TWI688574B - 抗ｃｄ４０抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涵蓋拮抗性抗CD40抗體及其抗原結合部分。特定言之，本發明係關於人類化抗CD40抗體。在某些實施例中，本發明抗體中和人類CD40(hCD40)活性。本發明之抗體或抗體部分適用於偵測CD40及抑制CD40活性，例如在患有CD40活性有害的病症之人類個體中。

Description

抗CD40抗體及其用途 相關申請案
本發明主張2015年5月29日申請之美國臨時申請案第62/168,425號之優先權，其全部內容以引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用之方式併入本文中。該ASCII複本創建於2016年5月12日，命名為117813-10420_SL.txt且大小為91,019位元組。
本發明係關於CD40(CD40)抗體及其抗原結合部分，及其在預防及/或治療各種疾病中之用途。
CD40為腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員，其在B細胞發育、淋巴細胞活化及抗原呈現細胞(APC)功能方面起重要作用。在器官特異性自體免疫疾病以及全身性自體免疫(諸如全身性紅斑性狼瘡症(SLE))中，上皮細胞、白血球及血管內皮上之CD40表現升高。在患有諸如克羅恩氏病(Crohn's disease)之慢性發炎性疾病的患者中，破壞CD40L/CD40信號傳導路徑可減少諸如IL-23及TNF之促炎性細胞介素產生，減弱T輔助細胞分化及功能，及抑制巨噬細胞活化。CD40與CD40L之相互作用誘導體液及細胞介導之免疫反應。CD40調控這對配體-受體活化B細胞及其他抗原呈現細胞(APC)，包括樹突狀細胞 (DC)。
CD40為48kDa I型跨膜蛋白(van Kooten,J Leukoc Biol.2000年1月；67(1)：2-17)，其表現於各種造血型細胞(淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞)及非造血型細胞(上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞)上。CD40L主要表現於經活化之T細胞、B細胞及血小板上。關於CD40/CD40L生物學之大部分瞭解來自APC(樹突狀細胞(DC)或B細胞上之CD40表現)及表現CD40L之T細胞之間的相互作用。在靜息B細胞上，CD40L接合(engagement)驅動B細胞活化、增殖及記憶B細胞發育(Kehry,Immunol.1996年4月1日；156(7)：2345-8)。CD40信號傳導亦為免疫球蛋白類別轉換及生發中心形成所需。CD40/CD40L信號傳導路徑在B細胞生物學中之重要性在CD40或CD40L缺陷型小鼠中顯而易見，CD40或CD40L缺陷型小鼠缺少生發中心且T依賴性抗體反應遭到抑止。然而，在CD40-/-小鼠中，非T依賴性IgG反應依然完好，表明此等小鼠中所缺少的為細胞-細胞相互作用。CD40缺陷型小鼠在T細胞區室中亦有缺陷。樹突狀細胞上經由CD40發生之信號傳導上調II類MHC以及各種協同刺激分子，諸如CD80及CD86，且促進DC之成熟。成熟DC經由產生諸如IL-2及IL-12之細胞介素來刺激CD4+ T細胞之活化及存活。低效的T細胞激活似乎為CD40L-/-小鼠中有缺陷的T依賴性體液反應之主要原因(Grewal,Nature.1995年12月7日；378(6557)：617-20)。在患有X連鎖高IgM症候群之人類中可見到類似B細胞表型。此等患者患有因消除CD40/CD40L信號傳導之CD40L基因座中之突變所致的原發性免疫缺乏症。此等個體具有升高的IgM含量且不能產生IgA、IgG及IgE，導致機會性感染風險增加(Adriana,J Clin Immunol.2008年5月；28增刊1：S62-6)。
CD40信號傳導路徑對靜息或原生淋巴細胞及APC轉換為經活化/成熟表型極為重要。雖然可以在不存在CD40/CD40L信號傳導的情況 下發生T細胞激活及B細胞活化，但此路徑為產生穩固的應變性免疫反應所需的。CD40與CD40L之接合導致TNF受體相關因子(TRAF)募集至CD40之細胞質域(Bishop,Adv Exp Med Biol.2007；597：131-51)。各種TRAF蛋白質之磷酸化引起典型及非典型NFkB路徑之活化。此外，JAK3與CD40細胞質尾之結合引起STAT5活化，STAT5活化誘導DC成熟以及TNF及IFNγ產生。TRAF6依賴性PI3K活化為DC中之關鍵存活信號，同時TRAF2/TRAF6具有NFkB活化及上調CD80表現之冗餘功能(Hostager,J Biol Chem.2003年11月14日；278(46)：45382-90)。TRAF2、3、5及6皆已顯示在藉由CD40信號傳導介導之免疫球蛋白類別轉換中起重要作用(Leo,Proc Natl Acad Sci U S A.1999年2月16日；96(4)：1421-1426)。
諸多自體免疫疾病之發病機制中涉及到CD40/CD40L信號傳導路徑，該等自體免疫疾病包括全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、發炎性腸病(IBD)、多發性硬化症、類風濕性關節炎及休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)(Law及Grewal,Adv Exp Med Biol.2009；647：8-36)。在遭到慢性自體免疫破壞之組織(包括腎臟、腸道及關節)中，巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞及B細胞上之CD40表現升高(Borcherding,Am J Pathol.2010年4月；176(4)：1816-27；Sawada-Hase,Am J Gastroenterol.2000年6月；95(6)：1516-23)。在患有SLE、IBD及休格連氏症候群之患者中，可溶性CD40L升高，與此等患者之炎症負荷一致。
慢性腸炎中CD40/CD40L路徑的一些最早證據來自臨床前模型，其中抗CD40L mAb保護嚙齒動物不患上實驗性結腸炎(de Jong,Gastroenterology.2000年9月；119(3)：715-23；Liu,J Immunol.2000年6月1日；164(11)：6005-14；Stuber,J Exp Med 1996年2月1日，183(2)：693-8)。疾病活動評分降低與腸道中促炎性細胞介素產生減少及防止慢性體重減輕的保護減弱有關。在CD40或CD40L基因缺陷型動物中觀察 到了類似結果(de Jong,Gastroenterology.2000年9月；119(3)：715-23)。在疾病發作之後用抗CD40L mAb治療小鼠仍可有效降低疾病活動性，表明此路徑對於維持慢性發炎性疾病至關重要。此外，CD40促效性抗體足以在缺少淋巴細胞之小鼠中驅動腸炎(Uhlig,Immunity.2006年8月；25(2)：309-18)。使用CD40 siRNA獲得之較新資料亦顯示CD40信號傳導在結腸炎中之重要作用(Arranz,J Control Release.2013年2月10日；165(3)：163-72)。在克羅恩氏病中，固有層單核細胞及上皮細胞以高水準表現CD40且末梢血液中富含CD40+單核細胞。此外，已將CD40基因座中之多形現象與IBD易感性增加聯繫起來。在經抗TNF抗體治療之克羅恩氏病患者中，轉錄譜指出，具有適當的藥物治療反應之患者體內的CD40 mRNA含量降低。然而，在對TNF抑制劑反應不良之患者中，CD40 mRNA含量不變，表明CD40依賴性、TNF非依賴性路徑會促進此等患者發炎。研究表明，抑制CD40介導之信號傳導在IBD以及其他自體免疫疾病之發病機制中為重要的。因此，仍然需要可出於治療目的用於治療諸如克羅恩氏病之慢性發炎性疾病及病症的拮抗性抗CD40抗體及其抗原結合部分。
本發明係關於拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分。本發明抗體包括(但不限於)能夠結合人類CD40且基本上不含促效活性之拮抗性人類化抗體及其抗原結合部分。
在一第一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合片段結合由SEQ ID NO：1之拓樸區(topographic region)Cys62-Phe67、Gln79-Cys83、Arg90-Thr99及Thr24-Cys37界定的人類CD40之抗原決定基。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分為拮抗性抗體。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分為基本上不含促效活性之拮抗性抗體。
在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之CDR3的重鏈可變區及包含具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列之CDR3的輕鏈可變區。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含具有SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2的重鏈可變區及包含具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之CDR2的輕鏈可變區。在另一其他實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR2的重鏈可變區及包含具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之CDR2的輕鏈可變區。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之CDR1的重鏈可變區及包含具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之CDR1的輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分為IgG同型。在另一相關實施例中，抗體或其抗原結合部分為IgG1或IgG4同型。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分在Jurkat細胞報導基因分析中具有至少50nM之IC50。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含具有如SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列之CDR3的輕鏈可變區及/或包含具有如SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列之CDR3的重鏈可變區。在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區包含具有如SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3且其中重鏈可變區包含具有如SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區進一步包含具有如SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的CDR2。在另一其他實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區進一步包含具有SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2。在另一實施例中，拮抗性 抗CD40抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區進一步包含具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1。在另一其他實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區進一步包含具有如SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的CDR1。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：6、42及8之CDR組的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：21、11及12之CDR組的輕鏈可變區。
在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分經人類化。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分進一步包含人類接受體構架。在另一相關實施例中，人類接受體構架包含選自SEQ ID NO：82-106之胺基酸序列。在另一實施例中，人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中該構架之胺基酸序列與該人類接受體構架之序列至少65%一致且包含至少70個與人類接受體構架一致的胺基酸殘基。在另一實施例中，人類接受體構架包含至少一個在關鍵殘基處之構架區胺基酸取代，該關鍵殘基選自：與CDR相鄰之殘基；糖基化位點殘基；稀有殘基；能夠與人類CD40相互作用之殘基；能夠與CDR相互作用之殘基；典型殘基(canonical residue)；介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；游標區(Vernier zone)內之殘基；及在Chothia界定之可變重鏈CDR1與Kabat界定之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。
在另一相關實施例中，關鍵殘基係選自48H、49H及36L。在一個 實施例中，關鍵殘基取代係在可變重鏈區中且為V48I或S49A。在另一實施例中，關鍵殘基取代係在可變輕鏈區中且為Y36F。
在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分基本上不含促效活性。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分抑制CD40與CD40配體(CD40L)或與可溶性CD40配體(sCD40L)之結合。在另一其他實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分結合cyno CD40。在一個實施例中，抗CD40抗體或其抗原結合部分結合人類及食蟹獼猴CD40，但不結合大鼠、兔或小鼠CD40。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分能夠調節CD40之生物功能。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分能夠中和CD40。在又另一其他實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分抑制NF-κB活化。
在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分與CD40之結合速率常數(Kon)選自至少約102M-1s-1；至少約103M-1s-1；至少約104M-1s-1；至少約105M-1s-1；及至少約106M-1s-1；如藉由表面電漿共振所量測。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分與CD40之解離常數(KD)選自由以下組成之群：至多約10-7M；至多約10-8M；至多約10-9M；至多約10-10M；至多約10-11M；至多約10-12M；及至多約10-13M。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含人類IgM恆定域、人類IgG1恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG3恆定 域、人類IgG4恆定域、人類IgA恆定域或人類IgE恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域。在相關實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之重鏈免疫球蛋白恆定區域為人類IgG1恆定域。在另一相關實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之人類IgG1恆定域包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分進一步包含有包含人類Igκ恆定域或人類Igλ恆定域之輕鏈免疫球蛋白恆定域。在相關實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之人類Igκ恆定域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列或其中人類Igλ恆定域包含胺基酸序列SEQ ID NO：81。
在某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其與如本文所述之態樣及實施例中之任一者中所闡述之抗體或其抗原結合部分相競爭。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR1；包含如SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR2；包含如SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR3；包含如SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR1；包含如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR2；及包含如SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域。在另一態樣中，本發明之特徵在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含與SEQ ID NO：28具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列的重鏈可變域及/ 或包含與SEQ ID NO：20具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO：41具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列的重鏈；及/或包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO：40具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列的輕鏈。在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之重鏈包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列，且拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之輕鏈包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種抗CD40抗體，其包含：包含如SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的重鏈及包含如SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分是重組性的。
在某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種醫藥組合物，其包含如本文所述之態樣及實施例中之任一者中所闡述之抗CD40抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
在其他某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種醫藥組合物，其包含如本文所述之態樣及實施例中之任一者中所闡述之抗CD40抗體或其抗原結合部分及聚山梨醇酯。在另一相關實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯80。
在另一實施例中，醫藥組合物包含組胺酸緩衝劑。
在另一其他實施例中，醫藥組合物包含多元醇。在相關實施例中，多元醇係選自甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖或蔗糖。
在另一實施例中，醫藥組合物之pH為約4至約8。在相關實施例中，醫藥組合物之pH為約5至約7。
在另一實施例中，醫藥組合物經凍乾。
在其他實施方案中，本發明之特徵亦在於一種經分離核酸，其編碼本文所述之態樣及實施例中之任一者之拮抗性抗CD40抗體胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之特徵在於一種載體，其包含經分離核酸。在相關實施例中，載體係選自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及pBJ載體。
在另一實施例中，宿主細胞包含載體。在相關實施例中，宿主細胞為原核細胞或真核細胞。在另一實施例中，真核細胞為原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞或昆蟲細胞。在另一其他實施例中，哺乳動物細胞為CHO細胞或COS細胞。
在某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種製造拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之方法，該方法包含在培養基中在足以產生拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分之條件下培養本文所述之態樣及實施例中之任一者之宿主細胞的步驟。在其他實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分係藉由該方法製造。
在其他實施例中，本發明之特徵亦在於一種用於降低人類CD40活性之方法，該方法包含使人類CD40與本文所述之態樣及實施例中之任一者之抗體或其抗原結合部分接觸，使得人類CD40活性降低的步驟。在另一實施例中，該方法為活體外方法。
在其他某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種用於治療患有CD40有害之病症的人類個體的方法，包含向該個體投與有效量之本文所述之態樣及實施例中之任一者之抗CD40抗體或其抗原結合部分。
在其他實施例中，本發明之特徵亦在於一種用於降低患有CD40活性有害之病症的人類個體中之人類CD40活性的方法，該方法包含向該人類個體投與本文所述之態樣及實施例中之任一者之抗體或其抗原結合部分，使得該人類個體中之人類CD40活性降低的步驟。
在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分係在向該個體投與第二藥劑之前、同時或之後投與。在另一相關實施例中，第二藥劑係選自能夠結合人類IL-12之抗體或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；組織胺；組織胺受體阻斷劑；緩激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲胺喋呤(methotrexate)；皮質類固醇、糖皮質激素受體調節劑；環孢素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、非類固醇消炎劑、吸入性類固醇；β促效劑；短效或長效β促效劑；白三烯或白三烯受體之拮抗劑；ADVAIR；IgE抑制劑；抗IgE抗體；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制劑；PDE4抑制劑；黃嘌呤(xanthine)；抗膽鹼激導性藥物；肥大細胞穩定劑；色甘酸(Cromolyn)；IL-4抑制劑；IL-5抑制劑；伊紅趨素(eotaxin)/CCR3抑制劑；組織胺或其受體(包括H1、H2、H3及H4)之拮抗劑；前列腺素D或其受體DP1及CRTH2之拮抗劑；TNF拮抗劑；TNF受體之可溶性片段；依那西普(ENBREL)；TNF酶拮抗劑；TNF轉化酶(TACE)抑制劑；蕈毒鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ；吡非尼酮(perfenidone)；化學治療劑甲胺喋呤；來氟米特(leflunomide)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素)或其類似物CCI-779；COX2或cPLA2抑制劑；NSAID；免疫調節劑；p38抑制劑；TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑；布地賽德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢靈(cyclosporine)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；胺基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝噠唑(metronidazole)；脂肪加氧酶抑制劑；美沙拉嗪(mesalamine)；奧沙拉嗪(olsalazine)；巴柳氮 (balsalazide)；抗氧化劑；凝血脂素抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β抗體；抗IL-6抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF之抗體或促效劑；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配體之抗體；FK506；雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；布洛芬(ibuprofen)；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素劑；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑；IL-1β轉化酶抑制劑；TNF-α正交轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；6-巰基嘌呤；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細胞介素受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎性細胞介素；IL-4；IL-10；IL-11；或TGF-β。
在另一實施例中，病症係選自呼吸障礙；哮喘；過敏性及非過敏性哮喘；因感染所致之哮喘；因呼吸道融合病毒(RSV)感染所致之哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣道發炎之病況；嗜酸性球增多症；纖維化及過量黏液產生；囊腫性纖維化；肺纖維化；異位性病症；異位性皮炎；蕁麻疹；濕疹；過敏性鼻炎；過敏性腸胃炎；皮膚之發炎性及/或自體免疫性病況；胃腸器官之發炎性及/或自體免疫性病況；發炎性腸病(IBD)；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病；肝臟之發炎性及/或自體免疫性病況；肝硬化；肝纖維化；由B型及/或C型肝炎病毒所引起之肝纖維化；硬皮病；腫瘤或癌症；肝細胞癌；神經膠母細胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；病毒感染； 細菌感染；寄生蟲感染；HTLV-1感染；抑止保護性1型免疫反應之表現及在疫苗接種期間抑止保護性1型免疫反應之表現。
在另一其他實施例中，病症係選自自體免疫性或發炎性疾病、諸如全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、類肉瘤病、發炎性關節炎、包括(但不限於)幼年型關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、萊特爾氏症候群(Reiter's syndrome)、僵直性脊椎炎及痛風性關節炎、器官或組織移植之排斥反應、超急性、急性或慢性排斥反應及/或移植物抗宿主疾病、多發性硬化症、高IgE症候群、結節性多動脈炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、克羅恩氏病、腹腔疾病(麩質敏感性腸病)、自體免疫性肝炎、惡性貧血、自體免疫性溶血性貧血、牛皮癬、硬皮病、重症肌無力、自體免疫性血小板減少性紫癲、自體免疫甲狀腺炎、格雷氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hasimoto's thyroiditis)、免疫複合性疾病、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、多發性肌炎及皮肌炎、冷凝球蛋白血症、血栓溶解、心肌症、尋常天疱瘡、肺間質纖維化、類肉瘤病、I型及II型糖尿病、1、2、3及4型遲發型過敏、過敏或過敏性病症、對治療蛋白之非吾人所樂見/非預期免疫反應、哮喘、徹奇-斯全司症候群(Churg-Strauss syndrome)(過敏性肉芽腫病)、異位性皮炎、過敏性及刺激性接觸性皮炎、蕁麻疹、IgE介導之過敏、動脈粥樣硬化、血管炎、特發性發炎性肌病、溶血性疾病、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、休格連氏病及牛皮癬。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療發炎性腸病(IBD)。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療潰瘍性結腸炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如 Ab102)係用於治療克羅恩氏病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療全身性紅斑性狼瘡症(SLE)。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療類肉瘤病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療幼年型關節炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療類風濕性關節炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療牛皮癬性關節炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療僵直性脊椎炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療化膿性汗腺炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療眼色素層炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療休格連氏病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療牛皮癬。
