WO2001005412A1 - Agents de reduction du cholesterol, inhibiteurs de production d'acide biliaire secondaire, aliments et boissons - Google Patents

Agents de reduction du cholesterol, inhibiteurs de production d'acide biliaire secondaire, aliments et boissons Download PDF

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WO2001005412A1
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yeast
kluyveromyces
saccharomyces
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Haruji Sawada
Yasuto Yoshida
Yasue Wada
Kenji Ohishi
Masahiko Itoh
Wakae Mori
Tunekazu Watanabe
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a cholesterol-lowering agent capable of lowering blood and liver cholesterol and improving the arteriosclerosis index; secondary bile acids useful for prevention and treatment of colorectal cancer, liver cancer, knee cancer, cholelithiasis, etc.
  • the present invention relates to a production inhibitor and its use in foods and drinks. Background art
  • Cholesterol which is present in excess in plasma, accumulates in the blood vessel walls and causes arteriosclerosis.However, after cholesterol is taken up by the liver, it is converted to bile acids without accumulating there, or it remains unchanged. If it is excreted into the intestinal tract and excreted together with feces, the cholesterol pool in the body is also reduced, and arteriosclerosis by the above mechanism is prevented. Therefore, it is expected to have not only a plasma cholesterol lowering effect but also a liver cholesterol lowering effect.
  • yeast has been known for a long time. Its effect on lipid metabolism was improved by administering beer yeast (9 g per day) supplemented with chromium to elderly people for 8 weeks. Reported that a decrease in cholesterol was observed [Ester G. Offenbacher and F. Xavier Pi-
  • yeasts it was reported that a methanol extract of yeast reduced serum cholesterol and triglyceride levels of cholesterol-loaded rats in red yeast (Sporobolomyces ruberrinus) and Saccharomyces uvarum ⁇ .
  • yeasts exhibiting a cholesterol-lowering effect other than brewer's yeast there are still few reports of yeasts exhibiting a cholesterol-lowering effect other than brewer's yeast, and there are no reports that yeast cells themselves or their cell components showed an effect of improving lipid metabolism.
  • cholic acid and chenodeoxycholic acid are synthesized from cholesterol and conjugated to glycine or taurine to form glycine or taurine-conjugated bile acids through the bile duct and digestive tract.
  • primary bile acids emulsify and disperse lipids in foods and drinks by their surfactant activity, promote the decomposition and absorption of serum by enzymes and lipases, and are actively reabsorbed from the ileum.
  • the reabsorbed bile acids return to the liver through the portal vein and are secreted again into the gastrointestinal tract to form the enterohepatic circulation, which repeats this circulation.
  • Bile acids that escaped absorption from the ileum can be deconjugated or dehydroxylated by intestinal bacteria, It is converted to secondary bile acids by modifications such as oxidation, reduction, and epimerization.
  • the major secondary bile acids generated during this process are deoxycholic acid and lithocholic acid, which are generated by the 7a-dehydration reaction of the primary bile acids cholic acid and chenodeoxycholic acid, respectively. .
  • Some of the secondary bile acids are passively absorbed from the large intestine and enter the liver and repeat enterohepatic circulation in the same way as primary bile acids, but the remaining bile acids are excreted in feces.
  • secondary bile acids such as deoxycholate and lithocholic acid produced by intestinal bacteria in the large intestinal lumen have a strong oncogenic promoter activity and can also cause cholelithiasis.
  • secondary bile acids By suppressing the production of secondary bile acids, it is possible to prevent or treat diseases such as colon cancer, liver cancer, knee cancer, bile duct cancer, and cholelithiasis.
  • ampicillin a penicillin antibiotic (Low-Beer, TS., Nutter, S., Lancet, 2 (8099), 1063-1065, 1978), 3, 1 2 / 3-dihydroxy-5 3-colan-1-24-N-methylamine (Roda, A., et.a., J. Parm.
  • Ampicillin and 3a, 123-dihydroxy-1 / 5 / 3-cholane-24-N-methylamine produce secondary bile acids by eliminating bacteria that catalyze 7 ⁇ -dehydroxylation in the large intestinal lumen
  • the emergence of resistant bacteria and the occurrence of side effects are problematic.
  • an object of the present invention is to provide a cholesterol-lowering agent capable of effectively lowering cholesterol in the blood and liver by using safe yeast having few side effects.
  • Another object of the present invention is to inhibit secondary bile acid production, which is effective and safe, is useful for the prevention or treatment of diseases such as colon cancer, liver cancer, kidney cancer, bile duct cancer, and cholelithiasis.
  • the agent is provided. Disclosure of the invention
  • yeast belonging to the following specific genera It has been found that it has little effect and has an effect of effectively lowering cholesterol in blood and liver.
  • yeast has an effect of suppressing the conversion of primary bile acids to secondary bile acids, and completed the present invention.
  • the present invention relates to a cholesterol-lowering agent containing, as an active ingredient, one or more yeasts belonging to the genera Candida, Isachenkia, Hanseniaspora, Cloeckella, Kluyveromyces, Pichia or Torrasbora, and It is intended to provide foods and beverages containing the same.
  • the present invention also provides the use of these specific yeasts for the production of cholesterol-lowering agents and cholesterol-lowering foods and drinks.
  • the present invention also provides a method for treating cholesterol lowering, characterized by administering these specific yeasts.
  • the present invention also provides a secondary bile acid production inhibitor containing yeast as an active ingredient, and a food or drink containing the same.
  • the present invention also provides a secondary bile acid production inhibitor for yeast and a use for producing a food or drink for suppressing secondary bile acid production.
  • the present invention provides a treatment method for suppressing secondary bile acid production, which comprises administering yeast.
  • FIG. 1 is a diagram showing the plasma cholesterol level of the group administered with the diet supplemented with cholesterol and the diet without supplement.
  • the yeast used for the cholesterol-lowering agent or the food or drink of the present invention is a yeast belonging to the genus Candida, Isachenkia, Hansenius spora, Cloechella, Kluyveromyces, Pichia or Torrasbora. More than species It is a yeast belonging to the genus Pichia or the genus Torulaspora, and these may be used alone or as a mixture of two or more.
  • the yeast may be live cells, heated cells, freeze-dried products, crushed products thereof, or components thereof.
  • yeasts belonging to the above genera preferred are, for example, Candida 'Kefir, Isachenkia' Orien, Squirrel, Hanseniaspora 'Evalam, Ku Kou Eckella. Africana, Kluiberomyces' Marxianas, Kluybechi Meisses' Lactis, Pichia ⁇ Farinosa, Torrasbora 'Delbruecki' and the following yeasts are most suitable.
  • Candida kefyr YIT 82 3 7 (FERM BP-7214, original date of deposit: July 16, 1999, depository) Ministry of International Trade and Industry, Ministry of Industry and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology, postcode 305-8566 Tsukuba, Ibaraki, Japan Hansenaspora uvarum YIT 8 164 (FERM BP-7212, original deposit date July 16, 1999), Issatchenkia orientalis YIT 8266 (the same applies hereinafter)
  • FERM BP-7215 original deposit date July 16, 1999
  • Kloeckera africana YIT 8165 (FERM BP-7213, original deposit date July 16, 1999)
  • Kluyveromyces Malki Sianas (Kluyveromyces) marxianus)
  • YIT 82 92 (FERM BP-7217, original deposit date July 16, 1999), Kluyveromyces lactis YIT 8263 (FERM BP-7216, original deposit date July 16, 1999), Pi
  • yeasts used in the production of foods (wine, milk, cheese) and are extremely safe strains for the human body.
  • yeast used as the secondary bile acid production inhibitor of the present invention will be described.
  • the yeast used as the secondary bile acid production inhibitor is not particularly limited, and the yeast includes live cells, heated cells, freeze-dried products, crushed products thereof, and the like obtained by culturing the yeast. These components are included.
  • yeast used in the present invention inhibits the reaction of eliminating 7 ⁇ -hydroxyl group such as cholic acid and inhibits the production of secondary bile acid such as dexoxycholic acid.
  • the present invention utilizes the action of suppressing and inhibiting the conversion of primary bile acids into secondary bile acids in yeast, and in particular, adsorbs primary bile acids such as cholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, and chenodeoxycholic acid.
  • Yeast having excellent ability to increase the intestinal concentration of short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid are preferred because they have an excellent effect of inhibiting the 7 ⁇ -hydroxyl group elimination reaction.
  • the secondary bile acid production inhibitors preferably belong to the genus Isatiencia, Kluyveromyces, Hansenius spora, Saccharomyces, Hippopitia, Candida, Torulaspora, Pichia and Tigosaccharomyces among yeasts.
  • Yeasts can be used, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • Candida 'Utilis, Torraspora' Delbruecki, Pichia anomala, Pichia Holsti and Tigosaccharomyces roxy It cited as the a further optimized the following yeasts of these. Isachenkia orientalis (Issatchenkia orentalis) YIT 8266 (FERM BP-7215), Kluyveromyces marxianus (Kluyveromyces marxianus) YIT 8 292 (FERM BP-7217), Kluyveromyces Lactis (Kluyveromyces 826) ), Kluyveromyces thermotolerans YIT 8294 (AT CC 20309), Hanseniaspora uvarum
  • YIT 8 1 6 4 (FERM BP-7212), Saccharomyces cerevisiae YIT 8 1 16 (ATC C 48 5 54), Saccharomyces dairensis YIT 8 1 9 1 Cac 3007), Saccharomyces exiguus YI ⁇ 810 (CBS 310), Saccharomyces unisporous
  • Saccharomyces bayanus Saccharomyces bayanus (Saccharomyces bayanus) YI T8 128 (CBS 380), Hypopitia burtonii (Hyphopichia burtonii) YI T8299 (CB S 2352), Candida kefyr YIT 8237 (FERM BP-7214) , Candida etchellsii YIT 8278 (ATC C 60 1 19), Candida zeylanoides (Candida zeylanoides) YIT 80 18 (I FO 07 19), Candida solani (Candida solani) YIT 8023 (CBS 1 908) , Candida maltosa YIT 8283
  • YIT 8 2 8 6 CBS 9 4
  • Candida cylindracea Candida cylindracea
  • YIT 82 7 6 ATC C 14830
  • Candida utilis Candida utilis
  • YIT 8 2 04 AT CC 995 0
  • Torulasbora del Bruecchi Torulasbora del Bruecchi (Torulaspora delbrueckii) YIT 83 1 3 (J CKi 2 2 04) and YIT 8133 (IFO 1172)
  • Pichia anomala YI T8298 JCM3587
  • YIT8297 JCM
  • yeasts have long been used in the production of foods (wine and cheese) and are extremely safe microorganisms for the human body.
  • these microbial cells are particles of a few microns, they have a feature that they are much easier to take than particles having a size of 20 microns or more that affect the texture.
  • Table 1 shows "The yeast, No. 3rd edition. JW Kreger-Van Rij, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1984. "FERM BP-7215
  • Diazonium blue B reaction The yeast used in the present invention can be produced by a usual method, for example, culturing in a complex medium containing a yeast extract or polypeptone or a synthetic medium mainly containing inorganic salts.
  • the yeast thus obtained is used as a viable cell or a lyophilized product thereof, or a dead cell subjected to heat treatment, a crushed product thereof, or a component thereof, as a pharmaceutical composition or food or drink. be able to.
  • the yeast used in the present invention may be a commercially available yeast.
  • the yeast described above can be used in various dosage forms together with a pharmaceutically acceptable carrier according to a conventional method. It can be a composition.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, when preparing an oral solid preparation, after adding an excipient and, if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, a flavoring agent, etc., to the yeast, a conventional method is used.
  • additives may be those commonly used in the art, such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cell mouth.
  • disintegrants dried starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, lactose, etc .
  • purified lubricant as lubricant H Stearic acid salts, borax, polyethylene glycol, sucrose as a flavoring agent, orange peel, Kuen acid, tartaric acid and the like.
  • a flavoring agent, a buffer, a stabilizing agent, a deodorant and the like are added to the above yeast, and an oral solution, a syrup, an elixir and the like can be produced by an ordinary method.
  • those described above may be used as the flavoring agent, and sodium citrate or the like may be used as the buffering agent, and tragacanth, gum arabic, gelatin or the like may be used as the stabilizer.
  • the food and drink of the present invention can be produced by adding the above yeast to various foods and drinks.
  • Preferred foods and drinks here include fermented milk, fruit juice drinks, soups, rice crackers, cookies and the like.
  • Food and drinks also include animal feed.
  • yeast is usually about 10 mg to 30 g per adult, preferably about 1 to 5 g per day. It is preferable to administer once or about 2 to 4 divided doses.
  • the cells were separated from the supernatant using a cooling centrifuge, and the cells were washed twice with distilled water.
  • the washed cells were placed in a two-litre Erlenmeyer flask, added with one liter of distilled water, and then heated in an autoclave at 115 ° C for 10 minutes. The heated cells were freeze-dried as they were.
  • each test feed was a cholesterol-supplemented diet containing 0.5% cholesterol and 0.25% sodium cholate, and 5% or 10% lyophilized yeast cells were added to the yeast-containing feed.
  • Component Control group 10% yeast group 5% yeast group
  • Example 1 The one prepared in Example 1 (mouth) was used.
