JP2013515085A - 肥満症および糖尿病を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図12
Description
本願は、それぞれ本明細書に援用した、2009年12月22日出願の米国特許仮出願第61/284,623号および2010年7月8日出願の米国特許仮出願第61/399,224号の利益を主張するものである。
該当なし
該当なし
該当なし
肥満症は西欧人に蔓延しつつあり、その原因は一般に高い脂肪消費量および西欧人のほとんど体を動かさない生活様式にある。肥満症は重要な公衆衛生上の問題であり、2型糖尿病および心血管疾患といった疾患に関係している。特に、内蔵型(中心性)肥満症は、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、脂質異常症、高血圧症、血栓形成促進性状態および炎症誘発性状態に関連している。用語「メタボリックシンドローム」は、中心性肥満症に関係するかまたは関係しないこともあるこれら生化学的異常および臨床状態を包含する。肥満症はエネルギー平衡の異常であり、高インスリン血症、インスリン抵抗性および脂質代謝の異常と関連する。肥満症は2型糖尿病、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症およびある種の癌の発症において最も重要なリスク因子の1つである。
肝では、PPARαが活性化されると、脂肪酸のβ酸化が増大し、トリグリセリド(TG)が減少し、超低密度リポタンパク質(VLDL)が合成される。このダイズイソフラボンゲニステインの作用の大半はコレステロール代謝に関与する遺伝子の発現の変化によって媒介されることが一般に認められている。ゲニステインはPPARが調節する遺伝子の上方制御を介して抗糖尿病作用および脂質低下作用を及ぼす。しかし、脂肪酸合成または他の脂質代謝の局面に対するゲニステインおよび他のファイトアレキシンまたはファイトアレキシンイソフラボン代謝物の作用についてはほとんど知られていない。
ら化合物への最初の関心は、アジア諸国のダイズ製品の消費量と肥満症の発症率の低下とを関連付ける研究から起こった。したがって、これらの化合物を肥満症予防に使用することの可能性が示唆された。
が増大する別のグループのファイトアレキシンを表す。グリセオリンのアイソフォームI−III(図1)は前駆体のダイゼイン由来のものであり、クメストロールに類似したコア構造を示す。グリセオリン(Ι−III)は、ダイズを発酵させて醤油および味噌を製造するのに一般に用いられる非毒産生性のアスペルギルス株のショウユコウジカビ(fungus Aspergillus sojae)にダイズを暴露することに由来し得る。ゲニステインおよびダイゼインと比較して、精製したグリセオリンはLXR受容体などのある種の遺伝子の活性を調節する能力が大きい。これらの知見から、グリセオリンに富んだダイズタンパク質は標準大豆タンパク質と比較してはっきりと異なる遺伝子調節性を有し得ることが示唆される。
L)コレステロールおよび超低密度リポタンパク質(VLDL)コレステロールを低下させ、トリグリセリド(TG)を増加させること、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。この方法は、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ACACB;ACAT1;ACOX1;AGPAT2;AHSG;AKT1;AKT2;CAP1;CD36;CEBPB;CRK;DBI;EIF2B1;EIF4EBP1;FBP1;FOS;GPD1;GPAM;HADH;HRASl;ITGA7;LPL;MAP2K1;ORM1;PLIN;PRKAR2B;PTGDS;PTPN1;PTPN11;SORBS1;SREBF1;VEGFA;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現を前記動物において増加させることをさらに含み得る。この方法は、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、AEBP1;ARAF;CBL;CEBPA;CEBPD;CSN2;DOK2;DOK3;EIF4E;FRS3;G6PC;GCG;GCK;GPD2;GRB10;GRB2;GSK3B;IGF2;INSl;ITGA2;ITGA8;LDLR;NCK2;NOS2;NPY;PHIP;PIK3CA;PIK3R2;PPP1CA;PTPRF;RETN;SDC1;SHC3;SLC27A4;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現を前記動物において減少させることをさらに含み得る。
kg〜約75mg/kg、約10mg/kg〜約60mg/kg、約20mg/kg〜約50mg/kg、約25mg/kg〜約40mg/kg、約25mg/kg〜約35mg/kg、好ましくは約30mg/kgの量で動物に提供することもできるし、動物に投与することもできるし、あるいは動物によって消費させることもできる
化学物質
ジヒドロテストステロン(DHT)、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびゲニステイン、17β−エストラジオールはSigma Chemical社(ミズーリ州セントルイス所在)からのものとした。細胞培地および試薬はInvitrogen社(カリフォルニア州カールズバッド所在)から購入した。
ショウユコウジカビ(Aspergillus sojae)(SRRC1125)培養基を暗室にてポテトデキストロース寒天で25℃で培養した。5日後、15mlの滅菌蒸留水中で分生子(3.4x107/ml)を収穫することによって接種材料を調製した。市販のダイズ品種Asgrow 5902からの種子の表面を70%エタノールで3分間滅菌し、脱イオン水で迅速にすすぎ、脱イオン水で2分間すすいだ。種子を滅菌脱イオン水に4〜5時間、事前浸漬し、Cuisinartフードプロセッサで2分間みじん切りにした。ショウユコウジカビ(Aspergillus sojae)胞子懸濁液(300ml)を各トレイ上の種子の切断表面に塗布した。全トレイを暗室にて25℃で3日間保管し、水ですすいで胞子を除去し、40℃で24時間オーブン乾燥した。抽出前にワーリングブレンダーを用いて種子を破砕した。
1Lのメタノールにより300gの破砕種子からグリセオリンI、IIおよびIIIを抽出した。延長チューブを併用した2台のWaters社の25mm×10mm粒径mBondapak CI8 ラジアルコンプレッションカラムセグメントを用いた分取スケールのHPLCによりグリセオリン単離した。Waters社のUV−VIS996検出器を併用したWaters社の600E System ControllerによりHPLCを行った。流速8.0ml/分で以下の溶媒系:A=アセトニトリル、B=水;5%Aにより10分間、5%A〜90%Aで60分間溶離し、次に90%Aで20分間維持することによって溶離した。注入量は20mLであった。グリセオリンを含む画分を真空下で濃縮し、凍結乾燥した。UV−VIS分光光度法、質量分析およびNMRによってこのグリセオリンを確認した。溶媒のアセトニトリル(HPLCグレード)およびメタノールはAldrich Chemical Companyから購入した。水はMilliporeシステムを用いて得、試料調製およびHPLC分析中に使用した。グリセオリンI(68%)、II(21%)およびIII(11%)の混合物を単離し(図1を参照)、治療に用いた。平均分子量338を用いて全細胞培養試験に用いたグリセオリンの濃度を算出した。
