WO1997029198A1 - Thrombinmuteine als antidot für thrombininhibitoren - Google Patents

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WO1997029198A1
WO1997029198A1 PCT/EP1997/000612 EP9700612W WO9729198A1 WO 1997029198 A1 WO1997029198 A1 WO 1997029198A1 EP 9700612 W EP9700612 W EP 9700612W WO 9729198 A1 WO9729198 A1 WO 9729198A1
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thrombin
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gly
ala
muteins
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PCT/EP1997/000612
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Martin Raditsch
Thomas Friedrich
Claus Bollschweiler
Martin Schmidt
Hans Wolfgang HÖFFKEN
Jürgen Schweden
Klaus Rübsamen
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Thrombin muteins as an antidote for thrombin inhibitors
  • the present invention relates to new thrombin muteins, their preparation and their use as an antidote for thrombin inhibitors.
  • Anticoagulants which act on the principle of direct thrombin inhibition are becoming increasingly important for antithrombotic therapy.
  • An imperative prerequisite for the broad use of anticoagulants is the possibility of neutralizing the effect in the event of overdoses, in the event of impaired breakdown or slow excretion, in order to avoid the then threatening hemorrhagic side effects, such as bleeding in the area of the peritoneum , the pericardium, the pleura.
  • highly effective antidotes are available for heparin with protamine sulfate, polylysine and platelet factor 4
  • there is currently no antidote suitable for use in humans for neutralizing thrombin inhibitors there is currently no antidote suitable for use in humans for neutralizing thrombin inhibitors.
  • Markwardt Thrombosis Research, Voi 74, No 1, ppl-23, 1994
  • thrombines thrombin derivatives. Examples of these are thrombin, thrombin-2-macroglobulin complexes and meizothrombin.
  • chemically inactivated thrombines such as, for. B. DFP thrombin or benzoyl thrombin for the neutralization of hirudin (Markwardt, Pharmazie 1989; 44; 648-649).
  • a genetically engineered, enzymatically inactive thrombin is described by Lentz (Lentz et al, JBC; Voi 266, No 15, pp 9598-9604).
  • Lentz Lentz et al, JBC; Voi 266, No 15, pp 9598-9604
  • the replacement of the serine residue at position 205 (position 525 in SEQ ID NO: 14) required for catalysis with alanine leads to an enzymatically inactive thrombin variant which has no cleavage activity towards synthetic substrates and the natural substrate fibrinogen has (Lentz et al, JBC Voi 266, No. 15, page 9598-9604), but has a lower binding affinity to the thrombin inhibitor dansylarginin-N- (3-ethyl-l, 5-pentanediyl) amide. 5
  • thrombin muteins are not suitable as antidotes for thrombin inhibitors, since they either have too little affinity for the thrombin inhibitor or they have too high a binding and enzymatic activity with regard to fibrinogesn.
  • the object was therefore to provide new thrombin muteins which are largely inactive enzymatically, have good binding of the thrombin inhibitor and at the same time bind the natural substrate fibrionogen with less affinity than the unmodified thrombin.
  • the invention relates to thrombin muteins which have the following sequence differences compared to natural thrombin 5 (a) Exchange of a Gly for Ala, the Gly being in the sequence environment Tyr-Gly-Phe and having the position 558 in natural human prothrombin (SEQ ID NO: 14);
  • the new thrombin muteins can be prepared starting from known natural thrombins, such as human thrombin, and other mammals, for example primates, cattle, pigs, dogs, cats, mice, rats.
  • Natural thrombin is to be understood as a polypeptide sequence which has thrombin activity and occurs naturally in an organism.
  • Thrombin muteins are not only to be understood as disulfide-bridged two-chain molecules (A and B chain), but also one-chain form molecules such as prethrombin or proteins that are only made up of the B chain or parts of the B chain, preferably from N and / or C-terminally shortened B chains. It is crucial for the thrombin muteins according to the invention that the effectiveness with regard to thrombin inhibitor binding is present.
  • the thrombin muteins according to the invention can also be prepared starting from known proteolysis products of thrombin, for example ⁇ -thrombin, ⁇ -thrombin, ⁇ -thrombin or else precursors of thrombin such as prothrombin, prothrombin intermediates or also meizothrombines, which then, if appropriate, by suitable cleavage methods can be converted into the active thrombin molecules, for example by means of factor Xa, fractions of the snake venom from Echis carinatus or also Oxyranus scutellatus.
  • the thrombin muteins according to the invention are suitable for neutralizing hirudin, hirudin derivatives or other thrombin inhibitors. Genetic engineering is preferred in which a corresponding gene for the thrombin mutein is produced and this gene is expressed in a suitable host organism.
  • the novel thrombin muteins have to natural thrombin least two differences in sequence, the first differences d replacement of a glycine residue to an alanine residue.
  • the position of the exchange depends on the origin of the natural starting thrombin. However, it is the glycine position which is in the sequence environment Tyr-Gly-Phe and which has the position 558 in natural human prothrombin (SEQ ID NO: 14).
  • the second sequence difference is either an exchange or a deletion of an amino acid residue at one of the three positions (His, Asp, Ser) that form the catalytic triad of the protease thrombin.
  • these positions are positions 363 for His, 419 for Asp and 525 for Ser.
  • these positions can be shifted somewhat depending on the total length of the molecule.
  • the sequence environment i.e. however, the amino acid residues before and after the corresponding amino acid are preserved in the thrombine, and it is therefore easily possible to determine the exact position of the corresponding amino acid residue using the sequence environment.
  • the thrombin muteins according to the invention can also have several changes (deletions or substitutions) on the catalytic triad. Thrombin muteins which have a single change in the catalytic triad are preferred.
  • Preferred changes are those in which the amino acids of the catalytic triad have been substituted.
  • Preferred substitutions for the histidine residue are those with polar or hydrophobic amino acids, in particular with Phe, Tyr, Ala or Val.
  • the aspartate residue is preferably substituted with other polar amino acids, for example gin or Asn.
  • Thrombin muteins in which the serine residue is changed are particularly preferred, in particular substitutions of the serine by amino acids which have no hydroxyl function, in particular those which have a space filling similar to that of Ser. Substitution Ser to Ala is particularly preferred.
  • the effectiveness of the thrombin muteins can be further improved by introducing further changes to the molecule.
  • the proteolytic stability continues is improved, for example to allow a longer duration of action in vivo.
  • the basic residues Arg 393, Lys 465, Arg 390 or Arg 382 can be exchanged for another non-basic amino acid.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences, in particular DNA sequences, which code for the thrombin proteins described. These can easily be determined by back-translating the polypeptide sequence into the corresponding DNA sequence according to the genetic code. Those codons which lead to a good expression in the desired host organism are preferably used.
  • the nucleic acid sequence can be produced either from the natural thrombin sequence by site-specific mutagenesis or else fully synthetically by DNA synthesis.
  • the thrombin muteins according to the invention are particularly suitable as an antidote for thrombin inhibitors such as hirudins, hirudin derivatives and low-molecular thrombin inhibitors.
  • Hirudinen is shown both in animal experiments and in humans.
  • hirudins there are also numerous hirudin muteins and isohirudins that have sequence changes compared to natural hirudin.
  • hirudins are therefore also to be understood as those hududins which carry one or more sequence changes with respect to the hirudin from Hirudo medicinalis and which have at least an equally high affinity for thrombin.
  • Hirudins are easily accessible using genetic engineering methods. Their half-life in humans is about 45 minutes.
  • hirudin in which the pharmacokinetics of hirudin have been modified by chemical modification are also known. Markwardt describes conjugates from dextran and hirudin with a longer duration of action. Long-acting polymer conjugates are known from EP 345616, EP 502962 and EP 557199. WO 9515183 describes long-acting hydrophobic hirudin derivatives. Depot forms and long-acting hirudin dimers (WO 9504823) are also known. Other thrombin inhibitors are low molecular weight Thrombin inhibitors, which are known for example from EP 236164, DE 2801478, EP 293881 or EP 185390.
  • thrombin inhibitors are recombinantly produced desulfato hirudins, hirudin muteins, polymer-modified hirudins such as. B. dextran-hirudins, PEG-hirudins, hydrophobically derivatized hirudins and hirudin muteins with an extended duration of action.
  • the new thrombins can be used to antagonize hirudisins, shortened hirudins, and hirudin analogs derived from hirudin and its partial sequences, e.g. Hiruloge or C-terminal hirudin peptides.
  • Other peptide thrombin inhibitors which e.g. have been described from blood-sucking organisms and are used for therapy after genetic engineering, such as. B. Rhodniin; Infestine.
  • neutralizable thrombin inhibitors are also synthetic, preferably low molecular weight thrombin inhibitors, such as, for example, derivatives of the tripeptide D-Phe-Pro-Arg, NAPAP, boronic acid derivatives, arginals or benzamidine derivatives.
  • the thrombin muteins according to the invention neutralize the thrombin inhibitors better than the principles described hitherto for neutralizing thrombin inhibitors.
