JPH03251176A - ５―置換ヒダントイン及びｎ―カルバミルアミノ酸変換酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は５−置換ヒダントインまたはＮ−カルバミルア
ミノ酸からし一アミノ酸を製造する方法に関する。

［従来の技術］ 従来、５−置換ヒダントインをＮ−カルバミルアミノ酸
、さらにＬ−アミノ酸に変換する微生物としてフラボバ
クテリウム属（特公昭６１−１２２９６号公報）、バチ
ルス属（特公昭６３−２４８９５号公報）、シュードモ
ナス属（特公昭６４７１４７６号公報）に属する細菌か
知られている。

［発明が解決しようとする課題］ 然しなから、いずれも酵素生産量か充分ではなかった。

本発明はこのような課題を解決するために、５置換ヒダ
ントインをＬ−アミノ酸に変換する能力を持つ細菌から
変換能に関与している遺伝子をクローニングし、遺伝子
増幅、及び転写、翻訳活性を高めることにより目的の酵
素生産量を高めようとするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明は５−置換ヒダントインをＮ−カルバミルアミノ
酸に変換する酵素、Ｎ−カルバミル−しアミノ酸をＬ−
アミノ酸に変換する酵素、それらをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片、それらのＤＮＡ断片を組み込んだヘク
ターＤＮＡ、斯かるベクターにより形質転換された微生
物及び該微生物を使用するＮ−カルバミルアミノ酸又は
Ｌ−アミノ酸の製造法である。

即ち、本発明は、 （１）第８図と第９図で示されるアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする５−置換ヒダントインをＮ−カルバミ
ルアミノ酸に変換する能力を持つ酵素タンパク質であり
、 （２）第１０図で示されるアミノ酸配列を有することを
特徴とするＮ−カルバミル−し−アミノ酸をＬ−アミノ
酸に変換する能力を持つ酵素タンパク質であり、 （３）それらをコートする第３−１図から第３−７図に
示される第１１５６番目塩基から第３２２８番目塩基ま
での配列（ＯＲＦ２）及び第３２３２番目塩基から第５
０１０番目塩基までの配列（ＯＲＦ３）を含むＤＮＡ断
片であり、（４）同様に第５０３１番目塩基から第６２
７５番目塩基までの配列（ＯＲＦ４）を含むＤＮＡ断片
であり、 （５）これらのＤＮＡ断片を組み込んだベクターＤＮＡ
であり、 （６）斯かるベクターＤＮＡにより形質転換された微生
物及び該微生物を使用するＮ−カルバミルアミノ酸又は
Ｌ−アミノ酸の製造法である、などと種々に定義するこ
とができる。

本発明を更に具体的に説明する。

１、遺伝子のクローニング 本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片は、５−置換ヒ
ダントインをＬ−アミノ酸に変換する能力を持つ細菌か
ら調製することができる。シュードモナス属細菌Ｎ　Ｓ
　６７１菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５４３）はこのような能
力を持つ細菌であり、約１７２キロ塩基対の大きさのプ
ラスミドＤＮＡを持っている。

本プラスミドＤＮＡはシュードモナス属細菌Ｎ５６７１
菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５４３）の継代培養の間に脱落す
ることかあり、このような菌株では５−置換ヒダントイ
ンの変換能も失われていることが分かった。

従って５−置換ヒダントインの変換に関与する遺伝子は
本プラスミドＤＮＡ上にあるとして、本プラスミドＤＮ
Ａを遺伝子供給源とした。

本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、宿主細胞内で
自律増殖できるものであれば何れのものでもよいが、酵
素生産量を高めるためにコピー数の多いもの及び強いプ
ロモーター構造を持つものなどが使用できる。大腸菌を
宿主細胞とする場合、プラスミドｐＵｃ１８などがベク
ターＤＮＡとして使用できる。

目的の遺伝子を含むＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え
は制限酵素による切断とＤＮＡリガーセによるライゲー
ションによって行われる。

組換え体ＤＮＡの中から目的の遺伝子を持つものを選択
するには、組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌などの微生物
を形質転換し、得られた形質転換株を５−置換ヒダント
インを唯一の窒素源とする寒天培地にまけばよい。この
とき宿主微生物はアミノ酸などの栄養要求性のないもの
か望ましい。

