TWI623317B - 以針對胚盤大同源物（ｄｌｇ）之天然反義轉錄本之抑制作用治療ｄｌｇ相關疾病 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於調節胚盤大同源物(DLG)之表現及/或功能的反義寡核苷酸，詳言之，藉由靶向胚盤大同源物1(DLG1)之天然反義聚核苷酸來進行該調節作用。本發明亦係關於此等反義寡核苷酸之鑑別法及其在治療與DLG表現相關之疾病及病症中的用途。

Description

以針對胚盤大同源物(DLG)之天然反義轉錄本之抑制作用治療DLG相關疾病
本發明之實施例包含調節DLG1及相關分子之表現及/或功能的寡核苷酸。
本申請案主張2010年7月14日申請的美國臨時專利申請案第61/364,211號之優先權，該案以引用方式全部併入本文中。
DNA-RNA及RNA-RNA雜交對包括DNA複製、轉錄及轉譯在內之核酸功能的許多態樣均係重要的。雜交亦為偵測特定核酸或改變其表現之多種技術的關鍵。舉例而言，反義核苷酸藉由雜交至目標RNA來破壞基因表現，藉此干擾RNA剪接、轉錄、轉譯及複製。反義DNA具有以下額外特徵：DNA-RNA雜交物充當由核糖核酸酶H消化(即一種存在於大多數細胞類型中之活性)之受質。反義分子可傳遞至細胞中，寡去氧核苷酸(ODN)即如此，或其可作為RNA分子由內源基因表現。FDA最近批准一種反義藥物，即VITRAVENETM(用於治療細胞巨大病毒視網膜炎)，反映出反義物具有治療效用。
提供本發明內容以呈現本發明之概要，簡要地指出本發明之性質及實質。應瞭解其並不用於解釋或限制申請專利範圍之範疇或意義。
在一實施例中，本發明提供藉由使用靶向天然反義轉錄本之任何區域的反義寡核苷酸使相應有義基因上調來抑制天然反義轉錄本之作用的方法。本文中亦預期對天然反義轉錄本之抑制作用可由siRNA、核糖核酸酶及小分子實現，其被視為在本發明之範疇內。
一實施例提供活體內或活體外調節患者細胞或組織中之DLG1聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含使該等細胞或組織與5至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與包含SEQ ID NO: 2之核苷酸1至1706內的5至30個連續核苷酸的聚核苷酸之反向互補序列具有至少50%序列一致性，藉此活體內或活體外調節患者細胞或組織中的DLG1聚核苷酸之功能及/或表現。
在一實施例中，寡核苷酸靶向DLG1核苷酸之天然反義序列，例如SEQ ID NOS: 2所闡述之核苷酸，及其任何變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。反義寡核苷酸之實例如SEQ ID NOS: 3至12所闡述。
另一實施例提供活體內或活體外調節患者細胞或組織中之DLG1聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含使該等細胞或組織與5至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與DLG1聚核苷酸之反義物的反向互補序列具有至少50%序列一致性；藉此活體內或活體外調節患者細胞或組織中的DLG1聚核苷酸之功能及/或表現。
另一實施例提供活體內或活體外調節患者細胞或組織中之DLG1聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含使該等細胞或組織與5至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與DLG1反義聚核苷酸之反義寡核苷酸具有至少50%序列一致性，藉此活體內或活體外調節患者細胞或組織中的DLG1聚核苷酸之功能及/或表現。
在一實施例中，本發明包含一種調節生物系統中的胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含：使該系統與至少一種靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸及其同功異型物之天然反義寡核苷酸之某一區域的反義寡核苷酸接觸；藉此調節胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之功能及/或表現。
在一實施例中，組合物包含一或多種反義寡核苷酸，其結合至有義及/或反義DLG1聚核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多種經修飾或經取代之核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經修飾之鍵。
在又一實施例中，經修飾之核苷酸包含經修飾之鹼基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2'-O-甲基、氟或碳、亞甲基或其他鎖核酸(LNA)分子。經修飾之核苷酸較佳為鎖核酸分子，包括α-L-LNA。
在一實施例中，向患者皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內投與寡核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸在醫藥組合物中投與。治療方案包含向患者投與反義化合物至少一次；然而，此治療可經修改以包括在一定時期內多次給藥。該治療可與一或多種其他類型之療法組合。
在一實施例中，寡核苷酸囊封於脂質體中或連接至載體分子(例如膽固醇、TAT肽)上。
下文描述其他態樣。
下文參考用於說明之實例應用來描述本發明之若干態樣。應瞭解，闡述諸多具體細節、關係及方法以提供對本發明之完整理解。然而，熟習相關技術之一般技術者將容易認識到，可不用一或多個具體細節或用其他方法實踐本發明。本發明不受操作或事件之排序所限，此係由於某些操作可以不同次序發生及/或與其他操作或事件同時發生之故。此外，並非所說明之所有操作或事件皆為實施本發明之方法所需。
本文所揭示之所有基因、基因名稱及基因產物意欲對應於來自本文所揭示之組合物及方法適用的任何物種之同源物。因此，該等術語包括(但不限於)來自人類及小鼠之基因及基因產物。應瞭解，當揭示來自特定物種之基因或基因產物時，除非上下文中明確指出，否則此揭示內容意欲僅為例示性的且不應解釋為限制性的。因此，舉例而言，本文揭示之基因在一些實施例中係關於哺乳動物核酸及胺基酸序列，其意欲涵蓋來自其他動物之同源及/或直系同源基因及基因產物，包括(但不限於)其他哺乳動物、魚、兩棲動物、爬蟲及鳥。在一實施例中，基因或核酸序列為人類。
定義
本文中使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不意欲限制本發明。除非文中另外明確指出，否則如本文中所用之單數形式「一」及「該」意欲亦包括複數形式。此外，在術語「包括」、「具有」或其變化形式於實施方式及/或申請專利範圍中使用的情況下，該等術語欲以類似於術語「包含」之方式具包括含義。
術語「約」或「大致」意謂在由一般技術者測定之特定值之可接受之誤差範圍內，其將部分地取決於該值如何量測或測定，亦即量測系統之限制。舉例而言，在此項技術之每次實踐中，「約」可意謂1或1以上標準差之內。或者，「約」可意謂既定值之至多20%、較佳至多10%、更佳至多5%且又佳至多1%之範圍。或者，尤其關於生物系統或過程而言，該術語可意謂在某一個值的一個數量級內，較佳在5倍內、且更佳在2倍內。當在申請案及申請專利範圍中描述特定值時，除非另有說明，否則應採用意謂在特定值之可接受誤差範圍內的術語「約」。
如本文中所用，術語「mRNA」意謂目標基因之目前已知之mRNA轉錄本，及可闡明的任何其他轉錄本。
「反義寡核苷酸」或「反義化合物」意謂結合至另一RNA或DNA(目標RNA、DNA)之RNA或DNA分子。舉例而言，若其為RNA寡核苷酸，則其藉助於RNA-RNA相互作用結合至另一RNA目標且改變目標RNA之活性。反義寡核苷酸可上調或下調特定聚核苷酸之表現及/或功能。該定義意欲包括任何外來RNA或DNA分子，自治療、診斷或其他觀點來看其係適用的。該等分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微型RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶性RNA、治療性編輯RNA及促效性與拮抗性RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外來引導序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪接子、引子、探針及雜交至目標核酸之至少一部分的其他寡聚化合物。因而，此等化合物可以單股、雙股、部分單股或環形寡聚化合物形式引入。
在本發明之上下文中，術語「寡核苷酸」係指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物之寡聚物或聚合物。術語「寡核苷酸」亦包括天然及/或經修飾單體或鍵之直鏈或環形寡聚物，包括脫氧核苷、核苷、其經取代及α-變旋異構形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及其類似物。寡核苷酸能夠藉由諸如以下單體與單體相互作用之常規模式特異性結合至目標聚核苷酸：沃森克里克(Watson-Crick)型鹼基配對、Hogsteen或反向Hogsteen型鹼基配對、或其類似相互作用。
寡核苷酸可為「嵌合的」，亦即由不同區域構成。在本發明之上下文中，「嵌合」化合物為寡核苷酸，其含有兩種或兩種以上化學區域，例如DNA區域、RNA區域、PNA區域等。各化學區域由至少一種單體單元構成，亦即在寡核苷酸化合物之情況下，由核苷酸構成。此等寡核苷酸通常包含至少一個區域，其中寡核苷酸經修飾以呈現一或多種所要性質。寡核苷酸之所要性質包括(但不限於)例如核酸酶降解抗性提高、細胞攝取增加及/或對目標核酸之結合親和力提高。寡核苷酸之不同區域因此可具有不同性質。本發明之嵌合寡核苷酸可形成為兩種或兩種以上如上所述之寡核苷酸、經修飾之寡核苷酸、寡核苷及/或寡核苷酸類似物之混合結構。
寡核苷酸可由可在「寄存子(register)」中連接(亦即當單體連續連接時，如在原生DNA中)，或經由間隔子連接之區域構成。間隔子意欲構成區域之間的共價「橋」且在較佳情況下長度不超過約100個碳原子。間隔子可具有不同官能基，例如具有正電荷或負電荷，具有特殊核酸結合性質(嵌入子、凹槽結合子、毒素、螢光團等)，具有親脂性、誘發特殊二級結構，例如誘發α-螺旋之含有丙胺酸的肽。
如本文中所用，「DLG」及「胚盤大同源物」及DLG聚核苷酸包括所有家族成員、同功異型物、同源物、突變體、對偶基因、片段、物種、編碼及非編碼序列、有義及反義聚核苷酸股等。
如本文中所用，胚盤大同源物1'、dJ1061C18.1.1、DKFZp761P0818、DKFZp781B0426、DLGH1、hdlg、hDlg、SAP97、SAP-97、突觸相關性蛋白97諸詞在文獻中被視為相同的且在本申請案中可互換使用。
如本文中所用，術語「對...有特異性之寡核苷酸」或「靶向...之寡核苷酸」係指具有(i)能夠與所靶向基因之一部分形成穩定複合物或(ii)能夠與所靶向基因之mRNA轉錄本之一部分形成穩定雙鏈體的序列之寡核苷酸。複合物及雙鏈體之穩定性可藉由理論計算及/或活體外檢定測定。用於測定雜交複合物及雙鏈體之穩定性的例示性檢定描述於下文之實例中。
如本文中所用，術語「目標核酸」涵蓋DNA、自該DNA轉錄之RNA(包含前mRNA及mRNA)以及獲自該RNA之cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義聚核苷酸。寡聚化合物與其目標核酸之特異性雜交干擾核酸之正常功能。化合物對目標核酸功能之此種調節(該化合物與目標核酸特異性雜交)一般稱為「反義」。受干擾的DNA功能包括例如複製及轉錄。受干擾的RNA功能包括所有病毒功能，諸如RNA易位至蛋白質轉譯之位點、自RNA轉譯蛋白質、RNA剪接以產生一或多種mRNA物質及可由RNA參與或促進的催化活性。對目標核酸功能的該干擾之總體作用為對編碼產物或寡核苷酸之表現的調節。
RNA干擾「RNAi」由與其「目標」核酸序列具有序列特異性同源性之雙股RNA(dsRNA)分子介導。在本發明之某些實施例中，介體為5-25個核苷酸之「小干擾」RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA源自於稱為Dicer之RNase酶對dsRNA的加工。siRNA雙鏈體產物募集至稱為RISC(RNA誘發之沉默複合物，RNA Induced Silencing Complex)的多蛋白siRNA複合物中。不希望受任何特定理論限制，咸信RISC隨後經導向目標核酸(適當時為mRNA)，其中siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用，從而以催化方式介導裂解。可根據本發明使用的小干擾RNA可根據在此項技術中熟知及一般熟練技術人員所熟悉之程序合成並使用。用於本發明方法中的小干擾RNA適當地包含約1至約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施例之實例中，siRNA可包含約5至約40 nt、約5至約30 nt、約10至約30 nt、約15至約25 nt、或約20-25個核苷酸。
適當寡核苷酸之選擇藉由使用自動比對核酸序列且指出一致性或同源性之區域的電腦程式來簡化。該等程式用於比較例如藉由搜尋諸如GenBank之資料庫或藉由對PCR產物進行定序所獲得的核酸序列。比較來自一定範圍之物種的核酸序列可選擇在物種之間呈現適當一致程度之核酸序列。在未定序之基因的情況下，執行南方墨點分析(Southern blot)來測定目標物種與其他物種的基因之間的一致程度。如此項技術中所熟知，藉由以不同嚴格程度執行南方墨點分析，可獲得一致性之大致量度。此等程序允許選擇對待受控制之個體中的目標核酸序列呈現較高程度互補性但對其他物種中的相應核酸序列呈現較低程度互補性的寡核苷酸。熟習此項技術者將認識到，在選擇用於本發明之基因之適當區域時存在相當的寬容度。
「酶性RNA」意謂具有酶活性之RNA分子(Cech,(1988) J. American. Med. Assoc. 260,3030-3035)。酶性核酸(核糖核酸酶)藉由首先結合至目標RNA發揮作用。該結合經由酶性核酸之目標結合部分發生，該目標結合部分緊靠著該分子中起裂解目標RNA作用之酶性部分。因此，酶性核酸首先識別，接著經由鹼基配對結合目標RNA，且一旦結合至正確位點，即發揮酶作用以切割目標RNA。
「誘餌RNA」意謂模擬針對配位體之天然結合域的RNA分子。誘餌RNA因此與天然結合目標競爭結合特異性配位體。舉例而言，已顯示HIV轉活化反應(TAR)RNA之過度表現可充當「誘餌」且該RNA有效結合HIV tat蛋白，藉此防止其結合至在HIV RNA中編碼的TAR序列。此為一特定實例。熟習此項技術者將認識到，此僅為一實例，且使用此項技術中一般已知之技術可容易產生其他實施例。
如本文中所用，術語「單體」通常表示由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成幾個單體單元(例如約3-4個)至約數百個單體單元大小之寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵之類似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物，如下文更充分地描述。
術語「核苷酸」涵蓋天然產生之核苷酸以及非天然產生之核苷酸。熟習此項技術者應明白，多種核苷酸先前已視為「非天然產生之」但隨後在自然界中發現。因此，「核苷酸」不僅包括已知含嘌呤及嘧啶雜環之分子，而且包括其雜環類似物及互變異構體。其他類型之核苷酸之說明性實例為含有以下之分子：腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二胺基嘌呤、8-側氧基-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N4,N4-亞乙基胞嘧啶、N6,N6-亞乙-2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷及在Benner等人，美國專利第5,432,272號中描述的「非天然產生之」核苷酸。術語「核苷酸」意欲涵蓋此等實例以及其類似物及互變異構體之每一者。尤其有利的核苷酸為含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶者，其被視為牽涉於人類治療及診斷應用中的天然產生之核苷酸。核苷酸包括天然2'-去氧及2'-羥基糖，例如如Kornberg及Baker,DNA Replication,第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所描述，以及其類似物。
關於核苷酸之「類似物」包括具有經修飾之鹼基部分及/或經修飾之糖部分的合成核苷酸(參見，例如一般由Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier & Altmann,(1997) Nucl. Acid. Res.,25(22),4429-4443,Toulm,J.J.,(2001) Nature Biotechnology 19:17-18；Manoharan M.,(1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139；Freier S. M.,(1997) Nucleic Acid Research,25:4429-4443；Uhlman,E.,(2000) Drug Discovery & Development,3: 203-213；Herdewin P.,(2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.,10:297-310描述)；2'-O、3'-C-連接[3.2.0]雙環阿糖核苷。該等類似物包括經設計以增強結合性質之合成核苷酸，例如雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性或其類似性質。
如本文中所用，「雜交」意謂寡聚化合物之實質上互補股之配對。配對之一機制涉及寡聚化合物各股之互補核苷或核苷酸鹼基(核苷酸)之間的氫鍵結，其可為沃森克里克、Hogsteen或反向Hogsteen氫鍵結。舉例而言，腺嘌呤與胸腺嘧啶為互補核苷酸，其經由形成氫鍵配對。雜交可在不同情形下進行。
當反義化合物與目標核酸之結合干擾目標核酸之正常功能以引起對功能及/或活性之調節，且存在足夠互補程度以避免反義化合物與非目標核酸序列在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內檢定或治療性處理之情況下在生理條件下，及在活體外檢定之情況下在執行檢定之條件下非特異性結合時，該反義化合物「可特異性雜交」。
