JP2023501155A - クリザンリズマブ含有抗体製剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒトＰ－セレクチンに対する抗体、とりわけＳＥＧ１０１又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体の新規な医薬製剤並びにその調製のためのプロセス及び製剤の使用に関する。

Description

本発明は、ヒトＰ－セレクチンに対する抗体、とりわけＳＥＧ１０１又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体の新規な医薬製剤並びにその調製のためのプロセス及び製剤の使用に関する。
Ｐ－セレクチンは、多くの炎症性疾患及び血栓性疾患の原因となっている。従って、国際公開第２００８／０６９９９９号パンフレットにおいて開示されるようなヒトＰ－セレクチンに対する抗体、とりわけＳＥＧ１０１（別名クリザンリズマブ及びＳｅｌＧ１）などの、Ｐ－セレクチンを標的とする治療薬は、炎症性疾患及び血栓性疾患を治療するための手段として使用することができる。
製剤された抗体は、保存の間に、化学的及び物理的不安定性が原因で生物学的活性を失うかもしれない。抗体又はさらには賦形剤の分解、チャージバリアントの形成、及び異性化反応は、安全性についての懸念並びに製剤の力価及び効力の徐々の減少につながる一般的な要因に含まれる。
扱いやすいように、タンパク質治療薬、例えば抗体の液体医薬製剤は、長期的に安定しており且つ安全で有効な量の治療薬を含有するべきである。凝集体の形成などの物理的及び化学的安定性並びに製造、保存、及び運搬の難しさに関する課題に加えて、タンパク質治療薬の液体製剤の問題は、分解及びチャージバリアントの形成であり、これらは、安全性についての問題点を引き起こす他に、目的のタンパク質の活性及び機能性に悪影響を与え得る。ゆえに、タンパク質治療薬を長い間にわたって安定に維持し、分解率並びにチャージバリアント及び／又はアイソフォームなどの他の分子種の形成を最小限にすることが可能な製剤を開発する必要がある。
保存及び運搬の際に安定している、特にクリザンリズマブ又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体についての抗Ｐ－セレクチン抗体製剤を提供することが、本発明の目的である。静脈内（ｉ．ｖ．）投与に適している、安定した液体抗体製剤を提供することが、さらなる目的である。
一態様において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブ並びに配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、イソアスパラギン酸に変わったクリザンリズマブのバリアント（イソ－クリザンリズマブ）を含む医薬組成物を提供する。適切には、また好ましくは、医薬組成物は、医薬組成物について５．５～７．５、好ましくは５．７～７．０、好ましくは５．７～６．３のｐＨ値をもたらす緩衝系をさらに含む。
医薬組成物は、ヒト対象に投与するのに適していなければならない。含有する有効成分が発する効果は別として、医薬組成物は、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、人の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合うべきである。
一態様において、本発明は、ヒトＰ－セレクチンに対する抗体、好ましくはクリザンリズマブ又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体を含む新規な医薬組成物であって、ｐＨ値は、５．５～７．５、５．７～７．０、好ましくは５．７～６．３である医薬組成物に関する。
図１は、ＣＺＥメインピークに対する製剤ｐＨの影響を示す図である。 図２は、ＣＺＥ塩基性ピークに対する製剤ｐＨの影響を示す図である。 図３は、ＣＺＥ酸性ピークに対する製剤ｐＨの影響を示す図である。 図４は、ＳＥＣによるスクリーニングされた製剤の純度を示す図である。 図５は、クリザンリズマブのｐＨ依存性の異性化を示す図である。
定義
本開示がより容易に理解されるために、特定の用語について最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
本明細書において使用されるように、本開示に関して（とりわけ請求項に関して）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び類似する用語は、本明細書において別段の指示がない限り又は文脈によって明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方をカバーするように解釈されたい。そのため、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において区別なく使用することができる。
「及び／又は」は、列挙されている構成成分又は特徴のそれぞれ１つ又は両方又はすべてが、考えられるバリアントであることを意味し、とりわけ、代替的に又は追加的に、２つ以上のバリアントとなる。
数値的な値Ｘに関する用語「約」は、例えばＸ±１０％、Ｘ±５％、Ｘ±３％を意味し、この範囲内のすべての値を含む。
語句「薬学的に許容される」は、確かな医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、人及び動物の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合っている化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書において使用される。
本明細書において使用されるように、用語「患者」又は「対象」は、ヒトを意味するように解釈される。注釈がつけられる場合を除き、用語「患者」又は「対象」は、区別なく本明細書において使用される。
本明細書において使用されるように、対象が治療から生物学的に、医学的に、又は生活の質において利益を得る場合、このような対象は、このような治療「の必要がある」。
用語「治療」は、以下を含む：（１）状況、障害、若しくは状態にかかっているかもしれない若しくはそれにかかりやすいかもしれないが、状況、障害、若しくは状態の臨床若しくは準臨床症状をまだ経験していない若しくは示していない動物、特に哺乳動物、とりわけヒトにおいて発症する状況、障害、若しくは状態の臨床症状の出現を予防する若しくは遅延させること；（２）状況、障害、若しくは状態を阻害すること（例えば、疾患若しくは維持療法の場合はその再発の、その少なくとも１つの臨床若しくは準臨床症状の発症を阻止する、低下させる、若しくは遅延させること）；及び／又は（３）状態を軽減すること（すなわち、状況、障害、若しくは状態又はその臨床若しくは準臨床症状の少なくとも１つの後退を引き起こすこと）。治療される患者の利益は、統計的に有意である又は患者が若しくは医師が少なくとも認知可能である。しかしながら、医薬品が、疾患を治療するために患者に投与される場合、結果として、常に有効な治療となるとは限らないかもしれないことが、十分に理解されるであろう。
詳細な説明
タンパク質治療薬の液体製剤は、タンパク質治療薬の生物活性を完全な状態に保ち、製造及び有効期限の間にタンパク質治療薬の官能基を分解から保護するべきである。タンパク質の分解過程は、化学的不安定性（例えば脱アミド、酸化、クリッピング、異性化等）又は物理的不安定性（例えば凝集体の形成）を伴い得る。抗体の様々な分解産物は、当技術分野においてよく知られている方法、例えばキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、イオン交換クロマトグラフィー、又はキャピラリーゾーン電気泳動によってチャージバリアントとして検出することができる（例えばｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２０１７．０２．０１７及びｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２．６．１３３３３を参照されたい）。一般的なチャージバリアントは、シアル酸、脱アミド、Ｃ末端リシン、Ｎ末端グルタミン酸、未処理のリーダー配列、アスパラギン酸の異性化、及びスクシンイミドの形成である（Ｙｉ Ｄｕ，ｅｔ ａｌ，２０１２．ＤＯＩ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２１３２８）。
クリザンリズマブの微小不均一性は、修飾又は化学的分解に関するものであり、これは、大量の様々に修飾されたバリアントをもたらす。クリザンリズマブについての主要なバリアントは、環状イミド中間体（スクシンイミド）の形成のステップを通る、軽鎖（ＣＤＲにおける）の３２位のアスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を介して形成され（「イソ－クリザンリズマブ」と本明細書において称されるバリアントを生じる）、環状イミド中間体は、およそ１：３のモル比で、アスパラギン酸及びイソアスパラギン酸に加水分解され得る。しかしながら、驚くべきことに、この修飾がＣＤＲ中にあるにもかかわらず、イソ－クリザンリズマブが、クリザンリズマブと実質的に等しい生物学的活性を示すことが分かった。さらに、対応するスクシンイミド中間体は、生理学的な件下で、アスパラギン酸及びイソアスパラギン酸に加水分解することが可能であり（それぞれ、クリザンリズマブ及びイソ－クリザンリズマブを生じる）、スクシンイミドバリアントを、患者に投与した後に、生物学的活性形態に変換することができることを意味する。この発見に基づくと、本発明の医薬組成物は、クリザンリズマブ及び大量の様々なバリアントを含有するが、クリザンリズマブの生物学的活性を保持し、長期間安定している。加えて、イソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブのスクシンイミド形の存在は、免疫原性についての問題点を提示しない。用語「免疫原性」は、本発明の医薬組成物の投与を、健康なボランティア又はその必要がある患者などのヒト対象に行った後の、クリザンリズマブに結合することが可能である宿主抗体の生成を指す。本発明の医薬組成物を受けたすべてのヒト対象のうち２％未満の対象しか、抗クリザンリズマブ抗体を発生させなかった。一方、生理学的条件下では、適切には薬剤投与の１日後、患者における総クリザンリズマブ及びすべてのそのバリアントのうち、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、５％未満、適切には２％未満、適切には１％未満、適切には０．５％未満である。さらに、イソ－クリザンリズマブはクリザンリズマブと同じくらい免疫原性が低く、クリザンリズマブと実質的に同じであることを発見したことは驚くべきことである。この文脈において使用される用語「実質的に同じ」は、イソ－クリザンリズマブの免疫原性が、同じ条件下で試験した場合に、クリザンリズマブの５倍以下、３倍以下、適切には２倍以下、適切には１．５倍以下であることを意味する。その代わりに、この文脈において使用される用語「実質的に同じ」は、イソ－クリザンリズマブの免疫原性が、同じ条件下で試験した場合に、クリザンリズマブの２０％以上、適切には４０％以上、適切には７０％以上であることを意味する。
Figure 2023501155000001
ゆえに、一態様において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブ並びに配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、イソアスパラギン酸に変わったクリザンリズマブのバリアント（イソ－クリザンリズマブ）を含む医薬組成物を提供する。
用語「イソ－クリザンリズマブ」は、２つの種、ホモ－イソ－クリザンリズマブ及びヘテロ－イソ－クリザンリズマブからなる。ホモ－イソ－クリザンリズマブという用語は、軽鎖の両方の３２位のアスパラギン酸残基が、イソアスパラギン酸によって置き換えられている（すなわち異性化した）抗体を指す。ヘテロ－イソ－クリザンリズマブという用語は、軽鎖の一方のみの３２位のアスパラギン酸残基が、イソアスパラギン酸によって置き換えられている抗体を指す。
単一の軽鎖について、３２位にアスパラギン酸を有する軽鎖は、ＬＣＤと命名される。３２位にイソアスパラギン酸を有する軽鎖は、ＬＣｉｓｏＤと命名される。３２位にスクシンイミドを有する軽鎖は、ＬＣｓｕｃｃｉと命名される。
一態様において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブと最大でも３つ、好ましくは２つ、より好ましくは１つだけのアミノ酸の違いを有する抗体並びに配列番号１０の３２位のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に変わった前記抗体のバリアントを含む医薬組成物を提供する。
クリザンリズマブと最大でも３つ、好ましくは２つ、より好ましくは１つだけのアミノ酸の違いを有する抗体に関して、当該違いは、ミスマッチ、すなわち、ある残基の異なる残基により置換することができる。当該違いはまた、クリザンリズマブの配列中のアミノ酸残基の挿入又は欠失とすることもできる。当該違いは、軽鎖及び／又は重鎖の配列中の、例えば抗体の様々なドメインにおける、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ヒンジ領域、Ｆｃ、及びＦａｂにおける任意の場所とすることができる。好ましくは、前記違いは、その抗原、すなわちヒトＰ－セレクチンに結合するその能力などの抗体の必須の特性に干渉しない。好ましくは、当該違いは、抗体の機能にとって重大である位置、例えばＣＤＲにない。特に、本発明の医薬組成物に関して、当該違いは、配列番号１０の３２位にない。
一実施形態において、医薬組成物は、配列番号１０の３２位がスクシンイミド（すなわちアスパラギン酸のスクシンイミドアイソフォーム）であるバリアントをさらに含む（「クリザンリズマブのスクシンイミド形」）。クリザンリズマブのスクシンイミド形は、典型的に、軽鎖の少なくとも一方の３２位にスクシンイミド及び他方の軽鎖の３２位にアスパラギン酸若しくはイソアスパラギン酸を有する抗体である又は非常に酸性の条件（例えば５あたりのｐＨ）において、両方のアスパラギン酸を、スクシンイミドにより置き換えることができる。一方の軽鎖にスクシンイミド及び他方の軽鎖にアスパラギン酸を３２位に含む抗体は、「クリザンリズマブのＤ－スクシンイミド」と命名される。スクシンイミドを有する一方の軽鎖及びイソアスパラギン酸を有する他方の軽鎖を３２位に含む抗体は、「クリザンリズマブのｉｓｏＤ－スクシンイミド」と命名される。
一実施形態において、医薬組成物は、医薬組成物において総チャージバリアントのうち、少なくとも２０％、適切には少なくとも２４％、少なくとも３０％、適切には少なくとも３５％、適切には少なくとも４０％のクリザンリズマブ（すなわちメインピーク）を含む。典型的に、また好ましくは、チャージバリアントは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によって分析することができる。曲線下面積（ＡＵＣ）は、一般に、総ＡＵＣに対する各ピークの％を決定するために使用されるであろう。明確にするため、クリザンリズマブを含むピークは、クリザンリズマブを含むピークがすべてのピークの中で最も大きなＡＵＣを有するというわけではないまれな状況であっても、本出願の全体にわたって「メインピーク」と呼ばれるであろう。