在另一其他實施例中，抗體或其抗原結合片段係藉由至少一種選自以下之模式投與：非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎 內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、推注、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內及經皮。
在其他某些實施例中，本發明之特徵亦在於一種藉由免疫分析判定測試樣品中CD40或其片段之存在情況的方法，其中免疫分析包含使測試樣品與至少一種本文所述之態樣及實施例中之任一者之抗體或其抗原結合部分及至少一種可偵測標記接觸。在另一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：(i)使測試樣品與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中該抗體或其抗原結合部分結合至CD40或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使複合物與至少一種可偵測標記接觸，其中可偵測標記結合至第一複合物上或CD40或其片段上未與抗體或其抗原結合部分結合之抗原決定基，從而形成第二複合物；及(iii)基於由第二複合物中之可偵測標記產生之信號偵測測試樣品中CD40或其片段的存在情況，其中CD40或其片段之存在情況與由可偵測標記產生之信號直接相關。在另一相關實施例中，該方法進一步包含以下步驟：(i)使測試樣品與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中抗體或其抗原結合部分結合至CD40或其片段上之抗原決定基，從而形成第一複合物；(ii)使複合物與至少一種可偵測標記接觸，其中可偵測標記與CD40或其片段競爭結合至抗體或其抗原結合部分，從而形成第二複合物；及(iii)基於由第二複合物中之可偵測標記產生之信號偵測測試樣品中CD40或其片段之存在情況，其中CD40或其片段之存在情況與由可偵測標記產生之信號間接相關。
在一個實施例中，本發明提供一種DVD-Ig，其包含本文所述之結合區，例如CDR。在一個實施例中，本發明之DVD-Ig包含四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一重鏈可變域，VD2為第二重鏈可變域，C為重鏈恆定域，X1為連接子，但必須不為CH1，且X2為Fc區；且兩條多肽鏈包含VD1-(X1)n- VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一輕鏈可變域，VD2為第二輕鏈可變域，C為輕鏈恆定域，X1為連接子，但必須不為CH1，且X2不包含Fc區；且n為0或1；其中該結合蛋白之該四條多肽鏈形成四個功能性抗原結合位點。在一個實施例中，DVD之第一(及/或第二)重鏈包含如SEQ ID NO：6、42及8中所闡述之CDR組。在一個實施例中，第一(及/或第二)輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：21、11及12中所闡述之CDR組。在一個實施例中，本發明之DVD-Ig為單特異性的且結合huCD40。在另一實施例中，本發明之DVD-Ig為多特異性的且結合CD40及第二分子目標。
圖1A以圖形方式描繪嵌合抗體(抗體1(Ab1))對比促效劑對照及已知拮抗性抗體(4D11(Astellas)及Bib(Boehringer))的拮抗活性。圖1B以圖形方式描繪與圖1A中相同的嵌合抗體Ab1在使用與圖1A中相同的促效劑及拮抗劑對照之促效性分析中的活性。
圖2以圖形方式描繪人類化抗體Ab101對比抗體4D11、抗體Blb、IgG抗體(對照)及促效性對照抗體(2141)之促效活性(圖2A)及拮抗活性(圖2B)。
圖3以圖形方式描繪人類化抗體Ab101之活體內研究的結果。圖3A以圖形方式描繪已接受人類PBMC以及Ig對照、CTLA4-Ig融合體或Ab101抗體之huscid小鼠中之IgG產量。圖3B以圖形方式描繪已投與與圖3A中相同之藥劑之相同小鼠模型中之B細胞存活率。
圖4顯示抗人類CD40鼠抗體拮抗劑之胺基酸序列比對及比對所得之共同序列。圖4A顯示抗體3(Ab3)(SEQ ID NO：48)、Ab1(SEQ ID NO：9)及抗體2(Ab2)(SEQ ID NO：76)之可變輕鏈之序列比對及可變輕鏈共同序列(SEQ ID NO：116)。圖4B顯示Ab3(SEQ ID NO：44)、Ab1(SEQ ID NO：5)及Ab2(SEQ ID NO：75)之可變重鏈之序列比對及 可變重鏈共同序列(SEQ ID NO：117)。
圖5A及圖5B以圖形方式描繪在實例7中所述之單核細胞活化分析中Ab102對人類CD40之代表性中和效能(拮抗活性)(圖5A)及促效活性(圖5B)。在各分析中，單核細胞活化與TNF濃度增加一致。
圖6以圖形方式描繪在預防性投與抗體138(Ab138)之情況下內視鏡檢評分之劑量反應性抑制。以15、5、1.5及0.5mg/kg之劑量測試抗體138。使用IgG陰性對照。抗p40IL-12/23處理用作陽性對照。疾病藉由轉移至動物之CD45Rbhi細胞介導。RB低係指陰性對照組。CD45RB低細胞不介導疾病。
圖7以圖形方式描繪用於測定投與抗體138(Ab138)後結腸中之IBA1+巨噬細胞之免疫組織化學分析的結果。結腸切片之組織學分析顯示巨噬細胞減少(通常量測炎症)。使用IgG陰性對照。抗p40IL-12/23處理用作陽性對照。
圖8以圖形方式描繪在結腸炎之T細胞轉移模型中在最後一次給藥後96小時循環抗體138(Ab138)之血清含量(等於C低谷)。血清含量顯示具有劑量反應性。抗p40IL-12/23處理用作陽性對照。在0.5mg/kg組中僅1隻動物具有可量測之Ab138含量。
圖9A以圖形方式描繪在結腸炎小鼠模型中投與抗體138後之內視鏡檢結果。在內視鏡檢證實有疾病之後，在細胞注射後三週起始抗體138(Ab138)處理，且注意到MEDAI總評分之劑量反應性抑制。最高劑量(15mg/kg)達至統計顯著性(圖9A)。
圖9B以圖形方式描繪在投與抗體138後之組織學結果。結腸中之IBA1+巨噬細胞之組織學分析以骨髓發炎之量測結果示出在圖9B中。
圖10以圖形方式描繪結果，其顯示，相比於僅用媒劑處理之對照動物(實線)，Ab102抑止抗KLH IgM及抗KLH IgG(虛線)。以0(僅媒劑)或10mg/kg之劑量向食蟹獼猴(兩隻/性別/組)皮下(SC)投與Ab102， 持續5週。在第8天，給所有動物投與匙孔螺血氰蛋白(Keyhole limpet hemocyanin；KLH)。在相對於KLH投與第-11天、第-7天、第0天、第4天、第7天、第10天、第14天及第21天(KLH天數)自各動物收集血清樣品。
圖11A為顯示在MRL/lpr小鼠中抗CD40抗體138處理預防蛋白尿之圖。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)媒劑用作對照。按<300mg/dL之尿蛋白的百分比測定蛋白尿。
圖11B為描繪結果之圖，其顯示抗CD40抗體138處理延長了MRL/lpr小鼠之存活期。給予動物15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與媒劑用作對照。示出隨時間推移之存活百分比。
圖12A為描繪結果之圖，其顯示抗CD40抗體138處理預防腎炎發展。圖12A顯示在給予了15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週之小鼠中，在第29天及第60天，抗體138對腎小球疾病之作用。單獨投與PBS媒劑用作對照。按照0至4之等級評定腎小球疾病。隨著不斷變老的MRL小鼠中腎小球疾病之嚴重程度加劇，5及15mg/kg抗體138維持功效，使腎小球疾病降到最低。基於以下準則，按等級0-4給血管周發炎評分：0，至多一些稀有淋巴細胞；1，一些淋巴細胞形成鬆散的聚集體；2，淋巴細胞形成離散的小聚集體；3，淋巴細胞極化聚集，膨脹至鄰近靜脈腔中，但未能完全包圍弓形動脈；4，淋巴細胞完全聚集在弓形動脈周圍且延伸至弓形動脈之外膜中。
圖12B為描繪結果之圖，其顯示抗CD40抗體處理預防腎炎發展。圖12B描繪結果，其顯示在給予了15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週之小鼠中，在第29天 及第60天，抗體138對腎血管周(PV)發炎之作用。單獨投與PBS媒劑用作對照。在29天及60天時，5及15mg/kg之抗CD40抗體可有效減少腎臟中之血管周(PV)浸潤。
圖12C為顯示抗CD40抗體138處理預防腎炎發展之圖。圖12C顯示在給予了15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週之小鼠中，在第29天及第60天時，抗體138對小管間質性發炎(TI)之作用。單獨投與PBS媒劑用作對照。在疾病早期，TI降低。
圖13A為顯示抗CD40抗體138處理預防唾液腺發炎之圖。圖13A顯示在給予了15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週之小鼠中，在第29天及第60天，抗體138對唾液腺發炎之作用。單獨投與PBS媒劑用作對照。基於以下準則，按等級0-4給導管周圍發炎評分：0，至多一些稀有白血球；1，一些白血球形成鬆散的聚集體；2，白血球形成離散的小聚集體；3，白血球極化聚集，完全包圍導管；4，白血球聚集，延伸至唾液腺之腺實質中。
圖13B為顯示抗CD40抗體138處理預防關節發炎之圖。圖13B顯示在給予了15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週之小鼠中，在第29天及第60天，抗體138對關節發炎之作用。單獨投與PBS媒劑用作對照。基於以下準則，按照0-4之等級給每小鼠兩個腳爪中之每一個的關節發炎評分：0，無發炎；1，在關節間隙中有一些白血球；2，在關節間隙內常見白血球，且有輕度滑膜增生；3，白血球膨脹至關節間隙中，且有中等滑膜增生；4，白血球及滑膜增生，延伸且聚結在關節間隙內，具有顯著的骨侵蝕及/或骨增生。每隻小鼠之評分相加所得的可能總評分為8。
圖14為一組四副圖(i-iv)，其顯示抗CD40抗體138預防脾臟中之 濾泡性輔助T細胞(Tfh)及生發中心(GC)B細胞之膨脹，如藉由流動式細胞測量術所測定。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。圖(i)顯示在第29天脾臟中之Tfh細胞之數目。圖(ii)顯示在第63天脾臟中之Tfh細胞之數目。圖(iii)顯示在第29天脾臟中之GCB細胞之數目。圖(iv)顯示在第63天脾臟中之GCB細胞之數目。
圖15A為顯示抗CD40抗體138處理預防第29天之總循環IgG含量增加之圖。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週及15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。
圖15B為顯示抗CD40抗體138處理預防第63天之總循環IgG含量增加之圖。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週及15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。
圖16A為顯示在第29天抗CD40抗體138處理對抗雙股DNA(抗dsDNA)效價之影響的圖。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。在第29天，測定抗dsDNA效價。
圖16B為顯示在第63天抗CD40抗體138處理針對抗雙股DNA(抗dsDNA)效價之圖。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、5mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。在第63天，測定抗dsDNA效價。
圖17A為顯示預防性給予抗CD40抗體138預防蛋白尿之圖。在26週齡小鼠中開始預防性治療，且該研究排除蛋白尿小鼠。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。按<300mg/dL之尿蛋白的百分比測定蛋白尿。
圖17B為顯示使用SLE小鼠模型，預防性給予抗CD40抗體138延長存活期之圖。在26週齡小鼠中開始預防性治療，且該研究排除蛋白 尿小鼠。給予小鼠15mg/kg抗體2×/週、1.5mg/kg抗體2×/週或15mg/kg抗體1×/週。單獨投與PBS媒劑用作對照。評定直至36週齡之存活百分比。
圖18A為顯示經抗體138以15mg/kg之劑量腹膜內處理2×/週之小鼠隨時間推移產生低蛋白尿之圖，如藉由尿蛋白級別(mg/dL當量)所示。腹膜內投與媒劑PBS，2×/週，用作對照。以10mg/kg之劑量經口(PO)給予潑尼松龍，一天一次(SID)。未經媒劑PBS處理之對照小鼠及經潑尼松龍處理之小鼠均未產生低蛋白尿。指定蛋白尿之臨限值為300mg/dL。
圖18B為顯示經抗體138以15mg/kp之劑量腹膜內處理2×/週之小鼠自蛋白尿恢復之速率的圖。基於如藉由正常尿蛋白百分比所測定之自蛋白尿恢復之速率，自蛋白尿恢復之平均時間為23±7天。腹膜內投與媒劑PBS，2×/週，用作對照。以10mg/kg之劑量經口(PO)給予潑尼松龍，一天一次(SID)。
圖18C為顯示經抗CD40抗體138以15mg/kp之劑量腹膜內處理2×/週之小鼠的存活期顯著延長的圖，如藉由存活百分比所示。腹膜內投與媒劑PBS，2×/週，用作對照。經口(PO)給予潑尼松龍，一天一次(SID)。
圖19A為顯示藉由用抗體138以15mg/kp IP 2×/週、1.5mg/kg 2×/週、15mg/kg 1×/週之劑量預防性治療來保存唾液產量的圖。媒劑PBS用作對照。以10mg/kg之劑量投與潑尼松龍。7週齡NZBWF-1小鼠(其為未患病的較年幼的小鼠)之唾液產量用作進一步比較。測定唾液量(mg)。經抗CD40處理之小鼠的唾液產量相對均一。
圖19B為顯示藉由用抗CD40抗體138以15mg/kp IP 2×/週、1.5mg/kg 2×/週、15mg/kg1×/週之劑量預防性治療來保存唾液量的圖。媒劑PBS用作對照。以10mg/kg之劑量投與潑尼松龍。測定唾液量/體 重(mg/gm)。經抗CD40抗體處理之小鼠的唾液產量顯著大於未經處理之對照小鼠。
圖20A為顯示藉由用抗CD40抗體138以15mg/kg之劑量治療性治療來保存唾液產量的圖。以10mg/kg之劑量投與潑尼松龍。11週齡小鼠之唾液產量用作進一步比較。測定唾液量(mg)。
圖20B為顯示藉由用抗CD40抗體138以15mg/kg之劑量治療性治療來保存唾液產量的圖。以10mg/kg之劑量投與潑尼松龍。11週齡小鼠之唾液產量用作進一步比較。測定唾液量/體重(mg/gm)。
本發明係關於拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分及其用途。本發明之各種態樣係關於抗體及抗體片段及其醫藥組合物以及用於製造此類抗體及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明抗體偵測人類CD40、活體外或活體內抑制人類CD40/CD40L活性及預防或治療諸如慢性發炎性疾病及克羅恩氏病之疾病或病症的方法。
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般技術者通常理解之含義。術語之含義及範疇應為清楚的，然而，在任何潛在不明確性之情況下，本文所提供之定義優先於任何字典或外部定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式的使用不具限制性。此外，除非另外具體說明，否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋包含一個單元之元件及組件以及包含一個以上子單元之元件及組件兩者。
一般而言，本文中所描述之結合細胞及組織培養、分子生物 學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交使用的命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般性及較特定提及中所描述來進行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文中所述來進行。本文中所述之結合分析化學、合成有機化學及藥物與醫藥化學使用的命名法及其實驗室程序及技術為在此項技術中熟知且常用者。關於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞及患者治療，使用標準技術。
為較容易地理解本發明，下文對所選術語加以定義。
如本文所用之術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合的。
術語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」為如下蛋白質或多肽：根據其來源或衍生源而不與其在天然狀態中所伴隨的天然結合組分結合；基本上不含來自同一物種之其他蛋白質；由來自不同物種之細胞表現；或在自然界中不存在。因此，化學合成或在不同於其天然來源的細胞之細胞系統中合成之多肽將與其天然結合組分「分離」。蛋白質亦可藉由使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離而使得基本上不含天然結合組分。經分離多肽之實例為經分離抗體或其抗原結合部分。
如本文所用之術語「回收」係指藉由例如使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離，使得諸如多肽之化學物質基本上不含天然結合組分之過程。
如本文所用之術語「人類CD40」及「人類CD40野生型」(本文 中簡寫為hCD40，hCD40wt)係指I型跨膜蛋白。在一個實施例中，術語人類CD40意欲包括重組人類CD40(rhCD40)，其可以藉由標準重組表現方法製備。表1提供人類CD40之胺基酸序列(亦即，SEQ ID NO.1)及其細胞外域之胺基酸序列(亦即，SEQ ID NO：107)，其為此項技術中已知的。
Figure 105116748-A0305-02-0026-1
如本文所用之「生物活性」係指CD40受體之所有固有生物特性。CD40之生物特性包括(但不限於)結合CD40L；參與B細胞發育；參與淋巴細胞活化；參與抗原呈現細胞功能；調控樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞之活性；誘導在巨噬細胞及樹突狀細胞中產生發炎性細胞介素；上調抗原呈現；上調T細胞刺激；及促進B細胞中之免疫球蛋白類別轉換。
如本文關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之相互作用所用之術語「特異性結合」或「特異性地結合」意謂該相互作用視化學物質上特定結構(例如，抗原決定子或抗原決定基)之存在而定；舉例而言，抗體識別且結合至特定蛋白質結構而非一般性地結合至蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記「A」及該抗體之反應中，含抗原決定基A(或未經標記之游離A)之分子的存在將減少結合至該抗體之經標記A的量。
如本文所用之術語「促效劑」係指當與相關分子(例如CD40)接 觸時，導致該分子之某一活性或功能之量值相比於在不存在促效劑的情況下所觀測到之活性或功能之量值增加的調節劑。
如本文所用之術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指當與相關分子接觸時，導致該分子之某一活性或功能之量值相比於在不存在拮抗劑的情況下所觀測到之活性或功能之量值減小的調節劑。具體的相關拮抗劑包括阻斷或調節人類CD40(hCD40)之生物或免疫活性之彼等拮抗劑。hCD40之拮抗性抗體可以例如抑制與CD40L一起培養(或暴露於CD40L)之初級人類B細胞(諸如將B細胞與表現CD40L之人類T細胞一起培養)之CD86上調。在一個實施例中，基本上不含促效活性之拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分定義為在促效性分析中，諸如實例7中所述之促效性單核細胞分析，活性水準相對於陰性對照等於一個標準差或在一個標準差之內。
本發明之抗體或其抗原結合部分為拮抗性抗體或其抗原結合部分，其造成CD40活性或功能相比於在不存在該抗體或其抗原結合部分之情況下的CD40活性或功能降低。在特定實施例中，該抗體或其抗原結合部分基本上不含促效活性，亦即該抗體或其抗原結合部分不會造成CD40活性或功能之量值相比於在不存在該抗體或其抗原結合部分之情況下的CD40活性或功能增加。促效活性及拮抗活性亦可使用此項技術中已知之方法評定，例如使用與NFkB介導之鹼性磷酸酶(AP)相關之表現CD40之報導細胞株表現人類CD40或B細胞分析。此外，在一個實施例中，促效活性及拮抗活性可以使用實例7中所述之活體外單核細胞促效性及拮抗性分析評定。
術語「抑制與CD40L之結合」係指抗體或其抗原結合片段防止CD40與配體CD40L結合之能力。如此抑制與CD40L之結合將導致降低或消除由CD40與CD40L之結合介導的生物活性。
如本文廣泛使用之術語「抗體」係指由四條多肽鏈(兩條重(H)鏈 及兩條輕(L)鏈)構成，保留免疫球蛋白(Ig)分子之主要抗原決定基結合特徵的任何Ig分子或其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。此類突變體、變異體或衍生物抗體形式在此項技術中已知。其非限制性實施例於下文加以論述。
在全長抗體中，各重鏈由重鏈可變區(本文中簡寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個域(CH1、CH2及CH3)構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中簡寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「抗體片段」)係指抗體中保留與抗原(例如hCD40)特異性結合之能力的一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。此類抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；特異性結合至兩個或兩個以上不同抗原。術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含兩個藉由鉸鏈區之二硫橋鍵連接之Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546；Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1，其以引用的方式併入本文中)，其包含單一可變域；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由 各別基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子連接，合成連接子能夠將其製造成VL與VH區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域在單一多肽鏈上表現，但使用過短以致於不允許同一條鏈上之兩個結構域之間進行配對的連接子，由此迫使該等結構域與另一條鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。該等抗體結合部分為此項技術中已知的(Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5))。
如本文所用之術語「抗體構築體」係指包含一或多個本發明之抗原結合部分連接至連接子多肽或免疫球蛋白恆定域的多肽。連接子多肽包含兩個或兩個以上藉由肽鍵連接之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接子多肽為此項技術中熟知的(參見例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中已知的且呈現於表2中。
Figure 105116748-A0305-02-0030-2
再者，抗體或其抗原結合部分可為藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價結合而形成的較大免疫黏附分子之一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製造四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1995)Human Antibodies and Hybriddmas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標誌肽及C端聚組胺酸標籤製造二價且生物素化之scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分可使用習知技術，諸如對全抗體分別進行木瓜酶或胃蛋白酶消化，由全抗體製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附分子可使用如本文中所述之標準重組DNA技術獲得。
如本文所用之「經分離抗體」意欲指基本上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合hCD40之經分離抗體基本上不含特異性結合除hCD40以外之抗原的抗體)。然而，特異性結 合hCD40之經分離抗體可以與其他抗原，諸如來自其他物種之CD40分子具有交叉反應性。另外，經分離抗體可以基本上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有鼠重鏈及輕鏈可變區連接至人類恆定區之抗體。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但VH及/或VL之CDR區中之一或多者之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有鼠重鏈及輕鏈可變區，其中鼠CDR中之一或多者(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之抗體。
術語「Kabat編號」、「Kabat界定」及「Kabat標記」在本文中可互換地使用。此等術語為此項技術中公認的，係指給比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基可變(亦即，高變)之胺基酸殘基編號的系統(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad,Sci.190：382-391；及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生與人群服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版編號91-3242)。就重鏈可變區而言，高變區範圍就CDR1而言自胺基酸位置31至35，就CDR2而言自胺基酸位置50至65，且就CDR3而言自胺基酸位置95至102。就輕鏈可變區而言，高變區範圍就CDR1而言自胺基酸位置24至34，就CDR2而言自胺基酸位置50至56，且就CDR3而言自胺基酸位置89至97。
如本文所用，術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另 一實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，接受體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不出現於人類抗體之一或多個特定位置之胺基酸殘基。接受體構架區及/或接受體恆定區可例如源自或獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體(例如此項技術中熟知之抗體、處於研發中之抗體或市售抗體)。
如本文所用，術語「CDR」係指在抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈之可變區中各自存在三個CDR，對於各可變區，該等CDR命名為CDR1、CDR2及CDR3。如本文所用之術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中之一組三個CDR。此等CDR之精確邊界已根據不同系統不同地加以限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))所述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確的殘基編號系統，且亦提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))發現，Kabat CDR內之某些子部分採用幾乎相同的肽主鏈構形，即使在胺基酸序列層面具有極大差異。此等子部分稱為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))及MacCallum(J MolBiol 262(5)：732-45(1996))描述。其他CDR邊界界定可不嚴格遵循以上系統中之一者，但仍然將與Kabat CDR重疊，但其可根據特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現而縮短或延長。本文中所用之方法可利用根據此等系統中任一者界定之CDR，但較佳實施例使用Kabat或Chothia界定之CDR。
如本文所用，術語「典型(canonical)」殘基係指CDR或構架中界定如Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227：799(1992)，均以引用的方式併入本文中)所界定的特定典型CDR結構之殘基。根據Chothia等人，多種抗體之CDR之重要部分具有幾乎相同的肽主鏈構形，即使在胺基酸序列層面差異極大。各典型結構主要為形成環之胺基酸殘基之相鄰區段指定一組肽主鏈扭轉角。