LNCaP細胞はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ヴァージニア州マナッサス所在)から入手し、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド所在)とともに、Media A[RPMI1640培地(フェノールレッド付)(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド所在)、2mMのL−グルタミン(Sigma社)、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン(BioSource International社、カリフォルニア州カマリロ所在)で維持した。細胞を空気中5%二酸化炭素の存在下37℃でインキュベートした。
75cm2フラスコの5%ウシ胎仔血清を補給したDMEM培地にMCF−7細胞を播種した。翌日、培地を2日間5%活性炭処理済血清を補給したフェノールレッドフリーDMEMと交換した。DMSO(ビヒクル)、1nMの17β−エストラジオール、10μΜのグリセオリン混合物および100nMのタモキシフェンにより細胞を処理した。全RNAを抽出した。各アレイは96遺伝子のパネルの発現を表す。各アレイのために、製造業者のプロトコルに記載の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で4μgのRNAをcDNAに逆転写した。cDNAテンプレートを適した準備済のPCRマスターミックスと混合し、同じプレートの各ウェルに等分し、定量RT−PCRおよびエストロゲン受容体シグナル伝達スーパーアレイ(米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在)を用いてリアルタイムPCRサイクリングプログラムを実行した。2−ΔΔCt法を用いて相対遺伝子発現を算出した(Ctは蛍光シグナルが検出閾値に達する部分サイクル数を示す)。この「ΔΔ」法(Pfafflらが記載)は、計5つの対照の内在性遺伝子(18SrRNA,HPRTl,RPL13A,GAPDHおよびACTB)を用いて算出された各試料の正規化ΔCt値を使用する。平均の倍数変化の値は、対照試料と比較して治療した遺伝子の平均倍数変化=2−(average ΔΔCt)として表した。記述統計学を用いて臨床変数を特徴付け、群間の遺伝子発現の統計学的有意差をスチューデントのt検定を用いて算出した。
本発明者らは外科的に閉経させた平均年齢17.8±0.5歳の成熟カニクイザル(Macaca fascicularis)30匹を用いた。全動物を4年間卵巣切除し、以降、各3−4匹の安定した社会集団で飼育した。これらの動物は微量または低用量の経口エストラジオールのいずれかを与えた場合のダイズイソフラボンを評価する無作為化ラテン方格クロスオーバー試験に先に登録されていた。この以前の試験では、各社会集団の動物には同じ試験治療を施行したが、順序は変えた。治療フェーズ間の4週間の休薬期間にわたる乳房のエンドポイントのいずれにも有意なキャリーオーバー効果は認められなかった。先の試験に用いたエストラジオール用量(女性の0.09または0.5mg/日に相当)ホルモン療法として閉経後女性に一般に処方される用量(〜1.0mg/日)未満であり、イソフラボン用量(女性の0,60,120または240mg/日に相当)はヒトの食餌またはサプリメント曝露の範囲内にあった。このレベルのエストロゲンまたはイソフラボン曝露がその後で成人乳腺組織のホルモン応答を変化させるというエビデンスはない。本試験では、試験開始前に全サルに対照のカゼイン/ラクトアルブミン食を6週間与えた。次いで、サルを社会集団ごとに無作為割付し、以下を含む3種の食餌の1つを与えた:1)エストラジオール(E2,1mg/1,800kcal)+カゼイン/ラクトアルブミン[対照(Con),9例];2)193.6mg/1,800kcalのイソフラボノイドを含むE2+ダイズタンパク質分離物(SPI)(11例);および3)188.5mg/1,800kcalのイソフラボノイドおよび134.1mg/1,800kcalのグリセオリンを含むE2+グリセオリンに富んだダイズタンパク質(GLY)(10例)。対照の食餌には6.7mg/1,800kcalのイソフラボノイドを含む微量のダイズタンパク質を含有した。イソフラボノイド用量はいずれもアグリコン当量で示す。食餌は等カロリーで、主要栄養素、コレステロール、カルシウムおよびリンの点で同様である。グリセオリンに富んだタンパク質は、破砕した(scarred)ダイズ(Glycine max)を酵素処理して親イソフラボンダイゼインをグリセオリンに転換させることにより製造した。次に、このダイズを粉砕、脱脂し、繊維濃縮物に組み込んだ。GLYサプリメントは、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)および紫外線(UV)モニタリング(可視分光光度法)によって定量した場合に、製品1gあたり959.5μgの非抱合型グリセオリンを含んだ(76.8%グリセオリンI、9.9%グリセオリンIIおよび13.6%グリセオリンIII)。グリセオリンのHPLC分析は、UV
−VIS996検出器を併用したWaters 600E System Controllerを用いて行われた。グリセオリンを抽出して0.5mlの80%EtOHでホモジナイズし、50℃で1時間加熱し、冷却し、14,000gで10分間遠心分離して濾過した。HPLCによって上清アリコート(20μL)を直接分析した。波長285nmでグリセオリンをモニターし、Vydac Multiring CI8(4.6x250mm;5μm)逆位相カラムを用いて分離した。標準的な溶媒系を用いて流速1.0ml/分で溶離した。HPLC分析はいずれも3回ずつ行った。相対的イソフラボノイド含有量も75ユニットごとに測定した(ダイズタンパク質分離物には61.5%ゲニステイン、34.6%ダイゼインおよび3.8%グリシテイン、グリセオリンに富んだタンパク質には52.6%ゲニステイン、43.0%ダイゼインおよび4.4%グリシテイン)。食餌のバランスをとるために、繊維濃縮物(FIBRIM2000(登録商標)を対照食餌およびSPI食餌に添加した。この濃縮物には製品1gあたり0.17mg(HPLCで測定した場合)のイソフラボノイドをもたらす少量のダイズタンパク質(重量あたり11.4%)を含んだ。ダイズタンパク質分離物および他の繊維濃縮物はDupont社の一部門であるSolae(ミズーリ州セントルイス所在)から豊富に提供を受けた。グリセオリンに富んだタンパク質はSolae、農務省南部研究所およびチューレーン大学医学部の協力により提供された。エストラジオール錠はマイラン製薬(ウエストバージニア州モーガントン所在)から入手した。動物には体重(BW)1kg当たり120kcalを1日1回給餌した。サル被験体とヒト被験者との間の代謝率差を埋め合わせるために、エストラジオール、イソフラボノイドおよびグリセオリンの1日量を(BWではなく)1800kcal(米国女性の推定1日摂取量)の食事に合わせて調整した。したがって、サルには体重1kgあたり66.7μgのE2(全群);体重1kgあたり0.44mg(Con)、12.91mg(SPI)または12.57mg(GLY)のイソフラボノイド、ならびに体重1kgあたり8.94mgのグリセオリン(GLY)を各日給餌した。注目すべきなのは、最初のSPIおよびGLY食餌処方には十分な嗜好性が欠けていたため、全動物を対照群の食餌(E2)に1週間14日置いて試験した。この期間に甘いアップルソースを用いて全食餌を再処方し、以降3週間給餌し、コンプライアンスの問題はなかった。動物に関わる全手順は、州法および連邦法、米国保健社会福祉省の基準およびウェイクフォレスト大学動物実験委員会が作製したガイドラインに準拠して行った。ウェイクフォレスト大学の施設および実験動物計画は実験動物管理評価認定協会(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)によっていずれも認証を受けている。
