WO2001023591A1 - Procédé de production de transglutaminase - Google Patents

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WO2001023591A1
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transglutaminase
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protein
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Yoshimi Kikuchi
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Yukiko Umezawa
Keiichi Yokoyama
Hiroshi Matsui
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Definitions

  • the present invention relates to a method for secreting a kind of protein, especially transglutaminase, by corynebacterium.
  • the transglutaminase that is secreted or produced is an enzyme that catalyzes the transacylation of the carboxyamide group in the peptide pot of the protein.
  • a reaction to form £ _ (r-Glu) -Lys 3 ⁇ 4 ⁇ and a conversion reaction to Glu by deamidation of Gin may occur.
  • This transglutaminase is used for the gelation of jellies and other products, the manufacture of yogurt, cheese, or gel cosmetics, and the modification of meat quality (Japanese Patent Publication 503822).
  • it is a highly industrial enzyme that is used for the production of heat-stable microcapsule materials and carriers for immobilized enzymes.
  • transglutaminase has been known to be of animal origin and of microbial origin (micro-mouthed vial transglutaminase: hereinafter referred to as “MTG”).
  • the former is a calcium ion-dependent enzyme that is distributed in animal organs, skin, blood, and so on.
  • guinea pig liver transglutaminase K. Ikura et Biochemistry 27, 2898 (1988)
  • human ⁇ skin keratinocyte transglutaminase M. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)
  • human lilL coagulation factor ⁇ A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900 (1990)).
  • Streptovertici Ilium has been described as being calcium-independent.
  • Streptoverticillium cinnamoneum Streptoverticillium griseocarneum
  • S. cinnamoneum Streptoverticillium cinnamoneum subsp.cinnamoneum
  • S. cinnamoneum Streptoverticillium cinnamoneum subsp.cinnamoneum
  • S. cinnamoneum Streptoverticillium cinnamoneum subsp.cinnamoneum
  • Stref. Tono-tissilium-mono 'Laens Streptoverticillium mobara ense
  • S.niobaraense Streptoverticillium mobaraense
  • transglutaminase These micro-structures of transglutaminase were identified as “-:: transglutaminase” by peptide mapping and in-density analysis, and it was found that they had no IM property compared to conventional ones. (European specialty; No. 1 public No. 0481 504 Al). Minute product "II comes from transglutaminase (MTG), I:,; from dl class ⁇ -products, ⁇ ' : Manufactured ⁇ In addition, the production of transglutaminase by the S method has been observed; The transglutaminase and its il gene are described, for example, in Biosci. Biotechnol.
  • transposable elements with coryne> ⁇ mfi1 have been reported [W093 / 18151; EP0445385; f-6_46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6 (1995) ;, 7-107976].
  • Transfer r- is a DNA fragment that can be transferred in Ikkyu I: It is known that it is present in a wide range of ffls from nuclear to nuclear. A transposon using metastasis factor was recalculated [W093 / 18151; Special Question 7-107976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); Special Question 9-1 7029 1] , it has become possible to revealed the different poles ⁇ ] 1 in the transposon research. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a coryneform bacterium to produce an industrially useful heterologous protein, particularly transglutaminase, and to efficiently secrete (secretory production) this extracellularly. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing a heterologous protein, particularly transglutaminase.
  • Mizun Hjj added a proline to the signal stream of coryne, which encodes the signal peptide region of the will (corresponding to the region of the cell, particularly the protein; the protein peptide region).
  • transgenic coryneform bacterium is cultured with human bacteria to secrete and express protransglutaminase and these proteases to produce protransglutaminase.
  • This is a method for obtaining a transglutaminase obtained by cutting the pro-structure portion of the above.
  • secreted by a protein or peptide means that a protein or peptide molecule is transported out of a bacterial cell (extracellularly), and finally the protein or peptide. This includes not only the case where the molecule is completely free in the medium, but also the case where only the part exists outside the cell and the case where it exists on the cell surface. Tatsura's form to implement Yunmei
  • coryneform bacteria are introduced as a system of host vectors, and transglutaminase ⁇ , which contains the pro-structural part of the secretory protein in the signal stream of cell debris from the coryne column.
  • transglutaminase ⁇ which contains the pro-structural part of the secretory protein in the signal stream of cell debris from the coryne column.
  • proteases and the like are expressed in the same manner as the pro-transglutaminase gene constructs; ⁇ Transfer the transformed coryneform bacterium into the coryneform 1 'together with the p-construct, or introduce the transformed coryneform bacterium into another coryneform bacterium and transform the resulting transformed coryneform bacterium into a pro-form.
  • the transglutaminase which is obtained by cleaving the pro part of the protransglutaminase, can be directly obtained outside the cells. It is known that secreted proteins are generally translated as peptides or prepbu peptides and then become mature proteins. That is, generally, after being translated as a peptide or a pre-peptide, the signal peptide
  • Pre-part is cleaved and converted to the mature peptide or pro-peptide, and the pro-peptide is further cleaved by the protease to form the mature peptide.
  • the term “signal sequence” refers to a sequence that is present at the N-terminus of a secretory protein precursor and is not present in a naturally occurring mature protein. “Signal peptide” is such a protein. Refers to a peptide cleaved from a precursor. Generally, the signal sequence is cleaved by a protease (commonly called a signal peptide) for secretion out of the cell. Although such signal peptides have a defined sequence of characteristics across organisms, certain signal peptides exhibiting secretory functions in one product necessarily have a secretory function in other rice products. That is not to say.
  • the signal peptide of the present invention which is one of the proteins that arrives at a certain protein in the evening. Although it may be a naturally occurring signal peptide, it is preferred that it comes to the secreted protein t., Or to use an appropriate codon depending on the frequency of ffili codons used.
  • the signal peptide of the present invention which can be used in the present invention may partially contain the N-terminal amino acid sequence of the natural mature protein from which it is derived. Tan with different signal peptides
  • the preproprotein is sometimes referred to as a “heterologous fusion protein.” For example, when the protein is transglucinase, the protein is referred to as “prebu protein”.
  • Bacterial cells ⁇ protein ft include corynebacterium glutamicum (glutamicum) cells PS1 and PS2 imum ⁇ - [features ⁇ , 6 — 5 0 2 5 4 8], and Corynebacterium-cells of Corynebacterium ammoniagenes (hereinafter sometimes abbreviated as C. ammonia genes) ⁇ Transmission of SlpA, a protein f-[Special-10 — 1 0 8 6 7 5] is only known.
  • [1, ",] of PS1 and S1 pA has homology of young F (about 30%), but other than that, almost no fll [HJ is observed. No homology was found in the signal sequence region .
  • the signal sequences of PS1 and PS2 of Corynebacterium glutamicum are shown in SEQ ID NOS: 29 and 1, and S of Corynebacterium ammonia ammonia
  • SEQ ID NO: 2 The signal sequence of 1 pA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Corynebacterium glutamicum (formerly known as glutamicum) Name Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermen turn)
  • the PS2 protein gene was cloned from the ATCC13869 strain and its sequence was determined.
  • the signal sequence region showed a difference from that of known glutamicum. No differences were observed, but two differences were observed up to the N-terminal amino acid residue 38 of the mature cell surface protein (40 residues of Thr ⁇ A sn, 5 residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7). G1y at the fifth residue is G1u).
  • Its signal sequence contains 30 amino acid residues and the N-terminal amino acid of mature cell surface protein. In SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence was reduced to SEQ ID NO: 7.
  • Actinomycetes [The original transglutaminase II gene has a high GC content, but coryneform bacteria are close to it, and their codon usage is similar, so the actinomycete parasite itself can be used as it is. There are advantages. Therefore, the present invention examined whether the transgenic yeast Minase gene of the actinic mountain, Yamagi, could be used as it was, and concluded that the signal peptide of the transgenic evening Minase, derived from the actinic W, was coryneform bacterium. It became clear that it did not work.
  • the transglutaminase gene encoding a mature protein containing a pro-structure derived from actinomycetes fused with a signal peptide of a cell surface protein derived from a coryneform bacterium functions effectively and has a pro-structure It has been clarified that it is efficiently secreted outside the cells as a proprotein. It also contains the signal peptide 30 amino acid S residue of the cell surface protein and an extra 38 amino acid residues in the N-terminal portion of the mature cell surface protein, that is, the N-terminal of the mature cell surface protein. Transglu evening with a professional structure part where parts are fused It was shown that the use of a minase gene further increased the efficiency of extracellular secretion of protease glutaminase.
  • the coryneform bacterium referred to in the present invention is an aerobic Gram-positive bacterium, which includes bacteria that were previously classified as Brevi bacterium but are now integrated into corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol). , 41, 255 (1981)), and also includes bacteria that are always closely related to corynepacteria.
  • the advantage of using coryneform cells is that they have been used for secretion of ft. Ft., which is considered to be suitable for secretion of ft.
  • the production of protein is very low, and the secretion of protein i is very simple and can be simplified.
  • the simple production of sugar, ammonia and inorganic salts Go to the land ⁇ i, rent and 1 ⁇ 2 It is that you are.
  • the coryne can be used as i 'i in this pi river.
  • Brevibacterium' Saccharolyticum ATCC14066 which can be replaced by L-glutamic acid production ⁇ 1 ', Brevibacterium innimario film ATCC14068, Brevibacterium lactofu amentum (Corynebacterium guru mimicum) ATCC13869, Brevibacterium rosemum ATCC13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium-glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetacea Sidfilm ATCC13870, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium-ridium (Corynebacterium gullicamica) ATCC15990, Brevipacterium-Ammoniagenes (Corynebacterium 'ammoniagenes) ATCC6871, etc.
  • the gene construct used in the present invention generally comprises a promoter, a sequence encoding an appropriate signal peptide, a nucleic acid fragment encoding a target protein, and It has regulatory sequences (such as one-time operation and one-time terminator) necessary for expressing the target protein gene in linen-type bacteria at appropriate positions so that they can function.
  • the target protein may have a pro-structure at the N-terminus.
  • the vector that can be used for this construct is not particularly limited, as long as it can function in coryneform bacteria. It may be integrated into the chromosome. Corynebacterium Yamato's plasmid is particularly preferred. These include, for example, pHM1519 (Agric, Biol.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ Contains plasmid that generates a gene.
  • people T-transposon can go to Icheon.
  • a transposon is used. Due to the transfer of ⁇ or the transfer of ⁇ , L 1 in-transfer is introduced into the staining break.
  • the promoter that can be used in the present invention is not particularly limited, and any promoter that can function in the absence of coryneform cells can be used in general.
  • the tac promoter ⁇ It may be a Yamagi promoter. Among them, the strong promoter of the tac promoter is more preferable.
  • promoters derived from coryneform fine iif include, for example, promoters of cell proteins, PS1 and PS2, and SlpA proteins, and glutamate degeneration in each amino acid biosynthesis system, for example, glutamic acid biosynthesis system.
  • Hydrogenase gene glutamine synthase gene of glutamine synthesis system, aspartokinase gene of lysine biosynthesis system, homoserine dehydrogenase of threonine biosynthesis system ⁇ gene, isoleucine and acetohydroxy acid of biosynthesis system Synthase gene, 2-isopropylmalate synthase gene of oral glycine biosynthesis system, glutamate kinase gene of proline and arginine biosynthesis system, phosphoribosyl-ATP pyrophosphorylase gene of histidine biosynthesis system, tryptophan , Tyrosine and phenylalanine, etc.
  • DAHP To Purron acid phosphate nucleic acid biosynthesis system, such as synthase gene, inosinate and Guaniru acid And the promoters of the phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) amide transferase gene, the inosinate dehydrogenase gene, and the guanylate synthase gene.
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • the signal peptide used in the present invention is a signal peptide of a secretory protein f! Of a coryneform bacterium serving as a host, and preferably a signal peptide of a cell debris protein t of a coryneform bacterium. is there.
  • Coryne 3 ⁇ 4 Bacterial cell surface proteins include, but are not limited to, PS1 and PS2 spread over glutajnicum (Tokuhyohei 6 _ 5 0 2 5 4 8), and SlpA spread over ajnmo niagenes (spec
  • the amino acid sequence of PS2 is column ffi-1 and the amino acid sequence of SlpA column W is column W2.
  • D Nase from coryne may also have signal peptides, and such signal peptides may also be used for water production. Can be.
  • the signal peptide may have an additional terminal amino acid sequence of the terminal amino acid sequence of the secretory protein i from which it comes.
  • the signal sequence is cleaved by the signal
  • the signal peptide encoding jimu f can be used as it is, but it can be used as it is, but can it be used? Ii 'Even if it is modified to use ⁇ suitable codon depending on the codon usage frequency. Good.
  • the additional signal that encodes the protein that is to be made 1: 1 is connected to the 3'-end of the gene that encodes the signal peptide, and expressed by the above promoter.
  • Useful proteins that can be secreted and produced by the present invention include, but are not limited to, essentially all secretory proteins from animals, plants and microorganisms.
  • proteins such as proteases, aminopeptidases, carboxypeptidases, collagenases and chitinases can be secreted and produced by the present invention.
  • the protein secreted and produced according to the present invention is preferably natural and secretory protein, more preferably.
  • a protein to which a pro-structure is added is preferable, and transglutaminase is particularly preferable as a useful protein secreted and produced by the present invention.
  • the transglucinase genes include actinomycetes, such as S. mobaraense IFO 13819, S.
  • transglutaminase of the type is possible according to the present invention.
  • the genes encoding these proteins can be modified, depending on the host used, to achieve only activity, including the addition of one or more amino acids, apical, i There are rare cases such as exchange, are you sure?
  • the codon may be converted to an appropriate codon depending on the codon usage.
  • a protein fragment encoding a proprotein containing a pro-structural portion (pro component) to secrete_produce a protein fi ', which is used as a prebu-peptide, by water.
  • 3 ⁇ 4 next transglutaminase pro-ii! Part is sequenced.
  • the professional part of the protein should be cut with a suitable step, for example, a protease, an aminopeptidase, an endopeptidase that cuts at the appropriate position, or more specially.
  • the gene sequence encoding the pro-structure of the target protein or the target protein may be modified so as to express a protein having a protease recognition site specific to a desired position.
  • General molecular biology techniques are well known to those skilled in the art, including techniques, techniques for cloning genes, and techniques for detecting produced proteins, for example, see Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA clonin g: A Practical Approach, Volumes I and II (DN Glover ed.
  • pro-structures obtained by modifying the pro-structures shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 include modified pro-structures having the amino acid sequences described in column numbers ⁇ 30 to 38.
  • Row ffi ⁇ 30 to 37 Modified pro-structure of transglutaminase of S. mobaraence
  • Column S1 -38 Chimera of trans-transglutaminase pro-structure of S. mobaraence and S. cinnamoneum
  • Sequence ⁇ 31 C-terminal FRAP in pro-structure (45 amino acid residues) derived from S.mobaraence
  • SEQ ID NO: 34 C-terminal RAP of pro-structure (45 amino acid residues) derived from S. mobaraence modified to GPK
  • SEQ ID NO: 35 C-terminal RAP of S.mobaraence-derived pro-structure (45 amino acid residues) is GP Has been modified to R
  • SEQ ID NO: 36 GPSFRAP at the C-terminus of the pro-structure portion (45 amino acid residues) derived from S. mobaraence is modified to GPK (FRAP is deleted and S at the C-terminus is modified to K)
  • ffi SEQ ID NO: 3 7 Sequence in which C-terminal GPSFRAP of S. mobaraence-derived pro-structure (45 amino acid residues) is modified to GPR (FRAP is deleted and C-terminal S is modified i)
  • -3 8 Chimeric pro-structure S (5 amino acid residues) consisting of the S. mobaraence Yamagi pro-structure part (15 amino acid residues) and a part of the S. cinn amoneum-derived pro structure part (41 amino acid residues)
  • one or a few amino acids may be replaced, deleted, human or added in the pro-structure portion.
  • the end region of the protein ft resulting from protease degradation does not necessarily have to be the same as the native protein 3 ⁇ 4-, but may have one or several extra amino acids added or deleted. There may be.
  • the protein is cleaved at almost the same position as that of the natural protein; that is, S, and more preferable that it is a peptide synthesized from the natural protein and l "j.
  • S. mobaraense and S. cinnamoneum are formed; for transglutaminase, the other columns are those in ffi columns 5 and 43, respectively.
  • proteases that cleave the propeptide at the position E that gives rise to the same protein as the protein, but for certain purposes the N-terminus is one or several amino acids longer or shorter than the native protein Peptides may have more appropriate activity, although such proteases may be commercially available, such as Dispase (Boehringer Mannheim).
  • Microorganisms culture solution include those derived from e.g. culture of actinomycetes and the like. Such proteinase Aze can also be used in unpurified state, and purified to a suitable purity as required After use.
  • SAMP45 a serine protease produced by Streptomyces albogriseolus (hereinafter sometimes abbreviated as S. albogriseolus).
  • S.mobaraense a transglutaminase from S. mobaraense, SAMP45 preferentially sever the 41'-Ser and 42 ⁇ ⁇ ⁇ Phe fi ', j of the pro-structure of the 1st row, ⁇ 3.
  • the coryneform-W containing the SAMP45jS gene from the prebuilt mouth is exposed to protransglutaminase
  • SAMP45iTi transfection was performed on coryneform bacterium using the pre-transglutaminase gene in a gorge-like manner. By producing on secretion z, transglutaminase can be efficiently activated by cleavage of the pro-structure.
  • svPEP proline-specific peptidase
  • This svPEP specifically cleaves a peptide or a peptide analog represented by the following formula (I) at a position in the formula, that is, at the carboxyl of the third or fourth ⁇ proline residue from the N-terminal. It is an enzyme that does.
  • Y is an oligopeptide consisting of 2 or 3 amino acid residues
  • ⁇ is an amino acid, peptide, amide, or ester.
  • this proline-specific peptidase is a proline-specific peptidase that acts on the sex ft of (1) to (8) below.
  • Suitable temperature is 25-30 ° C.
  • Phenylmethylsulfonyl fluoride, aminoethylbenzenesulfonyl fluoride 'Hide port chloride shows activity.
  • the molecular weight is about 50,000.
  • This svPEP can be prepared, for example, as follows.
  • An actinomycete producing a peptidase having the activity of svPEP for example, S.mobaraense IF013819, is cultured according to a method usually used for culturing actinomycetes.
  • Culture Actinomyces IF013819 May be a normal medium containing a normal carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and the like.
  • a carbon source glucose, starch, sucrose, and others can be used.
  • As a nitrogen source peptone, yeast extract, meat extract, bud extract, ammonium salt, and others are used as needed.
  • the cultivation can be carried out under aerobic condition F, for example, in a suitable range of 115.0 to 8.5 and a temperature of 15 to 37 ° C. (Depending on temperature, pH, and ground, the period varies depending on the temperature, pH, and ground.) Usually, the temperature is 1 to 10 minutes. ! Stop one. -After 1st of the question mentioned in the above,-i-recovery was collected from the -II material, and after washing, the liiij portion containing s vPEP was extracted from the W-return ⁇ to produce normal protein for HPLC. ⁇ ⁇ ⁇ : You can ':' make a svPEP by condemning the well-known 'f' step to 3 ⁇ 4 ⁇ .
  • svPEPiiiij amount from 1 rest ⁇ , '11, for example 0.5 excited phosphorus Sanna Toriumubaffa one ( ⁇ 7 ⁇ .) ⁇ 4: in a buffer - Hours, be carried out by. 1 to 5 MWA ⁇ Rukoto it can.
  • the temperature at this time is preferably 0 ° C. to about 5 ° C. to prevent inactivation of the yeast.
  • the svPEP can be separated from the liquid, but it's not good, but there are many ft.
  • the activity can be determined by determining the amount of (p-nitroanilide).
  • the purified svPEP can be further purified by reverse phase chromatography or the like, the partial amino acid sequence can be determined, and an appropriate probe can be designed to obtain the gene encoding svPEP. it can.
  • Such procedures are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Molecular Cloning 2nd edition [J. Sam. Brook EF Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31 (1989)].
  • the nucleotide sequence of the svPEP gene thus obtained and the entire amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NOS: 41 and 42, respectively, and the amino acid sequence of mature svPEP protein is shown in SEQ ID NO: 40 ⁇ You.
  • s vP EP completely cuts off the pro-structure when protease glutaminase is produced with protease in the form of S. mobaraenc e's solution or S. mobaraence @ body
  • protease glutaminase in the form of S. mobaraenc e's solution or S. mobaraence @ body
  • the corine cell 1 containing the svPEPii immature protein and the protease il gene is pro-transglutaminase
  • a coryneform bacterium carrying the transglutaminase of the Prebu mouth was transferred to the SAMP45ii ⁇ - and the svPE PJ ⁇ ⁇ -mountain by the ⁇ -like method, and protransglutaminase and SAMP45 At the same time, secretory production of svPEP during off-peak or off-peak periods enables efficient production of transglutaminase, which has a natural structure.
  • transgenic t-transformant can be cultured according to the method and conditions generally used.
  • the transformant can be cultured in a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions.
  • Organic micronutrients such as vitamins and amino acids can be added as needed to obtain higher growth.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols, and others.
  • a nitrogen source Ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, etc. can be used.
  • As the inorganic ion a calcium ion, a magnesium ion, a phosphate ion, a lithium ion, an iron ion and the like are appropriately used as needed.
  • Cultivation is performed under aerobic conditions at an appropriate range of pH 5.0 to 8.5 and 15 ° C to 37 ° C. By culturing the transformant under such conditions ⁇ , the target protein is abundant in the cells! : Efficiently secreted out of the cells.
  • transgluminase is generally lethal if it accumulates in microorganisms in large amounts in the body, but according to the present study, the transgulminase produced is [Urakyugai Is released into the body, so that translugminase can be You.
  • the protein ft secreted into the ground by 11 swords can be separated from the ground later-according to methods well known to 't. For example, after removing W rest by centrifugation, salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, and medium-high pressure liquid suspension Separation can be performed by known appropriate methods such as oral chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, or a combination thereof.
  • the protein secreted into the bacterial layer by the present invention is also ⁇
  • ⁇ l 5 ⁇ well known methods, for example increasing the salt concentration, after solubilized by use of the field ⁇ agents River ⁇ , can be separated and purified in the same manner as when it is secreted into 1 ⁇ 2 ground.
  • the protein secreted to the cell surface may not be solubilized, and may be used, for example, as an immobilized enzyme.
  • Example 1 Expression of preprotransglutaminase from S. mobaraense IF013819 in C. glutajnicum ATCC13869
  • the sequence of the transglutaminase gene from the S. mobaraense DSMZ strain has already been determined [Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998)].
  • the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were synthesized with reference to this sequence, and were prepared according to a conventional method (Saito, Miura [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]).
  • the region encoding the mature transglutaminase sequence was amplified from the DNA of mobaraense IFO 13819 by the PCR method. Pyrobest DNA polymerase (Cii Sha) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions were in accordance with the protocol recommended by the manufacturer.
  • SEQ ID NOS: 8 and 9 PCR primers
  • the DNA fragment of about l.Okb was then amplified, Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (Takara Shuzo) and [shed - 32 P] using dCTP, reacted in accordance with the attached pro Bok call, DN A probe was prepared.
  • DN A probe was prepared.
  • Southern plot hybridization was performed according to such a general method, it was confirmed that the transglutamine kinase gene was present in an approximately 4 kb fragment cut out with the restriction enzyme SacI.
  • the approximately 4 kb fragment obtained by digesting the chromosomal DNA of S. mob araense IF013819 with Sacl was converted to EASYTRAP V er.2 (Takara Shuzo), recovered by agarose gel electrophoresis, inserted into the Sacl site of pUCl8 (Takara Shuzo), and then introduced into a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo).
  • a library was prepared.
  • the DNA probe for transglutaminase prepared above was used to prepare the colony described in Molecular Cloning 2nd edition [J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl. 90 (1989)] r; ii. (1)
  • the library was screened by hybridization, and a strain W containing the plasmid in which the transglutaminase ⁇ gene fragment was cloned was collected. From this, plasmid was collected and labeled with pUITG. Was.
  • the salt sequence of the fragment cloned into pUITG was determined.
  • the sequence of the transglutaminase of S. mobaraense IF013819 was determined, and the ⁇ f- and
  • SEQ ID NOS: 10, 11 PCR primers for S. mobaraense promoter region and signal sequence
  • a PCR-amplified fragment of about 800 bp was obtained using the Sail cassette primer, and the nucleotide sequence of this fragment was determined.
  • the fragment contained the promoter region and signal sequence region of the transglutaminase gene. Is a fragment Was. Therefore, the PCR amplified fragment of about 800 bp was inserted into the Smal site of pVC7 described in JP-A-9-070291 to obtain pVITGS5.
  • SEQ ID NO: 14, 15 PCR primer
  • transglutaminase gene sequence determined in Example 1 (1) the primers shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 9 were synthesized, and the pUITG obtained in Example 1 (1) was synthesized.
  • the gene region of transglutaminase was prepared by PCR method. (SEQ ID NO: 16) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3 '
  • SEQ ID NO: 16 PCR primer
  • the region containing the expanded promoter of PS2 gene of glutajnicum ATCC13869 and the amplified PCR reaction solution 11 of the gene region of transglutaminase of Preb-mouth were also mixed with a gun-shaped mixture.
  • a crossover PCR was carried out using SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 9, and a transglutaminase with a prep-mouth structure connected to the region containing the mouth motor of the cell surface protein of the C. glutamicum ATCC13869.
  • the fusion platform of 1 ] was widened. Approximately 1.8 kb fragment was detected by agarose gel IT electrophoresis.
  • This fragment was collected from agarose gel using EASYTRAP Ver.2 (manufactured by 'ii Shuzo Co., Ltd.), and placed in the Smal ⁇ position of pVC7 in Special 9-07029 1 ,; practice to obtain pVKPTGO. .
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined according to the method described above, and it was confirmed that the fusion gene was constructed as expected.
  • Example 2 Cells of corynebacterium glutamicum (lutamicum ATCC13869) ⁇ Signal peptide of protein 'f! And S. mobaraense IF013819 Origin of the gene; ⁇ Fusion encoding transglutaminase Glutaminase secretion ⁇
  • the primer set forth in SEQ ID NO: 17 contains a sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of mature transglutaminase in order to construct a fusion gene with transglutaminase.
