WO1997024456A1 - Procede de dosage d'echantillon vital - Google Patents

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WO1997024456A1
WO1997024456A1 PCT/JP1996/003577 JP9603577W WO9724456A1 WO 1997024456 A1 WO1997024456 A1 WO 1997024456A1 JP 9603577 W JP9603577 W JP 9603577W WO 9724456 A1 WO9724456 A1 WO 9724456A1
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WO
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adp
reaction
enzyme
nad
glucose
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PCT/JP1996/003577
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinji Koga
Shinichi Sakasegawa
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring ADP in a test solution using an enzyme reaction, wherein the test solution comprises at least glucose, ADP-dependent hexokinase (ADP-HK), oxidized NAD (P) [oxidation Nicotinamide dodenine dinucleotide (phosphate)], glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and one or two selected from the group consisting of magnesium ion, cobalt ion and manganese ion
  • the reaction is carried out at a temperature of 15 to 45, and the ADP in the test solution is reduced together with AMP generated by the reaction together with reduced NAD CP) (reduced nicotinamide Adenine dinucleotide (phosphate)], and a method for measuring one of the enzyme that produces ADP or a substrate thereof in a test solution using an enzyme reaction.
  • a test solution containing at least one of the enzyme to be formed or one of its substrates is used as a reagent for at least an enzyme that produces ADP and a component involved in the reaction based on the substrate, ATP, glucose, ADP-HK, oxidized NAD (P) , G 6 PDH and magnesium ion, cobalt ion or manganese ion, and the reaction solution at a temperature of 15 to 45 ° C in the presence of one or two or more ion-releasing salts.
  • a method for determining the ADP-forming enzyme or its substrate in AMP based on the amount of reduced NAD (P) s produced along with the AMP produced by the reaction. The purpose is to easily and accurately measure ADP in test fluids such as plasma, urine, and cerebrospinal fluid as an increase in the amount of reduced NAD (P).
  • NAD (NADH + H +) reduction method reaction 1
  • pyruvate kinase and pyroxidate oxidase method reaction 2
  • pyruvate kinase, pyruvate decarboxylase and aldehyde hydrogenase A method for increasing the reduced NAD (P) (NAD (P) H + H +] (reaction formula 3) is known (JP-A-7-8297).
  • PEP means phosphoenorubyruvic acid
  • Pi means phosphate
  • PDC means pyruvate decarboxylase
  • A1DH means aldehyde dehydrogenase
  • TPP means thiamin pyrophosphate.
  • a method for quantitative determination of pyruvate which is measured using a color indicator system of hydrogen peroxide generated using pyruvate kinase and pyruvate oxidase shown in Reaction Scheme 2, is widely used.
  • the method is not always satisfactory in the accuracy of the measured values because it is affected by interfering substances (reducing substances) (uric acid, ascorbic acid, etc.) and coloring substances (pyrilvin, hemoglobin, etc.) in the sample.
  • reducing substances uric acid, ascorbic acid, etc.
  • coloring substances pyrilvin, hemoglobin, etc.
  • the method for increasing reduced NAD (P) using carbonic enzyme and aldehyde dehydrogenase utilizes the reverse reaction of pyruvate kinase.
  • the optimal pH for this reverse reaction is pH 7.5
  • the optimal pH for pyruvate decarboxylase is pH 6.0 to 6.4
  • the optimal pH for aldehyde dehydrogenase is pH is 9.0 and it is difficult to determine the optimal pH for the reaction in Reaction Scheme 3 because the optimal pH of the three enzymes used is different.
  • Pyruvate decarboxylase Since the Km value of pyruvic acid is considerably large at 3.6 to 3 OmM, it is necessary to use a large amount of expensive phosphoenol pyruvic acid as a substrate to produce a large amount of pyruvic acid, and (8) To complete the entire reaction in a short time, a large number of yeast The amount was only a complicated technique that requires.
  • the ADP-dependent hexokinase used in the present invention may be present in the cells of the hyper-thermophilic bacterium Pyrococcus-Friosus DSM366 (Py rococcusf ⁇ riosus DSM366). (J. Biol. Chem., 26, 1 7 5 3 7-1 75 4 1 (1994)), Netherlands Patent Publication No. 94000083. Official Gazette)
  • Pyrococcus-Friosus DSM366 Pyrococcusf ⁇ riosus DSM36666
  • the enzyme is not purified or isolated, and the growth temperature of the strain is 90 ° C to 105 ° C.
  • the optimal temperature of the enzyme is 90 ° C or higher, and the G6PDH used for the activity measurement is derived from yeast, and the activity is measured at 50 in consideration of its thermal stability.
  • the activity was measured only under the temperature condition different from the optimal temperature of ADP-HK, and in light of the optimal temperature of ADP-HK-What is the temperature condition for clinical diagnosis of general biological components? Ku was a different measurement conditions. Regarding the measurement at a reaction temperature of 50 ° C, in the field of clinical diagnosis, if the reaction temperature is 50 ° C, the measurement cannot be performed accurately due to the inactivation of the combined enzyme (6). (7) Thermal denaturation of the biological component as the sample occurs, causing smearing. And accurate measurement was impossible. Problems to be solved by the invention
  • the present inventors cultured the Pyrococcus' Flyosas DSM36638 strain, purified ADP-HK, and examined the optimal temperature of the enzyme reaction.
  • the optimal temperature was 80-1. It was 00 ° C.
  • the relative activity at 37 ° C is about 10% of 100 ° C, and generally, an enzymatic reaction performed at 37 ° C with an enzyme of such properties will give an accurate quantitative reaction. Seemed impossible to do.
  • the present inventors conducted a quantification experiment using the enzyme reaction at 37 ° C., and carried out ordinary reaction temperature conditions in general quantification of biological components including the enzyme reaction at 37 ° C. It is possible to easily and accurately measure ADP in a test solution such as biological components as the amount of reduced NAD (P) generated / increased at a temperature of 15 to 45 ° C. I discovered something.
  • the present inventors have proposed a method for measuring ADP present in a biological sample, or an enzyme producing ADP or a substrate thereof in a biological sample using the following enzymatic reaction (reaction formulas 4 and 5). If the biological sample is a test solution for the purpose of measuring the activity of the enzyme that produces ADP, the enzyme that produces ADP in the presence of the enzyme substrate and ATP and the components involved in the reaction based on that substrate ADP is produced using the reaction reagents described above or in the presence of ATP and an enzyme that produces ADP by acting on the substrate when the biological sample is a test solution for the purpose of measuring the amount of the substrate.
  • the reaction is based on glucose, ADP-HK and oxidized NAD (P) s, G6PDH and magnesium ion, cobalt ion or manganese ion using the reaction reagents of the components involved in the reaction based on the enzyme and its substrate.
  • ADP to generate AMP a reaction that reduces oxidized NAD (P) s to reduced NAD (P) s, and determines the amount of enzyme or its substrate that produces ADP in the living body based on the amount of reduced NAD (P) s generated
  • the present invention has been improved by finding that the method is extremely useful, and that such a reaction is an enzyme reaction that can be universally used for an enzyme or a substrate for producing ADP in a biological sample.
  • the present invention relates to ADP in a biological sample, which comprises glucose, ADP-HK and oxidized NAD (P) s, G
  • the purpose of the present invention is to provide a method for determining ADP as the production and increase of reduced NAD (P) s using manganese ions.
  • the present invention uses an enzyme or a substrate thereof for producing ADP in a biological sample as a test solution, using an enzyme for producing ADP and a reaction reagent involved in a reaction based on the substrate, and using ATP, glucose, ADP — To provide a simple and highly accurate method for reacting in the presence of HK and oxidized NAD (P), G6PDH and magnesium ion, cobalt ion or manganese ion. .
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for measuring ADP in a test solution using an enzyme reaction at least glucose, ADP-HK, oxidized NAD (P) , G 6 PDH and magnesium ions, cobalt ions and manganese ions, in the presence of one or more ion-releasing salts selected from the group consisting of 15 to 45 ° C.
  • the present invention relates to a method for measuring ADP in a test solution together with AMP produced by the reaction, based on the amount of reduced NAD (P) s produced.
  • the present invention also relates to a method for measuring ADP in a test solution using an enzyme reaction.
  • a test solution containing an enzyme that produces ADP or one of its substrates participates in a reaction based on at least the enzyme that produces ADP and its substrate Component reaction reagents, ATP, Rucose, ADP—HK, Oxidized NAD (P), G6 PDH and magnesium ion, cobalt ion or manganese ion, in the presence of one or more ion-releasing salts, 15 to 45
  • the reaction is carried out under the temperature conditions as described above, and the enzyme or its substrate that produces ADP in the test solution is measured together with the AMP produced by the reaction based on the amount of reduced NAD (P) s generated. is there.
  • Acid in the presence of salts The enzymatic reaction for producing reduced NAD (P) from the modified NAD (P) is represented by the following reaction formulas 4 and 5.
  • the ADP-HK in the present invention is not limited as long as it is ADP-HK that uses at least glucose as a substrate and consumes ADP to produce glucose-6-phosphate and AMP as shown in the above reaction formula 4.
  • the bacteria producing AD P-HK the hyperthermophilic bacterium Pyrococcus, Friosus, and DSM 3638 are based on Deutsche Sammlung 'Von' Microorganism Men's Gent-Chierkturlen GmbH (DSM).
  • DSM Diakuyu Log (1993)
  • G6PDH used in the enzyme reaction represented by the above reaction formula 5 is commercially available (Boehringer Mannheim: derived from Leuc on ostoc me sentoroides, Sigma: baker's yeast, Ba cillusstearothe rmophilus, Le euconostoc me sentoroides) is easily available.
  • any one or more ion-releasing salts that can release cobalt ions or manganese ions in place of magnesium ions which are ion-releasing salts used in the enzyme reaction (reaction formula 4) catalyzed by ADP-HK.
  • salts thereof include chlorides, sulfates, and the like, and preferably, magnesium chloride. , Cobalt chloride and manganese chloride, but are not limited thereto.
  • oxidized NAD (P) as a coenzyme used in the enzymatic reaction catalyzed by G6PDH also includes oxidized thione NAD (P) and oxidized 3 —Includes, but is not limited to, acetyl NAD (P) and oxidized deamino NAD (P).
  • the amounts of ADP-HI, G6PDH, glucose, oxidized NAD (P) s and magnesium ions, cobalt ions or manganese ions used in the enzymatic reactions represented by Reaction Formulas 4 and 5 are Any amount may be used as long as it progresses smoothly, and is appropriately adjusted depending on the type of substance in the test liquid to be measured, the content in the test liquid, the type of enzyme reaction to be conjugated, the reaction time and the temperature, etc.
  • the concentration of ADP-HK and G6PDH is, for example, about 0.1 to 100 UZm1, preferably about 1 to 50 UZm1.
  • the concentration of glucose and oxidized NAD (P) may be a concentration sufficient for performing an enzyme reaction, and the concentration of glucose is, for example, about 0.5 to 100 m ⁇ , preferably about 1 to 5 OmM, and oxidized NAD.
  • the (P) class is, for example, about 0.5 to 5 OmM, preferably about 1 to 1 OmM, and the concentration of magnesium ion, covanolate ion or manganese ion is, for example, about 0.1 to 5 OmM, preferably 0.5 to 0 OmM. It is about 5 to 10 mM.
  • an appropriate buffer which does not adversely affect the enzyme reaction system for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, mono- or diethanolamine buffer, Good buffer, etc.
  • the measurement method is not particularly limited, and a method such as an endpoint method or a rate attestation method can be used as appropriate.
  • the test solution to be measured includes a biological sample containing ADP in which ADP is present or formed, and examples thereof include serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid. Such a test solution is usually used to carry out the reaction in the above reaction system using 5 to 200 ⁇ 1, and the reaction temperature is, for example, 15 to 45, preferably 20 ° C to 4 ° C.
  • the reaction may be performed at a reaction temperature of 0 ° C, and the reaction time is 1 to 60 minutes, preferably 1 to 10 minutes in the end point method, and the reaction is performed linearly in the rate attest method. In time, Preferably, the measurement is carried out for 2-3 minutes.
  • the reaction of the present invention corresponding to the amount of ADP in the test solution involves the production of reduced NAD (P) s together with the AMP produced, and the amount of the reduced NAD (P) s produced can be determined by various methods. Although it can be measured, it is usually performed by an absorbance measurement method that can be measured simply and with high accuracy.
  • the measurement wavelength is appropriately selected according to the type of reduced NAD (P), and in the case of reduced NAD (P), reduced 3-acetyl-NAD (P), reduced deamino-NAD (P), etc.
  • reduced thio NAD a wavelength around 405 nm is selected.
  • a tetrazonium salt such as indonitrotetrazonium (INT) or nitrotetratetrazonium (NTB) was used as an electron acceptor for phenazine.
  • INT indonitrotetrazonium
  • NTB nitrotetratetrazonium
  • a method of forming a formazan dye by the action of tosulfate (PMS) diaphorase (EC 1.6.3.3) and measuring the color of the formazan dye may be used.
