JPS58167518A - ゼラチン誘導体添加静注用人免疫グロブリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素分解や化学修飾することなく、免疫グロ
ブリンに安定剤を添加することにより免疫グロブリン静
注用製剤を得る。方法に関わるものである。

人血漿より分画した免疫グロブリン（ＩｇＧ）製剤は、
各種重症感染症や、低ならびに無ガンマグロブリン血症
などの免疫不全症候群の治療に有効であるが、一般的な
血漿分画法である、コーン法により得られたＩｇＧは、
静脈内に直接投与すると、血圧低下、悪寒、発熱等のア
ナフィラキシ一様の重篤な副作用を生じせしめることが
あり、その使用は筋注のみに制限されている。しかし筋
注では、注射局所に痛みがあると、投与量に限界がある
こと、筋注局所で、蛋白分解作用を受けて失なわれるこ
と、投与部位よシ血管系の移行に１〜２日を要すること
等の問題がある。そこで、前述の副作用を持たない静注
用製剤が要請され、これまでに、ペプシン、プラスミン
等の酵素分解処理、酸性処理、β−プロピオラクトン、
Ｓ−スルホ化等の化学処理による静注用ＩｇＱ製剤が開
発、製造されてきた。しかし、酵素で分解する方法では
、得られるＩｇＧの抗体スペクトルが一部損失されてし
まうこと、その半減期が短かいこと等の問題があり、ま
た、化学修飾による方法では、化学修飾された分子上に
、新しい抗原決定基が出現することも懸念され、理想的
な静注用製剤とはいえない。

ところで、免疫グロブリン静注の際、アナフィラキシ一
様反応が生ずるのは、との製剤中に、分画精製過程で生
じた凝集１．　ｇ　Ｇが含まれており、それが、血漿中
の補体成分と結合し、活性化して、アナフィラトキシン
様物質や、血管透過性因子などの生物活性因子を遊離さ
せるためと考えられている。ＩｇＧの凝集体は、コーン
法の分画工程中、有機溶媒との接触、気液界面、固液界
面への露出、加温、および凍結乾燥等により生成される
が、これは、ゲル口過等の適当な方法を用いて除去する
ことができる。、しかし、ＩｇＧは、本来、不安定で、
容易に再凝集する。安定剤を添加することにより、この
再凝集を阻止することができれば、抗補体性が低く、か
つ修飾変性を受けていカい静注用製剤を得ることができ
る。このようにして得られる静注用ＩｇＧ製剤は、血漿
中に含まれるＩｇ（ｉと同等の血中半減期を有し、また
Ｆｃ部分を備えているため、食細胞表面リセプターと結
合し、食菌能を高めるなど、ＩｇＱが元来有する全ての
生物活性を発現し得ることが期待され、その点で、酵素
処理、化学処理製剤より有効性が高いと考えられる。

上記のような目的を達成し得るＩｇＧの安定化剤として
、アルブミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレング
リコールなどが有効であることは、既に、見い出されて
おり、これを根拠として、安定化剤として、ポリエチレ
ングリコールヲ添加した静注用製剤が既に開発され、市
販されている。

ところで、ＩｇＧの添加剤が具備すべき基本要件として
、それが、ＩｇＧ分子の凝集を抑制する作用をもつこと
局外に、生体内に投与した時の副作用がないこと、代謝
・排泄されやすいこと、抗原性がないこと等は重要であ
ろう。とくに、重篤な免疫不全症候群のように、頻回に
ＩｇＧｇ剤を投与しなければならない場合など、添加物
による副作用を極力抑制することが肝要となる。それゆ
え既に実用に供せられているポリエチレングリコールに
替る、より安全で、かつ効果的な安定剤の開発は、Ｉｇ
Ｑ製剤の臨床応用をより容易にするために、必要欠くべ
からざるものと言える。

本発明者らは、上記背景に基づき、前述した添加剤とし
ての要件を満足し、かつ既に実用に供せられているポリ
エチレングリコールよりも安全な添加剤を見い出すべく
、鋭意研究の結果、ゼラチン誘導体が、これら諸条件を
満足することを見い出したのである。すなわち、本発明
は、凝集体を含まない人免疫グロブリンを製造する方法
を提供するものである。