如本文中所用，片語「嚴格雜交條件」或「嚴格條件」係指本發明化合物將雜交至其目標序列，而雜交至最小數目之其他序列的條件。嚴格條件具序列依賴性且在不同情形下及本發明之上下文中將不同，寡聚化合物雜交至目標序列之「嚴格條件」由寡聚化合物之性質及組成及正在研究的檢定確定。一般而言，嚴格雜交條件包含低濃度(<0.15 M)之具有諸如Na+或K+之無機陽離子的鹽(亦即低離子強度)，高於20℃-25℃之溫度，低於寡聚化合物：目標序列複合物之Tm，及存在變性劑，諸如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲亞碸，或清潔劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。舉例而言，每1%甲醯胺，雜交率降低1.1%。高嚴格度雜交條件之一實例為在60℃下，0.1X氯化鈉-檸檬酸鈉緩衝液(SSC)/0.1%(w/v)SDS，持續30分鐘。
如本文中所用，「互補」係指在兩個核苷酸之間在1或2個寡聚股上精確配對的能力。舉例而言，若在反義化合物之某一位置的核苷鹼基能夠與在目標核酸之某一位置的核苷鹼基氫鍵結，該目標核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則寡核苷酸與目標核酸之間的氫鍵結之位置被視為互補位置。當各分子中的足夠數量之互補位置由可彼此氫鍵結之核苷酸佔據時，寡聚化合物及其他DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補。因此，「可特異性雜交」及「互補」為用於表示使得寡聚化合物與目標核酸之間發生穩定及特異性結合的足夠數目之核苷酸的足夠程度之精確配對或互補性的術語。
在此項技術中應瞭解，寡聚化合物之序列不必與其可特異性雜交之目標核酸序列100%互補。此外，寡核苷酸可在一或多個區段雜交以使得插入或相鄰區段不牽涉於雜交事件(例如環狀結構、錯配或髮夾狀結構)中。本發明之寡聚化合物包含與其所靶向之目標核酸序列內的目標區域至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%或至少約99%序列互補性。舉例而言，反義化合物20個核苷酸中有18個與目標區域互補且將因此特異性雜交的反義化合物將具有90%互補性。在此實例中，其餘非互補核苷酸可叢集或散佈有互補核苷酸且不必彼此鄰接或與互補核苷酸鄰接。因而，長度為18個核苷酸且其中有4個非互補核苷酸側接有兩個與目標核酸完全互補之區域的反義化合物將與目標核酸具有77.8%總互補性且將因此在本發明之範疇內。反義化合物與目標核酸某一區域之互補性百分比可使用此項技術中已知之BLAST程式(基礎局部比對搜尋工具)及PowerBLAST程式按常規測定。同源性、序列一致性或互補性百分比可藉由例如Gap程式(Wisconsin Sequence Analysis Package,第8版，Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)，使用預設設置測定，其利用Smith及Waterman之演算法(Adv. Appl. Math.,(1981) 2,482-489)。
如本文中所用，術語「熱熔點(Tm)」係指在限定離子強度、pH值及核酸濃度下，50%與目標序列互補之寡核苷酸與目標序列雜交達平衡狀態時之溫度。通常，對於短寡核苷酸(例如10至50個核苷酸)，嚴格條件將為：鹽濃度為至少約0.01至1.0 M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH值為7.0至8.3且溫度為至少約30℃。嚴格條件亦可由添加諸如甲醯胺之去穩定劑來達成。
如本文中所用，「調節」意謂增加(刺激)或減少(抑制)基因表現。
術語「變異體」當用於聚核苷酸序列之情形中時可涵蓋與野生型基因相關的聚核苷酸序列。此定義亦可包括例如「對偶」、「剪接」、「物種」或「多形」變異體。剪接變異體可與參考分子具有明顯一致性，但一般因在mRNA加工期間外顯子之選擇性剪接而具有較多或較少數量之聚核苷酸。相應多肽可具有其他功能域或缺少結構域。物種變異體為一物種與另一物種之間不同的聚核苷酸序列。野生型基因產物之變異體尤其適用於本發明。變異體可由在核酸序列中之至少一個突變引起且可產生變異mRNA，或結構或功能可能改變或可能不改變之多肽。任何既定天然或重組基因可能不具有，可能具有1個或許多個對偶基因形式。產生變異體之常見突變變化一般歸因於核苷酸之天然缺失、添加或取代。此等類型變化中之每一者在既定序列中可單獨發生或彼此組合發生一或多次。
所得多肽一般將相對於彼此具有顯著胺基酸一致性。多形變異體為既定物種之個體之間的特定基因之聚核苷酸序列中的變化。多形變異體亦可涵蓋「單核苷酸多形現象」(SNP)或單鹼基突變，其中聚核苷酸序列有一個鹼基發生變化。存在SNP可代表例如具有患疾病狀況之傾向(即易感性對抵抗性)的某一群體。
衍生聚核苷酸包括經化學修飾之核酸，例如氫經烷基、醯基或胺基置換。衍生物(例如衍生寡核苷酸)可包含非天然產生之部分，諸如變異糖部分或糖間鍵。其中的例示性部分為硫代磷酸酯及此項技術中已知的其他含硫物質。衍生核酸亦可含有標記，包括放射性核苷酸、酶、螢光劑、化學發光劑、產色劑、受質、輔因子、抑制劑、磁性粒子及其類似物。
「衍生」多肽或肽為經修飾之多肽或肽，例如藉由糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、醯化、化學偶合或適度福馬林處理修飾。衍生物亦可經修飾成直接或間接含有可偵測之標記，包括(但不限於)放射性同位素、螢光標記及酶標記。
如本文中所用，術語「動物」或「患者」意欲包括例如人類、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬蟲、魚、昆蟲及蜘蛛。
「哺乳動物」涵蓋通常接受醫療照護之溫血哺乳動物(例如人類及家養動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物及人類，以及僅為人類。
「治療」涵蓋治療哺乳動物之疾病狀況，且包括：(a)預防哺乳動物出現疾病狀況，尤其當該哺乳動物易患該疾病狀況但尚未診斷為患有時；(b)抑制該疾病狀況，例如阻止其發展；及/或(c)緩解該疾病狀況，例如使該疾病狀況消退直至達到所要終點。治療亦包括改善疾病症狀(例如減輕疼痛或不適)，其中該改善可能會或可能不會直接影響該疾病(例如造成、傳播、表現等)。
如本文中所用，「癌症」係指在哺乳動物中發現的所有類型之癌症或腫瘤或惡性腫瘤，包括(但不限於)：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌瘤及肉瘤。癌症本身顯現為「腫瘤」或包含癌症之惡性細胞的組織。腫瘤之實例包括肉瘤及癌瘤，諸如但不限於：纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、中皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、骨髓癌瘤、支氣管癌瘤、腎細胞癌瘤、肝腫瘤、膽管癌瘤、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌瘤、威耳姆士腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌瘤、小細胞肺癌瘤、膀胱癌瘤、上皮起源之癌瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。可由本發明揭示之組合物治療的其他癌症包括但不限於，例如霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰臟胰島素瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、胃癌、惡變前皮膚病變、睾丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性血鈣過多、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌及前列腺癌。
如本文中所用，「神經疾病或病症」係指神經系統及/或視覺系統的任何疾病或病症。「神經疾病或病症」包括涉及中樞神經系統(大腦、腦幹及小腦)、周邊神經系統(包括顱神經)及自主神經系統(其有一部分位於中樞及周邊神經系統中)之疾病或病症。神經疾病或病症包括(但不限於)後天性癲癇型失語症；急性散播性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養不良；年齡相關性黃斑變性；胼胝體發育不全；認知障礙症；艾氏症候群(Aicardi syndrome)；亞歷山大病(Alexander disease)；艾波病(Alpers' disease)；交叉性偏癱；阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)；血管性癡呆；肌萎縮性側索硬化；無腦；安格曼症候群(Angelman syndrome)；血管瘤病；缺氧症；失語症；失用症；蜘蛛膜囊腫；蛛網膜炎；阿諾德-基亞里畸形(Anronl-Chiari malformation)；動靜脈畸形；埃斯博格症候群(Asperger syndrome)；共濟失調毛細管擴張症；注意力不足過動症；自閉症；自主神經功能障礙；背痛；巴登氏病(Batten disease)；白塞氏病(Behcet's disease)；貝爾氏麻痹(Bell's palsy)；良性特發性瞼痙攣；良性病灶；肌萎縮；良性顱內高壓；賓斯旺格病(Binswanger's disease)；瞼痙攣；伯蘇二氏症候群(Bloch Sulzberger syndrome)；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性膠質母細胞瘤)；脊髓腫瘤；布塞二氏症候群(Brown-Sequard syndrome)；康納丸氏病(Canavan disease)；腕隧道症候群；灼痛；中樞性疼痛症候群；中央腦橋脊髓溶解；頭部病症；大腦動脈瘤；大腦動脈硬化；大腦萎縮；巨腦畸形；腦性癱瘓；恰克-馬利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth disease)；化學療法誘發之神經病及神經病變性疼痛；基亞里畸形(Chiari malformation)；舞蹈病；慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病；慢性疼痛；慢性區域性疼痛症候群；科羅二氏症候群(Coffin Lowry syndrome)；昏迷，包括持續性植物人狀態；先天性兩側面癱；皮質基底核退化症；顱骨動脈炎；顱縫早閉；庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)；累積性創傷病症；庫欣氏病(Cushing's syndrome)；巨大細胞包涵體病；細胞巨大病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈症候群；丹迪-沃克症候群(DandyWalker syndrome)；多森疾病(Dawson disease)；迪摩斯症候群(De Morsier's syndrome)；戴坤二氏麻痹(Dejerine-Klumke palsy)；癡呆；皮肌炎；糖尿病性神經病變；彌漫性硬化症；自主神經障礙；書寫困難；閱讀困難；肌張力障礙；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍症；腦炎；腦質膨出；腦三叉神經血管瘤病；癲癇症；艾伯氏麻痹(Erb's palsy)；特發性震顫；法博瑞氏病(Fabry's disease)；華氏症候群(Fahr's syndrome)；昏厥；家族性痙攣性麻痺；熱性癲癇發作；費氏症候群(Fisher syndrome)；弗里德棘希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)；額顳葉型癡呆及其他「Tau蛋白病(tauopathy)」；高歇氏病(Gaucher's disease)；格斯特曼症候群(Gerstmann's syndrome)；巨細胞動脈炎；巨細胞包涵體疾病；球狀細胞腦白質營養不良；格-巴二氏徵候群(Guillain-Barre syndrome)；HTLV-1相關性脊髓病；哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)；頭部損傷；頭痛；面肌痙攣；遺傳性痙孿性截癱；多神經炎型遺傳性運動失調；耳部帶狀疱疹；帶狀疱疹；平山症候群(Hirayama syndrome)；HIV相關性癡呆及神經病(亦為AIDS之神經學表現)；前腦無裂畸形；亨庭頓氏病(Huntington's disease)及其他多麩胺醯胺重複疾病；腦內積水；腦積水；高皮質醇症；低氧症；免疫介導之腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調症；幼兒植烷酸儲存疾病；幼兒雷夫蘇姆氏病(infantile refsum disease)；幼兒痙攣；發炎性肌病；顱內囊腫；顱內高壓；喬伯特症候群(Joubert syndrome)；卡恩斯-塞爾症候群(Keams-Sayre syndrome)；甘迺迪病(Kennedy disease)；凱博梅症候群(Kinsboume syndrome)；克利佩爾-費爾症候群；克拉培氏病(Krabbe disease)；庫-韋二氏病(Kugelberg-Welander disease)；克魯病(kuru)；拉弗拉病(Lafora disease)；蘭柏特伊頓重肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；朗道卡爾法尼症候群(Landau-Kleffner syndrome)；側神經(Wallenberg)症候群；學習困難；雷氏病(Leigh's disease)；林-戈二氏症候群(Lennox-Gustaut syndrome)；勒-奈二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)；腦白質營養不良；路易體癡呆(Lewy body dementia)；平腦症；閉鎖症候群；盧伽雷病(Lou Gehrig's disease)(亦即運動神經元病或肌萎縮性側索硬化)；腰椎間盤疾病；萊姆病(Lyme disease)--神經學後遺症；馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)；巨腦畸形(macrencephaly)；巨腦畸形(megalencephaly)；梅爾克松-羅森塔爾症候群(Melkersson-Rosenthal syndrome)；梅尼埃病(Menieres disease)；腦膜炎；門克斯病(Menkes disease)；異染性腦白質營養不良；小頭畸形；偏頭痛；密勒-費雪症候群(Miller Fisher syndrome)；小中風；粒線體肌病；默比厄斯氏症候群(Mobius syndrome)；單肢肌萎縮；運動神經元疾病；毛毛樣腦血管疾病(Moyamoya disease)；黏多醣病；多發梗塞性癡呆；多灶性運動神經病；多發性硬化及其他脫髓鞘病症；伴隨體位性血壓過低之多系統萎縮症；肌肉萎縮；重症肌無力；髓鞘脫失彌漫性硬化症；幼兒肌痙攣腦病；肌陣攣；肌病；先天性肌強直；發作性睡病；神經纖維瘤；惡性精神抑制症候群；AIDS之神經學表現；狼瘡之神經學後遺症；神經性肌強直；神經元蠟樣質脂褐素沈積病；神經元遷移病症；尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)；奧沙利文-麥雷奧症候群(O'Sullivan-McLeod syndrome)；枕神經痛；隱性脊柱神經管閉合不全序列征；大田原症候群(Ohtahara syndrome)；橄欖體腦橋小腦萎縮；眼陣攣-肌陣攣；視神經炎；起立性低血壓；過度使用症候群；感覺異常症；神經退化性疾病或病症(帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨庭頓氏病、阿茲海默症、肌萎縮性側索硬化(ALS))、癡呆、多發性硬化及其他與神經元細胞死亡相關之疾病及病症；先天性肌強直；腫瘤伴隨病；陣發性發作；帕里-伯格症候群(Parry Romberg syndrome)；佩-默二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)；週期性麻痹；周邊神經病；疼痛性神經病及神經病變性疼痛；持續性植物人狀態；廣泛性發展障礙；光噴嚏反射；植烷酸儲存疾病；皮克氏病(Pick's disease)；神經挾捏；垂體腫瘤；多肌炎；孔洞腦；脊髓灰質炎後症候群；帶狀疱疹神經痛；傳染病後腦脊髓炎；體位性低血壓；普瑞德威利症候群(Prader-Willi syndrome)；原發性側索硬化；朊病毒病；進行性半側面部萎縮；進行性多灶性腦白質病；進行性硬化性灰質營養不良；進行性核上麻痹；大腦假性腫瘤；雷姆斯-亨特症候群(Ramsay-Huntsyndrome)(I型及II型)；羅氏腦炎(Rasmussen's encephalitis)；反射性交感神經失養症；雷夫敘姆病(Refsum disease)；反覆運動失調症；反覆壓力損傷；腿不寧徵候群；反轉錄病毒相關性脊髓病；瑞特症候群(Rett syndrome)；雷耶症候群(Reye's syndrome)；聖維斯特舞蹈病(Saint Vitus dance)；山霍夫氏病(Sandhoff disease)；希爾德氏病(Schilder's disease)；腦裂畸形；鼻眼發育畸形；嬰兒搖籃症候群；帶狀疱疹；夏伊-德雷格症候群(Shy-Drager syndrome)；修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)；睡眠呼吸暫停症；索特斯症候群(Soto's syndrome)；痙攣狀態；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊肌萎縮；斯蒂夫-佩森症候群(Stiff-Person syndrome)；中風；斯特奇-韋伯症候群(Sturge-Weber syndrome)；亞急性硬化性泛腦炎；皮質下動脈硬化性腦病；薛登漢氏舞蹈症(Sydenham chorea)；暈厥；脊髓空洞症；遲發性運動障礙；泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)；顳動脈炎；脊髓栓繫症候群；托馬森病(Thomsen disease)；胸廓出口症候群；痛性痙攣(Tic Douloureux)；托德麻痹(Todd's paralysis)；妥瑞症候群(Tourette syndrome)；短暫性缺血性發作；可傳播的海綿狀腦病；橫貫性脊髓炎；創傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛；熱帶痙攣性後軀輕癱；結節性發梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動脈炎；希林二氏病(Von Hippel-Lindau disease)；瓦倫貝格症候群(Wallenberg's syndrome)；韋德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman disease)；西方症候群(West syndrome)；頸部鞭抽症(whiplash)；威廉姆斯症候群(Williams syndrome)；威爾森氏病(Wildon's disease)；及柴爾維格氏症候群(Zellweger syndrome)。
