WO1996020275A1

WO1996020275A1 - PROCEDE DE FABRICATION DE L'ACIDE D-N-CARBAMYLE-α-AMINE

Info

Publication number: WO1996020275A1
Application number: PCT/JP1995/002688
Authority: WO
Inventors: Hirokazu Nanba; Kazuyoshi Yajima; Masayuki Takano; Yukio Yamada; Yasuhiro Ikenaka; Satomi Takahashi
Original assignee: Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-26
Publication date: 1996-07-04
Also published as: KR100244066B1; EP1616946A1; DE69535398D1; CN1916164A; EP1616945A1; EP0801131A4; DE69535653T2; CN100406553C; CN1171812A; EP0801131A1; KR987001034A; EP1616945B1; ES2281075T3; CN1502701A; CN100516197C; EP0801131B1; CN1082090C; DE69535653D1; DE69535398T2

Description

明細書

D— N—力ルバモイルー一アミノ酸の製造法発明の分野

本発明は、 D— N—力ルバモイルー一アミノ酸の製造法、特に、 5— 置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応する D— N—力ルバモィルー α—ァミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）に関与する遺伝子を有する新規形質転換体を使用した D— Ν—力ルバモイル一 α—アミノ酸の製造法に関する。

従来の技術

光学活性な D— Ν—力ルバモイルー α—ァミノ酸は、対応する光学活性な D— a;—アミノ酸に変換することができ、光学活性な D—ひ一ァミノ酸は医薬中間体として重要な化合物である。特に、半合成ペニシリン類や半合成セファロスポリン類の製造中間体としての、 D—フヱニルグリシン、 D—パラヒドロキシフヱ二ルグリシンなどが工業的に有用な化合物として挙げられる。

D— Ν—力ルバモイルー α—ァミノ酸の製造法としては、 5—置換ヒダン卜インを不斉的に開裂加水分解して対応する D— Ν—力ルバモイルー α 一アミノ酸に、微生物の酵素作用を利用して変換する方法が知られており、特開昭 5 3— 9 1 1 8 9号、特開昭 5 3— 4 4 6 9 0号、特開昭 5 3— 6 9 8 8 4号、特開昭 5 3— 1 3 3 6 8 8号等に記載されている。

また、 5—置換ヒダントインを対応する D— N—力ルバモイルーひ一ァミノ酸に変換する酵素であるヒダントイナーゼに関与する遣伝子を、高温菌より取得して、これを中温菌に導入することにより、ヒダントイナーゼ活性を有する組換え体微生物を製造する方法については、特開昭 6 2— 8 7 0 8 9号に記載されている。また、 W0 9 4 / 0 0 5 7 7にはァグロバクテリウムに厲する菌からヒダントイナーゼ遺伝子断片を分離し、エシュリヒア · コリまたはァグロパクテリゥム厲細菌に導入して活性を発現させている。

発明の目的

上記の、微生物の酵素作用を利用する方法は、酵素の供給源として知られる微生物ではいずれも酵素生産量が十分でなく、さらに、培養培地が高価である等の欠点を有していた。

また、特開昭 6 2— 8 7 0 8 9号に示される組換え体微生物については、ヒダン卜イナーゼ活性を有する胞子形成高温菌と比較して数倍程度しか酵素活性が向上しておらず酵素の生産量は十分とはいいがたい。

また、上記組換え体微生物を用いて、 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応する D— N—力ルバモイルー α—ァミノ酸を生成蓄積させた例は全く示されていない。

本発明は、このような問題を解決すべく、酵素の生産性が極めて高い微生物を創製するとともに、このようにして得られた酵素源を使用して、 D —Ν—力ルバモイルー α—ァミノ酸を効率よく生産することを目的とする _c 発明の概要

組換え D N A手法を用いて、ヒダントイナーゼを生産する微生物を取得する方法については、特開昭 6 2— 8 7 0 8 9号および W0 9 4ノ0 0 5 7 7に示されているが、ヒダントイナーゼ遺伝子の供給源となる微生物は、本発明でヒダン卜イナーゼ遺伝子を取得した微生物とは全く異なるものである。さらにヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列や、アミノ酸配列も、本発明のものとはかなり相違がある。本発明は、バチルス（Bacillus) sp. KNK245 (FERM B P-4863) 、ァグロパクテリゥム（Agrobacterium) sp. KNK 7 12 (FERM BP— 1900) またはシユードモナス（ P seudomonas) sp. KNK003A (FERM BP— 3181) に由来するヒダントイナーゼに関与する遗伝子を含む DN A断片と、ベクター DN Aとの組換え体 DNAを用いェシエリヒア厲、シユードモナス厲、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア厲、ァグロバクテリウム厲、コリネバクテリゥム属またはブレビバクテリゥム厲に属する微生物のような宿主菌体を形質転換して得られる形質転換体の生産する当該酵素を、水性媒体中で 5— 置換ヒダントインに作用させる D— N—力ルバモイルーなーァミノ酸の製造法を提供するものである。

本発明により得られるようなヒダントイナーゼの生産性が極めて高い形質転換体はこれまで知られておらず、この形質転換体の酵素を作用させることにより非常に効率良く経済的に D— N—力ルバモイルーなーァミノ酸を製造することが可能になった。

以下、添付の図面を参照し、本発明を詳細に説明する。

図面の簡単な説明

図 1は、プラスミド pAH 1043の制限酵素地図である。

図 2は、ブラスミド pTHl 02の制限酵素地図である。

図 3は、ブラスミド pTHl 03の制限酵素地図である。

図 4は、プラスミド pTHl 04の制限酵素地図である。

図 5は、ブラスミド pPHD 301の制限酵素地図である。

図 6は、ブラスミド pTHB 301の制限酵素地図である。

発明の詳細な説明

本発明に用いる遗伝子を含む DNA断片は、バチルス sp. KNK24 5 ァグロパクテリゥム sp. KNK 712またはシユードモナス sp. KNK 003 Aから得ることができる。ァグロパクテリゥム sp. KNK 712およびシユードモナス sp. KNK003 Aは、各々、 FERM BP— 1900および FERM BP— 3181の受託番号の下、本出願人により既に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、また、 W092/10579にその詳細が記載されている公知株である。また、バチルス sp. KNK245は、この度、本発明者らにより、新たに見いだされた菌株で、 1994年 11月 12曰より、 FERM BP— 486 3の受託番号の下、同研究所に寄託されている。

つぎに、バチルス sp. KNK 245の菌学的性質を示す。

バチルス sp. KNK245

菌の形態桿菌、フィラメント状

菌の大きさ 0. 5〜0. 8 X 3〜： L 0 ( um)

グラム染色性 +

胞子形成 +

ji動 te

生育温度 37て〜 60°C

生育 pH 5. 0〜8. 9

5%NaClでの生育

7%NaClでの生育

0. 02%アサイドでの生育

0. 001%リゾチームでの生育

硝酸の還元

デンプンの分解 +

カゼィンの分解 + チロシンの分解一

カタラーゼ一

ォキシダーゼ +

ィンドール生成一

糖からの酸生成

マンノース（+ )