  • cannula blood was collected from the abdominal aorta under Nembutal anesthesia (non-fasting), and the plasma cholesterol concentration and plasma HDL concentration were measured. Total cholesterol concentration was measured using a Hitachi 7170 automatic biochemical analyzer.
  • the HD L cholesterol concentration was measured using a Hitachi 7170 automatic biochemical analyzer after sedimentation of lipoprotein components other than the HDL component using Kyowa Medix Detamina HDL.
  • Blood was collected from the tail vein on day 7 from the start of administration, and the plasma cholesterol concentration and plasma HDL concentration were measured. Total cholesterol concentration was measured using a Hitachi 7170 automatic biochemical analyzer.
  • the HDL cholesterol concentration was measured using a Kyowa Medix Detamina HDL to precipitate lipoprotein components other than the HDL component, and then using a Hitachi 7170 automatic biochemical analyzer.
  • the collected liver was lyophilized. Extraction of lipids was carried out according to the method of Folch et al., Using form: methanol (2: 1). Thereafter, the lower layer of chloroform was concentrated to dryness, diluted again with ethanol, and used for measurement of various liver lipid components. The cholesterol content in the liver lipid was measured using Demina Mina TC5 ⁇ 5.
  • the results of each animal test were tested for homogeneity of variance by the Bartlett method. If the variances were equal, a one-dimensional analysis of variance was used to perform a Dunnett-type multiple comparison test. The test was performed at the significance level of 5%, and the test for which a significant difference was obtained was performed using the Dunnett's multiple comparison test via the Kruskato Wallis test. In Dunnett's multiple comparison test, the significance level was set to 5% and 1%, and the test was performed at each level.
  • a plasma cholesterol lowering rate of 100% indicates that the plasma cholesterol level was reduced to the same level as the plasma cholesterol level of the rats in the normal diet group to which a cholesterol-free diet was administered.
  • a plasma cholesterol lowering rate of 0% indicates that the plasma cholesterol level increased to the same level as the plasma cholesterol level of the rats in the control group to which the cholesterol-added diet was administered.
  • the atherosclerosis index (A I) is the atherosclerosis index (A I)
  • AI (VLDL cholesterol level + LDL cholesterol level) / HDL cholesterol level.
  • a I (plasma total cholesterol level—plasma HDL cholesterol level) no plasma HDL cholesterol level
  • the improvement rate of the atherosclerosis index was calculated from the AI value of each group containing the yeast-containing feed, and the AI values of the cholesterol-supplemented group (control group) and the normal diet group.
  • the atherosclerotic index improvement rate of 100% indicates the same value as the AI value of the cholesterol-free diet group.
  • An improvement rate of atherosclerosis index of 0% indicates the same AI value as the cholesterol-supplemented food group (control group). 4 Weight measurement
  • the weight of the rats was measured at the time of arrival, and the rats were divided into groups so that there was no significant difference in weight between the groups, and preliminary breeding was started. Body weight was measured at the start of this test and at the end of the test.
  • Blood was collected from the tail vein on days 0, 5, and 8 after the start of administration of the cholesterol-added diet, and on the 14th day from the abdominal aorta under Nembutal anesthesia. After separating plasma from the collected blood, each lipid component was measured by an enzymatic method.
  • the plasma cholesterol level in the cholesterol-administered group increased to near the maximum on the fifth day. Thereafter, a slight increase was observed until the 14th day, but almost no significant change was observed.
  • the plasma cholesterol level in the cholesterol-free diet did not increase during the test period and tended to decrease slightly.
  • Table 9 shows the values of plasma lipids on day 14 after the start of the administration of the cholesterol-added diet.
  • the cholesterol level of the group without added cholesterol was 72.5 mg / dL, whereas that of the group with added cholesterol was 325.3 mgZdL, which is about 4.5 times higher.
  • plasma HLD cholesterol levels are significantly lower at 35.9 nig / dL versus 45.9 mg ZdL, respectively.
  • Table 10 shows the lipid content in the liver on day 14 after the start of the administration of the cholesterol-added diet.
  • the cholesterol-added diet group showed about 20 times higher cholesterol level than the non-cholesterol-added diet group.
  • Jar culture was performed by the method shown in Example 1 to prepare 200 g of freeze-dried cells (heat-treated at 110 for 10 minutes). These were fed on a cholesterol-supplemented diet in a diet of 10% each (10% yeast group in Table 8) and fed freely in a group of 8 animals per group for 7 days.
  • Tables 11 to 13 show the cholesterol lowering rate and the improvement rate (%) of the atherosclerosis index as compared with the plasma cholesterol level of the control group to which the high cholesterol diet was administered. No significant change in body weight was observed in any of the groups. Table 11
  • Jar culture was performed by the method shown in Example 1 (a), and 200 g of each freeze-dried cell was prepared. Each of the freeze-dried cells thus prepared was fed to a cholesterol-supplemented diet in a 10% diet (10% yeast group in Table 8), and fed freely for 7 days in a group of 8 animals per group. Table 14 shows the measurement results of plasma lipids.
  • Example 4 5% yeast supplemented food administration test
  • Example 3 The same test as in Example 3 was performed using a 5-week-old male Wistar rat. However, 5% of the freeze-dried yeast cells to be added to the feed of the test group were mixed with each other (5% yeast group in Table 8). Gave.
  • Table 16 shows the measurement results of liver lipid. Liver total cholesterol levels were significantly lower in all test groups than in the control group. Thus, it can be seen that the yeast according to the present invention is an excellent anticholesterol material that exhibits not only a plasma lipid lowering effect but also a liver lipid lowering effect by oral administration.
  • CA cholic acid
  • TCA taurocholic acid
  • GCA glycocholic acid
  • DSA deoxycholic acid
  • DCA deoxycholic acid
  • the bile acid adsorption rate is the absorption rate of yeast to the total bile acid added. It is the percentage of bile acid that has arrived and indicates the strength of adsorption of yeast and bile acid.
  • Bile acid adsorption rate (%) [ ⁇ Bile acid added (mnol)-bile acid in supernatant (mnol) ⁇
  • Table 17 shows bile acid adsorption rates. Isachenkia orien squirrel YIT 8266 was able to adsorb cholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid and chenodeoxycholic acid and exhibited excellent primary bile acid adsorption ability. The adsorption rates of yeast and cholic acid were almost the same in the reaction solutions at pH 6.7 and pH 7.2. These results indicate that yeast binds tightly to primary bile acids in the colon lumen and can inhibit secondary bile acid production by preventing deconjugation and 7a-dehydroxylation by enteric bacteria. Rukoto has been shown.
  • yeast has the effect of suppressing the production of secondary bile acids and, at the same time, adsorbing and deactivating the generated secondary bile acids, thereby reducing their toxicity.
  • Table 18 shows the results of measuring the bile acid adsorption rates of various yeasts in the same manner as in Example 5. All yeasts exhibited good adsorption of bile acids, the primary bile acids chenodeoxycholic acid, and the secondary bile acids dexoxycholic acid. Table 18
  • Example 7 Inhibition of secondary bile acid production by freeze-dried cells of Isachenkia orientalis YIT 8266
  • Solution A acetate nitrile / methanol Z 3 OmM ammonium acetate
  • Solution B acetonitrile / methanol / 3 OmM ammonium acetate
  • NADH (; 3—reduced form of NAD +) was monitored with a fluorescence detector (excitation wavelength 345 nm, emission wavelength 47 Onm) 0
  • Each bile acid was identified from the retention time of the standard.
  • the concentration of bile acids was determined from the area of each peak. At this time, the measurement results obtained by correcting the recovery rate from the peak area of the internal standard substance are shown in Table 21.
  • the administration of cholic acid increases the amount of primary bile acids reaching the large intestine, It was clarified that bile acid production was enhanced, and it was found that the effect of the secondary bile acid production inhibitor could be evaluated with high sensitivity.
  • Hyocholic acid 0.00 ⁇ 0.000 0.23 ⁇ 0.2 ⁇
  • Lysophilized cells of Isachenkia orien squirrel YIT 8266 were added to a high bile acid diet and administered for 14 days (5% diet) (Table 22). At this time, the amounts of casein, sucrose, lipid and cellulose were adjusted so that the energy values would be equivalent. Administration of yeast cells had little effect on body weight gain and food consumption during the study period (Table 23). Table 2 2
  • fecal excretion of secondary bile acids was reduced by about 82% and the secondary bile acid concentration in It decreased by about 84%. This tendency was particularly remarkable for dexcholate and lithocholic acid.
  • fecal excretion and fecal concentration of primary bile acids were significantly increased by administration of the cells.
  • Isachenkia orien squirrel YIT 8266 had a potent inhibitory effect on the conversion of primary bile acids to secondary bile acids. Table 24
  • Deoxycholic acid 10.10 ⁇ 6 51 0.22 ⁇ 0.46 "Lithocholic acid 0.35 ⁇ 0.31 0.00 ⁇ 0.0 (T-Hydoxycholic acid 0.80 ⁇ 0.32 1.81 ⁇ 0.64" s -Total secondary bile acids 11.25 ⁇ 6.59 2.03 ⁇ 0.8 ⁇
  • Freeze-dried cells of Isachenkia orientalis YIT 8266 decrease PH in the cecum
  • Short-chain fatty acids were analyzed under the following conditions using an HP LC system manufactured by Toa Denpa Kogyo. The pH buffer solution was mixed with the eluent immediately before the detector. Table 26
  • the high bile acid diet group had a pH of 6.65 and total short-chain fatty acid content of 55.9 mM
  • the high bile acid diet group with the yeast Isachenkia orientalis YIT 8266 had a pH of 6.46 (significant level). 5%)
  • total short-chain fatty acid content was 85.6 mM (significant level 1%)
  • decreased pH in cecum was observed, acidified the lumen of large intestine, and activated 7-1-dehydroxylase of intestinal bacteria Decreased.
  • Carrier 1 (flow rate) He (0.8mL / niin)
  • Lyophilized cells of Isachenkia orien squirrel YIT 8266 were suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) and mechanically disrupted using Dynomill (Shinmaruen Yuichi Prizes). At this time, 0.45 mm diameter glass beads were used as a grinding agent, and the grinding operation was repeated until more than 95% of the cells were broken by microscopic observation. The cell lysate was centrifuged at 9,000 g for 15 minutes to separate the cell contents in the supernatant. The cell contents were collected and freeze-dried.
  • Table 30 shows the feed composition for this test. Administration of yeast cell content had little effect on body weight gain or intake during the study. (Table 31). Table 30
  • fecal excretion of secondary bile acids was about 76% and secondary bile acid concentration in feces Fell by about 70%.
  • Deoxycholic acid 9.87 ⁇ 5,46 2.01 ⁇ 2.26 * Lithocholic acid 0.02 ⁇ 0.05 0.00 ⁇ 0.00 ⁇ - Hydoxycholic acid 0.65 ⁇ 0.36 0.49 ⁇ 0.14 ⁇ Total secondary bile acids 10.54 Sat 5.29 2.51 ⁇ 2.18 '
  • nS No significant difference
  • the total amount of short-chain fatty acids and PH in the cecum were 54.0 mM and ⁇ 66.65 in the high bile acid diet group, whereas the total bile acid diet group with yeast cell contents added was 68.3 mM ( ⁇ 6.65).
  • PH level was significant (5% significance level) and pH 6.46 (5% significance level). Therefore, the yeast cell contents had an effect of acidifying the lumen of the large intestine by increasing the amount of short-chain fatty acids and decreasing the activity of 7 ⁇ -dehydroxylase of enteric bacteria.
  • Lactic acid 2.4 ⁇ 1.0 1.9 ⁇ 1.2 ⁇
  • Isachenkia orien squirrel YIT 8266 significantly reduced the fecal concentration of the intestinal metabolites of cholesterol, copros-enol-copros-nonone. From this, the cell content of Isachenkia oriensis squirrel YIT 8266 can contribute to the prevention and cure of various diseases by suppressing the production of cholesterol metabolites, like the freeze-dried cells. Table 35
  • composition containing the following additives was compressed into tablets.
  • a health drink was manufactured according to the following formula. Table 37
  • composition of health drinks [%]
  • a juice drink was manufactured according to the following formula,
  • Fermented milk containing heated yeast cells was produced according to the following formulation.
  • Example 1 10% skim milk powder and 5% glucose were sterilized and inoculated with Lactobacillus bacteria to produce yogurt. To this, 0.1 to 20% of the heated yeast cells obtained in Example 1 were mixed to produce fermented milk.
  • Lactic acid was produced according to the following formula.
  • the cholesterol-lowering agent of the present invention comprising the above-described yeast cells or a component thereof exhibits a remarkable plasma cholesterol-lowering effect and a liver cholesterol-lowering effect, and is extremely effective in preventing arterial stiffness and other diseases caused by cholesterol accumulation. Things. In addition, it strongly suppresses the production of secondary bile acids through adsorption of bile acids and acidification in the lumen of the large intestine, and the secondary bile acid production inhibitor of the present invention is useful for the treatment of colorectal cancer, liver cancer, and kidney. It is extremely effective in preventing and treating cancer, bile duct cancer, and cholelithiasis.
  • the yeast used in the present invention is a safe yeast having no pathogenicity as is apparent from the fact that it has been used for the manufacture of cheese, horse milk, wine, etc. for a long time.
  • the cholesterol-lowering agent of the present invention when administered orally to a rat, did not show any death even at a dose of 8 g Zkg, and there is no problem in safety even if it is administered for a long time.