如本文所用，術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一個較佳實施例中，供體抗體為來自某一物種之不同於獲得或產生構架區之抗體的抗體。在人類化抗體之情況下，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。
如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR剩餘之序列。因為CDR序列之精確界定可藉由不同系統確定，所以構架序列之含義相對應地需要不同解釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各鏈上分成四個子區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不指定具體子區為FR1、FR2、FR3或FR4的情況下，如藉由其他所提及之框架區表示單一天然產生之免疫球蛋白鏈的可變區內之組合的FR。如本文所用，FR表示四個子區之一，且FRs表示構成構架區之四個子區中之兩者或兩者以上。
人類重鏈及輕鏈接受體序列為此項技術中已知的。在本發明之 一個實施例中，人類重鏈及輕鏈接受體序列係選自表3及表4中所述之序列。
Figure 105116748-A0305-02-0034-3
Figure 105116748-A0305-02-0034-4
Figure 105116748-A0305-02-0035-5
如本文所用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷導致基因重排及突變以表現特定免疫球蛋白之成熟過程的非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列。(參見例如，Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。由本發明之各種實施例所提供之優點之一源自以下認識：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更有可能保留物種中個體之主要胺基酸序列結構特徵，因此當治療上用於彼物種時不大可能被識別為來自外來源。
如本文所用，術語「關鍵」殘基係指可變區內對抗體、尤其人類化抗體之結合特異性及/或親和力影響較大的某些殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下中之一或多者：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點(可為N或O糖基化位點)、稀有殘基、能夠與抗原相互作用之殘基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、游標區內之殘基及在Chothia限定之可變重鏈CDR1與Kabat限定之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。
如本文所用，術語「人類化抗體」為免疫特異性結合至相關抗原(例如人類CD40)且包含基本上具有人類抗體之胺基酸序列的構架(FR)區及基本上具有非人類抗體之胺基酸序列的互補決定區(CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文所用，術語「基本上」在CDR之情況下係指CDR之胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。人類化抗體基本上包含所有至少一個且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR區對應 於非人類免疫球蛋白(亦即，供體抗體)之CDR區且所有或基本上所有構架區為具有人類免疫球蛋白共同序列之構架區。較佳地，人類化抗體亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及重鏈之至少可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變域。
人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；及任何同型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可以包含來自一種以上類別或同型之序列，且可以使用此項技術中熟知的技術選擇特定恆定域以使所需效應功能最佳化。
人類化抗體之構架區及CDR區不必準確對應於親本序列，例如供體抗體CDR或共同構架可藉由至少一個胺基酸殘基之取代、插入及/或缺失而突變誘發，使得該位點之CDR或構架殘基不對應於供體抗體或共同構架。然而，在一個較佳實施例中，該等突變不多。通常，至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%之人類化抗體殘基將對應於親本FR及CDR序列之彼等殘基。如本文所用，術語「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列中之構架區。如本文所用，術語「共同免疫球蛋白序列」係指由相關免疫球蛋白序列家族中最頻繁出現之胺基酸(或核苷酸)形成的序列(參見例如，Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987))。在免疫球蛋白家族中，共同序列中之各位置由該家族中最頻繁出現於該位置之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則共同序列中可包括任一個。
如本文所用，「游標」區係指如Foote及Winter(1992,J.Mol.Biol.224：487-499，其以引用的方式併入本文中)所描述，可調整CDR結構且微調與抗原之合適度的構架殘基子集。游標區殘基形成下伏於CDR之層且可影響CDR結構及抗體親和力。
術語「多價結合蛋白」在本說明書中用於表示包含兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。多價結合蛋白較佳經工程改造以具有三個或三個以上抗原結合位點，且一般不為天然產生之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩個或兩個以上相關或不相關標靶的結合蛋白。
如本文中可互換地使用的術語「雙重可變域」或「DVD」或「DVD-Ig」為包含兩個或兩個以上抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白的抗原結合蛋白。該等DVD可為單特異性的，亦即，能夠結合一個抗原；或多特異性的，亦即，能夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD Ig。DVDIg之每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，且每抗原結合位點在抗原結合時涉及總共6個CDR。在一個實施例中，本文所述之CDR(例如，SEQ ID NO：6、42及8(重鏈)及21、11及12(輕鏈))用於抗CD40 DVD中。DVD-Ig結構之實例為此項技術中已知的且描述於例如美國專利第7,612,181號中，其以引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「中和」係指當抗體或其抗原結合部分特異性結合細胞介素受體時，細胞介素受體之生物活性之中和。較佳地，中和抗體或其抗原結合部分為與hCD40之結合造成hCD40之生物活性抑制的中和抗體。較佳地，中和抗體或其抗原結合部分結合hCD40且使hCD40之生物學活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或85%以上。中和抗體或其抗原結合部分對hCD40之生物活性之抑制可 以藉由量測hCD40生物活性之此項技術中熟知的一或多種指示劑來評定。
術語「活性」包括以下活性：諸如抗體對抗原之結合特異性/親和力，例如結合至hCD40抗原之抗hCD40抗體，及/或抗體之中和效能，例如與hCD40之結合抑制hCD40之生物活性(例如結合CD40L)的抗hCD40抗體；參與B細胞發育；參與淋巴細胞活化；參與抗原呈現細胞功能；調控樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞之活性；誘導在巨噬細胞及樹突狀細胞中產生發炎性細胞介素；上調抗原呈現；上調T細胞刺激；及促進B細胞中之免疫球蛋白類別轉換。
用於評定本發明抗CD40抗體之活性的例示性分析包括如本文所闡述之活體外及活體內分析。特定言之，可使用該等分析來判定抗CD40抗體為促效性抗體抑或拮抗性抗體。
舉例而言，與人類CD40之結合及CD40-CD40L相互作用之抑制可以使用表現人類CD40之細胞株，經由FACS分析進行分析。拮抗活性及促效活性可以使用與NFkB介導之鹼性磷酸酶(AP)相關之表現CD40之報導細胞株表現人類CD40來評定。當經由CD40接收到信號時，NFkB活化導致AP之分泌，其藉由比色受質來量測。作為例示性拮抗性分析，CD40報導細胞株可以與表現CD40L之Jurkat細胞株一起培養(以提供生理配體相互作用)或與可溶性CD40L一起培養，且可以評定抗CD40抗體阻斷NFkB信號之能力。至於例示性促效性分析，可以用抗CD40抗體處理人類CD40報導細胞株且如上所述量測NFkB信號。
或者，可以採用B細胞促效性分析，其中用低劑量抗IgM及IL4活化B細胞，隨後添加CD40拮抗性抗體。B細胞活化之增強可以按CD86之上調來量測，CD86之上調又指示促效活性。類似地，可以採用B細胞拮抗性分析，其中將初級人類B細胞與表現CD40L之人類T細胞株一起培養，表現CD40L之人類T細胞株經由CD40/CD40L相互作用導致 B細胞活化及CD86表現上調。初級人類B細胞之CD86上調之抑制指示拮抗活性。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合至抗體或其抗原結合部分之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。在各種實施例中，抗原決定基可為線性或依序抗原決定基，亦即，胺基酸之線性序列，抗原(亦即，CD40)之一級結構之線性序列。或者，在其他實施例中，抗原決定基可為當抗原呈現其二級結構時具有特定三維形狀之構形抗原決定基。舉例而言，構形抗原決定基可以包含抗原之非線性、亦即非依序胺基酸。
在一個特定實施例中，抗原決定基為抗原中由抗體或其抗原結合部分結合之區域。在某些實施例中，當抗體或其抗原結合部分在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其目標抗原時，稱其特異性結合抗原。
如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。本發明之人類抗體可以包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中且尤其在CDR3中。然而，如本文所用之術語「人類抗體」不意欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
如本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體(進一步描述於下文第II C部分中)；自重組組合性人類抗體文庫分離之抗體(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.及Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.及Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.及Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)；自針對人類免疫球蛋白基因轉殖基因改造的動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.及Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.等人(2000)Immunology Today 21：364-370)；或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列中之任何其他手段製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體經歷活體外突變誘發(或當使用針對人類Ig序列轉殖基因改造之動物時，活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於且係關於人類生殖系VH及VL序列，但可能活體內不天然存在於人類抗體生殖系譜內的序列。一個實施例提供能夠結合人類CD40之完全人類抗體，其可以使用此項技術中熟知的技術產生，諸如(但不限於)使用人類Ig噬菌體文庫，諸如在Jermutus等人之PCT公開案第WO 2005/007699 A2號中所揭示之彼等人類Ig噬菌體文庫。
如本文所用之術語「表面電漿共振」係指允許藉由例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)在生物感測器矩陣內偵測蛋白濃度變化來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。有關進一步說明，參見Jönsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jönsson,U.等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人(1995)J.Mol.Recognit. 8：125-131；及Johnnson,B.等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
如本文所用之術語「kon」意欲指抗體與抗原結合形成如此項技 術中已知之抗體/抗原複合物的結合速率常數。
如本文所用之術語「koff」意欲指抗體自如此項技術中已知之抗體/抗原複合物解離的解離速率常數。
如本文所用之術語「KD」意欲指如此項技術中已知的特定抗體-抗原相互作用之解離常數。
如本文所用之術語「經標記抗體」係指併入有準備鑑別抗體或其抗原結合部分之標記的抗體。較佳地，標記為可偵測標誌物，例如併入經放射性標記之胺基酸或連接至可以藉由帶標誌之抗生物素蛋白(例如，含有可以藉由光學法或比色法偵測之螢光標誌物或酶活性之抗生蛋白鏈菌素)偵測之生物素基部分之多肽。多肽標記之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；螢光標記(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體)、酶標記(例如，辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標誌物；生物素基；由二級報導基因識別之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)；及磁化劑，諸如釓螯合物。
如本文所用之術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為物質之一種固態形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如，抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列組成。此等三維陣列係根據本領域中充分理解之特定數學關係排列。在晶體中重複之基本單元或構建塊稱為不對稱單元。不對稱單元在排列中符合給定的經良好定義的晶體學對稱性之重複提供晶體之「單位晶胞」。單位晶胞在所有三個維度上藉由規律變換(regular translation)重複，得到晶體。參見Giege,R.及Ducruix,A. Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第2版，第201-16頁，Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
如本文所用之術語「聚核苷酸」係指兩種或兩種以上核苷酸(核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一核苷酸類型之修飾形式)的聚合物形式。該術語包括單股及雙股形式之DNA，但較佳為雙股DNA。
如本文所用之術語「經分離聚核苷酸」應意謂如下聚核苷酸(例如具有基因組、cDNA或合成來源或其某種組合)：根據其來源，「經分離聚核苷酸」與自然界中與「經分離聚核苷酸」一起發現的聚核苷酸之全部或一部分不結合；可操作地連接至自然界中不連接的聚核苷酸；或在自然界中不以較大序列之一部分存在。
如本文所用之術語「載體」意欲指能夠轉運其已連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指可將額外DNA區段接合至其中的環形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接合至病毒基因組中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接的基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。由於質體為載體之最常用形式，因而在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括提供等效功能之其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「可操作地連接」係指所描述之組分處於准許其以其預期方式起作用的關係中之併接。「可操作地連接」至編碼序列之控制序 列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下達成的方式接合。「可操作地連接」之序列包括與相關基因相鄰之表現控制序列及以反式起作用或在一定距離起作用以控制相關基因之表現控制序列。如本文所用之術語「表現控制序列」係指實現所接合之編碼序列的表現及加工所需之聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列(亦即科紮克共同序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括其存在對表現及加工而言至關重要之組分，且亦可包括其存在有利之額外組分，例如前導序列及融合搭配物序列。本發明之蛋白質構築體可使用此項技術中已知的表現載體及宿主細胞表現及純化，包括表現卡匣、載體、重組宿主細胞及用於自單一開放閱讀框架重組表現及蛋白水解加工重組聚合蛋白質及前體蛋白(pre-protein)之方法(例如WO 2007/014162，其以引用的方式併入本文中)。
如本文所定義，「轉型」係指外源性DNA藉以進入宿主細胞之任何過程。轉型可在天然或人工條件下使用此項技術中熟知之各種方法進行。轉型可依賴於用於將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法。方法係基於待轉型之宿主細胞來加以選擇且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。此類「轉型」細胞包括所插入之DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體之一部分進行複製的穩定轉型細胞。其亦包括短暫表現所插入之DNA或RNA持續有限時間段之細胞。
如本文所用之術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指已引入外源性DNA之細胞。應瞭解，該等術語不僅意欲指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。因為可能由於突變或環境影響而在隨後幾代中出現某些修飾，所以該等後代實際上可能與親本細胞不一致，但仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」之範疇內。較佳地，宿主細胞包括選自任一生命界之原核及真核細胞。較佳真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。最佳地，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌(E.Coli)；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
可使用標準技術進行重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)。可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述執行酶促反應及純化技術。前述技術及程序一般可根據此項技術中熟知之習知方法及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種一般性及較特定參考文獻中所描述般執行。參見例如Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。
如此項技術中所知及如本文所用，「轉殖基因生物體」係指具有含轉殖基因之細胞的生物體，其中引入生物體(或生物體之祖先)中之轉殖基因表現在生物體中天然地不表現之多肽。「轉殖基因」為DNA構築體，其穩定地且可操作地整合至發展出轉殖基因生物體之細胞的基因組中，引導所編碼之基因產物在轉殖基因生物體之一或多個細胞類型或組織中表現。
術語「調控」及「調節」可互換使用，且如本文所用，係指相關分子之活性(例如，hCD40之生物活性)的變化或更改。調節可為相 關分子之某些活性或功能之量值增加或減小。分子之例示性活性及功能包括(但不限於)結合特徵、酶活性、細胞受體活化及信號轉導。
相應地，如本文所用之術語「調節劑」為能夠改變或更改相關分子之活性或功能(例如hCD40之生物活性)的化合物。舉例而言，調節劑可導致分子之某一活性或功能之量值相比在不存在調節劑之情況下所觀測到之活性或功能之量值增加或減小。在某些實施例中，調節劑為抑制劑，其使分子之至少一種活性或功能之量值減小。例示性抑制劑包括(但不限於)蛋白質、肽、抗體、肽體、碳水化合物或小有機分子。肽體描述於例如WO01/83525中。
如本文所用，術語「有效量」係指療法之足以降低或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；預防病症進展；引起病症消退；預防與病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病症；或增強或改善另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療效果的量。
如本文所用，術語「無反應者(non-responder)」用於指患有IBD(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)，在用TNFα抑制劑治療後其臨床疾病狀態無改善或改善有限或不當(例如，CDAI評分不降低、皮質類固醇之使用不減少)的個體。在一個實施例中，TNF無反應者為患有IBD，在用TNFα抑制劑治療後其克羅恩氏病活動性指數(CDAI)評分未能達成減少100分或100分以上的個體。在一個實施例中，無反應者為患有IBD，在用TNFα抑制劑治療後其克羅恩氏病活動性指數(CDAI)評分未能在特定時間範圍內達成減少100分或100分以上的個體。
I.結合人類CD40(hCD40)之抗體
本發明之一個態樣提供結合CD40、包括人類CD40(hCD40)之拮抗性人類化抗體或其抗原結合部分。本發明之其他實施例包括結合至 CD40之鼠單株抗體或其抗原結合部分，以及包含本文所述之抗CD40鼠抗體之可變區的嵌合抗體。較佳地，本發明抗體為不具有顯著促效活性之拮抗性抗CD40(例如，抗人類CD40)抗體。
1.衍生自抗體1(Ab1)之人類化抗hCD40拮抗性抗體
本發明至少部分地基於對具有拮抗特徵且在某些實施例中基本上不具有促效活性之人類化抗CD40抗體的鑑別。
如實例1中所描述，鑑別三種拮抗性抗hCD40鼠抗體，亦即Ab1(SEQ ID NO：9中所述之VL序列及SEQ ID NO：5中所述之VH序列)、Ab2(SEQ ID NO：76中所述之VL序列及SEQ ID NO：75中所述之VH序列)及Ab3(SEQ ID NO：48中所述之VL序列及SEQ ID NO：44中所述之VH序列)。
基於鼠拮抗性抗體Ab1、Ab2及Ab3之CDR胺基酸序列之比對確定共同CDR序列。VH CDR1、CDR2及CDR3區之共同胺基酸序列分別描述於SEQ ID NO：78、79及80中，且VL CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之共同胺基酸序列分別描述於SEQ ID NO：108、109及110中。所有序列亦描述於下表5及圖4中。
Figure 105116748-A0305-02-0046-6
重鏈CDR1域之共同胺基酸序列如SEQ ID NO：78(G(F/Y)TF(S/T)(D/S)Y(G/T)M(N/H))所闡述。可變重鏈CDR2域之共同 胺基酸序列如SEQ ID NO：79(YI(S/N)(S/P)(G/S)(R/S)(D/S/G)(N/Y)(I/P)(Y/N)Y(A/N)(D/Q)(T/K)(V/F)K(G/D))所闡述。可變重鏈CDR3域之共同胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：80((S/W)(W/G)(G/Y)(Y/S)FDV)中。
可變輕鏈CDR1域之共同胺基酸序列如SEQ ID NO：108((K/R)SS(Q/K)SLL(N/H)S(G/-)N(Q/G)(K/N)(N/T)YL(T/Y))所闡述。可變輕鏈CDR2域之共同胺基酸序列如SEQ ID NO：109((W/R)(A/M)ST(R/L)(E/A)S)所闡述。可變輕鏈CDR3域之共同胺基酸序列如SEQ ID NO：110((Q/M)(N/Q)(D/H)(Y/L)(T/E)YPLT)所闡述。
在一個實施例中，本發明提供一種抗CD40拮抗性抗體或其抗原結合部分，其包含可變輕鏈，該可變輕鏈包含具有SEQ ID NO：108之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：109之胺基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：110之胺基酸序列的CDR3；且包含可變重鏈，該可變重鏈包含具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的CDR3。
在鑑別鼠抗體Ab1、Ab2及Ab3之後，選擇抗體Ab1及Ab3進行人類化(描述於下文實例2中)。表11及表12分別提供人類化Ab1及Ab3之CDR、VH及VL區的胺基酸序列。特定言之，基於Ab3產生九種不同的人類化抗體(參見下文實例2及表12)。亦基於Ab1產生四種不同的人類化抗體，包括以下：A)huAb1VH.1/VL.1(如SEQ ID NO：13所闡述之VH胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：6、7及8所闡述之VH CDR1、CDR2及CDR3序列；及如SEQ ID NO：14所闡述之VL胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：10、11及12所闡述之VL CDR1、CDR2及CDR3序列)；B)huAb1VH.1A/VL.1(如SEQ ID NO：15所闡述之VH胺基酸序 列及分別如SEQ ID NO：6、7及8所闡述之VH CDR1、CDR2及CDR3序列；及如SEQ ID NO：14所闡述之VL胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：10、11及12所闡述之VL CDR1、CDR2及CDR3序列)；C)huAb1VH.1/VL.1A(如SEQ ID NO：13所闡述之VH胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：6、7及8所闡述之VH CDR1、CDR2及CDR3序列；及如SEQ ID NO：16所闡述之VL胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：10、11及12所闡述之VL CDR1、CDR2及CDR3序列)；及D)huAb1VH.1A/VL.1A(如SEQ ID NO：15所闡述之VH胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：6、7及8所闡述之VH CDR1、CDR2及CDR3序列；及如SEQ ID NO：16所闡述之VL胺基酸序列及分別如SEQ ID NO：10、11及12所闡述之VL CDR1、CDR2及CDR3序列)。
進一步修飾Ab1之人類化版本以移除輕鏈CDR1中之潛在脫醯胺位點。分析六個變異huAb1抗體，且該等抗體中之四個經鑑別為CD40之拮抗劑。六個抗體在此稱為Ab1v1、Ab1v2、Ab1v3、Ab1v4、Ab1v5及Ab1v6(CDR及可變序列提供於下表13中)。在六個人類化Ab1變異體中，選擇huAb1v1，因為具有尤其優異的拮抗活性。huAb1v1之重鏈可變序列提供於SEQ ID NO：15中，且CDR1、CDR2及CDR3序列分別描述於SEQ ID NO：6、7及8中。huAb1v1之輕鏈可變序列提供於SEQ ID NO：20中，且CDR1、CDR2及CDR3序列分別描述於SEQ ID NO：21、11及12中。
進一步突變誘發抗體huAb1v1之重鏈CDR2，產生十七種變異體(描述於下文實例4中)。此等huAb1v1重鏈CDR2變異體在本文中稱為huAb1v1CDR2v1至huAb1v1CDR2v17。huAb1v1CDR2v1至huAb1v1CDR2v17重鏈之序列提供於表16中，其中選擇VH huAb1v1CDR2v7作為針對CD40具有尤其優異的拮抗活性，同時仍然相對不含促效活性的純系。huAb1v1CDR2v7之重鏈可變序列提供於 SEQ ID NO：28中，且CDR1、CDR2及CDR3序列分別描述於SEQ ID NO：6、42及8中。
在選擇huAb1v1CDR2v7 VH(SEQ ID NO：28之VH及分別在SEQ ID NO：6、42及8中所述之CDR1、CDR2及CDR3序列)及huAb1v1 VL(SEQ ID NO：20之VL及分別在SEQ ID NO：21、11及12中所述之CDR1、CDR2及CDR3序列)之後，將可變區選殖至兩個不同的IgG背景中，產生兩個抗CD40拮抗性抗體，亦即Ab101及Ab102。表6(及表19)提供與此等IgG抗體有關之本發明特定實施例的全長重鏈及輕鏈序列。在表6中，恆定區加底線且CDR域呈粗體。
Figure 105116748-A0305-02-0049-8