キシロース一

ァラビノース +

ラムノース一

グルコース +

フルクトース +

ラフイノース一

シユークロース +

マルトース +

ラクトース一

かかる菌株からヒダントイナ一ゼ遺伝子を得るには、通常以下の様に行ラ。

まず、微生物の菌体より染色体 DNAを抽出し、つぎに、染色体 DNA を適当な制限酵素、例えば、 Sau3 A I等で部分加水分解した後に、べクター DN Aと結合させて、種々の染色体 DN Aの断片をもつ組換え体 DN Aを遺伝子ライブラリーとして得る（特開昭 58— 126789号および米国特許第 4, 237.224号明細書参照)。

そして、この遺伝子ライブラリーから目的とする遺伝子を含む組換え菌を選択するが、これは発現した蛋白を酵素活性等を指標として検出したり、蛋白の N末端配列を解析してそれに対応する DN Aプローブを合成してコロニーハイプリダイゼーション等で遺伝子の存在を検出すること等によつて行うことができる。また、既知のヒダントイナーゼの塩基配列をもとに適当な部分の配列を合成した DN Aプライマーを用い、コロニーハイプリダイゼーションゃポリメラーゼ ·チヱイン . リアクション（P CR) 法によって遺伝子を取得することもできる。遺伝子が取得できると、その塩基配列を解析する。また、ヒダントイナーゼを生産する微生物および、この酵素遺伝子を導入した組換え微生物を培養して、生産した酵素を精製し、その蛋白の分子量を決定するとともに、ァミノ末端付近のァミノ酸配列を気相プロテインシークェンサ一などで決定する。

ついで、これらの DNA塩基配列と蛋白のァミノ末端配列とを比較し、ヒダントイナーゼ蛋白をコードした塩基配列部分の蛋白への翻訳開始部位を決定し、この部位より翻訳終止コドンまでの遺伝子部分に酵素蛋白がコ一ドされていることを蛋白の分子量との関係も考慮して確かめ、目的とする遺伝子であることを確認する（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. , し old Spring Harbor Laboratory Press 第 4章、第 13章）。これにより、バチルス sp. KNK245、ァグロパクテリゥム sp. KNK 712およびシユードモナス sp. KNK00 3 Aより配列表の配列番号 1、 2および 3の DNA断片を得た。よく知られているごとく、こうして得られた当該酵素をコードした遺伝子およびまたはこれを含む DNA断片は、通常、 1つのアミノ酸に複数の塩基コドンが対応していることから、当該遺伝子および Zまたは DNA断片に対応するアミノ酸配列をコードした他の塩基配列を持つ DN A断片と等価である。本発明に用いるベクタ一としては、ェシヱリヒア厲、シユードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス厲、セラチア厲、コリネバクテリゥム厲またはブレビパクテリゥム属に属する細菌の細胞内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用出来る。

例えば、「組換え DNA実験指針一解説 · Q&A—」（組換え DNA実験指針研究会編、科学技術庁ライフサイエンス課監修、第一法規出版 (株）、平成 3年 9月 24曰改訂） 25〜27頁および 36〜38頁に記載の宿主一べクタ一系を用いることが出来る。また、強力な構造プロモーターをもつように改質したべクターを使用して、ベクター上の適切な位置に翻訳開始部位を連結した組換え D N Aを使用することにより酵素の生産量を上昇させることができる。これらの断片の両端を制限酵素で切断して、適当なベクターとの組換え体 DNAを作製して、ェシヱリヒア属、シユードモナス厲、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア厲、ァグロパクテリゥム属、コリネバクテリゥム属またはブレビパクテリゥム厲に属する微生物を直接形質転換してヒダントイナーゼを生産する組換え体微生物を取得することができる。

上記の属の菌種を直接形質転換しないで、例えば、ェシヱリヒア · コリのような他の微生物の宿主ベクター系にて目的遺伝子を一旦クローン化し、しかる後に適当なベクタ一との組換え体 DN Aを作製してから、上記の属の菌種を形質転換しても、同様にヒダントイナーゼを生産する組換え体微生物を取得することができる。

組換え体製造のためには、 S. N. Cohen et al. 米国特許第 4, 23 7.224号明細書、遺伝子操作実験法 [高木康敬編著、講談社サイェンティフィック (1980八 Method in Enzymology, 68. Recombinant DNA[Ray Mv編、 Academic Press( 1979 )]、特開昭 58— 12 6 7 8 9号明細書などの文献の記載が広く応用できる。。

クローンした目的遺伝子の不要な D N Aを取り除き、強力なプロモータ一を持つように改質したベクターを使用して、ベクター上の適切な位置に翻訳開始部位を連結した組換え D N Aを使用して上記の宿主菌を形質転換し、得られる形質転換株を用いることにより、目的酵素の生産量を上昇させることができる。

形質転換株は、通常の栄養培地に培養することにより、導入した組換え体 D N Aの形質を発現させることができる。組換え体 D N Aに遗伝子 D N Aまたはベクター D N A由来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補ってもよい。

このようにして得られた形質転換株を酵素源として得るには、通常の培地を用いて培養を行なえばよいが、必要に応じて、ヒダントイン化合物、ゥラシル、ィソプロピル一 1一チォー ;5— D—ガラクトサイド（ I P T G ) などの添加、温度上昇など、酵素誘導のための処理を行なうこともできる c 形質転換株の培養のために用いられる培地は、通常、炭素源、窒素源および無機イオンを含有する普通の培地であってよい。これにビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースゃシユークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニゥム塩などが用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムィォン、鉄イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅ィオン、アルミニウムイオン、モリブデンイオンなどが使用されてよい。培養は、好気的条件下に pH 4〜8、温度 2 5〜6 (TCの適当な範囲に制御しつつ、 1〜1 0日間培養を行なえば、望ましい結果が得られる。形質転換株の産生する酵素を作用する態様としては、当該転換株の培養液、菌体、菌体処理物、菌体から抽出した酵素、固定化菌体などを挙げることができる。

菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液より分離された菌，洗浄された菌体などいずれも使用可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエンや界面活性剤と接触させた菌体、リゾチームで処理した菌体、超音波処理した菌体、機械的に摩砕した菌体などの他、これら菌体の処理物から得られたヒダントイナーゼ活性を有する酵素抽出液、さらには、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、酵素蛋白の固定化用担体（例えば、陰イオン交換樹脂）への固定化物などが使用出来る。なお、固定化法については、例えば、特開昭 6 3— 1 8 5 3 8 2号明細書が参考になる。

