JPS6160049B2

JPS6160049B2 -

Info

Publication number: JPS6160049B2
Application number: JP58011317A
Authority: JP
Inventors: Satoru Funakoshi; Kazuo Morimoto; Morio Kuboyama; Nobuya Yanagiuchi; Muneo Yamada; Hajime Yokota
Original assignee: Morinaga Nyugyo KK
Current assignee: Morinaga Nyugyo KK
Priority date: 1983-01-28
Filing date: 1983-01-28
Publication date: 1986-12-19
Also published as: DE3402647C2; GB2134528A; AU2280683A; FR2540121B1; US4482485A; JPS59137417A; AU545411B2; CA1200489A; DE3402647A1; FR2540121A1; GB8334220D0; GB2134528B

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、人尿由来コロニー形成刺激因子
（colony stimulating factor.以下CSFと略記す
る）及びカリクレインの製造法に関する。更に詳しくは、生理活性物質であるところの
CSF及びカリクレインを健康人の尿又はCSFと
カリクレインとを含有する溶液（以下人尿等と記
載する）から高い回収率で分離精製し、医薬品と
して使用し得るカリクレイン不含のCSF及びカ
リクレインを同時に製造する方法に関するもので
ある。〔技術の背景及び先行技術〕 CSF及びカリクレインは人尿中に極めて微量
に存在する高分子の生理活性物質である。CSF
は、マウス及び人の骨髄中の顆粒球系前駆細胞に
作用して白血球構成細胞であるところの顆粒球及
び単球−マクロフアージの分化・増殖を促進する
糖蛋白質である（Ｋ・Motoyoshi，etal.，
Blood，52巻、1012頁〜1020頁、1978年；S.K.
Das，etal.，Blood，58巻、630〜641頁、1981
年）。また、人の骨髄貪食細胞による生体内CSF
の産生をも刺激する作用を有しており、制癌剤及
びＸ線照射等の治療により、著しい白血球減少症
に陥つた癌患者へ投与すると、顆粒球を主体とす
る白血球数の回復増加を促進することが知られて
いる（K.Motoyoshi，etal.，Japanese Journal
of Medicine，21巻、187頁〜191頁、1982年）。一方、カリクレインは哺乳動物血漿中のキニノ
ージエンからの生理活性ペプタイトであるキニン
類の生成及び血液凝固系に関与する一種の蛋白分
解酵素である。カリクレインが生成するキニン類
は、末稍血管拡張作用、血管透過性の亢進等の生
理作用を有し、カリクレインはこれらの作用を調
節する機能を果している。現在、動物膵臓から抽
出されたカリクレイン製剤が、末稍循環改善剤等
として市販されている。人尿由来のカリクレイン
は、これら動物由来カリクレインと同等の生理作
用を有しており、人由来であることから、異種蛋
白質に起因する副作用、例えばアレンギー性シヨ
ツク反応等を起こし難く、反復投与が可能である
ので、医薬としての価値は、むしろ動物由来カリ
クレイン製剤よりも高い。一方、医薬品として人尿からCSFとカリクレ
インとを分別して医薬品を製造する場合、一方の
製剤中に他方の物質が混入していることは医薬品
の品質及び安全性の点から望ましいことではな
い。特に顆粒球減少症治療剤としてのCSFは、
静脈内適用が効果的であり、従つてカリクレイン
の混入は絶対に許容し得ない問題である。なぜな
らばカリクレインは、たとえ微量であつても、静
脈内へ投与すると、その末稍血管拡張作用により
著しい血圧降下作用を発揮するので、CSFの投
与量に応じて、大量のカリクレインが静脈内へ導
入された場合、急激な血圧降下によるシヨツク状
態を患者に惹起せしめる可能性があるからであ
る。人尿由来のCSFもカリクレインもともに、前
記のように医薬品としての価値が極めて高く、従
つてこれらを人尿等から有効に回収し、かつ完全
に分離された状態で製造することは、安全性が高
く、安価な医薬品として提供する目的の上で、極
めて有益なことである。しかしながら従来人尿等
からCSF及びカリクレインの両者を効果的に分
別取得する方法に関する知見は極めて少なかつ
た。その理由は、CSFとカリクレインとがその
生理作用及び起源を必ずしも共通にしているわけ
ではないにもかかわらず、極めて類似した性質を
有しているからである。例えば、CSFもカリク
レインも糖鎖を結合した蛋白質であり、その等電
点は両者ともPH3.0〜4.5の酸性側領域にあり、電
気的性状の差違を利用してこれらを分別すること
は固難であつた。更に、人尿中に存在する場合、
CSFの分子量は60000〜100000ダルトンであり、
一方カリクレインのそれは50000〜80000ダルトン
であるから、両者は極めて接近た分子量を示して