  • the fluorescence of reduced NAD (P) s may be measured.
  • the test liquid as the biological sample in the present invention includes measurement of one of a substrate of an enzyme that produces ADP or ADP in the biological sample and an enzyme activity thereof.
  • a substrate of an enzyme that produces ADP or ADP in the biological sample
  • an enzyme activity thereof in the biological sample
  • Kinases, synthases, hydrolases or carboxylases and their substrate substances can be directed to ADP by the action of kinases, synthases, hydrolase or carboxylase.
  • the amount of enzyme activity or its substrate induced by ADP in the biological sample can be reduced by reducing NAD (P) Can be measured.
  • NAD NAD
  • the relationship between the substrate and the enzyme used is shown in Table 1 and one of the substrate and the enzyme involved in the reaction is measured, and the other component involved in the reaction (but the other involved ATP is not included or implied as a component of) may be used as a reaction reagent for components involved in the reaction.
  • Table 1 the relationship between the substrate and the enzyme used is shown in Table 1 and one of the substrate and the enzyme involved in the reaction is measured, and the other component involved in the reaction (but the other involved ATP is not included or implied as a component of) may be used as a reaction reagent for components involved in the reaction.
  • reaction formula when a reaction reagent is used as a component involved in the reaction.
  • the ADP should be measured.
  • the reaction reagent of the component involved in the reaction (however, ATP is included and does not mean as the other component involved: the same applies to the following) is described on the left side of the following reaction formula and below the arrow.
  • the meaning of the components (the same applies hereinafter), and the reagents of the components involved in the reaction when measuring urea as a biological sample include diarea amide hydrolase, water molecules, magnesium ions (magnesium chloride), and potassium hydrogen carbonate.
  • urea water molecules, magnesium ions (magnesium chloride), and potassium hydrogen carbonate are mentioned as the reaction reagents of the components involved in the reaction when measuring ureaamide hydrolase activity as a biological sample. Replaced by the molecules of the reaction medium.
  • Mg 2+ a method of measuring the one containing either creatinine or creatinine Ami Dohidororaze as KHC0 3 the biological sample, shows the reaction formula in the case of using the components involved in the reaction as a reaction reagent in the following .
  • the components on the left side and the right side of the reaction formula are the same, the components are involved in the reaction because they are successive products of the components produced in the sequential reaction. Is separate as a reaction reagent It is clear that it is not added in the middle (the same applies hereinafter).
  • creatine generated by an enzymatic reaction is used for the reaction of (2). It means that ADP may be measured as ADP produced by the reaction, or creatine produced by enzymatic reaction may be measured as ADP produced by the following reaction.
  • Reaction reagents for the components involved in the reaction when creatinine is measured as a biological sample include creatinine amide hydrolase, water molecules, creatine kinase (CK), and magnesium ion in the reaction system of (2).
  • creatinine amidohydrolase, water molecules, creatine amidohydrolase, urea, ureidoamidohydrolase, and magnesium ion are released, and are involved in the reaction when measuring creatinine amidohydrolase activity as a biological sample.
  • the reaction reagents for the components include creatinine, water molecules, creatine kinase, and magnesium ions in the reaction system (1), and creatinine, water molecules, creatinamide hydrolase, urea, ureidoamide hydrolase, and magnesium in the reaction system (2). O emissions, and the like.
  • reaction formula when the component involved in the reaction is used as a reaction reagent is shown below.
  • ADP can be measured.
  • the reaction reagents of the components involved in the reaction when creatinine is measured as a biological sample include creatinine diminase, a water molecule, and N-methylhydantoinase.
  • the reaction reagents of the components involved in the reaction when measuring are creatinine, water molecules,
  • the reaction formula is shown below, and ADP generated by the enzymatic reaction may be determined.
  • the reaction reagents of the components involved in the reaction when measuring creatine as a biological sample include creatine kinase and magnesium ion, and the reaction of the components involved in the reaction when measuring creatine kinase activity as a biological sample.
  • Reagents include creatine and magnesium ions.
  • the creatine in the reaction formula 9 may be creatine released based on the above reaction formula 7.
  • glycerol or glycerol-lucinase As a biological sample
  • the reaction formula when the component involved in the reaction is used as a reaction reagent is shown below, and the ADP generated by the enzyme reaction may be measured.
  • glycerol kinase and magnesium ion are mentioned as reaction reagents of components involved in the reaction when glycerol is measured as a biological sample.
  • Glycerol was released by the action of trilipase mono- or diglyceride by lipase-eye lipase (however, C0-lipase was added as an activator). Glycerol may be used, or glycerol released by the action of phospholipase D on phosphatidylglycerol may be used.
  • triglyceride as a biochemical test item of an in-vivo component and the measurement of spleen lipase activity using triglyceride-diglyceride as a synthetic substrate.
  • reaction reagents of the components involved in the reaction when measuring as a biological sample for the purpose of triglyceride quantification include lipase, water molecule, glycerol kinase
  • reaction reagents of the components involved in the reaction for the measurement of eye lipase activity include triglyceride-diglyceride synthetic substrate, water molecule, glycerol kinase, magnesium ion, and C0-lipase as appropriate.
  • surfactants as solubilizers for synthetic substrates are mentioned.
  • reaction formula 1 Choline, choline kinase Choline kinase
  • cholinesterase is used as a synthetic substrate such as corin ⁇ choline ester released by the action of phosphatidylcholine (phospholipid component) on phosphatidylcholine (phospholipid component), for example, benvicollin or orthotoluoline choline. It may be a corrin that has been released by acting.
  • the reagents involved in the reaction when measuring for the purpose of quantifying phospholipid components include phoslipase 0, water molecules, and magnesium ions, and the reaction when measuring for the purpose of measuring corin esterase activity.
  • the reaction reagent for the component involved in the reaction include a synthetic substrate such as benvicholine or orthotoluoylcholine, a water molecule, and a magnesium ion.
  • reaction formula when a component involved in the reaction is used as a reaction reagent is as follows.
  • reaction reagents of the components involved in the reaction of the present invention are evident from the above and the following various reaction formulas, and are appropriately selected and prepared depending on the test liquid to be measured. It is clear that the reaction is possible, and furthermore, these reaction reagents are not limited to those described.
  • the ammonia in the above reaction formula may be ammonia produced by the reaction of urea and ureamid hydrolase exemplified in the above reaction formula 6, and also exemplified in the reaction formula 7.
  • Ammonia generated by the reaction between creatinine and creatinine amidohydrolase in the reaction system (2) may be used, and ammonia generated by the previous reaction for creatinine and creatinine diminase in reaction formula 8 may be used.
  • this monument is not limited at all.
  • the amount of ATP to be added is, for example, about 0.1 to 50 mM, and preferably about 0.5 to 1 OmM.
  • the amount of the enzyme to be added is, for example, about 1 to 100 U / m1.
  • the substrate to be added when measuring the enzyme activity is, for example, about 1 to 10 OmM.
  • the amount of the component consumed by reacting with the substrate may be the same amount or twice as much as the amount of the substrate used.
  • the concentration of magnesium chloride is preferably, for example, about 0.1 to 5 OmM, preferably about 0.5 to 1 OmM as magnesium chloride, but an excess of these is used unless particularly inhibited in the reaction. It does not exclude that.
  • these reactions may be performed in the same reaction system together with the above-mentioned Reaction Formulas 4 and 5, or may be performed in a separate reaction system.
  • the upper limit of measurable components is limited by the amount of reduced NAD (P) present in the reaction solution before quantification (the measurement range is narrow).
  • the existing measurement method for creatinine is
  • the oxidase method is used, and the measurement value becomes inaccurate due to the influence of the reducing substance (ascorbic acid, etc.) in the sample. Furthermore, sarcosine oxidase acts on proline, and Defects such as being affected by proline Having.
  • NAD (P) H + H As shown in the above reaction formulas 47, 48, 49 and 50, 51, 52, this is a method for increasing reduced NAD (P), which is used to reduce reducing substances (ascorbic acid, etc.) and proline in a sample. Not affected at all.
  • diglyceride ⁇ monoglyceride is used instead of triglyceride in the above reaction formula 54 (in these cases, the reaction formula consumes two or one molecule of water molecule to release two or one molecule of fatty acid). The same applies to the case of).
  • the upper limit of measurable components is limited by the amount of reduced NAD present in the reaction solution before quantification (the measurement range is narrow).
  • FIG. 1 shows a calibration curve for ADP measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a calibration curve for ADP measurement using cobalt ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 3 shows a calibration curve for ADP measurement using manganese ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 4 shows a calibration curve for ADP measurement using magnesium ions at 20 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 5 shows a calibration curve for ADP measurement using magnesium ions at 40 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 6 shows a calibration curve for urea measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 7 shows a calibration curve for creatinine measurement using magnesium ions in the present invention.
  • FIG. 8 shows a calibration curve for creatinine measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 9 shows a calibration curve for creatine measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 10 shows a calibration curve for glycerol measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 11 shows a calibration curve for collin measurement using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 12 shows a calibration curve for measuring glumic acid when using magnesium ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 13 shows a calibration curve for urea measurement using cobalt ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 14 shows a calibration curve for creatinine measurement using manganese ions at 37 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 15 shows a calibration curve for creatine measurement using magnesium ions at 20 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 16 shows a calibration curve for glycerol measurement using magnesium ions at 40 ° C. according to the present invention.
  • FIG. 17 shows a quantitative curve of ADP measurement when reacting at 50 ° C. instead of the present invention.
  • Enzyme activity (UZm 1) (A s -Ab) ⁇ ⁇ .795 x enzyme dilution
  • a liquid culture medium containing the above-mentioned medium components is sterilized in a tank. After the tank is sterilized, the seed culture is transplanted, and cultured with stirring at 95 for 15 hours to obtain a culture medium of 5 mUZm1. 0 0 1 was obtained.
  • the obtained culture solution 2001 was centrifuged, and the obtained cells were 0.9% NaC
  • the plate was washed once with 2 ⁇ of Tris-hydrochloric acid buffer containing 1 ( ⁇ 7.5). Suspend the washed cells in 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ ⁇ 7.5), adjust to 21 and use a Kubota sonicator (INSONATOR 201 ⁇ ). The mixture was treated at 180 W for 30 minutes to obtain a disrupted cell suspension.
  • the solution was passed through a 200 ml (2.6 x 38 cm) column (manufactured by Pharmacia) and eluted with a linear gradient of 0 to 1 mol of NaCl.
  • an active fraction 950 U was eluted at a concentration of 0.08 to 0.1 mol of NaCl.
  • NaCl was dissolved in the obtained active fraction to 4 M, and 200 ml of Phenyl-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) buffered with 4 M NaC1 ( 2.
  • Elution was carried out through a 6 ⁇ 38 cm) column with a linear gradient of 4 to 0 M NaCl.
  • an active fraction (900 U) was obtained at a NaCl concentration of 0.02 to 0.07 mol.
  • the obtained active fraction was dialyzed overnight against 1 OmM Tris-HCl (pH 7.5) 81 at 5 ° C, and then buffered with 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
  • the active fraction (850 U) was eluted at a phosphate buffer concentration of 0.02 to 0.03 M. This enzyme solution is freeze-dried and 5 mg An elementary powder (170 U / mg) was obtained.
  • the molecular weight of ADP-HK measured by the gel filtration method using TSK-G300 SWSW (0.75 x 30 cm) manufactured by Toso One Co., Ltd. is 100 000 ⁇ 5 000 It was.
  • ADP was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare an ADP sample.
  • Fig. 1 horizontal axis: displayed as final concentration
  • ADP was quantitatively measured.
  • ADP was adjusted to 2.3 mM, 4.6 mM, 6.9 m, 9.2 mM, and 11.5 mM aqueous solutions to prepare ADP samples.
  • ADP sample (20 ⁇ ⁇ 1) was added to 1 ml of the measurement reagent, the mixture was heated for 37 minutes, and the absorbance at 330 nm after heating for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As shown in Fig. 2, ADP was quantitatively measured.
  • ADP was adjusted to an aqueous solution of 2.5 mM, 5. OmM, 7.5 mM, 10.0 mM, and 12.5 mM to prepare an ADP sample. 20 ml of ADP sample was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 330 nm after heating at 37 ° C for 5 minutes was measured using the reagent blank as a control. As shown in Fig. 3, AD ⁇ was quantitatively measured.
  • ADP was adjusted to 2.8 mM, 5.6 mM, 8.4 mM, 11.2 mM, and 14 mM aqueous solutions to prepare ADP samples.
  • ADP was adjusted to an aqueous solution of 27 mM, 5.4 mM, 8.1 mM, 10.8 mM, and 13.5 mM to prepare an ADP sample.
  • ADP sample 201 was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 330 nm after heating at 40 ° C for 5 minutes was measured using the reagent blank as a control. As shown in Fig. 5, ADP was quantitatively measured.
  • Urea was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare a urea sample.
  • Creatinine was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 m.13 m IV [to prepare a creatinine sample.