因此，在一個實施例中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體 (Ab101)，其包含具有如SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈及具有如SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在一個替代實施例中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體(Ab102)，其包含具有如SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈及具有如SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的重鏈。
因此，本發明包括具有拮抗活性之鼠、嵌合及人類化抗CD40抗體。在某些實施例中，本發明提供一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包括具有含有如SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3的輕鏈可變區及/或具有含有如SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3的重鏈可變區。在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有如SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR2、具有如SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈CDR3、具有如SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR2及具有如SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR3。在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括具有SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變域及具有SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一個實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括具有SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括具有SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。
本發明中包括具有表5、6、11、12、13、14、16、17、18及19中所述之胺基酸序列(可變或CDR)的抗體。因此，在一個態樣中，本發 明係關於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其具有輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：10、17、19或21中所闡述之胺基酸序列的CDR1；(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2；及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3。可替代地或呈組合形式，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括重鏈可變區，該重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1；(b)具有如SEQ ID NO：7或42中所闡述之胺基酸序列的CDR2；及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺 基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：108中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：109中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：110中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包含(a)具有如SEQ ID NO：78中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：79中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：80中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在本發明之又另一態樣中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部 分包含：包括如SEQ ID NO：5、13、15或22-38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或包括如SEQ ID NO：9、14、16、18、20或43中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：5中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：14、16或18中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：14、16、18、20或43中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
本文所述之抗體、尤其抗體Ab102對CD40具有拮抗活性，基本上無促效活性。因此，在本發明中包括結合至由抗體Ab102及Ab101識別之抗原決定基的抗體。在一個特定實施例中，本發明包括一種經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類CD40，使得含有結合至由SEQ ID NO：1之拓樸區Cys62-Phe67、Gln79-Cys83、Arg90-Thr99及Thr24-Cys37界定之抗原決定基的該抗體或其抗原結合片段的CD40與CD40配體(CD40L)之結合遭到抑制。在另一態樣中，本發明係關於一種能夠結合人類CD40之抗體或其抗原結合片段，其結合至人類CD40中之如下抗原決定基：其包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基Cys62-Phe67(Cys62、Gly63、Glu64、Ser65、 Glu66、Phe67)、Gln79-Cys83(Gln79、His80、Lys81、Tyr82、Cys83)、Arg90-Thr99(Arg90、Val91、Gln92、Gln93、Lys94、Gly95、Thr96、Ser97、Glu98及Thr99)及Thr24-Cys37(Thr24、Ala25、Cys26、Arg27、Glu28、Lys29、Gln30、Tyr31、Leu32、Ile33、Asn34、Ser35、Gln36、Cys37)中之三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二、二十三、二十四、二十五、二十六、二十七、二十八、二十九、三十、三十一、三十二、三十三、三十四個或所有。
在另一實施例中，本發明提供對CD40具有拮抗活性之重鏈CDR2區。特定言之，VH CDR2胺基酸序列YISSGRXNIYYADTVKG(SEQ ID NO：112)之殘基55(殘基X)已經鑑別為在相對於具有殘基S55之親本CDR2序列增加抗體之拮抗活性方面起作用。在HC CDR2之位置55處之殘基Thr、Asp、Val、Leu、Ile及Met導致相對於在位置55處之其他胺基酸而言，拮抗活性水準降低。在一個實施例中，本發明提供一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其包含：包含具有SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2的重鏈可變區及包含具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之CDR2的輕鏈可變區。可變重抗體鏈及輕抗體鏈中可與SEQ ID NO：111組合之CDR1及CDR3域胺基酸序列在全篇中均有描述，包括例如表13及表18。
在另一實施例中，本發明提供具有經鑑別為拮抗劑/促效劑開關之殘基的輕鏈CDR1區。如下文實例3中所述，VL CDR1區KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：10)在殘基「S」處之「NS」基元的修飾會引起拮抗性抗體切換至促效性抗體。因此，在一個實施例中，本發明包括一種具有CDR1 VL區之拮抗性抗CD40抗體，其包含SEQ ID NO：113(KSSQSLLNXGNQKNYLT；其中X不為胺基酸殘基 Pro)。
本文中之術語「競爭性抗體」係指任何數目之靶向同一分子或穩定但非共價連接之超分子實體、較佳同一分子(亦即CD40)的抗體，其中至少一者能夠特異性降低另一者之可量測結合，較佳地藉由在空間上妨礙其他抗體對其目標抗原決定基(如上所述)之獲取或藉由在目標實體中誘導及/或穩定降低目標對其他抗體之親和力的構形，更佳地藉由結合至與前者足夠靠近、與前者重疊或與前者相同的抗原決定基而直接阻斷對其他目標抗原決定基之獲取，最佳地重疊或相同，尤其相同。在本文中，若兩個抗原決定基共用其化學結構、較佳其胺基酸序列之一部分，則稱其「重疊」；且若其化學結構、較佳其胺基酸序列相同，則稱其「相同」。
在特定實施例中，競爭性抗體或其抗原結合部分為與本文所提出之抗體中之任一者相競爭的抗體或其抗原結合部分。在一個實施例中，本發明提供一種競爭性抗體，其可以與本文所述之抗體(例如，Ab101或Ab102)競爭且結合至人類CD40之拓樸抗原決定基(topographical epitope)，包括殘基Cys62-Phe67、Gln79-Cys83、Arg90-Thr99及Thr24-Cys37。
在特定實施例中，促效性抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，重鏈可變區包括(a)具有SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3；輕鏈可變區輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：74中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在其他特定實施例中，促效性抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，重鏈可變區包括(a)具有SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的 CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3；輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在其他實施例中，促效性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含：包括如SEQ ID NO：15或13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或包括如SEQ ID NO：77或43中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
2.衍生自抗體3(Ab3)之人類化抗CD40抗體
下表11中提供用於鼠Ab3之重鏈及輕鏈之人類化版本的胺基酸序列。因此，本發明之特徵進一步在於包含來自抗體3(Ab3)之可變及/或CDR序列之抗體。
在一個態樣中，本發明提供一種人類化抗體或其抗原結合部分，其包括輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其具有輕鏈可變區，該輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的CDR1；(b)具有如SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的CDR2；及(c)具有SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的CDR3。可替代地或呈組合形式，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括重鏈可變區，該重鏈可變區包括(a)具有 如SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的CDR1；(b)具有如SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的CDR2；及(c)具有SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的CDR3。
在本發明之又另一態樣中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包含：包括如SEQ ID NO：44、52、54或55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區；及/或包括如SEQ ID NO：48、53、56或57中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：53、56或57中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：54中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：53、56或57中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分包括：包括如SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：53、56或57中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
3.抗CD40嵌合抗體
嵌合抗體為抗體之不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如具有衍生自鼠單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。用於製造嵌合抗體之方法為此項技術中已知的。參見例如Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第4,816,397號，其以全文引用的方式併入本 文中。此外，可以使用關於藉由自具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子剪接基因以及自具有適當生物活性之人類抗體分子剪接基因來製造「嵌合抗體」所研發的技術(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855；Neuberger等人，1984,Nature 312：604-608；Takeda等人，1985,Nature 314：452-454，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在另一態樣中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有包括SEQ ID NO：76中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區及包括SEQ ID NO：75中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
在另一態樣中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分，其具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的CDR3。在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有包括SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區及包括SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
在另一態樣中，本發明係關於一種拮抗性抗CD40抗體或其抗原 結合部分，其具有輕鏈可變區及重鏈可變區，輕鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的CDR3；重鏈可變區包括(a)具有如SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列的CDR1、(b)具有如SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的CDR2及(c)具有SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的CDR3。在一個特定實施例中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分具有包括SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區及包括SEQ ID NO：5中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
以上經分離抗CD40抗體CDR序列建立起CD40抗體或其抗原結合部分之新穎家族，其根據本發明分離且包括包含表5、11-13及15-18中所列之CDR序列的抗體。為產生及選擇關於hCD40具有較佳CD40結合及/或中和活性的本發明CDR，可以使用此項技術中已知用於產生本發明抗體及評定彼等抗體之CD40結合及/或中和特徵的標準方法，包括(但不限於)本文中具體描述之彼等方法。
4.表徵本發明抗體
本發明之抗CD40抗體為拮抗性抗體且可以展現出降低或中和CD40活性之高能力，例如藉由此項技術中已知且如本文所述之若干活體外及活體內分析中之任一者評定。在某些實施例中，本發明之抗CD40抗體為拮抗性抗體且基本上不含促效活性。拮抗活性及促效活性可藉由此項技術中已知之分析測定，包括本文所述之彼等分析。舉例而言，與人類CD40之結合及CD40-CD40L相互作用之抑制可以使用表現人類CD40之細胞株，經由FACS分析進行分析。
在一個實施例中，使用報導細胞株測定抗CD40抗體之CD40拮抗活性或促效活性。舉例而言，拮抗活性及促效活性可以使用與NFkB介導之鹼性磷酸酶(AP)相關之表現CD40之報導細胞株表現人類CD40 來評定。當經由CD40接收到信號時，NFkB活化導致AP之分泌，其藉由比色受質來量測。作為例示性拮抗性分析，可以將CD40報導細胞株與表現CD40L之Jurkat細胞株一起培養(以提供生理配體相互作用)或與可溶性CD40L一起培養，其中可以評定抗CD40抗體阻斷NFkB信號(如藉由標準方法所測定，存在少量AP或不存在AP)之能力。作為例示性促效性分析，可以用抗CD40抗體處理人類CD40報導細胞株且如上所述量測NFkB信號(以超過陰性對照之AP存在情況呈現)。CD40報導細胞株之實例為HEK-BlueTM CD40L細胞(InvivoGen)，其用以經由在CD40刺激後NF-κB活化時胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)之分泌來量測CD40L的生物活性。CD40L-CD40相互作用可以藉由使用QUANTI-Blue(InvivoGen)評定SEAP之含量來監測。
在一個實施例中，如藉由拮抗性可溶性CD40L報導基因分析所測定，本發明之抗CD40拮抗性抗體或其抗原結合片段的IC50為0.4nM或0.4nM以下。在一個實施例中，如藉由拮抗性CD40報導基因分析在Jurkat細胞株中所測定，本發明之抗CD40拮抗性抗體或其抗原結合片段的IC50為51nM或51nM以下。在一個實施例中，如藉由拮抗性CD40報導基因分析在Jurkat細胞株中所測定，本發明之抗CD40拮抗性抗體或其抗原結合片段的IC50為3.4nM或3.4nM以下。在一個實施例中，如藉由拮抗性CD40報導基因分析在Jurkat細胞株中所測定，本發明之抗CD40拮抗性抗體或其抗原結合片段的IC50為0.9nM或0.9nM以下。
在一個實施例中，使用B細胞促效性分析測定抗CD40抗體之CD40拮抗活性或促效活性。舉例而言，可以採用B細胞促效性分析，其中用低劑量抗IgM及IL4活化B細胞，隨後添加CD40拮抗性抗體。B細胞活化之增強可以按CD86之上調來量測，CD86之上調又指示促效活性。類似地，可以採用B細胞拮抗性分析，其中將初級人類B細胞 與表現CD40L之人類T細胞株一起培養，表現CD40L之人類T細胞株經由CD40/CD40L相互作用導致B細胞活化及CD86表現上調。初級人類B細胞之CD86上調之抑制指示拮抗活性。
在一個實施例中，使用抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)介導之分析測定抗CD40抗體之CD40拮抗活性或促效活性。拮抗活性及促效活性可以藉由抗體介導ADCC之能力來評定。拮抗性CD40抗體將為ADCC之有效介體，然而促效性抗體將不具有ADCC活性。抗體依賴性細胞毒性(ADCC)係指藉由巨噬細胞、NK細胞、嗜中性白血球細胞等之活化誘導的一類細胞毒性，該等細胞藉由經由其表面上所表現之Fc受體結合至抗體恆定區來識別目標細胞。補體依賴性細胞毒性(CDC)係指藉由補體系統之活化誘導的一類細胞毒性，其經由抗體與抗原之結合發生。ADCC及CDC活性降低意謂如相比於例如對照抗CD40拮抗性抗體，諸如由融合瘤4D11(寄存編號FERM BP-7758)產生之單株抗體，彼等活性降低。EP1707627B1以全文引用的方式併入本文中，描述用於測定ADCC及CDC活性之分析。
另外，可以使用經固定抗CD40 Ab刺激之樹突狀細胞(DC)之生物活性來分析促效活性。DC咸信為最有效的抗原呈現細胞，其能夠拾取非淋巴組織中之Ag且將其攜帶至次級淋巴器官，響應於諸如危險信號及幫助信號之成熟刺激，激活T細胞。相比之下，在不活化的情況下藉由DC呈現Ag導致次級淋巴組織中具有同源TCR之效應T細胞之消除或調節T細胞之誘導。因此，在周邊組織中關於不成熟DC之成熟信號的存在或不存充當誘導應變性免疫反應或耐受性的開關。關於DC成熟之大部分CD4+ T細胞幫助信號由DC上所表現之CD40與經活化之CD4+ T細胞上之CD40配體(L)之間的相互作用提供。因此，CD40刺激藉由上調CCR7之表現，誘導DC遷移至次級淋巴組織中。Watanabe等人2003 J Immunol；171：5828-5836描述可用於判定抗CD40 抗體是否可以活化DC的分析來測定促效活性及拮抗活性。該等例示性分析包括測定經固定抗CD40 Ab刺激之BM-DC上之MHC I類/II類Ag及協同刺激分子的表現、經固定抗CD40 Ab刺激之BM-DC的活體內遷移活性、經固定抗CD40 Ab刺激之BM-DC的活體外遷移活性及CCR7表現。
在一個實施例中，抗CD40抗體或其抗原結合部分之促效活性係使用活體外單核細胞活化分析測定，諸如下文實例7中所述之分析。活體外單核細胞活化分析包括使單核細胞暴露於抗CD40抗體或其抗原結合部分，其中若抗體或其抗原結合部分為CD40之活化劑(促效劑)，則引起TNF產量增加。使用活體外單核細胞活化分析，基本上不含促效活性之拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分將導致不產生TNF或產生少量TNF，如實例7中所描述。
在一個實施例中，基本上不含促效活性之拮抗性抗CD40抗體或其抗原結合部分在活體外CD40促效性分析、例如實例7中所述之促效性單核細胞分析中，具有在陰性對照之一個標準差之內的活性。
促效性分析進一步描述於US 5786456、US2011/0243932及EP1707627B1中，其各自以全文引用的方式併入本文中。用於測試抗體功能之拮抗性分析進一步描述於US 7361345、US2011/0243932及EP1707627B1中，其各自以引用的方式併入本文中。
在較佳實施例中，經分離抗體或其抗原結合部分結合人類CD40，其中抗體或其抗原結合部分以約0.1s-1或0.1s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或其以約1×10-6M或1×10-6M以下之IC50抑制人類CD40活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-2s-1或1×10-2s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或可以約1×10-7M或1×10-7M以下之IC50抑制人類CD40活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約 1×10-3s-1或1×10-3s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或可以約1×10-8M或1×10-8M以下之IC50抑制人類CD40。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-4s-1或1×10-4s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或可以約1×10-9M或1×10-9M以下之IC50抑制CD40活性。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-5s-1或1×10-5s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或可以約1×10-10M或1×10-10M以下之IC50抑制CD40。或者，抗體或其抗原結合部分可以約1×10-5s-1或1×10-5s-1以下之koff速率常數自人類CD40解離，如藉由表面電漿共振所測定；或可以約1×10-11M或1×10-11M以下之IC50抑制CD40活性。
如下文實例所述使抗體人類化。藉由從頭合成(de novo synthesis)可變域或藉由突變誘發寡核苷酸引子及聚合酶鏈反應，或藉由允許CDR移植物中之每一者的回復突變與其他突變之不同組合，向CDR移植抗體序列中引入構架回復突變。將鼠單株CD40抗體之人類化可變區選殖至IgG表現載體中用於功能表徵。
在某些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。較佳地，重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。此外，抗體可包含輕鏈恆定區，κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區。較佳地，抗體包含κ輕鏈恆定區。或者，抗體部分可為例如Fab片段或單鏈Fv片段。
5.產生抗CD40人類化抗體
如上所述，人類化抗體為來自結合所要抗原之非人類物種抗體之抗體分子，其具有一或多個來自非人類物種之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區。已知人類Ig序列已揭示，例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi； www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide0l.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/； www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)，各自以全文引用的方式併入本文中。如此項技術中所知，如此導入之序列可用於降低免疫原性或降低、增強或修改結合、親和力、結合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。
人類構架區中之構架殘基可經來自CDR供體抗體之相應殘基取代，以更改、較佳地改善抗原結合。此等構架取代藉由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由使CDR與構架殘基之相互作用模型化以鑑別對於抗原結合而言重要之構架殘基，且進行序列比較以鑑別特定位置處的異常構架殘基。(參見例如Queen等人之美國專利第5,585,089號；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其以全文引用的方式併入本文中。)三維免疫球蛋白模型通常可獲得，且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。此等顯示之檢查使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能方面的可能性作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以此方式，可自共同序列及導入序列選擇FR殘基且組合以便達成所要抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最顯著參與影響抗原結合。抗體可以使用此項技術中已知之各種技術人類化，該等技術諸如(但不限於)以下各者中所述之彼等技術：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人， Science 239：1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公開案WO 91/09967；PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400、美國專利第5,565,332號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5814476號、第5763192號、第5723323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567號，其各自以全文引用的方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
抗CD40人類化抗體之實例提供於上文第1部分及第2部分及下文實例中。
II.製造抗體及產抗體之細胞株
本發明抗體可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者製造。
1.抗CD40單株抗體，使用融合瘤技術
