TWI571469B

TWI571469B - 具有鋅結合位的磷脂醯肌醇３－激酶抑制劑

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Publication number: TWI571469B
Application number: TW101111283A
Authority: TW
Inventors: 蔡雄; 翟海嘯; 賴正榮; 錢長庚; 包如迪
Original assignee: 古利斯股份有限公司
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2017-02-21
Also published as: DK2694075T3; AU2012236367B2; MX2013011132A; PT2694075T; CA2830822C; US10111864B2; HK1194969A1; EA201301114A1; KR20140023333A; ES2577982T3; JP6275784B2; US20220168284A1; DK3111938T3; HRP20160545T1; IL228588A; US20140243330A1; ZA201406167B; BR112013025340B1; ME03523B; ME02451B

Description

具有鋅結合位的磷脂醯肌醇3-激酶抑制劑

本發明係關於一種磷脂醯肌醇3-激酶抑制劑及磷脂醯肌醇3-激酶相關疾病之治療以及組蛋白去乙醯基酶相關病症之治療。

磷脂醯肌醇(phosphoinositides,PIs)，為磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol)的磷酸化衍生物，為真核細胞所必要，調節細胞核反應過程、細胞骨架動態、訊息傳遞及膜傳遞。在涉及PI代謝的酵素中，PI3-激酶(PI3K)由於其致癌特性以及可能當作藥物標靶而受到特別的重視。PI3-激酶會將磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol)或PI的肌醇環第3位予以磷酸化(Lindmo et.al.Journal of Cell Science 119,605-614,2006)。由於PI3K活性所產生的3-磷酸化磷脂質會結合於蛋白質激酶B(PKB)的pleckstrin同源(PH)結構域，造成PKB轉移到細胞膜，以及接續的PKB磷酸化。磷酸化PKB會抑制細胞凋零誘導蛋白質，例如FKHR、Bad及caspase，且據認為在癌症進展扮演重要角色。PI3K區分為I-III類，I類又進一步次區分為Ia及Ib類。在此等同功異構型(isoform)中，Ia類酵素據認為在回應生長因子酪胺酸激酶路徑活化的細胞增殖方面扮演最重要的角色(Hayakawa et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 6847-6858,2006)。在癌症有3個常見的突變固有地活化PI3K α，且當在細胞中表現時，此等突變會驅使致癌轉形，並且藉由例如PKB、S6K及 4E bp1這些在癌細胞中常見的分子長期性地活化下游訊息化(signaling)(Stephens et al.,Current Opinion in Pharmacology,5(4)357-365,2005)。如此，PI3-激酶對於治療增殖性疾病方面是受人重視的標靶。

已有數種已知的PI3-激酶抑制劑，包括Wortmannin及LY294002。雖然Wortmannin是一種有低奈米莫耳IC₅₀值的有效PI3K抑制劑，但是其體內(in vivo)的抗腫瘤活性低。(Hayakawa et al.,Bioorg.Med.Chem.14(20),6847-6858(2006))。最近，已有人報告有一群經嗎啉取代的喹唑啉、吡啶并嘧啶以及噻吩并嘧啶化合物，對於抑制PI3激酶p110 α有效(Hayakawa,6847-6858)。口服劑量的經嗎啉取代的噻吩并嘧啶化合物(GDC-0941)顯示在體內對於神經膠母細胞瘤(glioblastoma)異體移植物(xenograft)有腫瘤抑制作用。(Folkes et al.,Journal of Medicinal Chemistry,51,5522-5532,2008)。以下的公開案揭示一系列的噻吩并嘧啶、吡啶并嘧啶以及喹唑啉系的PI3-激酶抑制劑：WO 2008/073785；WO 2008/070740；WO 2007/127183；美國專利公開號20080242665。

組蛋白乙醯基化係一可逆的修飾，去乙醯基化係由一組稱為組蛋白去乙醯基酶(HDACs)的家族的酵素所催化。HDAC在人類由18個基因代表，且區分成4個大的類別(J Mol Biol,2004,338：1,17-31)。於哺乳動物，I類HDAC(HDAC1-3及HDAC8)係與酵母RPD3 HDAC相關，2類(HDAC4-7、HDAC9及HDAC10)係與酵母HDA1相關，4類(HDAC11)及3類(包括相關於酵母Sir2之sirtuin的一清楚的類別)。

Csordas,Biochem.J.,1990,286：23-38教示組蛋白會在N末端離胺酸殘基的ε-胺基受到轉譯後乙醯基化，此係由組蛋白乙醯基轉移酶(HAT1)催化的反應。乙醯基化會中和離胺酸側鏈的正電荷，且據認為會影響染色質結構。的確，轉錄因子接近染色質模板的作用會由於組蛋白過度乙醯基化而增進，且已發現在基因體的轉錄靜默區會有低度乙醯基化組蛋白H4的富化的現象(Taunton et al.,Science,1996,272：408-411)。於腫瘤抑制基因的案例，由於組蛋白修飾造成的轉錄靜默可能會造成致癌轉形以及癌症。

目前已有數種類型的HDAC抑制劑由臨床調查人員評估當中。實例包括羥胺酸衍生物、辛二醯基苯胺化物羥胺酸(SAHA)、PXD101以及LAQ824，正在臨床開發中。於苯甲醯胺類型的HDAC抑制劑，已有MS-275、MGCD0103及CI-994到達臨床試驗的階段。Mourne等人(Abstract #4725,AACR 2005)，證實苯甲醯胺的噻吩基修飾會顯著增強HDAC抑制劑對於HDAC1的活性。

已有某些癌症利用如此的組合方法有效受到治療；然而，使用細胞毒性藥物的雞尾酒治療策略常受限於劑量限制毒性以及藥物藥物間的交互作用。最近利用分子標靶藥物的進展已針對癌症的組合治療提供一種新的方式，能夠同時使用多種標靶劑，或者組合此等新療法以及標準的化療或放療，以在不到達劑量限制毒性的狀態改善結果。但是，使用此種組合方式的能力目前受限於顯示可相容之藥理及藥效性質的藥物。此外，比起相應的單一試劑的試驗，對於證明組合療法之安全性及效力的法規要求可能會更耗成本且更耗時。一旦許可，組合的策略對於病患而言也可能帶來成本增加，以及由於需要更精密複雜的投藥典範造成病患的順服性降低。

本發明係關於式I化合物：

以及其藥學上容許之鹽，其中R為氫或醯基。該醯基較佳為R₁C(O)-，其中R₁為經取代或非經取代的C₁-C₂₄烷基，較佳為C₁-C₁₀烷基，更佳為C₁-C₆烷基；經取代或非經取代的C₂-C₂₄烯基，較佳為C₂-C₁₀烯基，更佳為C₂-C₆烯基；經取代或非經取代的C₂-C₂₄炔基，較佳為C₂-C₁₀炔基，更佳為C₂-C₆炔基；經取代或非經取代的芳基，較佳為經取代或非經取代的苯基；或經取代或非經取代的雜芳基。

本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其藥學上容許之鹽，以及在醫藥上可接受之賦形劑或載劑。

式I化合物，具體稱為化合物1，當作治療試劑具有優勢的性質，例如可供治療癌症以及其他關於PI3激酶活性及/或HDAC活性的疾病及病症。化合物1，例如對於分子標靶PI3K及HDAC具有有效的抑制活性，且對於許多癌細胞株在體內有抗增殖的有效活性。化合物1在動物模型觀察到有顯著的口服生體可獲得性(bioavailability)。於利用口服或靜脈內對於受有異體移植的腫瘤的小鼠投藥時，該化合物顯示由腫瘤組織顯著攝入，及在腫瘤組織有顯著的藥效(pharmacodynamic)活性。化合物1在口服或靜脈內投藥之後的小鼠異體移植模型，也顯示實質上的抗腫瘤活性。該化合物，例如在使用Ames測試的基因毒性(genotoxicity)，顯示具有有利的安全性曲線。

本發明也關於使用本發明之化合物在治療PI3K相關疾病及病症例如癌症的用途。此等化合物藉由結合於鋅離子的能力，也當作HDAC抑制劑。該等化合物在多種治療標靶有活性，且治療多種疾病有效。再者，於一些案例中，據發現相較於各具有PI3-激酶抑制活性及HDAC抑制活性的分子之組合活性，此等化合物的活性較高。換言之，單一分子中具有PI3-激酶以及HDAC抑制活性之組合，相較於個別的PI3-激酶及HDAC抑制劑，可提供協乘功效。

再者，單一試劑PI3K路徑抑制劑的功效，受限於存在先天/後天的基因改變，以及活化多重促存活以及生長路徑(Engelman(2009)Nature Reviews Cancer,9：550-562)。由單一試劑PI3K路徑抑制劑所為之PI3K抑制，能藉由解開負回饋的迴圈，而實際上上調RAF-MEK-ERK路徑的訊息化。本發明之化合物，由於其整合的PI3K/HDAC抑制性活性，提供克服以單一試劑PI3K抑制劑治療癌症的限制的潛力。本發明之化合物，由於較長時間的抑制PI3K-AKT-mTOR路徑、抑制RAF-MEK-ERK路徑，以及下調受體酪胺酸激酶(RTK)蛋白質水平，在體內及體外實驗干擾癌症網絡。此外，本發明之化合物，在體外於腫瘤細胞株，藉由上調腫瘤抑制因子p53及p21，而誘導細胞週期制止(arrest)及細胞凋零。所以，本發明之化合物有克服先天及後天的抗藥性的潛力，且可能比臨床應用中單獨以單一試劑PI3K路徑抑制劑進行治療更為有效。

本發明提供之另一態樣，提供抑制PI3激酶活性之方法，係藉由使PI3激酶接觸有效的抑制性量的式I化合物，或其藥學上容許之鹽。

於一較佳具體例，式I化合物如下所示：

(以下“化合物1”也指N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺或其藥學上容許之鹽。

本發明並提供預防或治療涉及細胞異常增殖、分化或存活的疾病或病症的方法。於一具體例，本發明並提供使用本發明之一或更多種化合物於製造一藥劑以供阻止或減少涉及細胞異常增殖、分化或存活的疾病。於一較佳具體例，該疾病為癌症。於一具體例，本發明關於治療所需個體癌症的方法，包含對於該個體投予治療上有效量的本發明化合物。

用語"癌症"，係指由於惡性新生細胞的增殖造成的癌症，例如腫瘤、腫瘍、癌(carcinoma)、肉瘤、白血病、淋巴瘤等。例如，癌症包括但不限於：中皮瘤(mesothelioma)、白血病及淋巴瘤，例如皮膚性T細胞淋巴瘤(CTCL)、非皮膚性周邊T細胞淋巴瘤、相關於人類嗜T細胞淋巴球性病毒(HTLV)之淋巴瘤，例如成體T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B細胞淋巴瘤、急性非淋巴性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、及多發性骨髓瘤、非Hodgkin淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、Hodgkin 氏淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、成體T細胞白血病淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)，或肝細胞瘤。進一步的例子，包括：骨髓造血不良症候群、幼年時期固體腫瘤，例如腦瘤、神經母細胞瘤(neuroblastoma)、視網膜母細胞瘤、Wilms氏腫瘤、骨腫瘤，及軟組織肉瘤，成人常見的固體腫瘤，例如頭頸癌(例如口腔癌、喉癌、鼻咽癌、及食道癌)、泌尿生殖系統癌(例如前列腺癌、膀胱癌、腎癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌)、肺癌(例如小細胞及非小細胞癌)、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤及其他皮膚癌、胃癌、腦腫瘤、關連於Gorlin氏症候群之腫瘤(例如神經管胚細胞瘤，硬腦膜瘤等)，及肝癌。可藉由對象化合物治療的額外的癌症的例示形式，包括但不限於：骨骼肌或平滑肌的癌症、胃癌、小腸癌、直腸癌、唾腺癌、內膜癌、腎上腺癌、肛門癌、直腸癌、副甲狀腺癌、及腦下垂體癌。

在此所述的化合物有用於預防、治療及研究的額外的癌症，例如：結腸癌、家族性結直腸息肉(familiary adenomatous polyposis)癌，及遺傳性非息肉病結腸直腸癌、或黑色素瘤。再者，癌症包括但不限於唇癌、喉癌、咽下部癌、舌癌、唾腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(髓性及乳突狀甲狀腺癌)、腎癌、腎薄壁細胞癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、膀胱癌、黑色素瘤，腦腫瘤，例如神經母細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、髓母細胞瘤，及周邊神經外胚層腫瘤、膽癌、支氣管癌、多發性骨髓瘤、基底瘤(basalioma)、畸胎瘤、視網膜母細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、顱咽瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤(myosarcoma)、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、Ewing肉瘤，和漿細胞瘤。於本發明之一態樣，本發明提供使用本發明之一或更多種化合物製造治療癌症之藥劑的用途。

於一具體例，本發明之化合物使用於治療血液性癌症或血液性癌前病況。血液性癌症，包括：白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。例子包括：淋巴球性白血病，如急性淋巴球性白血病，包括前驅物B急性淋巴細胞性白血病、前驅物T急性淋巴細胞性白血病、Burkitt氏白血病、及急性雙表型白血病；及慢性淋巴球性白血病，包括B細胞前淋巴球性白血病；及骨髓性白血病，例如急性骨髓生成性白血病，包括急性早幼粒細胞(promyelocytic)性白血病、急性髓母細胞性白血病、及急性巨核母細胞性白血病；及慢性骨髓生成性白血病，包括慢性單細胞性白血病；急性單細胞性白血病。其他白血病，包括髮狀細胞白血病；T細胞前淋巴球性白血病；大顆粒淋巴球性白血病；及成體T細胞白血病。淋巴瘤，包括Hodgkin氏淋巴瘤及非Hodgkin氏淋巴瘤，包括B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤，例如皮膚性T細胞淋巴瘤，及NK細胞淋巴瘤。血液性癌前病況，包括骨髓生成不良症候群，及骨髓增殖性病症，例如原發性骨髓纖維變性(myelofibrosis)、真性紅細胞增多症(polycythemia vera)及原發性血小板增多症(essential thrombocythemia)。

本發明之化合物顯示可逆地誘導淋巴球減少，因此移除或減少在淋巴系循環的癌細胞水平有用。此種化合物對於治療自體免疫病症或媒介免疫反應亦為有用。

於一具體例，本發明提供用於減少一個體中的循環淋巴細胞數的方法，包含：對於該個體投予有效量的本發明的化合物。於一較佳具體例，該減少的淋巴細胞數為可逆的，亦即，當本發明之化合物的投藥停止後，循環的淋巴細胞數會回到正常範圍。於一具體例，該減少的循環的淋巴細胞數低於正常範圍，且該個體係處於淋巴球減少的狀態。較佳者，該個體由於減少的循環的淋巴細胞數而獲得治療性或預防性的好處。如此的個體，包括罹患血液性疾病者，例如罹患血液性癌，罹患自體免疫病症者，及需要媒介免疫反應者，例如罹患糖尿病的病患或器官移植的接受者。於人類個體，該循環的淋巴細胞數，例如：B-淋巴細胞、T-淋巴細胞或兩者，可從正常範圍掉到淋巴球減少的範圍。於某些疾病，循環的淋巴細胞數不正常的高。於此種疾病，可將循環的淋巴細胞數減少到正常範圍或淋巴球減少的狀態。