  • a creatinine sample 201 was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 34 nm after heating at 37 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As a result of the measurement, creatinine could be quantitatively measured as shown in FIG. Example 8
  • Creatinine was adjusted to an aqueous solution of 2.7 m, 5.3 mM, 7.9 mM, 10.5 mM, and 13 mM to prepare a creatinine sample.
  • a creatinine sample 20-1 was added to the measurement reagent iml, and the absorbance at 34 nm after heating at 37 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As a result of the measurement, creatinine could be quantitatively measured as shown in FIG. Example 9
  • Creatine was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare a creatine sample. 20 ml of a creatine sample was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 34 nm after heating at 37 ° (:, 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. The measurement results are shown in FIG. Creatine as shown Was quantitatively measured ( Example 10
  • Glycerol was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare a glycerol sample.
  • a glycerol sample (20 ⁇ 1) was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 34 nm after heating at 37 for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control.
  • glycerol was quantitatively measured as shown in FIG.
  • glycerol released by the action of lipase on triglyceride and phospholipase D on phosphatidylglycerol could be measured.
  • Choline chloride was adjusted to an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare a choline chloride sample.
  • 20 ml of a chlorinated chloride sample was added to 1 ml of the measurement reagent, the mixture was heated for 37 minutes, and the absorbance at 330 nm was measured using a reagent blank as a control.
  • the collin could be measured quantitatively.
  • phospholipase D was allowed to act on phospholipids, and the amount of released corin could be measured.
  • L-glutamic acid was prepared in an aqueous solution of 2.6 mM, 5.2 mM, 7.8 mM, 10.4 mM, and 13 mM to prepare an L-glutamic acid sample.
  • Measuring reagent 1 The L-glutamic acid sample 201 was added to m1, and the absorbance at 34 O nm after heating at 37 ° C. for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As a result of the measurement, as shown in FIG. 12, L-glutamic acid could be quantitatively measured.
  • L-glutamic acid released by the action of aspartate transferase (GOT) peranine transferase (GPT) could be measured.
  • Urea was adjusted to an aqueous solution of 2.3 mM. 4.6 mM. 6.9 mM, 9.2 mM, and 11.5 mM to prepare a urea sample.
  • a urea sample (201) was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 330 nm after heating at 37 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As a result of the measurement, urea was quantitatively measured as shown in FIG. Example 14
  • Creatinine was adjusted to an aqueous solution of 2.5 mM, 5.0 mM, 7.5 mM, 10.0 mM, and 12.5 mM to prepare a creatine sample.
  • a creatinine sample 201 was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 34 nm after heating at 37 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As shown in FIG. 14, creatinine was quantitatively measured.
  • Creatine was adjusted to 2.8 mM, 5.6 mM, 8.4 mM, 11.2 mM, and 14 mM aqueous solutions to prepare creatine samples.
  • Creatine sample 201 was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 34 nm after heating at 20 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control. As shown in FIG. 15, creatine was quantitatively measured.
  • Glycerol was adjusted to an aqueous solution of 27 mM, 5.4 mM, 8.1 mM, 10.8 mM, and 13.5 mM to prepare a glycerol sample.
  • Glycerol sample 201 was added to 1 ml of the measurement reagent, and the absorbance at 330 nm after heating at 40 ° C for 5 minutes was measured using a reagent blank as a control.
  • glycerol was quantitatively measured as shown in FIG.
  • glycerol released by the action of lipase on triglyceride and glycerol released by the action of phospholipase D on phosphatidylglycerol could be measured.
  • ADP was adjusted to an aqueous solution of 0.5 mM and 10 mM. 15 mM to prepare an ADP sample. After preheating 1 ml of the measuring reagent at 50 ° C for 5 minutes, add ADP Sample 201, and measure the absorbance at 330 nm after heating at 50 ° C for 5 minutes. The measurement was performed with the control as a control. As shown in Fig. 17, the measurement results could not be quantitatively measured at 50 ° C. The invention's effect
  • a biological substance is measured based on the amount of reduced NAD (P) produced, so that the determination limit is high and reduced NAD (P) having a clear molecular extinction coefficient is used. Since the measurement is performed, the reliability of the measured value is high. Further, the measurement method of the present invention has an advantage that it is not affected by reducing substances and the like in the sample. Therefore, according to the present invention, ADP present in a biological sample or an enzyme that produces ADP in a biological sample and its substrate can be measured simply and with high accuracy.

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Description

明 細 書 生体試料を測定する方法 産業上の利用分野
本発明は酵素反応を用いて被検液中の ADPを測定する方法において、 被検 液を少なく ともグルコース、 AD P依存性へキソキナーゼ （AD P— HK) 、 酸 化型 NAD (P) 〔酸化型ニコチンァミ ドアデニンジヌクレオチド （リ ン酸） 〕 類、 グルコース— 6 -リン酸脱水素酵素 （G 6 PDH) およびマグネシウムィォ ン、 コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた 1種または 2 種以上のイオン放出性塩類の存在下、 1 5〜4 5での温度条件にて反応させ、 被 検液中の ADPを反応によって生成される AMPとともに、 還元型 NAD CP) 〔還元型ニコチンァミ ドアデニンジヌクレオチド （リン酸） 〕 類の生成量に基づ いて測定する方法に関し、 また酵素反応を用いて被検液中の ADPを生成する酵 素またはその基質の一方を測定する方法において、 AD Pを生成する酵素または その基質の一方を含有する被検液を少なく とも ADPを生成する酵素とその基質 に基づく反応に関与する成分の反応試薬、 ATP、 グルコース、 ADP— HK、 酸化型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイオン またはマンガンイオンのいずれか 1種または 2種以上のイオン放出性塩類の存在 下、 1 5〜4 5 °Cの温度条件にて反応させ、 被検液中の ADPを生成する酵素ま たはその基質を反応によって生成される AMPとともに、 還元型 NAD (P) 類 の生成量に基づいて则定する方法に関し、 臨床検査などの分野で用いられ、 血清 、 血漿、 尿、 髄液などの被検液中の ADPを還元型 NAD (P) 類の生成 .増加 量として簡便かつ正確に測定する目的である。 従来の技術
従来、 生体試料中に存在する ADPや生体試料中の ADPを生成する酵素ま たはその基質を測定する方法としては酵素反応による基質の反応生成物に作用す る他の脱水素酵素または酸化酵素と組み合わせて则定する方法 （例えば、 グリセ ロールとグリセロールキナーゼの場合、 グリセロールに ATPの存在下、 グリセ ロールキナーゼを作用させて AD Pおよびグリセロールリ ン酸を生成せしめ、 こ のグリセロールリ ン酸をグリセロールリ ン酸脱水素酵素またはグリセロールリ ン 酸ォキシダーゼを用いて測定する方法） や酵素反応によって生成する A DPを種 々の方法で測定する方法が知られている。
しかし、 他の脱水素酵素や酸化酵素と組み合わせて、 測定する方法は A DP を生成する酵素によって、 それぞれ、 組み合わせの酵素を変えなければならず、 汎用性に欠け、 また、 測定しょうとする基質や酵素によっては組み合わせの酵素 が存在しない場合もある。
また、 酵素反応によつて生成する A D Pを则定する方法としては液体クロマ トグラフィ一を用いて则定する方法が知られているが液体クロマトグラフィ一法 は操作性が煩雑であるという欠点を有している。
さらに、 操作性に優れる ADP測定酵素法としてピルビン酸キナーゼ 〔PK (EC 2. 7. 1. 40) 〕 と乳酸脱水素酵素 〔LDH (EC 1. 2. 3. 3) 〕 を用いた還元型 NAD (NADH + H+ ) の減少法 （反応式 1 ) 、 ピルビ ン酸キナーゼとピルビン酸ォキシダーゼを用いたォキシダーゼ法 （反応式 2) や ピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒ ド 水素酵素を用いた還 元型 NAD (P) (NAD (P) H + H+ 〕 の増加法 （反応式 3) が知られてい る （特開平 7— 8297号公報） 。
これらの反応式を以下に示す。 下記式中の PE Pはホスホエノ一ルビルビン 酸、 P iはリン酸、 P DCはピルビン酸脱炭酸酵素、 A 1 DHはアルデヒ ド脱水 素酵素、 TP Pはチアミ ンピロリン酸を意味する。
(反応式 1 )
PK
PEP + ADP ►ピルビン酸 + ATP
Mg2 +
LDH
ピルビン酸 + NADH + H+ ►乳酸 + NAD + (反応式 2)
PK P E P + AD P ピルビン酸 + ATP
Mg2 +
ピルビン酸ォキシダーゼ
ピルビン酸 +02 +P i ^ァセチルリ ン酸 +CO
(反応式 3)
PK P E P + AD P ピルビン酸 + ATP
Mg2 +
PDC