固定化に使用される支持体としては、デュオライト（Duolite) A 5 6 8 または D S 1 7 1 8 6 (ローム ·アンド ·ハース社：登録商標）などのフエノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、アンバーライト（Amberlite) I R A 9 3 5、 I R A 9 4 5、 I R A 9 0 1 (ローム 'アンド 'ハース社：登録商標）、レワタイト（L ewatit) O C 1 0 3 7 (バイエル社：登録商標）、ダイアイオン（D iaion) E X— 0 5 (三菱化成工業:登録商標）などのポリスチレン樹脂のような各種ァミンゃアンモニゥム塩あるいはジエタノールァミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他 D E A E—セルロースなどの支持体も使用することができる。

さらに、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例として、グルタルアルデヒトを挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけでなく、部分精製酵素、菌体破砕液、無細胞抽出液など種々の精製度のものが使用できる。固定化酵素の調製は支持体に酵素を吸着後、架橘処理をする等の通常の調製法が使用できる。

本発明における酵素反応の基質となる、 5—置換ヒダントインは特に限定するものではなく、通常この種の反応に使用されるもの、いずれでもよい。例えば、一般式（1) ： o C =

R-CH-C=0

HN NH (1)

で表わされる化合物が挙げられる。

一般式（1) の化合物における置換基 Rは広範囲にわたることができるが、特に、医薬中間体のように産業上有用な化合物を与えるためには、 R がフヱニル基、水酸基で置換されたフヱニル基、アルキル基、置換アルキル基、ァラルキル基、またはチェニル基であるのが好ましい。水酸基で置換されたフヱニル基の場合、水酸基は 1つもしくはそれ以上であって、 0 ―、 m—、 p—いづれの位置に置換していてもよいが、 p—ヒドロキシフエニル基が代表的である。アルキル基は炭素数 1〜4であって、対応する D 一 N—力ルバモイルーなーァミノ酸が D— N—力ルバモイルーァラニン、 D— N—力ルバモイルーバリン、 D— N—力ルバモイルーロイシン、 D— N—力ルバモイルーイソロイシンなどとなる基である。置換アルキル基は炭素数 1~4のアルキル基が水酸基、アルキルチオ基、カルボキシル基、アミノ基、フユニル基、水酸基で置換されたフニニル基、アミド基などで置換されたものであって、対応する D— N—力ルバモイルーァミノ酸が D 一 N—力ルバモイルーセリン、 D— N—力ルバモイルースレオニン、 D— N—力ルバモイルーメチォニン、 D— N—力ルバモイルーシスティン、 D 一 N—力ルバモイルーァスパラギン、 D— N—力ルバモイルーグルタミン、 D— N—力ルバモイルーチロシン、 D— N—力ルバモイルートリブトファン、 D— N—力ルバモイルーァスパラギン酸、 D— N—力ルバモイルーグル夕ミン酸、 D— N—力ルバモイルーヒスチジン、 D— N—力ルバモイル —リジン、 D— N—力ルバモイルーアルギニン、 D— N—力ルバモイルーシ卜ルリンなどとなる基である。ァラルキル基は炭素数 7〜8のたとえばベンジル、フヱネチル基であって、対応する D— N—力ルバモイル— ーァミノ酸が D— N—力ルバモイルーフヱ二ルァラニンなどとなる基である。水性媒体としては、水、緩衝液、エタノールのような有機溶媒を含むものが使用される。さらに必要に応じて、微生物の成育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミン、金属などを水性媒体に添加することもできる。

上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌体と 5—置換ヒダントインを接触せしめて作用させる場合には、 5—置換ヒダントインを含み、かつ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸などの有機 ·微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコース、シユークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜に使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニゥム塩などが用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、アルミ二ゥムイオン、モリブデンイオンなどが使用されてよい。

培養は好気的条件下に、 pH 4〜8、温度 2 5〜 6 0 °Cの適当な範囲に制御しつつ行う。 1〜 1 0日間程度培養を行なえば、 5—置換ヒダントインは D— N—力ルバモイルーな一アミノ酸のみに効率よく交換される。一方、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体、菌体処理物、酵素抽出液、菌体の固定化物、菌体の不溶化物あるいは酵素蛋白質の固定化物と、 5—置換ヒダン卜インを溶解または懸濁した水性媒体中で反応を行う場合は、 1 0〜 8 0 °Cの適当な温度に調節し、 pHを 4〜 9. 5に保ちつつ暫時静置または搜拌すればよい。かくして、 5〜 1 0 0時間程度経過すれば、ヒダントイナーゼによる基質が D—特異的加水分解反応と、基質の化学的なラセミ化が同時に進行して、 D型、 D L型あるいは、 L型の 5—置換ヒダントインはすべて対応する D— N—力ルバモイル一 α—ァミノ酸に変換され、水性媒体中に多量に蓄積される。また、 5—置換ヒダントインは反応の進行に伴って分割して添加してもよい。

生成した D— N—力ルバモイルー —アミノ酸は、常套の分離方法により分離、精製することができる。

以上述べた方法により得られる分離、精製した D— Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸、あるいはヒダン卜イナーゼ反応により得られた反応液をそのまま用いて、 D - N—力ルバモイルー α—アミノ酸を化学的に、もしくは脱力ルバモイル活性を有する酵素の作用により変換して、 D— ーァミノ酸を容易に取得することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。

実施例 1

ヒダントイナーゼ活性菌の土壌からの分離土壌サンプル 0. 5gを生理食塩水 2mlに懸濁後、放置して上澄液を 1 滴、分離用寒天平板培地（肉エキス 1. 0%、ペプトン 1. 0%、ィ一ストエキス 1. 0%、塩化ナトリウム 0. 3%、寒天 2. 0%； pH7. 5) に塗布した。これを 50°Cで 2日間培養し、得られたコロニーを、同分離用平板培地にウランル 0. 1 %および塩化マンガン 2 Oppmを添加した平板培地に移植して、さらに 50°Cで 1曰培養した。こうして得られた菌体を、反応基質液（DL— （パラヒドロキシフヱニル）ヒダントイン 30m M、亜硫酸ナトリウム 0. 1%、炭酸緩衝液 5 OmM) 100 /1に懸濁し、 50°Cで 2時間反応させた。つぎに、反応液を TL Cプレートにスポットし、ブタノール：酢酸：水（4 ： 1 ： 1) の展開溶媒で展開後、 10%P —ジメチルァミノベンズアルデヒドの澳塩酸溶液を用いて黄色スポットを検出することにより、 N—力ルバモイルパラヒドロキシフヱ二ルグリシンを生成する菌株を選択した。このようにして 2740個のコロニーからヒダントイナーゼ高活性菌であるバチルス sp. KNK 24 δ (FERM BP— 4863) を分離した。