於一具體例，本發明包括使用本發明之一或更多種化合物於製造進一步防止細胞異常增殖、分化或存活的藥劑的用途。例如，本發明之化合物有用於防止腫瘤的大小增加或到達轉移的狀態。投予的該對象化合物可阻止癌症的進展或進化，或誘導腫瘤細胞凋零或抑制腫瘤血管新生。此外，本發明包括使用該對象化合物預防癌症再復發的用途。

本發明更包括治療或預防細胞增殖性病症，例如增生(hyperplasias)、生長不良(dysplasias)及癌前病變。生長不良為病理學家由生理切片可辨識癌前病變的最早的形式。可以投予該對象化合物以預防該增生、生長不良或癌前病變持續擴大或變成癌症。癌前病變例如可發生於皮膚、食道組織、乳房及子宮頸內上皮組織。

"組合療法"包括將該對象化合物進一步組合其他生物學上有活性的成分(例如但不限於第二及不同的抗腫瘤藥)以及非藥物療法(例如但不限於手術或放射線治療)。例如本發明之化合物可以與其他醫藥上有活性的化合物組合，較佳為能夠增加本發明化合物的功效的化合物。本發明之化合物可以與其他藥物療法同時(製成單一製備物或分開的製備物)或依序投予。一般而言，組合療法展望在單一治療週期中投予兩種或更多種的藥物。

於本發明之一態樣，該對象化合物可以與一或更多種分離的試劑組合投予，該一或更多種分離的試劑媒介涉及多種疾病狀態的蛋白質激酶。此種激酶，例如但不限於：絲胺酸/蘇胺酸專一性激酶、受體酪胺酸專一性激酶，以及非受體酪胺酸專一性激酶。絲胺酸/蘇胺酸激酶，包括有絲分裂原(mitogen)活化的蛋白質激酶(MAPK)、減數分裂專一性激酶(MEK)、RAF及aurora激酶。受體激酶家族，例如包括上皮生長因子受體(EGFR)(例如HER2/neu、HER3、HER4、ErbB、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Xmrk、DER、Let23)；纖維母細胞生長因子(FGF)受體(例如FGF-R1、GFF-R2/BEK/CEK3、FGF-R3/CEK2、FGF-R4/TKF、KGF-R)；肝細胞生長/散佈因子因子受體(HGFR)(例如MET、RON、SEA、SEX)；胰島素受體(例如IGFI-R)；Eph(例如CEK5、CEK8、EBK、ECK、EEK、EHK-1、EHK-2、ELK、EPH、ERK、HEK、MDK2、MDK5、SEK)；Axl(例如Mer/Nyk、Rse)；RET；及血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)(例如PDGF α-R、PDG β-R、CSF1-R/FMS、SCF-R/C-KIT、VEGF-R/FLT、NEK/FLK1、FLT3/FLK2/STK-1)。非受體酪胺酸激酶家族，包括但不限於：BCR-ABL(例如p43^ab1、ARG)；BTK(例如ITK/EMT、TEC)；CSK、FAK、FPS、JAK、SRC、BMX、FER、CDK及SYK。

於本發明之另一態樣，該等對象化合物可以與一或更多種分離的試劑組合投予，該一或更多種分離的試劑媒介非激酶生物標靶或程序。此種標靶包括組蛋白去乙醯基酶(HDAC)、DNA甲基轉移酶(DNMT)、熱休克蛋白(例如HSP90)、hedgehog路徑相關蛋白(例如sonic hedgehog、patched、moothened)及蛋白酶體(proteosome)。

於一較佳具體例，對象化合物可以與抗腫瘤藥(例如小分子、單株抗體、反義RNA及融合蛋白)組合，該抗腫瘤藥抑制一或更多種生物學標靶，例如有：Zolinza、Tarceva、Iressa、Tykerb、Gleevec、Sutent、Sprycel、Nexavar、Sorafinib、CNF2024、RG108、BMS387032、Affinitak、Avastin、Herceptin、Erbitux、AG24322、PD325901、ZD6474、PD184322、Obatodax、ABT737、GDC-0449、IPI-926、 BMS833923、LDE225、PF-04449913及AEE788。此種組合可能會增強治療效果，使其超過任一單獨試劑的功效，且可預防或減緩產生抗藥性突變的變異體。

於某些較佳實施例，本發明之化合物係與化療試劑組合投予。化療試劑包括廣範圍的在癌症領域的治療處理。此等藥劑在疾病的各階段投予，以縮小腫瘤、破壞手術後殘留的癌細胞、誘導減輕(remission)、維持減輕及/減少關於癌症或其治療的症狀。此種試劑包括但不限於烷基化試劑，例如芥子氣衍生物(Mechlorethamine、環磷醯胺、chlorambucil、melphalan、異環磷酰胺(ifosfamide))、乙烯亞胺(thiotepa、六甲基黑色素)、磺酸烷酯(Busulfan)、肼類和三嗪(Altretamine、Procarbazine、Dacarbazine及Temozolomide)、亞硝基脲(Carmustine、Lomustine及Streptozocin)、異環磷酰胺及金屬鹽(Carboplatin、Cisplatin及Oxaliplatin)；植物鹼，例如鬼臼毒素(Podophyllotoxin)(Etoposide及Tenisopide)、紫杉烷(Paclitaxel及Docetaxel)、長春花生物鹼(Vincristine、Vinblastine、Vindesine及Vinorelbine)，及喜樹鹼(Camptothecan)類似物(Irinotecan及Topotecan)；抗腫瘤抗生素，例如色黴素(Chromomycin)(Dactinomycin及Plicamycin)、蒽環黴素(Anthracycline)(Doxorubicin、Daunorubicin、Epirubicin、Mitoxantrone、Valrubicin及Idarubicin)，及其他抗生素，例如絲裂黴素(Mitomycin)、放線菌素 (Actinomycin)和平陽黴素(Bleomycin)；抗代謝物，例如葉酸拮抗劑(Methotrexate、Pemetrexed、Raltitrexed、Aminopterin)、嘧啶拮抗劑(5-Fluorouracil、Floxuridine、Cytarabine、Capecitabine及Gemcitabine)、嘌呤拮抗劑(6-Mercaptopurine及6-Thioguanine)及腺苷去胺酶抑制劑(Cladribine、Fludarabine、Mercaptopurine、Clofarabine、Thioguanine、Nelarabine及Pentostatin)；拓樸異構酶抑制劑，例如拓樸異構酶I抑制劑(Ironotecan、topotecan)及拓樸異構酶II抑制劑(Amsacrine、etoposide、etoposide phosphate、teniposide)；單株抗體(Alemtuzumab、Gemtuzumab ozogamicin、Rituximab、Trastuzumab、Ibritumomab Tioxetan、Cetuximab、Panitumumab、Tositumomab、Bevacizumab)；及各種抗癌藥，例如核醣核苷酸(ribonucleotide)還原酶抑制劑(Hydroxyurea)；腎上腺皮質類固醇抑制劑(Mitotane)；酵素(Asparaginase及Pegaspargase)；抗微小管試劑(Estramustine)；視黃醇(retinoid)(Bexarotene、Isotretinoin、Tretinoin(ATRA)及Lenalidomide。

於某些較佳具體例，本發明之化合物係與化學保護試劑組合投予。化學保護試劑作用為保護身體或使化學療法的副作用最小化。此種試劑包括但不限於amfostine、mesna及dexrazoxane。

於本發明之一態樣，該等對象化合物係與放射線療法組合投予。放射線一般係從內部傳遞(在接近癌症的部位植入放射線活性材料)，或從使用光子(x射線或gamma射線)或粒子放射線的機器從外部傳遞。當該組合療法進一步包含放射線治療，該放射線治療只要可達成組合治療試劑及放射線治療的有益效果，可於任意適合的時間實施。例如，於適當案例中，當放射線治療在投予治療性試劑時暫時停止可能是幾天或幾週，仍可達成有益的效果。

本發明之化合物可使用於組合免疫治療試劑。一種免疫療法的形式為藉由在遠離腫瘤的部位投予疫苗組合物，以在主體來源產生活性的全身性腫瘤專一性免疫反應。已有人提出各種類型的疫苗，包括單離的腫瘤抗原疫苗，以及抗遺傳性型(idiotype)疫苗。另一方法是使用來自欲治療個體的腫瘤細胞，或此細胞的衍生物細胞(由Schirrmacher et al.,(1995)J.Cancer Res.Clin.Oncol.12 1：487評論)。於美國專利號5,484,596,Hanna Jr.,et al.宣稱一種治療可觀的癌症以防止再發或轉移的方法，包含以手術移去該腫瘤，將該細胞以膠原蛋白酶分散，照射該細胞，並且以至少3個連續的約10⁷細胞的藥量對於該病患接種疫苗。

應了解本發明之化合物可能有利地使用於與一或多種附屬的治療試劑結合使用。附屬療法的適當試劑，包括5HT₁致效劑，例如triptan(例如sumatriptan或naratriptan)；腺苷A1致效劑；EP配體；NMDA媒介劑，例如甘胺酸拮抗劑；鈉通道阻斷劑(例如lamotrigine)；基質P拮抗劑 (例如NK₁拮抗劑)；大麻素(cannabinoid)；乙醯胺基吩或phenacetin；5-脂氧化酶抑制劑；白三烯受體拮抗劑；DMARD(例如methotrexate)；gabapentin及相關化合物；三環抗抑鬱劑(例如amitryptilline)；神經原穩定抗癲癇藥；單胺能攝取抑制劑(例如venlafaxine)；基質金屬蛋白酶抑制劑；氧化氮合成酶(NOS)抑制劑，例如iNOS或nNOS抑制劑；腫瘤壞死因子alpha之釋放或作用的抑制劑；抗體療法，例如單株抗體療法；抗病毒藥劑，例如核苷抑制劑(例如lamivudine)或免疫系統媒介劑(例如干擾素)；類鴉片止痛劑；局部麻醉劑；刺激劑，包括咖啡因；H₂-拮抗劑(例如ranitidine)；質子幫浦抑制劑(例如omeprazole)；制酸劑(例如氫氧化鋁或氫氧化鎂)；抗胃腸脹氣劑(例如simethicone)；去充血劑(例如phenylephrine、phenylpropanolamine、pseudoephedrine、oxymetazoline、epinephrine、naphazoline、xylometazoline、propylhexedrine或levo-desoxyephedrine)；鎮咳劑(例如codeine、hydrocodone、carmiphen、carbetapentane或dextramethorphan)；利尿劑；或鎮靜性或非鎮靜性抗組織胺。

該等化合物也可使用在治療涉及、相關、或關連於組蛋白去乙醯基酶(HDAC)失調的病症。已有一些病症是涉及或已知至少部分由HDAC活性媒介，其中HDAC活性已知在觸發發病有其影響，或其整體症狀已知或已顯示會由於HDAC抑制劑減輕。可預期能以本發明化合物治療的此類型病症，包括但不限於以下：抗增殖性病症(例如癌症)；神經退化性疾病，包括Huntington氏Disease、聚麩醯胺酸病、帕金森氏病、阿茲海默氏症、癲癇發作、紋狀體退化、漸進性核上性麻痺、扭轉性肌張力障礙、痙攣性斜頸及運動障礙、家族性震顫、吉爾斯DE LA穢語症候群、瀰漫性路易體病、漸進性核上性麻痺、匹克氏病、腦出血、原發性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症、肌萎縮側索硬化症、肥大性間質性神經病、視網膜色素變性、遺傳性視神經萎縮、遺傳性痙攣性截癱、漸進性共濟失調和Shy-Drager症候群；代謝疾病，包括第2型糖尿病；眼退化性疾病，包括：青光眼、年齡相關性黃斑退化，新生血管性青光眼(Rubeotic Glaucoma)；發炎性疾病及/或免疫系統病症，包括類風濕關節炎(RA)、骨性關節炎，青少年慢性關節炎、移植物抗宿主病、牛皮癬、哮喘、脊柱關節病、克羅恩病、炎症性腸道疾病結腸炎、酒精性肝炎，糖尿病、Sjoegrens氏症候群、多發性硬化症、強直性脊柱炎、膜性腎病、椎間盤疼痛、全身性紅斑狼瘡；涉及血管生成的疾病，包括癌症、牛皮癬、類風濕關節炎；心理障礙的病症，包括雙極性疾病、精神分裂症、躁狂症，抑鬱症和老年癡呆症；心血管疾病，包括預防及治療缺血相關或再灌流相關之血管及心肌組織損害、心臟衰竭、再狹窄和動脈硬化；纖維化疾病，包括肝纖維化、囊性纖維化和纖維血管瘤；感染性疾病，包括真菌感染，例如念珠菌感染(candidiasis)或念珠菌，細菌感染、病毒感染，例如單純皰疹、脊髓灰質炎病毒、犀牛病毒和柯薩奇病毒、原蟲感染，例如瘧疾、利甚曼原蟲感染、布氏錐蟲感染、弓形體病和球蟲病，及造血性病症，包括地中海性貧血、貧血及鐮狀細胞貧血。

本發明之化合物也可用於治療涉及、關於或相關於PI3激酶失調的病症。PI3激酶活性已涉及或顯示涉及許多病症。於某些案例，PI3激酶活性涉及觸發發病，而於其他情形，PI3激酶活性之抑制劑已知或顯示會減輕症狀。可預期能以本發明化合物治療的此類型病症，包括但不限於以下：癌症，包括白血病、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、胰臟癌、腎癌、胃癌及腦癌；再狹窄(restenosis)、動脈粥狀硬化、骨症、關節炎、糖尿病性視網膜病變、牛皮癬、良性前列腺增生症、動脈粥狀硬化、炎症、血管生成、免疫功能紊亂、胰臟和腎臟疾病。