ピルビン酸 'ァセ トアルデヒ ド + CO
TP P, Mg2 +
A 1 DH
ァセ トアルデヒ ド +H2 O + NAD (P) + ►酢酸 + NAD (P) H + H + しかしながら、 反応式 1に示す還元型 NAD (NADH + H+ ) の減少法に おいては、 前もって所定量の還元型 NADを反応液内に存在させ、 反応の終了後 、 反応液内に残存する還元型 NADの量を測定する減少法であるために、 ( 1 ) 測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
( 2 ) 測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型 NADの 量により制限される。
(3) 還元型 NADの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、 定量前に 反応液内に存在させる還元型 NADの量を変える必要がある。
(4) 分析用試薬中に含有される還元型 NADが不安定である。
等の問題点がある。
また、 反応式 2に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸ォキシダーゼを用い て生ずる過酸化水素の発色指示薬系を用いて測定するピルビン酸の定量法が広く 利用されているが、 （5) この方法は生体試料中の干渉物質 （還元物質） （尿酸 、 ァスコルビン酸等） や着色物質 （ピリルビン、 ヘモグロビン等） の影響を受け るので測定値の正確さにおいて必ずしも十分満足できる方法とはいえない。 また、 反応式 3に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸!] 炭酸酵素とアルデ ヒ ド脱水素酵素を用いた還元型 NAD (P) の増加法は、 ピルビン酸キナーゼの 逆反応を利用するもので、 （ 6) この逆反応における至適 pHが pH 7. 5であ り、 またピルビン酸脱炭酸酵素の至適 pHが pH 6. 0〜6. 4であり、 さらに アルデヒ ド脱水素酵素の至適 pHが pH 9. 0であり、 使用する三種類の酵素の 至適 pHが異なるために反応式 3における反応の至適 pHを決定することが困難 であり、 （ 7) またピルビン酸脱炭酸酵素のピルビン酸に対する Km値が 3. 6 〜3 OmMとかなり大きな値であることから、 基質である高価なホスホェノール ピルビン酸を多く使用してピルビン酸を多く生成せしめる必要性があるとともに 、 (8) 反応全体を短時間に終了させるためには非常に多くの酵素量を必要とす る繁雑な手法にすぎなかった。
また、 本発明に使用される ADP依存性へキソキナーゼとしては、 超高度好 熱菌ピロコッカス - フリオサス · D SM 3 6 3 8 (Py r o c o c c u s f υ r i o s u s DSM 3 6 3 8 ) 菌株の菌体内に存在することが報告されている (J. B i o l . Ch em. , 2 6 9, 1 7 5 3 7 - 1 75 4 1 ( 1 9 9 4 ) 、 オランダ国特許公開番号第 9 4 0 0 8 3 6号公報） 力 \ その理化学的性質の記載 はほとんどなく、 酵素も精製、 単離されたものではなく、 また該菌株の生育温度 が 9 0°C〜 1 0 5 °Cであるため、 その由来する酵素の至適温度が 9 0°C以上であ り、 活性測定に用いている G 6 PDHは酵母由来でその熱安定性を考慮して、 活 性測定を 5 0でで行っているもので、 ADP— HKの至適温度と異なる温度条件 にて活性測定を行ったものにすぎず、 ADP— HKの至適温度に照らして-一般の 生体成分の臨床診断の温度条件とは全く異なる測定条件であった。 また、 5 0°C の反応温度で測定を行うことに関して、 臨床診断の分野では反応温度として 5 0 °Cで行うと （ 6) 組み合わせの酵素の失活によって正確に測定できない。 （ 7) 検体となる生体成分の熱変性がおこり、 にごりが生じる。 などの問題点があり正 確な測定が不可能であつた。 発明が解決しょうとする課題
まず、 本発明者らはピロコッカス ' フリォサス · D SM 3 6 3 8菌株を培養 し、 ADP— HKを精製し、 該酵素の反応の至適温度を調べた結果、 至適温度は 8 0〜 1 0 0°Cであった。 さらに、 3 7 °Cにおける相対活性は 1 0 0°Cの 1 0 % 程度であり、 一般的にこのような性質の酵素を用いて 3 7てで酵素反応を行わせ ると正確な定量反応を行うことは不可能であると思われた。 しかしながら、 全く 意外にも本発明者らは 3 7 °Cで該酵素反応を用いた定量実験を実施して、 該酵素 反応 3 7 °Cを含む生体成分の一般的定量における通常の反応温度条件である 1 5 〜4 5°Cの温度条件にて生体成分などの被検液中の ADPを還元型 NAD (P) 類の生成■増加量として簡便かつ高精度に測定することがが可能であることを発 見した。
さらに、 本発明者らは、 下記酵素反応 （反応式 4、 5) を用いて生体試料中 に存在する ADP、 または生体試料中の A DPを生成する酵素またはその基質を 測定する方法において、 例えば生体試料が ADPを生成する酵素の活性则定を目 的とする被検液の場合にはその酵素の基質と AT Pの存在下に ADPを生成する 酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬を用いて、 または生体試 料が基質の量の測定を目的とする被検液の場合にはその基質に作用して ADPを 生成する酵素と AT Pの存在下に A DPを生成する酵素とその基質に基づく反応 に関与する成分の反応試薬を用いて、 グルコース、 ADP— HKおよび酸化型 N AD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイオンまたはマ ンガンイオンに基づく反応により、 ADPを AMPを生成せしめるとともに酸化 型 NAD (P) 類を還元型 NAD (P) 類に還元する反応を行い、 還元型 NAD (P) 類の生成量に基づいた生体中の ADPを生成する酵素またはその基質の定 量方法が極めて有用であり、 かかる反応が生体試料中の ADPを生成する酵素ま たはその基質に普遍的に利用できる酵素反応であることを見い出して、 本発明を UP した。
即ち、 本発明は生体試料中の ADPをグルコース、 ADP— HKおよび酸化 型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイオンまた はマンガンイオンを用いて ADPを還元型 NAD (P) 類の生成 ·増加量として 则定できる方法を提供することを目的とする。
更に本発明は、 被検液としての生体試料中の ADPを生成する酵素またはそ の基質を、 ADPを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する反応試薬を 用いるとともに、 ATP、 グルコース、 ADP— HKおよび酸化型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイオンまたはマンガンィォ ンの存在下に反応せしめて簡便かつ高精度に測定することのできる方法を提供す ることを目的とする。 課題を解決するための手段
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、 酵素反応を用いて被検液中 の AD Pを測定する方法において、 被検液を少なく ともグルコース、 ADP— H K、 酸化型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイ オンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた 1種または 2種以上のイオン 放出性塩類の存在下、 1 5〜45 °Cの温度条件にて反応させ、 被検液中の ADP を反応によって生成される AMPとともに、 還元型 NAD (P) 類の生成量に基 づいて測定する方法に関し、 また本発明は、 酵素反応を用いて被検液中の ADP を生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、 ADPを生成す る酵素またはその基質の一方を含有する被検液を少なく とも ADPを生成する酵 素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬、 ATP、 グルコース、 A DP— HK、 酸化型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コ バルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか 1種または 2種以上のイオン放出 性塩類の存在下、 1 5〜45での温度条件にて反応させ、 被検液中の ADPを生 成する酵素またはその基質を反応によって生成される AMPとともに、 還元型 N AD (P) 類の生成量に基づいて測定する方法である。
本発明で用いられる、 グルコース、 AD P— HKおよび酸化型 NAD (P) 類、 G 6 PDHおよびマグネシウムイオン、 コバルトイオンおよびマンガンィォ ンからなる群より選ばれた 1種または 2種以上のイオン放出性塩類の存在下、 酸 化型 NAD (P) 類から還元型 NAD (P) 類を生成する酵素反応は下記反応式 4及び 5で示される。
(反応式 4)
ADP-HK
グルコース + AD P ^グルコース一 6—リン酸 （G 6 P) + AMP
Mg2 +
(反応式 5)
G 6 PDH
G 6 P +NAD (P) + »グルコノラタ トン一 6—リン酸
+ NAD (P) H + H + 以下、 本発明をより詳細に説明する。
本発明における A DP— HKとしては、 上記反応式 4で示される少なく とも グルコースを基質とし、 ADPを消費してグルコース— 6—リン酸および AMP を生成する AD P— HKであれば何ら限定されるものではなく、 例えば AD P— HKの生産菌としては超高度好熱菌ピロコッカス · フリオサス · DSM 3638 菌株がドィツチェ ·ザンムルグ ' フォン 'マイクロオルガニスメン · ゥント -チ エルクツルレン · GmbH (DSM) に基準培養物として寄託され、 DSM力夕 ログ （ 1 993 ) に記載されており、 何人も入手可能であり、 本菌株から得られ た高度好熱性 ADP— HKが好ましい。
また、 上記反応式 5で示される酵素反応に用いられる G 6 PDHは市販され ており （ベーリ ンガーマンハイム社 ： L e u c on o s t o c me s e n t o r o i d e s由来、 シグマ社：パン酵母、 Ba c i l l u s s t e a r o t h e rmoph i l u s、 L e u c o n o s t o c me s e n t o r o i d e s 由来） 、 容易に入手可能である。
上記 ADP - HKが触媒する酵素反応 （反応式 4) に使用するイオン放出性 塩類であるマグネシウムイオンの代わりにコバルトイオンまたはマンガンイオン を放出し得るいずれか 1種または 2種以上のイオン放出性塩類を用いればよく、 その塩類としては塩化物、 硫酸化物などが包含され、 好適には塩化マグネシウム 、 塩化コバルト、 塩化マンガンが挙げられるが、 なんらこれらに限定されるもの ではない。
酵素反応式 5に示されるように、 上記 G 6 PDHが触媒する酵素反応に使用 される補酵素としての酸化型 NAD (P) 類にはこの他に酸化型チォー NAD ( P) 、 酸化型 3—ァセチル NAD (P) 、 酸化型デァミ ノ NAD (P) などが包 含されるが、 なんらこれらに限定されるものではない。
本発明において、 反応式 4および 5で示される酵素反応の ADP - HIく、 G 6 PDH、 グルコース、 酸化型 NAD (P) 類およびマグネシウムイオン、 コバ ルトイオンまたはマンガンィオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量 であればよく、 測定対象となる被検液中の物質の種類、 被検液中の含量、 共役さ せる酵素反応の種類、 反応時間および温度などにより適宜調整されるが、 ADP 一 HKおよび G 6 PDHの濃度は例ぇば0. 1〜 1 0 0 UZm 1程度、 好ましく は 1〜5 0 UZm 1程度である。 グルコース、 酸化型 NAD (P) 類の濃度は酵 素反応を行うのに十分な濃度あればよく、 グルコースは例えば 0. 5〜 1 0 0m Μ程度、 好ましくは 1〜5 OmM程度、 酸化型 NAD (P) 類は例えば 0. 5〜 5 OmM程度、 好ましくは、 1〜 1 OmM程度とされ、 マグネシウムイオン、 コ バノレトイオンまたはマンガンイオンの濃度としては例えば 0. 1〜5 OmM程度 、 好ましくは 0. 5〜 1 0mM程度である。
本発明の方法は、 酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液 （例えば、 トリス—塩酸緩衝液、 リ ン酸緩衝液、 モノまたはジエタノールァミ ン緩衝液、 グ ッ ド緩衝液等） を用いて行われる。 また、 測定手法は特に限定されず、 エンドポ イント法、 レートアツセィ法などの手法を適宜用いることができる。 測定対象と なる被検液としては A D Pが存在または形成された A D Pを含有する生体試料が 挙げられ、 例えば、 血清、 血漿、 尿、 髄液などが例示される。 このような被検液 としては通常 5〜2 0 0 ^ 1を用いて上記反応系によって反応を行うもので、 反 応温度としては例えば 1 5〜4 5で、 好ましくは 2 0°C〜4 0°Cの反応温度条件 で行えばよく、 また、 反応時間はエンドポイント法では、 1〜 6 0分間、 好まし くは 1〜 1 0分間、 レートアツセィ法では反応が直線的に行われている時間内、 好ましくは、 2〜 3分間を計って測定する。
被検液中の A DP量に相当する本発明の反応は、 生成される AMPとともに 還元型 NAD (P) 類の生成を伴い、 この還元型 NAD (P) 類の生成量は種々 の方法により測定することができるが、 通常、 簡便かつ高精度で測定することの できる吸光度測定法により行われる。 測定波長は還元型 NAD (P) 類の種類に よって適宜選択され、 還元型 NAD (P) 、 還元型 3 -ァセチル— NAD (P) 、 還元型デァミノ— NAD (P) などの場合には 340 nm付近、 還元型チォー NAD (P) の場合は 405 nm付近の波長が選択される。 また、 還元型 NAD (P) 類の生成量の測定法として、 ィンドニトロテトラゾニゥ厶 （ I NT) や二 トロブル一テトラゾニゥ厶 （NTB) 等のテトラゾニゥ厶塩を用いて電子受容体 としてフエナジンメ トサルフヱ一ト （PMS) ゃジァホラーゼ （E C 1. 6. 4. 3) の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、 このホルマザン色素の呈色 を測定する方法を用いてもよい。 また、 還元型 NAD (P) 類の蛍光を測定して もよい。
本発明における生体試料である被検液としては、 生体試料中に存在する AD Pまたは生体試料中の ADPを生成する酵素の基質またはその酵素活性の一方の 測定が挙げられる。 特に生体試料中の ADPを生成する酵素の基質またはその酵 素活性の一方の測定において、 ATPの存在下に、 ADPを生成する酵素または その基質を被検液とする場合、 各種生体試料中のキナーゼ、 シンセ夕一ゼ、 ヒ ド 口ラーゼまたはカルボキシラーゼとその基質となる物質がキナーゼ、 シンセ夕ー ゼ、 ヒ ドロラ一ゼまたはカルボキシラーゼの作用によって AD Pに導く ことがで きる。 従って、 これらの酵素反応系と酵素反応 4および 5で示される酵素反応系 を共役させることにより生体試料中の A DPに誘導される酵素活性またはその基 質の量を、 還元型 NAD (P) 類の生成量として測定することができる。 これら の例として基質と使用する酵素の関係として第 1表に示し、 その反応に関与する 基質や酵素活性いずれか一方の測定をなし、 その反応に関与する他方の成分 （但 し、 関与する他方の成分として、 ATPは包含、 意味しないものとする） を反応 に関与する成分の反応試薬として使用すればよい。 第 1表