本出願において使用される用語「チャージバリアント」は、クリザンリズマブのピークを含む、ＣＺＥによって特定することができるすべてのピークを指す。本出願において使用される用語「塩基性バリアント」は、ＣＺＥダイアグラムにおいてクリザンリズマブと比較して早い時刻に対応するピークを指す。本出願において使用される用語「酸性バリアント」は、ＣＺＥダイアグラムにおいてクリザンリズマブのピークと比較して遅い時刻に対応するピークを指す。ＣＺＥは、例えば実施例４において記載されるように実行することができる。
２つの主要な酸性バリアントピークがある。時刻が早い方のピークは、ヘテロ－イソ－クリザンリズマブを含み、時刻が遅い方のピークは、ホモ－イソ－クリザンリズマブを含む。推定であるが、全体で、イソ－クリザンリズマブは、酸性バリアントの約５０％～約７５％を占める。
少数の塩基性バリアントピークがあり、このうち、時刻が早い一方のピークは、クリザンリズマブのＤ－スクシンイミドを含み、時刻が遅い他方のピークは、クリザンリズマブのｉｓｏＤ－スクシンイミドを含む。推定であるが、全体で、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、塩基性バリアントの約２５％～約５０％を占める。
一実施形態において、医薬組成物は、ＣＺＥにかけられた場合、メインピークを示し、メインピークのＡＵＣは、総ＡＵＣの少なくとも２０％、適切には少なくとも２４％、少なくとも３０％、適切には少なくとも３５％、適切には少なくとも４０％である。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、７０％以下、適した６０％以下、適切には５０％以下、適切には４５％以下のクリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、ＣＺＥにかけられた場合、メインピークを示し、メインピークのＡＵＣは、総ＡＵＣの７０％以下、適切には６０％以下、適切には５０％以下、適切には４５％以下である。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約２０％～約５０％、適切には約３５％～約４５％、適切には約３７％～約４２％のクリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約２０％～約５０％、適切には約３５％～約４５％、適切には約３７％～約４２％のメインピークを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、少なくとも２０％、少なくとも３０％のイソ－クリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、少なくとも３０％、適切には少なくとも４０％の酸性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、４０％以下、適切には３５％以下のイソ－クリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、５６％以下、適切には４５％以下の酸性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約２０％～約４０％、適切には約２５％～約３５％のイソ－クリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約３０％～約５０％、適切には約３５％～約４５％、適切には約３７％～約４２％の酸性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、少なくとも５％、適切には少なくとも１０％のクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、適切には少なくとも１０％の塩基性バリアント、少なくとも１５％の塩基性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、１５％以下、適切には２０％以下のクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、２０％以下、適切には２５％以下、適切には３５％以下の塩基性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約５％～約２０％、適切には約１０％～１５％のクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約１０％～約３５％、適切には約１５％～２５％の塩基性バリアントを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％のクリザンリズマブとイソ－クリザンリズマブを含む。
一実施形態において、医薬組成物は、総チャージバリアントのうち、約５５％～約８５％、約６０％～約８０％、約６５％～約７５％のクリザンリズマブとイソ－クリザンリズマブを含む。
一実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブ並びに配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、イソアスパラギン酸に変わったクリザンリズマブのバリアント（イソ－クリザンリズマブ）並びに配列番号１０の３２位がスクシンイミドであるバリアント（クリザンリズマブのスクシンイミド形）を含む医薬組成物を提供する。
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を使用して、チャージバリアントの分布についてのｐＨ依存性動的挙動を特定した。６．３未満のｐＨでのインキュベーションの間に、スクシンイミドの蓄積が生じた。
インキュベーションのｐＨが低いほど、より多くのスクシンイミドが蓄積する。６．３を上回るｐＨ値では、より多くのイソアスパラギン酸が形成されたが、スクシンイミドの初めの量は、出発物質において観察されたものよりもさらに低いレベルまで減少した（図５）。
抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における化学的修飾は、標的分子への結合活性に影響を及ぼし得る。結合活性に対するＣＤＲ中の異性化バリアントとしてのスクシンイミドの影響は、すでに報告されている（Ｙａｎ Ｂ ｅｔ ａｌ，２００９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２１６５５；Ｃａｃｉａ Ｊ ｅｔ ａｌ，１９９６，ｄｏｉ：１０．１０２ｌ／ｂｉ９５１５２６ｃ；Ｖａｌｌｉｅｒｅ－Ｄｏｕｇｌａｓｓ Ｊ ｅｔ ａｌ，２００８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２００８．１０．０７８；Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２４４５８）。加えて、異性化バリアントとしてのイソアスパラギン酸もまた、ＣＤＲ中に存在する場合、結合活性の減少を引き起こすことが示されている（Ｃａｃｉａ Ｊ ｅｔ ａｌ，１９９６，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ９５１５２６ｃ；Ｈａｒｒｉｓ ＲＪ ｅｔ ａｌ，２００１，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｓ０３７８－４３４７（００）００５４８－ｘ；Ｒｅｈｄｅｒ ＤＳ ｅｔ ａｌ．，２００８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ７０１８２２３）。塩基性画分（スクシンイミドを含有する）の力価が、メインピーク（アスパラギン酸、クリザンリズマブを含有する）の力価と比較して低下したことが分かっているが、イソ－クリザンリズマブを含有する酸性バリアントが、クリザンリズマブと実質的に等しい生物学的活性を保持することを発見したことは驚くべきことである。
ゆえに、一態様において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含むクリザンリズマブの単離バリアントであって、配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、抗体の軽鎖の一方において又は軽鎖の両方においてイソアスパラギン酸により置き換えられている、クリザンリズマブの単離バリアントを提供する（イソ－クリザンリズマブ）。一実施形態において、置き換えは、スクシンイミド中間体の形成を通る。一態様において、本発明は、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、ヒトＰ－セレクチンに対するイソ－クリザンリズマブの結合親和性は、ヒトＰ－セレクチンに対するクリザンリズマブの結合親和性と実質的に等しい医薬組成物を提供する。Ｐ－セレクチンに対するクリザンリズマブ又はイソ－クリザンリズマブの結合親和性は、通常の手法によって、例えばＥＬＩＳＡによって決定することができる（例えば実施例２．１のように）。この文脈における用語「実質的に等しい」は、クリザンリズマブ及びイソ－クリザンリズマブの結合親和性に、２倍を超える違いはない、適切には１．５倍以下、適切には１．３倍以下、適した１．２倍以下であると理解される。適切には、イソ－クリザンリズマブの結合親和性は、クリザンリズマブの結合親和性の８０％～１２５％の範囲内にある。
一実施形態において、イソ－クリザンリズマブの生物学的活性は、クリザンリズマブの生物学的活性と実質的に等しい。用語「クリザンリズマブの生物学的活性」は、ヒトＰ－セレクチンの、そのリガンドＰＳＧＬ－１（Ｐ－セレクチングリコプロテインリガンド－１）との相互作用を阻害する、典型的に、ヒトＰ－セレクチンを発現する細胞のＰＳＧＬ－１との相互作用を阻害する、クリザンリズマブの能力を指す。生物学的活性は、通常の手法によって決定することができる。適切には、生物学的活性は、マイクロタイタープレートからの蛍光シグナルを測定することによって決定され、ウェルは、ＰＳＧＬ－１により最初にコーティングし、次いで、表面にヒトＰ－セレクション（Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を発現する哺乳動物細胞と、細胞を蛍光標識した後にインキュベートし、本発明の医薬組成物中に含まれるＳＥＧ１０１とインキュベートする。ＳＥＧ１０１又はそのバリアントの生物学的活性を測定するための適した方法は、実施例２．１において実証される。この文脈における用語「実質的に等しい」は、クリザンリズマブ及びイソ－クリザンリズマブの生物学的活性に、２倍を超える違いはない、適切には１．５倍以下、適切には１．３倍以下、適した１．２倍以下であると理解される。適切には、イソ－クリザンリズマブの生物学的活性は、クリザンリズマブの生物学的活性の８０％～１２５％の範囲内にある。
別の態様において、本発明は、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含むクリザンリズマブの単離バリアント（クリザンリズマブのスクシンイミド形）であって、配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸は、軽鎖の少なくとも一方においてスクシンイミドにより置き換えられており、それに対して、他方の軽鎖の対応する位置は、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、又はスクシンイミドである、クリザンリズマブの単離バリアントを提供する。
一態様において、本発明は、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、イソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解することが可能である医薬組成物を提供する。一実施形態において、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、ｐＨ７．４±０．４でイソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解することが可能である。一実施形態において、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、室温で、典型的に約２５℃で、ｐＨ７．４±０．４でイソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解することが可能である。一実施形態において、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、生理学的条件下で、イソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解することが可能である。用語「生理学的条件」は、ｐＨ７．４±０．４及び約３６．０～約４０．０の間の、好ましくは３６．５～３８．０、好ましくは約３６．５～３７．５℃の間の温度として理解される。一実施形態において、約５０％のクリザンリズマブのスクシンイミド形は、約２～約５時間以内に、適切には約３～約５時間以内に、適切には約３～約４時間に、生理学的条件下で、イソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解される。一実施形態において、クリザンリズマブのスクシンイミド形は、対象への注入（例えば静脈内）の後に、イソ－クリザンリズマブ及びクリザンリズマブに加水分解される。
一実施形態において、医薬組成物において、クリザンリズマブは、ＣＺＥによって決定されるメイン種である。メイン種は、最も大きなＡＵＣを有するとして理解される。
一実施形態において、医薬組成物において、イソ－クリザンリズマブは、ＣＺＥによって決定されるメイン種である。
一実施形態において、医薬組成物は、実質的に等しい量のクリザンリズマブ及びイソ－クリザンリズマブを含む。この文脈において使用される用語「実質的に等しい」は、イソ－クリザンリズマブの量が、クリザンリズマブの量の８０％～１２５％の範囲内に、適切にはクリザンリズマブの９０％～１１０％の範囲内にあることを意味する。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、約２℃～約８℃、適切には約５℃に保たれる。適切には、医薬組成物は、冷蔵庫において保たれる。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、約２℃～約８℃の間の、適切には約４℃～約６℃の間の、適切には５℃の温度を有する。３２位のアスパラギン酸の異性化は、温度の増加と共にかなり速い速度で起こることが分かっている（例えば表６において示されるように）。このような温度条件下で、クリザンリズマブの減少は、好ましくは、ＣＺＥ試験におけるメインピークのＡＵＣとして決定されるように、医薬組成物を調製した時点の出発物質と比較して、少なくとも１２ヵ月間にわたって、適切には１８ヵ月間、適切には２４ヵ月間、２５％以下、２０％以下、１５％以下、適切には１０％以下、適切には５％以下である。このような温度条件下で、総塩基性バリアントの量は、少なくとも１２ヵ月間にわたって、適切には１８ヵ月間、適切には２４ヵ月間、出発物質と比較して、１５％を超える変化はない、１０％以下、５％以下、適切には３％以下、適した２％以下である。このような温度条件下で、総酸性バリアントの量は、出発物質と比較して、少なくとも１２ヵ月間にわたって、適切には１８ヵ月間、適切には２４ヵ月間、２５％を超える増加はない、１５％以下、適切には１０％以下、適切には５％以下である。医薬組成物が適切なｐＨ範囲を有する場合、上記の変化は、さらに最小限にすることができる。例えば、約５．５～約７．５の間のｐＨ、適切には約５．５～約７の間のｐＨ、適切には約６～約７の間のｐＨ、適切には約６±０．３。適切には、医薬製剤は、約６のｐＨに保たれる。