  • the thrombins according to the invention are safe to use even in the event of an overdose, and therefore enable rapid and effective neutralization of the thrombin inhibitors in emergency situations.
  • the thrombin muteins according to the invention are in one for parenteral administration, i.e. suitable form for subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. Intravenous administration is preferred. If appropriate, the thrombin muteins according to the invention can also be administered as a continuous infusion.
  • the amount of inactive thrombin to be administered is e.g. depending on the extent of the overdose, body weight and the chosen form of administration. The extent of the overdose can be determined by a person skilled in the art before or during the use of thrombin by means of suitable tests.
  • the thrombin muteins according to the invention can be produced with the aid of genetic engineering methods. Genetically engineered production of a precursor form of thrombin mutein (analogous to Prothrombin) from which the thrombin mutein is released by means of proteolytic activation.
  • Another preferred form of production, especially for thrombin muteins that only consist of the B chain, is the expression of the gene for the B chain modified according to the invention in microorganisms, preferably in bacteria such as E. coli.
  • the expression product obtained may have to be renatured using methods familiar to the person skilled in the art in order to obtain an effective thrombin mutein molecule.
  • it has also proven to be advantageous to replace the Cys residue which contributes to the S-S bridging in natural human thrombin with another amino acid residue, for example Ser or Ala.
  • Prothrombin was prepared according to the publication by Degen et al (Biochemistry, 1983, 22, p 2087 -. 97) defined from a human liver cDNA bank Loo.
  • the muteins according to the invention were produced by targeted mutagenesis in the thrombin part.
  • the codon GGC for the amino acid (As) glycine in position 558 (SEQ ID NO: 14) of the human prothrombin was mutated into the codon GCC for the As Ala by targeted mutagenesis.
  • the oligonucleotide SEQ ID NO: 5 in the direction of the gene and the complementary oligonucleotide SEQ ID NO: 6 in the opposite direction were synthesized with the corresponding nucleotide exchange.
  • the oligonucleotide SEQ ID NO: 1 was synthesized in the direction corresponding to the 5 'end of the prothrombin gene.
  • the sequence for the restriction site Eco R1 was additionally added to this at the 5 'end.
  • the oligonucleotide SEQ ID NO: 2 was synthesized in the opposite direction corresponding to the 3 'end of the thrombin gene, and the sequence for the restriction site Eco R1 was also added to it at the 5' end.
  • the codon AGT for the As Ser in position 525 (SEQ ID NO: 14) of the human prothrombin became the codon GCT for the As Ala and the codon GGC for the As Gly in position 558 (SEQ ID NO: 14) Codon GCC mutated for the As Ala.
  • a PCR was carried out on the basis of the prothrombin mutein DNA from Example 1 and the oligo SEQ ID NO: 3 with the corresponding nucleotide exchange for Ala at position 525 in the sense direction and the oligo SEQ ID NO: 2 (3'end prothrombin).
  • the test conditions corresponded to those from Example 1.
  • a second PCR was carried out with the oligo SEQ ID NO: 4 complementary to SEQ ID NO: 3 and the oligo SEQ ID NO: 1 (5'end prothrombin).
  • the DNA fragments obtained in this way were denatured, hybridized, filled into a double strand and then, according to example 1, a further PCR was carried out with the external oligos SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the prothombin mutein cDNA thus prepared was purified, cut with Eco Rl, cloned into the vector pUC 18 and sequenced as a control.
  • the codon AGT for the As His in position 363 (SEQ ID NO: 14) of the human prothrombin became the codon GCA for the As Ala and the codon GGC for the AS Gly in position 558 (SEQ ID NO: 14) Codon GCC mutated for the As Ala.
  • a PCR was carried out on the basis of the prothrombin mutein DNA from Example 1 and the oligo SEQ ID NO: 10 with the corresponding nucleotide exchange for the Ala at position 363 in the sense direction and the oligo SEQ ID NO: 2 (3'end prothrombin).
  • the test conditions corresponded to those from Example 1.
  • a second PCR was carried out with the oligo SEQ ID NO: 11 complementary to SEQ ID NO: 10 and the oligo SEQ ID NO: 1 (5'end prothrombin).
  • the DNA fragments obtained in this way were denatured, hybridized, filled in to form a double strand and then a further PCR was carried out in accordance with Example 1 using the external oligos SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the prothombin mutein cDNA thus prepared was purified, cut with Eco Rl, cloned into the vector pUC 18 and sequenced as a control.
  • the codon GAC for the As Asp in position 419 (SEQ ID NO: 14) of the human prothrombin became the codon GCA for the As Asn and the codon GGC for the AS Gly in position 558 (SEQ ID NO: 14) Codon GCC mutated for the As Ala.
  • a PCR was carried out on the basis of the prothrombin mutein DNA from Example 1 and the oligo SEQ ID NO: 12 with the corresponding nucleotide exchange for the Asn at position 419 and the oligo SEQ ID NO: 2 (3'end prothrombin).
  • the test conditions corresponded to those from Example 1.
  • a second PCR was carried out with the oligo SEQ ID NO: 13 complementary to SEQ ID NO: 12 and the oligo SEQ ID NO: 1 (5'end prothrombin).
  • the DNA fragments thus obtained were denatured, hybridized, filled in to a double strand and then correspondingly
  • Example 1 carried out a further PCR with the external oligos SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the prothrombin thus produced - mutein cDNA was purified, then cut with Eco RI, cloned into the vector pUC 18 an d to control sequenced.
  • the codon AGT for the As Ser in position 525 (SEQ ID NO: 14) of the human prothrombin was mutated to the codon GCT for the As Ala.
  • a PCR was carried out on the basis of the prothrombin DNA and the oligo SEQ ID NO: 3 with the corresponding nucleotide exchange for the Ala at position 525 in the sense as well as the oligo SEQ ID NO: 2 (3'end prothrombin).
  • a second PCR was carried out with the oligo SEQ ID NO: 4 complementary to SEQ ID NO: 3 and the oligo SEQ ID NO: 1 (5'end prothrombin).
  • the DNA fragments obtained in this way were denatured, hybridized, filled into a double strand and then a further PCR was carried out with the external oligos SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the prothombin mutein cDNA thus prepared was purified, cut with Eco Rl, cloned into the vector pUC 18 and sequenced as a control.
  • the secretion leader of the sequence of the human tPA gene was added to the 5 'ends of the mutated prothrombin cDNAs (see Example 1 to 5) (Pennica et al Nature 301, 214-221, 1983).
  • the tPA sector was created with the synthetic oligonucleotides SEQ ID NO: 9 (5 'end of the tPA leader and Eco RI site) and SEQ ID NO: 8 (3' end tPA leader, 5 'end prothrombin) - tion leader cDNA amplified on the basis of PCR.
  • the mutated prothrombin mutein fragments were amplified with the oligo SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 2, which are complementary to SEQ ID NO: 8.
  • the tPA leader fragments were added to the respective prothrombin mother fragments.
  • the batches were denatured, hybridized, filled up to the double strand and with a further PCR with the oligonucleotides SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 2 the respective tPA leader prothrombin mutein DNAs were produced. These were cut with Eco R1, cloned into pUC 18 and sequenced for control. 5
  • these DNAs were cut out of the pUC 18 vectors with Eco Rl, isolated and inserted into the Eco Rl cleavage site of the vector pc DNA3 neo (Invitrogen, San Diego, USA).
  • the transcription of the prothrombin cDNA in this vector is under the control of the strong cytomegalovirus promoter.
  • the selection for transfected cells is carried out via the neomycin resistance gene located in the plasmid, which only allows G 418-resistant colonies to grow.
  • the DNA of the expression vectors was transfected with lipofectamine (25 Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstrasse 5, 76334 Eggenstein, Germany; No. 530-8324SA) in mammalian cells.
  • the cells used were CHO-Kl (ATCC CCL 61); 293 (ATCC CRL 1573).
  • the cells were split, so that 20 to 100 10 cm petri dishes were sown from a well of a 6-well plate.
  • the recombinant cells were started by treatment with G418 (Gibco, 1200 ⁇ g / ml in medium).
  • the resistant colonies obtained were separated by the "cloning cylinder" method and, after growing up and reaching sufficient cell numbers, were examined for expression of the corresponding thrombin muteins.
  • the medium was aspirated from confluent cells and replaced by fresh, serum-free medium. After fixed times such as after 24 hours, 48 hours, the incubated cell culture supernatant was removed and tested for the presence of the prothrombin using the ELISA.
  • Some of the recombinant cells obtained were cloned in microtiter plates to increase expression by separation.
  • DMEM Gibco No. 11880-028
  • F12 Gibco No. 21765-029 mixture consists of equal parts by volume
  • the DMEM used for this purpose was free of phenol red.