いる。従来、人尿からCSFやカリクレインを分離・
精製する方法は、その他の生理活性物質と同様
に、それぞれ個々の物質を対象として研究がなさ
れてきており、これらの方法をCSFとカリクレ
インの効果的な同時精製へ応用することは不可能
であつた。従つて、カリクレイン非含有のCSF
を精製する場合には、カリクレインの回収率は著
しく損なわれ、他方、カリクレインの分別を目的
とした場合には、CSFの回収は不可能であつ
た。人尿からCSFとカリクレインとを高い回収
率でかつ完全に分離された状態で同時に精製する
方法に関しては、既に本発明者らが親和体クロマ
トグラフイー及びイオン交換体クロマトグラフイ
ーによる方法を発明し、特許出願した（特願昭55
−133262号。以下先願の方法と記載する）。しかしながら先願の方法の理想的方法とは必ず
しもいえない面があり、例えば、親和性クロマト
グラフイーは分離特性の点で極めて優れている反
面、処理量当りの設備、担体のコストが高価であ
り、また、イオン交換体では、経済性の面ですこ
ぶる有利ではあるが、作業性に短所があり、特に
精密分画を目的とする濃度勾配溶出法にあつて
は、細心の注意と長時間を要する緩徐な処理が必
要であつた。CSFとカリクレインを同時に分離
精製する第３の方法としては、分子量により分別
するゲル過クロマトグラフイーがある。しかし
従来広く利用されている多糖体或いは各種プラス
チツクスを主成分とした軟性ゲル担体では、人尿
中に存在するCSFとカリクレインの分子量が極
めて近接しているために、これらを完全に分離す
ることは不可能であつた。高速液体クロマトグラフイーは、近年、広く有
機化合物の分離・同定を目的とした各種クロマト
グラフイーを更に発展向上させるために開発され
て来た技術であり、その特徴は、高圧高速下に各
種化合物を極めて高精度に、かつ短時間でクロマ
トグラフイー分画を可能ならしめることにある。
特に、ゲル過クロマトグラフイーの分野にあつ
ては、従来の軟質ゲル担体に代わり、耐圧性の優
れた微粒子ゲル過担体の開発に伴つて、高分子
物質の分子量による分別を飛躍的に改善し得る方
法を提供することになつた。本発明者らは、この高速液体クロマトグラフイ
ーによるゲル過の高い分別特性に着目し、人尿
由来のCSFとカリクレインとの同時精製法を行
なつた。そしてシリカゲルを主成分とする耐圧性
ゲル過担体による高速液体クロマトグラフイー
では、CSFとカリクレインとが極めて良好に分
離されることを見い出した。しかし、高速液体ク
ロマトグラフイー用の市販の担体は、CSF及び
カリクレインの非特異的吸着現象を起し、CSF
とカリクレインの１部が担体上に残留した。この
ゲル過担体への非特異的吸着現象は、市販の担
体一般について認められた現象であつたが、これ
はクロマト液相のイオン強度を高めることにより
防止することが可能であつた。しかし、液相のイ
オン強度を高めると、今度はCSFの生理学的活
性（以下単に活性と略記する）は、逆に不安定に
なり、回収活性量の低下という事態を招いた。本発明者らは、担体への非特異的吸着がなく、
かつCSF活性の低下を防止して、効果的にCSF
とカリクレインとを分離・精製せしめる高速液体
ゲル過クロマトグラフイーの条件について更に
検討を重ねたところ、CSF活性安定剤として知
られるポリエチレングリコール又はオクチル−フ
エノキシポリエトキシエタノール（以下OPPEと
略記する）が、この目的に合致することを見い出
し、その結果、本発明を完成するに至つたのであ
る。〔発明の目的及び発明の開示〕本発明の目的は人尿等からCSFとカリクレイ
ンとを同時に、完全にしかも高い回収率で分別
し、製造する方法を提供することにある。本発明の他の目的は人尿等から分別したカリク
レインを含まないCSF及びCSFを含まないカリ
クレインを提供することにある。本発明は、人尿等を濃縮し、安定剤を含有する
緩衝液と該濃縮液を平衡させ、分子量排除限界が
球状蛋白質で測定した時10⁵〜５×10⁵ダルトンの
分子篩効果を有する担体を充填し、かつ予め該緩
衝液を通液したカラムへ注入し、高速液体ゲル
過クロマトグラフイーを行ない、CSFとカリク
レインとを分離し、のちそれらを個別に回収する
ことを特徴とするCSFとカリクレインの製造法
に関する。〔発明の具体的な説明〕人尿等を、酸又はアルカリ溶液でPH６〜８に調
整し、適当な公知の蛋白質濃縮法、例えばシリカ
ゲル等の無機物吸着体又はイオン交換体などの吸
着法、硫安等の中性塩を用いた塩析法、限外過
法或いはこれらの組み合わせによる濃縮法によつ
て濃縮する。濃縮された人尿等の蛋白質含量は10
％（Ｗ／Ｖ）以下が望ましい。本発明を更に有利に実施するためには、この濃
縮工程で、CSF及びカリクレインの回収率を損
わない範囲で、狭雑高分子物質を可能な限り除去
する公知の方法を用いても良い。該濃縮液を、イ
オン強度が0.05以上0.5未満、好ましくは0.1〜0.3
であり、PHが6.0〜8.0である緩衝液、例えばリン
酸ナトリウム緩衝液等と平衡させ、更に安定剤と
して分子量1000〜10000のポリエチレングリコー
ル又はOPPE、例えばTriton Ｘ−100（商品名。
ローム＆ハース社製）、を0.01〜0.1％（Ｗ／Ｖ）
の濃度で加える。次に、球状蛋白質により測定し
