TWI723050B - 雙特異性抗人類A‐β/人類運鐵蛋白受體抗體及使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體及其使用方法。

Description

雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體及使用方法

本發明係關於抗人類A-β及人類運鐵蛋白受體之雙特異性抗體、產生該等抗體之方法、含有此等抗體之醫藥組合物及其用途。

所有癡呆症案例中約70%歸因於阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)，該病與對於認知而言至關重要的大腦區域及神經迴路之選擇性損傷相關聯。阿茲海默氏病表徵為尤其在海馬錐體神經元及含有主要為密集核心之澱粉狀蛋白沈澱及無害空洞之大量澱粉狀蛋白斑塊中的神經原纖維纏結。

胞外神經炎斑塊含有大量被稱為「澱粉狀蛋白β」、「A-β」、「Aβ4」、「β-A4」或「Aβ」之占主導地位的纖維狀肽；參見Selkoe,Ann.Rev.Cell Biol.10(1994)373-403；Koo PNAS 96(1999)9989-9990；US 4,666,829；Glenner BBRC 12(1984)1131)。此澱粉狀蛋白衍生自「阿茲海默氏前驅蛋白/P澱粉狀蛋白前驅蛋白」(APP)。APP為完整膜糖蛋白(參見Sisodia PNAS 89(1992)6075)，並藉由質膜蛋白酶、α-分泌酵素在AP序列內內蛋白分解分裂(參見Sisodia(1992),Joe.編)。此外，其他分泌酵素活性(尤其β-分泌酵素及γ-分泌酵素活性)導致胞外釋放包含39種胺基 酸(Aβ39)、40種胺基酸(Aβ 40)、42種胺基酸(Aβ 42)或43種胺基酸(Aβ 43)之澱粉狀蛋白-β(Aβ)(參見Sinha PNAS 96(1999)11094-1053；Price,Science 282(1998)1078-1083；WO 00/72880或Hardy,TINS 20(1997)154)。

應注意到，A-β具有若干天然存在形式，其中人類形態被稱為上述之Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42及Aβ43。最顯著的形式(Aβ42)具有胺基酸序列(始於N端)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO：05)。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，分別丟失C端胺基酸A、IA及VIA。在Aβ43形態中，以上所描繪序列之C端處包含額外的蘇胺酸殘基。

展示成核Aβ40小纖維所需時間明顯長於成核Aβ42小纖維所需時間(參見，例如Lansbury,Jr.,P.T.及Harper,J.D.,Ann.Rev.Biochem.66(1997)385-407)。如Wagner(J.Clin.Invest.104(1999)1239-1332)綜述，更加頻繁地發現Aβ42與神經炎斑塊相關聯並認為其更多地為活體外原纖維形成。亦表明Aβ42在經定序之非結晶Aβ肽之成核依賴性聚合中充當「種子」(參見例如，Jarrett,Cell 93(1993)1055-1058)。不僅自阿茲海默氏病變而且自罹患其他神經性病症及/或神經退化性病症瞭解經改質APP處理及/或產生含有蛋白質沈積之胞外斑塊。此等病症尤其包含：唐氏症候群(Down's syndrome)、荷蘭型出現澱粉樣變性之遺傳性腦出血、帕金森氏病(Parkinson's disease)、ALS(肌肉萎縮性側索硬化)、克羅伊茨費爾特雅各布病(Creutzfeldt Jacob disease)、HIV相關性癡呆症及運動神經病。

時至今日，僅描述了針對澱粉狀蛋白相關性疾病之限制性醫療干預 方案。舉例而言，已論述如加蘭他敏(galantamine)、雷斯替明(rivastigmine)或多奈哌齊(donepezil)之膽鹼酯酶抑制劑，此係因為其僅有益於輕度至中度病症之阿茲海默氏病患者。然而，亦已報導由於此等藥物之膽鹼激導性作用之不良事件。雖然此等膽鹼激導性增強治療的確產生一些症狀性益處，但對於大部分接受治療之患者而言，治療反應並不令人滿意。據估計，在僅約5%接受治療之患者中出現顯著的認知性改良，且極少跡象表明治療顯著地改變此漸進性病症之病程。

因此，對更有效的治療(尤其是可遏制或延遲病症進程之彼等治療)仍具有極大臨床需要。最近亦採用了如美金剛(memantine)之NMDA受體拮抗劑。

然而，已報導由於藥理學活性之不良事件。此外，使用此等NMDA受體拮抗劑之此治療可僅被視為對症方法而非病症改變方法。

此外，已提出用於治療澱粉狀蛋白相關病症之免疫調節方法。WO 99/27944揭示包含若干份A-β肽及載劑分子之結合物，由此該載劑分子應增強免疫反應。在WO 00/72880中提及另一主動型免疫接種方法，其中亦採用A-β片段引起免疫反應。

此外，在WO 99/27944或WO 01/62801中已提出使用一般抗A-β抗體之被動型免疫接種方法，且在WO 02/46237、WO 02/088306及WO 02/088307中已描述針對部分A-β之特異性人類化抗體。WO 00/77178描述結合水解期間β-澱粉狀蛋白採用之轉移狀態的抗體。WO 03/070760揭示識別在A-β肽上的兩種非連續胺基酸序列的抗體分子。

WO 2014/033074係關於結合血腦屏障上之受體的血腦屏障穿梭體及其使用方法。Pardridge,W.(Exp.Opin.Drug Deliv.12(2015)207-222) 已報導血腦屏障藥物傳送具有運鐵蛋白受體單株抗體之IgG融合蛋白。Yu,Y.J.等人(Sci.Translat.Med.6(2014)261ra154-261ra154)報導，治療性雙特異性抗體穿過非人類靈長類之血腦屏障。Sumbria,R.K.等人(Mol.Pharm.10(2013)3507-3513)報導，每天皮下投與靶向運鐵蛋白受體及aβ澱粉狀蛋白肽之四價雙特異性抗體，阿茲海默氏病轉殖基因小鼠大腦內澱粉狀蛋白斑塊崩解。Niewoehner,J.等人(Neuron 81(2014)49-609)報導，使用單價分子穿梭體增強大腦穿透及治療性抗體之效能。

本文報導一種雙特異性抗體，其包含a)一種(全長)抗體，其包含兩個各自具有(全長)抗體輕鏈及(全長)抗體重鏈之對，其中由具有(全長)重鏈及(全長)輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至(全長)抗體之重鏈中之一者的C端，其中該額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中該等(全長)抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，且在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中該等(全長)抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，且在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)， 其中特異性結合至第二抗原的該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)可彼此替換，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

在一個實施例中，額外Fab片段藉由肽連接子融合至重鏈之C端。

在一個實施例中，Fab片段之重鏈可變域的N端融合至全長重鏈的C端或肽連接子的C端。

在一個實施例中a)融合至額外Fab片段之全長重鏈具有充當C端重鏈胺基酸殘基之三肽LSP，其中其脯胺酸經由肽鍵直接融合至額外Fab片段或肽連接子之第一胺基酸殘基，且b)未融合至額外Fab片段之全長重鏈具有充當C端重鏈胺基酸殘基之三肽LSP，或SPG，或PGK。

在一個實施例中，(全長)抗體為a)人類子類IgG1之全長抗體，b)人類子類IgG4之全長抗體，c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在各別另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，f)在兩條重鏈中均具有突變S228P、L235E及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在各別另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體， g)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、1253A、H310A及H435A且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在各別另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或h)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、M252Y、S254T及T256E且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在各別另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體。

在一個實施例中，(全長)抗體為a)人類子類IgG1之全長抗體，b)人類子類IgG4之全長抗體，c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG1之全長抗體，f)在兩條重鏈中均具有突變S228P、L235E及P329G且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG4之全長抗體，g)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、1253A、H310A及H435A且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C 且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG1之全長抗體，h)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、M252Y、S254T及T256E且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG1之全長抗體，i)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、H310A、H433A及Y436A且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG1之全長抗體。

在一個實施例中，額外Fab片段融合至包含突變T366W之重鏈的C端或融合至包含突變T366S、L368A及Y407V之重鏈的C端。

在一個實施例中全長抗體為在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在各別另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1，且額外Fab片段融合至包含突變T366W之重鏈的C端或包含突變T366S、L368A及Y407V之重鏈的C端。