食餌療法の開始および終了時に、ケタミンおよびブプレノルフィンにより動物を麻酔して乳房生検、採血、子宮超音波検査、膣細胞診および体重測定を行った。乳房生検では、事前に選択した乳房四分円を1.5cm切開し、小さな(〜0.4g)乳腺試料を摘出した。ACUCに認可された臨床手順に従って、切開部を縫合し、動物をモニターし、回復中に麻酔を与えた。生検部位には後で同部位を再び採取しないように入れ墨を入れた。生検試料の半分は凍結させ、残りの半分は4%パラホルムアルデヒドにより4℃で24時間固定し、標準的手順を用いた組織化学検査用に処理した。
グリセオリンはin vitroでLNCaP細胞の肝臓X受容体を介してABCG1を上方制御する
図1に示すように、LNCaP細胞からの試験結果はLXRに対するグリセオリンの役割を示唆している。5μΜで48時間グリセオリン処理すると、ABCG1は8.1倍上方制御された。ABCA1の有意な上方制御も観察された(データは示さず)。ゲニステイン治療によって3倍上方制御され、ダイゼインおよびゲニステインでは2倍上方制御さ
れた。
グリセオリン治療によってLXR応答遺伝子ABCG1およびABCA1は上方制御される
2つのLXR応答遺伝子ABCG1およびABCA1はコレステロール排出ポンプとして協働する。これらの分子作用が、ダイズグリセオリンが肥満症および肥満関連症候群(高コレステロール血症および炎症など)を予防し得る潜在的機序をもたらす。LXRαおよびLXRβアイソタイプは、コレステロール逆輸送体であるATP結合カセットサブファミリーAメンバー1(ABCA1)およびサブファミリーメンバーG1(ABCG1;4−5)の調節を介した周辺組織およびマクロファージにおける遊離コレステロールの蓄積を制限する重要な役割について研究されてきた。LXRαは主に肝細胞、脂肪細胞および腸細胞に発現し、そこではLXRβが普遍的に発現する。
グリセオリンはin vitroでMCF7細胞の遺伝子発現を変化させる
表1はMCF−7細胞においてエストラジオール、グリセオリン混合物およびタモキシフェン治療によって変化した遺伝子のSuperArray分析の結果を示している。太字の数字は1.5を超える遺伝子発現の倍数変化を表す。SDF−1およびPgR遺伝子発現に対するグリセオリンおよびタモキシフェン治療の差次的効果を試験し、スーパーアレイ分析を行うことによって、乳癌およびエストロゲンシグナル伝達において一般に変化されるさらに広い遺伝子パネルを用いて2種の化合物間の差をさらに調べることにした。上記リアルタイムRT−PCRデータに基づき、本発明者らはDMSO(ビヒクル)、1nMのE2、100nMのタモキシフェンまたは10μΜのグリセオリンでMCF−7細胞を4時間処理することにした。全RNAを抽出・定量し、リアルタイムPCRアレイを行った。本発明者らはグリセオリンによって上方制御されたいくつかの遺伝子を同定した(SREBF1,SREBF2,ACOX1,PPARA,FASN,AGPAT7,AGPAT6,SCD5,CPT2,ABCG1,AC02,ECHl,ECHDCl,ECHDC2,ECHDC3)。
グリセオリンは霊長類の乳腺組織の遺伝子発現を変化させる
表2はグリセオリンに富んだダイズタンパク質分離物と標準的ダイズタンパク質分離物とを比較した、乳腺組織で上方制御および下方制御された遺伝子の数を示している。脂肪酸代謝に関与するHADH遺伝子はグリセオリン治療によって上方制御された。GPD1、GPAM、AGPAT2およびGPAMなどのグリセロ脂質代謝に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。アラキドン酸代謝に関与するPTGDS遺伝子は上方制御された。ITGA8,SDC1,シンデカン1およびITGA2など、ECM−受容体相互作用に関与するいくつかの遺伝子は下方制御された。上方制御された遺伝子はITGA7およびCD36であった。LPL,PLIN,SORBSl,CD36およびDBIなど、PPARシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。PRKAR2B,SORBSlおよびACACBなど、インスリンシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子は上方制御された。
グリセオリンはマウス肝組織の遺伝子発現を変化させる
表3はグリセオリンで治療した肝組織の遺伝子発現を、表4は有意に上方制御(>1.5)された数を、表5はグリセオリン治療したマウス肝組織において有意に下方制御(<1.5)された遺伝子の数を対照と比較して示している。
ロール機能に関与する上方制御された他のいくつかの遺伝子は、グリセオリン治療によって生じた。SORBS1遺伝子は脂質輸送に重要であり、SREBF1はコレステロール輸送に関与している。表7は有意に下方制御された遺伝子もいくつか示している。INS1はインスリン調節に重要である。
ルを取り込む。受容体−リガンド複合体はクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞に吸収され、次いで、コレステロールが種々の下流の生化学経路によって使用される。第2の経路では、細胞内濃度が低い場合にSCAP/SREBPシグナル伝達カスケードの活性化によりコレステロールが合成される。SREBP(ステロール調節エレメント結合タンパク質)は、多数のコレステロール合成遺伝子の発現を調節する転写因子であり、SCAP(SREBP切断活性化タンパク質)がその活性を調節する。最終的に、細胞が過剰なコレステロールを蓄積すると、コレステロール逆輸送経路が活性化され、過剰なコレステロールは肝臓へ輸送されて胆汁に分泌される必要がある。この第3の経路では、循環する高密度リポタンパク質(HDL)は非肝細胞からのコレステロールの第一の受容体として機能する。
霊長類試験および食餌
本試験の対象は外科的に閉経させた平均年齢17.8±0.5歳の成熟カニクイザル(Macaca fascicularis)30匹とした。全動物を4年間卵巣切除し、以降各3−4匹の安定した社会集団で飼育した。全動物を社会集団ごとに無作為割付し以下を含む3種の食餌のうちの1つを与えた:(1)カゼイン/ラクトアルブミン(C/L,9例);(2)193.6mg/1800kcalのイソフラボンを含むダイズタンパク質分離物(SOY,11例);および(3)188.5mg/1800kcalのイソフラボンおよび134.1mg/1800kcalのグリセオリンを含むグリセオリンに富んだダイズタンパク質(GLY、10例)。イソフラボン用量はいずれもアグリコン当量で表す。これまでに報告されているように(Woodら、2006年)、各食餌には生理学的投与量の微粉化17β−エストラジオール(E2,1mg/1800kcal)も含んだ。食餌の製造、組成物および分析に関するさらなる詳細も、この先の報告(Woodら、2006年)に記載されている。