  • the cholesterol-lowering agent and the secondary bile acid production inhibitor of the present invention are used not only as orally administered medicaments, but also mixed with food and taken daily to obtain arteriosclerosis, colorectal cancer, liver cancer, kidney cancer, It is extremely effective and is useful for preventing bile duct cancer and cholelithiasis and promoting health.

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Description

明 細 書 コレステロール低下剤、 2次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 技術分野
本発明は、 血中や肝臓のコレステロールを低下させ、 動脈硬化指数を改善し得 るコレステロール低下剤；大腸癌、 肝癌、 膝臓癌、 胆石症等の予防及び治療に有 用な 2次胆汁酸産生抑制剤及びその飲食品への利用に関する。 背景技術
近年、 循環器疾患による死亡率は年々増加しており、 心筋梗塞、 脳梗塞など動 脈硬化に起因した疾患を合わせると、 成人の死亡原因中第一位を占めている。
動脈硬化の原因としては様々なものがあるが、 血漿脂質、 特に血漿コレステロ ール値の上昇が最も重要な危険因子の一つとされている。
血漿コレステロール値の上昇原因としては、 まず遺伝的な疾患がある。 この場 合、 重篤な患者に対しては食事療法と同時にコレステロール合成阻害剤、 ニコモ ール、 クロフイブレート、 イオン交換樹脂、 蛋白同化ステロイド等の薬剤が使用 されているが、 これらの薬剤は、 肝毒性、 胃腸障害、 発ガン性等の副作用がある。 血漿コレステロール値上昇のもう一つの大きな原因として、 近年の卵、 バタ一、 肉等を大量に摂取する食生活による脂肪の過剰摂取があげられており、 これは、 若年齢層にも顕著になりつつある。 食事性の高コレステロール血症の場合、 通常 は重篤な高コレステロール血症には至らないが、 若齢期より血管に徐々にコレス テロールが蓄積し、 成人にいたって動脈硬化を引き起こすことが問題であり、 高 トリグリセライド血症とあいまって、 心筋梗塞や脳梗塞を招く危険性がある。 こ の種の高脂血症に対しては、 副作用があるなど問題の多い薬物療法よりも、 脂質 摂取量を適正範囲に制限した食事療法が重視される。 しかしながら、 食事制限は 精神的苦痛を伴うと共に食生活の楽しみをうばうため厳格な実施は困難であり、 効果には限界があることが多い。
血漿中に過剰に存在するコレステロ一ルは血管壁に蓄積して動脈硬化を招くが、 コレステロールが肝臓に取り込まれた後、 そこに蓄積されることなく胆汁酸に変 換されるかそのままの形で腸管に排出され、 糞便と共に体外に排泄されるならば、 体内コレステロールのプールも低下し、 上記機構による動脈硬化は予防される。 そこで、 血漿コレステロール値の低下作用だけでなく、 肝臓コレステロール値の 低下作用を併せ持つものが期待されている。
一方、 副作用が少なくコレステロール低下作用を示す微生物は、 これまで種々 の報告があるが、 酵母に関する報告は意外に少ない。 酵母といえば、 古くからビ ール酵母が知られているが、 その脂質代謝改善効果については、 クロムを補添し たビール酵母 （1日当たり 9 g) を 8週間、 老人に投与した結果、 血清コレステ ロール値の低下を認めたとの報告 〔Ester G. Offenbacher and F. Xavier Pi-
Sunyer, Beneficial effect of chromium-rich yeast on glucose tolerance and blood lipids in elderly subjects. Diabetes, 29, 919, (1980)〕 があるが、 塩化クロムと 5 gのビール酵母を 1 0週間、 老人に投与した結果、 血清コレステ ロール値や TGに対して影響を与えなかったとの報告 〔Caral J Rinko, and F.
Xavier Pト Sunyer, The effects of inorganic chromium and brewer' s yeast on glucose tolerance, plasma lipids, and plasma chromium in elderly subjects. , Am. J. Clin. Nutr., 42, 454, (1985)] やクロムを補添していない ビール酵母を使用した対人試験では血清コレステロール値の低下効果はなかつた との報告 [Arne T. Hostmark, Einar Ei lertsen and Ole Gro匿 rod, Plasma lipid and lipoprotein responses of rats to starch and sucrose diets with and without brewer's yeast. , J. Nutri. , ]09, 1073, (1978)] がある。 また、 ゥサギの餌に大豆蛋白を混ぜて投与すると血清コレステロール値が低下するが、 その大豆蛋白の 50 %をビール酵母で置換すると血清コレステロール値が逆に若 干上昇したとの報告 (Jorge De Abreu and Nancy Mi 1 lan, Effect of addition of brewer's yeas t to soy protein and casein on plasma cholesterol levels of rabbits. Archivos Lat inoamericanos de Nutricion. , 44, 18, (1994)〕 もあ る。
このように現在のところ、 ビール酵母 （brewer's yeast) の脂質代謝改善効果 については統一的な見解が得られていない。
一方、 他の酵母では、 酵母のメタノール抽出物が、 赤色酵母 (Sporobolomyces ruberrinus) と Saccharomyces uvarum■において、 わず力にコレステローリレ負荷 ラッ卜の血清コレステロール値及びトリグリセライ ド値を減少させたとの報告 〔長 修司、 藤井久雄、 白石淳、 納豆菌産生多糖類あるいは酵母のアルコール抽 出物がラッ トの脂質代謝に及ぼす影響、 福岡女子大学家政学部紀要、 11， 65, (1984)] があり、 更に Saccharomyces cerebisiaeの培養上清がマウスの血清 コレステロールを低下させたという報告 〔岸田忠昭、 Saccharomyces cerebisiae 培養物の血清コレステロール低下作用について、 栄養と食糧、 ϋ， 371, (1973)] がある。
しかしながら、 ビール酵母以外にコレステロール低下作用を示す酵母の報告は、 いまだ少なくまた、 酵母の菌体そのもの、 或いはその菌体構成成分が脂質代謝改 善効果を示したという報告はない。
また、 ヒ卜の肝臓においてコール酸及びケノデォキシコール酸等 （ 1次胆汁 酸） がコレステロールから合成され、 グリシン又はタウリンと抱合しグリシン又 はタウリン抱合型胆汁酸として胆管を通って消化管に分泌される。 胆汁酸は、 そ の界面活性作用によって飲食品中の脂質を乳化分散させ、 塍液の酵素 · リパーゼ による分解と吸収を促進し、 回腸から能動的に再吸収される。 再吸収された胆汁 酸は、 門脈を通って肝臓に戻り、 再度、 消化管に分泌され腸肝循環を構成し、 こ の循環を繰り返す。
回腸からの吸収を免れた胆汁酸は、 腸内細菌によって脱抱合や 7ひ一脱水酸化、 酸化、 還元、 ェピマ一化等の修飾を受けて 2次胆汁酸へと変換される。 この過程 で生じる主要な 2次胆汁酸は、 デォキシコール酸とリ トコール酸であり、 それぞ れ 1次胆汁酸であるコール酸とケノデォキシコール酸の 7 a一脱水酸化反応によ つて生じる。 2次胆汁酸の一部は、 大腸から受動的に吸収されて肝臓に移行し 1 次胆汁酸と同様に腸肝循環を繰り返すが、 残りの胆汁酸は糞便中へと排泄される。 近年、 大腸管腔内の腸内細菌によって産生されるデォキシコール酸ゃリ トコ一 ル酸などの 2次胆汁酸は、 大腸癌、 肝癌、 塍臓癌、 胆管癌などの発症に深く関与 していることが明らかになつている。 一般に、 発癌の過程は、 化学発癌剤や放射 線、 ウィルスなどによって遺伝子に突然変異が生じるイニシエーションと、 その 後、 プロモーターに長期間、 暴露されることによって増殖と分化に異常が生じる プロモーションの 2段階から成り立つと考えられている。 これまでに、 デォキシ コール酸ゃリトコール酸等の 2次胆汁酸は、 後者の過程においてプロモーターと して作用し、 大腸癌、 肝癌、 膝臓癌、 胆管癌の発症を促進することが報告されて いる （Narisawa, T.， et. al. , J. Natl. Cancer Inst, 53, 1093-1097, 1974、 Tsuda, H. , et. al. , Gann, 75, 871-5, 1984， Makino, T.， et. al. , J. Natl. Cancer Inst. , 76, 967-75, 1986)。 また、 2次胆汁酸の発癌プロモーター活性 は、 1次胆汁酸に比べてはるかに強いことも示されている （Narisawa, T. , et. al., J. Natl. Cancer Inst. , 53, 1093-1097, 1974、 Reddy, BS.， et. al., Cancer Res., 37, 3238-3242, 1977)。 さらに、 最近、 デォキシコール酸に関し ては、 癌以外にも胆石症の発症に関係し得ることが示されている （Marcus, SN.， Heaton, KW.， Gut, 29, 522-533, 1988)。
このように、 大腸管腔内において腸内細菌によって産生されるデォキシコール 酸ゃリ トコール酸などの 2次胆汁酸は、 強力な発癌プロモーター活性を有すると 同時に、 胆石症の原因にもなり得ることから、 2次胆汁酸の産生を抑制すること によって、 大腸癌、 肝癌、 膝臓癌、 胆管癌、 胆石症などの疾患を予防あるいは治 療することが可能である。 これまでに、 ペニシリン系の抗生物質であるアンピシリン （Low- Beer, TS. , Nutter, S.， Lancet, 2 (8099), 1063-1065, 1978)、 3 , 1 2 /3—ジヒドロキ シ一 5 3—コラン一 24— N—メチルァミン （Roda, A.， et. aし， J. P arm. Sci.， 81, 237-240, 1992)、 オリゴ糖の一種であるラクッロース （Magengast, FM., Eur. J. Clin. Invest., 18， 56-61, 1988) あるいは小麦糠 （La即 e, JW.， et. al.， Gut, 34, 531-536, 1993) については、 効果は弱いものの 2次胆汁酸 の産生を抑制することが報告されている。
アンピシリン及び 3 a, 123—ジヒドロキシ一 5 /3—コラン一 24— N—メ チルァミンは、 大腸管腔内において 7 α—脱水酸化反応を触媒する細菌を排除す ることによって 2次胆汁酸の産生を抑制するが、 長期間服用した際には耐性菌の 出現や副作用の発現が問題となる。 また、 抗生物質を用いて、 2次胆汁酸の産生 に関わる細菌のみを特異的に排除することは事実上不可能であり、 乳酸菌やビフ ィズス菌などのヒトの健康維持に重要な役割を果たしている腸内細菌も同時に排 除してしまうといった重大な問題を生ずる欠点がある。
一方、 ラクッロースや小麦糠は、 主に大腸管腔内の ρΗを低下させることよつ て至適 ρΗが中性付近である 7 α—脱水酸化酵素の活性を抑制し、 2次胆汁酸の 産生量を低下させると考えられている。 しかし、 これらの物質は、 有効性の面で 未だ十分ではなく、 疾病の予防及び治療に寄与し得る程の効果を示していない。 従って、 本発明の目的は、 副作用が少なく安全な酵母を用い、 血中や肝臓のコ レステロールを有効に低下し得るコレステロ一ル低下剤を提供することにある。 また、 本発明の他の目的は、 大腸癌、 肝癌、 塍臓癌、 胆管癌、 胆石症などの疾 患の予防あるいは治療に有用な、 有効性及び安全性の優れた 2次胆汁酸産生抑制 剤を提供するものである。 発明の開示
本発明者は、 鋭意研究を行った結果、 下記に示す特定の属に属する酵母が、 副 作用が少なく、 血中及び肝臓中のコレステロールを有効に低下する作用を有する ことを見出した。 また、 酵母が 1次胆汁酸の 2次胆汁酸への変換を抑制する作用 を有することを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明はキャンジダ属、 ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クルイべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスボラ属に属する 酵母の 1種又は 2種以上を有効成分として含有するコレステロール低下剤、 及び これを含有する飲食品を提供するものである。
また、 本発明はこれら特定の酵母のコレステロール低下剤及びコレステロール 低下用飲食品製造のための使用を提供するものである。
また本発明はこれら特定の酵母を投与することを特徴とするコレステロール低 下のための処置方法を提供するものである。
また、 本発明は、 酵母を有効成分とする 2次胆汁酸産生抑制剤及びこれを含有 する飲食品を提供するものである。