  • harvested After two or three days there was a change of media (“harvest”) in order to harvest the cell culture supernatant containing prothrombin mutein. In this way it was possible to harvest up to 10 times from a culture vessel. Different harvests from different Different culture vessels were combined to achieve a volume acceptable for purification.
  • the serum-free cell culture supernatant was removed after a differently long culture period.
  • the prothrombin present in the cell culture supernatant was cleaved by means of snake venom (Sigma; Cat. No. V3129). Each approach was carried out as follows:
  • the cleavage batches were incubated for 45 minutes at room temperature.
  • the resulting thrombin was then characterized in various tests.
  • 0.1 ml / well streptavidin-peroxidase complex (B.M. 1089153); 1: 10,000 diluted in 0.1% BSA / 0.05% Tween 20 / PBS; 30 minutes / RT wash as above 0.1 ml / well peroxidase substrate Stop reaction with 0.1 ml / well 2 M H2S04 Measure the absorption at 450 nm peroxidase substrate: 0.1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO) and 10 Mix ml of substrate buffer (0.1 M Na acetate pH 4.9); then add 14.7 ⁇ l of 3% H202
  • Adjuvant (Sigma F5881) day 14 200 ⁇ g human thrombin in 0.5 ml PBS / incomplete Freund's
  • Adjuvant (Sigma F5506) day 28 200 ⁇ g human thrombin in 0.5 ml PBS / incomplete Freund's
  • Adjuvant day 42 200 ⁇ g human thrombin in 0.5 ml PBS
  • the polyclonal rabbit antibodies from the serum obtained were purified via protein A Sepharose (according to the manufacturer Pharmacia) with a yield of 65 mg IgG / 10 ml serum. Before biotinylation, the antibodies were dialyzed against 0.05 M NaHC03 pH 9.0 (2x 2 1), then addition of 200 ⁇ l Biotin-X-NHS ester (Calbiochem 203189; 1 mg / ml H20) per 600 ⁇ l antibody ( 2.4 mg / ml) and shake for 2 hours / RT. Finally, dialysis was performed 3 times against PBS. A sandwich ELISA was set up using the antibodies obtained:
  • biotinylated anti-thrombin AK 1 200, diluted in 1% BSA / PBS / 0.05% Tween 20; 2 hours / RT - wash as above
  • Figure 1 shows the absorption (OD) against the thrombin concentration.
  • Peroxidase substrate Mix 0.1 ml TMB solution (42 mM in DMSO) and 10 ml substrate buffer (0.1 M Na acetate pH 4.9); then add 14.7 ⁇ l of 3% H202.
  • biotinylated anti-thrombin antibody 1 200; diluted in 0.1% BSA / 0.05% Tween 20 / PBS; 2-4 hours / RT Wash like above
  • 10 peroxidase substrate Mix 0.1 ml TMB solution (42 mM TMB in DMSO) and 10 ml substrate buffer (0.1 M Na acetate pH 4.9); then add 14.7 ⁇ l 3% H 2 0 2 .
  • the activity of the thrombin muteins is determined by cleaving a tripeptide. The following pipetting scheme is used for this:
  • the batches are incubated at 37 ° C. for 10-15 minutes.
  • the absorption is then measured at a wavelength of 405 nM and the amount of thrombin is determined on the basis of a calibration curve between 0.01 and 1 U / ml.
  • 35 1 of the prothrombin-containing cell culture supernatant from the CHO cell culture is first concentrated to 400 ml by ultrafiltration at 4C (SPS 400 membrane, Fresenius, St. Wendel) and then diafiltered against 10 mM Tris pH 7.5 until the guide
  • the fractions containing prothrombin are identified by means of ELISA.
  • the prothrombin mutein elutes from 280 mM NaCl.
  • About 150-200 mg of protein are isolated from this column.
  • the thrombin-containing cleavage from Example 14 is then applied to a heparin-Sepharose column (14 cm ⁇ 1 cm, Pharmacia) at a flow rate of 38 cm / h. After washing the column with 20 ml of 20 mM Na phosphate, 0.1 M NaCl pH 7.5 0.01%
  • hirudin The antidote effect of the inactive recombinant thrombins on hirudin was demonstrated in a thrombin activity test.
  • hirudin The thrombin mutein to be tested; active thrombin and S-2238 incubated together.
  • the principle on which this test is based is the neutralization (or competition) of hirudin by the inactive thrombin to be tested, and the resulting higher activity of the active thrombin.
  • hirudin HL20 1.5 U / ml
  • 0.1% BSA in TBS pH 7.5 100 ⁇ l of thrombin mutein (prepared in Example 2) were preincubated for 5 minutes at room temperature.
  • 50 ⁇ l of active thrombin 0.5 U / ml
  • the reaction was started by adding 50 ⁇ l of S-2238 (1 mg / ml in H 2 0; Chromogenix, Mölndal; Sweden). The batches were incubated at 37 ° C. for 15 minutes. The absorption was then measured at a wavelength of 410 nm. Neutralization of the hirudin by the inactive thrombin mutein led to an increase in absorption (Fig. 2).
  • antithrombin activity was determined as described in Spanagel et al., Blood Coagulation Fibrinolysis, 1991, 2 :, 121-127.
  • Anticoagulant activity was determined using the Pathromtin system (Behring).
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  • MOLECULE TYPE cDNA to mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 6: GGAACACATG TGTGTAGAAG GCATATTTCC CATCCCGGTC 40 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 7:
  • MOLECULE TYPE cDNA to mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 11: CGGGTACAGG AGGCACACGG CGGCGGTGAG 30 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 12:
  • MOLECULE TYPE cDNA to mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 12: GAACCTGGAC CGGAACATTG CCCTGAT 27
  • MOLECULE TYPE cDNA to mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 13: ATCAGGGCAA TGTTCCGGTC CAGGTTC 27

Abstract

Thrombinmuteine, die gegenüber dem natürlichen Thrombin folgende Sequenzunterschiede aufweisen: (a) Austausch eines Gly nach Ala, wobei sich das Gly in der Sequenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 558 besitzt; (b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgenden Reste: (b1) His, das sich in der Sequenzumgebung Ala-His-Cys befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 363 besitzt; (b2) Asp, das sich in der Sequenzumgebung Arg-Asp-Ile befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 419 besitzt; (b3) Ser, das sich in der Seqenzumgebung Asp-Ser-Gly befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 525 besitzt; und deren Verwendung als Antidot.

Description

Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Thrombinmuteine, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Antidot für Thrombin¬ inhibitoren.
Antikoagulantien, die nach dem Prinzip der direkten Thrombinhem- mung wirken, gewinnen für eine antithrombotische Therapie zuneh¬ mend an Bedeutung. Eine zwingende Voraussetzung für eine breite Anwendung von Antikoagulantien ist die Möglichkeit, die Wirkung bei Überdosierungen, bei einem gestörten Abbau oder einer ver- langsamten Ausscheidung zu neutralisieren, um so die dann drohen¬ den hämorrhagischen Nebenwirkungen, wie z B. Blutungen im Bereich des Peritoneums, des Pericards, der Pleura zu unterbinden. Wäh¬ rend bei Heparin mit Protaminsulfat, Polylysin und Platelet Fac¬ tor 4 hochwirksame Antidote zu Verfügung stehen, fehlt derzeit ein für die Anwendung am Menschen geeignetes Antidot zur Neutra¬ lisierung von Thrombininhibitoren.
In der Literatur werden verschiedene Antidotprinzipien beschrie¬ ben. Fareed diskutiert aktivierte Plasmafraktionen wie z. B. Au- top1ex-Präparate oder FEIBA als Prinzip zur Neutralisierung von Hirudin: Sie sind jedoch wegen der thromboplastinähnlichen Aktivität für eine Neutralisierung ungeeignet. (Fareed, Fed Proc 1989; 3: A 328; Walenga Sem. Thromb. Hemost. 1989; 15: 316-333) .
Markwardt (Thrombosis Research, Voi 74, No 1, ppl-23, 1994) be¬ schreibt die Verwendung von Thrombinen und Thrombinderivaten. Beispiele hierfür sind -Thrombin, Thrombin-2-Macroglobulin- Kom¬ plexe und Meizothrombin. Beschrieben wird auch der der Einsatz von chemisch inaktivierten Thrombinen wie z. B. DFP-Thrombin oder Benzoyl-Thrombin für die Neutralisierung von Hirudin (Markwardt, Pharmazie 1989; 44; 648-649) .
Diese Präparate sind jedoch als Antidot für eine Anwendung am Menschen wegen der Gerinnungsaktivität und der bis zu 1000 fach geringeren Affinität zu Hirudin ungeignet: (F. Doyle in Methods Enzymol; Vol. 222, pp299 ff, Moriata in Methods Enzymol; Voi 80, pp 303 ff, Stone et al. Biochemistry; 1987, 26, 4617 - 4624, Markwardt, Pharmazie; 44, 1989, pp 648-649) .
Humanes Prothrombin ist bekannt und wird bei Friezner et al.
