DK153865B - Fremgangsmaade til fremstilling af immunoglobulin, der er egnet til intravenoes injektion - Google Patents

Description

i

DK 153865 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde som angivet i krav 1's indledning til fremstilling af immunoglobulin, der er egnet til intravenøs injektion.

Eftersom immunoglobulin har antistof-aktivitet over 5 for mange pathogener, indgives det til patienter, som mangler forskellige antistoffer til at beskytte dem mod infektionssygdomme, eller til terapeutiske formål. Immu-noglobulinpræparater er blevet udviklet i to typer, den ene til intravenøs injektion og den anden til intramus-10 kulær injektion, og begge er i udbredt klinisk anvendelse.

De kendte fremgangsmåder til fremstilling af typen til intravenøs indgivning inkluderer en fremgangsmåde, hvorved råt immunoglobulin behandles med proteaser, såsom pepsin og plasmin, en fremgangsmåde, hvorved der anvendes 15 kemisk modificering af immunoglobulin ved acylering og andre kemiske midler, og en fremgangsmåde, hvorved der anvendes fraktionering af plasma eller af Cohn's plasma-fraktioner under anvendelse af polyethylenglycol, "Pluronic"®(polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer) 20 eller lignende.

I det immunoglobulin til intravenøs indgivning, som opnås ved fremgangsmåden under anvendelse af pepsinbehandling, er 75 IgG blevet omdannet til FCab'^ ved pepsins fordø-jende virkning, og dette er ufordelagtigt ved at have me-25 get kort halveringslevetid in vivo. Ved fremgangsmåden under anvendelse af plasminbehandling forbliver ganske vist 60-70% af immunoglobulinet i form af normalt immunoglobulin, men resten er blevet omdannet til lavmolekylære stoffer, som nedsætter produktets halveringslevetid in 30 vivo som det er tilfældet ved pepsinbehandling. I tilfælde af kemisk modificering er der mulighed for at udvikle frisk 2

DK 153865 B

antigenicitet afhængigt af typen af modificerende radikal og andre betingelser, hvilket medfører et sikkerhedsproblem, når det modificerede immunoglobulin skal indgives gentagne gange.

5 Fraktioneringen med polyethylenglycol eller "P1 u r o n i c’V^ anses almindeligvis for at være den mest ønskelige måde at udvinde immunoglobulinet i den form, hvori det findes i den levende krop, dvs. umodificeret og unedbrudt immunoglobulin. Proceduren er allerede blevet angivet i detaljer 10 af Polson eg Coval [japanske offentligt tilgængelige patentansøgninger nr. 44 814/1975, 91 321/1976 og 20 415/1978]. Den sidst nævnte japanske patentansøgning svarer til US patentskrift nr. 4 093 606, ifølge hvilket (a) en pasta, bestående af Cohn's fraktion II+III med 15 et proteinindhold på 25-30¾ eller fraktion II, suspenderes i vand til dannelse af et filtrat med lav ionstyrke og med en konduktivitet på omkring 300 x 10 ^ 5/cm ved pH 4,8-6,5 og et bundfald, (b) urenheder udfældes fraktionelt fra filtratet ved tilsætning af polyethylen-20 glycol til en koncentration på 4¾ (vægt/vol.) og derpå 5¾ (vægt/vol.), og (c) ί^-globulinet udfældes ved tilsætning af polyethylenglycol til en koncentration på 12¾ (vægt/vol.) ved en pH-værdi omkring 8,0, idet fremgangsmåden udføres ved en temperatur på 0-20 °C.

