KR101704378B1 - 단백질 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 제제 - Google Patents

단백질 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리 활성을 나타내는 TNFα 결합 단백질의 안정화용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 염기성 아미노산 및 당 및/또는 암모늄염을 포함하는 단백질 안정화용 조성물, 이를 포함하는 약제학적 제제 및 TNFα 결합 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 염기성 아미노산 및 당 및/또는 암모늄염을 이용한 제형은 다양한 질병의 치료를 위하여 사용되는 TNFα 결합 단백질 예를 들어, 항 TNF-alpha 항체의 aggregation, denaturation, oxidation를 효과적으로 억제함으로써, 단백질의 장기간 보존ㅇ보관이 가능하도록 하므로, TNFα 결합 단백질 예를 들어, 항 TNF-alpha 항체를 이용한 의료 분야에 광범위하게 사용될 수 있으므로 유용하다.

Description

단백질 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 제제 {Composition for Stabilizing Protein and Pharmaceutical Formulation Comprising the Same}
본 발명은 생리 활성을 나타내는 TNFα 결합 단백질의 안정화용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 염기성 아미노산 및 당 및/또는 암모늄염을 포함하는 단백질 안정화용 조성물, 이를 포함하는 약제학적 제제 및 TNFα 결합 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α, 또는 TNF)는 에 관여하는 (acute-phase protein)의 구성원인 cytokine이다. TNF-α는 주로 활성화된 에 의해 분비되는데보조 T 세포, 자연살해세포, 그리고 뉴런 등의 다양한 세포에서도 분비된다.
TNF의 면역반응은 여러 가지 질병(rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel disease, psoriasis, hidradenitis suppurativa 및 refractory asthma)의 원인이 되기도 한다.
이와 같이 TNF에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위하여 종종 TNF 저해제를 사용하기도 한다.
TNF 저해제 단백질 의약품으로 monoclonal antibody 단백질인 infliximab(상품명: Remicade), adalimumab(상품명: Humira), certolizumab pegol(상품명: Cimzia)와 circulating receptor fusion protein인 etanercept (상품명; Enbrel) 항체가 존재한다.
항체 단백질 의약품은 재조합 기술, 세포배양 기술, 정제 기술의 발전에 따라 더욱 그 생산량이 증가하고 있다. 그러나 항체 단백질은 일반적인 단백질 의약품에 비해 분자량이 크고 그 구조가 복잡하여 물리적·화학적 불안정성으로 인해 적절한 제형이 필요하다.
물리적 불안정성에 의해 발생하는 대표적인 현상인 응집(aggregation)을 형성한다는 문제점이 있다. 사실상, 응집을 유발하는 요인은 항체 단백질의 정제, 제형화, 보관 과정에서 다양하게 존재한다. 예를 들면 아래의 요인들 중 한가지 이상의 요인들로 인하여 응집이 발생할 수 있다. 정제 시에는 최적의 조건이 아닌 pH, 염 종류, 염 농도, 온도, 공기와의 접촉, 교반 속도 등이 영향을 미치며, 제형 화 시에는 단백질의 농축 조건이 영향을 미칠 수 있다. 그리고 버퍼 교환 시에는 필터 통과, 교반 등이 영향을 미치며 저장 시에는 온도변화, pH 변화, 공기와의 접촉, 교반 등이 응집 현상에 영향을 미칠 수 있다. 그 외에 단백질을 포함한 제형이 빛에 노출되는 경우에도 응집이 발생할 수 있다. 빛에 노출되면 광 반응성 물질이 생성되어 다른 기와 결합하여 변형체가 발생하기 때문이다. 또한, 포장용기도 응집을 발생하게 하는 원인이 될 수 있다. 포장재에서 미량의 금속이온이 제형으로 누출되어 아미드 결합의 가수분해를 촉진할 수 있기 때문이다(Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 348-351, Hamada, H.et al.).
