WO1992015331A1 - Preparation lyophilisee d'anticorps monoclonaux - Google Patents

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WO1992015331A1
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Yukio Shimazaki
Yasuyuki Kuroiwa
Shiro Takagi
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    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man

Definitions

  • Polyclonal antibodies are generally stable against these heating, lyophilization, and acid / alkaline treatments, whereas monoclonal antibodies are denatured by such treatments, and their activities are reduced. Easy to lose.
  • IgM is more unstable than other globulin-type monoclonal antibodies (eg, IgG, IgA, IgE).
  • heat treatment for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-76423 discloses that monoclonal antibody is unstable to heat treatment, and in order to overcome this thermal instability, egg albumin hydrolyzes in monoclonal antibody preparations. It discloses that a substance is added.
  • sugar alcohol sorbitol, mannitol and the like can be used, but mannitol is preferred.
  • Amino acids include glycine, alanine, norin, leucine, isoloisin, tyrosine, pheninoleanine, serine, threonine, glutamine, glutamic acid, asparagine, Aspartic acid, arginine, lysine, histidine, proline, tributphan, methionine, cystine and the like can be used, but glycine or arginine is preferred.
  • the pH of the solution for dissolving the monoclonal antibody is pH 4.0 to 8.1 when gelatin is added, when carboxylic acid is added, and when both gelatin and carboxylic acid are added.
  • Common used compounds such as organic acids, inorganic acids, and inorganic salts can be used alone or in combination.
  • Compounds that can be used for pH adjustment include, for example, citrate, sodium citrate, potassium citrate, phosphoric acid, sodium phosphate, and phosphoric acid.
  • the monoclonal antibody solution prepared in this way is sufficiently stable when frozen and freeze-dried as is, but isotonicity of the solution Surfactants such as Tween 20 or Tween 80, albumin such as human beef, or chelating agents such as EDTA etc. This is also possible.
  • IgM is exemplified as a monoclonal antibody.
  • IgM is unstable compared to other globulin-type antibodies (eg, IgG, IgA and IgE), and The stabilizing effect indicated by is easily applicable to other globulin-type antibodies.
  • Epstein-Barr 'Pills (EB virus) transformed cell line MP-5038 (EBK No. 1596) reactive with E. serotype Pseudomonas aeruginosa was cultured and sulfated from the culture supernatant.
  • the human 'monoclonal antibody was purified by column chromatography.
  • the monoclonal antibody obtained by this method had a purity of 99% or more in SDS-electrophoresis and HPLC analysis using a gel filtration column.
  • PBS Phosphate-buffered saline adjusted to ⁇ 7.4 so that the final concentration of this monoclonal antibody is O.lmg / ⁇
  • gelatin Nitsubishi Corporation, high grade gelatin, type A (neutral gelatin) and type B (acidic gelatin)
  • PBS Phosphate-buffered saline adjusted to ⁇ 7.4 so that the final concentration of this monoclonal antibody is O.lmg / ⁇
  • gelatin Nitsubishi Corporation, high grade gelatin, type A (neutral gelatin) and type B (acidic gelatin)
  • 0.5mfi was aseptically dispensed into polypropylene cryotubes (Corning) and frozen at 180 ⁇ . This was freeze-dried under reduced pressure in vacuum. After drying, an equivalent amount of distilled water for injection was added to the lyophilized product before freezing, and the lyophilized product was dissolved.
  • the antigen binding activity of the monoclonal antibody was measured by
  • washing solution PBS containing 0.05% Tween20
  • block solution PBS containing 0.5% bovine serum albumin
  • the enzyme reaction was stopped by adding 2% succinic acid at 50 i / gel, and the absorbance at 414 nm was measured using a 966-plate reader (Japan Intermed). A logarithmic plot was performed between the reciprocal of the dilution factor and the absorbance, and the dilution factor when the absorbance was 0.1 was determined, and this was defined as the antigen binding activity.
  • the monoclonal antibody used in Example 1 was dissolved in buffers at each pH so that the final concentration was 0.1 mg / mJli.
  • neutral gelatin was added to a final concentration of 0.01%, and 0.5mfi was aseptically dispensed into a polypropylene cryotube, frozen at 180, and freeze-dried under vacuum. .
  • the same volume of distilled water for injection as before freezing was added to the lyophilized product to dissolve it, and then the antigen binding activity was measured.
  • the final concentration of the monoclonal antibody used in Example 1 was added to a 50 mM phosphate buffer containing sodium citrate at an extension of 200 mM from ⁇ and adjusted to pH 6.1 to 8.1. And dissolved so as to be O.lmg / ⁇ . At this time, if the salt concentration of the solution was less than 150 mM, sodium chloride was added to bring the concentration to 150 mM.
  • This monoclonal antibody solution was aseptically dispensed into polypropylene tubes at a rate of 0.5 mfi, frozen at 180, and freeze-dried under reduced pressure in vacuo. The same amount of distilled water for injection as before the freezing was added to the freeze-dried product and dissolved, and then the antigen binding activity was measured.
  • the monoclonal antibody used in Example 1 was dissolved in PBS to a final concentration of 0.1 mg / mL.
  • neutral gelatin was added to a final concentration of 0.003%, and glucose, sucrose, mannitol, glycine, or arginine was added to a final concentration of 0.001 to 0.1%, respectively.
  • 0.5 ⁇ was aseptically dispensed into polypropylene cryotubes at a time and frozen in one. This was freeze-dried under reduced pressure under vacuum, and an equal volume of distilled water for injection was added to the freeze-dried product before freezing, and the antigen-binding activity was measured.