在一個實施例中，雙特異性抗體包含i)胺基酸序列與SEQ ID NO：01的序列一致性為70%或更高的輕鏈，ii)胺基酸序列與SEQ ID NO：02的序列一致性為70%或更高的重鏈， iii)胺基酸序列與SEQ ID NO：03的序列一致性為70%或更高的輕鏈，及iv)胺基酸序列與SEQ ID NO：04的序列一致性為70%或更高的重鏈Fab片段，其中SEQ ID NO：01具有胺基酸序列：

SEQ ID NO：02具有胺基酸序列：

SEQ ID NO：03具有胺基酸序列：

，及SEQ ID NO：04具有胺基酸序列：

如本文所報導之一個態樣為雙特異性抗體，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：01之(全長)輕鏈、具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之(全長)重鏈、具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之(全長)輕鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：04之抗體Fab片段。

在一個實施例中，雙特異性抗體為單株抗體。

如本文所報導之一個態樣為一種如本文所報導之編碼雙特異性抗體的經分離核酸。

如本文所報導之一個態樣為一種包含編碼如本文所報導之雙特異性抗體之如本文所報導之核酸的宿主細胞。

如本文所報導之一個態樣為一種產生如本文所報導之雙特異性抗體的方法，其包含以下步驟：a)培養如本文所報導之宿主細胞以產生雙特異性抗體，及 b)自細胞或培養基回收雙特異性抗體，藉此產生如本文所報導之雙特異性抗體。

如本文所報導之一個態樣為一種包含如本文所報導之雙特異性抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。

如本文所報導之一個態樣為一種包含如本文所報導之雙特異性抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之抗體，其用作藥劑。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之雙特異性抗體，其用於治療阿茲海默氏病。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之雙特異性抗體，其用於抑制/減緩大腦內斑塊之形成。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之雙特異性抗體，其用於崩解β-澱粉狀蛋白斑塊。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之雙特異性抗體在製造藥劑中的用途。

在一個實施例中，藥劑用於治療澱粉狀蛋白病症。

在一個實施例中，藥劑用於預防及/或治療與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關聯之病症。在一個實施例中，該病症係選自由以下組成之群：癡呆症、阿茲海默氏病、運動神經病、唐氏綜合症、克羅伊茨費爾特雅各布病、荷蘭型出現澱粉樣變性之遺傳性腦出血、帕金森氏病(Parkinson's disease)、HIV相關性癡呆症、ALS或與衰老相關的神經元病症。在一個較佳實施例中，藥劑用於治療阿茲海默氏病。

在一個實施例中，藥劑用於抑制/減緩大腦內斑塊之形成。在一個實 施例中，藥劑為用於崩解β-澱粉狀蛋白斑塊之藥劑。

如本文所報導之一個態樣為一種治療患有與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關聯之病症的個體的方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之雙特異性抗體。

如本文所報導之一個態樣為一種治療患有阿茲海默氏病之個體的方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之雙特異性抗體。

如本文所報導之一個態樣為一種用於崩解個體大腦內β-澱粉狀蛋白斑塊之方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之雙特異性抗體來崩解大腦內β-澱粉狀蛋白斑塊。

如本文所報導之一個態樣為一種抑制/減緩個體大腦內斑塊之形成的方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之雙特異性抗體來抑制/減緩大腦內斑塊之形成。

在Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.：Immunotechnology，第2卷，第1期，1996年2月，第73-73頁中描述結進孔二聚化模組及其在抗體工程中之用途。在Merchant,A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中報導CH3域中之額外二硫橋鍵。

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991)中。

如本文所用，根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991)中所述的Kabat編號系統對重鏈及輕鏈之全部恆定區 及域的胺基酸位置進行編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」。具體而言，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991)之Kabat編號系統(參見第647-660頁)用於κ及λ同型之輕鏈恆定域CL，且Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)用於重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)，在此情況下，在本文中藉由參考“根據Kabat EU索引編號”來進一步澄清。

I.定義

「血腦屏障」或「BBB」係指在周邊循環與大腦及脊髓之間的生理學屏障，其藉由腦毛細血管內皮膜內之緊密結合形成，產生限制分子(甚至諸如脲(60道爾頓)之極其微小的分子)輸送至大腦中的緊密屏障。大腦內BBB、脊髓內血脊髓屏障及視網膜內血視網膜屏障為CNS內之連續型毛細管屏障，且在本文中統稱為血腦屏障或BBB。當該屏障包含室管膜細胞而非毛細管內皮細胞時，BBB亦涵蓋血CSF屏障(脈絡叢)。

術語「抗人類A-β抗體」及「特異性結合至人類A-β之抗體」係指能夠結合具有足夠親和力的人類A-β肽之抗體，以使得該抗體在靶向A-β肽中可用作診斷及/或治療劑。

應注意到，人類A-β具有若干天然存在的形態，其中人類形態被稱為Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42及Aβ43。最顯著的形態(Aβ42)具有胺基酸序列SEQ ID NO：05。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，分別丟失C端胺基酸A、IA及VIA。在Aβ43形態中，額外蘇胺酸殘基包含於SEQ ID NO：05之C端。在一個實施例中，人類A-β蛋白具有胺基酸序列SEQ ID NO：05。

由此，該術語亦涵蓋結合至人類A-β多肽之截短片段的抗體。

「中樞神經系統」或「CNS」係指控制身體功能的神經組織複合體，且包括大腦及脊髓。

「血腦屏障受體」(本文簡稱「BBBR」)為在大腦內皮細胞上表現之胞外膜聯受體蛋白，其能夠將分子傳輸通過BBB或用於傳輸外源性投與的分子。本文中BBBR之實例包括：運鐵蛋白受體(TfR)，胰島素受體，胰島素樣生長因子受體(IGF-R)，低密度脂蛋白受體，其包括(但不限於)低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)，及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。一個較佳BBBR為運鐵蛋白受體(TfR)。

「運鐵蛋白受體」(「TfR」)為跨膜醣蛋白(分子量為約180,000Da)，其包括在脊椎動物中涉及鐵攝入的兩個二硫化物鍵接之次單元(每一者之表觀分子量為約90,000Da)。舉例而言，在一個實施例中，如本文所提及之TfR為包含如Schneider等人(Nature 311(1984)675-678)中之胺基酸序列的人類TfR。在一個實施例中，人類運鐵蛋白受體具有胺基酸序列SEQ ID NO：22。

「多特異性抗體」表示對於在相同抗原或兩個不同抗原上之至少兩個不同抗原決定基而言具有結合特異性之抗體。例示性多特異性抗體可結合BBBR及大腦抗原兩者。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如，F(ab')2雙特異性抗體)或其組合(例如，全長抗體加額外scFv或Fab片段)。亦已報導具有兩個、三個或大於三個(例如，四個)官能性抗原結合位點之經改造之抗體(參見例如，US 2002/0004587 A1)。

出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含衍生自如下文所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變 域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「衍生自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或低於10個、9個或低於9個、8個或低於8個、7個或低於7個、6個或低於6個、5個或低於5個、4個或低於4個、3個或低於3個、或2個或低於2個。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。

「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(K_d)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之方法)量測親和力。

「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，具有此類變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到改良。

只要抗體呈現所希望抗原結合活性，本文中的術語「抗體」即以最廣泛的含義使用且涵蓋不同抗體結構，其包括但不限於單株抗體、多選殖抗體及多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。

術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」為藉由Fc受體結合調節之功能，且係指在效應細胞存在之情況下藉由如本文所報導之抗體溶解靶細胞。在一個實施例中，在效應細胞(諸如，新鮮分離的PBMC(周邊血液單核細胞)或來自白血球層之純化效應細胞(如單核細胞或NK(自然殺手)細 胞))存在的情況下，藉由用如本文所報導之抗體處理表現紅系細胞(例如表現重組人類CD19之K562細胞)之CD19製劑來量測ADCC。用⁵¹Cr標記靶細胞，並隨後與抗體一起培育。將標記細胞與效應細胞一起培育，且分解清液層以釋放⁵¹Cr。對照組包括靶向內皮細胞與效應細胞(但抗體除外)培育。藉由量測該等對於Fcγ受體表現細胞之結合，諸如重組地表現FcγRI及/或FcγRIIA或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA)之細胞，來研究最初步驟中引起調節ADCC之抗體容量。在一個較佳實施例中，測量與NK細胞上FcγR之結合。