이와 같이, 응집현상은 온도, pH, 버퍼 종류, 농도, ionic strength, 부형제의 종류, 단백질의 농도, 환원성 물질의 유무, 불순물의 존재, 용기의 상태와 같은 환경적 요인이나 정제 방법 등, 여러 가지 요인에 의해 발생할 수 있다. 그러나 항체 단백질에서 나타나는 응집 현상의 가장 주된 원인은 구조 변화로 인하여 항체 단백질의 소수성 부위가 노출되는 경우 수용성이 떨어짐으로써 발생한다. 즉, 단백질 분자의 소수성 부위가 모여서 거대한 응집이 형성되는 것으로, 형성된 응집은 항체 단백질 사이에서 분자와 분자들 간에 공유 결합이 발생하여 비가역적인 형태로 진행되기도 한다 (Current Pharmaceutical Biotechnology 10(2009), 348-351, Hamada, H.et al.).
상기와 같은 이유로 응집된 항체 단백질은 대체로 활성이 감소되거나 시간이 지남에 따라 활성을 잃어버린다. 또한 이들 단백질은 응집되는 경우 인체에 투여하게 될 경우 응집되지 않은 상태에서는 나타내지 않던 항원성을 갖게 되어 항체(anti-drug antibody, ADA)의 생성을 유발시킬 수 있다. 따라서 이와 같은 단백질의 응집을 감소시키는 방법 및 감소된 응집 수준을 갖는 단백질의 안정화된 제형의 개발이 필요하다 (Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing Biotechnology: Pharmaceutical Aspects Volume XI, 2010, pp 271-291).
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 염기성 아미노산, 당 및/또는 암모늄염이 TNFα 결합 단백질의 응집을 억제하고, 장기간 보존ㅇ보관이 용이하도록 그 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생리활성을 가지는 TNFα 결합 항체의 응집(aggregation), 변성(denaturation) 및 산화(oxidation)를 억제할 수 있는 조성물 또는 TNFα 결합 항체의 응집(aggregation), 변성(denaturation) 및 산화(oxidation)를 억제시키기 위한 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질의 응집, 변성 및 산화를 억제하여 단백질을 안정화시키기 위한 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 또한, 단백질에 염기성 아미노산; 및 당 및/또는 암모늄염을 가하여 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질의 응집, 변성 및 산화를 억제하여 단백질을 안정화시키기 위한 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 또한, 단백질에 염기성 아미노산; 및 당 및/또는 암모늄염을 가하여 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 염기성 아미노산; 및 당 및/또는 암모늄염을 함유하는 조성물은 TNFα 결합 항체 단백질의 응집(aggregation), 변성(denaturation) 및 산화(oxidation)를 효과적으로 억제하므로, 단백질의 장기간 보존·보관을 가능하게 하며, 생체 내에서도 오랜 기간 활성을 유지할 수 있도록 안정화하므로, 항 TNF-alpha antibody을 이용한 의료 분야에 광범위하게 사용될 수 있다. 또한, 계면활성제 (surfactant)를 사용하지 않거나, 극미량을 사용하는 경우에도 단백질을 안정화할 수 있다.
도 1: 도 1의 그래프는 pH별 aggregate 함량(%) 변화를 11일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 2: 도 2의 그래프는 pH별 monomer 함량(%) 변화를 11일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 3: 도 3의 그래프는 pH별 fragment 함량(%) 변화를 11일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 4: 도 4의 그래프는 pH별 charge 변화에 따른 acidic variant 함량(%) 변화를 11일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 5: 도 5의 그래프는 pH별 charge 변화에 따른 K0 variant 함량(%) 변화를 11일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 6: 도 6의 그래프는 stabilizer 종류별 Aggregate 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 7: 도 7의 그래프는 stabilizer 종류별 monomer 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 8: 도 8의 그래프는 stabilizer 종류별 fragment 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 9: 도 9의 그래프는 stabilizer 종류별 charge 변화에 따른 acidic variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 10: 도 10의 그래프는 stabilizer 종류별 charge 변화에 따른 K0 variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 11: 도 11의 그래프는 알지닌 농도와 당 종류별 aggregate 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 12: 도 12의 그래프는 알지닌 농도와 당 종류별 monomer 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 13: 도 13의 그래프는 알지닌 농도와 당 종류별 fragment 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 14: 도 14의 그래프는 알지닌 농도와 당 종류별 charge 변화에 따른 acidic variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 15: 도 15의 그래프는 알지닌 농도와 당 종류별 charge 변화에 따른 K0 variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 16: 도 11의 그래프는 알지닌 농도와 등장화제별 aggregate 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 17: 도 17의 그래프는 알지닌 농도와 등장화제별 monomer 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 18: 도 18의 그래프는 알지닌 농도와 등장화제별 fragment 함량(%) 변화를 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 19: 도 19의 그래프는 알지닌 농도와 등장화제별 charge 변화에 따른 acidic variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다.