目的の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを持つ微生物は、５
−置換ヒダントインをＬ−アミノ酸に変換する際に生成
するアンモニウムイオンを窒素源として利用し、上記の
寒天培地で生育し、コロニを形成するので容易に分離で
きる。宿主微生物として大腸菌を用いるのか便利である
。

本発明に於いては、宿主微生物としての大腸菌ＪＭ１０
３を、ベクターＤＮＡとしてプラスミドｐＵｃ１８を用
い、この選択培地上に形成されたコロニーから形質転換
株を培養し、プラスミｌ”ＤＮＡを調製した結果、最小
のもので約７．５キロ塩基対の挿入ＤＮＡを持っていた
。このプラスミドＤＮＡをプラスミドｐＨＰＢ　１２と
命名した。

２、プラスミドｐＨＰＢ　１２かコートする変換能プラ
スミドｐＨＰＢ　１２で大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し
、アンピシリン耐性を指標にして形質転換株を得た。こ
の形質転換された大腸菌ＪＭＩ０３は微工研にＦＥＲＭ
　　Ｐ−１１１７６とじて寄託された。

この形質転換株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１７６）は、Ｄ
−５−置換ヒダントインをＮ−カルバミルＤ−アミノ酸
に、Ｌ−５−置換ヒダントインをＬ−アミノ酸に、Ｎ−
カルバミル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する能
力を有する。

上記の変換に用いる培地としては大腸菌が生育するため
に必要な成分が含まれていればよいか、栄養に富む培地
が適している。

３、プラスミドｐＨＰＢ　１２の挿入ＤＮＡの構造解析 プラスミドｐＨＰＢ　１２の制限酵素地図は第２図に示
される通りであり、プラスミドｐＨＰＢ　１２の挿入Ｄ
ＮＡの全塩基配列は第３−１図、第３２図、第３−３図
、第３−４図、第３−５図、第３−６図及び第３−７図
の通りであって、制限酵素ＭｂｏＴの認識配列（Ｇ　Ａ
　Ｔ　Ｃ）で始まり、制限酵素ＢａｍＨｒの認識配列（
ＧＧＡＴＣＣ）で終わっている。

この挿入ＤＮＡ内にそれぞれ分子量７５６００．６４９
００及び４５７００のタンパク質をコードし得る３つの
オープンリーディングフレイムかあり、それぞれＯＲＦ
　２．０ＲＦ３及び０ＲＦ４と命名した。第１１５６番
目塩基から第３２２８番目塩基までが０ＲＦ２、第３２
３２番目塩基から第５０１Ｏ番目塩基までが０ＲＦ３、
第５０３１番目塩基から第６２７５番目塩基までかＯＲ
Ｆ　４である。

ＯＲＦ　２．０ＲＥ３及び０ＲＦ４かコードし得るタン
パク質のアミノ酸配列をそれぞれ第８図、第９図及び第
１０図に示した。

４、プラスミドｐＨＰＢ　１２の各オープンリーディン
グフレームの機能 プラスミドｐＨＰＢ１２を各種制限酵素で切断、必要に
より末端を平滑化し、セルフライゲーション等を行い第
４図に示した欠失プラスミドを作製し、これらの欠失プ
ラスミドで大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、これらの形
質転換株の５−置換ヒダントイン及びＮ−カルバミルア
ミノ酸の変換能を調べた結果、Ｎ−カルバミル−し−ア
ミノ酸のＬ−アミノ酸への変換には０ＲＦ４か必要であ
ること、及びＤ−またはＬ−５−置換ヒダントインのそ
れぞれＮ−カルバミル−Ｄ−またはＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸への変換には０ＲＦ２と０ＲＦ３がともに必
要であることが分かった。

５、各遺伝子の利用法 本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの
組換え体ＤＮＡを導入した大腸菌などの微生物を次のよ
うに利用することができる。

遺伝子としてＯＲＦ　２とＯＲＦ　３を用いた場合、微
生物を培地に培養し、Ｄ−５−置換ヒダントインを添加
すればＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、Ｌ−５−置換
ヒダントインを添加すればＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ
酸が、ＤＬ−５−置換ヒダントインを添加すればＮ−カ
ルバミル−ＤＬ−アミノ酸がそれぞれ生産される。また
微生物を培地に培養し、得られる微生物体から上記変換
に関与する酵素タンパク質を調製することができる。