於一具體例，本發明之化合物可用於誘導或抑制細胞凋零，其係一種生理學的細胞死亡程序，對於正常發展及恆定有關鍵影響。改變細胞凋零路徑有助於許多人類疾病的致病性。本發明之化合物，當作細胞凋零的調節劑，將有用於治療許多有不正常的細胞凋零的人類疾病，包括癌症(尤其是但不限於濾泡性淋巴瘤、有p53突變的癌症、乳房、前列腺及卵巢的荷爾蒙依存性腫瘤，及癌前病變，例如家族性腺瘤性息肉病)，病毒感染(包括但不限於：痘病毒、皰疹病毒、EB病毒、辛德畢斯病毒和腺病毒)，自體免疫疾病(包括但不限於：全身性紅斑狼瘡、免疫媒介性腎小球腎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎性腸道疾病、自體免疫性糖尿病)，神經退化性病症(包括但不限於：阿爾茨海默氏症、艾滋病相關的老年癡呆症、帕金森氏病、肌萎縮性側索硬化症、色素性視網膜炎、脊髓肌肉萎縮症和小腦退化)、AIDS、骨髓增生異常症候群、再生障礙性貧血、缺血性腦損傷相關心肌梗塞、中風和再灌注損傷、心律失常、動脈粥狀硬化、毒素誘導或酒精引起的肝臟疾病、血液性疾病(包括但不限於：慢性貧血及再生障礙性貧血)，肌肉骨骼系統的退化性疾病(包括但不限於：骨質疏鬆症和關節炎)、阿司匹靈敏感性鼻竇炎，囊腫性纖維化，多發性硬化症，腎疾病，癌疼痛。

於一態樣，本發明提供本發明之化合物治療及/或預防免疫反應或免疫媒介反應及疾病的用途，例如預防或治療排斥移植人造或器官移植物材料、細胞、器官或組織以代替該組織的全部或部分功能，該組織例如心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚、角膜、血管、肺、胰、腸、四肢、肌肉、神經組織、十二指腸、小腸、胰腺的胰島細胞，包括異體移植物等；以治療或預防移植物抗寄主病、自體免疫疾病例如類風濕關節炎、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、多發性硬化症、重症肌無力、第I型糖尿病葡萄膜炎，青少年的發病或最近的發病糖尿病、葡萄膜炎、格雷夫斯病、銀屑病、過敏性皮炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、脈管炎，自體抗體媒介的疾病、再生障礙性貧血、Evan氏症候群、自體免疫性溶血性貧血等；及進一步治療會造成不正常免疫反應及/或活化的感染性疾病，包括例如B肝及C肝感染、HIV、金黃葡萄球菌感染、病毒性腦炎、敗血症，寄生性疾病，其中損害係由於發炎性反應誘導(例如麻風病)；及預防或治療循環性疾病，例如動脈硬化(arteriosclerosis)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、血管炎、結節性多動脈炎和心肌炎。此外，本發明可用於預防/抑制與基因療法關連的免疫反應，例如將外來基因導入自體細胞並表現該編碼產物。因此於一具體例，本發明係關於一種治療所需個體免疫反應疾病或病症或免疫媒介反應或病症之方法，包含對於該個體投予治療上有效量的本發明化合物。

於一態樣，本發明提供使用本發明之化合物治療許多神經退化性疾病的用途，一未窮舉的表包括：I.特徵為沒有其他顯在的神經性表徵的漸進性癡呆的病症，例如阿爾茨海默氏症、阿爾茨海默型老年癡呆；匹克氏病(葉萎縮)；II.結合漸進性癡呆及其他顯在的神經性異常的症候群：例如A)主要在成人發生的症候群(例如亨廷頓氏病、多系統萎縮其結合癡呆及共濟失調和/或帕金森氏症、漸進性核上性麻痺(Steel-Richardson-Olszewski)、瀰漫性路易體病，和corticodentatonigral退化；及B)主要在兒童或年輕人發生的症候群(例如Hallervorden-Spatz疾病和漸進性家族性肌陣攣性癲癇)；III.逐漸發生姿勢及行動異常的症候群，例如震顫麻痺(帕金森氏病)、紋狀體黑退化(striatonigral degeneration)、漸進性核上性麻痺、扭轉性肌張力障礙(扭轉痙攣、變形性肌張力不全)、痙攣性斜頸及其他運動障礙、家族性震顫，及Gilles de la Tourette症候群；IV.漸進性共濟失調之症候群，例如小腦退化(例如小腦皮質退化和橄欖體橋腦小腦萎縮(OPCA))；及脊髓小腦退化(Friedreich氏共濟失調和相關疾病)；V.中樞自律神經系不全症候群(Shy-Drager症候群)；VI.肌肉弱化及無感官變化的破壞的症候群(運動神經原疾病，例如肌萎縮性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症(例如小兒脊髓性肌萎縮症(Werdnig-Hoffman)、少年脊髓肌肉萎縮症(Wohlfart Kugelberg Welander)和其他形式的家族性脊肌萎縮症)、原發性側索硬化症、遺傳性痙攣性截癱；VII.結合肌肉弱化及無感官變化的破壞的症候群(漸進的神經性肌肉萎縮症；慢性家族性神經病)例如腓骨肌萎縮症(Charcot-Marie-Tooth)、肥厚間質性神經病(Dejerine-Sottas)，和雜項形式的慢性漸進性神經病；VIII.漸進性視覺喪失之症候群，例如視網膜色素退化(retinitis pigmentosa)、遺傳性視神經萎縮(Leber氏病)。再者，本發明之化合物可用於染色質重新模型化。

本發明的醫藥組合物包含如上述本發明化合物之醫藥上可接受之鹽。本發明也包含本發明之化合物之溶劑合物，及包含此種溶劑合物的醫藥組合物，例如水合物、甲醇合物或乙醇合物。用語“溶劑合物”係指固體，較佳為結晶，化合物的形式包括在晶格中存在溶劑分子。包含給定溶劑的化合物的溶劑合物，一般由該溶劑將該化合物結晶化以製備。溶劑合物可以包括許多溶劑，包括水、甲醇及乙醇。用語"水合物"係指溶劑為水的溶劑合物，包括但不限於半水合物、單水合物、二水合物、三水合物等。本發明也包括包含任意固體或液體形式包括結晶及結晶溶劑合物形式之本發明化合物的醫藥組合物。例如該等化合物可為結晶形式、非晶質形式且為任意粒子尺寸。該等粒子可以微粉碎或聚集，為顆粒、粉末、油、油狀懸浮液或任意其他固體或液體物理形式。

本發明之化合物及其衍生物、片段、類似物、同源物、醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，可以與醫藥上可接受的擔體或賦形劑一起納入適於供投予之醫藥組合物。此種組合物一般包含：治療上有效量之任意上述該等化合物，及藥學上容許之載體。較佳者，該有效量當治療癌症時係選擇性誘導適當的腫瘤細胞的末端分化的有效量，且少於會對病患造成毒性之量。

本發明之化合物可以用任意適當的方式投予，包括但不限於：腸外、靜脈內、肌肉內、皮下、植入、口服、舌下、口腔、鼻腔、肺、穿皮、外用、陰道、直腸及穿黏膜投予等。局部投予也可涉及使用穿皮投予，例如穿皮貼片或離子導入設備。醫藥製備物包括固體、半固體或液體製備物(錠劑、丸粒、片劑、膠囊劑、栓劑、乳膏、軟膏、氣霧劑、粉劑、液體、乳液、懸浮液、糖漿、注射劑等)，其包含本發明化合物當作有效成分，以適於選擇的投予模式。於一具體例，該醫藥組合物係口服投予，故配方為適於口服投予的形式，即固體或液體製備物。適當的固體口服配方，包括錠劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、丸粒、小袋和泡騰片、粉末等。適當的液體口服配方包括：溶液、懸浮液、分散液、乳液、油等。於本發明一具體例，該組合物配方為膠囊劑。依照該具體例，本發明之組合物包含該活性化合物、及鈍性擔體或稀釋劑及硬的明膠膠囊。

在本發明配方中可使用任何通常用為擔體或稀釋劑的鈍性賦形劑，例如膠(gum)、澱粉、糖、纖維素材料、丙烯酸酯或其混合物。較佳的稀釋劑為微結晶性纖維素。該等組合物可以進一步包含崩散劑(例如羧甲基纖維素鈉(croscarmellose sodium))及潤滑劑(例如硬脂酸鎂)，且可額外地包含一或多種選自於以下的添加劑：黏結劑、緩衝劑、蛋白酶抑制劑、界面活性劑、溶解劑、塑化劑、乳化劑、安定劑、增稠劑、甜味劑、成膜劑或其任意的組合。再者，本發明之組合物可為控制釋放的配方或立即釋放的配方。

針對液體配方，醫藥上可接受的擔體可為水溶液或非水溶液、懸浮液、乳液或油。非水溶液之例，如：丙二醇、聚乙二醇及可注射的有機酯，例如油酸乙酯。水溶性擔體包括：水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽液及經緩衝之介質。油，例如：汽油、動物、蔬菜或人造來源者，例如花生油、黃豆油、礦物油、橄欖油、葵花油及魚肝油。溶液或懸浮液也可包括以下成分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗細菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調整張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH值可利用酸或鹼調整，例如鹽酸或氫氧化鈉。

此外該等組合物可更包含：黏結劑(例如阿拉伯膠(acacia)、玉米澱粉、明膠、卡波姆(carbomer)、乙基纖維素、瓜爾膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮(povidone)；崩散劑(例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、交聯聚乙烯基吡咯烷酮(crospovidone)、瓜爾膠、甘醇酸澱粉鈉、Primogel)；各種pH及離子強度的緩衝液(例如tris-HCI、乙酸鹽、磷酸鹽)；添加劑，例如白蛋白或明膠用以防止吸附到表面；洗滌劑(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽酸鹽)；蛋白酶抑制劑；界面活性劑(例如月桂酸硫酸鈉)、滲透增進劑、溶解劑(例如甘油、聚乙烯甘油、聚乙二醇)、滑動劑(例如膠體二氧化矽)；抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏二亞硫酸鈉、丁基化羥基苯甲醚)、安定劑(例如羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素)；增稠劑(例如卡波姆(carbomer)、膠體二氧化矽、乙基纖維素、瓜爾膠)；甜味劑(例如蔗糖、阿斯巴甜(aspartame)、檸檬酸)；風味劑(例如薄荷、水楊酸甲酯或柳橙風味)；保存劑(例如Thimerosal、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)；潤滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉)、助流劑(例如膠體二氧化矽)；塑化劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)；乳化劑(例如卡波姆、羥基丙基纖維素、月桂基硫酸鈉)、聚合物塗劑(例如poloxamer或poloxamine)；塗佈及成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)；及/或佐劑。

於一具體例，該有效化合物係製備為帶有保護該化合物免於從其體快速消去的擔體，例如受控制的釋放配方，包括植入物及微膠囊化的傳遞系。可使用生物可分解性聚合物，例如乙烯乙烯基乙酸酯、多元酸酐、聚甘醇酸、聚原酯及聚乳酸。製備如此的配方的方法對於熟習該技術領域之人士而言為明顯。該等材料也可由Alza公司及Nova製藥公司購得。微脂體懸浮液(包括微脂體，其標靶於具有針對病毒抗原之單株抗體的受感染細胞)也可使用於當作醫藥上可接受的單體。此等可依照熟習該技術領域的人士已知的方法製備，例如美國專利號4,522,811所記載。

將口服組合物配方為方便劑量單元形式及劑量均勻性時更佳。在此使用的劑量單元形式係指在物理上分離的單元，其適用於單次供受治療的個體使用；各單元包括經計算能產生理想療效的預定量的有效化合物及所需的醫藥上的擔體。本發明之劑量單元形式的規格，直接或依賴該有效化合物的獨特特性而決定，且尤其是對於欲達到的療效，以及在混合供治療個體的有效化合物的技術領域中的固有限制。

用於口服投予之本發明的配方可包括一或多種滲透增強劑，包括長鏈脂肪酸或其鹽，例如癸酸及癸酸鈉。

於一較佳具體例，該化合物可配方為水溶液供靜脈內注射。於一具體例，可適當採用溶解劑。尤佳的溶解劑，包括環糊精及經修飾的環糊精，如經磺酸取代的β-環糊精衍生物或其鹽，包括經磺基丁基衍生的β-環糊精，如磺基丁醚-7-β-環糊精，其係由CyDex公司以商品名CAPTISOL®販售。

該醫藥組合物可與投予指示一起包括在容器、包裝或分配器中。

每日投予可以連續重覆進行數天或數年的期間。口服治療可以持續一周到病患的終生。較佳為投予連續5天，然後評估該病患以決定是否需要進一步投予。該投予可以為連續或斷續，例如連續治療數天，接著休息期。本發明之化合物可以在治療的第1天以靜脈內投予，第2天及之後的連續各天以口服投予。

包括有效成分的該醫藥組合物的製備，在該技術領域係為人周知，例如藉由混合、造粒或打錠程序。該有效治療成分時常與醫藥上可接受且與該有效成分相容的賦形劑混合。針對口服投予，係將該有效試劑與慣用於該用途的添加劑混合，添加劑例如載體(vehicle)、安定劑或鈍性稀釋劑，並且由慣用的方法轉換為供投予用的適當形式，例如錠劑、加衣錠、硬或軟明膠膠囊、水性或醇性或油性溶劑等，如上所述。

對於病患投予的化合物量，係少於會對於該病患可能造成毒性的量。於某些具體例，該化合物對於病患的投予量，少於會造成在病患血漿的化合物濃度等同或超過該化合物毒性水平之量。較佳者，該化合物於病患血漿之濃度維持為約10 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約25 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約50 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約100 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約500 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約1000 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約2500 nM。於一具體例，化合物於病患血漿之濃度維持為約5000 nM。實施本發明時應對於該病患投予的該化合物之最適量，取決於使用的特定化合物以及欲治療的癌症形式。

定義

以下列出各種敘述本發明所使用的各種用語的定義。此等定義應用於用語，如同在整份本說明書及申請專利範圍，除非有受限於特定例，其為個別或大集合的一部分。

用語"醯基"係指經氫、烷基、部分飽和的或完全飽和的環烷基、部分飽和的或完全飽和的雜環、芳基、及雜芳基取代的羰基。例如，醯基包括以下基團，例如(C₁-C₆)烷醯基(例如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基、第三丁基乙醯基等)；(C₃-C₆)環烷基羰基(例如環丙基羰基、環丁基羰基、環戊基羰基、環己基羰基等)；雜環羰基(例如吡咯啶基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶基羰基、哌基羰基、四氫呋喃基羰基等)；芳醯基(例如苯甲醯基)及雜芳醯基(例如噻吩基-2-羰基、噻吩基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、呋喃基-3-羰基、1H-吡咯基-2-羰基、1H-吡咯基-3-羰基、苯并[b]噻吩基-2-羰基等)。此外該醯基的烷基、環烷基、雜環、芳基及雜芳基部分，可為在各定義敘述的任一基團。當記載"可選擇性經取代"時，該醯基可以為未經取代，或經一或更多取代基(一般為1至3個取代基)獨立地選自以下在”經取代”的定義中列出的取代基之群組選擇性取代，或該醯基的烷基、環烷基、雜環、芳基及雜芳基部分可經上述在較佳及更佳的取代基列表所述者取代。