実施例 2

バチルス sp. KNK245由来のヒダントイナ一ゼの N末端アミノ酸配列の決定

バチルス sp. KNK245株一白金耳を 500ml坂口フラスコ中の種母培地（肉エキス 1. 0%、ペプトン 1. 0%、イーストエキス 0. 5% ； H 7. δ) 100mlに植菌し、 55 °Cで 19時間培養した。ついで、その 2%を 2リットル坂口フラスコの本培養培地（肉エキス 1. 0%、ぺプトン 1. 0%、イーストエキス 0. 5%、ゥラシル 0. 1%、塩化マンガン 4水和物 2 Oppm； pH 7. 5) 500 mlに植菌して 55 °Cで 19時間培養した。得られた 9リツトルの培養ブロスから菌体を遠心分離により集菌した。これを 0. 2MTris— HCl(pH8. 0 ) 20 mM硫酸マンガンに懸濁し、超音波粉砕した後、遠心分離を行い。無細胞抽出液を得た。つぎに、硫安沈殿による分画、 D E A E— S epharose、フヱニルー S epharose を用いて 32倍まで精製した。さらに、硫安を用いてヒダントイナーゼの結晶を取得した。この結晶を水に溶解して、 47 OA型気相プロテイン，シーケンサ一（アプライド♦バイオシステムズ社製）により解析したことろ、ヒダントイナーゼは N末端に、

1 5 10

Met-Lys-Lys- I le— I le - Lys— Asn— Gly— Thr— I le - Val— Thr- なるアミノ酸配列を持つことが判った。

実施例 3

ァグロパクテリゥム sp. KNK712 (FERM BP— 1900) 由来のヒダントイナ一ゼに関与する遗伝子を含むプラスミドの取得ヒダントイナーゼ遺伝子は、 WO 92 10579に記載されているプラスミド pAHD 101にクローン化された DN A断片上に存在していることを以下の方法で検討することにより見出した。 pAHDl 01を常法によりェシエリヒア · コリ J Ml 09に形質転換し、 10 OingZリットルのアンピシリンを含む L一ブロス（ぺプトン 10 リツトル、イーストエキス 5gZリットル、塩化ナトリウム 5gZリットル； pH 7. 0)50ml に植菌し、 37°Cで 16時間培養した。ついで、培養液 50mlを集菌し、上澄液を取り除き、 50mlの基質溶液（0. 5% 5— （パラヒドロキンフエニル）ヒダントイン、 0. 05%Triton X—100、 0. 0 δΜ リン酸緩衝液； pH 8. 7) に菌体を懸濁し、窒素気流下、 37てで 3時間反応を行った。この反応液を TIL Cにスポッ卜し、展開後、 ρ—ジメチルァミノベンズアルデヒドの塩酸溶液で発色したところ、標準品と一致する D— N—力ルバモイルー（パラヒドロキシフエニル）グリシンのスポットを示した。以上のことから、 pAHD 101の形質転換株はヒダントイナーゼをコードする遗伝子を発現していることが確認できた。

プラスミド pAHD 101を Saclおよび Sal Iで切断して、挿入断片を短縮化して得られた 2. lkbpの断片を、 pUC 18の Sac I， Sal I切断フラグメン卜と連結してブラスミド pAHl 043を得た（図 1参照)。また、 DN Aシークェンスキット（アプライド ·バイオシステムズ社製）を用いて、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。この結果を配列表配列番号 1に示した。

プラスミド pAH 1043でェシヱリヒア · コリ HB 101を形質転換し形質転換株ェシエリヒア · コリ HB101 pAH 1043 (FE RM BP— 4865) を得た。

実施例 4

バチルス sp. KNK 245の染色体 DNAとベクター DNAの組換え体 DN Aの創製

2リットルの液体培地（肉エキス 10g/リットル、ペプトン 10g リットル、イーストエキス 5gZリットノレ； pH 7. 5) でバチルス sp. KN K24 δ (FERM BP— 4863) を 45 °Cで 24時間培養した後、集菌し、菌体を得た。得られた菌体より Marmur法に従って染色体 DNA を抽出した。この染色体 DNA 1 gに BamH Iを 10U添加し、 37°C で 16時間反応させて完全分解を行なった。

—方、別にプラスミド pUC 19を BamH Iで完全切断し、これを先に得られた染色体からの DNA断片と T4 DNAリガーゼによって連結し、多種の組換え体プラスミドの混液を得た。実施例 5

バチルス sp. KNK 245由来のヒダントイナーゼ遺伝子の取得実施例 3に示したァグロパクテリゥム sp. KNK 712 (FERM BP- 1900) および特開昭 62— 87089号に示された Lul 22 0株由来のヒダン卜イナ一ゼ遗伝子の塩基配列をもとに、これらの配列の 1155bpの長さの塩基をはさみ、各相補鎖の配列を有する逆向きの 2種類のブライマー 1および 2 (表 1) を合成した。実施例 4で調製した、バチルス sp. KNK245由来の染色体 DNAを铸型として合成した 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼチューンリアクション（PCR) を行なったところ、 1. 2kbp程度のフラグメントを得ることができた。このフラグメントの塩基配列の決定を、 DNAシークェンスキット（ァブライド ·バイオシステムズ社製）を用いて決定したところ、既知のヒダントイナ一ゼ遗伝子の塩基配列と相同性が高く、得られた P CRフラグメントはヒダントイナーゼ遺伝子の一部であることがわかった。つぎに、このフラグメン卜の各相補鎖の配列を有する 2種類の逆向きのプライマー 3および 4 (表 1) を合成した。

さらに、実施例 4の組換え体 DN Aのベクター部分の配列を有するブライマ一 5 (表 1) を合成して、先に合成したプライマーと、このプライマ一を用いて、実施例 1の組換え体 DNAを铸型に PCRを行ない、ヒダン卜イナーゼ遺伝子の前半部分と後半部分を含む 2種類の D N A断片を得た _c そしてこれらの D N A断片の塩基配列を決定した。実施例 2で示したヒダントイナ一ゼ蛋白質の N末端ァミノ酸配列から予想される塩基配列から翻訳開始コドンを決定して、先に決定した塩基配列の結果と合わせてヒダントイナーゼをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。

この結果を配列表の配列番号 2に示す。つぎに、このようにして得られた塩基配列をもとに、ヒダントイナーゼ遺伝子の開始コドンの付近の配列に制限酵素 Ndelの切断配列をもつブライマ一 6 (表 1) とヒダントイナーゼ遺伝子内の Pst I切断部位の配列をもつプライマー 7 (表 1) を合成して、これらのプライマーを用い、実施例 1の染色体 DNAを铸型として P CRを行ない、 1. 2kbのフラグメント 1を得た。つぎに、先の Pst I切断部位で逆向きのプライマー 8 (表 1) と、終止コドンの後の配列を有し、 Hindi I I切断部位の配列をもつプライマー 9 (表 1) を合成して、実施例 1の染色体 DNAを铸型として P CRを行ない、 0. 25kbのフラグメント 2を得た。フラグメント 1を、 Nde Iと Pst Iで、フラグメント 2を、 Pst Iと Hind I I Iで、 WO 9 4/03613に示される pUC 19の改良ベクタープラスミド pUCNT を Ndelと Hindi I Iで、それぞれ切断した断片を T 4 D N Aリガーゼにより連結することによりヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミド pT Η 102を得た（図 2参照）。