一実施形態において、本発明は、適切には１８ヵ月又は２４ヵ月の有効期限の時点で、総チャージバリアントのうち、少なくとも２４％、少なくとも３０％、少なくとも３５％のメインピーク及び５６％以下、５０％以下、４５％以下の酸性バリアントを含む医薬組成物を提供し、適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。一実施形態において、本発明は、適切には１８ヵ月又は２４ヵ月の有効期限の時点で、総チャージバリアントのうち、少なくとも２４％のメインピーク及び５６％以下の酸性バリアントを含む医薬組成物を提供し、適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。
一実施形態において、本発明は、適切には１８ヵ月又は２４ヵ月の有効期限の時点で、総チャージバリアントのうち、少なくとも２４％、少なくとも３０％、少なくとも３５％のメインピーク、５６％以下、５０％以下、４５％以下の酸性バリアント、３５％以下、３０％以下、２５％以下の塩基性バリアントを含む医薬組成物を提供し、適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。一実施形態において、本発明は、適切には１８ヵ月又は２４ヵ月の有効期限の時点で、総チャージバリアントのうち、少なくとも２４％のメインピーク、５６％以下の酸性バリアント、及び３５％以下の塩基性バリアントを含む医薬組成物を提供し、適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。
マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析は、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉを含む化学的修飾を特定するために使用される。一態様において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、少なくとも５０％のＬＣＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約６０％～約８５％のＬＣＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の最初の３ヵ月以内で、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約７０％～約８５％のＬＣＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の１２ヵ月、適切には有効期限の１８ヵ月、適切には有効期限の２４ヵ月後に、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約６０％～約７０％のＬＣＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣＤを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣＤの減少パーセンテージは、有効期限の始めから有効期限の終わりまで、約３０％以下、２０％以下、適切には１５％以下であり、有効期限は、１２ヵ月、適切には１８ヵ月、適切には２４ヵ月である、医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣＤを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣＤの減少パーセンテージは、少なくとも約１８ヵ月間、約２０％以下である、医薬組成物を提供する。適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。医薬組成物が適切なｐＨ範囲を有する場合、上記の変化は、さらに最小限にすることができる。例えば、約５．５～約７．５の間のｐＨ、適切には約５．５～約７の間のｐＨ、適切には約６～約７の間のｐＨ、適切には約６±０．３。適切には、医薬製剤は、約６のｐＨに保たれる。
一実施形態において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、少なくとも１０％のＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、３０％以下のＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約１０％～約３０％のＬＣｉｓｏＤ、適切には約１５％～約２５％のＬＣｉｓｏＤ、適切には約２０％～約３０％のＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の最初の３ヵ月以内で、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約２５％未満のＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の１２ヵ月、適切には１８ヵ月、適切には有効期限の２４ヵ月後に、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約２５％を超えるＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣｉｓｏＤの変化パーセンテージは、有効期限の始めから有効期限の終わりまで、約３０％以下、２０％以下、１０％以下、適切には５％以下であり、有効期限は、１２ヵ月、適切には１８ヵ月の有効期限、適切には２４ヵ月である、医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣｉｓｏＤを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣＤの変化パーセンテージは、少なくとも約１８ヵ月間、約２０以下である、医薬組成物を提供する。適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。医薬組成物が適切なｐＨ範囲を有する場合、上記の変化は、さらに最小限にすることができる。例えば、約５．５～約７．５の間のｐＨ、適切には約５．５～約７の間のｐＨ、適切には約６～約７の間のｐＨ、適切には約６±０．３。適切には、医薬製剤は、約６のｐＨに保たれる。
一実施形態において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、少なくとも１％のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、１０％以下のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約１％～約１０％のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の最初の３ヵ月以内で、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約３％未満のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の１２ヵ月、適切には１８ヵ月、適切には２４ヵ月後に、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約５％を超えるＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣｓｕｃｃｉの変化パーセンテージは、有効期限の始めから有効期限の終わりまで、約２０％以下、１０％以下、適切には５％以下であり、有効期限は、１２ヵ月、適切には１８ヵ月、適切には２４ヵ月である、医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物であって、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量に対するＬＣｓｕｃｃｉの変化パーセンテージは、少なくとも約１８ヵ月間、約１０％以下である、医薬組成物を提供する。適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。医薬組成物が適切なｐＨ範囲を有する場合、上記の変化は、さらに最小限にすることができる。例えば、約５．５～約７．５の間のｐＨ、適切には約５．５～約７の間のｐＨ、適切には約６～約７の間のｐＨ、適切には約６±０．３。適切には、医薬製剤は、約６のｐＨに保たれる。
一実施形態において、本発明は、ＭＳによって決定されるように、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約６０％～８０％のＬＣＤ、約１５％～３０％のＬＣｉｓｏＤ、及び約１％～１０％のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の最初の３ヵ月以内で、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約７０％～８０％のＬＣＤ、約２０％～２５％のＬＣｉｓｏＤ、及び約１％～３％のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、有効期限の１２ヵ月、適切には１８ヵ月、適切には２４ヵ月後に、ＬＣＤ、ＬＣｉｓｏＤ、及びＬＣｓｕｃｃｉの総量のうち、約６０％～７０％のＬＣＤ、約２０％～３０％のＬＣｉｓｏＤ、及び約５％～１０％のＬＣｓｕｃｃｉを含む医薬組成物を提供する。適切には、医薬組成物は、約２～約８℃、適切には約５℃に保たれる。医薬組成物が適切なｐＨ範囲を有する場合、上記の変化は、さらに最小限にすることができる。例えば、約５．５～約７．５の間のｐＨ、適切には約５．５～約７の間のｐＨ、適切には約６～約７の間のｐＨ、適切には約６±０．３。適切には、医薬製剤は、約６のｐＨに保たれる。
ゆえに、一実施形態において、本発明の医薬組成物は、緩衝系をさらに含む。
本発明は、有効成分としてクリザンリズマブ又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体並びに緩衝系を含む新規な医薬組成物であって、医薬組成物は、約５．０～７．５、約５．５～７．０、約５．５～７．５、約５．５～７．０、約５．５～６．８、約５．５～６．５、約５．７～６．８、約５．７～６．５、約５．７～６．３、約５．９～６．１、又は約６．０のｐＨ値を有する、医薬組成物を提供する。特定の態様において、ｐＨは、上記に挙げられるｐＨ値の範囲内の任意のｐＨ値；例えば５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、及び６．３である。
本発明での使用に適した緩衝系は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタール酸の塩などの有機酸の塩；Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸バッファーを含むが、これらに限定されない。好ましくは、緩衝系は、クエン酸バッファー又はリン酸バッファー又はその組み合わせである。加えて、アミノ酸の構成成分、例えばグリシンもまた、緩衝剤として使用することができる。アミノ酸は、そのＤ－及び／又はＬ－形態で存在してもよいが、Ｌ－形態が典型的である。好ましくは、緩衝系は、アルギニン又はヒスチジンを含まない。
本発明による製剤に使用される適したバッファー系の濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約４０ｍＭであり、例えば、バッファー及び製剤の所望の安定性に依存する。好ましい実施形態において、緩衝系は、クエン酸であり、クエン酸は、好ましくは、１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～４０ｍＭ、好ましくは２０～３０ｍＭの濃度で使用される。別の好ましい実施形態において、緩衝系は、リン酸であり、リン酸は、好ましくは、１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～４０ｍＭ、好ましい２０～３０ｍＭの濃度で使用される。一実施形態において、クエン酸又はリン酸バッファーの対イオンは、ナトリウム及び／又はカリウムである。好ましい実施形態において、バッファーは、クエン酸ナトリウムバッファーである。
本発明での使用に適した安定化剤は、例えば、粘度増強剤、可溶化剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、及び／又はその他同種のものとして作用することができる。安定化剤は、イオン性とすることができるが、好ましくは非イオン性である（例えば糖）。糖は、単糖、例えばフラクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース、及びその他同種のもの；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、及びその他同種のもの；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、及びその他同種のもの；並びにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、及びその他同種のものなどのアルジトールを含むが、これらに限定されない。糖は、糖アルコール又はアミノ糖であってもよい。好ましくは、糖は、還元糖ではない。還元糖は、すべての単糖、ラクトース、マルトース、及びセロビオースを含むが、これらに限定されない。そのため、糖は、好ましくは非還元糖、例えばスクロース、トレハロース、ラフィノース、ソルビトール、及びマンニトールである。スクロースは、特に有用である。イオン性の安定化剤として、それらは、ＮａＣｌなどの塩又はアミノ酸の構成成分を含む。好ましくは、安定化剤は、アルギニン又はヒスチジンを含まない。アミノ酸は、そのＤ－及び／又はＬ－形態で存在してもよいが、Ｌ－形態が典型的である。本発明による製剤は、約５０～４００ｍＭ、約５０～３００ｍＭ、好ましくは１８０～３００ｍＭ、最も好ましい約２２０ｍＭの安定化剤、好ましくはスクロースを含む。
本発明の医薬組成物は、クリザンリズマブ又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体及び緩衝系に加えて、１つ以上の以下のものなどのさらなる構成成分を含んでいてもよい：（ｉ）安定化剤；（ｉｉ）界面活性剤；及び（ｉｉｉ）塩。