また本発明は酵母の 2次胆汁酸産生抑制剤及び 2次胆汁酸産生抑制用飲食品製 造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は酵母を投与することを特徴とする 2次胆汁酸産生抑制のための 処置方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 コレステロール添加食と無添加食投与群の血漿コレステロール値を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のコレステロール低下剤又は飲食品に用いる酵母は、 キャンジダ属、 ィ サチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クルイべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスボラ属に属する酵母であり、 これらは 1種でも、 2種以上 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母であり、 これらは 1種でも、 2種以上 を混合して用いてもよい。 上記酵母は生菌、 加熱菌体、 凍結乾燥物、 それらの破 砕物、 それらの構成物であってもよい。
上記の属に属する酵母のうち、 好ましいものとしては、 例えばキャンジダ 'ケ フィァ、 ィサチェンキア 'オリエン夕リス、 ハンセニァスポラ 'ゥヴァラム、 ク 口エッケラ .アフリカーナ、 クルイべロマイセス 'マルキシァナス、 クルイべ口 マイセス ' ラクチス、 ピチア ·ファリノサ、 トルラスボラ 'デルブルエツキ一が 挙げられ、 更にこれらのうち次の酵母が最適である。
キャンディダ ケフィァ (Candida kefyr) Y I T 82 3 7 (FERM BP- 7214、 原寄託日 1999年 7月 16日、 寄託機関 通産省工業技術院生命工学工業技術研究 所、 郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （以下同じ））、 ハンセニァスポラ ゥヴァラム (Hanseniaspora uvarum) Y I T 8 1 64 (FERM BP-7212, 原寄託日 1999 年 7月 16 日）、 ィサチェンキア オリエンタリス (Issatchenkia orientalis) Y I T 8266 (FERM BP-7215, 原寄託日 1999年 7月 16日）、 クロエッケラ アフリカーナ (Kloeckera africana) Y I T 8 16 5 (FERM BP- 7213、 原寄託日 1999年 7月 16 日）、 クルイべロマイセス マルキ シァナス （Kluyveromyces marxianus) Y I T 82 92 (FERM BP- 7217、 原寄託 日 1999 年 7月 16 日）、 クルイべロマイセス ラクチス (Kluyveromyces lactis) Y I T 8263 (FERM BP-7216、 原寄託日 1999年 7月 16 日）、 ピチア ファリノサ (Pichia farinosa) Y I T 8058 (FERM BP- 7210、 原寄託日 1999 年 7月 16 日）、 トルラスポラ デルブルエツキ一 (Torulaspora delbrueckii) Y I T 8 1 14 (FERM BP-721K 原寄託日 1999年 7月 16日）。
なお、 これらの微生物は食品 （ワイン、 乳酒、 チーズ） 製造に使用される酵母 として古くから知られており、 人体に対して極めて安全な菌株である。
上記菌株の性状を示すと表 1〜表 5の通りであって、 「ザ イースト （The yeast) 第 3版 N. J. W. Kreger-Van Rij, Elsevier Science Publ ishers B. V., Amsterdam, 1984」 に記載の同種微生物の性状とほぼ同様である。
表 1
眺
ρキマ
キヤンジダ ヽ、 ィ マ ソ LJ丄ッ ノ 'ノノ 11ノべへ门iフィ >
ンノ 1| 1^*Ίべ \门ヾィっ 1— ゾ ノレノ/ \· 、ノ ノ 菌 株 ケフィァ ラ ゥヴァラム オリエン夕リス アフリカーナ ス マ 1^シアナ セス ラクチス ァりノサ ルブルエツ +~
ΥΙΤ 8237 YIT 8164 ΥΙΤ 8266 ΥΙΤ 8165 ス YIT 8292 YIT 8263 YIT 8058 ΥΙΤ 8114
D—ク コース + + + + + + + +
D—ガラク卜ース + - - - + - +— マルトース ― - ― ― - - 十一
Me— a— D—ク:;レコシド ― ― - +— シユークロース + ― ― ― +— +— α—卜レハ ス - + + +— メリビ才ース - - ― ― +— 麵生
ラク! ^一ス +— ― ― 十一 - セロビオース + - +— ― +— ― メ 卜ース ― - - ラフイノース +— - +— - +— ィヌリン + - ― - +- 膽 ― ― 一
D—キシロース
D—グルコース + + + + + + + +
D—ガラク卜ース + +— + + + + 赚 14 D—ソルボース 十一 + +— +—
D -グルコサミン 十一
D—リボース +— +— +
Figure imgf000011_0001
表 3
キャンジダ ノヽ マ 二- 二 . ■
,入小 Ί ^エノ十/ クロエッケフ ク l^fへ口 ィ クリ Ι/Ίへ口 ^l ビエナマゾ ノ 卜レフ フ 丁 菌 株 ケフィァ ラ ゥヴァラム オリエン夕リス アフリカ一ナ ス マリ 14=·シァナ セス ラクチス ァりノサ ルブリレエツキ一
YIT 8237 ΥΙΤ 8164 ΥΙΤ 8266 YIT 8165 ス ΥΙΤ 8292 YIT 8263 YIT 8058 YIT 8114
Lーァラビ二卜一レ ― 一 一 ― —— ——
D—ク レシ卜ーリレ 十一 +— ― + + + ―
D—マンニ! ^レ +— ― ― + + + 十一 ガラクシトール ― ― - ―
ミ才イノシ卜ーリレ - ― 一 一 ―
D—ク レコノ -1, 5 ラク卜ン + ― + + +—
2 -ケト— D—グルコネート + ― ― 十一 ― +— +
D—ク レコネ一卜 ― + ― +
D—ク レクロネー卜 ― 一 ― 一 ―
D—ガラクッ口木 ― ― + ― ― ―
DL—ラクテ一卜 + ― + ― + ― +— 糊生 スクシネート +— ― + +— + 十一 - サイト ト +— 十一 - + 十一 + - メタノー Jレ - - - - - ェ夕ノール - + + + + + プロパンン -1, 2-：^"—ル - ― - ― - ブタン一 2 3—-; ^ール +
ナイ卜 卜
ナイトライ 1 十一 ェチルァミン + + + + + +— し一リジン + + + + +— +
表 4 キャンジダ ノ、 fe二ァスポ ィ エンキァ クロエッゲラ ク Jkfベロマイセ ク J kfベロマイ ピチア フ トルラスポラ デ 菌 株 ケフィァ ラ ゥヴァラム オリエン夕リス アフリカーナ ス マ ンアナ ir ラクチス ァりノサ ルフレエツキ一
YIT 8237 YIT 8164 YIT 8266 YIT 8165 ス YIT 8292 YIT 8263 Y1T 8058 YIT 8114 カタ'ベリン + + + + + 一 クレアチン ― 一 ― ― 一 ― クレアチニン ― ― ― ― ― 一 グルコサミン ― ― ― 一 ― イミダソ ル ― 一 ― w/oビタミン ― + +— 一 +- +—
W/0ミ才イノシ卜 - —ル + + + + + w/oパントテ ¾ ― + + + + +
WZOピオチン +— + + +— +
W/0チアミン +— + +- + +— + w oビ才チン ァミン ― + +— +— +— 十一 職 1生 WZOピリドキシン ― + + + + + w/oピリドキシン &？ァミン 一 + +— +— +- 十一
W/0ナイァシン ― + + - + +
W/O PABA + + + + + +
2 5V + + + + + + +
3 0°C + + + + + + +
3 5°C + + + + + + 十一
3 7°C + + + + + +—
4 0で + + + +
0.01 %シクロへキシミド + +
表 5 キャンジダ ハ 二ァスポ ィ エンキァ クロエッゲラ ク べロマイセ ク Jkfベロマイ ピチァ フ 卜ルラスポラ デ 菌 株 ケフィァ ラ ゥヴァラム オリエンタリス アフリカーナ ス "^Wシァナ セス ラクチス ァ1 Jノサ ルプルエツ
YIT 8237 YIT 8164 YIT 8266 YIT 8165 ス YIT 8292 YIT 8263 YIT 8058 YIT 8114
0. 1 %シクロへキシミド + ― ― + ― ―
― ― ― 一 一 ― 麵生 50%D -グルコース +— + + + +
60%D—グルコース + + +— 他の 14
質 聽 娜
ジァソ ゥムブ)ト Bi¾e ―
次に本発明の 2次胆汁酸産生抑制剤に用いられる酵母について説明する。
2次胆汁酸産生抑制剤に用いられる酵母は特に限定されず、 また酵母には、 酵 母を培養して得られる生菌体、 加熱菌体、 凍結乾燥物、 それらの破砕物、 及びそ れらの構成物が含まれる。
本発明で使用する酵母が、 コール酸等の 7 α—水酸基を脱離する反応を阻害し、 2次胆汁酸であるデォキシコール酸等の生成を阻害するということは今迄報告さ れていない。 本発明は、 酵母の 1次胆汁酸の 2次胆汁酸への変換を抑制阻害する 作用を利用したもので、 特にコール酸、 タウロコール酸、 グリココール酸、 ケノ デォキシコール酸等の 1次胆汁酸吸着能、 あるいは酢酸、 プロピオン酸、 酪酸等 の短鎖脂肪酸の腸内濃度上昇能に優れた酵母は、 7 α -水酸基脱離反応を阻害す る効果が優れ好ましい。
2次胆汁酸産生抑制剤については、 酵母のうち、 好ましいものとしてはィサチ エンキァ属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及びチゴサッカロマイ セス属に属する酵母が挙げられ、 これらは 1種又は 2種以上を混合して用いるこ とができる。
具体的には、 ィサチェンキア 'オリエン夕リス、 クルイべロマイセス 'マルキ シァナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス 'サーモトレラ ンス、 ハンセニァスポラ ' ゥヴァラム、 サッカロミセス ·セレビシェ、 サッカロ ミセス ·ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシグ一ス、 サッカロミセス 'ュニ スポラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア 'ブルトニ、 キャンジダ 'ケ フィァ、 キャンジダ 'ェチェルシー、 キャンジダ 'ゼイラノイデス、 キャンジ ダ · ソラ二、 キャンジダ .マルト一サ、 キャンジダ ' 卜ロピカリス、 キャンジ ダ ' シリンドラシェ、 キャンジダ 'ュチリス、 トルラスポラ 'デルブルエツキ一、 ピチア ·ァノマラ、 ピチア ·ホルスチー及びチゴサッカロマイセス · ロキシ一が 好ましいものとして挙げられ、 更にこれらのうち次の酵母が最適である。 ィサチェンキア オリエンタリス (Issatchenkia orentalis) Y I T 8266 (FERM BP-7215) , クルイべロマイセス マルキシァナス (Kluyveromyces marxianus) Y I T 8 2 92 (FERM BP- 7217)、 クルイべロマイセス ラクチス (Kluyveromyces lactis) Y I T 826 3 (FERM BP - 7216)、 クルイべロマイセ ス サ一モトレランス (Kluyveromyces thermotolerans) Y I T 8294 (AT C C 20309)、 ハンセニァスポラ ゥヴァラム (Hanseniaspora uvarum)
Y I T 8 1 6 4 ( FERM BP- 7212 ) 、 サッ カ ロ ミ セス セ レ ピシェ (Saccharomyces cerevisiae) Y I T 8 1 1 6 (ATC C 48 5 54)、 サッ カロミセス ダイレンシス (Saccharomyces dairensis) Y I T 8 1 9 1 (C B S 3007)、 サッカロミセス エキシグ一ス (Saccharomyces exiguus) Y I Τ 8 1 0 9 ( C B S 3 0 1 9 )、 サッカロミセス ユニスポラス
(Saccharomyces unisporus) Y I T 8226 (FERM BP- 7209、 原寄託日 1999年 3月 25 日、 寄託機関 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、 郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） 、 サッカロミセス バヤナ ス (Saccharomyces bayanus) Y I T8 128 (CBS 380)、 ヒポピチア ブルト二 (Hyphopichia burtonii) Y I T8299 (CB S 2352)、 キヤ ンジダ ケフィァ (Candida kefyr) Y I T 823 7 (FERM BP- 7214)、 キャンジ ダ ェチェルシー (Candida etchellsii) Y I T 8278 (ATC C 60 1 1 9)、 キャンジダ ゼイラノイデス (Candida zeylanoides) Y I T 80 18 ( I FO 07 1 9)、 キャンジダ ソラニ (Candida solani) Y I T 8023 (C B S 1 908)、 キヤンジダ マルト一サ (Candida maltosa) Y I T 8283
(ATC C 28 140)、 キャンジダ トロピカリス (Candida tropicalis)