一 81一

. ε— V丄 V丄

丄 νν νν 丄丄 ννν丄 V丄〇：>丄 vc> ov :i '丄

〇1V3丄：)丄丄丄 VV丄丄 33丄 VVV丄丄 V 丄丄丄 VV —， S

.ε -丄 v

0丄 3丄丄丄 VV丄丄 0 丄 VVV丄：） V丄：)丄丄： J VV i V — ,S

,ε - つ

.ε -o v

丄丄丄丄 ν οονν丄 νννο 丄丄：） VVV 丄：) 3—. s ε—丄 v丄 vo vov vvv vos丄：)丄丄丄 vv丄ー， s

8— ^

.S—：）丄丄丄丄 VVV3V 丄 3丄丄丄丄 0丄 3—， S

.ε-D vv

3vo:> V丄ー

9一 ^

.ε—： ινοον 丄 ovocio丄丄丄丄 — ,s

,ε— vvv丄丄 o v 丄 vvcivvs vvvvvv— . s

,ε—：)丄丄：) voovv 丄 vo 丄丄丄丄コ：)丄 v vv丄ー . s

0 0

5—丄0：)丄¥0：)3っ：） ¥( )っっ ¥¥{)( )っ丄0コ0—.3

0 0

0 0 0

.S_0 :>:)V(ii;)l l)lV( ) )VV3 >(£)VVV—.S

0 V 0

9Z0/S6dT/X3d SLiQZ/96 ΟΛΑ. 実施例 6 バチルス sp. KNK245ヒダントイナーゼ遺伝子の発現用組換え体 DNAの創製

実施例 5のフラグメント 2を得るのと同様の方法で P CRを行ない、 0. 25 kbのフラグメント 3を得た。ただし、この時使用した合成ブライマーは、フラグメント 2を得る時に使用した Pstl切断部位をもつブライマーの代わりに、 Pstl切断部位近くの Ndel切断部位を 1塩基置換して、 N delで切断できなくしたプライマー 10 (表 1) と、終止コドン付近のプライマーのかわりに、終止コドン以降の塩基の数をさらに減少させたブライマ一 1 1 (表 1) を使用した。つぎに、実施例 5の PTH I 02を取得するのと同じ方法でフラグメント 1と 3と pUC NTからプラスミド pTH 103を得た（図 3参照）。

さらに、 pTH 103を得るのと同様の方法で、ただし、終止コドン付近のプライマー 1 1の終止コドン TAGを TAAに変異させたブライマー 12 (表 1) を使用して、 pTHI 04を得た（図 4参照）。

pTH 104で形質転換されたェシェリヒア ' コリ HB 101をェシェリヒア * UHB101 pTH104とした。この菌株は、生命工学ェ業技術研究所に FERM B P— 4864の寄託番号の下、 1994年 1 1月 2日より寄託してある。

実施例 Ί

シユードモナス sp. KNK003 A (FERM BP— 3181) 由来の、ヒダントイナーゼに関与する遺伝子を含むブラスミドの取得

実施例 3と同様の方法によって、 W092 10579に記載されているブラスミド pPHD 301にヒダントイナーゼ遗伝子が存在することを見出した。

ェシヱリヒア ' コリ HB 101を pPHD301で形質転換してェシェリヒア · コリ HB 10 lpPHD 301 (FERM BP— 4866) を得た。また、 pPHD301の制限酵素地図を図 5に示す。

また、実施例 3と同様に、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行い、その結果を配列表の配列番号 3に示した。

実施例 8

形質転換株から得られた酵素による 5— （パラヒドロキンフエニル）ヒダントインの D— N—力ルバモイルー（パラヒドロキシフヱニル）グリシンへの変換

実施例 6で得られた形質転換株のェシヱリヒア · コ UHB 10 ΙρΤΗ 104を、アンピシリン 100 g/mlと塩化マンガン 4水和物 400 ppm を含む 2 YT ·ブロス（ポリペプトン 16gZリットル、ィーストエキス 10 g リットル、塩化ナトリウム 5 gZリットル； PH 7. 0 ) 50 mlに植菌し、 37 °Cで 24時間培養した。この培養液 50 mlから菌体を集菌し、 0. 05M炭酸緩衝液 pH8. 7に懸濁して 50mlとした。これに Triton X— 100を終濃度 0. 05%となるように加えた後、 5— （パラヒドロキシフヱニル）ヒダントインを 1. 5g加えて、 6N苛性ソーダで pH8. 7に pHコントロールしながら、窒素気流下、 40°Cに保温しながら 3時間撹拌して反応を行なつた。反応後の反応液を遠心分離して上清の生成 D —N—力ルバモイルー（パラヒドロキシフヱニル）グリシンの比色定量を、 10%パラジメチルァミノベンズアルデヒドの澳塩酸溶液による発色で行つたところ変換収率 97. 5%で0— —カルバモィル一（パラヒドロキシフエニル）グリシンが生成していた。

この反応液を塩酸で pH 5に調整し、遠心分離した後、上澄液を濃縮して、塩酸で pH 2に調整した後、 4 °Cに保存して析出した結晶を濾集した。水一エタノールより再結して、 97 Oingの D— N—力ルバモイルー（パラヒドロキシフヱニル）グリシンを得た。融点 176〜177°C、 [ ]ο²⁰ = -177. 0° (C = 0. 5、 5%エタノール）o

実施例 9

固定化ヒダントイナーゼの調製

実施例 7と同様の方法で得られたエシュリヒア · コリ HB 10 IPTH 104の培養液 1リットルを集菌後、 ImM硫酸マンガン水溶液に懸濁後、 6 Omlにして pH8. 5に調整し、超音波により菌体の破碎を行なった。このようにして得られた酵素液に pH 8. 5に平衡化した陰ィォン交換樹脂 Duolite A— 568を 2 Og加え、 15°Cで 20時間攬拌して、酵素を吸着させた。この液に終濃度 0. 1%となるようにグルタールアルデヒドを加え、 1時間撹拌し、架橋処理を行なった。この後、樹脂を澳集、洗浄して固定化ヒダントイナーゼ 2 Ogを得た。

実施例 10

固定化酵素による 5— (パラヒドロキンフエニル）ヒダントインの D— N—力ルバモイル一（パラヒドロキンフエニル）グリシンへの変換

実施例 9で得た固定化ヒダントイナーゼ 5 gを、窒素通気した 40°Cの lmM硫酸マンガン水溶液 10 Omlに加えた後、 5— （パラヒドロキシフエニル）ヒダントイン 3gを添加して 6 N水酸化ナトリウムで pH 8. 7にコントロールしながら、 40°C、窒素通気下 3時間撹拌して反応を行なった。反応後、静置して反応液を吸引採取した後、実施例 8と同様の方法で生成力ルバモイルアミノ酸を精製し、 D— N—力ルバモイルー（パラヒドロキシフヱニル）グリシンを 2. 2g得た。