本発明による適した界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０又は８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；オクチルグリコシド；ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、又はイソステアラミドプロピル－ジメチルアミン；ポリエチル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ）グリコール、ポリプロピルグリコール、並びにエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えばプルロニック、ＰＦ６８等）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベートであり、好ましくは、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０からなる群から選択される。より好ましくは、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
本発明による製剤に使用される界面活性剤、好ましくはポリソルベートの濃度は、製剤の約０．０１％～０．１％、好ましくは約０．０１％～０．０５％、最も好ましくは約０．０２％重量体積（ｗｅｉｇｈｔ ｂｙ ｖｏｌｕｍｅ）（ｗ／ｖ）である。
等張化剤は、本発明による製剤の浸透圧を生理学的に許容される値に調整するのに役立つ。等張化剤は、生理学的に許容される構成成分であり、特に限定されない。等張化剤の典型的な例は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は塩化カルシウム、及びその他同種のものなどの無機塩である。これらは、単独で又はその混合物で使用することができる。いくつかの作用物質は、２つの役割を有していてもよく、例えば、いくつかの糖又は糖アルコールは、安定化剤及び等張化剤の両方として役立ち得ることに注意するべきである。一実施形態において、等張化剤の濃度は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭである。一実施形態において、等張化剤は、塩化ナトリウムである。一実施形態において、塩化ナトリウムは、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、特に約１９０ｍＭの濃度である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物中の抗体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～７５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌである。一実施形態において、抗体の濃度は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌである。一実施形態において、抗体の濃度は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌである。一実施形態において、抗体の濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである。一実施形態において、抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌである。文脈上別段の指示がある場合を除き、本明細書において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又はその区別なく使用される用語「抗体（ＡＮＴＩＢＯＤＹ）」は、ＵＶによって検出することができ、そのため、タンパク質濃度を決定する際に関連する、医薬組成物によって含まれるクリザンリズマブ並びにその任意のバリアント（例えばクリザンリズマブのスクシンイミド形及びイソ－クリザンリズマブ）を含む。
さらに、本発明の医薬組成物は、２～８℃での３６週（約９ヵ月）間の保存の後でさえ、総抗体の２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、例えばＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないように、安定している。好ましくは、２～８℃での３６週（約９ヵ月）間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２～８℃での１２ヵ月間の保存の後でさえ、総抗体の１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、例えばＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２～８℃での１２ヵ月間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２～８℃での１５ヵ月間の保存の後でさえ、総抗体の１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、例えばＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２～８℃での１５ヵ月間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２～８℃での１８ヵ月間の保存の後でさえ、総抗体の１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、例えばＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２～８℃での１８ヵ月間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２～８℃での２４ヵ月間の保存の後でさえ、総抗体の１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、例えばＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２～８℃での２４ヵ月間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２５℃での１２週（約３ヵ月）間の保存の後でさえ、総抗体の５％、４％、３％、２％、１％未満しか、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２５℃での１２週（約３ヵ月）間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、２５℃での６ヵ月間の保存の後でさえ、総抗体の５％、４％、３％、２％、１％未満しか、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、２５℃での６ヵ月間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
本発明の医薬組成物は、４０℃での２週間の保存の後でさえ、総抗体の２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満しか、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定されるように、凝集しないほど、安定している。好ましくは、４０℃での２週間の保存の後に、総抗体の２％未満しか凝集しない。
一態様において、本発明は、
ａ）約５ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用されるクリザンリズマブ及びその任意のバリアント又はクリザンリズマブと最大でも３つのアミノ酸の違いを有する抗体及びその任意のバリアント；
ｂ）緩衝系、好ましくはクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）及び／又はリン酸（例えばリン酸カリウム）緩衝系、緩衝系は、好ましくは、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で使用されてもよい；及び緩衝系のｐＨは、５．０～７．５、好ましくは５．５～７．０、好ましくは５．７～６．３の範囲内の任意のｐＨ値である；
ｃ）任意選択で、好ましくは約５０ｍＭ～３００ｍＭの濃度の安定化剤、好ましくはスクロース；
ｄ）任意選択で、好ましくは約０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍｌ）～０．１％ｗ／ｖ（１ｍｇ／ｍｌ）の濃度の非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート８０；並びに
ｅ）任意選択で、好ましくは約５０～３００ｍＭ、より好ましくは約１００～２５０ｍＭ、特に約１９０ｍＭの濃度の等張化剤、好ましくはＮａＣｌ
を含む医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＥＧ１０１、約２２０ｍＭスクロース、約２０ｍＭクエン酸、及び約０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０を含む製剤であって、製剤のｐＨは、約６．０、好ましくは５．７～６．３、より好ましくは５．９～６．１、例えば６．０である、製剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度のクリザンリズマブ、リン酸ナトリウム約２５ｍＭ、ｐＨ約７、塩化ナトリウム約１９０ｍＭ、約０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０、及び注射用水を含む製剤ではない、医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、グリシンを含まない、医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、リン酸ナトリウムを含まない、医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、ｐＨ＝７を有していない、医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形並びに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、スクロースをさらに含む、医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、少なくとも５０ｍＭのスクロースを含む。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形の総量は、約５ｍＭ～５０ｍＭ、適切には５ｍＭ～３０ｍＭ、適切には１０ｍＭである、医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、界面活性剤をさらに含む、医薬組成物を提供する。一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベートである。一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。一実施形態において、医薬組成物は、少なくとも０．０１％の界面活性剤を含む。
一態様において、本発明は、例えば上記に記載されるように、クリザンリズマブ、イソ－クリザンリズマブ、及びクリザンリズマブのスクシンイミド形を含む医薬組成物であって、医薬組成物は、緩衝系をさらに含む、医薬組成物を提供する。一実施形態において、緩衝系は、クエン酸バッファーである。一実施形態において、医薬組成物は、１０～５０ｍＭのクエン酸バッファーを含む。
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、液体形態をしている。より好ましくは、前記組成物は、水性である、すなわち、溶媒は、水である。製薬の使用に適した製剤又は組成物は、無菌、均質、及び／又は等張であってもよい。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、ヒトへの静脈内投与に適している。しかしながら、本発明の医薬組成物は、皮下投与に適していなくてもよい。
一実施形態において、液体形態をした本発明の医薬組成物はまた、凍結乾燥にも適している。典型的に、凍結乾燥形態は、液体形態よりも安定しており、保存に好ましい形態であろう。しかしながら、液体形態が、少なくとも１２ヵ月、少なくとも１８ヵ月、又は少なくとも２４ヵ月間、理想的には１２ヵ月、１８ヵ月、又は２４ヵ月間、十分に安定している場合、液体形態は、使用のその利便性から好ましい。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、凍結乾燥形態をしており、クリザンリズマブ又はクリザンリズマブと最大でも３つ、好ましくは２つ、より好ましくは１つだけのアミノ酸の違いを有する抗体、好ましくは、それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブ、並びに配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、イソアスパラギン酸に変わったクリザンリズマブのバリアント（イソ－クリザンリズマブ）を含む。一実施形態において、医薬組成物は、クリザンリズマブのスクシンイミド形をさらに含む。
一実施形態において、凍結乾燥にかけられる液体製剤（凍結乾燥前の製剤）は、さらに緩衝系を含み、医薬組成物は、約５．０～７．５、約５．５～７．５、約５．５～７．０、約５．５～６．８、約５．５～６．５、約５．７～６．８、約５．７～６．５、約５．７～６．３、約５．９～６．１、又は約６．０のｐＨ値を有する。特定の態様において、ｐＨは、上記に挙げられるｐＨ値の範囲内の任意のｐＨ値；例えば５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、及び６．３である。
別の実施形態において、凍結乾燥製剤から溶解した製剤は、約５．５～７．５、約５．５～７．０、約５．５～６．８、約５．５～６．５、約５．７～６．８、約５．７～６．５、約５．７～６．３、約５．９～６．１、又は約６．０のｐＨ値を有する。特定の態様において、ｐＨは、上記に挙げられるｐＨ値の範囲内の任意のｐＨ値；例えば５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、及び６．３である。
一実施形態において、緩衝系は、クエン酸バッファー又はリン酸バッファーである。好ましい実施形態において、緩衝系は、クエン酸であり、クエン酸は、好ましくは、１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～４０ｍＭ、好ましい２０～３０ｍＭの濃度で使用される。別の好ましい実施形態において、緩衝系は、リン酸であり、リン酸は、好ましくは、１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～４０ｍＭ、好ましい２０～３０ｍＭの濃度で使用される。
一実施形態において、凍結乾燥形態をした本発明の医薬組成物は、本出願において前の方で教示されるように、安定化剤、界面活性剤、及び等張化剤を含むが、これらに限定されない賦形剤をさらに含む。一実施形態において、凍結乾燥形態は、安定化剤を含む。好ましくは、安定化剤は、スクロースである。一実施形態において、凍結乾燥前の製剤中のスクロースの濃度は、２０～１２０ｍｇ／ｍｌの間、適切には４０～１００ｍｇ／ｍｌの間、適切には６０～９０ｍｇ／ｍｌの間である。
