JPS6160817B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、単量体含有量の高い免疫グロブリン
の製法に関する。さらに詳しくは、人または動物
の血清、血漿などの免疫グロブリン含有生物材料
より免疫グロブリンを分画採取する方法におい
て、免疫グロブリン含有材料中に水溶性の塩基性
含窒素有機化合物を存在させることにより、凝集
体の生成を抑制し、単量体含有量の高い免疫グロ
ブリンを製法する方法に関する。 免疫グロブリンは、免疫療法に有用な物質で、
各種のウイルス感染症、細菌感染症の予防および
治療にすぐれた効果を有することが知られてお
り、一般に、人または動物の血清、血漿、その他
の体液などから種々の方法で分画採取されてい
る。公知の分画法としては、低温アルコール分画
法〔コーンら；ジヤーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイアテイ〔E.J.Cohn et al；J.
Am.Chem.Soc.）第68巻、459頁（1946）キスト
ラおよびニツチマン；ホツクス・サンギニス（P.
Kistler and H.Nitshmann；Vox Sanguinis）、第
７巻、414頁（1962）〕、リバノール硫安分画法
〔ハイデおよびハウプト；ベーリングウエルケ・
ミツタイルンゲン（K.Heide and H.Haupt；
Behringwerk−Mitteilungen）、第43巻、161頁
（1964）〕、およびイオン交換クロマトグラフイ法
〔ホツプら；ミユンヘン・メジチニツシユ・ヴオ
ツヘンシユリフト（H.H.Hoppe et al；Munchen
Medizinische Wochenshrift）、第34巻、1749頁
（1967）〕などが挙げられる。 しかしながら、これら公知の分画法によつてえ
られる免疫グロブリンは多量体を５〜10％（重量
％、以下同じ）、二重体を10〜20％程度含んでお
り、単量体含有量は70〜85％程度にすぎない。こ
のような多量体、二量体などの凝集体を多く含む
免疫グロブリンは医薬として用いる場合に重大な
欠点を有する。 まず、凝集体は、生体内に投与された場合に、
補体成分と反応しそれを活性化する性質（抗補体
性）を有し、その活性化された補体成分からアナ
フイラトキシン様物質が遊離し、その結果、血圧
降下、体温上昇、循環系障害などの副作用を誘引
するといわれている。したがつて、そのような凝
集体含有免疫グロブリンは投与方法に制約を受
け、静脈注射ができず、もつぱら、効果の発現の
遅い筋内注射に頼らざるをえない。このような筋
肉内投与では投与量および血管内浸透性に限界が
あり、急速な血中抗体レベルの上昇が望めないば
かりでなく、凝集体が新らたな抗原性を発現する
可能性も充分考えられ、筋肉内投与でもなお副作
用の問題が残る。 凝集体含有免疫グロブリンは、さらに、製剤化
の点にも離点を有し、凍結乾燥剤に不適当であ
る。すなわち、凝集体を含有する免疫グロブリン
を凍結乾燥すると、使用時の再溶解に時間がかか
るばかりでなく、不溶解物が残る欠点がある。そ
のため、このような凝集体含有免疫グロブリンは
通常液状のままで製剤化され、保存性を高めるた
めに水銀系防腐剤の添加が余儀なくされている。
ただ、抗破傷風人免疫グロブリン、抗Ｄ人免疫グ
ロブリンなどの特殊免疫グロブリン製剤の場合に
は、液状製剤では有効時間が短かいため、特殊な
操作を用いて凍結乾燥製剤とされているが、なお
溶解性に難点を有している。 このような欠点を解消するために、凝集体を含
まない免疫グロブリンの製法が種々提案されてお
り、たとえば、免疫グロブリンを酵素処理して凝
集体を分解させる方法〔シユルツエ；ドイチエ・
メジチニツシエ・ヴオツヘンシユリフト（H.E.
Schultze；Deutsch Medizinische
Wochenshrift）第87巻、1643頁（1962）、スゴウ
リス；ホツクス・サンギニス（J.T.Sgouris；
Vox Sanguinis）、第13巻、71頁（1967）〕、免疫
グロブリンをPH４の酸性水溶液に導入し、加水分
解により凝集体を解離させる方法〔コブレツト
ら；ホツクス・サンギニス（H.Koblet et al；
Vox Sanguinis）、第13巻、93頁（1967）〕、凝集
体をポリエチレングリコール、ハイドロキシエチ
ル殿粉などの合成高分子で除去する方法〔ポール
ソンら；ホツクス・サンギニス（A.Polson et
al；Vox Sanguinis）、第23巻、107頁（1972）、シ
ユナイダーら；ホツクス・サイギニス（W.