用語"烷基"包括有1至約20個碳原子，較佳為1至約12個碳原子的直鏈或分支鏈基團。更佳的烷基基團為有1至約10個碳原子的"低級烷基"基團。最佳者為有1至約8個碳原子的低級烷基基團。此種基團包括例如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、己基等。

用語"烯基"包括2至約20個碳原子、較佳為2至12個碳原子的有至少1個碳碳鍵的直鏈或分支鏈基團。更佳的烯基基團為有2至約10個碳原子，又更佳為約2至約8個碳原子的"低級烯基"基團。烯基基團例如包括乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基及4-甲基丁烯基。用語"烯基"及"低級烯基"，包括"順式"及"反式"配向的基團，或"E"及"Z"配向的基團。

用語"炔基"，包括2至約20碳原子，較佳為2至約12個碳原子的有至少1個碳碳參鍵的直鏈或分支鏈基團。更佳的炔基基團為有2至10個碳原子，更佳為2至約8個碳原子的"低級炔基"基團。炔基基團包括例如炔丙基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔、2-丁炔基及1-戊炔基。

用語"芳基"，單獨或組合意指包括1、2或3個環的碳芳香族系，其中該等環可以懸吊方式附著在一起，或是稠合。用語"芳基"包括芳香族基團，例如苯基、萘基、四氫萘基、茚滿及聯苯。

用語“雜環基(heterochclyl)”、“雜環(heterocycle)”、“雜環(heterocyclic)”或“雜環(hetercyclo)”，包含飽和、部分不飽和的及不飽和的包含雜原子的環形基團，其也稱為對應的"雜環基(heterocyclyl)"、"雜環烯基"及"雜芳基"，其中該等雜原子可選自氮、硫及氧。飽和的雜環基基團，包括例如包含1至4個氮原子的飽和的3至6員雜單環基(例如吡咯啶基、咪唑啶基、哌啶基、哌基等)；包含1至2個氧原子及1至3個氮原子的飽和的3至6員雜單環基(例如嗎啉基等)；包含1至2個硫原子及1至3個氮原子的飽和的飽和的3至6員雜單環基(例如噻唑啶基等)。部分不飽和的雜環基團，包括例如二氫噻吩、二氫吡喃、二氫呋喃及二氫噻唑。雜環基團可包括五價氮於例如四唑鎓(tetrazolium)及吡啶鎓(pyridinium)基團中。用語"雜環"也包含雜環基團與芳基或環烷基基團稠合在一起的基團。此種稠合的雙環基團，例如包括苯并呋喃、苯并噻吩等。

用語"雜芳基"，包含不飽和的雜環基團，雜芳基基團例如包括不飽和的3至6員，較佳為5或6員的包括1至4個氮原子的雜單環基，例如：吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡基、嗒基、三唑基(例如4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基等)；四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)等；不飽和的包括1至5個氮原子的縮合雜環基，例如吲哚基、異吲哚基、吲(indolizinyl)基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并嗒基(例如四唑并[1,5-b]嗒基等)等；不飽和的3至6員，較佳為5或6員之包含1個氧原子的雜單環基，例如吡喃基、呋喃基等；包含1個硫原子的不飽和的3至6員雜單環基，例如噻吩基等；包含1至2個氧原子及1至3個氮原子的不飽和的3至6員，較佳為5至6員的雜單環基，例如唑基、異唑基、二唑基(例如1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,5-二唑基等)等；包含1至2個氧原子及1至3個氮原子的不飽和的縮合雜環基(例如苯并唑基、苯并二唑基等)；包含1至2個硫原子及1至3個氮原子的不飽和的3至6員，較佳為5或6員的雜單環基，例如噻唑基、噻二唑基(例如1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等)等；包含1至2個硫原子及1至3個氮原子的不飽和的縮合雜環基(例如苯并噻唑基、苯并噻二唑基等)等。

用語"雜環烷基"，包含經雜環取代的烷基基團。更佳的雜環烷基基團為雜環基團中有1至6個碳原子的"低級雜環烷基"基團。

用語"經取代”，係指將給定結構中的一或更多個氫原子取代為一特定取代基的基團，該取代基包括但不限於：鹵基、烷基、烯基、炔基、芳基、雜環、硫醇、烷硫基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺醯基、烷基磺醯基烷基、芳基磺醯基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、胺基羰基、烷基胺基羰基、芳基胺基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、鹵烷基、胺基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基胺基、芳基胺基、烷基胺基烷基、芳基胺基烷基、胺基烷基胺基、羥基、烷氧基烷基、羧烷基、烷氧基羰基烷基、胺基羰基烷基、醯基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺醯基、膦酸、芳基、雜芳基、雜環及脂肪族。應了解該取代基可更進一步經取代。

為求簡化，在對於熟習該技術領域之人士而言為適當結構的情形，所有定義及意指的化學結構可為單價的化學結構(例如烷基、芳基等)或多價的化學結構。例如，”烷基”結構可指單價基團(例如CH₃-CH₂-)，或在其他情形，二價的連結結構可為”烷基”，在此情形熟習該技術領域之人士將了解二價基團(例如-CH₂-CH₂-)的烷基，等同於用語”伸烷基”。同樣地，需要二價結構的情形，記載為”烷氧基”、”烷基胺基”、”芳氧基”、”烷硫基”、”芳基”、“雜芳基”、”雜環”、”烷基”、“烯基”、”炔基”、“脂肪族基”或“環烷基”，熟習該技術領域之人士將了解用語烷氧基”、”烷基胺基”、”芳氧基”、”烷硫基”、“芳基”、“雜芳基”、”雜環”、”烷基”、”烯基”、”炔基”、“脂肪族基”或“環烷基”，係指對應的二價結構。

此處使用的用語”鹵素”或“鹵基”，係指選自氟、氯、溴及碘的原子。

此處使用的用語“異常增殖”，係指不正常的細胞生長。

詞語“結合(adjunctive)療法”，包含對一個體以減少或避免相關於本發明組合療法的副作用的試劑治療的方法，包括但不限於將例如減少抗癌藥的毒性作用例如骨再吸收抑制劑、心臟保護試劑；防止或減少發生與化療、放療或操作相關的噁心及嘔吐的藥劑；或減少與投予骨髓抑制抗癌藥相關連的感染機會的藥劑。

在此使用的用語”血管新生”，係指形成血管。具體而言，血管新生係一多步驟的程序，其中上皮細胞在病灶降解並經由其本身的基體膜而入侵，經由間質(interstitial stroma)朝血管新生刺激源移動，往移動端增殖，組織成血管，並再度附著於新合成的基體膜(參見Folkman et al.,Adv.Cancer Res.,Vol.43,pp.175-203(1985))。抗血管新生試劑會干擾此程序。干擾此等步驟中的數個步驟的試劑，包括：thrombospondin-1、angiostatin、endostatin、干擾素alpha，及化合物例如基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑，其阻斷清掃及創造供新形成的血管前進的酵素的作用；化合物例如.alpha.v.beta.3抑制劑，其干擾血管細胞用於將母血管與腫瘤橋接的分子；試劑例如專一性COX-2抑制劑，其阻止形成新血管的細胞的生長；及蛋白系化合物，其同時干擾此等標靶中的數個。

此處使用的用語”細胞凋零”，係指當年齡細胞健康及狀態支配，由正常功能的人類及動物細胞傳訊的程式化細胞死亡。“細胞凋零誘導劑”會觸發該程式化細胞死亡的程序。

在此使用的用語”癌症”，表示一類疾病或病症，其特徵為細胞不受控制的分裂，且該等細胞有能力入侵其他組織，其入侵係藉由入侵直接生長到鄰近的組織內部，或是以轉移植入到遠處。

在此使用用語”化合物”及“本發明之化合物”，係指式I化合物，以及其藥學上容許之鹽。本發明之化合物可由不同形式獲得，包括結晶形及非晶質形。該等化合物也可為溶劑合物，例如水合物，或有機溶劑的溶劑合物，較佳為醫藥上可接受的溶劑的溶劑合物。該等化合物也可為多結晶或多形。

用語”裝置”係指任意應用裝置，通常為設定以實行特定功能的機械或電子裝置。

此處使用的用語“生長不良(dysplasia)”係指不正常的細胞生長，一般係指病理學家可從活體切片辨識的最早的癌前病變的形式。

此處使用的用語“該等對象化合物之有效量”，相關於該治療方法，係指該對象化合物，當作為理想的藥劑投藥策略的一部分傳遞時，會帶來例如改變細胞增殖速度及/或分化狀態/或細胞存活率至臨床可接受標準的量。此量可以進一步放寬範圍到瘤形成的一或多種症狀，包括但不限於：1)減少癌細胞數目；2)減少腫瘤大小；3)抑制(即減慢到某個程度，較佳為停止)癌細胞滲透到周邊器官內；4)抑制(即減慢到某個程度，較佳為停止)腫瘤轉移；5)某個程度抑制腫瘤生長；6)減輕或減少與該病症相關的一或多種症狀的程度；及/或7)減輕或減少與投予抗癌試劑相關的副作用。

在此使用的用語”過度增生(hyperplasia)”，係指細胞過度分裂或生長。

詞語“免疫治療劑”，係指用於以接種轉移免疫捐出者例如另一人或動物的免疫性到寄主的試劑。用語包含使用由另一個體或動物產生的抗體的血清或gamma球蛋白；非專一性全身性刺激；佐劑；主動專一性免疫療法；及授受的(adoptive)的免疫療法。授受的免疫療法，係指藉由包括對於寄主接種敏化的淋巴細胞、轉移因子、免疫RNA或血清中的抗體或gamma球蛋白的療法或試劑治療疾病。

在瘤形成、腫瘤生長或腫瘤細胞生長的上下文使用的用語”抑制”，可藉由減慢出現初級及次級腫瘤、減慢發生初級及次級腫瘤、減少發生初級及次級腫瘤、減慢或減少疾病次級作用的嚴重度、停止腫瘤生長及腫瘤的回歸等來描述。最極端地，在此完全抑制，係指防止或化學性防止。

在此使用的用語”轉移”，係指癌細胞從原始腫瘤部位經由血液及淋巴管移動，於其他組織產生癌症。轉移也使用在於遠處生長的次級癌症。

在此使用的用語”瘤(neoplasm)”，係指由於過度細胞分裂造成的不正常質量。瘤可為良性(非癌化)或惡性(癌化)，且可稱為腫瘤。用語”瘤形成(neoplasia)”係造成腫瘤形成的致病程序。

此處使用的用語“癌前”，係指非惡化，但若不治療可能會成為惡性的狀況。

用語”增殖(proliferation)”係指細胞經歷細胞分裂。

詞語“PI3激酶相關的疾病或病症”，係指一疾病或病症其特徵為不適當的磷脂醯肌醇-3-激酶活性或是磷脂醯肌醇-3-激酶的過度活性。不適當的活性，係指：(i)在正常不表現PI3激酶的細胞表現PI3激酶；(ii)PI3激酶表現增加，造成不欲的細胞增殖、分化及/或生長；或(iii)PI3激酶表現減少，造成不欲的細胞增殖、分化及/或生長減少。PI3激酶過度活性，係指放大編碼為特定PI3激酶之基因，或產生PI3激酶活性之水平，可相關於細胞增殖、分化及/或生長病症(即，隨PI3激酶的水平增加，細胞性病症的一或多種症狀的嚴重度增加)。

詞語“放射線治療劑”，係指使用電磁或粒子放射治療瘤形成。

此處使用的用語”復發(recurrence)”，係指在一段緩解期後，回復成癌症。其可能由於未從起始的癌症移除所有的細胞引起，且可能會局部(與起始的癌症為相同部位)、區域性(起始癌症的附近，可能在淋巴節或組織)/或由於轉移而發生在遠處。

用語”治療”，係指任意程序、動作、應用、療法等，其中目標為直接或間接改善哺乳動物的狀況而對於哺乳動物，包括人類施以醫學輔助。

用語”疫苗”，包括誘導病患的免疫系統對抗腫瘤產生免疫反應，係藉由對於表現腫瘤關連抗原(Tea)的細胞加以攻擊。

此處使用的用語“醫藥上可接受之鹽”，係指在健全的醫藥判斷的範圍內，適於使用在接觸人類及低等動物的組織而不會有不當的毒性、刺激、過敏反應等且有等值的合理的益處/風險比值的鹽類。醫藥上可接受之鹽在該技術領域為周知。例如S.M.Berge,et al.詳述醫藥上可接受之鹽於J.Pharmaceutical Sciences,66：1-19(1977)。該等鹽可在最終單離及純化本發明化合物時原地製備，或是藉由使游離鹼與適當的有機酸或無機酸反應以分開的製備。醫藥上可接受的無毒性加成鹽，包括但不限於：以無機酸形成的胺基的鹽，無機酸例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸，與有機酸形成的鹽，有機酸例如乙酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、乳糖醛酸(lactobionic acid)，或丙二酸，或使用該領域中的其他方法，例如離子交換。其他醫藥上可接受之鹽，包括但不限於：己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、帕莫酸鹽(pamoate)、果酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性的鹼金屬或鹼土金屬鹽，包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。進一步的醫藥上可接受之鹽，當適當時，包括非毒性銨鹽、四級銨，及使用相對離子形成的胺陽離子，相對離子包括鹵根、氫氧化物、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、1至6個碳原子的烷基磺酸根、磺酸根及芳基磺酸根。有些鹽例如鈉鹽、鉀鹽及膽鹼鹽以及酸性鹽例如硫酸鹽及甲烷磺酸鹽發現可改善式I化合物於醫藥上可接受之介質中的溶解度。於一具體例，化合物1之醫藥上可接受之鹽為氯鹽。化合物1的較佳鹽，包括鈉鹽以及鉀鹽。其他較佳的鹽包括硫酸鹽及甲烷磺酸鹽。

此處使用的用語“醫藥上可接受之酯”，係指於體內水解的酯，且包括容易於人體內破壞以保留該母化合物或其鹽酸酯。適當的酯基，包括例如由醫藥上可接受之脂肪族羧酸衍生者，尤其烷酸、烯酸、環烷酸及烷二酸，其中各烷基或烯基結構較佳為不多於6個碳原子。具體的酯例如但不限於甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯及乙基琥珀酸酯。