Figure imgf000012_0001
(第 1表に続く） (E C 2. 7. 1. 3 2) へキソース へキソキナーゼ
(EC 2. 7. 1. 1 ) フルク トース フルク トキナーゼ
(E C 2. 7. 1. 4 ) 刀ラク ト一ス ガラク トキナ一ゼ
(EC 2. 7. 1. 6) グルコサミ ン グルコサミ ンキナーゼ
(E C 2. 7. 1. 8) アデノ ンン アデノ シンキナーゼ
(EC 2. 7. 1. 2 0) チミ ジン チミ ジンキナーゼ
(E C 2. 7. 1. 2 1 )
NAD NADキナーゼ
(E C 2. 7. 1. 2 3) リボフラビン リボフラビンキナーゼ
(EC 2. 7. 1. 2 6) ピリ ドキサール ピリ ドキサールキナーゼ (第 1表に続く）
Figure imgf000014_0001
(第 1表に続く） ァンモニァ ( E C 6 3 1 2 )
L一グルタ ミ ン酸 グルタ ミ ン酸キナーゼ
(EC 2. 7. 2. 1 1 )
L—ァスパラギン酸 ァスパラギンシンセ夕一ゼ
ァンモニァ ( E C 6 3 1 4
Lーァスパラギン酸 ァスパラギン酸キナーゼ
( E C 2 7 2 4 )
ATP ミォキナーゼ
(EC 9. 7 4 3
ATP ATP a s e
( E C 3. 6. 1. 4 ) クェン酸 クェン酸キナーゼ
(EC 4. 1. 3. 8)
L—ァスパラギン酸 ァスパラギン酸ァミ ノ トランスフエ う一ゼ （GOT)
(EC 2. 6. 1. 1 )
グル夕 ミ ンシンセ夕一ゼ
し b . 0. 1. L )
Lーァラニン ァラニンア ミ ノ トランスフェラ一ゼ (第 1表に続く） ひーケトグルタル酸 (G PT) (EC 2. 6. 1. 2) グル夕ミ ンシンセターゼ
(EC 6. 3. 1. 2) 以下にこれらの反応式を示す。
生体試料として尿素またはウレァァミ ドヒ ドロラーゼの一方を含有してこの 一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分としての反応試薬を使用 した場合の反応式を下記に示し、 酵素反応によつて生成する A D Pを測定すれば よい。 なお、 反応に関与する成分の反応試薬 （但し、 関与する他方の成分として 、 ATPは包含、 意味しないものとする ：以下同様である） としては、 下記反応 式中の左側および矢印下段に記載の成分を意味する （以下、 同様である） もので 、 生体試料として尿素を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては ゥレアアミ ドヒ ドロラーゼ、 水分子、 マグネシウムイオン （塩化マグネシウム） 、 炭酸水素カリウムが挙げられ、 また生体試料としてウレァアミ ドヒ ドロラーゼ 活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては尿素、 水分子、 マ グネシゥムイオン （塩化マグネシウム） 、 炭酸水素カリウムが挙げられ、 但し水 分子は反応媒体の分子にて代替される。
(反応式 6) 尿素、 ゥレアアミ ドヒ ドロラ一ゼ
ゥレアアミ ドヒ ドロラ一ゼ
八丁？+尿素+^12 〇 -ADP + P i + C〇2 + 2 NH4 +
Mg2+, KHC03 生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンアミ ドヒドロラーゼの一方 を含有してこの一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試 薬として使用した場合の反応式を下記に示す。 なお、 このような逐次酵素反応の 場合、 反応式中の左側の成分と右側の成分とが同一の場合には逐次反応での生成 成分の逐次反応物であることから反応に関与する成分であるが反応試薬として別 途に添加するものではないことは明白である （以下、 同様である） 。 また、 下記反応式における①、 ②について、 生体試料としてクレアチニンま たはクレアチニンァミ ドヒ ドロラーゼの一方を含有してこの一方を测定する方法 において、 酵素反応にて生成されるクレアチンを①の反応にて生成される ADP として測定してもよく、 または酵素反応にて生成されるクレアチンを②以下の反 応にて生成される ADPとして測定してもよいことを意味する。
生体試料としてクレアチニンを则定する場合の反応に関与する成分の反応試 薬としては①の反応系ではクレアチニンァミ ドヒドロラ一ゼ、 水分子、 クレアチ ンキナーゼ （CK) 、 マグネシウムイオンが挙げられ、 ②の反応系ではクレアチ ニンアミ ドヒ ドロラーゼ、 水分子、 クレアチンアミ ドヒ ドロラーゼ、 尿素、 ウレ イ ドアミ ドヒ ドロラーゼ、 マグネシウムイオンが举げられ、 また生体試料として クレアチニンァミ ドヒ ドロラーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反 応試薬としては①の反応系ではクレアチニン、 水分子、 クレアチンキナーゼ、 マ グネシゥムイオンが挙げられ、 ②の反応系ではクレアチニン、 水分子、 クレアチ ンアミ ドヒ ドロラーゼ、 尿素、 ウレイ ドアミ ドヒ ドロラーゼ、 マグネシウムィォ ンが挙げられる。
(反応式 7) クレアチニン、 クレアチュンアミ ドヒ ドロラーゼ
クレアチニンアミ ドヒ ドロラーゼ
ク レアチニン十 H2 〇 クレアチン
CK
①クレアチン + ATP ^クレアチンリン酸十 ADP
Mg2 + クレアチンアミ ドヒ ドロラ一ゼ
②クレアチン + H2 0 ^ザルコシン +尿素
ゥレアアミ ドヒ ドロラ一ゼ
尿素 +ATP+H2 0 »AD P + P i +C02 + 2 NH4 +
Mg2+, K H C 03 生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンディ ミナーゼの一方を含有 してこの一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試薬とし て使用した場合の反応式を下記に示し、 酵素反応によつて生成する A D Pを測定 すればよい。 この場合、 生体試料としてクレアチニンを測定する場合の反応に関 与する成分の反応試薬としてはクレアチニンディ ミナーゼ、 水分子、 N—メチル ヒダン トインナ一ゼが挙げられ、 生体試料としてクレアチニンディ ミナ一ゼ活性 測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチニン、 水分子、
N—メチルヒダントインナーゼが挙げられる。
(反応式 8 ) クレアチニン、 クレアチニンディ ミナーゼ
クレアチニンディミナーゼ
クレアチニン + H 2 0 —メチルヒダントイン + N H 3
N—メチルヒダン トイナ一ゼ
N—メチルヒダン トイン + A T P »力ルバモイルザルコシン + A D P 生体試料としてクレアチンまたはクレアチンキナーゼの一方を含有してこの 一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試薬として使用し た場合の反応式を下記に示し、 酵素反応によって生成する A D Pを则定すればよ い。 この場合、 生体試料としてクレアチンを測定する場合の反応に関与する成分 の反応試薬としてはクレアチンキナーゼ、 マグネシウムイオンが挙げられ、 また 生体試料としてクレアチンキナーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の 反応試薬としてはクレアチン、 マグネシウムイオンが挙げられる。
(反応式 9 ) クレアチン、 クレアチンキナーゼ
C K
クレアチン + A T P ►クレアチンリ ン酸 + A D P
M g 2 + なお、 反応式 9のクレアチンは、 上記反応式 7に基づいて遊離されたクレア チンであってもよい。
生体試料としてグリセロールまたはグリセ口一ルキナ一ゼ （G K ) の一方を 含有してこの一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試薬 として使用した場合の反応式を下記に示し、 酵素反応によつて生成する A D Pを 測定すればよい。 この場合、 生体試料としてグリセロールを測定する場合の反応 に関与する成分の反応試薬としてはグリセロールキナーゼ、 マグネシウムイオン が挙げられる。
(反応式 1 0 ) グリセロール、 グリセ口キナーゼ
G K
グリセロール十 A T P 、 リセロール一 3—リ ン酸 + A D P
M g 2 + なお、 グリセ口一ルは、 トリグリセリ ドゃモノまたはジグリセリ ドにリパー ゼゃ眸リパーゼ （但し、 活性化剤として C 0—リバ一ゼを適宜添加する） を作用 せしめて遊離されたグリセロールでもよく、 また、 ホスファチジルグリセ□ール にホスホリパーゼ Dを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよレ、。
特に、 生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリ ド定量の目的、 ト リグリセリ ドゃジグリセリ ドを合成基質とした脾リパ一ゼ活性測定の目的に好適 である。
例えば、 生体試料としてトリグリセリ ド定量の目的として測定する場合の反 応に関与する成分の反応試薬としてはリパーゼ、 水分子、 グリセロールキナーゼ
、 マグネシウムイオンが挙げられる。 また、 眸リパーゼ活性測定の目的として測 定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては、 トリグリセリ ドゃジグリ セリ ドの合成基質、 水分子、 グリセロールキナーゼ、 マグネシウムイオン、 適宜 C 0—リパーゼ、 合成基質の可溶化剤としての界面活性剤が挙げられる。
生体試料としてコリンまたはコリンキナーゼの一方を含有してこの一方を測 定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の 反応式を下記に示し、 酵素反応によつて生成する A D Pを測定すればよし、。 (反応式 1 1 ) コリン、 コリンキナーゼ コ リ ンキナーゼ
コ リ ン + A T P ►コ リ ンリ ン酸 + A D P
g 2 + なお、 コ リ ンはホスファチジルコリ ン （リ ン脂質成分） にホスリパーゼ Dを 作用せしめて遊離されたコリ ンゃコリンエステル、 例えばベンブイルコリ ンまた はオルト トルオイルコリンなどの合成基質にコリンエステラーゼを作用させて遊 離されたコリ ンであってもよい。
特に、 生化学検査項目としてのリ ン脂質成分定量の目的、 合成基質を用いた コリ ンエステラーゼ活性測定の目的に好適である。
このリ ン脂質成分定量の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反 応試薬としてはホスリパーゼ0、 水分子、 マグネシウムイオンが挙げられ、 また コリ ンエステラーゼ活性測定の目的として測定する場合の反応に関与する成分の 反応試薬としては例えばベンブイルコリンまたはオルト トルオイルコリンなどの 合成基質、 水分子、 マグネシウムイオンが挙げられる。
以下、 同様に、 生体試料として基質または A D Pを生成する酵素の一方を含 有してこの一方を測定する方法において、 その反応に関与する成分を反応試薬と して使用した場合の反応式を下記に示し、 酵素反応によつて生成する A D Pを则 定すればよい。
また、 本発明の測定法の完成に基づき、 本発明における反応に関与する成分 の反応試薬は、 上記および下記の種々反応式から明白なものであり、 測定すべき 被検液によって適宜選択、 調製が可能であることも明らかであり、 さらにまたこ れらの反応試薬は記載のものに何ら限定されるものではない。
(反応式 1 2 ) へキソース、 へキソキナーゼ
へキソキナーゼ
へキソース + A T P ►へキソース一 6 — リ ン酸 + A D P
g 2 +
(反応式 1 3 ) フルク トース、 フルク トキナーゼ フルク トキナーゼ
フルク ト一ス + ATP »フルク ト一ス一 1—リ ン酸十 ADP
Mg2 +
(反応式 1 4 ) ガラク トース、 ガラク トキナ一ゼ
ガラク トキナーゼ
ガラク ト一ス + ATP ^ガラク ト一スー 1— リ ン酸 + AD P
Mg2 +
(反応式 1 5) グルコサミ ン、 グルコサミ ンキナーゼ
ダルコサミ ンキナーゼ
ダルコサミ ン + ATP »ダルコサミ ン一 6— リ ン酸 + ADP
Mg2 +
(反応式 1 6) アデノシン、 アデノ シンキナーゼ
アデノ シンキナーゼ
アデノ シン + ATP ^ADP+AMP
g2 +
(反応式 1 7) チミ ジン、 チミ ジンキナーゼ
チミ ジンキナーゼ
チミ ジン + ATP ►TMP + ADP
Mg2 +
(反応式 1 8) NAD、 NADキナーゼ
NADキナーゼ
NAD + ATP 'NADP + ADP
Mg2 +
(反応式 1 9) リボフラビン、 リボフラビンキナーゼ
リボフラビンキナーゼ
リボフラビン + A T P -FMN + A D P
Mg2 + (反応式 20) ピリ ドキサール、 ピリ ドキサールキナーゼ
ピリ ドキサールキナーゼ
ピリ ドキサール + AT P ►ピリ ドキサ一ルリ ン酸十 ADP
Mg2 +
(反応式 2 1 ) メバロン酸、 メバロン酸キナーゼ
メバロン酸キナーゼ
メバロン酸 + ATP ►ホスホメバロン酸 + AD P
Figure imgf000022_0001
(反応式 22) プロテイン、 プロテインキナーゼ
プロティンキナーゼ
プロテイン + ΑΤΡ ►ホスホブロティン + AD Ρ
Mg2 +
(反応式 2 3) ホモセリ ン、 ホモセリ ンキナーゼ
ホモセリ ンキナーゼ
ホモセリ ン + AT P ►ホモセリ ンリ ン酸 + AD P
Mg2 +
(反応式 24) ピルビン酸、 ピルビン酸キナーゼ
ピルビン酸キナーゼ
ピルビン酸 + AT P ►PEP + ADP
Mg2 +
(反応式 25) ピルビン酸、 ピルビン酸カルボキシラーゼ
ピルビン酸カルボキシラーゼ
ピルビン酸 +HC03 ― +ATP *オギザ口酢酸 +P i +ADP
Mg2 +
(反応式 2 6) 酢酸、 酢酸キナーゼ
酢酸キナーゼ
酢酸 +ATP »ァセチルリ ン酸 + ADP
Mg2 + (反応式 27) アンモニア、 カルバミ ンキナーゼ
力ルバミ ンキナーゼ
NH3 +C02 +ATP 力ルバモイルリン酸 + ADP
Mg2 +
(反応式 28) L—アルギニン、 アルギニンキナーゼ
アルギニンキナーゼ
L一アルギニン + ATP »L—アルギニンリ ン酸十 AD P
Mg2 +
(反応式 29) L—グルタミ ン酸、 アンモニア、 グルタミ ンシンセターゼ
グル夕ミ ンシンセ夕一ゼ
L -グル夕ミ ン酸 + NH3 + ATP »L一グル夕ミ ン + AD P + P i
Mg2 + なお、 上記反応式におけるアンモニアとしては、 前記反応式 6にて例示され る尿素とウレァァミ ドヒドロラーゼとの反応によって生成されたアンモニアであ つてもよく、 また反応式 7にて例示される②の反応系におけるクレアチニンとク レアチニンアミ ドヒ ドロラ一ゼとの反応によって生成されたアンモニアであって もよく、 反応式 8のクレアチニンとクレアチニンディ ミナーゼのための前段の反 応によって生成されたアンモニアであってもよいもので、 このァンモニァとして は何ら限定されるものではない。
(反応式 30) L—グルタミ ン酸、 グルタミン酸キナーゼ
グル夕ミ ン酸キナーゼ
L一グル夕ミ ン酸 + ATP 一グル夕ミン酸ホスフェ一ト + AD P
Mg2 +
(反応式 3 1 ) Lーァスパラギン酸、 アンモニア、 ァスバラギンシンセターゼ ァスパラギンシンセ夕ーゼ
L—ァスパラギン酸 + NH3 +ATP ーァスパラギン + AD P + P i
Mg2 + (反応式 32) L—ァスパラギン酸、 L—ァスパラギン酸キナーゼ