「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合與完整抗體結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；雙功能抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種之抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中之幾者可進一步分成子類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。

如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿 德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾比星(daunorubicin)或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體；及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。

術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」係指在補體存在的情況下藉由如本文所報導之抗體誘導細胞之溶解。在一個實施例中，在補體存在的情況下，藉由用如本文所報導之抗體處理表現人類內皮細胞之CD19來量測CDC。在一個實施例中，用鈣黃綠素標記該等細胞。若抗體引起20%或更多之濃度為30μg/ml的靶細胞溶解，則發現CDC。可在ELISA中量測與補體因子C1q之結合。在此分析中，原則上，ELISA培養盤塗覆有一定濃度範圍之抗體，向該培養盤中添加純化之人類C1q或人類血清。藉由針對C1q之抗體，繼之藉由過氧化物酶標記之結合物偵測C1q結合。藉由405nm(OD405)之光密度來量測過氧化物酶基板ABTS®(2,2'-次偶氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(6)])之結合(最大結合Bmax)偵測。

「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其因抗體類別而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之向下調節；及B細胞活化。

可藉由抗體之Fc區與Fc受體(FcR)相互作用來調節Fc受體結合依賴性效應功能，該等Fc受體為造血細胞上特化細胞表面受體。Fc受體屬於免 疫球蛋白超家族，且已展示該等受體調節藉由免疫複合體之吞噬作用移除塗佈抗體的病原體，及經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)溶解紅血球及塗佈有相應抗體之各種其他細胞靶(例如腫瘤細胞)兩者((參見例如，Van de Winkel,J.G.及Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其針對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG抗體之Fc受體被稱為FcγR。Fc受體結合描述於(例如)Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248中。

針對IgG抗體之Fc區的受體(FcγR)之交聯觸發多種效應功能，其包括：吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性及釋放炎症介質，以及免疫複合體清除及調節抗體產生。在人體中，已表徵三種類別之FcγR，其為：

- FcγRI(CD64)結合具有高親和力之單體IgG，且在巨噬細胞、單核細胞、嗜中性白細胞及嗜酸性細胞上表現。對至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329(根據Kabat之EU索引編號)中之一者處的Fc區IgG的修飾減小與FcγRI結合。位置233至236處之IgG2殘基(經取代為IgG1及IgG4)減少與FcγRI結合10³倍，且消除人單核細胞對抗體致敏紅細胞之反應(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。

- FcγRII(CD32)將複合型IgG與介質結合以降低親和力，且得以廣泛地表現。此受體可分為兩種子型：FcγRIIA及FcγRIIB。在許多涉及殺滅之細胞(例如，巨噬細胞、單核細胞、嗜中性白細胞)上發現FcγRIIA，且其似乎能夠激活殺滅程序。FcγRIIB似乎在抑制程序中起一定作用，且 在B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜酸性細胞上發現FcγRIIB。在B細胞上，其似乎起到遏制進一步產生免疫球蛋白及同型轉換至(例如)IgE類別之功能。在巨噬細胞上，FcγRIIB起著抑制如經由FcγRIIA調節之吞噬作用的作用。在嗜酸性細胞及肥大細胞上，B形式可有助於經由結合至其獨立受體之IgE遏制此等細胞之活化。(例如)針對包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414(根據Kabat之EU索引編號)中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體，發現與FcγRIIA的結合減小。

- FcγRIII(CD16)將IgG與介質結合以降低親和力，並以兩種類型存在。在NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞及一些單核細胞及T細胞上發現FcγRIIIA，且FcγRIIIA調節ADCC。FcγRIIIB在嗜中性白細胞上高度表現。(例如)針對包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376(根據Kabat之EU索引編號)中之一者處具有突變之IgGFc區的抗體，發現與FcγRIIIA的結合減小。

在人類IgG1上對Fc受體之結合位點、上述突變位點的映射及用於量測結合FcγRI及FcγRIIA之方法描述於Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中。

藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所需治療或防治結果之量。

如本文所用，術語「Fc受體」係指表徵為存在與該受體相關聯的細胞質ITAM序列之活化受體(參見例如，Ravetch,J.V.及Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。此等受體為FcγRI、FcγRIIA及 FcγRIIIA。術語「無FcγR結合」表示抗體濃度為10μg/ml下，如本文所報導之抗體與NK細胞之結合為發現的如WO 2006/029879報導之抗OX40L抗體LC.001之結合的10%或更低。

儘管IgG4展示減小的FcR結合，但其他IgG子類之抗體展示強烈結合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丟失Fc碳水化合物)、Pro329及234、235、236及237Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435為殘基，其提供(若改變亦提供)減小FcR結合(Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；及EP 0 307 434)。在一個實施例中，如本文所報導之抗體屬於IgG1或IgG2子類且包含突變PVA236、GLPSS331及/或L234A/L235A。在一個實施例中，如本文所報導之抗體屬於IgG4子類且包含突變L235E。在一個實施例中，抗體進一步包含突變S228P。

本文中的術語「Fc區」用以定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所描述。

如本文所報導之抗體包含如Fc區，在一個實施例中為衍生自人源的Fc區。在一個實施例中，Fc區包含人類恆定區之所有部分。抗體之Fc區 直接涉及補體活化、C1q結合、C3活化及Fc受體結合。雖然補體系統上之抗體之影響取決於特定條件，但與C1q之結合係由Fc區中之界定結合位點造成。此等結合位點在目前技術水平下為已知的，且藉由(例如)Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.及Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；及EP 0 307 434進行描述。此等結合位點為(例如)L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat之EU索引編號；本文除非另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所描述)。子類IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常展示補體活化、C1q結合及C3活化，而IgG4不活化補體系統、不結合C1q且不活化C3。「抗體之Fc區」為熟習此項技術者熟知且基於抗體之木瓜蛋白酶裂解定義之術語。在一個實施例中，Fc區為人類Fc區。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變S228P及/或L235E(根據Kabat之EU索引編號)之人類IgG4子類。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變L234A及L235A(根據Kabat之EU索引編號)之人類IgG1子類。

「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及 FR序列一般出現VH(或VL)中的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用以指代結構基本上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。「全長抗體」為包含輕鏈及重鏈抗原結合可變區(VL、VH)以及輕鏈恆定域(CL)及重鏈恆定域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。更詳細而言，全長抗體包含兩條抗體輕鏈(分別包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域)及兩條抗體重鏈(分別包含重鏈可變域、鉸鏈區及重鏈恆定域CH1、CH2及CH3)。C端胺基酸殘基K或GK可存在於或並非彼此獨立地存在於全長抗體之兩條抗體重鏈中。此外，全長抗體可包含胺基酸添加物、突變及域內缺失(但並非整個域的缺失)。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之子代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親代細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉化細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。

「人類共同構架」為表示所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，該 亞群為如Kabat等人上文中之亞群κ I。在一個實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群III。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有HVR(例如CDR)均對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有FR均對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。

如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指包含胺基酸殘基延伸的抗體可變域的每一區，其在序列上為高變的(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上定義之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH(H1、H2、H3)中，且三個在VL(L1、L2、L3)中。

HVR包括(a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia,C.及Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)； (c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。

除非另外指明，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)進行編號。

「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。

「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual/subject)為人類。

「分離」之抗體為已與其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。評估抗體純度之方法的綜述參見例如Flatman,S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

「分離」之核酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。

「編碼抗人類α-β/人類運鐵蛋白受體抗體之分離核酸」係指編碼抗體 重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或單獨載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此類核酸分子。

如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即，除可能變異體抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異體抗體，此等變異體一般以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質的抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法、此類方法及其他製備單株抗體之例示性方法在本文中描述。

「裸抗體」係指未與異質部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。

「天然抗體」係指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱可變重域或重鏈可變域，接著為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，其中鉸鏈區位於第一恆定域與第二恆定域之間。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著為恆定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型(稱為κ及λ)中之一者。

術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。

相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中之與參考多肽序列胺基酸殘基一致的胺基酸殘基百分比，且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可獲得之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定比對序列之適當的參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且原始碼已隨使用者文檔一起提交於美國版權局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559，其在美國版權局以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自原始程式碼編寫。ALIGN-2程式經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者，其可表述為與給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A)如下計算：100乘以分率X/Y

其中X為利用序列比對程式ALIGN-2對A與B進行程式比對時評為一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性%值均使用ALIGN-2電腦程式如剛剛前一段落中所述獲得。