Y I T 8 2 8 6 (C B S 9 4)、 キャンジダ シリンドラシェ (Candida cylindracea) Y I T 82 7 6 (ATC C 14830) 、 キャンジダ ュチリ ス (Candida utilis) Y I T 8 2 04 (AT C C 9 9 5 0)、 トルラスボラ デルブルエツキ一 (Torulaspora delbrueckii) Y I T 83 1 3 (J CKi 2 2 04) 及び Y I T 8 1 33 ( I FO 1 1 72) 、 ピチア ァノマラ (Pichia anomala) Y I T8298 (J CM 3587 ) 及び Y I T 8297 ( J CM
3583 )、 ピチア ホルスチー (Pichia olstii) Y I T 8038 (ATCC
5 8 04 8 )、 及びチゴサッカロマイセス 口キシ一 (Zygosaccharomyces rouxii) Y I T8129 (CBS 732)。
なお、 これらの酵母は古くから食品 （ワイン、 チーズ） の製造に使用されてお り、 人体に対して極めて安全な微生物である。 また、 これらの菌体は、 数ミクロ ンの粒子なので、 食感に影響する 20ミクロン以上の粒子に比べてはるかに服用 し易いという特徴を有している。 上記酵母の性状として、 ィサチェンキア ·オリ ェンタリス （Issatchenkia orientals) Y I T 8 266 (FERM BP-7215) の性 状を具体的に示すと、 表 1の通りであって、 「ザ イースト （The yeast)、 第 3 版 . J. W. Kreger-Van Ri j, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam, 1984」 に記載の同種酵母の性状と同様である。
表 6
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8 2 6 6の性状
クレアチン
クレアチニン
ダルコサミン
ィミダゾール
W/0ビタミン
W/0ミオイノシ I ^一ル +
W/0パントテン酸 +
W/0ピオチン +
W/0チアミン +
W/0ピオチン &チアミン +
W/0ピリ ドキシン +
W/0ピリ ドキシン &チアミ +
W/0ナイァシン
W/0 ΡΑΒΑ +
2 5 +
3 O : +
3 5 +
3 7で +
4 0 V. +
0. 01 %シクロへキシミド
0. 1 %シクロへキシミド
1 %酢酸
50 %D-グルコース
60 %D-グルコース
他の性状
澱粉産生
酢酸産生
尿素加水分解
ジァゾニゥムブルー B反応
Figure imgf000018_0001
本発明に用いる酵母は、 通常の方法、 例えば酵母エキスやポリペプトンを含む 複合培地又は無機塩を主体とする合成培地で培養することによって製造すること ができる。
このようにして得られた酵母は、 生菌もしくはその凍結乾燥物、 又は加熱処理 等を施した死菌体、 それらの破砕物、 更にはそれらの構成物として、 医薬組成物 又は飲食品に用いることができる。 また、 本発明に用いる酵母は、 市販のもので あってもよい。
上記酵母は、 常法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬 組成物とすることができる。 例えば、 経口用固形製剤を調製する場合には、 上記 酵母に賦形剤、 必要に応じて結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 着色剤、 矯味剤、 矯臭剤 等を加えた後、 常法により錠剤、 被覆錠剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤等を製造 することができる。 そのよう添加剤としては、 当該分野で一般的に使用されるも のでよく、 例えば、 陚形剤としては、 乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオリン、 微結晶セル口一ス、 硅酸等を、 結合剤と しては、 水、 エタノール、 プロパノール、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン液、 カルボキシメチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルスターチ、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 リン酸カル シゥム、 ポリビニルピロリドン等を、 崩壊剤としては乾燥デンプン、 アルギン酸 ナトリウム、 カンテン末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カルシウム、 ラウリル硫酸 ナトリウム、 ステアリン酸モノグリセリ ド、 乳糖等を、 滑沢剤としては精製タル ク、 ステアリン酸塩、 ホウ砂、 ポリエチレングリコール等を、 矯味剤としては白 糖、 橙皮、 クェン酸、 酒石酸等が例示できる。
経口用液体製剤を調製する場合は、 上記酵母に矯味剤、 緩衝剤、 安定化剤、 矯 臭剤等を加えて常法により内服液剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を製造するこ とができる。 この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、 緩衝剤とし てはクェン酸ナトリウム等が、 安定化剤としてはトラガント、 アラビアゴム、 ゼ ラチン等が挙げられる。
また、 本発明の飲食品は、 上記酵母を種々の飲食品に添加せしめることにより 製造することができる。 ここで好ましい飲食品としては、 発酵乳、 果汁飲料、 ス ープ、 せんべい、 クッキー等が例示される。 なお飲食品には動物の飼料も含まれ る。
上記の各製剤中に配合されるべき酵母の量は、 これを適用すべき患者の症状に よりあるいはその剤型等により一定ではないが、 一般に製剤中 1〜 1 0 0重量％ とするのが望ましい。 また、 上記製剤又は飲食品の 1日あたりの投与量は、 患者 の症状、 体重、 年齢、 性別等によって異なり一概には決定できないが、 酵母とし て通常成人 1日あたり約 1 0mg〜30 g、 好ましくは約 1~ 5 gとすれば良く、 これを 1日 1回又は 2〜 4回程度に分け投与するのが好ましい。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明はこれに何ら限定 されるものではない。 なお、 「％」 は 「重量％」 を示す。
実施例 1
(ィ） 酵母の調製
ポテトデキストロース寒天スラントで保存している各種酵母のそれぞれの 1白 金耳を、 表 7に示す培地 1 0 OmL を含むそれぞれの坂口フラスコ （ 500mL) に植菌し、 30°Cで振とう培養 （ 12 Ospm) した。
2日後に 10リツター発酵槽 （実働容積 7 L) に坂口フラスコ 2本分を接種し て 30°Cにて、 通気速度 0. 5vvm、 回転速度 250 rpm、 pH6. 0 (5Nの水酸 化ナトリウムで自動制御） の条件下で 2日間、 通気攪拌培養した。
培養終了後、 冷却遠心分離機を使用して菌体と上清を分けたのち、 菌体を蒸留 水で 2度洗浄した。 この洗浄菌体を 2リツ夕一の三角フラスコに入れ、 蒸留水 1 リツターを加えた後、 1 1 5°Cにて 1 0分間オートクレーブで加熱した。 この加 熱菌体をそのまま凍結乾燥した。
表 7
前培養及び本培養の培地組成
グルコース （関東化学製） 30g
ポリペプトン （第五栄養株式会社製） 10g
酵母エキス （第五栄養株式会社製） 5g
リン酸 1カリウム （和光純薬製） lg
リン酸 2カリウム （和光純薬製） 2g
硫酸マグネシウム （和光純薬製） 0.5g
水道水 1L
PH6.0 (口） 試験飼料の調製
(ィ） で製造した酵母を用い、 下記表 8の組成の飼料を常法により混合し調製 した。 各試験飼料ともコレステロール 0. 5 %、 コール酸ナトリウム 0. 25% を含むコレステロール添加食とし、 酵母含有飼料には酵母凍結乾燥菌体 5 %又は 10 %を添加した。
表 8
飼料組成 （％表示）
成 分 対照群 10%酵母群 5 %酵母群
カゼィン 22.30 17.35 19.83
大豆油 1.0 1.0 1.0
ラード 10.0 9.45 9.72
無機塩 4.0 3.54 3.77
ビタミン 1.0 1.0 1.0
重酒石酸コリン 0.15 0.15 0.15
コレステロール 0.5 0.5 0.5
コール酸ナトリウム 0.25 0.25 0.25
濾紙粉末 10.0 7.46 8.73
鹿 fe 50.80 50.12 50.46
酵母菌体 0.0 10.0 5.0 試験方法 コレステロール低下作用
① 試験飼料
実施例 1 (口） で調製したものを用いた。
② 動物及び飼育方法
a) 1 0%酵母含有飼料投与群
5週齢の Wistar 系雄ラット （日本クレア製） を、 オリエンタル酵母製 F— 2 粉末飼料で 7日間予備飼育した後、 1群 8匹ずつ群分けし、 表 8の 10%酵母含 有飼料を 7日間投与した。 ラットは金属製ケージで群飼いし、 飼料及び水は自由 に摂取させた。
b) 5%酵母含有飼料投与群
5週齢の Wistar 系雄ラット （日本クレア製） を、 オリエンタル酵母製 F— 2 粉末飼料で 7日間予備飼育した後、 1群 8匹ずつ群分けし、 表 8の 5%酵母含有 飼料を 14日間投与した。 ラッ卜は金属製ケージで個別飼いし、 飼料投与量は 1 日 15 gの制限食とし、 水は自由に摂取させた。
③ 血漿脂質の測定
a) 10%酵母含有飼料投与群
投与開始から 7日目にネンブタール麻酔下 （非絶食） で腹部大動脈よりカニュ ーレ採血し、 血漿コレステロール濃度及び血漿 HDL濃度を測定した。 総コレス テロール濃度は日立 7170型生化学自動分析機を使用して測定した。
HD Lコレステロール濃度は協和メディックス製デタミナ HD Lを使用して H DL成分以外のリポ蛋白成分を沈降させた後、 日立 7 170型生化学自動分析機 を使用して測定した。
b) 5%酵母含有飼料投与群
投与開始から 7日目に尾静脈から採血し、 血漿コレステロール濃度及び血漿 H DL濃度を測定した。 総コレステロール濃度は日立 7 170型生化学自動分析機 を使用して測定した。
HDLコレステロール濃度は協和メディックス製デタミナ HDLを使用して H DL成分以外のリポ蛋白成分を沈降させた後、 日立 7 170型生化学自動分析機 を使用して測定した。
④ 肝臓脂質の測定
生理食塩水で肝臓を灌流した後、 採取した肝臓を凍結乾燥した。 脂質の抽出は Folch らの方法に従い、 クロ口ホルム： メタノール （2 ： 1) で行った。 その後、 クロロホルム下層を濃縮乾固し、 エタノールで再度希釈して各種肝臓脂質成分の 測定に供した。 肝臓脂質のうちコレステロール量はデ夕ミナ TC 5 δ 5を用いて 測定した。
【0039】
動物試験成績の評価法 ① 統計手法
各動物試験の結果は、 Bartlett 法によ分散の均一性を検定した後、 等分散の 場合は、 一次元配置の分散分析を経て Dunnett型の多重比較検定を、 不等分散の 場合 （Barilett 法により有意水準 5 %で検定を行い、 有意差が得られた検定対 象） は Kruska卜 Wallis の検定を経て Dunnett 型の多重比較検定を行った。 Dunnett 型の多重比較検定では有意水準を 5 %及び 1 %に設定し、 各水準で検定 を行った。
② 各脂質成分の低下率の求め方
ぐ血漿中のコレステロール低下率 >
血漿コレステロール低下率 100%とは、 コレステロールを含まない餌を投与 した普通食群のラッ卜の血漿コレステロール値と同じレベルまで血漿コレステロ —ル値が低下したことを示す。 また、 血漿コレステロール低下率 0 %とは、 コレ ステロール添加食を投与した対照群のラッ卜の血漿コレステロール値と同じレべ ルまで血漿コレステロール値が上昇したことを示す。
③ 動脈硬化指数 (Atherosclerotic index)
動脈硬化指数 （A I ) は、
A I = (VLDLコレステロール値 +LDLコレステロール値） /HDLコレステロール値 で表されるが、 血漿脂質の値から具体的に計算する場合には、 血漿総コレステロ —ル値と血漿 HDLコレステロール値を用いて、 次式から求めた。
A I = (血漿総コレステロール値—血漿 HDLコレステロール値） ノ血漿 HDLコレステロ ール値
動脈硬化指数の改善率は、 各酵母含有飼料投与群の A I値とコレステロール添 加食投与群 （対照群） 及び普通食群の A I値とから算出した。 ここで動脈硬化指 数改善率 100 %とは、 コレステロール非添加食群の A I値と同じ値であること を示す。 また、 動脈硬化指数改善率 0 %とは、 コレステロール添加食群 （対照 群） と同じ A I値であることを示す。 ④ 体重測定
ラッ卜の体重は入荷時に測定し、 各群間で有意な体重差が出ないように群分け して、 予備飼育を開始した。 また、 本試験開始時と試験終了時に体重測定を行つ た。
上記の試験方法は、 以下の予備試験や実施例に使用する。
丁懨 S式験：
採血はコレステロール添加食の投与開始後、 0日目、 5日目及び 8日目に尾静 脈から、 また、 1 4日目にはネンブタール麻酔下に腹部大動脈から行った。 採取 した血液から血漿を分離した後、 各脂質成分を酵素法で測定した。
その結果、 図 1に示すように、 コレステロール投与群の血漿コレステロール値 は 5日目には最大値近くまで上昇した。 その後、 1 4日目まで若干の上昇が認め られたものの、 ほとんど大きな変化は認められなかった。 一方、 コレステロール 非添加食 （コレステロール添加食からコレステロールとコール酸ナトリウムを除 いたもの） 投与群の血漿コレステロール値は試験期間中も上昇せず、 やや漸減す る傾向が認められた。