国保健社会福祉省の基準およびウェイクフォレスト大学動物実験委員会が作製したガイドラインに準拠して行った。ウェイクフォレスト大学の施設および実験動物計画は実験動物管理評価認定協会(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)によっていずれも認証を受けている
マイクロアレイ分析では、Tri試薬(Molecular Research Center、オハイオ州シンシナティ所在)を用いて凍結乳腺脂肪体生検から全RNAを抽出し、RNeasy Mini kit(QIAGEN社、カリフォルニア州バレンシア所在)を用いて精製し、NanoDrop ND−1000紫外線可視分光光度計(NanoDrop社、デラウェア州ウィルミントン所在)を用いて定量した。生検採取については既に記載されている(Woodら、2006年)。RNAの無損傷性(intactness)および品質はAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies社、デラウェア州ウィルミントン所在)を用いて確認した。各群からの品質の最も高い3つの試料(計12例)をマイクロアレイ分析に供した。RNAをGeneChip Rhesus Macaque Genome Arrays(Affymetrix社、カリフォルニア州サンタクララ所在)にハイブリダイズし、洗浄し、Cogenics(登録商標)の臨床データ部門(ノースカロライナ州モリスビル所在)にてスキャンした。GeneChip Operating Software(Affymetrix社)を用いて、スキャン画像から強度データを抽出した。脂質およびグルコース代謝経路に関連する10個の遺伝子(マイクロアレイ分析で同定)の発現を定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を用いて決定した。内部対照遺伝子GAPDHおよびBACTとしてマカクに特異的なqRT−PCRプライマー/プローブセットを生成し、ターゲットアッセイにはアカゲザルまたはヒトABI Taqmanプライマー/プローブセットを用いた(qRT−PCRにより評価した標的遺伝子用のプライマー/プローブセットを示す表11を参照のこと)。上記のように全乳腺試料(30例)から、全RNAを抽出し、定量し、上記のように逆転写した。Applied Biosystems社のABI PRISM(登録商標)7500 Fast Sequence Detection SystemによりTaqman試薬および標準的なサーモサイクリングプロトコルを用いてリアルタイムPCR反応を行った。ABI相対定量7500ソフトウェアv2.0.1.によって算出したΔΔCt法を用いて相対発現を決定した。外部検量用試料として原乳腺(stock mammary)組織を各プレート上で2回試験(run)した。
ベースライン時および治療終了後に採血して血清マーカーを測定した。液体クロマトグラフィ−フォトダイオードアレイ質量分光分析によって総グリセオリン(I〜III)およびダイズイソフラボノイドの血清濃度を決定した。放射免疫測定用(E2,DSL−4800超高感度、Diagnostic Systems Laboratories社、テキサス州ウェブスター所在)または酵素結合免疫吸着検定用(MCP−1およびET−1、R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス所在;XLAPs、Osteometer Biotech A/S社、デンマーク国ヘアレブ所在;GLP−1(総)、レプチンおよびインスリン、ALPCO Diagnostics社、ニューハンプシャー州セーレム所在;アディポネクチン、Mercodia社、ノースカロライナ州ウィンストンセーレム)の市販のキットおよびプロトコルを用いてE2、血管および骨代謝回転マーカー(単球走化性タンパク質(MCP)−1、エンドセリン(ET)−1およびCrossLapsコラーゲン分解産物(XLAPs))および代謝マーカー(インスリン、グルカゴン様ペプチド(GLP)−l)、アディポネクチンおよびレプチン)の血清濃度を測定した。COBAS FARA II分析装置(Roche Diagnostics社、ニュージャージー州モントクレア所在)により標準的なプロトコルおよび試薬
を用いた酵素法を利用して、総コレステロール(TC)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL)およびトリグリセリド(TG)濃度を測定した。ウェイクフォレスト大学医学部の完全に標準化された臨床化学実験室にて血清分析を行った。ヘパリン・マンガン沈殿法を用いてHDL濃度を測定した。低密度リポタンパク質コレステロール(LDL)+超低密度リポタンパク質コレステロール(VLDL)をTPCとHDLとの間の差として算出した。ベースランおよび治療後の時点からの試料を同時に分析して全部の血清測定を行った。
GeneSifter(登録商標)ソフトウェアプログラム(Geospiza社、ワシントン州シアトル所在)を用いてマイクロアレイデータを解析した。強度データをRMAで正規化し、log2スケールに変換し、試料および群間の不均一性をスクリーニングし、管理された(supervised)分散分析(ANOVA)および治療間のペアワイズ比較を用いて評価した。結果に記載のように、選別されたデータについて主成分分析(PCA)、パターンナビゲーション、クラスタ分析、ヒートマップおよびKEGG経路分析を行った。各治療によって変化した遺伝子数の違いをカイ2乗検定を用いて比較し、平均連結法を用いた階層的クラスタ分析デンドログラムの一部としてユークリッド距離(治療ベクトル間の数値差を表す)を算出した。KEGG分析により経路を評価した。zスコア(>2.0)を特定の経路における遺伝子の有意な過剰出現と考えた。Ingenuity Pathway Analysis(IPA)ソフトウェアv8.0(Ingenuity Systems社、カリフォルニア州レッドウッドシティー所在)を用いて特定の古典的(canonical)分類および機能的分類内の発現量の異なる遺伝子の出現を評価した。フィッシャーの直接確率検定を用いてBenjamini−Hochberg補正法によりIPAにおいて所与のカテゴリー内の遺伝子数の有意性を決定し、各治療群について-log10(P値)で表した。その他のデータはSAS統計パッケージ(バージョン9.1,SAS Institute社;ノースカロライナ州カリー所在)を用いて分析した。一般線形モデルを用いて平均値を決定し、群間差を算出した。正規分布および群間の等分散性について全データを評価した。遺伝子発現および血清マーカーのデータを対数変換して分布を改善し、次いでデータを元のスケールに再変換し、対照の倍数変化として報告した(90%信頼区間)。RNAの質が悪かったため、SOY群の動物1匹を遺伝子発現分析から除外した。これにより最終的なグループサイズは、qRT−PCRデータについてはC/Lが9例、SOYが10例、GLYが10例であった。治療後の血清脂質およびマーカーのデータをベースライン値によって共変した。ボンフェローニ補正を用いて、ペアワイズテストの数についてペアワイズの全P値を調整した。いずれの比較にも両側検定の有意水準0.05を選択した。
食餌摂取量