  • Table 5 shows the relative activities, where the activity before freeze-drying was set to 10.
  • the antibody activity was well recovered in any of the low-molecular substances, and the effect depended on the concentration of the added low-molecular compound.
  • This monoclonal antibody solution was aseptically dispensed into glass vials (Iwaki Glass Co., Ltd.) with a capacity of 10 mF each, frozen at 180, and freeze-dried under reduced pressure. An antigen-binding activity was measured after adding an equal volume of distilled water for injection to the freeze-dried product before freezing and lysing. as a result, The monoclonal antibody retained the antigen-binding activity before freezing.
  • the monoclonal antibody used in Example 1 was prepared by adding sodium citrate (0.02 ⁇ ), sodium chloride (0.05 ⁇ ), and mannitol (0.5 ⁇ ) to a concentration of l lgZ. %) Was dissolved in 0.1M phosphoric acid bite solution ( ⁇ 7.0). This monoclonal antibody solution was dispensed into glass vials, frozen at 180, and freeze-dried under reduced pressure under vacuum. An equal volume of distilled water for injection before freezing was added to the lyophilizate to dissolve it, and then the antigen-binding activity was measured according to Example 1. As a result, the monoclonal antibody retained the antigen-binding activity before freezing.
  • a human / human hybridoma MP 5121 (Shenzhen 2270) produced by the cell fusion method and produces human Igfi that is reactive to S. cerevisiae bacteria is cultured.
  • Monoclonal antibodies were purified from the culture supernatant according to Example III. This monoclonal antibody was adjusted to a concentration of lmg / Bfi with sodium citrate (0.05%), sodium chloride (0.05%), mannitol (0.5% ) was dissolved in a 0.1 M phosphate buffer ( ⁇ 7.0). This monoclonal antibody solution was dispensed into glass vials, frozen at 180 TC, and then lyophilized under reduced pressure under vacuum.
  • the same amount of distilled water for injection as before the freezing was added to the lyophilizate to dissolve it, and the antigen-binding activity was measured according to Example 1.
  • the LPS of the antigen was extracted from serotype A serotype Bacillus (ATCC 27577). As a result, monoclonal antibodies are frozen It retained the antigen binding activity before the conclusion.