表 9に、 コレステロール添加食投与開始後 1 4日目の血漿脂質の値を示した。 コレステロール非添加食群のコレステロール値が 7 2 . 5 mg/dL であるのに対 して添加食群のそれは 3 2 5 . 3 mgZdL であり、 約 4 . 5倍上昇しているのが わかる。 それに反して、 血漿 H L Dコレステロール値はそれぞれ 4 5 . 9 mgZdL に対して 3 1 . 4 nig/dLと有意に低下している。 表 9
血漿脂質濃度 （14日目）
Figure imgf000025_0001
**p<0. 01
表 1 0に、 コレステロール添加食投与開始後 1 4日目の肝臓中の脂質含量を示 した。 コレステロール添加食群のコレステロール値は非添加食群のそれに比べて 約 2 0倍高い値を示している。
表 1 0
肝臓中の脂質含量 （14日目）
Figure imgf000025_0002
**p<0. 01
実施例 2
実施例 1に示す方法でジャー培養を行い、 各 2 0 0 gの凍結乾燥菌体 （ 1 1 0でにて 1 0分加熱処理したもの） を調製した。 これをコレステロール添加食に それぞれ 1 0 %混餌 （表 8の 1 0 %酵母群） して、 1群 8匹の群飼いで、 7日間、 自由に摂餌させた。
表 1 1〜表 1 3に高コレステロール食を投与した対照群の血漿コレステロール 値に比較したときのコレステロール低下率及び動脈硬化指数の改善率 （％) を示 した。 なお、 いずれの群も体重に有意な変化は認められなかった。 表 1 1
趣コレステロ一 ^氐下 顏
Figure imgf000026_0001
Ml 2
gコレステロー 氐 報謂胸 δίΰ»:昏率
Figure imgf000027_0001
表 1 3
鎌コレステロー 氐下率及
Figure imgf000028_0001
実施例 3 ： 10%酵母添加食投与試験
試験方法；
実施例 1 (ィ） に示す方法でジャー培養を行い、 各 200 gの凍結乾燥菌体を 調製した。 この調製した凍結乾燥菌体をコレステロール添加食にそれぞれ 10% 混餌 （表 8の 10%酵母群） して、 1群 8匹の群飼いで、 7日間、 自由に摂取さ せた。 表 14に血漿脂質の測定結果を示す。
表 14
Ife漿脂質 （ 10 %混餌投与）
Figure imgf000030_0001
**pく 0.01
コレステロールを添加した高脂肪食を与えることにより、 対照群では総コレス テロール値が増加し、 動脈硬化指数は 7. 97〜9. 62まで上昇したが、 同じ 高脂肪食でも本願発明にかかる酵母菌体を 10%添加した試験群では、 上記分析 項目のすべてにおいて数値の上昇が顕著に抑制されているのがわかる。 このよう に、 クルイべロマイセス マルキシァナス Y I T 8292、 クルイべロマイセ ス ラクチス Y I Τ 8263、 ハンセニァァスボラ ゥヴァラム Y I T816 4、 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I Τ 8266、 キャンジダ ケフィァ Y I Τ 8237、 ピチア ファリノサ Υ Ι Τ8058はいずれも極めて高い血 漿コレステロール低下率を示し、 動脈硬化指数を改善した。
実施例 4 ： 5%酵母添加食投与試験
5週齢の雄ウィスターラッ卜を用いて実施例 3と同様の試験を行った。 ただし、 試験群の飼料に添加する酵母凍結乾燥菌体をそれぞれ 5 %混餌 （表 8の 5 %酵母 群） して、 1群 8匹の個別飼いで、 14日間、 1日 15 gの制限食を与えた。
血漿脂質の分析結果は表 1 5に示す通りであって、 高脂肪食を与えることによ り対照群では総コレステロール値、 動脈硬化指数が上昇したが、 同じ高脂肪食で も 5 %の酵母菌体を添加した試験群では上記分析項目のすべてにおいて上昇が頭 著に抑制された。
¾15
1翻讃
Figure imgf000032_0001
**pく 0.01
表 16に肝臓脂質の測定結果を示した。 肝臓総コレステロール量は対照群に比 ベていずれの試験群も有意に低下した。 このように、 本願発明にかかる酵母は、 その経口投与によって血漿脂質の低下作用だけでなく、 肝臓脂質の低下作用も示 す優れた抗コレステロール素材であることが分かる。
表 16
Figure imgf000033_0001
**ρ<0.01
実施例 5 胆汁酸吸着能
試験方法；
コール酸 （CA)、 タウロコール酸 （TCA)、 グリココール酸 （GCA)、 ケ イデォキシコール酸 （CDCA)、 又はデォキシコール酸 （DCA) のナトリウ ム塩 （シグマ社製） を、 最終濃度が lmM となるように pH 6. 7の 0. 1Mリ ン酸緩衝液あるいは pH 7. 5の 0. 1Mリン酸緩衝液に溶かした。
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の凍結乾燥菌体、 l O Omg を 15mL の遠心チューブに取り、 そこに、 上で作製した胆汁酸溶液、 3. 5mL を加えて、 37°Cで振盪 （120spm) した。 1時間後に、 酵母菌体を遠心分離
( 12, 000 rpm、 10分間） によって沈殿させて、 上清を分取した。 この上 清中の胆汁酸を、 ェンザパイル II (第一化学薬品社製） で定量し、 下式から、 胆汁酸吸着率を求めた。 胆汁酸吸着率とは、 添加した全胆汁酸に対する酵母に吸 着した胆汁酸の割合 （％) であり、 酵母と胆汁酸の吸着の強さを示す。
胆汁酸吸着率 （％) = [{添加した胆汁酸 (mnol)—上清中の胆汁酸 (mnol)}
Z添加した胆汁酸 (nmol)] X 1 00
表 1 7に胆汁酸吸着率を示す。 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8 2 6 6は、 コール酸、 タウロコール酸、 グリココール酸及びケノデォキシコール酸を 吸着し、 優れた 1次胆汁酸吸着能を示した。 また、 酵母とコール酸の吸着率は、 PH6. 7と pH 7. 2の反応液においてほぼ同等の値であった。 これらの結果 から、 酵母は大腸管腔内において 1次胆汁酸と強固に結合し、 腸内細菌による脱 抱合や 7 a一脱水酸化反応を妨害することによって 2次胆汁酸の産生を阻害し得 ることが示された。
また、 2次胆汁酸であるデォキシコール酸とも強固に結合した。 このことから、 酵母は、 2次胆汁酸の産生を抑制すると同時に、 生じた 2次胆汁酸を吸着、 非動 化することによって、 その毒性を軽減させる作用も有する。
表 1 7
ィサチェンキア オリエン夕リスの胆汁酸吸着率 （％)
Figure imgf000034_0001
実施例 6
実施例 5と同方法で種々の酵母の胆汁酸吸着率を測定した結果を表 1 8に示す。 いずれの酵母も胆汁酸、 1次胆汁酸のケノデォキシコール酸及び 2次胆汁酸のデ ォキシコール酸の良い吸着性を示した。 表 1 8
各種酵母の胆汁酸吸着率
Figure imgf000035_0001
実施例 7 ィサチェンキア オリエンタリス Y I T 8 2 6 6の凍結乾燥菌体によ る 2次胆汁酸産生抑制
予備試験
5週齢の Wi s t ar 系雄ラッ卜 （日本クレア製） を、 オリエンタル酵母社製 F— 2粉末飼料で 7日間飼育した後、 1群 8匹ずつ各群間で体重差が出ないよう群分 けし、 表 1 9の試験飼料を 1 4日間投与した。 ラットは金属製ケージで個別飼い し、 飼料及び水は自由に摂取させた。 表 1 9
飼料組成 [%]
成 分 普通食 高胆汁酸食
カゼイン 22. 30 22. 30
ショ糖 56. 55 55. 80
無機塩 4. 00 4. 00
ビタミン 1. 00 1. 00
大豆油 1. 00 1. 00
ラード 10. 00 10. 00
重酒石酸コリン 0. 15 0. 15
コレステロール 0. 00 0. 50
コール酸ナトリウム 0. 00 0. 25
濾紙粉末 5. 00
Figure imgf000036_0001
1 4日間飼育後の普通食群、 高胆汁酸食群の間では、 摂取量及び体重増加量に は有意な差は認められなかった。
【00 38】
胆汁酸量
2 5mg の 1 2〜 1 4日目の凍結乾燥糞便をスクリユーキャップ付試験管 （1 5mL) に量り取り、 0. Ι δ ^πιοΐ の内部標準物質 （ 5— j3—プレグナン— 3 ひ， 1 7 α, 2 0 α—トリオ一ル） と 5 mL のエタノールを加えて、 7 0°Cのブロッ クヒ一夕一で 2時間加熱した。 不溶物を遠心分離 （3 0 0 O rpm、 1 5分間） に よって沈殿させた。 上清は別の試験管に移して、 窒素ガス送風下で乾固した。 抽 出物を 0. 5mL のメタノールに溶かした後、 0. 4 5 mのフィルター （日本 ミリポア社製） を通して不溶物を除いた。 1 0 Lのサンプルを HP LCシステ ム （ジヤスコ社製） で以下の条件下で分離した。 表 20
胆汁酸の分離条件
A液： ァセ卜二トリル/メタノール Z 3 OmM酢酸アンモニゥム
(30： 30： 40) 混液
B液： ァセトニトリル/メタノール /3 OmM酢酸アンモニゥム
(20： 20： 60) 混液
溶出条件： 100%B液、 0 %A液から、 直線的にグラジェントを
かけて 32分後に、 0%B液、 100%A液とした。
その後、 この組成で 13分間溶出した。
流速： 1. OfflLZ分
カラム温度： 25°C
ンヤスコ社製分離カラム Bilepak- II(4.6min i.d. x 250mm)
分離カラムを通過した溶出液に、 反応液 （0. 3mM 3 _ニコチン酸アミドア デニンジヌクレオチド （ 3— NAD+) 、 ImM エチレンジァミン四酢酸及び 0. 05 % 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmM リン酸カリウム緩衝液、 pH7. 8) を 1. OmLZ分の流速で混合した。 この混液を、 3 α—ヒドロキシステロィ ドデヒドロゲナーゼを充填した酵素カラム、 Enzymepak (4. 6腿 i.d.
X 35匪、 ジヤスコ社製） に送り、 胆汁酸の脱水酸化反応に伴って生じる
NADH (;3— NAD +の還元型） を蛍光検出器でモニタ一した （励起波長 34 5nm, 発光波長 47 Onm)0
各胆汁酸は、 標準品の保持時間から同定した。 また、 胆汁酸の濃度は、 各ピー クの面積から求めた。 この際、 内部標準物質のピーク面積から回収率を補正した 測定結果を表 2 1に示すが、 コール酸を投与することによって、 大腸へ到達す る 1次胆汁酸の量が増大し、 2次胆汁酸の産生量が亢進することが明らかとなり、 2次胆汁酸産生抑制剤の効果を感度良く評価できることが判明した。 表 21
各種胆汁酸の糞便排泄量 [wmol/day]
普通食 高胆汁酸食
1次胆汁酸
α—ミユリコール酸 1.52±0. 35 8·52±3·05"
/3—ミユリコ一ル酸 0·20±0· 09 8.48±1.55"
ヒォコール酸 0.00±0. 00 0.23±0.2Γ
コール酸 0.00土 0. 00 29.20±7.44"
ケノデォキシコール酸 0.00±0. 00 0.57±0.20"
全 1次胆汁酸 1.72±0. 40 47.00±10.31"
2次胆汁酸
デォキシコ一ル酸 0.72士 0. 26 9.13±5.92Μ
リトコール酸 0.18±0. 10 0.13±0.18"·5·
ヒォデォキシコール酸 0.01土 0, 03 1.06±0.54'
全 2次胆汁酸 0.90±0. 35 10.32±5.84"
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5%
* 有意水準 1 %
n.s. 有意な差なし
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の凍結乾燥菌体による 2次胆 汁酸産生抑制
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の凍結乾燥菌体を高胆汁酸食 に添加して 14日間投与 （5%混餌投与） した （表 22)。 尚、 この際、 ェネル ギー価が同等となるよに、 カゼイン、 蔗糖、 脂質及びセルロース量で調整した。 酵母菌体の投与は、 試験期間中の体重増加量及び摂餌量にほとんど影響を与えな かった （表 23)。 表 2 2
飼料組成 [%]
成 分 高胆汁酸食 酵母添加高胆汁酸食 カゼィン 22.30 20.56
ショ糖 55.80 54.15
無機塩 4.00 4.00
ビタミン 1.00 1.00
大豆油 1.00 1.00
ラード 10.00 9.85
重酒石酸コリン 0.15 0.15
コレステロール 0.50 0.50
コール酸ナトリウム 0.25 0.25
濾紙粉末 5.00 3.55
酵母加熱乾燥菌体 0.00 5.00
※ ィサチェンキア オリエン夕リス YIT8266 表 2 3
試験期間中の摂食量及び体重増加量
高胆汁酸食 酵母添加高胆汁酸食
摂餌量 [g/14day] 236.0 ±8.6 227. 8±21.5η.5·
体重増加 [g/14day] 95.9土 4.0 93. 6±11.9n s.
(注） スチューデント t一検定
n. s.有意な差なし
表 2 4及び 2 5に示すように、 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8 2 6 6を投与することによって、 2次胆汁酸の糞便排泄量は約 8 2 %、 また糞中の 2 次胆汁酸濃度は約 84%低下した。 この傾向は、 特にデォキシコール酸とリトコ ール酸で顕著であった。 一方、 1次胆汁酸の糞便排泄量及び糞中濃度は、 当該菌 体の投与によって有意に上昇した。
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8 2 6 6は、 1次胆汁酸から 2次胆汁 酸への変換を強力に抑制する作用を有していた。 表 24
各種胆汁酸の糞便排泄量 [^mol/day]
Q 咼胆汁酸赏 酵母 刀口¾flU^ @g
1次胆汁酸 III
13.70 + 3.40 r Q 7 s.