食餌摂取量の指標として体重、血清E2および血清イソフラボノイドを測定した。治療群ではベースライン時または治療後の平均BW、BWの変動または血清E2濃度に有意な違いはなかった(いずれもANOVA P>0.05)。給餌4時間後、平均血清グリセオリン濃度はGLY群では134.2±34.6nmol/L、SOY群では無視できるほど小さかったが(GLYと比較してP<0.001)、給餌4時間後(いずれもP<0.001)および24時間後(いずれもP<0.05)、総血清イソフラボノイド濃度はC/L群と比較してSOY群およびGLY群では有意に高かった。SOY群およびGLY群では、給餌4時間後(P=0.59)または24時間後(P=0.73)の総血清イソフラボノイドに差はなかった。個々のイソフラボノイドも2種の食餌間で同程度であった。給餌4時間後のSOY食餌およびGLY食餌の総血清イソフラボノイドは、ヒトダイズインターベンション試験で報告されたものと同程度であった。
カゼイン/ラクトアルブミン(C/L)、標準ダイズタンパク質(SOY)およびグリセオリンに富んだダイズタンパク質(GLY)を含有した食餌の乳腺脂肪における遺伝子発現プロフィール
網羅的発現プロフィールから、SOYと比較して、GLYによって多数の遺伝子が変化したことがわかった。例えば、FC>1.5およびANOVA P<0.05の遺伝子(名称付き)計139のうち、SOY群(44例)と比較してGLY群(111例)では多数に変化がみられ(P<0.001、カイ2乗検定)、GLY遺伝子とSOY遺伝子とのオーバーラップはわずか14%であった(図3)。図3からは、網羅的発現プロフィールは、標準ダイズタンパク質と比較して多数の遺伝子がグリセオリンによって変化したことは明らかである。例えば、FC>1.5およびANOVA P<0.05の遺伝子(名称付き)計139のうち、標準ダイズタンパク質群(44例)と比較してグリセオリン群(111例)では多数に変化がみられ(P<0.001、カイ2乗検定)、グリセオリン遺伝子と標準ダイズタンパク質とのオーバーラップはわずか14%であった。管理された(Supervised)階層的クラスタ分析からは、C/LおよびSOY(GLYおよびSOYではなく)は最も密接な関係がある群であり、FC>1.5で有意に変化した遺伝子ではユークリッド距離は〜11であることがわかった(図4)。図4は管理された階層的クラスタ分析を示しており、カゼイン/ラクトアルブミンおよび標準ダイズタンパク質(グリセオリンおよび標準ダイズタンパク質ではない)は最も密接な関係がある群であり、FC>1.5で有意に変化した遺伝子ではユークリッド距離は〜11であることがわかった。グリセオリンと標準ダイズタンパク質とのはっきりと異なるプロフィールの差も、FC>1.5で変化した遺伝子のPCAベクトルから質的に明白である。GLYとSOYとのはっきりと異なるプロフィールの差もFC>1.5で変化したPCAベクトル(図4)およびヒートマップ(図5)から質的に明白である。ANOVAおよび管理されたペアワイズ比較によるFC>1.5で有意に変化した全遺伝子の完全なリストを表9に示す。qRT−PCRによって評価した脂質および/または糖代謝、PPARおよびAMPKシグナリングおよび/またはアディポサイトカイン活性に関連する10遺伝子を表9に示す。これらの標的のうち、カゼイン/ラクトアルブミンと比較してグリセオリン群では10個のうち8個が上方制御され(いずれもP<0.05)、標準ダイズタンパク質とカゼイン/ラクトアルブミン群との間では10個のうちいずれも差がなかった。
経路分析
経路分析を用いて、古典的分類および機能的分類によって変化した遺伝子を分類した。GLY群の変化した遺伝子のIPAで最も過剰出現した古典的経路はいずれも脂質、糖質および/またはエネルギー代謝に関係した。これらの経路には、KEGG経路分析により、グリセロリン脂質およびグリセロ脂質代謝、チトクロムp450代謝、およびAMPKシグナル伝達(いずれもP<0.01)(表8を参照。GLYおよび標準的タンパク質食餌によって有意に変化した遺伝子を示す(脂質、グルコースおよびエネルギー代謝に関連する)を含んだ。遺伝子プローブからのKEGG経路分析によって経路を同定した(この経路ではFC>1.5、P<0.05および>2の遺伝子が変化した。zスコアが有意(>2)な経路のみを示す)。注目すべき経路には、グリセロ脂質代謝、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)シグナル伝達およびチトクロムp450代謝が含まれる。SOY群では、zスコアが有意な経路または関連する経路の過剰出現はみられなかった。GLY遺伝子のIPAに最も過剰出現した機能的経路は、脂質代謝、低分子生化学および糖代謝であった(いずれもP<0.05)。脂質代謝の最も有意なサブカテゴリーはトリアシルグリセロール生合成であった(−log10(P値)=6.9)。KEGG経路分析についても同様のパターンがみられ、脂質、グルコースおよびエネルギー代謝(表8)に関連するGLY群の変化した遺伝子が有意に過剰出現(zスコア>2)することが明らかとなった。本明細書で注目すべき経路には、グリセロ脂質代謝、ペルオキシソーム
増殖因子活性化受容体(PPAR)シグナル伝達およびチトクロムp450代謝が含まれた。
遺伝子発現の定量
上記知見をさらに検証するために、脂質および/または糖代謝、PPARおよびAMPKシグナル伝達、および/またはアディポサイトカイン活性に関連する10個の遺伝子標的をqRT−PCRによって評価した。C/Lと比較してGLY群では、評価した16の標的のうち9個が上方制御されたが(いずれもP<0.05)、SOY群とC/L群との間には16個の標的に差はなかった(表9を参照。qRT−PCRによる定量では、食餌タンパク質が乳腺脂肪組織内の脂質およびグルコース代謝、PPARシグナル伝達およびアディポサイトカイン活性に関連する選択的遺伝子の相対的発現に作用することを示す。)。GLY群で増加した標的には、アディポサイトカインシグナル伝達(アディポネクチンおよびレプチン)、糖代謝(グリセロール−3−リン酸脱水酵素およびグリコーゲン合成酵素)、PPARシグナル伝達(PPARγおよびリピン1)および脂質代謝(リポタンパク質リパーゼおよびペリリピン)の遺伝子が含まれた。これらのカテゴリー間では相当なクロストークが生じ、ひいては特定の分子が多様な経路で機能し得ることは注目すべきである。
血清マーカー
ベースライン時には血清脂質測定に有意な差はなかった(ANOVA、いずれもP>0.05)。治療後、GLY群では、C/L群およびSOY群と比較してTCおよびLDL+VLDLは低く(いずれもP<0.01)、C/L群と比較してTGは高かった(P=0.008)(表10を参照。血清脂質、血管、骨代謝回転および代謝マーカーに対する治療効果を示す)。SOY群でも、C/L群と比較してTGは高かった(P=0.02)。HDLまたはTC/HDL比に有意な群間差は認められなかった。ベースライン時または治療後に、血清MCP−1,ET−1,XLAPSまたは代謝マーカーに群間差はみられなかった(いずれもANOVA P>0.05)。
イトカインシグナル伝達、リポタンパク質リパーゼおよびトリグリセリド代謝など)にGLYの作用が主に関連した。GLY食餌もC/L食餌と比較して血清総コレステロール(具体的には非高密度リポタンパク質コレステロール)を低下させた。これらの予備的知見からは、グリセオリンに富んだダイズタンパク質には標準ダイズとは異なる、脂肪細胞活性および栄養素代謝に関連する作用があることが示唆される。
溶液