도 20: 도 20의 그래프는 알지닌 농도와 등장화제별 charge 변화에 따른 K0 variants 함량(%)을 14일간 50℃에서 측정한 결과이다
도 21: 도 21의 그래프는 pH 조절하는 산의 종류에 따른 SE-HPLC 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 22: 도 22의 그래프는 pH 조절하는 산의 종류에 따른 IE-HPLC 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 23: 도 23의 그래프는 등장화제 조합에 따른 SE-HPLC 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 24: 도 24의 그래프는 등장화제 조합에 따른 IE-HPLC 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 25: 도 25의 그래프는 자사 제형과 Humiraㄾ 제형의 aggregate 함량(%) 변화를 12주간 30℃에서 측정한 결과이다.
도 26: 도 26의 그래프는 자사 제형과 Humiraㄾ 제형의 monomer 함량(%) 변화를 12주간 30℃에서 측정한 결과이다.
도 27: 도 27의 그래프는 정제된 adalimumab을 양이온 교환수지(WCX: weak cation-exchange)를 이용하여 고압 액체 크로마토크래피(HPLC)로 분석한 결과이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명 법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 TNFα 결합 단백질; 염기성 아미노산; 및 당 및/또는 암모늄염을 포함하는 단백질 안정화용 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, TNFα 결합 단백질은 TNF-α의 생물학적 기능을 조절하는 생리활성을 가지는데, 예를 들어 TNF-α의 활성을 중화시키거나, TNF-α가 이의 수용체와 결합하는 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 측면에서 상기 TNFα 결합 단백질은 예를 들어 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 또는 TNFα 수용체 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 결합 정도는 특별히 제한되지 않으나, TNFα 결합 단백질은 예를 들어, 약 10-7~10-13 M 의 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 조성물에 포함되는 TNFα 결합 단백질의 농도는 약리학적 효과를 나타내는 정도로, 예를 들어 5 내지 100 mg/ml의 농도, 바람직하게 25 내지 75 mg/ml의 농도, 더욱 바람직하게 45 내지 55 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 염기성 아미노산은 알지닌, 히스티딘 및 라이신으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 염기성 아미노산의 농도는 예를 들어, 5 내지 500 mM의 농도, 바람직하게 50 내지 500mM, 더욱 바람직하게 50 내지 150mM로 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 50 내지 200mM 농도의 염기성 아미노산을 사용하였으며, 해당 범위에서 목적하는 단백질의 응집 억제 효과가 존재함을 확인하였다.
본 발명에 따른 단백질 안정화용 조성물에는 단백질의 응집, 변성 및 산화을 더욱 감소시키기 위하여 당 및/또는 암모늄염을 추가로 포함한다.
하나의 실시예에서, 상기 당은 만니톨, 수크로오스, 말토스 및 트레할로스로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 이 때, 상기 당의 농도는 0.5 내지 10% (w/v), 바람직하게 0.5 내지 5 % (w/v), 더욱 바람직하게 1 내지 2.5% (w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 해당 범위에서 목적하는 단백질의 응집 억제 효과 및 산성변이체 감소, K0 및/또는 K1 감소 억제 효과가 존재함을 확인하였다.