一実施形態において、凍結乾燥形態をした本発明の医薬組成物は、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）をさらに含む。典型的に、凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥前の製剤に追加される。凍結乾燥保護剤は、スクロースなどの非晶形又はマンニトールなどの結晶形又はその混合物とすることができる。さらなる凍結乾燥保護剤は、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールを含むが、これらに限定されない。本発明による凍結乾燥前の製剤中の総凍結乾燥保護剤の濃度は、２０～１５０ｍｇ／ｍｌ、適切には４０～１２０ｍｇ／ｍｌ、適切には６０～１２０ｍｇ／ｍｌ、適切には６０～１００ｍｇ／ｍｌである。例えば、４０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び６０ｍｇ／ｍｌのマンニトールが凍結乾燥前の製剤中にある場合、凍結乾燥前の製剤中の総凍結乾燥保護剤の濃度は、１００ｍｇ／ｍｌである。二つの機能を有する賦形剤の場合、機能を区別することなく総量を計算に入れる。例えば、凍結乾燥前の製剤が４０ｍｇ／ｍｌのスクロースを含む場合、凍結乾燥保護剤の濃度は、４０ｍｇ／ｍｌであり、同時に、安定化剤の濃度も、４０ｍｇ／ｍｌである。
一実施形態において、凍結乾燥保護剤の少なくとも１つは、スクロースである。一実施形態において、唯一の凍結乾燥保護剤は、スクロースである。
一実施形態において、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比は、少なくとも３００、好ましくは少なくとも５００、好ましくは少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、又は少なくとも９００である。凍結乾燥保護剤の少なくとも１つがスクロースである場合、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比は、抗体に対するスクロースのモル比しか指さない。例えば、４０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び６０ｍｇ／ｍｌのマンニトールを含む凍結乾燥前の製剤において、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比は、５５３となり、これは、マンニトールの量を凍結乾燥保護剤として考慮していない。抗体の計算において、メインピークを含むすべてのチャージバリアントを総合し、これを、好ましくはＵＶによって決定する。例えば、凍結乾燥前の製剤が３０ｍｇ／ｍｌのＳＥＧ１０１を含有する場合、これは、メインピーク（クリザンリズマブ）を含む総チャージバリアントを指す。
一実施形態において、凍結乾燥前の製剤中の抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ～７０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ～７０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約４０ｍｇ／ｍｌである。
界面活性剤を使用することにより、溶解したタンパク質の凝集を低下させることができる及び／又は溶解した製剤における粒子の形成を低下させることができる。追加される界面活性剤の量は、溶解したタンパク質の凝集を低下させる及び溶解後の粒子の形成を最小限にするような量である。
界面活性剤は、凍結乾燥前の製剤、凍結乾燥製剤、及び／又は溶解した製剤に、所望される通りに、適切には凍結乾燥前の製剤に、追加することができる。
一実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０又はポリソルベート２０である。好ましくは、界面活性剤は、０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍＬ）～０．１％ｗ／ｖ（１ｍｇ／ｍＬ）、好ましくは０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍＬ）～０．０５％ｗ／ｖ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、好ましくは０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度である。
理想的には、凍結乾燥形態は、室温で保存される。その代わりに、凍結乾燥形態は、２～８℃で保存される。理想的には、凍結乾燥形態は、少なくとも１８ヵ月、少なくとも２４ヵ月、又は少なくとも３６ヵ月の有効期限を有する。理想的には、凍結乾燥形態は、１８ヵ月、２４ヵ月、又は３６ヵ月の有効期限を有する。
凍結乾燥製剤は、患者への投与の直前に、溶解することができる。溶解は、許容される期間内で、典型的に１０分未満で達成される。溶解により、凍結乾燥前の製剤と比較して、低い、同じ、又は高い抗体濃度がもたらされるが、一般的に、低い抗体濃度がもたらされる。溶解した製剤は、保存中、溶解から使用までの期間、典型的に数時間、最高で数日、物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持する。溶解媒質は、水、すなわち無菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、又は約５０ｍＭ～約１００ｍＭの量の酢酸、プロピオン酸、コハク酸、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムの酸性溶液、塩化マグネシウムの酸性溶液、及びアルギニンの酸性溶液からなる群から選択される。最も好ましい溶解媒質は、無菌水である。溶解した製剤は、投与前に、注入溶液による、溶解した製剤の希釈によって、必要とされる等張性を達成することができる。
一態様において、本発明は、約５．０～７．５、好ましくは５．５～７．５のｐＨ値を有する水性の製剤を凍結乾燥することによって得ることができる凍結乾燥製剤であって、凍結乾燥製剤は、
ａ）抗体（クリザンリズマブ及びその任意のバリアント）；
ｂ）凍結乾燥保護剤、並びに
ｃ）緩衝系
を含む、凍結乾燥製剤を提供する。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、界面活性剤、好ましくはポリソルベート４０又はポリソルベート８０をさらに含む。好ましくは、界面活性剤は、約０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍＬ）～０．１％ｗ／ｖ（１ｍｇ／ｍＬ）の濃度で水性の製剤中に存在する。
一実施形態において、抗体は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で水性の製剤中に存在する。
一実施形態において、緩衝系は、クエン酸、例えばクエン酸ナトリウムである。好ましくは、緩衝系は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で水性の製剤中に存在する。
一実施形態において、凍結乾燥保護剤は、スクロース、マンニトール、又はその混合物である。好ましくは、凍結乾燥保護剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で水性の製剤中に存在する。
一実施形態において、抗体に対する凍結乾燥保護剤、好ましくはスクロースのモル比は、約２００～１５００である。
一実施形態において、本発明は、凍結乾燥製剤の総重量に基づいて
ａ）約２５～４０ｗ／ｗ％、好ましくは約２８％～３２ｗ／ｗ％の抗体；及び
ｂ）約５５％～７５ｗ／ｗ％、好ましくは約６５％～７１ｗ／ｗ％のスクロース
を含む凍結乾燥製剤を提供する。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨを有し、
ａ）約３０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）任意選択で、最高１００ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトール；
ｄ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｅ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約３０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約９０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｄ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約９０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｄ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約５０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｄ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約３０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトール；
ｄ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｅ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約３０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約８０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトール；
ｄ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｅ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性の製剤を凍結乾燥することから得ることができ、水性の製剤は、約５．７～６．３のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．０を有し、
ａ）約３０ｍｇ／ｍＬの濃度のクリザンリズマブ及びその任意のバリアント；
ｂ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロース；
ｃ）約６０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトール；
ｄ）約２０ｍＭの濃度のクエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）；並びに
ｅ）約０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のポリソルベート８０
を含む。
一態様において、本発明は、上記に記載されるように、凍結乾燥製剤を溶解することによって得られる液体医薬組成物を提供する。
保存時間の間、安定している抗体製剤を提供することが、本発明の目的である。本発明によれば、安定した製剤は、その中の抗体が、保存中、その力価並びに物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持する製剤である。抗体製剤の安定性は、生物学的活性アッセイを使用して測定されてもよい。好ましくは、抗体の活性における低下は、開始時刻（すなわちＴ＝０）と比較して、２４若しくは３６週間又は１２ヵ月、１５ヵ月、１８ヵ月、若しくは２４ヵ月間の長期的な保存条件（２～８℃）において、保存中、２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である。ＳＥＧ１０１について、生物学的活性は、ヒトＰ－セレクチンを発現する細胞の、そのリガンドＰＳＧＬ－１との、例えば、それらの表面にヒトＰ－セレクチンを提示するように組換え修飾された哺乳動物細胞の、組換えヒトＰＳＧＬ－１との相互作用を阻害するその能力に基づいて決定される。適切には、生物学的活性は、マイクロタイタープレートからの蛍光シグナルを測定することによって決定され、ウェルは、ＰＳＧＬ－１により最初にコーティングし、次いで、表面にヒトＰ－セレクションを発現する哺乳動物細胞と、細胞を蛍光標識した後にインキュベートし、本発明の医薬組成物中に含まれるＳＥＧ１０１とインキュベートする。ＳＥＧ１０１又はそのバリアントの生物学的活性を測定するための適した方法は、実施例２．１において実証される。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、上記に記載されるように、長期の保存の間に、検出不可能な抗体凝集又は非常に低いレベルの抗体凝集のみ呈する。好ましい実施形態において、製剤中の抗体分子の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、６週間、１２週間、２４週間、３６週間、４８週間、１年間、又は１８ヵ月間若しくは２４ヵ月間の２～８℃での保存の後に、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されるように、モノマーとして存在する。最も好ましくは、製剤中の抗体分子の少なくとも９７％は、３６週間又は１年間、１８ヵ月間、若しくは２４ヵ月間の２～８℃での保存の後に、モノマーとして存在する。好ましくは、ＳＥＣは、実施例３において記載されるように実行される。
好ましくは、液体抗体製剤は、６ヵ月以上の有効期限を呈するべきである。本発明の医薬組成物は、好ましくは２～８℃に保たれた場合に、少なくとも９ヵ月、例えば９ヵ月、少なくとも１年、例えば１年、少なくとも１８ヵ月、例えば１８ヵ月、又は最高２年、例えば２４ヵ月の有効期限を呈する。好ましくは、医薬組成物は、約１２ヵ月、１８ヵ月、又は適切には２４ヵ月の有効期限を呈する。有効期限を決定するメインの要因は、普通、副産物及び分解産物の形成並びに生理活性の損失である。その有効期限の間に、クリザンリズマブの生物学的活性は、元々の活性の８０％～１２５％の間に留まるべきである。本発明の製剤は、これらの所望される安定性のレベルを達成する。
抗Ｐ－セレクチン抗体
ヒトＰ－セレクチンに対する抗体は、例えば国際公開第２００８／０６９９９９号パンフレットから知られており、それぞれ配列番号１、２、及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３並びに配列番号４、５、及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むことによって特徴づけられる抗体を含む。ヒトＰ－セレクチンに対する抗体はまた、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むことによって特徴づけられてもよい。特に、ＳＥＧ１０１は、配列番号９の重鎖及び配列番号１０の軽鎖を含む、Ｐ－セレクチンに対するヒト化モノクローナル抗体である。抗体は、高い親和性及び特異性で、Ｐ－セレクチンのアミノ末端に位置するレクチン結合ドメインに結合し、Ｐ－セレクチンの、その受容体Ｐ－セレクチングリコプロテインリガンド－１（ＰＳＧＬ－１）との相互作用をブロックする。
