JPS63317084A - ウロキナ−ゼの加熱による低分子化抑制法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はウロキナーゼ製剤の製造法に関する。

さらに詳しくはウロキナーゼ水溶液を、たとえば、６０
℃１１０時間加熱して病原性ウィルスを不活化する際、
ウロキナーゼの低分子化を防止する方法に関する。

（従来の技術） ウロキナーゼは尿中に少量存在するプラスミノーゲン活
性化因子の一つであり、線溶作用があり、今日血栓症の
治療に広く用いられている。ウロキナーゼの歴史は古＜
ｔｓｏｏ年代すでに５ａＪｉ。

Ｇｅｈｒｉｇなどにより尿中に線溶活性を有する物質の
存在が認められており、１９５２年に至り５ｏｂｅｌ　
　によりこのプラスミノーゲンアクチベーターにウロキ
ナーゼ（以下ＵＫと略称する）と云う名称が与えられた
。１９５７年にＰｅｏｕｇ　　は本品の活性測定法、尿
からの分離、精製法をほぼ完成し血栓症治療の臨床応用
への道を拓いた（　Ｐｄｏｕｇ、１．：　Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　２４２７８（１
９５７）、）ｏ　　その後Ｗ１１　ｉ　ｊ　ｅは　ＵＫ
は１種の物質ではなくて２種あることを明らかにした。

すなわち、分子量５４，０００の高分子型ウロキナーゼ
（以下Ｈ−Ｕ　Ｋという）及び分子量３２．０００の低
分子型ウロキナーゼがあり（以下Ｌ−ＵＫという）、人
体から尿が排泄された時は前者のみであるが、尿の保存
、抽出、精製中に尿中のウロペプシンなどの蛋白分解酵
素で分解切断されて後者が生成することを知った（Ｗｈ
ｉｔｅＷ。

Ｆ、　ｅｔａｐ、：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５　
２１６０（１９６６））。従って今日のＵＫ製剤には比
率は種々異なるが、Ｈ−ＵＫとＬ−ＵＫが混在するわけ
である。

上述２種のＨ−ＵＫとＬ−ＵＫの性能の比較について述
べると両者の純品を通常の測定法、例えばフィブリン平
板法、フィブリンチューブ法ＣＰｅＯｕｇ、　Ｊ、　ｅ
ｔａｅ、　：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣｊａ、２４　２７８（１９５７））或いはＡＧＬＭ
Ｅ　合成基質法（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ａ、　、１．　ｅ
ｔａｇ（１９６９））などで測定するとミリモル当りほ
ぼ同一の活性を示すが、最も生体内における血栓溶解作
用に近い方法、チャンドラ、ループ法（Ｃｈａｎｄｅｅ
ｒ、Ａ、Ｂ、：Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、７−１１０（１
９５７）、　　Ｐｏｏｌｅ、Ｊ、　Ｃ，Ｆ　：Ｑ、　Ｊ
、　ＥＸＰ。

Ｐｈｙｓｉｏｇ、　４４３７２　（１９５９）　）、或
いは天然型であるグルタミールプラスミノーゲンを用い
た方法（特開昭５８−１３０４８５）などの測定法を用
いると、Ｉ（−Ｕ　ＫはＬ−ＵＫの約２倍の活性を示し
、臨床に用いる場合約半量で同等の効果を示すため、出
血など不慮の副作用を防ぐことができる（特開昭５ｌ−
１１０４８５）。その他種々の利点も認められ現在欧米
でも、また我が国においてもＵＫ製剤の規格においてＨ
−ＵＫの含量７５　ｏ、／、以上と定められている。

一方人間の血液、臓器、尿中には肝炎ウィルスその他の
病原性ウィルスが存在することが知られている。従って
人の尿から製造したＵＫ製剤をそのま１人に投与すると
ウィルス感染症に侵される可能性がある。それ故今日米
国においてもまた我が国においてもＵＫ製剤は病原ウィ
ルスの不活化を目的として６０℃，１０時間の加熱処理
を義務づけている。

しかしこの６０℃１１０時間の加熱処理をＵＫ液に施す
とＵＫの活性の低下が起るので、これを防ぐ工夫が種々
行なわれている。すなわちアミノ酸、糖類、塩類、ゼラ
チン、ヒト血清アルブミン、ヒドロキシプロピルセルロ
ーズなどを加熱処理の際に添加する方法である（特公昭
５６−４３２１８、特開昭５３−１４２５９２、特開昭
５６−２８９１）以上の方法によって６０℃１１０時間
の加熱処理によるＵＫ活性の低下をある程度防ぐことが
できる。

