JPS647050B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ガンマグロブリン誘導体の精製法、
さらに詳しくは、スルホ化ガンマグロブリンをイ
オン交換体で処理することによりスルホ化ガンマ
グロブリンの凝集物を除去して単分子含量を高め
るとともに抗補体性を充分に低減させ、生化学的
および物理的に安定なスルホ化ガンマグロブリン
を製造する方法に関する。 混合血漿より分画されるガンマグロブリンは、
多くの感染症に対して体液性抗体としての活性を
有し、いわゆる免疫グロブリン製剤として各種の
感染症の予防および治療に使用されている。しか
しながら、従来の免疫グロブリン製剤では、その
精製過程で生じる凝集分子のために静脈内投与が
できずもつばら筋肉内注射に限られていた。すな
わち、多量の凝集分子を含むガンマグロブリンを
静脈内投与すると、補体の急激な活性化が起り、
血圧降下、体温上昇、循環器系障害などの副作用
を伴うといわれている。一方、筋肉内注射では、
その投与量および血管内への浸透速度に限界があ
り、急速な血中抗体レベルの上昇を必要とする場
合には適当でない。そのため、その本来の抗体活
性を充分に保持させながら上記のような抗補体性
を低下させ、静脈内注射の可能なガンマグロブリ
ンの製造が望まれている。 このような静脈内注射可能なガンマグロブリン
の製法として、ペプシン処理法〔エイチ・イー・
シユルツエ；ドイチエ・メジチニツシエ・ヴオツ
ヘンシユリフト（H.E.Schultze；Deutsch
Medizinishe Wochenshrift）87巻、1643（1962）〕
およびプラスミン処理法〔ヨツト・テー・スゴウ
リス；ホツクス・ザンギニス（J.T.Sgouris；
Vox Sanguinis）13巻、71（1967）〕などが提案さ
れているが、これら蛋白質分解酵素による処理で
えられるガンマグロブリンは２つあるいはそれ以
上の断片に切断、低分子化されているため血中で
の抗体残留時間が短く、またガンマグロブリン分
子のFc部分の切断によりそのFc部分の生物活性
が抵下する欠点を有する。 さらに、上記のような欠点のない静脈内注射用
ガンマグロブリンの製法、すなわち、ガンマグロ
ブリンの構造をほとんど変えずに静脈内注射可能
なガンマグロブリンをえる方法も研究されてお
り、たとえば、バランダンらのPH４処理法〔ホツ
クス・ザンギニス（S.Barundun et al.；Vox
Saguinis）13巻、93（1967）〕、ステフアンのβ−
プロピオラクトン処理法〔ホツクス・ザンギニス
（W.Stephan；Vox Sanguinis）28巻、422
（1975）〕などが知られているが、このPH４処理の
ガンマグロブリンは保存中に凝集分子が増大し抗
補体性が再び高くなる傾向があり、またβ−プロ
ピオラクトン処理によるガンマグロブリンは、人
体に投与したとき抗原性を生じる可能性があると
いわれている。 最近、増保らは、ガンマグロブリンの鎖間SS
結合をスルホ化してすぐれた静脈注射可能なガン
マグロブリンをえることが報告している（特開昭
51−1630号）。このスルホ化ガンマグロブリンは、
その鎖間SS結合は切断されているが水素結合な
どにより本来の高次構造を有しその抗体活性を完
全に保持しながら、抗補体性は著しく低減され
（５％蛋白質濃度で抗補体価（CH₅₀）が30％以下
といわれている）、しかも、生体内に投与後はす
みやかに還元、酸化をうけて元のガンマグロブリ
ンに復元するという特徴を有している〔増保ら、
ジヤーナル・オブ・バイオケミストリイ（J.