「心血管疾病或病症」包括(但不限於)與血流不正常及/或心功能不正常相關之疾病及病狀。該等疾病或病狀包括充血性心臟衰竭、心肌梗塞及任何其他與心臟有關之疾病。
「發炎疾病或病狀」包括(但不限於)導致發炎作為其症狀之疾病或病狀。
「肺部疾病或病症」包括(但不限於)與肺功能不正常相關之疾病及病狀。
「增殖性疾病或病症」包括(但不限於)涉及由骨髓、淋巴或紅血球系產生之造血源性增生性/贅生性細胞或其前驅細胞的造血贅生性病症。此等病症包括(但不限於)紅血球胚細胞白血病；急性早幼粒細胞白血病(APML)；慢性骨髓性白血病(CML)；淋巴惡性疾病，包括(但不限於)急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(其包括B系ALL及T系ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、幼淋巴細胞白血病(PLL)；毛細胞白血病(HLL)及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia，WM)。其他形式之惡性淋巴瘤包括(但不限於)非霍奇金淋巴瘤及其變體、外周T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴球性白血病(LGF)、霍奇金病及里-斯二氏病(Reed-Sternberg disease)。
本發明包含一種用本發明寡核苷酸治療上文所指定之疾病或病狀中任一者之方法。本發明係關於靶向DLG mRNA同功異型物之天然反義轉錄本的寡核苷酸之用途，其係用於製造治療與異常DLG表現相關之疾病或病狀的藥劑。
聚核苷酸及寡核苷酸組合物及分子
目標：在一實施例中，目標包含胚盤大同源物(DLG)及其同功異型物之核酸序列，包括不限於與DLG相關的有義及/或反義非編碼及/或編碼序列。較佳表現目標為DLG1。在一較佳實施例中，本發明係關於DLG家族mRNA之天然反義轉錄本及靶向且至少部分與該天然反義轉錄本互補的約5至約30個核苷酸之寡核苷酸。
果蠅胚盤大(Dlg1)人類同源物為在中樞神經系統中之突觸後緻密物中發現的MAGUK。Dlg1與緊密接合之形成、上皮細胞極性及控制果蠅成蟲盤之增殖有牽連。其由胺基端脯胺酸富集結構域、多個PDZ結構域、SH3結構域、HOOK結構域、i3結構域及鳥苷酸激酶(GK)樣結構域組成。
膜相關性鳥苷酸激酶(MAGUK)蛋白對於在神經元突觸及緊密接合處建構離子通道及受體而言係重要的。MAGUK於心肌細胞中表現，且詳言之，突觸相關性蛋白97(SAP97)發現於心房及心室心肌中的間盤層面上，在此其與Kv1.5通道共存。此外，心臟SAP97與Kv1.5次單元已共沈澱，提示兩種蛋白之間的直接相互作用。已使用蛋白微陣列及定量螢光偏振表徵PDZ結構域之結合選擇性來證明SAP97與Kv1.5之間的強相互作用。然而，經由通道之NH2端部分或涉及第二信使之間接相互作用亦有可能。不管兩種蛋白之間的相互作用之性質如何，所有研究一致認為SAP97與Kv1.5次單元之共表現使得異源系統中之向外鉀電流增加。膜相關性鳥苷酸激酶(MAGUK)蛋白為建構若干離子通道之重要搭配物。MAGUK蛋白SAP97於心肌中大量表現且與電壓依賴性Shaker通道Kv1.5及Kir通道相互作用。在其他組織中，SAP97可調節肌膜中心臟離子通道之靶向。實際上，在新生大鼠肌細胞中，SAP97過度表現使得Kv1.5通道在質膜中叢集並固定且增加相應電流。
在一實施例中，反義寡核苷酸用於預防或治療與DLG1家族成員相關之疾病或病症。可用本發明之寡核苷酸及/或用由使用反義化合物獲得的幹細胞再生之細胞/組織治療的例示性胚盤大同源物1(DLG1)介導疾病及病症包含：與DLG1之異常功能及/或表現相關之疾病或病症、癌症、與細胞增殖相關或以細胞增殖為特徵之疾病或病狀、由發生腫瘤之人類病毒引起之疾病或病症、與細胞命運決定相關之疾病或病症、與細胞抑制異常相關之疾病或病症、眼睛癌發生、乳腺管癌、子宮頸腫瘤形成、惡性纖維組織細胞瘤、與DLG1之突變體或異常表現或功能相關之疾病或病症、與細胞週期缺陷相關之疾病或病症、與PDZ功能障礙接合相關之疾病或病症、與T細胞活化異常相關之疾病或病症、免疫系統之疾病或病症、人類免疫缺乏病毒-1感染、神經髓鞘形成之軸突刺激異常、神經髓鞘形成異常、許旺細胞(Schwann cell)髓鞘形成中之膜內穩恆異常、神經疾病或病症、精神分裂症、帕金森氏病、智力遲鈍、自閉性恰克-馬利-杜斯氏症、與心臟Kv4及Kv1.5通道之調節異常相關之疾病或病症或病狀、與CF/浦肯雅(Purkinje)細胞突觸處的GluR1之傳輸及插入異常相關之疾病或病症或病狀、與突觸發生異常相關之疾病或病症或病狀、與突觸功能異常相關之疾病或病症或病狀、與突觸強度降低相關之疾病或病症或病狀、視網膜損傷、與角質細胞分化及/或創傷癒合相關之疾病或病症、與跨膜受體自ER向質膜通行異常相關之疾病或病症或病狀、泌尿生殖系統發育異常、腎水腫、泌尿道異常、與平滑肌定向異常相關之疾病或病症或病狀、與神經肌肉接合點之骨骼肌及運動神經元組分受損相關之疾病或病症或病狀、腎疾病或病症及裂顎。如下文引用文摘中所述，配子發育需要體細胞生殖系協調相互作用以確保生殖系及成體幹細胞之再生及分化。在其中，作者指出生殖系與體細胞群之間的實體接觸係關鍵，此係由於其允許可擴散信號在其中交換之故。作者進一步指出，腫瘤抑制基因胚盤大(DLG)編碼在上皮細胞極性、不對稱神經母細胞分裂及神經肌肉接合點形成中發揮功能之分隔接合蛋白。近期公開案提出DLG在果蠅睾丸中的新作用，因為DLG之突變導致睾丸缺陷及細胞死亡。在體細胞系中的精子形成之整個過程中需要DLG且其定位由沿睾丸頂端體細胞之質膜均勻分佈變化為處於生長中的囊腫中位於遠端之體細胞上的受限定位。DLG睾丸之廣泛缺陷強調了體細胞在男性幹細胞席位之建立與維持及體細胞分化中的重要性。此亦可明確適用於哺乳動物細胞且因此DLG之上調在與男性幹細胞席位及體細胞分化之功能不正常相關之疾病或病狀中有利。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20798604。
在本發明之實施例中，向需要組織治療(例如皮膚治療或其類似治療)或有發展成需要組織修補或復原(例如皮膚治療)之病狀的風險之個體提供治療及/或化妝方案及相關特定治療。可例如基於個體之DLG1狀況作出診斷。患者之DLG1在諸如皮膚、肌肉、大腦、脊髓、甲狀腺、胰腺、肺、心臟或肌肉/神經元接合之既定組織/器官中的表現量可藉由熟習此項技術者已知及本文中別處描述之方法測定，例如藉由使用PCR或基於抗體之偵測方法分析組織。
在一實施例中，向有需要之患者投與一或多種反義寡核苷酸調節DLG，以預防或治療與DLG同正常對照組相比表現、功能、活性異常相關的任何疾病或病症。
在一實施例中，寡核苷酸對於DLG1之聚核苷酸(包括但不限於非編碼區域)具有特異性。DLG1目標包含DLG1之變異體；DLG1之突變體，包括SNP；DLG1之非編碼序列；對偶基因、片段及其類似物。寡核苷酸較佳為反義RNA分子。
根據本發明之實施例，目標核酸分子不僅限於DLG1，且亦包括DLG1分子之同功異型物、受體、同源物、非編碼區域及其類似物中之任一者。
在一實施例中，寡核苷酸靶向DLG1目標之天然反義序列(編碼及非編碼區域之天然反義物)，包括但不限於其變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。寡核苷酸較佳為反義RNA或DNA分子。
在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包括化合物中之一或多個核苷酸位置上存在不同鹼基的變異體。舉例而言，若第一核苷酸為腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸之變異體。此可在反義化合物之任一位置上發生。隨後使用本文所述之方法測試此等化合物以測定其抑制目標核酸表現之能力。
在一些實施例中，反義化合物與目標之間的同源性、序列一致性或互補性為約50%至約60%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約60%至約70%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約70%至約80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
當反義化合物與目標核酸之結合干擾目標核酸之正常功能而使得活性損失，且存在足夠互補程度以避免反義化合物與非目標核酸序列在需要特異性結合之條件下非特異性結合時，該反義化合物可特異性雜交。該等條件包括，亦即在活體內檢定或治療性處理之情況下之生理條件，及在活體外檢定之情況下執行檢定之條件。
當反義化合物(不管是否為DNA、RNA、嵌合、經取代等)與目標DNA或RNA分子之結合干擾目標DNA或RNA之正常功能而使得效用損失，且存在足夠互補程度以避免反義化合物與非目標序列在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內檢定或治療性處理之情況下在生理條件下，及在活體外檢定之情況下在執行檢定之條件下非特異性結合時，該反義化合物可特異性雜交。
在一實施例中，包括不限於使用例如PCR、雜交等鑑別及擴增的反義序列、如SEQ ID NOS: 2所闡述之一或多個序列及其類似物的DLG1之靶向調節DLG1之表現或功能。在一實施例中，表現或功能與對照組相比得以上調。在一實施例中，表現或功能與對照組相比得以下調。
在一實施例中，寡核苷酸包含如SEQ ID NOS: 3至12所闡述之核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑑別及擴增之反義序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。經修飾之鍵或核苷酸間鍵之實例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其類似物。在一實施例中，核苷酸包含磷衍生物。可連接至本發明之經修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分上的磷衍生物(或經修飾之磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷烴磷酸酯、硫代磷酸酯及其類似物。上述磷酸酯類似物之製備及其併入核苷酸、經修飾之核苷酸及寡核苷酸中之方法本身亦已知且不必在此加以描述。
反義物之特異性及敏感性亦由熟習此項技術者操控以用於治療用途。反義寡核苷酸已用作治療動物及人類之疾病狀況之治療部分。反義寡核苷酸已安全且有效地投與人類且許多臨床試驗目前正在進行中。因此確定，寡核苷酸可為適用的治療形式，其可經組態以適用於治療細胞、組織及動物，尤其人類之治療方案中。
在本發明之實施例中，寡聚反義化合物，尤其寡核苷酸結合至目標核酸分子且調節由目標基因編碼之分子的表現及/或功能。受干擾之DNA之功能包含例如複製及轉錄。受干擾的RNA功能包含所有病毒功能，諸如RNA易位至蛋白質轉譯之位點、自RNA轉譯蛋白質、RNA剪接以得到一或多個mRNA物質及可由RNA參與或促進的催化活性。功能可視所要功能而定得以上調或抑制。
反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外來引導序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪接子、引子、探針及其他雜交至目標核酸之至少一部分的寡聚化合物。因而，此等化合物可呈單股、雙股、部分單股或環形寡聚化合物形式引入。
在本發明之上下文中，使反義化合物靶向特定核酸分子可為多步驟過程。該過程一般自鑑別需要調節其功能之目標核酸開始。此目標核酸可為例如具有與特定病症或疾病狀況相關聯表現的細胞基因(或自基因轉錄之mRNA)、或來自傳染媒介物之核酸分子。在本發明中，目標核酸編碼胚盤大同源物1(DLG1)。
靶向過程一般亦包括在目標核酸內確定至少一個目標區域、區段或位點，以供發生反義相互作用，從而實現所要作用，例如調節表現。在本發明之上下文中，術語「區域」經定義為具有至少一個可鑑別結構、功能或特徵的目標核酸之一部分。區段係在目標核酸之區域內。「區段」之定義為目標核酸內區域之較小部分或子部分。如本發明中所用，「位點」之定義為目標核酸內的位置。
在一實施例中，反義寡核苷酸結合至胚盤大同源物1(DLG1)之天然反義序列且調節DLG1(SEQ ID NO: 1)之表現及/或功能。天然反義序列之實例包括SEQ ID NOS: 2。
在一實施例中，反義寡核苷酸結合至胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之一或多個區段且調節DLG1之表現及/或功能。該等區段包含DLG1有義或反義聚核苷酸之至少5個連續核苷酸。
在一實施例中，反義寡核苷酸對DLG1之天然反義序列具有特異性，其中寡核苷酸與DLG1之天然反義序列之結合作用可調節DLG1之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸化合物包含如SEQ ID NOS: 3至12所闡述之序列、使用例如PCR、雜交法等鑑別及擴增的反義序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。經修飾之鍵或核苷酸間鍵之實例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其類似物。在一實施例中，核苷酸包含磷衍生物。可連接至本發明之經修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分上的磷衍生物(或經修飾之磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷烴磷酸酯、硫代磷酸酯及其類似物。上述磷酸酯類似物之製備及其併入核苷酸、經修飾之核苷酸及寡核苷酸中之方法本身亦已知且不必在此加以描述。
因為，如在此項技術中已知，轉譯起始密碼子通常為5'-AUG(在轉錄mRNA分子中；在相應DNA分子中為5'-ATG)，所以轉譯起始密碼子亦稱為「AUG密碼子」、「起始密碼子」或「AUG起始密碼子」。少數基因之轉譯起始密碼子具有RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG；且5'-AUA、5'-ACG及5'-CUG已展示在活體內發揮作用。因此，術語「轉譯起始密碼子」及「起始密碼子」可涵蓋許多密碼子序列，但在各情況中起始胺基酸通常為甲硫胺酸(在真核生物中)或甲醯基甲硫胺酸(在原核生物中)。真核生物基因及原核生物基因可具有兩個或兩個以上替代性起始密碼子，其中任一者可優先用於特定細胞類型或組織中或在特定條件集合下的轉譯起始。在本發明之上下文中，「起始密碼子」及「轉譯起始密碼子」係指活體內用於使編碼胚盤大同源物1(DLG1)之基因所轉錄的mRNA開始轉譯的密碼子，不受該等密碼子之序列影響。基因之轉譯終止密碼子(或「終止密碼子」)可具有三個序列中之一者，亦即5'-UAA、5'-UAG及5'-UGA(相應DNA序列分別為5'-TAA、5'-TAG及5'-TGA)。
術語「起始密碼子區域」及「轉譯起始密碼子區域」係指該種mRNA或基因之一部分，涵蓋在自轉譯起始密碼子之任一方向(亦即5'或3')上的約25至約50個鄰接核苷酸。類似地，術語「終止密碼子區域」及「轉譯終止密碼子區域」係指該種mRNA或基因之一部分，涵蓋在自轉譯終止密碼子之任一方向(亦即5'或3')上的約25至約50個鄰接核苷酸。因此，「起始密碼子區域」(或「轉譯起始密碼子區域」)及「終止密碼子區域」(或「轉譯終止密碼子區域」)為可用本發明之反義化合物有效靶向之所有區域。
開放閱讀框架(ORF)或「編碼區域」在此項技術中已知係指轉譯起始密碼子與轉譯終止密碼子之間的區域，其亦為可有效靶向之區域。在本發明之上下文中，靶向區域為基因內區域，涵蓋基因之開放閱讀框架(ORF)之轉譯起始或終止密碼子。
另一目標區域包括5'未轉譯區域(5'UTR)，在此項技術中已知係指在自轉譯起始密碼子之5'方向上的mRNA部分，且因此包括mRNA(或基因上之相應核苷酸)之5'帽端位點與轉譯起始密碼子之間的核苷酸。另一目標區域包括3'未轉譯區域(3'UTR)，在此項技術中已知係指在自轉譯終止密碼子之3'方向上的mRNA部分，且因此包括mRNA(或基因上之相應核苷酸)之轉譯終止密碼子與3'端之間的核苷酸。mRNA之5'帽端位點包含經由5'-5'三磷酸酯鍵連接至mRNA之5'-端殘基上的N7-甲基化鳥核苷殘基。mRNA之5'帽端區域被視為包括5'帽端結構本身以及與該帽端位點相鄰之前50個核苷酸。本發明之另一目標區域為5'帽端區域。
儘管一些真核生物mRNA轉錄本經直接轉譯，但許多含有一或多個稱為「內含子」之區域，其在轉譯之前自轉錄本切除。其餘(及由此轉譯)區域稱為「外顯子」且剪接在一起形成連續mRNA序列。在一實施例中，靶向剪接位點(亦即內含子-外顯子接合點或外顯子-內含子接合點)尤其適用於異常剪接牽涉於疾病中之情況或特定剪接產物之過度產生牽涉於疾病中之情況。歸因於重排或缺失之異常融合接合點為目標位點之另一實施例。經由來自不同基因來源之兩個(或兩個以上)mRNA的剪接過程產生的mRNA轉錄本稱為「融合轉錄本」。使用靶向例如DNA或前mRNA之反義化合物可有效地靶向內含子。
在一實施例中，反義寡核苷酸結合至目標聚核苷酸之編碼及/或非編碼區域且調節目標分子之表現及/或功能。
在一實施例中，反義寡核苷酸結合至天然反義聚核苷酸且調節目標分子之表現及/或功能。
在一實施例中，反義寡核苷酸結合至有義聚核苷酸且調節目標分子之表現及/或功能。
替代性RNA轉錄本可自DNA之相同基因組區域產生。此等替代性轉錄本一般稱為「變異體」。更特定言之，「前mRNA變異體」為自相同基因組DNA產生之轉錄本，其開始或終止位置不同於自相同基因組DNA產生之其他轉錄本，且含有內含子及外顯子序列。
一旦在剪接期間切除一或多個外顯子或內含子區域或其部分，前mRNA變異體即產生較小「mRNA變異體」。因此，mRNA變異體為經加工的前mRNA變異體且每一獨特前mRNA變異體必須總由剪接產生獨特mRNA變異體。此等mRNA變異體亦稱為「選擇性剪接變異體」。若不進行前mRNA變異體剪接，則前mRNA變異體與mRNA變異體相同。
變異體可經由使用替代性信號開始或終止轉錄而產生。前mRNA及mRNA可具有一個以上起始密碼子或終止密碼子。來源於使用替代性起始密碼子之前mRNA或mRNA的變異體稱為前mRNA或mRNA之「替代性起始變異體」。使用替代性終止密碼子之轉錄本稱為前mRNA或mRNA之「替代性終止變異體」。一特定類型之替代性終止變異體為「polyA變異體」，其中所產生的多個轉錄本由經轉錄機構替代性選擇一個「polyA終止信號」藉此產生在獨特polyA位點終止之轉錄本而得到。在本發明之上下文中，本文所述之變異體類型亦為目標核酸之實施例。
在反義化合物所雜交之目標核酸上的位置經定義為活性反義化合物所靶向的目標區域之至少5個核苷酸長度的部分。
儘管某些例示性目標區段之特定序列在本文中加以闡述，但熟習此項技術者將認識到此等序列用於說明及描述在本發明之範疇內的特定實施例。其他目標區段可由一般技術者鑒於本發明內容容易地鑑別。