  • SEQ ID NO: 14 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3 '
  • phases PS2 of C. glutajnicum ATCC13869 obtained by A fcl, 1 j to protein 'N-end amino acid 4 4 region and a promoter region ⁇ No 5 which encodes the remaining 3 ⁇ 4 of f' - I PCR with the basin
  • the reaction solution 11 and the PCR reaction solution 11 of the transfer region of the transglutaminase also having a ⁇ - length were mixed to form a gun, and the sequence ⁇ 14 and the ffi sequence -9 were crossed to form a crossover.
  • PCR was performed and 5'-I containing the promoter region of C. glutajnicum ATCC13869 cells ⁇ protein HQ gene f: the translocation connected to the basin and the region coding for 44 residues of the amino terminal amino acid residue Evening minase fusion;
  • digestion of pVKTG3 with Kpnl and Xbal encodes about 1.7 k of the 5'-upstream region containing the promoter region of the lutamicum ATCC13869 cell surface protein gene and 44 residues of the N-terminal amino acid.
  • the fusion gene of the mature transglutaminase connected to the region was excised and recovered by agarose gel electrophoresis. Was. This fragment was inserted into the Kpnl-Xbal site of pPK4 described in JP-A-9-322774 to construct PPKTG3.
  • pPKTG3 Beam J 1 together consisting of promoter and signaling Le peptide and N-terminal 1 to 4 amino acid residues in the glutamicum ATCC13 869 mountains come, formed 3 ⁇ 4 Bok Ransugeru evening Minaze ⁇ Den or S. Mobaraense mountain; river, transform lutamicum ATCC13869 into fife and select CM2S containing 5 mg / l chloramphenicol or 25 mg / 1 kanamycin.
  • glutamicum ATCC13869 containing the selected PVKTG3 or pPKTG3 was added with 5 mg / 1 chloramphenicol or 25 mg / l kanamycin, and 30 ° C in the kMM solution resting. 4 8 o'clock, after ar, ⁇ ⁇ ⁇ on ⁇ ⁇
  • Example 3 C. glutamicum ATCC13869 cell ⁇ protein' bound to a signal peptide of S. mobaraense IF013819 native pro-transglutaminase fusion gene
  • transglutaminase gene (a heterologous fusion preb mouth transglutaminase gene) with a mouth structure that expresses the signal sequence of the cell surface protein of lutamicum ATCC13869
  • Example 1 (1) The primers shown in Example 1 (1) were synthesized based on the transglucinase gene sequence determined in Example 1 (1) and the primers shown in SEQ ID NO.
  • the gene region of protransglutaminase was amplified by PCR from pUITG obtained in step (1).
  • SEQ ID NO: 22 PCR primer
  • the amplified 5'-basin containing the promoter region of the protein gene corresponding to PS2 of C. glutajnicum ATCC13869 and the N-terminal amino acids 30, 31, 44 and 68 residues The PCR reaction solution of 1 ⁇ 1 in each of the PCR coding regions and the PCR reaction solution 11 of the IS gene region of transglutaminase with a pro structure also having a wider width are mixed to form a ⁇ , Crossover PCR was carried out by passing columns # 14 and # 9, and the proteins that transfect ffl to PS2 of glutamicum ATCC13869 (the 5'-basin and the N-terminal amino acid 3 ⁇ including the promoter region of ⁇ ) Fusion with protransglutaminase associated with each region encoding residues 31, 31, 44, and 68 ⁇ That is, ⁇ linked to the promoter of glutamicum ATCC13869 ⁇ W protein ; Fused pre-protoglutaminase ildium-fragment;
  • the agarose gel ⁇ Aikiro Jin detected fragments of ⁇ of about 1.8 kb to 1.9 kb; These fragments were collected from agarose gel by running EASYTRAP Ver.2 ('Sake Brewery') and transferred to «J, i ; -9—07029 1 pVC7 Smal! ⁇ To obtain pVKPTGl and pVKPTG2, respectively. , PVKPTG3, and pVKPTG4.
  • the promoter region of the protein gene which is related to PS2 of glutamicum ATCC13869 from about 1.81 ⁇ to 1.9 kb, was obtained.
  • Transform C glutamicum ATCC13869 with the constructed plasmid KpVKPTGU pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTGU pPKPTG2, pPKPTG3, or PPKPTG4, and add 5 mg of chloramphenicol or 25 mg / l of kanamycin in Kanamycin S.
  • the strains produced in step were selected.
  • gluta mi cum ATCC13869 which forms the selected pVKPTGl, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG pPKPTG2 pPKPTG3 or pPKPTG4, contains 5m8 chloramphenicol or 25m8 kanamycin.
  • Example 4 Corynebacterium ammoniasenes cell surface protein l signal sequence and S.mobaraense IF013819 consensus protrans Glutaminase-encoding sequence Glutaminase secretion ⁇
  • transglutaminase gene with a pro-structural element (y ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ fusion preprotransglutaminase gene) that transduces the signal sequence of cell ⁇ protein f ⁇ of C. a femoral oniagenes
  • SEQ ID NOS: 23, 24 PCR primers
  • S ⁇ a marathoniagenes ⁇ waste protein t
  • S ⁇ Mix PCR reaction solution 1 in the PCR reaction region 1 in the region encoding amino acid 25 residues with PCR solution 1 in the fi fi region of the transglutaminase with pro-structure obtained in Example 3 (1).
  • Crossover PCR was performed by crossing the sequence ⁇ 23 and ft! Column -9-9, and the 5 'one basin including the promoter region of the cell protein! (SlpA) im of C.
  • the fusion j- (y' ⁇ fusion preglutamine transglutaminase ⁇ m ⁇ of the transglutaminase with a pro-structure connected to the region 1 encoding the terminal amino acid 25 residue was Jf ⁇ i.
  • electrophoresis an approximately 1.7 kb wide fragment was detected. This fragment was purified from agarose gel by running EASYTRAP Ver. And, Sma I i r of P VC7 - was the VSPTG 1 by W people.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 25 is a fusion gene with a transglutaminase gene with a pro-structure having a signal sequence of a cell surface protein (SlpA) of oniagenes (heterologous fusion prebub transgluminase gene) A) to construct the cell surface protein of aininoniagenes It contains the sequence encoding the amino acid sequence at the N-terminal of the signal sequence of quality (SlpA).
  • SlpA cell surface protein of oniagenes
  • This fragment was identified as-9-3 2 2 7 7 4 pPKSPTGl was constructed by inserting it into the Kpnl-Xbal site of PPK4 listed in r; d Plasmids pVKSPTGl and pPKSPTGl both promoted to PS2jn transmission of glutamicum ATCC13869 at the same time.
  • the signal peptide is SlpA of ammmoniagenes. S.mobaraense (This ill comes from the biography ⁇ -.
  • the primers shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 were synthesized with reference to the sequence of plasmid pKK223-3 (manufactured by Amersham Pharmacia) in which the tac promoter of E. coli was cloned. did. From the DNA of PKK223-3, a region corresponding to the tac promoter overnight was amplified by PCR.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 28 is a fusion gene with a transglutaminase gene with a pro-structure having a signal sequence of cell surface protein (S1pA) of C. a thigh oniagenes (heterologous fusion preform).
  • Mouth transg In order to construct the rutaminase gene, it contains a sequence encoding an amino acid sequence at the N-terminal side of the signal sequence of the cell surface protein (S ⁇ ) of ajiimoniagenes. (SEQ ID NO: 27) 5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3 '
  • digestion of pVTSPTGl with Kpnl and Xbal encodes 25 residues of the N-terminal amino acid of ammoniagenes cell surface protein (SlpA), which has about 1.5 1 ⁇ 7 ac promoter.
  • the fusion gene of transglucinase with a pro-structure connected to the region was cut out and recovered by agarose gel electrophoresis. This fragment is inserted into the Kpnl-Xbal site of pPK4 described in JP-A-9-322722 Constructed pPTSPTGl.
  • Both plasmids pVTSPTGl and pPTSPTGl consist of the tac promoter from E. coli, the signal peptide from SlpA of C. ammoniagenes, and the protransglutaminase gene from S. mobaraense.
  • the S. mobaraense orchid 3819 strain was cultivated 24 times at 30 ° C in ISP 2 liquid-ground. 10 ml of this solution was clarified by centrifugation, and washed twice with brine. A final to Kinkyu was 1 ⁇ 2 bacteria was suspended in 1 saline 10ml, ' ⁇ 4 (5) P that even the river had professional transformer guru evening Minaze is ⁇ are 3 ⁇ 4 VKSPTG1, pVTSPTGK pPKSPTGK Oh Rui is I the pPTSPTGl 10 ml of 1 ⁇ 2hri'l of glutamicum 181 ⁇ 13869 was passed through a membrane filter and added, and kept at 30 ° C for 6 ll'ij.
  • Example 6 Secretion of protransglutaminase using a fusion gene having a signal sequence of cell surface protein of C aminoniagenes and a sequence encoding protransglutaminase derived from Strep tovertici Ilium cinnamoneum IF012852
  • transglutaminase P of S. cinnamoneum IF012852 has already been determined (Japanese Patent Application No. 11-295649). From the amino acid sequence No. 1 E] to No. 32 ⁇ ⁇ , the sequence of the pre-part, from No. 33 to 86 ⁇ 1, the sequence of the pro part, from 87 ⁇ to 416 to 1 are mature ⁇ transglutaminase! It is estimated to be 3 ⁇ 4 columns. The delineated pro-structure and amino acid sequence of the protein ' ⁇ are reduced to the sequence number ⁇ 4 and the i-th column ⁇ 43 respectively.
  • Escherichia coli AJ13669 which was transformed with the plasmid KpUJ-MTG, which has the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , as FERM P-17602 with 1999 -Nieda Surgical Institute:. Life: 3 ⁇ 4 ⁇ in the Technical Research Institute (
  • SEQ ID NOs: 44, 45 PCR primer
  • the pPKSPTGl constructed in Example 4 (2) was used as a ⁇ type, and the combination of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: ⁇ 47 contained the promoter region of the PS2 gene, a cell surface protein of C. glutamicum. '-Upstream and cell surface proteins of C. ammoniagenes S1 The region containing the pA signal sequence was amplified by PCR.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 47 Contains the sequence encoding the N ⁇ amino acid.
  • ajMoniagenes cells containing the PS2j promoter region An approximately 1.8 kb wide fragment was detected by c-agarose gel electrophoresis in which the 5′-fused prebub transglutaminase transfection fragment connected to the signal sequence was extended. After digesting this fragment with EcoRI and BamHI, it was recovered from agarose gel and inserted into the EcoRI-BamHI site of pUC19 to obtain PUKSPTG2 '. The nucleotide sequence of the inserted fragment was determined according to the method described above, and it was confirmed that the fusion gene was constructed as expected.
  • the plasmid pPKSPTGl (S. mobaraense IF013 819, protransglutinase minase @ J ⁇ river) constructed in Example 4 (2) was used to obtain a preprotransglutaminase of approximately 1.8 kb of EcoRI-BamHI.
  • the fragment containing the zymogen was cut and placed in the EcoRI_BamHI position of pUC19 (pUKSPTGl).
  • the pUKSPTGl was digested with Aatll and a fragment of about 1.2 kb was cut out to give Jt-, and the PUKSPTG2 'was also removed with Aat I Iii'Hride to remove the about 1.2 kb fragment.
  • the pUKSPTGl was digested with Aatll and a fragment of about 1.2 kb was cut out to give Jt-, and the PUKSPTG2 'was also removed with Aat I Iii'Hride to remove the about 1.2 kb
  • pUKSPTG3 was blunt-ended at its EcoRI site and inserted with an Xbal linker in the same manner as previously performed with pUKSPTG2' to construct pUKSPTG3. Further, an approximately 1.8 kb fragment of Xbal was extracted from pUKSPTG3 and inserted into the Xbal site of pPK4 to construct PPKSPTG3.
  • glutamicum ATCC 13869 containing the selected PPKSPTG2 and pPKSPTG3 was added to a TG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin (60 g of glucose, 0.4 g of magnesium sulfate heptahydrate, 30 g of ammonium sulfate, 30 g of phosphoric acid, Potassium dihydrogen 1 g, iron sulfate heptahydrate 0.01 g, manganese sulfate pentahydrate 0.01 g, thiamine hydrochloride 450 g, piotin 450 g, DL-methionine 0.15 g, calcium carbonate 50 g, 1 L with water and adjusted to pH 7.5) at 30 ° C.
  • a TG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin (60 g of glucose, 0.4 g of magnesium sulfate heptahydrate, 30 g of ammonium sulfate, 30 g of phospho
  • Example 7 Pro-transglutaminase derived from S. mobaraense IF013819 pro-transglutaminase is replaced by S, cinnamon ieum IF012852 [pro-transglutaminase-II pro-transglutaminase (hybrid body production) Evening minase secretory locus
  • the primer shown in SEQ ID NO: 48 is a 5'-upstream region containing the promoter region of the PS2 gene of C. glutamicum ATCC13869, the signal sequence of the cell surface protein (S ⁇ ) of ammoniagenes, and the Streptoverticillium cinnamonieum IF012852-derived In order to construct a fusion gene (heterologous fusion preprotransglutaminase gene) with the mature transglutaminase gene derived from S. mobaraense IF013819, which has the pro-structure of transgluminase, It contains the sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of mature transglutaminase. (SEQ ID NO: 14) 5-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3 '
  • SEQ ID NOS: 8 and 9 PCR primers
  • the amplified 5'-basin containing the promoter region of the PS2 gene of glutajnicum ATCC13869, the signal sequence of the ammoniagenes cell surface protein (SlpA), and the transglutaminase derived from S. cinnamonieum IF012852 Mix the PCR reaction solution 1-1 in the region encoding the pro-structure sequence of SEQ ID NO: 1 with the PCR reaction solution 1-1 in the region encoding the mature transglutaminase gene derived from S. mobaraense IF013819, which was also amplified.
  • glutamicum ATCC13869 5 -A mature transglutaminase derived from S. mobaraense IF013819, which has a signal sequence of the cell surface protein (SlpA) of the basin and the ajnmoniagenes, and a pro-transglutaminase derived from S. treptovertic illium cinnamon ieum IF012852.
  • SlpA cell surface protein
  • pro-transglutaminase derived from S. treptovertic illium cinnamon ieum IF012852 A fusion gene fragment with zildenf was amplified. By agarose gel electrophoresis, an approximately 1.8 kb long fragment was detected.
  • the glutamicum ATCC1386 9 was transformed into Fife, and a strain containing 25 mg of kanamycin and grown in CM2S Tenya was selected.
  • the glutamicum ATCC 13869 for the PPKSPTG4 and PPKSPTG5 selected t MMTG liquid above containing kanamycin 25 mg / l - was 30 ° 3-necked, respectively in the land.
  • the culture medium of 10-1 was subjected to SDS-PAGE, and then Western blot analysis was carried out using a stake transmigration-minase antibody described in I'jii according to a conventional method.
  • pPKSPTGl was used as a control group, and its peculiarity in the structure of the gene was that its mouth structure was derived from S. mobaraense.
  • pPKSPTG4 has a feature in the gene constitution that the pro-structure is derived from S. c innamoni eum. In pPKSPTG5, 16 amino acids from the N-terminal of the pro-structure are from S. mobaraense, and 40 amino acids from the C-terminal are S. ci.
  • chimeric pro structure derived from nnamoni eum. Others are common to the three. As a result, a significant difference was observed in the amount of secretion due to the difference in the amino acid sequence of the pro-structure. Those with chimeric pro structure have the highest secretion (ATCC13869 / pP SPTG5) 0 3. Transglutamination due to differences in pro structure
  • the sequence of .- of SAMP45 a naturally occurring serine protease of S. albogriseolus, has been determined [J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)].
  • a primer was synthesized with the sequence number 49 and the sequence number ⁇ "50 ⁇ , and the gene region containing the N-terminal pro structure of SAMP45, mature SAMP45, and the C-terminal pro structure was synthesized.
  • Amplification was performed by PCR according to the same method as described above.
  • SEQ ID NO: 49, 50 PCR primer
  • SEQ ID NO: 52 contains the promoter region of the cell surface protein PS2 gene of C. glutamicum.
  • the 5'-hi basin and the region containing the signal sequence of the SlpA gene of the cell surface protein of S. oniagenes were also amplified by PCR.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 52 contains a sequence encoding an N-terminal amino acid of proserine protease in order to construct a fusion gene with serine protease having a pro structure.
  • Sequences 3 ⁇ 4 1, 52 PCR primers for the construction of fusion preproserine proteinase ⁇ Next, the amplified N-terminal pro structure of SAMP45, mature SAMP45,
  • each of the PCR reaction solution of the gene coding region containing the end structure and the 5'-upstream region containing the promoter region of the PS2 promoter, also if] widened, and the cell layer of ammoniagenes Mix the PCR reaction solution 1 ⁇ 1 of the region containing the signal sequence of the protein SlpA gene to form ⁇ , perform crossover PCR using SEQ ID NO: ⁇ 51 and SEQ ID NO: 50, and A 5'-upstream region including the promoter region of the gene and a heterologous fusion prebroserin protease gene fragment connected to the signal sequence of the cell surface protein SlpA of ammoniagenes were amplified.
  • An amplified fragment of about 3.9 kb was detected by agarose gel electrophoresis. After digesting the PCR product with HindIII and EcoRI, the fragment is subjected to agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 3.9 kb is recovered from the agarose gel and inserted into the Hindi 11-EcoRI site of pVC7 described above. Thus, pVSSl was obtained respectively.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined according to the method described above, and it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • the plasmid pVSSl that was constructed had the river, the C. glutamicuiD ATCC13869 and form t transformed, were selected 3 ⁇ 4 strains raw f ⁇ and in fflCM2S agar medium above containing Kuroramufue Nicole of 5 mg / 1.
  • glutamicum ATCC13869 which binds the selected pVSSl, was loaded with 5 mg of chloramphenicol, and incubated at 30 ° for 70 hours in a k! M TG solution. This -Kyosui lm l was separated into ⁇ ⁇ 1 ⁇ and i-kyu by the heart separation.
  • the mixture was turbidized in 0.1 M sodium phosphate I, room temperature buffer (pH 7.0).
  • the activity of serine protease was measured as follows. Add 50% of the culture suspension or bacterial suspension to 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.25 Bz-Phe-Val-Arg-pNA (manufactured by Bachem). In addition, the mixture was reacted at 30 ° C. for 20 minutes with 0.6 ml of the total solution, and the reaction was stopped by adding 0.4 ml of 50% acetic acid. The activity was determined by measuring the absorbance at 41 Onm and calculating the 3 ⁇ 4 of the released pNA (p-nitroanilide).
  • the f-position of the enzyme was defined as the element that releases l ⁇ mol of pNA in one minute.
  • the activity of serine protease was not detected in the ⁇ gami, and the activity was detected in the M suspension. Calculated from the detected activity and the specific activity according to the literature [J. Bacteriol., 179, 430-438 (1977)], approximately 9 mg / l of serine protease was secreted and expressed on the bacterial surface. It was confirmed that.
  • lutajnicum AT having the secreted expression plasmid pPKSPTGl of the transglutaminase with the pro-structure described in Example 4 (2) CC13869 was transformed, and strains grown on the CM2S agar medium containing 5 mg of chloramphenicol and 25 mg / l of kanamycin were selected.
  • the selected C. glutamicum ATCC13869 having pVSSl and pPK SPTGl was cultured in the above MMTG liquid medium containing 5 mg / l chloramphenicol and 25 mg / 1 kanamycin at 30 ° C for 70 hours.
  • transglutaminase property of the above-mentioned ⁇ was confirmed by the above-mentioned hydroxamate method, it was confirmed that the transglutaminase property was about 20 U / mg compared to that of the natural animal. .
  • ISP2 liquid medium yeast extract 4g, malt extract 10g, gluco 800 g of S. mobaraense IF013819 strain was inoculated from a plate, and cultured at 120 rpm with shaking for 48 hours at 30 ° C. .
  • the nutrient solution was centrifuged, and the rest was removed except for nutrients. After washing with a 20 mM Tris-HCl buffer containing 25 mg / L kanamycin, the resulting suspension was suspended in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 25 mg / L kanamycin. After shaking for 4 hours with ice 1: L, the supernatant obtained by centrifugation was collected. After passing through a nitrocellulose filter (pore size 0.22 ⁇ m, manufactured by Sartorius), the FPLC was lost.
  • ⁇ Total protein in the stage ' ⁇ : ⁇ :, totality, specificity, yield and;
  • the enzyme solution was added to a 20 mM sodium phosphate buffer solution containing 0.25 mM Ala-Ala-Pro-pNA (manufactured by Bachem), and reacted at 30 ° C for 5 minutes with a total solution of 0.61111, followed by 50% acetic acid. Was added to stop the reaction.
  • the activity was determined by measuring the absorbance at 410 nm and calculating the released pNA.
  • One unit of the enzyme was defined as the amount of enzyme capable of releasing lzniol pNA in one minute.
  • Table 4 Purification of proline-specific beptidase from S. mobaraence
  • HPLC system Pump: HITACHI L_6300, Detector: L-4000H
  • this enzyme is an enzyme that specifically cleaves the carboxyl side of proline, and Ala-Ala-Pro-pNA, Phe-Arg-Ala-Xaa (SEQ ID NO: 68) (where Xaa is Pro- pNA, pNA stands for p-nitroanilide), Ala-Phe-Pro-pNA, which is recognized in this order, and shows strong reactivity with the third or fourth N-terminal proline-containing peptide. was revealed. In addition, it was found that it did not act on peptides that proline from the N-terminus or at the 5th position ( ⁇ 5).
  • SEQ ID NO: 68 Substrate for svPEP (ii) Optimum pH
  • pH4-6 20mM sodium acetate buffer
  • the reaction was carried out at 30 ° C for 5 minutes using Ala-Ala-Pro-pNA as ⁇ ⁇ .
  • the activity in a 20 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 was defined as 100%, and the fll of each buffer was determined. As a result, it became clear that the optimum pH was 6 to 6.5.
  • the purified enzyme solution was added to a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) containing the various conjugates at the concentrations shown in Table 6 and left at room temperature for 10 minutes. Thereafter, Ala-Ala-Pro-pNA was added and reacted at 30 ° C for 5 minutes. The activity against Ala-Ala-Pro-pNA when no compound was added was defined as 100%, and the relative substrate decomposition fi when various compounds were added was defined as the relative activity. As a result, P-chloromercuribenzoic acid, which is an SH enzyme inhibitor, was also inhibited by a small amount.
  • mobaraense IF013819 prepared by the above method was digested with Sacl, and a fragment of about 6 kb was recovered by agarose gel electrophoresis using EASYTRAP Ver.2 (Takara Shuzo). After inserting the recovered fragment into the Sacl site of PUC18, it was introduced into a combi- tent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Effi 1 :) to prepare a library.
  • the prepared library was screened by colony hybridization using the P-labeled synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: ⁇ 54 as a probe, and the svPEPi ⁇ -fragment was cloned by screening the library.
  • the strain W that harbors the plasmid was screened to obtain the desired gene f.
  • the plasmid collected from the W strain by 1 "1 was designated as pUMPl.
  • the nucleotide sequence of the fragment cloned as pUMPl was determined.
  • the svPEP transmission f sequence corresponding to svPEP has been added to fid column number 41.
  • the Zoden ⁇ - was estimated 3 ⁇ 4 the Amino acid sequence encoded in, out N-terminal portion Amino acid sequence determined from our 1! Made enzyme evening protein previously (2 0 residues) brother, SEQ ID NO: 4
  • the amino acid primary sequence of the mature svPEP shown in FIG. 0 was determined.
  • the primary sequence of all amino acids including the svPEP signal sequence as shown in SEQ ID NO: 42 and the region assumed to be a pro-structure was determined.
  • Escherichia coli AJ13691 transformed with pUMPl was designated as FEM BP-7160 on May 15, 2000 based on the Budapest Treaty by the Ministry of International Trade and Industry and the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Japan 305- 8566 Deposited at Tsukuba-Higashi 1-chome 1-1-3, Ibaraki Prefecture (4) Construction of a proline-specific propeptidase (svPEP) gene with a spout structure having a signal sequence of a cell surface protein of C.
  • svPEP proline-specific propeptidase
  • ammoniagenes heterologous fusion prebub proline-specific propeptidase (svPEP) gene
  • SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 were synthesized using the pUM PI constructed in Example 9 (3) as type ⁇ , and the sv PEP The pro-structure and the gene region containing mature svPEP were expanded by PCR in the same manner as before.
  • Sequence ⁇ 55, 56 PCR primer Next, using the pPKSPTGl constructed in Example 4 (2) as type ⁇ ⁇ ⁇ , the combination of sequence ⁇ ⁇ 51 and SEQ ID The 5'-hi basin containing the promoter region of the PS2 parasite, which is K, and the region containing the signal sequence of the cell 3 ⁇ 4
  • the primer shown in SEQ ID NO: 57 contains a sequence encoding an amino acid at the N-terminal side of svPEP in order to construct a fusion gene with svPEP having a pro structure.
  • SEQ ID NO: 57 PCR primer primary Next, the amplified svPEP pro-structure and the gene containing mature svPEP 1 ⁇ 1 each of the PCR reaction solution of the coding region and the 5'-upstream region containing the promoter region of the amplified PS2 gene and the region containing the signal sequence of SlpA, the cell surface protein of C.
  • the PCR reaction mixture was mixed to form type II, and crossover PCR was performed using SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 56.
  • the svPEP gene fragment of the pre-profusion of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ species fused to the signal sequence of the cell surface protein SlpA of oniagenes was amplified.
  • a wide fragment of about 2. 1 kb was detected by agarose gel-g swimming. After the PCR product was ii'Hilled with Hindlll, it was subjected to agarose gel 3 ⁇ 4swimming ⁇ , and about 2 lkb fragment was recovered from the agarose gel. By adding persimmon, pVSSSPl was obtained. The nucleotide sequence of the inserted fragment was determined according to a conventional method, and it was confirmed that the fusion gene was constructed as expected.
  • the constructed plasmid pVSSSPl was used to transform glutamicum ATCC13869, and strains grown on the above CM2S agar medium containing 5 mg / l chloramphenicol were selected.