또 다른 실시예에서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 이 때, 상기 암모늄염의 농도는 5 내지 500mM, 바람직하게 30 내지 150 mM, 더욱 바람직하게 40 내지 80 mM일 수 있다. 해당 범위에서 목적하는 단백질의 응집 억제 효과 및 산성변이체 감소, K0 및/또는 K1 감소 억제 효과가 존재함을 확인하였다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 당과 암모늄염을 모두 포함할 수 있다. 당과 암모늄염을 모두 포함하는 경우, 당의 농도는 0.5 내지 5 % (w/v), 바람직하게 1 내지 2% (w/v), 더욱 바람직하게 1 내지 2.5% (w/v)로 포함되고, 암모늄염의 농도는 30 내지 150 mM, 바람직하게 40 내지 80 mM, 더욱 바람직하게 40 내지 60mM로 포함될 수 있다. 해당 범위에서 목적하는 단백질의 응집 억제 효과 및 산성변이체 감소, K0 및/또는 K1 감소 억제 효과가 존재함을 확인하였다.
이를 바탕으로, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 100 mg/ml의 TNFα 결합 단백질; 5 내지 200 mM의 염기성 아미노산; 및 1 내지 100%의 당을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 100 mg/ml의 TNFα 결합 단백질; 5 내지 200mM의 염기성 아미노산; 및 5 내지 200mM의 암모늄염을 포함할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 5 내지 100 mg/ml의 TNFα 결합 단백질; 5 내지 200mM의 염기성 아미노산; 1 내지 2%의 당 및 40 내지 80 mM의 암모늄염을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서 본 발명에서 사용하는 "안정화"는 다음 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 해당하는 것을 의미할 수 있다:
(a) TNFα 결합 단백질의 변성, 탈아미드화 (deamidation) 또는 산화 억제;
(b) C-말단 라이신의 K0 변이체 (단일클론항체의 라이신 변이체 정량 MS 피크들 중 가장 주요 피크로 표시됨) 감소 억제;
(c) 산성변이체 (acidic variant)의 생성 억제;
(d) TNFα 결합 단백질 모노머의 감소율 억제; 및
(e) TNFα 결합 단백질 응집 또는 단편의 생성 증가 억제.
정제된 adalimumab은 양이온 교환수지를 이용한 HPLC 분석 결과, 메인 픽 뒤쪽으로 2개의 peak가 나타난다. C-터미널에 lysine이 2개가 절단된 구조가 K0, C-터미널에 lysine이 1개가 절단된 구조가 K1, Antibody의 C 터미널 말단에 2개의 lysine가 결합된 구조는 K2 및 양이온 교환수지 메인 peak 앞에 나타나는 modified adalimumab peaks은 acidic variants를 나타낸다 (도 27).
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 유용한 보조제로서 기능하며, 생리학적으로 허용가능한 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상뿐만 아니라 이들의 배합물도 포함된다. 많은 경우에 있어서, 조성물에 당, 폴리알코올(예, 만니톨, 솔비톨) 또는 염화나트륨과 같은 등장화제가 함유될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 이의 항체 부분의 수명 또는 효능을 증가시켜 주는 습윤제, 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 제제는 TNF-α 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 억제제, 키나제 억제제, 동시-투여 분자 차단제, 흡착 분자 차단제, 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지, 검출가능한 리포터, TNF-α 길항제, 항류머티즘제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병제, 각성제, 천식 의약, 베타 효능제, 스테로이드 흡입제, 스테로이드 경구제, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인 및 사이토카인 길항제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물 또는 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 질병 치료방법을 제공한다. 상기 투여는 예를 들어 근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐 또는 피하로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 주사 가능한 용액으로 제조될 수 있다. 주사 가능한 용액은 플린트 또는 앰버 바이알, 앰플 또는 사전-충진 주사기에 액체 또는 동결건조 용량 형태로 포함될 수 있다. 적합한 조성물의 pH는 pH 5.7 내지 6.3일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 TNFα 결합 단백질을 포함하는 용액에 염기성 아미노산; 및 당 및/또는 암모늄염을 가하여 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 시중에서 구입할 수 있는 관절염 치료제인 Humiraㄾ에서 사용된 항 TNF-alpha antibody와 동일한 아미노산 서열을 가진 항체 단백질을 CHO 세포에서 발현시킨 후, 이를 고순도로 정제하여 수득한 것을 사용하였다. 본 발명에 따른 염기성 아미노산, 당이 항 TNF-alpha antibody의 aggregation, denaturation & oxidation을 억제하여 그 제형을 안정화시키는데 효과적인지 실험을 수행하였다.