遺伝子として０ＲＦ４を用いた場合、微生物を培地に培
養し、Ｎ−カルバミル−し−アミノ酸を添加すればＬ−
アミノ酸か生産される。また微生物を培地に培養し、得
られる微生物体から上記変換に関与する酵素タンパク質
を調製することができる。

遺伝子としてＯＲＦ　２．０ＲＦ３及びＯＲＦ　４を用
いた場合、微生物を培地に培養し、Ｄ−５−置換ヒダン
トインを添加すればＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸か、
Ｌ−５−置換ヒダントインを添加すればＬ−アミノ酸が
、ＤＬ＝５−置換ヒダントインを添加すればＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸が、Ｎ−カルバミル
−し−アミノ酸を添加すればＬ−アミノ酸がそれぞれ生
産される。また微生物を培地に培養し、得られる微生物
体から上記変換に関与する酵素タンパク質を調製するこ
とができる。

培養液からの生産物の分離精製はイオン交換クロマトグ
ラフィーなどの通常の方法に従って行うことができる。

また微生物体からの酵素タンパク質の分離精製は細胞破
砕後、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの通常の方
法に従って行うことかできる。分離精製された酵素タン
パク質は固定化酵素反応などに用いることができる。

［実施例］ 実施例１．遺伝子の構造と機能 １−１．シュードモナス属細菌Ｎ５６７１菌のプラスミ
ドＤＮＡの調製 ５００ｍ１　のＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１０ｇ／ｌ　）リ
プトン、５ｇ／　１酵母エキス、１０ｇ／１ＮａｃＩ　
、　ｐＨ７，２）にシュードモナス属細菌Ｎ５６７１菌
（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５４３）を植菌し、３０°Ｃで振盪
培養した。定常期に入った菌体を遠心によって集め、３
０ｍ１の５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム、ｐＨ８゜０に懸濁し、室温に１０分分間−た。

６０ｍ１の０．２ＮＮａＯＨ、ｌＸ５ＤＳを加え撹拌し
、水中に５分間室いた。

４５ｍ１の５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４，８を加え撹拌し
、水中にＩＯ分分間−た。１２ｋｒｐｍ、　３０分間、
４°Ｃの遠心によって上清を得て、これに９０ｍ１のイ
ソプロパツールを加え撹拌し、室温に１５分分間室た。

１２ｋｒｐｍ、３０分間、１５℃の遠心によって沈澱を
得て、これを８ｍｌのｌｏｍ〜Ｉ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
、１ｍＭ　ＥＤＴ、Ａ、ｐＨ８，０に溶かし、常法に従
って、ＣｓＣ１／エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠
心にかけプラスミドＤＮＡを精製した。

１−２０組換え体ＤＮＡの作製 実施例１−１で得られたシュードモナス属細菌Ｎ５６７
１菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５４３）のプラスミドＤＮＡを
制限酵素Ｍｂｏ　Ｉで部分消化した。別にプラスミドｐ
Ｕｃ１８を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、子牛腸ア
ルカリホスファターセ処理したものを用意し、両者を常
法によりライゲーションさせた。この反応液で大腸菌Ｊ
Ｍ１０３を形質転換し、選択培地（６ｇ／Ｉ　Ｎａ２１
（ＰＯ，，３ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，０，５ｇ／ｌ　Ｎ
ａＣ１，０，ＩＸＤ　Ｌ　−５−（２−メチ／Ｌｚチオ
ｆｆ−４／Ｎ　ｔ：：ダントイン、０．２Ｘクルコース
、２ｍＭ　Ｍｇ５Ｌ　、Ｏ，１ｍＭ　ＣａＣ１゜、０．
００１Ｘ　Ｍｎ５Ｏ＜、　０．０００１Ｘ　Ｆｅ５Ｏｔ
　、１　ｕｇ／ｎ＋　１チアミン、１ｍＭ　ＩＰＴＧ　
、１．６％寒天）にまいた。

３０℃で保温し、生育してくる形質転換株を得た。

これらの形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製した結
果、最小のもので約７．５キロ塩基対の挿入ＤＮＡを持
っていた。このプラスミドＤＮＡをｐＨＰＢ　１２と命
名した。