  • the selected C. glutamicum ATCC13869 having pVSSSPl was cultured in a BMMTG liquid medium containing 5m8 of chloramphenicol at 30 ° C for 70 hours. 1 ml of this culture solution was separated into a culture supernatant and cells by centrifugation. The cells were suspended in 0.1 M sodium phosphate buffer (PH7.0).
  • the activity of svPEP was measured as follows.
  • the plasmid pVSSSPl was drawn, and the glutamicum ATCC 13869, which contains the plasmid pPKSPTGl, was secreted into Example 4 (2); above containing Ichiru and 25mg eight of kanamycin,:; dCM2S3 ⁇ 4i heaven - were selected 3 ⁇ 4 strains f in the land.
  • glutamicum ATCC13869 was added to the selected pVSSSPl and pPKSPTGl, and 5 mg / l chloramphenicol and 25 mg / l kanamycin were added to the L! MMTG liquid at 30 ° C and 70 ° C.
  • transglutaminase activity of this culture supernatant was confirmed by the above-mentioned hydroxamate method, and it was confirmed that it had almost the same specific activity (about 20 U / mg) as the natural form.
  • the sequence of transglutaminase determined in Example 1 (1) was determined based on the sequence of the transgene. Synthesizing the sequencer and the sequencer-9 and synthesizing the inf region of mature transglutaminase from pU ITG taken at cliff line 1 (1) using the same PCR method as before ⁇ ,; Next, using the pPKSPTGl constructed in cliff line 4 (2) as a type, by combining the sequence ⁇ -14 with the sequence number ⁇ 58, or the sequence ⁇ 14 and the ffi sequence 959, C.
  • the primers of SEQ ID NO: 58 lack the C-terminal amino acid 2 residue ffi column Ala-Pro in the pro-structure of transglutaminase, and the primer of SEQ ID NO: 59 has C-terminal amino acid 4 Residue sequence
  • the gene sequence lacking Phe-Arg-Ala-Pro has been deleted.
  • the N-terminal amino acid of mature transglutaminase Contains an array that encodes
  • SEQ ID NO: 58, 59 PCR primers C. glutamicum cells, each of which has been expanded ⁇ The t 'oniagenes cells, including the 5'-hi basin, which includes the PS2 trans-port motor region, which is the protein t ⁇ ⁇ Protein PCR reaction solution that encodes the signal sequence of f!
  • i 1 be the class ' ⁇ , and' 1 4 and; g9 utam i cum cells ⁇ PS2 gene f- promoter region 5'-I: watershed and ammoniagenes cells Tan Park 'by signals ffi column of SlpA, and trans guru evening against the ⁇ deletion ⁇ pro-structure part of Minaze ⁇ been formed 3 ⁇ 4 trans guru evening Minaze Den ⁇ - fragments each'; 1] was wide.
  • the sequence number ⁇ 60 was determined based on the gene sequence of transglutinase determined in Example 1 (1). And the primers shown in SEQ ID NO: 61 were synthesized, and SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 9, Alternatively, the gene region of protransglutaminase was amplified by PCR from pUITG obtained in Example 1 (1) with the combination of SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 9.
  • Sequence ⁇ 60, 61 PCR primer Next, ⁇ With pPKSPTGl constructed in Example 4 (2) as ⁇ , 3 ⁇ 4 sequence ⁇ 1 14 and 1 3 ⁇ 4 sequence ⁇ ⁇ 62, or sequence 3 ⁇ 4 14 and sequence
  • pPKSPTGl constructed in Example 4 (2) as ⁇ , 3 ⁇ 4 sequence ⁇ 1 14 and 1 3 ⁇ 4 sequence ⁇ ⁇ 62, or sequence 3 ⁇ 4 14 and sequence
  • the primer reduced to Asp at the N-terminal amino acid 1 residue in the pro-structure of transglutaminase As and the primer with the sequence ⁇ '63 as the N-terminal amino acid 6 residues
  • the sequence of Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu has been deleted, and the fusion gene with the signal sequence of the cell surface protein S1 pA of C. ammon iagenes has been identified. For construction, it contains a sequence encoding an amino acid at the C-terminal side of the signal sequence of the cell surface protein S1 pA of C. ammoniagenes.
  • SEQ ID NOS: 62, 63 PCR primers
  • the amplified 5'-L basin containing the open motor region of PS2 gene f which is the cell surface protein i of C. glutami cum, and the cell surface of C. ammoniagenes, each of which was amplified.
  • the ftSlpA signal region-encoding region containing the signal sequence is encoded by the PCR reaction solution for each of the transfer region and the transglutaminase, which also has the N-terminus of the pro-structure part partially deleted.
  • Glutamicum ATCC13869 was transformed using the constructed plasmid K pPKSPTGl ⁇ , pPKSPTGl AFEAP, pPKSPTGl ⁇ , or p PKSPTG1 ADNGAGE, and strains grown on the CM2S agar medium containing 25 mg / l kanamycin were selected. Next, select the pP Glutamicum ATCC13869 having KSPTGI AAP, pPKSPTGl AFRAP, pP SPTGl AD, or pPKSPTGl A DNGAGE was cultured in the above MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours, respectively.
  • Example 10 The plasmid pVSSl constructed in Example 8 (1) was used. ⁇ In Example 10 (2), the id of the pro-structure was partially lost.Protransglutaminase secretion 3 ⁇ 4J3 ⁇ 4plasmid pPKSPTGl ⁇ ⁇ pPKSPTGl ⁇ FRAP, pPKSPTGl AD and pPKSPTGl ⁇ DNGAGE / Glutam icum ATCC13869 was transformed into fCM, and dCM2S containing 5 mg / l of chloramphenicol and 25 mg of kanamycin was transformed with dCM2S-Ten-O. Was selected.
  • SAMP45 is normally secreted and secreted, and is also secreted.
  • the pro-structural portion of L-prostaglandinase is cleaved. Secretion of transglutaminase having a molecular weight was observed.
  • SDS-PAGE semi-driving was performed on the PVDF membrane in the same manner as described above. After blotting, the PVDF membrane was stained with Coomassie-Priable Bull, destained, and air-dried. A portion of the mature transglutaminase was cut out, and the N-terminal amino acid sequence was analyzed using a protein sequencer.
  • Example 1 (1) Based on the transglutaminase transfer determined in Example 1 (1), the primers shown in Sequence-8 and Sequence 3 ⁇ 49 were synthesized based on the f sequence, and the pU ITG obtained in Example 1 (1) was synthesized. The transfection region of mature transglutaminase was amplified by PCR.
  • SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 64 are combined, or SEQ ID NO: 14 and a combination of SEQ ID NO: 65, or Is a combination of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 66, or a combination of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 67, the 5'-upstream region including the promoter region of the PS2 gene, a cell surface protein of C. glutamicum, and ajnmoniagenes
  • the signal sequence of the cell surface protein S1 pA and the region containing the pro-structure of transglutaminase were amplified by PCR.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 64 corresponds to the sequence of the C-terminal amino acid 3 residue Arg-Ala-Pro in Gly-Pro-Lys and the primer shown in SEQ ID NO: 65 in the transglutaminase pro-structure.
  • the lymer has a gene sequence obtained by converting Arg_Ala-Pro to Gly-Pro-Arg.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 66 has a sequence of 5 residues of C-terminal amino acid in the pro-structure portion, only from Ser-Phe-Arg-Ala-Pro to Lys
  • the primer shown in SEQ ID NO: 67 is It has a gene sequence converted from Ser-Phe-Arg-Ala-Pro to only Arg.
  • a fusion gene with mature transglutaminase contains a sequence encoding an amino acid at the N-terminal side of the mature transglutaminase. (SEQ ID NO: 14) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3 '
  • Sequence sequence ⁇ 6 4-6 7 PCR primers
  • the amplified 5'_ upstream region containing the PS2 ⁇ gene, which is the cell surface protein of C ⁇ glutamicum, and the protein surface protein of ammoniagenes SlpA The PCR reaction solution of the gene region encoding the signal sequence and the region containing the modified pro-structure portion was 1: 1 each, and the PCR reaction solution of the region encoding the expanded mature transglutaminase was also 1-1.
  • the mixture was mixed to form type II, and subjected to crossover PCR using SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 9 to obtain the 5'-upstream region including the mouth region of the PS2 gene, which is the cell surface protein of glutamicum.
  • SlpA The mature transglutaminase gene fragment connected to the signal sequence and the pro-structure of the modified transglutaminase was amplified.
  • the constructed plasmid pPKSPTGlU pPKSPTG12.pPKSPTG13 or pPKSPTG14 was transformed into lutamicum ATCC13869 to form i, and kanamycin containing 25 mg / l was transformed with i.
  • C. glutamicum ATCC 13869 supplemented with pPKSPTG12, PPKSPTG13 or pPKSPTGM was subjected to 25 mg / l of namycin-containing arsenic and kMMTG solution-free ground at 30 ° 48], respectively.
  • SDS-PAGE Western blot analysis was performed according to a conventional method, using the transglutaminase inhibitor described above, and the secretion of transglutaminase with a pro-structure was confirmed. .
  • the secretory expression plasmid pPKSPTGll, PPKSPTG12, pPKSPTG13 or pPKSPTG14 of the transgluminase with the modified pro-structure portion described in Example 11 (2) was converted to glutamicum Transform to ATCC13869 Then, a strain grown on the CM2S agar medium containing 5 mg / l chloramphenicol and 25 mg / l kanamycin was selected. Next, the selected C.
  • SAMP45 is normally secreted and expressed, and then secreted again.
  • the modified pro- ⁇ -part of transglutaminase with a pro-structure is cut off and the native transglutaminase is produced.
  • transglutaminase can be produced in large quantities by a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, and can be efficiently secreted outside the cells. Since the protein produced by the present invention is released into the culture medium, it can be directly recovered from the culture medium by stool and human control by a known appropriate method.

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Description

明細書
トランスグル夕ミナーゼの製造法 g明の背景
本発明は、 ½種タンパク 、 中でも卜ランスグルタミナ一ゼをコリネ 細菌で 分泌^^する方法に関するものである。 ，;亥方法で分泌 産される ¾砘夕ンパク fi は :業上ィ ϊ川な酵素や生理活性夕ンパク 等であり、 トランスグルタミナーゼは 食品加工や医¾等に幅広く利用されている。
y-稀タンパク 'πの分泌生^としてはこれまでにバチルス ½細 ¾による分泌 ^ : の総, [Microbiol. rev., 57, 109 - 137(1993)]、 メタノール 匕性 ft?:WPichia p astorisによる分泌 の総説 [Biotechnol., 11, 905-910( 1993)]、 そして Asper gillusi のカビによるに ^的 z 座の報;1 [Biotechnol., 6， 1419-1422(1988); Bi otechnol., 9, 976- 981(1991)] のように多数報 されている。
本 明の 1つの ¾施態様において分泌生; -されるトランスグル夕ミナーゼは 夕ンパク' Πのぺプチド鍋内にあるァ—カルボキシァミ ド基のァシル転移反応を触 媒する酵^である。 木酵^をタンパク Γίに作川させると、 £_ (r-Glu)-Lys ¾ ^形成反応、 Ginの脱ァミ ド化による Gluへの ^換反応が起こりうる。 この卜 ランスグル夕ミナ一ゼは、 ゼリー等のゲル化: &品、 ヨーグルト、 チーズ、 あるい はゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改篛等に利用されている （特公平 5038 2 ) 。 また、 熱に安定なマイクロカプセルの素材、 固定化酵素の担体などの製造 に利用されているなど、 産業上利用性の高い酵素である。
トランスグル夕ミナ一ゼはこれまでに動物由来のものと微生物由来のもの （マ イク口バイアルトランスグル夕ミナ一ゼ：以下 「MTG」 という） が知られてい る。 前者は、 カルシウムイオン依存性の酵素で、 動物の臓器、 皮膚、 血液などに 分布している。 例えば、 モルモット肝臓トランスグル夕ミナーゼ （K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898(1988) )、 ヒ卜^皮ケラチン細胞トランスグルタミ ナーゼ（M. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333(1990))、 ヒ ト lilL液凝固因 ίΧΙΙΙ (A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900( 1990) )な どがある。
後 については、 ス卜レプ卜バーチシリウム (Streptovertici Ilium)の か ら、 カルシウム非依 :件.のものが されている。 ί列えば、 ストレプトバーチチ シリウム -クリセォカノレニウム (Streptoverticillium griseocarneum ) IF0 12 776 、 ス トレプトバーチシリウム · シナモニゥム （Streptoverticillium cinnam oneum sub sp. cinnamoneum ) (以後 S. cinnamoneumと略すことがある) IF012 852 、 ス 卜レフ。卜ノ —チシリウム - モノ 'ラエンス (Streptoverticillium mobara ense) (以後、 S.niobaraenseと略すことがある） IF0 13819 があげられている 、'ル' 昭 64- 27471) 。 これらの微 .物が 『；:するトランスグルタミナーゼの -次 構造はべプチドマツピング及び in伝 f構造解析の結 、 勁物 [ 来のものとは IM 性を个く持たないことが 1，Jjしている（ヨーロッパ特,;午公 1 公¾0481 504 Al)。 微 ^物「I I来トランスグルタ ミナーゼ （ M T G ) は、 I：,； dl 類^の - ^物から ,'ί : 操作をへて製^されているため、 供給 ;:、 効牛: の点で I Ϊがあった。 また、 S伝 r-じ :的丁法によるトランスグルタミナーゼの製造も,; みられている。 トラ ンスグルタミナ一ゼ夕ンパク' Πおよびその il伝ィ-については例えば、 Biosci. Bi otechnol. Biochem. , 58, 82-87(1994)， Biosci. Biotechnol. Biochem. ,58,88- 92(1994)、 Biochimie, 80, 313-319(1998)., Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998), W0 96/06931、 W0 96/22366などに報告されており、 これらには例えば Str eptomyces lividans^ Aspergillus oryzae、 Escherichia col i等の病」三ベクター 系での発現生産に関する報告がなされている。 これらの情報と共に、 E.coli、 母等の微生物における分泌発現 （特開平 5- 199883) による方法と E.coliで MTG を不活性融合タンパク質封人体として発現させた後、 この封入体をタンパク質変 性剤で可溶化し、 脱変性剤処理を経て再生させることにより活性をもつ M T Gを 生産する方法 （特開平 6- 30771)が報告されている。 しかしながら、 E.coliや酵母 等の微生物によるこのような分泌発現においては、 その発現量が非常に少なレ、と いう問題点が指摘される。
一方、 コリネ¾細菌を利用して！! ¾極タンパク^を効率良く分泌生 するための 研究としては、 これまでにコリネバクテリゥム 'グル夕ミカム （Corynebacteriu m glutamiciini) (以後、 glutamicumと略すことがある） によるヌクレアーゼ（n uclease)やリパーゼの分泌 [US4965197, J.Bacteriol. , 174, 1854-1861(1992)] 及び、 サチライシン^のプロテアーゼの分泌 [Appl.Environ. Microbiol.， 61, 16 10 - 1613(1995)]、コリネ^細 | の細胞^^夕ンパク' Πの分泌に^する 先 [特^、 1''· 6— 502548]、 これを利川したフイブロネクチン結合夕ンパク Γίの分泌 [Ap pi. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400( 1997)]、変 型分泌装 ί を利川して夕 ンパク iの分泌を向上させた银告 [特開平 1 1 - 169 182 ]等がある力 ごく 限られたタンパク tについて極めて少数の報 ί1;·があるのみである。 タンパク ftの ¾'ί ( でみると、 Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)において、 Bacillus subtilis山来のサチライシン^伝了- (aprE)のプロモーター、リボソーム 結合部位及びシグナルぺプチドの 1¾列を利川して Dichelobacter nodosus山来の アルカリ性プロテアーゼの^伝子を glutamicum において 現させ、 約 2.5mg/ mlの蓄積を認めた例はあるものの、 US4965197、 特¾平 6— 502548、 あるい は特閲平 1 1— 169 182の記載においては具体的な分泌蓄積の値が記載され ておらず、 また、 フイブロネクチン結合タンパク質の分泌 [Appl. Environ. Micr obiol., 63, 4392- 4400(1997)]においては、 最大約 2.5 ig/Lという非常に少量の 分泌蓄積が確認されているに過ぎない。 この様に、 実用的なレベルで効率よく培 地中に異種タンパク質を蓄積させたという報告は未だなされていない。
また、 コリネ型細菌の遺伝子操作技術は、 プロトプラストによるトランスフォ 一メーシヨン法の確立 [J.Bacteriol., 159, 306-311(1984); J.Bacteriol., 161,
463-467(1985)]、 各種ベクターの開発 [Agric. Biol. Chem. , 48, 2901-2903(19 84); J.Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246 (1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol. , 31, 65-69 ( 1989)]、 ii伝丫- 現制御法の問発 [Bio/Technology， 6, 428- 430( 1988)]及びコス ミ ドの I】 S[Gene, 39, 28卜 286(1985)]など、 プラスミ ドゃファージを川いた 系で 展してきた。 またコリネ型細菌 1来の )Τ1伝 fクローニング [Nucleic Acids