可以使用此項技術中已知之各種技術製備單株抗體，該等技術包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，可以使用融合瘤技術產生單株抗體，包括此項技術中已知及例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(該等參考文獻以全文引用的方式併入)中所教示之彼等融合瘤技術。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指衍生自單一純系，包括任何真核、原核或噬菌體純系的抗體，且並非產生抗體的方法。
使用融合瘤技術製造及篩選特異性抗體之方法在此項技術中為常規且熟知的。在一個實施例中，本發明提供產生單株抗體之方法以及由該方法產生之抗體，該方法包含將分泌本發明抗體之融合瘤細胞(其中較佳地，融合瘤係藉由融合自經本發明抗原免疫之小鼠分離的脾細胞產生)與骨髓瘤細胞一起培養且隨後篩選由分泌能夠結合本發明多肽之抗體的融合瘤純系之融合產生的融合瘤(參見實例1)。簡言之，可以用CD40抗原免疫小鼠。在一個較佳實施例中，CD40抗原與佐劑一起投與以刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽)或ISCOM(免疫刺激複合物)。該等佐劑可以藉由將多肽隔離在局部沈積中而避免多肽快速分散，或其可以含有刺激宿主分泌巨噬細胞趨化因子及免疫系統之其他組分的物質。較佳地，若將投與多肽，則免疫時程將涉及多肽之兩次或兩次以上投與，時間跨越數週。
在用CD40抗原免疫動物之後，可自動物獲得抗體及/或產抗體細胞。藉由給動物放血或殺死動物，自動物獲得含抗CD40抗體之血清。血清可按其自動物獲得之形式使用，可自血清獲得免疫球蛋白部分，或可自血清純化出抗CD40抗體。以此方式獲得之血清或免疫球蛋白為多株，從而具有一系列各種各樣的特性。
在偵測免疫反應時，例如偵測小鼠血清中對抗原CD40具有特異性的抗體，收集小鼠脾臟且分離脾細胞。隨後藉由熟知技術將脾細胞融合至任何適合的骨髓瘤細胞，例如來自可獲自ATCC之細胞株SP20 的細胞。藉由極限稀釋法選擇及選殖融合瘤。隨後藉由此項技術中已知之方法，針對分泌能夠結合CD40之抗體的細胞分析融合瘤純系。腹水通常含有大量抗體，可以藉由用陽性融合瘤純系免疫小鼠來產生。
在另一實施例中，可由經免疫動物製備產抗體永生化融合瘤。在免疫之後，殺死動物且如此項技術中所熟知，將脾臟B細胞融合至永生化骨髓瘤細胞。參見例如Harlow及Lane之前述文獻。在一個較佳實施例中，骨髓瘤細胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞株)。在融合及抗生素選擇之後，使用CD40或其部分或表現CD40之細胞篩選融合瘤。在一個較佳實施例中，使用酶聯免疫分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)、較佳ELISA執行初始篩選。ELISA篩選之實例提供於WO 00/37504中，其以引用的方式併入本文中。
針對所要特徵，包括穩固融合瘤生長、高抗體產量及所要抗體特徵，選擇、選殖及進一步篩選產抗CD40抗體之融合瘤，如下文進一步論述。融合瘤可活體內在同基因型動物中、在缺乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中或在活體外細胞培養中培養及擴大。選擇、選殖及擴大融合瘤之方法已為一般技術者所熟知。
在一個較佳實施例中，融合瘤為如上所述之小鼠融合瘤。在另一較佳實施例中，在非人類、非小鼠物種中，諸如在大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬中產生融合瘤。在另一實施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌性骨髓瘤與表現抗CD40抗體之人類細胞融合。
識別特定抗原決定基之抗體片段可藉由已知技術產生。舉例而言，本發明之Fab及F(ab')2片段可使用酶，諸如木瓜酶(用於產生Fab片段)或胃蛋白酶(用於產生F(ab')2片段)，由免疫球蛋白分子之蛋白水解分裂產生。F(ab')2片段含有可變區、輕鏈恆定區及重鏈之CHI域。
2.抗CD40單株抗體，使用SLAM
在本發明之另一態樣中，使用此項技術中稱為選定淋巴細胞抗體法(selected lymphocyte antibody method；SLAM)之程序，自單一經分離淋巴細胞產生重組抗體，如美國專利第5,627,052號、PCT公開案WO 92/02551及Babcock,J.S.等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中所述。在此方法中，使用抗原特異性溶血性溶菌斑檢定法篩選分泌相關抗體之單細胞，例如源自第1部分中所述之經免疫動物中之任一者的淋巴細胞，其中使用諸如生物素之連接子將抗原CD40、CD40之子單元或其片段偶聯至綿羊紅血細胞，且用於鑑別分泌對CD40具有特異性之抗體的單細胞。在鑑別出相關的分泌抗體之細胞之後，藉由反轉錄酶-PCR自細胞奪回重鏈及輕鏈可變區cDNA，且此等可變區隨後可在適當免疫球蛋白恆定區(例如，人類恆定區)之背景下在諸如COS或CHO細胞之哺乳動物宿主細胞中表現。經源自活體內選擇之淋巴細胞的經擴增免疫球蛋白序列轉染的宿主細胞隨後可經歷進一步分析及活體外選擇，例如藉由淘選經轉染細胞以分離表現CD40抗體之細胞。經擴增之免疫球蛋白序列可以諸如藉由活體外親和力成熟法進一步活體外操控，諸如PCT公開案WO 97/29131及PCT公開案WO 00/56772中所述之彼等方法。
3.抗CD40單株抗體，使用轉殖基因動物
在本發明之另一實施例中，藉由用CD40抗原免疫包含一些或所有人類免疫球蛋白基因座之非人類動物來產生抗體。在一個較佳實施例中，非人類動物為XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含人類免疫球蛋白基因座之大片段且在小鼠抗體產生方面有缺陷的經工程改造之小鼠品系。參見例如Green等人Nature Genetics 7：13-21(1994)及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598及6,130,364。亦參見1991年7月25日公開之WO 91/10741、1994年2月3日公開之WO 94/02602、1996年10月31日公開之WO 96/34096及WO 96/33735、1998年4月23公開之WO 98/16654、1998年6月11日公開之WO 98/24893、1998年11月12日公開之WO 98/50433、1999年9月10日公開之WO 99/45031、1999年10月21日公開之WO 99/53049、2000年2月24日公開之WO 0009560及2000年6月29日公開之WO 00/037504。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之成人樣人類譜，且產生抗原特異性人類Mab。XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及x輕鏈基因座之兆鹼基(megabase)大小之生殖系組態YAC片段而含有人類抗體譜之約80%。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)；Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
4.抗CD40單株抗體，使用重組抗體文庫
亦可使用活體外方法製造本發明抗體，其中對抗體文庫進行篩選以鑑別具有所要結合特異性之抗體。重組抗體文庫之此類篩選方法為此項技術中熟知的且包括以下各者中所述之方法：例如Ladner等人之美國專利第5,223,409號；Kang等人之PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人之PCT公開案第WO 91/17271號；Winter等人之PCT公開案第WO 92/20791號；Markland等人之PCT公開案第WO 92/15679號；Breitling等人之PCT公開案第WO 93/01288號；McCafferty等人之PCT公開案第WO 92/01047號；Garrard等人之PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等 人(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982；美國專利申請公開案20030186374及PCT公開案第WO 97/29131號，其內容各自以引用的方式併入本文中。
重組抗體文庫可來自經CD40或CD40之一部分(諸如細胞外域)免疫的個體。或者，重組抗體文庫可來自未經處理之個體，亦即，尚未用CD40免疫之個體，諸如來自尚未用人類CD40免疫之人類個體的人類抗體文庫。藉由用包含人類CD40之肽篩選重組抗體文庫來選擇本發明抗體，從而選擇彼等識別CD40之抗體。執行此類篩選及選擇之方法為此項技術中熟知的，諸如在前述段落中之參考文獻中所述。為選擇對hCD40具有特定結合親和力之本發明抗體，諸如以特定koff速率常數自人類CD40解離的彼等抗體，可使用此項技術中已知的表面電漿共振法選擇具有所要koff速率常數之抗體。為選擇對hCD40具有特定中和活性之本發明抗體，諸如具有特定IC50之彼等抗體，可使用此項技術中已知用於評定hCD40活性之抑制的標準方法。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離抗體或其抗原結合部分，其結合人類CD40。較佳地，抗體為中和抗體。在各種實施例中，抗體為重組抗體或單株抗體。
舉例而言，本發明抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法產生。在噬菌體呈現方法中，功能抗體域呈現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。特定言之，該等噬菌體可以用於呈現自庫或組合抗體文庫(例如，人類或鼠類)表現之抗原結合域。表現結合相關抗原之抗原結合域的噬菌體可用抗原來選擇或鑑別，例如使用經標記抗原或結合或捕捉至固體表面或珠粒之抗原。此等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，其包括自具有以重組方式 融合至噬菌體基因III或基因VIII蛋白質之Fab、Fv或經二硫化物穩定之Fv抗體域的噬菌體表現的fd及M13結合域。可用以製造本發明抗體之噬菌體呈現方法的實例包括以下各者中所揭示之彼等噬菌體呈現方法：Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187 9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申請案第PCT/GB91/01134號；PCT公開案WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及美國專利第5,698,426號；第5,223,409號；第5,403,484號；第5,580,717號；第5,427,908號；第5,750,753號；第5,821,047號；第5,571,698號；第5,427,908號；第5,516,637號；第5,780,225號；第5,658,727號；第5,733,743號及第5,969,108號，其各自以全文引用之方式併入本文中。
如上文參考文獻中所述，在噬菌體選擇之後，可以自噬菌體分離抗體編碼區且用其產生完整抗體，包括人類抗體或任何其他所要抗原結合片段，且在任何理想宿主中表現，該宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌，例如如下文詳細描述。舉例而言，亦可使用此項技術中已知之方法，採用用於以重組方式產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技術，諸如在PCT公開案WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；及Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；及Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(該等參考文獻以全文引用的方式併入中)中所揭示之彼等方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的實例包括在美國專利4,946,778及5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；及Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)中所述之彼等技術。
替代藉由噬菌體呈現篩選重組抗體文庫，可以應用此項技術中已知用於篩選大組合文庫之其他方法來鑑別本發明之雙重特異性抗體。一種類型之替代表現系統為重組抗體文庫按RNA-蛋白質融合體表現之表現系統，如Szostak及Roberts之PCT公開案第WO 98/31700號以及Roberts,R.W.及Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所述。在此系統中，藉由活體外轉譯在3'端攜帶肽基接受體抗生素嘌呤黴素(puromycin)之合成mRNA，在mRNA與其所編碼之肽或蛋白質之間創建共價融合體。因此，可以基於所編碼肽或蛋白質(例如抗體或其部分)之性質，諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之結合，自複雜的mRNA混合物(例如組合文庫)富集特異性mRNA。編碼自篩選該等文庫回收之抗體或其部分的核酸序列可以藉由如上所述之重組手段(例如，在哺乳動物宿主細胞中)來表現，且此外，可以藉由已將突變引入最初選擇之序列中之mRNA-肽融合體的額外幾輪篩選或藉由如上所述用於重組抗體之活體外親和力成熟的其他方法進行進一步親和力成熟。
在另一種方法中，本發明抗體亦可使用此項技術中已知之酵母呈現方法產生。在酵母呈現方法中，使用遺傳方法將抗體域繫栓至酵母細胞壁且使其呈現於酵母之表面上。特定言之，該酵母可以用於呈現自庫或組合抗體文庫(例如，人類或鼠類)表現之抗原結合域。可用以製造本發明抗體之酵母呈現方法的實例包括在Wittrup等人(美國專利第6,699,658號)(其以引用的方式併入本文中)中所揭示之彼等酵母呈現方法。
5.製造重組CD40抗體
本發明抗體可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者製造。舉例而言，自宿主細胞表現，其中編碼重鏈及輕鏈之表現載體藉 由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於引入外源性DNA至原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明抗體，但抗體在真核細胞中之表現為較佳的，且在哺乳動物宿主細胞中為最佳的，因為該等真核細胞(且尤其哺乳動物細胞)與原核細胞相比更可能組裝且分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體。
用於表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中所述之dhfr-CHO細胞，其與例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述之DHFR可選擇標誌物一起使用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞持續足以允許抗體在宿主細胞中表現或更佳地，將抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中之時間段產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
宿主細胞亦可用於產生功能性抗體片段，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解，以上程序之變化在本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本發明抗體之輕鏈及/或重鏈之功能片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術來移除一些或所有並非結合至相關抗原所需的編碼輕鏈及重鏈中之任一者或兩者之DNA。本發明抗體亦涵蓋自該等截短之DNA分子表現之分子。此外，可藉由標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯而產生雙功能抗體，其中一條重鏈及一條輕鏈為本發明抗體且另一條重鏈及輕鏈對除相關抗原以外之抗原具有特異性。
在用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分的較佳系統 中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈及抗體輕鏈之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，將抗體重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接至CMV強化子/AdMLP啟動子調控元件以驅動高水準之基因轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈，且自培養基回收完整抗體。使用標準分子生物學技術來製備重組表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收抗體。再者，本發明提供一種藉由在適合培養基中培養本發明之宿主細胞直至合成本發明之重組抗體來合成本發明之重組抗體的方法。該方法可以進一步包含自培養基分離重組抗體。
本發明之另一實施例提供一種糖基化抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。新生活體內蛋白質產生可以經歷進一步加工，稱為轉譯後修飾。特定言之，可以酶促方式(稱為糖基化之過程)添加糖(糖基)殘基。所得蛋白質攜帶共價連接之寡醣側鏈，稱為糖基化蛋白質或糖蛋白。抗體為在Fc域以及可變域中含有一或多個碳水化合物殘基的糖蛋白。Fc域中之碳水化合物殘基對Fc域之效應功能具有重要影響，且對抗體之抗原結合或半衰期影響極小(R.Jefferis,Biotechnol.Prog.21(2005)，第11-16頁)。相比之下，可變域之糖基化會對抗體之抗原結合活性產生影響。可變域中之糖基化可能由於位阻而可能對抗體結合親和力具有不利影響(Co,M.S.等人，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)，或造成對抗原之親和力增加(Wa11ick,S.C.等人，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright,A.等人，EMBO J.(1991)10：2717-2723)。
本發明之一個態樣係關於產生糖基化位點突變體，其中抗體或其抗原結合部分之O或N連接之糖基化位點已經突變。熟習此項技術 者可以使用標準熟知技術產生該等突變體。保留生物活性，但具有增加或降低之結合活性的糖基化位點突變體為本發明之另一目標。
在另一實施例中，修改本發明之抗體或抗原結合部分之糖基化。舉例而言，可製得去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。可更改糖基化以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如更改抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而消除一或多個可變區糖基化位點，以藉此消除該位點之糖基化。此類去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於PCT公開案WO2003016466A2及美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
另外地或可替代地，可以製得糖基化類型更改之經修飾之本發明抗體，諸如具有降低量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體或具有增加之等分GlcNAc結構之抗體。此類經更改之糖基化模式已證明會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機制更改之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制更改之細胞在此項技術中已有描述且可用作表現本發明之重組抗體以藉此產生糖基化更改之抗體的宿主細胞。參見例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-1以及歐洲專利第EP 1,176,195號；PCT公開案WO 03/035835；WO 99/54342 80，其各自以全文引用之方式併入本文中。
蛋白質糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現蛋白質之宿主細胞而定。不同生物體可以產生不同糖基化酶(例如，糖基轉移酶及醣苷酶)，且具有不同的可用受質(核苷酸糖)。歸因於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之組成可以視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發明之糖基殘基可以包括(但不限於)葡萄糖、半乳 糖、甘露糖、海藻糖、N-乙醯葡萄糖胺及唾液酸。較佳地，糖基化抗體或其抗原結合部分包含糖基殘基，使得糖基化模式為人類。
熟習此項技術者已知，不同蛋白質糖基化可以產生不同蛋白質特徵。舉例而言，在諸如酵母之微生物宿主中產生且利用酵母內源性路徑糖基化之治療蛋白的功效相比於在諸如CHO細胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的功效而言會降低。該等糖蛋白亦可在人類中具有免疫原性且在投與之後顯示降低的活體內半衰期。人類及其他動物中之特定受體可以識別特定糖基殘基且促進自血流中快速清除蛋白質。其他不良影響可以包括在蛋白質摺疊、溶解度、對蛋白酶之易感性、移行、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識別、抗原性或過敏原性方面之改變。因此，醫師可能偏愛具有特定組成及糖基化模式之治療蛋白，例如與在人類細胞中或在既定個體動物之物種特異性細胞中產生的糖基化組成及模式相同或至少類似的糖基化組成及模式。
表現不同於宿主細胞之蛋白質的糖基化蛋白質可藉由對宿主細胞進行遺傳修飾以表現異源糖基化酶來達成。使用此項技術中已知之技術，醫師可以產生展現人類蛋白質糖基化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株進行遺傳修飾以表現非天然存在之糖基化酶，使得在此等酵母菌株中產生之糖基化蛋白質(糖蛋白)展現與動物細胞、尤其人類細胞之蛋白質糖基化相同的蛋白質糖基化(美國專利公開案第20040018590號及第20020137134號及PCT公開案WO2005100584 A2)。
除抗體或其抗原結合部分之外，本發明亦有關一種對本發明之該等抗體或其抗原結合部分具有特異性的抗個體基因型(抗Id)抗體。抗Id抗體為識別通常與另一抗體之抗原結合區相關之獨特決定子的抗體。抗Id可以藉由用抗體或其抗原結合部分或其含CDR區免疫動物來 製備。經免疫動物將識別免疫抗體之個體基因型決定子且對其起反應，且產生抗Id抗體。抗Id抗體亦可用作「免疫原」誘導另一動物中之免疫反應，產生所謂的抗抗Id抗體。
此外，熟習此項技術者應瞭解，相關蛋白質可使用經基因工程改造以表現各種糖基化酶之宿主細胞文庫表現，使得該文庫之宿主細胞成員產生具有變異糖基化模式之相關蛋白質。醫師可以隨後選擇且分離具有特定新穎糖基化模式之相關蛋白質。較佳地，具有經過特定選擇之新穎糖基化模式之蛋白質展現出改良或更改的生物特性。
III.拮抗性抗CD40抗體之用途
鑒於其與人類CD40結合之能力，本發明之抗人類CD40抗體或其部分可用於使用習知免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學，偵測人類CD40(例如，在生物樣品中，諸如血清或血漿)。本發明提供一種用於偵測生物樣品中之人類CD40的方法，其包含使生物樣品與本發明之抗體或抗體部分接觸且偵測結合至人類CD40之抗體(或抗體部分)或未結合抗體(或抗體部分)，從而偵測生物樣品中之人類CD40。可用可偵測物質直接或間接標記抗體以促進已結合或未結合抗體之偵測。適合的可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光材料之實例包括繖酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料之實例包括魯米諾(luminol)；且適合放射性材料之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
代替標記抗體，可以藉由競爭免疫分析，利用經可偵測物質標記之rhCD40標準品及未標記之抗人類CD40抗體，在生物流體中分析 人類CD40。在此分析中，將生物樣品、經標記之rhCD40標準品及抗人類CD40抗體合併且測定結合至未標記抗體之經標記rhCD40標準品之量。生物樣品中之人類CD40之量與結合至抗CD40抗體之經標記rhCD40標準品之量成反比。類似地，亦可藉由競爭免疫分析，利用經可偵測物質標記之rhCD40標準品及未標記之抗人類CD40抗體，在生物流體中分析人類CD40。
本發明之抗體及抗體部分較佳能夠活體外及活體內中和人類CD40活性。因此，本發明之該等抗體及抗體部分可用於抑制hCD40活性，例如在含有hCD40之細胞培養中、在具有與本發明抗體交叉反應之CD40的人類個體中或其他哺乳動物個體中。在一個實施例中，本發明提供一種用於抑制hCD40活性之方法，其包含使hCD40與本發明之抗體或抗體部分接觸，使得hCD40活性遭到抑制。舉例而言，在含有或疑似含有hCD40之細胞培養中，可以向培養基中添加本發明之抗體或抗體部分以抑制培養物中之hCD40活性。
在另一實施例中，本發明提供一種用於降低個體、有利地為患有CD40活性有害之疾病或病症的個體中之hCD40活性的方法。本發明提供用於降低患有此類疾病或病症之個體中之CD40活性的方法，該方法包含向個體投與本發明之抗體或抗體部分，使得個體中之CD40活性降低。較佳地，CD40為人類CD40，且個體為人類個體。或者，個體可為表現本發明抗體能夠結合之CD40的哺乳動物。再者，個體可為已引入CD40(例如，藉由投與CD40或藉由表現CD40轉殖基因)之哺乳動物。本發明抗體可以出於治療目的投與給人類個體。此外，本發明抗體可以投與給表現該抗體能夠結合之CD40的非人類哺乳動物，出於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型。關於後者，該等動物模型可適用於評估本發明抗體之治療功效(例如，測試劑量及投藥時程)。
如本文所用，術語「CD40活性有害的病症」意欲包括在患有該病症之個體中CD40之存在已顯示會或疑似會引起該病症之病理生理學或為造成該病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，CD40活性有害的病症為預期CD40活性降低可緩解病症之症狀及/或進程的病症。該等病症可例如由患有該病症之個體的生物流體中CD40之濃度增加(例如，個體之血清、血漿、滑液等中CD40之濃度增加)證明，其可以例如使用如上所述之抗CD40抗體偵測。可用本發明抗體及其變異體或其抗原結合片段治療之病症的非限制性實例包括下文有關本發明抗體之醫藥組合物的部分中所論述之彼等病症。舉例而言，適合病症包括(但不限於)全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、類肉瘤病、幼年型關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、萊特爾氏症候群、僵直性脊椎炎、痛風性關節炎、器官或組織移植之排斥反應、移植物抗宿主疾病、多發性硬化症、高IgE症候群、結節性多動脈炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、克羅恩氏病、腹腔疾病(麩質敏感性腸病)、自體免疫性肝炎、惡性貧血、自體免疫性溶血性貧血、牛皮癬、硬皮病、重症肌無力、自體免疫性血小板減少性紫癲、自體免疫甲狀腺炎、格雷氏病、橋本氏甲狀腺炎、免疫複合性疾病、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、多發性肌炎及皮肌炎、冷凝球蛋白血症、血栓溶解、心肌症、尋常天疱瘡、肺間質纖維化、類肉瘤病、I型及II型糖尿病、1、2、3及4型遲發型過敏、過敏或過敏性病症、哮喘、徹奇-斯全司症候群(過敏性肉芽腫病)、異位性皮炎、過敏性及刺激性接觸性皮炎、蕁麻疹、IgE介導之過敏、動脈粥樣硬化、血管炎、特發性發炎性肌病、溶血性疾病、阿茲海默氏病及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病。在一個特定實施例中，疾病或病症為慢性發炎性病症。在一個特定實施例中，CD40活性有害的病症為發炎性腸病(IBD)，包括(但不限於)克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
在其他實施例中，本發明之抗CD40抗體或抗原結合部分用於治療TNFα活性有害的病症，包括(但不限於)類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、化膿性汗腺炎、幼年型特發性關節炎、牛皮癬性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎及克羅恩氏病。在一個實施例中，TNFα活性有害的病症為眼色素層炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療患有發炎性腸病(IBD)之人類個體。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療潰瘍性結腸炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療克羅恩氏病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療全身性紅斑性狼瘡症(SLE)。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療類肉瘤病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療患有幼年型關節炎之人類個體。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療類風濕性關節炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療牛皮癬性關節炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療患有僵直性脊椎炎之人類個體。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療化膿性汗腺炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如 Ab102)係用於治療眼色素層炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療休格連氏病。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療牛皮癬。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療異位性皮炎。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係用於治療硬皮病。