以下、ゼラチン誘導体の添加剤としての安全性およびそ
の効果について詳細に述べる。

そもそも、本発明において添加剤として見い出されたゼ
ラチン誘導体は、本来、代用血漿とじて開発されたもの
であり、代用血漿としてのゼラチンの不適当な性質、す
なわち３０℃でゲル化すること、および若干の抗原性を
有することを、その化学修飾により改善したものである
。これには、１９５１年、Ｃａｍｂｅｌｌらが、セラチ
ンヲクリオキザールにより縮合し、過酸化水素により酸
化することによって得たオキシポリゼラチン（たとえば
商品名：ゲリフンドール・ビオテスト）、１９５２年、
Ｔｏｕｒｔｅｌｏｔｔｅが、ゼラチンを分解後、無水コ
ハク酸により、サクシニル化することによ−って得た変
性液状ゼラチン（たとえば商品名：ブラスマゲル・ロガ
ー・ベロン、プラスマゲルーＫ・ブラウン、フィジオゲ
ルあるいはゲラフシン）、さらに１９６０年、Ｓｃｈｍ
ｉｄ　ｔ−Ｔｈｏｍｅらが、ゼラチンを分解後、ジイソ
シアナートにより尿素橋を形成することによって得たゼ
ラチン誘導体（たとえば商品名：ヘマセル）の三種があ
る。これらのゼラチン誘導体は、いずれも耐薬性がすぐ
れており、１００ｇ以上投与しても、非耐薬件の徴候（
硬直、体温上昇、奪麻疹）は認められず、大部分は腎か
ら排泄され、残った一部は、生体内の蛋　　′白質分解
酵素によって分解されることが明らかになっている。！
た、血液凝固障害や抗原性発現による副作用がないこと
も確認されている。このような諸性質は、ゼラチン誘導
体が静注用製剤のための添加剤として、安全性の観点か
らは、充分満足すべきものであることを示している。

一方、ゼラチン誘導体の添加は、ＩｇＧの凝集を抑制す
る効果、換言すれば、Ｉｇ（Ｊを安定化する効果をも有
する。

任意の方法によって得られたＩｇＱの単量体成分が、気
液、固液界面との接触により、凝集反応を惹起し、その
抗補体活性が著しく増加することはよく知られた事実で
ある。第１図に示すように、各種添加剤をＩｇＱ溶液に
添加し、振盪して界面変性を誘起した場合、グリシン、
ショ糖の添加では、さらに凝集を促進するのに対し、ヘ
マセル、ゲラフシン等のゼラチン誘導体を添加すると、
凝集体の生成（図中では濁度で評価）が抑制される。

また、同時に、抗補体活性の増加も顕著に抑制される。

これらの傾向は、アルブミンあるいはポリエチレングリ
コールを添加した場合と同様である。

このような添加効果は、ＩｇＱの溶液濃度にも依存する
が、ゼラチン誘導体の濃度が１０　ないしｌＯ“係の範
囲内で顕著に現われ、またその効果は添加濃度が高い程
著しい。ＩｇＱの界面変性を防止するためには、５１１
ｇＧの場合、好ましくは１０−２ないし１０１係のゼラ
チン誘導体濃度が必要である。

また、ＩｇＧは、熱的にも変性し、凝集体の生成、およ
びその抗補体作用の増加を認めるが、この反応に際し、
ＩｇＱに、上記ゼラチン誘導体を添加することにより、
それらの増加は、顕著に抑制されることも見い出される
。このような添加効果は、添加量が高い程著しいが、と
くに、ゼラチン誘導体の添加量が、ＩｇＧ重量の１ない
し２００係の範囲内で顕著である。この熱変性抑制作用
は、既存のポリエチレングリコールでは認められない特
異な効果である。このように、ゼラチン誘導体が、Ｉｇ
Ｑの界面変性、熱変性を抑制する作用を有することは、
この誘導体を添加したＩｇＧ液状裂剤製剤安定性を有し
、副作用のない静注用製剤となり得ることを示している
。