（発明の解決しようとする問題点） ところが発明者らが上記加熱処理について実験を重ねて
いたところ意外にも本処理の際ＵＫの低分子化が起り、
しかもこの現象は、後述するように、上記加熱安定剤の
何れでも防ぐことができないことが分った。加熱処理時
にＵＫ活性の低下を熱安定剤で防ぐことができてもＵＫ
の低分子化が進みＨ−ＵＫの含量が７５％を割るとその
製剤は規格外として廃棄せざるを得ない。したがってこ
れはＵＫの活性の低下以上の重要な問題となった。

（問題点を解決するための手段） そこで発明者らはこの問題に取組み苦心研究を重ねた結
果、ついに本問題の解決策に到達し本発明を完成した。

すなわち、ｐＨ２からｐＨ１０まで各段階のＵＫ液を調
製し６０℃，１０時間の加熱処理を施し、ＵＫの活性残
存率とＨ−ＵＫ含量率を平行して測定した（実験例１１
第１表、実験例２、第２表）。

その結果活性残存率は比較的高いｐＨ値、すなわちＰＨ
６．５〜７．０が望ましく、一方Ｈ−ＵＫ含量率の低下
を防ぐには比較的低いｐＨ１すなわちｐｕａ、ｏ〜４．
０が好適であることが分った。すなわち活性残存率とＨ
−ＵＫ含量率維持の至適条件は完全に相反するという結
果を得た。

そこで前記加熱安定剤であるヒト血青アルブミン、ゼラ
チン、アミノ酸などを添加して低いｐＨで加熱処理する
ことを試みたが、ｌ）Ｈを少し低下させても活性残存率
は著しく低下する結果となり、この試みは失敗に終った
（実験例３、第３表）。

つぎに６０℃，１０時間の加熱処理をＩ）Ｈ６〜７の活
性残存率の至適条件において、Ｈ−Ｕ　Ｋ含量率の低下
しない方法を模策して数々の試みを行なった結果、該溶
液に水溶性クエン酸塩またはクエン酸を少量添加すると
活性残存率の至適条件でもＩ（−Ｕ　Ｋの低分子化を防
禦し得ることが判明した（実験例４、第４表）。

本発明は上記の新知見に基づくもので、ウロキナーゼ含
有水溶液をクエン酸またはその水溶性塩の存在下に加熱
処理することを特徴とする水溶液中のウロキナーゼの加
熱による低分子化抑制法である。

水溶性クエン酸塩としては、たとえば、クエン酸ナトリ
ウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５０７，２Ｈ２０）、　オヨびソノ
酸性塩（Ｎａ２ＨＣ６Ｈ５０７）、クエン酸カリウム（
ＫｓＣ６Ｈ７０７）Ｈ２Ｏ）・　およびその酸性塩（Ｋ
Ｈ２Ｃ６Ｈ５０７）、クエン酸アンモニウム（（ＮＨ４
）　ａ　ＣｓＩ■５０７）、およびその酸性塩（（ＮＨ
４）２ＨＣ６，Ｉ（５０７）、クエン酸リチウム（Ｌｉ
８Ｃ６Ｈ５０７＋　４Ｈ２０）　　などが挙げられる。

これらは２種以上を混用してもよい。クエン酸塩または
クエン酸の添加量はＵＫ液の０．１〜０，５％（クエン
酸ナトリウムとして）が好ましい。すなわち他の塩類ま
たはクエン酸は分子量比で上記クエン酸ナトリウム相当
量を用いるのが好ましい。用いるＵＫの精製の度合は特
に限定されるものでないが、好ましくは比活性１，００
０国際国際車〜−蛋白以上、さらに好ましくは１０，０
００国際車位／写−蛋白以上のものである。またｐＨは
活性残存率を出来るだけ損じないため、６．０〜７．５
に保たれることが好ましい。

加熱処理の条件は６０℃１１０時間の製剤規格に準じて
、約６０’Ｃ，約１０時間であるのが望ましい。しかし
ながら、目的に（芯じて、この範囲以外の条件を、ＵＫ
活性やＨ−ＵＫ含量のそれによる変動が受容できる限り
、加熱処理に適用してもよい。

なおりエン酸塩を添加すると同時にヒト血清アルブミン
を添加して加熱処理を行ない、さらにメンブランフィル
タ−で除菌濾過を行なうとフィルターにＵＫが吸着され
るのを防ぎ極めて良好な結果力（得られた（実施例４）
。