Lーァスパラギン酸キナーゼ
Lーァスパラギン酸 + AT P —ァスパラギン酸リ ン酸 + AD P
Mg +
(反応式 33) ATP、 ミオキナーゼ
ミオキナーゼ
ATP + AMP ^2 ADP
Mg2 +
(反応式 34 ) ATP、 ATP a s e
AT P a s e
ATP + H2 〇 »ADP + P i
Mg2 +
(反応式 35) クェン酸、 クェン酸キナーゼ
クェン酸キナーゼ
クェン酸 +HS— C 0 A + ATP »オギザ口酢酸 +ァセナル— C 0 A +
M g 2 +
ADP+P i
(反応式 36) L—ァスパラギン酸、 ひ—ケトグルタル酸、 ァスパラギン酸アミ ノ トランスフェラーゼ （GOT)
GOT
L—ァスパラギン酸+ひーケトグルタル酸 ~~►オギザ口酢酸 +L—グル夕ミン酸 グル夕ミ ンシンセ夕一ゼ
L一グル夕ミ ン酸 + NH4 + +ATP —グル夕ミ ン + ADP + P i g2 + 上記反応において、 特に GOT活性測定として好適である。
(反応式 37) L—ァラニン、 ひ一ケトグルタル酸、 ァラニンアミノ トランスフ エラ一ゼ （GPT)
G PT
Lーァラニン +ひ一ケトグルタル酸 ~~►ピルビン酸+ L—グル夕ミ ン酸 グル夕 ミ ンシンセ夕一ゼ
L—グル夕 ミ ン酸 + NH4 + +ATP ►L—グル夕 ミ ン + ADP + P i
Mg2 + 上記反応において、 特に GPT活性測定として好適である。
これらの反応において、 添加する ATPの量は例えば 0. l〜50mM程度 、 好ましくは 0. 5〜1 OmM程度である。 また、 基質を定量する場合に、 添加 する酵素量は例えば 1〜 1 00 U/m 1程度である。 さらに、 酵素活性を測定す る場合の添加する基質は例えば 1〜 1 O OmM程度である。 これらの基質や酵素 以外の反応に関与する成分の反応試薬においては、 基質と反応して消費される成 分は上記基質の使用量と同量ないしそれの 2倍量程度でよく、 マグネシウムィォ ンの濃度としては好適には塩化マグネシウムとして例えば 0. 1〜5 OmM程度 、 好適には 0. 5〜1 OmM程度であるが、 特に反応において阻害を受けない限 りこれらより過剰量を使用することを除外するものではない。
またこれらの反応は、 前記反応式 4および 5とともに同一反応系としてもよ く、 また別反応系としてもよいが、 好ましくは同一反応系となすことである。
特に、 好適な例を述べると、 尿素の場合の既存測定法は、
(反応式 38)
ゥレアアミ ドヒ ドロラーゼ （E C 3. 5. 1. 5 )
ゥレア + H2 0 02 + 2NH3
グル夕ミ ン酸 II兑水素酵素
NH3 +ひーケ トグルタル酸 + N AD (P) H + H +
L一グル夕ミ ン + NAD (P) + 上記反応式 38に示す通り、 還元型 NAD (P) の減少法であり、 そのため，
( 8 ) 測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
(9) 測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型 NAD ( P) の量により制限される （測定レンジが狭い） 。
( 1 0) 還元型 NAD (P) の量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、 定量前に反応液内に存在させる還元型 NAD (P) の量を変える必要がある。
( 1 1 ) 分析用試薬中に含有される還元型 NAD (P) が不安定である。
( 1 2) ドライ用試薬への対応が不可能である。 等の欠点を有する。 さらに、 この測定法は原理的にアンモニアを測定する方法であるために、
( 1 3) 検体や試薬中のアンモニアを消去する必要がある。
それに対して、 本発明の測定法は、
(反応式 39)
ゥレアアミ ドヒ ドロラーゼ （E C 3. 5. 1. 45)
ATP+尿素 +H2 〇 -ADP + P i +C02 +2NH4 +
Mg2+, KHCOa
(反応式 4 0 )
ADP-HK
グルコース + AD P ►グルコース一 6—リン酸 (G 6 P) + AMP
Mg2 +
(反応式 4 1 )
G 6 PDH
G 6 P+NAD (P) + »グルコノラク トン一 6—リン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 39、 40、 4 1に示す通り、 還元型 NAD (P) の増加法であ り、 減少法により生じる欠点は全く無く、 さらに、 アンモニアの消去も必要とし なレ、優れた測定法であつた。
クレアチンキナーゼの場合の既存測定法は、
(反応式 42)
クレアチンキナーゼ
クレアチン + ADP ►クレアチンリ ン酸 + ATP
Mg2 +
へキソキナーゼ
グルコース + AT P »グルコース— 6—リ ン酸 (G 6 P) +ADP
Mg2 +
G 6 PDH
G 6 P+NAD (P) + ►ダルコノラク トン一 6—リン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 4 2に示した。 この反応系では基質となるクレアチンリ ン酸が非 常に高価で測定試薬の値段が高くなる欠点があつた。
それに対して、 本発明の測定法は、
(反応式 4 3)
クレアチンキナーゼ
クレアチン + ATP »クレアチンリ ン酸 + AD P
Mg2 +
(反応式 4 4)
ADP-HK
グルコース + AD P ^グルコース一 6—リ ン酸 （G 6 P) + AMP
Mg2 +
(反応式 4 5)
G 6 PDH
G 6 P +NAD (P) + »グルコノラク トン一 6—リ ン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 4 3、 4 4、 4 5に示す通り、 基質としてクレアチンを用いるた め測定試薬を安価に提供することができた。
クレアチニンの場合の既存測定法は、
(反応式 4 6)
クレアチニンアミ ドヒドロラーゼ
クレアチニン + H2 〇 ►クレアチン
クレアチンアミ ドヒ ドロラーゼ
クレアチン + H2 〇 ^ザルコシン十尿素
ザルコシンォキシダ一ゼ
ザルコシン + 02 +H2 〇 》グリシン + H2 〇2 +ホルムアルデヒ ド
上記反応式 4 6に示す通り、 ォキシダーゼ法であり、 検体中の還元物質 （ァ スコルビン酸等） の影響を受けるために測定値が不正確となり、 さらにザルコシ ンォキシダーゼがプロリンに作用し、 検体中のプロリ ンの影響を受ける等の欠点 を有する。
それに対して、 本発明の測定法は、
(反応式 47)
クレアチニンアミ ドヒ ドロラーゼ
ク レアチニン + H2 0 »ク レアチン
ク レアチンキナーゼ
ク レアチン + AT P 、りレアチンリ ン酸 + ADP
(反応式 48)
ADP-HK
グルコース + ADP »グルコース— 6— リ ン酸 (G 6 P) 十 AMP
Mg2 +
(反応式 4 9)
G 6 PDH
G 6 P + NAD (P) + ►グルコノラク トン一 6— リ ン酸 +
NAD (P) H + H
(反応式 50)
ク レアチニンディ ミナーゼ
ク レアチニン + H2 0 »N—メチルヒダン トイン + NH3
N—メチルヒダン トイナーゼ
N—メチルヒダン トイン + ATP + H2 0一"►力ルバモイルザルコシン + AD P
(反応式 5 1 )
ADP-HK
グルコース + AD P ^"ルコース一 6— リ ン酸 (G 6 P) + AMP
g2 +
(反応式 52)
G 6 PDH
G 6 P + NAD (P) + ►グルコノラク トン一 6— リ ン酸 +
NAD (P) H + H 上記反応式 4 7、 4 8、 4 9および 5 0、 5 1、 52に示す通り、 還元型 N AD (P) の増加法であり、 検体中の還元物質 （ァスコルビン酸等） やプロリ ン の影響を全く受けない。
卜リグリセリ ドの場合の既存測定法は、
(反応式 5 3)
リパーゼ
トリグリセリ ド + 3 H2 0 ——》グリセロール + 3脂肪酸
グリセロールキナーゼ
グリセロール + AT P ^"リセロールリン酸 + ADP
Mg2 +
グリセロールリン酸ォキシダーゼ
グリセロールリン酸 +〇2 +H2 〇 ~~►ジヒ ドロキシアセトンリン酸 + H2 〇2 上記反応式 5 3に示す通り、 ォキシダーゼ法であり、 検体中の還元物質 （ァ スコルビン酸等） の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、 本発明の測定法は、
(反応式 54)
リパーゼ
トリグリセリ ド + 3 H 2 0 ——、 リセロール + 3脂防酸
グリセロールキナーゼ
グリセロール + AT P »グリセロールリ ン酸 + AD P
Mg2 +
(反応式 5 5)
AD P -HK
グルコース + AD P »グルコース— 6—リン酸 （G 6 P) +AMP
Mg2 +
(反応式 5 6)
G 6 PDH
G 6 P +NAD (P) + ►グルコノラク トン一 6—リ ン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 54. 55. 56に示す通り、 還元方 NAD (P) の増加法であ り、 検体中の還元物質の影響を全く受けない。
なお、 上記反応式 54の卜リグリセリ ドの代わりにジグリセリ ドゃモノグリ セリ ド （これらの場合 2分子または 1分子の水分子を消費して 2分子または 1分 子の脂肪酸を遊離する反応式となる） の場合も同様である。
ホスファチジルコリ ンの場合の既存測定法は、
(反応式 57)
ホスホリパーゼ D
ホスファチジルコリ ン + H 2 0 ^ホシファチジン酸+コリ ン
コリ ンォキシダーゼ
コ リ ン +2〇2 +H2 〇 ►ベタイン + 2 H2 〇2 上記反応式 57に示す通り、 ォキシダーゼ法であり検体中の還元物質 （ァス コルビン酸等） の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、 本発明の測定法は、
(反応式 58)
ホスホリパーゼ D
ホスファチジルコ リ ン + H 2 〇 ^ホシファチジン酸十コ リ ン
コリ ンォキシダーゼ
コ リ ン + ATP »コ リ ンリ ン酸 + AD P
Mg2 +
(反応式 59)
ADP-HK
グルコース + A D P ^グルコース一 6— リ ン酸 （G 6 P) + AMP
Mg2 +
(反応式 60)
G 6 PDH
G 6 P + NAD (P) + ^グルコノラク トン一 6— リ ン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 58、 59、 60に示す通り、 還元型 NAD (P) の増加法であ り検体中の還元物質の影響を受けない。
ァスパラギン酸ァミノ トランスフヱラ一ゼ （GOT) の場合の既存測定法は、 (反応式 6 1 )
GOT
L—ァスパラギン酸 +ひ —ケトグルタル酸 ~~ ^オギザ口酢酸 +L—グル夕ミ ン酸 リ ンゴ酸脱水素酵素
オギザ口酢酸 + NAD (P) H + H+ ^L—リンゴ酸 + NAD + 上記反応式 6 1に示す通り、 還元型 NADの減少法であり、 そのため、
( 1 4) 測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
( 1 5) 測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型 NAD の量により制限される （測定レンジが狭い） 。
( 1 6) 還元型 NADの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、 定量前 に反応液内に存在させる還元型 NADの量を変える必要がある。
( 1 7) 分折用試薬中に含有される還元型 NADが不安定である。
( 1 8) ドライ用試薬への対応が不可能である。 等の欠点を有する。
さらに、 この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、 正確に測定す ることができない方法であった。
それに対して、 本発明での測定方法は、
(反応式 62)
GOT
Lーァスパラギン酸 +ひーケトグルタル酸 ^ »オギザ口酢酸 +L -グル夕ミ ン酸 グルタ ミ ンシンセ夕ーゼ
L -グル夕ミ ン酸 + NH4 + +ATP -グル夕ミ ン + AD P + P i
Mg2 +
(反応式 63)
ADP-HK
グルコース + AD P ^グルコース— 6— リ ン酸 (G 6 P) + AMP
Mg2 + (反応式 64 )
G 6 PDH
G 6 P +NAD (P) + *グルコノ ラク トン一 6— リ ン酸+
NAD (P) H + H + 上記反応式 62、 63、 64に示す通り、 還元型 NAD (P) の増加法であ り、 減少法により生じる欠点は全く無く、 さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去 も必要としなし、優れた測定法であつた。
ァラニンアミ ノ トランスフヱラーゼ （GPT) の場合の既存则定法は、 (反応式 65)
GPT
L—ァラニン +ひ 一ケ トグル夕ル酸 ~~►ピルビン酸 + L—グルタ ミ ン酸
乳酸脱水素酵素
ピルビン酸 + NAD (P) H + H+ ——》乳酸 + NAD + 上記反応式 65に示す通り、 還元型 NADの減少法であり、
(1 9) 測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
(20) 则定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型 NAD の量により制限される。 （測定レンジが狭い）
(2 1 ) 還元型 NADの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、 定量前 に反応液内に存在させる還元型 NADの量を変える必要がある。
(22) 分析用試薬中に含有される還元型 NADが不安定である。
(23) ドライ用試薬への対応が不可能である。 等の欠点を有する。
さらに、 この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、 正確に測定す ることができない方法であった。
それに対して、 本発明での測定法は、
(反応式 66)
G PT
L—ァラニン +ひ 一ケ トグルタル酸 ~~►ピルビン酸 +L—グル夕 ミ ン酸 グル夕ミ ンシンセ夕一ゼ
L一グル夕ミ ン酸 + NH4 + 十 ATP ^L—グル夕ミ ン + ADP + P i
Mg2 +
(反応式 6 7)
ADP-HK
グルコース + AD P ►グルコース— 6—リ ン酸 （G 6 P) + AMP
Mg2 +
(反応式 6 8)
G 6 PDH
G 6 P+NAD (P) + »グルコノラク トン一 6—リン酸 +
NAD (P) H + H + 上記反応式 6 6、 6 7、 6 8に示す通り、 還元型 NAD (P) の増加法であ り、 減少法により生じる欠点は全く無く、 さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去 も必要としない優れた測定法であった。
以下、 本発明の生体試料中の ADPを生成する酵素またはその基質の測定方 法を例をもって具体的に説明するが、 本発明の方法はこれらに限定されるもので ない。
図面の簡単な説明
第 1図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときの A DP 測定の検量線を示すものである。
第 2図は本発明によって 3 7 °Cでコバルトイオンを用いたときの AD P測定 の検量線を示すものである。
第 3図は本発明によって 3 7 °Cでマンガンイオンを用いたときの AD P測定 の検量線を示すものである。
第 4図は本発明によって 2 0 °Cでマグネシウムイオンを用いたときの A D P 測定の検量線を示すものである。 第 5図は本発明によって 4 0 °Cでマグネシウムイオンを用いたときの A D P 測定の検量線を示すものである。