  • Human IgM-producing human and human hybridomas prepared by the cell fusion method MP 5097, MP 5139, MP 5114 and MP 5156 (Researcher No. 2268, 2272, 2269 and 2339, respectively) Monoclonal antibodies were purified from the culture supernatant of (1). These monoclonal antibodies were reactive with Pseudomonas aeruginosa, and were reactive with serotypes B, E, G, and I, respectively. A total of five of these four monoclonal antibodies and the monoclonal antibody shown in Example 9 were added to sodium citrate (0.02%) so that the final concentration was 5 mgZmJa. M), sodium chloride (0.05M) and mannitol (0.5%) in 0.1M phosphate buffer ( ⁇ 7.0).

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Description

m m
発明の名称
モノ ク ローナル抗体含有凍結乾燥製剤 産業上の利用分野
本発明は、 モノ ク ローナル抗体を主成分とする凍結乾燥製 剤に関する。
従来の技術
モノク ローナル抗体は、 特定のェピ トープのみに反応性を 有する均一なグロブリ ンタ ンパク貿である。 近年、 細胞融合、 培養、 及びタ ンパク質精製技術等の進歩によ り、 モノ ク ロ一 ナル抗体の大量調製が可能とな り、 例えば、 各種分析、 診断、 治療、 予防等、 広い分野で利用されるよう になった。 中でも、 治療あるいは予防薬と して、 モノ ク ローナル抗体への期待が 髙まっている。 と りわけ、 ヒ 卜に対する適用は、 今後更に進 展することが予想され、 抗原性の点で好ま しいヒ ト由来のモ ノ ク 口一ナル抗体の開発が進められている。
従来当該分野においては、 同様な目的のために免疫グロブ リ ンなどのポリ ク ローナルな抗体が診断治療に使用されてき た。 モノ ク ローナル抗体が特定のェピ トープのみに反応性を 有する均一なものであるのに対し、 ポリ ク ローナルな抗体は その名の通り複数の抗体の混合物である。 そのためポリ ク 口 一ナルな抗体は性質の異なる分子が相互に安定化し合い、 全 体と して比較的安定な状態となっている。 しかし、 精製され たモノ ク ローナル抗体は異なる分子同志の相互作用による安 定化が期待できず、 そのグロブリ ンタイプによ らず、 種々の 物理的、 化学的作用に対して不安定である。
モノク ローナル抗体やポリ ク ローナルな抗体などのグロブ リ ン蛋白は、 特に診断及び治療を 目的と した場合、 混入する ウィルスの不活化のために加熱処理が施されることがある。 また、 該グロブリン蛋白は溶液状態では長期保存には向かな い。 そのため凍結乾燥が該グロブリ ン蛋白分子を安定保存す るための製剤形態と して汎用されている。 更に、 必要によ り 該グロブリ ン蛋白は酸 · アルカ リ処理なども行われる。
これらの加熱、 凍結乾燥、 酸 · アルカ リ処理に対して、 ポ リ ク ローナルな抗体は一般に安定であるのに対し、 モノ ク ロ ーナル抗体はそれらの処理等によ リ変性し、 その活性を失い 易い。 と リわけ IgMは他のグロブリンタイプのモノク ローナ ル抗体 （例えば IgG、 IgA , IgE ) に比べてよ り不安定である。 加熱処理については例えば特開昭 61- 76423にはモノク ローナ ル抗体が加熱処理に対して不安定であ り、 この熱的不安定性 を克服するためにモノク ローナル抗体製剤中に卵アルブミ ン 加水分解物を添加する事を開示している。
一方、 凍結乾燥処理においてはモノ ク 口.ーナル抗体に特有 な問題点がある。 即ちモノク ローナル抗体を凍結乾燥するに 際して、 モノ ク ローナル抗体溶液を安定化剤を添加せずに凍 結乾燥した場合、 その処理中に生じる変性によ り抗原結合活 性が低下する という問題が生じ、 これを防止することが必要 である。 このような問題.点はモノク ローナル抗体において顕 著であ リ、 ポリ ク ローナルな抗体の場合は上記の理由からも ともと安定であ り、 大きな問題とはならない。 モノ ク ローナル抗体の凍結乾燥物の調製には、 凍結乾燥前 の溶液に異種タ ンパゥ質であるアルブミ ンを添加した り （例 えば特開昭 60- 146833、 特開昭 61 - 78730、 特開昭 61- 78731、 W0 90/11091)、 糖質であるマル トースを添加する こと （例え ば W0 89/11297)が既に公知である。