200mLの水、300μLの1M CaCl2、300μLの1.2M MgS04、300μLの1M KH2P04、3mLの0.14M KCl、1.2M NaHCO3中の6mLの1M HEPES、および15mLの2.6M NaClを用いてKrebs−Ringers−Hepes(KRH)緩衝液を調製した。pHを7.4に調製し、H2Oを添加して最終量を300mLにした。得られた溶液を0.22μmフィルタにより滅菌した。180.16mgのD−glucoseを10mLのH20に溶解することによってDグルコース(分子量=180.16)原液(100mM)を調製した。
溶液G(10nM)を得、100μLの溶液Fを900μLのKRH緩衝液に加えることによって溶液Fを希釈して溶液H(3nM)を得、100μLの溶液Gを900μLのKRH緩衝液に加えることによって溶液Gを希釈して溶液I(1nM)を得、100μLの溶液Hを900μLのKRH緩衝液に加えることによって溶液Hを希釈して溶液J(0.3nM)を得た。100μLの各濃縮物を各ウェルに加えて、各ウェルの最終量を1000μL(細胞への添加時に1:10で希釈)とした。
マウス3T3−L1細胞の細胞培養および分化は、脂肪細胞分化、グルコース取り込みおよびインスリン作用の研究にとって広く容認されているモデルである。適したホルモンカクテルによって刺激した場合に、これらの細胞は、大きな脂質液滴蓄積による分化発現のプログラムを施行する。初代脂肪細胞と同様に、脂肪細胞はマーカー(例えば、レプチンおよびアディポネクチン)を発現し、Glut4を発現し、グルコース取り込みを増大させることによってインスリン刺激に応答する。このような試験では、凍結前駆脂肪細胞はZenbio社(ノースカロライナ州Research Triangle Park所在)から購入した。凍結前駆脂肪細胞を37℃で解凍し、Zenbio社の前駆脂肪細胞培養液で希釈し、集密になるまで95%空気および5%C02を含んだ湿気のある環境下にて24ウェルプレートで37℃でインキュベートした。さらに2日インキュベートすることによって集密に由来するシグナルを認めた。前駆脂肪細胞培地をZenbio社の分化培地と交換し細胞をさらに3日間インキュベートした。細胞の95%超が大きな脂質液滴に満たされたとき、この培地をZenbio社の脂肪細胞維持培地と約2週間交換した。
グルコース刺激およびグリセオリンインキュベーション
KRH1mLで洗浄後、Zenbio社の脂肪細胞維持培地にて、1mlのKrebs−Ringerバッファー中37℃で各図面に示した種々の時間インキュベートすることによって、細胞を血清、インスリンおよびグルコースの飢餓状態にした後、完全に分化した3T3−L1脂肪細胞を用いてグルコース取り込み試験を行った。翌日、細胞をKRH緩衝液で1回洗浄し、図7および8のチャレンジマップに従ってKRH、インスリンおよ
び/またはグリセオリン溶液をウェル1〜24に加えた。細胞をインキュベートし、KRB中37℃で種々の濃度のグリセオリン、インスリンまたはその両方に30分間または45分間(グリセオリン単独)曝露した後、Dグルコース中10μLの[3H]2−デオキシグルコースを添加した。次に、各プレートを37℃の水浴で10分間インキュベートし、氷上に設置した。上を覆っている培地を除去し、1mLの氷冷KRH緩衝液と交換し、新しい氷冷KRH緩衝液で2回各ウェルを洗浄した。KRH緩衝液を除去し、500μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを加えた後、1mLピペットを用いて目に見える細胞すべてを各ウェルの底から洗い落とした(移動した)。各ウェルから、450μLを集めてアッセイに供し、液体シンチレーションカウンターで[3H]を測定した。データをCPM/ウェルとして表した。インスリンとのインキュベーション前に細胞を血清飢餓状態にしない同様の試験を行った。このデータを図9に示しており、インスリン媒介性グルコース取り込みが比較的小さく増加したことを反映している。例えば図10に示すように、維持培地をKRHと交換することによりZenBio社の脂肪細胞維持培地(高濃度のグルコースおよび有意なレベル濃度のインスリンを含む)の細胞を24時間飢餓状態にすることによって、インスリン媒介性グルコース取り込みは大幅に増加した(図9と比較して感受性は約10倍増大し、最大インスリン媒介性グルコース取り込みは約5倍改善した)。図9と図10を比較すると、ZenBio社の脂肪細胞維持培地をグルコースもインスリンも含まないKRH緩衝液と交換したところ細胞のインスリン応答性は改善したことは明らかである。図11は図10と同じ試験からの別のインスリン用量応答曲線を示しているが、迅速なピペット操作(rapid pipetting technique)を用いている。これらのデータから、この細胞株ではインスリン抵抗性を生じさせる可能性があることがわかる。また、データからはPark,S.らが「Glyceollins,One of the Phytoalexins Derived from Soybeans under Fungal Stress, Enhance Insulin Sensitivity and Exert Insulinotropic Actions」(J.Agric.Food Chem.2010;58(3):1551−1557)で示唆しているように、グリセオリンはインスリン感受性を変化させないことが明らかである。
KRH単独またはグリセオリン併用KRHとのプレインキュベーション
実施例11の試験を広げ、24時間血清飢餓中に存在するグリセオリンが無視できないほどの効果を生じるか否かを検証するために、維持培地をKRH単独または5μΜのグリセオリンを補充したKRHと交換することによって細胞を血清飢餓状態にした。この血清飢餓プロトコルに従って、KRB中の0.3nMのインスリン(きわめて低用量)に37℃で30分間細胞を曝露した後、Dグルコース中の10μLの[3H]2−デオキシグルコースを添加した。グルコース取り込みを上記のように試験した。図12に示すように、グリセオリンとのプレインキュベーションなしの場合、5μΜのグリセオリン単独では0.3nMのインスリンが刺激した以上にグルコース取り込みが刺激された(柱2および3を比較されたい)。インスリン不存在下ではグリセオリンはグルコース取り込み刺激しないことが示唆されているため、この結果は驚くべきものである。ピペット操作技術を用いて、24時間血清飢餓状態なしでこの試験を繰り返し、その結果を図13に示す。Parkらの結果は、図13の柱5および6の比較により示す結果を反映するものであり、5uMのグリセオリンの添加によりグルコース取り込みが増強されたことから(図13、柱5)インスリン感受性が増大したものと考えられた。しかし、図13の柱3は、5μΜのグリセオリンが0.3nMのインスリン単独(柱2を参照)よりも一層大きくグルコース取り込みを刺激することも示している。
果を発揮するには少なくとも16〜24時間必要であり、図13の柱5−8(無血清培地を使用)のプレインキュベーション条件はこの仮説を検討するために設計されている。しかし、図13の柱2および4の比較は、24時間血清飢餓状態にし、インスリン(柱2)またはインスリン併用グリセオリン(柱4)で30分間刺激した細胞のデータを示しており、グリセオリンはプレインキュベーションなしで、グルコース取り込みの刺激に明らかに有効であるという驚くべき知見を明らかにしている。
KRH単独またはグリシノール併用KRHとのプレインキュベーション