術語「醫藥調配物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含對將投與調配物之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。

「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat/treating)」)係指臨床介入以試圖改變所治療個體之自然病程，且可出於預防目的或在臨床病理學病程期間進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、降低疾病演進速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，如本文所報導之抗體用於延遲疾病發斬或減緩疾病演進。

術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合於抗原的抗體重鏈或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變域通常具有類似結構，其中各域皆包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如，Kindt,T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co., N.Y.(2007)，第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH域或VL域，分別篩選互補VL域或VH域之集合庫來分離。參見例如，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628。

如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖其所連接之另一個核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體及併入已引入宿主細胞中之基因組的載體。某些載體能夠導引與其以操作方式連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱作「表現載體」。

II.組合物及方法

在一個態樣中，本發明部分地基於發現如本文所報導之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體具有已改良之特性。在某些實施例中，提供雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。如本文所報導之抗體適用於(例如)診斷或治療阿茲海默氏病。

A.例示性雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體

在一個態樣中，本發明提供結合至人類A-β及人類運鐵蛋白受體之經分離雙特異性抗體。抗體為由全長核心抗體及融合Fab片段組成的雙特異性抗體，其中某些域為橫向交換的。由此，所得雙特異性抗體為不對稱的。因此，使用稱作結進孔的異二聚體化技術，使用具有所謂結突變之第一重鏈(HCknob)及具有所謂孔突變之第二重鏈(HChole)，生成雙特異性抗體。

亦為本發明之一態樣的抗體0012由胺基酸序列為SEQ ID NO：06至09之四種多肽構成。

抗體0012為雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)，其中特異性結合至第二抗原之額外Fab片段包含域交叉，使得輕鏈可變域(VL)與重鏈可變域(VH)彼此替換，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

亦為本發明之一態樣的抗體0015由胺基酸序列為SEQ ID NO：01至03及SEQ ID NO：10之四種多肽構成。

抗體0015為雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及 b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)，其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

亦為本發明之一態樣的抗體0020由胺基酸序列為SEQ ID NO：11至13之三種多肽構成。

抗體0020為雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124 處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)，其中特異性結合至第二抗原之額外Fab片段為單鏈Fab片段，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

亦為本發明之一態樣的抗體0024由胺基酸序列為SEQ ID NO：14至17之四種多肽構成。

抗體0024為雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

不同表現質粒上各別多肽之不同分配/組合及所得質粒之不同比率已用於雙特異性抗體之重組產生。結果顯示於下表。

已小規模生成雙特異性抗體，且已在第一純化步驟後用蛋白A親和性層析法並在第二純化步驟後用製備型尺寸排阻層析法分析副產品分佈。結果顯示於下表。

抗A-β結合位點包含額外糖基化位點。因此，已測定糖基化。結果顯示於下表。

在ProtA純化後的3公升醱酵物中之非糖基化Fab之百分比

在ProtA+SEC純化後的31醱酵物中之非糖基化Fab之百分比

已藉由在特定pH值下於緩衝液中培育14天來測試雙特異性抗體之穩定性。結果顯示於下表。

經測定，抗體0015及0024之聚集溫度為大約53℃至55℃，抗體0012之聚集溫度為大約54℃至56℃。

如藉由BIAcore所測定之結合人類運鐵蛋白受體之解離速率(k_d以[1/Ms]計)與抗體0015及0024以及親代抗人類運鐵蛋白受體抗體相當；在25℃、37℃及40℃下分別為：1.86E-02至1.97E-02、1.98E-2至2.03E-2及1.44E-02。

在U937細胞分析中，所有抗體之A-β特異效應功能與親代單特異性抗A-β抗體相當。資料顯示於下表。

雙特異性抗體中無一者顯示活體外嗜中性白血球活化。

整個抗體0015顯示合適的特性，並因此為本發明之較佳態樣。此外，此抗體具有經改良特性，其與其他存在於經改良副產物曲線中。

在本文之一個態樣中提供一種雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)，其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，且其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體。

如本文所報導之另一態樣為一種雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原， 其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)，其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體，其中人類A-β結合位點包含與胺基酸序列SEQ ID NO：18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列，及與胺基酸序列SEQ ID NO：19具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列，且其中人類運鐵蛋白受體結合位點包含與胺基酸序列SEQ ID NO：20具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列，及與胺基酸序列SEQ ID NO：21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。

在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列含有關於參考序列之取代(例 如，保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之結合位點仍保持與其抗原結合的能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：18或20中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。

在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列含有關於參考序列之取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之結合位點仍保持與其抗原結合的能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：19或21中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。

在一個實施例中，人類A-β結合位點包含如SEQ ID NO：18之VH序列(包括該序列之轉譯後修飾)，及如SEQ ID NO：19之VL序列(包括該序列之轉譯後修飾)。

在一個實施例中，人類運鐵蛋白受體結合位點包含如SEQ ID NO：20之VH序列(包括該序列之轉譯後修飾)，及如SEQ ID NO：21之VL序列(包括該序列之轉譯後修飾)。

在一個實施例中，雙特異性抗體包含i)輕鏈，其與SEQ ID NO：01具有70%至100%，至少70%、至少80%、至少90%或95%或更高之序列一致性，ii)重鏈，其與SEQ ID NO：02具有70%至100%，至少70%、至少80%、至少90%或95%或更高之序列一致性，iii)輕鏈，其與SEQ ID NO：03具有70%至100%，至少70%、至少80%、至少90%或95%或更高之序列一致性，及 iv)重鏈Fab片段，其與SEQ ID NO：04具有70%至100%，至少70%、至少80%、至少90%或95%或更高之序列一致性，其中SEQ ID NO：01具有胺基酸序列：

SEQ ID NO：02具有胺基酸序列：

SEQ ID NO：03具有胺基酸序列：

，及SEQ ID NO：04具有胺基酸序列：

如本文所報導之另一態樣為一種雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者特所形成之結合位點異性結合至第一抗原，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)， 其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體，其中人類A-β結合位點包含胺基酸序列為SEQ ID NO：18之重鏈可變域(VH)及胺基酸序列為SEQ ID NO：19之輕鏈可變域(VL)，且其中人類運鐵蛋白受體結合位點包含胺基酸序列為SEQ ID NO：20之重鏈可變域(VH)及胺基酸序列為SEQ ID NO：21之輕鏈可變域(VL)。

如本文所報導之另一態樣為一種雙特異性抗體，其包含a)一種全長抗體，其包含兩個各自具有全長抗體輕鏈及全長抗體重鏈之對，其中藉由具有全長重鏈及全長輕鏈的對中之每一者所形成之結合位點特異性結合至第一抗原，其中該全長抗體包含由兩條全長重鏈之Fc區多肽(分別包含CH1、CH2及CH3域)形成的Fc區，及b)一個額外Fab片段，其中該額外Fab片段融合至全長抗體之一個重鏈的C端，其中額外Fab片段之結合位點特異性結合至第二抗原，其中全長抗體輕鏈中之每一者在輕鏈恆定域(CL)中在位置123處包含胺基酸殘基精胺酸(而非野生型麩胺酸殘基；E123R突變)，並在位置124處包含胺基酸殘基離胺酸(而非野生型麩醯胺酸殘基；Q124K突變)(根據Kabat編號)，其中全長抗體重鏈中之每一者在第一重鏈恆定域(CH1)中在位置147處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸殘基；K147E突變)，並在位置213處包含麩胺酸殘基(而非野生型離胺酸胺基酸殘基；K213E突變)(根據Kabat EU索引編號)， 其中特異性結合至第二抗原之該額外Fab片段包含域交叉，使得該輕鏈恆定域(CL)與該重鏈恆定域1(CH1)彼此替換，其中第一抗原為人類A-β蛋白且第二抗原為人類運鐵蛋白受體，其中人類A-β結合位點包含胺基酸序列為SEQ ID NO：18之重鏈可變域(VH)，及胺基酸序列為SEQ ID NO：19之輕鏈可變域(VL)，其中人類運鐵蛋白受體結合位點包含胺基酸序列為SEQ ID NO：20之重鏈可變域(VH)，及胺基酸序列為SEQ ID NO：21之輕鏈可變域(VL)，且其中Fc區多肽為a)人類子類IgG1，b)人類子類IgG4，c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4，e)在兩個Fc區多肽中具有突變L234A、L235A及P329G，且在一個Fc區多肽中具有突變T366W及S354C，且在各別另一Fc區多肽中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1，f)在兩個Fc區多肽中具有突變S228P及P329G，且在一個Fc區多肽中具有突變T366W及S354C，且在各別另一Fc區多肽中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4，g)在兩個Fc區多肽中具有突變L234A、L235A、P329G、I253A、H310A及H435A，且在一個Fc區多肽具有突變T366W及S354C，且在各別另一Fc區多肽中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1， h)在兩個Fc區多肽中具有突變L234A、L235A、P329G、M252Y、S254T及T256E，且在一個Fc區多肽中具有突變T366W及S354C，且在各別另一Fc區多肽中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1，或i)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A、P329G、H310A、H433A及Y436A且在一條重鏈中具有突變i)T366W及ii)S354C或Y349C且在各別另一重鏈中具有突變i)T366S、L368A及Y407V及ii)Y349C或S354C之人類子類IgG1之全長抗體。