ポリ ク ロ一ナルな抗体である免疫グロブリ ンは、 比較的低 濃度で用いられることが多く 、 溶液保存あるいはそれに続く 凍結乾燥処理時に凝集体が生成することがある。 この凝集体 は該グロブリ ンを静注した場合にアナフィ ラキシ一様の重篤 な副作用の原因と考えられている。 そこで凝集体の形成を抑 えるために保存溶液に異種タ ンパク質を加えるこ と が知られ ている。 例えば， 異種タ ンパク質であるゼラチンを単独で免 疫グロ ブリ ン溶液に添加した り （例えば特開昭 58- 167518、 Vox. Sang. (1983)51.81-86)、 あるいは糖質であるシユーク ロースとゼラチンを併用 して添加すると、 保存中の凝集体形 成が防止され、 更に抗菌、 抗ウィルス作用が保持される こ と が知られている（SU 700132)。 これらに開示さ ている こ と はいずれもポリ ク 口一ナルな抗体である免疫グロブリ ンを髙 濃度溶液と した場合の凝集体形成の防止を 目的と している。 そ してこれらの何れにも凍結乾燥処理による抗原結合活性の 低下に関しては論じ られていない。 これに対して、 モノ ク ロ ーナル抗体は比較的低濃度で保存ない し凍結乾燥される。 そ してそのような低濃度であっても凍結乾燥処理時に生じる変 性とそれに伴う抗原結合活性の低下が問題となる。 そ してこ の問題の解決に免疫グロブリ ンにおける凝集体形成の防止の ためのゼラチン添加が有用であるか否かについては従来知ら れていなかった。
他方、 カルボン酸及びその塩が、 多く のタ ンパク質溶液の PH維持のための緩衝液の成分と して使用されることは広く知 られている。 例えば W0 89/11298では、 モノ ク ローナル抗体 保存溶液に沈雜する凝集体形成の防止のため、 安定化剤と し てマルト一ス、 食塩、 リ ン酸ナ ト リ ウムを添加することが開 示されているが、 その際緩衝液成分と してリ ン酸ナ ト リ ウム の他にクェン酸ナ ト リ ウムも使用することが例示されている < しかし、 これはモノク ローナル抗体溶液の保存中に生じる凝 集体形成を防止するこ と について示されるもので、 モ ノ ク ロ ーナル抗体の凍結乾燥処理さ らには該処理時のモノ ク ローナ ル抗体の変性とそれに伴う抗原結合活性の低下の防止につい ては何も開示していない。 また、 W0 89/11297では、 凍結乾 燥前のモノ ク ローナル IgG抗体溶液にマルトースを安定化剤 と して添加し、 更に酢酸ナ ト リ ウムを緩衝液の成分と して 5 〜10ミ リモルの饞度に添加して、 該溶液の PHを 3〜 6の酸性 領域に維持することが開示されている。 この場合、 酢酸ナ ト リ ゥムの使用は明らかに緩衝液の成分と してのものであ り、 ¾10 89/11297 にはカルボン酸及びその塩が PH緩衝作用を示す 範囲を越えた PHにおいても凍結乾燥処理時の抗体の変性を防 止するための安定化剤と して作用するこ と については何ら示 されていない。 また、 該抗体溶液の PHについては注射剤と し て低い PHの抗体溶液を静注した場合、 投与部位に傷みを生ず る場合がある。 該抗体溶液を注射剤と して用いる場合、 中性 付近の PH範囲が望ま しいが、 この PH範囲での利用についても W0 89/11297には示されていない。
また、 免疫グロブリ ンを血清や血漿から調製する際に混入 する恐れのあるウィルスの不活化を 目的と して、 免疫グロブ リ ンを溶液状態で加熱処理するこ とがある。 例えば特開昭 62 -292731、 特開昭 61 - 194035、 特開昭 61-191622あるいは特開 昭 57 - 140724では、 カルボン酸を該グロブリ ン溶液に添加す ることが示されている。 また、 特開昭 61-78730及び特開昭 61 -78731では、 免疫グロブリ ンを乾燥状態で加熱処理する際に 酢酸ナ ト リ ウムを添加することが示されている。 しかし、 こ れらはいずれも加熱処理の際の安定化を 目的と してカルボン 酸を添加しているに過ぎない。 即ち凍結乾燥処理時の抗体の 変性とそれに伴う抗原結合活性を防止するためにカルボン酸 及びその塩が有用であるか否かについてはこれまで知られて いなかった。
発明が解決しょ う とする髁題
本発明の目的は、 モノ ク ローナル抗体の凍結乾燥処理時に 生じる変性と、 それに伴う抗原結合活性の低下を防止した、 安定なモ ノ ク ローナル抗体凍結乾燥製剤を提供する こ と にあ る。
課題を解決するための丰段
本発明者らは、 上記髁題を解決するために鋭意検討を行つ た結果， モノ ク ローナル抗体の凍結乾燥処理においてモノ ク ローナル抗体の安定化のためにゼラチン、 カルボン酸も し く はその塩が有効であることを見いだした。 すなわち、 凍結乾 燥前のモノク ローナル抗体を含む溶液がゼラチンを含有する ことによ り、 凍結乾燥処理時に生じるモノク ローナル抗体の 変性と、 それに伴う抗原結合活性の低下を防止出来ること。 また凍結乾燥前のモノ ク ローナル抗体を含む溶液がカルボン 酸も しく はその塩を含有するこ とによ り、 広い範西の PH領域 で、 しかも緩衝作用を示す範囲外の P Hにおいても凍結乾燥処 理時に生じるモノク ローナル抗体の変性と、 それに伴う抗原 結合活性の活性の低下を防止出来、 これによ りモ ノ ク ローナ ル抗体の安定かつ安全性の髙ぃ製剤組成物の作製が可能であ ることを見いだし、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明はモノ ク ローナル抗体及びゼラチンを含有す るこ と を特徵とする凍結乾燥製剤及びモノク ローナル抗体及 びカルボン酸も し くはその塩を含有する Ρ Η 6 · 1〜 8 . 1である溶 液を凍結乾燥して諝製した製剤を提供するものである。
以下、 本発明を具体的に説明する。
本発明に使用きれるモノ ク ローナル抗体と しては、 ヒ ト、 マウス、 ラッ 卜等から通常得られるモノク ローナル抗体であ リ、 その由来や生産手段を問わない。 例えば従来報告されて いる細胞融合法や形質転換法等の方法によ り作製した抗体産 生細胞や、 ク ローニングした抗体遗伝子を組み込んだ細胞を 培養して得た培養液、 あるいはこのよ うな抗体産生細胞を移 植したマウスの腹水等から、 本発明に使用されるモノ ク ロ一 ナル抗体を得ることができる。 これらの細胞培養液あるいは マウスの腹水等から得られるモノ ク ローナル抗体の精製方法 と しては、 疏酸アンモニゥム塩析、 イオン交換ク ロマ ト ダラ フィ 一、 ゲル滤過、 アブイ 二ティ ク ロマ ト グラ フィ ー、 超遠 心分離、 吸着ク ロマ ト グラ フィ ー， 疎水性ク ロマ 卜 グラ フィ —等の方法が使用できる。 本発明に使用されるモ ノ ク ローナ ル抗体のグロブリ ンタ イ プは、 lgG、 I gM、 Ig A及び I g Eである こ と が多いが、 そのタ イ プは問わず、 いずれのグロ プリ ンタ イ ブのものも使用できる。 その中でも特に I gMは、 他のグロ プリ ンタ イプの抗体に比べてよ リ不安定なため、 I g M型のモ ノ ク ローナル抗体において有効な安定化の方法は， 他のグロ ブリ ンタ イ プのモノ ク ローナル抗体にも容易に適用される。 また、 本発明において、 モノ ク ローナル抗体は単独で用いて もよい し、 複数のモ ノ ク ローナル抗体を混合して用いても差 し支えない。
ゼラチンは、 その調製方法によ リ等電点の異なる二つのタ イブ （中性タ イ プと酸性タ イプ） が得られるが、 本発明に用 いるのはそのいずれでも良く 、 更にォキシポリ ゼラチン、 変 性液状ゼラチン等の化学的修飾を受けたゼラチンも使用可能 である。
カルボン酸と しては、 クェン酸、 齚酸、 .シユ ウ酸、 コハク 酸、 フマル酸等が使用でき るが、 クェン酸が好ま しい。 また、 カルボン酸の塩と しては、 クェン酸ナ ト リ ウム、 クェン酸力 リ ウム、 酢酸ナ ト リ ウム、 酢酸カ リ ウム、 シユ ウ酸ナ ト リ ウ ム、 シユ ウ酸カ リ ウム、 コハク酸ナ ト リ ウム、 コハク酸カ リ ゥム、 フマル酸ナ ト リ ウム， フマル酸カ リ ウム等が使用でき るが、 クェン酸ナ ト リ ウムが好ま しい。
また、 モノ ク ローナル抗体の安定化、 または溶液の PH調整、 等張化及び緩衝作用を 目的と して、 ゼラチン、 カルボン酸あ るいはその塩に加え、 更に無機塩、 単糖類、 二糖類、 糖アル コールも し く はア ミ ノ酸を添加する こ とも'可能である。
無機塩は、 塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウム、 塩化マグネシ ゥム等が使用できるが、 塩化ナ ト リ ウムが好ま しい。
単糖類は、 グルコース、 マンノース、 ガラク トース、 フル ク トース等が使用できるが、 グルコースあるいはマンノース が好ま しい。
二糖類は、 マル トース、 シユーク ロース、 ラ ク トース等が 使用できるが、 マルトースあるいはシユーク ロースが好ま し い
糖アルコールは， ソルビ トール、 マンニ トール等が使用で きるが、 マンニ トールが好ま しい。
アミ ノ酸は、 グリ シン、 ァラニン、 ノ リ ン、 ロイシン、 ィ ソ ロ イ シン、 チロ シン、 フ エ ニノレア ラニ ン、 セ リ ン、 ス レオ ニン、 グルタ ミ ン、 グルタ ミ ン酸、 ァスパラギン、 ァスパラ ギン酸、 アルギニン、 リ ジン、 ヒ スチジン、 プロ リ ン、 ト リ ブ ト フ ァ ン、 メチォニン、 システィ ン等が使用できるが、 グ リ シンあるいはアルギニンが好ま しい。
本発明の凍結乾燥製剤を作製する には、 ゼラチン、 カルボ ン酸も し く はその塩を含有するモ ノ ク ローナル抗体溶液を凍 結乾燥すれば良い。 好ま し く は、 ゼラチン、 カルボン酸も し く はその塩を含有し、 P Hの調整された緩衝液にモ ノ ク ローナ ル抗体溶液を添加する こ と、 あるいはモノ ク ローナル抗体溶 液にゼラチン、 カルボン酸も し く はその塩を添加する こ と等 によ り行う こ と ができる。 本発明で用い られるモ ノ ク ローナ ル抗体の溶液中での濃度は、 0.01mg/mfiから 50mgZinfiであ リ 、 好ま し く は、 O.lmgZmfl力、ら 10mg rafiである。 ゼラチンの添 加量は、 モ ノ ク ローナル抗体 1重量部に対し 100分の 1 重量 部から 100重量部であ リ、 好ま し く はモノ ク ローナル抗体 1 重量部に対し 10分の 1重量部から 10重量部である。 添加され るカルボン酸も し く はその塩の濃度は 2 mMから 500mMであ リ 、 好ま し く は 10mMから 200mMである。
モノ ク ローナル抗体を溶解する溶液の pHは、 ゼラチン を添 加す る場合は PH4.0~8.1であ り 、 カルボン酸を添加する場 合、 及びゼラ チ ン と カルボン酸の両方を添加する場合は PH 6·1〜8·1であ り、 好ま し く は ρΗ6·5〜7.8である。 ΡΗの調整は、 通常用い られる有機酸や無機酸、 無機塩等の化合物を皐独或 は組み合わせて使用する こ と が出来る。 PH調整に使用でき る 化合物と しては例えば、 クェン酸、 クェン酸ナ ト リ ウム、 ク ェン酸カ リ ウム， リ ン酸、 リ ン酸ナ ト リ ウム、 リ ン酸力 リ ウ ム、 塩酸、 卜 リ スヒ ド ロ キシメチルァ ミ ノ メ タ ン、 酢酸、 酢 酸ナ ト リ ウム、 酢酸カ リ ウム、 水酸化ナ ト リ ウム、 ホウ酸、 ホウ酸ナ ト リ ウム、 ホウ酸カ リ ウム等が例示できる。 モ ノ ク ローナル抗体を溶解する緩衝液の濃度は 5 mMから 500ιηΜであ り 、 好ま し く は 10mMから 500mMである。 このよ う に、 カノレボ ン酸も し く はその塩は PH調整に際しても使用され得るが、 上 記の量はこれらも含む全量を意味する。
この様に して調製されたモ ノ ク ローナル抗体溶液は、 この まま凍結 し凍結乾燥しても十分安定であるが、 溶液の等張化 やモノ ク ローナル抗体の容器付着性等を防止する目的で、 ッ ィーン 20やツイーン 80等の界面活性剤、 ヒ トゃ牛等のアルブ ミ ン、 あるいは EDTA等のキレー ト剤等'を添加するこ とも可能 である。
モノク ローナル抗体溶液の凍結乾燥は、 通常知られる方法 で行う ことができ、 その乾燥温度、 真空度は逋宜選択できる < 実施例
以下、 実施例を示して本発明を説明するが、 本発明はこれ に限定されるものではない。 また、 本発明ではモノク ローナ ル抗体と して IgMを例示しているが、 IgMは上述したごと く他 のグロブリンタイプの抗体 （例えば IgG、 IgA及び IgE)に比べ て不安定であ り、 IgMで示される安定化効果は、 他のグロブ リンタイプの抗体に容易に適用できるものである。
実施例 1
E血清型緑膿菌に反応性を有するェプスタ イ ン · バー ' ゥ ィルス （EBウィルス） 形質転換細胞株 MP-5038 (微ェ研条寄第 1596号）を培養し、 その培養上清から硫酸アン ΐニゥム塩析、 セフ ア ク リル S- 300 (フ アルマシア社）を用いたゲル ¾1過、 ヒ ドロキシァパタ イ ト HPLC力ラム（三井東圧化学）及びブルーセ ファ ロース（フ アルマシア社）を用いたカラムク ロマ トグラ フ ィ一によ リ、 ヒ ト ' モノク ローナル抗体を精製した。 この方 法で得られたモ ノ ク ローナル抗体は、 SDS-電気泳動及びゲ ル滤過カラムを用いた HPLCによる分析で、 99 %以上の純度を 有していた。 このモノ ク ローナル抗体を終濃度と して O . lmg / Ββとなる様に ΡΗ7.4 に調整されたリ ン酸緩衝化生理食塩液 (以下 PBSと称する）に溶解した。 一方、 ゼラチン （二ツ ビ社、 ハイ グレー ドゼラチン、 タ イプ A (中性ゼラチン）及びタ イプ B (酸性ゼラチン））を終濃度と して 0.001から 1 % となる様に 加え、 2 πιβ容量のポリ プロ ピレン製クライオチューブ （コー ニング社）に 0.5mfiずつ無菌的に分注し、 一 80 ^にて凍結させ た。 これを真空滅圧下凍結乾燥した。 乾燥後、 凍結前と等量 の注射用蒸留水を凍結乾燥物に加えて溶解後、 以下の方法に よ りモノク ローナル抗体の抗原結合活性を測定した。
(抗原結合活性測定法）
抗緑膿菌抗体の抗原結合活性の測定は、 以下のよ う に して 実施した。 E血清型緑膜菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27581)ホルマ リ ン死菌体よ り 田辺 ら（免疫実験操作法 C、 (1978) 1793-1801)の方法によ り調製したリポ多糖（LPS)を PBS に 1 mg/mfi濃度となる様に溶解し、 これを 0.1Mリ ン酸緩衝液 (PH7.0)で 500倍に希釈した後、 96穴 EIAプレー ト（グライナ一 社、 イ ミ ュロ ン- 600)の各ゥエルに 50 1ずつ分注した。 4 °C に一晩放置して固定化した後、 0.05 % Tween20を含む PBS (以 下洗浄液と略す）を洗浄し、 0.5 %牛血清アルブ ミ ン を含む PBS (以下ブロ ッ ク液と略す） で各ゥエル当 り 200 1ずつ分注 し、 室温で 1時間振と う して非特異的タ ンパク質結合部位を 飽和させた。 ブロ ック液を除去した後、 適当な濂度から頫次 倍々希釈した被検体溶液を ゥエル当 り 100 μ ΐずつ入れ、 室温 で 2時間振と う した。 洗浄液で 4 回洗浄した後、 ブロ ッ ク液 で 1000倍に希釈したパーォキシダーゼ標識ャギ抗ヒ ト IgM抗 体（タ ゴ社）をゥエル当 リ 100 1ずつ分注し、 室温で 2時間振 と う した。 洗浄液で 4 回洗浄した後、 0.1Mクェン酸緩衝液 (PH4.0)で 1 回洗浄し、 l ng/mfl 2， 2， -アジノ ビス（3-ェチル ンズチアゾリ ン- 6-スルフォニ ッ タ ァシ ド） 及び 0.003%過 酸化水素水を同緩衝液に含む基質溶液をゥエル当 り 50 # 1ず つ分注し、 室温で振とう した。 30分後、 2 %コハク酸をゥェ ル当 り 50 iずつ加えて酵素反応を停止させた後， 414nmにお ける吸光度を 96六プレー ト リーダー（日本インターメ ッ ド社） にて測定した。 希釈倍率の逆数と吸光度の間で雨対数プロ ッ 卜を行い、 吸光度 0.1を示すときの希釈倍率を求め、 これを 抗原結合活性と した。
凍結前の抗原結合活性を 10と した相対活性で、 結果を表 1 に示した。 ゼラチンを添加せずにモノク ローナル抗体を凍結 乾燥した場合、 抗原結合活性は大き く滅少した。 これに対し て、 ゼラチンを添加した場合、 凍結乾燥後においても抗原結 合性が良く 回収され、 その効果は添加したゼラチンの濃度に 依存した。
〔表 1 〕
Figure imgf000015_0001
実施例 2
実施例 1 に用いたモノ ク ローナル抗体を終濃度と して 0.1 mg/mJliとなる様に各 pHの緩衝液に溶解した。 一方， 中性ゼラ チンを終濃度と して 0.01%となる様に加え、 ポリ プロ ピレン 製クライオチューブに 0.5mfiずつ無菌的に分注し、 一 80 に て凍結させ、 真空滅圧下凍結乾燥した。 凍結前と等容量の注 射用蒸留水を凍結乾燥物に加えて溶解後、 .抗原結合活性を測 定した。
凍結前の活性を 10と した相対活性で、 結果を表 2 に示した いずれの P Hにおいても抗原結合活性は良く 回収された。 〔表 2〕
Figure imgf000016_0001
実施例 3
クェン酸ナト リ ウムを含まないかあるいは 2 または lOmM含 有し、 PH 7 に調整された 20mMリ ン酸緩衝液に、 実施例 1で用 いたモノ ク ローナル抗体を終濃度と して O.liag ιιβとなる よう に溶解した。 この際、 溶液の塩濃度を塩化ナ ト リ ウムで 150mMに調整した。 このモノク ローナル抗体溶液を、 ポリプ ロ ピレン製クライオチューブに 0·5ιηβずつ無菌的に分注し、 一 80°Cにて凍結し、 真空減圧下凍結乾燥した。 凍結前と等量 の注射用蒸留水を凍結乾燥物に加えて溶解後、 抗原結合活性 を測定した。
凍結前の活性を 10と した相対活性で、 結果を表 3 に示した, クェン酸ナ ト リ ゥムを含有せずにモノ ク ローナル抗体を凍結 乾续した場合、 抗原結合活性は大き く滅少した。 これに対し て、 クェン酸ナ ト リ ウムを含有した場合、 凍結乾燥後におい ても抗原結合活性が良く 回収され、 その効果は含まれるクェ ン酸ナ 卜 リ ゥムの濃度に依存した。 〔表 3〕
Figure imgf000017_0001
実施例 4
クェン酸ナ ト リ ウムを ΙΟηΜから 200mMの擴度に含有し、 pH 6·1〜8·1に調整された 50mMリ ン酸緩衝液に、 実施例 1 で用い たモノク ローナル抗体を、 終濃度と して O.lmg/ιηβとなるよ う に溶解した。 この際、 溶液の塩濃度が 150mMに満たない場 合、 塩化ナ ト リ ウムを添加して 150mMと した。 このモノク ロ ーナル抗体溶液を、 ポリ プロ ピレン製ク ライオチューブに 0.5mfiずつ無菌的に分注し、 一 80 にて凍結し、 真空減圧下 凍結乾燥した。 凍結前と等量の注射用蒸留水を凍結乾燥物を 加えて溶解後、 抗原結合活性を測定した。
凍結前の活性を 10と した相対活性で、 結果を表 4 に示した , ΡΗ6·1〜8·1でクェン酸ナ 卜 リ ゥムを含有することによ リ、 凍 結乾燥後も抗原結合活性が良く 回収された。
〔表 4〕 抗 原 結 合 活 性
溶液の PH クェン酸ナ ト リ ウム濃度（mM)
10 50 100 200
6.1 10 10 10 10
7.0 9 10 10 10
8.1 Θ 10 10 一 実施例 5
実施例 1 で使用 したモ ノ ク ローナル抗体を終濃度と して 0.1mg/m£となる様に PBSに溶解した。 一方、 中性ゼラチンを 終濃度と して 0.003 %となる様に加え、 更にグルコース、 シ ユーク ロース、 マンニ トール、 グリシン、 あるいはアルギニ ンをそれぞれ終濃度と して 0.001から 0.1 %なる様に加え、 ポ リプロ ピレン製クライオチューブに 0.5ιηβずつ無菌的に分注 し、 一 にて凍結させた。 これを真空滅圧下凍結乾燥した , 凍結前と等容量の注射用蒸留水を凍結乾燥物に加えて溶解後， 抗原結合活性を測定した。
凍結乾燥前の活性を 10と した相対活性で， 結果を表 5 に示 した。 いずれの低分子物質においても抗体活性が良く 回収さ れ、 その効果は添加した低分子化合物の濃度に依存した。
〔表 5〕
ゼラチン 低分子物質 抗 原 結 合活性
濃度 (％) 濃度 (％) グルコ シユーク マンニ グリシン アルギ
ース ロース f ^一ル ニン
0.003 0.001 7 7 7 8 7
0.003 0.003 8 8 7 8 8
0.003 0.01 8 6 8 10 8
0.003 0.03 8 8 8 10 8
0.003 0.1 8 10 8 10 8
0.003 0 8 6 6 6 6 実施例 6
実施例 1で用いたモ ノ ク ローナル抗体を終濃度と して 0.1 nigZmfiとなる様に PBSに溶解した。 一方、 中性ゼラチンを終 濃度と して 0· 003 %となる様に加え、 更にマンニ トールを終 濃度と して 0.5あるいは 1 %となる様に加えた。 ポリ プロ ピ レン製クライオチューブに 0.5mfiずつ無菌的に分注し、 一 80 にて凍結させた。 これを真空滅圧下凍結乾燥した。 凍結前 と等容量の注射用蒸留水を凍結乾燥物に加えて溶解後、 抗原 結合活性を測定した。
凍結乾燥前の活性を 10と した相対活性で、 結果を表 6 に示 したが、 いずれのマンニ トール濃度においても抗原結合活性 が良く 回収された。
〔表 6〕
Figure imgf000019_0001
実施例 7
実施例 1で使用 したモ ノ ク ローナル抗体を、 1 eZmAの機 度となるよう に、 中性ゼラチン（0·01%)、 クェン酸ナ ト リ ウ ム（0.02Μ), マンニ トール（0.5%)及び塩化ナ ト リ ゥム（0.05Μ) を含む 0.1Mリ ン酸緩衝液（ΡΗ7.0) に溶解した。 このモ ノ ク ロ ーナル抗体溶液を、 lOmfi容量のガラス製バイアル （岩城ガラ ス社） に 丄 ιηβずつ無菌的に分注し、 一 80 にて凍結し、 真空 滅圧下凍結乾燥した。 凍結前と等容量の注射用蒸留水を凍結 乾燥物に加えて溶解後、 抗原結合活性を測定した。 その結果、 モノ ク ローナル抗体は、 凍結前の抗原結合活性を保持してい た。
実施例 8