クリザンリズマブは、ヒトＰ－セレクチンに対するヒト化モノクローナル抗体であり、これもまた、参考文献国際公開第２０１８／０８３６４５Ａ１号パンフレットにおいて記載される。クリザンリズマブは、配列番号９の重鎖及び配列番号１０の軽鎖を含むことによって特徴づけられる。表１は、ＳＥＧ１０１の配列の特徴を要約する。
Figure 2023501155000002
標的疾患及び障害
本発明の医薬組成物は、種々の疾患又は障害を治療する、回復させる又は、予防するために使用することができる。本発明の医薬組成物は、特に、Ｐ－セレクチン媒介性又はＰ－セレクチン関連障害を治療するのに、特に、鎌状赤血球症と関連する血管閉塞（ｖａｓｏ－ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、炎症、及び疼痛発作を低下させる又は排除するのに有用である；例えば国際公開第２０１８／０８３６４５Ａ１号パンフレット及び国際公開第２００８／０６９９９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。
本発明に関して、用語「Ｐ－セレクチン媒介性障害」又は「Ｐ－セレクチン関連障害」は、Ｐ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体のレベルの増加と関連する又はそれによって特徴づけられる障害を指す。抗Ｐ－セレクチン抗体又はその結合断片は、Ｐ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体の形成を低下させる能力を有することができる。それらはまた、あらかじめ形成されたＰ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体を解離させる能力を有していてもよい。従って、抗Ｐ－セレクチン抗体又はその結合断片を含む本発明の医薬組成物の使用は、新たなＰ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体の形成を阻害することによる、Ｐ－セレクチン媒介性疾患の予防を可能にすることが十分に理解されるであろう。前記製剤の使用は、あらかじめ形成されたＰ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体を解離させることによって、既存のＰ－セレクチン媒介性障害の治療を可能にすることもまた、十分に理解されるであろう。適切には、Ｐ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体の形成における低下及びこのような複合体の解離は、細胞間相互作用の間に生じる。そのため、適切には、本明細書において記載される抗Ｐ－セレクチン抗体又はその結合断片によって予防される障害は、細胞間相互作用におけるＰ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体のレベルの増加と関連する障害である。
Ｐ－セレクチン／ＰＳＧＬ－１複合体のレベルの増加は、幅広い障害及び／又は症状において観察されてもよい。特に、それらは、炎症性及び／又は血栓性障害及び／又は症状を有する対象又は対象由来のサンプルにおいて観察される。ゆえに、抗Ｐ－セレクチン抗体又はその結合断片を含む本発明の医薬組成物は、以下からなる群から選択される炎症性及び／又は血栓性障害などの障害を治療するために使用されてもよい：鎌状赤血球症、鎌状赤血球疼痛発作、関節炎（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、及び乾癬性関節炎）、移植片拒絶、移植片対宿主病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、皮膚炎、敗血症、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、虚血再灌流傷害（例えば心筋梗塞、脳卒中、又は臓器移植による）、癌（例えば、多発性骨髄腫）、並びに広範囲にわたる外傷と関連する状態又は例えば結核菌（Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｉ）による感染と関連する、例えばＩＶ型遅延型過敏症などの慢性炎症又は全身性炎症性反応症候群（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）又は多臓器不全。
鎌状赤血球疼痛発作は、鎌状赤血球症を有する対象が経験するかもしれない。抗Ｐ－セレクチン抗体又はその結合断片を含む本発明の医薬組成物は、対象における鎌状赤血球症における血管閉塞性疼痛発作を治療する及び予防することにおいて、特定の有用性を有していてもよい。適切には、鎌状赤血球症を有する対象は、以下からなる群から選択される遺伝子型を有する：ＨｂＳＳ、ＨｂＳＣ、ＨｂＳβ０－サラセミア、及びＨｂＳβ０＋サラセミア。
患者投与
Ｐ－セレクチン媒介性疾患又は病状の治療のための本発明の製剤の使用を提供することが、本発明の目的である。本発明は、Ｐ－セレクチン媒介性疾患又は病状、適切には鎌状赤血球症を治療するための方法であって、その必要がある対象に本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の医薬組成物は、Ｐ－セレクチン媒介性疾患又は病状、例えば炎症性及び血栓性疾患、腫瘍転移の予防及び治療に並びに特に、鎌状赤血球症と関連する血管閉塞、炎症、及び疼痛発作を、好ましくは、国際公開第２０１８／０８３６４５Ａ１号パンフレットの１３頁、第３段落から１９頁、第３段落において記載される投薬法により低下させる又は排除するのに有用であり、前記頁は、ここに、参照によって援用される。本発明の製剤は、単独の治療として又は本明細書において前に記載される状態を治療するのに有用な他の薬剤若しくは療法と併せて投与されてもよい。
一態様において、本発明は、Ｐ－セレクチン媒介性疾患又は病状の治療及び／又は予防において、例えば鎌状赤血球疼痛発作の予防において使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、最初に、導入期において提供され、この間、対象は、５ｍｇ／ｋｇ～７．５ｍｇ／ｋｇの量で、抗体の２回の導入用量を受け、２回の導入用量の間の時間間隔は、２週間（＋／ー３日）であり、次いで、維持期においてさらに、提供され、この間、対象は、５ｍｇ／ｋｇ～７．５ｍｇ／ｋｇの量で、抗体の複数回の維持用量を受け、複数回の維持用量の間の時間間隔は、４週間である、医薬組成物に関する。
一態様において、本発明の医薬組成物は、バイアル中にある。
一態様において、本発明の医薬組成物は、典型的に、注入を行う、等張溶液（例えば０．９％ＮａＣｌ又は５％ブドウ糖）を充填した注入容器（例えばプラスチックで作製された注入バッグ）にシリンジを介して医薬組成物を移すことによって、静脈内ルートによって患者に投与される。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象、典型的に、健康なボランティア又は患者に、好ましくは静脈内ルートによって、好ましくは５ｍｇ／ｋｇの量で、好ましくは、２週間間隔の２回の導入用量、その後に続く４週間毎の複数回の維持用量で、投与される。一実施形態において、血清中のクリザンリズマブ及びその任意のバリアントの濃度は、決定され、以下のＰＫパラメーターの１つ以上又はすべては、満たされる：
ａ）前記医薬組成物の投与後の、１．５～２．５ｈ、好ましくは１．９２ｈの好ましい中央値を有する、０．４～１０時間（ｈ）、好ましくは０．５５ｈ～６．２５ｈの範囲のｔｍａｘ；
ｂ）最初の用量後、１１６±９１．３μｇ／ｍＬ；又は好ましくは、定常状態で、５０～２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１２４±３１．６μｇ／ｍＬの範囲のＣｍａｘ；
ｃ）１００ｈ～３００ｈの範囲の、好ましくは１５０ｈ～２１０ｈの範囲の、例えば約１８３ｈ（７．６日）の見かけのｔ１／２；
ｄ）１００００～３００００μｇ×ｈ／ｍＬの範囲の、好ましくは１５週目に２０４００μｇ×ｈ／ｍＬの、好ましくは２３．５％の変動係数を有するＡＵＣｔａｕ，ｓｓ。「ｔａｕ」は、ここで、投薬間隔を指し、従って、ＡＵＣｔａｕ、定常状態（ｓｓ）は、１５週目１日目の注入の始まりから１９週目の日の注入の直前までのＡＵＣである；
ｅ）１０～３０ｍＬ／ｈ、好ましくは１５～２０ｍＬ／ｈの範囲の、例えば約１７．２ｍＬ／ｈの、ＳＣＤ及び典型的に７０ｋｇの体重を有する患者における、定常状態１５週目の平均クリアランス；
ｆ）約３．７８μｇ／ｍＬ～９．８μｇ／ｍＬの範囲の、定常状態において４週間毎に、とりわけ７週目～２７週目に得られるＰＫトラフ濃度。加えて、前回の注入の２週間後の３週目に、トラフ濃度は、約１２μｇ／ｍＬ～約２４μｇ／ｍＬ、好ましくは約１５μｇ／ｍＬ～約２１μｇ／ｍＬ、好ましくは約１８．２μｇ／ｍＬとなる。
血清中のクリザンリズマブ及びそのバリアントの濃度は、典型的にエクスビボにおいて、典型的にＥＬＩＳＡによって、典型的に、ベイトとしてＰ－セレクチンを使用して決定される。それゆえに、方法は、Ｐ－セレクチンに結合することが可能であり、好ましくは、アッセイにおいて使用される抗ヒトＩｇＧ抗体がさらに結合することができるすべての血清クリザンリズマブ及びそのバリアントを測定する。
典型的に、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血清中のクリザンリズマブ及びその任意のバリアントを検出するために使用される。高結合能のイムノプレートを、マウス抗ヒトＰ－セレクチン抗体によりコーティングした。プレートを、次いで、ヒトＰ－セレクチンによりコーティングした。定量化したクリザンリズマブ及びその任意のバリアントを、標準物質及び品質管理（ＱＣ）サンプルを調製するために使用し、次いで、指定されたサンプルウェルに追加した。結合したクリザンリズマブの量は、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ホースラディッシュペルオキシダーゼに共有結合されたストレプトアビジンタンパク質（ストレプトアビジン－ＨＲＰ）、及び発色基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の続く追加によって視覚化し、この反応の産物は、分光光度計により４５０ｎｍで検出した。血清サンプル中のクリザンリズマブ及びそのバリアントの濃度は、標準検量線から逆算する。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象、典型的に、健康なボランティア又は患者に、好ましくは静脈内ルートによって、好ましくは５ｍｇ／ｋｇの量で、好ましくは、２週間間隔の２回の導入用量、その後に続く４週間毎の複数回の維持用量で、投与され、血清中のクリザンリズマブ及びそのバリアントは、典型的に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される、ＰＳＧＬ－１へのＰ－セレクチンの結合の、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の阻害を達成する。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイは、インビトロ結合競合アッセイである。クリザンリズマブ及びその任意のバリアントの非存在下において、Ｐ－セレクチンのその標的ＰＳＧＬ－１への結合は、定量化可能なシグナルを産出し、１００％として設定される。例えば本発明の製薬組成物を追加することによる又は本発明の製薬組成物を受けたヒト対象から得られる血清を追加することによるクリザンリズマブ及びその任意のバリアントの追加は、Ｐ－セレクチンのＰＳＧＬ－１への結合を阻害し、シグナルの低下をもたらし、これを、阻害のパーセンテージとして計算することができる。
ＳＰＲアッセイの一実施形態において、Ｐ－セレクチンは、免疫グロブリンに融合されたＰ－セレクチン（ＰＳｅｌ－Ｉｇ）によって置換され、ＰＳＧＬ－１は、ＰＳｅｌ－Ｉｇに結合することがなお可能なＰＳＧＬ－１の最小限のペプチドバージョンに相当するグリコスルホペプチド（ｇｌｙｃｏｓｕｌｆｏｐｅｐｔｉｄｅ）６（ＧＳＰ６）によって置換される。
さらなるＳＰＲの実施形態は、実施例６において詳細に説明される。
一態様において、本発明の医薬組成物は、クリザンリズマブ及びイソ－クリザンリズマブを含み、医薬組成物を使用することによって決定されるＩＣ５０は、約４～７μｇ／ｍｌ、典型的に約４．６～６．２μｇ／ｍｌ、典型的に約５．０～５．７μｇ／ｍｌの範囲、典型的に約５．２μｇ／ｍｌである。一実施形態において、ＩＣ５０は、インビトロアッセイにおいて決定される。
実施例１：ＳＥＧ１０１の液体製剤の調製
ＳＥＧ１０１は、例えば、国際公開第２００８／０６９９９９号パンフレットの１５頁、２０行目～１８頁、２９行目において記載される方法によって産生することができ、これらの頁は、参照によって本明細書において援用される。表２は、ＳＥＧ１０１に対するそれらの適合性について試験した製剤を示す。サンプルＢ及びＣ並びにサンプルＦ及びＧは、それぞれ、製剤内のばらつきを判定するために同一とする。
Figure 2023501155000003
１ 結果
１．１ 力価アッセイ
すべてのサンプルについて、ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイによって測定する力価は、予想される範囲内での安定性についての研究に着手した時のものとした。ＥＬＩＳＡの通例の基準は、参照物質と比較して、８０％～１２５％の相対的生物学的活性であった。
結合ＥＬＩＳＡによる力価アッセイは、サンプル又は安定性について測定した時点のいずれについても重要な変化を示さなかった（表３）。細胞ベースのアッセイ（表４）において、力価の著しい低下は、すべてのヒスチジン及び／又はアルギニン含有サンプル（表３）について４０℃／２週間並びに２５℃／１２週間で観察された。リン酸又はクエン酸バッファー中のサンプルは、力価におけるこのような低下を示さなかった。
製剤Ｋについての別個の実験において、力価を、様々な時点において、ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイによって（他の製剤と同じ方法を使用して）測定した（表５）。
Figure 2023501155000004
Figure 2023501155000005
Figure 2023501155000006
サンプルは、密封したバイアル中に保った。バイアルの外側の湿度は、実際には、薬剤の安定性にとって重要ではない。
１．２ ＣＺＥによるチャージバリアント
長期的な保存条件（２～８℃）では、チャージバリアントプロファイルにおける徐々の変化は、非常に限られたものしかなかった。しかしながら、変化は、温度を上げた（２５℃）及びストレスがかかる（４０℃）条件では、非常に明白である。
１．２．１ 分解過程に対するｐＨ値の影響
ＣＺＥメインピークにおける変化は、主に、温度によって引き起こされるように思われ、重要な違いは、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０の設定点の間では観察されない（図１、表６）。
Figure 2023501155000007