また、これらの添加剤がＩｇＧの凍結乾燥に伴なう変性
に対して抑制作用をもつことも明確である。すなわち、
第２図に示したようにＩｇＧは疎開される。この効果は
、一般に蛋白質の凍結乾簗の際に、安定剤として用いら
れる糖類、アミノ酸類をはるかに上回ることが示されて
いる。このように、ゼラチン誘導体がＩｇＧの界面変性
、熱変性のみでなく、凍結乾燥に伴なう変性をも抑制し
得ることはゼラチン誘導体を添加した後、Ｉ’ｇＧを凍
結乾燥することにより、乾燥静注用製剤を製造し得るこ
とを示す事実と言える。この製剤を臨床的に使用する際
には、水に溶解することが必要であるが、このときには
、前述したゼラチン誘導体の界面変性、および熱変性抑
制作用が副作用の発現抑止に有効であろうことは、再度
、論するまでもないことであろう。

次に、ゼラチン誘導体添加静注用ＩｇＧ製剤の具体的製
造法について記す。前述したように、靜Ｙｌ用製剤とし
ては、液状製剤、乾燥製剤の二種を製造することができ
るが、いずれの製剤を製造するかにより、製造工程の一
部を変更する必要かある。

以下、それぞれ別記する。

（１１液状製剤の製造法 原料としては、人血漿から任意の方法で分画したＩｇＧ
画分を用いる。この両分に、ＩｇＧ凝集体が含まれてい
る場合、これを除去する。

含１れている凝集体が不溶性のもののみの場合は、遠心
分離、あるいは、０．０５ないし２．０μｍの孔径をも
つメンブランフィルタ−で、口過スることにより、凝集
体を除去する。また、この□ 両分に、上記操作で完全に除去しきれない、微細な凝集
体が含まれている場合は、ゲル口過法、分別沈殿法、吸
着クロマトグラフィー法あるいは膜分離法等の適当な方
法でこれを分別除去する。ただし、ＩｇＧ凝集体を生ず
ることのない適当な方法で分画されたＩｇＧを原料にす
る場合、この凝集体除去工程は省略することができる。

ここで、得られたＩｇＧ画分の溶液濃度が、目的とする
液状製剤濃度より低い場合、および、生体内に輸注され
ることが不適当な低分子物質を含む場合は、限外口過に
よる濃縮および低分子除去をすることが必要である。こ
こで用いられる限外口過膜は、低分子物質を透過し、か
つＩｇＧの透過を効率的に阻止し得るものならば、特に
、限定されるべきものでなく、好ましくは分画分子量１
万ないし１０万の膜である。また、このとき用いられる
限外口過用溶媒は、とくに限定される必要はなく、その
後の操作の簡易性を考慮すれば、好ましくは生理食塩水
である。

ただし、この工程で、不溶性凝集体が生成する場合があ
り、このときは、適当な孔径のメンブランフィルタ−を
用いて、これを除去する。用いるメンブランフィルタ−
の孔径は、でき得る限り、小さい方が凝集体の除去率は
高く、好ましくは、０．０５ないし０．２μｍである。

上記のようにして得られた、凝集体を含まないＩｇＱ画
分に、ゼラチン誘導体を添加する。

添加すべき、ゼラチン誘導体量は、目的とする液状製剤
のＩｇＱ濃度によって異なり、当該濃度におけるＩｇＱ
の界面変性を完全に抑止し得る添加量を選択すべきであ
る。５係液状製剤の導体添加が好ましい。一般に、市販
のゼラチン誘導体は、３．５ないし４０重量係の溶液に
調整されており、このまま添加することができる。