25 Fra DE offenliggørelsesskrift nr. 2 364 792 kendes en fremgangsmåde til rensning af &-globulin, hvorved man blander et Υ'-globulin-koncentrat med en ligekædet, langkædet, vandopløselig, uladet polymerforbindelse med en gennemsnitsmolekylvægt mellem 3000 og 20000 i 30 en vandig væske ved en pH-værdi mellem 4 og 5 og en temperatur mellem 4 og 30 °C i sådanne koncentrationer, at polymerforbindelsens opløsningshæmmende virkning svarer til en koncentration af polyethylenglycol med molekylvægt 6000 på mellem 4 og 4,8 g pr. 100 ml, idet 35 koncentrationen af ^-globulin i blandingen indstilles

DK 153865B

3 til mellem 3 og 8 uægt %, og man efter faseadskillelse fraskiller en uopløselig fraktion og udvinder en renset X'-globulin-fraktion fra den resterende vandige fase.

Imidlertid er det, når polyethylenglycol eller "Pluronic" 5 fraktioneringen udføres under sådanne kendte betingelser, ganske vist muligt at opnå et immunoglobulinpræparat, der ikke indeholder noget immunoglobulin af aggregat-type og er egnet til intravenøs injektion, men udbyttet er altid lavt. Derfor har man ivrigt ventet på en forbedring 10 i udbyttet.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det vist sig, at der i trinnet til fjernelse af aggregat-type-immunoglobu-linet ved tilsætning af en lav koncentration af polyethylenglycol eller en "Pluronic"® til det .rå immunoglo-15 bulinmateriale, samtidig fjernes ikke-aggregat-type- immunoglobulin. Endvidere har det vist sig,at når et immunoglobulinmateriale indeholdende en forholdsvis stor mængde aggregat-type-immunoglobulin fraktioneres med polyethylenglycol eller en "Pluronic"®, bliver tabet af·ikke-20 aggregat-type-immunoglobulin også stort. Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at udbyttet af ikke-aggregat-type-immunoglobulin forbedres bemærkelsesværdigt ved behandling af det rå immunoglobulinmateriale med en syre for at dissociere aggregat-type-immunoglobulinet og efterfølgende 25 fraktionering af materialet med polyethylenglycol eller en polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer.

I overensstemmelse hermed er det opfindelsens formål at angive en fremgangsmåde til fremstilling af et immunoglobulin, som er egnet til intravenøs injektion, i højt 30 udbytte ud fra plasma eller Cohn's fraktion I+II+III, fraktion II+III, fraktion II eller fraktion III opnået ved at udsætte plasma for Cohn's kold-alkohol-fraktione-ring.

*" DK 153865 B

4

Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte .

Det plasma, der anvendes som udgangsmateriale ved frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen, stammer fortrinsvis fra menneskeblod i betragtning af problemet med antigenici- tet. Cohn's plasmafraktioner I+II+III, II+III, II og III er i det væsentlige a-, |3- og ^globulin (IgG, IgA, IgM). Plasma-iT-globulin-fraktionen opnås ved kontinuert fæld-10 ning med koldt ethanol som beskrevet i detaljer i Journal of Clinical Investigation, 23, 417 (1944) og Journal of the American Chemical Society, 6J3, 479 (1946).

Syrebehandlingen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved at holde udgangsmaterialet under sure betingelser. Ved denne behandling dissocieres aggregat-type-immunoglobulinet i råmaterialet først i en ikke-aggregat-type. De sure betingelser er pH 3,2-4,2, fortrinsvis 3,8-4,2, og en ionstyrke på 0,002-0,30, fortrinsvis 0,10-0,20. Andre pH-betingelser er ikke ønskelige, fordi der, hvis pH er under 3,2, vil finde denaturering af proteinet sted, medens den nævnte dissociation af aggregat-type-immunoglobulinet, hvis pH er over 4,'2, bliver utilstrækkelig. Koncentrationen af protein er ikke kritisk, men er fortrinsvis 2-10 vægt/vol.%, fordi den er let at arbejde med. Temperaturen ved syrebehandlingen er 4-15 °C.