Schneider et al；Vox Sanguinis）、第31巻、141
頁（1976）〕などが知られている。 しかしながら、これらの方法のうち、ペプシ
ン、プラスミンなどの蛋白分解酵素による処理方
法では、凝集体がほぼ完全に解離されるけれど
も、必要な単量体も同時に分解されてＦ
（ab′）₂，FabおよびFcなどの断片に切断され、免
疫グロブリンの血中半減期が短かくなるほか、
Fc部分の切断によりFc部分に由来する生物活性
も低下する欠点を有する。さらに、プラスミン処
理では、抗体活性も低下するといわれている。ま
たPH４の酸性水溶液による処理方法では、凝集体
の解離が完全でなく、保存中に再凝集がみられる
ほか、Fc部分が一部変性し、その活性を失なう
可能性がある。さらに合成高分子物質による処理
方法では、凝集体と共に単量体も除去されるため
単量体の収量の低下をもたらし、しかも合成高分
子物質が免疫グロブリン中に残存し、その影響が
出る可能性が大きい。 本発明者らは、上記のような公知の免疫グロブ
リンにおける欠点を解消し、凝集体を含まない単
量体含有量の高い免疫グロブリンをえるべく種々
研究を重ねた結果、従来公知の分画法において、
分画操作過程における免疫グロブリン含有材料中
に、水溶性の塩基性含窒素有機化合物を存在させ
ることにより、凝集体の形成を抑え、所期の目的
を達成しうることを見い出し、本発明を完成する
に到つた。 すなわち、本発明によれば、人および動物の血
清、血漿などの免疫グロブリン含有材料につい
て、低温アルコール分画法、リバノール硫安分画
法、イオン交換クロマトグラフイ法などで分画す
るに際し、その分画操作過程における免疫グロブ
リン含有材料中に水溶性の塩基性含窒素有機化合
物を存在させることにより、単量体含有量の高い
免疫グロブリンを効率よく製造できる。 本発明の方法は、免疫グロブリンを含むあらゆ
る生物材料に適用でき、人または動物の血清、血
漿、その他の体液、ならびに各種臓器抽出液など
を出発材料として用い、公知の分画法における諸
条件、すなわち、温度、PH、アルコール、リバノ
ール、硫安などの沈殿剤の濃度などについて実質
的に変更を加えることなく実施できる。また、存
在させるべき水溶性の塩基性含窒素有機化合物
も、出発材料に最初から添加してもよく、また分
画操作がある一定の段階まで進行した段階で添加
してもよい。たとえば、低温アルコール分画法で
血漿を分画する場合、一般に、血漿をまず８％エ
タノールで処理して沈殿と上清に分画し、こ
の上清を20％エタノールで処理して沈殿＋
および上清＋に分画し、さらに沈殿＋を
20％エタノールで処理して沈殿＋ｗおよび上
清＋ｗに分画し、ついで沈殿＋ｗを17％
エタノールで処理して沈殿と上清に分画し、
最後に25％エタノールにて上清を処理して所望
の免疫グロブリン（沈殿）をえているが、本発
明の塩基性含窒素有機化合物は、その出発材料で
ある血漿の処段階から添加してもよく、あるいは
上清、沈殿＋、またはその後の画分の段階
から添加してもよい。ことに、上記低温アルコー
ル分画法での沈殿＋の画分まで処理したもの
が免疫グロブリン製造用の原材料として入手可能
であり、本発明はそのような沈殿＋について
塩基性含窒素有機化合物を添加して分画操作を行
なう方法も有利に用いられる。ただ、本発明の塩
基性含窒素有機化合物の存在が凝集体の形成を抑
制する効果を有することから、各分画操作におい
て塩基性含窒素有機化合物が存在していることが
望ましい。したがつて、本発明の実施に際して
は、出発材料および各画分にそれぞれ塩基性含窒
素有機化合物を添加し、分画操作を行なうのが望
ましい。 本発明で用いられる塩基性含窒素有機化合物は
解離紙数pKbが７以下のものであつて、たとえ
ば、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリ
ンなどの塩基性アミノ酸、ロイシンアミド、グリ
シンアミド、アラニンアミドなどの中性アミノ酸
のアミド誘導体またはその低級アルキルエステ
ル、グアニジンまたはメチルグアニジン、ベンズ
アミジンなどのグアニジン誘導体、イミダゾール
または２−メチルイソダゾールなどのイミダゾー
ル誘導体、Ｄ−グルコサミンなどのグルコースの
アミン誘導体、およびメチルアミン、エチルアミ