lb. ±0. l β —ミユリコール酸 7し 0 ο 0Ζ it 0 Ζ. f Ul 7 /
ヒォコール酸 u 0.12±0.17 0.29±0.15n-s- コール酸 24.37±5.86 35.30±2.55" ケノデォキシコー mル酸 1.10±0.41 1.34±0.27n s' 全 1次胆汁酸 46.60±7.30 63.80±6.81"
2次胆汁酸
デォキシコール酸 10.10±6· 51 0.22±0.46" リトコール酸 0.35±0.31 0.00±0.0(T ヒォデォキシコール酸 0.80±0·32 1.81±0.64"· s- 全 2次胆汁酸 11.25±6.59 2.03±0.8Γ
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5%
* 有意水準 1 %
n. s. 有意な差なし
表 25
糞便中の胆汁酸の組成 [%]
高胆汁酸食 酵母添加 r¾胆汁酸食
1次胆汁酸
α—ミユリコール酸 23.58±5.32 23.11 ±3.47η·5·
;3—ミユリコール酸 12.59±3.07 17.50±2.51" ヒォコ——レ酸 0.19 + 0.27 0.43 + 0.22 -s- コール酸 42.47±11.42 53.87±3.0
ケノデォキシコール酸 1.89±0.65 2.06±0.50n s. 全 1次胆汁酸 80.72±11.55 96.97±0.98"
2次胆汁酸
デォキシコール酸 17.30±11.46 0.30±0.67" リトコール酸 0.59土 0.53 0.00±0.0(T
ヒォデォキシコール酸 1.39±0.59 2.73±0.89" 全 2次胆汁酸 19.28±11.55 3.03±0.98"
高胆汁酸食 酵母添加高胆汁酸食
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5%
* 有意水準 1 %
n. s. 有意な差なし
ィサチェンキア オリエンタリス Y I T 8266の凍結乾燥菌体による盲腸内 PH低下
0. 5 gの 14日目の盲腸内容物を 4. 5 mL の精製水に懸濁し、 0. 5mL の 1 0 %過塩素酸水溶液を添加して 4 °Cでー晚保存した。 この懸濁液を遠心分離
( 9 , Ο Ο Ο ΓΡΠΚ 1 0分） して上清を分取した後、 0. 4 5 mのフィルタ一
(日本ミリポア社製） を通してから、 HP LC分析に供した。
短鎖脂肪酸は、 東亜電波工業社製の HP L Cシステムを用いて以下の条件で解 折した。 なお、 pH緩衝溶液は、 検出器の直前で溶離液に混合した。 表 26
短鎖脂肪酸の分析条件
カラム： 昭和電工社製のカラム KC- 811 Shodex (2本） 溶出液 （流量） ： 7 %ァセトニトリルを含む 1 5mM過塩素酸溶 液（lmL/Diin)
カラム温度： 42
PH調整溶液 （流速） 7 %ァセトニトリル、 6 0 mMトリス （ヒドロ キシメチル） ァミノメタンを含む 1 5 mM過塩 素酸溶液（lmL/min)
検出器： 電導度検出器 （東亜電波工業社製）
セル温度： 45 C 表 27
盲腸内の PH及び短鎖脂肪酸含量
高胆汁酸食 酵母添加高胆汁酸食
盲腸内 pH 6.65±0.08 6.46±0.20'
短鎖脂肪酸含量 [mM]
酢酸 26.6±8.4 37.5±4.0"
プロピオン酸 7.2±2.3 17.5±4.0"
酪酸 2.2±1.4 3.9±0.8*
乳酸 2.5±1.0 2.6±1.2n+s'
コハク酸 15.5±7.3 21.8±7.4n.s.
ギ酸 1.1土 0.6 1.8±1.3
イソ酪酸 0.7±0.6 0.4±0.4n s- 全短鎖脂肪酸 55.9±15.7 85.6±5.Γ
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5%
* 有意水準 1 %
n. s. 有意な差なし
その結果、 高胆汁酸食群は pH 6. 6 5、 全短鎖脂肪酸量 5 5. 9mM であつ たのに対し、 酵母ィサチェンキア オリエンタリス Y I T 8266添加高胆汁酸 食群は、 pH6. 46 (有意水準 5 %)、 全短鎖脂肪酸量は 8 5. 6mM (有意水 準 1 %) と盲腸内 pHの低下が見られ、 大腸管腔内を酸性化し腸内細菌の 7ひ一 脱水酸化酵素の活性を低下させた。 ィサチェンキア オリエンタリス Y I Τ 8266の凍結乾燥菌体によるコレス テロール代謝抑制
2 5mg の 14日目の糞便をスクリュ一キヤップ付試験管 （ 1 5mL) に量り取 り、 0. 1 /imol の内部標準物質 （5 i3—コレスタン） と 1 N水酸化ナトリウム を含む 90 %エタノール溶液、 lmL を加えて、 80°Cのブロックヒーターで加 熱した。 1時間後に、 0. 5mL の蒸留水を加え、 中性ステロールを 2. 5mL の 石油エーテルで 2回抽出した。 抽出液は、 7. 5mL の蒸留水で洗浄した後、 硫 酸ナトリウムで脱水し、 窒素ガス送風下で乾固した。 抽出した中性ステロールは、 トリメチルシリル化した後、 ガスクロマトグラフィーを用いて表 28の条件で測 定した。
表 28
クロマトグラフィー （GC) 分析条件
GC装置： Yokogawa-HewleU -Packard製、 モデル 5890
カラム： SPB-1 FSでコートしたキヤビラリ一ガラスカラム
(Supelco製） 0.32匪 i.d. X30m
カラム温度： 250°C、 8分— 270°C、 10T7分→270t：、 15分
キャリア一 （流速） He(0.8mL/niin)
Spilit, Τ=230 :
検出器： FID, T = 280°C
サンプル注入】 1 L
分析時間： 25分 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の投与によって、 コレステロ 一ルの腸内代謝産物であるコプロス夕ノールゃコプロス夕ノンの糞便中の濃度が 有意に低下した （表 29)。 これらのコレステロールの腸内代謝産物については、 大腸癌等の疾患の発症に関係していることから （Suzuki, K.,et. al.， Cancer Lett. , 33, 307-316, 1986)、 ィサチェンキア オリエンタリス Y I T 8266 は、 コレステロール代謝産物の産生を抑制し、 種々の疾病を予防、 治療し得る。 表 29
糞便中の中性コレステロールの組成 [%]
高胆汁酸食 酵母添加高胆汁酸食
コプロステロール 25.7土 12.5 9.2±11.9*
コプロス夕ノン 1.9±2.5 0.4±0.6"·5·
コレステロール 72.3±14.2 90.5±12.
コプロス夕ノール + 27.7±14.2 9.5±12.4*
コプロス夕ノン
(注） スチュ一デント t-検定
* 有意水準 1 %
n.s. 有意な差なし
実施例 8 ィサチェンキア オリエンタリス Y I T 8266の菌体内容物による 2次胆汁酸産生抑制
菌体内容物の調製
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の凍結乾燥菌体を 0. 1Mの リン酸緩衝液 （pH8. 5) に懸濁して、 ダイノミル （シンマルェン夕一プライ ゼス社製） を用いて機械的に破砕した。 この際、 0. 45 mm 径のガラスビーズ を磨砕剤として使用し、 磨砕操作は、 顕微鏡観察により 95 %以上の菌体が破砕 されるまで繰り返した。 菌体破碎液を 9， 000 gで 15分間遠心分離して、 上 清中に菌体内容物を分離した。 この菌体内容物を採集し、 凍結乾燥した。
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の菌体内容物による 2次胆汁 酸産生抑制
実施例 7と同方法でィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266から調製 した菌体内容物の 2次胆汁酸産生抑制効果を検証した。
本試験の飼料組成は、 表 30に示した。 酵母菌体内容物の投与は、 試験期間中 の体重増加量や摂取量にほとんど影響を与えなかった。 （表 31)。 表 30
飼料組成 （％組成）
成 分 r¾胆汁酸食 菌体内谷物添加咼胆汁酸
食
カゼィン 22.30 20.78
ン 3糖 5δ.80 53.12
無機塩 4.00 4.00
ビタミン 1.00 1.00
人豆油 1.00 1.00
ラード 10.00 9.77
重酒石酸コリン 0.15 0.15
コレステロール 0.50 0.50
コール酸ナトリウ 、 0.25 0.25
濾紙粉末 5.00 4.43
酵母菌体内容物 0.00 5.00 表 31
試験期間中の摂食量及び体重増加量
高胆汁酸食 菌体内容物添加高胆汁酸食
摂餌量 [g/14day] 232.8±9.9 220.7±6.5η·5·
体重増加 [g/14day] 95.9±4.0 88.4±4.5n s.
(注） スチューデント t-検定
n. S. 有意な差なし
表 32及び表 33に示すように、 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T82 66の菌体内容物を投与することによって、 2次胆汁酸の糞便排泄量は約 76%, また糞中の 2次胆汁酸濃度は約 70%低下した。
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の菌体内容物は、 凍結乾燥菌 体と同様に、 1次胆汁酸から 2次胆汁酸への変換を強力に抑制する作用を有して いた。 表 32
各種胆汁酸の糞便排泄量 [ mol/day]
高胆汁酸食 菌体内容物添加高胆汁酸食
1次胆汁酸
a—ミユリコール酸 8.56±1.85 6.80±2.04n 3—ミユリコール酸 6.80±2.1S 8.70±3·04η ヒォコ一ル酸 0.20±0.15 0.25±0.06n コール酸 28.96±11.99 29.99±4· 77" ケノデォキシコール酸 0.44±0.29 0·64±0·35η
次胆汁酸 44.96±13.17 46.37±9.40η
2次胆汁酸
デォキシコール酸 9.87±5,46 2.01±2.26* リトコール酸 0.02±0.05 0.00±0.00η ヒォデォキシコール酸 0.65±0·36 0.49±0.14η 全 2次胆汁酸 10.54土 5.29 2.51±2.18'
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5%
n. s. 有意な差なし
3 3
糞便中の胆汁酸の組成 [%]
高胆汁酸食 菌体内容物添加高胆汁酸食 次胆汁酸
α—ミユリコール酸 16.01±4.33 13.75±1.82n's 3—ミユリコール酸 12.39±3.19 17.30±3.29" ヒォコール酸 0.34±0.20 0.51±0.09n.s コール酸 51.04土 10.63 62.47±6.95" ケノデォキシコール酸 0.76±0.34 1.27±0.56n's 全 1次胆汁酸 79.82±8.31 94.02±3.61"
次胆汁酸
デォキシコール酸 18· 29 ±8.90 3.64±3.76** リ トコール酸 0.04±0.11 0.00±0.00"'s ヒォデォキシコール酸 1.13±0.38 1.07±0.44n's 全 2次胆汁酸 20.18±8.31 5.98±3.61"
(注） スチューデント t-検定
有意水準 5 %
n.S. 有意な差なし 盲腸内の全短鎖脂肪酸量及び PHは、 高胆汁酸食群が 54. 0mM、 ρΗ6. 6 5であったのに対し、 酵母菌体内容物添加高胆汁酸食群では、 68. 3mM (有意 水準 5%)、 pH 6. 46 (有意水準 5%) であった。 よって、 酵母菌体内容物 は、 短鎖脂肪酸量を増大させることによって大腸管腔内を酸性化し、 腸内細菌の 7 α—脱水酸化酵素の活性を低下させる作用を有していた。
表 34
盲腸内の pH及び短鎖脂肪酸含量
高胆汁酸食 ~~菌体内容物添加高胆汁酸 盲腸内 ΡΗ 6.65±0.08 6.46±0.20*
短鎖脂肪酸含量 [mM]
酢酸 26.2±9·0 30.2±7· 1"
プロピオン酸 7.2±2.5 14.3±2.2*
酪酸 2.2±1.5 2.1±0.9η
乳酸 2.4±1.0 1.9±1.2η
コハク酸 14.3±7.1 17.8±6.4η
ギ酸 0.9±0.3 1.8±1.7Π
イソ酪酸 0.7±0.7 0.2±0.2Π
全短鎖脂肪酸 54.0±15.9 68.3±13.9*
(注） スチューデント t-検定
有意水準 5 %
* 有意水準 1 %
n. s. 有意な差なし
ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の菌体内容物の投与によって、 コレステロールの腸内代謝産物であるコプロス夕ノールゃコプロス夕ノンの糞便 中濃度が有意に低下した。 このことから、 ィサチェンキア オリエン夕リス Y I T 8266の菌体内容物は、 凍結乾燥菌体と同様、 コレステロール代謝産物の産 生を抑制することによつても種々の疾病の予防や治癒に寄与し得る。 表 35
糞便中の中性ステロールの組成 [%]
高胆汁酸食 菌体内容物添加高胆汁酸食 コプロス夕ノール 21.1土 8.2 10.0±9.9*
コプロスタノン 2.0±1.6 0.5±0.5"
コレステロール 76.9±9.6 89.6±10.2'
コプロス夕ノール +コプロ:; 夕ノン 23.1±9.6 12.1±10.7*
(注） スチューデント t-検定
** 有意水準 5 %
* 有意水準 1 %
実施例 9
上記実施例で使用した各種酵母菌体を用いて、 次の組成の飲食品を製造した < 1) 健康向け食品 （錠剤）
次の添加物を含有する組成物を打錠し、 錠剤とした。
表 36
健康向け食品の組成 [%]
酵母菌体の乾燥物 10
植物抽出末 30
ローヤルゼリー粉末 5
コラーゲン末 5
乳 糖 25
トウモロコシデンプン 20
ヒドロキシプロピルセルロース 4
ステアリン酸マグネシウム 1
2) 健康向け飲料
次の処方により健康飲料を製造した。 表 37
健康向け飲料の組成 [%]
酵母菌体の乾燥物 5
八チミツ 15
クェン酸 0.1
dl—リンゴ酸 0.1
植物抽出末 20
D—ソルビト一ル液 （70%) 10
0.05
香 料 適 量
精製水 100とする残余
3) 果汁飲料
次の処方により果汁飲料を製造した,
表 38
果汁飲料の組成 [%]
ブドウ糖液糖 33
グレープフルーツ果汁 60
酵母菌体の乾燥物 5
杳 料 適
酸味料 適 量
4) 発酵乳
次の処方により加熱酵母菌体入り発酵乳を製造した。
10 %の脱脂粉乳と 5 %のグルコースを滅菌し、 ラクトバチルス属細菌を植菌 してヨーグルトを製造した。 これに実施例 1で得た加熱酵母菌体を 0. 1〜2 0%混合し、 発酵乳を製造した。
5) 乳酒
次の処方により乳酸を製造した。
10 %の脱脂粉乳と 5 %のグルコースを滅菌し、 ラクトバチルス属細菌を植菌 すると同時に実施例 1で得た酵母を植菌し、 48時間 37 °Cで静置培養して乳酒 を製造した。 産業上の利用可能性
上述の酵母の菌体又はその構成物からなる本発明のコレステロール低下剤は顕 著な血漿コレステロール低下作用、 肝臓コレステロール低下作用を示し、 動脈硬 化その他コレステロール蓄積が原因の疾患の予防に極めて有効なものである。 また、 胆汁酸の吸着及び大腸管腔内の酸性化等を介して、 2 次胆汁酸の産生を 強力に抑制し、 本発明の 2次胆汁酸産生抑制剤は、 大腸癌、 肝癌、 塍臓癌、 胆管 癌、 胆石症などの予防及び治療に極めて有効なものである。
