JP2001521544A

JP2001521544A - 免疫グロブリン含有組成物

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Publication number: JP2001521544A
Application number: JP54520598A
Authority: JP
Inventors: ロナルドヴァンスマッキントッシュ; アンギリアンウェルチ
Original assignee: コモンサーヴィシスエージェンシー
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 2001-11-06
Also published as: TW520290B; WO1998042376A9; AU6414498A; WO1998042376A1; DE69821741D1; CA2283965A1; US6485932B1; DE69821741T2; EP0967995A1; EP0967995B1; GB9705810D0; ATE259656T1; ES2215294T3

Abstract

(57)【要約】本発明は静脈内投与のための、免疫グロブリンの水性溶液を含む液体組成物およびその調製に関する。本液体組成物は、４℃から25℃の範囲の温度で長期間の保存の間に免疫グロブリンが本質的に凝集せず分解もせず、かつ抗−補体活性、PKA活性およびカリクレイン活性の許容できるレベルを維持するように保存に際して安定であるように製剤される。

Description

【発明の詳細な説明】免疫グロブリン含有組成物本発明は免疫グロブリンの水性溶液を含む、静脈内投与のための液体組成物に関する。この免疫グロブリンは一般にはヒトの血漿由来の免疫グロブリンG(IgG) である。静脈内インフュージョンのための免疫グロブリンはここ数年臨床用に使用されてきた。製品は凍結乾燥製剤またはある場合には静脈注射可能な液体製剤として入手可能である。例えば５gの免疫グロブリンの入ったバイアルとして与えられた乾燥製剤は使用前に注射可能な溶液に再構成されなければならず、１日あたり１ｇ／（体重kg）までの用量がいくつかの臨床応用に推奨されている。そのような高用量は注射可能な製剤に再構成すべき多数のバイアルを必要とし、それは不便であり時間の浪費である。従って、すぐに使用できる注射可能製剤の開発は非常な利点がある。しかしながら、そのような液体製剤は長期間の保存に安定であることが必要とされる。従来、IgGは血漿からエタノール分画法を用いて単離されている。この方法には、今も主として米国で使用されているCohn-Oncley原法および主にヨーロッパで使用されている、種々の変法が含まれる(エタノール分画法の総説については、Kistler P.とFriedli H.のMethods of Plasma Protein Fractionation中のEth anol Precipitation，J.M．Curling編集，Academic Press，inc.，New York，19 80を参照せよ)。エタノールの不利益、すなわち、タンパク質を変性させる可能性は、低い処理温度を使用することにより相殺され、それゆえこれらの方法は一般に「低温エタノール分画法」と称される。低温エタノール分画法は、慣習的に画分として知られる異なる沈殿へのタンパク質の選択的分離を達成するために、すべて５つの変数、すなわち、エタノール濃度、ｐＨ、イオン強度、温度およびタンパク質濃度に依存している。画分IIはヒト血漿の低温エタノール分画において主要な免疫グロブリン含有沈殿である。ある場合には免疫グロブリンの筋肉内投与のための調製物は画分IIから製剤化されてきた。しかしながら、これらの調製物の静脈内インフュージョンはアナフィラキシスに似た重大な有害反応（すなわち、心血管虚脱および気管支痙攣）を受容者に引き起こすことが分かった(Immunoglobulins:Characteristics and u ses of intravenous preparations，Alving B.M.とFinlayson J.S.編集，US Dep t．of Health and Human Sciences Publication No.(FDA)-80-9005，1979を参照せよ)。これらの重大な有害作用は現在では主としてIgG分子の凝集物の存在および、画分IIにおけるプレ-カリクレイン活性化因子(PKA)およびカリクレインのような血管作用血漿酵素の痕跡量のコンタミネーションによって引き起こされることが知られている。