25 Andre temperaturer er ikke ønskelige, fordi den førnævnte dissociation, hvis temperaturen er under 4 °C, vil være utilstrækkelig, medens der, hvis temperaturen overskrider 15 °C, vil finde nedbrydning af proteinet sted. Varigheden af syrebehandlingen er 30-180 minutter. Hvis behandlingens 30 varighed er kortere end 30 minutter, bliver den førnævnte dissociation utilstrækkelig, medens for lang en varighed af behandlingen er spild af tid og endog somme tider giver ugunstige resultater. Syrer, der kan anvendes til behandlingen, inkluderer uorganiske syrer, såsom saltsyre 5

DK 153865 B

og phosphorsyre, og organiske syrer, såsom eddikesyre og citronsyre.

Efter den ovenfor beskrevne syrebehandling gennemføres en fraktionering ved anvendelse af en alkylenoxidpolymer 5 eller -copolymer med en molekylvægt på 2 000 - 20 000 til opnåelse af et meget rent immunoglobulin af ikke-aggregat-type i højt udbytte. Alkylengruppen i den alkylenoxidpolymer, der anvendes ved fraktioneringen, kan indeholde 1-4 carbonatomer, såsom methylen, ethylen, propylen eller 10 butylen. Alkylenoxidcopolymererne inkluderer copolymere af to eller flere alkylenoxider, såsom polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer.

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at pH-betingelserne ved fraktioneringen under anvendelse af en alkylenoxid-15 polymer eller -copolymer med en molekylvægt på 2 000 - 20 000 er en meget vigtig faktor, og udbyttet og renheden af immunoglobulinet forbedres kun udpræget i et meget begrænset pH-område på 4,8-5,4, fortrinsvis 4,8-5,2.- Dette påvises også klart ved de forsøgsresultater (tabel 1), der 20 er opnået ved opløsning af en fraktion II+III pasta i o,6% vandig natriumchloridopløsning til en proteinkoncentration på 5%, behandling af den resulterende opløsning med en syre ved pH 3,5 og 10 °C i 60 minutter, fraktionering af opløsningen med polyethylenglycol (i 5% koncentration) 25 ved forskellige pH-værdier i området 4,0-6,0 og bestemmelse af udbyttet og renheden af det opnåede immunoglobulin af ikke-aggregat-type.

.DK 153865 B

6

Tabøl 1 - pH-betingelser ved polyethylenglycol- fraktionering.

pH IgG udvinding, % IgG renhed, % 4,1 60 35 4,3 58 60 5.0 70 98 5,5 45 95 6.0 10 93 Når der anvendes en polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer med en gennemsnitsmolekylvægt på 15 000 i stedet for polyethylenglycolen, opnås også et højere udbytte og en højere renhed af ikke-aggregat-type-5 immunoglobulinet under de ovenstående pH-betingelser end under andre pH-betingelser.

Den ovennævnte polymer eller copolymer sættes til udgangsmaterialet til en koncentration på 4,5-5,5 vægt/vol.%, fortrinsvis 5 vægt/vol.?i, og de udfældede urenheder, f.eks.

10 aggregat-type-immunoglobulin, fjernes på konventionel måde, f.eks. ved centrifugering (1000-5000 omdr./min.). Til den således fraktionerede supernatant sættes yderligere den ovenstående polymer eller copolymer til en koncentration på 6-13 vægt/vol.?0. Ved indstilling af pH-værdien til 15 8,0-9,0 udfældes det ønskede ikke-aggregat-type-immuno globulin og kan udvindes på konventionel måde, f.eks. ved centrifugering (1000-5000 omdr./min.). Udvindingen af det ønskede produkt under de ovenstående betingelser er 60¾ eller mere. Det dannede bundfald opløses igen, f.eks. i 20 fysiologisk saltopløsning eller en 0,02 M acetatpufferop løsning blandet med 0,6¾ natriumchlorid, 2¾ mannitol og 1¾ albumin, og den resulterende opløsning sendes igennem et bakteriefilter til opnåelse af en immunoglobulinopløs-