歸因於CD40在先天性及應變性免疫反應中之重要作用，本發明之抗CD40 mAb將具有治療未經生物製劑治療之患者(biologic naïve patient)及抗TNF不當的反應群體的潛能。本發明提供一種能夠抑制CD40信號傳導的治療，抑止諸如TNF及IL-23產生之分子路徑及維持腸道慢性發炎之黏著/協同刺激分子表現。基於經抗TNF治療之克羅恩氏病患者的表現譜分析，用抗CD40治療可能具有延伸超出抗TNF反應群體以治療較寬範圍之克羅恩氏病患者的潛力。在某些實施例中，本發明提供一種治療對抗TNF療法不起反應之IBD患者子群體的方法。該等IBD患者可能患有克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎，且對用TNFα抑制劑治療不起反應或反應有限，TNFα抑制劑諸如(但不限於)英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)或戈利木單抗(golimumab)。本文所述之抗CD40拮抗性抗體可用於治療患有克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎之TNF無反應者。在某些實施例中，本發明包括一種治療患有中度至重度活躍的克羅恩氏病且為抗TNF無反應者的患者(例如成人患者)的方法。
本發明抗體或其抗原結合部分可以單獨或以組合形式使用以治療該等疾病。應瞭解，本發明抗體或其抗原結合部分可以單獨或與額 外藥劑(例如治療劑)組合使用，該額外藥劑由熟習此項技術者出於其既定目的來加以選擇。舉例而言，額外藥劑可為此項技術中公認適用於治療待藉由本發明抗體治療之疾病或病況的治療劑。額外藥劑亦可為賦予治療組合物有益屬性之藥劑，例如影響組合物黏度之藥劑。應進一步瞭解，將包括在本發明內之組合為適用於其既定目的之彼等組合。以下闡述之藥劑係出於說明性目的且不意欲受限制的。作為本發明之一部分的組合可為本發明之抗體及至少一種選自以下清單之額外藥劑。組合亦可包括一種以上額外藥劑，例如兩種或三種額外藥劑，若組合如此，則所形成之組合物可以執行其既定功能。
組合療法可以包括一或多種CD40拮抗劑，例如抗CD40抗體或其片段，與一或多種額外治療劑一起調配及/或共投與，該一或多種額外治療劑例如一或多種細胞介素及生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑(例如全身性消炎劑)、抗纖維化劑、代謝抑制劑、酶抑制劑及/或細胞毒性或細胞生長抑制劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、免疫調節劑、基因療法載體、烷基化劑、抗血管生成劑、抗代謝物、含硼劑、化學保護劑、激素、抗激素劑、皮質類固醇、光敏性治療劑、寡核苷酸、放射性核素劑、拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑或放射增敏劑，如本文詳細描述。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與第二藥劑組合用於治療發炎性腸病(IBD)。在某些實施例中，第二藥劑為美沙拉嗪、巴柳氮、硫唑嘌呤、6-MP、甲胺喋呤、英利昔單抗、賽妥珠單抗、阿達木單抗、戈利木單抗、那他珠單抗(natalizumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、優特克單抗(ustekinumab)或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與第二藥劑組合用於治療SLE，其中第二藥劑為硝基貼劑 (nitropaste)/硝化甘油、硝苯地平(nifedipine)、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalifil)或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與第二藥劑組合用於治療SLE，其中第二藥劑為皮質類固醇、內源性類固醇產生器、NSAID、消炎劑、緩解疾病的抗風濕性藥物(disease-modifying antirheumatic drug；DMARD)、免疫抑制劑、抗凝血劑或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與皮質類固醇組合用於治療SLE。可使用之皮質類固醇之實例包括潑尼松龍、甲潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼松(prednisone)或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與影響內源性類固醇產生之藥劑(例如促皮質素(阿克撒(Acthar)))組合用於治療SLE。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與局部或注射療法組合用於治療SLE。此類療法之實例包括(但不限於)皮質酮、氫皮質酮、吡美莫司乳膏(pimecrolimus cream)、他克莫司軟膏(tacrolimus ointment)、咪喹莫特(imiquimod)或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與非類固醇消炎藥(NSAID)組合用於治療SLE。可用於組合療法中之NSAID的實例包括(但不限於)吲哚美辛(indomethacin)、萘丁美酮(nabumetone)、塞內昔布(celecoxib)、布洛芬、萘普生(naproxen)、雙氯芬酸(diclofenac)或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)係與消炎藥組合用於治療SLE。在其他實施例中，消炎藥為乙醯胺苯酚及/或水楊酸鹽。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與緩解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)組合用於治療SLE。DMARD之實例包括(但不限於)羥氯喹(hydroxychloroquine)(必賴克廔(Plaquenil))、氯奎(chloroquine)、甲胺喋呤(瑞瑪翠(Rheumatrex))、來氟米特(愛諾華(Arava))、柳氮磺胺吡啶或其組合。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與貝利單抗(Belimumab)(本利斯塔(Benlysta))、利妥昔單抗(Rituximab)(美羅華(Rituxan))、靜脈內Ig或其組合組合使用。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與免疫抑制劑組合用於治療SLE。免疫抑制劑之實例包括(但不限於)硫唑嘌呤(依木蘭(Imuran))、環磷醯胺(癌得星(Cytoxan))、環孢靈、他克莫司及黴酚酸酯。
在一個實施例中，本發明之抗CD40抗體或其抗原結合部分(例如Ab102)與抗凝血劑組合用於治療SLE。抗凝血劑之實例包括(但不限於)阿司匹靈(aspirin)、肝素、華法林(warfarin)及依諾肝素(enoxaparin)(拉福諾克斯(Lovenox))。
較佳額外治療劑之其他實例可以與一或多種CD40拮抗劑(例如抗CD40抗體或其片段)共投與及/或調配。該等組合可用於治療如本文所闡述之CD40相關病症。可以與一或多種抗CD40抗體或其片段共投與及/或調配之治療劑的額外實例包括以下中之一或多者：尤其TNF拮抗劑(例如TNF受體之可溶性片段，例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物，例如75kD TNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，依那西普))；TNF酶拮抗劑，例如TNF轉化酶(TACE)抑制劑；蕈毒鹼受體拮抗劑；TGF-β拮抗劑；干擾素γ；吡非尼酮；化學治療劑，例如甲胺喋呤、來氟米特或西羅莫司(雷帕黴素)或其類似物，例如CCI-779；COX2及cPLA2抑制劑；非類固醇消炎藥(NSAID)；免疫調節劑；p38 抑制劑、TPL-2、MK-2及NFkB抑制劑。
其他較佳組合為抑制細胞介素之消炎藥(CSAID)；其他人類細胞介素或生長因子以及此等細胞介素及生長因子之受體的抗體或拮抗劑，該等細胞介素及生長因子例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-31、干擾素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、EGF、PDGF及內皮素-1。本發明之抗體或其抗原結合部分可與細胞表面分子(諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA)或其配體(包括CD154(gp39或CD40L))之抗體組合。
治療劑之較佳組合可以干擾發炎級聯反應中之不同點；較佳實例包括TNF拮抗劑，如嵌合、人類化或人類TNF抗體、阿達木單抗(修美樂(HUMIRA)；D2E7；PCT公開案第WO 97/29131號)、CA2(瑞米凱德(REMICADE))、CDP 571及可溶性p55或p75 TNF受體、其衍生物(p75TNFR1gG(依那西普)或p55TNFR1gG(來那西普(LENERCEPT))以及TNF轉化酶(TACE)抑制劑；類似地，出於相同原因，IL-1抑制劑(介白素-1轉化酶抑制劑、IL-1RA等)可為有效的。其他較佳組合包括介白素4。
可調整給藥方案以提供最佳所要反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。就易投藥性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於欲治療之哺乳動物個體的物理個別單元；各單元含有經計算可產生所要治療效果的預定量之活性化合物與所需醫藥載劑結合。本發明之單位劑型之規格係由下列情況指定且直接視下列情況而定：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定 治療或預防效果，及(b)混合此類活性化合物以治療個體敏感性之技術中的固有限制。
應注意，劑量值可隨欲緩解之病狀的類型及嚴重程度變化。此外應瞭解，對任何特定個體而言，特定給藥方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與的人員的專業判斷而隨時調整，且本文所闡述之劑量範圍僅為例示性的，且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實務。
在另一態樣中，本申請案之特徵在於一種治療(例如，治癒、抑止、改善、延遲或預防發作或預防再現或復發)或預防個體中CD40活性有害的病症的方法。該方法包括：以足以治療或預防CD40相關病症之量向個體投與CD40結合劑(尤其拮抗劑)，例如本文所述之抗CD40抗體或其片段。CD40拮抗劑(例如抗CD40抗體或其片段)可單獨或與如本文所述之其他治療模式組合向個體投與。
在另一態樣中，本申請案提供一種用於活體外偵測樣品(例如，生物樣品，諸如血清、血漿、組織、生檢)中CD40之存在情況的方法。本發明方法可用於診斷病症，例如發炎性病症。該方法包括：(i)使樣品或對照樣品與如本文所述之抗CD40抗體或其片段接觸；及(ii)偵測在抗CD40抗體或其片段與樣品或對照樣品之間的複合物形成情況，其中樣品相對於對照樣品在複合物形成方面之統計學顯著變化指示樣品中CD40之存在情況。
在又另一態樣中，本申請案提供一種用於活體內偵測CD40之存在情況的方法(例如，在個體中活體內成像)。本發明方法可用於診斷病症，例如CD40相關病症。該方法包括：(i)在允許抗體或片段與CD40結合之條件下，向個體或對照個體投與如本文所述之抗CD40抗體或其片段；及(ii)偵測抗體或片段與CD40之間的複合物形成情況，其中個體相對於對照個體在複合物形成方面之統計學顯著變化指示 CD40之存在情況。
置換Fc部分中之胺基酸殘基以更改抗體效應功能為此項技術中已知的(Winter等人之美國專利第5,648,260號；第5624821號)。抗體之Fc部分介導若干重要的效應功能，例如細胞介素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。在一些情況下，此等效應功能為治療性抗體所需的，但在其他情況下，視治療目標而定，可能為不必要的或甚至有害的。某些人類IgG同型，尤其IgG1及IgG3，分別經由結合至FcγR及補體C1q來介導ADCC及CDC。新生的Fc受體(FcRn)為決定抗體之循環半衰期的關鍵組分。在另一實施例中，抗體恆定區(例如抗體之Fc區)中之至少一個胺基酸殘基發生置換，使得抗體之效應功能更改。
一個實施例提供一種經標記抗體或其抗原結合部分，其中本發明之抗體或抗體部分經衍生或與一或多個功能分子(例如，另一種肽或蛋白質)連接。舉例而言，本發明之經標記抗體或其抗原結合部分可以藉由將本發明之抗體或抗體部分(藉由化學偶聯、基因融合、非共價結合或以其他方式)功能上連接至一或多種其他分子實體來衍生，該一或多種其他分子實體諸如另一種抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測試劑、醫藥製劑、可以介導抗體或抗體部分與另一種分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)之結合的蛋白質或肽及/或選自由以下組成之群的細胞毒性劑或治療劑：有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、免疫調節劑、基因療法載體、烷基化劑、抗血管生成劑、抗代謝產物、含硼劑、化學保護劑、激素、抗激素劑、皮質類固醇、光敏性治療劑、寡核苷酸、放射性核素劑、拓樸異構酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、放射增敏劑及其組合。
可適用於衍生化本發明之抗體或抗體部分的可偵測試劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹 明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素及其類似物。亦可用可偵測酶，諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似者衍生化抗體。當抗體用可偵測酶衍生化時，其係藉由添加酶用於產生可偵測反應產物之其他試劑來偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺產生可偵測的著色反應產物。抗體亦可用生物素衍生化，且經由抗生素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合之間接量測來偵測。
本發明之另一實施例提供一種結晶抗體或其抗原結合部分。較佳地，本發明係關於如本文中所揭示之完整抗CD40抗體及其片段之晶體，包含該等晶體之調配物及組合物。在一個實施例中，結晶抗體或其抗原結合部分之活體內半衰期大於抗體或其抗原結合部分之可溶性對應物。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分在結晶之後保留生物活性。
本發明之結晶抗體或其抗原結合部分可根據此項技術中已知及如以引用的方式併入本文中之WO 02072636中所揭示之方法產生。
IV.醫藥組合物
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有效量」之本發明之抗體或抗體部分。「治療有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內可有效達成所要治療結果的量。抗體或抗體部分之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可視以下因素而變化：諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及抗體或抗體部分在個體中引起所要反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。「預防有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內，可有效達成所要預防結果之量。通常，由於預防劑量係在疾病 之前或在疾病早期用於個體，因此預防有效量將小於治療有效量。
包含本發明抗體之醫藥組合物係用於(但不限於)診斷、偵測或監控病症；預防、治療、管理或改善病症或其一或多種症狀；及/或研究。在一個特定實施例中，組合物包含一或多種本發明抗體。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明抗體及一或多種除本發明抗體以外的用於治療CD40活性有害之病症的預防劑或治療劑。較佳地，預防劑或治療劑已知適用於或已用於或當前正用於預防、治療、管理或改善病症或其一或多種症狀。根據此等實施例，組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明之抗體及抗體部分可併入適用於向個體投與之醫藥組合物中。通常，醫藥組合物包含本發明之抗體或抗體部分及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者以及其組合。在許多情況下，在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉將為較佳的。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含極少量之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其可增加抗體或抗體部分之存放期或有效性。
已知各種傳遞系統且其可用於投與一或多種本發明抗體或一或多種本發明抗體與適用於預防、管理、治療或改善病症或其一或多種症狀之預防劑或治療劑的組合，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現抗體或抗體片段之重組細胞中；受體介導之內飲作用(參見例如Wu及Wu,J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))；將核酸構築為反轉錄病毒或其他載體之一部分；等等。投與本發明之預防劑或治療劑 之方法包括(但不限於)非經腸投與(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、瘤內投與及黏膜投與(例如鼻內及經口途徑)。另外，亦可使用肺部投藥，例如使用吸入器或噴霧器，及用氣霧劑調配。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，本發明抗體、組合療法或本發明組合物係使用Alkermes AIR經肺藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與。在一個特定實施例中，本發明之預防劑或治療劑係肌肉內、靜脈內、瘤內、經口、鼻內、經肺或皮下投與。預防劑或治療劑可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射，藉由經上皮或黏膜皮膚襯層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部的。
在一個特定實施例中，可能需要將本發明之預防劑或治療劑局部投與至需要治療之區域；此可藉由例如(但不限於)局部輸注、注射或藉助於植入物來達成，該植入物為多孔或無孔材料，包括膜及基質，諸如矽橡膠膜(silastic membrane)、聚合物、纖維基質(例如TISSUEL)或膠原蛋白基質。在一個實施例中，將有效量之一或多種本發明抗體拮抗劑局部投與至個體之受侵襲區域，從而預防、治療、管理及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，將有效量之一或多種本發明抗體與有效量之一或多種除本發明抗體以外之療法(例如，一或多種預防劑或治療劑)組合局部投與至個體之受侵襲區域，從而預防、治療、管理及/或改善病症或其一或多種症狀。
在另一實施例中，本發明之預防劑或治療劑可以在控制釋放或 持續釋放系統中傳遞。在一個實施例中，可使用泵來達成控制釋放或持續釋放(參見Langer之前述文獻；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980,Surgery 88：507；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一實施例中，可使用聚合材料達成本發明療法之控制釋放或持續釋放(參見例如，Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編),Wiley,New York(1984)；Ranger及Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；亦參見Levy等人，1985,Science 228：190；During等人，1989,Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.71：105)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。用於持續釋放調配物之聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚丙交脂(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個較佳實施例中，用於持續釋放調配物中之聚合物為惰性，不含可濾出雜質，儲存穩定，無菌且生物可降解。在又另一實施例中，控釋釋放或持續釋放系統可鄰近預防或治療目標置放，從而僅需要全身劑量之一部分(參見例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release，同前文獻，第2卷，第115-138頁(1984))。
控制釋放系統在Langer之綜述(1990,Science 249：1527-1533)中有所論述。熟習此項技術者已知之任何技術皆可用於製造包含一或多種 本發明治療劑之持續釋放調配物。參見例如美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548；PCT公開案WO 96/20698；Ning等人，1996,「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」,Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等人，1995,「Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions」,PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等人，1997,「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；及Lam等人，1997,「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其各自以全文引用的方式併入本文中。
在本發明組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸的特定實施例中，可活體內投與核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑的表現，此係藉由將其構築為適當核酸表現載體之一部分且投與其，使得其變成細胞內，例如藉由使用反轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic,Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包覆包衣，或藉由將其連同已知進入細胞核之同源盒樣肽一起投與(參見，例如Joliot等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)。或者，核酸可藉由同源重組引入細胞內且併入宿主細胞DNA內用於表現。
將本發明之醫藥組合物調配成與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括(但不限於)非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、經口、鼻內(例如吸入)、經皮(例如局部)、經黏膜及經直腸投與。在一個特定實施例中，組合物係根據常規程序調配為適合於靜脈內、皮下、肌 肉內、經口、鼻內或局部投與給人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之組合物為於無菌等張水性緩衝劑中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以減輕注射位點之疼痛。
若本發明之組合物將局部投與，則該等組合物可以軟膏、乳膏、經皮貼片、潤膚液、凝膠、洗髮精、噴霧、氣霧劑、溶液、乳液的形式或熟習此項技術者熟知的其他形式調配。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。關於不可噴霧之局部劑型，通常採用包含與局部施用相容之載劑或一或多種賦形劑且動態黏度較佳大於水之黏性至半固體或固體形式。適合調配物包括(但不限於)溶液、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似者，必要時將其滅菌或與用於影響諸如滲透壓之各種特性的助劑(例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、緩衝劑或鹽)混合。其他適合的局部劑型包括可噴霧的氣霧劑製劑，其中較佳與固體或液體惰性載劑組合之活性成分與加壓揮發性物質(例如氣態推進劑，諸如氟氯烷(freon))混合封裝或封裝於擠壓瓶中。必要時，亦可向醫藥組合物及劑型中添加增濕劑或保濕劑。此類額外成分之實例為此項技術中熟知的。
若本發明方法包含鼻內投與組合物，則該組合物可調配成氣霧劑形式、噴霧劑、薄霧或滴液形式。特定言之，根據本發明使用之預防劑或治療劑宜藉助於使用適合推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體)，以氣霧劑噴霧呈現形式自加壓包裝或噴霧器傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，劑量單位可藉由提供可傳遞計量之量的閥來決定。可調配含有化合物與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物的膠囊及藥筒(由例如明膠構 成)用於吸入器或吹入器中。
若本發明方法包含經口投與，則組合物可調配為錠劑、膠囊、扁囊劑、膠囊錠、溶液、懸浮液及其類似者之口服形式。錠劑或膠囊可藉由習知手段用醫藥學上可接受之賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑(例如，預膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或矽石)；崩解劑(例如，馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)或濕潤劑(例如，月桂基硫酸鈉)。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆。用於經口投與之液體製劑可呈(但不限於)溶液、糖漿或懸浮液形式，或其可呈現為乾燥產品，在使用之前用水或其他適合媒劑復原。該等液體製劑可藉由習知手段用醫藥學上可接受之添加劑製備，該等添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠(acacia))；非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。該等製劑亦可酌情含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及甜味劑。用於經口投與之製劑可經適當調配以緩慢釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。
本發明方法可包含例如藉由使用吸入器或噴霧器經肺投與與氣霧劑一起調配之組合物。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一個特定實施例中，本發明抗體、組合療法及/或本發明組合物係使用Alkermes AIR經肺藥物傳遞技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與。
本發明方法可包含藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)投與經調配用於非經腸投與之組合物。注射用調配物可以添加有防腐劑之單位劑型(例如，於安瓿或多劑量容器中)呈現。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可呈在使用之前用適合媒劑(例如，無菌無熱原質水)復原之粉末形式。
本發明方法可另外包含投與調配為儲槽式製劑之組合物。該等長效調配物可藉由植入(例如，皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，組合物可用適合的聚合或疏水性物質(例如，如於可接受之油中的乳液)或離子交換樹脂或微溶衍生物(例如，微溶鹽)調配。
本發明方法涵蓋投與經調配為中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。