Biochem.）19巻、1377（1976）〕。さらに、この抗
補体性の低いスルホ化ガンマグロブリンはきわめ
て安全に低または無ガンマグロブリン血症の患者
に投与することができ、すぐれた臨床効果が証明
されている（小林登、国際血液輸血学会（パリ）
1978）。 このように、スルホ化ガンマグロブリンは静脈
内注射可能な免疫グロブリン製剤としてすぐれ、
注目をあびているが、これを工業的に量産するこ
とは必ずしも容易ではない。すなわち、前記増保
らの方法では、充分に精製され、凝集分子の少な
いガンマグロブリンを原料として用いた場合には
抗補体性の低い製品がえられるが、通常工業的に
製造されているガンマグロブリン、たとえば、コ
ーン法分画法（低温エタノール分画法）によつて
えられたものを原料とした場合には抗補体価
（CH₅₀）を30〜20％程度に低下させるにとどまる
ことが多い。このように前記増保らの方法は原理
的には優れているが、より高い安全性が保障され
る製品を工業的規模で製造するためには、何らか
の処理方法をさらに付加する必要がある。 かかる状況のもとに、本発明者らは、一般に工
業的規模で生産されている凝集分子を多く含むガ
ンマグロブリン原料からでも抗補体価が充分に低
減されたスルホ化ガンマグロブリンを恒常的にえ
る方法を見い出すべく種々研究を重ねた。すなわ
ち、製剤の安全性の観点から、さらに抗補体性の
低いスルホ化ガンマグロブリンをえるとを目的と
し、しかも、凝集分子を多く含むどのようなガン
マグロブリンを原料として用いた場合でも、常に
抗補体性の低い製品が工業的に量産しうる方法を
見い出すべく鋭意研究した。その結果、該スルホ
化処理後のガンマグロブリンをさらにイオン交換
体で処理することにより抗補体価を著しく低減し
うることを知り、本発明を完成するにいたつた。 本発明は、抗補体性の低い静脈注射可能なガン
マグロブリンの工業的な製法を提供することを目
的とする。本発明の他の目的は、スルホ化ガンマ
グロブリンとの凝集分子を除去し、モノマーを主
成分とした抗補体性が著しく低減されたスルホ化
ガンマグロブリンを提供することである。 本発明によれば、公知の方法でスルホ化処置し
てえられるスルホ化ガンマグロブリンをイオン交
換体を通して、主として凝集分子からなる画分と
主として単分子からなる画分とに分別し、この単
分子からなる画分を採取して抗補体性のきわめて
低いスルホ化ガンマグロブリンがえられる。本発
明の方法で精製してえられる単分子スルホ化ガン
マグロブリンは、５％蛋白質濃度で抗補体価が10
％以下と著しく低減されており、静脈内注射用免
疫グロブリン製剤として適している。 本発明方法で用いられる原料のスルホ化ガンマ
グロブリンは、国際的に採用されているコーン法
〔ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイアテイ（J.Am.Chem.Soc.）68巻、459
（1946）〕などの分画法によりえられるガンマグロ
ブリンを、テトラチオン酸アルカリ塩、ヨードソ
安息香酸アルカリ塩、空気などの分子状酸素含有
ガスなどの酸化剤ならびに、亜硫酸ナトリウム、
亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸などの亜硫酸イオ
ンを発生する化合物とで処理することによりえら
れ（特開昭51−1630号、特開昭51−76418号）、ま
た、これを適宜透析などで精製したものを含む。 用いられるイオン交換体としては、陰イオン交
換基を導入したアガロースゲル（例えばDEAE−
セフアロースなど）、デキストランゲル（例えば
DEAE−セフアデツクス、QAE−セフアデツク
スなど）、セルロースゲル（例えばDEAE−セル
ロースなど）、ビニール系ゲル（例えばDEAE−
TOYOPEALなど）、およびアミロースゲルなど
の陰イオン交換体、および陽イオン交換基を導入