出発物質と比較して、塩基性バリアントは、ｐＨ６．０で増加したが、ｐＨ７．０では、徐々に減少することが、観察される（図２、表７）。ｐＨ６．０の２～８℃では、塩基性ピークのレベルは、ほぼ一定のままであったが、２～８℃のｐＨ７．０では、遅いが一定の減少が、観察された。温度を上げた条件（２５℃）では、ｐＨ６．０及び７．０の両方で、プラトーに達するように思われる。
Figure 2023501155000008
塩基性ピークのｐＨ依存性の様々な発生とは対照的に、酸性バリアントは、出発物質と比較して、両方のｐＨ値で徐々に増加する（図３）。ｐＨ７．０では、酸性バリアントの相対的ピーク面積において観察される増加は、すべての温度で、ｐＨ６．０と比較して量が約２倍である。さらにまた、ｐＨ６．０では、酸性バリアントにおける非常に小さな増加のみ、２～８℃で検出可能である。
そのため、ｐＨ６．０の製剤は、長い間にわたって、チャージバリアントプロファイルにおける絶対的な変化をそれほど示さず、ｐＨ７．０の製剤と比較して、保存の間に、よりむらのない製品品質を提供すると結論づけることができる。
Figure 2023501155000009
製剤Ｋについての別個の実験において、チャージ不均一性を、様々な時点において、ＣＺＥによって（他の製剤と同じ方法を使用して）測定した（表９）。
Figure 2023501155000010
１．３ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による純度
すべての試験した条件で、凝集体のレベルは、ｐＨ６．０の製剤で１．５％～２％であり、ｐＨ７．０の１０ｍｇ／ｍＬの製剤で２％～２．５％である（図４、表１０～１２）。凝集体のレベルにおいて重要な変化は、観察されない。断片は、およそ０．１％の分量で存在する。モノマーのピークは、＞９６％であり、また、保存時間にわたってほとんど変化を示さない。ｐＨ７．０の５０ｍｇ／ｍＬ製剤は、保存時間にわたって、まぎれもなくより高い凝集体レベルを示し、ストレスがかかっている条件では最高約４％に至る。
Figure 2023501155000011
Figure 2023501155000012
Figure 2023501155000013
製剤Ｋについての別個の実験において、純度を、様々な時点において、ＳＥＣによって（他の製剤と同じ方法を使用して）測定した（表１３）。
Figure 2023501155000014
実施例２：ＳＥＧ１０１の生理活性を測定するためのアッセイ
２．１ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにおいて、ＳＥＧ１０１サンプルの力価及び同一性は、組換えヒトＰ－セレクチンに結合するそれらの能力に基づいて測定する。ＥＬＩＳＡプレートを、組換えヒトＰ－セレクチンによりコーティングし、段階的な量のＳＥＧ１０１を追加する。結合したＳＥＧ１０１は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにつながれた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用し、その後に続く比色基質の追加によって、定量化する。比色反応の結果は、光吸収によって測定する。ＳＥＧ１０１試験サンプルの力価は、Ｐ－セレクチンに結合するその能力を、ＳＥＧ１０１参照標準と比較することによって、定量化する。サンプル及び標準物質は、タンパク質含有量に基づいて標準化する。相対的な力価は、欧州薬局方に従って平行線定量法を使用して計算する。最終的な結果は、参照標準と比較した、サンプルの相対的な力価として（パーセントで）表す。
２．２ 細胞ベースのアッセイ－Ｐ－セレクチン発現Ｒａｊｉ細胞のＰＳＧＬ－１への付着の阻害
Ｖ底マイクロタイタープレートを、組換えヒトＰＳＧＬ－１によりコーティングし、次いで、段階的な量のＳＥＧ１０１を追加する。表面にヒトＰ－セレクチンを提示するように組換え修飾したＲａｊｉ細胞を、蛍光標識し、プレートに追加する。インキュベーション後、プレートを、遠心分離すると、非付着細胞は、Ｖ字形のウェルの底に蓄積し、非付着細胞を蛍光リーダーを使用して測定する。ＳＥＧ１０１試験サンプルの力価は、Ｐ－セレクチン発現Ｒａｊｉ細胞のＰＳＧＬ－１への付着を阻害するその能力をＳＥＧ１０１参照標準と比較することによって定量化する。サンプル及び標準物質は、タンパク質含有量に基づいて標準化する。相対的な力価は、欧州薬局方に従って平行線定量法を使用して計算する。最終的な結果は、参照標準と比較した、サンプルの相対的な力価として（パーセントで）表す。
Figure 2023501155000015
実施例３：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による純度
この試験は、ＵＶ検出とサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に基づく。様々なサイズのバリアント（例えば低分子量及び高分子量バリアント並びに不純物）を、適したカラムで未変性条件下でＳＥＣによって分離する。メインピークの純度並びに凝集体及び断片の量は、各クロマトグラムにおけるサンプルについて得られた総面積のうちのパーセンテージとして決定する。
使用するＨＰＬＣシステムは、ポンプ、注入システム、及びオンラインデガッサー、冷却装置を備えたオートサンプラー、カラム加熱、並びに２１０ｎｍで吸光度をモニターすることが可能なＵＶ検出器を備えた適した高速液体クロマトグラフィーシステムとする。カラムは、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、５μｍ；７．８ｍｍ×３００ｍｍ又は等価物とする。
サンプル溶液を、およそ０．７５ｍｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬの最終濃度まで、移動相（ｐＨ６．５±０．１の１５０ｍＭリン酸カリウム溶液）により希釈する。参照溶液を作製するために、参照物質を、およそ０．７５ｍｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬの最終濃度まで、移動相により希釈する。移動相を、ブランクとして使用する。ＬＯＱ溶液は、およそ０．７５μｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬ、２ｍｇアプロチニン／ｍＬの最終濃度まで、アプロチニン溶液により参照物質を希釈することによって作製する。
クロマトグラフィー条件は、流速０．４ｍＬ／分、ＵＶ２１０ｎｍによる検出、カラム温度３０℃±２℃、オートサンプラー温度およそ５℃、実行時間３５分間、並びに参照溶液中およそ７．５μｇのＳＥＧ１０１と等価な注入容量１０μＬの試験溶液及び参照溶液として調整した。ブランクのクロマトグラムにおいて、干渉ピークは、ブランクにおいて検出されるべきではなく、試験溶液のクロマトグラムの統合範囲において、シグナルの高さ≧ＬＯＱシグナルの高さとなるべきである。定量限界（ＬＯＱ）は、ＳＥＧ１０１ピークについて、シグナルノイズ比≧１０となるようにする。ピーク面積の再現性は、ＰＡｒｅｆによって割ったＰＡｓａｍｐｌｅが、少なくとも０．８０、最大１．２０となるようにするべきである。ＰＡｓａｍｐｌｅは、ｍＡＵ×ｍｉｎでの個々のサンプル注入ごとの総ピーク面積を指す。ＰＡｒｅｆは、ｍＡＵ×ｍｉｎでのサンプルブロックの前の参照注入についての総ピーク面積を指す。
純度（メインピークの％Ｐ）、０．９５の相対保持時間のピークを有していない凝集体（メイン構成成分よりも前に溶出する）の合計（％）、及び断片（メイン構成成分よりも後に溶出する）の合計（％）について報告する。０．９５の相対保持時間（モノマー／メインピークの保持時間と比べた保持時間）のピークについて、個々に報告する。
実施例４：ＣＺＥによる同一性及びチャージ不均一性
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の分離原理は、電場において様々な質量対実効電荷比を有するタンパク質の様々な電気泳動易動度に基づく。そのｐＩを下回るｐＨでは、各タンパク質は、正に荷電し、陽極から陰極に移動する。メインピークと比較したタンパク質バリアントの移動速度は、タンパク質バリアントの質量対実効電荷比の増加と共に速くなる。明確にするために、用語「メインピーク」は、たとえ、ある条件下で、医薬組成物中の主な形態がイソ－クリザンリズマブ形態であっても、クリザンリズマブを指す。種々の理由により、様々な易動度がもたらされるかもしれないが、メインバリアントよりも速く移動するバリアントは、「塩基性バリアント」と一般に命名され、ゆっくり移動するバリアントは、「酸性バリアント」と命名される。ＵＶ吸光度による検出の後に、チャージバリアントは、相対的時間補正ピーク面積の決定によって定量化する。
同一性は、コミックスにおけるメインピークパターンを観察することによって又は電気泳動図を比較することによって決定する。
２１４ｎｍでの検出が可能なＵＶ検出器を備えたキャピラリー電気泳動システムを、使用することができる。毛細管は、コーティングしてない溶融シリカ毛細管、内径５０μｍとする。
サンプル溶液を、およそ３．０ｍｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬの最終濃度まで、サンプルバッファー（５ｍＭリン酸ｐＨ７．３±０．１）により希釈する。参照物質を、およそ３．０ｍｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬの最終濃度まで、サンプルバッファーにより希釈する。感度溶液は、およそ６０μｇ ＳＥＧ１０１／ｍＬの最終濃度まで、サンプルバッファーにより参照物質を希釈することによって作製する。コミックス溶液は、３：２の比（ｖ／ｖ）で、参照溶液と試験溶液を混合することによって作製する。サンプルバッファーを、ブランクとして使用する。
電気泳動条件は、入口から検出器まで毛細管の長さが４０ｃｍ、毛細管の毛細管全長が５０ｃｍ、電圧が２０ｋＶ、極性が正、毛細管温度が２５℃±２℃、オートサンプラー温度が１５℃±３℃、実行時間が４５分間、データ転送速度が８Ｈｚ、検出が２１４ｎｍ、及び口径が１００×８００μｍ並びに注入時間が８秒間０．５ｐｓｉ（４ｐｓｉ×秒）となるように調整する。
干渉ピークは、ブランクにおいて検出されるべきではなく、サンプルの電気泳動図の統合範囲において、シグナルの高さ≧ＬＯＱシグナルの高さとなるべきである。分離度は、Ｒｓ≧１．４となるべきであり、分離度Ｒｓは、毛細管の性能を評価するために、参照溶液の最初及び最後の注入について計算する。定量限界（０．６０％）を確立するために、ＬＯＱ溶液（２．０％希釈）におけるＳＥＧ１０１メインピークについてのシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）を、≧１０にしなければならない。ピーク面積の再現性は、ＰＡｒｅｆによって割ったＰＡｓａｍｐｌｅが、少なくとも０．８０、最大１．２０となるようにするべきである。ＰＡｓａｍｐｌｅは、試験溶液の個々の注入ごとの時間補正総ピーク面積を指し（ｍＡＵ）、ＰＡｒｅｆは、参照溶液の最初の注入についての時間補正総ピーク面積を指す（ｍＡＵ）。
純度については、各サンプルごとに、酸性バリアントの相対的時間補正ピーク面積（メインピークと比べた移動時間＞１．０）、塩基性バリアントの相対的時間補正ピーク面積（メインピークと比べた移動時間＜１．０）、及びメインピークについて報告する。チャージバリアント＜０．６０％（ＬＯＱ）は、酸性バリアント又は塩基性バリアントの合計の計算に含まない。
同一性については、コミックス溶液中のメインピークについて観察される単一のピークが、必要とされる。追加的に、サンプル溶液のピークパターンを、参照のピークパターンと比較する。
実施例５：ＳＥＧ１０１の凍結乾燥製剤の調製
表２は、ＳＥＧ１０１に対するそれらの適合性について試験した液体製剤を示す。
ＳＥＧ１０１はまた、さまざまな異なるタンパク質濃度、凍結乾燥保護剤対タンパク質モル比、及び非晶凍結乾燥保護剤のみ（スクロース）の又は結晶増量剤（マンニトール）と組み合わせた使用を包含する６つの異なる凍結乾燥製剤に製剤した。製剤の正確な組成を、表１５に示す。
Figure 2023501155000016
５．１ 凍結乾燥プロセス条件
製剤組成、すなわち非晶対部分的に結晶の製剤における違いにより（表１５）、２つの異なる凍結乾燥プロセスを、遂行した。
表１６に要約される第１の実行を、非晶製剤ＤＰ１、ＤＰ２、及びＤＰ３について選択した。表１７に要約される第２の実行において、スクロース及びマンニトールの組み合わせを含有する製剤、すなわちＤＰ４、ＤＰ５、及びＤＰ６を、凍結乾燥した。ＰＤフェーズの間の両方の実行におけるチャンバー圧力を、０．１３３ｍｂａｒに設定した。二次乾燥フェーズ（ＳＤ）を、両方の実行について同一とした。全体的な乾燥材料含有量が候補の製剤において比較的高いので（非晶製剤において最高４４３ｍｇ及び部分的に結晶の製剤において最高５５７ｍｇ）、残留する湿気レベルの増加のリスクがある。そのため、ＳＤの間のチャンバー圧力を、０．０５ｍｂａｒまで低下させ、設定棚温度を、８時間３０℃とした。
Figure 2023501155000017
Figure 2023501155000018
５．２ 安定性
凍結乾燥安定性研究の目的は、６つの凍結乾燥ＳＥＧ１０１製剤（表１５）の物理化学的安定性を比較することであった。製剤を、予定される（５±３℃）、温度を上げた（２５±２℃、６０±５％ｒ．ｈ．；ｒ．ｈ．：相対湿度）、及びストレス（４０±２℃、７５±５％ｒ．ｈ．）保存条件に、最高１２ヵ月曝露し、分析した。
凍結乾燥プロセスに入ろうとしている凍結乾燥前の溶液についての結果と、凍結乾燥サイクル直後に溶解した溶液についての結果との比較は、溶解及び凍結乾燥サイクル自体は、実際には、製剤の物理化学的特性に対して影響を有していないことを示す。
５．３ ＳＥＣによる凝集体及びＣＺＥによるチャージバリアントの決定
凍結乾燥製剤を、様々な時点で、ＡＰＷ（追加的に精製した水）中に溶解し、ＳＥＣ（表１８）及びＣＺＥ（表１９）による分析にかけた。
Figure 2023501155000019
Figure 2023501155000020
５．４ ＤＰ２についてのさらなる研究
５．４．１ 長期安定性試験（５℃）
５℃でのＤＰ２の６ヵ月の保存後、結果はすべて、長期保存条件のために設定される必要条件の範囲内にある。試験した品質の特徴すべてについて、いかなる傾向もなかった。
５．４．２ 温度を上げた安定性試験（２５℃／６０パーセントＲＨ）
２５℃／６０％ＲＨでのＤＰ２の６ヵ月の保存後、表２０に示す結果を除く品質の特徴すべてについて、いかなる傾向もなかった。すべての他の方法についての結果は、温度を上げた条件について予想される傾向をたどる。結果はすべて、長期保存条件のために設定される必要条件の範囲内にある。
Figure 2023501155000021
５．４．３ ストレス安定性試験（摂氏４０度／７５パーセントＲＨ）
４０℃／７５％ＲＨでのＤＰ２の６ヵ月の保存後、表２１に示す結果を除く品質の特徴すべてについて、いかなる傾向もなかった。
すべての他の方法についての結果は、ストレス条件について予想される傾向をたどる。結果はすべて、長期保存条件のために設定される必要条件の範囲内にある。
Figure 2023501155000022
５．５ 他の分析方法についての結果
すべての溶解した製剤は、すべての抜き取り時点で実質的に可視粒子がなく、無色であった。ＵＶ含有量及びｐＨは、すべてのストレス条件で変化していなかった（方法によるばらつき又は予想されるバイアル間のばらつきの範囲内であった）。ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイにより決定される製剤ＤＰ１、ＤＰ２、及びＤＰ３の生物学的活性は、４０℃で６ヵ月後に並びにＤＰ１及びＤＰ２については５℃及び２５℃で１２ヵ月後に、変化していなかった（予想される方法によるばらつきの範囲内であった）（表２２）。