実施例 1で用いたモノ ク ローナル抗体を、 l«gZ雇 ϋの濃度 となるように、 クェン酸ナ ト リ ウム （0.02Μ), 塩化ナ ト リ ウ ム（0.05Μ)、 マンニ トール（0.5%)を含む 0.1Mリ ン酸緩銜液 (ΡΗ7.0)に溶解した。 このモノク ローナル抗体溶液をガラス 製バイアルに分注し、 一 80 にて凍結後、 真空滅圧下凍結乾 燥した。 凍結前の等容量の注射用蒸留水を凍結乾燥物に加え て溶解後、 実施例 1 に従って抗原結合活性を測定した。 その 結果、 モノ ク ローナル抗体は、 凍結前の抗原結合活性を保持 していた。
実旌例 9
細胞融合法によ り作製し、 Α血清型緑瞜菌に対して反応性 を有するヒ ト Igfi を産生するヒ ト · ヒ トーハイブリ ドーマ MP 5121 (微ェ研条寄 2270号）を培養し、 その培養上清から実施例 丄 に従って、 モノク ローナル抗体を精製した。 このモノ ク ロ —ナル抗体を l mg/ Bfiの濃度となるよう に、 クェン酸ナ ト リ ゥム（0·02Μ)、 塩化ナ ト リ ウム（0·05Μ)、 マンニ トール（0·5%) を含む 0.1Mリン酸緩衝液（ΡΗ7.0)に溶解した。 このモ ノ ク ロ ーナル抗体溶液をガラス製バイアルに分注し、 一 80TCにて凍 結後、 真空滅圧下凍結乾燥した。 凍結前と等量の注射用蒸留 水を凍結乾燥物に加えて溶解後、 実施例 1 に従って抗原結合 活性を測定した。 なお、 抗原の LPSは、 A血清型緑臢菌（ATCC 27577)から抽出した。 その結果、 モノク ローナル抗体は、 凍 結前の抗原結合活性を保持していた。
実施例 10
細胞融合法によ り作製したヒ 卜 IgM 産生ヒ 卜 · ヒ トーハイ ブリ ドーマ MP 5097, MP 5139、 MP 5114及び MP 5156 (それぞ れ微ェ研条寄 2268号、 2272号、 2269号及び 2339号） の培養上 清からモノク ローナル抗体を精製した。 これらモノ ク ローナ ル抗体は緑膿菌との反応性を有し、 それぞれ、 B 、 E 、 G及 び I血清型菌に反応性を持っていた。 これら 4種のモノ ク ロ ーナル抗体と実施例 9で示したモノク ローナル抗体の合わせ て 5種類を、 それぞれ終濃度と して 5 mgZmJaの濃度となるよ う に、 クェン酸ナ ト リ ウム（0.02M)、 塩化ナ ト リ ウム（0.05M)、 マンニ トール（0·5 % )を含む 0· 1Mリ ン酸緩衝液（ΡΗ7·0)に溶 解した。 このモノク ローナル抗体溶液をガラス製バイアルに 分注し、 一 80 にて凍結後、 真空滅庄下凍結乾燥した。 凍結 前と等量の注射用蒸留水を加えて溶解後、 実施例 1 に従って 抗原結合活性を測定した。 なお、 それぞれの钪原は、 Α血清 型は ATCC 27577、 B血清型は ATCC 27578 , E血清型は ATCC 27581、 G血清型は ATCC 27584, 及び I血清型は ATCC 27586 から抽出した LPSを用いた。 その結果、 モ ノ ク ローナル抗体 は、 5種類の血清型緑膿菌 LPSそれぞれに対して、 凍結前の 抗原結合活性を保持していた。
発明の効果
本発明に示したゼラチンあるいはカルボン酸及びその塩の 添加にょ リ 、 凍結乾燥時の変性を抑え、 抗原結合活性を安 定に保持したモノ ク ローナル抗体凍結乾燥製剤の供給が可能 となった。 モノ ク ローナル抗体のグロブリ ンタイプは、 lgG、 IgH , IgA及び IgEのいずれの型にも適用可能であ り、 と りわ け安定性の乏しい IgMに対して十分適用できる。 モノ ク ロ一 ナル抗体は、 ヒ ト由来である場合もあ り、 マウスあるいはラ ッ 卜由来の場合でも本発明を適用できる。 また、 凍結乾燥製 剤中に含まれるモノクローナル抗体は一種の場合もあるが、 数種のモノ ク ローナル抗体を含む場合にも適用できる。
この発明のモノク ローナル抗体凍結乾燥製剤は、 免疫グロ ブリン製剤と同様に免疫補充療法剤と して、 細菌感染症、 ゥ ィルス感染症等に対する予防あるいは治療剤と して供耠可能 である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . モノ ク ローナル抗体及びゼラチンを含有するこ と を特徴 とする凍結乾燥製剤。
2 . モノ ク ロマナル抗体及びカルボン酸も し く はその塩を含 有する ΡΗ6·1〜8·1である溶液を凍結乾燥して調製した製剤
3 · カルボン酸がクェン酸である請求項 2記戦の製剤。
4 . 凍結乾燥前の溶液の ΡΗが 4.0〜8.1である請求項丄記載の 製剤。
5 . モノ ク ローナル抗体がヒ 卜由来である請求項 1 〜 4記載 のいずれか 1項に記載の製剤。
6 . モノク ローナル抗体のグロブリ ンタイプが IgM型である 請求項 1 〜 4記載のいずれか 1項に記載の製剤。
7 . ゼラチンが中性ゼラチンあるいは酸性ゼラチンである請 求項 1 あるいは請求項 4記戦の製剤。
8. 製剤が、 さ らにカルボン酸あるいはその塩も し く は無機 塩を含有する請求項 1 あるいは請求項 4記載の製剤。
9 . 製剤が、 さ らに単糖類、 二糖類、 糖アルコ、ールまたはァ ミ ノ酸のうち少なく とも 1種を含有する請求項 1 〜 4記载 のいずれか 1項に記載の製剤。
10. 製剤が、 複数のモノ ク ローナル抗体を含む請求項 1 〜 4 記載のいずれか 1項に記載の製剤。
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