24時間血清飢餓中に存在するグリシノール(グリセオリンの代わり)が無視できないほどの効果を生じるか否かを検証するために、維持培地をKRH単独または5μΜのグリシノールを補充したKRHに交換することによって細胞を24時間血清飢餓状態にし、この試験は実施例12に記載したのとは別法で行った。グリシノールはグリセオリンよりも非常に強力なエストロゲンアゴニストであり、Parkらは選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)としてグリセオリンを同定し、グリセオリンにはエストロゲンアゴニスト作用によりグルコース取り込みを増強する可能性があることを提唱している。しかし、図14に示すように、グリシノールはグルコース取り込みを刺激する効果がなく、実際にはグルコース取り込みを阻害することもある(柱1および8を比較されたい)。このデータからはエストロゲンが媒介する経路はグルコース取り込みの刺激に関与していないことが示唆される。
種々のグリセオリンによるプレインキュベーション
グリセオリン混合物(先の実施例で使用)と同混合物を構成する個々のグリセオリン(I、IIおよびIII)とを比較するために、グリセオリン混合物(グリセオリンI、IIおよびIII)、グリセオリンI、グリセオリンIIまたはグリセオリンIIIのいずれかで細胞を24時間プレインキュベートした。図15に示すように、各グリセオリンはインスリン媒介性グルコース取り込みを増強するのに有効であり、グリセオリンIおよびIIIはグリセオリンIIよりも有効であると考えられる。図16のデータからこの知見が裏付けられ、3種のグリセオリンいずれもがインスリン媒介性グルコース取り込みを増強することは明らかである。図16に示した試験では、KRH(血清飢餓)により24時間プレインキュベートした3T3−L1分化脂肪細胞をインスリン存在下で5μΜのグリセオリン混合物または個々のグリセオリンに、またはインスリンの不存在下でグリシノールに30分間曝露した。図16柱は以下の通りである:1)DMSO対照;2)KRH対照;3)グリセオリン混合物(5μΜ);4)グリセオリンI(5μΜ);5)グリセオリンII(5μΜ);6)グリセオリンIII(5μΜ);7)グリシノール(1μΜ);8)グリシノール(0.1μΜ)。グリセオリンIはグリセオリンIIおよびIIIよりもグルコース取り込みを刺激すると考えられる。このグリセオリン混合物は約75%のグリセオリンIを含んでいるため、精製したグリセオリンIよりも活性が弱いと考えられる。柱7および8からは、先に示したように、グリシノールはグリセオリンと同じ生物活性を示さないことが示唆される。最後に、柱1からはDMSOビヒクルにはグルコース取り込みに及ぼす影響が全くないことがわかる。
グリセオリンIおよびIIIはインスリン不存在下でグルコース取り込みを刺激する
細胞をKRHで24時間プレインキュベート(血清飢餓)し、次いでインスリンの存在下または不存在下でグリセオリンIまたはグリセオリンIIIに曝露した。図17のデータからは、グリセオリンIおよびIIIはいずれもインスリン不存在下でグルコース取り込みを刺激することができるが、グルコース取り込みはインスリン添加後にさらに増強されることがわかる。図17の各柱は次の通りである:1)DMSO対照;2)0.3nM
インスリン;3)グリセオリンI(5μΜ);4)0.3nMインスリン+グリセオリンI(1μΜ);5)0.3nMインスリン+グリセオリンI(5μΜ);6)グリセオリンIII(5μΜ);7)グリセオリンI(1μΜ);8)0.3nMインスリン+グリセオリンIII(5μΜ)。p<0.05の互いに異なる柱には異なる上付き文字を付けている。
非常に低用量のインスリンに対する3T3−L1分化脂肪細胞の反応
低濃度のインスリンを用いて実施例11に記載の実験を繰り返した。図18の用量反応曲線は、3T3−L1分化脂肪細胞のグルコース取り込みに対する非常に低い用量のインスリン濃度の影響を示す。
グリセオリン混合物を用いた19時間プリインキュベーション後のグルコース取り込み
3T3−L1分化脂肪細胞を指示された濃度でKRHまたはグリセオリン混合物(グリセオリンI、IIおよびIII)と19時間プレインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、指示された濃度でインスリンを負荷し、その結果を図19に示す。柱2は0.2nMのインスリン単独によるグルコース取り込みの刺激を示している(1と2の柱を比較されたい)。柱3,4および5からグルコース取り込みをさらに刺激するには5μΜのグリセオリンが必要である(すなわち、0.5および1.0μΜのグリセオリン濃度では不十分である)ことが示唆される。柱6は最大インスリン用量(1nM)を示し、柱8はグリセオリン(5μΜ)とのプレインキュベーションによってグルコース取り込みはさらに一層増強されることを示している。グリセオリンが高用量のインスリン以上にグルコース取り込みを刺激することができることは知られていないので、このようなデータは驚くべきものである。これらのデータはまた、グリセオリンはインスリン感受性を増強するのではなく、インスリン非依存性の機序を介してグルコース取り込みを刺激することも示唆している。この試験を3時間だけ(19時間の代わりに)プレインキュベーションすることにより繰り返したところ、そのデータからはインスリン単独で得られた値よりも高い値までグルコース取り込みを刺激するのにグリセオリン混合物との3時間のプレインキュベーションで十分であることがわかる(図20)。
グリセオリン混合物とのプレインキュベーション45分後のグルコース取り込み
3T3−L1分化脂肪細胞を対照としてKRHに45分間(図21の「o」を参照)または5μΜのグリセオリン混合物(図21の「●」を参照)のいずれかに曝露し、種々の用量のインスリンを負荷して上記の用量反応曲線を得た(例えば実施例11を参照)。その結果を図21に示す。上記の血清飢餓試験とは異なり、この試験には24時間の血清除去を含まなかった。これはインスリン無反応系(insulin−insensitive system)を作ってグリセオリンがインスリン感受性を増大させるか否かを確かめることが目的であった。白丸に示しているように、一晩の培地交換(medium switch)(24時間血清飢餓;図18参照)後の用量反応曲線と比較して、細胞をKRHとプレインキュベートしたときに観察された反応は非常に鈍く、インスリン無反応性である。グリセオリンがインスリン感受性を増大させると、一般に想定されるように図21のインスリン用量反応曲線は左に移動するはずであるが、そうはならなかった。すなわち、どのインスリン負荷レベルでもグルコース取り込みは有意に増大した。このことから、グリセオリンはインスリンに依存しない機序を介してグルコース取り込みを刺激するはずであることが示唆される。インスリン媒介性グルコース取り込みGLUT4トランスポーターによって媒介され、これら細胞はGLUT1トランスポーター(これが基礎的グルコース取り込みを担っていると考えられている)を有していることから、グリセオリンはGLUT4を変化させることによってインスリン感受性を増大させるのではなく、GLU
T1を介して基礎的(basal)グルコース取り込みを増大させている可能性が高いと考えられる。
先に示したように、3T3−L1分化脂肪細胞をKRH中で24時間プレインキュベート(血清飢餓)してグルコースおよびインスリンから細胞を飢餓させた。これによって非常に高感度のグルコース取り込み試験が行える。次に細胞を種々の濃度のグリセオリン混合物と45分間インキュベートし、洗浄し、続いてKRH中でさらに30分間インキュベートした。図22に示すように、グリセオリン混合物単独でグルコースの基礎的取り込みをインスリン非依存的に刺激する。
Claims (20)