包含選自說明性較佳目標區段內的至少5個連續核苷酸之延伸段的長度為5-100個核苷酸之目標區段視為亦適用於靶向。
目標區段可包括如下DNA或RNA序列，其包含自一說明性較佳目標區段之5'-端的至少5個連續核苷酸(其餘核苷酸為緊挨著目標區段之5'-端上游開始並延續直至DNA或RNA含有約5至約100個核苷酸的相同DNA或RNA之連續延伸段)。類似地，較佳目標區段由如下DNA或RNA序列表示，其包含自一說明性較佳目標區段之3'-端的至少5個連續核苷酸(其餘核苷酸為緊挨著目標區段之3'-端上游開始並延續直至DNA或RNA含有約5至約100個核苷酸的相同DNA或RNA之連續延伸段)。熟習本文所說明之目標區段之技術者將能夠在不進行不當實驗之情況下鑑別其他較佳目標區段。
一旦鑑別一或多個目標區域、區段或位點，即選擇與目標充分互補，亦即充分較佳且以足夠特異性雜交之反義化合物，以產生所要作用。
在本發明之實施例中，寡核苷酸結合至特定目標之反義股。寡核苷酸之長度為至少5個核苷酸且可合成為各寡核苷酸靶向重疊序列以便合成覆蓋目標聚核苷酸之整個長度的寡核苷酸。目標亦包括編碼以及非編碼區域。
在一實施例中，較佳由反義寡核苷酸靶向特定核酸。使反義化合物靶向特定核酸為多步驟過程。該過程一般自鑑別將對其功能加以調節之核酸序列開始。此目標核酸可為例如表現與特定病症或疾病狀況相關聯的細胞基因(或自該基因轉錄之mRNA)、或非編碼聚核苷酸，諸如非編碼RNA(ncRNA)。
RNA可劃分為(1)信使RNA(mRNA)，其轉譯成蛋白質，及(2)非蛋白質編碼RNA(ncRNA)。ncRNA包含微型RNA、反義轉錄本及含有高密度終止密碼子且缺乏任何廣泛「開放閱讀框架」的其他轉錄單元(TU)。許多ncRNA似乎自蛋白質編碼基因座之3'未轉譯區域(3'UTR)中之起始位點開始。ncRNA通常罕見且由FANTOM共生物種定序的ncRNA至少有一半似乎不經聚腺苷酸化。大部分研究人員出於明顯的理由專注於加工且輸出至細胞質的聚腺苷酸化mRNA。最近，顯示非聚腺苷酸化細胞核RNA集合可能極大，且許多該等轉錄本由所謂的基因間區域產生。ncRNA可藉以調節基因表現之機制為與目標轉錄本鹼基配對。藉由鹼基配對起作用之RNA可分組為(1)順式編碼RNA，其在其作用針對之RNA之相同基因位置處但在反向股上編碼，且因此呈現與其目標之理想互補，及(2)反式編碼RNA，其在不同於其作用針對之RNA之染色體位置處編碼且一般不呈現與其目標之理想鹼基配對潛能。
不希望受理論限制，本文所述之反義寡核苷酸干擾反義聚核苷酸可改變相應有義信使RNA之表現。然而，此調節可為不一致的(反義阻斷基因表現使得信使RNA增多)或一致的(反義阻斷基因表現使得同時信使RNA減少)。在此等情況下，反義寡核苷酸可靶向反義轉錄本之重疊或非重疊部分，由此引起其阻斷基因表現或螯隔作用。編碼以及非編碼反義物可以相同方式靶向且任一類別均能夠以一致或不一致方式調節相應有義轉錄本。用於鑑別針對目標使用的新寡核苷酸之策略可基於由反義寡核苷酸或調節所要目標之任何其他手段使反義RNA轉錄本的基因表現阻斷。
策略1：在不一致調節之情況下，阻斷反義轉錄本之基因表現增加習知(有義)基因之表現。倘若後一基因編碼已知或推定藥物目標，則其反義對應物之阻斷基因表現可設想為模擬受體促效劑或酶刺激物之作用。
策略2：在一致調節之情況下，可同時阻斷反義及有義兩種轉錄本之基因表現且藉此實現習知(有義)基因表現之協同減少。舉例而言，若反義寡核苷酸用於實現阻斷基因表現，則此策略可用於應用一靶向有義轉錄本之反義寡核苷酸及靶向相應反義轉錄本之另一反義寡核苷酸，或同時靶向重疊有義及反義轉錄本的單一能量對稱之反義寡核苷酸。
根據本發明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核糖核酸酶、外來引導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物(諸如siRNA化合物)及其他雜交至目標核酸之至少一部分且調節其功能的寡聚化合物。因而，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可為此等物質中之一或多者的模擬物。此等化合物可為單股、雙股、環形或髮夾狀寡聚化合物且可含有諸如內部或末端凸出、錯配或環狀物之結構元件。反義化合物按常規製備成線性的，但可相連或以其他方式製備成環形及/或分支的。反義化合物可包括構築體，諸如雜交以形成完全或部分雙股化合物之兩股或具有足夠自我互補性以允許雜交及形成完全或部分雙股化合物之單股。兩股可在內部連接，而留有自由的3'端或5'端或可連接形成連續髮夾狀結構或環狀物。髮夾狀結構可在5'端或3'端含有突出物，產生單股特性之延長物。雙股化合物視情況可在各末端均包括突出物。其他修飾可包括連接至一末端、選定核苷酸位置、糖位置或一核苷間鍵上的結合基團。或者，兩股可經由非核酸部分或連接基團連接。當僅由一股形成時，dsRNA可採取自我互補髮夾型分子形式，其自身對折形成雙鏈體。因此，dsRNA可為完全或部分雙股的。基因表現之特定調節可藉由在轉殖基因細胞株中穩定表現dsRNA髮夾而實現，然而，在一些實施例中，基因表現或功能得以上調。當由兩股或採取自我互補髮夾型分子形式以自身對折形成雙鏈體的單股形成時，兩股(或單股之雙鏈體形成區域)為以沃森克里克方式鹼基配對之互補RNA股。
一旦引入系統中，本發明化合物可引發一或多種酶或結構蛋白之作用以實現目標核酸之裂解或其他修飾或可經由基於佔用之機制起作用。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為「DNA樣」(亦即一般具有一或多個2'-去氧糖且一般為T而非U鹼基)或「RNA樣」(亦即一般具有一或多個2'-羥基或2'-經修飾之糖且一般為U而非T鹼基)。核酸螺旋可採用一種以上類型之結構，最常用的為A形及B形。咸信，一般而言，具有B形樣結構之寡核苷酸為「DNA樣」且具有A形樣結構之寡核苷酸為「RNA樣」。在一些(嵌合)實施例中，反義化合物可含有A形及B形兩種區域。
在一實施例中，所要寡核苷酸或反義化合物包含以下至少一者：反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經修飾之鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；微型干擾RNA(miRNA)；小時序RNA(stRNA)；或短髮夾狀RNA(shRNA)；小RNA誘發之基因活化(RNAa)；小活化RNAs(saRNAs)；或其組合。
dsRNA亦可活化基因表現，亦即一種稱為「小RNA誘發之基因活化」或RNAa之機制。靶向基因啟動子之dsRNA誘發相關基因之有效轉錄活化。在人類細胞中使用合成dsRNAs顯示RNAa，其稱為「小活化RNAs」(saRNAs)。目前尚不知曉RNAa在其他生物體中是否得以保留。
已發現小雙股RNA(dsRNA)，諸如小干擾RNA(siRNA)及微型RNA(miRNA)觸發稱為RNA干擾(RNAi)之進化保守機制。RNAi總是經由重塑染色質導致基因沉默藉此抑制轉錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白質轉譯。然而，在下文實例部分詳細描述的情況中，顯示寡核苷酸增加胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸及其編碼產物之表現及/或功能。dsRNA亦可充當小活化RNA(saRNA)。不希望受理論限制，藉由靶向基因啟動子中之序列，saRNA將在稱為dsRNA誘發之轉錄活化(RNAa)之現象中誘發目標基因表現。
在另一實施例中，本文中鑑別的「較佳目標區段」可用於篩選調節胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之表現的其他化合物。「調節劑」為減少或增加編碼DLG1之核酸分子的表現且包含至少一與較佳目標區段互補之含5個核苷酸之部分的化合物。篩選法包含以下步驟：使編碼DLG1之有義或天然反義聚核苷酸的核酸分子之較佳目標區段與一或多種候選調節劑接觸，及選擇一或多種減少或增加編碼DLG1聚核苷酸(例如SEQ ID NOS: 3至12)之核酸分子的表現之候選調節劑。一旦顯示候選調節劑能夠調節(例如減少或增加)編碼DLG1聚核苷酸之核酸分子的表現，調節劑即可用於DLG1聚核苷酸之功能的進一步調查研究中，或用作根據本發明之研究劑、診斷劑或治療劑。
靶向天然反義序列較佳調節目標基因之功能。例如DLG1基因(例如寄存編號NM_004087)。在一實施例中，目標為DLG1基因之反義聚核苷酸。在一實施例中，反義寡核苷酸靶向DLG1聚核苷酸(例如寄存編號NM_004087)之有義及/或天然反義序列、其變異體、對偶基因、同功異型物、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。寡核苷酸較佳為反義分子且目標包括反義及/或有義DLG1聚核苷酸之編碼及非編碼區域。
本發明之較佳目標區段亦可與本發明之其各別互補反義化合物組合以形成穩定雙股(雙鏈體)寡核苷酸。
該等雙股寡核苷酸部分在此項技術中已展示可經由反義機制調節目標表現及調節轉譯以及RNA加工。此外，雙股部分可經化學修飾。舉例而言，該等雙股部分已展示可藉由雙鏈體之反義股與目標之經典雜交來觸發目標之酶促降解，從而抑制目標。
在一實施例中，反義寡核苷酸靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸(例如寄存編號NM_004087)、其變異體、對偶基因、同功異型物、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。寡核苷酸較佳為反義分子。
根據本發明之實施例，目標核酸分子不僅限於DLG1，且亦包括DLG1分子之同功異型物、受體、同源物及其類似物中之任一者。
在一實施例中，寡核苷酸靶向DLG1聚核苷酸之天然反義序列，例如，如SEQ ID NOS: 2所闡述之聚核苷酸，及其任何變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。反義寡核苷酸之實例如SEQ ID NOS: 3至12所闡述。
在一實施例中，寡核苷酸與DLG1反義物之核酸序列(包括但不限於與DLG1聚核苷酸相關的非編碼有義及/或反義序列)互補或結合，且調節DLG1分子之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸與DLG1天然反義之核酸序列(如SEQ ID NOS: 2所闡述)互補或結合且調節DLG1分子之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸包含SEQ ID NOS: 3至12之至少5個連續核苷酸序列且調節DLG1分子之表現及/或功能。
聚核苷酸目標包含DLG1，包括其家族成員、DLG1之變異體；DLG1之突變體，包括SNP；DLG1之非編碼序列；DLG1之對偶基因；物種變異體、片段及其類似物。寡核苷酸較佳為反義分子。
在一實施例中，靶向DLG1聚核苷酸之寡核苷酸包含：反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)、微型干擾RNA(miRNA)、小時序RNA(stRNA)、或短髮夾狀RNA(shRNA)、小RNA誘發之基因活化(RNAa)、或小活化RNA(saRNA)。
在一實施例中，用寡核苷酸靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸(例如SEQ ID NOS: 1)及該等DLG同功異型物之天然反義序列(例如SEQ ID NO: 2)調節此等目標之表現或功能。在一實施例中，表現或功能與對照組相比得以上調。在一實施例中，表現或功能與對照組相比得以下調。
在一實施例中，反義化合物或調節劑包含如SEQ ID NOS: 3至12所闡述之序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。
在一實施例中，SEQ ID NOS: 3至12包含一或多個LNA核苷酸。表1展示適用於本發明方法中的例示性反義寡核苷酸。
所要目標核酸之調節可以此項技術中已知之若干方式進行。舉例而言，反義寡核苷酸、siRNA等。酶性核酸分子(例如核糖核酸酶)為能夠催化多種反應中之一或多者的核酸分子，包括能夠以核苷酸鹼基序列特異性方式反覆裂解其他各別核酸分子。該等酶性核酸分子可用於例如實際上靶向任何RNA轉錄本。
反式裂解酶性核酸分子因其序列特異性而展示用作人類疾病之治療劑的前景。酶性核酸分子可經設計以裂解細胞RNA之背景內的特定RNA目標。該裂解事件致使mRNA無功能且結束來自彼RNA之蛋白質表現。以此方式，可選擇性抑制與疾病狀況相關之蛋白質之合成。
一般而言，具有RNA裂解活性之酶性核酸藉由首先結合至目標RNA起作用。該結合經由酶性核酸之目標結合部分發生，該目標結合部分緊靠著該分子中起裂解目標RNA作用之酶性部分。因此，酶性核酸首先識別，接著經由互補鹼基配對結合目標RNA，且一旦結合至正確位點，即發揮酶作用以切割目標RNA。該目標RNA之戰略裂解將破壞其直接合成編碼蛋白質之能力。在酶性核酸已結合並裂解其RNA目標之後，其自彼RNA釋放以搜尋另一目標及可反覆結合並裂解新目標。
已使用諸如活體外選擇(進化)策略(Orgel,(1979) Proc. R. Soc. London,B205,435)之若干方法來開發能夠催化諸如磷酸二酯鍵及醯胺鍵之裂解與接合之多種反應之新核酸催化劑。
催化活性最佳之核糖核酸酶之開發將顯著有助於使用RNA裂解核糖核酸酶來調節基因表現的任何策略。舉例而言，錘頭核糖核酸酶在飽和(10 mM)濃度之Mg2+輔因子存在下以約1 min-1之催化速率(kcat)起作用。人造「RNA連接酶」核糖核酸酶已顯示以約100 min-1之速率催化相應自修飾反應。此外，已知具有由DNA構成之受質結合臂的某些經修飾之錘頭核糖核酸酶以接近100 min-1之多重轉換速率催化RNA裂解。最終，用某些核苷酸類似物置換錘頭之催化核心內的特定殘基得到經修飾之核糖核酸酶，其在催化速率方面顯示多達10倍之改良。此等發現表明核糖核酸酶可以顯著大於由大多數天然自裂解核糖核酸酶活體外呈現之催化速率促進化學轉化。某些自裂解核糖核酸酶之結構亦可能最佳化以得到最大催化活性，或可製造呈現顯著較快之RNA磷酸二酯裂解速率的全新RNA基元。
符合「錘頭」型之RNA催化劑對RNA受質進行的分子間裂解最先於1987年(Uhlenbeck,O. C. (1987) Nature,328:596-600)展示。回收獲得RNA催化劑且使其與多重RNA分子反應，表明其確實為催化性的。
基於「錘頭」基元設計的催化RNA已用於藉由在催化RNA中作出適當鹼基變化來裂解特定目標序列以維持與目標序列之必需鹼基配對。此允許使用催化RNA來裂解特定目標序列且指示基於「錘頭」型設計的催化RNA可在活體內裂解特定受質RNA。
RNA干擾(RNAi)已成為哺乳動物及哺乳動物細胞中調節基因表現之有效工具。此方法需要使用表現質體或病毒及加工成siRNA的小髮夾狀RNA編碼序列傳遞小干擾RNA(siRNA)作為RNA本身或作為DNA。此系統能有效傳送前siRNA至前siRNA具有活性之細胞質中且允許使用經調節及組織特異性啟動子進行基因表現。
在一實施例中，寡核苷酸或反義化合物包含核糖核酸(RNA)及/或脫氧核糖核酸(DNA)之寡聚物或聚合物、或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。此術語包括由天然產生之核苷酸、糖及共價核苷間(主鏈)鍵構成之寡核苷酸以及具有非天然產生之部分而功能類似的寡核苷酸。該等經修飾或經取代之寡核苷酸通常因諸如以下所要性質而比原生形式更為所需：細胞攝取增加、對目標核酸的親和力提高及在核酸酶存在下的穩定性提高。
根據本發明，寡核苷酸或「反義化合物」包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核糖核酸酶、外來引導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物(諸如siRNA化合物)、saRNA、aRNA及其他雜交至目標核酸之至少一部分且調節其功能的寡聚化合物。因而，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可為此等物質中之一或多者的模擬物。此等化合物可為單股、雙股、環形或髮夾狀寡聚化合物且可含有諸如內部或末端凸出、錯配或環狀物之結構元件。反義化合物按常規製備成線性的，但可相連或以其他方式製備成環形及/或分支的。反義化合物可包括構築體，諸如雜交以形成完全或部分雙股化合物之兩股或具有足夠自我互補性以允許雜交及形成完全或部分雙股化合物之單股。兩股可在內部連接，而留有自由的3'端或5'端或可連接形成連續髮夾狀結構或環狀物。髮夾狀結構可在5'端或3'端含有突出物，產生單股特性之延長物。雙股化合物視情況可在各末端均包括突出物。其他修飾可包括連接至一末端、選定核苷酸位置、糖位置或一核苷間鍵上的結合基團。或者，兩股可經由非核酸部分或連接基團連接。當僅由一股形成時，dsRNA可採取自我互補髮夾型分子形式，其自身對折形成雙螺旋。因此，dsRNA可為完全或部分雙股的。基因表現之特定調節可藉由在轉殖基因細胞株中穩定表現dsRNA髮夾而實現。當由兩股或採取自我互補髮夾型分子形式以自身對折形成雙螺旋的單股形成時，兩股(或單股之雙螺旋形成區域)為以沃森克里克方式鹼基配對之互補RNA股。
一旦引入系統中，本發明化合物可引發一或多種酶或結構蛋白之作用以實現目標核酸之裂解或其他修飾或可經由基於佔用之機制起作用。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為「DNA樣」(亦即一般具有一或多個2'-去氧糖且一般為T而非U鹼基)或「RNA樣」(亦即一般具有一或多個2'-羥基或2'-經修飾之糖且一般為U而非T鹼基)。核酸螺旋可採用一種以上類型之結構，最常用的為A形及B形。咸信，一般而言，具有B形樣結構之寡核苷酸為「DNA樣」且具有A形樣結構之寡核苷酸為「RNA樣」。在一些(嵌合)實施例中，反義化合物可含有A形及B形兩種區域。
本發明之反義化合物可包含長度為約5至約80個核苷酸(亦即約5至約80個連接核苷)之反義部分。此係指反義化合物之反義股或部分之長度。換言之，本發明之單股反義化合物包含5至約80個核苷酸，且本發明之雙股反義化合物(諸如dsRNA)包含5至約80個核苷酸長度的有義及反義股或部分。一般技術者應瞭解，此包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個(或其中之任何範圍)核苷酸長度之反義部分。
在一實施例中，本發明之反義化合物具有10至50個核苷酸長度之反義部分。一般技術者應瞭解，此包含具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(或其中之任何範圍)核苷酸長度的反義部分之寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸長度為15個核苷酸。
在一實施例中，本發明之反義或寡核苷酸化合物具有12或13至30個核苷酸長度之反義部分。一般技術者應瞭解，此包含具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(或其中之任何範圍)核苷酸長度的反義部分之反義化合物。