第 6図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときの尿素则 定の検量線を示すものである。
第 7図は本発明によって 3 7てでマグネシウムイオンを用いたときのクレア チニン測定の検量線を示すものである。
第 8図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレア チニン測定の検量線を示すものである。
第 9図は本発明につて 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレアチ ン測定の検量線を示すものである。
第 1 0図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのグリ セロール測定の検量線を示すものである。
第 1 1図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのコリ ン測定の検量線を示すものである。
第 1 2図は本発明によって 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのグル 夕 ミン酸測定の検量線を示すものである。
第 1 3図は本発明によって 3 7 °Cでコバルトイオンを用いたときの尿素測定 の検量線を示すものである。
第 1 4図は本発明によって 3 7 °Cでマンガンイオンを用いたときのクレアチ ニン測定の検量線を示すものである。
第 1 5図は本発明によって 2 0 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレ ァチン測定の検量線を示すものである。
第 1 6図は本発明によって 4 0 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのグリ セロール測定の検量線を示すものである。
第 1 7図は本発明の代わりに 5 0 °Cにて反応したときの A D P測定の定量曲 線を示すものである。 発明の実施の形態
以下、 実施例、 参考例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、 本発明は これらの実施例、 参考例によって限定されるものではない。 参考例
ADP-HKの酵素活性測定法
測定試薬
5 OmM トリスー塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
2 0 mM グルコース
2 mM ADP
Figure imgf000035_0001
5 U/m 1 G 6 PDH
0. 0 2 5 % NBT (ニトロテトラブニゥムブル一）
1 mM NADP
1 % トリ トン X— 1 0 0
5 U/m 1 ジァホラ一ゼ （NADPH)
測定試薬 1 m 1を 3 7°Cで 1分間予備加温した後、 0. 0 2 m 1の酵素液を 添加して 1 0分間反応させる。 反応後、 0. 1 N塩酸を 2m 1添加して反応を停 止させ、 5分以内に層長 1. 0 cmのセルを用いて、 波長 5 5 0 nmにおける吸 光度を測定する （A s) 。 また盲検として酵素液のかわりに蒸留水 0. 0 2m l を用いて同一の操作を行って吸光度を測定する （Ab) 、 この酵素使用の吸光度 (A s) と盲検の吸光度 （Ab) の吸光度差 （A s - Ab) より酵素活性を求め る。 酵素活性 1単位は 3 7eCで 1分間に 1 モルの還元型 NAD Pを生成させる 酵素量とし、 計算式は下記の通りである。
酵素活性 （UZm 1 ) = (A s -Ab) χ θ . 7 9 5 x酵素の希釈倍率
〔ADP— HKの取得〕
P y r o c o c c u s f u r i o s u s DSM3 6 3 8の培養
培地組成 0 1 % 酵母エキス
0 5 % ト リプトン
0 1 2 % マルトース
2. 3 9 % Na C 1
0 , 4 % N a 2 S〇4
0 0 7 % KC 1
0 , 0 2% NaHC03
0 0 1 % KB r
0. 0 3 % H3 B04
1 0 8 % MgC 1 2
0. 1 5 % C a C 1 2
0 0 0 2 5 % S r C 1 2
0 0 2 5 % NH4 C 1
0 0 1 4 % K2 HP04
0 1 % CH3 COONa
0 0 0 1 5 % N (COOH) 3
0 0 0 0 5 % n S O 4
0 0 0 1 4 % F e S O 4
0 0 0 0 2 % N i C 1 2
0 0 0 0 1 % C o SO*
0 0 0 0 1 % Zn S04
0 0 0 0 0 1 % C u S 04
Figure imgf000036_0001
0 0 0 0 0 0 1 % N a 2 Mo 04
0 1 % システィン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地 （p H 7) 5 0 0m lを 5 0 0m l容三角フラ スコ 1 0本に分注し、 1 2 0て、 2 0分間、 加熱滅菌した後、 これに P y r o c o c c u s f υ r i o s u s DSM 3 6 3 8株の菌体懸濁液 1 0m lを移植 し、 攪拌させながら、 9 5°Cで 2 0時間培養し、 種培養液とした。 上記培地成分 を含む液体培地 2 0 0 1 / 3 0 0 1 タンクを滅菌した後、 種培養液を移植し、 攪 拌させながら、 9 5でで 1 5時間培養し、 5mUZm 1 の培養液 2 0 0 1 を得た。
〔ADP— HKの精製〕
得られた培養液 2 0 0 1を遠心分離して、 得られた菌体を 0. 9 %のN a C
1 を含む 2 Ο ΙΏΜのトリス一塩酸緩衝液 （ρΗ 7. 5) で 1回洗浄した。 洗浄菌 体を 2 0 mMのトリス—塩酸緩衝液 （Ρ Η 7. 5) に懸濁して 2 1に調整し、 ク ボタ社製の超音波破砕機 （ I NS ONATOR 2 0 1 Μ) を用いて 1 8 0 W、 3 0分間処理して、 菌体破砕液を得た。
この破砕液を 8 0 0 0 r pm、 3 0分間遠心分離し、 1. 8 1 (酵素活性 9 8 0 U) の上清を得た。 この上清を透析チューブを用いて 1 OmMのトリス一塩 酸緩衝液 （PH 7. 5) 8 1 に対して 5 で一夜透析した後、 1 0mMのトリス 一塩酸緩衝液 （pH 7. 5) で緩衝化した DE AE— S e p h a r 0 s e F F
(フアルマシア社製） 2 0 0m l ( 2. 6 x 3 8 cm) のカラムに通し、 0〜 1 モルの N a C 1のリニアグラジェントで溶出を行った。 その結果、 0. 0 8〜0 • 1モルの Na C 1濃度で活性画分 （ 9 5 0 U) が溶出された。 この得られた活 性画分に 4 Mとなるように N a C 1 を溶解し、 4Mの N a C 1で緩衝化された P h e n y l - S e p h a r o s e F F (フアルマシァ社製） 2 0 0 m l ( 2.
6 X 3 8 c m) のカラムに通し、 4〜0MのNa C 1のリニアグラジェントによ り溶出を行った。
その結果、 0. 0 2から 0. 0 7モルの Na C 1濃度で活性画分 （ 9 0 0 U) が得られた。 この得られた活性画分を 1 OmMトリス—塩酸 （pH 7. 5) 8 1 に 5 °C、 一夜透析した後、 1 OmMトリス—塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) で緩衝化 したヒ ドロキシァパタイ ト （ペンタツクス社製） 1 0 0m l (2. 6 x 1 9 cm ) のカラムに通し、 0〜0. 5 Mのリン酸緩衝液 （p H 7. 5) のリニアグラジ ェントにより溶出を行った。 その結果、 0. 0 2〜0. 0 3Mのリン酸緩衝液濃 度で活性画分 （ 8 5 0 U) が溶出された。 この酵素液を凍結乾燥して 5 m gの酵 素粉末 （ 1 7 0 U/mg) を得た。
ADP-HKの理化学的性質は以下の通りであつた。
CADP-HKの理化学的性質〕
( 1 ) 酵素作用
基黉としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
グルコース + AD P »グルコース— 6—リ ン酸 + AMP
Mg2 +
( 2 ) 分子量
ト一ソ一社製 TS K— G 30 0 0 SWXL ( 0. 7 5 X 3 0 cm) を用いたゲ ル濾過法により測定した ADP - HKの分子量は 1 0 0 0 0 0 ± 5 0 00であつ た。
( 3) 至適 pHは pH 6. 0〜7. 0 (リ ン酸緩衝液） であった。
( ) 至適温度は 8 0〜 1 0 0でであることから高度好熱性 A DP— HKと認 められた。 実施例 1
< 3 7。Cでマグネシゥムイオンを用いたときの A D Pの定量〉
測定試薬
5 0 mM トリスー塩酸緩衝液 （PH 7. 5) 20 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000038_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
ADPを 2. 6mM、 5. 2mM 7. 8mM、 1 0. 4mM、 1 3mMの 水溶液に調整し、 ADPサンプルを作成した。 測定試薬 l m 1に ADPサンプル 2 0 1加え、 3 7° (：、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを 対照にして測定した。 測定結果は第 1図 （横軸：最終濃度として表示） に示すよ うに ADPが定量的に測定できた。 実施例 2
< 3 7 °Cでコバルトイオンを用いたときの A DPの定量〉
測定試薬
5 0 mM 卜リスー塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000039_0001
1 0 U/m 1 ADP-HK
測定方法
ADPを 2. 3mM、 4. 6 mM, 6. 9 m , 9. 2mM、 1 1. 5 mM の水溶液に調整し、 ADPサンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1に ADPサンプ ル 2 0〃 1加え、 3 7て、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブランク を対照にして測定した。 測定結果は第 2図に示すように A D Pが定量的に測定で きた。 実施例 3
< 3 7。Cでマンガンイオンを用いたときの ADPの定量〉
測定試薬
5 0 mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 7 5) 20 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000039_0002
1 0 U/m 1 ADP-HK 測定方法
ADPを 2. 5mM、 5. OmM、 7. 5mM、 1 0. 0 mM, 1 2. 5 m Mの水溶液に調整し、 ADPサンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1に ADPサン プル 2 0〃 1加え、 3 7°C、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブラン クを対照にして測定した。 測定結果は第 3図に示すように AD Ρが定量的に測定 できた。 実施例 4
< 2 0 °Cでマグネシゥムイオンを用いたときの AD Pの定量 >
測定試薬
5 0 m ト リス一塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 2 OmM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000040_0001
2 0 U/m 1 ADP-HK
測定方法
ADPを 2. 8mM、 5. 6 mM, 8. 4mM、 1 1. 2 mM, 1 4 mMの 水溶液に調整し、 ADPサンプルを作成した。 測定試薬 l m 1に ADPサンプル 2 0 // 〗加え、 2 0て、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを 対照にして測定した。 測定結果は第 4図に示すように A D Pが定量的に測定でき た。 実施例 5
< 4 0てでマグネシウムイオンを用いたときの ADPの定量 >
測定試薬
5 OmM トリス一塩酸緩衝液 （pH 7 5)
2 0 mM グルコース 5 U/m 1 G 6 P DH
1 mM NAD P
Figure imgf000041_0001
5 U/m 1 AD P -HK
測定方法
AD Pを 2 7mM、 5. 4 mM. 8. 1 mM, 1 0. 8 mM, 1 3. 5 m Mの水溶液に調整し、 ADPサンブルを作成した。 測定試薬 1 m 1に AD Pサン プル 2 0 1加え、 4 0°C、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブラン クを対照にして測定した。 測定結果は第 5図に示すように A D Pが定量的に測定 できた。 実施例 6
< 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときの尿素の定量 >
測定試薬
5 0 mM トリス—塩酸緩衝液 （P H 5) 3 0 U/m 1 ゥレアアミ ドリア一ゼ
2 mM ATP
1 0 mM KC 1
8 mM KHC〇3
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
2 mM MgC 12
5 U/m 1 ADP— HK
測定方法
尿素を 2. 6 mM, 5. 2mM、 7. 8 mM, 1 0. 4 mM, 1 3mMの水 溶液に調整し、 尿素サンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1に尿素サンプル 2 0 1加え、 3 7て、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを対照に して測定した。 測定結果は第 6図に示すように尿素が定量的に測定できた, 実施例 7
< 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量 （ 1 ) 〉 測定試薬
5 0 mM トリスー塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 1 0 0 U/m 1 クレアチニンアミ ドヒ ドロラーゼ
5 U/m 1 クレアチンキナーゼ
2mM ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000042_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
クレアチニンを 2. 6mM、 5. 2mM、 7. 8mM, 1 0. 4 m . 1 3 m IV [の水溶液に調整し、 クレアチニンサンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1にク レアチニンサンプル 2 0 1を加え、 3 7°C、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光 度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 7図に示すようにクレ ァチニンが定量的に測定できた。 実施例 8
< 37 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量 （ 2 ) > 測定試薬
5 OmM トリスー塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
1 0 U/m 1 クレアチュンディ ミナーゼ
1 0 U/m 1 N—メチルヒダントイナーゼ