DK 153865B

7 ning, som er egnet til intravenøs klinisk brug. Immuno-globulinet i denne opløsning udviser ingen ændring i egenskaber efter udmåling af opløsningen i små portioner i ampuller og lyophilisering. Således kan produk-5 tet, når det er beregnet til langtidsopbevaring, brin ges i form af et lyophiliseret præparat.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede immunoglobulin indeholder i det væsentlige intet immunoglobulin af aggregat-type, og den antikomplementære ak-10 tivitet er mindre end 20 enheder, prøvet på en opløsning med en koncentration på 5 %, idet renheden som IgG er 90% eller derover.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler. I disse eksempler blev udvin-15 dingen af immunoglobulin bestemt ved enkelt immuno diffusion og renheden ved elektrophorese under anvendelse af en celluloseacetatmembran. Den antikomplementære aktivitet blev prøvet ved den metode, som er angivet af Kobat and Mayer [Experimental Immunochemistry, side 225 (1961)] 20 og den metode, som er angivet af Nishioka and Okada ["Bio chemistry of Immunity", side 103 (1971), Kyoritsu Publishing Company] .

EKSEMPEL 1

En Cohn's fraktion II+III pasta (1 kg) opnået ved kold-25 alkohol-fraktioneringen, blev opløst i 10 liter af en 0,6/ό vandig natriumchloridopløsning. Opløsningen blev indstillet til pH 3,8 med IN saltsyre og omrørt ved 4 °C i 60 minutter for at frembringe syrebehandling. Til opløsningen sattes 500 g polyethylenglycol (gennemsnits-30 molekylvægt 4000). Medens polyethylenglycolen fik lov at opløses, blev opløsningens pH-værdi gradvis forøget med IN vandig natriumhydroxidopløsning. Så snart pH-værdien

DK 153865 B

s nåede 5,0, blev· bundfaldet fjernet ved centrifugering (4000 omdr./min.) til opnåelse af en klar supernatant. Udvindingen af IgG i supernatanten var 85% baseret på II+III fraktionen, og renheden af IgG var 97%. Til su-5 pernatanten sattes endnu 500 g polyethylenglycol (mole kylvægt 4000). Under forsigtigt omrøring blev supernatanten indstillet til pH 8,5 med IN vandig natriumhydroxid-opløsning. Immunoglobulinet, der udfældedes under de ovenstående betingelser, blev udvundet ved centrifugering 10. (4000 omdr./min.). Det endelige udbytte af IgG fra udgangsmaterialet var 84%. Renheden var 95 %.

Hele det udvundne bundfald blev opløst i en 0,02 M acetatpufferopløsning (pH 6,6) indeholdende 1% humant albumin, og under anvendelse af det samme opløsnings-15 middel blev koncentrationen indstillet til 5%. Opløs ningen blev steriliseret ved at sendes igennem et "Millipore"-filter (Millipore Co.) og aseptisk udmålt i små beholdere. Halvdelen af den udmålte væske blev øjeblikkeligt lyophiliseret til opnåelse af et tørt 20 præparat. De antikomplementære aktiviteter (ved en proteinkoncentration på 5%) af væskepræparatet og opløsningen af lyophiliseret præparat fandtes at være henholdsvis 14 og 16.

En 5% opløsning blev indgivet til fem mus med en legems-25 vægt på ca. 20 g i en dosis på 1 ml pr. mus. Der blev ikke iagttaget hverken fald i legemsvægt eller nogen anomali i Piloerection under en observationsperiode på en uge. Det lyophiliserede præparat blev prøvet efter et års opbevaring ved 4 °C, men der blev ikke iagttaget nogen ændring 30 i opløselighed og antikomplementær aktivitet sammenlignet med det oprindelige præparat.