在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包括化合物中之一或多個核苷酸位置上存在不同鹼基的變異體。舉例而言，若第一核苷酸為腺苷，則可產生在此位置含有胸苷、鳥苷或胞苷之變異體。此可在反義或dsRNA化合物之任一位置上發生。隨後使用本文所述之方法測試此等化合物以測定其抑制目標核酸表現之能力。
在一些實施例中，反義化合物與目標之間的同源性、序列一致性或互補性為約40%至約60%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約60%至約70%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約70%至約80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
在一實施例中，反義寡核苷酸，諸如SEQ ID NOS: 3至12闡述的核酸分子，包含一或多個取代或修飾。在一實施例中，核苷酸經鎖核酸(LNA)取代。
在一實施例中，寡核苷酸靶向與DLG1相關之編碼及/或非編碼序列及如SEQ ID NOS: 1及2闡述的序列的有義及/或反義核酸分子之一或多個區域。寡核苷酸亦靶向SEQ ID NOS: 1及2之重疊區域。
本發明之某些較佳寡核苷酸為嵌合寡核苷酸。在本發明之上下文中，「嵌合寡核苷酸」或「嵌合體」為含有兩個或兩個以上化學上不同之區域的寡核苷酸，該等區域各由至少一個核苷酸構成。此等寡核苷酸通常含有至少一個經修飾核苷酸區域，其賦予一或多種有利性質(諸如核酸酶抗性提高、細胞攝取增加、對目標之結合親和力提高)；及作為能夠裂解RNA:DNA或RNA:RNA雜交物之酶之受質的區域。舉例而言，RNase H為裂解RNA:DNA雙螺旋之RNA股的細胞內切核酸酶。RNase H之活化因此使得RNA目標裂解，藉此極大地提高基因表現之反義調節的效率。因此，當使用嵌合寡核苷酸時，與雜交至相同目標區域之硫代磷酸酯去氧寡核苷酸相比，較短寡核苷酸通常可獲得相當之結果。RNA目標之裂解可藉由凝膠電泳及(若需要)此項技術中已知之相關核酸雜交技術按常規偵測。在一實施例中，嵌合寡核苷酸包含至少一個經修飾以提高目標結合親和力之區域及(一般)用作RNAse H之受質的區域。寡核苷酸對其目標(在此情況下，編碼ras之核酸)之親和力按常規藉由量測寡核苷酸/目標對之Tm來測定，Tm為寡核苷酸與目標解離時之溫度；以分光光度法偵測解離。Tm愈高，寡核苷酸對目標之親和力愈大。
本發明之嵌合反義化合物可形成為如上所述之兩個或兩個以上寡核苷酸、經修飾寡核苷酸、寡核苷及/或寡核苷酸模擬物之複合結構。該等化合物在此項技術中亦稱為雜交體或間隙子(gapmer)。教示該等雜交結構之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,013,830號、第5,149,797號、第5,220,007號、第5,256,775號、第5,366,878號、第5,403,711號、第5,491,133號、第5,565,350號、第5,623,065號、第5,652,355號、第5,652,356號及第5,700,922號，其中各者均以引用方式併入本文中。
在一實施例中，經修飾之寡核苷酸區域包含至少一個在糖之2'位置處經修飾之核苷酸，最佳2'-O烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-經修飾之核苷酸。在另一實施例中，RNA修飾包括在嘧啶核糖上的2'-氟、2'-胺基及2'O-甲基修飾、在RNA之3'端的無鹼基殘基或反向鹼基。該等修飾按常規併入寡核苷酸中且此等寡核苷酸已展示對既定目標具有比2'-去氧寡核苷酸高之Tm(亦即較高目標結合親和力)。該提高的親和力之作用為極大地增強RNAi寡核苷酸對基因表現之抑制。RNAse H為裂解RNA:DNA雙螺旋之RNA股的細胞核酸內切酶；此酶之活化因此使得RNA目標裂解，且因此可極大地提高RNAi抑制之效率。RNA目標之裂解按常規可藉由凝膠電泳證明。在一實施例中，嵌合寡核苷酸亦經修飾以提高核酸酶抗性。細胞含有多種可降解核酸之外切及內切核酸酶。許多核苷酸及核苷修飾已顯示使得其所併入的寡核苷酸比原生寡去氧核苷酸更耐核酸酶消化。核酸酶抗性按常規藉由將寡核苷酸與細胞萃取物或經分離核酸酶溶液一起培育且一般藉由凝膠電泳量測隨時間剩餘的完整寡核苷酸之程度來量測。已經修飾以提高其核酸酶抗性之寡核苷酸保持完整之時間比未修飾之寡核苷酸長。多種寡核苷酸修飾已經證明可提高或賦予核酸酶抗性。含有至少一個硫代磷酸酯修飾之寡核苷酸目前更佳。在一些情況下，提高目標結合親和力之寡核苷酸修飾亦獨立地能提高核酸酶抗性。
本發明預想的一些較佳寡核苷酸之特定實例包括包含經修飾主鏈，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環糖間鍵的寡核苷酸。最佳為具有硫代磷酸酯主鏈之寡核苷酸及具有雜原子主鏈，尤其CH2--NH--O--CH2、CH,--N(CH3)--O--CH2[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2及O--N(CH3)--CH2--CH2主鏈之寡核苷酸，其中原生磷酸二酯主鏈表示為O--P--O--CH,)。由De Mesmaeker等人(1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374揭示之醯胺主鏈亦較佳。具有N-嗎啉基主鏈結構之寡核苷酸亦較佳(Summerton及Weller，美國專利第5,034,506號)。在另一實施例中，諸如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸之磷酸二酯主鏈經聚醯胺主鏈置換，核苷酸直接或間接結合至聚醯胺主鏈之氮雜氮原子上。寡核苷酸亦可包含一或多個經取代之糖部分。較佳寡核苷酸在2'位置處包含以下一者：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3(其中n為1至約10)；C1至C10低碳烷基、烷氧基烷氧基、經取代之低碳烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷基胺基；經取代之矽烷基；RNA裂解基團；報導基團；嵌入劑；改良寡核苷酸之藥物動力學性質的基團；或改良寡核苷酸之藥效學性質之基團及其他具有類似性質之取代基。較佳修飾包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2 CH2 OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)]。其他較佳修飾包括2'-甲氧基(2'-O--CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)及2'-氟(2'-F)。所作之類似修飾亦可在寡核苷酸上的其他位置，尤其在3'端核苷酸上的糖之3'位置及5'端核苷酸之5'位置。寡核苷酸亦可具有諸如環丁基之糖模擬物來替代戊呋喃糖基。
寡核苷酸亦可或者或另外包括核苷鹼基(在此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未修飾」或「天然」核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核苷酸包括僅極少或瞬時在天然核酸中發現之核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、尤其5-甲基胞嘧啶(亦稱為5-甲基-2'去氧胞嘧啶且在此項技術中通常稱為5-Me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC及龍瞻雙醣基HMC以及合成核苷酸，例如2-胺基腺嘌呤、2-(甲基胺基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(胺基烷基胺基)腺嘌呤或其他雜取代之烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N6(6-胺基己基)腺嘌呤及2,6-二胺基嘌呤。可包括此項技術中已知之「通用(universal)」鹼基，例如肌苷。已顯示5-Me-C取代使核酸雙螺旋穩定性提高0.6-1.2℃且為目前較佳之鹼基取代。
本發明之寡核苷酸之另一修飾涉及使一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸，由此提高寡核苷酸之活性或細胞攝取。該等部分包括(但不限於)脂質部分(諸如膽固醇部分、膽固醇基部分)、脂鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基)、多元胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。包含親脂性部分之寡核苷酸及製備該等寡核苷酸之方法在此項技術中已知，例如美國專利第5,138,045號、第5,218,105號及第5,459,255號。
在既定寡核苷酸中不必所有位置均經相同修飾，且實際上，一種以上上述修飾可併入單一寡核苷酸中乃至寡核苷酸內的單一核苷內。本發明亦包括寡核苷酸，其為如上文中所定義之嵌合寡核苷酸。
在另一實施例中，本發明之核酸分子與包括但不限於以下之另一部分結合：基礎核苷酸、聚醚、多元胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、脂質或聚烴化合物。熟習此項技術者將認識到，此等分子可連接於構成該核酸分子之任一或多個核苷酸之糖、鹼基或磷酸酯基上之若干位置。
根據本發明使用的寡核苷酸可便利地且按常規經由熟知的固相合成技術製得。用於此合成之設備由包括Applied Biosystems在內的數家供應商出售。亦可使用該合成之任何其他裝置；寡核苷酸之實際合成在一般技術者之技能內。亦熟知使用類似技術來製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。亦熟知使用類似技術及市售經修飾之醯胺酯(amidite)及控制孔隙之玻璃(CPG)產物，諸如生物素、螢光素、吖啶或補骨脂素修飾之醯胺酯及/或CPG(獲自Glen Research,Sterling VA)來合成螢光標記、生物素標記或其他修飾之寡核苷酸，諸如膽固醇修飾之寡核苷酸。
根據本發明，使用修飾，諸如使用LNA單體來提高由諸如MOE、ANA、FANA、PS等當前化學物構成之寡核苷酸的作用之效能、特異性及持續時間且增加其投藥途徑。此可藉由用LNA單體取代當前寡核苷酸中之一些單體來實現。LNA修飾之寡核苷酸可具有類似於母化合物的尺寸或可較大或較佳較小。該等LNA修飾之寡核苷酸較佳含有少於約70%、更佳少於約60%、最佳少於約50% LNA單體且其尺寸較佳介於約5與25個核苷酸之間、更佳介於約12與20個核苷酸之間。
較佳經修飾之寡核苷酸主鏈包含但不限於硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包含3'伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯)、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(包含3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯(具有正常3'-5'鍵)、此等物質之2'-5'連接類似物、及具有反極性者，其中相鄰核苷單元對以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。
教示上述含磷鍵之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,196號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,306號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號及第5,625,050號,其中各者均以引用方式併入本文中。
不包括磷原子之較佳經修飾寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵、或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成之主鏈。其包括具有以下之物質：N-嗎啉基鍵(部分地由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；亞甲基甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸酯基主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有N、O、S及CH2混合構成部分之其他主鏈。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,264,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,610,289號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號及第5,677,439號，其中各者均以引用方式併入本文中。
在其他較佳寡核苷酸模擬物中，核苷單元之糖與核苷間鍵(亦即主鏈)均經新基團置換。保持鹼基單元與適當核酸標靶化合物雜交。一種此寡聚化合物，即已顯示具有優良雜交性質之寡核苷酸模擬物稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸之糖主鏈經含醯胺之主鏈，尤其胺基乙基甘胺酸主鏈置換。核苷鹼基保留且直接或間接結合於主鏈之醯胺部分之氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,539,082號、第5,714,331號及第5,719,262號，其中各者均以引用方式併入本文中。PNA化合物之其他教示可見於NieLsen等人(1991) Science 254,1497-1500中。
在本發明之一實施例中，具有硫代磷酸酯主鏈之寡核苷酸及具有雜原子主鏈且尤其上文提及之美國專利第5,489,677號之CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈)、CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-及-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中原生磷酸二酯主鏈表示為-O-P-O-CH2-)，及上文提及之美國專利第5,602,240號之醯胺主鏈的寡核苷。具有上文提及之美國專利第5,034,506號之N-嗎啉基主鏈結構的寡核苷酸亦較佳。
經修飾之寡核苷酸亦可含有一或多個經取代之糖部分。較佳寡核苷酸在2'位置處包含以下一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基,其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C至CO烷基或C2至CO烯基及炔基。尤其較佳為O(CH2)nOmCH3、O(CH2)n,OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2nON(CH2)nCH3)2，其中n及m可為1至約10。其他較佳寡核苷酸在2'位置處包含以下一者：C至CO低碳烷基、經取代之低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑、改良寡核苷酸之藥物動力學性質的基團、或改良寡核苷酸之藥效學性質的基團、及其他具有類似性質之取代基。較佳修飾包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)，亦即烷氧基烷氧基。其他較佳修飾包括2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2，亦稱為2'-DMAOE，如下文實例中所述，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(此項技術中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)。
其他較佳修飾包含2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-O CH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。所作之類似修飾亦可在寡核苷酸之其他位置，尤其3'末端核苷酸上或2'-5'連接之寡核苷酸中糖之3'位置及5'末端核苷酸之5'位置。寡核苷酸亦可具有糖模擬物(諸如環丁基部分)替代戊呋喃糖基糖。教示該等經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號及第5,700,920號，其中各者均以引用方式併入本文中。
寡核苷酸亦可包括核苷鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核苷酸包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核苷酸包括其他合成核苷酸及天然核苷酸，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿密啶、2-硫胸嘧啶及2-硫胞嘧啶；5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵基(尤其5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
另外，核苷酸包含美國專利第3,687,808號中所揭示者、'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering',第858-859頁，Kroschwitz,J.I.,編John Wiley & Sons,1990中所揭示者、Englisch等人,'Angewandle Chemie,International Edition',1991,30,第613頁所揭示者及Sanghvi,Y.S.,第15章，'Antisense Research and Applications',第289-302頁,Crooke,S.T.及Lebleu,B. ea.,CRC Press,1993所揭示者。此等核苷酸中某些尤其適用於提高本發明之寡聚化合物之結合親和力。其包含5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代嘌呤，包含2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧碇。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙螺旋穩定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.及Lebleu,B.,編，'Antisense Research and Applications',CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278頁)且為目前較佳之鹼基取代，當與2'-O甲氧基乙基糖修飾組合時尤其較佳。