Res., 14， 10113-1011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15， 10598(1987); Nucleic Acids Res. , 15, 3922(1987); Nucleic
Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem. , 52, 525-531 (1988); Mol.
Microbiol., 2, 63-72(1988); Mol. Gen. Genet. , 218, 330-339(1989); Gene,
77, 237-251 ( 1989 )]についても報 ί'ίされている。
さらにコリネ >ΨΜ m f i 1来の転移因子についても報告されている [W093/ 18151； E P0445385; 特 f- 6 _ 46867； Mol. Microbiol., 11， 739-746(1994); Mol. Microbiol., 14， 571-581(1994); Mol. Gen. Genet. , 245, 397-405(1994); FEM S Microbiol. Lett.，126， 1-6(1995); 、 7— 107976 ]。
移 r-とは¾色休 I：で転移し得る D N A断) で、 ^核生物から 核 :.物まで の広い fflの ^物に^在する^が知られている。 転移因了-を利用したトランス ポゾンがリ gされ [W093/18151; 特問平 7— 107976; Mol. Gen. Genet., 2 45, 397-405(1994); 特問平 9一 7029 1 ]、 トランスポゾンで異極遗伝]1を究 現させることも可能になってきた。 発明の開示
本発明は、 コリネ型細菌に産業上有用な異種タンパク質、 特にトランスグル 夕ミナーゼを生産させ、 これを効率的に菌体外に分泌 （分泌生産） させることに よって、 異種タンパク質、 特にトランスグルタミナーゼを製造する方法を提供す ることを目的とする。
本究明者らは、 放線菌等の分泌夕ンパク tにおいてシグナルべプチドと jt-にプ 口部分も分泌過^に ¾要な機能を ¾たしていることに し、 f ヒィ ί川な 稀 タンパク i、 特にトランスグルタミナーゼを効率よく分泌生^するノ j法を允叫す るに^った。
すなわち、 水¾明は、 コ
Figure imgf000007_0001
卜.流にプ口 ί を^む ffiの分泌 タンパク' πが接^された融合夕ンパク tをコリネ^細 ι に .および分泌させ、 次いでプロ構造部を ¾断 ·除 することを特徴とする、 y の分泌 ίタンパク πの製造 -法である。
より U休的には、 水允 Hjjは、 コリネ^細 will のシグナルペプチド '(域、 特に 細胞^ ;タンパク' Π·のシグナルべプチド ΐίί域をコードする ¾1列のド流にプロ^ 部を む 1 1的タンパク ΪΤΔίκ膽リ、 Vfにプロトランスグルタミナーゼ miム r-¾ 列を結 rした 構築物をコリネ 細 wに 入し、 ί' られた形 i転換コリネ 細 wを ^し、 じたタンパク' Πを w休外に効 4'；よく分泌させ、 w休外に放出され た夕ンパク 'Πをプロテア一ゼ ;で処 ίψ.してプロ構造郃分を t刀断することによって、 多: ΰ:の i I的 ¾砘タンパク 'π、 特にトランスグル夕ミナーゼを る方法である。 さらにまた 発明は、 プロテア一ゼ についてもトランスグルタミナ一ゼ 伝 f構築物と じょうにこれらのプロテア一ゼ^の ^伝子構築物を作製し、 プロトランスグル夕ミナーゼ逍伝了-を含む 現構築物とともにコリネ 細 wに^ 人し、 られた形質転換コリネ ¾'細菌を培 するか、 または別のコリネ型細菌に
^入し、 得られた形質転換コリネ型細菌をプロトランスグル夕ミナ一ゼ 伝子^ 人菌と共に培養し、 プロトランスグル夕ミナーゼおよびこれらのプロテアーゼを 分泌発現させることにより、 プロトランスグル夕ミナーゼのプロ構造部分を切断 したトランスグル夕ミナーゼを得る方法である。 なお、 本明細書において、 タンパク質またはペプチドが 「分泌」 されるとは、 タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外 （細胞外） に移送されることをい い、 最終的にそのタンパク質またはべプチド分子が培地中に完全に遊離状態にお かれる場合はもちろん、 部のみが菌体外に存在している場合、 菌体表層に存在 している場合も含む。 允明を実施するための辰良の形態
本究明の方法により、 コリネ型細菌が宿主べクタ一系として川いられ、 コリネ 欄閣の細胞 屑夕ンパク のシグナルべプチドのド流に分泌 ·のプロ構造部を むトランスグルタミナーゼ^伝丫-を結合した 現構築物が作製され、 これがコ リ
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腿され、 w休外に分泌されたプロトランスグルタミ ナ一ゼのプロ構造部をプロテァ一ゼ等で処理して切断することによって、 プロ構 造部が除去された多 のトランスグル夕ミナーゼが得られる。
さらにまた本発明の方法により、 プロテアーゼ等についてもプロトランスグル 夕ミナーゼ遗伝子構築物と同じようにこれらのプロテァーゼ等の発現 ¾; ίム- f- 築物を作製し、 プロトランスグルタミナ一ゼ^伝 p構築物とともにコリネ 細1 ' に^入し、 得られた形 転換コリネ型細菌を培 ί!するか、 または別のコリネ型細 閑に導入し、 得られた形質転換コリネ型細菌をプロ卜ランスグルタミナ一ゼ 伝 子導入菌と共に培養、 分泌発現することにより、 プロトランスグル夕ミナーゼの プロ部分を切断したトランスグル夕ミナ一ゼを直接菌体外に得ることができる。 分泌型タンパク質は一般にはプレぺプチドまたはプレブ口べプチドとして翻訳 され、 その後、 成熟型タンパク質になることが知られている。 すなわち、 一般に、 プレぺプチドまたはプレブロぺプチドとして翻訳された後、 シグナルべプチド
( 「プレ部分」 ） が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、 プ 口ペプチドはプロテア一ゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟べプチドに なることが知られている。 本明細書において、 「シグナル配列」 とは、 分泌性夕 ンパク質前駆体の N末端に存在し、 かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配 列をいい、 「シグナルペプチド」 とはそのようなタンパク質前駆体から切り取ら れるペプチドをいう。 一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に if-つてプロテア ーゼ （ -般にシグナルべプチダ一ゼと呼ばれる） によって切断される。 このよう なシグナルぺプチドは生物嵇を越えて -定の 通した配列上の特徴を -するが、 ある ^物 で分泌機能を示すシグナルぺプチドが他の 物稲においても必ずしも 分泌機能を ^するということではない。
本 細,1 こおいて、 シグナルべプチドおよびプロ部分の をィ iするタンパク Τί すなわち、 -次翻 ^物を 「プレブ口タンパク fi」 と称することがあり、 ま た、 シグナルぺプチドをィ /しないがプロ邰分をィ /するタンパク 'Πを 「プロタンパ ク Ώ」 と称することがある。 プロタンパク Γίのプロ部分は 「プロ構造部」 または ί'(1に 「プロ構造」 と称することもあり、 本明細 においてタンパク' の 「プロ構 造部/プロ構^」 とタンパク' Πの 「プロ部分」 とは 換的に使川される。 プレブ 口タンパク f!またはプレタンパク tにおいて、 そのシグナルぺプチドは なる夕 ンパク' Πに 1 ί]来する Aであっても、 Π的タンパク Γίに天然に 在するシグナル ぺプチドであってもよいが、 使川する? の分泌 タンパク tに 来することが 好ましい。 あるいは、 使川する ffiliのコドン使川頻度に応じて^適なコドンをィ J するように改変してもよい。 さらに本発明の ^的に使用し得るシグナルぺプチド は、 それが由来する天然の成熟夕ンパク質の N末端ァミノ酸配列を一部含んでい てもよい。 シグナルぺプチドが異なるタンパク質に由来する場合はプレプロ夕ン パク質を特に 「異種融合プレブ口タンパク質」 と称することもある。 例えば、 夕 ンパク質がトランスグル夕ミナ一ゼの場合は、 それぞれ 「プレブ口 卜ランスグル 夕ミナ一ゼ」 、 「プロトランスグル夕ミナ一ゼ」 および 「異種融合プレブ口トラ ンスグルタミナ一ゼ」 と称される。 また、 「プロ部分を切断した」 タンパク質と は、 ペプチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも 1以上 のアミノ酸を除去したタンパク質をいい、 その N末端領域が天然の成熟型タンパ ク ftのものと完全に -致するタンパク i、 および、 その夕ンパク Γίの活性を有す る限り、 天然のタンパク に比'晈して Ν末端にプロ部分に巾来する 1以上の余分 のァミノ酸を冇するものおよび天然の成熟 夕ンパク 'Πよりもアミノ酸配列が短 いタンパク iも含まれる。
これまでコリネ 細 ¾を川いて！^' Ti夕ンパク 'Πを M休外に分泌 ) ; した例は従 来の技術の ¾に述べた如く極めて少なく、 かつ枝術としては ' ΰである。 さらに またコリネ 細 [ が ΙΊ ^で w休外にプロテア一ゼ^のタンパク 'Πを分泌している という例は知られておらず、 内 /i-:f'l;DNaseの分泌 [US4965197]と、 水 ¾Π川こおいて 使川する細胞 ',' タンパク 'Π [«iU f- 6 - 5 0 2 5 4 8 ] が細胞^ より剁がれ ちて W休外に] L出されている' ;^が知られている例である。 ただし、 コリネ 細 ί¾では分泌に 1 ゎるシグナルぺプチ卜'は細胞^ タンパク fiを除いてはこれま で知られていない。 これまでに知られているコリネ !細菌の細胞^ タンパク ft としては、 コリネバクテリゥム ·グルタミカム（ glutamicum)の細胞 夕ン パク 'Π'である PS1及び PS2の imム Γ- [特^、 6— 5 0 2 5 4 8 ]、 及びコリネバクテ リウム -アンモニアゥネス ( Corynebacterium ammoniagenes ) (以後、 C. ammonia genesと略すことがある ) の細胞 ¾ タンパク fである SlpAの 伝了- [特 - 1 0 — 1 0 8 6 7 5 ]が知られているだけである。 これらのタンパク の内、 PS1と S1 pAの [,",]には若 Fの相同性 (約 3 0 % ) が認められるが、 その他にはほとんど ffl [HJ 性は認、められず、 さらにシグナル配列領域に関しては互いに相同性は認められて いない。 シグナル配列の例として、 コリネバクテリウム · グルタミカムの PS1と P S2のシグナル配列を配列番号 29と 1に、 コリネパクテリゥム ·アンモニアゲネス の S 1 pAのシグナル配列を配列番号 2に示す。
そこで、本発明者らはコリネバクテリゥム 'グルタミカム（ glutamicum) (旧 名称ブレビパクテリゥム .ラクトフアーメンタム （Brevibacterium lactofermen turn) ) ATCC13869株より PS2タンパク質遺伝子をクロ一ン化し、 その配列を決定し たところ、シグナル配列領域には既知の glutamicum由来のものとの違いが認め られなかったが、 成熟型細胞表層タンパク質の N末端アミノ酸の 3 8残基までに 2つの違いが認められた （配列番号 7に示すアミノ酸配列において 4 0残基 の T h r^ A s n、 5 5残基目の G 1 yが G 1 u ) 。 そのシグナル配列 3 0ァミノ 酸残基および成熟型細胞表層タンパク質の N末端アミノ酸 3 8残基を含む 6 8残 ^をコ一ドする塩基配列及びプロモーター領域を含むその 5'-ヒ流領域を K列番 6に、 ァミノ酸配列を配列番 7に小した。
次に、 本允明^はコリネ 細[ において異稀夕ンパク flを多: ,；:に w休外に分泌 産することが可能かどうかを^みるべく細胞 ¾ タンパク Γίのプロモーター領 域やシグナルべプチドを含む領域を利川しての ¾極夕ンパク質の分泌研究を行つ た。
放線菌 [ 来のトランスグル夕ミナーゼ遗伝子は G Cコンテントが高いが、 コリ ネ型細菌もそれに近く、 またコドン利用性も近似しているので、 放線閣の迫伝子 そのものがそのまま利用しうる利点がある。 そこで本発明 は放線 山来の卜ラ ンスグル夕ミナ一ゼ迠伝子をそのまま利用しうるか否かを検討した結 ¾、 放線 W 由来のトランスグル夕ミナ一ゼのシグナルぺプチドはコリネ型細菌では機能しな いことがあきらかになった。 しかしながらコリネ型細菌由来の細胞表層タンパク 質のシグナルべプチドと融合した放線菌由来のプロ構造部を含む成熟タンパク をコードするトランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子はそのまま有効に機能し、 プロ構造 部を有するプロタンパク質として効率良く菌体外に分泌されることが明らかとな つた。 さらにまた細胞表層タンパク質のシグナルぺプチド 3 0ァミノ S変残基と成 熟細胞表層夕ンパク質の N末端部分の 3 8アミノ酸残基を余分に含む、すなわち、 成熟細胞表層夕ンパク質の N末端部分が融合したプロ構造部付きトランスグル夕 ミナーゼ遺伝子を使用するとプロ卜ランスグル夕ミナ一ゼの菌体外分泌効率がさ らに増大することが示された。
本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性かん閣であり、 従来ブレビ パクテリゥム厲に分類されていたが現在コリネバクテリゥム厲に統合された細菌 を含み（Int. J. Syst. Bacteriol . , 41， 255( 1981 ) )、 またコリネパクテリゥム と 常に近縁なブレビパクテリゥム厲細菌を含む。 コリネ型細 [ を使川するこ との利点としてはこれまでに ¾極夕ンパク ftの分泌に好適とされる力ビ、 atや B ac i 1 lus^細菌と比べ、もともと菌休外に分泌されるタンパク 'Πが めて少なく、 y綱夕ンパク iを分泌 」 した ¾合の ^製過^が簡略化、 ^略化できることであ り、 また糖、 アンモニアや無機塩^のシンプルな ·地で く ^ iし、 地代や ½
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いることである。
本発 π川こおいて ϊί' じ iとして使川できるコリネ 細 iとしては、 L -グルタミン 酸生^ 1 に代^されるブレビバクテリウム 'サッカロリテイクム ATCC14066、 ブレ ビバクテリゥム ·ィンマリオフィルム ATCC14068、 ブレビパクテリゥム ·ラクトフ アーメンタム （コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム） ATCC13869、 ブレビパクテリ ゥム ·ロゼゥム ATCC13825、ブレビバクテリゥム ·フラバム（コリネバクテリゥム - グルタミカム） ATCC14067、 コリネバクテリウム ·ァセトァシドフィルム ATCC138 70、 コリネバクテリウム ·グルタミカム ATCC13032、 コリネバクテリウム - リリウ ム （コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム） ATCC15990、 ブレビパクテリゥム -アン モニァゲネス （コリネバクテリゥム 'アンモニアゲネス） ATCC6871等の野 z上株、 及びこれら野性株より誘導される変異株、 例えばグル夕ミン酸生産性を失った変 異株、 史にはリジン等のアミノ酸生産変異株、 イノシン等の核酸のような他の物 質を生産する変異株も含まれる。
本発明に使用される遺伝子構築物は、 一般にプロモーター、 適切なシグナルべ プチドをコ一ドする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、 およびコ リネ型細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列 （オペ レー夕一やターミネ一夕一等） を、 それらが機能し得るように適切な位置に有す るものである。 目的タンパク質は、 N末端にプロ構造部を有していてもよい。 こ の構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、 コリネ型細菌中で機能 し^るものであればよく、 プラスミ ドのように¾色休外で έΠ ί増殖するものであ つても細菌染色体に組み込まれるものであってよい。 コリネ 細菌山来のプラス ミ ドは特に好ましい。 これらには、 例えば pHM1519(Agric， Biol . Chem. , 48, 29 01-2903( 1984) ), ρΑΜ330 (Agric. Biol . Chem. , 48, 2901-2903( 1984) )、 および これらを改 Αした ¾剤耐 : ^伝子を^するプラスミ ドが含まれる。 また、 人 T-ト ランスポゾン も利川することができる。 トランスポゾンが使川される ¾ Aはネ1！ μ搬換えまたはそれ Π の 移能によって L 1的 in伝 Ϊ-が染色休巾に^?入される。 本¾明に使川できるプロモータ一は特に限定されず、 コリネ 細 の¾休內で 機能し ί; るプロモーターであれば一般に使川でき、 更に異極由来の、 例えば tac プロモーター ^の E. coli山来のプロモーターであってもよい。その中で、 tacプロ モー夕一^の強力なプロモーターがより好ましい。 コリネ型細 iif 来のプロモー ターとしては、 例えば、 細胞^ ^タンパク Γίの PS1、 PS2、 SlpAの^伝丫-のプロモ 一タ一、 各極アミノ酸生合成系、 例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱 水素酵素迫伝子、 グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、 リジン生合成 系のァスパルトキナーゼ遺伝子、 スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素^ 伝子、イソロイシンおよびパリン生合成系のァセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、 口ィシン生合成系の 2-ィソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、 プロリンおよびァ ルギニン生合成系のグル夕ミン酸キナーゼ遺伝子、 ヒスチジン生合成系のホスホ リボシル- ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、 トリプトファン、 チロシンおよびフエ 二ルァラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデォキシァラピノへプッロン酸リン 酸 （DAHP) 合成酵素遺伝子、 イノシン酸およびグァニル酸のような核酸生合成系 におけるホスホリボシルピロホスフェート（PRPP )アミ ドトランスフェラ一ゼ遗伝 子、 ィノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグァニル酸合成酵素遺伝子のプロモ一夕 一が挙げられる。
本発明で使 fflするシグナルぺプチドは、 宿主であるコリネ¾細菌の分泌性夕ン パク f!のシグナルべプチドであり、 好ましくは、 コリネ型細菌の細胞^屑タンパ ク tのシグナルべプチドである。コリネ ¾細菌の細胞表層夕ンパク tとしては、 glutajnicumに巾来する PS1及び PS2 (特表平 6 _ 5 0 2 5 4 8 ) 、 及び ajnmo niagenesに山来する SlpA (特 |j l': 1 0 - 1 0 8 6 7 5 )が举げられる。 PS1のアミ ノ酸! ¾列を! ¾列番 - 29に、 PS2のァミノ酸配列を ffi列 - 1に、 SlpAのァミノ酸 ι¾ 列を W列^ 2に^す。 また、 米 M特,; Ί:4965197によれば、 コリネ 細 ι ΊΙΐ来の D Naseにもシグナルべプチドがあると，ίわれており、 そのようなシグナルぺプチド も水発叨に利用することができる。
シグナルぺプチドには、 それが山来する分泌性夕ンパク iの Ν 端アミノ酸配 列の が付加されていてもよい。 シグナル配列は、 翻訳産物が | 体外に分泌さ れる際にシグナルべプチダーゼによって切断される。 なお、 シグナルペプチドを コードする j iム fは、 天然 !のままでも使川できるが、 使川する? ii' のコドン使 川頻度に応じて ίδ適なコ ドンを冇するように改変してもよい。
これらのシグナルべプチドを使用する場合、 1:1的とするタンパク Κをコードす る追伝了-は、 シグナルペプチドをコードする遺伝子の 3'-末端側に接続し、 かつ、 上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。
本発明によって分泌生産し得る有用タンパク質は、 本質的には動植物や微生物 il]来の分泌型夕ンパク質全般が含まれ特に限定されない。例えば、 プロテア一ゼ、 アミノぺプチダ一ゼ、 カルボキシぺプチダーゼ、 コラゲナーゼおよびキチナーゼ 等のタンパク質を本発明によって分泌生産することができる。 本発明によって分 泌生産される夕ンパク質は天然で分泌型である夕ンパク質が好ましく、 より好ま しくはプロ構造部が付加したタンパク質が好ましく、 トランスグル夕ミナ一ゼは 本発明によって分泌生産される有用タンパク質として特に好ましい。 トランスグ ル夕ミナーゼ遺伝子としては放線菌、 例えば S. mobaraense IFO 13819、 S. cinn amoneum IFO 12852、 Streptovertic i Il ium griseocarneum IFO 12776、 Streptom yces lydicus [W09606931 ] や 0omycetes [W09622366]^の力ビなどの分泌型のト ランスグル夕ミナーゼの^伝了-が本発明の f]的に利川可能である。 これらのタン パク Γίをコードする迠伝子は、 使川する宿主に応じて、 および みの活性を得る ために改変することができ、 それらには 1以ヒのアミノ酸の付加、 欠尖、 i 換な どが まれ、 必^により？;' ϋ·:のコドン使用频度に応じて 適なコドンに変換して もよい。
然でプレブ口ぺプチドとして されるタンパク fi 'を水 明によって分泌 _ 産する¾ ^は、 プロ構造部 （プロ郃分） を含むプロタンパク Γίをコードする 伝 断片を使川することが好ましい。 プロ構造部の配列の例として、 放線 |¾ 来卜 ランスグルタミナーゼのプロ構 ii!部の ft!列を配列桥 · 3 ( S. mobaraenceil l^)お よび ft!列番 - 4 (S. c innajiioneum山; に^した。 夕ンパク Γίのプロ構^部は適 、 な 段、 例えばプロテア一ゼによって切断すればよく、 ァミノぺプチダーゼ、 適切な位 で切断するェンドぺプチダーゼ、 あるいは、 より特^的なプロテア一 ゼを使川することができる 、 その結 ^ tじるタンパク fiが天然のタンパク Ήと 同等またはそれ以上の活性を -するような位 で切断するプロテア一ゼが好まし い。 あるいは、 的タンパク質または目的タンパク質のプロ構造部をコードする 遺伝子配列を改変して、 望みの位 に特異的なプロテアーゼの認識部位を有する タンパク質を発現するように設計することもできる。 このような改変技術、 遺伝 子のクロ一ニング技術、 生産されたタンパク質の検出技術を含む、 一般的な分子 生物学的手法は当業者によく知られたものであり、 例えば、 Sambrook et al . , 1 989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition ( 1989 ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、 DNA clonin g: A Practical Approach, Volumes I and I I (D. N. Glover ed. 1985 )、 F.M. A usubel et al . ( eds) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. ( 1994)、 PCR Technology :Principles and Application for DNA Am plification, H. Erlich, ed. , Stockton Press等を参照することができる。 配列番号 3および 4に示したプロ構造部を改変したプロ構造部の例としては、 «列番^ 3 0〜 3 8に記載したアミノ酸配列を有する改変プロ構造部が挙げられ る。
<配列表フリーテキス卜 >
ffi列 ^ 3 0〜 3 7 : S. mobaraenceのトランスグルタミナーゼの改変プロ構造部 S1列桥 - 3 8 ： S.mobaraenceと S. cinnamoneumの卜ランスグル夕ミナーゼプロ構 造部のキメラ これらの改変プロ構造部は以下のような特徴を有する ：
配列稀^ 3 0 = S.mobaraence由来プロ構造部（45アミノ酸残 の C末の APが欠失 している
配列 ^ 3 1 = S.mobaraence由来プロ構造部（45アミノ酸残基）の C末の FRAPが欠 失している
配列番号 3 2 二 S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の N末の Dが欠失 している
配列番号 3 3 二 S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の N末の DNGAGE が欠失している
配列番号 3 4 = S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の C末の RAPが GP Kに改変されている
配列番号 3 5 = S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の C末の RAPが GP Rに改変されている
配列番号 3 6 = S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の C末の GPSFRAP が GPKに改変されている （FRAPが欠失し、 C末の Sが Kに改変されている） ffi列番号 3 7 = S.mobaraence由来プロ構造部 （45アミノ酸残基） の C末の GPSFRAP が GPRに改変されている （FRAPが欠失し、 C末の Sが i こ改変されている） 配列 - 3 8 = S.mobaraence山来プロ構造部の 部 ( 15アミノ酸残基) と S. cinn amoneum由来プロ構造部 （41アミノ酸残基） の一部からなるキメラプロ構造邰 (5
6アミノ酸残^)
このように、 所定の位 にプロテアーゼの特^的認識部位を^する限り、 プロ 構造部において、 1または ¾数 lのアミノ酸が ί換、 欠失、 ^人または付加され ていてもよい。
プロテアーゼ分解の結 ίί られるタンパク ftの 端領域は必ずしも大然の夕 ンパク ¾-と ^一でなくてもよく、 1〜数個のアミノ酸を余分に 加された、 ある いは欠失したものであってもよい。 般には、 そのタンパク の活性という 1¾点 から、 天然のタンパク質とほぼト じ位; Sで切断されることが好ましく、 天然のも のと l"j の成 ¾ペプチドであることがより好ましい。例えば、 S. mobaraenseおよ び S. cinnamoneumの成； トランスグルタミナ一ゼについてはその «列が ffi列 ' 5および 4 3にそれぞれ されるものである。 従って、 一般には、 天然に じ る成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位 Eでプロペプチドを切断する特 異的プロテアーゼが最も好ましい。 しかしながら、 特定の目的については、 天然 のタンパク質に比較して N末端がアミノ酸 1〜数個分長いあるいは短いぺプチド がより適切な活性を有することがある。そのようなプロテア一ゼには Dispase (ベ 一リンガーマンハイム社製） のような商業的に人手できるものの他、 微生物の培 養液、 例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。 そのようなプロテ ァーゼは未精製状態で使用することもでき、 必要に応じて適当な純度まで精製し た後に使用してもよい。
他の好適なプロテアーゼの例としては、 ストレプ卜マイセス ·アルボグリセォ ラス (Streptomyces albogriseolus) (以後、 S. albogriseolusと略すことがあ る）の^生するセリンプロテアーゼである SAMP45がある。 S. mobaraenseのプロト ランスグルタミナーゼの ¾ 、 SAMP45は、 1¾列¾ 3のプロ構造部の 41¾目の Se rと 42·^Πの Pheの fi'，jを優先的に t刀断するため、 i 列^号 5に す大然 ; の成熟ト ランスグルタミナーゼの N >k端にプロ構造部の Cぶ端の Phe- Arg- Ala-Proの 4個 のァミノ酸が付加された構造のタンパク Γίが ^成される。 発 nj らは、 このよ うなタンパク 'Γίもトランスゲルタミナ一ゼ活性を 'ΐϊしていることを ： 、した。 な お、 S層 45_ii fム f-の 列は既に ^されており、 «列 ^ - 3 9にプロ構^の付加 した夕ンパク Π (プロ SAMP45) のアミノ酸 列を小した （J. Bacteriol . , 179, 430-438( 1997) ) 。 SAMP45は、 S. albogriseolusの ^液または S. albogriseolus W休の形態でプロトランスグルタミナ一ゼに作川させた にプロ榀造部をー 残して ¾1断することができ、 その結^、 プロ構造部の大部分を除去したトランス ゲルタミナーゼを^ることができる。 あるいは、 プレブ口 SAMP45jS伝 を ¾入し たコリネ -細 Wをプロトランスグルタミナーゼを | 休外に分泌 するコリネ リ 細 と J I:に ·ϋすることにより、 |nj様にプロ 造部の人邰分を除 iしたトランス グルタミナーゼを ることができる。 また、 プレブロトランスグルタミナーゼの ^伝 fを¾人したコリネ¾細菌に SAMP45iTi伝 fを冏様の方法で ¾人し、 プロトラ ンスグル夕ミナーゼと冋時に SAMP45を [ii体表屑または菌体外に分泌 z上産させるこ とにより、 プロ構造部の切断による卜ランスグル夕ミナーゼの活性化を効率よく 行うことができる。