一般而言，組合物之成分係單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如呈於標明活性劑之量之氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。當投與模式為輸注時，組合物可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。當投與模式為注射時，可提供一安瓿注射用無菌水或生理食鹽水以使得可在投與之前混合成分。
特定言之，本發明亦規定，本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係封裝於標明藥劑之量之氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中。在一個實施例中，本發明之一或多種預防劑或治療劑或者醫藥組合物係以乾燥無菌凍乾粉末或無水濃縮物形式提供於氣密密 封式容器中且其可復原(例如用水或生理食鹽水)至適當濃度以向個體投與。較佳地，本發明之一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物係以至少5mg、更佳至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg之單位劑量以乾燥無菌凍乾粉末形式提供於氣密密封式容器中。本發明之凍乾預防劑或治療劑或醫藥組合物應在2℃至8℃下儲存在其初始容器中，且本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物應在復原後1週內、較佳5天內、72小時內、48小時內、24小時內、12小時內、6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一個替代實施例中，本發明之一或多種預防劑或治療劑或醫藥組合物係以液體形式提供於標明藥劑之數量及濃度之氣密密封式容器中。較佳地，液體形式之所投與組合物以至少0.25mg/ml、更佳至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml提供於氣密密封式容器中。液體形式應在2℃至8℃下儲存在其初始容器中。
本發明之抗體及抗體部分可併入適用於非經腸投與之醫藥組合物中。抗體或抗體部分較佳將製備為含有0.1-250mg/ml抗體之可注射溶液。可注射溶液可由液體或凍乾劑型構成，於燧石或琥珀小瓶、安瓿或預填充注射器中。緩衝劑可為L-組胺酸(1-50mM)，最佳地5-10mM，pH 5.0至7.0(最佳pH 6.0)。其他適合緩衝劑包括(但不限於)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用濃度為0-300mM(對於液體劑型，最佳為150mM)之氯化鈉來修改溶液之毒性。對於凍乾劑型，可包括低溫保護劑，主要為0-10%蔗糖(最佳為0.5-1.0%)。其他適合之低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型，可包括膨化劑，主要為1-10%甘露糖醇(最佳為2-4%)。液體及凍乾劑型中均可使用穩定劑，主要為1-50mM L-甲硫胺酸(最佳為5-10mM)。其他適合的膨 化劑包括甘胺酸、精胺酸，可以0-0.05%聚山梨醇酯80(最佳為0.005-0.01%)形式包括。其他界面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯20及BRIJ界面活性劑。按用於非經腸投與之可注射溶液製備的包含本發明之抗體及抗體部分之醫藥組合物可以進一步包含適用作佐劑之試劑，諸如用於增大治療蛋白(例如抗體)之吸收或分散的試劑。特別適用之佐劑為玻尿酸酶，諸如HYLENEX(重組人類玻尿酸酶)。在可注射溶液中添加玻尿酸酶改良非經腸投藥、尤其皮下投藥後的人類生物可用性。其亦允許伴隨較少疼痛及不適的較大注射部位體積(亦即大於1ml)，且注射部位反應之發生率極小。(參見WO2004078140、US2006104968，其以引用的方式併入本文中)。
在一個實施例中，本發明包括一種醫藥組合物，其包含本發明抗體(例如抗體Ab102)、組胺酸及聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)。在一個實施例中，本發明包括一種醫藥組合物，其包含抗體、組胺酸及聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)，該抗體包含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸的重鏈及包含SEQ ID NO：40之胺基酸的輕鏈。在某些實施例中，醫藥組合物經凍乾。
本發明之組合物可呈多種形式。此等形式包括(例如)液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。較佳形式視預期投藥模式及治療應用而定。典型的較佳組合物呈可注射或可輸注溶液之形式，諸如與用於使人類經其他抗體被動免疫之組合物類似的組合物。較佳投藥模式為非經腸(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在一個較佳實施例中，藉由靜脈內輸注或注射投與抗體。在另一較佳實施例中，藉由肌肉內或皮下注射投與抗體。
治療組合物通常必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他 有序結構。無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物(亦即，抗體或抗體部分)與以上所列成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中、隨後視需要過濾滅菌來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入含有基本分散介質及來自以上所列成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌凍乾粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及噴霧乾燥，其得到活性成分加上來自先前經無菌過濾之活性成分溶液之任何其他所要成分的粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鹽及明膠之延遲吸收劑來達成。
本發明之抗體及抗體部分可藉由此項技術中已知的各種方法投與，但對於許多治療應用，較佳投藥途徑/模式為皮下注射、靜脈內注射或輸注。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所要結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可用將保護化合物不會快速釋放之載劑製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。許多用於製備此類調配物之方法已獲得專利或為熟習此項技術者所熟知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在某些實施例中，本發明之抗體或抗體部分可與例如惰性稀釋劑或可同化的可食用載劑一起經口投與。該化合物(及視需要選用之其他成分)亦可密封於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓縮成錠劑，或直接併入個體之飲食中。對於經口治療性投藥，可將化合物與賦形劑合併且以可攝取錠劑、經頰錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、 粉片及其類似者之形式使用。為藉由除非經腸投與以外之形式投與本發明之化合物，可能需要將該化合物用防止其失活之材料包覆或與防止其失活之材料共投與。
在其他實施例中，本發明之抗體或抗體部分可結合至基於聚合物之物質，使得該基於聚合物之物質可以賦予本發明之該抗體或抗體部分足夠的大小，使得本發明之該抗體或抗體部分可得益於增強的滲透及滯留效應(EPR效應)(亦參見PCT公開案第WO2006/042146A2號及美國公開案第2004/0028687A1號、第2009/0285757A1號及第2011/0217363A1號及美國專利第7,695,719號(其各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中))。
亦可將補充活性化合物併入組合物中。在某些實施例中，本發明之抗體或抗體部分係與一或多種適用於治療CD40活性有害的病症之額外治療劑一起調配及/或共投與。舉例而言，本發明之抗hCD40抗體或抗體部分可與一或多種結合其他目標之額外抗體(例如，結合細胞介素或結合細胞表面分子之抗體)一起調配及/或共投與。此外，本發明之一或多種抗體可與以上治療劑中之兩者或兩者以上組合使用。該等組合療法宜採用較低之治療劑投與劑量，從而避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。
在某些實施例中，針對CD40之抗體或其片段係與此項技術中已知之延長半衰期之媒劑相關。該等媒劑包括(但不限於)Fc域、聚乙二醇及聚葡萄糖。該等媒劑描述於例如美國申請案第09/428,082號及公開之PCT申請案第WO 99/25044號中，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。
在一個特定實施例中，藉助於基因療法，投與包含編碼本發明抗體或本發明之另一預防劑或治療劑之核苷酸序列的核酸序列來治療、預防、管理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法係指藉由向 個體投與已表現或可表現核酸進行之療法。在本發明之此實施例中，核酸產生其所編碼之本發明抗體或介導預防或治療作用之預防劑或治療劑。
可根據本發明使用此項技術中可得之任一種用於基因療法之方法。關於基因療法之方法的一般綜述，參見Goldspiel等人，1993,Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu及Wu,1991,Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan,Science 260：926-932(1993)；及Morgan及Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62：191-217；5月，1993,TIBTECH 11(5)：155-215。重組DNA技術領域通常已知之可用方法描述於Ausubel等人(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。基因療法之各種方法的詳細說明提供於US20050042664 A1中，其以引用的方式併入本文中。
熟習此項技術者將易於瞭解，本文所述之本發明方法的其他適合修改及改編顯而易見且可在不脫離本發明或其中所揭示之實施例之範疇的情況下使用適合的等效物進行。現已詳細描述了本發明，參考以下實例將更清楚理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不意欲限制本發明。
實例 實例1：拮抗性抗人類CD40(hCD40)單株抗體
為鑑別CD40特異性拮抗性抗體，使用融合瘤技術分離鼠類單株抗CD40抗體。
簡言之，用人類CD40抗原及佐劑使小鼠免疫。在免疫(其包括歷時數週投與若干次抗原)之後，自各經免疫動物收集血清。隨後使用標準ELISA及流動式細胞測量術分析測試血清，以鑑別具有能夠偵測 CD40之抗體的血清。在基於結合分析偵測到在小鼠血清中存在CD40特異性抗體之後，收集小鼠脾臟且根據標準技術分離產抗體細胞。隨後藉由已知技術融合脾細胞，形成產抗體之骨髓瘤細胞。在融合之後，藉由ELISA及流動式細胞測量術篩選融合瘤，以確定各種抗體CD40阻斷及中和特徵。
在篩選之後，雖然大多數抗體經鑑別具有促效活性，但三種鼠單株抗體(Ab1、Ab2及Ab3)經鑑別對CD40具有拮抗活性，且基本上無促效活性。該三個鼠抗體之重鏈及輕鏈胺基酸序列描述於下表7至9中。可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)內之CDR由粗體顯示(分別為CDR1、CDR2及CDR3)。
Figure 105116748-A0305-02-0102-9
Figure 105116748-A0305-02-0102-10
Figure 105116748-A0305-02-0103-12
Figure 105116748-A0305-02-0103-13
來自三個抗CD40拮抗性鼠單株抗體(Ab1、Ab2及Ab3)之CDR區 之共同序列經鑑別且提供於上文表5中。三個鼠抗體之可變區胺基酸序列之比對亦提供於圖4A(輕鏈)及圖4B(重鏈)中。
使用反轉錄酶-PCR(RT-PCR)選殖三個抗體之鼠重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)。隨後將此等VH及VL區(上文表7至9中所述)選殖至包含人類免疫球蛋白(Ig)恆定區之載體中，且隨後在哺乳動物宿主細胞中表現為嵌合抗體。隨後使用活體外分析表徵此等人類嵌合抗體(人類恆定區及鼠類可變區)，以各自判定其是否具有拮抗及/或促效作用。
使用FACS分析判定三個嵌合抗CD40抗體是否可以結合人類胎腎(HEK)細胞上表現之huCD40或cyno CD40。雖然三個嵌合抗體各自可結合HEK細胞上表現之人類CD40，但該等嵌合抗體中僅兩者識別cyno，嵌合抗體3(chAb3)不結合至cyno CD40。FACS結合研究之結果概述於表10中。
FACS分析亦用於判定三個嵌合抗體是否可抑制可溶性CD40配體(sCD40L)與CD40之結合。使用表現CD40之HEK細胞，量測IC50值。如表10中所述，嵌合抗體各自能夠阻斷CD40結合至其配體。
除結合分析之外，亦使用與NFkB介導之鹼性磷酸酶(AP)相關之表現CD40之報導細胞株表現人類CD40來量測拮抗活性及促效活性。在表現CD40之報導細胞株分析中，當經由CD40接收到信號時，NFkB活化導致AP之分泌，其藉由比色受質來量測。為測定拮抗活性，將CD40報導細胞株(HEK)與表現CD40L之Jurkat細胞株一起培養(以提供生理配體相互作用)或與可溶性CD40L(例如，表10中所提及之His-CD40L)一起培養。量測抗CD40抗體阻斷NFkB信號之能力。為量測促效活性，直接用抗CD40抗體處理人類CD40報導細胞株且量測NFkB信號。三個嵌合抗體之代表性CD40拮抗性及促效性分析資料概述於表10及圖1A及圖1B中。
表10：抗CD40嵌合抗體之功能特徵之概述
Figure 105116748-A0305-02-0105-14
如表10及圖1中所述，抗CD40嵌合抗體顯示出拮抗活性，且無可偵測之促效活性。基於以上實驗之結果，選擇抗CD40拮抗性抗體Ab1及Ab3之重鏈及輕鏈可變區進行人類化。
實例2：拮抗性抗CD40抗體Ab1及Ab3之人類化 拮抗性抗CD40抗體Ab1之人類化
基於Ab1之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)CDR序列產生人類化抗體。特定言之，選擇人類生殖系序列來構築CDR經移植之人類化Ab1抗體，其中Ab1之VH及VL鏈之CDR域經移植至不同的人類重鏈及輕鏈接受體序列上。基於與單株抗體Ab1之VH及VL序列之比對，選擇以下人類序列作為接受體：
1.IGHV3-21*01及IGHJ6*01，用於構築重鏈接受體序列
2.IGHV3-48*01及IGHJ6*01，作為用於構築重鏈之替代接受體
3.IGKV4-1*01及IGKJ2*01，用於構築輕鏈接受體序列
4.IGKV2-40*01及IGKJ2*01，作為用於構築輕鏈之替代接受體
隨後藉由將Ab1之相應VH及VL CDR移植至以上1-4中所述之接受體序列中製備CDR移植抗體。
為產生具有構架回復突變之人類化抗體，鑑別構架突變且將其引入CDR移植抗體中。此等突變係使用標準技術引入，包括在聚合酶鏈反應中從頭合成含回復突變及突變誘發寡核苷酸引子之可變域。針對CDR移植抗體(含有抗體Ab1之CDR)中之每一者，如下構築回復突 變與其他突變之不同組合。(注意：下文所提及之突變的殘基編號係基於Kabat編號系統。)
關於CDR移植抗體之重鏈，使以下游標殘基及VH/VL介接殘基中之一或多者發生回復突變：V48I及/或S49A。
關於CDR移植抗體之輕鏈，使以下游標殘基及VH/VL介接殘基發生回復突變：Y36F。
衍生自鼠單株Ab1之人類化抗體之可變區的說明提供如下：●人類化Ab1(huAb1VH.1)為含有IGHV3-21*01及IGHJ6*01構架序列之CDR經移植之Ab1 VH；●人類化Ab1VH.1a(huAb1VH.1A)為包含huAb1VH.1之胺基酸序列與以下兩個構架回復突變之人類化重鏈：V48I、S49A；●人類化Ab1VL.1(huAb1VL.1)為含有IGKV4-1*01及IGKJ2*01構架序列之CDR經移植之Ab1 VL；及●人類化Ab1VL.1a(huAb1VL.1A)為基於huAb1VL.1之人類化輕鏈且含有1個所提出之構架回復突變：Y36F。
注意：IGHV3-21_IGHJ6係指包含對應於IGHV3-21*01及IGHJ6*01之可變序列的抗體。
隨後將人類化可變區選殖至IgG表現載體中以便基於以下重鏈及輕鏈可變區組合對四種不同人類化抗體進行功能表徵：
A.huAb1VH.1/VL.1
B.huAb1VH.1A/VL.1
C.huAb1VH.1/VL.1A
D.huAb1VH.1A/VL.1A
以上人類化抗體之可變區及CDR胺基酸序列描述於下表11中。
表11：人類化版本之抗體1(huAb1)之VH及VL序列
Figure 105116748-A0305-02-0107-15
Figure 105116748-A0305-02-0108-16
如上所述，Ab1之VH及VL區之人類化版本的CDR與鼠Ab1抗體相同。
拮抗性抗CD40抗體3(Ab3)之人類化
亦基於Ab3之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)CDR序列產生人類化抗體。選擇人類生殖系序列來構築CDR經移植之人類化Ab3抗體，其中Ab3之VH及VL鏈之CDR域經移植至不同的人類重鏈及輕鏈接受 體序列上。基於與單株抗體Ab3之VH及VL序列之比對，選擇以下人類序列作為接受體：
1.IGHV3-69*06及IGHJ6*01，用於構築重鏈接受體序列
2.IGHV1-18*01及IGHJ6*01，作為用於構築重鏈之替代接受體
3.IGKV2-29*02及IGKJ2*01，用於構築輕鏈接受體序列
4.IGKV2-28*01及IGKJ2*01，作為用於構築輕鏈之替代接受體
隨後藉由將Ab3之相應VH及VL CDR移植至以上1-4中所述之接受體序列中製備CDR移植抗體。
為產生含構架回復突變之人類化抗體，鑑別多種構架突變且將其引入CDR移植抗體中。此等突變係使用標準技術引入，包括在聚合酶鏈反應中從頭合成含回復突變及突變誘發寡核苷酸引子之可變域。針對CDR移植抗體(含有抗體Ab3之CDR)中之每一者，構築突變(包括回復突變)之不同組合。(注意：下文所提及之突變的殘基編號係基於Kabat編號系統。)
關於重鏈Ab3，使以下游標殘基及VH/VL介接殘基中之一或多者發生回復突變：M48I、V67A、I69L。此外，考慮變為Q1E。引入Q1E突變係為防止形成焦麩胺酸鹽。
關於輕鏈Ab3，使以下游標殘基及VH/VL介接殘基中之一或多者發生回復突變：Y36F、L46Y。
衍生自鼠單株Ab3之人類化抗體之可變區的說明提供如下：
●huAb3VH.1z為含有IGHV1-69*06及IGHJ6*01構架序列之CDR經移植之人類化Ab3 VH。
●huAb3VH.1係基於huAb3VH.1z，含Q1E改變以防止形成焦麩胺酸鹽。
●huAb3VH.1A為基於huAb3VH.1之人類化設計且含有3個額外的構架回復突變：M48I、V67A、I69L。
●huAb3VH.1b為介於huAb3VH.1與huAb3VH.1A之間的中間設計且含有1個所提出之構架回復突變：I69L。
●huAb3VL.1為含有IGKV2-28*01及IGKJ2*01構架序列之CDR經移植之人類化Ab3 VL。
●huAb3VL.1A為基於huAb3VL.1之人類化設計且含有2個構架回復突變：Y36F、L46Y。
●huAb3VL.1B為介於huAb3VL.1與huAb3VL.1A之間的中間設計。其含有1個所提出之構架回復突變：L46Y。
亦應注意：* IGHV1-69_IGHJ6由IGHV1-69*06及IGHJ6*01生殖系序列組成。
隨後將人類化可變區選殖至IgG表現載體中以便基於以下重鏈及輕鏈可變區組合對九種不同人類化抗體進行功能表徵：
A.huAb3VH.1/VL.1
B.huAb3VH.1B/VL.1
C.huAb3VH.1A/VL.1
D.huAb3VH.1/VL.1A
E.huAb3VH.1B/VL.1A
F.huAb3VH.1A/VL.1A
G.huAb3VH.1/VL.1B
H.huAb3VH.1B/VL.1B
I.huAb3VH.1A/VL.1B
以上人類化抗體之可變區及CDR胺基酸序列描述於下表12中。
Figure 105116748-A0305-02-0110-17
Figure 105116748-A0305-02-0111-18
Figure 105116748-A0305-02-0112-19
Figure 105116748-A0305-02-0113-20
Figure 105116748-A0305-02-0114-21
Figure 105116748-A0305-02-0115-22
如上所述，Ab3之VH及VL區之人類化版本的CDR與鼠Ab3抗體相同。
因為Ab3不結合至cyno CD40(參見實例1)，所以選擇Ab1之人類化版本進行進一步分析。
實例3：人類化Ab1抗體之VL CDR1之修飾
檢查上述人類化Ab1 VH及VL抗體序列，鑑別暴露於輕鏈CDR1中之潛在脫醯胺序列基元(「NS」基元)。所鑑別之「NS」基元位點會引起脫醯胺及水解，且產生丁二醯亞胺中間體及天冬胺醯基-ASP或異ASP。因此，該序列基元係由人類化Ab1 VL CDR1序列工程改造所得。移除「NS」基元將促使抗體製造改良。
進一步工程改造人類化Ab1，產生六個不同抗體。值得注意地是，四個保留拮抗活性，而兩個變成促效性抗體(huAb1v4及huAb1v3)。如表14中所示，huAb1v4及huAb1v3顯示促效活性，如藉由huCD40報導基因分析所測定；同時不呈現拮抗活性，如在Jurkat/報導基因分析中所測定。變異的人類化Ab1抗體(huAb1v1至huAb1v6)之VH及VL胺基酸序列以及CDR描述於下表13中。
Figure 105116748-A0305-02-0115-23
Figure 105116748-A0305-02-0116-24
Figure 105116748-A0305-02-0117-25
Figure 105116748-A0305-02-0118-26
除VL CDR1中之「NS」基元之修飾之外，上文在表13中所述之變異體huAb1v2及huAb1v3在其VH域中亦具有額外構架突變。
下表14提供變異體之結合活性、促效活性及拮抗活性之概述。該等分析之說明可見於上文實例2中。在下表14中，VL CDR1中突變之「NS」基元加底線。如表14中所述，抗體huAb1v4(在VL CDR1域中含有「P」突變)及huAb1v3(在VL CDR1域中含有「L」突變且在VH區內含有構架突變)儘管衍生自具有拮抗活性之親本抗體，仍展現出促效活性。
Figure 105116748-A0305-02-0118-27
*VH中之額外構架差異
選擇人類化抗CD40抗體huAb1v1進行進一步研究及改良。
實例4：抗CD40抗體huAb1v1之HC CDR2之工程改造
自實例3中所述之變異體，選擇抗體huAb1v1進行進一步分析。為進一步改良此抗體之效能，產生在HC CDR2域內含有突變之 huAb1v1重鏈(HC)變異體。製得十七種額外變異體(稱為huAb1v1CDR2v1至v17)。使變異體HC區與huAb1v1 LC(SEQ ID NO：20)配對以進行活性研究，從而測定促效活性及拮抗活性。製得十七個變異體重鏈，且活體外活性研究顯示，一般而言，變異體保留其拮抗活性且效能不同於huAb1v1。表15顯示，雖然抗體變異體維持拮抗活性，但各變異體之效能不同。
Figure 105116748-A0305-02-0119-28
所有huAb1v1 HC變異體在位置S55皆有突變，如下表16(位置55加底線)中所述。
Figure 105116748-A0305-02-0120-29
Figure 105116748-A0305-02-0121-30
下表17提供在S55殘基(呈粗體/加底線)之工程改造之後，上述huAb1v1變異體之HC CDR2區之比較。huAb1v1之VH CDR2區對應於SEQ ID NO：15之胺基酸殘基50-66。
Figure 105116748-A0305-02-0121-31
Figure 105116748-A0305-02-0122-32
選擇重鏈可變區huAb1v1CDR2v7，因為其具有優於上表15-17中所產生且所述之其他變異體的特別有利的特性。值得注意地，huAb1v1CDR2v7在其HC CDR2中具有突變，經鑑別為S55G。特定言之，含有抗體huAb1v1之VL(SEQ ID NO：20；參見表13)及VH huAb1v1CDR2v7之抗體經測定具有相比於抗體huAb1v1增加20倍之拮抗活性。
使huAbv1之VL及huAb1v1CDR2v7之VH在兩種不同的人類IgG1恆定區之情況下表現。選擇一個IgG1恆定區，因為其效應功能減弱(hCg1,z,non-a L234A、L235A或LALA)；且選擇其他IgG1恆定區，因為其效應功能減弱且其具有一組可增強FcRn結合之突變(hCg1,z,non-a L234A、L235A-T250Q、M428L或LALA-QL)。下表18及19提供關於抗人類CD40抗體Ab101(VL huAbv1/VH huAb1v1CDR2v7/hCg1/k-LALA)及Ab102(VL huAbv1/VH huAb1v1CDR2v7/hCg1/k-LALA-QL)之重鏈及輕鏈的胺基酸序列資訊。各VH或VL序列之個別CDR之胺基酸殘基用粗體指出。在表19中，恆定區加底線。
Figure 105116748-A0305-02-0122-34
Figure 105116748-A0305-02-0123-39
Figure 105116748-A0305-02-0123-38
Figure 105116748-A0305-02-0124-41
實例5：人類化拮抗性抗hCD40抗體Ab101及Ab102之功能表徵 活體外分析
人類化抗CD40抗體Ab101及Ab102均顯示拮抗活性，類似於實例1中所述之報導基因分析中之發現。因為殘餘促效活性與潛在風險有關，所以研發B細胞促效性分析。在此分析中，針對人類B細胞中CD86上調之抑制情況，評定抗體。人類B細胞組成性表現CD40且經由CD40進行信號傳導，引起B細胞活化，如藉由表面上之CD86之上 調所量測。用低劑量抗IgM及IL4活化B細胞且添加CD40拮抗性抗體。按CD86之上調量測B細胞活化之增強，其係在促效性CD40而非拮抗性CD40 Ab存在下觀察到的，表明前者候選物之活體外不可偵測之促效活性。為量測拮抗活性，將初級人類B細胞與表現CD40L之人類T細胞株一起培養，其經由CD40/CD40L相互作用引起B細胞活化及CD86表現上調。量測拮抗性CD40抑制初級人類B細胞之CD86上調的能力且顯示出抗CD40抗體Ab101之強拮抗活性，如圖2B中所示。圖2A顯示抗體Ab101不具有促效活性。值得注意地，如圖2B中所述，抗體Ab101之IC50值為1.337，對比拮抗性抗體Blb(Boehringer Ingelheim)之IC50值4.213及促效性抗體4D11(Astellas)之IC50值0.1906。因此，抗體Ab101(及Ab102，鑒於相同的可變區)為CD40之強拮抗劑且基本上不顯示活體外促效活性。
活體內分析
為測試抗體Ab101之活體內活性，建立人類抗體產生及B細胞存活之模型。簡言之，當將自健康供體分離之人類PBMC轉移至免疫功能不全的scid小鼠中時，響應於小鼠抗原產生人類IgG，其可在14天後量測。另外，來自此等小鼠之脾細胞之FACS分析指示人類B細胞移植及存活。藉由包括用破傷風類毒素(TetTox)疫苗攻擊及量測抗TetTox特異性IgG來量測抗原特異性反應(Naito,2000；Jeurissen,2004)。
用週劑量之抗人類CD40(Ab101，5mg/kg，腹膜內)處理此等huscid小鼠引起人類IgG產生(圖3A)及B細胞存活(圖3B)之抑制>85%，清楚證明抗體在活體內具有活性。特定言之，圖3A顯示抗體Ab101相比於Ig對照能夠抑制IgG產生，且圖3B指出，在以上huscid模型中投與抗體Ab101抑制B細胞存活。
實例6：Fab Ab102之抗原決定基分析
使用Fab Ab102，進行晶體學研究來判定Fab Ab101所結合之抗原決定基。如上所述，抗體Ab101及Ab102之VH及VL序列相同，且因此，在以下晶體結構研究中Fab Ab102之使用代表抗體Ab101及Ab102兩者之結合特徵。
測定單獨的Ab102 Fab及與CD40抗原複合之Ab101 Fab的晶體結構。獲得晶體且在IMCA-CAT 17ID光束線下收集資料。Ab102 Fab之晶體結構經解析為1.74Å解析度且Ab102 Fab/CD40複合物結構經解析為2.84Å解析度。晶體結構提供Ab102 Fab之3D構形抗原決定基之鑑別。
Ab102 Fab之3D構形抗原決定基之鑑別
Ab102 Fab與CD40之間的接觸涉及關鍵的氫鍵及穩定界面之疏水相互作用。使用CCP4程式套中之程式NCONT產生分子接觸清單(在4.0Å下量測)。量測兩個各別結晶學CD40單體與Ab102 Fab之相應結合的輕鏈及重鏈之間的接觸。在Ab102 Fab與結晶學CD40二聚體(由晶體接觸產生之二聚體)之間觀察到額外接觸。基於此資訊，Ab102 Fab結合之抗原決定基包含由CD40之Cys62-Phe67、Gln79-Cys83、Arg90-Thr99、Thr24-Cys37界定之拓樸區。
材料及方法 CD40抗原之製備及純化：
將編碼人類CD40細胞外域之DNA序列(胺基酸1-193)選殖至pHybE載體中，繼之以同框C端Tev蛋白酶裂解位點及六組胺酸標籤(SEQ ID NO：115)。使用轉染試劑聚乙烯亞胺(PEI，Polysciences Inc)，以4：1之PEI：DNA比，將質體以1×10e6個細胞/毫升轉染至HEK2936e細胞(MRL)中。在轉染後24小時，向經轉染的細胞培養物中饋入胰化蛋白-N1(至0.5%)。在轉染後第7天，藉由離心，隨後經由0.2u PES過濾器(Corning)過濾，對經轉染的細胞培養物進行清潔。使 用配備有10kDa膜(GE Healthcare)之Kvick TFF系統，將經清潔之培養基的緩衝液更換為PBS，pH 7.4，且將其加載至經PBS(pH 7.4)平衡之5mwHisTrap FF柱(GE Healthcare)上。用PBS(pH 7.4)中之25mM咪唑洗滌管柱且用PBS(pH 7.4)中之250mM咪唑溶離所結合的蛋白質。使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置(Millipore)，以10kDa分子量截斷濃縮經溶離蛋白質，且藉由SEC，於經PBS(pH 7.4)平衡且操作之26/60 Superdex 200柱(GE Healthcare)上進一步純化。合併含有CD40之溶離份，藉由在280nm下之吸光度量測濃度，且藉由SEC、SDS-PAGE及質譜法分析樣品。將[CD40(h)(21-193)]-Tev-His6(「His6」揭示為SEQ ID NO：115)以等分試樣儲存在-80℃下。