(Biochemistry, Voi 22, 1983, pp2087-2097) beschrieben. Die Amino¬ säuresequenz des humanen Prothrombins ist auch in SEQ ID NO: 14 angegeben. In der Literatur finden sich verschiedene Zählweisen für die humane Thrombinsequenz, weshalb im folgenden - wenn nicht anders angegeben - die Zählweise bzgl. SEQ ID NO:14 benützt wird.
5 Ein gentechnisch hergestelltes, enzymatisch inaktives Thrombin wird von Lentz (Lentz et al, JBC; Voi 266, No 15, pp 9598-9604) beschrieben. Hier führt der Austausch des für die Katalyse not¬ wendigen Serin Restes an Position 205 (Position 525 in SEQ ID NO:14) gegen Alanin zu einer enzymatisch inaktiven Thrombinva- ° riante, die keine Spaltungsaktivität gegenüber synthetischen Sub¬ straten und dem natürlichen Substrat Fibrinogen aufweist (Lentz et al, JBC Voi 266, Nr. 15, Seite 9598-9604), aber eine niedri¬ gere Bindungsaffinität gegenüber dem Thrombininhibitor Dansylar- ginin-N-(3-Ethyl-l,5-Pentanediyl)amid aufweist. 5
Aus Arbeiten von Stone et al. ( Biochemistry; Voi 30, 6392-6397) ist die natürliche Thrombinvariante Qick II bekannt. Quick II- Thrombin unterscheidet sich lediglich an der Position 238 (Posi¬ tion 558 in SEQ ID NO:14) vom natürlichen Thrombin. Hier ist der 0 im natürlichen Thrombin vorkommende Glycinrest 238 gegen den hy¬ drophoben Rest Valin mutiert. Dieser geringfügige Austausch in der Pl-Tasche des Enzyms führt zu einer deutlich reduzierten Spaltungsrate für Fibrinogen (2% der ursprünglichen Aktivität) und gleichzeitig zu einer drastischen Verminderung der Bindung 5 sowohl von niedermolekularen Substraten als auch von Hirudin. Stone zeigte, daß die Bindungskonstante dieses Muteines für Hirudin sich um mehr als einen Faktor 1000 verschlechtert hat und erklärt dieses Ergebnis sowohl mit einer sterischen Blockie¬ rung der Bindetasche als auch mit einer konformellen Reorganisa- ° tion der Umgebung des aktiven Zentrums.
Die bisher bekannten Thrombinmuteine sind als Antidot für Thrombininhibitoren nicht geeignet, da sie entweder eine zu ge¬ ringe Affinität zum Thrombininhibitor aufweisen oder eine zu hohe 5 Bindung und enzymatische Aktivität bezüglich Fibrinogesn besitzen.
Es bestand daher die Aufgabe, neue Thrombinmuteine bereitzustel¬ len, die enzymatisch weitgehend inaktiv sind, eine gute Bindung des Thrombininhibitors aufweisen und gleichzeitig das natürliche ° Substrat Fibrionogen mit geringerer Affinität binden als das unmodifiziertes Thrombin.
Gegenstand der Erfindung sind Thrombinmuteine, die gegenüber dem natürlichen Thrombin folgende Seguenzunterschiede aufweisen 5 (a) Austausch eines Gly nach Ala, wobei sich das Gly in der Se¬ quenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) die Position 558 besitzt;
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgenden Reste
(bl) His, das sich in der Sequenzumgebung Ala-His-Cys befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) die Position 363 besitzt;
(b2) Asp, das sich in der Sequenzumgebung Arg-Asp-Ile befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) die
Position 419 besitzt;
(b3) Ser, das sich in der Sequenzumgebung Asp-Ser- Gly befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) die
Position 525 besitzt;
Die neuen Thrombinmuteine können ausgehend von bekannten natürli¬ chen Thrombinen wie etwa Thrombin vom Menschen, und anderen Säu¬ gern, beispielsweise Primaten, Rind, Schwein, Hund, Katze, Maus, Ratte, hergestellt werden. Unter natürlichem Thrombin ist eine Polypeptidsequenz zu verstehen, die Thrombinaktivität besitzt und natürlicherweise in einem Organismus vorkommt.
Unter Thrombinmuteinen sind nicht nur disulfidverbrückte Zwei- Kettenmoleküle (A- und B-Kette) zu verstehen, sondern auch Ein- Kettenform-Moleküle wie Präthrombin oder Proteine, die nur aus der B-Kette oder Teilen der B-Kette, bevorzugt aus N-und/oder C-terminal verkürzten B-Ketten, bestehen. Entscheidend für die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine ist, daß die Wirksamkeit bzgl. Thrombininhibitor-Bindung vorhanden ist.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine können auch ausgehend von bekannten Proteolyseprodukten des Thrombin hergestellt werden, beispielsweise ß-Thrombin, γ-Thrombin, ω-Thrombin oder auch Vor¬ stufen des Thrombins wie Prothrombin, Prothrombin-Intermediate oder auch Meizothrombine,die dann ggf. durch geeignete Spaltungs- methoden beispielsweise mittels Faktor Xa, Fraktionen des Schlan¬ gengiftes aus Echis carinatus oder auch Oxyranus scutellatus in die aktiven Thrombinmoleküle überführt werden können.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine sind geeignet zur Neutrali- sierung von Hirudin, Hirudinderivaten oder anderen Thrombin¬ inhibitoren. Bevorzugt ist die gentechnische Herstellung, bei der ein entspre¬ chendes Gen für das Thrombinmutein hergestellt wird und dieses Gen in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert wird.
Die neuen Thrombinmuteine besitzen gegenüber natürlichem Thrombin mindestens zwei Sequenzunterschiede, wobei der erste Unterschied ein Austausch eines Glycinrestes zu einem Alaninrest ist. Die Po¬ sition des Austausches ist abhängig von Herkunft des natürlichen Ausgangsthrombins. Es handelt sich jedoch um die Glycinposition, die sich in der Sequenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und die im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 558 besitzt.
Der zweite Sequenzunterschied ist entweder ein Austausch oder eine Deletion eines Aminosäurerestes an einer der drei Positionen (His, Asp, Ser) , die die katalytische Triade der Protease Thrombin bilden. Diese Positionen sind beim natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) die Positionen 363 für His, 419 für Asp und 525 für Ser. Bei anderen nicht-humanen Thrombinen können diese Positionen abhängig von der Gesamtlänge des Moleküls etwas verschoben sein. Die Sequenzumgebung, d.h. die Aminosäurreste vor und nach der entsprechenden Aminosäure ist jedoch bei den Throm¬ binen konserviert und daher ist es leicht möglich, die genaue Po¬ sition des entsprechenden Aminosäurerestes anhand der Sequenzum- gebung festzulegen.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine können auch mehrere Verän¬ derungen (Deletionen oder Substitutionen) an der katalytischen Triade besitzen. Bevorzugt sind Thrombinmuteine, die eine ein- zige Veränderung an der katalytischen Triade aufweisen.
Bevorzugte Veränderungen sind solche bei denen Substitutionen der Aminosäuren der katalytischen Triade vorgenommen wurden. Bevor¬ zugte Substitutionen für den Histidinrest sind solche durch po- lare oder hydrophobe Aminosäuren, insbesondere durch Phe, Tyr, Ala oder Val. Der Aspartatrest wird bevorzugt durch andere polare Aminosäuren, beispielsweise Gin oder Asn substituiert.
Besonders bevorzugt sind Thrombinmuteine, bei denen der Serinrest verändert wird, insbesondere Substitutionen des Serins durch Ami¬ nosäuren, die keine Hydroxyfunktion besitzen, insbesondere sol¬ che, die eine ähnliche Raumerfüllung wie Ser besitzen. Ganz be¬ sonders wird die Substitution Ser nach Ala bevorzugt.
Die Thrombinmuteine können in ihrer Wirksamkeit weiter verbessert werden durch das Einbringen weiterer Veränderungen des Moleküls. So ist z.B. denkbar, daß die proteolytische Stabilität weiter verbessert wird, um beispielsweise eine längere Wirkdauer in vivo zu ermöglichen. Hier können beispielsweise die basischen Reste Arg 393, Lys 465, Arg 390 oder Arg 382 (SEQ ID NO:14) gegen eine andere nicht basische Aminosäure ausgetauscht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA Sequenzen, die für die beschriebenen Thrombinmu¬ teine codieren. Diese lassen sich leicht durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz in die entsprechende DNA-Sequenz gemäß dem genetischen Code ermitteln. Bevorzugt verwendet man solche Co- dons, die im gewünschten Wirtsorganismus zu einer guten Expres¬ sion führen.
Die Nukleinsäuresequenz können entweder ausgehend von der natür- liehen Thrombingensequenz durch ortsspezifische Mutagenese oder auch vollsynthetisch durch DNA-Synthese hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine eignen sich vor besonders als Antidot für Thrombininhibitoren wie Hirudine, Hirudinderivate und niedermolekulare Thrombininhibitorern.