그러나, 본 발명은 이에 제한되지 않으며 치료용으로 사용 가능한 생리 활성 단백질과 항 TNF-alpha antibody의 종류에 따라 다양한 질병의 치료를 위한 조성물을 안정화하기 위하여 본 발명에 따른 조성물이 사용될 수 있으며, 따라서 다양한 질병의 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:
본 실험은, 항체 단백질 (Adalimumab)의 가장 안정적인 pH를 확인하기 위하여 pH별 안정성을 확인하기 위한 실험이다. 표 1에 예시한 바와 같이 citrate-phosphate buffer를 바탕으로 각 pH 별로 제조된 sample을 50℃에 보관하며 시간이 지남에 따른 aggregation, monomer, fragment 함량을 SE (Size Exclusion)-HPLC로 분석하여 확인하였다. 분석은 TSKgel G3000SWXL(300 x 7.8mm) HPLC분석 column 을 이용하여 0.2M potassium phosphate, 0.25M potassium chloride, pH6.2 buffer를 0.5ml/min로 흘려 주었다. 11일간 50℃에서 관찰한 결과 도 2에서와 같이 pH 5.7와 pH 6.3에서 monomer 감소율이 가장 낮은 것으로 나타났다. 그리고 도 1, 3에서와 같이 aggregate, fragment의 증가율도 pH 5.7와 pH 6.3이 낮은 것으로 보아 단백질에 가장 안정적인 pH로는 pH 5.7와 pH 6.3으로 관찰되었다.
또한 antibody는 denaturation, deamidation, oxidation 등에 의해 charge가 변화된다. K0, K1, K2 variant peak들이 denaturation, deamidation, oxidation 등의 변성에 의해 acidic variant peak으로 이동 하는 것으로 생각된다. 이를 분석 하기 위하여 ProPac WCX-10(250 x 4mm) HPLC 분석 Column을 이용하여 50mM sodium phosphate(pH 7.5)를 base로 sodium chloride 농도 구배로 흘려 분석 하였다. 11일간 50℃에서 관찰한 결과 도 5에서와 같이 pH 5.7와 pH 6.3에서 가장 K0 variant의 감소율이 적었다. 그리고 도 4에서와 같이 pH 5.7와 pH 6.3에서 acidic variant의 생성이 억제되었다.
[표 1] citrate-phosphate buffer를 바탕으로 각 pH 별로 제조된 sample
Figure 112015100276118-pat00001

실시예 2:
본 실험은, 단백질의 가장 안정적인 stabilizer를 확인하기 위하여 stabilizer별 안정성을 확인하기 위한 실험이다. 표 2에 예시한 바와 같이 각 stabilizer별로 제조 된 sample을 50℃에 보관하며 시간이 지남에 따른 aggregate, monomer, fragment를 SE-HPLC로 분석하여 확인하였다. 분석은 TSK gel G3000SWXL(300 x 7.8mm) HPLC분석 column 을 이용하여 0.2M potassium phosphate, 0.25M potassium chloride, pH 6.2 buffer를 0.5ml/min로 흘려 주었다. 14일간 50℃에서 관찰한 결과 도 6, 7, 8에서와 같이 salt보다 염기성 아미노산이 보다 monomer 감소율이 적었으며 aggregate, fragment의 증가율도 낮았다.
또한, antibody는 denaturation, deamidation, oxidation 등에 의해 charge가 변화 된다. K0, K1, K2 variant peak들이 denaturation, deamidation, oxidation 등의 변성에 의해 acidic variant Peak으로 이동하는 것으로 생각 된다. 이를 분석하기 위하여 ProPac WCX-10(250 x 4mm) HPLC분석 column을 이용하여 10mM sodium phosphate(pH7.5)를 base로 sodium chloride 농도 구배로 흘려 분석하였다. 14일간 50℃에서 관찰한 도 10에서와 같이 알지닌, 라이신에서 가장 K0 variant의 감소율이 적었다. 도 9에서와 같이 알지닌, 라이신에서 acidic variant들의 생성이 억제되었다.