さらに、本発明者らが見出した、 S. mobaraenseの生産するプロリン特異的ぺプ チダ一ゼ（svPEP) を SAMP45と組み合わせて使用することにより、 N末端に付加し た Phe- Arg- Ala- Proの 4個のアミノ酸も除去され、天然型と同一の成熟トランスグ ル夕ミナーゼを得ることができる。
この svPEPは、 以下の式（I)で表されるぺプチドまたはべプチド類似物を式中 の箇所で、すなわち N末端から 3番目または 4 φ目のプロリン残基のカルボキシル 删を特異的に切断する酵素である。
Y-Pro- i -Z (I)
(式巾、 Yは 2または 3アミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、 Ζはァミノ 酸、 ペプチド、 アミ ド、 またはエステルである。 ）
より 休的には、 このプロリン特 ¾的べプチダーゼは、 以ドの（1)〜（8)の性 ft をィ /するプロリン特 -的ぺプチダーゼである。
(1) 以ドのプロリン^ィ /ぺプチドの少なくとも 1つを、 φで小した '/:^、すなわ ちプロリンのカルボキシル側で切断する （pNAは P-ニトロァニリ ドである） 。
Ala-Ala-Pro- | - pNA、 Ala-Phe-Pro- I - pNAヽ Phe-Arg-Ala-Pro- φ -pNA (Phe-Arg- Ala-Xaa (配列 ¾ 68) (式巾、 Xaaは Pro- pNAであり、 pNAは p -ニトロァニリ ドを ^す。 ) に^じ）
(2) 15適 pHが 6.0〜6.5である。
(3) pH4〜9で安定である。
(4) :適温度が 25〜30°Cである。
(5) 20°C以下で安定である。
(6) フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィ ド、アミノエチルベンゼンスルフォ ニルフルオライ ド 'ハイ ド口クロライ ドで活性が Γ される。
(7) 等電点が 10.2である。
(8)分子量が約 50,000である。
この svPEPは例えば以下のようにして調製することができる。 svPEPの活性を有 するぺプチダーゼを産生する放線菌、例えば放線菌 S.mobaraense IF013819を、放 線菌の培養に通常用いられる方法に従って培養する。 放線菌 IF013819を培養する ための培地としては通常の炭素源、 窒素源、 無機イオン等を含有する通常の培地 でよい。 炭素源としてはグルコース、 デンプン、 ショ糖、 その他を用いることが できる。 窒素源としてはペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 ^芽エキス、 アンモ ニゥム塩、 その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気条件 Fで行ない、 例 えば、 ロ115.0から8.5、 度を 15°Cから 37°Cの適 な範國こ制御して行なうことが できる。お- Ϊ期問は温度、 pH、 地によって) なるが、 通常 1〜10卜 度であり、 般には、 I]的とする本 svPEPの ^が ¾大に したヒ こは ·！！を停 1ヒすればよい。 ヒ述した朋問の - 1 後、 - II物から i休を回収し、 ' く洗^後、 W休^ より s vPEPを^む liiij分を' 出し、 HPLCヽ の通常タンパク Ήの 製に 川される、 、 ：¾ ^によく知られた の f製 ^段を糾み Λわせることによつて ί製 svPEP を ':ることができる。 1 休 からの svPEPiiiij分の ^,'11は例えば 0.励リン酸ナ トリゥムバッファ一（ρΗ7. ο )Λ4:のバッファー中で - 時 ]、 1〜 5 mwA^ ることによって行なうことができる。 この時の温度は酵^の失活を防 II：するため 0 °C〜約 5 °Cが好まし 、。svPEPは ヒ^液からも 離することも >'J能だが、 夾維夕ンパク ftが多く、 洗 ι ί休^^から 出粘製するノ jがィ /利である。
なお、 段階での活性 分の確認はその则分巾の ^沾性を測定することによ つて行なうことができる。 尜活忤:の測定は、 適切な^ Ήおよび反応 ^成物の検
;li 法を組み合わせて行なうことができ、 例えば Ala- Ala- Pro- pNA、 Ala- Phe- Pro - pNA、 Phe- Arg- Ala-Pro- pNA、 を基質として -素を反応させ、 遊離した pNA (p-二 トロアニリ ド） の量を^出することにより活性を定 liiすることによって行なうこ とができる。
このようにして精製した svPEPを必要に応じて、逆相クロマトグラフィー等を川 いてさらに純化し、 その部分アミノ酸配列を決定し、 適切なプローブを設計する ことにより svPEPをコードする遺伝子を得ることができる。このような手順は当業 者によく知られたものであり、 例えば、 Molecular Cloning 2nd edition[J. Sam brook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31( 1989) ]を参照すればよい。 このようにして得られた svPEPの遺伝子の塩基 配列とそれにコードされる全ァミノ酸配列をそれぞれ配列番号 4 1および 4 2に、 svPEPの成熟夕ンパク のァミノ酸配列を配列 ¾号 4 0に^す。
s vP EPは、 S . mobaraenc eの 'ί ¾液または S · mobaraence @体の形態でプロテアーゼ と にプロ卜ランスグルタミナ一ゼに作 させた ¾合に、 プロ構造部を 全に切 断することができ、 この結]^、 プロ構造部が完全に除去された成熟 トランスグ ルタミナーゼを ί ることができる。あるいは、 プレブ口 svPEPii iム子及びプロテア ーゼ il伝 Γ-を^入したコリネ 細 1 をプロトランスグルタミナーゼを | 休外に分 泌 ,Ι ' するコリネ 細 1 と J tに J¾ することにより、 ¾様にプロ構 ii!l部が ^に 除 された成¾ トランスゲルタミナーゼを^ることができる。 また、 プレブ口 トランスグルタミナーゼの^伝 fを 人したコリネ 細菌に SAMP45ii伝 Γ-と svPE PJ^伝 Γ-の I山]方を^様の 法で^人し、 プロトランスグルタミナ一ゼ及び SAMP45 と同時に svPEPを | 休 または閑休外に分泌生産させることにより、人然と ー の構 ^を ½つ成 トランスグルタミナ一ゼの 産を効率よく行うことができる。 本 ¾明に使川し ¾る ;ηίム丫-榴築物のコリネ型細菌への 入 -法は特に I され ず、 般に使川される 法、 例えば、 プロ トプラス ト法（Gene, 39, 281-286( 198 5 ) )、 エレクト口ポレーシヨン法（Bio/Technology， 7, 1067-1070 ) ( 1989) ) を使 川することができる。 られた 伝子 入形 t転換体は通常川いられる方法およ び条件に従って培養することができる。 例えば、 形質転換体は炭素源、 窒素源、 無機イオンを含有する通常の培地で培 ¾することができる。 さらに高い増殖を得 るために、 ビタミン、 アミノ酸等の有機微 a栄養素を必要に応じて添加すること もできる。
炭素源としてはグルコースおよびシユークロースのような炭水化物、 酢酸のよ うな有機酸、 アルコール類、 その他を使用することができる。 窒素源としては、 アンモニアガス、 アンモニア水、 アンモニゥム塩、 その他が使用できる。 無機ィ オンとしては、 カルシウムイオン、 マグネシウムイオン、 リン酸イオン、 力リウ ムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養は pH5.0〜8.5、 15°C〜3 7°Cの適切な範囲にて好気的条件下で行い、 1〜7ロ[¾3程度培養する。このような 条件^で形質転換体を培養することにより、 目的タンパク質は菌体内で多！:に生 ^され効率よく菌体外に分泌される。 トランスグル夕ミナーゼについては、 微生 物の [ 体内で多 に蓄積すると一般に致死的であることが知られているが、 本発 叫によれば ^産されたトランスグル夕ミナーゼは【浦休外に放出されるため、 致死 的¾ を受けることなく迚統的にトランスルグ夕ミナーゼ
Figure imgf000022_0001
る。
水 11刀によって ½地中に分泌されたタンパク ftは、 ' tによく知られた方法 に従つて - 後の^地から分離； m製することができる。 例えば、 W休を^心分離 等により除去した後、 塩析、 エタノール沈殿、 限外濾過、 ゲル濾過クロマ卜グラ フィ一、 イオン交換カラムクロマトグラフィー、 ァフィニーティ一クロマトグラ フィ一、 中高圧液休ク口マトグラフィー、 逆相クロマトグラフィ一、 疎水ク口マ トグラフィ一等の既知の適切な方法、 またはこれらを組み合わせることにより分 離；^製することができる。 本発明によって菌体^層に分泌されたタンパク質も ¾
^l5†によく知られた方法、 例えば塩濃度の上昇、 界而活性剤の使川^によって可 溶化した後に、 ½地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。 また、 ある場合には、 菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、 例えば 固定化酵素として使用しても良い。
本発明は以下の実施例によって、 更に具体的に説明されるが、 これらはいかな る意味でも本発明を限定するものと解してはならない。 実施例
実施例 1 ： S. mobaraense IF013819由来のプレプロトランスグルタミナ一ゼの C. glutajnicum ATCC13869における発現
( 1 ) S. mobaraense IF013819由来トランスグル夕ミナーゼ
遺伝子の取得
S. mobaraense DSMZ株由来トランスグル夕ミナーゼ遺伝 -の配列は既に泱定さ れている [Eur. J. Biochem.， 257, 570-576(1998)]。 この配列を参考にして、 配 列番 8と配列番号 9に示したプライマーを合成し、 常法に従って （斉藤、 三浦 の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]) 調製した S. mobaraense IFO 13819の ¾色休 DNAから成熟トランスグル夕ミナ一ゼ配列をコードする領域を PCR法にて増幅した。 P CR反応には Pyrobest DNA polymerase Cii洒 社製） を用い、 反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
(配列 Φ ¾■ 8 ) 5-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(配列 * 9 ) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
く配列 ¾フリーテキス ト >
配列番 8、 9 ： PCRプライマー
次に増幅した約 l.Okbの DNA断片を、 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (宝酒造社製） と [ひ—32 P] dCTPを用いて、 添付のプロ卜コールに従って 反応させ、 DN Aプローブを作製した。 作製したプローブと S. mobaraense IF01 3819の染色体 DNAを用いて、 Molecular Cloning 2nd edition[J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31 (1989)]に記載されているような一般的な方法に従って、サザンプロットハイプリ ダイゼーシヨンを行ったところ、制限酵素 Sac Iで切り出される約 4 k bの断片に トランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子が存在していることが確認できた。 そこで S. mob araense IF013819の染色体 D N Aを Saclで消化した約 4 k bの断片を EASYTRAP V er.2 (宝酒造社製） を用いてァガロースゲル電気泳動により回収し、 これを pUCl 8 (宝酒造社製)の Sacl部位に挿入した後、 Escherichia coli JM109 (宝酒造社製) のコンビテン 卜セルに導入し、 ライブラリーを作製した。
先に作製したトランスグルタミナーゼの DN Aプローブを川いて、 Molecular Cloning 2nd edition[J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, pl.90(1989)]r;ii載のコロニ一ハイプリダイゼー シヨンにより、 ライブラリーのスクリーニングを行い、 トランスグルタミナーゼ ^伝 ί ^断片がクローン化されたプラスミ ドを保持する W株を取 し、 これよりプ ラスミ ドを Μ収し、 pUITGと 付けた。 pUITGにクローン化されている断片の塩 ½ 配列を決 したところ、 S. mobaraense IF013819のトランスグルタミナ一ゼの ΰ \ | ま、 S. mobaraense DSMZ株のトランスグルタミナーゼの ^ f-と |njじ塩 列をィ ίすることが確認'された。
塩 A K列の決定の結^、 この Saclの約 4 kbの断片はシグナル配列 (プレ部分) が -部欠けた不完全な D N A断片であることが ΐ-ijHJjした。 そこでプロモーター領 域と' 仝なシグナル配列領域のクローニングを^みた。 クローニングは TAKARA L A PCR in vitro Cloning Kit ('k洒造社製) と«列^ 1 0及び ι¾列^ 1 1に ^した合成プライマーを利川し、 添付のプロトコルに従って' 施した。
(配列¾ 10) 5-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3'
(配列番^ 1 1 ) 5-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3'
く配列表フリーテキス卜 >
配列番 10、 1 1 ： S. mobaraenseのプロモーター領域およびシグナル配列のた めの PCRプライマ一
その結果、 Sailのカセットプライマ一を用いたときに約 800 bpの PCR増 幅断片が得られ、 この断片の塩基配列を決定したところトランスグル夕ミナ一ゼ 遺伝子のプロモーター領域とシグナル配列領域を含む断片であることが確認され た。 そこで、 この約 800 bpの PCR増幅断片を特開平 9— 07029 1記載 の pVC7の Smal部位に揷入することによって、 pVITGS5を得た。 さらに pUITGを Sacl で消化することにより、 トランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子を含む約 4 kbの断片を ァガロースゲル電気泳動により回収し、 この断片を pVITGS5の Sac I部位に挿入し 、 全 のトランスグル夕ミナ一ゼ造伝子を含むプラスミ ド pVITGCを構築した。
[,',κ 塩 Sftl列の決定はダイ夕一ミネ一ターサイクルシークェンシングキッ 卜 （P Eアプライ ドバイオシステムズ礼製） と DNAシークェンサ一 373 A (PEァ プライ ドバイオシステムズ社製） を川いて行った。 1 列^ 12にプレブ口トラ ンスグルタミナーゼ^伝 の配列を^したが、 N 端の 3 1ァミノ酸 K列がシグ ナル ¾列 （プレ郃分） であると えられた。 プレブロトランスグルタミナーゼの ァミノ酸¾列は ί 列^ - 13に小した。
(2) トランスグルタミナーゼ^伝 f-プロモーター^域の変換
glutamicumの細胞^^夕ンパク ftである PS2の jil伝 fの! ¾列は既に決定され ている [Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]。 この配列を参考にして配列 ¾り - 1 4と ft!列^り- 1 5に^したプライマ一を合成し、 常法に従って調製した C. gluta m i cum ATCC 13869の ¾色休 D N Aから P S2タンパク fl 伝 -のイニシエーションコ ドンの 5 ' -ヒ流域のプロモーターを含む領域を P C R法にてよ'1]幅した。
(¾列¾ 14 ) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番 15 ) 5-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3' ぐ ffi列 ¾フリーテキス ト >
配列番号 14、 15 : PCRブラィマー
一方、 実施例 1 ( 1) で決定したトランスグルタミナ一ゼの遺伝子配列をもと に配列番号 16と配列番^ 9に示したプライマーを合成し、 実施例 1 ( 1) で取 得した pUITGからプレブ口トランスグル夕ミナ一ゼの遺伝子領域を P CR法にて 増幅した。 (配列番号 16 ) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3'
く配列表フリ一テキスト>
配列番号 16 ： PCRブライマ一
次に、 ¾幅させた glutajnicum ATCC13869の PS2遗伝子のプロモ一夕一を含む 領域と、 やはり増幅させたプレブ口トランスグル夕ミナーゼの遗伝子領域の P C R反応液 1 1を混ぜて銃型とし、 配列番 14と配列番号 9を川いてクロスォ 一バー PCRを行い、 C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質遗伝子のプ 口モーターを含む領域に接続されたプレブ口構造部付き卜ランスグル夕ミナーゼ の融台^伝]1を 幅させた。 ァガロースゲル ITメ ί泳動により約 1. 8 kbの堦幅 断片を検出した。 この断片を EASYTRAP Ver.2 ('ii洒造社製) を川いてァガロース ゲルから [nl収し、 特 9— 07029 1,; 践の pVC7の Smal邰位に 入すること によって、 pVKPTGOを^た。 述の方法に従って、 挿入断片の塩基配列の決定を行 レ、、 Γ'想通りの融合造伝子が構築されていることを確認した。
(3)プレブ口トランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子の glutamicum ATCC13869での究 現
施例 1 ( 1) で構築した pVITGC (プロモーターおよびプレブロトランスグル タミナーゼ遗伝 fのすべてが S.mobaraense由 あるいは、 'JI施例 1 (2) で構 築した pVKPTGO (プロモ一夕一は glutamicum ATCC13869の PS2遗伝子由来で、 プ レプロトランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子は S.mobaraense由来） で glutamicum AT CC13869を形質転換し、 5mg/lのクロラムフエ二コールを含む CM 2 S寒天培地 (酵母エキストラクト 10 g、 トリプトン 10 g、 シュ一クロース 5g、 NaC 1 5 g、 寒天 15 g、 水で 1 Lにする） で生育した菌株を選択した。 次に、 選択した pVITGCあるいは、 pVKPTGOを有する C. glutamicum ATCC13869を、 5nig/lのクロラムフエ二コールを含む MM液体培地 （グルコース 30g：、 硫酸 マグネシウム七水和物 0. 4 g、 硫酸アンモニゥム 30 g、 リン酸二水素力 リウム 1 g、 硫酸鉄七水和物 0. 01 g、 硫酸マンガン五水和物 0. 0 1 g、 チアミン塩酸塩 200〃g、 ピオチン 500〃g、 DL—メチォニン 0. 15 g、 炭酸カルシウム 50 g、 水で 1 Lにして pH7. 5に調整） でそ れぞれ 30 °C、 48時問培養した。 培養終了後 10 1の培養上 ^を S D S-P AGEに供してから、 Biosci.Biotechnol .Biochem.， 58, 82-87( 1994) ^載の杭ト ランスグル夕ミナ一ゼ抗体を川いて、 常法に従って （例えば、 J. Sajnbrookら （1 989) (I'jii述) に¾載されるような 般的な T-顺） ウエスタンプロッ トを行った。 その結 トランスグル夕ミナーゼの分泌を検出することはできなかった。 以 の結^より S. mobaraenseのトランスグルタミナーゼのシグナル [¾列は glutam i cum ATCC 13869においては機能しないことが確 、された。
^施例 2 ：コリネバクテリゥム ·グルタミカム （ lutamicum ATCC13869)の細 胞^ タンパク' f!のシグナルべプチドおよび S. mobaraense IF013819 来の成; ¾ トランスグルタミナーゼをコードする融合 伝 fを川いた成熟トランスグルタミ ナーゼの分泌 η
( 1 ) glutamicum ATCC13869の細胞^^夕ンパク fiのシグナル ffi列をィ/するト ランスグルタミナーゼ ;mム の構築
glutamicumの細胞 ¾ タンパク Γίである PS2の^伝 -の¾列は既に決定され ている [Mol. Microbiol., 9， 97-109(1993)]。 この (¾列を参考にして K列 - 1 4と配列番^ 17に示したプライマーを合成し、 ' 施例 1 (2) の方法により調 製した lutamicum ATCC13869の染色休 D N Aから PS2に相当するタンパク Ώの N末端側アミノ酸 44残基 （シグナルべプチド 30アミノ酸残基と成熟細胞表層 タンパク質の 14アミノ酸残基） をコードする領域とプロモーター領域を含む 5' -上流域とを P C R法にて増幅した。また配列番号 17に示したブライマ一はトラ ンスグル夕ミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、 成熟トランスグル夕ミナ —ゼの N末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。 (配列番号 1 4 ) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番号 1 7 ) 5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3' く配列表フリーテキスト>
配列番号 1 Ί ； PCRプライマー
方、 ' 施例 1 ( 1 ) で決定したトランスグルタミナ一ゼの] ΰ伝子 |¾列をもと に Κ列 Φ号 8と配列桥^ 9に^したプライマーを合成し、 ' 施例 1 ( 1 ) で取 した pUITGから成熟卜ランスグルタミナーゼの^伝 f領域を P C R法にて堦幅し た。
次に、 A fclさせた C. glutajnicum ATCC13869の PS2に相、1 jするタンパク' f の N 端側アミノ酸 4 4残¾をコードする領域とプロモーター領域を^む 5' - I：流域と の P C R反応液 1 1と、 やはり γί巾 させた成 ¾卜ランスグル夕ミナーゼの 伝 領域の P C R反応液 1 1を¾ぜて銃型とし、 配列 ^ 1 4と ffi列 - 9を川 いてクロスオーバ一 P C Rを行い、 C. glutajnicum ATCC13869の細胞^ タンパク HQ伝 fのプロモーター領域を含む 5'- I：流域と N末端側ァミノ酸 4 4残 ½をコ -ドする領域に接続された成 ¾トランスグル夕ミナーゼの融合; ΰ伝了を ' 幅させ た。
ァガロースゲル' ,1気泳動により約 1 . 7 k bの ¾幅断片を検出した。 この断片 を EASYTRAP Ver.2 (宝酒造社製） を用いてァガロースゲルから回収し、 特問甲- 9 - 0 7 0 2 9 1 載の PVC7の Smal部位に挿入することによって、 pVKTG3を得た。 前述の方法に従って、 揷入断片の塩基配列の決定を行い、 ？想通りの融合遗伝子 が構築されていることを確認した。
また、 pVKTG3を Kpnlと Xbalを用いて消化することにより、 約 1 . 7 k の lutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む 5' - 上流域と N末端側アミノ酸を 4 4残基コードする領域に接続された成熟トランス グル夕ミナーゼの融合遺伝子を切り出し、 ァガロースゲル電気泳動により回収し た。 この断片を特開平 9 _ 3 2 2 7 7 4記載の pPK4の Kpnl— Xbal部位に挿入する ことによって、 PPKTG3を構築した。
( 2 )C . glutamicum ATCC13869の細胞表屑タンパク のシグナル配列を川いての 成 ¾トランスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミ ド PVKTG3あるし、は pPKTG3 ( ともにプロモーターとシグナ ルぺプチドおよび N 端 1 4アミノ酸残基からなる ム J1は glutamicum ATCC13 869山来で、成 ¾卜ランスゲル夕ミナーゼ^伝 ま S.mobaraense山; を川いて、 lutamicum ATCC13869を形 fife換し、 5 mg/lのクロラムフエ二コールあるいは 2 5 mg/ 1のカナマイシンを む C M 2 S ¾天 '地で 1:. fiした w株を選択した。 次 に、 選択した PVKTG3あるいは pPKTG3をィ jする C. glutamicum ATCC13869を、 5 mg/ 1のクロラムフエ二コールあるいは 2 5 mg/lのカナマイシンを^む , k MM液休 地で 3 0 °c 4 8時 μ, した。 a r後、 ι ο〃 ιの 上^を S D S -
P A G Eに供してから、 Biosci . Biotechnol . Biochem.， 58， 82- 87( 1994),; 成の杭 トランスグルタミナ一ゼ杭休を川いて、 常法に従ってウエスタンブロットを行つ た。 その結 、 w株において - I： 1 iに成 トランスグルタミナーゼとほぼ冋 じ分 Γ- ;:をィ /する、 分泌されたトランスグルタミナーゼを少 , 検出する ' ができ た。
' 施例 3： C. glutamicum ATCC13869の細胞^ タンパク' のシグナルぺプチドに 結合した S. mobaraense IF013819中来のプロ トランスグルタミーゼ融合 伝
' 砘融合プレブ口トランスグル夕ミナーゼ ;η伝 f) を川いたプロトランスグル 夕ミナーゼの分泌生^
( 1 ) lutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質のシグナル配列を ϊするプ 口構造部付きトランスグルタミナ一ゼ遗伝子 （異種融合プレブ口トランスグル夕 ミナ一ゼ遺伝子） の構築
C. glutamicumの細胞表層タンパク質である PS2の遺伝子配列 [Mol . Microbio 1リ 9， 97-109(1993)]を参考にして、 配列番号 18、 配列番号 19、 配列番号 2 0、 そして配列番^ 21に示したプライマ一を合成した。 実施例 1 (2) の方法 により調製した glutamicum ATCC13869の染色体 D N Aから、配列桥^ 14と配 タ潘 18、 あるいは配列番号 14と配列番号 19、 あるいは配列番^ 14と配 列番¾20、あるいは配列番 14と配列番 21の糾み合わせにより、 PS2に相 するタンパク Kの N未端側アミノ酸をそれぞれ 30、 3 1、 44、 および 68 残 ^コードする領域 （シグナルべプチド 30アミノ酸残基を含む） とプロモータ 一領域を^む 5' -ヒ流域とを PCR法にて^幅した。
1 列 ¾ - 18、 | 列 'J 19、 配列^ - 20、 そして I潘 2 1に | したプ ライマーはプロ構 部付きトランスグルタミナーゼとの融合^ 丫-を構築するた めに、 プロ卜ランスグル夕ミナ一ゼの N 端側のァミノ酸をコードする配列を んでいる。
(«列^り- 18) 5-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3 (配列^り- 19 ) 5-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3 (¾列 ^ - 20 ) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3 (配列^り · 2 1 ) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3
<¾列^フリーテキスト >
配列 * - 18〜 21 ： PCRブラィマ一
-方、 ^施例 1 ( 1) で決定したトランスグル夕ミナ一ゼの遗伝子配列をもと に ffi列悉^ 22と配列番号 9に示したプライマーを合成し、 実施例 1 ( 1) で取 得した pUITGからプロトランスグル夕ミナ一ゼの遗伝子領域を PCR法にて増幅 した。
(配列番号 22 ) 5-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3'
く配列表フリーテキス卜 >
配列番号 22： PCRプライマ一 次に、 それぞれ増幅させた C. glutajnicum ATCC13869の PS2に相当する夕ンパク 質遺伝子のプロモ一夕一領域を含む 5' -ヒ流域と N末端側ァミノ酸 30、 3 1、 44、 および 68残基をコードする領域の P CR反応液各々 1〃 1と、 やはり增 幅させたプロ構造部付き卜ランスグルタミナ一ゼの IS伝子領域の P CR反応液 1 1を混ぜて銥型とし、 ffi列桥 14と ϋ列番^ 9を川いてクロスオーバー P C Rを行い、 それぞれ glutamicum ATCC13869の PS2に ffl当するタンパク' 伝 (■ のプロモータ一 域を む 5' -ヒ流域および N 端侧アミノ酸 3◦、 3 1、 44、 および 68残基をコードするそれぞれの 域に接統されたプロトランスグルタミ ナーゼとの融 r iム \ すなわち、 glutamicum ATCC13869^Wタンパク' imム f-のプロモータ一に結 した Φ;融 プレプロ卜ランスグルタミナーゼ il ίム -断 片を ; させた。
ァガロースゲル ίί気泳勁により、 それぞれ約 1. 8 k bから 1. 9 k bの γ;巾 ί,ί 断片を検出した。 この断片を EASYTRAP Ver.2 (' 酒造社製) を川いてァガロース ゲルから问収し、 «J、i;-9— 07029 1 の pVC7の Smal! ½に^人すること によって、 それぞれ pVKPTGl、 pVKPTG2、 pVKPTG3、 そして pVKPTG4を^た。 ι' 述の 方法に従って 入断) 'rの^^ i¾列の決 を ί rい、 ί'恕通りの融合； mム Γ-が描築さ れていることを確, した。