在另一態樣中，根據以上實施例中之任一者之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體可(單獨或組合地)併入有如描述於以下章節1至3中之任何特徵：

1.嵌合及人類化抗體

在某些實施例中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如US 4,816,567；及Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。典型地，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR(或其部分))衍生自非人類抗體，且FR(或其部分)衍生自人類抗體序 列。人類化抗體視情況將亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所衍生自之抗體)之相應殘基取代，以(例如)恢復或提高抗體特異性或親和力。

人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且進一步描述於例如Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321及US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述特異性測定區(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述「表面再塑」)；Dall'Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述「FR改組」)；及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68及Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。

可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims,M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體共同序列的構架區(參見例如Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Presta,L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；及衍生自篩選FR集合庫之構架區(參見例如Baca,M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684及Rosok,M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618))。

2.人類抗體

在某些實施例中，本文所提供之抗體為人類抗體。可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。

人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。亦參見例如描述XENOMOUSE^TM技術之US 6,075,181及US 6,150,584；描述HUMAB®技術之US 5,770,429；描述K-M MOUSE®技術之US 7,041,870及描述VELOCIMOUSE®技術之US 2007/0061900。由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可進一步加以修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合。

人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株。(參見，例如Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。額外方法包括描述於例如US 7,189,826(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni, J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述人類-人類融合瘤)中之彼等。人類融合瘤技術(三源雜交瘤技術)亦描述於Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937及Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中。

人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生噬菌體呈現集合庫之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列接著可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體集合庫選擇人類抗體之技術。

3.抗體變異體

在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當的修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成製備。此類修飾包括(例如)發生於抗體之胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任意組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。

a)取代、插入及缺失變異體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代型突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於下表中標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表1中標題「例示性取代」下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體及針對所需活性篩選的產物中，例如保留/提高之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。

胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一類別。

一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如改良)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)來便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異體抗體並篩選具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異體抗體。

可在HVR中進行改變(例如取代)以(例如)提高抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」，亦即藉由密碼子編碼之殘基中，該等殘基在體細胞成熟過程中經歷高頻突變(參見例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，及/或接觸抗原之殘基中進行，其中測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由自二級集合庫構築及再選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom,H.R.等人Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。隨後產生二級集合庫。隨後篩選該集合庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機分組。涉及抗原結合之HVR殘基可(例如)使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。特定言之，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在 HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性變化(例如本文所提供之保守性取代)。此類更改(例如)可在HVR中接觸抗原之殘基之外。在上文所提供之變異VH及VL序列的某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

一種適用於鑑別可經靶向以用於突變誘發之抗體之殘基或區的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所描述。在此方法中，鑑別標靶殘基之殘基或群(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物之標靶或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以判定其是否含有所需特性。

胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或超過一百個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。

b)糖基化變異體

在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低抗體糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。

在抗體包含Fc區之情況下，可更改與其連接之碳水化合物。由哺乳 動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見例如，Wright,A.及Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中的GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對如本文所報導之抗體中的寡醣進行修飾以便產生具有某些改良之特性的抗體變異體。

在一個實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接於Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此抗體中之岩藻糖的量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。藉由計算相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析量測之與Asn 297連接的所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，糖鏈內Asn297處之岩藻糖之平均量來測定岩藻糖之量，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之EU編號)；然而，歸因於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即位於位置294與300之間。此類岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。與「脫岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變異體相關的公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249； Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka,J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在實例11處)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；及WO 2003/085107)。

抗體變異體進一步具有平分寡醣，例如其中連接於抗體之Fc區的雙觸角寡醣藉由GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878；US 6,602,684；及US 2005/0123546中。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。

c)Fc區變異體

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。

在某些實施例中，本文涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體之半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有 害。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析，以證實CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合(由此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。媒介ADCC、NK細胞之初代細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁之表3中。評估相關分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於US 5,500,362(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；及Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞量測術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者，或另外，可在活體內，例如，在諸如Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示之動物模型中，評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析，以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol. 18(2006：1759-1769))進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。

效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的彼等抗體(US 6,737,056)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或多於兩者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(US 7,332,581)。

描述具有提高或降低之與FcR之結合的某些抗體變異體。(參見例如，US 6,737,056；WO 2004/056312及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334處(殘基之EU編號)之取代的Fc區。

在一些實施例中，在Fc區內進行更改，其導致經改變(亦即，經改良或減弱中之任一者)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如如US 6,194,551,WO 99/51642，及Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所描述。

具有延長之半衰期及改良之與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593；及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)之結合的抗體描述於US 2005/0014934中。彼等抗體包含在其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn之結合。此類Fc變異體包括具有以下Fc區殘基中的一或多者處之取代之彼等：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、 413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(US 7,371,826)。

關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan,A.R.及Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。

d)經半胱胺酸工程改造之抗體變異體

在某些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基從而定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如US 7,521,541中所述產生經半胱胺酸工程改造之抗體。

e)抗體衍生物

在某些實施例中，可將本文中所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適合於抗體衍生作用之部分包括(但不限於)水可溶聚合物。水可溶聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛 因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定病症下之療法等考慮因素來確定。

在另一個實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射選擇性地加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可為任何波長，且包括(但不限於)不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近的細胞之溫度的波長。

B.重組方法及組合物

可使用例如如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體之經分離核酸。此類核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH的胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之一或多個載體(例如表現載體)。在另一個實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下各者轉型)：(1)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的載體；或(2)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製造雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體 之方法，其中該方法包含在適用於抗體之表現的條件下培養包含編碼如上文提供之抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)復原抗體。

為了重組產生雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體，分離(例如如上所述之)編碼抗體的核酸並插入至一或多個載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及定序。

適合用於選殖或表現編碼抗體之載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。抗體片段及多肽在細菌中之表現參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton,K.A.，於：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編),Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245至254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現)在表現之後，可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離抗體且其可進一步經純化。

除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用於表現糖基化抗體之適合的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑 別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。

植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用之哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(如例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房瘤(MMT 060562)；如例如Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述之TRI細胞；MRC5細胞；及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述參見例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編),Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255至268頁。

C.用於診斷及偵測之方法及組合物

在某些實施例中，本文所提供之任何雙特異性抗人類A-β/人類運鐵 蛋白受體抗體適用於偵測生物樣品中A-β之存在。如本文所使用之術語「偵測」包涵定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。

在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法中之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中A-β之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含在容許雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體與A-β結合的條件下，用如本文所描述之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體接觸生物樣品，及偵測在雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體與A-β之間是否形成複合體。此方法可為活體外或活體內方法。

在某些實施例中，提供經標記之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹醯基；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(US 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。

D.醫藥調配物

藉由將具有所希望純度的此抗體與一或多個視情況選用的醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)(1980))以凍乾調配物或水溶液形式混合來製備如本文所描述之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體之醫藥調配物。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度上對接受者通常為無毒的，且其包括(但不限於)：緩衝劑(諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸)；包括抗壞血酸及甲硫胺酸之抗氧化劑；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六羥季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、酚、丁基或苄醇，烷基對羥苯甲酸酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)，兒茶酚，間苯二酚，環己醇，3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)之多肽；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；諸如聚(乙烯吡咯啶酮)之親水性聚合物；胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸)；單醣、雙糖及包括葡萄糖、甘露糖或糊精之其他碳水化合物；諸如EDTA之螯合劑、諸如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇之糖；諸如鈉之成鹽抗衡離子；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或諸如聚乙二醇(PEG)之非離子表面活性劑。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rhuPH20(HYLENEX^®,Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rhuPH20)及使用方法描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。