此處使用之用語”醫藥上可接受之前驅藥”，係指在健全的醫藥判斷的範圍內，適於使用在接觸人類及低等動物的組織而不會有不當的毒性、刺激、過敏反應等且有等值的合理的益處/風險比值的本發明的化合物的該等前驅藥，及當可能時，為本發明之化合物之兩性離子型。在此使用的”前驅藥”，意指在體內利用代謝方式(例如水解)可轉換為本發明之化合物。該技術領域已知有各種前驅藥的形式，例如已討論於Bundgaard,(ed.),Design of Prodrugs,Elsevier(1985)；Widder,et al.(ed.),Methods in Enzymology,Vol.4,Academic Press(1985)；Krogsgaard-Larsen,et al.,(ed).“Design and Application of Prodrugs,Textbook of Drug Design and Development,Chapter 5,113-191(1991)；Bundgaard,et al.,Journal of Drug Deliver Reviews,8：1-38(1992)；Bundgaard,J.of Pharmaceutical Sciences,77：285 et seq.(1988)；Higuchi and Stella(eds.)Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems,American Chemical Society(1975)；and Bernard Testa & Joachim Mayer, “Hydrolysis In Drug And Prodrug Metabolism：Chemistry,Biochemistry And Enzymology,John Wiley and Sons,Ltd.(2002)。

在此使用的“藥學上容許之載體”，意欲包括所有相容於醫藥上的投予的任意及所有的溶劑、分散介質、包覆劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑等，例如無菌的無致熱原水。適當的載體敘述於最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，其係該領域的標準參考文本，本發明將其納入當作參考。此等擔體或稀釋劑的較佳實施例包括但不限於：水、鹽液、林格氏液、葡萄糖溶液，及5%人類血清白蛋白。也可使用微脂體及非水溶性載體，例如固定油。此等用在醫藥上有效物質的介質及試劑的用途，為該技術領域中周知的。除非任意習知的介質或試劑與該活性化合物不相容，否則其使用於組合物均是可考量的。也可將補充的活性化合物納入該組合物。

在此使用的用語“癌前”係指非惡性但若不治療可能變成惡性的狀況。

在此使用的用語”個體”，係指任意動物。較佳動物為哺乳動物。更佳為該哺乳動物為人類。個體也指例如犬、貓、馬、牛、豬、天竺鼠、魚、鳥等。

本發明之化合物也可利用附屬的適當官能基修飾以增強選擇性的生物學性質。此種修飾係該技術領域中已知，且可包括例如增加對於給定生物學系統(例如血液、淋巴系、中樞神經系)的生物學穿透性、增加口服可利用性、增加溶解性以能利用注射投予、改變代謝及改變泌出速率。

該合成的化合物可以從反應混合物分離，並進一步利用例如管柱層析、高壓液相層析或再結晶等方法予以精製。如熟悉該技術之人士可了解者在此配方的該等化合物的合成對於該技術領域中具有通常知識者而言為明白的。此外，可將各種合成步驟以交替或依序的順序實施以獲得所望的化合物。合成此處所述之該等化合物時有用的合成化學品轉換及保護基方法學(保護及脫保護)，包括例如敘述於R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagent for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed.,Encylcopedia of Reagent for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)，及之後的版本。

醫藥組合物

本發明之醫藥組合物包含醫藥上有效量的本發明的化合物，以及一起配方的一或多種藥學上容許之載體或賦形劑。

如此處所使用，用語“藥學上容許之載體或賦形劑”，意指無毒、鈍性固體、半固體或液體填料、稀釋劑、膠囊化材料或任意形式配方輔助劑。可當作藥學上容許之載體的例子及材料，例如糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；環糊精，例如alpha-(α)、beta-(β)及gamma-(γ)環糊精；澱粉，例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如羧基甲基纖維素鈉、乙基纖維素及纖維素乙酸酯；黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂及栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及黃豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，例如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原水；等張鹽液；林格氏液；乙醇，及磷酸緩衝液，及無毒可相容之潤滑劑，例如月桂機硫酸鈉及硬脂酸鎂，及著色試劑、釋放劑、包覆劑、甜味劑、風味劑及芬芳劑、保存劑及抗氧化劑，依照配方人的判斷，也可存在於該組合物中。

本發明之醫藥組合物可以經口服、非口服、吸入噴霧、外用、直腸、鼻、頰、陰道或經植入的貯池投予，較佳為口服投予或注射投予。本發明的醫藥組合物，可包括任意習知的無毒的醫藥上可接受的擔體、佐劑或載體。於一些情形，配方的pH可以由醫藥上可接受之酸、鹼或緩衝劑調整，以增加該配方化合物或其傳遞形式的穩定性。在此使用的用語非口服(parenteral)，包括皮下、皮內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜腔內、胸骨內、鞘內、病灶內及顱內注射或輸液技術。

口服投予用之液體劑型，包括醫藥上可接受之乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除了該活性化合物，該液體劑型可包括在該技術領域常用的鈍性稀釋劑，例如水或其他溶劑、溶解化劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、篦麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及山梨糖醇酐的脂肪酸酯，及其混合物。除了鈍性稀釋劑，該等口服組合物也可包括佐劑，例如溼化劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、風味劑及芬芳劑。

可注射製備物，例如無菌可注射水性或油溶性懸浮液，可使用適當的分散劑或濕化劑及懸浮劑，依已知的技術配方。該無菌的可注射製備物也可為於無毒性的非口服可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射的溶液、懸浮液或乳液，例如為1,3-丁二醇的溶液。可採用的可接受的載體及溶液，有水、林格氏液、U.S.P.及等張的氯化鈉溶液。此外習知採用無菌、固定油為溶積或懸浮介質。為此用途，可使用溫和的固定油，包括單甘油酯或二甘油酯。此外脂肪酸例如油酸使用在製備可注射物。

該可注射的配方可以經滅菌，例如藉由通過細菌滯留濾器過濾，或藉由將殺菌劑鈉入無菌固體形式的組合物中，該組合物可於使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌的可注射介質中。

為了延長藥物的效果，常希望減慢藥物從皮下或肌肉內注射吸收的速率。此目的可藉由使用水溶液不佳的結晶或非晶質材料的懸浮液而達成。藥物吸收的速率因此會依存於其溶離速度，進而依存於結晶大小及結晶形式。或者，可藉由將藥物溶解或懸浮於油性載體而達到非口服投藥劑形的延緩吸收。可注射的貯池劑型，可藉由形成藥物的微膠囊基質於生物可分解性的高分子而製作，高分子例如聚丙交酯-聚乙交酯。取決於藥物對高分子的比例及該採用的特定高分子的天性，可以控制藥物釋放速率。其他生物可分解性高分子，例如：聚(原酸酯)及聚(酸酐)。貯池可注射配方也可藉由將藥物捕集於與體組織相容的微脂體或微乳劑而製備。

經直腸或陰道投予的組合物，較佳為栓劑，其可藉由將本發明化合物與適當的非刺激性賦形劑或載體例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合以製備，該等非刺激性賦形劑或載體在常溫為固體但於體溫為液體，因此會在直腸或陰道腔熔解並釋出該活性化合物。

口服投予用的固體劑型，包括膠囊、錠劑、藥丸、粉末及顆粒。於此等固體劑型，係將該活性化合物與至少一種鈍性的醫藥上可接受之賦形劑或擔體混合，該賦形劑或擔體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣及/或：a)填充劑或延展劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及矽酸；b)黏結劑，例如羧基甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖及亞拉伯膠(acacia)；c)保濕劑例如甘油；d)崩散劑，例如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或樹薯澱粉、藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；e)溶解減緩劑，例如石蠟；f)吸收促進劑，例如四級銨化合物；g)溼化劑，例如鯨蠟醇及甘油單硬脂酯；h)吸收劑，例如高嶺土及皂土黏土；及 i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉，及其混合物。於膠囊劑、錠劑及藥丸的情形，該劑型也可包含緩衝劑。

類似形態的固體組合物也可採用，使用如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇的賦形劑，填充於軟及硬明膠膠囊內。

錠劑、糖衣錠、膠囊、藥丸及顆粒的固體劑型可以製備成有包衣及殼，例如腸衣及其他包衣在醫藥配方技術領域係為人熟知的。其可選擇性地包含失透劑，且可為僅會或優先於腸道的某個部分選擇性地以延遲的方式釋出有效成分的組合物。可使用的包埋的組合物的例子，包括聚合性物質及蠟。

以局部或穿皮投予本發明化合物的劑型，包括乳膏、糊劑、乳霜、乳液、凝膠、粉末、溶液、噴劑、吸入劑或貼片。該活性成分係於無菌條件下與藥學上容許之載體及任何需要的保存劑或必要的緩衝劑混合。眼用配方、耳滴劑、眼藥膏、粉末及溶液也可在本發明範圍內加以考慮。

除了本發明的活性化合物，該乳膏、糊劑、乳霜及凝膠也可包含賦形劑例如動物油及蔬菜油、油、蠟、石蠟、澱粉、黃耆膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽酮、皂土、矽酸、滑石及氧化鋅，或其混合物。

除了本發明之化合物，粉末及噴劑也可包含賦形劑例如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末或此等物質的混合物。噴劑也可額外包括慣用的推進劑，例如氯氟烴。

穿皮貼片有提供將化合物以受控制的傳遞方式傳到身體的優點。此種劑型可藉由將化合物溶解或分散於適當的介質以製作。也可使用吸收增進劑以增加該化合物通過皮膚之量。速率可藉由提供速率控制膜或分散該化合物於聚合物基質或凝膠以控制。

為了以經肺傳遞，本發明的治療組合物係配方並對於病患以固體或液體微粒的形式直接投予(例如吸入到呼吸系)投予。製備以實施本發明的固體或液體微粒形式的化合物，包括可呼吸的大小的微粒：即微粒的尺寸足夠小以在吸入時能通過口及喉，並進入支氣管及肺的肺泡。氣溶膠化的治療物的傳遞，具體而言經氣溶膠化的抗生物的傳遞，係在該技術領域中已知的(見例如美國專利號5,767,068，VanDevanter et al.，美國專利號5,508,269，Smith et al.,，Montgomery之WO 98/43650，以上均納入於此當作參考)。於美國專利號6,014,969也可發現有關於抗生物的經肺傳遞的討論，納入於此當作參考。

本發明化合物之“治療上有效量”，係指該化合物之量以可應用於醫學治療的合理的效益/風險比，對於受治療的個體帶來療效。該療效可為客觀的(即，可由一些測試或標記測量)或主觀的(即，個體給予一效果的指示或感覺)。上述化合物的有效量，可從約0.1 mg/Kg至約500 mg/Kg的範圍，較佳為從約1至約50 mg/Kg的範圍。有效劑量也取決於投予路徑，以及可否與其他試劑一起使用。然應了解，該等化合物及本發明組合物的每日總用量，將由主治醫師在合理的醫學判斷的範圍內決定。對於特定病患的特定治療上有效的劑量水平，取決於許多因素，包括欲治療的病症，及該病症的嚴重程度；該採用的特定化合物的活性；採用的特定組合物；病患的年紀、體重、一般健康、性別及飲食；投予時間、投予路徑，及採用的特定化合物的吸收速率；治療的期間；與特定化合物一起組合或同時使用的藥物；以及該醫學領域為人熟知的可能因子。

對於人類或其他動物投予的本發明化合物的每日總劑量，以單一或分次的劑量的量，例如為0.01至50 mg/kg體重，或更常為0.1至25 mg/kg體重。單次投藥組合物可包括此種量或其次要的多重量以供每日的劑量。一般而言，依本發明的治療療法，包含每日以單次或多次投藥對於所需治療的病患投予約10 mg至約1000 mg的本發明化合物。

在此敘述的配方的該等化合物，可以經由注射、靜脈內、動脈內、真皮下、腹腔內、肌肉內或皮下投予；或口服、經頷、經鼻、穿黏膜、局部、以眼用製備物、或經由吸入投予，劑量為0.1至約500 mg/kg體重，或劑量介於1 mg與1000 mg/dose之間，每4至120小時，或依特定藥物的需求而定。在此的方法考量投予有效量的化合物或化合物組合物，以達成所望的或所述的效果。一般而言，本發明的醫藥組合物可以每日投予約1至約6次，或連續輸液。此種投予可使用為慢性或急性療法。取決於欲治療的主體及特定的投予模式，可以與醫藥上的賦形劑或擔體組合以生產單一劑型的有效成分的量。一般的製備物包括約5%至約95%活性化合物(w/w)。或，此等製備物可包括約20%至約80%的活性化合物。

可能需要比起上述引用的劑量更低或更高的劑量。對於任一特定病患的特別的劑量及治療療法，將取決於許多因素，包括採用的特別的化合物的活性、年紀、體重、一般健康狀態、性別、飲食、投予時間、分泌速率、藥物組合、該疾病的嚴重度及進程、狀況或症狀、該病患對於疾病、狀況或症狀的意向，及治療的醫師的判斷。

當病患的狀況改善，視需要可投予本發明化合物、組合物或組合的維持劑量。接著，投予的劑量或頻率或兩者可以因應症狀減少，當症狀減輕到所望的水平，可以保持改善的狀況在一水平。然而病患有時會需要在疾病症狀再發的時候進行長期性的間歇治療。

實施例

本發明的該等化合物及程序將由以下實施例更被了解，該等實施例係意欲僅作為例示，並非限制本發明範圍。對於揭示的具體例的各種改變及修飾，對於熟習該技術領域之人士乃明顯，且此等改變及修飾包括但不限定相關於本發明化學結構、取代基、衍生物、配方及/或方法，在不偏離本發明精神及附帶的申請專利範圍的範圍內可以進行。

化合物1及其甲烷磺酸鹽、鈉鹽、鉀鹽及氯鹽的製備，例示如下。

中間產物107-1或107-2可藉由使106與R-2-1或 R-2-2分別反應而製備。該合成R-2-1及R-2-2的合成方案，例示如下：

或另一替代方法：

中間產物108-1及108-2，可藉由107-1或107-2，與R-3-1或R-3-2的偶聯反應製備，其中R-3-1及R-3-2可依照以下方案製備：

實施例1：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4- 嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺(化合物1) 步驟a：(Z)-2-(乙氧基甲基)-3-甲氧基丙烯酸乙酯(化合物202)

將鈉(40.9 g,1.78 mol)小心地分次加到乙醇(750 mL)，將此溶液濃縮，於所有的鈉金屬消失後獲得NaOEt粉末。於攪拌狀態，添加己烷(1.0 L)，將該混合物以冰水浴冷卻。於0-5℃滴加201(130 g,0.89 mol)與甲酸乙酯(131 g,1.78 mol)的混合物。將反應混合物於室溫攪拌終夜。以冰水浴冷卻的狀態，滴加硫酸二甲酯(224 g,1.78 mol)。將獲得的混合物於50℃加熱2小時。於混合物添加三乙基氯化銨(122 g)及氫氧化鈉(20 g)。然後將混合物於於室溫攪拌4小時並過濾。將濾液以水洗滌，並以Na₂SO₄乾燥。濃縮以獲得標題化合物(140 g,37%)無色油，不經精製而使用在次一步驟。

步驟b：2-側氧基-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物203)