（作用） 本発明において、クエン酸またはその水溶性塩はウロキ
ナーゼの水中における加熱による低分子化を抑制する。

実験例１ 比活性１２９４００国際単位／国際−蛋白（以下ＩＵ／
ｑ−ｐｒｏ、と略称する）、高分子ウロキナーゼ含量９
４，４％の高純度ウロキナーゼ（以下ＵＫと略称）を０
．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０、２　Ｍ　ＩＪン酸
緩衝液に０．７　Ｗ　／　ｙｓｌの濃度に溶解し、この
液からｐＨ２，３，４，５，６，７，８，９゜１０に調
整した９種類のＵＫ溶液を作製し、これらそれぞれに６
０℃，１０時間の加熱処理を行なった後ＵＫの残存活性
（註１）とＨ−ＵＫの含量（註２）を測定した。その結
果を第１表に示す。

註 １）ＵＫ残存活性の測定：　Ｊ、　ｐｇｏｕｇのフィブ
リン試験管法で行なった。（Ｂｉｏｃｈ　ｉｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

２）Ｈ−ＵＫの含量測定：高滓製作所（京都）製高速液
体クロマトグラフ用液送用ユニットＬＣ−６Ａ、クロマ
トバック０Ｒ−３Ａ及び東洋ツーダニ業（東京）製ｓｗ
−ａｏｏｏゲルクロマト用カラムを組合せた高速液体ク
ロマトグラフィーを用いたゲル濾過法で行なった。

なお以下の実験例、実施例においても上記２つの測定法
で行なった。

（以下余白） 第　　１　　表 ＊　被検液加熱処理前のＵＫ活性を１００とする。

＊　＊　　　　　ＯＨ−Ｕ　Ｋ含量を１００とする。

＊＊＊　　加熱時にＵＫが重合反応を起した故力）Ｈ−
ＵＫのＲＴ位に溶出分が少ない。

実験例２ 比活性１４３００　ＩＵ／ダー蛋白、ＥＩ−ＵＫ含量９
７．２’：るの高純度ＵＫを用いてｐＨを６．０，６．
５゜７．０について実験例１と同様の実験を行なった。

その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 ＊　被検液加熱処理前のＵＫ活性を１００とする。

＊＊　　　　　″　　　　Ｈ−ＵＫ含量を１０とする。

実験例３ 比活性１４５３００　ＩＵ／刀−蛋白、Ｈ−ＵＫ含量９
７．２％の高純度ＵＫを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．２Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に、０．７〜／　ｍｌの濃
度に溶解し、これにヒト血清アルブミン０．３％、ゼラ
チン０．３％、リジン１．５％、ヒドロキシプロピルセ
ルローズ５００００２％を別々に添加して、ｐＩｉ６．
０及びＩ）Ｈ７，０について加熱処理（６０℃１１０時
間）を行ない、ＵＫ活性及びＨ−ＵＫ含量を測定した。

結果を第３表に示す。

＊　被検液加熱処理前のＵＫ活性をｌＯＯとする。

＊　＊　　　　　′ＩＨ−Ｕ　Ｋ含量を１００とする。

実験例４ 比活性１４５３００　ＩＵ／ダー蛋白、Ｈ−Ｕ　Ｋ含量
９７．２％の高純度ＵＫを０．７　Ｑ　／　ｍｅの溶液
とし、これにクエン酸ナトリウムを０．１．　０．２５
．　０．５％になるように添加し、Ｉ）Ｈを６．０　、
　６．５　、　７．０に調整し、加熱処理（６０’Ｃ，
１０時間）を行ない、ＵＫ活性とＨ−ＵＫ含量を測定し
た。

結果を第４表に示す。

（以下余白） 第　　４　　表 ＊　被検液加熱処理前のＵＫ活性を１００とする。

＊＊　　　　　″　　　　Ｉ（−ＵＫ含量を１００とす
る。

実施例１ 比活性１２１６００　ＩＵ／Ｍｌｉ−Ｈ−ＯＫＫ量９５
．２％のＵＫｌ、５Ｍｙを０．１　Ｍ塩化ナトリウムを
含む０゜２Ｍリン酸ナトリウム液１００肩ｌに溶解し、
これにクエン酸を０．１％になるよう添加し、ｐＨを６
．０に調整し、６０℃，ｔＯ時間加熱処理を行ない冷浸
ＵＫ活性とＨ−ＵＫ含量を測定した。ＵＫＫ性残存率と
Ｈ−Ｕ　Ｋ含量率はそれぞれ加熱処理前の６９％及び９
１％であった。

実施例２ 比活性１２１６００　ＩＵ／ｑ−ｐｒＱ、Ｈ−ＵＫ含ｉ
９５．２％のＵＫを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．２　Ｍリン酸ナトリウム液に溶解し１８０００００Ｉ
　Ｕ　／　ｍｌの濃度のＵＫ液１０００屑ｌを調製し、
これにクエン酸ナトリウムを０．１％になるように添加
し、ｐＨを６．０として６０℃，１０時間加熱処理を行
なった後直ちに水冷した。この液をセファデックスＧ−
１００を用いたゲルクロマトグラフィーに付し、クエン
酸ナトリウムを除去した後、孔径０．２２μｍのメンブ
ランフィルタ−を用いた除菌濾過を行ない、２　ｍｌず
つ分注して凍結乾燥した。加熱処理前から最終製剤まで
のＵＫＫ性残存率７３％であり、Ｈ−ＵＫ含全量率９０
．０％（加熱処理前のＨ−ＵＫ含量を１００％として）
であった。