Hirudine sind ursprünglich aus Blutegeln isolierte Proteine, be¬ stehend aus 65 Aminosäuren, die sich durch eine extrem hohe Affi¬ nität zum Thrombin (ki = 10~12 Mol/1) und hervorragende Selektivität für Thrombin auszeichnenen. Die Wirksamkeit von
Hirudinen ist sowohl im Tierexperiment als auch beim Menschen ge¬ zeigt. Neben den ursprünglich isolierten Hirudinen gibt es auch zahlreiche Hirudinmuteine und auch Isohirudine, die gegenüber dem natürlichen Hirudin Sequenzveränderungen aufweisen. Unter Hirudine sind daher neben den natürlichen Hirudinen auch solche Hirudine zu verstehen, die ein oder mehrere SequenzVeränderungen bezogen auf das Hirudin aus Hirudo medicinalis tragen und die mindestens eine gleichgroße Affinität zum Thrombin besitzen.
Hirudine sind leicht mit Hilfe von gentechnischen Methoden zug¬ änglich. Ihre Halbwertszeit beträgt beim Menschen etwa 45 Minu¬ ten.
Bekannt sind auch Derivate des Hirudins bei dem durch chemische Modifikation die Pharmakokinetik des Hirudins modifiziert wurde. Markwardt beschreibt Konjugate aus Dextran und Hirudin mit ver¬ längerter Wirkdauer. Aus EP 345616, EP 502962 und EP 557199 sind langwirksame Polymer-Konjugate bekannt. In WO 9515183 werden langwirksame hydrophobe Hirudin-Derivate beschrieben. Depot-For- men sowie langwirksame Hirudin-Dimere (WO 9504823) sind ebenfalls bekannt. Weitere Thrombininhibitoren sind niedermolekulare Thrombininhibitoren, die beispielsweise aus EP 236164, DE 2801478, EP 293881 oder EP 185390 bekannt sind.
Weitere Thrombininhibitoren sind rekombinant hergestellte Desul- fato-Hirudine, Hirudin-Muteine, Polymer-modifizierte Hirudine wie z. B. Dextran-Hirudine, PEG-Hirudine, hydrophob derivatisierte Hirudine sowie Hirudin-Muteine mit verlängerter Wirkdauer. Weiterhin können die neuen Thrombine eingesetzt werden zur Anta- gonisierung von Hirudisinen, verkürzten Hirudinen, sowie von Hirudin und dessen Teilsequenzen abgeleiteten Hirudin-Analogen wie z.B. Hiruloge oder C-terminalen Hirudinpeptiden. Neutrali¬ siert werden können auch andere peptidische Thrombininhibitoren, die z.B. aus blutsaugenden Organismen beschrieben wurden und nach gentechnischer Herstellung zur Therapie eingesetzt werden, wie z. B. Rhodniin; Infestin.
Beispiele für neutralisierbare Thrombininhibitoren sind auch syn¬ thetische, vorzugsweise niedermolekulareThrombininhibitoren, wie beispielsweise Derivate des Tripeptids D-Phe-Pro-Arg, NAPAP, Bo- ronsäurederivate, Arginale oder Benzamidinderivate.
Die erfindungsgemäße Verwendung als Antidot ist auf alle der vor¬ stehenden Thrombininhibitoren anwendbar.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine neutralisieren die Thrombininhibitoren besser als die bislang beschriebenen Prinzi¬ pien zur Neutralisierung von Thrombinibhibitoren. Die erfindungs- gemäßen Thrombine sind selbst bei einer Überdosierung sicher in der Anwendung, und ermöglichen daher in Notfallsituationen eine schnelle und wirkungsvolle Neutralisierung der Thrombin- inhibitoren.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine liegen in einer für eine parenterale Verabreichung, d.h. für die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung geeigneten Form vor. Die intrave- nöse Verabreichung ist bevorzugt. Gegebenfalls können die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine auch als Dauerinfusion verab¬ reicht werden. Die Menge des zu verabreichenden inaktiven Thrombins richtet sich z.B. nach dem Ausmaß der Überdosierung, dem Körpergewicht und der gewählten Verabreichungsform ab. Das Ausmaß derüberdosierung kann von einem Fachmann vor oder auch während der Thrombinanwendung durch geeignete Tests ermittelt werden.
Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine sind mit Hilfe von gentech- nischen Methoden herstellbar. Bevorzugt ist die gentechnische Herstellung einer Vorläuferform des Thrombinmuteins (analog zum Prothrombin) aus der das Thrombinmutein mittels proteolytischer Aktivierung freigesetzt wird.
Eine weitere bevorzugte Herstellungsform, vor allem für Thrombin- muteine, die nur aus der B-Kette bestehen, ist die Expression des Gens für die erfindungsgemäß veränderte B-Kette in Mikroorganis¬ men, bevorzugt in Bakterien wie E. coli.
Das erhaltene Expressionsprodukt muß gegebenenfalls mit dem Fachmann geläufigen Methoden renaturiert werden um ein wirksames Thrombinmuteinmolekül zu erhalten. Bei der Expression der B-Kette in Bakterien hat es sich auch als vorteilhaft herausgestellt, den Cys-Rest, der im natürlichen humanen Thrombin zur S-S-Verbrückung beiträgt, gegen einen anderen Aminosäurerest, beispielsweise Ser oder Ala auszutauschen.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Er¬ findung, ohne diese jedoch einzuschränken.
Prothrombin wurde nach der Publikation von Degen et al (Biochemie 1983, 22., S. 2087 - 97) aus einer humanen Leber cDNA Bank klo- niert.
Durch gezielte Mutagenese im Thrombinteil wurden die erfindungs- gemäßen Muteine hergestellt.
Beispiel 1
Herstellung von Ala 558 Prothrombin
Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon GGC für die Aminosäure (As)Glycin in Position 558 (SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCC für die As Ala mutiert.
Hierzu wurden das Oligonukleotid SEQ ID NO: 5 in Sinnrichtung des Gens und das dazu komplementäre Oligonukleotid SEQ ID NO: 6 in Gegensinnrichtung mit dem entsprechenden Nukleotidaustausch syn¬ thetisiert. Entsprechend dem 5'Ende des Prothrombingens wurde in Sinnrichtung das Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 synthetisiert. Die- sem wurde am 5'Ende zusätzlich die Sequenz für die Restriktions- schnittstelle Eco Rl angefügt. Entsprechend dem 3' Ende des Pro¬ thrombingens wurde in Gegensinnrichtung das Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 synthetisiert und diesem am 5'Ende ebenfalls die Sequenz für die Restriktionsschnittstelle Eco Rl angefügt. Mit 50 ng der humanen Prothrombin cDNA als Template und jeweils 50 pMol der Oligos SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 2 wurde nach Zu¬ gabe von 2nM dNTPs, Polymerasepuffer und Pfu-Polymerase ( Strata- gene) eine PCR Reaktion mit 35 Zyklen zu je 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72°C durchgeführt. Dem entsprechend wurde eine zweite PCR mit dem gleichen Template und den Oligos SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 1 durchgeführt. Die beiden so entstandenen DNA-Fragmente wurden nach einer Standardvorschrift ( PCR purifi¬ cation kit, Quiagen, Hilden ) aufgereinigt. Je 0,1 pMol der bei- den Fragmente wurden zusammengegeben, für 5 min auf 95°C zur Dena¬ turierung erhitzt und 1 h bei Raumtemperatur zur Renaturierung gehalten. Um den vollständigen DNA-Doppelstrang zu erzielen, wur¬ den nach Zugabe von 2 nM dNTPs, Polymerasepuffer und Pfu Polymerase 10 Zyklen bei je 1 min 94°C und 5 min 72°C durchge- führt. Zur Amplifikation des Vollängenfragments wurden dem Ansatz für eine weitere PCR je 50 pMol der außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 zugegeben und nach nochmaliger Zugabe von Pfu-Polymerase 35 Zyklen zu je 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72° C durchgeführt. Die so hergestellte mutierte Prothrombin cDNA mit dem Austausch von Gly nach Ala in Position 558 wurde nach Standardvorschrift aufgereinigt, mit der Restriktionsendonuklease Eco R 1 nachgeschnitten und mit einer T4-Ligase nach Standardvorschrift in den ebenfalls Eco R 1 ge¬ schnittenen Vektor pUC 18 (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Frei- bürg) kloniert. Zu Kontrolle wurde die DNA sequenziert.
Beispiel 2
Herstellung von Ala 525, Ala 558 Prothrombin
Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As Ser in Position 525 (SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCT für die As Ala und das Codon GGC für die As Gly in Position 558 (SEQ ID NO:14) zum Codon GCC für die As Ala mutiert.
Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO: 3 mit dem entsprechenden Nukleotidau- stausch zum Ala an der Position 525 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3'Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 3 komplementären Oligo SEQ ID NO: 4 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5'Ende Prothrombin) durchge¬ führt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybri¬ disiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Bei- spiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt. Die so hergestellte Prothombin - Mutein cDNA wurde aufgereinigt, mit Eco Rl nachgeschnitten, in den Vektor pUC 18 kloniert und zu Kontrolle sequenziert.
Beispiel 3
Herstellung von Ala 363, Ala 558 Prothrombin
Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As His in Position 363 (SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCA für die As Ala und das Codon GGC für die AS Gly in Position 558 (SEQ ID NO: 14) zum Codon GCC für die As Ala mutiert.
Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO: 10 mit dem entsprechenden Nukleotidau- stausch zum Ala an der Position 363 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3'Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 10 komplementären Oligo SEQ ID NO: 11 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5'Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Beispiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.
Die so hergestellte Prothombin - Mutein cDNA wurde aufgereinigt, mit Eco Rl nachgeschnitten , in den Vektor pUC 18 kloniert und zu Kontrolle sequenziert.
Beispiel 4
Herstellung von Asn 419, Ala 558 Prothrombin
Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon GAC für die As Asp in Position 419 (SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCA für die As Asn und das Codon GGC für die AS Gly in Position 558 (SEQ ID NO: 14) zum Codon GCC für die As Ala mutiert.
Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO: 12 mit dem entsprechenden Nukleotidau- stausch zum Asn an der Position 419 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3'Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 12 komplementären Oligo SEQ ID NO: 13 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5'Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Beispiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.
Die so hergestellte Prothombin - Mutein cDNA wurde aufgereinigt, mit Eco Rl nachgeschnitten, in den Vektor pUC 18 kloniert und zu Kontrolle sequenziert.
Beispiel 5
Herstellung von Ala525-Prothrombin
Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As Ser in Position 525 (SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCT für die As Ala mutiert.
Hierzu wurde auf Basis der Prothrombin-DNA und dem Oligo SEQ ID NO: 3 mit dem entsprechenden Nukleotidaustausch zum Ala an der Position 525 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3'Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 3 komplementären Oligo SEQ ID NO: 4 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5'Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann eine weitere PCR mit den außenliegenden Oli¬ gos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.
Die so hergestellte Prothombin - Mutein cDNA wurde aufgereinigt, mit Eco Rl nachgeschnitten, in den Vektor pUC 18 kloniert und zu Kontrolle sequenziert.
Beispiel 6
Konstruktion von Expressionsvektoren für humane Prothrombin- muteine
Zur sekretorischen rekombinanten Expression in CHO Säugerzellen wurde an die 5'Enden der mutierten Prothrombin cDNAs (siehe Bei¬ spiel 1 bis 5) die Sektretionsleader Sequenz des humanen tPA Gens angefügt (Pennica et al Nature 301, 214 - 221, 1983) . Ausgehend von einer tPA cDNA wurde mit den synthetischen Oligonukleotiden SEQ ID NO: 9 (5'Ende des tPA leaders und Eco RI Stelle) sowie SEQ ID NO: 8 (3'Ende tPA-Leader, 5'Ende Prothrombin) die tPA-Sektre- tionsleader cDNA auf Basis PCR amplifiziert. Mit dem zu SEQ ID NO: 8 komplementären Oligo SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 2 wurden jeweils die mutierten Prothrombinmuteinfragmente amplifiziert. Die tPA-leader-Fragmente wurden zu den jeweiligen Prothrombinmu- teinfragmenten zugegeben. Die Ansätze wurden denaturiert, hybri¬ disiert zum Doppelstrang aufgefüllt und mit einer weiteren PCR mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 2 die jewei¬ ligen tPA-Leader-Prothrombinmutein-DNAs hergestellt. Diese wurden Eco Rl geschnitten, in pUC 18 kloniert und zur Kontrolle sequen¬ ziert. 5
Zur Expression in CHO Zellen wurden diese DNAs mit Eco Rl aus den pUC 18 Vektoren herausgeschnitten, isoliert und in die Eco Rl Schnittstelle des Vektors pc DNA3 neo (Invitrogen, San Diego, USA) eingefügt. Die Transkription der Prothrombin cDNA steht in 10 diesem Vektor unter der Kontrolle des starken Cytomegalievirus- promotors. Die Selektion auf transfizierte Zellen wird über das im Plasmid liegende Neomycin-Resistenzgen durchgeführt, das nur G 418-resistenten Kolonien das Wachstum erlaubt.
15 Vor der Transfektion wurden die entsprechenden DNAs, die für eine Expression in CHO-Zellen vorgesehen waren, mit dem Restriktions- enzym Pvul linearisiert, präzipitiert und in 10 mM Tris-Puffer (pH8,5) steril aufgenommen.
20 Beispiel 7
Expression von Prothrombin-Muteinen in Säugerzellen
Die DNA der Expressionsvektoren wurde mit Lipofektamin (Fa. 25 Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstraße 5, 76334 Eggenstein, Deutschland; Nr. 530-8324SA) in Säugerzellen transfiziert. Die verwendeten Zellen waren CHO-Kl (ATCC CCL 61); 293 (ATCC CRL 1573) .
30 Je 2xl05 Zellen/ml wurden in 3 ml Wachstumsmedium pro Napf einer 6-well-Kulturplatte eingesät. Am nächsten Tag wurde die Trans- fektion durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen einmal mit serum¬ freiem Medium gewaschen. Die Transfektion mit Lipofektamin wurde nach Angaben der Herstellerfirma Fa. Gibco durchgeführt (Focus
35 (1993), 15 Nr. 3, 73-78). Jeder Napf erhielt 1 μg DNA und 6 μl Li¬ pofektamin, die in zusammen 1000 μl serumfreiem Zellkulturmedium aufgebracht wurden. Nach 6 stündiger Inkubation bei 37°C wurde das Transfektionsmedium abgesaugt und die Zellen mit normalem Wachstumsmedium (inklusive foetalem Kälberserum, FCS) über Nacht
40 inkubiert.
Beispiel 8
Transiente Expression von Prothrombinmuteinen in 293-Zellen 45 293-Zellen werden in DMEM-Medium (Gibco Nr. 41965) + 10 % FCS (BioWhittaker Nr. 14601 B) gehalten. Die Transfektion wurde durchgeführt wie oben beschrieben. Dabei wurde zur Erhöhung der Expression eine Co-Transfektion mit dem Plasmid pAdVantage (Fa. Promega Nr. E1711) durchgeführt. 0,2 μg der pAdVantage-DNA, sowie 0,8 μg der DNA des jeweiligen Prothrorn- binmuteins im Expressionsvektor pcDNA3 wurden transfiziert wie oben beschrieben. Am l.Tag nach Transfektion wurde das serumhal- tige Medium abgesaugt und durch serumfreies Medium (ohne Phenol- rot) ersetzt. Am dritten Tag nach Transfektion wurde der Zell¬ kulturüberstand abgenommen und bis zum Test bei -20°C gelagert.
Beispiel 9
Stabile Expression von Prothrombinmuteinen in CHO-Kl-Zellen
Die Transfektion wurde durchgeführt wie oben beschrieben. CHO- Zellen werden in DMEM/F12 = 1:1 (Gibco Nr. 21331-020) + 10% FCS gehalten und gezüchtet. Am l.Tag nach Transfektion wurden die Zellen gesplittet, so daß aus einem Napf einer 6-Napfplatte 20 bis 100 10 cm Petrischalen ausgesät wurden. Gleichzeitig wurde begonnen, die rekombinanten Zellen durch Behandlung mit G418 (Fa. Gibco, 1200 μg/ml in Medium) zu selektionieren. Die erhaltenen resistenten Kolonien wurden durch die "cloning cylinder" Methode vereinzelt und nach Hochzüchten und Erreichen genügender Zellzah¬ len auf Expression der entsprechenden Thrombinmuteine untersucht. Hierzu wurde das Medium von konfluenten Zellen abgesaugt und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Nach festen Zeitpunk¬ ten wie z.B. nach 24 Stunden, 48 Stunden wurde der inkubierte Zellkulturüberstand abgenommen und auf Vorliegen des Prothrombins mit Hilfe des ELISA getestet.
Teilweise wurden die erhaltenen rekombinanten Zellen zur Steige¬ rung der Expression durch Vereinzelung in Mikrotiterplatten klo¬ niert.
Um genügende Mengen des serumfreien Zellkulturüberstandes bereit¬ zustellen, wurden gut exprimierende CHO-Zellen in verschiedenen Kulturgefäßen bis zur Konfluenz in Medium mit 10 % FCS gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit serum¬ freiem DMEM /F12-Medium (DMEM: Gibco-Nr.11880-028; F12: Gibco Nr.21765-029 Mischung besteht aus gleichen Volumenanteilen) inkubiert. Das für diese Zwecke benutzte DMEM war frei von Phe¬ nolrot. Nach zwei bzw. drei Tagen erfolgte jeweils ein Medien- Wechsel ("Ernte"), um den Prothrombinmutein enthaltenden Zell¬ kulturüberstand zu ernten. Auf diese Art konnte bis zu 10-mal aus einem Kulturgefäß geerntet werden. Verschiedene Ernten aus ver- schiedenen Kulturgefäßen wurden dabei vereinigt, um ein für die Aufreinigung aktzeptables Volumen zu erreichen.