実施例 11

バチルス sp. KNK 245ヒダントイナーゼ遺伝子のバチルス .サブチルスでの発現実施例 5に記載の方法に準じて、バチルス sp. KNK245由来の染色体 DNAを铸型として、プライマー 12および 13 (表 1) を用いて P CRを行い、 1. 7kbのフラグメントを得た。これを BamH Iおよび Hin dl I Iで切断し、同様に切断したブラスミ KpHY300 PLK (宝酒造）とライゲートしてプラスミド PTHB301を得た。その制限酵素地図を図 6に示す。

このプラスミド pTHB 301をバチルス ·サブチルス I SW1214 (宝酒造より入手）、バチルス ·サブチルス YS— 11 ( I AMI 201 9) またはバチルス ·サブチルス 3115 U AM12020) に、電気穿孔法（島津製作所製 GTE— 10型使用、 l OKVZcm, 2ms) で導入し、実施例 4に示す培地に、 MnCl₂ · 4H₂0を 0. 02 リットル添加した培地で、 37て、 20時間培養した。菌体を集めて、超音波により破砕することにより、無細胞抽出液を調製したところ、バチルス sp. K NK245を同条件で培養したときと比較して、ヒダントイナーゼの比活性は、いずれも約 2. 2倍高かった。

実施例 12

バチルス sp. KNK 245ヒダントイナーゼ遺伝子の好熱菌での発現実施例 11で作製したブラスミド pTHB 301をプロ卜プラス卜法 ( J . Bacteriol.. 149 , 824 ( 1982 ) に準じる）でバチルス · ステアロザーモフィラス（Bacillus stearothermophilus) I F 012 550に形質転換し、実施例 11と同様の方法で培養し、無細胞抽出液を調製した。同条件で調製したバチルス sp. KNK245の無細胞抽出液と比較して、ヒダン卜イナ一ゼの比活性は約 3. 6倍高かった。

以上記載したとおり、本発明によれば、ヒダントイナーゼの生産性が極めて高い微生物が創製でき、これを酵素源として使用することにより、 D 一 N—力ルバモイルー crーァミノ酸が効率よく生産できる。

微生物の寄託

ァグロパクテリゥム sp. KNK712は FERM BP— 1900の受託番号の下、 1988年 5月 31曰より；シユードモナス sp. KNK 003Aは FERM B P— 3181の受託番号の下、 1990年 12月 1日より；バチルス sp. KNK 245は FERM BP— 4863の受託番号の下、 1994年 11月 2曰より；ェシエリヒア · コリ HB 1 01 PTH104は FERM B P— 4864の受託番号の下、 199 4年 11月 2日より；ェシエリヒア - コリ HB101 p AH 1043 は FERM BP— 4865の受託番号の下、 1.9.94年 11月 2日より；ェシエリヒア · コリ HB101 pPHD301は FERM BP— 4866の受託番号の下、 1994年 11月 2日より、いずれもブタぺスト条約に基づき、下記受託機関に寄託してある。

名称通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所

(旧名称通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所）あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305)

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 2 5 1 8

配列の型：塩基

配列：

10 20 30 40 50 60

GAGCTCGGCCTCGTCGGTGAAATGCCAGCGCGGGAAGAAGGTCGTAAGCGCGAGTTCGGG

70 80 90 100 110 120

GAAGACAATGAAATTCGCGCCCCGGCTCGCGGCnTCGTCAGCATGTCGAGAAGACGAAC

130 140 150 160 170 180 GACGACCTGTTCGCGTGTCTCCGCGCGCGCGATCGGACCTTGTTGTCCCACTGCAAGTAT

190 200 210 220 230 240

CATCTGACGTGTCATGAACCTCTGCTCCTTCCTAGGTGATGTCCGGCCCAGCGGCCGGGA

250 260 270 280 290 300

AAACGTTGTGAAACACATCGCCGAAAACCGGCTTTGTGACTCGCGGCGCAATGCAAATTC

310 320 330 340 350 360

TACATAAAGTACGAAATAHACATGCAGCACGACAATAACAGGCGTAAAATTTTTGATCT

370 380 390 400 410 420

GTCAACCGGAGCGGAACCGGAATTTGCGCTGCTTGACAAGCTCTCGCGCGAGCCCGCCGT 430 440 450 460 470 480

CGACTTCAACTCGnCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCnCGCTAGGC

490 500 510 520 530 540

CGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACnGTATAAAGAATTACATTCCA

550 560 570 580 590 600

TATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAACGG

MetAspIlellelleLysAsnGly

610 620 630 640 650 660

AACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAGAT

ThrlleValThrAlaAspGlylleSerArgAlaAspし euGlylleLysAspGlyし yslle

670 680 690 700 710 720

CACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGCTA

ThrGlnlleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrlleAspAlaAlaGlyArgTyr

730 740 750 760 770 780

CGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACGCA

ValPheProGlyGlylleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThrGln

790 800 810 820 830 840

GTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACCAT

SerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThrlle 850 860 870 880 890 900

CGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGGGA

ValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrpAsp

910 920 930 940 950 960

CGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGACCC

GlyMetAlaGlyGlyLysSerAlalleAspTyrGlyTyrHisIlelleValLeuAspPro

970 980 990 1000 1010 1020

GACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCnCAA ThrAspSerVallleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlylleThrSerPheLys

1030 1040 1050 1060 1070 1080 GGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACGTGACGCTGCTGAAGACGCT

ValPhe etAlaTyrArgGly etAsn etlleAspAspValThrLeuLeuLysThrLeu

1090 1100 1110 1120 1130 1140 CGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCCGC

AspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAla

1150 1160 1170 1180 1190 1200 CGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCGCT

AspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu 1210 1220 1230 1240 1250 1260 CAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAAAT

SerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGluIle

1270 1280 1290 1300 1310 1320 CGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTGAT

ValAsnAlaProIleTyrlleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluValMet

1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTACCT

ArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeu

1390 1400 1410 1420 1430 1440 CACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCGCC

ThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro

1450 1460 1470 1480 1490 1500 GGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTCGA

AlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPheGlu

1510 1520 1530 1540 1550 1560 AACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGGAA

ThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheし ysGlyHisし ysAspArgGlyArgAsn ACCGCCAGCTCAATG 000CCOTCGGC& CGAGTT0. AATG T ;G-

gylnal r GGlAsnGesereuThrnphlsaVllLGlealGuLvv

CCACO TCAGGGCGTCACTACTGGTCGCG TTCCTTCCAGTCGTGGA gypyygeAralleosetalT AsphAlprAnAlaoGlalGlluArLeuMtMevGlpruGv