凝集した免疫グロブリンは血漿タンパク質の補体群に結合し活性化することができ(いわゆる「抗−補体活性」)、補体系の活性化はアナフィラトキシンである補体ペプチドC5aおよびC3aの生成を生じさせる。PKAおよびカリクレインを生理学的に有意な量で投与すると重大な高血圧発症および心血管虚脱を引き起こし得ることも知られている。従って、静脈内インフュージョンのための免疫グロブリン製剤の調製において、上述の問題に注意を払う必要がある。この問題を解決するために多くのアプローチがとられてきた。それらには、凝集物形成を避けるための画分IIの処理の改変；画分IIから凝集物および他の血漿タンパク質のコンタミネーションを除くための免疫グロブリンのさらなる精製、および一切の凝集物および残存PKAおよびカリクレインを解離させるための、画分IIからの免疫グロブリンのペプシンのようなタンパク質分解酵素の極めて低濃度における処理が含まれる。(静脈内インフュージョンのための免疫グロブリンの作製に関する総説については、Lundblad J.L.とSchroeder D.D.によるMethods for the Production of IVIG Preparatio ns and Analysis of IVIG Preparations Available，Clinical applications of intravenous immunoglobulin therapy，P.L．Yap編集、Churchill Livingstone Inc.，New York，1992を参照せよ)。このような方法でのペプシンの使用は比較的低いｐＨ、例えば4.0で最適化されることが分かってきた。さらに、そのような低いｐＨ処理は効果的なウイルス不活化手順であることもよく知られている(R eid，K.G.ら、Vox Sang．55 p75-80，1988，Potential contribution of mild p epsin treatment at pH 4 to the viral safety of human immunoglobulin prod ucts参照)。実際、静脈内インフュージョンのためのヒト免疫グロブリンの調製物は、特に分子サイズ分布、抗−補体活性、PKAに関するガイドラインを詳しく述べており、調製方法が既知の感染性因子を不活化することが知られているステップを含むことを詳しく述べている欧州薬局方委員会(EUropean Pharmacopoeia Comission) が推奨しているようなある基準を満たすことが要求されている(欧州薬局方、第３版、1996年６月発行、1997年１月１日の第２版の差替、モノグラフ号数1997:0 918、Human Normal Immunoglobulin for INtravenous Aministrationを参照せよ )。現在市場にある静脈内インフュージョン用のヒト免疫グロブリン製品の大多数は輸送および保存上の安定性を与えるために凍結乾燥調製品の形である。これらの調製物は使用する前に再構成されなければならず、それは前述したように不便であり時間の浪費であろう。加えて、静脈内インフュージョンのための免疫グロブリンの液体組成物も人手可能である。米国特許第4,499,073号(Cutter Laboratories Inc.)にはｐＨが3.5〜5.0の範囲であることが要求されるヒト免疫グロブリンの静脈内注射可能溶液の作製が記載されている。さらに、イオン強度が低いレベル特に0.001より低く低下させることが必要とされている。この範囲にｐＨおよび低イオン強度を保つことは、分子サイズ分布および抗−補体活性のような基準を満足しつつこの液体製剤の長期保存性に必須であるとされている。ヒト免疫グロブリンの安定な液体製剤の作製のための別の提案はWO95/22990(T he Green Cross Corporation)に含まれており、5.5の領域のｐＨと１mmho未満の低電気伝導度とを必要とするものである。米国特許第4,499,073号に記載の提案は、E.J．Cohnら(J．Am．Chem．Soc．68: 459-475，1946)、およびL.J．Oncleyら（J．Am．Chem．Soc．71;541-550，1949 ）に最初に記載された方法を用いて作製された画分IIまたは画分III濾過物（上清III）の処理に関するものである。しかしながら、これらの条件は他の低温エタノール分画法に由来する安定なIgG溶液の作製には適していないようである。