しかも、 本願発明に用いる酵母は古くからチーズや馬乳酒、 ワイン製造等に使 用されていることから明らかなように病原性のない安全な酵母であり、 その菌体 あるいは構成物からなる本願発明のコレステロール低下剤も、 ラッ卜に経口投与 した場合 8 g Zkg の投与量でも死亡例は認められず、 長期間投与しても安全性 には問題がない。
従って、 本発明のコレステロール低下剤及び 2次胆汁酸産生抑制剤は経口投与 する医薬として利用するほか、 食品に混合して日常的に摂取させ、 動脈硬化、 大 腸癌、 肝癌、 塍臓癌、 胆管癌、 胆石症などの予防と健康増進に役立たせるのにも 適した極めて有効なものである。

Claims

請求の範囲
1 . キャンジダ属、 ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クルイべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2 種以上を有効成分として含有するコレステロール低下剤。
2 . キャンジダ.ケフィァ、 ィサチェンキア ·オリエン夕リス、 ハンセニァスポ ラ .ゥヴァラム、 クロエッケラ .アフリカーナ、 クルイべロマイセス ·マルキシ ァナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 ピチア · ファリノサ及びトルラスポ ラ ·デルブルエツキ一から選ばれる酵母の 1種又は 2種以上を有効成分して含有 するコレステロール低下剤。
3 . 請求項 1又は 2記載の酵母を含有することを特徴とするコレステロール低下 用飲食品。
4 . 酵母を有効成分とする 2次胆汁酸産生抑制剤。
5 . 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母であることを特徴 とする請求項 4記載の 2次胆汁酸産生抑制剤。
6 . 酵母がィサチェンキア 'オリエン夕リス、 クルイべロマイセス ·マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス 'サーモトレランス、 ハンセニァスポラ · ゥヴァラム、 サッカロミセス 'セレピシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシグ一ス、 サッカロミセス 'ユニスポ ラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア 'ブルトニ、 キャンジダ 'ケフィ ァ、 キャンジダ ·ェチエルシ一、 キャンジダ ·ゼイラノイデス、 キャンジダ 'ソ ラニ、 キャンジダ.マルトーサ、 キャンジダ ' トロピカリス、 キャンジダ ' シリ ンドラシェ、 キャンジダ .ュチリス、 トルラスボラ ·デルブルエツキ一、 ピチ ァ 'ァノマラ、 ピチア ·ホルスチ一、 及びチゴサッカロマイセス ' ロキシ一から 選ばれる 1種又は 2種以上の酵母であることを特徴とする請求項 4記載の 2次胆 汁酸産生抑制剤。
7 . 請求項 4〜 6いずれか 1項記載の酵母を含有してなる 2次胆汁酸産生抑制用 飲食品。
8 . キャンジダ属、 ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クルイべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2 種以上のコレステロール低下剤製造のための使用。
9 . キャンジダ ·ケフィァ、 ィサチェンキア ·オリエン夕リス、 ハンセニァスポ ラ -ゥヴァラム、 クロエッケラ ·アフリカーナ、 クルイべロマイセス ·マルキシ ァナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 ピチア · ファリノサ及びトルラスポ ラ ·デルブルエツキ一から選ばれる酵母の 1種又は 2種以上のコレステロール低 下剤製造のための使用。
10. 請求項 1又は 2記載の酵母のコレステロール低下用飲食品製造のための使用。
1 1. 酵母の 2次胆汁酸産生抑制剤製造のための使用。
12. 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である請求項 1 1 記載の使用。
13. 酵母がィサチェンキア ·オリエンタリス、 クルイべロマイセス ·マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス 'サ一モトレランス、 ハンセニァスポラ · ゥヴァラム、 サッカロミセス 'セレピシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシグ一ス、 サッカロミセス 'ユニスポ ラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア ·プルトニ、 キャンジダ ·ケフィ ァ、 キャンジダ ·ェチェルシー、 キャンジダ ·ゼイラノイデス、 キャンジダ 'ソ ラニ、 キャンジダ .マルトーサ、 キャンジダ · トロピカリス、 キャンジダ · シリ ンドラシェ、 キャンジダ ·ュチリス、 トルラスボラ ·デルブルエツキ一、 ピチ ァ 'ァノマラ、 ピチア ·ホルスチー、 パキチコスボラ ' トランスバーレンシス及 びチゴサッカロマイセス · ロキシ一から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である 請求項 1 1記載の使用。
14. 請求項 1 1〜 1 3のいずれか 1項記載の酵母の 2次胆汁酸産生抑制用飲食品 製造のための使用。
15. キャンジダ属、 ィサチェンキア属、 ハンセニァスボラ属、 クロエッケラ属、 クルイべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2 種以上を投与することを特徵とするコレステロール低下のための処置方法。
16. キャンジダ ·ケフィァ、 ィサチェンキア ·オリエン夕リス、 ハンセニァスポ ラ -ゥヴァラム、 クロエッケラ ·アフリカーナ、 クルイべロマイセス ·マルキシ ァナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 ピチア · ファリノサ及びトルラスポ ラ ·デルブルエツキ一から選ばれる酵母の 1種又は 2種以上を投与することを特 徵とするコレステロール低下のための処置方法。
1 7. 酵母を投与することを特徴とする 2次胆汁酸産生抑制のための処置方法。
18. 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である請求項 1 7 記載の方法。
19. 酵母がィサチェンキア ·オリエンタリス、 クルイべロマイセス ·マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス ·サ一モトレランス、 ハンセニァスポラ · ゥヴァラム、 サッカロミセス ·セレビシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス ·エキシグ一ス、 サッカロミセス 'ユニスポ ラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア · プルトニ、 キャンジダ ·ケフィ ァ、 キャンジダ ·ェチェルシー、 キャンジダ ·ゼイラノイデス、 キャンジダ 'ソ ラニ、 キャンジダ ·マルト一サ、 キャンジダ · トロピカリス、 キャンジダ ·シリ ンドラシェ、 キャンジダ ·ュチリス、 トルラスボラ ·デルブルエツキ一、 ピチ ァ 'ァノマラ、 ピチア 'ホルスチ一、 パキチコスボラ ' 卜ランスバーレンシス及 びチゴサッカロマイセス · ロキシ一から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である 請求項 1 7記載の方法。
補正書の請求の範囲
[2000年 1 2月 4日 （04. 12. 00 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 1、 2、 8、 9、 1 5及び 16は補正された；他の請求の範囲は変更なし。 （3頁)]
1. (補正後） ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クル ィべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2種以 上を有効成分として含有するコレステロール低下剤。
2. (補正後） ィサチェンキア 'オリエンタリス、 ハンセニァスポラ 'ゥヴァラ ム、 クロエッケラ ·アフリカーナ、 クルイべロマイセス 'マルキシァナス、 クル ィベロマイセス■ ラクチス、 ピチア · ファリノサ及びトルラスボラ ·デルブルエ ツキ一から選ばれる酵母の 1種又は 2種以上を有効成分して含有するコレステロ ール低下剤。
3. 請求項 1又は 2記載の酵母を含有することを特徴とするコレステロール低下 用飲食品。
4. 酵母を有効成分とする 2次胆汁酸産生抑制剤。
5. 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 八ンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母であることを特徵 とする請求項 4記載の 2次胆汁酸産生抑制剤。
6. 酵母がィサチェンキア 'オリエンタリス、 クルイべロマイセス 'マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス ·サーモトレランス、 ハンセニァスポラ . ゥヴァラム、 サッカロミセス 'セレピシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシグ一ス、 サッカロミセス ·ユニスポ ラス、 サッカロミセス .バヤナス、 ヒポピチア 'ブルトニ、 キャンジダ 'ケフィ ァ、 キャンジダ .ェチェルシー、 キャンジダ 'ゼイラノイデス、 キャンジダ *ソ ラニ、 キャンジダ .マルトーサ、 キャンジダ · トロピカリス、 キャンジダ · シリ ンドラシェ、 キャンジダ .ュチリス、 トルラスボラ 'デルブルエツキ一、 ピチ ァ 'ァノマラ、 ピチ 7 ·ホルスチ一、 及びチゴサッカロマイセス ' ロキシ一から
54 補正された用紙 （条約第 19条） 選ばれる 1種又は 2種以上の酵母であることを特徴とする請求項 4記載の 2次胆 汁酸産生抑制剤。
7 . 請求項 4〜 6いずれか 1項記載の酵母を含有してなる 2次胆汁酸産生抑制用 ロロ。
8 . (補正後） ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クル ィべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2種以 上のコレステロール低下剤製造のための使用。
9 . (補正後） ィサチェンキア ·オリエンタリス、 ハンセニァスポラ ' ゥヴァラ ム、 クロエッケラ .アフリカーナ、 クルイべロマイセス 'マルキシァナス、 クル ィベロマイセス · ラクチス、 ピチア · ファリノサ及びトルラスボラ ·デルブルエ ツキ一から選ばれる酵母の 1種又は 2種以上のコレステロール低下剤製造のため の使用。
10. 請求項 1又は 2記載の酵母のコレステロール低下用飲食品製造のための使用。
1 1. 酵母の 2次胆汁酸産生抑制剤製造のための使用。
12. 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である請求項 1 1 記載の使用。
13. 酵母がィサチェンキア ·オリエン夕リス、 クルイべロマイセス 'マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス ' ラクチス、 クルイべロマイセス 'サーモトレランス、 ハンセニァスポラ . ゥヴァラム、 サッカロミセス 'セレピシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシダース、 サッカロミセス 'ユニスポ ラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア ·プルトニ、 キャンジダ 'ケフィ ァ、 キャンジダ ·ェチェルシー、 キャンジダ ·ゼイラノイデス、 キャンジダ - ソ ラニ、 キャンジダ .マルトーサ、 キャンジダ . トロピカリス、 キャンジダ ' シリ ンドラシェ、 キャンジダ .ュチリス、 トルラスボラ 'デルブルエツキ一、 ピチ
55 補正された用紙 （条約第 19条） ァ 'ァノマラ、 ピチア 'ホルスチ一、 パキチコスボラ ' トランスバーレンシス及 びチゴサッカロマイセス · 口キシ一から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である 請求項 1 1記載の使用。
14. 請求項 1 1〜 1 3のいずれか 1項記載の酵母の 2次胆汁酸産生抑制用飲食品 製造のための使用。
1 5. (補正後） ィサチェンキア属、 ハンセニァスポラ属、 クロエッケラ属、 クル ィべロマイセス属、 ピチア属又はトルラスポラ属に属する酵母の 1種又は 2種以 上を投与することを特徴とするコレステロール低下のための処置方法。
16. (補正後） ィサチェンキア 'オリエン夕リス、 ハンセニァスポラ ·ゥヴァラ ム、 クロエッケラ ·アフリカ一ナ、 クルイべロマイセス ·マルキシァナス、 クル ィベロマイセス ·ラクチス、 ピチア ·ファリノサ及びトルラスボラ ·デルブルエ ッキーから選ばれる酵母の 1種又は 2種以上を投与することを特徴とするコレス テロール低下のための処置方法。
17. 酵母を投与することを特徴とする 2次胆汁酸産生抑制のための処置方法。
18. 酵母がィサチェンキア属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 サ ッカロミセス属、 ヒポピチア属、 キャンジダ属、 トルラスボラ属、 ピチア属及び チゴサッカロマイセス属から選ばれる 1種又は 2種以上の酵母である請求項 1 7 記載の方法。
19. 酵母がィサチェンキア ·オリエン夕リス、 クルイべロマイセス ·マルキシァ ナス、 クルイべロマイセス · ラクチス、 クルイべロマイセス ·サーモトレランス、 ハンセニァスポラ · ゥヴァラム、 サッカロミセス ·セレビシェ、 サッカロミセ ス 'ダイレンシス、 サッカロミセス 'エキシダース、 サッカロミセス 'ユニスポ ラス、 サッカロミセス ·バヤナス、 ヒポピチア · プルトニ、 キャンジダ ·ケフィ ァ、 キャンジダ ·ェチエルシ一、 キャンジダ ·ゼイラノイデス、 キャンジダ -ソ ラニ、 キャンジダ ·マルトーサ、 キャンジダ · トロピカリス、 キャンジダ ·シリ ンドラシェ、 キャンジダ .ュチリス、 トルラスボラ 'デルブルエツキ一、 ピチ
56
補正された用紙 （条約第 19条）
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