■−３．プラスミドｐＨＰＢ　１２かコートする変換能 プラスミド、ｐＨＰＢ１２で大腸菌ＪＭ１０３を形質転
換し、アンピシリン耐性を指標にして得られた形質転換
株（ＦＥＭＲＰ−１１１７６）を１．５ｍｌのＬ−Ｂｒ
ｏｔｈ培地に植菌し、３０℃で６００ｎｒｎのＯＤが１
になるまで振盪培養した。７．５μｌの２００ｍＭ　Ｉ
ＰＴＧを加え、さらに１時間、３０℃で振盪培養した。

これに７５μｌの２ＸのＬ−またはＤ−５−（２−メチ
ルチオエチル）ヒダントインあるいはＮ−カルバミル−
Ｌ−またはＮ−カルバミル−Ｄ−メチオニンのうちのい
ずれか１つを添加し、さらに３０℃で振盪培養を続けた
。前２者を添加したものについては１日後に、後２者を
添加したものについては３日後に生成物を薄層クロマト
グラフィーにより分析した。

結果は第１図の通りであり、図中のヒダントインは５−
（２−メチルチオエチル）ヒダントインを、ヒダントイ
ン酸はＮ−カルバミルメチオニンを示す。Ｎ−カルバミ
ル−Ｌ−メチオニンはメチオニンに変換されたか、Ｎ−
カルバミル−Ｄ−メチオニンは変換されなかった。Ｌ−
５−（２−メチルチオエチル）ヒダントインはメチオニ
ンに変換されたか、Ｄ−５−（２−メチルチオエチル）
ヒダントインはＮ−カルバミルメチオニンに留まった。

このＮ−カルバミルメチオニンは、変換されないことか
ら０体であると考えられる。なおし−５−（２−メチル
チオエチル）ヒダントイン及びＮ−カルバミル−Ｌ−メ
チオニンから生成したメチオニンは何れもＬ体であるこ
とかキラルプレート分析によって判明した。以上の結果
からプラスミドｐＨＰＢ　１２は、Ｌ−またはＤ−５−
（２ｔメチルチオエチル）ヒダントインをそれぞれＮカ
ルバミル−し−またはＮ−カルバミル−Ｄ−メチオニン
に変換する能力と、Ｎ−カルバミルＬ−メチオニンをＬ
−メチオニンに変換する能力があることが分かった。

１−４．プラスミドｐＨＰＢ　ｌ　２の挿入ＤＮＡの構
造解析 プラスミドｐＨＰＢ　１２の制限酵素地図を作成したと
ころ第２図のようになった。これらの制限酵素を用いて
プラスミ）”ｐＨＰＢ１２の挿入ＤＮＡ部分をＭ１３ｍ
ｐ１８ファージにサブクローニングし、ジデオキシ法に
よって塩基配列を決定した。この方法によって塩基配列
が決定できなかった領域はＭ１３ｍｐ１８ファージにサ
ブクローニングされた挿入ＤＮＡ部分をさらにキロシー
フェンス用デイリージョンキット（宝酒造）を用いて縮
め、ジデオキシ法によって塩基配列を決定した。

この結果、プラスミドｐＨＰＢ　１２の挿入ＤＮＡの全
塩基配列が決定された（第３−１図、第３−２図、第３
−３図、第３−４図、第３−５図、第３−６図、第３−
７図）。この挿入ＤＮＡ内にそれぞれ分子量７５，６０
０．６４，９００及び４５．７００のタンパク質をコー
ドし得る３個のオープンリーディングフレームが見出さ
れた。これらをそれぞれ０ＲＦ２．０ＲＦ３及び０ＲＦ
４と命名した。（第２図） ■−５．プラスミドｐＨＰＢ　ｌ　２の欠失プラスミド
の作製 プラスミｔ”ｐＨＰＢ１２を各種制限酵素で切断し、得
られたベクターＤＮＡを含むＤＮＡ断片をセルフライゲ
ーションさせ、第４図に示した欠失プラスミドを作製し
た。プラスミドｐＤＢＡ３５はプラスミドｐＨＰＢ　１
２を制限酵素ＢａｍＨ［で切断後、セルフライゲーショ
ンさせたもので、０ＲＦ２を完全な形で持っている。プ
ラスミドｐＤＸＢ５１はプラスミドｐＨＰＢ　１２を制
限酵素Ｘｂａｌで切断後、セルフライゲーションさせた
もので、ＯＲＦ　２と０ＲＦ３を完全な形で持っている
。プラスミドｐＤＫＰ４６はプラスミドｐＨＰＢ　１２
を制限酵素Ｋｐｎ　Ｉで切断後、セルフライゲーション
させたもので、ＯＲＦ　３とＯＲＦ　４を完全な形で持
っている。プラスミドｐＤＳ７３８はプラスミドｐＨＰ
Ｂ　１２を制限酵素ＳｍａＩと５ｔｕｌで切断後、セル
フライゲーションさせたもので、０ＲＦ４を完全な形で
持っている。プラスミドｐＤＳＰ７３はプラスミドｐＨ
ＰＢ　１２を制限酵素５ｔｕｌとＰｆｌＭＩで切断後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーセ反応により末端を平滑化し、セ
ルフライゲーションさせたもので、０ＲＦ２と０ＲＦ４
を完全な形で持っている。プラスミドｐＤＫＸ３５はプ
ラスミドｐＤＫＰ４６を制限酵素Ｘｂａｌで切断後、セ
ルフライゲーションさせたもので、ＯＲＦ　３を完全な
形で持っている。