また、 pVKPTGU pVKPTG2、 pVKPTG3、 そして pVKPTG4を Kpnlと Xbalを川いて消化 することにより、 約 1. 81^ヒから 1. 9 kbのに glutamicum ATCC13869の PS2 に祀当するタンパク質遗伝子のプロモーター領域を含む 5' -上流域と N 端側ァ ミノ酸 30、 3 1、 44、 および 68残基をコードするそれぞれの領域に接続さ れたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼの融合遗伝子を切り出し、 ァガ口一 スゲル電気泳動により回収した。これらの断片を特開平 9 _ 322774記載の p PK4の Kpnl— Xbal部位に揷入することによって、 pPKPTGU pPKPTG2、 pPKPTG3、 そ して PPKPTG4を構築した。 ( 2 )C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いての プロ卜ランスグル夕ミナーゼの分泌
構築したプラスミ KpVKPTGU pVKPTG2、 pVKPTG3、 pVKPTG4、 pPKPTGU pPKPTG2、 pPKPTG3、 あるいは PPKPTG4を fflいて C. glutamicum ATCC13869を形質転換し、 5m g のクロラムフエ二コールあるいは 25mg/lのカナマイシンを含むし k CM2 S¾天 -地で生荇した菌株を選択した。 次に、 透択した pVKPTGl、 pVKPTG2、 pVKP TG3、 pVKPTG4、 pPKPTG pPKPTG2 pPKPTG3、 あるいは pPKPTG4を^する gluta mi cum ATCC13869を、 5m 八のクロラムフエ二コールあるいは 25m八のカナマイ シンを含むし^ MM液休 -地でそれぞれ 30°C、 481 ] -1 した。 - ½終 後 10〃 1の ¾ ヒ :を S D S— P A G Eに供してから、 Biosci.Biotechnol.Bioc hem., 58, 82- 87(1994) 战の杭トランスグルタミナ一ゼ抗休を川いて、常法に従 つてウエスタンブロッ トを行った。 その結 i¾、 pVC7あるいは pPK4のどちらのべク 夕一でも、 ほぽ同 のプロ構造部付きトランスグル夕ミナーゼの分泌が確認され たが、 PS2に flj当するタンパク の成 ¾夕ンパク の N 端側ァミノ酸残 の さ に応じて分泌 にィ了^な 違が認められた。 代表的な分泌 Mを ^1に小した。
^1. lutamicum ATCC13869の細胞^ j タンパク ' のシグナル ¾列を川いての プロ トランスグル夕ミナーゼの分泌生産 1¾
Figure imgf000032_0001
( 3 ) Dispase消化によるプロトランスグル夕ミナ一ゼの切断と活性の検出 pVKPTGK pVKPTG2N pVKPTG3、 pVKPTG4、 pPKPTG pPKPTG2、 pPKPTG3、 あるいは PPKPTG4を有する C. glutamicum ATCC13869の培養上清にプロテア一ゼである Disp ase (ベーリンガーマンハイム社製） を基質：酵素 = 1 ： 1となるように添加し、 pH 7. 5、 37 C 1時間反応を行つた。 Dispase消化反応後、 SDS— PAGE を行いプロトランスグル夕ミナーゼの切断を確認し、 さらにハイ ドロキサメート 法 [J. Biol. Chem. , 241, 5518- 5525(1966)]にてトランスグル夕ミナ一ゼ活性を 確認したところ、 天然 ¾とほぼ同じ比活性 （約 20U/mg) を有する事が確認 できた。
^施例 4 ：コリネバクテリゥム ·アンモニアゲネス （ ammoniasenes)の細胞表 タンパク lのシグナル配列、および S.mobaraense IF013819巾来のプロトランス グルタミナーゼをコードする配列を冇する融合 伝 Pを川いたプロトランスグル タミナーゼの分泌 ^
( 1 )C. a腿 oniagenesの細胞^^タンパク f Ϊのシグナル配列をィ Jするプロ構造部 付きトランスグルタミナーゼ遗伝子 （y砘融合プレプロトランスグルタミナ一ゼ 遗伝 の構築
ammoniagenesの細胞表層タンパク （SlpA)の造伝子配列 [特 、 10— 1 08675 ] を参考にして K列悉^ 23と配列 号 24に したブラィマーを合 成し、常法に従って調製した ammoniagenesの染色休 D N Aから細胞^^夕ンパ ク fl(SlpA)^伝-了-のプロモーター領域を含む 5' -i:流域と N末端側ァミノ酸 25 残基 （シグナルペプチド） をコードする領域を PCR法にて増幅した。 また配列 番 24に したプライマーはプロ卜ランスグル夕ミナ一ゼとの融合遗伝子を構 築するために、 プロトランスグル夕ミナ一ゼの N末端側のアミノ酸をコードする 配列を含んでいる。
(配列番号 23) 5-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'
(配列番号 24 ) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3 く配列表フリーテキスト >
配列番号 23、 24 : PCRブラィマ一 次に、 ^幅させた C . a匪 oniagenesの細胞^屑夕ンパク t ( S ΙρΑ )迠伝 のプロモ 一ター領域を む 5' -に流域と N末端側アミノ酸 25残基をコードする ΐΐΐ域の P CR反応液 1〃 1と、 ' 施例 3 ( 1 ) で させたプロ構造邰付きトランスグル タミナーゼの ϋ ίム fi域の P C R反応液 1 1を混ぜて鈸 とし、 配列^ 23 と ft!列 ¾リ-9を川いてクロスオーバー P CRを行い、 C. a腿 oniagenesの細胞 タンパク !(SlpA)imム のプロモーター 域を む 5' 一ヒ流域と 端側ァミノ 酸 25残^をコードする 1域に接^されたプロ構造部付きトランスグルタミナ一 ゼの融 j- (y 'τ融 プレブ口トランスグルタミナーゼηίム ηを Jf¾iさせ た。 ァガロースゲル ITメ泳動により、 約 1. 7 kbの '幅断片を検 した。 この 断 を EASYTRAP Ver.2 造礼製) を川いてァガロースゲルから '1収し、 PVC7 の Sma I ir -に W人することによって VSPTG 1を た。
( 2 )プロモーター ίίίΐ域の変換； lutamicum ATCC13869の細胞 夕ンパク t in伝 f-のプロモーターとの -合
C. glutamicumの細胞 ¾ ^タンパク' Π—である PS2の^伝子配列 [Mol. icrobio 1.， 9， 97-109(1993)]を参考にして ffi列 4と配列番¾25に小したプライ マーを合成した。 ' 施例 1 (2) の方法により調製した glutamicum ATCC1386 9の染色休 D N Aから PS2に祀当するタンパク質遺伝子のプロモー夕一領域を含む 5' _ _ヒ流域を PCR法にて増幅した。 また配列番号 25に示したプライマ一は a顧 oniagenesの細胞表層タンパク質（ SlpA )のシグナル配列を有するプロ構造部 付きトランスグル夕ミナーゼ遺伝了-との融合遺伝子 （異種融合プレブ口トランス グル夕ミナーゼ遺伝子）を構築するために、 aininoniagenesの細胞表層タンパク 質（ S lpA )のシグナル配列の N末端側ァミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
(配列番号 2 5 ) 5 -CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3
<配列表フリーテキス卜〉
«列^号 25： PCRプライマー
-方、 C . ammoniagenesの細胞 ¾ タンパク t ( SlpA)のシグナル配列をィ/するプ 口構造部付き卜ランスグル夕ミナーゼ^伝 との融合; S伝 配列をもとに配列 ■I 2 6と 1 列 * ^ 9に示したブラィマーを合成し、 'Λ'施例 4 ( 1 ) で取 した pV プロ構造部付き卜ランスグル夕ミナ一ゼの 伝 f領域を P C R法にて '幅した。 (配列番号 2 6 ) 5 -ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3'
く配列 ¾フリーテキスト〉
[¾列 ^ ^26； PCRプライマー 次に、 増幅させた glutamicum ATCC13869の PS2に ιするタンパク 'ΓΠΰ伝イ- のプロモーター領域を含む 5 ' -ヒ流域の P C R反応液 1〃 1と、 やはり^幅させ た ajnmoniagenesの細胞表層タンパク質（SlpA)のシグナル配列を打するプロ構 造部付きトランスグル夕ミナーゼの遗伝子 （異種融合プレプロ卜ランスグル夕ミ ナーゼ遺伝子） 領域の P C R反応液 1 1を混ぜて銪型とし、 配列番号 1 4と配 列番号 9を用いてクロスオーバー P C Rを行い、 glutamicum ATCC13869の PS2 に相当するタンパク質遺伝子のプロモーター領域を含む 5 ' -上流域を有する、 ammoniagenesの細胞表層夕ンパク質（SlpA)の N末端側ァミノ酸 2 5残基をコー ドする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグル夕ミナーゼの融合遺伝子を 増幅させた。
ァガロースゲル電気泳動により約 1 . 8 k bの増幅断片を検出した。 この断片 を EASYTRAP Ver.2 (宝酒造社製） を用いてァガロースゲルから回収し、 特開— f 9 - 0 7 0 2 9 1記載の pVC7の Smal部位に揷入することによって pVKSPTGlを得た。 ^述の方法に従って、 挿人断片の塩基配列の決定を行い、 Γ，想通りの融合 伝丫- が構築されていることを確認した。
また、 pVKSPTGlを Kpnlと Xbalを川いて消化することにより、 約 1 . 8 の glutajnicum ATCC13869の PS2に fl ιするタンパク O 伝 -のプロモーター領域を む 5， - I：流域を /する、 C · a腿 on i agenesの細胞^^夕ンパク' Π ( S ΙρΑ )の N 端 删ァミノ酸 2 5残 ¾ (シグナルべプチド） をコ一ドする領域に接^されたプロ構 造部付きトランスグルタミナ一ゼの融合^伝 r- 融合プレブ口 卜ランスグル 夕ミナ一ゼ 伝子） を切り出し、 ァガロースゲル' ΐ ί泳動により ["1収した。 この 断片を特^、 - 9— 3 2 2 7 7 4 r;d載の PPK4の Kpnl— Xbal部位に挿入することによ つて、 pPKSPTGlを構築した。 プラスミ ド pVKSPTGl および pPKSPTGlはともに、 プロ モー夕一は glutamicum ATCC13869の PS2jn伝了-に l!来し、シグナルぺプチドは ammmoniagenesの SlpA (こ lil来し、フ。口卜ランスク "ノレ夕ミナーゼ (ま S.mobaraense (こ ill 来する遗伝 Γ-で構成されている。
( 3 ) E. coliの t a cプロモ一夕一への変換
E. col iの t a cプロモー夕一がクローン化されているプラスミ ド pKK223- 3 (ァ マシャムフアルマシア社製） の配列を参考にして配列番号 2 7と配列番号 2 8に 示したプライマーを合成した。 PKK223- 3の D N Aから t a cプロモ一夕一に相当 する領域を P C R法にて増幅した。 また配列番号 2 8に示したプライマーは C. a 腿 on i agene sの細胞表層タンパク質（ S 1 pA )のシグナル配列を有するプロ構造部付 き卜ランスグル夕ミナーゼ遺伝子との融合遺伝子 （異種融合プレブ口トランスグ ルタミナーゼ遺伝子）を構築するために、 ajiimoniagenesの細胞表層タンパク質 ( S ΙρΑ )のシグナル配列の N末端側のァミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。 (配列番号 2 7 ) 5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3'
(配列 * ¾· 2 8 ) 5 -CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3 く配列^フリーテキス 卜 >
¾列¾ 27、 28： PCRブラィマー 次に、よ1, γ;巾 させた t a cプロモーターに 1、 する 域の P C R反応液 1 1と、 ' 施例 4 ( 2 )で させた anmoniagenesの細胞 タンパク fi (SlpA)のシク" ナル ¾列をィ jするプロ構s邰付きトランスグルタミナーゼの； mム ί-領域の P C R 乂応液 を ¾ぜて鈸 とし、 配列^ - 2 7と fid列^ - 9を川いてクロスォー バー P C Rを行い、 t a cプロモー夕一を する、 C. ammoniagenesの細胞 ^夕 ンパク' n( SlpA)の N 端側ァミノ酸 2 5残^をコードする領域に接続されたプロ 構^部付き卜ランスグルタミナーゼの融合 S伝 Γ- ( 極融^プレブ口トランスグ ルタミナーゼ^^ ） を^幅させた。 ァガロースゲル ¾ 泳動により、 約 1 . 5 k bの 幅断片を検出した。 この断片を EASYTRAP Ver.2 ('ΐί酒造ネ I：製） を川いて ァガロースゲルから回収し、 ' 19 - 0 7 0 2 9 UL!戦の PVC7の Smal部位に 人することによって pVTSPTGlを た。 | 述の方法に従って揷人断片の塩丛配列の 決定を行い、 f，想通りの融合遗伝 f-が構築されていることを確認した。
また、 pVTSPTGlを Kpnlと Xbalを用いて消化することにより、 約 1 . 5 1^ 1の七 a cプロモーターを有する、 ammoniagenesの細胞表層タンパク質（SlpA)の N末 端側アミノ酸を 2 5残基コードする領域に接続されたプロ構造部付きトランスグ ル夕ミナーゼの融合遺伝子を切り出し、ァガロースゲル電気泳動により回収した。 この断片を特開平 9 _ 3 2 2 7 7 4記載の pPK4の Kpnl— Xbal部位に挿入すること によって、 pPTSPTGlを構築した。プラスミ ド pVTSPTGlおよび pPTSPTGlはともに、 E. coli由来の tacプロモーター、 C.ammoniagenesの SlpAに由来するシグナルぺプチド、 S.mobaraenseに由来するプロトランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子で構成されている。
( 4 )C. a画 oniagenesの細胞^ タンパク' Πのシグナル !¾列を川いてのプロトラ ンスグルタミナーゼの分泌
構築したプラスミ KpVKSPTGK pVTSPTGK pPKSPTG pPTSPTGlを川いて glu t ami cum ATCC13869を j fifc換し、 5 mg/lのクロラムフエニコ一ルあるいは 25 m g/1のカナマイシンを^む I· dCM23¾ -地で した W株を選択した。次に 逸択した pVKSPTGl、 あるいは pVTSPTGl、 pPKSPTGK pPTSPTGlをィ jする C. glutami cum ATCC13869を、 5mg/lのクロラムフエニコ一ルあるいは 25mg/lのカナマイシ ンを む l: dMM液休 ·地でそれぞれ 30°Cにて 4811、^】お-^した。 J¾終 後 10 UL 1の - i 上 ίを SD S— PAGEに iJt-してから、 Biosci.Biotechnol.Bioc hem., 58, 82 - 87(1994),;, の杭トランスグル夕ミナ一ゼ抗休を川いて、' 法に従 つてウエスタンプロ'ソ 卜を行った。 その結 、 pVC7あるいは pPK4のどちらのべク ターでも、 ほぽ^：,!:のプロトランスグル夕ミナーゼの分泌が確^された。 代^的 な分泌 を^ 2に した。 2. ammoniagenesの細胞^ jf¾タンパク質のシグナル Κ列を川いたプロトラン スグル夕ミナーゼの分泌生産
Figure imgf000038_0001
( 5 ) Dispase消化によるプロ 卜ランスグル夕ミナーゼの切断と活性の検出 pVKSPTGl, pVTSPTGl, pPKSPTGK あるいは pPTSPTGlを有する lutami cum AT CC13869の培養上清にプロテア一ゼである Dispase (ベ一リンガーマンハイム社製） を基質：酵素 = 1 ： 1となるように添加し、 pH7.5、 3 7°Cで 1時間反応を行つ た。 Dispase消化反応後、 S D S— P A G Eを行いプロ構造部付き卜ランスグル夕 ミナーゼの切断を確認し、 さらにハイ ドロキサメート法にてトランスグル夕ミナ —ゼ活性を確認したところ、 大然型とほぼ同じ比活性 （約 2 0U/mg) をィ if る が確認できた。
^施例 5 S.mobaraenceの培甚液および閑体によるプロトランスグルタミナ一ゼ の切断と活' の検出
( 1 ) S. mobaraense IF013819株の -^液によるプロトランスグルタミナーゼの W断と ¾性の検出
S. mobaraense IF013819株を I S P 2液休 'ί地 （ J:エキス卜ラクト 4 g、 ^^エキストラクト 1 0 g、 グルコース 4 g、 水で 1 Lにして pH 7. 3に 調整） で 3 0°Cで 24時問培 ¾した。 この培 ¾液 1 0mlに、 ^施例 4 ( 5) で も川いたプロ卜ランスグルタミナーゼが蓄積している pVKSPTGl、 pVTSPTGK pPKS PTGl、あるいは pPTSPTGlをィ/する C. glutajnicum ATCC13869の U,'l 1 0 m 1を メンブランフィルータ一で滤過後に添加し、 30 で 6時問保持した。 その後、 SD S— PAGEを行いプロ構造部付き卜ランスグル夕ミナーゼの切断を確認し、 さらにハイ ドロキサメート法にて天然型とほぼ同じ比活性 （約 20 U/mg) を 有する、 トランスグル夕ミナ一ゼ活性を確認した。 また、 SD S— PAGE後、 P 01}^11^11(16116- 1101^(16(?¥0 ?)膜にセミ ドライブロッテイングした （遺伝 子クローニングのためのタンパク質構造解析、 朿京化学同人 （ 1 9 9 3 ) ) 。 ブ ロッテイング後、 P V D F膜をクマシ一ブリリアントブル一で染色し、 脱染、 風 乾した。 成熟トランスグル夕ミナーゼの部分を切り取り、 プロテインシークェン サー （モデル 4 7 6 A、 パーキンエルマ一社製） で N末端アミノ酸配列の解析を 行った。 その結果、 配列番号 5に示した天然型の成熟トランスグル夕ミナ一ゼと 同一の N末端アミノ酸配列を有していることが確認された。
(2) S. mobaraense IF013819株の菌体によるプロ構造部付きトランスグルタミ ナーゼの切断と活性の検出
S. mobaraense 蘭 3819株を I S P 2液体 -地で 30°Cで 24 ½問培 ϋした。 この 液 10mlを遠心分離により渠菌し、 生 塩水で 2回洗净した。 終 的に ½菌した菌休を 10mlの 1食塩水で縣濁し、 ' 施例 4 (5) でも川いた プロトランスグル夕ミナーゼが^ ¾している PVKSPTG1、 pVTSPTGK pPKSPTGK あ るいは pPTSPTGlをィ/する glutamicum八1^13869の½ hri'l 10 m 1をメンブ ランフィルターで滤過し添加し、 30 °Cで 6 ll、 'ij保 した。 その後、 S D S— P AGEを行いプロ構造部付き卜ランスグル夕ミナーゼの切断を ί 認し、 さらにハ イ ドロキサメート法にて、 天然 とほぽ冋じ比沽性 （約 20 U/m g ) をィ Jする トランスグルタミナ一ゼ活性を確認、した。 また、 SDS— PAGE後、 PVDF 脱にセミ ドライブロッテイングした （遗伝子クローニングのためのタンパク Ώ構 造解析、 京化 *1人 （ 1993) ) 。 ブロッテイング後、 PVDF脱をクマシ 一プリリアントブルーで染色し、 脱 ¾、 風乾した。 成 ¾トランスグル夕ミナーゼ の部分を切り取り、 プロテインシークェンサ一で N 端ァミノ酸配列の解析を ί r つた。 その結 、 [¾列 * -j 5に^した天然 の成熟トランスグルタミナーゼと 一の Ν未端ァミノ酸配列を有していることが確認された。 施例 6 ： C aminoniagenesの細胞表層タンパク質のシグナル配列、 および Strep tovertici Ilium cinnamoneum IF012852由来のプロトランスグルタミナ一ゼをコ 一ドする配列を有する融合遺伝子を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌生
( 1) a腿 oniagenesの細胞表層タンパク質のシグナル配列、 および S. cinnam onieum IF012852由来のプロトランスグル夕ミナーゼをコードする配列を有する 融合遺伝子の構築
S. cinnamoneum IF012852のトランスグルタミナ一ゼ遗伝 Pの配列は既に決定 されている（特願平 11- 295649)。 ァミノ酸配列の 1番 E]から 32番 Πまでがプレ部分 の配列、 33番 から 86^ 1,ほでがプロ部分の配列、 87^目から 416 に 1までが成熟 ^トランスグルタミナーゼの！ ¾列であると推定されている。 描定されているプロ 構造と成 ¾タンパク 'Γίのァミノ酸配列をそれそれ配列番 ^ 4と i 列 ^ 4 3に小 す。 また^亥造 ίム を むプラスミ KpUJ-MTG で形 Γί転換した Escherichia co l i AJ13669は、 1999什 :10) j 141 1付けで FERM P- 17602として、
Figure imgf000041_0001
- に^枝 術院 :.命 に：¾技術研究所（| |水 1 〒305- 8566 ¾城 I.つくば 1 J1 I 1 - 3) に ,¾乇してあり、 2000〈|-： 8〗」281 1付けでブダぺスト 約に ^づく ' 託に移^され、
■ ' m BP - 7287が付 ']-されている。
まず pUJ- MTGより制限 «:¾BamHIでプレブ口トランスグル夕ミナーゼ S伝丫 -の个 土 ίをカバーする領域約 3.5Kbを切り,1 Uし、 これを pUC 19の BamH I部位に W人した pUC SCTGを作製した。
pUCSCTGを銥 として、 1 列 ^ 4 4と ¾列^ 4 5に/^したブラィマーを 成 し、 S. cinnamonieum IF012852山来のプロトランスグル夕ミナーゼを む) ΰίム Γ ΐίί域をこれまでと问じょうに PCR法にて増 した。
(ffi列 * ; 4 4 ) 5 -GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3'
(ffi列番号 4 5 ) 5 -GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3'
<配列表フリーテキスト >
配列番号 4 4、 4 5 : PCRブラィマー
次に、 突施例 4(2 )で構築した pPKSPTGlを銪型として、 配列番号 4 6と配列番^ 4 7の組み合わせにより、 C. glutamicumの細胞表層タンパク質である PS2遺伝子 のプロモーター領域を含む 5'-上流域と C. ammoniagenesの細胞表層夕ンパク質 S1 pAのシグナル配列を含む領域を PCR法にて増幅した。
配列番号 4 7に示したプライマ一は Streptovertic i ll ium c innamonieum IF012 852由来のプロトランスグルタミナーゼとの融合遗伝子を構築するために、 Strep tovertici I lium cinnamonieum IF012852ltl来のプロトランスグルタミナ一ゼの N ^端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
([¾列^ 4 6 ) 5 -TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3'
(配列桥 - 4 7 ) 5 -CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GG C C - 3，
く¾列^フリーテキス 卜 >
¾列^ 4 6、 4 7 : PCRブラィマ一 次に、 i feさせた S. c innajnonieum IF012852山来のプロトランスグルタミナ一 ゼを む^伝了-をコ一ドする領域の PCR反応液 1〃 1と、 やはり ¾幅させた PS2^伝 のプロモーター領域を^む 5'- 流域と C . ammoniagenesの細胞 夕ンパク t SlpAのシグナル配列を Λむ領域の PCR反応液 1 1を混ぜて鈸型とし、 §1列^ '； 4 6 と 1¾列 ^ - 4 5を川いてクロスオーバー PCRを行い、 PS2j 伝 のプロモーター領 域を^む 5'-ヒ流域と C. ajMoniagenesの細胞 夕ンパク SlpAのシグナル ¾列 に接^された 5¾ 融合プレブ口トランスグルタミナーゼ迠伝 f断片をよ 幅させた c ァガロースゲル 気泳動により、 約 1 .8kbのよ '幅断片を検出した。 この断片を E coRIと BamHI消化した後、 ァガロースゲルから回収し、 pUC19の EcoRI- BamHI部位に 挿入することによって、 PUKSPTG2'を得た。 前述した方法に従って、 挿入断片の塩 基配列の決定を行い、 '想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。 この PUKSPTG2'を EcoiUで消化した後、 Blunting kit (宝酒造社製) で平滑末端化 し、 5，-末端がリン酸化された 5'-CTCTAGAG- 3，の配列を持つ Xbalリンカ一 (宝酒造 社製） を挿入し、 耳環状化し PUKSPTG2を構築した。 PUKSPTG2を Xbalを用いて消化 することにより、約 1.8kbの融合プレブ口 トランスグル夕ミナーゼ遺伝子（プロト ランスグル夕ミナーゼ遺伝子は S. c innamonieum IF012852由来） を切り出し、 ァ ガロースゲル電気泳動により回収した。 これらの断片を前述の pPK4の bal部位に 挿入することによって、 PPKSPTG2を構築した。
次にプロ構造部の N末端側の 郃が S. mobaraenseのプロ構造部に; Sき替わった キメラプロ構造部を するプレブ口トランスグルタミナ一ゼ造伝子の構築を行な つた （|戊熟 ¾卜ランスグル夕ミナ一ゼ逍伝子とプロ構造部の は S. cinnamoni eum IF012852[ tl^) 。
まず' 施例 4 ( 2 )で構築されているプラスミ ド pPKSPTGl ( S. mobaraense IF013 819山來のプロ卜ランスグル夕ミナーゼ ¾J¾川）より、 EcoRI-BamHIの約 1. 8kbのプ レプロトランスグルタミナ一ゼ 伝 -を^む断片を切り i l ;し、 pUC19の EcoRI _Bam HI邰位に 人した（pUKSPTGl )。 pUKSPTGlを Aat l l消化して約 1.2kbの断片を t刀り出 すと J t-に、 PUKSPTG2'についても Aat I Iii'H匕して約 1.2kb断片を除去した約 3. 3kbの i -を調製した。この約 3.3kbの断 j 'rと pUKSPTGl山来の約 1.2kbの Aat 1 1断片とをラ ィゲイシヨンし、 ' 法の遗伝 操作法に ½づき、 Aat II断片の柿入されたクローン を選択した。その『11で Aat I I断〗 Vの柿入された j [njを知るために顺次シークェンス を行ない、 Π的の方向 （プレブ口卜ランスグル夕ミナーゼがコードされている） に挿入されたものを選択した（pUKSPTG3')。 さらに pUKSPTG3'についても先に pUKSP TG2'で行なったと同じようにその EcoRI部位を 滑末端化し、 Xbalリンカーを挿人 し、 pUKSPTG3を構築した。 さらに pUKSPTG3より Xbalの約 1.8kb断片を ¾り出し、 p PK4の Xbal部位に挿入することによって、 PPKSPTG3を構築した。
( 2 ) C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質のシグナル配列を用いての Strepto vertici I l ium c innamonieum IF012852由来プロ卜ランスグル夕ミナ一ゼの分泌 構築したプラスミ ド PPKSPTG2および pPKSPTG3を用いて glutamicum ATCC 1386 9を形質転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む上記 CM2S寒天培地で生育した菌株を 選択した。 次に、 選択した PPKSPTG2および pPKSPTG3を有する glutamicum ATCC 13869を、 25mg/lのカナマイシンを含む TG液体培地（グルコース 6 0 g、 硫酸 マグネシウム七水和物 0 . 4 g、 硫酸アンモニゥム 3 0 g、 リン酸二水素力 リウム 1 g、 硫酸鉄七水和物 0 . 0 1 g、 硫酸マンガン五水和物 0 . 0 1 g、 チアミン塩酸塩 4 5 0〃g、 ピオチン 4 5 0〃g、 D L—メチォニン 0 . 1 5 g、 炭酸カルシウム 5 0 g、 水で 1 Lにして p H 7 . 5に調整） でそ れぞれ 30°C、 3日問培卷した。 培養終了後 10 1の培 i l:^を SDS - PAGEに供してか ら、 前述の抗トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、 常法に従ってウエスタンブ 口ッ 卜解析を行った。 本抗体は S.mobaraense山来のトランスグルタミナ一ゼに対 する抗休であるが、 S. cinnamonieum^来のトランスグル夕ミナ一ゼに †しても反 応性を示した。 その結架、 プロ構造部付き S. cinnamonieum IF012852山来トラン スグル夕ミナ一ゼの分泌が確認された （約 30〜50mg/L) 。
' 施例 7 ： S. mobaraense IF013819由来のプロトランスグルタミナ一ゼのプロ構 造部を S, cinnamon ieum IF012852[ll来のプロ構造部にすげ替えること （ハイプリ ッド体作製） によるプロトランスグル夕ミナーゼの分泌生座
PPKSPTG2あるいは PPKSPTG3から配列番号 1 4と配列番号 4 8に示したブラィマ —を合成し、 に glutamicum ATCC13869の PS2遺伝子のプロモーター領域を含む 5' -上流域と C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質（SlpA)のシグナル配列、そして S. cinnajnonieum IF012852由来のトランスグル夕ミナーゼのプロ構造部配列をコー ドする領域をそれそれ PCR法にて増幅した。