とくに、高い添加量を必要とする場合には、市販品を事
前に凍結乾燥して固体粉末とし、これを添加するか、あ
るいは、限外口過等により濃縮後、添加すればよい。市
販ゼラチン誘導体に無機塩類が含まれている場合、何ら
かの事由により、必要であれば透析等の操作により、こ
れらを除去したのち、添加しても、これら誘導体の変性
抑止効果には影響しない。また、逆に、■）１１調節、
浸透圧調節等の事由により、必要であれば、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム等の無機アルカリ類、塩酸、リ
ン酸等の無機酸類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化力ルンウム等の無機塩類を、また、相剰的な変性抑止
効果を期待する場合等、何らかの事由により必要あれば
人血清アルブミン、各種アミノ酸類、各種糖類を補助的
に添加することができる。また、ゼラチン誘導体の添加
は、とぐに原料ＩｇＱの濃縮操作後に限定されるべきも
のでなく、希薄濃度のＩｇＧ原料溶液に、所定量を添加
しその後、目的の液状製剤濃度まで濃縮する手法を用い
てもよい。ただし、この除用いるべき、濃縮用限外口過
膜は、ゼラチン誘導体の透過を阻止し得る分画能を有す
る必要があり、分画分子量１万以下の膜が好ましい。こ
のように、ゼラチン誘導体を添加した後、濃縮操作を行
なう際には、ゼラチン誘導体の存在によりＩｇＱの非特
異的凝集が抑止されるため、本操作中でのＩｇＱの損失
を最小限に抑えることができ望ましいものである。

以上のような操作により、目的とする濃度の液状静注用
ＩｇＧ製剤を得ることができる。

（１１）乾燥製剤の製造法 上記ＣＩ＋の液状製剤の製造法と同様にして、凝集体を
含まないＩｇＱ画分を得る。液状製剤の場合と異なり、
乾燥製剤を目的とするときには、ここで得られるＩｇＱ
画分の濃度が極端に低くとも、その後の操作上、支障・
をもたらさないが、不適当な低分子物質を相対的に多ぐ
含む場合には、これを除去する必要がある。しかし、本
操作段階で低分子物質を完全に除去することは、ＩｇＱ
分子の安定性を著しく損い、変性、凝集を惹起させる恐
れがある。したがって、その低分子物質を相対的に減少
もしくは除去する目的で濃縮および透析を兼ねた限外口
過操作を行なうことが望ましい。ここで用いる限外口過
膜は上記（１１の液状製剤の製造法に記載した限外口過
膜に準じてよい。ここで用いられる溶媒は、とぐに限定
されないが、好ましくは生理食塩水である。また、この
操作中に生じた凝集体の除去は、上記、液状製剤の場合
と同様にして行なえばよい。

上記のようにして得られた凝集体を含まないＩｇＱ画分
に、ゼラチン誘導体を添加する。ゼラチン誘導体の添加
量は、任意に選択することができるが、次に行なわれる
凍結乾燥工程での凝集を効果的に抑制するためにはＩｇ
Ｑに対して０．１ないし２００重量係、好１しくは、１
０ないし１２０重量優である。このとき、上記（ＩＩの
液状製剤の製造法の場合と同様に、必要があれば無機ア
ルカリ類、無機酸類、無機塩類、アミノ酸類、糖類、人
血清アルブミンを同様に添加することができる。１だ、
ゼラチン誘導体の添加が、原′ＩＪｒ１ｇＧの濃縮・透
析工程後に限定される必要がないことも、液状製剤製造
の場合と同様である。

以上のような操作後、常法に従い、凍結乾燥すれば乾燥
静注用製剤を得ることができる。

以下、本発明の実施例を示す。

実施例１゜ コーン法により製造した市販筋注用人ＩｇＱ溶液から、
生理食塩水を溶出液とした七フアクリルＳ−２００ゲル
によるゲル口過を行ない、凝集体を含まないＩｇＱ画分
を得る。これを、分画分子量１万の限外口過膜を用い、
回分濃縮法により、ＩｇＧ溶液を１０％まで濃縮する。