１−６．プラスミドｐＨＰＢ　ｌ　２の各オープンリー
ディングフレイムの機能 実施例１−５で得られた各種欠失プラスミドで大腸菌Ｊ
Ｍ１０３を形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして
形質転換株を得た。これらの形質転換株のＮ−カルバミ
ル−Ｌ−メチオニン及びＬまたはＤ−５−（２−メチル
チオエチル）ヒダントインの変換能を実施例１−３と同
し条件で調べた。

第５図はプラスミドｐＨＰＢ　１２の欠失プラスミドを
持つ大腸菌ＪＭ１０３のＮ−カルバミルＬ−メチオニン
の変換能を薄層クロマトグラフィーによって分析した図
である。図中のヒダントイン酸はＮ−カルバミルメチオ
ニンを示す。その結果、Ｎ−カルバミル−Ｌ−メチオニ
ンのし一メチオニンへの変換にはＯＲＦ　４が必要であ
ることが分かる。

同様に第６図及び第７図はそれぞれＬ−及びＤ−５−（
２−メチルチオエチル）ヒダントインの変換能を薄層ク
ロマトグラフィーによって分析した図である。両図中の
ヒダントインは５−　（２−メチルチオエチル）ヒダン
トインを、ヒダントイン酸はＮ−カルバミルメチオニン
を示す。これら第６図及び第７図からし−またはＤ−５
−（２−メチル升オニチル）ヒダントインの変換には０
ＲＦ２とＯＲＦ　３がともに必要であることが分かる。

このときＬ−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ンの場合、プラ“スミドｐＨＰＢ　１２ではメチオニン
まで変換されたか、プラスミドｐＤＸＢ５１ではＯＲＦ
　４を持っていないためＮ−カルバミルメチオニンに留
まった。またＤ−５−（２−メチルチオエチル）ヒダン
トインの場合、生成するＮ−カルバミルメチオニンは０
体なのでプラスミドｐＨＰＢ１２でもメチオニンまで変
換することはできなかった。

実施例２．アミノ酸の生成速度 プラスミドｐＨＰＢ］２を持つ大腸菌ＪＭＩＯ３である
形質転換株である（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１７６夢）及
びシュードモナス属細菌Ｎ５６７１菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−
９５４３）をそれぞれＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に植菌し、３
０°Ｃで、−晩、振盪培養した。遠心によって集菌し、
それぞれの菌体を６００ｎｍのＯＤか１になるように、
０．２ＸのＬ−５−（２−メチルチオエチル）ヒダント
インを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地あるいはＭＹ培地（６ｇ
／ｌ　Ｎａ２Ｈｐｏ４．３ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，０，
５ｇ／ｌ　ＮａＣ１、０，５Ｘグルコース、２ｍＭ　Ｍ
ｇ５Ｏ，，０，１ｍＭＣａＣｌ２．０．００１Ｘ　Ｍｎ
ＳＯ４、Ｏ，０ＯＯＩＸ　ＦｅＳＯ４，２μｇ／ｍ！チ
アミン、０．０ＩＸ酵母エキス）に懸濁した。このとき
形質転換株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１７６１）の方には
ＩｍＭになるようにＩＰＴＧを添加した。