[표 2] stabilizer별로 제조된 sample
Figure 112015100276118-pat00002

실시예 3:
본 실험은 기존 제품화된 Humiraㄾ 제형과 알지닌, 및 당이 포함된 신규 제형을 비교하여 알지닌, 당이 포함된 제형이 기존 제품화된 Humiraㄾ 제형보다 안정하다는 것을 확인한 실험이다.
각 종류별 당과 알지닌 농도별로 제조된 표 3의 sample을 50℃에 보관하며 시간이 지남에 따른 aggregate, monomer, fragment를 SE-HPLC로 분석하여 확인하였다. 분석은 TSK gel G3000SWXL(300 x 7.8mm) HPLC 분석 column을 이용하여 0.2M potassium phosphate, 0.25M potassium chloride, pH6.2 buffer를 0.5ml/min로 흘려 주었다. 14일간 50℃에서 관찰한 결과에 따르면 도 11, 12, 13에서와 같이 알지닌만 포함된 제형 보다는 알지닌과 당이 함께 포함된 제형 및 Humiraㄾ 제형보다 monomer 감소율이 적었으며 aggregate, fragment의 증가율도 낮았다.
또한, antibody는 denaturation, deamidation, oxidation 등에 의해 charge가 변화된다. adalimumab은 K0, K1, K2 variant Peak들이 denaturation, deamidation, oxidation 등의 변성에 의해 acidic variant Peak으로 이동하는 것으로 생각된다. 이를 분석 하기 위하여 ProPac WCX-10(250 x 4mm) HPLC분석 Column 을 이용하여 50mM sodium phosphate(pH7.5)를 base로 sodium chloride 농도 구배로 흘려 분석 하였다. 14일간 50℃에서 관찰한 결과 도 15에서와 같이 알지닌과 당이 함께 포함된 제형이 알지닌만 포함된 제형 및 Humiraㄾ 제형보다 K0 variant의 감소율이 적었다. 또한, 도 14에서와 같이 알지닌과 당이 함께 포함된 제형이 알지닌만 포함된 제형 및 Humiraㄾ 제형보다 acidic variant들의 생성이 억제되었다.
[표 3] 각 종류별 당과 알지닌 농도별로 제조된 샘플
Figure 112015100276118-pat00003

실시예 4:
본 실험은, 기존 제품화된 Humiraㄾ 제형과 알지닌 및 여러 가지 등장화제가 포함된 신규 제형을 비교하여 표 4의 알지닌, 등장화제들이 포함된 제형이 기존 제품화된 Humiraㄾ 제형보다 안정하다는 것을 확인한 실험이다.
각 종류별 등장화제를 300 Osmol/Kg가 되게 첨가하며 sample을 제조하고 이 sample을 50℃에 보관하며 시간이 지남에 따른 aggregate, monomer, fragment를 SE-HPLC로 분석하여 확인하였다. 분석은 TSK gel G3000SWXL(300 x 7.8mm) HPLC분석 column을 이용하여 0.2M potassium phosphate, 0.25M potassium chloride, pH6.2 buffer를 0.5ml/min로 흘려 주었다. 14일간 50℃에서 관찰한 결과, 도 16, 17, 18 에서와 같이 알지닌만 포함된 제형 보다는 알지닌과 등장화제가 함께 포함된 제형 및 Humiraㄾ 제형 보다 monomer 감소율이 적었으며 aggregate, fragment의 증가율도 낮았다.
또한, antibody는 denaturation, deamidation, oxidation 등에 의해 charge가 변화된다. adalimumab은 K0, K1, K2 variant Peak들이 denaturation, deamidation, oxidation 등의 변성에 의해 acidic variant Peak으로 이동하는 것으로 생각 된다. 이를 분석하기 위하여 ProPac WCX-10(250 x 4mm) HPLC분석 Column 을 이용하여 10mM sodium phosphate(pH7.5)를 base로 sodium chloride 농도 구배로 흘려 분석 하였다. 14일간 50℃에서 관찰한 결과 도 20에서와 같이 알지닌과 등장화제인 황산암모늄이 함께 포함된 제형이 Humiraㄾ 제형 보다 K0 variant의 감소율이 동일하게 나왔다.