將化合物202(140 g,0.745 mol)、尿素(40.0 g,0.697 mol)及濃鹽酸(34 mL)於乙醇(500 mL)的混合物，加熱回流終夜。蒸發~50%體積的反應物後，將得到的懸浮液過濾，以少量乙醇洗滌，乾燥以獲得化合物203(47 g,37%)白色固體。LCMS：171[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)：δ 1.19(t,J=7.2 Hz,3H),3.92(s,2H),4.08(q,J=7.2 Hz,2H),7.0(s,1H),7.08(d,J=6.0 Hz,1H),8.83(d, br,J=4.8 Hz,1H)。

步驟c：2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物204)

於化合物203(47 g,280 mmol)的乙酸(500 mL)溶液，添加溴(49.0 g,307 mmol)。將混合物加熱回流2小時，冷卻至室溫，再於0-5℃冷卻並過濾，以獲得標題化合物204黃色固體(38 g,54%)。LCMS：169[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,D₂O)：δ 1.28(t,J=7.2 Hz,3H),4.32(q,J=7.2 Hz,2H),9.00(br,s,2H)。

步驟d：2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物R-2-1)

將化合物204(38.0 g,153 mmol)、磷醯三氯(300 mL)及N,N-二甲基苯胺(3 mL)的混合物加熱回流2小時，冷卻至室溫並濃縮。將殘渣小心的以冰水淬滅，以碳酸鈉調整pH至7-8，並以EtOAc萃取。將合併的有機層以冰水及鹵水洗滌，以Na₂SO₄乾燥，蒸發並以管柱層析純化(以EtOAc/己烷10%洗提)以獲得化合物R-2-1(15 g,52%)白色固體。LCMS：187[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)：δ 1.36(t,J=7.5 Hz,3H),4.39(q,J=7.5 Hz,2H),9.08(s,2H)。

步驟e：(Z)-2-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基-3-側氧基丙-1-烯-1-酸鈉(化合物206)

將NaH(27 g,60%於礦物油，0.675mol)於無水1,2-二甲氧基乙烷(300 mL)的混合物，加熱至40-50ºC，並滴加3,3-二甲氧基丙酸甲酯(205)(100 g,0.675 mol)。將獲得的混合物攪拌0.5小時，並於40-50ºC滴加甲酸甲酯(81 g,1.35mol)。將獲得的混合物在冷卻到0ºC之前於40-50ºC(內溫)攪拌2小時。將反應混合物緩慢回溫到25ºC，並攪拌終夜。添加Et2O(150 mL)，並攪拌30 min。將獲得的懸浮液過濾。將該固體以Et20(100mL)洗滌，收集並乾燥以獲得該標題化合物206(82 g,61%)灰白色固體。LCMS(m/z)：130.8[M+1]+.1HNMR(400 MHz,CD30D)：δ 3.36(s,6H),3.60(s,3H),5.34(s,1H),8.92(s,1H)。

步驟f：2-胺基-嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物207)

對於胍鹽酸鹽(42.2 g,0.44 mol)於DMF(300 mL)的混合物，添加化合物206(80 g,0.40 mol)。將獲得的混合物於100ºC加熱1小時。在反應混合物冷卻之前過濾。將濾餅以50 mL DMF過濾，將合併的濾液濃縮，將殘渣懸浮於冷EtOH，並以冷EtOH(50 mL)洗滌，以獲得該化合物207(38 g,61.5%)黃色固體。LCMS(m/z)：154.2[M+1]⁺,195.1[M+42]⁺。¹H NMR(400 MHz,CD₃OD)：δ 3.88(s,3H),8.77(s,2H)。

步驟g：2-氯嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物R-2-2)

將化合物207(7 g,0.046 mol)添加到濃鹽酸(15.2 mL)與CH2Cl2(60 mL)的混合物中。冷卻後，於15-20ºC添加ZnCl2(18.6 g,0.138 mol)。將該混合物於15-20ºC攪拌0.5 h，冷卻至5-10ºC。於維持內溫為5-10ºC的狀態，分次加入NaNO2(9.5 g,0.138 mol)。反應持續約~2小時。將反應混合物倒入冰水(50 mL)。分離有機層，將水相以CH2Cl2(30 mL*2)萃取。將合併的有機相萃取物濃縮，以獲得粗製產物(4.2 g)。將該粗製化合物懸浮於己烷(20 mL)，於60ºC加熱30分鐘並過濾。將濾液濃縮，以獲得該標題化合物R-2-2(3.5 g,44.4%)灰白色固體。LCMS(m/z)：214.1[M+42]+。1HNMR(400 MHz,CDCl3)：δ 4.00(s,3H),9.15(s,2H)。

步驟h：5-溴-2-甲氧基吡啶(化合物303)

將2-甲氧基-吡啶(100 g,0.92 mole)、NBS(180 g,1.0 mole)於乙腈(1.0L)的溶液，攪拌回流21小時。TLC顯示該反應完成。將反應混合物冷卻至室溫並濃縮。收集約~900ml溶劑。將獲得的懸浮液過濾，以正己烷洗滌(~400mL)。再次濃縮濾液，以獲得粗製產物。將該粗製產物於減壓狀態蒸餾(30℃/~0.3mmHg)以獲得該標題化合物澄清油(146 g,84%)。LCMS(m/z)：190.0[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)：δ 3.90(s,3H),6.65(d,J=8.8 Hz,1H),7.62(dd,J=8.8 Hz,2.4Hz,1H),8.19(s,1H)。

步驟i：6-甲氧基吡啶-3-基有機硼酸(boronic acid)(R-3-1)：

於化合物303(20 g,0.11 mole)於無水THF(180 ml)的溶液中，於-78℃滴加n-BuLi(59 mL,2M於THF)，將獲得的混合物攪拌1小時。於-78℃添加硼酸異丙酯(37mL)，將該反應混合物回溫到室溫，並持續攪拌終夜。TLC(己烷/乙酸乙酯=5：1)顯示反應完全。將反應物以4N HCl(90 ml)調整為pH 3-4。以過濾收集沉澱物，以獲得粗製化合物 R-3-1(21 g,128%)。將該粗製化合物R-3-1(21g)溶於水(200 ml)，將溶液以濃氨水調整為pH至8-9，以過濾收集沉澱物，以獲得純標題化合物R-3-1白色固體。(11 g,67%)。LCMS(m/z)：154.1[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.86(s,3H),6.76(d,J=8.4 Hz,1H),7.99(dd,J=8.4 Hz,2.0 Hz,1H),8.05(br,2H),8.52(d,J=2.0 Hz,1H)。

步驟j：2-甲氧基-5-(4,4,5,5，-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷(dioxaborolan)-2-基)吡啶(化合物R-3-2)

將化合物303(55 g,0.29 mol)、4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-雙(1,3,2-二氧雜硼烷)(90 g,0.35 mol)、乙酸鉀(57 g,0.58 mol)及雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(2.2 g,3 mmol)於無水二烷(500 mL)的混合物，於氮氣氛圍下於108℃加熱終夜。將反應混合物濃縮，以管柱層析，以己烷/乙酸乙酯洗提精製，以獲得標題化合物R-3-2(58 g,84%)。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 1.30(s,12H),3.88(s,3H),6.81(d,J=8.0 Hz,1H),7.88(dd,J=8.0 Hz,2.0Hz,1H),8.41(d,J=2.0Hz,1H)。

步驟k：噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物102)

尿素法：將3-胺基噻吩-2-羧酸甲酯(101)(90.0 g,573 mmol,1.0 eq)及尿素(277.6 g,4.6 mol,8.0 eq)的混合物，於190℃加熱3-4小時，並冷卻至室溫。對此反應混合物添加NaOH水溶液(10%,800 mL)。於常溫攪拌1 小時後，以過濾移除該固體。將濾液以HCl酸化成pH 3-4，以過濾收集沉澱的固體，以水洗滌，並於真空乾燥，以獲得所望產物化合物102灰白色固體(87 g,89%)。m.p.：280-285℃.LCMS(m/z)：169.0[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 6.92(d,J=5.2 Hz,1H),8.05(d,J=5.2 Hz,1H),11.0-11.5(br,2H)。

KOCN法：對於3-胺基噻吩-2-羧酸酯(101)(100.0 g,636.9 mmol,1.0 eq)、乙酸(705 mL)及水(600 mL)的混合物，緩慢地花1小時添加氰酸鉀(154.8 g,1.91 mol,3.0 eq)於水(326 mL)的溶液。將獲得的混合物於室溫攪拌20 小時，過濾並以水(500 mL)洗滌。將濾餅放入適當大小的反應器，添加2 M氫氧化鈉水溶液(1.65 L)，將漿體攪拌2 h，並以LCMS確認形成了所望產物。將該混合物冷卻至10℃，添加3 M鹽酸水溶液(1.29 L)直到pH=5.0~6.0.將漿體過濾，以水(700 mL)洗滌，於50℃在真空烘箱乾燥24小時，以獲得化合物102(100 g,94%)灰白色固體。LCMS(m/z)：169.1[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 6.92(d,J=5.2 Hz,1H),8.04(d,J=5.2 Hz,1H),11.14(s,1H),11.51(s,1H)。

步驟1：2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物103)

緩慢添加羥基氯化磷(152 mL,1.67 mol,7.0 eq)到冷的化合物102(40 g,238 mmol,1.0 eq)與N,N-二甲基苯胺(22.5 mL,179 mmol,0.75 eq)於乙腈(250 mL)的溶液，且維持溫度在20℃以下。然後將該混合物加熱到 85℃，攪拌24小時。將該反應混合物冷卻至15℃，緩慢導入冰及冷水(360 mL)的混合物上。過濾獲得的漿體，以冷水(200 mL)洗滌。將濾餅於真空烘箱於40℃乾燥24小時，以獲得化合物103(40.5 g,83%)灰白色固體。M.p.：245-250℃.LCMS(m/z)：205.0[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 7.75(d,J=5.2 Hz,1H),8.71(d,J=5.2 Hz,1H)。

步驟m：2-氯-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物104)

對於化合物103(34.2 g,167 mmol,1.0 eq)與甲醇(500 mL)之混合物緩慢添加嗎啉(31.2 mL,367 mmol,2.2 eq)。將該反應混合物於室溫攪拌終夜。以過濾收集沉澱物，以甲醇洗滌，並於真空乾燥以獲得所望產物化合物104淡黃色固體(39 g,91%)。M.p.：250-255℃.LCMS(m/z)：256.0[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.76(t,J=5.2 Hz,4H),3.92(t,J=5.2 Hz,4H),7.42(d,J=5.2 Hz,1H),8.32(d,J=5.2 Hz,1H)。

步驟n：2-氯-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲醛(化合物105)

對於化合物104(20 g,78.4 mmol,1.0 eq)於THF(無水，320 mL)的懸浮液，於-78℃於氮氣下緩慢添加n-BuLi(於己烷，2.4 M,40.8 mL,102 mmol,1.3 eq)。將獲得的漿液升溫到-60℃，並轉變為澄清的棕色溶液。將反應混合物再次冷卻至-78℃，緩慢添加DMF(無水，9.1 mL,118 mmol,1.5 eq)。將獲得的溶液於-78℃攪拌0.5小時，於1小時左右回溫到0℃，緩慢倒入到HCl水溶液(0.25 M,660 mL)與冰水(320 mL)的溶液。將該得到的漿體於0-10℃攪拌0.5小時，以冷水洗滌，並於真空中以獲得化合物105黃色固體(22 g,98%)。M.p.：260-265℃.LCMS(m/z)：284.0[M+1]^{+ 1}H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.77(t,J=5.2 Hz,4H),3.96(t,J=5.2 Hz,4H),8.30(s,1H),10.21(s,1H)。

步驟o：(2-氯-4-嗎啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-胺(化合物106)

對於化合物105(20.0 g,70.4 mmol,1.0 eq)於甲醇(125 mL)的溶液，於氮氣氛圍添加甲胺於甲醇(27% v/v,75 mL,563.2 mmol)的溶液。將該反應混合物於室溫攪拌終夜，將溶劑於真空中移除，獲得粗製固體產物，將其於氮氣下溶於甲醇(550 mL)及THF(220 mL)，分次加入硼氫化鈉(8g,211.2 mmol)，於室溫攪拌終夜。將反應混合物於真空中蒸發，加水(300 mL)。將水溶性混合物以二氯甲烷萃取，將合併的萃取物以Na₂SO₄乾燥並濃縮。將殘渣溶於6M HCl(230 mL)，攪拌30 min。將水溶液以二氯甲烷洗滌幾次，並以NaOH(4N)調整為pH 9-10。以過濾收集沉澱的固體，並乾燥(60℃,6h)，獲得淡黃色固體(18 g,85%)。M.p.：240-245℃.LCMS(m/z)：299[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 2.32(s,3H),3.74(t,J=5.2 Hz,4H),3.88(t,J=5.2 Hz,4H),3.96(s,2H),7.24(s,1H)。

步驟p(a)：2-[(2-氯-4-嗎啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-胺基]-嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物107-1)

對於106(10 g,33.6 mmol)及R-2-1(6.8 g,36.4 mmol)於CH₃CN(400 mL)的混合物於室溫添加二異丙基乙胺(220 mL,1.26 mol)。將獲得的混合物於室溫攪拌終夜。然後將該混合物蒸發然後添加二氯甲烷(300 mL)。將有機層以水洗滌，以Na₂SO₄乾燥，於真空中濃縮以留下殘渣。對於該殘渣添加乙酸乙酯，將獲得的混合物於冰/水浴溫度攪拌50 min。將獲得的固體以過濾收集，以獲得標題產物107-1白色固體(10.6 g,70%)。LCMS：449[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 1.30(t,J=7.2 Hz,3H),3.25(s,3H),3.71(t,J=5.2 Hz,4H),3.83(t,J=4.8 Hz,4H),4.29(m,2H),5.21(s,2H),7.39(s,1H),8.87(s,2H)。

步驟p(b)：2-[(2-氯-4-嗎啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-胺基]-嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物107-2)

將化合物106(25 g,84 mmol)、CH₃CN(500 mL)及R-2-2(16 g,92 mmol)於室溫攪拌。添加二異丙基乙胺(DIPEA)(500 mL,2.9 mol)。將該溶液攪拌終夜並且蒸發。添加二氯甲烷(500 mL)後，將有機相以水洗滌，以Na₂SO₄乾燥，並於真空中濃縮。對於此殘渣添加乙酸乙酯(200 mL)，並將該混合物於冰/水浴攪拌50 min。收集標題化合物為白色固體(29.4 g,81%)。LCMS(m/z)：435.2[M+1]^{+ 1}HNMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：3.25(s,3H),3.71(t,J=5.2 Hz,4H),3.82-3.84(m,7H),5.21(s,2H),7.39(s,1H), 8.87(s,2H)。

步驟q(a)：2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物108-1)