9

DK 153865 B

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL

Når 1 kg pasta af Cohn's fraktion II+III blev behandlet ifølge eksempel 1 i US patentskrift nr. 4 093 606, dvs. opløsning i destilleret vand ved 5 °C under sænkning 3 af pH-værdien til 5,8 ved tilsætning af 20 ml 10% eddikesyreopløsning, tilsætning af polyethylenglycol (PEG) med en gennemsnitsmolekylvægt på 4000 til en koncentration på 4% (vægt/vol.) og frafiltrering af bundfaldet efter 1-2 timers henstand, forøgelse af PEG-koncentra-10 tionen til 5% (vægt/vol.) og frafiltrering af bundfaldet efter en ellerflere timers henstand, og endelig indstilling af pH-værdien til 8 ved tilsætning af 5% "Tris"-opløs-ning og udfældning af tø'-globulinet ved tilsætning af PEG til en koncentration på 12% (vægt/vol.), var udbyttet 15 af ^-globulin fra udgangsmaterialet 63% med en renhed på 95%.

EKSEMPEL 2

En Cohn's fraktion II pasta (500 g) opnået ved kold-ethanol-fraktioneringen blev opløst i 10 liter af en 20 0,1% natriumchloridopløsning. Immunoglobulin uden ind hold af aggregat-type blev udvundet fra opløsningen på lignende måde som i eksempel 1. Udbyttet med hensyn til IgG var 80% i modsætning til 62%, når syrebehandlingen (pH 3,8) blev udeladt. Renheden var 97%.

25 På lignende måde som i eksempel 1 blev det opnåede immunoglobulin opløst i en 0,5% natriumopløsning til en protein-koncentration på 5%. Efter tilsætning af 1% mannitol blev opløsningen sendt igennem et bakteriefilter og lyophili-seret. Det lyophiliserede præparat blev opløst i destil-30 leret vand til injektion til en proteinkoncentration på 5%. Den antikomplementære aktivitet ved denne koncentration fandtes at være 13.

DK 153865B

10 EKSEMPEL 3

Proceduren fra eksempel 1 blev gentaget, undtagen at poly-ethylenglycolen (gennemsnitsmolekylvægt 4000) blev erstattet med den samme mængde af en polyoxyethylen-poly-5 oxypropylen-copolymer (gennemsnitsmolekylvægt 15 000).

Immunoglobulinet blev udvundet med de samme resultater som i eksempel 1.

t

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af immunoglobulin, der er egnet til intravenøs injektion, hvorved (a) plasma eller Cohn's fraktion I+II+III, fraktion II+III, fraktion 5 II eller fraktion III, opnået ved at udsætte plasma for Cohn's kold-alkohol-fraktionering, tilsættes ~n alkylenoxidpolymer eller -copolymer med en molekylvægt på 2000- 20000 til en koncentration på 4,5-5,5 vægt/vol.?i, (b) aggregat-type-immunoglobulin fjernes som bundfald, 10 og (c) supernatanten fra trin (b) ved pH 8,0-9,0 tilsættes mere af den nævnte polymer eller copolymer til en koncentration på 6-13 vægt/vol.%, 0g der som bundfald udvindes et ikke-aggregat-type-immunoglobulin, som i det væsentlige ikke indeholder noget aggregat-type-immuno-15 globulin, kendetegnet ved, at plasmaet eller Cohn-fraktionerne inden trin (a) behandles med en syre ved pH 3,2-4,2 og en ionstyrke på 0,002-0,30 ved en temperatur på 4-15 °C i 30-180 minutter, og at trin (a) udføres ved pH 4,8-5,4.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinkoncentrationen ved syrebehandlingen er 2-10 vægt/vol.%.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte syre er saltsyre, phosphorsyre, 25 eddikesyre eller citronsyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaet stammer fra menneskeblod. DK 153865B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en alkylenoxidpolymer, som indeholder methylen-, ethylen-, propylen- eller butylengrupper.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at der anvendes en alkylenoxidcopolymer bestående af en polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer.