KR20220092917A

KR20220092917A - 크리잔리주맙 함유 항체 제형

Info

Publication number: KR20220092917A
Application number: KR1020227017799A
Authority: KR
Inventors: 파비안 비켈; 리나 보아도; 디르크 헬리우스; 프랑수아 그리아우트; 캐롤라인 힐베르트; 프리더 크뢰너; 위르겐 지그; 라이제카어 파울; 마자 안코; 알료사 옐렌코
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2022-07-04
Also published as: JP2023501155A; AU2020373017A1; TW202128221A; JOP20220097A1; PE20221276A1; CO2022005207A2; IL292403A; MX2022005044A; CN114828826A; BR112022008097A2; WO2021087050A1; EP4051236A1; US20220378912A1; CA3158921A1; ECSP22033601A; CL2022001085A1

Abstract

본 발명은 인간 P-셀렉틴에 대항하는 항체, 특히 SEG101, 또는 크리잔리주맙과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체의 신규한 약제학적 제형, 및 이의 제조 방법 및 상기 제형의 용도에 관한 것이다.

Description

크리잔리주맙 함유 항체 제형

본 발명은 인간 P-셀렉틴에 대항하는 항체, 특히 SEG101, 또는 크리잔리주맙(crizanlizumab)과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체의 신규한 약제학적 제형, 및 이의 제조 방법 및 상기 제형의 용도에 관한 것이다.

P-셀렉틴은 다수의 염증성 및 혈전성 질환에 기여한다. 따라서, P-셀렉틴을 표적화하는 치료제, 예컨대, WO 2008/069999에 개시된 바와 같은 인간 P-셀렉틴에 대항하는 항체, 특히 SEG101(크리잔리주맙 및 SelG1로도 알려짐)이 염증성 및 혈전성 질환을 치료하는 수단으로서 사용될 수 있다.

제형화된 항체는 저장 중 화학적 및 물리적 불안정성으로 인해 생물학적 활성을 잃을 수 있다. 항체 또는 심지어 부형제의 분해, 전하 변이체의 형성 및 이성질화 반응은 시간 경과에 따라 안전성 문제 및 제형의 역가 및 효능 감소로 이어지는 흔한 요인들 중 하나이다.

편리하게는, 단백질 치료제, 예를 들어, 항체의 액체 약제학적 제형은 장기간 안정해야 하며, 안전하고 유효한 양의 치료제를 함유해야 한다. 응집체의 형성 및 제조, 저장 및 전달의 어려움과 같은 물리적 및 화학적 안정성과 관련된 난제에 더하여, 단백질 치료제의 액체 제형의 문제는 분해 및 전하 변이체의 형성인데, 이는 안전성 문제 유발 이외에 관심있는 단백질의 활성 및 기능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 전하 변이체 및/또는 동형과 같은 다른 분자 종의 형성 및 분해 속도를 최소화하면서, 단백질 치료제를 장기간에 걸쳐 안정하게 유지할 수 있는 제형의 개발이 필요하다.

본 발명의 목적은 특히 저장 및 전달 시에 안정한, 특히 크리잔리주맙 또는 크리잔리주맙과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체를 위한 항-P-셀렉틴 항체 제형을 제공하는 것이다. 추가로, 목적은 정맥내(i.v.) 투여에 적합한 안정한 액체 항체 제형을 제공하는 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙, 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산이 이소아스파르트산으로 변경된 크리잔리주맙의 변이체(이소-크리잔리주맙)을 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 적합하게는 그리고 바람직하게는, 약제학적 조성물은 약제학적 조성물을 위한 5.5 내지 7.5, 바람직하게는 5.7 내지 7.0, 바람직하게는 5.7 내지 6.3의 pH 값으로 야기하는 완충 시스템을 추가로 포함한다.

약제학적 조성물은 인간 대상체에 투여하기에 적합해야 한다. 함유된 활성 성분으로부터 유도되는 효과와는 별도로, 약제학적 조성물은 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합해야 한다.

일 양태에서, 본 발명은 인간 P-셀렉틴에 대한 항체, 바람직하게는 크리잔리주맙, 또는 크리잔리주맙과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체를 포함하는, 신규한 약제학적 조성물로서, pH 값은 5.5 내지 7.5, 5.7 내지 7.0, 바람직하게는 5.7 내지 6.3인, 약제학적 조성물에 관한 것이다.

도 1은 CZE 주요 피크에 대한 제형 pH의 영향이다.
도 2는 CZE 염기성 피크에 대한 제형 pH의 영향이다.
도 3은 CZE 산성 피크에 대한 제형 pH의 영향이다.
도 4는 SEC에 의해 스크리닝된 제형의 순도이다.
도 5는 크리잔리주맙의 pH 의존적 이성질화이다.

정의

본 개시를 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 개시의 문맥에서(특히 청구항의 문맥에서) 사용되는 용어 부정관사, 정관사, 및 유사한 용어는 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수형과 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 이와 같이, 용어 "어느 하나의"(또는 "어느 한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

"및/또는"은 목록의 구성 요소 또는 특징의 각각 하나 또는 둘 모두 또는 모두가 가능한 변이체, 특히 대안적 또는 누적 방식으로 이들의 둘 이상임을 의미한다.

수치 X와 관련하여 용어 "약"은, 예를 들어, X ± 10%, X ± 5%, X ± 3%(이러한 범위 내의 모든 값 포함)를 의미한다.

어구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간을 의미하는 것으로 여겨진다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상체는 상기 대상체가 그러한 치료로부터 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 유익할 경우 치료를 "필요로 하는" 것이다.

용어 "치료"는 다음을 포함한다: (1) 상태, 장애 또는 병태에 걸렸거나 걸리기 쉽지만 그러한 상태, 장애 또는 병태의 임상적 또는 아임상적 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않은 동물, 특히 포유동물 및 특히 인간에서 발병하는 상태, 장애 또는 병태의 임상 증상의 출현을 예방하거나 지연시키는 것; (2) 상태, 장애 또는 병태를 억제하는 것(예를 들어, 적어도 하나의 이의 임상적 또는 아임상적 증상의 유지 치료의 경우 질환 발병 또는 이의 재발을 저지하거나, 감소시키거나, 지연시키는 것); 및/또는 (3) 병태를 완화시키는 것(즉, 상태, 장애 또는 병태 또는 이의 임상적 또는 아임상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 야기하는 것)을 포함한다. 치료하고자 하는 환자에게 주는 이익은 통계적으로 유의하거나 환자 또는 의사가 적어도 인지할 수 있다. 그러나, 질환을 치료하기 위해 약제가 환자에게 투여될 때, 결과가 항상 효과적인 치료가 아닐 수 있음이 인지될 것이다.

상세한 설명

단백질 치료제의 액체 제형은 단백질 치료제의 생물학적 활성을 그대로 보존하고 제조 및 저장 수명 동안 단백질 치료제의 작용기를 분해로부터 보호해야 한다. 단백질의 분해 경로는 화학적 불안정성(예를 들어, 탈아미드화, 산화, 클리핑, 이성질화 등) 또는 물리적 불안정성(예를 들어, 응집체의 형성)을 수반할 수 있다. 항체의 상이한 분해 생성물은, 예를 들어, 모세관 등전 집속(capillary isoelectric focusing; cIEF), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 또는 모세관 영역 전기영동(capillary zone electrophoresis)(예를 들어, doi: 10.1016/j.jchromb.2017.02.017 및 doi: 10.4161/mabs.2.6.13333 참조)과 같이 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 전하 변이체로서 검출될 수 있다. 일반적인 전하 변이체는 시알산, 탈아미드화, C-말단 리신, N-말단 글루탐산, 비가공 리더 서열, 아스파트 산의 이성질화 및 석신이미드의 형성이다(Yi Du, et al., 2012. DOI: 10.4161/mabs.21328).

크리잔리주맙의 미세이질성은 다량의 상이하게 변형된 변이체를 초래하는 변형 또는 화학적 분해와 관련이 있다. 크리잔리주맙에 대한 주요 변이체는 대략 1:3의 몰비로 아스파르트산 및 이소아스파르트산으로 가수 분해될 수 있는 사이클릭 이미드 중간체(석신이미드)의 형성 단계를 통해 경쇄(CDR에서)의 32번 위치에서 아스파르트산의 이소아스파트 산으로의 이성질화(본원에서 "이소-크리잔리주맙"로 지칭되는 변이체를 제공함)를 통해 형성된다. 그러나, 놀랍게도 이소-크리잔리주맙은 이러한 변형이 CDR에 있더라도 크리잔리주맙과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상응하는 석신이미드 중간체는 생리학적 조건 하에서 아스파르트산 및 이소-아스파르트산으로 가수분해될 수 있는데(각각 크리잔리주맙 및 이소-크리잔리주맙을 제공함), 이는 석신이미드 변이체가 환자에게 투여된 후 생물학적 활성 형태로 전환될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 발견에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 크리잔리주맙 및 다량의 상이한 변이체를 함유하더라도 크리잔리주맙의 생물학적 활성을 유지하고 장기간 동안 안정하다. 또한, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드의 존재는 면역원성 문제를 나타내지 않는다. 용어 "면역원성"은 본 발명의 약제학적 조성물을 건강한 지원자 또는 이를 필요로 하는 환자와 같은 인간 대상체에게 투여한 후 크리잔리주맙에 결합할 수 있는 숙주 항체의 생성을 지칭한다. 본 발명의 약제학적 조성물을 받은 모든 대상체 중에서 2% 미만의 인간 대상체가 항-크리잔리주맙 항체를 생성시켰다. 한편으로, 생리학적 조건 하에서, 적합하게는 약물 투여 1일 후, 환자의 전체 크리잔리주맙 및 모든 이의 변이체의 5% 미만, 적합하게는 2% 미만, 적합하게는 1% 미만, 적합하게는 0.5% 미만은 크리잔리주맙의 석신이미드이다. 또한, 놀랍게도 이소-크리잔리주맙의 면역원성은 크리잔리주맙과 실질적으로 동일하게 낮은 것으로 확인되었다. 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 이소-크리잔리주맙의 면역원성이 동일한 조건 하에 시험될 때 크리잔리주맙의 5배 이하, 3배 이하, 적합하게는 2배 이하, 적합하게는 1.5배 이하 더 높다는 것을 의미한다. 대안적으로, 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 이소-크리잔리주맙의 면역원성이 동일한 조건 하에 시험될 때 크리잔리주맙의 20% 이상, 적합하게는 40% 이상, 적합하게는 70% 이상이라는 것을 의미한다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙, 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산이 이소-아스파르트산으로 변경된 크리잔리주맙의 변이체(이소-크리잔리주맙)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

용어 "이소-크리잔리주맙"은 2종의 호모-이소-크리잔리주맙 및 헤테로-이소-크리잔리주맙으로 이루어진다. 용어 호모-이소-크리잔리주맙은 경쇄 둘 모두의 32번 위치에서 아스파르트산 잔기가 이소-아스파르트산으로 치환된(즉, 이성질화된) 항체를 지칭한다. 용어 헤테로-이소-크리잔리주맙은 경쇄 중 단지 하나의 32번 위치에서 아스파르트산 잔기가 이소아스파르트산으로 치환된 항체를 지칭한다.

단일 경쇄에 관한 한, 32번 위치에서 아스파르트산을 갖는 경쇄는 LC_D로 명명된다. 32번 위치에서 이소-아파트산을 갖는 경쇄는 LC_isoD로 명명된다. 32번 위치에서 석신이미드를 갖는 경쇄는 LC_succi로 명명된다.

일 양태에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙과 최대 3개, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 항체, 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아스파르트산이 이소-아스파르트산으로 변경된 상기 항체의 변이체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

크리잔리주맙과 최대 3개, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 항체와 관련하여, 차이는 미스매치, 즉, 잔기의 상이한 잔기로의 치환일 수 있다. 차이는 또한 크리잔리주맙의 서열 내 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실일 수 있다. 차이는 경쇄 및/또는 중쇄의 서열 내 임의의 위치, 예를 들어, 항체의 상이한 도메인, 예를 들어, CH1, CH2, CH3, VH, CL, VL, 힌지 영역, F_c 및 F_ab일 수 있다. 바람직하게는, 상기 차이는 항원, 즉, 인간 P-셀렉틴에 결합하는 능력과 같은 항체의 기본적인 성질을 방해하지 않는다. 바람직하게는, 차이는 항체의 기능에 중요한 위치, 예를 들어, CDR이 아니다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물의 맥락에서, 차이는 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에 있지 않다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 석신이미드인 변이체(즉, 아스파르트산의 석신이미드 동형)("크리잔리주맙의 석신이미드")를 추가로 포함한다. 크리잔리주맙의 석신이미드는 전형적으로 경쇄 중 적어도 하나의 32번 위치에 석신이미드, 및 다른 경쇄의 32번 위치에 아스파르트산 또는 이소아스파르트산을 갖는 항체이거나, 매우 산성 조건(예를 들어, 대략 5의 pH)에서 둘 모두의 아스파르트산이 석신이미드로 치환될 수 있다. 32번 위치에서 석신이미드의 하나의 경쇄 및 다른 경쇄 아스파르트산을 포함하는 항체는 "크리잔리주맙의 D-석신이미드"로 명명된다. 32번 위치에서 석신이미드를 갖는 하나의 경쇄 및 이소-아스파르트산을 갖는 다른 경쇄를 포함하는 항체는 "크리잔리주맙의 isoD-석신이미드"로 명명된다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적 조성물 내 전체 전하 변이체 중 적어도 20%, 적합하게는 적어도 24%, 적어도 30%, 적합하게는 적어도 35%, 적합하게는 적어도 40%의 크리잔리주맙(즉, 주요 피크)을 포함한다. 전형적으로는 그리고 바람직하게는, 전하 변이체는 모세관 영역 전기영동(CZE)에 의해 분석될 수 있다. 곡선 하 면적(AUC)은 일반적으로 전체 AUC에 대한 각 피크의 %를 결정하는 데 사용될 것이다. 명확성을 위해, 크리잔리주맙을 포함하는 피크는 크리잔리주맙을 포함하는 피크가 모든 피크 중에서 최대 AUC를 갖지 않는 드문 상황에서도 본 출원 전반에 걸쳐 "주요 피크"로 지칭될 것이다.

본 출원에서 사용되는 용어 "전하 변이체"는 크리잔리주맙의 피크를 포함하여 CZE에 의해 확인될 수 있는 모든 피크를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "염기성 변이체"는 CZE 다이어그램에서 크리잔리주맙과 비교하여 더 낮은 시간 값에 해당하는 피크를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "산성 변이체"는 CZE 다이어그램에서 크리잔리주맙의 피크와 비교하여 더 높은 시간 값에 해당하는 피크를 지칭한다. 예를 들어, CZE는 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

2개의 주요 산성 변이체 피크가 존재한다. 더 낮은 시간 값을 갖는 것은 헤테로-이소-크리잔리주맙을 포함하고, 더 높은 시간 값을 갖는 것은 호모-이소-크리잔리주맙을 포함한다. 전체 이소-크리잔리주맙은 추정 상 산성 변이체 중 약 50% 내지 약 75%를 차지한다.

몇 가지 염기성 변이체 피크가 존재하며, 그 중에 더 낮은 시간 값을 갖는 것은 크리잔리주맙의 D-석신이미드를 포함하고, 더 높은 시간 값을 갖는 다른 것은 크리잔리주맙의 isoD-석신이미드를 포함한다. 크리잔리주맙의 전체 석신이미드는 추정 상 염기성 변이체 중 약 25% 내지 약 50%를 차지한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은, CZE에 주어질 때, AUC가 전체 AUC의 적어도 20%, 적합하게는 적어도 24%, 적어도 30%, 적합하게는 적어도 35%, 적합하게는 적어도 40%인 주요 피크를 나타낸다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 최대 70%, 적합하게는 최대 60%, 적합하게는 최대 50%, 적합하게는 최대 45%의 크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은, CZE에 주어질 때, AUC가 전체 AUC의 최대 70%, 적합하게는 최대 60%, 적합하게는 최대 50%, 적합하게는 최대 45%인 주요 피크를 나타낸다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 20% 내지 약 50%, 적합하게는 약 35% 내지 약 45%, 적합하게는 약 37% 내지 약 42%의 크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 20% 내지 약 50%, 적합하게는 약 35% 내지 약 45%, 적합하게는 약 37% 내지 약 42%의 주요 피크를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 적어도 20%, 적어도 30%의 이소-크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 적어도 30%, 적합하게는 적어도 40%의 산성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 최대 40%, 적합하게는 최대 35%의 이소-크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 최대 56%, 적합하게는 최대 45%의 산성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 20% 내지 약 40%, 적합하게는 약 25% 내지 약 35%의 이소-크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 30% 내지 약 50%, 적합하게는 약 35% 내지 약 45%, 적합하게는 약 37% 내지 약 42%의 산성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 적어도 5%, 적합하게는 적어도 10%의 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체의 적합하게는 적어도 10%의 염기성 변이체, 적어도 15%의 염기성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 최대 15%, 적합하게는 최대 20%의 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 최대 20%, 적합하게는 최대 25%, 적합하게는 최대 35%의 염기성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 5% 내지 약 20%, 적합하게는 약 10% 내지 15%의 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 10% 내지 약 35%, 적합하게는 약 15% 내지 25%의 염기성 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 적어도 약 55%, 적어도 약 60%의 크리잔리주맙 + 이소-크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 전체 전하 변이체 중 약 55% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 75%의 크리잔리주맙 + 이소-크리잔리주맙을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙, 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산이 이소아스파르트산으로 변경된 크리잔리주맙의 변이체(이소-크리잔리주맙), 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 석신이미드인 변이체(크리잔리주맙의 석신이미드)를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

모세관 영역 전기영동(CZE)을 사용하여 전하 변이체 분포의 pH 의존적 동적 거동이 확인되었다. 6.3 미만의 pH에서 인큐베이션 동안 석신이미드 축적이 발생하였다.

인큐베이션 pH가 낮을수록 더 많은 석신이미드가 축적된다. 6.3 초과의 pH 값에서 더 많은 이소-아스파르트산이 형성된 반면, 석신이미드의 초기 양은 출발 물질에서 관찰된 것보다 훨씬 더 낮은 수준까지 감소되었다(도 5).

항체의 상보성-결정 영역(CDR)에서의 화학적 변형은 표적 분자에 대한 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다. 결합 활성에 대한 CDR에서의 이성질화 변이체로서 석신이미드의 영향은 이미 보고된 바 있다(Yan B et al., 2009, doi: 10.1002/jps.21655; Cacia J et al., 1996, doi: 10.1021/bi951526c; Valliere-Douglass J et al., 2008, doi: 10.1016/j.chroma.2008.10.078; Ouellette D et al., 2013, doi: 10.4161/mabs.24458). 또한, 이성질화 변이체로서의 이소아스파르트산은, CDR에 존재하는 경우, 결합 활성의 감소를 초래하는 것으로 밝혀졌다(Cacia J et al., 1996, doi: 10.1021/bi951526c; Harris RJ et al., 2001, DOI: 10.1016/s0378-4347(00)00548-x; Rehder DS et al., 2008, doi: 10.1021/bi7018223). 염기성 분획(석신이미드 함유)의 역가는 주요 피크(아스파르트산 함유, 크리잔리주맙)의 역가에 비해 감소된 것으로 밝혀졌지만, 놀랍게도 이소-크리잔리주맙을 함유하는 산성 변이체는 크리잔리주맙과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 유지하는 것으로 확인되었다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 크리잔리주맙의 단리된 변이체를 제공하고, 여기서 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산은 항체의 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄에서 이소아스파르트산으로 치환된다(이소-크리잔리주맙). 일 구현예에서, 치환은 석신이미드 중간체의 형성을 통해서 이루어진다. 일 양태에서, 본 발명은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 인간 P-셀렉틴에 대한 이소-크리잔리주맙의 결합 친화성은 인간 P-셀렉틴에 대한 크리잔리주맙의 결합 친화성과 실질적으로 동일하다. P-셀렉틴에 대한 크리잔리주맙 또는 이소-크리잔리주맙의 결합 친화성은 일상적인 방법에 의해, 예를 들어, ELISA(예를 들어, 실시예 2.1에서와 같이)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 크리잔리주맙 및 이소-크리잔리주맙의 결합 친화성이 2배 이하, 적합하게는 1.5배 이하, 적합하게는 1.3배 이하, 적합하게는 1.2배 이하로 상이하다는 것으로 이해된다. 적합하게는, 이소-크리잔리주맙의 결합 친화성은 크리잔리주맙의 결합 친화성의 80% 내지 125% 내에 있다.

일 구현예에서, 이소-크리잔리주맙의 생물학적 활성은 크리잔리주맙의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하다. 용어 "크리잔리주맙의 생물학적 활성"은 인간 P-셀렉틴과 이의 리간드 PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1)의 상호작용을 억제하는, 전형적으로 인간 P-셀렉틴을 발현하는 세포와 PSGL-1의 상호작용을 억제하는 크리잔리주맙의 능력을 지칭한다. 생물학적 활성은 일상적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 적합하게는, 이는 세포를 형광 표지하고 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 SEG101과 함께 인큐베이션한 다음에, 웰이 먼저 PSGL-1로 코팅된 후 그 표면에 인간 P-셀렉틴을 발현하는 포유동물 세포와 함께 인큐베이션된 마이크로타이터 플레이트로부터 형광 신호를 측정함으로써 결정된다. SEG101 또는 이의 변이체의 생물학적 활성을 측정하는 적합한 방법은 실시예 2.1에서 입증된다. 이러한 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 크리잔리주맙 및 이소-크리잔리주맙의 생물학적 활성이 2배 이하, 적합하게는 1.5배 이하, 적합하게는 1.3배 이하, 적합하게는 1.2배 이하 상이하다는 것으로 이해된다. 적합하게는, 이소-크리잔리주맙의 생물학적 활성은 크리잔리주맙의 생물학적 활성의 80% 내지 125% 내에 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 크리잔리주맙의 단리된 변이체(크리잔리주맙의 석신이미드)를 제공하고, 여기서 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산은 경쇄 중 적어도 하나에서 석신이미드로 치환되는 반면 다른 경쇄에서의 상응하는 위치는 아스파르트산, 이소아스파르트산 또는 석신이미드이다.

일 양태에서, 본 발명은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 크리잔리주맙의 석신이미드는 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해될 수 있는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 크리잔리주맙의 석신이미드는 pH 7.4± 0.4에서 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해될 수 있다. 일 구현예에서, 크리잔리주맙의 석신이미드는 실온, 전형적으로 약 25℃에 pH 7.4± 0.4에서 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해될 수 있다. 일 구현예에서, 크리잔리주맙의 석신이미드는 생리학적 조건 하에 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해될 수 있다. 용어 "생리학적 조건"은 pH 7.4± 0.4 및 약 36.0℃ 내지 약 40.0℃, 바람직하게는 36.5℃ 내지 38.0℃, 바람직하게는 약 36.5℃ 내지 37.5℃의 온도로 이해된다. 일 구현예에서, 약 50%의 크리잔리주맙의 석신이미드는 약 2시간 내지 약 5시간 이내에, 적합하게는 약 3시간 내지 약 5시간 이내에, 적합하게는 약 3시간 내지 약 4시간 이내에 생리학적 조건 하에서 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해된다. 일 구현예에서, 크리잔리주맙의 석신이미드는 대상체에 주사(예를 들어, 정맥내로) 후 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙으로 가수분해된다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물 내 크리잔리주맙은 CZE에 의해 결정된 바와 같은 주요 종이다. 주요 종은 최대 AUC를 갖는 것으로 이해된다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물 내 이소-크리잔리주맙은 CZE에 의해 결정된 바와 같은 주요 종이다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은 실질적으로 동량의 크리잔리주맙 및 이소-크리잔리주맙을 포함한다. 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 이소-크리잔리주맙의 양이 크리잔리주맙의 양의 80% 내지 125% 이내, 적합하게는 크리잔리주맙의 90% 내지 110% 이내임을 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃로 보관된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 냉장고에서 보관된다. 일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 4℃ 내지 약 6℃, 적합하게는 5℃의 온도를 갖는다. 32번 위치에서 아스파르트산의 이성질화는 온도가 증가함에 따라 훨씬 더 빠른 속도로 일어나는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 표 6에 도시된 바와 같이). 이러한 온도 조건 하에서, 크리잔리주맙의 감소는, 바람직하게는 CZE 시험에서 주요 피크의 AUC로 결정하는 경우, 약제학적 조성물이 제조된 시점에 출발 물질과 비교하여 적어도 12개월의 기간에 걸쳐, 적합하게는 18개월의 기간 동안, 적합하게는 24개월의 기간 동안 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 적합하게는 10% 이하, 적합하게는 5% 이하이다. 이러한 온도 조건 하에, 전체 염기성 변이체의 양은 적어도 12개월의 기간에 걸쳐, 적합하게는 18개월의 기간 동안, 적합하게는 24개월의 기간 동안 출발 물질과 비교하여 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 적합하게는 3% 이하, 적합하게는 2% 이하로 변한다. 이러한 온도 조건 하에서, 전체 산성 변이체의 양은 출발 물질과 비교하여 적어도 12개월의 기간에 걸쳐, 적합하게는 18개월의 기간 동안, 적합하게는 24개월의 기간 동안 25% 이하, 15% 이하, 적합하게는 10% 이하, 적합하게는 5% 이하로 증가한다. 상기 변화는 약제학적 조성물이 적절한 pH 범위를 갖는 경우 더 최소화될 수 있다. 예를 들어, 약 5.5 내지 약 7.5의 pH, 적합하게는 약 5.5 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 ± 0.3의 pH에서이다. 적합하게는, 약제학적 제형은 약 6의 pH에서 보관된다.

일 구현예에서, 본 발명은 적합하게는 18개월 또는 24개월 저장 수명의 시간에 전체 전하 변이체 중 적어도 24%, 적어도 30%, 적어도 35%의 주요 피크 및 최대 56%, 최대 50%, 최대 45%의 산성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 적합하게는 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 일 구현예에서, 본 발명은 적합하게는 18개월 또는 24개월 저장 수명의 시간에 전체 전하 변이체 중 적어도 24%의 주요 피크 및 최대 56%의 산성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 적합하게는 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다.

일 구현예에서, 본 발명은 적합하게는 18개월 또는 24개월 저장 수명의 시간에 전체 전하 변이체 중 적어도 24%, 적어도 30%, 적어도 35%의 주요 피크 및 최대 56%, 최대 50%, 최대 45%의 산성 변이체, 최대 35%, 최대 30%, 최대 25%의 염기성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 적합하게는 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 일 구현예에서, 본 발명은 적합하게는 18개월 또는 24개월 저장 수명의 시간에 전체 전하 변이체 중 적어도 24%의 주요 피크, 최대 56%의 산성 변이체, 및 최대 35%의 염기성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 적합하게는 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다.

질량 분광기(MS) 분석은 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi를 포함한 화학적 변형을 확인하는 데 사용된다. 일 양태에서, 본 발명은 MS에 의해 결정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 적어도 50%의 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 60% 내지 약 85%의 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 첫 3개월 이내에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 70% 내지 약 85%의 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 12개월, 적합하게는 저장 수명의 18개월, 적합하게는 저장 수명의 24개월 후에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 60% 내지 약 70%의 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물로서, LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_D의 백분율 감소가 저장 수명의 시작에서 저장 수명의 종료까지 약 30% 이하, 20% 이하, 적합하게는 15% 이하이고, 저장 수명은 12개월, 적합하게는 18개월, 적합하게는 24개월인, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_D를 포함하는 약제학적 조성물로서, 약 적어도 18개월의 기간 동안 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_D의 백분율 감소가 약 20% 이하인, 약제학적 조성물을 제공한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 상기 변화는 약제학적 조성물이 적절한 pH 범위인 경우 추가로 최소화될 수 있다. 예를 들어, 약 5.5 내지 약 7.5의 pH, 적합하게는 약 5.5 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 ± 0.3의 pH에서이다. 적합하게는, 약제학적 제형은 약 6의 pH에서 보관된다.

일 구현에서, 본 발명은 MS에 의해 결정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 적어도 10%의 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현에서, 본 발명은 MS에 의해 결정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 최대 30%의 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 10% 내지 약 30%의 LC_isoD, 적합하게는 약 15% 내지 약 25%의 LC_isoD, 적합하게는 약 20% 내지 약 30%의 LC_isoD를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 첫 3개월 이내에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 25% 미만의 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 12개월, 적합하게는 18개월, 적합하게는 저장 수명의 24개월 후에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 25% 초과의 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물로서, LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_isoD의 백분율 변화는 저장 수명의 시작에서 저장 수명의 종료까지 약 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 적합하게는 5% 이하이고, 저장 수명은 12개월, 적합하게는 18개월의 저장 수명, 적합하게는 24개월인 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_isoD를 포함하는 약제학적 조성물로서, 약 적어도 18개월의 기간 동안 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_D의 백분율 변화는 약 20% 이하인, 약제학적 조성물을 제공한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 상기 변화는 약제학적 조성물이 적절한 pH 범위인 경우 추가로 최소화될 수 있다. 예를 들어, 약 5.5 내지 약 7.5의 pH, 적합하게는 약 5.5 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 ± 0.3의 pH에서이다. 적합하게는, 약제학적 제형은 약 6의 pH에서 보관된다.

일 구현에서, 본 발명은 MS에 의해 결정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 적어도 1%의 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현에서, 본 발명은 MS에 의해 결정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 최대 10%의 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 1% 내지 약 10%의 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 첫 3개월 이내에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 3% 미만의 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 12개월, 적합하게는 18개월, 적합하게는 24개월 후에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 5% 초과의 LC_succi를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물로서, LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_succi의 백분율 변화는 저장 수명의 시작에서 저장 수명의 종료까지 약 20% 이하, 10% 이하, 적합하게는 5% 이하이고, 저장 수명은 12개월, 적합하게는 18개월, 적합하게는 24개월인, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 LC_succi를 포함하는 약제학적 조성물로서, LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량에 대해 LC_succi의 백분율 변화는 약 적어도 18개월의 기간 동안 약 10% 이하인, 약제학적 조성물을 제공한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 상기 변화는 약제학적 조성물이 적절한 pH 범위인 경우 추가로 최소화될 수 있다. 예를 들어, 약 5.5 내지 약 7.5의 pH, 적합하게는 약 5.5 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 ± 0.3의 pH에서이다. 적합하게는, 약제학적 제형은 약 6의 pH에서 보관된다.

일 구현예에서, 본 발명은 MS에 의해 측정하는 경우 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 60% 내지 80%의 LC_D, 약 15% 내지 30%의 LC_isoD 및 약 1% 내지 10%의 LC_succi를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 첫 3개월 이내에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 70% 내지 80%의 LC_D, 약 20% 내지 25%의 LC_isoD 및 약 1% 내지 3%의 LC_succi를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 저장 수명의 12개월, 적합하게는 18개월, 적합하게는 24개월 후에 LC_D, LC_isoD 및 LC_succi의 총량의 약 60% 내지 70%의 LC_D, 약 20% 내지 30%의 LC_isoD 및 약 5% 내지 10%의 LC_succi를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃, 적합하게는 약 5℃에서 보관된다. 상기 변화는 약제학적 조성물이 적절한 pH 범위인 경우 추가로 최소화될 수 있다. 예를 들어, 약 5.5 내지 약 7.5의 pH, 적합하게는 약 5.5 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 적합하게는 약 6 ± 0.3의 pH에서이다. 적합하게는, 약제학적 제형은 약 6의 pH에서 보관된다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 완충 시스템을 추가로 포함한다.

본 발명은 활성 성분으로서 크리잔리주맙, 또는 크리잔리주맙과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체, 및 완충 시스템을 포함하는 신규한 약제학적 조성물로서, 약 5.0 내지 7.5, 약 5.5 내지 7.0, 약 5.5 내지 7.5, 약 5.5 내지 7.0, 약 5.5 내지 6.8, 약 5.5 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.8, 약 5.7 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.3, 약 5.9 내지 6.1, 또는 약 6.0의 pH 값을 갖는, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, pH는 상기 열거된 것들 내의 임의의 pH 값; 예를 들어, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2 및 6.3이다.

본 발명과 사용하기에 적합한 완충 시스템은 유기산 염, 예컨대, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카르본산, 타르타르산, 석신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; Tris, 토메타민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 완충 시스템은 시트르산 완충제 또는 포스페이트 완충제 또는 이들의 조합물이다. 추가로, 아미노산 성분, 예를 들어, 글리신이 또한 완충제로서 사용될 수 있다. 아미노산은 D-형태 및/또는 L-형태로 존재할 수 있지만, L-형태가 전형적이다. 바람직하게는, 완충 시스템은 아르기닌 또는 히스티딘을 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 제형에 사용되는 적합한 완충 시스템의 농도는, 예를 들어, 완충제 및 제형의 요망되는 안정성에 따라 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 40 mM이다. 바람직한 구현예에서, 완충 시스템은 시트레이트이고, 시트레이트는 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM의 농도로 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트이고, 포스페이트는 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM의 농도로 사용된다. 일 구현예에서, 시트레이트 또는 포스페이트 완충제의 상대 이온은 나트륨 및/또는 칼륨이다. 바람직한 구현예에서, 완충제는 시트르산나트륨 완충제이다.

본 발명과 사용하기에 적합한 안정화제는, 예를 들어, 점도 향상제, 가용화제, 및/또는 등장화제 등으로 작용할 수 있다. 안정화제는 이온성일 수 있지만, 바람하게는 비이온성(예를 들어, 당)이다. 당은 단당류, 예를 들어, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 및 소르보스 등; 이당류, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 및 셀로비오스 등; 다당류, 예를 들어, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 및 전분 등; 및 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 및 자일리톨 소르비톨(글루시톨) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 당은 당 알코올 또는 아미노 당일 수 있다. 바람직하게는, 당은 환원당이 아니다. 환원당은 모든 단당류, 락토스, 말토스 및 셀로비오스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 당은 바람직하게는 비-환원당, 예를 들어, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 소르비톨 및 만니톨이다. 수크로스가 특히 유용하다. 이온성 안정화제로서 이들은 NaCl 또는 아미노산 성분과 같은 염을 포함한다. 바람직하게는, 안정화제는 아르기닌 또는 히스티딘을 포함하지 않는다. 아미노산은 이의 D-형태 및/또는 L-형태로 존재할 수 있지만, L-형태가 전형적이다. 본 발명에 따른 제형은 약 50 mM 내지 400 mM, 약 50 mM 내지 300 mM, 바람직하게는 180 mM 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 약 220 mM의 안정화제, 바람직하게는 수크로스를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 크리잔리주맙 또는 크리잔리주맙과 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체 및 완충 시스템에 더하여, 다음 중 하나 이상과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다: (i) 안정화제; (ii) 계면활성제; 및 (iii) 염.

본 발명에 따른 적합한 계면활성제는 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 옥틸 글리코시드; 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아미도프로필-디메틸아민; 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 코폴리머(예를 들어, Pluronics, PF68 등)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 비이온성 계면활성제이다. 바람직한 구현예에서, 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리소르베이트이다. 더욱 바람직하게는, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.

본 발명에 따른 제형에 사용되는 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트의 농도는 제형의 약 0.01% 내지 0.1%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 0.05%, 가장 바람직하게는 약 0.02% 부피 기준 중량(w/v)이다.

등장화제는 본 발명에 따른 제형의 삼투압을 생리학적으로 허용되는 값으로 설정하는 역할을 한다. 등장화제는 생리학적으로 허용되는 성분이며, 특별히 제한되지 않는다. 등장화제의 전형적인 예는, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 또는 염화칼슘 등과 같은 무기 염이다. 이들은 단독으로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수 있다. 일부 제제는 이중 역할을 할 수 있는데, 예를 들어, 일부 당 또는 당 알코올은 안정화제와 등장화제 둘 모두로 작용할 수 있음이 주지되어야 한다. 일 구현예에서, 등장화제의 농도는 약 50 mM 내지 약 300 mM이다. 일 구현예에서, 등장화제는 염화나트륨이다. 일 구현예에서, 염화나트륨은 약 100 mM 내지 약 250 mM, 특히 약 190 mM의 농도이다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 중 항체의 농도는 약 1 mg/mL 내지 100 mg/ml, 약 5 mg/mL 내지 100 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 75 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 30 mg/ml이다. 일 구현예에서, 항체의 농도는 적어도 약 5 mg/ml이다. 일 구현예에서, 항체의 농도는 적어도 약 10 mg/ml이다. 일 구현예에서, 항체의 농도는 적어도 약 20 mg/ml이다. 일 구현예에서, 항체의 농도는 약 10 mg/ml이다. 문맥 상 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 "항체(antibody)" 또는 이의 상호교환적으로 사용되는 용어 "항체(ANTIBODY)"는 약제학적 조성물에 의해 포함되는 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체(예를 들어, 크리잔리주맙의 석신이미드 및 이소-크리잔리주맙)를 포함하고, 이는 UV에 의해 검출될 수 있으므로 단백질 농도를 결정하는 데 관련성이 있을 수 있다.

게다가, 본 발명의 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 36주(약 9개월) 동안 저장 후에도, 예를 들어, SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는, 2℃ 내지 8℃에서 36주(약 9개월) 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 12개월 동안 저장 후에도, 예를 들어, SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 12개월 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 15 개월 동안 저장 후에도, 예를 들어, SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는, 2℃ 내지 8℃에서 15 개월 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 18개월 동안 저장 후에도, 예를 들어, SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 18개월 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 24개월 동안 저장 후에도, 예를 들어, SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 24개월 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 25℃에서 12주(약 3개월) 동안 저장 후에도 SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는, 25℃에서 12주(약 3개월) 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 25℃에서 6개월 동안 저장 후에도 SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는, 25℃에서 6개월 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 40℃에서 2주 동안 저장 후에도 SEC-HPLC에 의해 측정하는 경우 전체 항체의 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집되도록 안정하다. 바람직하게는, 40℃에서 2주 동안 저장 후에도 전체 항체의 2% 미만이 응집된다.

일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다:

a) 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체 또는 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체와 최대 3개의 아미노산 차이를 갖는 항체(약 5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 사용됨);

b) 완충 시스템, 바람직하게는 시트레이트(예를 들어, 시트르산나트륨) 및/또는 포스페이트(예를 들어, 인산칼륨) 완충 시스템(완충 시스템은 바람직하게는 약 10 mM 내지 50 mM의 농도로 사용될 수 있고, 완충 시스템의 pH는 5.0 내지 7.5, 바람직하게는 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 5.7 내지 6.3의 임의의 pH 값을 가짐);

c) 선택적으로, 안정화제, 바람직하게는 수크로스(바람직하게는 약 50 mM 내지 300 mM 농도);

d) 선택적으로, 비이온성 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(바람직하게는 약 0.01% w/v(0.1 mg/ml) 내지 0.1% w/v(1 mg/ml)의 농도); 및

e) 선택적으로, 등장화제, 바람직하게는 NaCl(바람직하게는 약 50 내지 300 mM, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 250 mM, 특히 약 190 mM의 농도).

바람직한 구현예에서, 본 발명은 약 10 mg/ml 농도의 SEG101, 약 220 mM의 수크로스, 약 20 mM의 시트레이트 및 약 0.02% w/v의 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형으로서, 제형의 pH는 약 6.0, 바람직하게는 5.7 내지 6.3, 더욱 바람직하게는 5.9 내지 6.1, 예를 들어, 6.0인, 제형을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 약 10 mg/ml 농도의 크리잔리주맙, 약 25 mM의 소듐 포스페이트, 약 7의 pH, 약 190 mM의 염화나트륨, 약 0.02% w/v의 폴리소르베이트 80 및 주사용수를 포함하는 제형이 아닌, 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 글리신을 포함하지 않는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 소듐 포스페이트를 포함하지 않는, 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 7의 pH를 갖지 않는, 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 수크로스를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 50 mM의 수크로스를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드의 총량은 약 5 mM 내지 50 mM, 적합하게는 5 mM 내지 30 mM, 적합하게는 10 mM인, 약제학적 조성물을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 계면활성제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 0.01%의 계면활성제를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 크리잔리주맙, 이소-크리잔리주맙 및 크리잔리주맙의 석신이미드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 완충 시스템을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 완충 시스템은 시트레이트 완충제이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 10 mM 내지 50 mM의 시트레이트 완충제를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 액체 형태이다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 수성이고, 즉, 용매는 물이다. 약제학적 용도에 적합한 제형 또는 조성물은 멸균, 균질 및/또는 등장성일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간용 정맥내 투여에 적합한다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물은 피하 투여에 적합하지 않을 수 있다.

일 구현예에서, 액체 형태의 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 동결건조에 적합하다. 전형적으로, 동결건조 형태는 액체 형태보다 더 안정하고, 저장에 바람직한 형태일 것이다. 그러나, 액체 형태가 적어도 12개월, 적어도 18개월 또는 적어도 24개월의 기간, 이상적으로는 12개월, 18개월 또는 24개월의 기간 동안 충분히 안정하다면 이의 사용 편의성 때문에 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 크리잔리주맙 또는 크리잔리주맙과 최대 3개, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 항체, 바람직하게는 각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙, 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산이 이소-아스파르트산으로 변경된 크리잔리주맙의 변이체(이소-크리잔리주맙)을 포함하는, 동결건조 형태이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 크리잔리주맙의 석신이미드를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 동결건조에 주어진 액체 제형(예비-동결건조 제형)은 완충 시스템을 추가로 포함하고, 여기서 약제학적 조성물은 약 5.0 내지 7.5, 약 5.5 내지 7.5, 약 5.5 내지 7.0, 약 5.5 내지 6.8, 약 5.5 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.8, 약 5.7 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.3, 약 5.9 내지 6.1, 또는 약 6.0의 pH 값을 갖는다. 특정 양태에서, pH는 상기 열거된 것들 내의 임의의 pH 값; 예를 들어, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2 및 6.3이다

또 다른 구현예에서, 동결건조 제형으로부터의 재구성된 제형은 약 5.5 내지 7.5, 약 5.5 내지 7.0, 약 5.5 내지 6.8, 약 5.5 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.8, 약 5.7 내지 6.5, 약 5.7 내지 6.3, 약 5.9 내지 6.1, 또는 약 6.0의 pH 값을 갖는다. 특정 양태에서, pH는 상기 열거된 것들 내의 임의의 pH 값; 예를 들어, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2 및 6.3이다

일 구현예에서, 완충 시스템은 시트레이트 완충제 또는 포스페이트 완충제이다. 바람직한 구현예에서, 완충 시스템은 시트레이트이고, 시트레이트는 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM의 농도로 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트이고, 포스페이트는 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM의 농도로 사용된다.

일 구현예에서, 동결건조 형태의 본 발명의 약제학적 조성물은 본 출원에 앞서 교시된 바와 같은 안정화제, 계면활성제 및 등장화제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 부형제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 동결건조 형태는 안정화제를 포함한다. 바람직하게는, 안정화제는 수크로스이다. 일 구현예에서, 예비-동결건조 제형 중 수크로스의 농도는 20 mg/ml 내지 120 mg/ml, 적합하게는 40 mg/ml 내지 100 mg/ml, 적합하게는 60 mg/ml 내지 90 mg/ml이다.

일 구현예에서, 동결건조 형태의 본 발명의 약제학적 조성물은 동결건조보호제를 추가로 포함한다. 전형적으로, 동결건조보호제는 예비-동결건조 제형에 첨가된다. 동결건조보호제는 비정질 형태, 예컨대, 수크로스, 또는 결정질 형태, 예컨대, 만니톨, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 추가 동결건조보호제는 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 예비-동결건조 제형 중 전체 동결건조보호제의 농도는 20 mg/ml 내지 150 mg/ml, 적합하게는 40 mg/ml 내지 120 mg/ml, 적합하게는 60 mg/ml 내지 120 mg/ml, 적합하게는 60 mg/ml 내지 100 mg/ml이다. 예를 들어, 40 mg/ml의 수크로스 및 60 mg/ml의 만니톨이 예비-동결건조 제형 중에 존재하는 경우, 예비-동결건조 제형 중 전체 동결건조보호제의 농도는 100 mg/ml이다. 이중 기능을 갖는 부형제의 경우, 계산은 기능을 구별하지 않고 총량을 취한다. 예를 들어, 예비-동결건조 제형이 40 mg/ml의 수크로스를 포함하는 경우, 동결건조보호제의 농도는 40 mg/ml이고, 동시에 안정화제의 농도는 40 mg/ml이다.

일 구현예에서, 동결건조보호제 중 적어도 하나는 수크로스이다. 일 구현예에서, 동결건조보호제는 오로지 수크로스이다.

일 구현예에서, 항체에 대한 동결건조보호제의 몰비는 적어도 300, 바람직하게는 적어도 500, 바람직하게는 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800 또는 적어도 900이다. 동결건조보호제 중 적어도 하나가 수크로스인 경우, 항체에 대한 동결건조보호제의 몰비는 오로지 항체에 대한 수크로스의 몰비에 대한 것이다. 예를 들어, 40 mg/ml의 수크로스 및 60 mg/ml의 만니톨을 포함하는 예비-동결건조 제형에서, 항체에 대한 동결건조보호제의 몰비는 553이며, 이는 만니톨의 양을 동결건조보호제로서 고려하지 않은 것이다. 항체의 계산에서 주요 피크를 포함하는 모든 전하 변이체는 함께 취해지며, 이는 바람직하게는 UV에 의해 결정된다. 예를 들어, 예비-동결건조 제형이 30 mg/ml의 SEG101을 함유하는 경우, 이는 주요 피크(크리잔리주맙)를 포함하는 전체 전하 변이체에 대한 것이다.

일 구현예에서, 예비-동결건조 제형 중 항체의 농도는 약 10 mg/mL 내지 100 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 70 mg/ml, 약 20 mg/ml 내지 70 mg/ml, 약 30 mg/ml 내지 50 mg/ml, 예를 들어, 약 40 mg/ml이다.

계면활성제를 사용하면 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고/감소시키거나 재구성된 제형에서 미립자의 형성을 감소시킬 수 있다. 첨가되는 계면활성제의 양은 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고 재구성 후 미립자의 형성을 최소화하는 양이다.

계면활성제는 예비-동결건조 제형, 동결건조 제형 및/또는 요망에 따라 재구성된 제형에, 적합하게는 예비-동결건조 제형에 첨가될 수 있다.

일 구현예에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다. 바람직하게는, 계면활성제는 0.01% w/v(0.1 mg/mL) 내지 0.1% w/v(1 mg/mL), 바람직하게는 0.01% w/v(0.1 mg/mL) 내지 0.05% w/v(0.5 mg/mL), 바람직하게는 0.02% w/v(0.2 mg/mL)의 농도이다.

이상적으로, 동결건조 형태는 실온에서 저장된다. 대안적으로, 동결건조 형태는 2℃ 내지 8℃에서 저장된다. 이상적으로, 동결건조 형태는 적어도 18개월, 적어도 24개월 또는 적어도 36개월의 저장 수명을 갖는다. 이상적으로, 동결건조 형태는 18개월, 24개월 또는 36개월의 저장 수명을 갖는다.

동결건조 제형은 환자에 투여하기 직전에 재구성될 수 있다. 재구성은 허용되는 기간, 전형적으로 10분 미만 내에 달성된다. 재구성은 예비-동결건조 제형에 비해 더 낮거나, 동일하거나, 더 높은 항체 농도를 야기하지만, 일반적으로 더 낮은 항체 농도를 야기한다. 재구성된 제형은 재구성으로부터 사용까지의 기간 동안, 전형적으로 몇 시간 내지 최대 며칠 동안 저장 시 물리적 및 화학적 안정성 및 온전성을 필수적으로 유지한다.

재구성 매질은 약 50 mM 내지 약 100 mM 양으로 물, 즉, 멸균 수, 주사용 정균수(BWFI) 또는 아세트산, 프로피온산, 석신산, 염화나트륨, 마그네슘 클로라이드, 염화나트륨의 산성 용액, 마그네슘 클로라이드의 산성 용액 및 아르기닌의 산성 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 재구성 매질은 멸균 수이다. 재구성된 제형은 투여 전에 주입 용액으로 재구성된 제형을 희석함으로써 필요한 등장성을 달성할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 약 5.0 내지 7.5, 바람직하게는 5.5 내지 7.5의 pH 값을 갖는 수성 제형을 동결건조시킴으로써 수득 가능한 동결건조 제형을 제공하고, 여기서 동결건조 제형은

a) 항체(크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체);

b) 동결건조보호제; 및

c) 완충 시스템을 포함한다.

일 구현예에서, 동결건조 제형은 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 40 또는 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다. 바람직하게는 계면활성제는 약 0.01% w/v(0.1 mg/mL) 내지 0.1% w/v(1 mg/mL)의 농도로 수성 제형 중에 존재한다.

일 구현예에서, 항체는 약 10 mg/mL 내지 100 mg/mL의 농도로 수성 제형 중에 존재한다.

일 구현예에서, 완충 시스템은 시트레이트, 예를 들어, 시트르산나트륨이다. 바람직하게는, 완충 시스템은 약 10 mM 내지 50 mM의 농도로 수성 제형 중에 존재한다.

일 구현예에서, 동결건조보호제는 수크로스, 만니톨 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 동결건조보호제는 약 10 mg/mL 내지 100 mg/mL의 농도로 수성 제형 중에 존재한다.

일 구현예에서, 항체에 대한 동결건조보호제, 바람직하게는 수크로스의 몰비는 약 200 내지 1500이다.

일 구현예에서, 본 발명은 동결건조 제형의 총 중량을 기준으로

a) 약 25 w/w% 내지 40 w/w%, 바람직하게는 약 28 w/w% 내지 32 w/w%의 항체; 및

b) 약 55 w/w% 내지 75 w/w%, 바람직하게는 약 65 w/w% 내지 71 w/w%의 수크로스

를 포함하는, 동결건조 제형을 제공한다.

일 구현예에서, 동결건조 제형은 수성 제형을 동결건조함으로써 수득 가능하며, 여기서 수성 제형은 약 5.7 내지 6.3의 pH를 갖고,

a) 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 10 mg/mL 내지 100 mg/mL 농도의 수크로스;

c) 선택적으로, 최대 100 mg/mL 농도의 만니톨;

d) 약 20 mM 농도의 시트레이트(예를 들어, 시트르산나트륨); 및

e) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일 구현예에서, 동결건조 제형은 수성 제형을 동결건조함으로써 수득 가능하며, 여기서 수성 제형은 약 5.7 내지 6.3의 pH, 바람직하게는 약 6.0의 pH를 갖고,

a) 약 30 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 90 mg/mL 농도의 수크로스;

c) 약 20 mM 농도의 시트레이트(예를 들어, 시트르산나트륨); 및

d) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

a) 약 40 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 90 mg/mL 농도의 수크로스;

d) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

a) 약 50 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 40 mg/mL 농도의 수크로스;

d) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

a) 약 30 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 20 mg/mL 농도의 수크로스;

c) 약 40 mg/mL 농도의 만니톨;

e) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

a) 약 30 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 40 mg/mL 농도의 수크로스;

c) 약 80 mg/mL 농도의 만니톨;

e) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

a) 약 30 mg/mL 농도의 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체;

b) 약 40 mg/mL 농도의 수크로스;

c) 약 60 mg/mL 농도의 만니톨;

e) 약 0.02% w/v(0.2 mg/mL) 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 상술된 바와 같이 동결건조 제형을 재구성함으로써 수득된 액체 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적은 저장 시간 동안 안정한 항체 제형을 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 안정한 제형은 그 중의 항체가 본질적으로 이의 효능, 물리적 및 화학적 안정성 및 저장 시 온전성을 유지하는 제형이다. 항체 제형의 안정성은 생물학적 활성 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 활성 감소는 개시 시간(즉, T=0)과 비교하여 24주 또는 36주 동안, 또는 12개월, 15 개월, 18개월 또는 24개월 동안 장기간 저장 조건(2℃ 내지 8℃)에서 저장 시 20% 미만, 더욱 바람직하게는 15% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만이다. SEG101에 관한 한, 생물학적 활성은 인간 P-셀렉틴을 발현하는 세포와 이의 리간드 PSGL-1, 예를 들어, 인간 P-셀렉틴을 이의 표면에 제시하도록 재조합으로 변형된 포유동물 세포와 재조합 인간 PSGL-1의 상호 작용을 억제하는 능력에 기초하여 결정된다. 적합하게는, 이는 세포를 형광 표지하고 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 SEG101과 함께 인큐베이션한 다음에, 웰이 먼저 PSGL-1로 코팅된 후 그 표면에 인간 P-셀렉틴을 발현하는 포유동물 세포와 함께 인큐베이션된 마이크로타이터 플레이트로부터 형광 신호를 측정함으로써 결정된다. SEG101 또는 이의 변이체의 생물학적 활성을 측정하는 적합한 방법은 실시예 2.1에서 입증된다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 상술된 바와 같이 장기간 저장 동안 비검출 또는 단지 매우 낮은 수준의 항체 응집만을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 제형 중 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 항체 분자는 2℃ 내지 8℃에서 6주 동안, 12주 동안, 24주 동안, 36주 동안, 48 주 동안, 1년 동안, 또는 18개월 동안, 또는 24개월 동안 저장 후, 예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정하는 경우, 모노머로서 존재한다. 가장 바람직하게는, 제형 중 항체 분자의 적어도 97%는 2℃ 내지 8℃에서 36주 동안 또는 1년 동안, 18개월 동안 또는 24개월 동안 저장 후 모노머로서 존재한다. 바람직하게는, SEC는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행된다.

바람직하게는, 액체 항체 제형은 6개월 이상의 저장 수명을 나타내야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 보관될 때, 적어도 9개월, 예를 들어, 9개월, 적어도 1년, 예를 들어, 1년, 적어도 18개월, 예를 들어, 18개월, 또는 최대 2년, 예를 들어, 24개월의 저장 수명을 나타낸다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 약 12개월, 18개월 또는 적합하게는 24개월의 저장 수명을 나타낸다. 저장 수명을 결정하는 주요 요인은 일반적으로 부산물 및 분해 생성물의 형성 및 생물활성의 손실이다. 크리잔리주맙의 생물학적 활성은 이의 저장 수명 동안 원래 활성의 80% 내지 125%로 유지되어야 한다. 본 발명의 제형은 이러한 요망되는 안정성 수준을 달성한다.

항-P-셀렉틴 항체

인간 P-셀렉틴에 대한 항체는, 예를 들어, WO 2008/069999로부터 공지되어 있으며, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다. 인간 P-셀렉틴에 대한 항체는 또한 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 V_H 도메인 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 V_L 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, SEG101은 SEQ ID NO: 9의 중쇄 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄를 포함하는 P-셀렉틴에 대한 인간화 단클론성 항체이다. 항체는 높은 친화성 및 특이성으로 P-셀렉틴의 아미노 말단에 위치한 렉틴-결합 도메인에 결합하고, P-셀렉틴과 이의 수용체 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)의 상호작용을 차단한다.

크리잔리주맙은 인간 P-셀렉틴에 대항하는 인간화 단클론성 항체이고, 또한 참조 WO 2018/083645 A1에 기재되어 있다. 크리잔리주맙은 SEQ ID NO: 9의 중쇄 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 표 1은 SEG101의 서열 특징을 요약한 것이다.

[표 1] SEG101의 아미노산 설명

표적 질환 및 장애

본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 질환 또는 장애를 치료, 개선 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 특히 P-셀렉틴 매개 또는 P-셀렉틴 관련 장애를 치료하는 데, 특히 겸상 적혈구 질환과 관련된 혈관 폐쇄성, 염증, 및 통증 위기를 감소시키거나 없애는 데 유용하고; 예를 들어, WO 2018/ 083645A1 및 WO 2008/069999A2를 참조한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "P-셀렉틴 매개 장애" 또는 "P-셀렉틴 관련 장애"는 증가된 수준의 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체와 관련되거나 이를 특징으로 하는 장애를 지칭한다. 항-P-셀렉틴 항체 또는 이의 결합 단편은 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체의 형성을 감소시키는 능력을 가질 수 있다. 이들은 또한 미리 형성된 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체를 해리시키는 능력을 가질 수 있다. 따라서, 항-P-셀렉틴 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물의 사용은 새로운 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체의 형성을 억제함으로써 P-셀렉틴 매개 장애를 예방할 수 있음이 인지될 것이다. 또한, 상기 제형의 사용은 미리 형성된 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체를 해리시킴으로써 기존의 P-셀렉틴 매개 장애의 치료를 가능하게 한다는 것이 인지될 것이다. 적합하게는, P-셀렉틴/PSGL-1 복합체의 형성 및 이러한 복합체의 해리의 감소는 세포 대 세포 상호 작용 동안 발생한다. 따라서, 적합하게는 본원에 기재된 항-P-셀렉틴 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 예방되는 장애는 세포 대 세포 상호작용에서 증가된 수준의 P-셀렉틴/PSGL-1 복합체와 관련된 장애이다.

P-셀렉틴/PSGL-1 복합체의 증가된 수준은 광범위한 장애 및/또는 증상에서 관찰될 수 있다. 특히, 이들은 염증성 및/또는 혈전성 장애 및/또는 증상을 갖는 대상체 또는 대상체로부터의 샘플에서 관찰된다. 따라서, 항-P-셀렉틴 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 다음으로 이루어진 염증성 및/또는 혈전성 장애와 같은 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다: 겸상 적혈구 질환, 겸상 적혈구 통증 위기, 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염, 및 건선 관절염), 이식편 거부, 이식편대숙주병, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 건선, 피부염, 패혈증, 신염, 홍반성 루프스, 경피증, 비염, 아나필락시스, 당뇨병, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, 혈전증, 종양 전이, 알레르기 반응, 갑상선염, 허혈성 재관류 손상(예를 들어, 심근경색, 뇌졸중 또는 장기 이식으로 인한), 암(예를 들어, 다발성 골수종) 및 광범위한 외상 또는 만성 염증과 관련된 병태, 예를 들어, 이를 테면, IV형 지연 과민증, 예를 들어, 결핵균에 의한 감염 관련, 또는 전신 염증 반응 증후군, 또는 다발성 장기 부전.

겸상 적혈구 질환이 있는 대상체는 겸상 적혈구 통증 위기를 경험할 수 있다. 항-P-셀렉틴 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에서 겸상 적혈구 질환에서의 혈관 폐쇄성 통증 위기를 치료하고 예방하는 데 특정 유용성을 가질 수 있다. 적합하게는, 겸상 적혈구 질환을 갖는 대상체는 HbSS, HbSC, HbSβ0-지중해빈혈 및 HbSβ0+ 지중해빈혈로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자형을 갖는다.

환자 투여

본 발명의 목적은 P-셀렉틴 매개 질환 또는 의학적 병태의 치료를 위한 본 발명의 제형의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명은 P-셀렉틴 매개 질환 또는 의학적 병태, 적합하게는 겸상 적혈구 질환을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 P-셀렉틴 매개 질환 또는 의학적 병태, 예를 들어, 염증성 및 혈전성 질환, 종양 전이의 예방 및 치료에 유용하며, 특히, 바람직하게는 WO 2018/083645A1의 13 페이지, 3 단락 내지 19 페이지 3 단락(상기 페이지는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 투여 요법으로 겸상 적혈구 질환과 관련된 혈관 폐쇄성, 염증, 및 통증 위기를 감소시키거나 제거하는 데 유용하다. 본 발명의 제형은 단독 치료로서 또는 본원에 앞서 기재된 바와 같은 병태를 치료하는 데 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 P-셀렉틴 매개 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방, 예를 들어, 겸상 적혈구 통증 위기의 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이고, 여기서 조성물은 먼저 대상체가 5 mg/kg 내지 7.5 mg/kg의 양으로 항체의 2개의 로딩 용량을 받고 2개의 로딩 용량 사이의 시간 간격은 2주(+/- 3일)인 로딩 단계에 제공되고, 이후 추가로 대상체가 5 mg/kg 내지 7.5 mg/kg의 양으로 항체의 복수의 유지 용량을 받고 복수의 유지 용량 사이의 시간 간격은 4주인 유지 단계에 제공된다.

일 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 바이알에 있다.

일 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 경로에 의해, 전형적으로 주입이 실시되는 등장액(예를 들어, 0.9% NaCl 또는 5% 덱스트로스)이 충전된 주입 용기(예를 들어, 플라스틱으로 제조된 주입 백)로 주사기를 통해 옮김으로써 환자에 투여된다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체, 전형적으로 건강한 지원자 또는 환자에게 바람직하게는 5 mg/kg의 양, 바람직하게는 2주 간격으로 2회 로딩 용량, 및 이어서 4주 마다 복수의 유지 용량으로 바람직하게는 정맥내 경로에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체의 농도가 결정되고, 다음 PK 매개변수 중 하나 이상 또는 전부가 충족된다:

a) 상기 약제학적 조성물의 투여 후 0.4 내지 10시간(h), 바람직하게는 0.55 h 내지 6.25 h, 바람직하게는 평균 1.5 h 내지 2.5 h, 바람직하게는 1.92 h 범위의 t_max;

b) 첫 용량 이후, 116 μg/mL ± 91.3 μg/mL의 범위; 또는 바람직하게는 50 μg/mL 내지 200 μg/mL, 바람직하게는 124 μg/mL ± 31.6 μg/mL의 정상 상태의 C_max;

c) 100 h 내지 300 h의 범위, 바람직하게는 150 h 내지 210 h의 범위, 예를 들어, 약 183 h(7.6 일)의 겉보기 t_1/2;

d) 바람직하게는 23.5%의 변동 계수로 10 000 μg × h/mL 내지 30 000 μg × h/mL의 범위, 바람직하게는 15주에 20400 μg × h/mL의 AUC_{tau, ss}(여기서, "tau"는 투약 간격을 지칭하고, 따라서 AUCtau, 정상 상태(ss)는 15주 1일에 주입 시작부터 19 주차에 주입 직전까지의 AUC임);

e) 전형적으로 체중이 70 kg인 SCD 환자에서, 10 mL/h 내지 30 mL/h, 바람직하게는 15 mL/h 내지 20 mL/h의 범위, 예를 들어, 약 17.2 mL/h의 15주 정상 상태에서의 평균 제거율;

f) 약 3.78 μg/mL 내지 9.8 μg/mL의 범위의 특히 7주 내지 27주 정상 상태에서 4주마다 얻어진 PK 최저 농도. 또한, 3 주에, 이전 주입 후 2주 동안 최저 농도는 약 12 μg/mL 내지 약 24 μg/mL, 바람직하게는 약 15 μg/mL 내지 약 21 μg/mL, 바람직하게는 약 18.2 μg/mL이다.

혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 변이체의 농도는 전형적으로 생체외 및 전형적으로 ELISA에 의해, 전형적으로 공급원으로서 P-셀렉틴을 사용하여 결정된다. 따라서, 방법은 P-셀렉틴에 결합할 수 있고 바람직하게는 검정에 사용된 항-인간 IgG 항체에 의해 추가로 결합될 수 있는 모든 혈청 크리잔리주맙 및 이의 변이체를 측정한다.

전형적으로, 샌드위치 ELISA는 인간 혈청에서 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체를 검출하는 데 사용된다. 고-결합 이뮤노플레이트는 마우스 항-인간 P 셀렉틴 항체로 코팅되었다. 이어서 플레이트는 인간 P-셀렉틴으로 코팅되었다. 정량화된 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체는 표준물 및 품질 관리(QC) 샘플을 제조하기 위해 사용되었고, 이후 지정된 샘플 웰에 첨가되었다. 결합된 크리잔리주맙의 양은 비오티닐화된 염소 항-인간 IgG, 호스래디쉬 과산화효소에 공유 결합된 스트렙타비딘 단백질(스트렙타비딘-HRP), 및 발색 기질, 테트라메틸벤지딘(TMB)의 후속 첨가에 의해 가시화되고, 이러한 반응의 생성물은 분광광도계로 450 nm에서 검출되었다. 혈청 샘플에서 크리잔리주맙 및 이의 변이체의 농도는 표준 검량선으로부터 역-계산된다.

일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체, 전형적으로 건강한 지원자 또는 환자에게 바람직하게는 적어도 5 mg/kg의 양, 바람직하게는 2주 간격으로 2회 로딩 용량, 및 이어서 4주 마다 복수의 유지 용량으로 바람직하게는 정맥내 경로에 의해 투여되고, 여기서 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 변이체는, 전형적으로 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정에 의해 결정하는 경우, PSGL-1에 대한 P-셀렉틴 결합의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 억제를 달성한다.

표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정은 시험관내 결합 경쟁 검정이다. 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체의 부재에서, P-셀렉틴의 이의 표적 PSGL-1에 대한 결합은 100%로 설정된 정량 가능한 신호를 생성한다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물을 첨가함으로써, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 받은 인간 대상체로부터 수득된 혈청을 첨가함으로써, 크리잔리주맙 및 이들의 임의의 첨가는 P-셀렉틴의 PSGL-1에 대한 결합을 억제하여, 감소된 신호를 야기하고, 이는 억제 백분율로 계산될 수 있다.

SPR 검정의 일 구현예에서, P-셀렉틴은 PSel-Ig에 여전히 결합할 수 있는 PSGL-1의 최소 펩티드 버전을 나타내는 글리코설포펩티드 6(GSP6)에 의해 면역글로불린에 융합된 P-셀렉틴(PSel-Ig) 및 PSGL-1에 융합된 P-셀렉틴으로 대체된다.

추가 SPR 구현예는 실시예 6에 기술된다.

일 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 크리잔리주맙 및 이소-크리잔리주맙을 포함하며, 여기서 약제학적 조성물을 사용하여 결정된 IC50은 약 4 μg/ml 내지 7 μg/ml, 전형적으로 약 4.6 μg/ml 내지 6.2 μg/ml, 전형적으로 약 5.0 μg/ml 내지 5.7 μg/ml, 전형적으로 약 5.2 μg/ml의 범위이다. 일 구현예에서, IC50은 시험관내 검정으로 결정된다.

실시예

실시예 1: SEG101에 대한 액체 제형의 제조

SEG101은, 예를 들어, WO 2008/069999의 15 페이지 20 줄 내지 18 페이지 29 줄(상기 페이지는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다. 표 2는 SEG101에 대한 이들의 적합성에 대해 시험된 제형을 보여준다. 샘플 B 및 샘플 C, 및 샘플 F 및 샘플 G는 각각 제형 내의 가변성을 평가하기 위해 동일하다.

[표 2] 시험된 제형

1 결과

1.1 역가 검정

모든 샘플에 대해, ELISA 및 세포-기반 검정에 의해 측정된 역가는 기대 범위 내에서 안정성 연구의 시작 시기였다. ELISA에 대한 현재 사양은 참조 물질과 비교하여 80% 내지 125% 상대 생물학적 활성이었다.

ELISA 결합에 의한 역가 검정은 측정된 임의의 샘플 또는 안정성 시점에 대한 관련 변화를 나타내지 않았다(표 3). 세포-기반 검정(표 4)에서 모든 히스티딘 및/또는 아르기닌 함유 샘플에 대해 40℃/2주뿐만 아니라 25℃/12주에 유의한 역가 감소가 관찰되었다(표 3). 포스페이트 또는 시트레이트 완충제의 샘플은 이러한 역가 감소를 나타내지 않았다.

제형 K에 대한 별도의 실험에서, 상이한 시점에 ELISA 및 세포-기반 검정(다른 제형에 대해 동일한 방법을 이용함)에 의해 역가를 측정하였다(표 5).

[표 3] ELISA 결합에 의한 역가(P-셀렉틴에 대한 결합)

[표 4] 세포-기반 검정에 의한 역가

[표 5] 제형 K에 대한 ELISA 및 세포 기반 검정에 의한 역가

샘플을 밀봉된 바이알에 보관하였다. 바이알 외부의 습도는 실제로 약물의 안정성과 관련이 없다.

1.2 CZE에 의한 전하 변이체

장기간 저장 조건(2℃ 내지 8℃)에서 시간 경과에 따른 전하 변이체 프로파일에 단지 매우 제한된 변화만이 있었다. 그러나, 변화는 가속(25℃) 및 스트레스(40℃) 조건에서 매우 두드러졌다.

1.2.1 분해 경로에 대한 pH 값의 영향

CZE 주요 피크의 변화는 주로 온도에 따라 나타나며, pH 6.0과 pH 7.0 설정점 사이에 관련 차이가 관찰되지 않았다(도 1, 표 6).

[표 6] CZE 주요 피크에 대한 제형 pH의 영향. 열 A 내지 K의 값은 CZE 다이어그램에서 주요 피크 % AUC를 나타낸다.

출발 물질과 비교할 때, 염기성 변이체는 pH 6.0에서 증가한 반면, pH 7.0에서는 시간 경과에 따라 감소가 관찰되었다(도 2, 표 7). 2℃ 내지 8℃에서 pH 6.0에서는 염기성 피크의 수준이 거의 일정하게 유지된 반면, 2℃ 내지 8℃에서 pH 7.0에서는 느리지만 일정한 감소가 관찰되었다. 가속화된 조건(25℃)에서, pH 6.0과 pH 7.0 둘 모두에서 정체기에 도달한 것으로 보인다.

[표 7] CZE 염기성 피크에 대한 제형 pH의 영향. 열 A 내지 K의 값은 CZE 다이어그램에서 염기성 변이체 % AUC의 합을 나타낸다.

염기성 피크의 pH-의존적인 상이한 발달과는 대조적으로, 산성 변이체는 출발 물질과 비교하여 시간 경과에 따라 둘 모두의 pH 값에서 증가한다(도 3). pH 7.0에서, 산성 변이체의 관찰된 상대 피크 면적 증가는 pH 6.0과 비교하여 양이 모든 온도에서 약 2배였다. 다시, 2℃ 내지 8℃에서 pH 6.0에서는 산성 변이체에 매우 작은 증가만이 검출될 수 있다.

따라서, pH 6.0에서의 제형은 시간 경과에 따라 전하 변이체 프로파일에서 덜 절대적인 변화를 나타내며, pH 7.0에서의 제형과 비교하여 저장 동안 더욱 일관된 제품 품질을 제공한다는 결론을 내릴 수 있다.

[표 8] CZE 산성 피크에 대한 제형 pH의 영향. 열 A 내지 K의 값은 CZE 다이어그램에서 산성 변이체 % AUC의 합을 나타낸다.

제형 K에 대한 별도의 실험에서, 상이한 시점에서 CZE(다른 제형에 대해 동일한 방법을 이용함)에 의해 전하 이질성을 측정하였다(표 9).

[표 9] 제형 K의 CZE 주요, 염기성 및 산성 피크에 대한 제형 pH의 영향

1.3 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 순도

모든 시험된 조건에서, 응집체 수준은 pH 6.0에서 제형의 경우 1.5% 내지 2%이고, pH 7.0에서 10 mg/mL 제형의 경우 2% 내지 2.5%였다(도 4, 표 10 내지 표 12). 응집체 수준의 관련 변화는 관찰되지 않았다. 단편은 대략 0.1%의 양으로 존재한다. 모노머 피크는 96% 초과이며, 또한 저장 시간의 경과에 따라 변화를 거의 나타내지 않았다. pH 7.0에서 50 mg/mL 제형은 스트레스 조건에서 최대 약 4%로 저장 시간의 경과에 따라 뚜렷하게 더 높은 응집체 수준을 나타냈다.

[표 10] SEC에 의해 측정하는 경우 스크리닝된 제형 A 내지 제형 K의 순도. 값은 항체의 모노머 형태에 상응하는 % AUC를 나타낸다.

[표 11] SEC에 의해 측정하는 경우 스크리닝된 제형 A 내지 제형 K의 순도. 값은 항체 응집체 형태의 % AUC의 합을 나타낸다.

[표 12] SEC에 의해 측정하는 경우 스크리닝된 제형 A 내지 제형 K의 순도. 값은 항체 단편의 % AUC의 합을 나타낸다.

제형 K에 대한 별도의 실험에서, 상이한 시점에서 SEC(다른 제형에 대해 동일한 방법을 이용함)에 의해 순도를 측정하였다(표 13).

[표 13] SEC에 의해 측정하는 경우 제형 K의 순도

실시예 2: SEG101의 생물활성을 측정하기 위한 검정

2.1 ELISA

ELISA에서, SEG101 샘플의 역가 및 동일성을 재조합 인간 P-셀렉틴에 결합하는 이들의 능력에 기초하여 측정하였다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 P-셀렉틴으로 코팅하고, 등급화된 양의 SEG101을 첨가하였다. 결합된 SEG101을 호스래디쉬 과산화효소에 결합된 항-인간 IgG 항체, 및 이어서 비색 기질을 첨가하여 정량화하였다. 비색 반응의 결과를 광 흡수에 의해 측정하였다. SEG101 시험 샘플의 역가를 P-셀렉틴에 결합하는 이의 능력을 SEG101 참조 표준물의 능력과 비교함으로써 정량화하였다. 샘플 및 표준물을 단백질 함량을 기준으로 정규화하였다. 상대 역가를 유럽 약전에 따라 평행선 검정을 이용하여 계산하였다. 최종 결과를 참조 표준물과 비교하여 샘플의 상대 역가(퍼센트)로 표시하였다.

2.2 세포-기반 검정 - P-셀렉틴 발현 Raji 세포의 PSGL-1에 대한 접착 억제

V-바닥 마이크로타이터 플레이트(V-bottom microtiter plate)를 재조합 인간 PSGL-1로 코팅한 후, 등급화된 양의 SEG101을 첨가하였다. 인간 P-셀렉틴을 이들의 표면에 나타내도록 재조합으로 변형된 Raji 세포를 형광 표지하고, 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하였고, 부착되지 않은 세포는 V-형 웰의 바닥에 축적되었으며, 여기서 형광 판독기를 사용하여 이들을 측정하였다. PSGL-1에 대한 P-셀렉틴 발현 Raji 세포의 접착을 억제하는 이의 능력을 SEG101 참조 표준물의 능력과 비교함으로써 SEG101 시험 샘플의 역가를 정량화하였다. 샘플 및 표준물을 단백질 함량을 기준으로 정규화하였다. 상대 역가를 유럽 약전에 따라 평행선 검정을 사용하여 계산하였다. 최종 결과를 참조 표준물과 비교하여 샘플의 상대 역가(퍼센트)로 표시하였다.

[표 14] 크리잔리주맙의 상이한 전하 변이체의 생물활성

실시예 3: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 순도

이 시험은 UV 검출을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 기초로 했다. 상이한 크기의 변이체(예를 들어, 저분자량 및 고분자량 변이체 및 불순물)를 적합한 컬럼에서 천연 조건 하에 SEC에 의해 분리하였다. 주요 피크의 순도뿐만 아니라 응집체 및 단편의 양을 각 크로마토그램에서 샘플에 대해 얻어진 총 면적의 백분율로 결정하였다.

사용될 HPLC-시스템은 펌프, 주입 시스템 및 온라인 탈기기, 냉각 장치가 있는 오토샘플러, 컬럼 히트 및 210 nm에서 흡광도를 모니터링할 수 있는 UV 검출기가 장착된 적합한 고성능 액체 크로마토그래피 시스템이었다. 컬럼은 TSKgel G3000SWXL, 5 μm; 7.8 mm × 300 mm, 또는 등가물이었다.

샘플 용액을 약 0.75 mg의 SEG101/mL의 최종 농도까지 이동상(pH 6.5± 0.1에서 150 mM 인산칼륨 용액)으로 희석하였다. 참조 용액을 제조하기 위해, 참조 물질을 대략 0.75 mg의 SEG101/mL의 최종 농도까지 이동상으로 희석하였다. 이동상을 블랭크로서 사용하였다. 참조 물질을 대략 0.75 μg의 SEG101/mL, 2 mg의 아프로티닌/mL의 최종 농도까지 아프로티닌 용액으로 희석함으로써 LOQ 용액을 제조하였다.

크로마토그래피 조건을 유량 0.4 mL/분, UV 210 nm로의 검출, 컬럼 온도 30℃±2℃, 오토-샘플러 온도 약 5℃, 실행 시간 35 분, 및 참조 용액 중 대략 7.5 μg의 SEG101과 등가인 주입 부피 10 μL의 시험 및 참조 용액으로 조정하였다. 블랭크 크로마토그램에서, 시험 용액의 크로마토그램의 적분 범위에서 LOQ 신호 높이 이상의 신호 높이를 갖는 블랭크에서 간섭 피크가 검출되지 않아야 한다. 정량 한계(LOQ)는 신호 대 잡음비가 SEG101 피크의 10 이상이 되도록 하였다. 피크 면적의 재현성은 PA_샘플을 PA_참조로 나눈 값이 최소 0.80 및 최대 1.20이 되도록 해야 한다. PA_샘플은 mAU × min의 각 개별 샘플 주입에 대한 총 피크 면적을 나타낸다. PA_참조는 mAU × min의 샘플 블록 전 참조 주입에 대한 총 피크 면적을 나타낸다.

순도(주요 피크의 %P), 0.95의 상대 체류 시간에서 피크가 없는 응집체(주성분보다 먼저 용리됨)의 합(%) 및 단편(주성분보다 늦게 용리됨)의 합(%)이 보고되어야 한다. 0.95의 상대 체류 시간(모노머/주요 피크의 체류 시간에 대한 체류 시간)에서의 피크는 개별적으로 보고되어야 한다.

실시예 4: CZE에 의한 동일성 및 전하 이질성

모세관 영역 전기영동(CZE)의 분리 원리는 전기장에서 상이한 순 전하 대 질량 비를 갖는 단백질의 상이한 전기영동 이동도를 기초로 하였다. pI 미만의 pH에서 각 단백질은 양전하를 띠고, 양극에서 음극으로 이동할 것이다. 주요 피크와 비교한 단백질 변이체의 이동 속도는 단백질 변이체의 순 전하 대 질량비가 증가함에 따라 높아진다. 명확성을 위해, 용어 "주요 피크"는 특정 조건 하에서도 약제학적 조성물 내 우세한 형태가 이소-크리잔리주맙 형태이더라도 크리잔리주맙을 지칭한다. 여러 가지 이유가 상이한 이동성을 초래할 수 있지만, 주요 변이체보다 빨리 이동하는 변이체는 일반적으로 '염기성 변이체'라 명명되고, 더 느리게 이동하는 것들은 '산성 변이체'라 명명된다. UV 흡광도에 의한 검출 후, 전하 변이체를 상대 시간 보정된 피크 면적 결정에 의해 정량화하였다.

동일성을 공동-혼합에서 주요 피크 패턴을 관찰하거나 전기영동도를 비교함으로써 결정하였다.

214 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기를 갖는 모세관 전기영동 시스템이 사용될 수 있다. 모세관은 내경이 50 μm인 코팅되지 않은 용융-실리카 모세관이다.

샘플 용액을 샘플 완충제(5 mM 포스페이트 pH 7.3± 0.1)로 대략 3.0 mg의 SEG101/mL의 최종 농도까지 희석하였다. 참조 물질을 대략 3.0 mg의 SEG101/mL의 최종 농도까지 샘플 완충제로 희석하였다. 샘플 완충제를 사용하여 참조 물질을 대략 60 μg의 SEG101/mL의 최종 농도까지 희석함으로써 민감도 용액을 제조하였다. 3:2(v/v)의 비로 시험 용액과 참조 용액을 혼합함으로써 공동-혼합 용액을 제조하였다. 샘플 완충제를 블랭크로서 사용하였다.

전기영동 조건을 입구에서 검출기까지의 모세관 길이가 40 cm이고, 모세관의 총 모세관 길이가 50 cm이고, 전압이 20 kV이고, 극성이 양성이고, 모세관 온도가 25℃±2℃이고, 오토-샘플러 온도가 15℃±3℃이고, 실행 시간이 45 분이고, 데이터 속도가 8 Hz이고, 검출이 214 nm에서이고, 조리개가 100 μm × 800 μm이며, 주입 시간이 8 s 동안 0.5 psi(4psi × s)가 되도록 조정하였다.

샘플의 전기영동도의 적분 범위에서 LOQ 신호 높이 이상의 신호 높이를 갖는 블랭크에서 간섭 피크가 검출되지 않아야 한다. 분해능은 R_S ≥ 1.4여야 하며, 여기서 분해능 R_S는 모세관 성능을 평가하기 위해 참조 용액의 첫 주입 및 마지막 주입에 대해 계산하였다. 정량 한계(0.60%)를 확인하려면 LOQ 용액(2.0% 희석)에서 SEG101 주요 피크에 대한 신호 대 잡음비(S/N)가 10 이상이어야 한다. 피크 면적의 재현성은 PA_샘플을 PA_참조로 나눈 값이 최소 0.80 및 최대 1.20이 되도록 해야 한다. PA_샘플은 시험 용액의 각 개별 주입에 대한 총 시간 보정 피크 면적(mAU)을 나타내고, PA_참조는 참조 용액의 첫 주입에 대한 총 시간 보정 피크 면적(mAU)을 나타낸다.

순도를 위해, 각 샘플에 대하여, 산성 변이체의 상대 시간 보정 피크 면적(주요 피크에 대해 이동 시간 > 1.0), 염기성 변이체의 상대 시간 보정 피크 면적(주요 피크에 대해 이동 시간 < 1.0) 및 주요 피크가 보고되어야 한다. 0.60%(LOQ) 미만의 전하 변이체는 산성 또는 염기성 변이체의 합 계산에 포함시키지 않았다.

동일성을 위해, 공동-혼합 용액에서 주요 피크에 대해 관찰된 단일 피크가 필요했다. 추가로, 샘플 용액의 피크 패턴을 참조의 피크 패턴과 비교하였다.

실시예 5: SEG101에 대한 동결건조 제형의 제조

표 2는 SEG101에 대한 이들의 적합성에 대해 시험된 액체 제형을 보여준다.

SEG101을 또한 다양한 여러 단백질 농도, 동결건조보호제 대 단백질 몰비 및 비정질 동결건조보호제 단독(수크로스) 또는 결정질 증량제(만니톨)과 조합한 사용을 포괄하는 6 개의 상이한 동결건조 제형으로 제형화하였다. 제형의 정확한 조성은 표 15에 제시되어 있다.

[표 15] SEG101 예비-동결건조 제형의 조성물

5.1 동결건조 공정 조건

제형 조성물의 차이, 즉, 비정질 대 부분 결정질 제형(표 15)으로 인해, 2개의 별개의 동결건조 공정을 실행하였다.

표 16에 요약된 첫 번째 실행을 비정질 제형 DP1, DP2 및 DP3에 대해 선택하였다. 표 17에 요약된 두 번째 실행에서, 수크로스 및 만니톨의 조합을 함유하는 제형, 즉, DP4, DP5및 DP6을 동결건조시켰다. PD 단계 동안 두 실행 모두에서 챔버 압력을 0.133 mbar로 설정하였다. 2차 건조 단계(SD)는 두 실행 모두에서 동일했다. 전체 건조 물질 함량은 후보 제형에서 비교적 높기 때문에(비정질 제형에서 최대 443 mg 및 부분 결정질 제형에서 최대 557 mg), 잔류 수분 수준이 증가할 위험이 있었다. 따라서, SD 동안 챔버 압력은 0.05 mbar로 감소되었고, 설정된 저장 온도는 8 h 동안 30℃였다.

[표 16] 첫 번째 실행 매개변수

[표 17] 두 번째 실행 매개변수

5.2 안정성

동결건조 안정성 연구의 목적은 6 개의 동결건조된 SEG101 제형의 물리-화학적 안정성을 비교하는 것이었다(표 15). 제형을 의도된(5℃±3℃), 가속화된(25±2℃, 60±5% rh; rh: 상대 습도) 및 스트레스(40±2℃, 75±5% rh) 저장 조건에 최대 12개월 동안 노출시키고 분석하였다.