方法A：將化合物107-1(12 g,26.7 mmol)、R-3-1(4.9 g,32 mmol)、NaHCO₃(6.7 g,80.1 mmol)及雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(188 mg,0.267 mmol)於甲苯(80 ml)、乙醇(50 ml)及水(10 ml)的混合溶劑中的混合物，於108℃在氮氣氛圍加熱4.5小時。TLC顯示反應完成。然後將該反應混合物冷卻至室溫，加水(20 ml)。以過濾收集獲得的固體，然後懸浮於乙醇(100 mL)。將該懸浮液於室溫攪拌30分鐘並過濾。將收集的固體以乙醇清洗，於真空中乾燥，以獲得標題化合物108-1白色固體(10g,72%)。

方法B：將化合物107-1(1.5 g,3.34 mmol)、R-3-2(1.6 g,6.68 mmol)、NaHCO₃(0.84 g,10.0 mmol)及雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(118 mg,0.167 mmol)於甲苯(24 ml)、乙醇(15 ml)及水(3 ml)之混合溶劑中的混合物，於108℃在氮氣氛圍中加熱終夜。將該反應混合物於二氯甲烷與水之間分層。分離有機層，以鹵水洗滌，以Na₂SO₄乾燥，過濾，並於真空中乾燥，以獲得殘渣，將其以管柱層析精製(以己烷/乙酸乙酯洗滌)以獲得化合物108-1白色固體(1.7 g,98%)。

m.p.198-202℃。LCMS：522.30[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 1.31(t,J=7.2 Hz,3H),3.28(s,3H), 3.76(t,J=4.4 Hz,4H),3.93(t,J=4.4 Hz,4H),3.94(s,3H),4.30(q,J=7.2 Hz,2H),5.24(s,2H),6.92(d,J=8.8 Hz,1H),7.47(s,1H),8.57(dd,J=8.8 Hz,2.0Hz,1H),8.88(s,2H),9.15(d,J=2.0 Hz,1H)。

步驟q(b)：甲基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧酸酯(化合物108-2)

對於化合物107-2(20 g,46.0 mmol)、B-3-1(9.2 g,60.2 mmol,1.3 eq.)於二烷(540 mL)之混合物，於室溫添加固體NaHCO₃(11.6 g,138.1 mmol,3 eq.)，再加水(40 mL)。將該反應混合物藉由經由溶液表面通入氮氣以脫氣。然後添加雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(323 mg,0.46 mmol,0.01eq.)，將獲得的反應混合物於108℃加熱15小時。TLC與LCMS顯示反應完成。趁熱(>90℃)以矽藻土過濾該反應混合物，以二烷(70 mL)洗滌。將濾液逐漸冷卻到室溫，於冷卻期間產生了白色微小晶體。將該懸浮液過濾並以二烷(80 mL)洗滌以獲得標題化合物108-2白色固體(18g,78%)。LCMS(m/z)：508.3[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.28(s,3H),3.76(t,J=4.8 Hz,4H),3.82(s,3H)；3.92(m,4H),3.93(s,3H),5.20(s,2H),6.91(d,J=8.8Hz,1H),7.47(s,1H),8.57(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,1H),8.88(s,2H),9.15(d,J=2.0Hz,1H)。

步驟r：N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺(化合物1) 製備羥基胺甲醇溶液

將NH₂OH.HCl(80 g,1.12 mol)於MeOH(400 mL)的混合物於60-65℃加熱1小時以形成澄清溶液。然後於冰-水浴中冷卻。對此冷的混合物滴加KOH(96 g,1.68 mol)於MeOH(240 mL)之溶液，同時維持該反應溫度為0-10℃。將獲得的混合物於0℃攪拌30分鐘，然後於填充有無水Na₂SO₄(700 g)的恆壓漏斗過濾。於冰浴下收集該濾液，並保存在冰箱供未來使用。

從化合物108-1製備化合物1

將化合物108-1(10 g,19 mmol)懸浮於上述新鮮製備的羥基胺甲醇溶液(1.79M,350 ml)。對於此混合物添加二氯甲烷(100 mL)。將反應燒瓶密封，將該混合物於變成澄清溶液前於室溫攪拌5小時。再攪拌9小時，過濾移除任何不溶的固體。藉由添加乙酸調整濾液的pH為6-7，以形成固體沉澱。以過濾收集該固體，並以水與少量甲醇洗滌，於真空中於60℃乾燥5小時以獲得化合物1白色固體(9.2g,96%)。m.p.177-180℃.LCMS：509.3[M+1]⁺。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.24(s,3H),3.76(t,J=5 Hz,4H),3.92(t,J=5 Hz,4H),3.92(s,3H),5.20(s,2H),6.90(d,J=8.8 Hz,1H),7.44(s,1H),8.57(dd,J=8.8 Hz,2.4Hz,1H),8.75(s,2H),9.01(s,1H),9.14(d,J=2.0 Hz,1H),11.08(s,1H)。

從化合物108-2製備化合物1

對於化合物108-2(31 g,61.1 mmol)於二氯甲烷(310 mL)之懸浮液，於室溫添加上述新鮮製備的羥基胺甲醇溶液(1.79M,744 ml)。將該反應燒瓶密封，將該反應混合物於室溫攪拌5小時。反應混合物變成澄清溶液。將該反應溶液過濾以移去任何不溶固體。然後於此濾液加水(310 mL)，於添加時無固體形成。於攪拌下添加乙酸(18.5 mL)以調整pH為10.20(持續以pH計監控)。於乙酸添加時無內溫變化。將該反應混合物再持續攪拌4小時。逐漸形成白色固體。過濾該懸浮液，並以少量甲醇清洗(100mL x 3)。將收集的白色固體再懸浮於甲醇(620mL)及水(124mL)以形成懸浮液。對於上述懸浮液添加額外的乙酸(11g)，以調整pH為5-6。觀察到該固體形式有所改變。將該懸浮液持續再攪拌2小時，以濾紙過濾，並以少量甲醇(100 mL x 3)洗滌。將收集的白色固體於烘箱乾燥(50℃)12小時以獲得該標題化合物1白色固體(23.6g,76.0%)。m.p.：255-259℃。LCMS(m/z)：509.3[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.24(s,3H),3.76(t,J=5.2 Hz,4H),3.92(t,J=5.2Hz,4H),3.92(s,3H),5.20(s,2H),6.91(d,J=8.4Hz,1H),7.45(s,1H),8.57(dd,J=8.4Hz,2.4Hz,1H),8.75(s,2H),9.07(s,1H),9.14(d,J=2.4Hz,1H),11.14(s,1H)。

實施例2：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺甲烷磺酸酯(化合物2)

方法A：對於化合物1(300 mg,0.59 mmol)與MeOH/Et₂O(3/1,40mL)之混合物，於0℃添加甲烷磺酸(114 mg,1.18 mmol)於MeOH(3 mL)之溶液。將獲得的混合物於0℃攪拌3小時。以過濾收集沉澱，以Et₂O洗滌以獲得化合物2白色固體(260 mg,73%)。

方法B：對於化合物1(1.5 g,2.95 mmol)於二氯甲烷/MeOH(40 mL/10 mL)的懸浮液於室溫(15ºC)添加甲烷磺酸(341 mg,3.55 mmol)於2 mL MeOH以形成澄清溶液。將該反應混合物於室溫攪拌終夜。該反應混合物仍為澄清。對於該混合物添加乙酸乙酯(40mL)，持續於室溫攪拌3小時。以過濾收集獲得的沉澱，以獲得化合物2白色固體(1.45g,83%)。

m.p.：179-185℃.LCMS：509.3[M+1]^{+ 1}H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 2.35(s,3H),3.26(s,3H),3.78(t,J=9.6 Hz,4H),3.95(s,3H),4.03(t,J=9.2 Hz,4H),5.24(s,2H),6.99(d,J=8.8 Hz,1H),7.50(s,1H),8.54(dd,J=8.8 Hz,2.4 Hz,1H),8.76(s,2H),9.12(d,J=2.4 Hz,1H),11.11(br,1H)。

實施例3：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺鈉鹽(化合物3)

對於化合物1(300 mg,0.59 mmol)於甲醇(30 mL)之懸浮液，於0℃緩慢添加t-BuONa(85 mg,0.88 mmol)。將獲得的反應物回溫到室溫，持續攪拌2小時。將反應物濃縮，將殘渣磨碎(triturate)，以乙酸洗滌並過濾以獲得化合物3白色固體(230 mg,73%)。m.p.：178-183℃.LCMS：509.3[M+1]⁺.¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.17(s,3H),3.75(s,4H),3.92(s,7H),5.16(s,2H),6.90(d,J=8.4 Hz,1H),7.42(s,1H),8.57(d,J=8.0 Hz,1H),8.65(s,2H),9.14(s,1H)。

實施例4：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺鉀鹽(化合物4)

對於化合物1(400 mg,0.78 mmol)於甲醇(50 mL)之混合物於0℃在N₂氛圍添加t-BuOK(132 mg,1.17 mmol)。將該反應物於0℃攪拌1小時，並持續於室溫攪拌1.5小時。以過濾移去不溶固體，並將濾液冷卻至-20℃。對於該濾液添加Et₂O(100 mL)。將獲得的混合物於-20℃攪拌1小時。添加己烷(70 mL)，將該混合物持續於-20℃攪拌2小時。以過濾收集該固體，於真空中乾燥以獲得化合物4白色固體(150 mg,35%)。m.p.：174-179℃.LCMS：509.3[M+1]^{+ 1}H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.16(s,3H),3.74-3.76(m,4H),3.90-3.93(m,7H),5.15(s,2H),6.90(d,J=8.4Hz,1H),7.43(s,1H),8.39(br,1H),8.58(d,J=8.8Hz,1H),8.62(s,2H),9.15(s,1H)。

實施例5：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺氯鹽(化合物5)

對於化合物1(200 mg,0.39 mmol)於DCM/MeOH(60 mL/12 mL)的溶液，添加氫氧化膽鹼(106 mg,0.39 mmol,45%於MeOH)。將該混合物於室溫攪拌2小時，然後濃縮以去除~30 mL的溶劑。添加乙酸乙酯(60 mL)，將該混合物於於室溫攪拌2小時。發生小量沉澱後，將該混合物濃縮以移去~40 mL的溶劑，並再添加乙酸乙酯(60 mL)。將該混合物於室溫攪拌2小時，並過濾以獲得化合物5白色固體(180 mg,76%)。m.p.：181-185℃.LCMS：509.3[M+1]^{+ 1}H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ 3.11(s,9H),3.17(s,3H),3.40(t,J=4.8Hz,2H),3.75(t,J=4.8Hz,4H),3.84(br,2H),3.90-3.93(m,7H),5.15(s,2H),6.89(d,J=8.8Hz,1H),7.41(s,1H),8.57(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,1H),8.64(s,2H),9.14(d,J=2.0Hz,1H)。

實施例6：製備N-羥基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-嗎啉并噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)胺基)嘧啶-5-羧醯胺硫酸鹽(化合物6)

對於化合物1(200 mg,0.39 mmol)於DCM/MeOH(30 mL/7.5 mL)之懸浮液添加硫酸(77 mg,0.79 mmol，於1 mL MeOH)以形成澄清溶液。將該反應混合物於室溫攪拌終夜。發生沉澱，然後添加第三丁基甲醚(60 mL)。將該反應混合物於室溫持續攪拌1小時。以過濾收集該固體以獲得化合物6白色固體(180 mg,76%)。M.p.：243-246℃.LCMS：509.3[M+1]^{+ 1}H NMR(400 MHz,DMSO-d₆)：δ 3.26(s,3H),3.78(t,J=4.8 Hz,4H),3.96(s,3H),4.03(t,J=4.4 Hz,4H),5.24(s,3H),6.98(d,J=8.4 Hz,1H),7.50(s,1H),8.54(dd,J=8.8 Hz,2.4 Hz,1H),8.76(s,2H),9.12(d,J=2.0 Hz,1H),11.06(br,1H)。

實施例7：PI3激酶活性分析

以下分析係用於決定化合物1抑制PI3K之各種同功異構型及突變體的能力。

PI3K α

PI3K α活性係使用ADP-Glo發光激酶試驗測量。將P13K α、N端GST標籤化重組人類全長p110 α及未標籤化的重組全長人類p85 α的複合體，一起於受桿狀病毒感染的Sf9細胞表現系中共同表現。(GenBank存取號，p110 α：U79143；p85 α：XM_043865)。該蛋白使用谷胱甘肽瓊脂以單步驟親和性層析精製。實施競爭試驗以測量於存在經過精製的PI3K α(p110 α/p85 α)及PIP2A中，從ATP產生的ADP量。將PI3K α與20 μM PIP2基質，一起於反應緩衝液(50 mM HEPES,pH 7.4,150 mM NaCl,5 mM MgCl2,3 uM Naorthovanadate,1 mM DTT,10 μM超純ATP及0.5% DMSO)中於30℃溫育30分鐘。然後以ADP-Glo試驗法測量反應中產生的ADP。此試驗法以兩步驟實施；首先將等體積的ADP-GLO^TM Reagent(Promega)加入，以中止激酶反應，並且耗盡殘餘的ATP。於第二步驟，添加激酶檢測試劑，其會同時轉換ADP為ATP。使用偶合的luciferase/luciferin反應測量新合成的ATP。於此試驗法中決定的化合物1的IC₅₀少於100 nM。

也利用上述一般程序決定化合物1抑制PI3K α變異體H1047R及E545K的能力。所決定的兩突變體的IC₅₀少於100 nm。

PI3K β

PI3K β的活性，係利用均勻時間解析螢光(homogenous time resolved fluorescence(HTRF))技術，使用時間解析螢光共振轉移(TR-FRET)試驗法決定。將P13K β、N端組胺酸標籤化重組全長人類p110β及未標籤化的重組全長人類p85 α複合體，於受桿狀病毒感染的Sf21細胞表現系中共同表現。(GenBank存取號，p110β：NM_006219；p85α：XM_043865)。使用谷胱甘肽以單步驟親和性親和精製該蛋白質。實施競爭試驗，以測量於經過精製的重組PI3Kbeta(p110 β/p85 α)存在之下，從PIP2產生的PIP3的量。將PI3K β與10 μM PIP2基質在反應緩衝液(20 mM HEPES,pH 7.5,10 mM NaCl,4 mM MgCl₂,2 mM DTT,10 μM ATP and 1% DMSO)中於30℃溫育30分鐘。然後將反應產物與PIP3檢測子蛋白、銪標定的抗體、生物素標定的PIP3探針及異藻藍素(allophycocyanin)標定的鏈黴親合素(Streptavidin)混合。形成了感測物複合物，以於該反應混合物中產生一穩定TR-FRET信號。該信號的強度隨著結合於PIP3檢測劑的經生物素標定的探針取代為由於生物活性而產生的PIP3而減少，且該混合物中的未結合的生物素標定的PIP3探針的量增加。TR-FRET信號係使用微平盤讀取儀並減去背景值後決定。