この文献に記載されているｐＨ条件および低イオン強度は出願人が使用した低温エタノール分画法によって調製した免疫グロブリンに適用すると安定な産物を形成しない。種々の改変低温エタノール分画法が広く、特にヨーロッパで使用されているため、先行技術で適しているとして教示されている以外の出発材料に由来する安定なIgG溶液に対する必要性が存在する。ここで驚くべきことに、先行技術に教示されるものと全く異なるｐＨおよびイオン強度を使用し、免疫グロブリン調製物をペプシンのような酵素で処理することを更に含む条件を使用することにより、安定な静脈内注射可能な免疫グロブリン溶液が得られることがあるということが発見された。従って、本発明は製薬的に許容できる水性担体中の免疫グロブリン溶液を含み、その溶液は5.0から5.8の範囲のｐＨおよび0.02から0.25の範囲のイオン強度を有し、免疫グロブリンがペプシン処理を受けたものである、静脈内投与のための液体組成物を提供する。イオン強度は0.04〜0.25の範囲であってよい。イオン強度（Ｉ）は溶液中のイオンの濃度（ｃ）にイオン価（ｚ）の２乗を掛けて得られる項の総和の半分、すなわち、Ｉ=¹/₂Σc*z²である。例えば、60mM NaClのイオン強度は以下のように計算される。¹/₂[(0.06×1²)+(0.06×1²)]=0.06 本発明によって調製される免疫グロブリンの溶液はおよそ４mmhoから20mmhoを越える伝導度を有しているとして測定されている。水性担体は、この組成物中の他の成分と共存可能で患者に害を与えないという意味で「製薬的に許容」できなければならない。本発明の液体組成物は凍結乾燥されていないという利点を有する。従って、本液体組成物は使用前に再構成される必要がない。免疫グロブリンの化学修飾は必要ではなく、画分IIの更なる追加の精製も必要としない。有利なことに、本発明の液体組成物の製剤化は保存に際して安定な組成物を生じさせることが分かった。保存の際に安定であるということは、4℃から25℃の範囲の温度にて長期間の保存の間、免疫グロブリンが本質的に凝集せず、分解もせず、許容できるレベルの抗−補体活性、PKA活性およびカリクレイン活性を維持していることを意味すると解される。長期間とは25℃にて、12週間、好ましくは26週間および最も好ましくは52週間；また4℃にて、６ヶ月、好ましくは12ヶ月、および最も好ましくは24ヶ月を意味すると解される。組成物が本質的に凝集しないとは、調製物中に存在するIgG二量体よりも大きな分子サイズのものが、調製物の免疫グロブリン成分の2.5％から３％を越えて増加しないことを意味すると解される。組成物が本質的に分解しないとは、調製物中に存在するIgGモノマーよりも小さな分子サイズを有するものが調製物の５％から７％以下であることを意味すると解される。加えて、本組成物は初期抗体機能（例えば、抗−風疹ウイルス活性）が50％を越えて残存しているならば、許容できる分解レベルを示したとみなされる。抗−補体活性の許容できるレベルとは、補体の消費が50％（免疫グロブリンのmgあたり１CH₅₀；定義については、本明細書のプロトコルＢを参照せよ）よりも高くないレベルを言う。PKAおよびカリクレインの許容できるレベルとは、30g/Lの免疫グロブリンを含む溶液中でそれぞれmlあたり35iu以下、mlあたり0.05iu未満である。分子サイズ分布、抗−補体活性、PKA／カリクレイン活性および抗風疹ウイルス活性のテストは以下のプロトコルＡ〜Ｄに記載されている。上述した安定特性を示した液体組成物は、静脈内フュージョンのために適した免疫グロブリン製剤に関する（欧州薬局方中の、前に言及したような）ある基準を満たす可能性があるだろう。凝集、抗−補体活性、PKA/カリクレイン含量および抗体機能の許容できるレベルに関する上記の要求に従って、好ましくは本液体組成物のｐＨはｐＨ5.25〜5. 75の範囲でありイオン強度は0.04〜0.18の範囲、より好ましくは0.03〜0.18の範囲である。本明細書で明らかにした組成物の製剤のペプシン処理は、画分II材料の更なる精製または修飾を用いることのいかなる必要性をも除去する。本液体組成物は残存ペプシンを含んでいるかもしれないが、必要であればこれを除去することができる。加えて、低いｐＨ、例えばｐＨ４でのペプシン処理はウイルス不活化ステップとして特に有効である。本組成物の免疫グロブリンは好ましくはIgGであるが、他の免疫グロブリン、例えばIgAおよび／またはIgMを全免疫グロブリン含量の５重量％のレベルまで含んでいてよい。しかしながら、特定の使用に適した組成物はIgAおよび／またはIgMを必要なものとして含んでいることがある。本液体組成物の免疫グロブリンはどんな適切な方法で得られてもよい。例えば、免疫グロブリンは前述したCohn-Oncley低温エタノール分画法、または図１に記載したような改変低温エタノール分画法によって調製されてよい。免疫グロブリンは画分II沈殿物として、または分画過程の上清として（例えば、上清IIIまたはＩおよびIII）得られることがある。画分II沈殿物は、溶解、残存エタノール夾雑物の除去、ペプシン処理および静脈内投与のために適した液体組成物への製剤化に先だって凍結および保存されてもよい。再溶解した画分II（または上清ＩおよびIII）中のエタノール夾雑物は、例えば、低ｐＨにて適切なバッファーに対して溶液をダイアフィルトレーション(diafiltration)することにより除去されてよい。適切なバッファーは例えば、0.45％ NaCl、１％シュークロース、および200〜400ml 1M HCl/kgタンパク質を含む。あるいは、例えば、エタノール夾雑物は凍結乾燥によって除去されてよく、その乾燥固体は再溶解され、塩酸のような適切な滴定液を用いて低ｐＨに調整されてよい。一般には、エタノール夾雑物が除去された免疫グロブリン溶液のｐＨについていえば、その範囲は3.9〜4.5であり、好ましくは3.9〜4.1であり、残存エタノール夾雑物は10mg/(タンパク質g)未満である。免疫グロブリンを含む溶液は(例えば限外濾過により)全タンパク質の８〜12％ w/wにまで濃縮されることがあり、炭水化物（例えばグルコース、マルトースまたはシュークロース）のような適切な安定化剤が、タンパク質１部に対して安定化剤１部（w/w）からタンパク質１部に対して安定化剤２部(w/w)の濃度で添加されてよい。例えば、グルコース対タンパク質１：１(w/w)、マルトース対タンパク質1.5：１または２：１、シュークロース対タンパク質1.5:1または２：１。アミノ酸（例えばグリシン）のような他の安定化剤もこの段階で100mg/gタンパク質に至る濃度まで添加されてよい。次に、免疫グロブリンモノマーの凝集物形成を低減させるため；抗補体活性を低下させるためおよびPKAおよびカリクレイン活性のレベルを減少させるために少量のペプシンと共にインキュベーションが行われる。好ましくは、ペプシンは 10〜150μg/（全タンパク質g）の範囲で添加され、より好ましくは25〜100μg/ （全タンパク質g）の範囲である。次に、免疫グロブリン溶液は、20℃〜37℃の適切な範囲、好ましくは20℃〜35℃にて、１時間から72時間の範囲の適切な時間、好ましくは20〜24時間インキュベーションされる。インキュベーション後免疫グロブリン溶液のｐＨは適切な滴定液、例えば水酸化ナトリウムを用いてｐＨ5.0から5.5に調整される。好ましくはｐＨはｐＨ5.25 から5.75の間に調整される。この溶液のタンパク質濃度は、溶液のイオン強度が 0.02から0.25になるような適切な濃度の塩溶液を用いて希釈することにより２〜 10％(w/w)、好ましくは４〜６％(w/w)に調整されてよい。好ましくはイオン強度は0.03から0.18の間に調整される。アミノ酸（例えばグリシン）のような他の安定化剤が組成物に前に添加されていない場合(上記を参照)、それらはこの段階で 100mg/(gタンパク質)までの濃度で含めることができる。製剤化された免疫グロブリン溶液は次に濾過され可能性のあるいかなるバクテリアのコンタミネーションをも除去され、製薬的に許容できる容器に無菌的に分注される。従って、保存について安定であり、血漿の低温エタノール分画法によって調製した免疫グロブリンの製薬的に許容できる水性担体中の溶液を含み、免疫グロブリンが最終容器中で凍結乾燥される必要のない、静脈内投与のための液体組成物がここに提供される。本発明の実施態様は以下の実施例の項を参照することにより、例によって更に説明されるであろう。実施例実施例１：出発材料としての免疫グロブリンの入手手順免疫グロブリン（画分II）はヒトの血漿から低温エタノール分画法によって一般に調製した。画分II調製のための製造アプローチの例を図１に概説した。図１において、画分IIは、Hinkら(Vox Sang．2:174-186，1957)の画分IIとII沈殿条件を用いて単離した画分I、IIおよびIIIの合わさった沈殿物からVogelaarら(Vox Sang．27:193-206，1974)の変法を用いて単離される。混合画分I、I IおよびIII沈殿物を調製する技法はKistlerとNitschmann(Vox Sang．7:414-424 ，1962)によっても記載されている。実施例２：静脈内インフュージョンのための免疫グロブリン液体組成物の調製上記のように調製した、または他の一切の適切な方法によって調製した免疫グロブリン（画分II）を滅菌蒸留水に4℃にて再溶解した(3.5L/kgペースト)。生じた溶液を次に濾過により透明にし(0.45μmポアサイズフィルター)、エタノール除去し(エタノール<10mg/gまで)、少なくとも４倍容の0.45％ NaCl、１％シュークロースおよび310ml-320ml、1M HCl/kgタンパク質に対するダイアフィルトレーションによってpH調整（ｐＨを4.0±0.1に）した。溶液は最終的に８〜12％全タンパク質にまで限外濾過により濃縮した。次にタンパク質溶液を安定化剤(タンパク質１部に対してシュークロース２部、w/w)と共に製剤化し少量のペプシン（0.025-0.1mgペプシン/gタンパク質）を添加した。このペプシン含有溶液を濾過し(0.45μmポアサイズフィルター)35℃ にて21時間インキュベーションした。インキュベーションに続いて、溶液のｐＨを0.25MのNaOHを用いてｐＨ5.0〜5. 8に調整した。溶液のタンパク質濃度を４から６％に調整しNaCl濃度を60mMに調整した。最終的な製剤化免疫グロブリン液体組成物を濾過滅菌し、適切な容器に無菌的に分注した。実施例３：アミノ酸（グリシン）を追加安定化剤として製剤化された静脈内インフュージョンのための免疫グロブリン液体組成物静脈内投与に適した免疫グロブリン組成物を実施例２のように調製たが、ペプシン処理およびインキュベーションに先立ち、スクロースを含む溶液製剤に加えて安定化剤として50mg/gのグリシンを含ませた。実施例４：静脈内インフュージョンのための免疫グロブリン液体免疫組成物の安定性種々の組成の液体免疫グロブリンの多数のバッチ（実施例２および３に記載のものを含む）を調製し、種々のｐＨ値で製剤化した。これらの組成物を種々の温度にて種々の長さの時間の保存に伴う安定性に関してテストした。このテストは以下に記載したテストプロトコルＡからＤに従って行った。安定性に関する基準は以下の様に定義した：凝集：調製物中に存在するIgG二量体よりも大きな分子サイズを有するものが調製物の免疫グロブリン成分中に2.5％を越えて増加しない。分解：調製物中にIgG単量体よりも小さな分子サイズを有する調製物のタンパク質成分が５％を越えて存在しない。抗体機能：組成物の調製時の初期レベルに比較して50％以上の抗体活性（例えば抗風疹ウイルス）が残存している。抗−補体活性：補体の消費が50％（免疫グロブリンのmgあたり１CH₅₀；定義については面明細書中のプロトコルＢを参照せよ。）より大きくないPKA 活性： 30g/L免疫グロブリンの溶液中に35iu/mLより高いPKA活性がない。カリクレイン活性： 30g/L溶液中に0.05iu/mL未満のカリクレイン活性である。この系列の実験の結果を表１〜８に示す。結果は表示した基準について示した時間と温度で安定なバッチ数として提示する。表示した基準について示した時間と温度でテストしたバッチ数はカッコ内に示した。例えば、37℃にて４週間の分解／抗体機能に対する「１(４)」の記載は37℃にて４週間の保存後にテストした４つのうち１バッチが分解および抗体機能について上述した安定性基準を満たしたことを意味する。また表１〜８中で影をつけた欄は本発明によって調製した液体組成物、すなわち、ｐＨが5.0〜5.8、イオン強度0.02〜0.25でペプシン処理を受けた組成物、にかかわるデータに関する。本発明によらずに調製された免疫グロブリン組成物に関するデータで比較のために示したものは影を付けない欄にある。この結果からの結論は以下のとおり：実験Ｉ(表１)：５％w/v免疫グロブリン(0.1mg/gでペプシン処理)；10％シュークロース；60mM N aCl；pH4.05-6.02 本発明に従って、液体形態でpH5.25から5.5にて生成物を製剤化する場合、その生成物は4℃にて26週間より安定であり、25℃および37℃における実験的加速安定性(accelerated stability)をパスする。実験II(表２)：５％w/v免疫グロブリン(ペプシンで処理していない);10％w/vシュークロース；6 0mM NaCl；pH4.25-5.25 ペプシンの非存在下で、ｐＨ5.25またはそれ以下の液体製剤は上昇した温度における保存に際して凝集する。加えて、従前の研究からペプシンはPKAおよびカリクレインを低減させるのに必要であることが知られており、この実験のpH5.25 の製剤によって確かめられた。実験III(表３)：５％w/v免疫グロブリン(ペプシンで処理していない);10％w/vシュークロース；３〜９mM NaCl；pH4.50-5.0 免疫グロブリン組成物が低いｐＨおよび低イオン強度で製剤化される場合に、ペプシン無しであると、その生成物は高いPKAおよびカリクレインレベルを有し、それは25℃および４℃の保存で低下しない。この組成物は37℃の保存で凝集する。これらの製剤化条件は、液体製剤を長期間貯蔵するための安定性に必須であるとして米国特許第4,499,073号（Cutter Laboratories Inc.）に記載されたものの内である。この実験結果は、米国特許第4,499,073号に記載された条件は、出願人らが使用した低温エタノール分画法に従って調製した免疫グロブリンに適用すると安定な産物を形成しないことを示している。実験IV(表４)：５％w/v免疫グロブリン(0.1mg/gでペプシン処理したもの)；１０％w/vシュークロース；４−９mM NaCl；pH4.4-5.2 免疫グロブリン組成物を(ペプシン存在下で)低イオン強度にて製剤化すると、その生成物は４℃においてさえ断片化する傾向がある。実験Ｖ(表５)：５％w/v免疫グロブリン(0.025mg/gまたは0.05mg/gにてペプシン処理)：１０％w/ vシュークロース；60mM NaCl；pH5.25〜5.75 ペプシン濃度を0.025mg/（gタンパク質）まで低下させると、生成物は分解せず、PKAおよびカリクレインのレベルは十分制限内にある。すべてのバッチは上昇した温度でも凝集体を示さなかった。実験VI(表６)：５％w/v免疫グロブリン(0.1mg/gにてペプシン処理したもの)；10％w/vシュークロース；100および180mM NaCl；pH4.05-5.5 免疫グロブリン組成物（0.1mg/(gタンパク質)のペプシンで処理したもの）のイオン強度を約60mmolから180mmol NaClまで増加させると、生成物は上昇した温度で保存に際して一般に凝集する。実験VII(表７)：５％w/v免疫グロブリン(0.025〜0.1mg/gにてペプシン処理したもの)；10％w/vシュークロース：タンパク質のグラムあたり50mgのグリシン；30〜60mM NaCl；ｐＨ5.5 好ましい組成物はまた追加の安定化剤としてアミノ酸（例えばグリシン）と共に製剤化することもできる。実験VIII(表８)：５％w/v免疫グロブリン(0.025〜0.1mg/gにてペプシン処理したもの);7.5〜10％w /vマルトース；タンパク質ｇあたり50mgのグリシン；60mM NaCl；pH5.5 好ましい組成物はまた安定化剤としてマルトースと共に製剤化することもできる；好ましいマルトースの濃度は7.5〜10％w/vである。本発明によって、マルトースまたはシュークロースの存在下で5.0〜5.8の範囲のｐＨ、0.02〜0.25のイオン強度で、およびペプシン処理にかけて生成物を製剤化すると、この生成物は4℃にて26週間を越えて安定であり、25℃および37℃における実験的加速安定テストにパスする。テストした種々の組成物から得たデータに基づき、本明細書で前に明らかにした組成物（すなわち、5.0〜5.8の範囲のｐＨ、イオン強度0.02〜0.25およびペプシン処理にかけて製剤化したもの）は、許容できる凝集、分解、抗−補体活性、 PKA含量およびカリクレイン含量という点で安定であることが確定される。テストプロトコルＡ．分子サイズ分布免疫グロブリン生成物の分子サイズ分布は高性能液体クロマトグラフィーを用いてサイズ排除(size exclusion)によって測定する。生成物は7.8ｘ300mmの大きさのTSK G3000 SW-XLゲル濾過カラム（同じ材質のガードカラム(7.8ｘ40mm)を備えたもの）を用いてPye Unicamモジュラーシステムで解析する。サンプルは移動相中で５〜10g/Lに希釈され(0.2Mリン酸カリウムバッファーpH7.0)、0.45μm メンブレンを通して濾過し、20μLを注入する。タンパク質は0.4mL/分で溶出させ、280nmのUV吸収によって検出する。得られた軌跡はヨーロッパ薬局方に記載された基準に従って手動三角法(manual triangulation)によって解析する。凝集体(リテンション時間15〜18分)、二量体(18.5〜19.5分)、単量体（21.0〜 22.0分）および断片（単量体ピークの後、塩前線(salt front)の前に溶出する一切の物質）に対応するピーク面積を明らかにし、総溶出面積のパーセンテージとして定量する。Ｂ．抗−補体活性免疫グロブリン調製物による補体の自発的（抗原非依存性）活性化のレベルは、感作ヒツジ赤血球の固定量の補体による溶血の阻害の程度をFrommhagenとFind enberg(J．Immunol 89:336-343，1962)の方法に従って測定する。要約すると、一定量のモルモット補体をテストするサンプルの希釈列と共にインキュベーションする。ある時間インキュベーション後(37℃にて60分間)、各チューブに等量の感作ヒツジ赤血球を加え溶血の程度を測定することによってテストサンプルによって不活化された補体の量を測定する。50％の溶血が起こるテストサンプルの希釈は、50％の補体が消費された希釈でもある。サンプルのタンパク質濃度から、抗補体活性は１CH₅₀ユニット（10⁸個のヒツジ赤血球細胞の50％を溶解させるために必要な補体）を消費するために必要なタンパク質のmg数として計算することができる。Ｃ．プレカリクレイン活性化因子活性およびカリクレイン活性免疫グロブリン生成物中のPKA活性のレベルはAlvingとその共同研究者らの方法(J．Lab Clin Med．96:334-346，1980)に従って測定する。要約すると、PKA活性の測定は２段階の手順によって行われる；第１段階は解析している物資によるプレカリクレインのカリクレインへの転換を含む。第２段階では生成されたカリクレインを終末点インキュベーションアッセイによる合成基質S2303(Kabi Diagnostics，Sweden)の加水分解速度によって測定する。PKA活性をUK基準１調製物(UK Reference 1 prepatation)（75国際単位のPKAを含む血漿タンパク質画分）の活性と比較する。サンプル中のPKAによって生まれるカリクレイン活性は、プレカリクレイン非存在下において測定された活性をプレカリクレイン存在下の活性から差し引くことによって測定する。カリクレイン濃度はユニット/mlで記録する。ここで、１ユニットは、0.2mMのS2302を37℃、pH8.0にて１μmol/分の初速度で加水分解する量である。実際には、10μｌのテスト溶液をLundblad(Develp．Biol．Stand．44:107-114 ，1979)の方法によって調製した90μｌのプレカリクレイン試薬とｐＨ8.0および 37℃にて60分間インキュベーションする。次に500μｌのS2303を添加し、更に10 分間インキュベーションを続け、そのとき100μｌの10％酢酸を添加して反応を止める。すべてのサンプル、標準品および対照を二重にアッセイし、各サンプルと対照はカリクレインブランク（プレカリクレイン試薬の代わりにアッセイバッファーを添加する）を含むものとした。次に、各溶液の吸光度を405mMで読み取り、標準品の平均光学的濃度から標準曲線を作製する。ブランクの平均吸光度をテスト溶液の平均吸光度から差引き、PKA濃度を標準曲線から計算する。Ｄ．抗体機能（抗−風疹ウイルス活性）抗−風疹抗体をゲル法における溶血によって定量する。これは存在する抗−風疹抗体の機能的完全性を測定する補体媒介アッセイであって、免疫グロブリン調製物の抗原結合特性および抗原媒介補体結合特性の両方に依存するものである。要約すると、赤血球をその表面を風疹抗原でコーティングすることにより感作し、次に、これらをアガロース中に再懸濁しプレートに注ぐ。この混合物が固化したらウェルを切り、テストするサンプルおよび標準品で満たす。4℃における一晩のインキュベーションの間、サンプルはアガロース中へ拡散し、存在するいかなる特異的抗体も赤血球表面上の抗原と複合体を形成する。このケルをモルモット補体に浸し37℃にてインキュベーションする。抗原−抗体複合体は補体を活性化し、赤血球の溶解を生じさせる。これはウェルの周囲の透明な円形領域によって顕在化される；溶血ゾーンの面積は抗体濃度のlog₁₀に比例する。テストするサンプルの希釈物を標準品の希釈物（予めWHO国際基準に対して較正しておく）と並行してアッセイし、抗体濃度に対する標準品の拡散ゾーン面積のプロットから、テストしているサンプルの抗−風疹抗体濃度を計算する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウェルチアンギリアンイギリスファイフケイワイ11 ５ユーエイチダルゲティーベイザファーズ 31

Claims

【特許請求の範囲】１．製薬的に許容できる水性担体中の免疫グロブリン溶液であって、5.0〜5.8の範囲のｐＨおよび0.02〜0.25の範囲のイオン強度を有し、前記免疫グロブリンがペプシン処理を受けている前記溶液を含む、静脈内投与のための液体組成物。２．4℃〜25℃の温度範囲にて長期間の保存に際し、免疫グロブリンが本質的に凝集せず、分解せず、許容できるレベルの抗−補体活性、PKA活性およびカリクレイン活性を維持する、保存時に安定である、請求項１に記載の液体組成物。３．組成物中に存在するIgG二量体よりも大きな分子サイズを有するものが免疫グロブリン成分の2.5％を越えて増加しない、請求項２に記載の液体組成物。４．組成物中に存在するIgG単量体よりも小さな分子サイズを有するものが組成物の５％以下である、請求項２または３に記載の液体組成物。５．初期抗体機能が50％を越えて残存する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の液体組成物。６．抗−補体活性レベルが、補体の消費が50％以下となるレベルである、請求項２〜５のいずれか１項に記載の液体組成物。７．PKAレベルが、30g/lの免疫グロブリンを含む組成物１mlあたり35iu以下である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の液体組成物。８．カリクレインレベルが、30g/lの免疫グロブリンを含む組成物１mlあたり0.0 5iu未満である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の液体組成物。９．25℃にて12週間よりも長く安定に維持される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の組成物。 10．4℃にて６ヶ月よりも長く安定に維持される、請求項２〜９のいずれか１項に記載の液体組成物。 11．ｐＨがｐＨ5.25〜5.75の範囲である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の液体組成物。 12．イオン強度が0.03〜0.18の範囲である、請求項１〜11のいずれか１項に記載の液体組成物。 13．イオン強度が0.04〜0.25の範囲である、請求項１〜11のいずれか１項に記載の液体組成物。 14．ペプシン処理が低ｐＨで行われている、請求項１〜13のいずれか１項に記載の液体組成物。 15．ペプシンが10〜150μg／(ｇ全タンパク質)の範囲で添加されている、請求項１〜14のいずれか１項に記載の液体組成物。 16．ペプシン処理が20℃〜37℃の範囲の適切な温度で行われており、１時間〜72 時間の範囲の適切な温度で行われている、請求項１〜15のいずれか１項に記載の液体組成物。 17．更にIgAおよび／またはIgMを含む、請求項１〜16に記載の液体組成物。 18．免疫グロブリン溶液が血漿の低温エタノール分画によって調製される、請求項１〜17に記載の液体組成物。 19．免疫グロブリン溶液が総タンパク質の８〜12％w/wに濃縮され、適切な安定化剤がタンパク質１部に対して安定化剤１部（w/w）からタンパク質１部に対して安定化剤２部(w/w)の濃度で添加されている、請求項１〜18のいずれか１項に記載の液体組成物。 20．安定化剤が炭水化物である、請求項19に記載の液体組成物。 21．更にアミノ酸を100mg/gタンパク質までの濃度で含む、請求項19または20に記載の液体組成物。 22．静脈内投与のための、免疫グロブリンを含む液体組成物を調製する方法であって、ａ）免疫グロブリン溶液を得るための血漿の低温エタノール分画ステップ；ｂ）前記免疫グロブリン溶液からの残存エタノールの除去ステップ；ｃ）前記免疫グロブリン溶液のｐＨを3.9〜4.5に調製するステップ；ｄ）ペプシンを10〜150μg/(g免疫グロブリン溶液総タンパク質)の濃度で添加し、前記溶液を20℃〜37℃にて１〜72時間インキュベーションするステップ；およびｅ）前記溶液のｐＨを5.0〜5.8、およびイオン強度を0.03〜0．18に調製するステップを含む、前記調製方法。 23．ステップｃ）後に免疫グロブリン溶液の免疫グロブリンを総タンパク質の８〜12％(w/w)に濃縮し、添加剤をタンパク質１部に対して安定化剤１部（w/w）からタンパク質１部に対して安定化剤２部(w/w)の濃度で添加することを更に含む、請求項22に記載の方法。 24．安定化剤が炭水化物である、請求項23に記載の方法。 25．イオン強度が生理学的に許容し得る塩の添加によって調整される、請求項22 〜24に記載の方法。 26．塩が塩化ナトリウムである、請求項25に記載の方法。