また配列番号 4 8に示したプライマ一は C. glutamicum ATCC13869の PS2遺伝子 のプロモーター領域を含む 5 ' -上流域と ammoniagenesの細胞表層タンパク質（S ΙρΑ)のシグナル配列、そして Streptoverticillium cinnamon ieum IF012852由来の トランスグル夕ミナーゼのプロ構造部を有する S. mobaraense IF013819由来の成 熟トランスグル夕ミナ一ゼ遺伝子との融合遺伝子 （異種融合プレプロトランスグ ルタミナーゼ遺伝子） を構築するために、 S. mobaraense IF013819由来の成熟ト ランスグル夕ミナーゼの N末端側ァミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。 (配列番号 1 4) 5-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列希号 48 ) 5-GGG GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GC G CTG G-3'
<ffi列^フリ一テキスト >
配列桥 4 8 ： PCRプライマー
' 施例 1 ( 1 ) で泱定した S.mobaraenseill来トランスグルタミナ一ゼの 伝 7¾1列をもとに配列^^ 8と配列^ 9に^したプライマ一を合成し、 '雄 例 1 ( 1 )で取 した pUITGから S. mobaraense由来成熟トランスグル夕ミナーゼの ^伝子領域を PCR法にて^幅した。
(配列 Φ 8 ) 5-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(配列 -9 ) 5-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
く配列^フリ一テキス ト >
配列番 8、 9 ： PCRプライマー
次に、 それぞれ増幅させた glutajnicum ATCC13869の PS2造伝子のプロモータ 一領域を含む 5'-ヒ流域と ammoniagenesの細胞表層タンパク質（SlpA)のシグナ ル配列、 そして S. cinnamonieum IF012852由来の卜ランスグル夕ミナーゼのプロ 構造部配列をコードする領域の PCR反応液 1〃 1と、 やはり増幅させた S. mobarae nse IF013819由来の成熟トランスグル夕ミナーゼ遺伝子をコードする領域の PCR 反応液 1〃 1を混ぜて銪型とし、配列番号 14と配列番号 9を用いてクロスオーバ — PCRを行い、 C. glutamicum ATCC13869の PS2遺伝子のプロモーター領域を含む 5， -ヒ流域と ajnmoniagenesの細胞表層タンパク質（SlpA)のシグナル配列、そして S treptovertic i l l ium cinnamon ieum IF012852由来のプロトランスグル夕ミナ一ゼ のプロ構造部を有する S. mobaraense IF013819由来の成熟トランスグルタミナ一 ゼ il伝 fとの融合造伝子断片を増幅させた。 ァガロースゲル電気泳勋により、 約 1.8kbの堦幅断片を検出した。 この断 を制限 :素 Seal及び Eco0651で消化する ことにより じる約 800bpの断片をァガロースゲルから回収し、 ¾施例 4 ( 2 )で構 築した pPKSPTGlの、 Sealと Eco065 Iで切り出される断片と人れ替えることにより p PKSPTG4および PPKSPTG5を構築した。
(¾列^ ' 1 4 ) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
( ¾列 ¾ — 9 ) 5 -CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
( 2 ) C. ammoniagenesの細胞 ^ 夕ンパク ftのシグナル配列および S. c innamon ieum IF012852山來プロ構造部を川いての S. mobaraense IF013819山来トランス グル夕ミナーゼの分泌
構築したプラスミ ド PPKSPTG4および PPKSPTG5を川いて glutamicum ATCC1386 9を形 Fife換し、 25mg八のカナマイシンを含む上 CM2S¾天 也で生育した【 株を 選択した。 次に、 選択した PPKSPTG4および PPKSPTG5を する glutamicum ATCC 13869を、 25mg/lのカナマイシンを含む上 t MMTG液体 -地でそれぞれ 30° 3口 した。培養終了後 10〃1の培甚上洁を SDS - PAGEに供してから、 I'jii述の杭トラン スグル夕ミナ一ゼ抗体を用いて、 常法に従って、 ウエスタンプロッ ト解析を行つ た。 その結果、 S. cinnamon ieum IF012852由来のプロ構造部付き S. mobaraense IF013819由来トランスグル夕ミナーゼの分泌が確認、された。 d¾ 3にプロトランス グル夕ミナ一ゼの生産量を示す。 pPKSPTGlは対照区として用いられており、 その 追伝子構成上の特色はプ口構造部が S . mobaraense由来である。 pPKSPTG4はプロ構 造部が S . c innamoni eum由来という遺伝子構成上の特色がある。 pPKSPTG5はプロ構 造部が N末端から 1 6アミノ酸が S. mobaraense由来で、 C末部 4 0アミノ酸が S. c i nnamoni eum由来のキメラプロ構造という遺伝子構成上の特色を有している。 それ 以外については 3者共通している。 結果はプロ構造のアミノ酸配列の違いにより 分泌量に有意な差異が見られた。 キメラプロ構造を持つものが最も分泌量が高い (ATCC13869/pP SPTG5 )0 3 . プロ構造部の違いによるプロ 卜ランスグルタミ
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
' 施例 8 ：セリンプロテア一ゼ（ SAMP45 ) 3ΰ伝 f-のクローン化と ¾现プラスミ ドの 作製, if価
( 1 ) ammoniagenesの細胞表屑タンパク Ήのシグナル配列を^するプロ構造部 付きセリンプロテアーゼ（SAMP45 ) i伝丫- (異砘融合プレブロセリンプロテア一ゼ ( SAMP45 ) 伝了-) の構築
S. albogriseolusの； 生するセリンプロテアーゼである SAMP45の ϋΐί ί-の配列 は既に決定されている [J . Bacteriol . , 179, 430-438( 1997)]。この配列を参考に して ffi列番 4 9と配列番 ^" 5 0に^したプライマ一を合成し、 SAMP45の N末端 プロ構造、 成熟 SAMP45、 そして C末端プロ構造を含む造伝子領域を先に述べた同 じ方法に従い PCR法にて増幅した。
(配列番号 4 9 ) 5 -AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3'
(配列番号 5 0 ) 5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3'
<配列表フリーテキスト >
配列番号 4 9、 5 0 : PCRブラィマ一 次に、実施例 4 (2 )で構築した pPKSPTGlを鍩型として、配列番 5 1と配列番号 5 2の組み合わせにより、 C . glutamicumの細胞表層タンパク質 PS2遗伝子のプロ モー夕一領域を含む 5'-ヒ流域と C . a画 oniagenesの細胞表層タンパク !SlpA追伝 子のシグナル配列を含む領域を同じく PCR法にて増幅した。
配列番号 5 2に示したプライマーはプロ構造部付きセリンプロテア一ゼとの融 合遗伝子を構築するために、 プロセリンプロテアーゼの N末端側のアミノ酸をコ ードする配列を含んでいる。
(配列桥^ 5 1 ) 5 -GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(1¾列番号 5 2 ) 5 -CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3' <配列^フリーテキスト >
配列 ¾ 1 , 5 2 :融合プレプロセリンプロテア一ゼ^伝子構築のための PC Rプライマー 次に、 それぞれ増幅させた SAMP45の N末端プロ構造、 成熟 SAMP45、
端プ口構造を含む造伝子をコードする領域の PCR反応液各々 1〃1と、やはり if]幅さ せた PS2追伝子のプロモーター領域を含む 5'-上流域と ammoniagenesの細胞^ 層タンパク質 SlpA造伝子のシグナル配列を含む領域の PCR反応液 1〃1を混ぜて銥 型とし、 配列番^ 5 1と配列赉号 5 0を用いてクロスオーバ一 PCRを行い、 ？ 伝子のプロモー夕一領域を含む 5'-上流域と ammoniagenesの細胞表層タンパク 質 SlpAのシグナル配列に接続された異種融合プレブロセリンプロテア一ゼ遺伝子 断片を増幅させた。
ァガロースゲル電気泳動により、 約 3.9kbの増幅断片を検出した。 PCR産物を Hi ndl l lと EcoRIで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動に供し、約 3. 9kbの断片をァ ガ口ースゲルから回収し、前述の pVC7の Hindi 11- EcoRI部位に挿入することによつ て、それぞれ pVSSlを得た。先に述べた方法に従って挿入断片の塩基配列の決定を 行い、 予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
( 2 )C. a腿 oni¾enesの細胞表層タンパク質のシグナル配列を川いてのセリンプ 口テアーゼの分泌
構築したプラスミ ド pVSSlを川いて、 C. glutamicuiD ATCC13869を形 t転換し、 5 mg/1のクロラムフエ二コールを含む上 fflCM2S寒天培地で生 f}した ¾株を選択した。 次に、選択した pVSSlを^する glutamicum ATCC13869を、 5mg のクロラムフエ 二コールを ¾む上, k!M TG液休 地で 30° 70時^ ^した。この -恭液 lm lを^ 心分離により ·ι 1ϋと i休に分離した。 休は 0. 1Mリン酸ナ I、りゥム緩衝液（p H7.0 )に 濁した。セリンプロテア一ゼの活性測定は以ドのようにして行った。 0. 25 1の Bz- Phe-Val- Arg- pNA (バッケム礼製) を含ィ ίする 20mMリン酸ナトリウム緩 衝液（pH7.0)に、培 上^あるいは菌休懸濁液 50〃 1を加え、総液 0.6mlで 30°C、 20分問反応させた後、 50%酢酸を 0.4ml加えて反応を停止させた。 41 Onmの吸光度を 測定し、遊離した pNA(p- nitroani lide)の ¾を算出することにより活性を決定した。 なお、 酵 f 位は 1分問に l〃molの pNAを遊離させる^素 とした。 その結 、 ι 上沾にはセリンプロテアーゼの活性は検出されず、 M体您濁液に活性を検出す ることができた。 検出された活性値と文献 [J. Bacteriol . , 179, 430-438( 199 7) ]による比活性値から計算した結果、 約 9mg/l相当のセリンプロテア一ゼが菌休 面に分泌発現していることが確認された。
( 3 )に glutajnicum ATCC13869において分泌発現されたセリンプロテアーゼによ るプロ構造部付きトランスグル夕ミナーゼのプロ構造部の切断
構築したプラスミ ド pVSSlを用いて、 実施例 4 (2)に記載したプロ構造部付きト ランスグル夕ミナーゼの分泌発現プラスミ ド pPKSPTGlを有する lutajnicum AT CC13869を形質転換し、 5mg八のクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイシンを 含む上記 CM2S寒天培地で生育した菌株を選択した。 次に、 選択した pVSSl及び pPK SPTGlを有する C. glutamicum ATCC13869を、 5mg/lのクロラムフエ二コールと 25m g/1のカナマイシンを含む上記 MMTG液体培地で 30°C、 70時問培養した。培養終了後 10 の ¾巷上^を SDS- PAGEに供してから、前述の抗トランスグル夕ミナ一ゼ抗体 を川いて、 常法に従って、 ウェス夕ンブロッ ト解析を行つた。 その結 ¾SAMP45が ιΓ.' に分泌発現し、 やはり分泌されているプロ構造部付き卜ランスグル夕ミナー ゼのプロ構造部が切断され、 大然 ·!の成熟トランスグルタミナーゼとほぼ同じ分 f- ' :を打するトランスグル夕ミナーゼの分泌が認められた。
この ¾ 上^について ·述のハイ ドロキサメート法にてトランスグルタミナ一 セ 性を碓認したところ、 天然 ¾とほぽ冋じ比沽性 (約 20U/mg) をィ /する' が確 できた。
また、 SDS- PAGE後、 先に述べた方法に従って、 PVDF股にセミ ドライブロッティ ングした。 ブロッテイング後、 PVDF股をクマシーブリリアントブルーで染色し、 脱 ¾、 風乾した。 成熟トランスグル夕ミナーゼの部分を切り取り、 プロテインシ ークェンサ一で Nぶ端ァミノ酸配列の解析を行った。その結 ¾、配列 ¾ 5に し た S. mobaraenseli]来の天然型の成熟卜ランスグルタミナーゼにプロ構造部の C k 端側ァミノ酸の Phe-Arg- Ala- Proの 4つのァミノ酸が付 ' されて t、る構造であるこ とが確認された。 施例 9：プロリン特異的べプチダ一ゼ（svPEP)遺伝子のクローン化と発現プラス ミ ド作製評価
( 1 ) S. mobaraense IF013819の生産するプロリン特異的ぺプチダーゼ（svPEP ) の精製
ISP2液体培地（酵母エキス卜ラクト 4g、 マルトエキストラクト 10g、 グルコ ース 4g、 水で 1Lにして pH7.3に調整） を 5L坂口フラスコに 800mL張り込み、 S. mobaraense IF013819株をプレー卜より植菌して 30°Cで 48時問、 120rpmで振盪培 養した。
^養液を遠心分離し、 養上洁を除いて閑休を 収した。 25mg/Lのカナマイシ ンを aむ 20mMトリス-塩酸緩衝液で洗 後、 られた1 休を 25mg/Lのカナマイシン を含む 0.1M リン酸ナ卜リゥム緩衝液 (pH7.0) に懸濁した。氷 1:で4時問振¾後、 心分離により られた上 ίを L"l収した。 ニトロセルロースフィルター （ポアサ ィズ 0.22〃m、 ザルトリウス社製） を川いて滤過滅 W後、 FPLC (Amarsham Pharma ciaネ ) を川いて 1.5M硫酸アンモニゥム I 50mMリン酸緩衝液 (pH7.0)で、ド衡化 した Butyト Sepnarose 4FF (Amarsham Pharmacia ) のカラム ( 1.6 ^ x 10cm) に通し、 緩衝液屮、 硫酸アンモニゥム 1.5- 0 Mの :線 S度么 Jft!で 出した。 '\- 成分を ィ J—する ^分を ί【'1収し、 さらに卜'条件で Phenyl- Sepharose HPカラム (lm L、 Amarsham Pharmacia社製） に通し、 活性 | 1分を 収し、 50mMリン酸ナトリウム 緩衝液 （PH7.0) に対して一晩、 4°Cで透析した。 これにより、 邰分； |¾:製 ^液を ί た。
^段階における総タンパク' Π:ή：、 総沽性、 比沾性、 収率および; Ii製度を^
4に小す。 なお、 段階での ^ ,性の測定は : らの 法 m - u ； ;ι·^ 化' : 験法 31 白 分解酵 II, 会出版センター（1993)， pl87) に従って以 ドのように行った。
0.25mMの Ala- Ala- Pro- pNA (バッケム社製)を含冇する 20mMリン酸ナトリゥム緩 衝液に酵素溶液を加え、 総液 ¾0.61111で30° 5分問反応させた後、 50%酢酸を 0.4 ml加えて反応を停 させた。 410nmの吸光度を測定し、 遊離した pNAの を算出す ることにより活性を決定した。なお、酵素 1単位は 1分間に l zniolの pNAを遊離させ る酵素量とした。 表 4 . S.mobaraence由来プロリン特異的べプチダ一ゼの精製
精製ステップ 容量 (ml ) 総活性 総タンパク質 比活性 収率 (％) 精製度
(単位） 量 （mg) (単位 /mg) (倍） 粗酵素抽出液 550 308 385 0.80 100 1 フ"チルセファ Π-ス 4F 45.6 213 8.98 23.7 69 30 F
フエ二ルセファ Π-ス HP 5.8 136 3.83 35.5 44 44
( 2 ) S. mobaraense IF013819の生産するプロリン特異的ぺプチダーゼ（svPEP ) の N末端アミノ酸配列解析 部分 製酵素液を逆 mクロマトグラフィーにかけてさらに純化 ί製した。 逆 fli クロマトグラフィ一の条件は以ドの通りである。
HPLC装^： ポンプ： HITACHI L_6300、 検出器： L-4000H
カラム ： PROTEIN C4 214TP5410 (VYDAC社製） 溶出条件： 24-40% ァセトニトリル 直線勾配 I 0. 1% トリフルォロ舴酸
(20min) ¾温にて溶出 流速： 1.0ml I mm. 検出波長： 280nm
U己条件で純化した酵素試料をメンブランカー卜リッジ（パーキンエルマ一社製） を用いて Polyvinyl idene-difluoride(PVDF )膜に転写し、気相プロテインシ一クェ ンサー PPSQ-10 (β^ϊ製作所製） にて Ν末端アミノ酸配列を解析した。 その結果、 配列番号 53に示した 20残基の Ν末端ァミノ酸部分配列が得られた。
(配列番号 53) Gin Ala Asp l ie Lys Asp Arg He leu Lys l ie Pro 1 5 10 Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys
15 20
( 3 ) S. mobaraense IF013819の 産するプロリン特 S的ぺプチダーゼ（svPEP) の特性評価
以下の特性について S. mobaraense IF013819の -； するプロリン特¾的ぺプチ ダーゼを 肺した。
(a)允色 pNA付加べプチドを½ とした ¾Λ:ρΝΑを付加した 'Τί々のべプチド^ 0.25匪 oiを^ィ /する 20mMリン酸ナ 1、リゥム緩衝液 (PH6.5)に ^液を加え、 総!,;: 0.6mlで 37°C、 5分 反応させた。 50 :酸 0.4mlを加えて反応を させ、 1 Onmの吸光度を測 して t刀断沾件を求めた。
(b) 色 Ai^NA( ?_ナフチルァミ ド）付加べプチドを A Tiとした ¾合：0.3腿 olの ぺプチドを^ィ ίする 20mMリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH6.5)にあ製 fi? ^液を加え、 総 uU.Omlで 37°C、 5分問反応させた。 Fast garnet GBC 液 (10% Triton X - 100/ 1 顏ナ卜リウム （pH4.0)で' 解し、 0.1%としたもの)を 0.4ml添加して反応を ί II：させ、 550nmの吸光度を測定して切断沾性を求めた。
(c)ぺプチドを人 ijftとした ¾合： ling I mlに調製したぺプチド溶液を とし、酵 ^溶液を添加して 30°C、 1時問反応させた。以下の条件の HPLCにて切断沽性を確認 した。
カラム ： YMC- PACK 0DS- A 4·6χ150ππη (ヮイエムシィ）
溶出液 ： 0.1ο トリフルォロ酢酸 (TFA) -ァセ卜二トリル
mx ： lml I min
検出波畏： UV 220nm その結果、 本酵素は、 プロリンのカルボキシル側を特異的に切断する酵素であ つて、 Ala- Ala- Pro- pNA、 Phe-Arg-Ala-Xaa (配列番号 6 8 ) (式中 Xaaは Pro-pNA であり、 pNAは p -ニトロァニリ ドを表す）、 Ala- Phe-Pro- pNAの順によく認識し、 N 末端から 3番目あるいは 4番目にプロリンを含 ¾するベプチドに強い反応性を示 すことが明らかになった。 また、 N末端から あるいは 5番 にプロリンを ィ j—するぺプチドには作用しないということがわかった（ ^ 5 ) 。
^ 5 . svPEPの特 ¾性
Figure imgf000054_0001
pNA : p-二卜ロア二リ ド、 ?NA： 5 -ナフチルアミ ド く配列衷フリーテキス卜〉
配列番号 6 8 ： svPEP用基質 (ii)至適 pH
pH4〜6： 20mM 酢酸ナトリゥム緩衝液
pH5.5〜8： 20mM リン酸ナトリゥム緩衝液
pH6.5〜9.5： 20mMhリス-塩酸緩衝液
を^々使川し、 Ala- Ala-Pro- pNAを丛^として 30°C、 5分問反応させた。 20mMリン 酸ナ卜リゥム緩衝液、 pH6.5における活性を 100%として各緩衝液を川いた の fll 対沾性を 出した。 その結 、 適 pHは 6〜6.5であることが Iリ 1らかになった。
(iii) pH安定性
pH3から 10までの 0.15M GTA緩衝液（3,3-ジメチルグルタル酸、 卜リス（ヒドロキ シメチル）アミノ スタン、 2-アミノ -2-メチル -1，3-プロパンジオールによる緩衝 液） を使川し、 ： (Vi製醉^ ¾液 20 1に ApHの緩衝液を 40 1加え、 4°Cで -晚放 した後、 pHを 7.0に,¾幣し、 液'' を 120〃 1に f わせた。 そのうち 50〃1を使川して A la - Ala- Pro-pNAを加え 30°Cで 5分問反応させた。 pH7.0である以外は I二^と じ 件で保 :した ¾合の沾性を 100%として i pHでの 分解 を残 活性とした。 その結 ¾、 pH4〜9の^ Mで安定であることが示された。
(iv) 1適温^
も' f製 fi ^液 50〃1に 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.5) を 0.5ml加え、 Ala- A la- Pro- pNAを 0.25mMになるように加えて 20°Cから 60°Cで 5分 分解した。 25°Cにお ける « 分解' ' を 100%とした場合の各温度での相対分解¾を相対沾性とした。 そ の結 、 ¾適温度は 25〜30°Cであることが示された。
(V)温度安定性
精製酵素液 50〃 1に 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.5) を 0.5ml加え、 4°Cま たは 20°Cから 60°Cで 15分間処理した後、氷冷し、 Ala- Ala-Pro- pNAを 0.25mMとなる ように加えて、 30°Cで 5分間反応させた。 上記で 4°Cで処理した場合の活性を 100% として残存活性を算出した。 その結果、 20°C以下で安定であるということが示さ れた。
(vi )阻害剤
各種ィ匕合物を第 6表に示した濃度で含有する 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6.5) に精製酵素溶液を加え、 室温で 10分問放置した。 その後 Ala-Ala- Pro- pNAを 加えて 30°Cで 5分問反応させた。 化合物無添加の場合の Ala- Ala- Pro- pNAに対する 活性を 100%として、 各種化合物添加の場合の相対基質分解 fiを相対活性とした。 その結果、 SH酵素阻害剤である P-クロロメルクリ安息香酸等によっても若千の阻 '^を受けたが、 セリンプロテア一ゼ阻 剤であるフエ二ルメチルスルフォニルフ ルォライ ド （ナカライテスクネ ί:製） およびアミノエチルベンゼンスルフォニルフ ルォライ ド ·ハイ ド口クロライ ド （ベーリンガー 'マンハイム礼製） にて比 '咬的 強い阻 作川を受けた。
表 6 . S.mobaraence由来のプロリン特異的べプチダーゼ活性への阻害剤の影響
Figure imgf000057_0001
( 3 )S. mobaraense IF013819由来プロリン特異的べプチダ一ゼ（svPEP)追伝子の 取得
決定した svPEPの N末端 20ァミノ酸配列から推定される塩基配列中で縮重の少な い部位 Lys- l ie- Pro- Gly- Met- Lys-Phe- Va^Glu- Glu- Lysを選び配列番号 54に示し た合成オリゴヌクレオチドを作製した。 この合成オリゴヌクレオチドをプローブ として、 常法に従って調製した S. mobaraense IF013819の染色体 DNAを、 6塩基配 列を認識する種々の制限酵素で消化し、 サザンプロッ 卜ハイブリダイゼーション 法により解析したところ、 Sac l切断により約 6kbの単一バンドが検出された。そこ で、先の方法により調製した S. mobaraense IF013819の染色体 DNAを Sac lで消化し、 約 6kbの断片を EASYTRAP Ver.2 (宝酒造社製)を用いてァガローズゲル電気泳動に より回収した。 回収断片を PUC18の Sacl部位に挿入した後、 Escherichia col i JM 109 (' ffi造ネ 1:製） のコンビテントセルに導入し、 ライブラリーを作製した。作製 したライブラリーを、 配列番^ 54に した合成ォリゴヌクレオチドの Pラベル化 物をプローブとしてコロニーハイブリダィゼーシヨンにより、 ライブラリーのス クリーニングを行い、 svPEPi^伝 Γ-断片がクローン化されたプラスミ ドを保持する W株をスクリーニングし、 Π的とする ^伝 fを取 ί ^した。 この W株より 1"1収した プラスミ ドを pUMPlと 付けた。
(配列番 - 54) 5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3'
く配列^フリーテキスト〉
配列^ - 5 4 ： svPEP川のプローブ
pUMPlとしてクローン化した断片の塩基配列を決^した。 svPEPに対応する svPE P 伝 f配列を fid列番 4 1に くした。この造伝 Γ-にコードされるァミノ酸配列を 推 ¾したところ、先にお1!製酵素夕ンパク質より決定した N末端部分ァミノ酸配列（2 0残基） を兄出し、 配列番号 4 0に示した成熟型 svPEPのアミノ酸一次配列を決定 した。また、配列番 4 2に示したような svPEPのシグナル配列およびプロ構造と 想定される領域を含む全アミノ酸の一次配列を決定した。
pUMPlで形質転換した Escherichia coli AJ13691を FEM BP- 7160として、 2000 年 5月 1 5日付けでブダぺスト条約に基づき通商産業省 ·工業技術院生命工学ェ 業技術研究所（日本国 〒305- 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1一 3)に寄託してある ( 4 )C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプ口構造部 付きプロリン特異的べプチダーゼ（svPEP)遺伝子（異種融合プレブ口プロリン特異 的べプチダーゼ（svPEP )遺伝子） の構築 実施例 9 (3 )で決定した svPEPの配列を参考にして、 施例 9 (3)で構築した pUM PIを鈸型として、 配列 Φ号 5 5と配列番号 5 6に示したプライマーを合成し、 sv PEPのプロ構造、 そして成熟 svPEPを含む遺伝子領域をこれまでと同じ方法で PCR 法にて ¾幅した。
(配列 - 5 5 ) 5'- GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3'
(配列 6 ) 5'- GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
く配列^フリーテキスト〉
配列 Φ 5 5、 5 6 : PCRブラィマ一 次に、 ^施例 4(2)で構築した pPKSPTGlを銥型として、 配列赉^ 5 1と配列番号 5 7の組み合わせにより、 glutamicumの細胞衷層タンパク Kである PS2迫伝子 のプロモー夕一領域を含む 5'-ヒ流域と C . ammoniagenesの細胞 ¾ |タンパク SI PA遗伝ィのシグナル配列を含む領域を PCR法にて増幅した。
配列番 - 5 7に示したプライマーはプロ構造部付き svPEPとの融合遗伝子を構 築するために、 svPEPの N末端側のァミノ酸をコードする配列を含んでいる。
(配列番^ 5 1 ) 5 -GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(配列番号 5 7 ) 5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3' <配列表フリーテキスト >
配列番号 5 7 ： PCRプライマ一 次に、 それぞれ増幅させた svPEPのプロ構造、 そして成熟 svPEPを含む遺伝子を コードする領域の PCR反応液各々 1〃1と、 やはり増幅させた PS2遺伝子のプロモー 夕一領域を含む 5'-上流域と C . 画 oniagenesの細胞表層夕ンパク質 SlpAのシグナ ル配列を含む領域の PCR反応液 を混ぜて銪型とし、配列番号 5 1と配列番号 5 6を用いてクロスオーバー PCRを行レ、、 PS2遗伝子のプロモ一夕一領域を含む 5'-上 流域と C. a画 oniagenesの細胞表層夕ンパク質 SlpAのシグナル配列に接続された ^種融合プレプロ svPEP遺伝子断片を増幅させた。
(配列桥号 5 1 ) 5 -GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(配列番 5 6 ) 5'- GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
ァガロースゲル? g気泳勋により、 約 2. lkbの堦幅断片を検出した。 PCR産物を Hi ndl l lで ii'H匕した後、 ァガロースゲル ¾気泳勋に供し、 約 2 · lkbの断片をァガロー スゲルから回収し、 施例 8 ( 1 )記战の pVSSlの Hindi I I部位に柿入することによ つて、 それぞれ pVSSSPlを得た。常法に従って、挿入断片の塩基配列の決 を行い、 '想通りの融合逍伝子が構築されていることを確認した。
( 5 ) ammoniagenesの細胞 ¾屑夕ンパク質のシグナル配列を川いてのプロリン 特 的ぺプチダ一ゼの分泌