CGACTTCGCCCTCAAAT TCTTGACCGCCGCCCGGCTCGAAACGGTTGGATGGGGGGG一 1930 1940 1950 1960 1970 1980 AHCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGACA

Pheし eutysArgArgtysTyrし ysGln***

457

1990 2000 2010 2020 2030 2040 ATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCHCGAC

2050 2060 2070 2080 2090 2100 AGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGGAC

2110 2120 2130 2140 2150 2160 TGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCCCC

2170 2180 2190 2200 2210 2220 CCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACATG

2230 2240 2250 2260 2270 2280 CAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGACA

2290 2300 2310 2320 2330 2340 TGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATCTT

2350 2360 2370 2380 2390 2400 GCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGATC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 GACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGHCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCGCC

2470 2480 2490 2500 2510

GCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATC 配列番号： 2

配列の長さ： 2 1 0 5

配列の型：塩基

配列：

10 20 30 40 50 60

GTCGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAG

70 80 90 100 110 120

GCCGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTC

130 140 150 160 170 180 CATATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAAC

MetAspIlellelleLysAsn

190 200 210 220 230 240

GGAACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAG

GlyThrlleValThrAlaAspGlylleSerArgAlaAspLeuGlylleLysAspGlyし ys

610 620 630 640 650 660

AAGGTCnCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACCTGACGCTGCTGAAGACG LysValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsn etlleAspAspValThrLeuLeuLysThr

670 680 690 700 710 720

CTCGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCC

LeuAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValHetValHisAlaGluAsnGlyAspAla

730 740 750 760 770 780

GCCGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCG

AlaAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAla

790 800 810 820 830 840

CTCAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAA

LeuSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlu

850 860 870 880 890 900

ATCGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTG

IleValAsnAlaProIleTyrlleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluVal

910 920 930 940 950 960

ATGCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTAC

HetArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyr 970 980 990 1000 1010 1020

CTCACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCG

LeuThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrPro

1030 1040 1050 1060 1070 1080 CCGGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTC

ProAlaArgAlaし ysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPhe

1090 1100 1110 1120 1130 1140 GAAACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGG

GluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArg

1150 1160 1170 1180 1190 1200 AACGACnTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGnGATGATGGTC AsnAspPheArgAlalleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetVal

1210 1220 1230 1240 1250 1260 TATCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACG

TyrGlnGlyValAsnGluGlyArglleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThr

1270 1280 1290 1300 1310 1320 CGCCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGAC

ArgProAlaLysValPheGly etPheProGlnLysGlyThrlleAlaValGlySerAsp 1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCCGACATCGTCCnTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCAC AlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetVallleGluGlnThrAla etHis

1390 1400 1410 1420 1430 1440 AACGCCATGGAnACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTG AsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrYal

1450 1460 1470 1480 1490 1500 CTCCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGG

LeuLeuArgGlyLysVallleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGly

1510 1520 1530 1540 1550 1560 AAATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGA

LysPheLeuし ysArgArgし ysTyrLysGln***

1570 1580 1590 1600 1610 1620 CAATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCG

1630 1640 1650 1660 1670 1680 ACAGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGC

1690 1700 1710 1720 1730 1740 ACTGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCC 3333si〕3〕v3J8¾iJv〕3J3J-3s>33-}33ssa〕3vvvv.0vvv3ici〕33.vI.v

3E3si8J.〕i§3 〕i§。i3fu§3〕sn〕〕vvi。v〕vv

83。3§〕31ί護〕8LEv8§U313ν33 V〕3:333， LI3:〕33 >一V

〕i¾l23s}JI〕i8ll〕3 !}3l:3:.vil3..sv3,yvvv

3l sii3}}33i:f 3i3:s3;}3:Gi33f33J53sli,;3133v>vvvv>v

§8

配列番号： 3

配列の長さ： 1 5 6 9

配列の型：塩基

配列：

10 20 30 40 50 60

TCGGAACCTGAAAACGAAATATCCCGCCGGACGGTGGGAAGGTGAAAGGAGGAGTCTCCA

Met

70 80 90 100 110 120

TGACAACAGHATCAAGGGTGGAACGATCGTCGCCGCCGATCGCAGCTATGAAGCCGATA

ThrThrVallleLysGlyGlyThrlleValAlaAlaAspArgSerTyrGluAlaAspIle

130 140 150 160 170 180 TCCTGATCGAAGGCGAAAAGATCGCCCAGATCGGCAGGGATCTGCAGGGCGACAAGATTG

LeuIleGluGlyGluLysIleAlaGlnlleGlyArgAspLeuGlnGlyAspLysIleVal

190 200 210 220 230 240

TAGACGCCGAGGGTGCCTATATCATTCCCGGCGGCATCGATCCTCACACGCATCTTGAAA

AspAlaGluGlyAlaTyrllelleProGlyGlylleAspProHisThrHisLeuGluMet

250 260 270 280 290 300

TGCCCTTTATGGGCACGACCACTGCCGAGACCTGGGAGTCCGGCACTTTCGCGGCTCTCT

ProPheMetGlyThrThrThrAlaGluT rTrpGluSerGlyThrPheAlaAlaLeuSer S89S/ & s OAV

0000〕〕iE ,3§ -3Jlv333JV33〕V3§3.V0V

670 680 690 700 710 720

CGGAGGCTCATGCCTATTCCCGCCCGCCGGAGGTCGAGGGCGAGGCCACCAACCGCGCCA

GluAlaHisAlaTyrSerArgProProGluValGluGlyGluAlaThrAsnArgAlalle

730 740 750 760 770 780

TCATGATCGCCGATGCCGCAGGCGTGCCGGTCTATATCGTGCATGTCTCCTGTGAACAGG

MetlleAlaAspAlaAlaGlyValProValTyrlleValHisValSerCysGluGlnAla

790 800 810 820 830 840

CGCACGAAGCGATCCGCCGCGCACGCCAGAAGGGAATGCGCGTCTATGGCGAGCCGCTCA

HisGluAlalleArgArgAlaArgGlnLysGly etArgValTyrGlyGluProLeuIle

850 860 870 880 890 900

TCCAGCACCTGCTGCTTGACGAGTCCGAGTACAAGAGAGCCGACTGGGACGAGGCGGCTC

GlnHisし euし euし euAspGluSerGluTyrし ysArgAlaAspTrpAspGluAlaAlaArg

910 920 930 940 950 960

GGCGGGTGATGTCCGCGCCATTCCGCGATAAAAGCCATCAGGACAGCCTCTGGGCTGGGC

ArgVal erSerAlaProPheArgAspLysSerHisGlnAspSerLeuTrpAlaGlyLeu

970 980 990 1000 1010 1020

TCGCAGCGGGCTCGCTGCAGGTCGTGGCAACGGACCACTGCGCCTTTACCACTGAACAGA

AlaAlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisCysAlaPheThrThrGluGlnLys 1030 1040 1050 1060 1070 1080 AGCGGCTGGGACTCAACGACTTCACGAAAATCCCGAACGGCACCGGGGGGTTAGAGGACC