教示上述經修飾之核苷酸以及其他經修飾之核苷酸之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第3,687,808號以及第4,845,205號、第5,130,302號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,750,692號及第5,681,941號，其中各者均以引用方式併入本文中。
本發明之寡核苷酸之另一修飾涉及使一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸，由此提高寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取。
該等部分包含(但不限於)：脂質部分，諸如膽固醇部分、膽酸；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇；脂鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基；磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯；多元胺或聚乙二醇鏈；或金剛烷乙酸、棕櫚基部分或十八胺或己基胺基-羰基-第三氧基膽固醇部分。
教示該等寡核苷酸結合物之製備的代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號及第5,688,941號，其中各者均以引用方式併入本文中。
藥物發現：本發明化合物亦可應用於藥物發現及目標驗證之領域中。本發明係關於本文所鑑別之化合物及較佳目標區段之用途，其在藥物發現研究中用以闡明胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸與疾病狀況、表型或病狀之間存在的關係。此等方法包括偵測或調節DLG1聚核苷酸，其包含使樣品、組織、細胞或生物體與本發明化合物接觸，在處理後某一時間量測DLG1聚核苷酸之核酸或蛋白含量及/或有關表型或化學終點，及視情況將量測值與未經處理樣品或用本發明之其他化合物處理的樣品比較。此等方法亦可與其他實驗平行或組合進行以測定對於目標驗證過程未知基因之功能或測定特定基因產物作為治療或預防特定疾病、病狀或表型之目標的有效性。
評估基因表現之上調或抑制：
外源核酸向宿主細胞或生物體中之轉移可藉由直接偵測在細胞或生物體中核酸之存在來評估。該偵測可藉由此項技術中熟知之若干方法實現。舉例而言，外源核酸之存在可藉由南方墨點分析或藉由聚合酶鏈反應(PCR)技術，使用特異性擴增與核酸相關之核苷酸序列的引子來偵測。外源核酸之表現亦可使用包括基因表現分析在內之習知方法來量測。舉例而言，由外源核酸產生之mRNA可使用北方墨點分析(Northern blot)及反轉錄PCR(RT-PCR)偵測及定量。
外源核酸表現RNA亦可藉由量測酶活性或報導蛋白活性來偵測。舉例而言，反義調節活性可間接地根據目標核酸表現之減少或增加作為外源核酸產生效應RNA之指示來量測。基於序列保守性，可設計並使用引子來擴增目標基因之編碼區域。最初，可使用自各基因最高度表現之編碼區域構造模型對照基因，但可使用任何編碼或非編碼區域。各對照基因藉由將各編碼區域插入報導編碼區域與其聚(A)信號之間來組裝。此等質體將產生在基因之上游部分具有報導基因及在3'非編碼區域具有潛在RNAi目標之mRNA。個別反義寡核苷酸之有效性將藉由對報導基因之調節來分析。適用於本發明方法中的報導基因包括乙醯羥基酸合成酶(AHAS)、鹼性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖苷酸酶(GUS)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、青色螢光蛋白(CFP)、辣根過氧化酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂鹼合成酶(NOS)、章魚肉鹼合成酶(OCS)及其衍生物。可使用賦予針對安比西林(ampicillin)、博萊黴素(bleomycin)、氯黴素(chloramphenicol)、健大黴素(gentamycin)、濕黴素(hygromycin)、康黴素(kanamycin)、林可黴素(lincomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、草丁膦(phosphinothricin)、嘌黴素(puromycin)及四環素(tetracycline)之抗性的多種選擇標記。測定對報導基因之調節的方法在此項技術中已為吾人所熟知，且包括(但不限於)螢光方法(例如螢光光譜法、螢光活化細胞分類(FACS)、螢光顯微術)、抗生素抗性測定。
DLG1蛋白及mRNA表現可使用熟習此項技術者已知且在本文中別處描述之方法分析。舉例而言，諸如ELISA之免疫檢定可用於量測蛋白含量。DLG1 ELISA檢定套組可例如自R&D Systems(Minneapolis,MN)購得。
在實施例中，藉由與對照組樣品中的DLG1表現相比來評估使用本發明之反義寡核苷酸處理的樣品(例如活體內或活體外之細胞或組織)中之DLG1表現(例如mRNA或蛋白質)。舉例而言，蛋白質或核酸之表現可使用熟習此項技術者已知之方法與模擬處理或未經處理樣品中之蛋白質或核酸之表現比較。或者，視所要資訊而定，可與用對照反義寡核苷酸(例如具有變異或不同序列者)處理之樣品比較。在另一實施例中，可將經處理與未經處理樣品中之DLG1蛋白或核酸表現差異與經處理樣品與未經處理樣品中之不同核酸(包括研究人員認為適合的任何標準物，例如管家基因)表現差異比較。
所觀測之差異可按需要例如以比率或分率形式表示以用於與對照組比較。在實施例中，用本發明之反義寡核苷酸處理之樣品中的DLG1 mRNA或蛋白含量與未經處理樣品或用對照核酸處理之樣品相比增加或減少約1.25倍至約10倍或10倍以上。在實施例中，DLG1 mRNA或蛋白之含量增加或減少至少約1.25倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍或至少約10倍或10倍以上。
套組、研究試劑、診斷劑及治療劑
本發明化合物可用於診斷、治療及預防，且作為研究試劑及套組組分。此外，能夠以敏銳特異性抑制基因表現之反義寡核苷酸通常由一般技術者用於闡明特定基因之功能或區分生物路徑之各個成員的功能。
對於在套組及診斷劑及各種生物系統中使用，本發明化合物單獨或與其他化合物或治療劑組合適用作差示及/或組合分析中之工具以闡明在細胞及組織內表現的基因之一部分或整個互補序列之表現模式。
如本文中所用，術語「生物系統」或「系統」經定義為表現或能夠表現胚盤大同源物1(DLG1)基因之表現產物的任何生物體、細胞、細胞培養物或組織。此等生物系統包括(但不限於)人類、轉殖基因動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植物、移植物及其組合。
作為一個非限制性實例，比較經一或多種反義化合物處理之細胞或組織內之表現模式與未經反義化合物處理之對照細胞或組織內之表現模式且分析所產生之模式的差異基因表現量，因為該等模式與(例如)所檢驗基因之疾病相關性(disease association)、信號傳導路徑、細胞定位(cellular localization)、表現量、大小、結構或功能有關。此等分析可對受刺激或未受刺激之細胞且在影響表現模式之其他化合物存在或不存在下執行。
此項技術中已知之基因表現分析方法之實例包括DNA陣列或微陣列、SAGE(基因表現連續分析)、READS(經消化cDNA之限制酶擴增)、TOGA(總基因表現分析)、蛋白質陣列及蛋白質組研究、表現序列標籤(EST)定序、消減RNA指紋(SuRF)、消減選殖、差示呈現(DD)、比較性基因組雜交、FISH(螢光原位雜交)技術及質譜分析法。
本發明化合物適用於研究及診斷，此係由於此等化合物雜交至編碼胚盤大同源物1(DLG1)之核酸之故。舉例而言，以本文中揭示為有效DLG1調節劑之效率條件下雜交的寡核苷酸在偏向基因擴增或偵測之條件下分別為有效引子或探針。此等引子及探針適用於需要特異性偵測編碼DLG1之核酸分子的方法及擴增該核酸分子以用於偵測或用於進一步研究DLG1。本發明之反義寡核苷酸(尤其引子及探針)與編碼DLG1之核酸的雜交可藉由此項技術中已知之手段偵測。該等手段可包括酶與寡核苷酸之結合、寡核苷酸之放射性標記或任何其他合適偵測手段。亦可製備使用該等偵測手段來偵測樣品中之DLG1含量的套組。
反義物之特異性及敏感性亦由熟習此項技術者操控以用於治療用途。反義化合物已用作治療動物(包括人類)之疾病狀況的治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全且有效地投與人類且許多臨床試驗目前正在進行中。因此確定，反義化合物可為適用的治療形式，其可經組態成適用於治療細胞、組織及動物，尤其人類之治療方案中。
對於治療，藉由投與本發明之反義化合物來治療疑似患有可藉由調節DLG1聚核苷酸之表現來治療的疾病或病症之動物(較佳人類)。舉例而言，在一非限制性實施例中，方法包含向需要治療之動物投與治療有效量之DLG1調節劑的步驟。本發明之DLG1調節劑有效地調節DLG1之活性或調節DLG1蛋白之表現。在一實施例中，DLG1在動物中之活性或表現與對照組相比受到約10%抑制。較佳，DLG1在動物中之活性或表現受到約30%抑制。更佳，DLG1在動物中之活性或表現受到50%或50%以上抑制。因此，寡聚化合物與對照組相比調節胚盤大同源物1(DLG1)mRNA之表現至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。
在一實施例中，胚盤大同源物1(DLG1)在動物中之活性或表現與對照組相比增加約10%。較佳，DLG1在動物中之活性或表現增加約30%。更佳，DLG1在動物中之活性或表現增加50%或50%以上。因此，寡聚化合物與對照組相比調節DLG1 mRNA之表現至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。
舉例而言，胚盤大同源物1(DLG1)之表現的減少可在動物之血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其他體液、組織或器官中量測。較佳地，所分析之該等體液、組織或器官內所含的細胞含有編碼DLG1肽之核酸分子及/或DLG1蛋白本身。
可藉由添加有效量之本發明化合物至合適的醫藥學上可接受之稀釋劑或載體中從而在醫藥組合物中利用本發明化合物。本發明之化合物及方法之使用亦可適用於預防。
結合物
本發明寡核苷酸之另一修飾涉及使一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸，由此提高寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取。此等部分或結合物可包括共價結合至諸如第一或第二羥基之官能基的結合基團。本發明之結合基包括嵌入劑、報導分子、聚胺、聚醯胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物藥效學性質之基團及增強寡聚物之藥物動力學性質之基團。典型結合基團包括膽固醇、脂質、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及染料。在本發明之上下文中，提高藥效學性質之基團包括改良攝取、提高耐降解性及/或增強與目標核酸之序列特異性雜交的基團。在本發明之上下文中，提高藥物動力學性質之基團包括改良本發明化合物之攝取、分佈、代謝或排泄的基團。代表性結合基團揭示於1992年10月23日申請的國際專利申請案第PCT/US92/09196號及美國專利第6,287,860號中，該等文獻以引用方式併入本文中。結合部分包括(但不限於)：脂質部分，諸如膽固醇部分、膽酸；硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇；脂鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基；磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯；多元胺或聚乙二醇鏈；或金剛烷乙酸、棕櫚基部分或十八基胺或己基胺基-羰基-第三氧基膽固醇部分。本發明之寡核苷酸亦可與活性藥物物質結合，例如阿司匹林(aspirin)、華法林(warfarin)、苯基丁氮酮、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮基布洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺醯基肌胺酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufenamic acid)、亞葉酸(folinic acid)、苯并噻二嗪、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮呯(diazepine)、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽(barbiturate)、頭孢菌素(cephalosporin)、磺胺藥物(sulfa drug)、抗糖尿病藥、抗細菌劑或抗生素。
教示該等寡核苷酸結合物之製備的代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號及第5,688,941號。
調配物
本發明之化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物混合、囊封、結合或以其他方式締合成例如脂質體、受體靶向分子、口服、直腸、表面或其他調配物，以幫助攝取、分佈及/或吸收。教示該等幫助攝取、分佈及/或吸收之調配物的製備之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第5,108,921號、第5,354,844號、第5,416,016號、第5,459,127號、第5,521,291號、第5,543,165號、第5,547,932號、第5,583,020號、第5,591,721號、第4,426,330號、第4,534,899號、第5,013,556號、第5,108,921號、第5,213,804號、第5,227,170號、第5,264,221號、第5,356,633號、第5,395,619號、第5,416,016號、第5,417,978號、第5,462,854號、第5,469,854號、第5,512,295號、第5,527,528號、第5,534,259號、第5,543,152號、第5,556,948號、第5,580,575號及第5,595,756號，其中各者均以引用方式併入本文中。
儘管反義寡核苷酸無需在有載體之情況下投與以調節目標表現及/或功能，但本發明之實施例係關於用於表現反義寡核苷酸之表現載體構築體，包含啟動子、雜交啟動子基因序列，且具有強大的組成性啟動子活性或可在所要情況下誘發之啟動子活性。
在一實施例中，本發明實踐涉及用合適的核酸傳遞系統投與至少一種上述反義寡核苷酸。在一實施例中，該系統包括可操作連接於聚核苷酸之非病毒載體。該等非病毒載體之實例包括單獨寡核苷酸(例如SEQ ID NOS: 3至12之任一或多者)或其與合適蛋白質、多醣或脂質調配物之組合。
此外，合適核酸傳遞系統包括病毒載體，通常為來自腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、輔助依賴性腺病毒、反轉錄病毒或日本脂質體(HVJ)複合物之血球凝集病毒中之至少一者的序列。病毒載體較佳包含可操作地連接於聚核苷酸之強大真核生物啟動子，例如細胞巨大病毒(CMV)啟動子。
其他較佳載體包括病毒載體、融合蛋白及化學結合物。反轉錄病毒載體包括莫洛尼(Moloney)鼠類白血病病毒及基於HIV之病毒。一種較佳的基於HIV之病毒載體包含至少兩種載體，其中gag及pol基因來自HIV基因組且env基因來自另一病毒。DNA病毒載體較佳。此等載體包括痘載體，諸如正痘或鳥類痘載體：疱疹病毒載體，諸如單純性疱疹I病毒(HSV)載體；腺病毒載體及腺相關病毒載體。
本發明之反義化合物涵蓋任何醫藥學上可接受之鹽、酯或該等酯之鹽、或任何其他化合物，其在投與動物(包括人類)後能夠(直接或間接)提供生物活性代謝物或其殘餘物。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之生理學及醫藥學上可接受之鹽，亦即保留母化合物之所要生物活性且不另外產生不良毒理學作用的鹽。對於寡核苷酸，醫藥學上可接受之鹽之較佳實例及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。
本發明亦包括包括本發明之反義化合物的醫藥組合物及調配物。視需要局部治療抑或全身性治療及待治療之區域而定，本發明之醫藥組合物可以多種方式投與。投藥可為表面(包括經眼及至黏膜，包括經陰道及直腸傳遞)、肺部(例如藉由吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括由噴霧器；氣管內、鼻內、表皮及經皮)、口服或非經腸投藥。非經腸投藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液；或顱內(例如，鞘內腔或腦室內)投藥。
對於治療中樞神經系統中之組織，投藥可藉由例如注射或輸注至腦脊髓液中來進行。反義RNA向腦脊髓液中之投藥描述於例如美國專利申請公開案第2007/0117772號，「Methods for slowing familial ALS disease progression,」中，該文獻以引用方式全部併入本文中。
當意欲將本發明之反義寡核苷酸投與中樞神經系統中之細胞時，可與一或多種能夠促進本發明之反義寡核苷酸滲透越過血腦障壁之藥劑一起投藥。可例如注射於內嗅皮質或海馬區中。藉由投與腺病毒載體至肌肉組織中之運動神經元來傳遞神經營養因子描述於例如美國專利第6,632,427號中，「Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons,」，其以引用方式併入本文中。載體直接向腦(例如紋狀體、丘腦、海馬區或黑質)之傳遞在此項技術中已知且描述於例如美國專利第6,756,523號，「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain,」中，其以引用方式併入本文中。投藥可藉由注射快速進行或經一段時間藉由緩慢輸注或投與緩慢釋放調配物來進行。
本發明之反義寡核苷酸亦可與提供所要醫藥或藥效學性質之藥劑聯合或結合。舉例而言，反義寡核苷酸可偶合至此項技術中已知可促進滲透或傳輸越過血腦障壁之任何物質(諸如針對轉鐵蛋白受體之抗體)且藉由靜脈注射投與。反義化合物可與例如使得反義化合物更有效及/或增加反義化合物越過血腦障壁之傳輸的病毒載體聯合。滲透性血腦障壁破壞亦可例如藉由輸注以下各物來達成：糖包括(但不限於)內消旋赤藻糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、甜醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露糖醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、福壽草醇(adonitol)、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)海藻糖、L(-)海藻糖、D(-)來蘇糖、L(+)來蘇糖及L(-)來蘇糖；或胺基酸，包括(但不限於)麩醯胺酸、離胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸及牛磺酸。提高血腦障壁滲透之方法及材料描述於例如美國專利第4,866,042號，「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier,」、第6,294,520號，「Material for passage through the blood-brain barrier,」及第6,936,589號，「Parenteral delivery systems,」中，所有文獻均以引用方式全部併入本文中。
本發明之反義化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物混合、囊封、結合或以其他方式締合成例如脂質體、受體靶向分子、口服、直腸、表面或其他調配物，以幫助攝取、分佈及/或吸收。舉例而言，陽離子脂質可包括在調配物內以促進寡核苷酸攝取。顯示可促進攝取的一種此類組合物為LIPOFECTIN(獲自GIBCO-BRL,Bethesda,MD)。
咸信具有至少一個2'-O-甲氧基乙基修飾之寡核苷酸尤其適用於口服。用於表面投藥之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑。習知醫藥載劑，水性、粉末狀或油狀基質，增稠劑及其類似物可為必需的或所需的。經塗佈之保險套、手套及其類似物亦可適用。
宜以單位劑型存在的本發明之醫藥調配物可根據醫藥行業中熟知之習知技術製備。此等技術包括使活性成分與醫藥載劑或賦形劑締合的步驟。一般而言，該等調配物係藉由下述步驟製備：使活性成分與液體載劑或經細微粉碎之固體載劑或兩者均勻且緊密地締合，隨後視需要使該產物定形。
本發明之組合物可調配成許多可能劑型中之任一者，諸如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。本發明之組合物亦可調配成於水性介質、非水性介質或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液黏度之物質，其包括(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。該懸浮液亦可含有穩定劑。
本發明之醫藥組合物包括(但不限於)溶液、乳液、泡沫劑及含有脂質體之調配物。本發明之醫藥組合物及調配物可包含一或多種滲透增強劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成份。
乳液通常為一種液體以直徑一般超過0.1 μm之小滴形式分散於另一液體中的非均質系統。乳液可含有除分散相之外的其他組分及可以於水相、油相中之溶液形式存在或自身作為各別相存在之活性藥物。包括微乳液作為本發明之一實施例。乳液及其用途在此項技術中已為吾人所熟知且進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
本發明之調配物包括脂質體調配物。如本發明中所用，術語「脂質體」意謂由以球形雙層形式排列的兩親媒性脂質構成的微脂粒。脂質體為單層或多層微脂粒，其具有由親脂性物質形成之膜及含有待傳遞組合物的水性內部。陽離子脂質體為帶正電的脂質體，咸信其與帶負電的DNA分子相互作用形成穩定複合物。咸信pH值敏感性或帶負電之脂質體圍裹DNA而與其複合。陽離子及非陽離子脂質體均已用於傳遞DNA至細胞。
脂質體亦包括「空間穩定」脂質體，該術語如本文中所用係指包含一或多種特殊脂質之脂質體。當併入脂質體中時，此等特殊脂質產生循環壽命相對於缺乏該等特殊脂質之脂質體延長之脂質體。空間穩定脂質體之實例為脂質體之微脂粒形成脂質部分有一部分包含一或多種糖脂或用一或多種親水性聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)部分)衍生之脂質體。脂質體及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
本發明之醫藥調配物及組合物亦可包括界面活性劑。界面活性劑在藥物產物、調配物及乳液中的用途在在此項技術中為熟知的。界面活性劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用方式併入本文中。
在一實施例中，本發明使用各種滲透增強劑來實現核酸(尤其寡核苷酸)之有效傳遞。除輔助非親脂性藥物擴散越過細胞膜之外，滲透增強劑亦提高親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可分為5大類：亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑。滲透增強劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。
熟習此項技術者將認識到調配物按常規根據其預期用途，亦即投藥途徑設計。
用於表面投與之調配物包括本發明之寡核苷酸與表面傳遞劑(諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑)混合的調配物。較佳脂質及脂質體包括中性(例如二油醯基-磷脂醯基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)、陰離子型(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG)及陽離子型(例如二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基-磷脂醯基乙醇胺DOTMA)。
為了表面或其他投藥，本發明之寡核苷酸可囊封於脂質體內或可與該等脂質體，尤其與陽離子脂質體形成複合物。或者，寡核苷酸可與脂質，尤其與陽離子脂質複合。較佳脂肪酸及酯、其醫藥學上可接受之鹽、及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
口服組合物及調配物包括散劑或顆粒、微粒、奈米顆粒、於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微小錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳口服調配物為本發明之寡核苷酸連同一或多種滲透增強劑界面活性劑及螯合劑一起投與之調配物。較佳界面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。較佳膽酸/鹽及脂肪酸及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用方式併入本文中。滲透增強劑之組合亦較佳，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽之組合。尤其較佳組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本發明之寡核苷酸可以包括噴霧乾燥粒子或複合形成之微米或奈米粒子之顆粒形式經口傳遞。寡核苷酸複合劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。
用於非經腸、鞘內或腦室內投藥之組合物及調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適當之添加劑，諸如(但不限於)滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之某些實施例提供含有一或多種寡聚化合物及一或多種其他藉由非反義機制起作用之化學治療劑的醫藥組合物。該等化學治療劑之實例包括(但不限於)癌症化學治療藥物，諸如道諾黴素(daunorubicin)、柔紅黴素(daunomycin)、放線菌素(dactinomycin)、阿黴素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博來黴素(bleomycin)、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺、胞嘧啶阿拉伯糖、雙氯乙基-亞硝基脲、白消安(busulfan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、放線菌素D、光神黴素(mithramycin)、潑尼松(prednisone)、羥基孕酮、睾固酮、它莫西芬(tamoxifen)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲三聚氰胺、戊甲三聚氰胺、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、苯丁酸氮芥、甲基環己基亞硝基脲、氮芥類、美法侖(melphalan)、環磷醯胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮胞苷、羥基脲、脫氧助間型黴素(deoxycoformycin)、4-羥基過氧環-磷醯胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-FUdR)、甲胺喋呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、長春新鹼、長春鹼、依託泊苷(etoposide)(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、替尼泊苷(teniposide)、順鉑及己烯雌酚(DES)。當與本發明化合物一起使用時，該等化學治療劑可個別使用(例如5-FU及寡核苷酸)、連續使用(例如5-FU及寡核苷酸使用一段時間以後使用MTX及寡核苷酸)或與一或多種其他該等化學治療劑組合使用(例如5-FU、MTX及寡核苷酸，或5-FU、放射線療法及寡核苷酸)。包括但不限於非類固醇消炎藥物及皮質類固醇之消炎藥物，以及包括但不限於病毒唑、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韋(acyclovir)及苷昔洛韋(ganciclovir)之抗病毒藥物亦可組合於本發明組合物中。反義化合物與其他非反義藥物之組合亦在本發明範疇內。兩種或兩種以上組合化合物可一起或連續使用。反義化合物與一或多種基於細胞之治療劑的組合亦在本發明範疇內。舉例而言，本發明包含本發明之寡核苷酸與幹細胞(例如間葉幹細胞)之組合，用於治療與DLK表現相關之疾病或病狀及與細胞修補、復原、恢復或更換相關或需要細胞修補、復原、恢復或更換之疾病或病狀(例如充血性心臟衰竭)或幹細胞可活化新細胞生長以修補患病或受損組織的其他疾病或病狀。本發明包含一種恢復單層完整性之方法，其包含向需要治療之患者投與本文中所主張或描述之寡核苷酸且其中該患者視情況用其他化合物或細胞治療。
在另一有關實施例中，本發明之組合物可含有一或多種靶向第一核酸之反義化合物(尤其寡核苷酸)及一或多種靶向第二核酸目標之其他反義化合物。舉例而言，第一目標可為胚盤大同源物1(DLG1)之特定反義序列，且第二目標可為來自另一核苷酸序列之區域。或者，本發明之組合物可含有兩種或兩種以上靶向相同胚盤大同源物1(DLG1)核酸目標之不同區域的反義化合物。反義化合物之許多實例在本文中說明且其他可選自此項技術中已知之合適化合物。兩種或兩種以上組合化合物可一起或連續使用。
給藥：
咸信治療組合物之調配及其隨後投藥(給藥)在熟習此項技術者之技能範圍內。給藥視待治療疾病狀況之嚴重性及反應性而定，治療過程持續數天至數月，或直至治癒或實現疾病狀況之消減為止。最佳給藥時程可由量測患者體內之藥物積聚來計算。一般技術者可容易確定最佳劑量、給藥方法及重複率。最佳劑量可視個別寡核苷酸之相對效能而變化且一般可基於被發現在活體外及活體內動物模型中有效的EC50來估計。一般而言，劑量為每公斤體重0.01 μg至100 mg，且可每日、每週、每月或每年給予一次或一次以上，或甚至每2至20年給予一次。一般技術者可容易地基於量測的滯留時間及藥物於體液或組織中之濃度估計給藥之重複率。成功治療之後，患者可能需要接受維持療法以預防疾病狀況再發生，其中寡核苷酸以在每公斤體重0.01 μg至100 mg範圍內的維持劑量投與，每日一次或一次以上至每20年一次。
在實施例中，用以下劑量之藥物治療患者：至少約1、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100 mg/kg體重。反義寡核苷酸之某些注射劑量描述於例如美國專利第7,563,884號，「Antisense modulation of PTP1B expression,」中，其以引用方式全部併入本文中。
雖然上文已描述本發明之各種實施例，但應理解，該等實施例僅藉由舉例方式來呈現且無限制性。可根據本文之揭示內容在不偏離本發明之精神或範疇之情況下對所揭示之實施例作出諸多變化。因此，本發明之寬度及範疇不受上述任一實施例限制。
本文提及之所有文獻均以引用方式併入本文中。本申請案中引用的所有公開案及專利文獻出於所有目的以引用方式併入，該引用程度就如同已個別地指示各個公開案或專利文獻一般。此文獻中引用各種參考文獻，本發明申請者並不承認任何特定參考文獻為本發明之「先前技術」。本發明組合物及之實施例在以下實例中說明。
實例
以下非限制性實例用於說明本發明之選擇實施例。應瞭解，在所示組分要素中的比例及替代物的變化將為熟習此項技術者顯而易知且在本發明之實施例之範疇內。
實例1：對胚盤大同源物1(DLG1)及/或DLG1聚核苷酸之有義股的反義核酸分子具有特異性之反義寡核苷酸的設計
如上所述，術語「對...具有特異性之寡核苷酸」或「靶向...之寡核苷酸」係指具有(i)能夠與靶向基因之一部分形成穩定複合物，或(ii)能夠與靶向基因之mRNA轉錄本之一部分形成穩定雙螺旋的序列的寡核苷酸。
藉由使用在每一既定序列中自動鑑別19-25個核苷酸之子序列的電腦程式(例如IDT AntiSense Design,IDT OligoAnalyzer)來簡化適當寡核苷酸之選擇，該等子序列將與具有所要熔化溫度(一般50-60℃)的目標聚核苷酸序列形成雜交物且不會形成自二聚物或其他複雜二級結構。
適當寡核苷酸之選擇藉由使用自動比對核酸序列且指出一致性或同源性之區域的電腦程式進一步簡化。該等程式用於比較例如藉由搜尋資料庫(諸如GenBank)或藉由定序PCR產物獲得的核酸序列。比較來自既定基因組之一定範圍之基因及基因間區域的核酸序列可選擇對相關基因呈現適當特異性程度之核酸序列。此等程序允許在既定基因組中選擇目標核酸序列呈現較高程度互補性但對其他核酸序列呈現較低程度互補性的寡核苷酸。熟習此項技術者將認識到，在選擇用於本發明之基因之適當區域時存在相當的寬容度。
當反義化合物與目標核酸之結合干擾目標核酸之正常功能以引起對功能及/或活性之調節，且存在足夠互補程度以避免反義化合物與非目標核酸序列在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內檢定或治療性處理之情況下在生理條件下，及在活體外檢定之情況下在執行檢定之條件下的非特異性結合時，該反義化合物「可特異性雜交」。
本文所述之寡核苷酸之雜交性質可藉由此項技術中已知之一或多種活體外檢定來測定。舉例而言，本文所述之寡核苷酸之性質可藉由使用熔融曲線檢定測定目標天然反義物與潛在藥物分子之間的結合強度而獲得。
目標天然反義物與潛在藥物分子(Molecule)之間的結合強度可使用量測分子間相互作用之強度的任一常規方法(例如熔融曲線檢定)估計。
熔融曲線檢定測定天然反義物/分子複合物自雙股快速轉變為單股構形時的溫度。此溫度被普遍視為兩種分子之間的相互作用強度之可靠量度。
熔融曲線檢定可使用實際天然反義RNA分子之cDNA複本或對應於分子之結合位點的合成DNA或RNA核苷酸來執行。含有執行此檢定必需之所有試劑的多重套組可購得(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor kit)。此等套組包括含有雙股DNA(dsDNA)結合染料(諸如ABI HRM染色，SYBR綠，SYTO等)之一者的合適緩衝溶液。dsDNA染料之性質致使其呈游離態時幾乎不發射螢光，但當結合至dsDNA時發射強螢光。
為了執行檢定，cDNA或相應寡核苷酸以由特定製造者方案所限定之濃度與分子混合。將混合物加熱至95℃以解離所有預先形成之dsDNA複合物，隨後緩慢冷卻至室溫或由套組製造者限定之其他較低溫度以使DNA分子退火。新形成之複合物隨後緩慢加熱至95℃，同時持續收集由反應產生的螢光之量的數據。螢光強度與存在於反應中的dsDNA之量成反比。數據可使用與套組相容之即時PCR器具收集(例如ABI's StepOne Plus Real Time PCR System或lightTyper instrument,Roche Diagnostics,Lewes,UK)。
藉由使用適當軟體(例如lightTyper(Roche)或SDS Dissociation Curve,ABI)描繪螢光關於溫度之負導數(-d(螢光)/dT，Y軸)相對於溫度(X軸)之曲線來建構熔融峰。分析數據以鑑別自dsDNA複合物快速轉變為單股分子之溫度。此溫度稱為Tm且與兩種分子之間的相互作用之強度成正比。Tm通常將超過40℃。
實例2：對DLG1聚核苷酸之調節 用反義寡核苷酸處理Hek293T細胞