た時に、分子量排除限界が10⁵〜５×10⁵ダルトン
の分子篩効果を有する高速液体クロマトグラフイ
ー用ゲル過担体、例えば市販のTSK−
Gel3000SW（東洋ソーダ社製）、ZORBAX PSM
−1000（商品名。デユポン社製）、Shim−pack
HSG−40（商品名。島津製作所製）等を充填
し、そして安定剤を加えた上記緩衝液を予め通液
して平衡化したカラムへ該濃縮液を注入し、流速
１〜５ml・cm^-2・min^-1で該緩衝液を高圧ポンプ
により前記カラムに通液し、高速ゲル過クロマ
トグラフイーを行う。緩衝液の通液圧力は、カラ
ムの半径によつて変動するが、通常半径５mmで10
Kg／cm²以上が望ましい。前記の操作によりCSFは分子量85000ダルトン
の単一ピークとして、またカリクレインは分子量
60000ダルトンのピークとしてカラムから溶出さ
れるので、それぞれ個別に回収する。次いで得ら
れたCSF及びカリクレインを、それぞれ必要に
応じて透析、脱塩処理し、医薬として許容し得る
PH調整塩、溶解補助剤又は賦形剤を添加して無菌
過充填又は無菌凍結乾燥等の処理を行ない、医
薬品を製造する。前記のようにして分別された
CSF及びカリクレインを更に公知の方法で個別
に精製することもできる。以上のようにしてCSF及びカリクレインが同
時に製造される。次に試験例及び実施例により更に具体的に本発
明の方法を説明する。試験１従来法と本発明によるゲル過クロマトグラフ
イーの比較試験実施例１と同一の方法により調整した人尿の濃
縮液を従来法のゲル過用担体としてSephacryl
Ｓ−300（フアルマシア社製）及び本発明の方法
の高速液体クロマトグラフイー用担体とてTSK
−Gel3000SW（東洋曹達製）を用いてゲル過
クロマトグラフイーを行ない、その分離特性を比
較した。Sephacryl Ｓ−300カラム（φ20×1200
mm）には該濃縮液1.4ml、TSK−Gel3000SWカラ
ム（φ7.5×1200mm）には0.2mlを注入し、前者は
ペリスタポンプで５ml／cm²／hrの流速で、後者は
高圧送液ポンプLC−3A（島津製作所）を用いて
2.0ml／cm²／minの流速で実施例１と同一の緩衝
液を通液し、クロマトグラフイーを行なつた。１
分画５ml（前者）及び２ml（後者）ずつを分取
し、CSF及びカリクレイン活性を次の方法によ
り測定して試験した。CSF活性は、C₅₇BL／6N
マウス骨髄細胞を用いる単層軟寒天平板状による
コロニー形成法で測定した。即ち、各分画試料を
２％（Ｖ／Ｖ）牛血清を含有する蒸留水で適宜希
釈して過除菌（0.45μフイルター）した後、３
枚のシヤーレへ0.1mlずつ分注し、これに0.3％
（Ｗ／Ｖ）寒天、20％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清及び
C₅₇BL／6Nマウス骨髄細胞１×10⁵個を含有する
McCoy′s5A培地１mlを加えて十分混和した後、
37℃、7.5％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガス通気下のフラン
器で７日間培食した。培養後、顕微鏡視野下で50
個以上の細胞から成る集塊をコロニーとして、形
成されたコロニー数を計測し、形成されたコロニ
ー数（単位）でCSF活性を表わした。１単位は
１形成コロニーとして、得られたCSF標品の純
度を、標品の蛋白質１mg当りのコロニー形成数を
示す比活性で表わした。カリクレイン活性は、カリクレインの合成基質
であるＨ−Ｄ−Val−Leu−Arg−パラニトロアニ
リン（以下ペプチド−PNAと略記する）を用い
る酵素化学的方法で測定した。すなわち、試料
0.1mlを0.2Mトリス−塩酸緩衝液PH8.0、２mlへ加
え、37℃、５分間プレインキユベートした後、
0.2mMペプチド−PNA溶液0.2mlを加え、37℃で
30分間反応させ、50％（Ｗ／Ｖ）酢酸溶液0.2ml
で反応を停止させた後、405nmの波長で遊離PNA
量を測定した。カリクレインの阻害剤アプロチニ
ンを含むものを対照として、37℃で１分間に生成
されるPNA量でカリクレイン活性を表わした。
すなわち、１分間に生成されるPNA1μmoleを
1PNA単位とした。従来法及び本発明の方法による高速液体クロマ
トグラフイーの分離パターンは、それぞれ図１及
び図２に示すとおりであつた。図１及び図２はそれぞれ従来法及び本発明の方
法によるCSFとカリクレインの分別状況を示
し、両図において左縦軸はCSF活性と280nmにお
ける光学密度とを、右縦軸はカリクレイン活性
を、横軸は分画番号を、−は光学密度を、〓は
CSF活性を、そして〓はカリクレイン活性をそ
れぞれ示す。従来法によるSephacryl Ｓ−300ゲル過クロ
マトグラフイーでは、CSFとカリクレインと完
全に分別されず、カリクレイン不含のCSF分画
の回収率は30％以下であつた。これに対して、本
発明の方法による高速液体クロマトグラフイーで
は、CSFとカリクレインとがほぼ完全に分別さ
れており、カリクレイン不含のCSFの回収率は
90％以上であり、カリクレインは実質的に混入し
ていなかつた。これらの両方法によるCSFとカ
リクレインの回収率及びCSF中のカリクレイン
混入量を測定した結果は表１に示すとおりであ
る。