ArgLeuGlyteuAsnAspPheThrし ysIleProAsnGlyThrGlyGlyLeuGluAspArg

1090 1100 1110 1120 1130 1140 GGTTGTCGCTGCTCTGGACCTATGGCGTGAAGACGGGGCGGCTCACGCCTAACGAAnCG LeuSerLeuLeuTrpThrTyrGlyValLysThrGlyArgLeuThrProAsnGluPheVal

1150 1160 1170 1180 1190 1200 TCGCCGTCACCTCCACCAATATCGCACAAATCCTGAACATCTATCCGCAAAAGGGCGCAA

AlaValThrSerThrAsnlleAlaGlnlleLeuAsnlleTyrProGlnLysGlyAlalle

1210 1220 1230 1240 1250 1260 TCCTGCCTGGGTCCGATGCCGACCTCGTCGTCTGGGATCCAGCCAAATCGAAGAAGATCA

LeuProGlySerAspAlaAspLeuValValTrpAspProAlaLysSerLysLysIleThr

1270 1280 1290 1300 1310 1320 CTGCTTCCGCTCAGAAATCCATCATCGACTACAATATCTTCGAGGGCTACGAGGTGACCG

AlaSerAlaGlnし ysSerllelleAspTyrAsnllePheGluGlyTyrGluValThrGly

1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCATGCCGCGATACACGCTCTCACGCGGCGAGGTCGTATGGGGCGAGGAAGGCAGCAACG

MetProArgTyrThrLeuSerArgGlyGluValValTrpGlyGluGluGlySerAsnGlu

CAATCA AC o

y rolelIGalv*

CTCTCCTCTCACCCATTT AGGCAGCGAAACGGTTTGGGTG TGGATGGCGTTTGATGG pyggyat LeuSerThluIlal aroArAlaserAl LsHisMerTrLsGeVpvlG -

00AGCA CAACAGATCGCCCGCGCGGTCGCOCTGGAAGGCGTTTGGGAGT ggggygygareauArreAlaaAlroArlAPhlGlArPoPhaAlVlSerAr ProArPGlGV CC CC GCCGCC¾CAGTCCGccCCGTCGO rCGGGG_

Claims

請求の範囲

1. バチルス（Bacillus) sp. KNK245 (F ERM BP— 4

863) 、ァグロパクテリゥム（Agrobacterium) sp. KNK 712 (F ERM B P— 1900) またはシユードモナス（Pseudomonas) sp.

KNKO 03 A (FER BP— 3181) に由来し、 5—置換ヒダントィンを不斉的に開裂加水分解して対応する D— N—力ルバモイルー α— アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）をコードする遺伝子を含む DN Α断片と、ベクター DN Aとの組換体 DN Aを用いて、宿主微生物を形質転換して得られる形質転換微生物。

2. 宿主微生物が、ェシヱリヒア属、シユードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、ァグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビパクテリゥム属に属する微生物から選ばれる請求項 1記載の形質転換微生物。

3. 形質転換微生物がェシヱリヒア · コリ（Escherichia coli) HB 101 pTH 102、ェシヱリヒア · コリ（Escherichia coli) HB 101 pTH103、ェシリヒア ' コリ（Escherichia coli) HB 101 pTH 104 (F ERM B P— 4864 ) 、ェシエリヒア . コリ（Escherichia coli) HB101 AH 1043 (FERM BP 一 4865) またはェシエリヒア · コリ（Escherichia coli) HB 10 1 PHD301 (FERM B P— 4866 ) である請求項 2記載の形質転換微生物。

4. 請求項 1〜 3 L、ずれか 1項記載の形質転換微生物を使用することを特徴する 5—置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応する D— N— 力ルバモイルーひーァミノ酸に変換する酵素の製造法。

5. 請求項 4記載の製造法で得られた酵素を使用することを特徴とする 5—置換ヒダントインから D— N—力ルバモイルー α—ァミノ酸の製造法 _c

6. 5—置換ヒダントインが一般式（1) ：

R-CH-C=0 HN NH

C II

0

(式中、 Rはフヱニル基、水酸基で置換されたフヱニル基、アルキル基、置換アルキル基、ァラルキル基またはチェ二ル基を示す。）で表わされる化合物である請求項 5記載の製造法。

7. バチルス sp. KNK245 (F ERM BP— 4863) 由来のヒダン卜イナーゼをコードする遺伝子を含む DNA断片と、プラスミド（p UCNT) との組換えにより得られ、図 2〜4のいずれかに示す制限酵素切断地図を有する組換えプラスミド。

8. 組換えプラスミドが、 pTH 102、 TH 103または pTH 10 4である請求項 7記載の組換プラスミド。

9. ァグロバクテリウム sp. K N K 712 (FERM BP— 190 0) 由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含む DNA断面とブラスミド pUC 18との組換えによって得られ、図 1の制限酵素地図を有する組換えプラスミド。

10. 組換えプラスミドが pAH 1043である請求項 9記載の組換えプラスミド。

11. シユードモナス sp. KNK003A (FERM BP— 318 1) 由来のヒダントイナーゼをコードする遗伝子を含む DNA断片と、プラスミド pUC 18の組換えによって得られ、図 5の制限酵素地図を有する組換えブラスミド。

12. 組換えプラスミドが PPHD301である請求項 11記載の組換えプラスミド。

13. 配列表配列番号 2のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜472のァミノ酸配列の全部または一部をコードする 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— N—力ルバモイルー α—アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。

14. 配列表配列番号 2の塩基番号 1〜1776の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— Ν—力ルバモイル— α—アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含む DN Α断片。

15. 配列表配列番号 1のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜457のァミノ酸配列の全部または一部をコードする 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— N—力ルバモイルーな一アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。

16. 配列表配列番号 1の塩基番号 1 ~ 2518の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— N—力ルバモイルー α—ァミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含む DN Α断片。

17. 配列表配列番号 2のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜472のァミノ酸配列の全部または一部を含み、 5—置換ヒダン卜インを不斉的に加水分解して対応する D— N—力ルバモイルー α—ァミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。

1 8 . 配列表配列番号 1のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜4 5 7のァミノ酸配列の全部または一部を含み、 5 _置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応する D— Ν _力ルバモイルーなーァミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。

1 9. 配列表配列番号 3のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜4 8 5のァミノ酸配列の全部または一部をコ一ドする 5—置換ヒダン卜インを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— Ν—力ルバモイルー α—ァミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。

2 0 . 配列表配列番号 3の塩基番号 1〜1 5 6 9の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、 5—置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応する D— Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含む D N Α断片。

2 1 . 配列表配列番号 3のァミノ酸配列のァミノ酸番号 1〜 4 8 5のァミノ酸配列の全部または一部を含み、 5—置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応する D— N—力ルバモイル— α—ァミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。