例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。抗體調配物水溶液包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所描述之彼等抗體調配物水溶 液，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳含有對彼此無不利影響之互補活性的活性成分。此類活性成分適合以對預期目的有效之量組合存在。

可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分包覆於所製備之微囊中，例如分別在膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)(1980)中。

可製備延釋製劑。延釋製劑之適合的實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。延釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(US 3,773,919)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙瑞林乙酸鹽構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易地藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。在一個實施例中，調配物為等滲的。

E.治療方法及組合物

本文所提供之任何雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體可在治療方法中使用。

在一個態樣中，提供一種用作藥劑之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在其他態樣中，提供一種用於預防及/或治療與澱粉樣病 變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關病症中使用的雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在某些實施例中，提供一種在治療方法中使用之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在某些實施例中，本文提供一種在治療患有與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關病症之個體之方法中使用的雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投有效量之至少一種額外治療劑，諸如下列或抗pTau或抗α-突觸核蛋白抗體。在其他實施例中，本文提供一種用於抑制斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在某些實施例中，本文提供一種在抑制個體中斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊之方法中使用的雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體以抑制斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊。根據以上實施例中之任一者的「個體」較佳為人類。

在另一態樣中，本文提供雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，藥劑用於治療與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關之病症。在另一實施例中，藥劑在治療與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關病症之方法中使用，該方法包含向患有與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關病症之個體投與有效量的藥劑。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投有效量之至少一種額外治療劑，諸如下列或抗pTau或抗α-突觸核蛋白抗體。在另一實施例中，藥劑用於抑制斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊。在另一實施例中，藥劑在抑制個體內斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊 之方法中使用，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以抑制斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊。根據以上實施例中之任一者的「個體」可為人類。

在另一態樣中，本文提供一種用於治療與澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關之病症的方法。在一個實施例中，該方法包含向患有澱粉樣病變及/或澱粉狀蛋白斑塊形成相關病症之個體投與有效量之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，諸如以下給定之藥劑或抗pTau或抗α-突觸核蛋白抗體。根據以上實施例中之任一者的「個體」可為人類。

在另一態樣中，本文提供一種用於抑制個體內斑塊形成及/或用於崩解β-澱粉狀蛋白斑塊之方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體，以抑制斑塊形成及/或崩解β-澱粉狀蛋白斑塊。在一個實施例中，「個體」為人類。

在另一態樣中，本文提供(例如)在以上治療方法中之任一者中使用的包含本文提供之雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體中之任一者的醫藥調配物。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體及至少一種額外治療劑，例如以下給定或抗pTau或抗α-突觸核蛋白抗體。

如本文所報導之抗體在療法中可單獨使用或與其他試劑組合使用。舉例而言，如本文所報導之抗體可與至少一種額外治療劑共同投與。在某 些實施例中，額外治療劑為當採用如本文所報導的雙特異性抗體進行治療時有效地治療相同或不同神經病症之治療劑。例示性額外治療劑包括(但不限於)：上述各種神經藥物、膽鹼酯酶抑制劑(諸如多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)及他可林(tacrine))、NMDA受體拮抗劑(諸如美金剛(memantine))、澱粉樣蛋白β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARy促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(抑制素)、安目帕克(ampakines)、鈣離子通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動澱粉樣蛋白β肽免疫接種、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗澱粉樣蛋白β肽抗體。在某些實施例中，選擇至少一種能夠減輕神經學藥物之一或多種副作用的額外治療劑。

上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或大於兩種治療劑包括在相同或單獨調配物中)及單獨投與，在此情況下，如本文所報導之抗體的投與可在投與一或多種額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體之投與及額外治療劑之投與彼此在約一個月內，或約一週、兩週或三週內，或約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。如本文所報導之抗體亦可與其他干預療法組合使用，諸如(但不限於)放射療法、行為療法或此項技術中已知並適用於治療或預防神經病症之其他療法。

如本文所報導之抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何適合的方法投與，包括非經腸、肺內及鼻內投與，且必要時針對局部治療，包括病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。視 投與之短期或長期性而定，給藥可藉由任何適合之途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。

如本文所報導之抗體將以與良好醫學實務一致的方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知的其他因素。抗體並非必須，而是視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及如上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所述相同之劑量且用如本文所述之投與途徑使用，或以本文所述劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。

運輸融合構築體或化合物穿過BBB之基於脂質之方法包括(但不限於)：將融合構築體或化合物囊封入耦合至結合到BBB血管內皮上之受體單價結合實體的脂質體中(參見例如，US 2002/0025313)，並以低密度脂蛋白粒子(參見例如，US 2004/0204354)或載脂蛋白E(參見例如，US 2004/0131692)包被該單價結合實體。

為了預防或治療疾病，如本文所報導之抗體的適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重程度及病程、是出於預防還是出於治療目的投與抗體、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之響應及主治醫師之判斷而定。一次性或歷經一系列治療向患者適當投與該抗體。視病症之類型及嚴重程度，無論是(例如)藉由一或多個單獨投與或藉由連續輸液，約1μg/kg至15 mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)之抗體可為向患者投與之初始候選劑量。視上文所提及之因素而定，一種典型的日劑量範圍可為約1μg/kg至100mg/kg或更大。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病況而定持續至發生疾病症狀之所需抑制為止。抗體之一種例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可例如每週或每三週間歇地投與(例如，使得患者接受約二劑至約二十劑抗體，或(例如)約六劑抗體)。可投與初始較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。

應理解，可使用如本文所報導之免疫結合物代替或外加雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體實施任何以上調配物或治療方法。

III.製品

在如本文所報導之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症之材料的製品。製品包含容器及附於或系連於容器之標記或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納組合物本身或與有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物組合，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為如本文所報導之抗體。標記或藥品說明書指示組合物用於治療所選病況。此外，製品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含如本文所報導之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或治療劑。此實施例中之 製品可進一步包含指示組合物可用以治療具體病症之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏(Ringer's)溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者立場而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

應理解，以上製品中之任一者可包括如本文所報導之免疫結合物代替或外加如本文所報導之雙特異性抗體。

IV.實例

以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文提供之一般描述，可實施各種其他實施例。

材料及一般方法

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991)中。根據Kabat編號(Kabat,E.A.,等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公眾健康服務中心，Bethesda,MD(1991))來編號並指代抗體鏈之胺基酸。

重組型DNA技術

使用標準方法以如Sambrook,J.等人，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述操控DNA。根據製造商之說明使用分子生物試劑。

基因合成

自由化學合成製得之寡核苷酸製備所需基因片段。藉由包括PCR擴增之黏接及接合並隨後經由指定限制位點選殖組配藉由單個限制核酸內切酶裂解位點側接之長基因片段。藉由DNA定序確認次選殖基因片段之DNA序列。根據Geneart(Regensburg，德國)給定之規範定序基因合成片段。

DNA序列測定

藉由在MediGenomix GmbH(Martinsried，德國)或SequiServe GmbH(Vaterstetten，德國)處執行之雙股定序測定DNA序列。

DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理

GCG's(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)套裝軟體版本10.2及Infomax's Vector NT1 Advance套件版本8.0用於序列創建、映射、分析、附註及圖示。

表現載體

針對所描述之雙特異性抗體的表現，可應用基於含或不含CMV內含子A啟動子之cDNA組織或含CMV啟動子的基因體組織的短暫表現的表現質粒(例如在HEK293細胞中)。

除了抗體表現卡匣之外，載體亦含有：- 允許在大腸桿菌中複製此質體之複製起點，及- 在大腸桿菌中賦予安比西林(ampicillin)耐性之β-內醯胺酶基因。

抗體基因之轉錄單元由以下要素構成：- 5'端處之一或多個獨特限制位點- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子，- 就cDNA組織而言之內含子A序列， - 衍生自人類抗體基因之5'非轉譯區，- 免疫球蛋白重鏈信號序列，- 作為cDNA或含基因體外顯子-內含子組織之對應抗體鏈編碼核酸，- 含聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及- 在3'端處之一或多個獨特限制位點。

編碼抗體鏈之融合基因由PCR及/或基因合成產生，並藉由已知重組方法及技術藉由(例如)在對應載體中使用獨特限制位點連接根據核酸片段來組配。藉由DNA定序檢驗次選殖核酸序列。對於短暫轉染，較大量質體藉由質體製備自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)來製備。