CD40 Ab102 Fab片段之製備及純化：
藉由木瓜酶裂解親本mAb製備CD40 Ab102之Fab片段，如下詳述。用PBS(pH 7.4)緩衝液中之50mM半胱胺酸活化木瓜酶。將PBS(pH 7.4)緩衝液中之mAb CD40 Ab102[hu IgG1/k]LALA QL與木瓜酶以1：100之木瓜酶：mAb重量比混合且在37℃下培育1h。用5mM碘乙醯胺淬滅反應。在10ml Mab SelectSure樹脂(GE Healthcare)上純化混合物，其中將Fab片段以流經物形式收集。使用Ultrafree-15 Biomax 10kDa分子量截斷(MWCO)離心裝置(Millipore)濃縮流經物。於在50mM HEPES、50mM NaCl緩衝液(pH 7.5)中預平衡之2.6cm×60cm Sephacryl 200 HiPrep柱(GE Healthcare)上純化經濃縮之混合物。將含有Fab片段(藉由在280nm下之UV吸光度監測)之溶離份合併且冷凍在-80℃下。藉由分析型SEC、SDS-PAGE及質譜法評定樣品純度。
CD40/CD40 Ab102 Fab複合物製備：
使重組人類CD40在哺乳動物表現系統中表現且隨後使用此項技術中熟知之技術純化。將重組人類CD40及CD40 Ab102 Fab蛋白質以1.1：1莫耳比混合且在4℃下培育4h。將複合物樣品以1ml/min加載至 在50mM HEPES、50mM NaCl緩衝液(pH 7.5)中預平衡之2.6cm×60cm Sephacryl 200 HiPrep柱(GE Healthcare)上。將含有複合物(藉由在280nm下之UV吸光度監測)之溶離份合併且使用Ultrafree-15 Biomax 10kDa分子量截斷(MWCO)離心裝置(Millipore)濃縮至18mg/ml。藉由分析型SEC及SDS-PAGE評定樣品純度。
Ab102 Fab結晶：
以22.5mg/ml於50mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.5)中提供單獨的Fab。在23℃下藉由蒸氣擴散，晶體生長。儲集器含有25%(w/v)PMME 550、0.1M MES pH 6.5、0.01M硫酸鋅。藉由添加相等體積之蛋白質及儲集器溶液進行滴液。晶體生長為厚稜柱且使用添加有10%(v/v)丙二醇之儲集器溶液進行低溫保護。收集晶體，經由低溫溶液洗滌且直接在液氮中低溫冷卻。在阿貢國家實驗室(Argonne National Laboratories)(Argonne IL)，在氣態氮，100K下，在17ID光束線下於先進光子源下收集1.74Å之繞射資料。
與CD40抗原複合之Ab102 Fab的結晶：
以18mg/ml於50mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.5)中提供Fab複合物。所用抗原構築體為[CD40(h)(21-193)]-TEV-6His(「His6」揭示為SEQ ID NO：115)。在23℃下藉由蒸氣擴散，晶體生長。儲集器含有2M硫酸銨、0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽，pH 4.2。藉由添加相等體積之蛋白質及儲集器溶液進行滴液。晶體生長為細棒且使用2.5M硫酸鋰低溫保護。收集晶體，經由低溫溶液洗滌且直接在液氮中低溫冷卻。在阿貢國家實驗室(Argonne IL)，在氣態氮，100K下，在17ID光束線下於先進光子源下收集2.84Å之繞射資料。
Ab102 Fab及Ab102 Fab CD40複合物之結構測定
使用來自Global Phasing Ltd之程式autoPROC處理兩種晶體結構之繞射資料。
在空間群C2221中，按以下單位晶胞尺寸處理Ab102 Fab資料集：a=64.65 b=130.4 c=132.6。使用程式PHASER，使用先前已有報導之Fab搜索模型(蛋白質資料庫(Protein Data Bank)條目3Q0S)確定最大可能分子置換解法。基於分子置換解法產生1個Fab分子之座標。使用REFMAC及程式BUSTER初步優化所得解法。使用程式COOT且檢查2Fo-Fc及Fo-Fc電子密度圖來執行迭代蛋白質模型構建。優化以使用BUSTER添加水分子結束。最終優化統計資料報導為R自由/R工作(Rfree/Rwork)值：0.23/0.19。
在空間群P21212中，按以下單位晶胞尺寸處理Ab102 Fab CD40複合物資料集：a=173.3 b=76.0 c=126.1。使用程式PHASER，使用以上所報導之預先解析之Ab102 Fab確定最大可能分子置換解法。基於分子置換解法發現2個Fab分子之座標。使用REFMAC及程式BUSTER初步優化所得解法。使用程式COOT且檢查2Fo-Fc及Fo-Fc電子密度圖手動構建CD40之模型。優化以使用BUSTER添加水分子結束。最終優化統計資料報導為R自由/R工作值：0.25/0.20。
實例7：Ab102在單核細胞活化分析中之中和效能及促效活性
在此實例中使用以下方法來檢查Ab102之活體外拮抗及促效活性。
拮抗性分析：在拮抗性分析中評定Ab102阻斷CD40介導之單核細胞活化之能力。在80ng/mL GM-CSF及80ng/mL IFNγ存在下，將經純化之單核細胞以2×106/mL之濃度與1μg/mL MEGACD40L(Enzo)混合。在96孔U形底組織培養(TC)盤中，每孔添加50μL。在培養基中製備測試材料之稀釋液，且向自供體獲得之人類單核細胞中添加50μL稀釋液。將細胞在37℃，5% CO2下培養兩天，隨後收集上清液以便使用Meso Scale Discovery(MSD)免疫分析平台進行細胞介素(TNF)分析。
促效性分析：評定Ab102經由CD40誘導單核細胞活化之能力。使用MEGACD40L(Enzo)作為單核細胞活化之陽性對照。將經純化之人類單核細胞在培養基中在80ng/mL GM-CSF及80ng/mL IFNγ存在下稀釋至2×106/mL，且在96孔U形底TC盤中添加50μL/孔。在培養基中製備測試材料之稀釋液，且向單核細胞中添加50μL稀釋液。將細胞在37℃，5% CO2下培養兩天，隨後收集上清液以便使用Meso Scale Discovery(MSD)免疫分析平台進行細胞介素(TNF)分析。
因為骨髓細胞在克羅恩氏病之發病機制中起重要作用，所以研發上文所提及之基於單核細胞之分析來評估Ab102之功能活性。CD40信號傳導誘導單核細胞活化且從而產生發炎性細胞介素，諸如TNF。Ab102之代表性單核細胞拮抗性及促效性分析分別顯示於圖5A及圖5B中。如圖5A中所示，Ab102以濃度依賴性方式阻斷TNF之表現。在促效性分析形式中，可溶性CD40L誘導以1.9nM之EC50自單核細胞產生TNF，而濃度高達200nM之Ab102不誘導TNF產生。如圖5B中所述，Ab102對於TNF含量之影響類似於陰性對照(非相關IgG)之彼等含量，顯示出少量至無可偵測TNF產生。自三種不同供體獲得一致的結果，其中IC50值顯示於下表20中。
Figure 105116748-A0305-02-0130-44
總而言之，Ab102在以上所述之拮抗性及促效性分析中之測試結果顯示，Ab102為基本上不含促效活性且無可量測之促效活性的拮抗性抗CD40抗體。
實例8：Ab102之交叉反應性
測試Ab102與來自各種物種之CD40之交叉反應性。使用標準技 術，經Alexa 647標記之Ab102對B細胞表面上之人類及食蟹獼猴CD40展現類似的結合動力學，其中於人類細胞上之EC50值為0.89±0.17nM，且於食蟹獼猴細胞上之EC50值為1.4±0.15nM，如下表21中所示。在高達30μg/mL(200nM)之濃度下，偵測不到Ab102與小鼠、大鼠及兔CD40之結合。
Figure 105116748-A0305-02-0131-45
總而言之，使用標準結合分析，Ab102結合至人類及食蟹獼猴CD40，但未顯示出與小鼠、大鼠或兔CD40之可偵測結合。
實例9：使用小鼠抗CD40抗體138來治療T細胞轉移結腸炎
使用以下方法在活體內研究中測定小鼠抗CD40抗體(抗體138)治療結腸炎之能力。抗鼠類CD40抗體138具有與Ab102類似的特徵，例如抗體138與Ab102一樣，為基本上無促效活性之拮抗性抗體。因此，抗體138為實例9之小鼠模型中之Ab102活性的代表。下文描述結腸炎之活體內T細胞轉移模型。
分離及注射未處理之T細胞
在第0天，自balb/c小鼠收集脾臟且將其置放於冰上補充有4%胎牛血清之RPMI培養基(完全培養基)中。藉由機械破碎且通過100μm細胞過濾器進入補充有4%胎牛血清之RPMI培養基(完全培養基)中來獲得單細胞懸浮液。藉由離心(1250rpm，持續10分鐘，在4℃下)收集細胞且使其再懸浮於Robosep緩衝液(Stem Cell Technologies)中。使用Moxi微型細胞計數器(Orflo)量測細胞濃度且於Robosep緩衝液中調整至1×108個細胞/毫升。使用陰性選擇磁珠套組(Stem Cell Technologies)，根據製造商之說明書分離CD4+ T細胞。藉由FACS進一步純化細胞，得到CD4+CD45RB高及CD4+CD45RB低之群體，將其分別按細胞之最亮42%及最暗12%收集。對細胞進行計數且將其調整至1×106個細胞/毫升，且將0.5mL(1×105個細胞)腹膜內(IP)注射至SCID小鼠中。
治療
隨後在細胞注射時(預防性治療)或在藉由內視鏡檢證實疾病之後(治療性治療)開始，以各種劑量於PBS中按兩次/週向SCID小鼠(以上所述)腹膜內投與小鼠抗CD40抗體138。此外，包括多個對照組。該等組接受1)15mg/kg腹膜內抗體951(非相關IgG)，於PBS中，兩次/週；或2)抗體138(阻斷CD40L之抗體)，腹膜內，於PBS中，兩次/週。另外，在T細胞轉移(TCT)研究中，抗p40(IL-12/23)抗體或抗TNF單株抗體係作為臨床上相關的對照比較而投與。
內視鏡檢
在細胞注射至小鼠中之後的不同時間，藉由結腸鏡檢評定疾病。在用異氟烷麻醉之後，將可撓性管飼針緩慢地插入肛門中且緩慢地注射300μL PBS以移除糞粒。使動物自麻醉中恢復且走動以方便排出任何剩餘糞粒(約五分鐘)。再用異氟烷麻醉小鼠且將內視鏡檢探針(Karl Storz)插入肛門中至3cm之深度。捕捉距肛門邊緣3、2及1cm處之像片影像。稍後使用下表22中詳述之等級給影像評分。將三個距離中之每一者處的各參數的評分組合，產生鼠類內視鏡檢疾病活動性指數(MEDAI)總評分，顯示於表22中。可使用MEDAI總評分獲得之最大評分為24。
在治療性給藥之情況下，使用細胞注射後三週的內視鏡檢評分證實疾病且給動物分組治療。
表22.MEDAI內視鏡檢評分
Figure 105116748-A0305-02-0133-46
組織學
在卡匣中沿拉伸分段的整個結腸取向提交GI樣品，其允許分析完整結腸長度且處理成福馬林(formalin)固定石蠟包埋(FFPE)。將各區塊切片5微米，且安裝於玻璃載片上，隨後使用抗IBA1抗體(目錄號019-19741；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)執行免疫組織化學來偵測離子化鈣結合接附分子1(IBA1)。使用IBA1標誌物鑑別組織切片中之巨噬細胞。用甲基綠給載片對比染色，使其脫水，且裝上玻璃蓋玻片。
隨後藉由Vectra成像系統在4×下掃描載片且檢查4×低功率馬賽克影像(mosaic image)，隨後選擇區域在20×下成像。
Vectra成像重新掃描載片且捕捉所選擇之20×高功率高解析度影像，隨後在inForm軟體(Perkin Elmer)中對其進行影像分析算法。所用inForm算法集具有三種算法：第一種設定光譜成像檔案中IBA1及CD3染色之臨限值，以消除背景/外來染色。後續算法將組織分割成各相關組織(固有層、上皮細胞、肌層、黏膜下層及背景)，且對由第一算法產生之RGB影像中之CD3或IBA1進行定量。
關於組織分割或細胞分割資料，將InForm資料導出為正文檔案，將其合併成單一資料檔案。
基於急性模型中之拮抗活性之驗證，使用慢性結腸炎之模型建 立概念驗證。執行三個研究來測試在未處理T細胞轉移至免疫功能不全的宿主(SCID小鼠)中之後阻斷結腸炎之影響。在預防性及治療性治療模式中研究單一劑量，同時在預防性模式中檢查完全劑量反應。
在細胞轉移時投與之小鼠抗CD40抗體138之劑量反應
使用結腸炎之T細胞轉移模型測定預防性投與抗CD40抗體138之小鼠的劑量反應。治療始於細胞轉移時，涵蓋一系列劑量(0.5、1.5、5及15mg/kg)。降至1.5mg/kg之劑量造成MEDAI總評分之最大抑制，而0.5mg/kg不具有顯著影響。小鼠抗CD40抗體138之活性等效於用作陽性對照之抗p40IL-12/23治療之標準劑量。結腸切片之組織學分析顯示巨噬細胞(發炎之一般量度)減少，其與疾病之內視鏡檢評定密切相關，如圖6及圖7中所述。特定言之，圖6描述在預防性投與小鼠抗CD40抗體138之情況下在第39天的內視鏡檢評分之劑量反應抑制(最終評分)。在圖6中，RB低係指陰性對照組。CD45RB低細胞不介導疾病。在結腸炎之此模型中，疾病係藉由轉移至動物之CD45RBhi細胞介導。圖7顯示小鼠結腸中之IBA1+巨噬細胞之數目(以組織學方式測定)且描述在大於0.5mg/kg且低於p40陽性對照之劑量下巨噬細胞之較低含量。
在最後一次給藥後96小時量測循環小鼠抗CD40抗體138之含量(等於C低谷)且其顯示具有劑量反應性，如圖8中所述。在該組中除一隻動物以外的所有動物中，最低劑量(0.5mg/kg)產生小於定量下限(LLOQ)之濃度。
在細胞轉移後3週投與之小鼠抗CD40抗體138之劑量反應
當在細胞注射後三週起始小鼠抗CD40抗體138治療時，在證實內視鏡檢疾病之後，在最高劑量(15mg/kg)下觀察到MEDAI總評分之劑量反應性抑制，達到統計顯著性(圖9A)。作為骨髓發炎之量度的結腸中之IBA1+巨噬細胞之組織學分析產生類似結果，如圖9B中所述。在 接受15mg/kg之動物中，在最後一次給藥後72小時量測之抗體138之平均血清濃度為191.9μg/ml。
實例10：食蟹獼猴中之T細胞依賴性抗體反應
在食蟹獼猴中執行T細胞依賴性抗體反應(TDAR)分析。以0(僅媒劑)或10mg/kg之劑量給每組每種性別兩隻皮下(SC)投與Ab102，持續5週。在第8天，給所有動物投與匙孔螺血氰蛋白(KLH)。在相對於KLH投與第-11天、第-7天、第0天、第4天、第7天、第10天、第14天及第21天自各動物收集血清樣品。在完成最後一次安排的血液收集之後，使所有動物返回測試設備動物群體(圖10)。
發現相比於僅經媒劑處理之動物，Ab102抑止抗KLH IgM及IgG抗體T細胞依賴性抗體反應，如圖10中所示。
此研究中之發現與在非經腸投與原型外來蛋白質之後藥理學抑止CD40依賴性IgM及IgG抗體產生一致。結果表明，Ab102之使用可能適合治療狼瘡，其中自體抗體產生為該疾病之一部分。此等發現亦支持食蟹獼猴作為用於臨床前毒理學研究之適當物種的生物相關性。此外，研究證實與食蟹獼猴CD40之交叉反應性，且顯示Ab102在已知需要CD40之機制(T依賴性抗體反應)中之活體內活性。
實例11：使用小鼠抗CD40抗體138治療全身性紅斑性狼瘡症(SLE)
由於小鼠抗CD40抗體138在以上急性模型及結腸炎模型中所示之拮抗活性(參見實例9)，所以在全身性紅斑性狼瘡症(SLE)之小鼠模型中檢查此小鼠抗CD40抗體之功效。使用兩種SLE模型：MRL/lpr及NZB/W-F1(描述於Theofilopoulos及Kono.1999.Murine lupus models：gene-specific and genome-wide studies.Lahita R.G.編，Systemic Lupus Erythematosus，第3版，第145頁中)。用於評定抗CD40治療在MRL/lpr及NZB/W-F1小鼠中之功效的基本原理為兩方面的。首先，該等模型在其SLE表現方面不同。NZB/W-F1小鼠自發地發展出狼瘡性腎炎及 涎腺炎，而MRL/lpr小鼠除腎炎及涎腺炎之外亦發展出關節及皮膚表現(Andrews等人J.Exp.Med.148：1198-1215.1978)。因為患者之SLE表現不同，所以使用兩種模型允許評定在大多數SLE患者中之潛在功效。其次，MRL/lpr及NZB/W-F1小鼠在其疾病之遺傳基礎方面不同(Perry等人J.Biomed.Biotech.2011,Article ID 271694)，且因此，各模型之功效在轉譯至遺傳異質性人類方面的信賴度增加。
11.1.SLE之MRL/lpr模型
為測定功效，自10週齡開始，藉由腹膜內注射(i.p.)按下表23中所指出之劑量向小鼠投與小鼠抗CD40抗體138。在該研究中，使用PBS注射作為陰性對照，且使用潑尼松龍作為陽性對照。
Figure 105116748-A0305-02-0136-47
藉由Albustix(用於測試尿蛋白之尿液試紙(urine dip stick)品牌)每週監測蛋白尿。在治療開始之後立刻開始發展出定義為
Figure 105116748-A0305-02-0136-61
300mg/dL之高蛋白尿，如圖11A中所示。如圖11A中所述，截止第63天完成研究，50-60%之未經處理之PBS對照小鼠及經1.5mg/kg抗CD40抗體處理之小鼠已發展出高蛋白尿。相比之下，其他處理組中之幾乎所有小鼠在整個研究中維持低蛋白尿。15mg/kg 1×/週處理組顯著不同於PBS對照。亦監測存活情況且發現以15mg/kg 1×/週及5mg/kg 2×/週給藥使得存活期優於未經處理之PBS對照動物顯著延長，如圖11B中所示。應注意，許多小鼠在其發展出腎炎之前因為由Faslpr突變產生之淋巴腺病造成的痛苦而安樂死。因此，所觀察到之存活率降低不能僅歸因於腎炎。儘管如此，此等資料仍指出，抗CD40抗體劑量依賴 性地預防蛋白尿且延長易生狼瘡之MRL/lpr小鼠之存活期。
亦在來自各個處理組之小鼠的腎臟、唾液腺及踝關節之經蘇木精及伊紅(eosin)(H&E)染色染色的福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織切片中評估抗CD40抗體治療SLE之功效。隨著MRL小鼠之年齡自開始時的10週齡變為結束時的19週，在9週研究內，未經處理之PBS對照小鼠中所有測試器官之疾病的嚴重程度增加。
在腎臟中，在治療29天及63天時，當以15mg/kg投與時，抗CD40抗體治療可有效減少腎小球疾病，如圖12A中所示。隨著不斷變老的MRL小鼠中腎小球疾病嚴重程度加劇，5及15mg/kg抗CD40抗體治療維持功效，使腎小球疾病降到最低。以15mg/kg之劑量一週一次給予的抗CD40抗體與一週兩次給予一樣有效。以5mg/kg之劑量一週兩次給予的抗CD40抗體之有效性亦接近相同。在29天及63天時，以5及15mg/kg之劑量給予的抗CD40抗體可有效減少腎臟中之血管周(PV)浸潤，如圖12B中所示，且具有在疾病早期減少小管間質性(TI)之趨勢，如圖12C中所示。
在唾液腺中，在第29天，以1.5、5及15mg/kg之劑量給予的抗CD40抗體可有效減少唾液腺發炎，而在療法之第63天，15mg/kg維持功效(圖13A)。在未經處理之小鼠中在第29天後唾液腺浸潤無顯著改變。
在跗關節組織中，在第29天，以1.5、5及15mg/kg之劑量投與的抗CD40抗體可有效減少關節周圍發炎；而在療法之第63天，15mg/kg維持功效(圖13B)。在關節中，19週之小鼠相比於10週之小鼠，發炎傾向於減少。儘管如此，在療法之63天，15mg/kg之抗CD40抗體治療仍顯著減少發炎至接近零。
生發中心(GC)形成要求經由GC B細胞上之CD40與濾泡性輔助T細胞(Tfh)上之CD40L接合而使B細胞及T細胞相互作用。GC為產生漿 細胞及記憶B細胞且發生親和力成熟及Ig類別轉換之解剖結構。其對於在SLE中發展出高親和力及致病性自體抗體至關重要。
小鼠抗CD40抗體138破壞B細胞與T細胞相互作用且防止形成GC。為評定GC形成之防止程度，藉由流動式細胞測量術測定脾臟中GC B細胞及Tfh細胞之數目(圖14)。在第29天在所有經抗CD40抗體138處理(無論劑量如何)之小鼠中，Tfh細胞數目顯著低於對照。在所測試之劑量中，5mg/kg劑量組在第63天仍然顯著低於對照(圖14，參見圖(i)及圖(ii))。在第29天在所有抗CD40抗體劑量下，GC B細胞亦低於對照，且其在第63天在以5及15mg/kg之劑量接受抗CD40抗體之小鼠中仍然較低。然而，與未經處理之對照之此等差異在統計學上不顯著。不管該等結果，資料中存在所有給藥組都有治療作用之整體趨勢。此外，在此等實驗中，鼠類抗CD40抗體展現少量至無促效活性。
在鼠類及人類SLE中，除自體反應性抗體之含量之外，循環總IgG含量隨時間推移增加。因此，為評定抗CD40抗體138對抗體產生之影響，檢查總循環IgM及IgG含量。此外，亦檢查抗dsDNA抗體，其為常見的狼瘡相關自體抗體。發現在第29天，經抗CD40抗體以15及1.5mg/kg之劑量處理之小鼠中之總IgG含量顯著低於未經處理之對照中之總IgG含量，如圖15A中所述。在經抗CD40抗體138以15mg/kg處理之小鼠中，顯著較低之總IgG含量保持長達63天，如圖15B中所述。此外，在此時間點，在經抗CD40抗體138以5mg/kg處理之小鼠中觀察到顯著較低含量。未發現循環IgM含量之差異。
在第29天，在經抗CD40抗體138處理之小鼠及未經處理之對照小鼠中，抗dsDNA效價並無顯著不同，如圖16A中所述。然而，截止第63天，抗dsDNA效價在未經處理之對照小鼠中大幅增加，但在經15及5mg/kg抗CD40抗體138處理之小鼠中下降，但差異不明顯，如圖16B 中所述。
自以上研究(實例11.1)獲得之結果指出，抗CD40抗體138可有效預防在易生狼瘡之MRL/lpr小鼠中發展出腎炎。此外，抗CD40抗體138預防唾液腺及關節發炎之發展。此研究表明，與Ab102具有類似特性之拮抗性小鼠抗CD40抗體138可有效治療人類SLE。
11.2.SLE之NZB/W-F 1 小鼠模型
亦測試SLE之第二小鼠模型以判定拮抗性小鼠抗CD40抗體138是否可有效治療該疾病。特定言之，為測定抗CD40抗體138之功效，在NZB/W-F1小鼠中測試抗體，其中根據下表24中所述之給藥時程使用預防方案及治療方案兩者。如在研究11.1中一樣，PBS充當陰性對照且潑尼松龍為陽性對照。
Figure 105116748-A0305-02-0139-48
關於預防方案，在小鼠26週齡時開始處理。所有小鼠經驗證皆具有<300mg/dL蛋白質。關於治療方案，使用滾動登記；每週監測未經處理之小鼠之蛋白尿且當其產生
Figure 105116748-A0305-02-0139-62
300mg/dL蛋白尿時，將其登記至3組治療方案中之一組中。
預防性治療
每週監測蛋白尿且如圖17A中所示，其中截止32週齡，約50%未經處理之對照小鼠具有蛋白尿。相比之下，經抗CD40抗體138處理之 小鼠中僅1隻且經潑尼松龍處理之小鼠中無一者產生高蛋白尿。此等結果相對於未經處理之對照為顯著的。如圖17B中所示之存活情況反映蛋白尿結果，且所有處理顯著不同於PBS對照。因此，15及1.5mg/kg處理劑量均預防蛋白尿且延長存活期。
治療性治療
在此第二小鼠SLE模型中，用抗CD40抗體138進行治療性治療亦為有效的。如圖18A及圖18B中所示，經抗CD40抗體138處理之小鼠隨時間推移產生低蛋白尿，然而未經處理之對照小鼠及經潑尼松龍處理之小鼠均不產生低蛋白尿。基於自蛋白尿恢復之速率，如圖18B中所示，據估算，自蛋白尿恢復之平均時間為23±7天。抗CD40抗體138處理亦顯著延長存活期，如圖18C中所述。
唾液輸出
量測經預防性及治療性治療之小鼠之唾液產量以評定唾液腺功能。向經麻醉小鼠投與硝酸匹魯卡品(pilocarpine nitrate)且用棉拭子收集8分鐘時段內之唾液。按棉拭子之淨增重量測唾液輸出。在預防性研究中，發現未經處理之對照小鼠的唾液產量高度可變，但顯著不同於NZBWF-1未患病的較年幼小鼠之唾液產量，如圖19A及圖19B中所述。變化性可能歸因於疾病程度，因為大多數具有最低唾液產量之媒劑對照小鼠具有蛋白尿(圖19A及圖19B，媒劑組中紫色對比黑色)。然而，重要的是，經抗CD40抗體138處理之小鼠之唾液產量相對均勻(圖19A)且顯著大於未經處理之對照小鼠。雖然所有經抗CD40抗體138處理之群組皆具有較高的唾液產量，但當隨體重而變量測(圖19B)時，僅經1.5mg/kg處理之群組保留顯著性。儘管如此，此等資料仍指出，預防性抗CD40抗體138處理可以預防唾液腺功能之丟失。
在經治療性治療之小鼠中，發現經抗CD40抗體138處理之小鼠的唾液產量顯著高於未經處理之對照(圖20A及圖20B)。圖20A及圖20B 顯示，藉由治療性給予抗CD40抗體可保存唾液產量。無論考慮總唾液抑或針對體重標準化之唾液，這點均顯而易見。值得注意地，未經處理之小鼠皆具有蛋白尿，然而經抗CD40抗體處理之小鼠中無一者具有蛋白尿。因此可以推論得出，治療性給予基本上不含促效活性之拮抗性抗CD40抗體可預防或逆轉唾液腺功能之衰退。
此研究指出，拮抗性抗CD40抗體138可有效預防在易生狼瘡之NZB/W-F1小鼠中發展出腎炎且可有效挽救此等小鼠免受腎炎之苦。此外，抗CD40抗體預防唾液腺及關節發炎之發展。此研究支持以下假設：基本上不含促效活性之拮抗性抗CD40抗體在人類SLE中將為有效的。
實例11.1及11.2中所用之方法包括以下：
MRL/lpr小鼠
MRL/lpr：按以下4個劑量中之一者，向10週齡MRL/lpr小鼠中腹膜內投與抗CD40抗體(抗體138)：15mg/kg；5mg/kg；或1.5mg/kg，每週兩次；或15mg/kg，每週一次。包括經PBS(媒劑)腹膜內每週兩次處理之小鼠作為陰性對照，且包括經10mg/kg潑尼松龍PO sid處理之小鼠作為陽性對照。
NZB/W-F 1 ：在預防方案及治療方案中，向NZB/W-F1小鼠投與抗CD40抗體138。關於預防方案，在26週齡時開始，按兩個劑量中之任一者，以15mg/kg或1.5mg/kg，每週兩次，向小鼠腹膜內給予抗CD40。以10mg/kgPO sid給予潑尼松龍或給予PBS之小鼠分別充當陽性及陰性對照。自一開始測試小鼠之蛋白尿且自預防性研究中排除任何具有
Figure 105116748-A0305-02-0141-63
300mg/dL之小鼠。關於治療方案，當小鼠產生
Figure 105116748-A0305-02-0141-64
300mg/dL之蛋白尿時，開始對其進行處理。小鼠以15mg/kg腹膜內接受抗CD40，每週兩次。以10mg/kg PO sid給予潑尼松龍或PBS之小鼠分別充當陽性及陰性對照。
蛋白尿
使用Albustix試劑條(Siemens 2191,Pittsburgh,PA)每週測試尿液中之蛋白質含量。當至少2次連續測試或在死亡或安樂死之前，尿蛋白含量增加至
Figure 105116748-A0305-02-0142-65
300mg/dL時，小鼠視為具有蛋白尿。
流動式細胞測量術
在含1%熱滅活胎牛血清(Invitrogen)及1×青黴素/鏈黴素(Sigma,St Louis,MO)之Hanks緩衝鹽溶液(Invitrogen)中製得脾單細胞懸浮液。藉由離心移除紅血球且將細胞再懸浮於染色緩衝液(PBS(Invitrogen)，含1.5%熱滅活胎牛血清及0.02%疊氮化鈉(Sigma))中。用針對CD3(145-2011,BD)、CD4(GK1.5 eBioSciences)、ICOS(C398.4A,Biolegend)、CXCR5(L138D7,Biolegend)、PD-1(29F.1A12,Biolegend)、GL7(A488,Biolegend)、CD19(BUV395,BD)、CD95(Jo2,Biolegend)之抗體給細胞染色。使抗體直接偶聯至異硫氰酸螢光素、藻紅素、藻紅素及花青5、別藻藍蛋白、多甲藻素葉綠素a及花青5.5或生物素。全部B細胞經鑑別為CD19+；GC B細胞經鑑別為CD19+、CD95+及GL7+；Tfh細胞經鑑別為CD3+、CD4+、ICOS+、CXCR5+及PD-1+。藉由FACSCalibur(BD Biosciences)流式細胞儀分析細胞且用FlowJo軟體(版本8.5,Treestar Inc.)分析。
組織學
當媒劑對照小鼠垂死時，收集腎臟、踝及唾液腺組織且將其固定於10%中性緩衝福馬林中。此外，在特定的中間時間點，自各組之代表性小鼠收集此等相同組織及血液。將組織固定於10%中性緩衝福馬林中8小時，經處理及石蠟包埋以便H&E。基於對常規H&E染色經福馬林固定石蠟包埋(FFPE)之切片的評估，評估腎臟、唾液腺及踝之發炎性浸潤。關於腎臟，病理學家基於以下評分準則，針對腎小球疾病、血管周浸潤及小管間質性浸潤按0至4等級給3μm H&E切片評 分：腎小球疾病：0=無疾病；1=偶有腎小球之腎小球膜區段性增厚；2=大部分腎小球之腎小球膜區段性至彌漫性增厚；3=腎小球膜彌漫性增厚、細胞過多、增大的足細胞、無黏附；4=腎小球膜彌漫性增厚，且含有在以下中之一或多者比其他區域糟糕的區域：凝聚的蛋白質、纖維化、細胞缺乏、增大的足細胞、黏附及鮑氏囊(Bowman's capsule)之新月體。血管周腎臟發炎：0=至多一些稀有淋巴細胞；1=一些淋巴細胞形成鬆散的聚集體；2=淋巴細胞形成離散的小聚集體；3=淋巴細胞極化聚集，膨脹至鄰近靜脈腔中，但未能完全包圍弓形動脈；4=淋巴細胞完全聚集在弓形動脈周圍，無極化。小管間質性(TI)浸潤：0=無浸潤；1=極少至輕度TI浸潤；2=在20%小管之間的輕度浸潤；3=在至多50%小管之間的輕度至中等浸潤；4=在整個腎皮質中>50%小管之間及在其周圍的中等浸潤。唾液及關節發炎評分係基於相同原理，隨著組織內浸潤增加，用0-4評分。
唾液輸出
為量測唾液腺輸出，首先在小型隔離室中，用氧氣/異氟烷使小鼠鎮靜。在鎮靜之後，向小鼠腹膜內投與30μl(60μg)硝酸匹魯卡品(Sigma)。在注射後兩分鐘，將預稱重之兒童安全拭子(修整至約1.5cm，棉花加莖幹)置放於動物口中門牙之後。將小鼠側放以允許合併臉頰上之唾液及由棉拭子吸附。8分鐘後，移出拭子且稱重以計算淨唾液重量。
ELISA
總循環IgG及IgM含量係藉由ELISA，使用eBioscience套組(目錄號88-50400,88-50470)，根據製造商之說明書測定。
序列概述
Figure 105116748-A0305-02-0144-49
Figure 105116748-A0305-02-0145-50
Figure 105116748-A0305-02-0146-51
Figure 105116748-A0305-02-0147-52
Figure 105116748-A0305-02-0148-53
Figure 105116748-A0305-02-0149-54
Figure 105116748-A0305-02-0150-55
Figure 105116748-A0305-02-0151-56
Figure 105116748-A0305-02-0152-57
Figure 105116748-A0305-02-0153-58
Figure 105116748-A0305-02-0154-60

Claims (2)

  1. 一種抗CD40抗體，其包含：包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的輕鏈。
  2. 一種抗CD40抗體，其包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的輕鏈。
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