동결건조 공정에 들어가는 동결건조 전 용액에 대한 결과와 동결건조 사이클 직후의 재구성된 용액에 대한 결과의 비교는 재구성 및 동결건조 사이클 자체가 실제로 제형의 물리화학적 성질에 영향을 미치지 않음을 보여주었다.

5.3 SEC에 의한 응집체 및 CZE에 의한 전하 변형체의 결정

동결건조 제형을 상이한 시점에 APW(추가로 정제된 물)에서 재구성하고, SEC(표 18) 및 CZE(표 19)에 의한 분석에 주어지게 하였다.

[표 18] SEC에 대한 안정성 데이터

[표 19] CZE에 대한 안정성 데이터

5.4 DP2에 대한 추가 연구

5.4.1 장기 안정성 시험(5℃)

DP2의 5℃에서 6개월 저장 후, 모든 결과는 장기 보관 조건에 설정된 요건 내에 있었다. 시험된 모든 품질 특성에 대한 경향은 관찰되지 않았다.

5.4.2 가속화된 안정성 시험(25℃/60% RH)

25℃/60% RH에서 DP2의 6개월 저장 후, 표 20에 제시된 결과를 제외하고 모든 품질 특징에 대한 경향이 관찰되지 않았다. 다른 모든 방법에 대한 결과는 가속화된 조건에 대해 예상되는 경향을 따랐다. 모든 결과는 장기 저장 조건에 설정된 요건 내에 있었다.

[표 20] CZE에 의해 측정하는 경우 상이한 시점에 25℃에서 저장된 DP2의 전하 변이체

5.4.3 스트레스 안정성 시험(섭씨 40도/75% RH)

40℃/75% RH에서 DP2의 6개월 저장 후, 표 21에 제시된 결과를 제외하고 모든 품질 특징에 대하여 경향이 관찰되지 않았다.

다른 모든 방법에 대한 결과는 스트레스 조건에 대해 예상되는 경향을 따랐다. 모든 결과는 장기 저장 조건에 설정된 요건 내에 있었다.

[표 21] DP2에 대한 스트레스 시험 동안 관찰된 변화

5.5 기타 분석 방법에 대한 결과

모든 재구성된 제형은 실제로 눈에 보이는 입자가 없고 모든 포설 지점에서 무색이었다. UV 함량 및 pH는 모든 스트레스 조건에서 변하지 않았다(방법 가변성 또는 예상되는 바이알 대 바이알 가변성 내에서). ELISA 및 세포-기반 검정으로 결정하는 경우 제형 DP1, DP2 및 DP3의 생물학적 활성은 40℃에서 6개월 후, 그리고 5℃ 및 25℃에서 12개월 후 DP1 및 DP2에 대하여 변하지 않았다(예상된 방법 가변성 내에서)(표 22).

[표 22] ELISA 및 생물검정에 대한 동결건조 안정성 데이터

실시예 6: 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR)을 이용한 인간 샘플(PD)에서 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체에 의한 P-셀렉틴 억제의 측정

SPR-기반 방법을 이용하여 크리잔리주맙으로 처리된 인간 공여자로부터의 인간 혈청 샘플에서 크리잔리주맙의 생체 외 % P-셀렉틴 억제를 측정하였다. 이러한 PD 검정에 의해서 P-셀렉틴(항원; 리간드)이 PSGL-1(리간드 수용체)에 결합하는 것을 차단하는 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 변이체의 능력을 측정하였다. 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체에 의한 차단을 PSGL-1 결합 도메인을 모사하는 펩티드 유사체인 글리코설포펩티드 6(GSP-6)에 결합하는 면역글로불린에 융합된 스파이킹된 P-셀렉틴(Psel-Ig)의 억제 %로서 측정하였다. 예를 들어, 표준 아민 커플링을 사용하여 이용된 바이오센서 칩의 2개 채널(FC-2 및 FC-3)에 스트렙타비딘을 고정시킨 다음, 분석용으로 펩티드를 고정시키기 위해 비오티닐화된 GSP-6을 주입하였다. 스트렙타비딘을 비오틴-차단함으로써 참조 채널(FC-1)을 제조하였다. 전처리 샘플은 각 대상체에 대한 최대 결합을 확립하였고, 이를 다양한 시점에 대상체로부터의 투여 후 혈청 샘플을 사용하여 억제 %를 계산하기 위한 기준으로서 사용하였다. 일련의 희석으로 정량화된 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체를 사용하여 표준 억제 곡선을 생성하였는데, 이는 모든 조건 하에서 크리잔리주맙에 대해 5.2 μg/mL의 IC₅₀ 값을 보여주었다.

Psel-Ig의 존재 및 Psel-Ig의 부재에서 차단 완충제와 혼합된 SCD 환자로부터의 혈청 샘플을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군 샘플로 사용하였다.

검정은 환자로부터 수집된 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체가 실제로 표적에 결합한다는 것을 보여주었다. 환자 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체는 스파이킹된 P-셀렉틴(Psel-Ig)이 글리코설포펩티드 6(GSP-6)에 결합하는 것을 98% 차단하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> ANTIBODY FORMULATIONS <130> PAT058708-WO-PCT <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR1 <400> 1 Ser Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 <400> 2 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 <400> 3 Arg Gly Glu Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR1 <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly His Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Asp Glu Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region (VH) <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Glu Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region (VL) <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly His Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp 85 90 95 Glu Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Glu Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly His Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp 85 90 95 Glu Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

각각 SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 9의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 크리잔리주맙(crizanlizumab), 및 SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 아미노산 아스파르트산이 이소-아스파르트산으로 변경된 크리잔리주맙의 변이체(이소-크리잔리주맙)를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, SEQ ID NO: 10의 32번 위치에서 크리잔리주맙의 석신이미드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이소-크리잔리주맙은 호모-이소-크리잔리주맙 및 헤테로-이소-크리잔리주맙으로 이루어지는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 내 전체 전하 변이체 중 적어도 20%의 크리잔리주맙을 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 내 전체 전하 변이체 중 최대 50%의 크리잔리주맙을 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 내 전체 전하 변이체 중 약 20% 내지 약 50%의 크리잔리주맙을 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템을 추가로 포함하고, 조성물은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, pH는 약 5.5 내지 약 7, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.7 내지 약 6.3인, 약제학적 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서, pH는 약 5.9 내지 약 6.1인, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템은 시트레이트 완충제인, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템은 포스페이트 완충제인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 안정화제는 수크로스인, 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 수크로스는 50 mM 내지 350 mM, 바람직하게는 100 mM 내지 300 mM의 농도인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 등장화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 등장화제는 염화나트륨인, 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 염화나트륨은 50 mM 내지 300 mM의 농도인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제18항에 있어서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제인, 약제학적 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 80인, 약제학적 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트는 0.01% w/v(0.1 mg/mL) 내지 0.1% w/v(1 mg/mL)의 농도인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체(ANTIBODY)는 5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 농도의 항체 및 완충 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로서, 조성물은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는, 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, pH는 약 5.7 내지 약 6.3인, 약제학적 조성물.
제23항 또는 제24항에 있어서, 완충 시스템은 시트레이트(예를 들어, 시트르산나트륨) 및/또는 포스페이트(예를 들어, 인산칼륨)인, 약제학적 조성물.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제26항에 있어서, 안정화제는 수크로스인, 약제학적 조성물.
제26항 또는 제27항에 있어서, 안정화제는 약 50 mM 내지 약 300 mM의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제29항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80인, 약제학적 조성물.
제29항 또는 제30항에 있어서, 계면활성제는 약 0.01% w/v(0.1 mg/ml) 내지 0.1% w/v(1 mg/ml)의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 등장화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항에 있어서, 등장화제는 NaCl인, 약제학적 조성물.
제32항 또는 제33항에 있어서, 등장화제는 약 50 mM 내지 300 mM의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 농도의 항체(크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체), 약 50 mM 내지 약 350 mM의 농도의 수크로스, 및 완충 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로서, 조성물은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 완충 시스템은 시트레이트 완충제 및/또는 포스페이트 완충제인, 약제학적 조성물.
제35항에 있어서, 약제학적 조성물의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3, 예를 들어, 약 6.0인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 형태로 존재하는, 약제학적 조성물.
수성 제형을 동결건조함으로써 수득 가능한 동결건조 제형으로서,
a) 항체(크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체);
b) 동결건조보호제; 및
c) 완충 시스템을 포함하는, 동결건조 제형.
제38항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는, 동결건조 제형.
제39항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 80인, 동결건조 제형.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 약 10 mg/mL 내지 100 mg/mL의 농도로 수성 제형 중에 존재하는, 동결건조 제형.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템은 시트레이트, 예를 들어, 시트르산나트륨인, 동결건조 제형.
제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조보호제로서 수크로스 및/또는 만니톨을 추가로 포함하는, 동결건조 제형.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 제형은 약 10 mg/mL 내지 100 mg/mL의 농도의 수크로스를 포함하는, 동결건조 제형.
제43항 또는 제44항에 있어서, 항체에 대한 수크로스의 몰비는 약 200 내지 1500인, 동결건조 제형.
제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 제형의 총 중량을 기준으로
a) 약 25 w/w% 내지 40 w/w%, 바람직하게는 약 28 w/w% 내지 32 w/w%의 항체; 및
b) 약 55 w/w% 내지 75 w/w%, 바람직하게는 약 65 w/w% 내지 71 w/w%의 수크로스를 포함하는, 동결건조 제형.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항의 동결건조 제형을 재구성함으로써 수득되는 액체 약제학적 조성물.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물을 사용함으로써 결정된 IC50은 약 4.6 μg/ml 내지 6.2 μg/ml의 범위인, 약제학적 조성물.
제48항에 있어서, IC50은 시험관내에서 결정되는, 약제학적 조성물.
겸상 적혈구 질환의 치료, 특히, 혈관 폐쇄성 위기(Vascular Occlusion Crisis, VOC)의 예방을 필요로 하는 대상체에서 겸상 적혈구 질환을 치료하는, 특히, 혈관 폐쇄성 위기를 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물에 포함된 치료적 유효량의 항체(크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 치료적 유효량은 대상체의 체중 킬로그램 당 5 mg 또는 7.5 mg인, 방법.
제50항에 있어서, 첫 2회 용량은 2주 간격으로 투여되고, 이어서 4주마다 동일한 용량이 투여되는, 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 약제학적 조성물은 정맥내 경로에 의해 대상체에 투여되는, 방법.
제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량은 대상체의 체중 킬로그램 당 5 mg이고, 첫 2회 용량은 2주 간격으로 투여되고, 이어서 4주마다 동일한 용량이 투여되고, 하기 PK 매개변수 중 하나 이상 또는 전부를 충족하는, 방법:
a) 상기 약제학적 조성물의 투여 후, 1.5시간(h) 내지 2.5 h의 바람직한 중앙값, 바람직하게는 1.92 h의 바람직한 중앙값을 갖는 0.4 h 내지 10 h, 바람직하게는 0.55 h 내지 6.25 h 범위의 t_max;
b) 첫 용량 이후, 116 μg/mL ± 91.3 μg/mL의 범위; 또는 바람직하게는 50 μg/mL 내지 200 μg/mL, 바람직하게는 124 μg/mL ± 31.6 μg/mL의 정상 상태의 C_max;
c) 100 h 내지 300 h의 범위, 바람직하게는 150 h 내지 210 h의 범위, 예를 들어, 약 183 h(7.6 일)의 겉보기 t_1/2;
d) 바람직하게는 23.5%의 변동 계수(Coefficient of Variance)로 10000 μg × h/mL 내지 30000 μg × h/mL의 범위, 바람직하게는 15주에 20400 μg × h/mL의 AUC_{tau, ss};
e) 바람직하게는 체중이 70 kg인 SCD 환자에서, 10 mL/h 내지 30 mL/h, 바람직하게는 15 mL/h 내지 20 mL/h의 범위, 예를 들어, 약 17.2 mL/h의 15주 정상 상태에서의 평균 제거율;
f) 약 3.78 μg/mL 내지 9.8 μg/mL의 범위의 특히 7주 내지 27주에 정상 상태에서 4주마다 얻어진 PK 최저 농도.
제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 내 크리잔리주맙 및 이의 임의의 변이체는 PSGL-1과 P-셀렉틴의 결합의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 억제를 달성하는, 방법.