Beispiel 10
Nachweis der Expression von rekombinanten Prothrombinmuteinen
Zellen, die Prothrombin exprimieren und in das Zellkulturmedium sezernieren, wurden auf Vorliegen des rekombinanten Prothrombin getestet, indem der Zellkulturuberstand von konfluenten Zellen auf Vorliegen von Prothrombin mittels ELISA oder nach Spalten des Prothrombins auf Thrombin-Aktivität bzw. Thrombin-Antigen unter¬ sucht wurde.
Hierzu wurde der serumfreie Zellkulturuberstand nach unterschied¬ lich langer Kulturdauer abgenommen. Spaltung des in dem Zell¬ kulturuberstand vorliegenden Prothrombins wurde mittels snake ve- nom (Fa. Sigma; Kat. Nr. V3129) erreicht. Jeder Ansatz wurde fol¬ gendermaßen durchgeführt:
388 μl Probe (serumfreier Zellkulturuberstand oder Prothrombin)
63 μl snake venom (0,2 mg/ml in H20)
50 μl Puffer (1 M NaCl; 100 mM CaCl2; 200 mM Tris pH7,4) 100 μl H20
Die Spaltungsansätze wurden für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde das entstandene Thrombin in verschiedenen Tests charakterisiert.
Beispiel 11
Nachweis von Prothrombinmuteinen und Thrombinmuteinen durch ELISA
Der ELISA zur Bestimmung von Prothrombin und Thrombin wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Microtiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Thrombin- Antikörpern; 5 μg/ml 0,05 M NaHC03, pH 9,2; 16 Stunden/4°C.
Absättigen mit 1% BSA/PBS; 0,3 ml/well; 0,5-1 Stunde/RT
3x Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS
11 Standardverdünnungen von human-Thrombin( Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg) , angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS in 2er Schritten; parallel dazu Verdünnungen der zu bestimmenden Proben; 0,1 ml/well; 2-4 Stunden/RT Waschen wie oben - 0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-Antikörper 1:200; verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 2-4 Stunden/RT Waschen wie oben
0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153); 1:10000 verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 30 Minuten /RT Waschen wie oben 0,1 ml/well Peroxidasesubstrat Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H2S04 Messung der Absorption bei 450 nm Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 μl 3% H202
Beispiel 12
Herstellung von Antikörpern gegen humanes Thrombin
Zur Induktion von polyklonalen Antikörpern wurden Kaninchen wie folgt immunisiert:
Tag 1 200 μg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/complete Freund's
Adjuvant (Sigma F5881) Tag 14 200 μg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/incomplete Freund' s
Adjuvant (Sigma F5506) Tag 28 200 μg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/incomplete Freund' s
Adjuvant Tag 42 200 μg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS
7 Tage nach der letzten Immunisierung erfolgte die Blutabnahme aus der Ohrvene der Kaninchen.
Die Reinigung der polyklonalen Kaninchen-Antikörper aus dem ge¬ wonnenen Serum erfolgte über Protein A Sepharose (gemäß Herstel¬ ler Pharmacia) mit einer Ausbeute von 65 mg IgG/10 ml Serum. Vor der Biotinylierung wurden die Antikörper gegen 0,05 M NaHC03 pH 9,0 (2x 2 1) dialysiert, dann Zusatz von 200 μl Biotin-X-NHS- Ester (Calbiochem 203189; 1 mg/ml H20) pro 600 μl Antikörper (2,4 mg/ml) und 2 Stunde/RT schütteln. Abschließend wurde .3mal gegen PBS dialysiert. Mit den gewonnenen Antikörpern wurde ein sandwich-ELISA aufge¬ baut:
Mikrotiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Throm- bin-AK 5 μg/ml in 0,05 M NaC03, pH 9,2; 16 Stunden/4*C
Absättigen mit 1% BSA; 0,3 ml/well; 0,5 Stunden/RT
3x waschen mit 0,05% Tween 20/PBS
11 Standardverdünnungen von human Thrombin (Calbiochem
605195) angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/PBS/0, 05% Tween 20 in 2er Schritten; parallel dazu Verdünnungen der zu bestim¬ menden Proben; 0,1 ml/well; 2 Stunden/RT
Waschen wie oben
0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-AK 1:200, verdünnt in 1% BSA/PBS/0,05% Tween 20; 2 Stunden/RT - Waschen wie oben
0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153),
1:10000 verdünnt in 0,1% BSA/PBS/0, 05% Tween 20; 30 Minu- ten/RT
0,1 ml/well Peroxidasesubstrat - Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2M H2S04
Messung der Absorption (OD) bei 450 nm.
In Abbildung 1 ist die Absorption (OD) gegen die Thrombinkonzen- tration aufgetragen.
Peroxidase-Substrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-Acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 μl 3% H202.
Nachweis von Prothrombinmuteinen und Thrombinmuteinen durch
ELISA.
Der ELISA zur Bestimmung von Prothrombin und Thrombin wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Microtiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Thrombin- Antikörpern; 5 μg/ml 0,05 M NaHC03, pH 9,2; 16 Stunden/4°C. Absättigen mit 1% BSA/PBS; 0,3 ml/well; 0,5-1 Stunde/RT 3x Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS - 11 Standardverdünnungen von human-Thrombin (Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg), angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS in 2er Schritten; parallel dazu Ver¬ dünnungen der zu bestimmenden Proben; 0,1 ml/well; 2-4 Stun¬ den/RT - Waschen wie oben
0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-Antikörper 1:200; verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 2-4 Stunden/RT Waschen wie oben
0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153); 1:10000 verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 30 Minuten/RT 5 - Waschen wie oben
0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H2S04
Messung der Absorption bei 450 nm.
10 Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 μl 3% H202.
Beispiel 13a
15
Reinigung von Humanthrombin aus Blutplasma
Die Reinigung von humanen Prothrombin aus humanem Citratplasma erfolgte wie in Henrikson (Methods in Enzymology, Voi 222, pp
20 312-3279 beschrieben. Die Prothrombinspaltung und Reinigung des Thrombins durch Heparinchromatographie erfolgte wie in Beispiel 14 und 15 angegeben. Die Thrombinhaltigen Fraktionen wurden mit Hilfe des chromogenen Thrombinassays mit S 2238 ermittelt und durch Ultrafiltration auf 1 mg/ml aufkonzentriert und gegen PBS
25 diafiltriert.
Bestimmung der Thrombinaktivität mit dem chromogenen Substrat S 2238
30 Die Aktivität der Thrombinmuteine wird durch die Spaltung eines Tripeptides ermittelt. Hierzu wird nach folgendem Pipettierschema verfahren:
50 μl Probe (Thrombin 0,5 U/ml; oder gespaltenes Prothrombin in 35 verschiedenen Verdünnungen)
100 μl H20 50 μl S-2238(l mg/ml in H20; Fa. Chromogenix, Mölndal; Schweden) .
40 Die Ansätze werden für 10 - 15 Minuten bei 37°C inkubiert. An¬ schließend wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nM gemessen und die Thrombinmenge anhand einer Eichkurve zwischen 0,01 und 1 U/ml ermittelt.
45 Beispiel 13b
Reinigung von Prothrombinmuteinen durch Anionenaustauschchromato- graphie 5
35 1 des Prothrombin-haltigen Zellkulturüberstandes aus der CHO- Zellkultur wird zunächst durch Ultrafiltration bei 4C (SPS 400 Membran, Fresenius, St. Wendel) bis auf 400 ml aufkonzentiert und gegen dann gegen 10 mM Tris pH 7, 5 diafiltriert bis die Leitfä-
10 higkeit 1,1 mS/cm beträgt. Das entsalzte Filtrat wird dann auf eine Q-Sepharose FF Säule (5 cm Durchmesser, Voi 530 ml) mit einer Flussrate von 6 ml/min aufgetragen, die Säule mit Start- puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5) gewaschen und anschließend mit einem Gradienten nach 400 mM NaCl über 15 Säulenvolumen ent-
15 wickelt. Die Prothrombin-haltigen Fraktionen werden mittels ELISA identifiziert. Das Prothrombinmutein eluiert ab 280 mM NaCl. Es werden etwa 150 - 200 mg Protein aus dieser Säule isoliert.
Beispiel 14 20
Freisetzung der Thrombinmuteine aus Prothrombin
Die auf Amicon YM 30 aufkonzentrierten Fraktionen ( 20 ml Endvo¬ lumen, 175 mg Gesamtprotein) der Q-Sepharose Chromatographie wer-
25 den gegen 2 Liter 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 100 mM NaCl dialysiert und für die Spaltung durch Zusatz von 1 M CaCl2, 20 mM Tris pH 7, 5 auf eine Endkonzentation von 10 mM eingestellt. Nach Zugabe von 30 mg Schiagengift aus Oxyranus scutellatus wird bei 4βC unter Rühren gespalten und die Reaktion nach 12 h durch Zusatz von 2 ml
30 20 mM EGTA-Lösung, pH 7, 5 abgestoppt.