【表】＊この方法の検出限界以下であることを意味
する。
試験２各種緩衝液イオン強度と安定剤濃度による回収
率の比較高速液体クロマトグラフイー用ゲル過担体へ
のCSF及びカリクレインの吸着現象と緩衝液の
イオン強度及び安定剤の添加濃度を検討するため
に異なつた条件下で高速液体クロマトグラフイー
を実施し、試験１と同一の方法でCSF及びカリ
クレイン活性を測定し、回収率を比較して試験し
た。試験に用いた人尿濃縮液は、実施例１と同一の
方法で調製し、高速液体クロマトグラフイーは、
TSK−Gel3000SW（φ7.5×1200mm）カラム及び
LC−3Aポンプを用い、室温で１ml／minの流速
で実施した。安定剤として、ポリエチレングリコール（シグ
マ社製。平均分子量6000ダルトン）、緩衝液とし
て、0.01M〜0.5Mリン酸ナトリウム、PH7.0（イ
オン強度約0.02〜1.14）を用いた。試験結果は表２及び表３に示すとおりであつ
た。安定剤を含有しない各濃度の緩衝液でクロマ
トグラフイーを行なつた場合、CSFはいずれの
濃度の緩衝液でも回収率は低かつた。特に、イオ
ン強度が低い場合は、CSFとカリクレイン両者
とも回収率は低下した。