したアガロースゲル（例えばCM−セフアロース
など）、デキストランゲル（例えばCM−セフア
デツクス、SP−セフアデツクスなど）、セルロー
スゲル（例えばCMセルロースなど）、ビニール
系ゲル（例えばCM−TOYOPEALなど）、およ
びアミロースゲルなどの陽イオン交換体を含む
が、陰イオン交換体の方がえられる製品の生化学
的および物理的安定性などの観点から好ましい。
またこれら陰イオン交換体および陽イオン交換体
を併用してもよい。 本発明方法を実施するには、まずスルホ化ガン
マグロブリンを至適水素イオン濃度（PH値）およ
び至適イオン強度の展開用緩衝液中でイオン交換
体で処置して大部分の単分子スルホ化ガンマグロ
ブリンをイオン交換体に吸着させる。この際、凝
集分子スルホ化ガンマグロブリンおよびスルホ化
されていないガンマグロブリンはイオン交換体に
吸着されずに素通りする。このイオン交換体を前
記緩衝液で洗浄することによりこれら凝集分子な
どの除去がより完全に行なわれる。 上記のイオン交換体への単分子スルホ化ガンマ
グロブリンの吸着に用いられる緩衝液は、陰イオ
ン交換体を用いる場合には、PH４〜10、好ましく
はPH７〜８を有し、またイオン強度0.01〜0.15、
好ましくは0.03〜0.09、を有する。陽イオン交換
体を用いる場合には、PH４〜6.5、好ましくはPH
５〜６、またイオン強度0.01〜0.1、好ましくは
0.035〜0.07、を有する緩衝液を用いる。なお、
該吸着処理に用いるスルホ化ガンマグロブリンの
濃度はとくに制限されないが、ガンマグロブリン
のイオン交換体に対する交換容量を考慮すれば、
２〜12％（Ｗ／Ｖ％）程度が望ましい。 展開用緩衝液の具体例としては、リン酸緩衝
液、クエン酸塩緩衝液、トリス−リン酸緩衝液、
トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸塩緩衝
液などがあげられる。 上記のごとくイオン交換体に吸着された単分子
スルホ化ガンマグロブリンは、上記展開緩衝液と
異なるPHおよびイオン強度を有する緩衝液で溶出
することにより容易に回収される。この溶出用緩
衝液は、陰イオン交換体を用いた場合はPH３〜８
のものが好ましく、陽イオン交換体の場合はPH６
〜９のものが好ましい。なお、イオン強度につい
ては緩衝液のPHおよびイオン交換体の種類に関係
なく、展開緩衝液のイオン強度よりも高ければよ
く、一般に0.05〜0.8の範囲が好ましい。この溶
出用緩衝液の具体例としては、リン酸塩緩衝液、
グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸
ナトリウム水溶液およびそれぞれの溶液に塩化ナ
トリウムを加えたものなどがあげられる。 本発明による精製処理は、通常、室温下に行な
うが、所望により冷却下に行なつてもよい。 本発明方法でえられる精製スルホ化ガンマグロ
ブリンは精製前のものに比べて、単分子含量、抗
補体価および安定性においてきわめて優れたもの
である。たとえば、後記実施例１に示すような方
法でスルホ化処理してえられるスルホ化ガンマグ
ロブリンの３ロツトについて本発明方法により
DEAE−セフアロースCL−6BおよびCM−セフ
アロースCL−6Bを用いて精製し、５％蛋白質濃
度に調整したものについて、抗補体価（CH₅₀）、
超遠心分析による単分子含量およびカーン振盪機
より一定時間振盪した場合の光散乱度の差による
振盪安定性を測定したところ、下記第１表に示す
成績がえられた。

【表】

【表】 上記第１表に示す結果からも明らかなように、
本発明方法で精製されたスルホ化ガンマグロブリ
ンは、精製前に比し抗補体価は著しく低減され、
５％蛋白質濃度で10％以下となる。ことに陰イオ
ン交換体を用いた場合にはその低減度が著しい。
また、単分子含量でも精製前では75〜80％程度で