來自ATCC之Hek293T細胞(目錄號CRL-1573)在37℃及5% CO2下於生長培養基(MEM/EBSS(Hyclone目錄號SH30024，或Mediatech目錄號MT-10-010-CV)+10% FBS(Mediatech目錄號MT35-011-CV)+青黴素/鏈黴素(Mediatech目錄號MT30-002-CI))中生長。在實驗前一天，將細胞以1.5×105/ml之密度再塗於6孔板上且在37℃及5%CO2下培育。在實驗當天，將6孔板中的培養基更換為新鮮的生長培養基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μM之濃度。將2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)在室溫下一起培育20分鐘且施加至含有Hek293T細胞之6孔板之各孔中。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照組。在37℃及5% CO2下培育3-18小時之後，將培養基更換為新鮮的生長培養基。添加反義寡核苷酸之後48 h，移除培養基且使用來自Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)或來自Qiagen之RNeasy總RNA分離套組(目錄號74181)，根據製造者說明書自細胞提取RNA。將600 ng RNA添加至反轉錄反應中，該反應使用來自Thermo Scientific之Verso cDNA套組(目錄號AB1453B)或高容量cDNA反轉錄套組(目錄號4368813)，如製造者方案所述執行。使用來自此反轉錄反應之cDNA，藉由即時PCR，使用ABI Taqman基因表現混合物(目錄號4369510)及由ABI設計的引子/探針(Applied Biosystems Taqman基因表現檢定：Hs00938204_m1，Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)監測基因表現。使用以下PCR循環：50℃持續2分鐘，95℃持續10分鐘，使用Mx4000熱循環計(Stratagene)或StepOne Plus即時PCR機器(Applied Biosystems)進行40個循環(95℃持續15秒，60℃持續1分鐘)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間的18S校正dCt值的差異計算用反義寡核苷酸處理後的基因表現之變化倍數。
結果：即時PCR結果顯示Hek293T細胞中之DLG1 mRNA含量在用針對DLG1反義mRNA Hs.636103設計的寡聚物處理之後48小時顯著增加(圖1)。
實例3：在用靶向DLG1-特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸處理後HEK293T細胞中的單層完整性之加速恢復
在實例3中，腎上皮細胞株HEK293T用靶向DLG1特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸處理，該反義寡核苷酸在實例2中顯示在20 nM之最終濃度下上調DLG1 mRNA。以下數據顯示DLG1 mRNA經由調節DLG1特異性天然反義轉錄本之功能的上調與如閉合檢定所測定的單層完整性之加速恢復相關聯。
材料及方法
用靶向DLG1特異性天然反義轉錄本的反義寡核苷酸處理之HEK293T細胞中的閉合檢定。來自ATCC之HEK293T細胞(目錄號CRL-1573)在37℃及5% CO2下在生長培養基[MEM/EBSS(Hyclone目錄號SH30024)+10% FBS(Mediatech目錄號MT35-011-CV)+青黴素/鏈黴素(Mediatech目錄號MT30-002-CI)]中生長。在實驗前一天，將細胞以5×105/孔之密度再塗於6孔板上且在37℃及5% CO2下培育隔夜。在實驗當天，將6孔板中的培養基更換為新鮮的生長培養基(1.5 ml/孔)。所有反義寡核苷酸由IDT Inc.(Coralville,IA)製造。所有寡核苷酸之序列列於表1中。寡核苷酸在不含DNAse/RNAse之無菌水中稀釋至20 μM之濃度。為了向一個孔給藥，將2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)在室溫下一起培育20分鐘且逐滴施加於含HEK293T細胞之6孔板之一孔中。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照組。在37℃及5% CO2下培育18 h之後，將培養基更換為新鮮的生長培養基。添加反義寡核苷酸之後48小時，使用無菌200 μl尖頭或棉拭子刮擦單細胞層。接下來的3-5天中使刮痕閉合且由三個獨立觀察者在至少3個不同場合下盲法記分。每一觀察者之分數以佔未經處理對照組之%表示，隨後對用各寡核苷酸處理的複製物的結果取平均值且使用ANOVA及事後檢驗與對照孔相比較。
結果：閉合檢定結果顯示用靶向DLG1特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸(其在實例2中顯示上調DLG1 mRNA)處理加速單層完整性之恢復，其可有利於治療上皮創傷及病狀。
公開科學文獻之證據表明DLG1為上皮細胞中對於細胞極性及接合點形成重要的蛋白組分。接合點功能對使細胞保持在一起成為組織而言係重要的。基本上，DLG1促進上皮之完整性。上皮(亦即共同形成組織之一群上皮細胞)之結構完整性為上皮之主要性質；弄碎或破壞其將損害許多其他上皮功能。破壞緊密上皮所損害的任何事可被視為不利的(一生物代謝區中之水或其他組分損失，一個代謝區中之組分進入/移動至另一代謝區)。緊密上皮細胞形成極具內聚力的上皮，其提供兩種不同環境之間的重要障壁。舉例而言，上皮在皮膚中之完整性保護患者或生物體對抗污垢及可能的病毒或細菌感染。
以下參考文獻係關於上皮，其中任一者可使用本發明之寡核苷酸處理：
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表現DLG同功異型物之任何組織或器官均為所主張寡核苷酸之目標。
因此，本發明包含一種治療眾多與組織之完整性及適當功能(包括(但不限於)上皮細胞(及/或上皮組織)分佈、極性及功能)相關的疾病及/或病狀的方法。此包括皮膚、黏膜、腸、呼吸道上皮之病狀及/或與癌細胞遷移相關之病狀；經由皮膚或任何類型上皮的病毒或細菌感染；與血視網膜障壁之完整性、血腦障壁之完整性、單層完整性及血大腦脊髓液障壁之完整性相關之病狀。DLG1之上調亦與構成組織之細胞(例如上皮及/或上皮細胞)的適當極化相關。儘管本發明已關於一或多種實施例來說明及描述，但熟習此項技術者在閱讀及瞭解本說明書及隨附圖式之後將想到相等改變及修改。另外，雖然可關於若干實施例中之僅一者揭示本發明之特定特徵，但此特徵可與對於任何既定或特定應用而言可為所要且有利的其他實施例之一或多個其他特徵組合。
本發明之摘要將使讀者快速弄清本發明之性質。應瞭解，本發明之摘要不用於解釋或限制以下申請專利範圍之範疇或意義。
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圖1展示在用靶向DLG1-特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸處理之後，HEK293T細胞中之DLG1 mRNA含量增加(由即時PCR測定)。CUR-1695至CUR-1704為靶向DLG1天然反義物之反義寡核苷酸。*-P<0.05；**-P<0.01；***-P<0.001。以CUR-1695至CUR-1704表示之條柱分別對應於用SEQ ID NOS: 3至12處理之樣品；及
圖2展示在用靶向DLG1-特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸處理的HEK293T細胞中的單層完整性之加速復原，如閉合檢定所測定。CUR-1696至CUR-1704為靶向DLG1天然反義物之反義寡核苷酸。*-P<0.05；**-P<0.01；***-P<0.001。以CUR-1696、CUR-1699、CUR-1700、CUR-1703及CUR-1704表示之條柱分別對應於用SEQ ID NOS: 4、7、8、11及12處理之樣品。
序列表描述-SEQ ID NO: 1：智人胚盤大同源物1(果蠅)(DLG1)、轉錄本變異體2、mRNA(NCBI寄存編號：NM_004087)；SEQ ID NO: 2：天然DLG1反義序列(Hs.636103)；SEQ ID NO: 3至12：反義寡核苷酸。*表示硫代磷酸酯鍵。

Claims (43)

  1. 一種10至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸的用途，其係用於製造供上調具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在生物系統中之功能及/或表現的藥劑，其中該寡核苷酸特異性雜交至具有SEQ ID NO：2之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本中之互補序列。
  2. 如請求項1之用途，其中該寡核苷酸與該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本具100%互補性。
  3. 一種10至30個核苷酸長度之靶向並特異性結合具有SEQ ID NO：2之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本之某一區域的反義寡核苷酸之用途，其係用於製造供上調具有SEQ ID NO：1之該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在生物系統中之功能及/或表現之藥劑。
  4. 如請求項3之用途，其中該胚盤大同源物(DLG)在活體內或活體外之功能及/或表現比對照組增加。
  5. 如請求項3之用途，其中該反義寡核苷酸靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之天然反義轉錄本。
  6. 如請求項3之用途，其中該反義寡核苷酸靶向包含胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列的核酸序列。
  7. 如請求項3之用途，其中該反義寡核苷酸靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之重疊及/或非重疊序列。
  8. 如請求項3之用途，其中該反義寡核苷酸包含一或多個選自以下之修飾：至少一個經修飾之糖部分、至少一個經修飾之核苷間鍵、至少一個經修飾之核苷酸及其組合。
  9. 如請求項8之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  10. 如請求項8之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷間鍵：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  11. 如請求項8之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)及其組合。
  12. 如請求項1之用途，其中該寡核苷酸係選自SEQ ID NOS：4、6-8、11及12所闡述之寡核苷酸序列。
  13. 一種19至30個核苷酸長度的短干擾RNA(siRNA)寡核苷酸之用途，其係用於製造供活體內或活體外上調胚盤大同源物1(DLG1)基因在哺乳動物細胞或組織中之功能及/或表現之藥劑，其中該siRNA寡核苷酸特異性雜交至具有SEQ ID NO：2之天然反義聚核苷酸之互補的非重疊區域。
  14. 一種包含至少一個修飾之10至30個核苷酸長度之合成經修飾寡核苷酸，其中該至少一個修飾係選自：至少一個經修飾之糖部分；至少一個經修飾之核苷酸間鍵；至少一個經修飾之核苷酸及其組合；其中該寡核苷酸為反義化合物，其特異性雜交至具有SEQ ID NO：2之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本中的互補區域，且與正常對照相比，可在活體內或活體外上調其功能及/或表現，其中該寡核苷酸係選自SEQ ID NOS：4、6-8、11及12所闡述之序列。
  15. 如請求項14之寡核苷酸，其中該至少一個修飾包含選自由以下組成之群的核苷酸間鍵：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  16. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  17. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵主鏈。
  18. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸，該經修飾之核苷酸係選自：肽核酸、鎖核酸(LNA)及其組合。
  19. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  20. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸、鎖核酸(LNA)及其組合。
  21. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  22. 如請求項14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  23. 一種醫藥組合物，其包含一或多種對如請求項14之一或多種胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸具有特異性的寡核苷酸及醫藥學上可接受之賦形劑。
  24. 如請求項23之組合物，其中該等寡核苷酸包含一或多個修飾或取代。
  25. 如請求項24之組合物，其中該一或多個修飾係選自：硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
  26. 一種10至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸之用途，其係用於製造供預防或治療與至少一個具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸相關之疾病的藥劑，其中該反義寡核苷酸結合至該至少一個具有SEQ ID NO：2之胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之天然反義轉錄本上，且上調該至少一個胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之表現。
  27. 如請求項26之用途，其中與該至少一個胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸相關之疾病係癌症。
  28. 一種10至30個核苷酸長度之寡核苷酸的用途，其係用於製造治療與細胞分佈、完整性或極性相關之疾病或病狀之藥劑，其中該寡核苷酸靶向具有SEQ ID NO：2之DLG1基因的天然反義轉錄本且與其具有100%互補性。
  29. 如請求項28之用途，其中該疾病或病狀係選自與組織相關之疾病、病狀或傷口。
  30. 一種活體外方法，其係鑑別及選擇至少一個對具有SEQ ID NO：2之DLG1基因的天然反義轉錄本具有選擇性的寡核苷酸以作為供用於活體內投藥之選定目標聚核苷酸，其包括：鑑別至少一個10至30個核苷酸長度之寡核苷酸，其至少部分與該選定目標聚核苷酸之反義聚核苷酸互補；量測反義寡核苷酸與該目標聚核苷酸或該選定目標聚核苷酸之反義聚核苷酸在嚴格雜交條件下之雜交物之熱熔點；及基於所得資訊選擇至少一個供用於活體內投藥之寡核苷酸。
  31. 一種活體外上調具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在生物系統中之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至少一個10至30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，其中該至少一個寡核苷酸與具有SEQ ID NO：2之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本具有100%互補性；藉此上調該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之功能及/或表現。
  32. 如請求項31之方法，其中該至少一個寡核苷酸係選自SEQ ID NOS：4、6-8、11及12所闡述之至少一個寡核苷酸序列。
  33. 一種活體外上調具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在患者細胞或組織中之功能及/或表現的方法，其包含：使該等細胞或組織與至少一個10至30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與具有SEQ ID NO：2之該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸的反義寡核苷酸具有100%互補性；藉此活體外上調該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在患者細胞或組織中之功能及/或表現。
  34. 一種活體外上調具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸在生物系統中之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至少一個靶向具有SEQ ID NO：2之該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之天然反義轉錄本區域的10至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸；藉此上調該胚盤大同源物(DLG)聚核苷酸之功能及/或表現。
  35. 如請求項34之方法，其中該胚盤大同源物(DLG)在活體外之功能及/或表現比對照組增加。
  36. 如請求項34之方法，其中該至少一個反義寡核苷酸靶向包含胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列的核酸序列。
  37. 如請求項34之方法，其中該至少一個反義寡核苷酸靶向胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之重疊及/或非重疊序列。
  38. 如請求項34之方法，其中該至少一個反義寡核苷酸包含一或多個選自以下之修飾：至少一個經修飾之糖部分、至少一個經修飾之核苷間鍵、至少一個經修飾之核苷酸及其組合。
  39. 如請求項38之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  40. 如請求項38之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷間鍵：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  41. 如請求項38之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)及其組合。
  42. 一種活體外上調具有SEQ ID NO：1之胚盤大同源物1(DLG1)基因在哺乳動物細胞或組織中之功能及/或表現的方法，其包括：使該等細胞或組織與至少一個19至30個核苷酸長度的短干擾RNA(siRNA)寡核苷酸接觸，該至少一個siRNA寡核苷酸特異性雜交至具有SEQ ID NO：2之天然反義聚核苷酸的互補非重疊區域；及活體外上調胚盤大同源物1(DLG1)在哺乳動物細胞或組織中之功能及/或表現。
  43. 如請求項42之方法，其中該寡核苷酸與該胚盤大同源物1(DLG1)聚核苷酸之具有SEQ ID NO：2的天然反義聚核苷酸具有100%互補性。
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