その後、孔径０．１μ乳のメンブランフィルタ−にて、
不溶性凝集体を除去し、市販の３，５重量係ゼラチン誘
導体溶液（商品名：ヘマセル）を所定量、添加する。次
に、ＩｇＱ濃度が５％になるように注射用蒸留水を添加
希釈し、必要であれば、０．１μｍｌＪつメンブランフ
ィルタ−により、再度口過して、最終製品を得る。ゼラ
チン誘導体の最終濃度は１％である。本製品の抗補体活
性は１６単位であり、副作用の発現しない安全値として
、生物学的製剤基準に定められた値、２０単位を下回り
、まだ、凝集体の存在も認められなかった。

実施例２゜ コーン法における分画■のＩｇＧ沈殿を生理食塩水に溶
解し、分画分子量１万の限外口過膜を用いて、回分法に
より脱アルコールする。これが、凝集体を含まなければ
、そのまま限外口過することにより、また、凝集体を含
むときは実施例１の場合と同様にして凝集体を除去した
後、分画分子量１万の膜を用いて、限外口過することに
より、１０係まで濃縮する。このＩｇＧ原料を０．１μ
ｍの孔径を有するメンブランフィルタ−で口過した後、
あらかじめ、脱塩、凍結乾燥したゼラチン誘導体（商品
名ニゲラフシン）粉末をＩｇＧに対して５０重量係、ま
た、グリシンを４５重量係添加する。これを生理食塩水
で希釈して、ＩｇＧの最終濃度５係、ゼラチン誘導体２
．５％、グリシン２．２５％、塩化ナトリウム０．９係
の製品を得た。本製品は、４℃および室温条件下で、長
期間安定で、凝集体の生成も認められなかった。また、
Ｉｇ（Ｂ単独溶液では界面変性に伴なう凝集が生起する
条件下で、強制約に振盪しても、凝集は生起せず、抗補
体活性も１８±１単位で変化しなかった。液状静注用Ｉ
ｇＧｇ剤として適格な性状であった。

実施例３゜ 実施例１．と同様にして凝集体を含まないＩｇＱ原料を
得る。これに、あらかじめ脱塩、凍結乾燥したゼラチン
誘導体（商品名：へマセル）をＩｇＧに対して、２０重
量係、人血清アルブミンを１０重重量部加し、分画分子
量３，０００の膜を用いて限外口過濃縮し、■ｇＧ濃度
５％とする。本実施例の場合、凝集体をほとんど生成さ
れないため必ずしも必要ではないが、０．１μｍの孔径
を有するメンブランフィルタ−によす、凝集体を完全に
除去する。こうして、得られた最終製品は、その抗補体
活性が１６単位であり、実施例２．で得られた製品と同
様、液状静注用製剤として優れた安定性を示した。

実施例４ コーン法により製造した市販筋注用人ＩｇＱ溶液から、
生理食塩水を溶出液としたセフ７クリルＳ−３００ゲル
によるゲル口過を行ない、凝集体を含まないＩｇＧ画分
を得る。これを分画分子量１万の限外口過膜を用い、１
０係のＩｇＱ濃度になるように濃縮する。このＩｇＱ原
料を０．１ｐｍの孔径を有するメングラ／フィルターで
口過した後、あらかじめ、脱塩、凍結乾燥したゼラチン
誘導体（商品名：へマセル）粉末を、ＩｇＧに対して４
０重重量部加する。これを生理食塩水により希釈し、■
ｇＧ濃度５係とする。

最終的に、これを常法に従がって凍結乾燥する。

得られた凍結乾燥品を蒸留水に溶解し、抗補体活性を測
定すると、１５単位であり、生物学的製剤基進に定めら
れた値を充分満足する。また凝集体の存在も認められな
かった。

実施例５゜ 実施例２．に記載された操作法に準じて、凝集体除去、
さらに１０係まで限外口過濃縮されたＩｇＧ溶液を０．
０５μ仇の孔径を有するメンブランフィルタ−で口過す
る。一方、市販の４ｑｂゼラチン誘導体（商品名ニゲラ
フシン）を透析により脱塩後、分画分子量３，０００の
限外口過膜により、１０％まで濃縮する。この１０％ゼ
ラチン誘導体液、およびグリシンを上記１０％ＩｇＧ生
理食塩水溶液に、それぞれ所定量添加しＩｇＧ濃度５％
まで生理食塩水で希釈する。これを常法に従い、凍結乾
燥する。木製品中のゲラフシン誘導体、グリシン、塩化
ナトリウムの含有量は、ＩｇＧに対してそれぞれ３０．
４５．９重量係である。この水溶液の抗補体活性は、１
６±１単位であり、凝集体の存在も認められなかった。