あつたものが精製後は90〜95％と上昇している。
なお、超遠心分析法では、著しく大きい凝集分子
は遠心開始直後に沈殿するため分析しにくいが、
ゲルクロマトグラフイ、たとえば薄層ゲルクロマ
トグラフイによる分析ではスルホ化ガンマグロブ
リンの凝集分子をポリマーとオリゴマーとに区別
できる。この方法によつても、精製前のモノマー
含量60〜70％のものが精製後では85％以上に上昇
することが確認されている。 さらに、振盪前後の光散乱度の測定結果からも
明らかなように、本発明方法により精製されたス
ルホ化ガンマグロブリンは、振盪によつても不溶
性物質の析出が少なく物理的にもきわめて高い安
定性を示す。 ついに実施例をあげて本発明方法をさらに具体
的に示すが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。 実施例 １ テトラチオン酸ナトリウム248ｇおよび亜硫酸
ナトリウム408ｇを、それぞれ塩化ナトリウム加
リン酸塩緩衝液（PH7.6）1500mlおよび3500mlに
とかし、除菌過する。それぞれの液を人血漿よ
りエタノール分画によつてえられるガンマグロブ
リンの15％水溶液10に加えてゆつくり撹拌す
る。43℃で4.5時間撹拌してスルホ化を行なう。 えられた反応混合液を生理的食塩液で透析して
過剰のスルホ化剤を除去し、さらに展開緩衝液
（リン酸塩緩衝液：μ＝0.06，PH7.5）にて平衡化
する。 このようにしてえられたスルホ化ガンマグロブ
リンの濃度を約８％に調整し、その15を上記展
開用緩衝液と同じリン酸塩緩衝液で平衡化した
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア製）
を充填したカラム（16）に通して展開する。 イオン交換体に吸着されずに素通りする画分
（Ｐ）は約２％蛋白質濃度の溶液16である。
該カラム上に上記と同じリン酸塩緩衝液を充分に
流して洗浄し、素通りする蛋白質がほとんど検出
されなくなつてから、酢酸塩緩衝液（μ＝0.1，
PH4.0）を流し、溶出する画分（Ｐ）を集める。
この画分は約2.5％蛋白質濃度の溶液32である。 えられた各画分を水酸化ナトリウム水溶液で中
和し、約５％蛋白質濃度まで濃縮し、ついで2.25
％グリシン含有等張リン酸緩衝液で透析する。こ
れを前記第１表と同様にして各物性を測定し、そ
の結果を第２表に示す。

【表】 上記の結果から明らかなように、Ｐ画分は抗
補体価が高く、凝集分子を多く含み、さらに振盪
安定性も悪い。一方、目的とするＰ画分は処理
前よりも抗補体価が充分に低く、単分子含量が高
く、かつ振盪安定性も著しく増大し、不都合な性
質を示す成分はＰ画分にきわめて効果的に除去
されている。 なお、上記実施例におけるイオン交換体による
分離パターンを示すと第１図のとおりである。図
中、横軸はフラクシヨン番号、縦軸は波長280nm
での各フラクシヨンの吸光度を示す。 また、上記実施例における精製処理前のスルホ
化ガンマグロブリン溶液(A)、Ｐ画分(B)およびＰ
画分(C)について超遠心分析（Ｘ）および薄層ゲ
ル過分析（Ｙ）に付した場合のパターンを測定
すれば第２図に示すとおりである。この超遠心分
析はベツクマン超遠心機を用い蛋白質濃度約1.67
で、60.000rpm、50分間の遠心の条件下で行な
い、薄層ゲル過分析は右田の方法（Annual
Report of Inst.Virus Research，Kyoto Univ.8
巻、130（1965）を参照）によつて行なつた。図
中、ａは単分子物質（7S）、ｂ（9S）、ｃ（11S）、
ｄ（13S）はオリゴマー、ｐはポリマーを示す。
第２図から明らかなように、両分析結果はほとん
ど同じパターンを示すが、とくに大きな凝集分子
の量は薄層ゲル過分析の方に高く出ている。し
かし、超遠心分析にはポリマーは示されていな
い。またいずれの場合も、Ｐ画分に凝集分子が