對於所有構築體，結進孔雜二聚技術與第一CH3域中之典型結(T366W)取代基及第二CH3域中之相應孔取代基(T366S、L368A及Y407V)(以及兩個額外引入之半胱胺酸殘基S354C/Y349'C)(含於以上所描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)一起使用。

細胞培養技術

使用如Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(eds.),John Wiley & Sons,Inc.中之現有方案中所描述之標準細胞培養技術。

HEK293-F系統中之短暫轉染

藉由短暫表現產生雙特異性抗體。因此，根據製造商之說明使用HEK293-F系統(Invitrogen)完成與相應質粒之轉染。簡言之，振盪燒瓶或攪拌之醱酵槽中在無血清FreeStyle^TM 293表現培養基(Invitrogen)於懸浮 液中生長之HEK293-F細胞(Invitrogen)用各別表現質體及293fectin^TM或fectin(Invitrogen)之混合物轉染。對於2L振盪燒瓶(Corning)，將HEK293-F細胞以1.0*10⁶個細胞/毫升之密度接種於600mL中且在120rpm、8% CO₂下進行培育。在第二天，在大約為1.5×10⁶個細胞/毫升之細胞密度下用約42mL A)包含600μg總質粒DNA(1μg/mL)之20mL Opti-MEM培養基(Invitrogen)與B)補充有1.2mL 293 fectin或fectin(2μl/mL)之20ml Opti-MEM培養基之混合物來轉染細胞。在醱酵過程中根據葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。在5至10天之後收集含有所分泌抗體之清液層，且直接自該清液層中純化出抗體或將該清液層冷凍並儲存。

蛋白質測定

根據Pace等人，Protein Science 4(1995)2411-1423使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數，藉由在280nm處測定光密度(OD)來測定純抗體及衍生物之蛋白質濃度。

測定清液層中之抗體濃度

用蛋白A瓊脂糖珠粒(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德國)藉由免疫沈澱來估計細胞培養清液層中之抗體及衍生物的濃度。因此，在TBS-NP40(50mM Tris緩衝液，pH為7.5，補充有150mM NaCl及1% Nonidet-P40)中將60μL蛋白A瓊脂糖珠粒洗滌三次。隨後，將1mL至15mL細胞培養清液層應用於在TBS-NP40中預平衡之蛋白A瓊脂糖珠粒。室溫下培育1小時後，珠粒在Ultrafree-MC-filter管柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗滌一次，用0.5mL2倍磷酸鹽緩衝鹽水(2倍PBS,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德國)洗滌兩次並用0.5mL 100mM檸檬酸 鈉緩衝液(pH 5.0)短暫地洗滌四次。藉由添加35μl NuPAGE® LDS樣品緩衝液(Invitrogen)來溶離細胞結合性抗體。將一半的樣品分別與NuPAGE®樣品還原劑合併或保持未還原，並在70℃下加熱10min。因此，5μl至30μl應用於4%至12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)(具有針對非還原性SDS-PAGE之MOPS緩衝液，並具有針對還原性SDS-PAGE的NuPAGE®抗氧化劑操作緩衝液添加劑(Invitrogen)之MES緩衝液)，並用Coomassie Blue染色。

藉由親和力HPLC層析來定量量測細胞培養清液層中之抗體的濃度。簡言之，將含有結合至蛋白A之抗體的細胞培養清液層應用於含200mM KH₂PO₄、100mM檸檬酸鈉、pH 7.4之Applied Biosystems Poros A/20管柱，並在Agilent HPLC 1100系統上用200mM NaCl、100mM檸檬酸、pH 2.5溶離。藉由UV吸光度及峰值面積之積分來定量所溶離之抗體。以純化標準IgG1抗體作為標準。

或者，藉由Sandwich-IgG-ELISA來量測細胞培養清液層中抗體及衍生物之濃度。簡言之，在室溫下持續1小時地或在4℃下整夜將100μL/孔之經生物素標記之抗人類IgG捕獲分子F(ab')2<h-Fcγ>BI(Dianova)以0.1μg/mL塗佈至StreptaWell High Bind Streptavidin A-96孔微量滴定板(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德國)，且隨後用200μL/孔PBS、0.05% Tween(PBST,Sigma)洗滌三次。其後，將100μL/孔之含有細胞培養清液層之個別抗體的PBS(Sigma)稀釋系列添加至孔，並在室溫下於震盪器上培育1至2小時。用200μL/孔PBST洗滌孔三次，並在偵測抗體在室溫下於震盪器上培育1至2小時之際，以0.1μg/mL之100μl F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)偵測結合性抗體。藉由用200μL/孔PBST洗 滌三次來移除非結合偵測抗體。藉由添加100μL ABTS/孔繼之以培育，來偵測結合偵測抗體。在測量波長405nm(參考波長492nm)處於Tecan Fluor Spectrometer上進行吸光率測定。

製備型抗體純化

參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化抗體。簡言之，將抗體施用於蛋白A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。pH 2.8下達成溶離抗體，繼之以立即中和抗體。藉由尺寸排阻層析法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS或包含150mM NaCl(pH 6.0)之20mM組胺酸緩衝液中將聚集蛋白質自單體抗體分隔開。單體抗體份數經合併、用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)、凍結並在-20℃或-80℃下儲存。提供部分樣品用於後續蛋白質分析及分析型特徵化，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜分析。

SDS-PAGE

根據製造商說明使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4%至12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES(還原性凝膠，具有NuPAGE® antioxidant操作緩衝液添加劑)或MOPS(非還原性凝膠)操作緩衝液。

CE-SDS

藉由CE-SDS用微流Labchip技術(PerkinElmer，美國)分析純度及抗體完整性。因此，用HT蛋白質表現試劑盒根據製造商之說明書製備用於CE-SDS分析之5μl抗體溶液，並用HT蛋白質表現晶片在LabChip GXII系統上分析。使用LabChip GX軟體分析資料。

分析型尺寸排阻層析

藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白A純抗體應用於Dionex Ultimate®系統(Thermo Fischer Scientific)上之含300mM NaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄緩衝液(pH 7.5)的Tosoh TSKgel G3000SW管柱，或至Dionex HPLC-System上之含2倍PBS的Superdex 200管柱(GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰值面積之積分來定量所溶離之蛋白質。BioRad Gel過濾標準151-1901用作標準。

質譜分析

本章節描述雙特異性抗體之特徵，並強調其校正組件。藉由去糖基化完整抗體(在特定案例中為去糖基化/限制性LysC消化抗體)之電噴霧電離質譜分析(ESI-MS)分析預期的一級結構。

在蛋白質濃度為1mg/ml下，在37℃下用含N-糖苷酶F之磷酸鹽或Tris緩衝液使該等抗體去糖基化至多17小時。在室溫下，用含100μg去糖基化抗體之Tris緩衝液(pH 8)進行限制性LysC(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德國)消化120小時，或對應地在37℃下持續40min。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC將樣品去鹽。在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。

化學降解測試

將樣品分成三個等分試樣，且分別再緩衝至20mM His/His*HCl、140mM NaCl(pH 6.0)中或PBS中，並儲存在40℃(His/NaCl)或37℃(PBS)下。對照樣品儲存在-80℃下。

培育結束後，分析樣品之相對活性濃度(BIAcore)、聚集(SEC)及片段化(毛細電泳法或SDS-PAGE)，且與未經處理之對照進行比較。

熱穩定性

在20mM組胺酸/組胺酸氯、140mM NaCl(pH 6.0)中製備濃度為1mg/mL之樣品，經由0.4μm過濾器板藉由離心轉移至光學384孔培養盤中並用石蠟油覆蓋。藉由動態光散射在DynaPro培養盤讀取器(Wyatt)上重複量測流體動力學半徑，同時以0.05℃/min之速率將樣品自25℃加熱至80℃。

或者，將樣品轉移至10μL微光析槽陣列中，且用Optim1000儀器(Avacta Inc.)記錄靜態光散射資料以及在266nm雷射下激發後之螢光資料，同時以0.1℃/min之速率將樣品自25℃加熱至90℃。