構築したプラスミ ド pVSSSPlを川いて、に glutamicum ATCC13869を形質転換し、 5mg/lのクロラムフヱ二コールを含む上記 CM2S寒天培地で生育した菌株を選択し た。次に、 選択した pVSSSPlを有する C. glutamicum ATCC13869を、 5m八のクロラ ムフヱ二コールを含む上 §BMMTG液体培地で 30°C、 70時間培養した。 この培養液 1 m 1を遠心分離により培養上清と菌体に分離した。 菌体は 0. 1Mリン酸ナトリウム 緩衝液 (PH7.0)に懸濁した。 svPEPの活性測定は以下のようにして行った。 0.25mM の Ala- Ala- Pro- pNA (バッケム社製） を含有する 20mMリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH 7. 0)に、 培養上清あるいは菌体懸濁液 50〃1を加え、 総液量 0.6mlで 30°C、 20分間 反応させた後、 50 酢酸を 0.4ml加えて反応を停止させた。 410nmの吸光度を測定し、 遊離した pNAの量を算出することにより活性を決定した。なお、 fi孝素 1 位は 1分問 に l〃molの pNAを遊離させる酵素量とした。 その結果、 培養上清には svPEPの活性 は検出されず、 菌体懸濁液に活性を検出することができた。 検出された活性値と 鐘例 9 ( 1 )による比活性値から, !1·算した結 ¾、 約 50mg/l相当の svPEPが | 体^ [fii に分泌発現していることが確認された。
( 6 ) glutamicum ATCC13869において分泌究现されたセリンプロテア一ゼとプ 口リン特 的べプチダ一ゼによるプロ構造部付きトランスグル夕ミナ一ゼのプロ ^il!i部の切断
描築したプラスミ ド pVSSSPlを川いて、 ' 施例 4 (2 )に;; したプロ構^部付き トランスグルタミナーゼの分泌 プラスミ ド pPKSPTGlをィ ϊする glutamicum ATCC 13869を形 fife換し、 5mg八のクロラムフエニコ一ルと 25mg八のカナマイシン を含む上, :;dCM2S¾i天 -地で fした ¾株を選択した。次に、選択した pVSSSPl及び pPKSPTGlをィ /するに glutamicum ATCC13869を、 5mg/lのクロラムフエニコ一ルと 2 5mg/lのカナマイシンを^むし L!MMTG液体^地で 30°C、 70Ι1、 した。 雄 f 後 10 1の - を SDS- PAGEに供してから、 ι¾述の杭トランスグルタミナーゼ杭 休を川いて、 常法に従って、 ウエスタンプロット解析を った。 その結 WSAMP45 および svPEPが Π:-常に分泌 し、やはり分泌されているプロ構造部付きトランス グル夕ミナーゼのプロ構^部が切断され、 天然型の成熟トランスグル夕ミナ一ゼ とほぼ同じ分子虽を ίするトランスグル夕ミナーゼの分泌が認められた。
この培^上清について前述のハイ ドロキサメート法にてトランスグル夕ミナ一 ゼ活性を確認したところ、 天然型とほぼ同じ比活性 （約 20U/mg) を有する が確 iiじ、 L
また、 SDS- PAGE後、 前述の方法に従って、 PVDF膜にセミ ドライブロッテイング した。 プロッティング後、 PVDF膜をクマシ一プリリアン卜ブル一で染色し、脱染、 風乾した。 成熟トランスグル夕ミナ一ゼの部分を切り取り、 プロテインシ一クェ ンサ一で N末端ァミノ酸配列の解析を行った。 その結果、 配列番号 5に示した S. m obaraense由来の天然型の成熟トランスグル夕ミナーゼと同一の、 Aspを N末端のァ ミノ酸として有する配列を取っていることが確認された。 施例 1 0 ： S. mobaraense IF013819fii来のプロトランスグルタミナ一ゼのプロ 構造部の部分欠失休作製とトランスグルタミナ一ゼの分泌生産
( 1 ) プロ構造部の部分欠失型トランスグル夕ミナーゼ^伝了-の構築
先ずプロ構造 1 の 端側のァミノ酸残 ¾の 分欠失 を作製するために、' 施 例 1 ( 1 ) で決定した卜ランスグル夕ミナーゼの ^伝 Γ ¾列をもとに ¾列^ - 8 と配列^ - 9に したブラィマーを合成し、 '崖列 1 ( 1 )で取 した pU ITGから 成熟卜ランスグルタミナ一ゼの in伝 f領域をこれまでと问じ PCR法にて '巾 ί,;した。 次に、 '崖列 4 ( 2 )で構築した pPKSPTGlを銥型として、配列桥 - 1 4と配列番^ 5 8、 あるいは配列^ 1 4と ffi列桥 5 9の糾み合わせにより、 C . glutajnicu mの細胞^ ^タンパク Γίである PS2jS伝子のプロモーターを含む 5'-ヒ流域と am moniagenesの細胞 ¾ 3夕ンパク' f!SlpAのシグナル K列、 及び卜ランスグルタミナ —ゼのプロ構造部を含む迫伝 f領域を PCR法にて ^幅した。
配列桥 5 8に したブラィマ一は、トランスグル夕ミナ一ゼのプロ構造部の C 末端アミノ酸 2残基の ffi列 Ala-Proを欠失、 配列番号 5 9に したプライマーは C 末端ァミノ酸 4残基の配列 Phe- Arg- Ala- Proを欠失した遗伝子配列を冇しており、 さらに成熟トランスグルタミナーゼとの融合遺伝子を構築するために、 成熟トラ ンスグル夕ミナーゼの N末端側のアミノ酸をコ一ドする配列を含んでいる。
(配列番号 1 4 ) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番号 5 8 ) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CCG GCG C - 3' (配列番号 5 9 ) 5 -GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G- 3，
<配列表フリ一テキスト >
配列番 - 5 8， 5 9 : PCRブラィマー それぞれ塯幅させた C. glutamicumの細胞^ タンパク tである PS2 伝 のプ 口モーター 域を含む 5'-ヒ流域とに a腿 oniagenesの細胞 ¾ ^タンパク f!SlpAの シグナル配列、 及びそれぞれの改変 ffiのプロ構造部を^む領域をコ一ドする 伝 域の PCR反応液 と、やはり 幅させた成 ¾トランスグルタミナーゼを コードする領域の pciu乂応液 i 1を せて綱 'ίとし、 ' 1 4と ; 列？ f 9を 川いてクロスオーバー PCRを ί rい、 に g 1 utam i cumの細胞 ^ 夕ンパク f ίである P S 2ϋΰ伝 f-のプロモーター領域を^む 5'- I：流域と ammoniagenesの細胞^ タン パク' SlpAのシグナル ffi列、 及びトランスグル夕ミナーゼの郃分欠失^プロ構造 部に接^された成 ¾トランスグル夕ミナーゼ 伝 Ϊ-断片をそれぞれよ';1]巾 させた。
(配列^ - 1 4 ) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(¾列 - 9 ) 5 -CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' ァガロースゲル' ΐ¾泳動により、約 1.8kbのそれぞれのよ？]幅断片を検出した。こ れらの断片を制限酵尜 Seal及び Eco065Iで消化することにより生じる約 800bpの断 片をァガロースゲルから回収し、 突施例 4 ( 2 )で構築した pPKSPTGlの、 Sealと Ec o0651で切り出される断片と人れ替えることにより pPKSPTG 1 Δ AP ( Ala-Pro欠失 ¾ ) 及び pPKSPTGl△ FRAP ( Phe- Arg- Ala- Pro欠失型）を構築した。
次にプロ構造部の N末端側のアミノ酸残基の部分欠失型を作製するために、実施 例 1 ( 1 ) で泱定したトランスグル夕ミナーゼの遺伝子配列をもとに配列番 ^ 6 0と配列番号 6 1に示したプライマーを合成し、 配列番号 6 0と配列番号 9、 あ るいは配列番号 6 1と配列番号 9の組み合わせで実施例 1 ( 1 ) で取得した pUIT Gからプロトランスグルタミナーゼの遺伝子領域を PCR法にて増幅した。
(配列番号 6 0 ) 5 -AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T - 3，
(配列 1 ) 5 -GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G- 3，
(K列番 9 ) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
く配列 フリーテキス卜〉
配列^ 6 0， 6 1 : PCRブラィマ一 次に、 ^施例 4(2 )で構築した pPKSPTGlを鈸 として、 ¾列 ^リ 1 4と 1¾列 ·Τ 6 2、 あるいは配列 ¾ 1 4と配列¾ 63の組み わせにより、 C. glutamicum の細胞 ¾ ^タンパク 'Γίである PS2遗伝子のプロモーター領域を含む 5'-ヒ流域とに ammoniagenesの細胞^ 'タンパク赏 SlpAのシグナル配列を含む領域を PCR法にて した。
ffi列 - 6 2に小したブラィマ一は、 トランスグルタミナーゼのプロ構造部の N 端ァミノ酸 1残基 Πの Aspを欠失、 また配列桥' 6 3に したプライマーは N 端ァミノ酸 6残基の配列 Asp- Asn- Gly- Ala- Gly- Gluを欠失した逍伝子配列をィ ίして おり、さらに C . ammon iagenesの細胞表層タンパク質 S 1 pAのシグナル配列との融合 遗伝子を構築するために、 C . ammon i agenesの細胞表層タンパク質 S 1 pAのシグナル 配列の C末端側のァミノ酸をコードする配列を含んでいる。
(配列番号 1 4 ) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番号 6 2 ) 5 -GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G- 3，
(配列番号 6 3 ) 5'-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G- 3'
<配列表フリーテキスト>
配列番号 6 2， 6 3 : PCRブラィマー それぞれ増幅させた C . glutami cumの細胞表層タンパク iである PS2遗伝 fのプ 口モーター領域を含む 5'- L流域と C. ammoniagenesの細胞 ¾層夕ンパク ftSlpAの シグナル配列を含む領域をコードする遗伝了-領域の PCR反応液各々 1 1と、やはり ¾幅させたプロ構造部の N末端を部分欠失したプロ卜ランスグルタミナ一ゼをコ 一ドする^域の PCR反応液 1〃1を混ぜて鈸 とし、配列 ¾ - 1 4と配列^ - 9を川 いてクロスオーバー PCRを行い、 glutamicumの細胞^^夕ンパク 'Γίである PS2 ^伝 fのプロモータ一領域を含む 5'-ヒ流域と ajmoniagenesの細胞 ^ 夕ンパ ク贾 SlpAのシグナル配列、 及び卜ランスグル夕ミナーゼの部分欠失 !プロ構造部 に接続された成熟トランスグル夕ミナーゼ遗伝子断片を増幅させた。
(配列 ^ S- l 4 ) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列 - 9 ) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' ァガ口一スゲル 気泳動により、約 1.8kbのそれぞれの^幅断 'を検出した。こ れらの断片を制限酵 Seal及び Eco065Iで消化することにより生じる約 800bpの断 片をァガロースゲルから回収し、 突施例 4 ( 2 )で構築した pPKSPTGlの、 Sealと Ec o0651で切り出される断片と入れ替えることにより pPKSPTGl△ D( Asp欠失 ¾ )及び p PKSPTGl ADNGAGE(Asp- Asn- Gly- Ala- Gly-Glu欠失型）を構築した。
( 2 ) プロ構造部分欠失型卜ランスグル夕ミナーゼの分泌
構築したプラスミ K pPKSPTGl ΔΑΡ, pPKSPTGl AFEAP, pPKSPTGl Δϋ, あるいは p PKSPTG1 ADNGAGEを用いて glutamicum ATCC13869を形質転換し、 25mg/lのカナ マイシンを含む上記 CM2S寒天培地で生育した菌株を選択した。 次に、 選択した pP KSPTGI AAP, pPKSPTGl AFRAP, pP SPTGl AD, あるいは pPKSPTGl A DNGAGEを有する glutamicum ATCC13869を 25mg/lのカナマイシンを含む上記 MMTG液体培地でそ れぞれ 30°C、 48時間培養した。 -養終了後 10 1の培養上消を SDS-PAGEに ί してか ら、 ι' 述の杭トランスグル夕ミナ一ゼ抗休を川いて、 常法に従って、 ウェスタン ブロッ卜解析を行った。 その結果、 プロ構 i 部が部分的に欠失したプロトランス ゲルタミナーゼの分泌が確認された。 pPKSPTGl AAP、 pPKSPTGl A FRAP、 および pP KSPTG1 ADを保 ½する紐換え休はそれぞれ大然 ¾' (pPKSPTGl )と
Figure imgf000066_0001
したが、 pPKSPTG 1 Δ DNGAGEを保持する糾換え休については 然 ( pPKSPTG 1 )のそ れの約 1/2の分泌 ;ύ:であつた。
( 3 ) glutamicum ATCC13869において分泌允 されたセリンプロテアーゼによ るプロ祸造 i 分欠'火 プロ卜ランスグルタミナーゼのプロ ½ ^部の 断
' 施例 8 ( 1 )で構築したプラスミ ド pVSSlを川いて、 ^施例 1 0 ( 2 )に, id战した プロ構造部分欠火 プロトランスグルタミナ一ゼの分泌 ¾J¾プラスミ ド pPKSPTGl ΔΑΡヽ pPKSPTGl Δ FRAP, pPKSPTGl ADおよび pPKSPTGl Δ DNGAGEをィ/する glutam icum ATCC13869を形' fife換し、 5mg/ lのクロラムフヱニコールと 25mg八のカナマイ シンを^む dCM2S¾天お '地で f した [ 株を選択した。 次に、 選択した pVSSl と pPKSPTGl ΔΑΡ、 pPKSPTGl Δ FRAP, pPKSPTGl ADおよび pPKSPTGl△ DNGAGE をィ /す る lutamicum ATCC13869を 5mg八のクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイ シンを^む [i^MMTG液休培地で 30°C、 70時 -巷した。培 ¾終了後 10 1の - ¾ヒ を SDS-PAGEに供してから、 ιϊίί述の抗卜ランスグル夕ミナーゼ抗体を川いて、 常 法に従って、 ウエスタンブロット解析を行った。
その結 SAMP45が正常に分泌発 ¾し、 やはり分泌されて L、るプロ構造部分欠失 ¾プロトランスグル夕ミナ一ゼのプロ構造部が切断され、 天然型の成熟トランス グル夕ミナーゼとほぼ同じ分子量を有するトランスグル夕ミナーゼの分泌が認め られた。 また、 SDS-PAGE後、 先に述べたと同じ方法で PVDF膜にセミ ドライブロッテイ ン グした。 ブロッテイング後、 PVDF膜をクマシ一プリリアントブル一で染色し、 脱 染、 風乾した。 成熟トランスグル夕ミナーゼの部分を切り取り、 プロテインシ一 クェンサ一で N末端アミノ酸配列の解析を行った。その結果、 pPKSPTGl AAPを有す る組換え体では配列番号 5に示した天然型の成熟トランスグル夕ミナ一ゼの N末 端に Phe-Argが付加したものが、 pPKSPTGl AFRAPを有する組換え休では成熟トラン スグル夕ミナーゼの N末端に Ser- Ala- Gly- Pro- Serが付加したものが、 pP SPTGl AD および pPKSPTGl ADNGAGEを有する組換え体では成熟卜ランスグル夕ミナーゼに Ph e- Arg- Ala- Proが付加していることが確認された。
' '施例 1 1 ： S. mobaraense IF013819|tl来のプロトランスグルタミナーゼのプロ 構造部の改変体作製とトランスグルタミナーゼの分泌生産
( 1 ) プロ構造部改変型プロトランスグル夕ミナ一ゼ遗伝子の構築
施例 1 ( 1 ) で決定したトランスグルタミナ一ゼの遗伝— f配列をもとに配列 - 8と配列 ¾ 9に示したプライマーを合成し、 施例 1 ( 1 ) で取得した pU ITGから成熟トランスグル夕ミナーゼの 伝了領域を PCR法にて增幅した。
次に、 実施例 4(2 )で構築した pPKSPTGlを鈸型として、 配列番 1 4と配列桥号 6 4の糾み合わせ、 あるいは配列赉弓- 1 4と配列番号 6 5の組み合わせ、 あるい は配列番号 1 4と配列番号 6 6の組み合わせ、 あるいは配列番号 1 4と配列番 6 7の組み合わせにより、 C. glutamicumの細胞表層タンパク質である PS2遺伝子 のプロモーター領域を含む 5'-上流域と ajnmoniagenesの細胞表層タンパク質 S1 pAのシグナル配列、 及びトランスグル夕ミナーゼのプロ構造部を含む領域を PCR 法にて増幅した。
配列番号 6 4に示したプライマーは、トランスグルタミナーゼのプロ構造部の C 末端ァミノ酸 3残基の配列 Arg- Ala- Proを Gly- Pro- Lysに、配列番号 6 5に示したプ ライマーは Arg_Ala-Proを Gly- Pro- Argに変換した遺伝子配列を有している。 また 配列番号 6 6に示したブライマーは、 プロ構造部の C末端ァミノ酸 5残基の配列 Se r- Phe- Arg-Ala- Proから Lysのみに、 配列番号 6 7に示したプライマ一は、 Ser- Ph e - Arg- Ala-Proから Argのみに変換した遺伝子配列を有している。
さらに成熟トランスグル夕ミナ一ゼとの融合遗伝子を構築するために、 成熟卜 ランスグル夕ミナーゼの N末端側のァミノ酸をコードする配列を含んでいる。 (配列番^ 1 4 ) 5 -AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(配列番号 6 4 ) 5'- GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTG GGG CCG AAC GAC GGG C- 3，
( ¾列 6 5 ) 5' - GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C- 3，
(配列徘^ 6 6 ) 5 -GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTC GGG CCG GCG CTC GAA G- 3,
(配列番号 6 7 ) 5 -GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CCG GCG CTC GAA G -3，
く配列表フリ一テキスト >
配列恭^ 6 4〜 6 7 ： PCRプラィマー それぞれ増幅させた C · glutamicumの細胞表層タンパク質である PS2遗伝子のプ 口モーター領域を含む 5'_上流域と ammoniagenesの細胞表層夕ンパク質 SlpAの シグナル配列、 及び改変型プロ構造部を含む領域をコードする遺伝子領域の PCR 反応液各々 1〃1と、 やはり增幅させた成熟トランスグル夕ミナ一ゼをコードする 領域の PCR反応液 1〃1を混ぜて銪型とし、配列番号 1 4と配列番号 9を用いてクロ スォ一ノ 一 PCRを行い、 glutamicumの細胞表層タンパク質である PS2遺伝子のプ 口モー夕—領域を含む 5'—上流域とに ammoniagenesの細胞表層夕ンパク質 SlpAの シグナル配列、 及び改変型卜ランスグル夕ミナーゼのプロ構造部に接続された成 熟トランスグル夕ミナーゼ遺伝子断片を増幅させた。
(配列番号 14 ) 5-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(1 列番 9 ) 5-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' ァガロースゲル' 4¾ί泳動により、約 1.8kbの^幅断片を検出した。この断 を制 限 ^ Seal及び Eco0651で消化することにより じる約 800bpの断） 'rをァガロース ゲルから |"1収し、 '眉列 4( 2 )で構築した pPKSPTGlの、 Sealと Eco065Iで t刀り出さ れる断) ',-と人れ^えることにより pPKSPTGll ( Gly-Pro-Lys改変 )及び pPKSPTG12 (Gly- Pro- Arg改変 -) 、 pPKSPTG13( Aphe- Arg- Ala- Proで Lys 人改変^)及び pPK SPTG14(△ phe-Arg- Aia- Proで Argiifi人改変 )を構築した。
( 2 ) プロ^) l!i改変 '1卜ランスグルタミナ一ゼの分泌
構築したプラスミ pPKSPTGlU pPKSPTG12. pPKSPTG13あるいは pPKSPTG14を川 いて lutamicum ATCC13869を形 i転換し、 25mg/lのカナマイシンを^むヒ, kC M2S½ 地で ^ iした ( 株を選択した。次に、 選択した pPKSPTGll、 pPKSPTG12, PPKSPTG13あるいは pPKSPTGMをィ /する C. glutamicum ATCC 13869を、 25mg/lの力 ナマイシンを^むヒ, kMMTG液休 -地でそれぞれ 30° 48 】 ^した。 ^終 後 10〃1の 上^を SDS-PAGEに供してから、 ι¾述の杭卜ランスグルタミナーゼ抗 休を川いて、 常法に従って、 ウエスタンプロット解析を行った。 その結 、 プロ 構造部付きトランスグル夕ミナーゼの分泌が確認された。
(3)C. glutamicum ATCC13869おいて分泌発現されたセリンプロテアーゼによる 改変型プロ構造部付き卜ランスグル夕ミナーゼのプロ構造部の切断
施例 8( 1 )で構築したプラスミ ド pVSSlを用いて、実施例 1 1( 2 )に記載した 改変型プロ構造部付きトランスグル夕ミナーゼの分泌発現プラスミ ド pPKSPTGll、 PPKSPTG12, pPKSPTG13あるいは pPKSPTG14を glutamicum ATCC13869に形質転換 し、 5mg/lのクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイシンを含む上記 CM2S寒天培 地で生育した菌株を選択した。 次に、 選択した pVSSlと pPKSPTGll、 あるいは pVSS 1と pPKSPTG12、 pVSSlと pPKSPTG13、 あるいは pVSSlと pPKSPTG14を有する C. gluta mi cum ATCC13869を、 5mg/lのクロラムフエ二コールと 25mg/lのカナマイシンを含 む dMMTG液体掊地で 30°C、 70時問培巷した。 お-養終了後 10〃 1の培養上清を SDS - PAGEに供してから、 ι' 述の抗トランスグルタミナ一ゼ抗休を川いて、常法に従つ て、 ウェスタンプロット解析を行った。 その結 SAMP45が正常に分泌発現し、 や はり分泌されて t、る改変 '-』プロ構造部付きトランスグルタミナ一ゼの改変型プロ ^^部が t刀断され、 天然型の成 トランスグルタミナーゼとほぼ同じ分子； をィ了 するトランスグルタミナーゼの分泌が められた。
また、 SDS- PAGE後、 常法通り PVDF脱にセミ ドライブロッテイングした。 プロッ ティング後、 PVDF脱をクマシ一プリリアントブルーで染色し、 脱染、 風乾した。 成¾トランスグル夕ミナーゼの部分を切り取り、 プロティンシークェンサ一で N 端アミノ酸配列の解析を行った。 その結果、 pVSSlと pPKSPTGll、 あるいは pVSS 1と PPKSPTG12を する glutamicum ATCC13869については配列番^ 5に^した 大然 の成熟トランスグルタミナーゼと^一の、 Aspを N末端のァミノ酸として ί する ¾列を取っていることが確認された。 他方、 pVSSlと pPKSPTG13、 あるいは pV SSIと pPKSPTGMをィ ίする glutamicum ATCC13869については天然型の成熟卜ラ ンスグル夕ミナーゼに Ser_Ala- Gly- Pro- Lys (配列番 6 9 ) 、 あるいは Ser- Ala -Gly-Pro-Arg (配列番号 7 0 ) の付加したものであった。
前者の天然型成熟トランスグルタミナーゼと同一のアミノ酸配列を有するもの の培養上清についてハイ ドロキサメート法にてトランスグル夕ミナ一ゼ活性を確 認したところ、 天然型とほぼ同じ比活性 （約 20U/mg) を有する事が確認できた。 <配列表フリーテキス ト〉
配列番号 6 9、 7 0 :天然の卜ランスグル夕ミナ一ゼに付加された配列 本発明により、 コリネパクテリゥム属細菌に有用タンパク質、 特にトランスグ ル夕ミナーゼを多量に産生させ、かつ効率よく菌体外に分泌させることができる。 本発明によって生産されるタンパク質は培地中に放出されるため、 既知の適切な 方法により、 简便かつ人規ネ ¾に培地から ίίί接回収することができる。

Claims

諳求の範囲
1 . コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にコリネ型細菌由来のシ グナルぺプチド領域をコードする核酸配列が接続され、 に前記シグナルべプチ ド領域をコードする核酸配列の 流にプロ構造部を含む異砘の分泌 夕ンパク l をコードする核酸配列が接統された允現造伝 f構築物を^するコリネ 細 i を -
1$し、 ιϊϊ記！ ¾種の分泌 タンパク tを前¾コリネ¾細菌に^ および分泌させ、 次いで前 ¾种;の分泌 タンパク 'Πからプロ構造部を切断 ·除去することを特徴 とする、 -極の分泌 タンパク tの製造方法。
2 . の分泌 夕ンパク ftがトランスグルタミナーゼである, ί求项 1 战のノ j 法。
3 . シグナルぺプチドがコリネ 細 ι 山来の細胞 夕ンパク' のシグナルぺプ チドである 求 1または 2に^ (¾の/ J法。
4 . シグナルぺプチドがコリネバクテリウム ·グルタミカム山来の細胞 ；夕ン パク fiのシグナルべプチドである 求项 1または 2に記載の方法。
5 . シグナルぺプチドが ¾列 1または 2 9に^すァミノ酸配列をィ /する、 ,Ι,'ί 求 ¾ 4 1 の方法。
6 . シグナルべプチドがコリネバクテリゥム ·アンモニアゲネス山来の細胞^ ' 夕ンパク Kのシグナルべプチドである 求项 1または 2記載の方法。
7 . シグナルべプチドが配列^ ^ 2に小すァミノ酸配列を する 求项 6 ,记战の 方法。
8 . プロ構造部が放線菌出来の卜ランスグル夕ミナーゼのプロ構造部に相 ¾する 1 f求埙 1〜 7のいずれか 1項に 載の方法。
9 . プロ構造部が配列番号 3または 4に示す配列を有する、請求項 8記載の方法。
1 0 . プロ構造部が、 配列番 3または 4に記載のアミノ酸配列において少なく とも一つのアミノ酸の置換または欠失または挿入または付加またはこれらの組み 合わせを含む請求項 8記載の方法。
1 1 . プロ構造部のァミノ酸配列が配列番号 3 0〜 3 8に記載のァミノ酸配列の いずれかである請求項 1 0記載の方法。
1 2 . プロ構造部の切断 ·除去がプロテア一ゼによって行なわれる ·求^ 1また は 2に■!ふ観の方法。
1 3 . 極の分泌型タンパク Γίを; ¾生および分泌するコリネ 細 が ϋίにプロテ ァーゼを産生することを特徴とする、 求项 1 2に;记載の方法。
1 4 . プロ構造部の切断 ·除去がプロテア一ゼおよびべプチダーゼによって行わ れる, 求项 1 3に^載の方法。
1 5 . Wfllの分泌 夕ンパク' Πを^ Ί:.および分泌するコリネ 細 'が UIにプロテ ァーゼおよびぺプチダ一ゼを^ 7 することを特徴とする、 求 ¾ 1 4に, k]战のノ J 法。
1 6 . プロテア一ゼが放線菌山来である 求项 1 2または 1 4に, kl,践の方法。
1 7 . プロテア一ゼがストレプ卜マイセス ·アルボグリセオラス山来である 求 1 2または 1 4に^裁の方法。
1 8 . ぺプチダーゼが放線 | ΊΙΐ来である^ ί·求项 1 4に^戦の方法。
1 9 . ぺプチダーゼがストレブトマイセス 'モバラエンス由来である 求 1 4 に 載の方法。
2 0 . 卜ランスグル夕ミナーゼが放線 ¾由来トランスグル夕ミナーゼである 'ί求 2〜 1 1のいずれか 1項に記載の方法。
2 1 . トランスグル夕ミナ一ゼがストレプトバ一チシリウム ·モバラエンス由来 トランスグル夕ミナーゼである請求項 2 0に記載の方法。
2 2 . トランスグル夕ミナ一ゼが配列番号 5のアミノ酸配列を有する、 請求項 2 1に記載の方法。
2 3 . トランスグル夕ミナ一ゼがストレプトバ一チシリウム ·シナモニゥム由来 トランスグルタミナ一ゼである請求項 2 0記載の方法。
2 4 . 卜ランスグル夕ミナ一ゼが配列番号 4 3のアミノ酸配列を有する、 ^求項 2 3に記載の方法。
2 5 . コリネ型細菌由来のシグナルぺプチドのド流に成熟型トランスグルタミナ —ゼが接^された融合タンパク Γίをコリネ 細 Wに^ゾ上および分泌させることを 特徴とする、 成熟 トランスグルタミナ一ゼを分泌 ζ ^する方法。
2 6 . 以卜ーの性 をィ /するプロリン特Ά ' 的ぺプチダ一ゼ ο
( 1 ) 以下のプロリン含ィ ίペプチドの少なくとも 1つに対して作川し、プロリンの カルボキシル側で ぺプチドを t刀断する。
Ala - Ala - Pro - pNA、 Ala - Phe - Pro - pNA、 Phe-Arg - Ala - Pro - pNA
(式屮、 pNAは P-ニトロァニリ ドを す。 )
(2 ) 1適 pHが 6.0〜6.5である。
( 3 ) pH4〜9で安定である。
(4) 1適温度が 25〜30°Cである。
( 5 ) 20°C以ドで安定である。
(6 ) フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィ ド、アミノエチルベンゼンスルフォ ニルフル才ライ ド 'ハイ ドロクロライ ドで活 ' がれ される。
( 7) ϋ点が 10.2である。
( 8)分 f が約 50, 000である。
2 7 . 放線菌由来である^求项 2 6に記載のプロリン特異的べプチダーゼ。
2 8 . 配列番^ 4 0記戟のァミノ酸配列を含む 求 ¾ 2 6記載のプロリン特異的 ぺプチダ一ゼ活性を有するポリぺプチド。
2 9 . 配列番号 4 0記載のアミノ酸配列において少なくとも 1個のアミノ酸の置 換または欠失または挿入または付加またはこれらの組合わせを含む、 請求項 2 6 記載のプロリン特異的ぺプチダーゼ活性を有するポリぺプチド。
3 0 . 請求項 2 8あるいは請求項 2 9に記載されたポリペプチドをコードする核 酸分子。
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