【表】＊未処理の濃縮液の活性に対する百分率
表３に示す各種濃度でポリエチレングリコール
及びTriton Ｘ−100を含有する0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液（イオン強度0.20）を使用したとき
のCSFの回収率を比較検討した結果、安定剤と
してそれぞれポリエチレングリコール及びTriton
Ｘ−100を0.01〜0.1％濃度で使用した場合、CSF
の回収率が著しく改善されることが、判明した。
また、安定剤は低濃度で用いる方が好ましく、表
３に示すように、0.01％（Ｗ／Ｖ）で、ほぼ十分
な効果が得られた。安定剤濃度を必要以上に高く
すれば、CSFとカリクレインとが分別されず、
また試料粘度を増加せしめるので、0.1％（Ｗ／
Ｖ）以上の濃度は好ましくなかつた。

【表】表３に示した緩衝液は、0.2Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、PH7.0を用た結果を示したものである
が、食塩等の中性塩を加えてイオン強度を調整し
ても、安定剤の存在下では、同様な回収率の改善
結果が認められた。尚この結果をまとめて表４に
示した。表４は、ポリエチレングリコール0.01％
存在下での各種緩衝液での回収率を比較したもの
である。

〔発明の効果〕

本発明の方法によつて奏せられる効果は次のと
おりである。 CSF及びカリクレインの回収率が従来法に
比してそれぞれ約3.5倍及び約2.4倍である。 CSF及びカリクレインを同時に製造し得
る。 CSFへのカリクレインの混入量が実質的に
ない。従来法に比して極めて短時間でCSF及びカ
リクレインを製造し得る。

【図面の簡単な説明】

図１及び図２は、それぞれ従来法によるゲル
過及び本発明の方法の高速ゲル過によるCSF
とカリクレインの分別パターンを示す。両図にお
いて左縦軸はCSF活性と280nmにおける光学密度
とを、右縦軸はカリクレイン活性を、横軸は分画
番号を、−は光学密度を、〓はCSF活性を、そし
て〓はカリクレイン活性をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１健康人の尿、又は人尿由来コロニー形成刺激
因子とカリクレインを含有する溶液を蛋白質につ
き濃縮し、安定剤を含有する緩衝液と該濃縮液を
平衡させ、分子量排除限界が球状蛋白質で測定し
た時10⁵〜５×10⁵ダルトンの分子篩効果を有する
担体を充填しかつ予め該緩衝液を通液したカラム
へ注入し、高速液体ゲル過クロマトグラフイー
を行ない、人尿由来コロニー形成刺激因子とカリ
クレインとを分離し、のちそれらを個別に回収
し、製造することを特徴とする人尿由来コロニー
形成刺激因子及びカリクレインの製造法。２緩衝液がイオン強度0.05〜0.5、PH6.0〜8.0で
あり、0.01〜0.1％（Ｗ／Ｖ）の安定剤を含有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の製造法。３安定剤が分子量1000〜10000ダルトンのポリ
エチレングリコール又はオクチル−フエノキシポ
リエトキシエタノールであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項又は第２項に記載の製造法。