ン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチ
ルアミン、tert−ブチルアミンなどの炭素数１〜
４のアルキルアミンなどが挙げられるが、とくに
アルギニンが好ましい。 これらの塩基性含窒素有機化合物は、分画操作
の各過程を通して１種のみを単独で用いてもよ
く、２種以上を適宜の割合で併用してもよい。さ
らに、各分画過程毎にそれぞれ別種のものを単独
もしくは２種以上組み合わせて用いても差しつか
えない。また該塩基性含窒素有機化合物は遊離塩
基の形、またはその酸付加塩の形で、そのまま対
象の各画分に添加してもよいし、あるいは水溶液
の形で用いてもよい。 塩基性含窒素有機化合物の用量は、所期の目的
を達成しうる範囲で用いられて、処理される免疫
グロブリン含有材料中の蛋白質重量に基づいて、
0.5〜600％、好ましくは５〜200％の範囲であ
る。この用量が0.5％未満の場合には本発明の効
果が充分に達せられず、一方、600％を超える場
合には、分画操作に悪影響を与え、画分の精製が
困難となるため好ましくない。またあまり多量に
用いることは経済的にも不利である。 本発明の方法は従来公知の分画法における工業
的設備に何らの改変を加えることなく実施でき、
所望の単量体含有量の高い免疫グロブリンが製造
できる。 本発明の方法でえられる免疫グロブリンは単量
体含有量が高く、その凍結乾燥品の再溶解性も良
好である。なお、本発明の方法により得られた免
疫グロブリンは添加した塩基性含窒素有機化合物
が残存しているが、そのままでもあるいは透析な
どの操作によりこれを除去してもよい。 つぎに、後記実施例１および５の凍結乾燥品お
よびｌ−アルギニン塩酸塩を添加しない以外は実
施例１と全く同様に処理してえられる対照の凍結
乾燥品について、再溶解性その他の性状を試験し
た。その結果を第１表に示す。 この試験において、単量体含有量の測定法は下
記のとおりであり、その他の性状は厚生省告示第
263号「生物学的製剤基準」に準拠して行なつ
た。 単量体含有量の測定法： 免疫グロブリンの５％水溶液0.5mlを用い、こ
れをセフアデツクスＧ−200（フアルマシア社
製）にてゲル過に付し、液について波長
280nmでの吸光度を測定して蛋白質濃度を測り、
単量体含有量を算出した。

【表】 上記結果から明らかなように、本発明方法でえ
られる免疫グロブリンは、対照品に比べて単量体
含有量がはるかに高く、またその凍結乾燥品の溶
解性も良好であつて、凍結乾燥製剤に好適であ
る。また、電気泳動的純度、易動度、加温安定
性、抗体価において、対照品と差異が認められな
い。 本発明方法で製造される免疫グロブリンは、そ
のままの形で静脈内投与が可能であり、さらに、
このものをスルホ化、アルキル化、アシル化、β
−プロピオラクトン処理などによる従来公知の化
学処理免疫グロブリンの製造原料としても用いる
ことができ、それによつて従来品よりも単量体含
有量の高い化学処理免疫グロブリンをえることが
できる。 つぎに、前記実験で用いたものと同じ実施例１
および対照の免疫グロブリンについて、既知の方
法でスルホ化し〔増保ら；ホツクス・サイギニス
（Vox Sanguinis）、第32巻、175頁（1977）〕、そ
のスルホ化免疫グロブリンについて単量体含有量
および抗補体価を測定した。その結果を第２表に
示す。

【表】 上記実験結果に示されるように、本発明の製品
はすぐれたスルホ化免疫グロブリンを与える。 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが本発明はこれらに限定されるものでは
ない。 実施例 １ 人血漿に0.5w／ｖ％のｌ−アルギニン塩酸塩
を添加溶解させ、これにエタノールを8v／ｖ％
濃度まで加え、PH7.2、−３℃にて処理して沈殿
および上清をえる。この上清をPH6.8、−５℃
でエタノール濃度20v／ｖ％とし、免疫グロブリ
ンを含む沈殿＋とアルブミンを主成分とする
上清＋に分画する。この沈殿＋を、沈殿
重量に基づいて10w／ｗ％のｌ−アルギニン塩酸
塩を含む水溶液に溶解させたのち、PH7.2、−５℃
でエタノール濃度20v／ｖ％として、沈殿＋
ｗをえる。この沈殿＋ｗを、沈殿重量に基づ
いて10w／ｗ％のｌ−アルギニン塩酸塩を含む水
溶液に溶解し、PH5.2、−６℃にてエタノール濃度