Figure 2023501155000023
実施例６：表面プラズモン共鳴解析（ＳＰＲ）を使用するヒトサンプル（ＰＤ）におけるクリザンリズマブ及びその任意のバリアントによるＰ－セレクチン阻害の測定
ＳＰＲベースの方法は、クリザンリズマブにより治療されたヒトドナー由来のヒト血清サンプルにおけるクリザンリズマブのエクスビボＰ－セレクチン阻害％を測定するために使用した。このＰＤアッセイにより、Ｐ－セレクチン（抗原；リガンド）がＰＳＧＬ－１（リガンド受容体）に結合するのをブロックする、血清中のクリザンリズマブ及びそのバリアントの能力を測定した。クリザンリズマブ及びその任意のバリアントによるブロックは、ＰＳＧＬ－１結合ドメインを模倣するペプチドアナログである、グリコスルホペプチド６（ＧＳＰ－６）に結合する、免疫グロブリンに融合された添加Ｐ－セレクチン（Ｐｓｅｌ－Ｉｇ）の阻害％として測定した。例えば、ストレプトアビジンを、標準的なアミンカップリングを使用して、使用されるバイオセンサーチップの２つのチャネル（ＦＣ－２及びＦＣ－３）上に固定し、その後、解析用のペプチドを固定するためにビオチン化ＧＳＰ－６を注入した。参照チャネル（ＦＣ－１）は、ビオチンブロッキングストレプトアビジンによって調製した。治療前のサンプルにより、対象ごとの最大の結合を確かめ、これを、種々の時点での対象由来の投薬後血清サンプルを使用して阻害％を計算するための基準として使用した。一連の希釈液中の定量化したクリザンリズマブ及びその任意のバリアントは、標準阻害曲線を生成するために使用し、すべての条件下でクリザンリズマブについて５．２μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を示した。
Ｐｓｅｌ－Ｉｇを有していない及びＰｓｅｌ－Ｉｇを有するブロッキングバッファーと混合したＳＣＤを有する患者由来の血清サンプルは、それぞれ、ネガティブコントロールサンプル及びポジティブコントロールサンプルとして機能した。
アッセイは、患者から収集した血清中のクリザンリズマブ及びその任意のバリアントが実際に標的と結合することを示す。患者血清中のクリザンリズマブ及びその任意のバリアントは、グリコスルホペプチド６（ＧＳＰ－６）に結合する添加Ｐ－セレクチン（Ｐｓｅｌ－Ｉｇ）の９８％をブロックした。

Claims (54)

  1. それぞれ配列番号１０及び配列番号９の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を有するクリザンリズマブ並びに配列番号１０の３２位のアミノ酸であるアスパラギン酸が、イソアスパラギン酸に変わったクリザンリズマブのバリアント（イソ－クリザンリズマブ）を含む医薬組成物。
  2. 配列番号１０の３２位がスクシンイミドであるクリザンリズマブをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記イソ－クリザンリズマブは、ホモ－イソ－クリザンリズマブ及びヘテロ－イソ－クリザンリズマブからなる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 前記医薬組成物において総チャージバリアントのうち、少なくとも２０％のクリザンリズマブを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記医薬組成物において前記総チャージバリアントのうち、５０％以下のクリザンリズマブを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記医薬組成物において前記総チャージバリアントのうち、約２０％～約５０％のクリザンリズマブを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 緩衝系をさらに含み、前記組成物は、約５．５～約７．５のｐＨを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記ｐＨは、約５．５～約７、好ましくは約５．５～約６．５、好ましくは約５．７～約６．３である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記ｐＨは、約５．９～約６．１である、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
  10. 前記緩衝系は、クエン酸バッファーである、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 前記緩衝系は、リン酸バッファーである、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 安定化剤をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 前記安定化剤は、スクロースである、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. スクロースは、５０ｍＭ～３５０ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ～３００ｍＭの濃度である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 等張化剤をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  16. 前記等張化剤は、塩化ナトリウムである、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 塩化ナトリウムは、５０ｍＭ～３００ｍＭの濃度である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 界面活性剤をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記界面活性剤は、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０である、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記界面活性剤、好ましくはポリソルベートは、０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍＬ）～０．１％ｗ／ｖ（１ｍｇ／ｍＬ）の濃度である、請求項１８～２０のいずれかに記載の医薬組成物。
  22. 抗体は、５ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 約５～約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体及び緩衝系を含む医薬組成物であって、前記組成物は、約５．５～約７．５のｐＨを有する、医薬組成物。
  24. 前記ｐＨは、約５．７～約６．３である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記緩衝系は、クエン酸（例えばクエン酸ナトリウム）及び／又はリン酸（例えばリン酸カリウム）である、請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。
  26. 安定化剤をさらに含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記安定化剤は、スクロースである、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記安定化剤は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの濃度で存在する、請求項２６又は２７に記載の医薬組成物。
  29. 非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 前記界面活性剤は、ポリソルベート８０である、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記界面活性剤は、約０．０１％ｗ／ｖ（０．１ｍｇ／ｍｌ）～０．１％ｗ／ｖ（１ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在する、請求項２９又は３０に記載の医薬組成物。
  32. 等張化剤をさらに含む、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  33. 前記等張化剤は、ＮａＣｌである、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 前記等張化剤は、約５０ｍＭ～３００ｍＭの濃度で存在する、請求項３２又は３３に記載の医薬組成物。
  35. 約５～約５０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体（クリザンリズマブ及びその任意のバリアント）、約５０ｍＭ～約３５０ｍＭの濃度のスクロース、並びに緩衝系を含む医薬組成物であって、前記組成物は、約５．５～約７．５のｐＨを有する並びに前記緩衝系は、クエン酸バッファー及び／又はリン酸バッファーである、医薬組成物。
  36. 前記医薬組成物のｐＨは、約５．７～約６．３、例えば約６．０である、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 凍結乾燥形態した請求項１～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  38. 水性の製剤を凍結乾燥することによって得ることができる凍結乾燥製剤であって、前記凍結乾燥製剤は、
    ａ）抗体（クリザンリズマブ及びその任意のバリアント）；
    ｂ）凍結乾燥保護剤、並びに
    ｃ）緩衝系
    を含む、凍結乾燥製剤。
  39. 界面活性剤をさらに含む、請求項３８に記載の凍結乾燥製剤。
  40. 前記界面活性剤は、ポリソルベート８０である、請求項３９に記載の凍結乾燥製剤。
  41. 抗体は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で前記水性の製剤中に存在する、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
  42. 前記緩衝系は、クエン酸、例えばクエン酸ナトリウムである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
  43. 凍結乾燥保護剤としてスクロース及び／又はマンニトールをさらに含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
  44. 前記水性の製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースを含む、請求項３８～４３のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
  45. 抗体に対するスクロースのモル比は、約２００～１５００である、請求項４３～４４のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
  46. 前記凍結乾燥製剤の総重量に基づいて
    ａ）約２５～４０ｗ／ｗ％、好ましくは約２８～３２ｗ／ｗ％の抗体；及び
    ｂ）約５５～７５ｗ／ｗ％、好ましくは約６５～７１ｗ／ｗ％のスクロース
    を含む、請求項３８～４５のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
  47. 請求項３７～４６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤を溶解することによって得られる液体医薬組成物。
  48. 前記医薬組成物を使用することによって決定されるＩＣ５０は、約４．６～６．２μｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１～３７、４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  49. 前記ＩＣ５０は、インビトロにおいて決定される、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 鎌状赤血球症の治療、とりわけ、血管閉塞発作（ＶＯＣ）の予防を、その必要がある対象において行うための方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物中に含まれる、治療的に有効な用量の抗体（クリザンリズマブ及びその任意のバリアント）を対象に投与することを含み、前記治療的に有効な用量は、対象の体重１キログラムにつき５ｍｇ又は７．５ｍｇである、方法。
  51. 最初の２回の用量は、２週間間隔で投与され、その後、４週間毎に同じ用量が投与される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記医薬組成物は、静脈内ルートによって対象に投与される、請求項５０又は５１に記載の方法。
  53. 前記治療的に有効な用量は、対象の体重１キログラムにつき５ｍｇであり、前記最初の２回の用量は、２週間間隔で投与され、その後、４週間毎に同じ用量が投与され、並びに以下のＰＫパラメーター：
    ａ）前記医薬組成物の投与後の、１．５～２．５ｈ、好ましくは１．９２ｈの好ましい中央値を有する、０．４～１０時間（ｈ）、好ましくは０．５５ｈ～６．２５ｈの範囲のｔｍａｘ；
    ｂ）最初の用量後、１１６±９１．３μｇ／ｍＬ；又は好ましくは、定常状態で、５０～２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１２４±３１．６μｇ／ｍＬの範囲のＣｍａｘ；
    ｃ）１００ｈ～３００ｈの範囲の、好ましくは１５０ｈ～２１０ｈの範囲の、例えば約１８３ｈ（７．６日）の見かけのｔ１／２；
    ｄ）１００００～３００００μｇ×ｈ／ｍＬの範囲の、好ましくは１５週目に２０４００μｇ×ｈ／ｍＬの、好ましくは２３．５％の変動係数を有するＡＵＣｔａｕ，ｓｓ；
    ｅ）１０～３０ｍＬ／ｈ、好ましくは１５～２０ｍＬ／ｈの範囲の、例えば約１７．２ｍＬ／ｈの、好ましくは、ＳＣＤ及び７０ｋｇの体重を有する患者における、定常状態１５週目の平均クリアランス；
    ｆ）約３．７８μｇ／ｍＬ～９．８μｇ／ｍＬの範囲の、定常状態において４週間毎に、とりわけ７週目～２７週目に得られるＰＫトラフ濃度
    の１つ以上又はすべてが満たされる、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 血清中のクリザンリズマブ及びその任意のバリアントは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の、Ｐ－セレクチンのＰＳＧＬ－１との結合の阻害を達成する、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
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