このようにして調製した菌体懸濁液を３０°Ｃで振盪培
養し、経時的に培養液を抜取り、メチオニンの生成量を
ＨＰＬＣによって分析した（表１）。

この結果、形−質転換株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１７６
、ｌＦ）はシュードモナス属細菌Ｎ５６７１菌（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−９５４３）よりも、両培地でメチオニンの生成
速度が高いことを確認した。

表１．アミノ酸の生成速度 Ｎ５６７１　　　　　　　０．００　０．００　　０．
００　　　０．０ＯＮＳ６７１　　　　　　　０．００
　０．０１　　０．０５　　　０、Ｉ５実施例３．各種
５−置換ヒダントインの変換能形質転換株（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１１１７６９）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に植菌し、
３０℃で６００ｎｍのＯＤが１になるまで振盪培養した
。この１ｍｌから遠心によって集菌し、０．２Ｘ　５−
置換ヒダントインと　１ｍＭ　ＩＰＴＧを含む１ｍｌの
ＭＹ培地に懸濁した。３０℃で一晩、振盪培養し、生成
するアミノ酸をＨＰＬＣによって分析した（表２）。こ
の結果、メチオニン、アラニン、イソロイシン、フェニ
ルアラニンなどのアミノ酸に対応する５−置換ヒダント
インは、速やかに変換されることが分かった。また、バ
リン、ロイシンなどのアミノ酸に対応する５−置換ヒダ
ントインも変換されることが分かった。

Ｕ発明の効果コ 本発明によって、５−置換ヒダントインまたはＮ−カル
バミルアミノ酸の変換の関与する遺伝子を大腸菌で安定
に発現させることか可能になった。

この結果、変換酵素を大腸菌内に多量に蓄積させること
か可能になり、変換能の高められた菌株か得られた。

表　　　２ Ｌ−５−メチルヒダントイ ン Ｌ−アラニン １、１２

【図面の簡単な説明】

第１図は形質転換株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１７６）の
変換能を薄層クロマトグラフィーによって分析した図で
ある。 第２図はプラスミｌ”ｐＨＰＢ１２の制限酵素地図であ
る。 第３−１図、第３−２図、第３−３図、第３−４図、第
３−５図、第３−６図、第３−７図はプラスミドｐＨＰ
Ｂ１２の挿入ＤＮＡ部分の全塩基配列を示す図である。 第４図はプラスミドｐＨＰＢ　１２の欠失プラスミドの
構造を示す図である。白抜きの棒は挿入ＤＮＡ部分を、
実線は欠失部分を示す。 第５図はプラスミドｐＨＰＢ　ｌ　２の欠失プラスミド
を持つ大腸菌ＪＭＩ０３のＮ−カルバミル−Ｌ−メチオ
ニンの変換能を薄層クロマトグラフィーによって分析し
た図である。図中のヒダントイン酸はＮ−カルバミルメ
チオニンを示す。 第６図はプラスミドｐＨＰＢ　１２の欠失プラスミドを
持つ大腸菌ＪＭ１０３のＬ−５−（２−メチルチオエチ
ル）ヒダントインの変換能を薄層クロマトグラフィーに
よって分析した図である。図中のヒダントインは５−（
２−メチルチオエチル）ヒダントインを、ヒダントイン
酸はＮ−カルバミルメチオニンを示す。 第７図はプラスミドｐＨＰＢ　１２の欠失プラスミドを
持つ大腸菌ＪＭ１０３のＤ−５−（２−メチルチオエチ
ル）ヒダントインの変換能を薄層クロマトグラフィーに
よって分析した図である。図中のヒダントインは５−（
２−メチルチオエチル）ヒダントインを、ヒダントイン
酸はＮ−カルバミルメチオニンを示す。 第８図は０ＲＦ２か、第９図は０ＲＦ３が、及び第１０
図はＯＲＦ　４が、それぞれコードし得るタンパク質の
アミノ酸配列をアミノ酸の一文字記号で示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）第８図と第９図で示されるアミノ酸配列を有する
   ことを特徴とする５−置換ヒダントインをＮ−カルバミ
   ルアミノ酸に変換する能力を持つ酵素タンパク質
2. （２）第１０図で示されるアミノ酸配列を有することを
   特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ
   酸に変換する能力を持つ酵素タンパク質