実施例６、 実施例５．と全く同様の操作により、ゼラチン誘導体、
グリシン、塩化ナトリウムおよび人血清アルブミンをそ
れぞれ、ＩｇＧに対して、２゜３０．９および５重量係
合む、凍結乾燥品を得る。

木製品の水溶液の抗補体活性は１４単位であり凝集体の
存在も認められなかった。また、過酷な条件（５７°Ｃ
で４時間）で加温してもゲル化せず、乾深靜主用壊剤と
して適合する製品であ１．た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩｇＧの界面変性に及ぼす、種々の添加物の
抑制効果を示した図である。１係のＩｇＱ生理食塩水溶
液に、最終濃度０．５％の種々の添加物を添加し、同一
形状の容器に入れ、強制的に振盪して界面変性を誘起さ
せた場合の抗補体活性および濁度（６５０ｎｍ）の測定
結果である。 第２図は、ＩｇＧの凍結乾燥に伴なう変性に及ぼす種々
の添加物の抑制効果を示した図である。 ５係のＩｇＱ生理食塩水溶液にそれぞれＩｇＧに対して
３０重量係の種々の添加物を添加し、凍結乾燥する。そ
の凍結乾燥品を蒸留水に溶解後、抗補体活性および濁度
を測定した結果である。 手続補正占（方式） 昭和５７年７月９日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 メ へ小件の表示　　　　　昭和５７年　特許願Ｗａｌ１９
０３６号２、発明の名称　　　　　ゼラチン誘導体添加
静注用人免疫グロブリンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所（居ｆｒ）　　　　東京都憑区芝大門／丁目／番３
号住所（麿所） 氏名（名称） ３、ＬＨ正命令の日付　　　昭和５７年６り／７日６、
補正の対象　　　　　図而

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）人血漿よシ分画した、凝集体を含まない免疫グロ
   ブリンに、ゼラチン誘導体を安定剤として添加すること
   を特徴とした静注用人免疫グロブリンの製造法。
2. （２）ゼラチン誘導体を添加すべき免疫グロブリンが、
   囚任意の方法によって分画した、凝集体を含む免疫グロ
   ブリンから、ゲル口過法、膜分離法、吸着クロマトグラ
   フィー法、分別沈殿法等の任意の方法で凝集体を除去し
   た両分、あるいは、（Ｂ）免疫グロブリン凝集体を生ず
   ることのない、適当々方法で、人血漿より分画された免
   疫グロブリン画分、である特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。
3. （３）　　安定剤として添加するゼラチン誘導体が、（
   〜ゼラチンを分解後、無水コノ１り酸により、サクシニ
   ル化したもの、すなわち変性液状ゼラチン（ＭＦＧ）（
   たとえば、商品名：ゲラフシ／等）、（Ｂｌゼラチンを
   分解後、ジイソシアナートによシ、尿素橋を形成したも
   の（たとえば、商品名：ヘマセル等）、あるいは（Ｑゼ
   ラチンをグリオキザールにより縮合し、過酸化水素によ
   シ酸化したもの、すなわちオキシポリゼラチン（ＯＰＧ
   ）（たとえば、商品名：ゲリフンドール等）である特許
   請求の範囲第１項ないし第２項記載の製造法。
4. （４）ゼラチン誘導体を添加する方法が、（八本誘導体
   を単独で添加する方法、および（Ｂ）アミノ酸類、糖類
   、人血清アルブミン等の免疫グロブリン安定剤、あるい
   は、無機塩類等の等張化剤を、補助的に、同時に添加す
   る方法である特許請求の範囲第１項ないし第３項記載の
   製造法。