- 動物において、アディポサイトカインシグナル伝達、糖代謝、脂肪酸代謝、アラキドン酸代謝、PPARシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、脂質代謝、細胞外マトリックス(ECM)−受容体相互作用またはそれらの組み合わせに関連する遺伝子の発現を調節する、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、グリセオリンI、グリセオリンII、グリセオリンIIIまたはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、約100nM〜約50μΜの量で提供される、請求項2に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、動物1匹あたり約1mg/kg/〜動物1匹あたり約100mg/kgの量で提供される、請求項2に記載の組成物。
- 前記遺伝子が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され、且つ、ADIPOQ;DGAT2;GPDl;GYS1;LEP;LPIN1;LPL;PLIN;PPARG;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記遺伝子が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して上方制御され、且つ、ACACB;ACAT1;ACOXl;AGPAT2;AHSG;AKT1;AKT2;CAP1;CD36;CEBPB;CRK;DBI;EIF2B1;EIF4EBP1;FBP1;FOS;GPDl;GPAM;HADH;HRAS1;ITGA7;LPL;MAP2K1;ORM1;PLIN;PRKAR2B;PTGDS;PTPN1;PTPN11;SORBS1;SREBF1;VEGFA;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記遺伝子が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む前記組成物を投与されていない動物と比較して下方制御され、且つ、AEBP1;ARAF;CBL;CEBPA;CEBPD;CSN2;DOK2;DOK3;EIF4E;FRS3;G6PC;GCG;GCK;GPD2;GRB10;GRB2;GSK3B;IGF2;INS1;ITGA2;ITGA8;LDLR;NCK2;NOS2;NPY;OLR1;PHIP;PIK3CA;PIK3R2;PPP1CA;PRKCI;PTPRF;RETN;SDC1;SHC3;SLC27A4;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項4に記載の組成物。
- 少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を必要とする動物において、高脂血症、肥満症、過剰コレステロール、心血管疾患、肝疾患、糖尿病またはそれらの組み合わせを治療するための少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、且つ、グリセオリンI、グリセオリンII、グリセオリンIIIまたはそれらの組み合わせである、請求項8に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、約100nM〜約50μΜの量で提供される、請求項9に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、動物1匹あたり約1mg/kg/〜動物1匹あたり約100mg/kgの量で提供される、請求項9に記載の組成物。
- 糖尿病を治療するために、前記組成物が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ADIPOQ;DGAT2;GPD1;GYS1;LEP;LPIN1;LPL;PLIN;PPARG;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を増加させる、請求項11に記載の組成物。
- 糖尿病を治療するために、前記組成物が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、前記動物において、総コレステロール(TC)を低下させ、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールおよび超低密度リポタンパク質(VLDL)コレステロールを低下させ、トリグリセリド(TG)を増加させ、またはそれらの組み合わせをなす、請求項11に記載の組成物。
- 肥満症を治療するために、前記組成物が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、ACACB;ACAT1;ACOX1;AGPAT2;AHSG;AKT1;AKT2;CAP1;CD36;CEBPB;CRK;DBI;EIF2B1;EIF4EBP1;FBP1;FOS;GPD1;GPAM;HADH;HRASl;ITGA7;LPL;MAP2K1;ORM1;PLIN;PRKAR2B;PTGDS;PTPN1;PTPN11;SORBS1;SREBF1;VEGFA;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を増加させる、請求項11に記載の組成物。
- 肥満症を治療するために、前記組成物が、少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を投与されていない動物と比較して、AEBP1;ARAF;CBL;CEBPA;CEBPD;CSN2;DOK2;DOK3;EIF4E;FRS3;G6PC;GCG;GCK;GPD2;GRB10;GRB2;GSK3B;IGF2;INSl;ITGA2;ITGA8;LDLR;NCK2;NOS2;NPY;PHIP;PIK3CA;PIK3R2;PPP1CA;PTPRF;RETN;SDC1;SHC3;SLC27A4;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の前記動物における発現を減少させる、請求項に11記載の組成物。
- 少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物を必要とする動物において、グルコース取り込みを刺激する少なくとも1つの単離されたグリセオリンを含む組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、誘発されたダイズから単離され、且つ、グリセオリンI、グリセオリンII、グリセオリンIII、またはそれらの組み合わせである、請求項16に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、約100nM〜約50μΜの量で提供される請求項17に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの単離されたグリセオリンが、動物1匹あたり約1mg/kg〜動物1匹あたり約100mg/kgの量で提供される、請求項17に記載の組成物。
- 前記組成物がインスリンをさらに含むか、またはインスリンを必要とする動物においてグルコース取り込みを刺激するインスリンを含むさらなる組成物も提供される、請求項19に記載の組成物。
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