聚集起始溫度定義為流體動力學半徑(DLS)或散射光強度(Optim1000)開始增加之溫度。

或者，將樣品轉移至9μL多光析槽陣列中。在Optim1000儀器(Avacta Analytical Inc.)中以0.1℃/分鐘之恆定速率將多光析槽陣列自35℃加熱至90℃。該儀器連續記錄266nm雷射之散射光強度，其中大約每0.5℃一個資料點。相對於溫度標繪光散射強度。聚集起始溫度(T_agg)定義為散射光強度開始增加之溫度。

解鏈溫度定義為螢光強度對比波長之圖中的拐點。

實例1

表現及純化

如以上於一般材料及方法章節中所描述產生雙特異性抗體。

藉由蛋白A親和性層析法及尺寸排阻層析法之組合自清液層純化雙特 異性抗體。藉由質譜分析表徵所獲得之產物的一致性，藉由CE-SDS、單體含量及穩定性表徵諸如純度之分析性特性。

如一般方法章節中所描述，藉由去糖基化完整抗體及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或替代性去糖基化/限制性LysC消化抗體之電噴霧電離質譜分析(ESI-MS)，分析預期的一級結構。

僅在蛋白A及SEC純化之後應用額外分析方法(例如熱穩度、質譜分析及功能性評估)。

實例2

藉由ELISA測定活體外Aβ1-40纖維結合

藉由ELISA分析量測雙特異性抗體與纖維狀Aβ之結合。簡言之，在37℃下將7μg/mL之含Aβ(1-40)之PBS塗覆在Maxisorb培養盤，持續3天，以產生纖維狀Aβ，接著在RT下乾燥3h。在RT下用含1% CroteinC及0.1% RSA之PBS(填充緩衝液)填充培養盤1h，隨後用洗滌緩衝劑洗滌一次。添加濃度至多為100nM之雙特異性抗體或對照樣於填充緩衝液中，並在4℃下培育整夜。在4個洗滌步驟之後，藉由添加1：10,000稀釋度之含抗人類IgG-HRP(Jackson Immunoresearch)之填充緩衝液(1 RT)來偵測構築體，繼之以6次洗滌並在TMB(Sigma)中培育。在用1N HCl遏止顯色後，於450nm處讀出吸光率。

實例3

測定活體外運鐵蛋白受體結合

藉由FACS分析小鼠X63.AG8-563骨髓瘤細胞來測試雙特異性抗體與鼠類運鐵蛋白受體之結合。若Aβ抗體展示非特異性結合至Ag8細胞之某一傾向，則可藉由與20多倍之抗小鼠TfR抗體共同培育來定量具體結合。細 胞藉由離心獲得，經PBS洗滌一次，並在添加或不添加含200nM抗小鼠TfR抗體之100μL RPMI/10% FCS的情況下，將5×10⁴個細胞與1.5pM至10nM稀釋度系列之多肽融合體在冰塊上共同培育1.5h。在用RPMI/10% FCS洗滌2次後，以稀釋度為1：600將細胞與偶合至藻紅蛋白(Jackson Immunoresearch)之異型絲抗人類IgG在RPMI/19% FCS中在冰塊上共同培育1.5h。將細胞再次洗滌、於RPMI/10% FCS中再懸浮，並在FACS-Array儀器(Becton-Dickinson)上量測藻紅蛋白螢光。

實例4

人類TfR抗體相互作用之基於表面電漿子共振的結合分析

在配備有根據供應商手冊使用標準胺偶合化學程序以抗人類Fab抗體(GE Healthcare，目錄號28-9583-25)預處理之C1感測器晶片(GE Healthcare，目錄號BR1005-35)的BIAcore B 4000(GE Healthcare)上進行結合實驗。

針對動力學量測，在25℃下，以磷酸鹽緩衝液生理鹽水pH 7.4、0.05% Tween 20施加60秒接觸時間及10μL/min之流動速率將樣品抗體固定化。以遞增濃度施加重組His6標記人類運鐵蛋白受體(R&D systems，目錄號2474-TR-050)，並隨時間推移監測信號。記錄30μL/min流動速率下之平均時間間隔150秒之締合時間及600秒之分解時間。用1：1結合模型(朗繆爾等溫模型(Langmuir isotherm))擬合資料。

實例5

藉由間接免疫螢光法用如本文所報導之雙特異性抗體染色自阿茲海默氏病患者大腦切片之天然人類β-澱粉狀蛋白斑塊

藉由免疫組織化學分析用間接免疫螢光法可測試雙特異性抗體染色 天然人類β-澱粉狀蛋白斑塊之能力。可予以表明真正的人類β-澱粉狀蛋白斑塊之特定及敏感性染色。藉由間接免疫螢光法標記顳葉皮層之未固定組織之冷凍切片，該顳葉皮層自阿茲海默氏病診斷為陽性之患者死後獲得。兩步驟培育用於偵測結合雙特異性抗體，其藉由結合至Alexa 555染料(Molecular Probes)之親和-純化異型絲抗人類(GAH555)IgG(H+L)所揭示。對照樣可包括無關人類IgG1抗體(Sigma)及僅二級抗體，其均應產生負面結果。

實例6

藉由如本文所報導之雙特異性抗體在阿茲海默氏病之小鼠模型中活體內綴飾β-澱粉狀蛋白斑塊

在APP/PS2雙轉基因小鼠、小鼠模型中可測試雙特異性抗體之AD相關聯澱粉樣變性(Richards,J.Neuroscience,23(2003)8989-9003)、其活體內免疫綴飾β-澱粉狀蛋白斑塊之能力。此使得能評估大腦穿透程度及澱粉狀蛋白-β斑塊結合程度。與裸抗Aβ單株抗體相比較，可以不同的劑量投與融合多肽，且在6天後，向動物灌注經磷酸鹽緩衝之生理鹽水且在乾冰上凍結大腦並為進行冷凍切片做準備。

可使用未固定冷凍切片或藉由單一標記間接免疫螢光法以在室溫下經1小時結合至濃度為15μg/ml之Alexa555染料(GAH555)(Molecular Probes)的異型絲抗人類IgG(H+L)，來評估抗體結合至β-澱粉狀蛋白斑塊之存在。可藉由將BAP-2與濃度為0.5μg/ml之抵抗Aβ結合至Alexa 488的小鼠單株抗體在室溫下同培育1小時，來完成澱粉狀蛋白斑塊之對比染色。將螢光封固劑(S3023 Dako)嵌入蓋玻片且藉由共焦鐳射顯微鏡成像。

雖然出於清楚理解之目的，前述發明已藉助於說明及實例詳細地描 述，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文所引用的所有專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用的方式明確併入。

<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)

<120> 雙特異性抗人類A-β/人類運鐵蛋白受體抗體及使用方法

<140> TW 105131520

<141> 2016-09-30

<150> EP 15188064,8

<151> 2015-10-02

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0015-LCl

<400> 1

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0015-HC1

<400> 2

<210> 3

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0015-LC2

<400> 3

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0015-Fab

<400> 4

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0012-LC1

<400> 6

<210> 7

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0012-HC1

<400> 7

<210> 8

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0012-LC2

<400> 8

<210> 9

<211> 688

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0012-HC2

<400> 9

<210> 10

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0015-HC2

<400> 10

<210> 11

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0020-LC1

<400> 11

<210> 12

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0020-HC1

<400> 12

<210> 13

<211> 947

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0020-HC2

<400> 13

<210> 14

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0024-LC1

<400> 14

<210> 15

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0024-HC1

<400> 15

<210> 16

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0024-LC2

<400> 16

<210> 17

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 0024-HC2

<400> 17

<210> 18

<211> 126

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

<210> 19

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-023 VH人類化變異體_DASG

<400> 20

<210> 21

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-009 VL人類化變異體_NYA

<400> 21

<210> 22

<211> 760

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Claims (8)

1. 一種雙特異性抗體，其中包含胺基酸序列為SEQ ID NO：01之輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：02之重鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：03之輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：10之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：04之抗體Fab片段。
2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該抗體為單株抗體。
3. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1及2中任一項之雙特異性抗體及醫藥學上可接受之載劑。
4. 如請求項1及2中任一項之雙特異性抗體，其用作藥劑。
5. 如請求項1及2中任一項之雙特異性抗體，其用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
6. 一種如請求項1及2中任一項之雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療澱粉狀蛋白病症之藥劑。
7. 如請求6項之用途，其中該藥劑用於治療阿茲海默氏病。
8. 如請求項6之用途，其中該藥劑用於抑制/減緩大腦內斑塊之形成。