17v／ｖ％として上清をえる。この上清を
過後、PH7.2、−５℃にてエタノール濃度25v／ｖ
％として沈殿をえる。この沈殿を10w／ｖ％
ｌ−アルギニン塩酸塩水溶液に溶解し、凍結乾燥
する。この乾燥粉末を精製水に溶かし、グリシ
ン、塩化ナトリウムなどを加え、無菌過後、小
分して凍結乾燥する。 かくしてえられた免疫グロブリンのゲル過分
析パターンを示すと第１図のとおりであり、多量
体含有量０％、二量体含有量1.4％、単量体含有
量98.6％であつた。 また、対照として、ｌ−アルギニン塩酸塩をま
つたく添加しない以外は上記とまつたく同様にし
てえられた免疫グロブリンのゲル過分析パター
ンは第２図のとおりであり、多量体含有量3.8
％、二量体含有量17.3％、単量体含有量78.9であ
つた。 実施例 ２ 低温アルコール分画法によりえられた沈殿＋
の画分を、沈殿重量に基づいて10w／ｗ％のｌ
−アルギニン塩酸塩を含む水溶液に溶解し、以下
実施例１と同様の操作により免疫グロブリンをえ
る。このものの単量体含有量は98.2％であつた。 実施例 ３ 人血漿に0.5w／ｖ％のｌ−アルギニン塩酸塩
を加えて溶解したのち、キストラー・ニツチマン
法により低温アルコール分画を行なう。各操作過
程においてｌ−アルギニン塩酸塩を存在させて分
画し、沈殿をえる。このものの単量体含有量は
98.8％であつた。 実施例 ４ 人血清に0.5w／ｖ％のｌ−アルギニン塩酸塩
を加えて溶解したのち、リバノール硫安分画法を
実施する。各操作の過程において、ｌ−アルギニ
ン塩酸塩を存在せしめて分画し、免疫グロブリン
の沈殿をえる。えられた沈殿を5w／ｖ％ｌ−ア
ルギニン塩酸塩水溶液に溶解後、透析して硫酸ア
ンモニウムを除去する。以下実施例１と同様にし
て免疫グロブリンをえる。このものの単量体含有
量は94.7％であつた。 実施例 ５ ｌ−アルギニン塩酸塩にかえて、ｌ−リジン塩
酸塩を用いた以外は実施例１と同様にして免疫グ
ロブリンをえる。このものの単量体含有量は94.3
％であつた。 実施例 ６ ｌ−アルギニン塩酸塩にかえて、ロイシンアミ
ド塩酸塩を用いた以外は実施例１と同様にして免
疫グロブリンをえる。このものの単量体含有量は
96.2％であつた。 実施例 ７ ｌ−アルギニン塩酸塩にかえて、グアニジン塩
酸塩を用いた以外は実施例１と同様にして免疫グ
ロブリンをえる。このものの単量体含有量は96.7
％であつた。 実施例 ８ ｌ−アルギニン塩酸塩にかえて、イミダゾール
塩酸塩を用いた以外は実施例１と同様にして沈殿
をえる。この沈殿についてｌ−アルギニン塩
酸塩を用いて実施例１と同様に処理して免疫グロ
ブリンをえる。このものの単量体含有量は93.2％
であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によりえられた免疫グロ
ブリンのゲル過分析パターンを示し、第２図は
従来方法によりえられ免疫グロブリンのゲル過
分析パターンを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫グロブリン含有材料より免疫グロブリン
   を分画採取する方法において、分画操作の過程に
   おける免疫グロブリン含有材料に解離指数pKbが
   ７以下の塩基性含窒素有機化合物の水溶性塩を、
   免疫グロブリン含有材料中の蛋白質重量に基づい
   て0.5〜600重量％の範囲で添加することを特徴と
   する単量体含有量の高い免疫グロブリンの製法。 ２ 塩基性含窒素有機化合物が、塩基性アミノ
   酸、中性アミノ酸のアミド誘導体またはその低級
   アルキルエステル、グアニジンまたはその誘導
   体、イミダゾールまたはその誘導体、グルコース
   のアミン誘導体および炭素数１〜４のアルキルア
   ミンから選ばれる１種または２種以上の組合わせ
   からなる前記第１項記載の製法。 ３ 塩基性含窒素有機化合物がアルギニンである
   前記第１項記載の製法。 ４ 塩基性含窒素有機化合物の使用量が、免疫グ
   ロブリン含有材料中の蛋白質重量に基づいて、５
   〜200重量％である前記第１項記載の製法。 ５ 塩基性含窒素有機化合物を、各分画操作毎に
   免疫グロブリン含有材料に添加する前記第１〜３
   項いずれか１つに記載の製法。