2mM ATP 2 0 m グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000043_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
クレアチニンを 2. 7 m , 5. 3 mM. 7. 9 mM, 1 0. 5 mM, 1 3 mMの水溶液に調整し、 クレアチニンサンプルを作成した。 測定試薬 i m lにク レアチニンサンプル 2 0〃 1を加え、 3 7°C、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光 度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 8図に示すようにクレ ァチニンが定量的に測定できた。 実施例 9
く 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの測定〉 測定試薬
5 0 mM トリス一塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
5 U/m 1 クレアチンキナーゼ
2mM ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000043_0002
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
クレアチンを 2. 6 mM, 5. 2mM、 7. 8 mM, 1 0. 4 mM, 1 3m Mの水溶液に調整し、 クレアチンサンプルを作成した。 測定試薬 l m lにクレア チンサンプル 20〃 1を加え、 3 7° (：、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 则定結果は第 9図に示すようにクレアチン が定量的に測定できた ( 実施例 1 0
く 3 7 °Cでマグネシウムイオンを用いたときのグリセ口一ルの測定 > 測定試薬
5 0 mM トリス一塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
5 U/m 1 グリセロールキナーゼ
2 mM ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM Na DP
Figure imgf000044_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
グリセロールを 2. 6 mM, 5. 2 mM, 7. 8 mM, 1 0. 4mM、 1 3 mMの水溶液に調整し、 グリセロールサンプルを作成した。 測定試薬 l m lにグ リセロールサンプル 20〃 1を加え、 3 7で、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光 度を、 試薬ブランクを対照にして则定した。 測定結果は第 1 0図に示すようにグ リセロールを定量的に測定できた。 また、 トリグセリ ドにリパーゼを作用させ遊 離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼ Dを作用さ せ遊離するグリセロールも測定することができた。 実施例 1 1
< 3 7ででマグネシゥムイオンを用いたときのコリ ンの測定 >
測定試薬
5 OmM トリス一塩酸緩衝液 （P H 7 5)
5 U/m 1 コリンキナーゼ
2mM ATP 2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM Na DP
Figure imgf000045_0001
5 U/m 1 AD P -HK
測定方法
塩化コリンを 2. 6 mM, 5. 2mM、 7. 8 mM, 1 0. 4mM、 1 3m Mの水溶液に調整し、 塩化コリンサンプルを作成した。 測定試薬 l m lに塩化コ リ ンサンプル 2 0〃 1を加え、 3 7て、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 1 1図に示すようにコリ ンを 定量的に測定できた。 また、 リ ン脂質にホスホリパーゼ Dを作用させ、 遊離する コリ ンも測定することができた。 実施例 1 2
< 3 7てでマグネシゥムイオンを用いたときの L—グルタミ ン酸の測定 > 測定試薬
5 0 mM トリス—塩酸緩衝液 （PH 7. 5) 1 0 U/m 1 グル夕 ミ ンシンセ夕一ゼ
1 0 mM NH4 C 1
2mM ATP
20 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000045_0002
5 U/m 1 ADP-HK
測定法方
L一グルタ ミ ン酸を 2. 6 mM. 5. 2mM、 7. 8 mM, 1 0. 4 mM、 1 3 mMの水溶液に調製し、 L一グルタ ミ ン酸サンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1に L一グルタ ミ ン酸サンプル 2 0 1を加え、 3 7°C、 5分間加温後の 3 4 O nmの吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 1 2図に 示すように L一グルタミ ン酸が定量的に測定できた。 また、 ァスパラギン酸トラ ンスフェラ一ゼ （GOT) ゃァラニントランスフヱラーゼ （GPT) の作用によ つて遊離する L一グル夕ミ ン酸も測定することができた。 実施例 1 3
< 3 7 °Cでコバルトイオンを用いたときの尿素の定量 >
測定試薬
5 0 mM トリス一塩酸緩衝液 （pH 5) 3 0 U/m 1 ゥレアアミ ドリアーゼ
2mM ATP
1 0 mM KC 1
8 mM KHCOs
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000046_0001
1 0 U/m 1 ADP-HK
測定方法
尿素を 2. 3 mM. 4. 6 mM. 6. 9 mM, 9. 2mM、 1 1. 5mMの 水溶液に調整し、 尿素サンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1に尿素サンプル 20 1加え、 3 7 °C、 5分間加温後の 34 0 n mの吸光度を、 試薬ブランクを対照 にして则定した。 測定結果は第 1 3図に示すように尿素が定量的に測定できた。 実施例 1 4
< 3 7 °Cでマンガンイオンを用いたときのクレアチニンの定量〉
測定試薬 5 0 mM トリス一塩酸緩衝液 （P H 7. 5) 1 0 0 U/m 1 クレアチニンアミ ドヒ ドロラーゼ
5 U/m 1 クレアチンキナーゼ
2mM ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
2 mM Mn C】 2
1 0 U/m 1 A D P - H K
測定方法
クレアチニンを 2. 5mM、 5. 0 mM. 7. 5 mM, 1 0. 0 mM, 1 2 . 5mMの水溶液に調整し、 クレアチュンサンプルを作成した。 測定試薬 1 m 1 にクレアチニンサンプル 20 1を加え、 3 7°C、 5分間加温後の 3 4 0 nmの 吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 1 4図に示すよう にクレアチニンが定量的に測定できた。
実施例 1 5
< 2 0°Cでマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの则定〉 測定試薬
5 0 mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 7. 5)
5 U/m 1 クレアチンキナーゼ
2m ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000047_0001
2 0 U/m 1 ADP-HK
測定方法 クレアチンを 2. 8mM、 5. 6mM、 8. 4 mM, 1 1. 2mM、 1 4m Mの水溶液に調整し、 クレアチンサンプルを作成した。 測定試薬 l m lにクレア チンサンプル 2 0 1を加え、 20°C、 5分間加温後の 3 4 0 nmの吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 1 5図に示すようにクレアチ ンが定量的に測定できた。 実施例 1 6
< 4 0°Cでマグネシウムイオンを用いたときのグリセロールの測定 > 測定試薬
5 OmM トリス—塩酸緩衝液 （p H 7. 5 )
5 U/m 1 グリセロールキナーゼ
2 mM ATP
2 0 mM グルコース
5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NADP
Figure imgf000048_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
グリセロールを 2 7 mM. 5. 4mM、 8. 1 mM. 1 0. 8 mM, 1 3 . 5mMの水溶液に調整し、 グリセロールサンプルを作成した。 则定試薬 1 m 1 にグリセロールサンプル 2 0 1を加え、 4 0°C、 5分間加温後の 34 0 nmの 吸光度を、 試薬ブランクを対照にして測定した。 測定結果は第 1 6図に示すよう にグリセロールを定量的に測定できた。 また、 トリグセリ ドにリバ一ゼを作用さ せ遊離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼ Dを作 用させ遊離するグリセロールも測定することができた。
参考例 2
< 5 0°Cのときの ADOの定量性〉 測定試薬
5 0 mM トリス一塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 2 0 mM グルコース
0. 5 U/m 1 G 6 PDH
1 mM NAD P
Figure imgf000049_0001
5 U/m 1 ADP-HK
測定方法
ADPを 0 5mM、 1 0 mM. 1 5mMの水溶液に調整し、 ADPサンプ ルを作成した。 则定試薬 1 m 1を 5 0°Cで 5分間予備加温した後、 A DPサンプ ル 2 0 1を加え、 5 0°C、 5分間加温後の 34 0 nmの吸光度を、 試薬ブラン クを対照にして測定した。 測定結果は第 1 7図に示すように 5 0°Cでは定量的な 測定はできなかった。 発明の効果
本発明の測定方法では、 還元型 NAD (P) 類の生成量に基づいて生体物質 を測定するので测定限界が高く、 また分子吸光係数が明確になっている還元型 N AD (P) 類を測定するので、 測定値の信頼性が高い。 更に、 本発明の測定方法 は、 検体中の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。 従って、 本発 明によれば、 生体試料中に存在する ADPまたは生体試料中の ADPを生成する 酵素とその基質を簡便にして高精度で測定することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 酵素反応を用いて被検液中の AD Pを測定する方法において、 被検液 を少なく ともグルコース、 ADP依存性へキソキナーゼ、 酸化型 NAD (P) 類 、 グルコース— 6—リ ン酸脱水素酵素およびマグネシウムイオン、 コバルトィォ ンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた 1種または 2種以上のィォン放 出性塩類の存在下、 1 5〜4 5での温度条件にて反応させ、 被検液中の ADPを 反応によって生成される AMPとともに、 還元型 NAD (P) 類の生成量に基づ いて測定する方法。
2. ADPが、 存在または形成された ADPである請求の範囲第 1項に記 載の測定する方法。
3. ADP依存性へキソキナーゼが、 高度好熱性 ADP依存性へキツキナ ーゼである請求の範囲第 1項に記載の測定する方法。
4. 温度条件が 2 0〜4 0°Cである請求の範囲第 1項に記載の測定する方 法。
5. ADP依存性へキソキナーゼおよびグルコース一 6—リ ン酸脱水素酵 素が 0. 1〜 1 0 0 U/m 1、 グルコースが 0. 5〜 1 0 0 mM、 酸化型 NAD
(P) 力 0. 5〜5 OmM、 イオン放出性塩類が 0. l〜5 0mMの濃度である 請求の範囲第 1項に記載の測定する方法。
6. 酵素反応を用いて被検液中の ADPを生成する酵素またはその基質の —方を測定する方法において、 ADPを生成する酵素またはその基質の一方を含 有する被検液を少なく とも ADPを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与 する成分の反応試薬、 ATP、 グルコース、 ADP依存性へキソキナーゼ、 酸化 型 NAD (P) 類、 グルコース— 6—リ ン酸脱水素酵素およびマグネシウムィォ ン、 コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか 1種または 2種以上のィォ ン放出性塩類の存在下、 1 5〜4 5 °Cの温度条件にて反応させ、 被検液中の AD Pを生成する酵素またはその基質を反応によって生成される AMPとともに、 還 元型 NAD (P) 類の生成量に基づいて測定する方法。
7. ADPを生成する酵素がゥレアアミ ドヒ ドロラーゼであり、 その基質 がゥレアである請求の範囲第 6項に記載の測定する方法。
8. ADPを生成する酵素がクレアチンキナーゼであり、 その基質がクレ ァチンである請求の範囲第 6項に記載の測定する方法。
9. クレアチンが、 クレアチニンにクレアチニナ一ゼを作用させて遊離さ れたクレアチンである請求の範囲第 8項に記載の測定する方法。
1 0. ADPを生成する酵素が N—メチルヒダントイナ一ゼであり、 その基 質が N—メチルヒダントインである請求の範囲第 6項に記載の測定する方法。
1 N—メチルヒダントインカ^ クレアチニンにクレアチニンディ ミナ一 ゼを作用させて遊離された N—メチルヒダントインである請求の範囲第 1 0項に 記載の測定する方法。
1 2. ADPを生成する酵素がグリセロールキナーゼであり、 その基質がグ リセロールである請求の範囲第 6項に記載の測定する方法。
】 3. グリセロールが、 リパーゼの作用によってトリグリセリ ド、 ジグリセ リ ドまたはモノグリセリ ドから遊離されたグリセロールまたはホスホリパーゼ D の作用によるホスファチジルグリセロールから遊離されたグリセロールである請 求の範囲第 1 2項に記載の測定する方法。
1 4. ADPを生成する酵素がコリンキナーゼであり、 その基質がコリ ンで ある請求の範囲第 6項に記載の则定する方法。
1 5. コリ ンが、 ホスホリパ一ゼ Dの作用によるホスファチジルコリ ンまた はコリンエステラーゼの作用によるコリンエステルから遊離されるコリンである 請求の範囲第 1 4項に記載の測定する方法。
1 6. A D Pを生成する酵素がグルタミ ンシンセ夕一ゼまたはグルタミ ン酸 キナーゼであり、 その基質が L一グル夕ミン酸である請求の範囲第 6項に記載の 測定する方法。
1 7. L—グルタミン酸が、 L—ァスパラギン酸及びひーケトグルタル酸か らァスパラギン酸ァミノ トランスフヱラーゼの作用により形成される L—グル夕 ミ ン酸である請求の範囲第 1 6項に記載の測定する方法。
1 8. L—グルタミ ン酸が、 L—ァラニン及びひーケトグルタル酸からァラ ニンアミノ トランスフェラーゼの作用により形成される L一グル夕ミ ン酸である 請求の範囲第 1 6項に記載の測定する方法。
1 9. ADP依存性へキソキナーゼが、 高度好熱性 ADP依存性へキツキナ ーゼである請求の範囲第 6項に記載の则定する方法。
20. 温度条件が 20〜4 (TCである請求の範囲第 6項に記載の则定する方 法。
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