Beispiel 15
Reinigung der Thrombinmuteine durch Heparinchromatographie
35
Der Thrombin-haltige Spaltansatz aus Beispiel 14 wird anschlie¬ ßend auf eine Heparinsepharose-Säule (14 cm x 1 cm, Pharmacia) mit einer Flußrate von 38 cm/h aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 20 ml 20 mM Na-Phosphat, 0,1 M NaCl pH 7,5 0,01 %
40 Pluriol F68 wird die Säule mit einem linearen Gradienten nach 600 mM NaCl,20 mM Na-Phosphat, pH 7,5, 0,01 % Pluriol F68 über 150 ml entwickelt Die Thrombinmuteine werden dann durch ELISA ermittelt. Die Muteine eluieren bei etwa 400 mM NaCl. Es wurden 30 -35 mg Mutein erhalten und nach Zugabe von BSA (lmg/ml) gegen PBS, 5 0,01 % Pluriol F68 dialysiert und bei -20βC gelagert. Beispiel 16
Neutralisierung von Hirudin im in vitro System
Die Antidot-Wirkung der inaktiven rekombinanten Thrombine auf Hirudin wurde in einem Thrombin-Aktivitätstest nachgewiesen. Hierzu wurden Hirudin; das zu testende Thrombinmutein; aktives Thrombin und S-2238 miteinander inkubiert. Das diesem Test zugrundeliegende Prinzip ist die Neutralisation (oder Kompeti- tion) von Hirudin durch das zu testende inaktive Thrombin, sowie die daraus resultierende höhere Aktivität des aktiven Thrombins.
Hierzu wurde nach folgendem Pipettierschema verfahren:
100 μl Hirudin HL20 (1,5 U/ml) bzw. 0,1% BSA in TBS pH 7,5 und 100 μl Thrombinmutein (hergestellt in Beispiel 2) wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach Zugabe von 50 μl aktivem Thrombin (0,5 U/ml) wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl S-2238(1 mg/ml in H20; Fa. Chromogenix, Mölndal; Schweden) gestartet. Die Ansätze wurden für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 410 nm gemessen. Neutralisation des Hirudins durch das inaktive Thrombinmutein führte zu einer Erhöhung der Absorption (Abb. 2) .
Beispiel 17
Neutralisierung von PEG-Hirudin im Hund
Beagle-Hunden (9,8-13,5 kg) wurde subcutan PEG-Hirudin in einer Dosis von 10 mg/kg appliziert.180 min nach der PEG-Hirudin Injek¬ tion wurde die das nach Beispiel 2 hergestellte Thrombinmutein (Thrombinmut #3) als eine intravenöse Infusion mit einer Dosie¬ rung von 20g/kg über 50 min appliziert. Blutproben wurden den Hunden durch Punktion der V. brachialis zu Beginn des Experiments und weitere Proben nach 150 über einen Zeitraum bis zu 6 h ent¬ nommen. Aus dem Citrat-Blut wurde das Plasma durch Zentrifugation bei 2000 g für 20 min gewonnen und bis zur Analyse bei -20 C auf¬ bewahrt.
In den Plasmaproben wurde die Antithrombin-Aktivität wie in Span- nagel et al., Blood Coagulation Fibrinolysis, 1991, 2:, 121-127 beschrieben bestimmt. Die antikoagulatorische Aktivität (aPTT) wurde mit Hilfe des Pathromtin-Systems (Behring) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Abb 3 zusammengefaßt. Während in den Kon¬ trolltieren die Antithrombinaktivität nach Applikation von PEG- Hirudin rapide anstieg, konnte in den mit dem Antidot behandelten Tieren ein Anstiegt der Antithrombinaktivitat (Abb. 3B) verhin¬ dert werden. Nach Beendigung der Antidot-Infusion stieg der PEG- Hirudin Plasmaspiegel dann mit einer den Kontrolltieren ver¬ gleichbaren Rate weiter. Der qualitativ gleiche Verlauf wird auch bei der aPTT beobachtet (Abb. 3A) .
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: Neue Thrombinmuteine und ihre Verwendung als Antidot
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: GGGGGGGAAT TCGCCAACAC CTTCTTGGAG GAG 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GGGGGGGAAT TCCTACTCTC CAAACTGATC AAT 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK :
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: GGATGCCTGT GAAGGTGACG CTGGGGGACC CTTTGTCATG 40 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: CATGACAAAG GGTCCCCCAG CGTCACCTTC ACAGGCATCC 40 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GACCGGGATG GGAAATATGC CTTCTACACA CATGTGTTCC 40 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: GGAACACATG TGTGTAGAAG GCATATTTCC CATCCCGGTC 40 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: TCCATGCCCG ATTCAGACGC GCCAACACCT TCTTGGAGGA 40 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: TCCTCCAAGA AGGTGTTGGC GCGTCTGAAT CGGGCATGGA 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: GGGGGGGAAT TCGTGAAGCA ATCATGG 27 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: CTCACCGCCG CCGCATGCCT CCTGTACCCG 30 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: CGGGTACAGG AGGCACACGG CGGCGGTGAG 30 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: GAACCTGGAC CGGAACATTG CCCTGAT 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: ATCAGGGCAA TGTTCCGGTC CAGGTTC 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK.:
(A) LÄNGE: 579 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu
1 5 10 15 Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu 20 25 30
Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu 35 40 45
Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn 50 55 60
Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr 65 70 75 80
Arg Ser Gly Ile Glu Cys Gin Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys 85 90 95
Pro Glu Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gin Glu Asn 100 105 110
Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 115 120 125
Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gin Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly 130 135 140
Gin Asp Gin Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser 145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gin Cys Val Pro Asp Arg Gly Gin 165 170 175
Gin Tyr Gin Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu 180 185 190
Ala Trp Ala Ser Ala Gin Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gin Asp Phe 195 200 205
Asn Ser Ala Val Gin Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly 210 215 220
Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe 225 230 235 240
Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr 245 250 255
Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr 260 265 270
Ala Thr Ser Glu Gin Gin Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser 275 280 285
Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu 290 295 300 Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg 305 310 315 320
Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gin Val 325 330 335
Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gin Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu 340 345 350
Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro 355 360 365
Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly 370 375 380
Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met 385 390 395 400
Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu 405 410 415
Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser 420 425 430
Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser 435 440 445
Leu Leu Gin Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu 450 455 460
Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gin Pro Ser Val Leu 465 470 475 480
Gin Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser 485 490 495
Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro 500 505 510
Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro 515 520 525
Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gin Met Gly Ile 530 535 540
Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr 545 550 555 560
Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gin Lys Val Ile Asp Gin 565 570 575
Phe Gly Glu

Claims

Patentansprüche
1. Thrombinmuteine, die gegenüber dem natürlichen Thrombin fol- gende Sequenzunterschiede aufweisen
(a) Austausch eines Gly nach Ala, wobei sich das Gly in der Sequenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 558 be- sitzt;
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgen¬ den Reste
(bl) His, das sich in der Sequenzumgebung Ala-His-Cys befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 363 besitzt;
(b2) Asp, das sich in der Sequenzumgebung Arg-Asp-Ile befindet und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 419 besitzt;
(b3) Ser, das sich in der Sequenzumgebung Asp-Ser- Gly befin¬ det und im natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 525 besitzt;
2. Thrombinmuteine nach Anspruch 1 die gegenüber dem natürlichen humanen Prothrombin (SEQ ID NO:14) folgende Sequenzunter¬ schiede aufweisen
(a) Austausch des Gly nach Ala, an der Position 558 und
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgen¬ den Reste
(bl) His an der Position 363; (b2) Asp an der Position 419; (b3) Ser an der Position 525.
3. Thrombinmuteine nach Anspruch 2, wobei der Sequenzunterschied (b) ein Austausch an der Postion 525 ist.
4. Thrombinmuteine nach Anspruch 3, wobei der Sequenzunterschied (b) ein Austausch von Ser nach Ala ist
5. Nukleinsäuresequenz codierend für ein Thrombinmutein gemäß Anspruch 1 bis 4.
6. Verwendung von Thrombinmuteinen nach Anspruch 1 bis 4 bei der Behandlung von Gerinnungstörungen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 als Antidot für Thrombin- inhibitoren.
8. Verwendung nach Anspruch 7 als Antidot für Hirudine, Hirudin- muteine oder Hirudinderivate.
9. Verwendung nach Anspruch 8 als Antidot für Hirudinderivate, die mit Polyethylenglykol modifiziert sind.
10. Antidot für Thrombininhibitoren, enthaltend ein Thrombinmu¬ tein nach Anspruch 1 bis 4 zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen.
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