多く含まれ、Ｐ画分は単分子含量が上昇してい
る。 実施例 ２ 15％ガンマグロブリン水溶液60を実施例１と
同様にスルホ化処理したのち透析する。そのスル
ホ化ガンマグロブリンの濃度を約７％に調整し、
約100をクエン酸塩緩衝液（μ＝0.03，PH7.5）
で平衡化したDEAEセフアロースCL−6Bカラム
（150）に通して展開する。 吸着されずに素通りする画分（Ｐ）は約1.5
％蛋白質濃度の溶液約125である。該カラムを
前記実施例１と同様にして洗浄後、塩化ナトリウ
ム加グリシン−塩酸緩衝液（μ＝0.55，PH3.5）
を流し溶出する画分（Ｐ）を集める。この画分
は約２％蛋白質濃度の溶液約245である。 えられた各画分を実施例１と同様に処理し、同
様に各物性を測定したところ第３表に示す結果を
えた。

【表】 実施例 ３ 前記実施例１の方法において、展開用緩衝液と
してリン酸塩緩衝液（μ＝0.06，PH7.5）の代わ
りにクエン酸塩緩衝液（μ＝0.03，PH7.5）を用
い、濃度約７％に調整したスルホ化ガンマグロブ
リン約15をDEAE−セフアロースCL−6Bカラ
ム（16）に展開するとＰ画分（蛋白質濃度約
1.7％）15.6をえる。ついで、溶出緩衝液とし
てクエン酸緩衝液（μ＝0.614，PH6.0）を用いて
溶出すると、Ｐ画分（蛋白質濃度約2.2％）31
をえる。 実施例 ４ 展開用緩衝液としてリン酸塩緩衝液（μ＝
0.06，PH7.5）を用いて上記実施例３と同様に処
理して、Ｐ画分（蛋白質濃度約1.8％）約14
をえる。ついで、溶出緩衝液としてグリシン−塩
酸緩衝液（μ＝0.542，PH3.5）を用いて溶出し
て、Ｐ画分（蛋白質濃度約2.4％）29をえる。 実施例 ５ 展開用緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（μ＝
0.0175，PH8.5）、および溶出用緩衝液として塩化
ナトリウム加リン酸塩緩衝液（μ＝0.45，PH6.0）
を用いた以外は、前記実施例３と同様にして、Ｐ
画分（蛋白質濃度約1.2％）22およびＰ画
分（蛋白質濃度約2.6％）27をえる。 実施例 ６ 前記実施例１と同様に処理してえられるスルホ
化ガンマグロブリン溶液を酢酸塩緩衝液（μ＝
0.05，PH5.3）にて透析し平衡化する。そのスル
ホ化ガンマグロブリン濃度を約７％に調整し、そ
の15を、上記と同じ酢酸塩緩衝液で平衡化した
CM−セフアロースCL−6B（フアルマシア製）を
充填したカラム（16）に通して展開する。 吸着されずに素通りする画分（Ｐ）は約1.9
％蛋白質濃度の溶液13である。 上記吸着ざれたイオン交換体充填カラムを前記
実施例１と同様にして洗浄後、酢酸ナトリウム水
溶液（μ＝0.2）を流して溶出する画分（Ｐ）
を集める。この溶出画分（Ｐ）は約2.5％蛋白
質濃度の溶液27である。 えられた各画分を実施例１と同様に処理し、同
様に、各物性を測定したところ第４表に示す結果
をえた。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法によるイオン交換体処理に
おける各フラクシヨンの吸光度（OD₂₈₀）パター
ンを示し、第２図は、精製前および精製後の各画
分について超遠心分析（Ｘ）および薄層ゲル過
分析（Ｙ）のパターンを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｓ−スルホ化ガンマグロブリンを、PH７〜
   ８、イオン強度0.01〜0.15の展開用緩衝液中で陰
   イオン交換体で処理するか、またはPH４〜6.5、
   イオン強度0.01〜0.1の展開用緩衝液中で陽イオ
   ン交換体で処理して単分子Ｓ−スルホ化ガンマグ
   ロブリンを該イオン交換体に吸着させ、ついでこ
   れを溶出することを特徴とするＳ−スルホ化ガン
   マグロブリンの精製法。