[표 4] 알지닌, 등장화제들이 포함된 제형
Figure 112015100276118-pat00004

실시예 5:
pH를 조절하는 산의 종류를 달리하여 제형을 제조하고, 실험을 진행하였다. 각각의 조성은 표 5에 나타내었다.
[표 5] pH 조절하는 acid 종류에 따른 제형
Figure 112015100276118-pat00005
도 21을 참조하면, SEC 결과에서는 pH 보정에 HCl만이 다른 산보다 aggregate 증가가 높게 나타났다. 그 이외의 조건은 유사하거나 비슷하게 나타났다. 3 번>4 번>5 번(Citric acid > Phosphoric acid > Succinic acid) 순으로 안정성이 좋은 것으로 보여졌다. 3 번(Citric acid) 조건에서 aggregate 억제에 가장 효과적으로 보여졌다. 그러나, 도 22에 나타낸 바와 같이, IE-HPLC K0감소율은 3 번째로 우수한 것으로 나타났다. 따라서, SEC, IE-HPLC 두 가지 분석 결과를 종합하면 Citric acid를 포함한 제형이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 판단하였다.
실시예 6:
만니톨과 황산암모늄을 조합하여 제형을 제조하고, 실험을 진행하였다. 또한, pH 보정을 위하여 Citrate buffer를 추가하였다. 각각의 조성은 표 6에 나타내었다.
[표 6] 등장화제 조합을 포함한 제형
Figure 112015100276118-pat00006
도 23을 참조하면, 샘플 간 SEC 결과에서 큰 차이는 없었으나, 도 24를 참조하면 6번 및 7번에서 산성변이체에 대한 좋은 안정성을 보였고, 7번에서 가장 우수한 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 결과적으로, 만니톨, 황산암모늄, Citric acid buffer에서 안정성이 우수한 것으로 판단하였다.
실시예 6:
본 실험은 앞의 실험을 통하여 자사에서 자체적으로 개발한 제형과 Humiraㄾ 제형을 장기 가속 실험을 통하여 서로 비교하여 자사가 개발한 제형이 기존 Humiraㄾ 제형 보다 뛰어나거나 또는 동등한 성능을 나타내는지를 비교 확인하기 위한 실험이다.
자사에서 개발한 제형 sample과 Humiraㄾ 제형 sample을 50℃에 보관하며 시간이 지남에 따른 aggregate, monomer, fragment를 SE-HPLC로 분석하여 확인하였다. 분석은 TSK gel G3000SWXL(300 x 7.8mm) HPLC분석 column을 이용하여 0.2M potassium phosphate, 0.25M potassium chloride, pH6.2 buffer를 0.5ml/min로 흘려 주었다. 12주간 30℃에서 관찰 결과한 도 25 및 도 26에서와 같이 자사 제형이 Humiraㄾ 제형보다 monomer 감소율이 적었으며 aggregate, fragment의 증가율도 낮았다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 아달리무맙 (adalimumab);
    알지닌;
    만니톨; 및
    황산암모늄을 포함하는, 아달리무맙 안정화용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    pH는 pH5.7 내지 6.3인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 알지닌의 농도는 5 내지 500mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 만니톨의 농도는 0.5 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 황산암모늄의 농도는 1 내지 200 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    5 내지 100 mg/ml의 아달리무맙;
    5 내지 500 mM의 알지닌;
    0.5 내지 10 %의 만니톨; 및
    5 내지 200mM의 황산암모늄을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 안정화는 다음 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 해당하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 아달리무맙 모노머의 감소율 억제;
    (b) 아달리무맙 응집 또는 단편의 생성 증가 억제;
    (c) 아달리무맙의 변성, 탈아미드화 (deamidation) 또는 산화 억제;
    (d) C-말단 라이신의 K0 변이체의 감소 억제 및
    (e) 산성변이체 (acidic variant)의 생성 억제.
  13. 제1항, 제6항 내지 제10항 및 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 제제.
  14. 아달리무맙을 포함하는 용액에 알지닌, 만니톨 및 황산암모늄을 추가하는 단계를 포함하는 아달리무맙을 안정화하는 방법.

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