 4. プロリン水酸化酵素 α サブュニッ卜および β サブュニッ卜の少なくとも —方をコードするポリヌクレオチドを有する、 Autographs californica 核多角体 ウィルス由来の夕ーゲティングベクター。
15. プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチドが、 配 列番号 1の塩基配列を有する DNA断片の少なくともコード領域である請求項 14 の夕ーゲティングベクター。
16. 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域 に、 ヒト ·コラーゲン発現カセッ卜を有する組換えプラスミドベクタ一。
17. ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜が、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御 配列の支配下にヒ卜 ·コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合 ポリヌクレオチドである請求項 16の組換えプラスミドベクタ一。
18. ヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜が、 カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御 配列の支配下に、 カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 ·コ ラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである 請求項 16の組換えプラスミドベクター。
19. 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域 に、 プロリン水酸化酵素 aサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方 をコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクター。
20. プロリン水酸化酵素 aサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、 配 列番号 1の塩基配列を有する DNA断片の少なくともコード領域である請求項 19 の組換えプラスミドべクタ一。
21 . 請求項 16、 17 または 18 の組換えプラスミドベクターと、 トランスポゾ ンの卜ランスポゼ一スをコ一ドするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミド ベクタ一とからなるベクタ一セッ卜。
22. 請求項 19 または 20 の組換えプラスミドベクターと、 卜ランスポゾンの 卜ランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドべク 夕一とからなるベクターセッ卜。
23. 配列番号 2のアミノ酸配列を有するカイコ 'プロリン水酸化酵素 αサブュ ニッ卜をコードするポリヌクレオチド。
24. 配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片である請求項 23 のポリヌクレ ォチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1482035A1 (en) * 2002-03-06 2004-12-01 Toray Industries, Inc. Process for producing physiologically active protein using genetically modified silkworm

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2852325B1 (fr) 2003-03-13 2005-06-03 Acide nucleique dirigeant l'expression d'un polypeptide d'interet dans les glandes sericigenes posterieures d'un lepidoptere, et ses applications
JP4271122B2 (ja) * 2004-10-15 2009-06-03 財団法人 ひろしま産業振興機構 カイコでの組換えタンパク質製造のためのポリヌクレオチド
KR101323563B1 (ko) * 2005-10-18 2013-10-29 니토 보세키 가부시기가이샤 항체를 생산하는 트랜스제닉 누에와 그의 제조방법
CN101200718B (zh) * 2006-12-11 2013-04-17 南京理工高新技术发展有限公司 类人胶原蛋白基因、其不同重复数的同向串联基因、含有串联基因的重组质粒及制备方法
GB0710614D0 (en) * 2007-06-04 2007-07-11 Lonza Biologics Plc Mammalian expression vector with a highly efficient secretory signal sequence
US20110023154A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Silkworm genome editing with zinc finger nucleases
WO2010074081A1 (ja) 2008-12-22 2010-07-01 国立大学法人北海道大学 三重螺旋構造を有するタンパク質、およびその製造方法
JP5839810B2 (ja) * 2011-03-03 2016-01-06 日本製粉株式会社 フィブリノゲンを産生するトランスジェニックカイコ
JP2014198715A (ja) * 2013-03-15 2014-10-23 岡本株式会社 タンパク質繊維
CN105143243B (zh) * 2013-03-21 2020-03-13 国家科学和工业研究组织 三螺旋蛋白的纯化
CN104313053B (zh) * 2014-10-24 2017-01-18 华南农业大学 一种生产人源胶原蛋白ii型的方法
CA3028523A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Amsilk Gmbh Articles comprising a silk polypeptide for antigen delivery
US20220002389A1 (en) * 2018-10-29 2022-01-06 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Anti-hiv antibody and method for producing same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0823979A (ja) * 1994-07-15 1996-01-30 Terumo Corp ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法
WO1997038121A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Fibrogen, Inc. α2 SUBUNIT OF PROLYL-4-HYDROXYLASE NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SUCH SUBUNIT AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1037278C (zh) * 1992-05-08 1998-02-04 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法
CN1074296C (zh) * 1997-11-05 2001-11-07 浙江农业大学 用蚕表达丙肝抗原制备口服药物的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0823979A (ja) * 1994-07-15 1996-01-30 Terumo Corp ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法
WO1997038121A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Fibrogen, Inc. α2 SUBUNIT OF PROLYL-4-HYDROXYLASE NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SUCH SUBUNIT AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOPKINSON I. ET AL: "The complete cDNA derived sequence of the rat prolyl 4-hydroxylase alpha subunit", GENE, vol. 149, 1994, pages 391 - 392, XP002945823 *
See also references of EP1391509A4 *
TARJA H. ET AL: "Cloning, baculovirus expression and characterization of a second mouse prolyl 4-hydroxylase alpha-subunit isoform: formation of an alpha2beta2 tetramer with the protein disulfide-isomerase/beta subunit", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 4427 - 4431, XP002945822 *
TOSHIKI T. ET AL: "Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 18, no. 1, January 2000 (2000-01-01), pages 81 - 84, XP002945821 *
YAMAO M. ET AL: "Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus", GENES AND DEVELOPMENT, vol. 13, no. 5, 1999, pages 511 - 516, XP002945820 *
YOSHISATO K.: "Kumikae-tai konchuu riyou e no teigen", SANSHI KONCHUU KEN SHIRYOU, vol. 28, March 2001 (2001-03-01), pages 93 - 95, XP002945824 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1482035A1 (en) * 2002-03-06 2004-12-01 Toray Industries, Inc. Process for producing physiologically active protein using genetically modified silkworm
EP1482035A4 (en) * 2002-03-06 2005-11-09 Toray Industries METHOD FOR THE PRODUCTION OF PHYSIOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN USING A GENETICALLY MODIFIED SILK ROBUST
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