実施例３ 比活性１６６４００　ＩＵ／ｑ−蛋白、Ｈ−ＵＫＫ量８
２％のｔＪ　Ｋを０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．２Ｍリン酸緩衝液に０．７　’ＩＩｙ／　ｍｅの濃度
に溶解しりＵ　Ｋ　液５０　Ｎ／をつくり、これにクエ
ン酸カリウムをＱ、　３０１０になるように加えて２分
し、Ａ液とＢ液とする。

Ａ液はＩ）Ｈ６，０にＢ液はｐＨ７，０に調整し、両夜
に６０℃，ｔＯ待時間加熱処理を施し、冷浸両液のＵＫ
活性とＨ−Ｕ　Ｋ含量を測定した結果を第５表に示す。

第　　５　　表 ＊　被検液加熱処理前のＵＫ活性を１００とする。

＊　＊　　　　　Ｈ−Ｕ　Ｋ含量を１００とする。

＊＊＊　　加熱処理後の被検液中のＬ−ＯＫとＨ−ＯＫ
の合計量を１００とする。

実施例４ 比活性１５３，０００　　Ｉ　Ｕ／’！、Ｈ−υに含量
９３６％のＵＫＫ溶液（５００，０００ＩＱ／肩１＝３
．２７’ダ／眉／）にクエン酸ナトリウムｏ、　１　’
７０　％　ヒト血清アルブミン０．３％及びリン酸ナト
リウム０．２Ｍになるように加え、ＰＨ６．０に調整し
、６０℃５１０時間の加熱処理を行なった後、直ちに水
冷した。

このＵＫＩに孔径０．２２μｍメンブランフィルタ−を
用いた除菌−過操作を行ない、無菌生理食塩水を用いて
希釈し、６０，０００　Ｉ　Ｕ　／ｍｅのウロキナーゼ
溶液とした後、凍結乾燥した。氷晶の加熱処理前から最
終製剤までの口にの回収率は９２％であり、■−〇にの
含量率は９０．６％（加熱処理前のＨ−ＵＫ含量を１０
０％として）であった。

（発明の効果） 本発明によれば、クエン酸またはその水溶性塩を存在さ
せるという簡単な手段により、ウロキナーゼ含有水溶液
の加熱処理におけるウロキナーゼの低分子化を抑制し、
高分子型ウロキナーゼ含量の高い製剤を得ることができ
る。

手続補正古く方式〉 昭和６２年　７月１７日 昭和６２年特許願第１５３０４３号 ２、発明の名称　ウロキナーゼの加熱による低分子化抑
制法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　兵庫県神戸市東灘区御影本町 ３丁目４１ｔｉ２０号 名称　日本ケミカルリサーチ株式会社 代表者　　芦　１）　信 ４、代理人 〒５４１　　口（０６）　２０２−５８５８５、補正命
令の日付　（自発） ６、補正の対象　明細書の発明の詳細な説明の欄補正の
内容 明細占用１２頁、第２表の下２行目、 ｒＨ−ＵＫ含量を１０とする。Ｊをｒ　Ｈ−Ｕ　Ｋ含量
を１００とする。」に訂正する。

同、第１５頁下から３行目、ｒ　Ｕ　Ｋ　１，５　ｍａ
ＪをｒＵＫ１５０ｎｏＪに訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ウロキナーゼ含有水溶液をクエン酸またはその水溶
   性塩の存在下に加熱処理することを特徴とする水溶液中
   のウロキナーゼの加熱による低分子化抑制法。 ２　ウロキナーゼ含有水溶液にクエン酸またはその水溶
   性塩を、クエン酸ナトリウムに換算して０．１〜０．５
   ％の濃度で溶存させる特許請求の範囲第１項記載の低分
   子化抑制法。 ３　クエン酸の水溶性塩がクエン酸のナトリウム、カリ
   ウムもしくはリチウム塩またはそれらの二種以上である
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の低分子化抑制
   法。 ４　加熱処理を約６０℃で約１０時間行う特許請求の範
   囲第１項、第２項または第３項記載の低分子化抑制法。 ５　ウロキナーゼ含有水溶液をクエン酸またはその水溶
   性塩の存在下にＰＨ６．０ないし７．５に保って加熱処
   理する特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
   ４項記載の低分子化抑制法。