在本試驗法中決定的化合物1的IC₅₀介於100與1000 nM之間。

PI3K δ

PI3K δ的活性係使用螢光極化法測量。將P13K δ、N端組胺酸標籤化全長人類p110 δ以及未標籤化的重組人類p85 α的複合體，於受桿狀病毒感染的Sf9細胞中共同表現。(GenBank存取號，p110 δ：NM_005026)。將該蛋白使用谷胱甘肽以單步驟親和層析精製。實施競爭試驗，以測量於存在經純化的重組PI3K δ(p110 δ/p85 α)存在之下從PIP2產生的PIP3的量。將PI3K δ與在反應緩衝液(20 mM HEPES(pH 7.5),10 mM NaCl,4 mM MgCl₂,2 mM DTT,10 μM ATP及1% DMSO)中的10 μM PIP2基質一起於30℃溫育1小時。然後將反應產物與PIP3偵測劑蛋白質以及該螢光PIP3探針混合。極化(mP)值隨著結合於PIP3偵測劑的螢光探針取代為由於酵素活性產生的PIP3而減少，且混合物中的未結合的螢光探針的量增加。極化程度(mP)值，係使用微平盤讀取儀減去背景值決定。

於本試驗決定的化合物1的IC₅₀低於100 nM。

PI3K γ

PI3K γ的活性，係利用均勻時間解析螢光(homogenous time resolved fluorescence(HTRF))技術，使用時間解析螢光共振轉移(TR-FRET)試驗法決定。使N端組胺酸標籤化人類P13K δ於受桿狀病毒感染的Sf9細胞表現系中表現。(GenBank存取號AF327656)。使用谷胱甘肽以單步驟親和性親和精製該蛋白質。實施競爭試驗，以測量於經過精製的重組PI3K γ(p120 γ)存在之下，從PIP2產生的PIP3的量。將PI3K β與10 μM PIP2基質在反應緩衝液(20 mM HEPES,pH 7.5,10 mM NaCl,4 mM MgCl₂,2 mM DTT,10 μM ATP及1% DMSO)中於30℃溫育30分鐘。然後將反應產物與PIP3檢測子蛋白、銪標定的抗體、生物素標定的PIP3探針及異藻藍素(allophycocyanin)標定的鏈黴親合素(Streptavidin)混合。形成了感測物複合物，以於該反應混合物中產生一穩定TR-FRET信號。該信號的強度隨著結合於PIP3檢測劑的經生物素標定的探針取代為由於生物活性而產生的PIP3而減少，且該混合物中的未結合的生物素標定的PIP3探針的量增加。TR-FRET信號係使用微平盤讀取儀並減去背景值後決定。在本試驗法中決定的化合物1的IC₅₀介於100與1000 nM之間。

實施例8：HDAC活性分析

HDAC抑制性活性係使用Biomol Color de Lys系分析(AK-500,Biomol,Plymouth Meeting,PA)。簡言之，使用HeLa細胞核萃取物當作HDAC的來源。將不同濃度的測試化合物於二甲基亞碸(DMSO)中系列稀釋，並於存在呈色性人造基質之下添加到HeLa細胞核萃取物。最終的狀態包括50 mM Tris/Cl、pH 8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl及1 mM MgCl₂。反應在添加終止用顯影劑之前於室溫(25℃)進行1小時。於WALLAC Victor II 1420微平盤讀取儀以螢光強度(激發波長：350-380 nm；發射波長：440-460 nm) 測量相對酵素活性。資料使用有sigmoidal劑量回應曲線擬合的GraphPad Prism(v4.0a)，針對計算IC₅₀進行分析。於此試驗法決定的化合物1的IC₅₀低於100 nM。

決定了對於HDAC同型(isotype)的化合物1的活性。HDAC專一性係於BPS Bioscience(San Diego,CA)，依照其標準操作程序實施。簡言之，使經純化的有標記(flag)的-(人類HDAC-1)、NCOR2-(人類HDAC3)、GST-(人類HDAC4、6、7、10及11)或His-(人類HDAC 2、5、8及9)標籤化的酵素在Sf9昆蟲細胞表現，並於使用前精製。用於HDAC1、2、3、6、7、8、9及11的基質為BPS Bioscience開發的HDAC基質3。針對其他HDAC酵素，使用HDAC第2a類基質。所有的酵素反應係於37ºC進行30分鐘二重複，例外是HDAC11酵素分析，其是在室溫進行3小時。

下表顯示各HDAC1-11的結果，IC50值以如下方式提供：I>1000 nM；100 nM<II<1000 nM；10 nM<III<100 nM；IV<10 nM。

實施例9：細胞增殖分析

人類癌細胞株從美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)購買，並於有提供者建議的培養基的96井圓底平盤上以每井5,000至 10,000個細胞的量接種。然後將該細胞與各濃度的化合物一起於補充0.5%(v/v)胎牛血清(FBS)的培養基中溫育72小時。生長抑制性係使用Promega cell Titer-Glo套組，以三磷酸腺苷(ATP)含量試驗得知。Promega cell Titer-Glo套組為一基於螢火蟲發光酶(firefly luciferase)的ATP監控系統。簡言之，將16μl的哺乳細胞溶解物及基質溶液以每井84μl的培養基添加以溶解細胞，並穩定ATP。將該混合物振盪及溫育30分鐘，然後測量發光。IC₅₀值，係使用有sigmoidal劑量回應曲線擬合的PRISM軟體(GraphPad Software)計算。

表1顯示於化合物1及參考化合物SAHA、GDC-0941，及SAHA與GDC-0941的組合的細胞系試驗法中的抗增殖活性。於此等試驗法使用以下的分級：IC₅₀I>10,000 nM，10,000 nM≧II≧1000 nM，1000 nM>III≧100 nM，100 nM>IV≧10 nM，及V<10 nm。

實施例10：化合物1之配方 a.化合物1於30% Captisol(10 mg/mL)：

於包含化合物1(10 mg)的小玻璃瓶中添加30% Captisol(0.937 ml)。將該混合物超音波振盪2 min。於該混合物添加氫氧化鈉(1 N,39.3 μl,2 eq.)，並且超音波振盪/旋渦振動(vortex)以得澄清溶液(pH=12)。然後將該溶液以鹽酸(1 N,23.6 μl,1.2 eq.)調整為pH=10。

b.化合物1於30% Captisol(7.5 mg/mL)：

於包含化合物1(7.5 mg)的小玻璃瓶中添加30% Captisol(0.941 ml)。將該混合物超音波振盪2 min。於該混合物添加氫氧化鈉(1 N,29.5 μl,2 eq.)，並且超音波振盪/旋渦振動(vortex)以得澄清溶液(pH=12)。然後將該溶液以鹽酸(1 N,29.5 μl,2 eq.)調整為pH=5。

c.化合物1於C10/PEG1450/PEG400(5 mg/mL)：

於包含化合物1(5 mg)、癸酸鈉(20 mg)、PEG400(40 μl)、及PEG1450(40 mg)的小玻璃瓶中，添加H₂O(0.88 ml)及NaOH(1 N,24.6 μl,2.5 eq.)。將該混合物超音波振盪及渦流振動以得澄清溶液，然後以HCl(1 N,7.4 μl,0.75 eq.)調整為pH=10。

實施例11：於罹患腫瘤的小鼠中的藥物動力學(Pharmacokinetics)及藥物效力學(Pharmacodynamics)的探討罹患H2122腫瘤的裸小鼠

使用罹患H2122(人類非小細胞肺癌細胞株)異體移植腫瘤的裸小鼠供藥物動力學研究。將化合物1與癸酸鈉及PEG400(5 mg/ml)於水配方，並對各隻動物以50 mg/kg的劑量經胃管以口服(PO)投予。於化合物投予後的不同時點，於各時點將3隻小鼠以CO₂使安樂死，並收集血液及腫瘤組織。將血液收集在包含肝素鈉的管中。以離心分離血漿。將血漿及組織保存於-80℃供之後的分析。使用PE Sciex API-3000 LC-MS/MS系(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)分析血漿及腫瘤組織中的化合物濃度。

探討結果整理於圖1及下表2。圖1為在口服投予之後，血漿及腫瘤組織中的化合物1對時間的變化。結果顯示化合物1優先累積於腫瘤組織。此現象由表3的結果所支持，其顯示在腫瘤組織比起在血漿中有顯著較長的化合物1的半衰期，且腫瘤對於化合物1的暴露顯著較多(AUC)。

罹患Daudi腫瘤的SCID小鼠

將Daudi(非-Hodgkin氏淋巴瘤細胞株)細胞植入雌性Scid(嚴重複合型免疫不全)小鼠。建立腫瘤後，對於動物以口服方式，以胃管投藥25、50或100 mg/kg化合物1，該化合物於30% Captisol、pH 10各以濃度1.875、3.75或7.5 mg/mL配方。

在化合物投予後的各時點，將3隻小鼠以CO₂安樂死，收集血液及腫瘤組織。將收集收集到含肝素鈉的管中。以離心分離血漿。將血漿及組織於-80℃保存以供以後分析。使用PE Sciex API-3000 LC-MS/MS system(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)分析血漿中的化合物濃度。

研究結果整理於圖2A、2B及2C以及下表3。圖2A係口服投予後，在血漿中的化合物1濃度對於時間的變化圖，顯示對該化合物有藥量依存的暴露。圖2B為在口服投予後，在腫瘤組織中的化合物1濃度對時間的變化圖。結果顯示化合物1以劑量依存方式優先累積於腫瘤組織。於圖2C比較投藥100 mg/kg後，於血漿以及腫瘤濃度，顯示腫瘤組織會優先攝取化合物1。此現象由表3的結果所支持，其顯示在腫瘤組織中比起在血漿中的化合物1半衰期顯著較長，並且在腫瘤組織對於化合物1的暴露顯著較高(AUC)。

藥效動力學(Pharmacodynamics)

收集腫瘤以供以單一劑量的化合物1於25 mg/Kg、50 mg/kg及100mg/kg治療後的PD評估。使用Tissuelyser(Qiagen,Valencia,CA)依製造商指示從腫瘤組織萃取蛋白質。例行地使用30ug蛋白質於如上述WB分析。將細胞溶解物再溶解於NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)之上，並且轉移到硝基纖維素膜(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。將該等點墨物以各種不同的初級抗體於4℃進行探查(probe)終夜。對各試驗法使用 GAPDH(甘油醛3-磷酸去氫酶，1：30,000,Abcam,Cambridge,MA)當作內部對照。然後將膜以紅外光標定的二級抗體(1：10000)結合之-IR Dye-800(Rockland Immunochemicals,Inc.Gilbertsville,PA)或結合之-Alexa 680(Invitrogen)一起溫育。使用Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor Biotechnology,Lincoln,NE)將膜造影。

該研究的結果如圖3，其呈現從3組劑量獲得之腫瘤萃取物的西方點墨圖。此等結果顯示化合物1抑制PI3K-AKT-mTOR路徑，壓抑RAF-MEK-ERK路徑，下調RTK蛋白質水平，及上調腫瘤壓抑子(suppressor)p53及p21水平。

實施例12：於犬之藥動學探討

也實施化合物1於米格魯犬的藥動學探討，使用靜脈內投予5 mg/kg水溶液其含癸酸鈉/PEG400(5 mg/ml)，以及口服投予5 mg/kg含癸酸鈉/PEG4000/PEG1450(pH 10)的腸膠囊。於各種時間點收集血漿，並且以LC-MS/MS分析化合物1的濃度。探討的結果如圖4及下表4。圖4為針對口服及靜脈內投藥的血漿濃度對時間的變化圖。經由口服投藥達到化合物1的顯著血漿水平。

實施例13：於大鼠之藥動學探討

本探討的目的在於決定於雄性Sprague-Dawley大鼠中，口服投予化合物1之後的化合物1的血漿藥動學。

將化合物1溶於30% Captisol於水，以獲得名目濃度10 mg/mL(pH=10)供口服投予。將獲得的澄清黃色溶液保存於室溫直到投藥。

將得自Charles River Laboratories的3隻雄性Sprague-Dawley大鼠使用於此探討。在本探討的活體部分提供任食的得自Research Diets Inc.的高脂肪飼食(VHFD,D12492i)。將化合物1經由單一口服(PO)胃管，以20 mg/kg的劑量投予。

於投藥後0.25、0.5、1、3、6及24小時後，從尾靜脈收集血液樣本(體積約150 μL)。將血液樣本放入含肝素鈉的管子，並於8000 rpm於4℃離心6分鐘，以從樣本分離血漿。離心之後，將獲得的血漿移到清潔的試管，並於-80℃冷凍保存，等待生物分析。

使用PE Sciex API-3000 LC-MS/MS系(PE-Sciex.,Foster City,CA)，決定血漿樣本中的化合物1及其初級代謝物的濃度。

藥動學參數係從受試個體的平均濃度時間資料決定。使用WINNONLIN^® Professional 5.2.的區隔的模型化，以計算參數。在定量極限以下(定量下限=1 ng/mL)，在計算各動物中的參數時忽略不計。

在口服投予化合物1後，化合物1的C_max及T_max的平均值各為39.5 μg/L及0.1 hr。AUC_(0-∞)的平均值為163.6 μg/L*hr。半衰值(T_½)為11.7 hr。

實施例14：於異體移植腫瘤模型評估化合物1 A. SU-DHL4、H2122、Daudi及OPM2異體移植腫瘤模型

將SU-DDHL4(擴散大B細胞淋巴瘤細胞株)、H2122(人類NSCLC細胞株)、Daudi(非Hodgkin氏淋巴瘤細胞株)及OPM2(多發性骨髓瘤腫瘤細胞株)細胞植入裸小鼠或Scid(嚴重複合型免疫不全)小鼠。在腫瘤建立後，將罹有足夠大小的腫瘤的動物隨機指定為活性組(化合物1)及控制組(載體(vehicle))。化合物1於實施例7(b)配方為口服投予，並基於各動物的體積，以胃管口服傳遞。對照組使用如同對應的活性組的相同投藥程序，以載體處理。

H2122腫瘤組(裸小鼠)，開始時每天2次接受化合物1劑量75 mg/kg，然後由於在75 mg/Kg的劑量有體重減輕，從第11天起每天2次，每週5天投藥50 mg/Kg。於一探討中，Daudi腫瘤組(Scid小鼠)每週5天接受化合物1，劑量25、50或100 mg/Kg。於另一探討，Daudi腫瘤組每天2次，每週5天投藥50 mg/Kg。於另一探討，將於Daudi腫瘤模型口服投予化合物1的效力與口服GDC-0941及口服vorinostat單獨比較，及組合比較。OPM2腫瘤組每天2次，一週5天接受化合物1，劑量50 mg/kg。SU-DHL4腫瘤組，以口服投藥100 mg/Kg，或以靜脈內投藥50 mg/Kg。

於探討的期間，使用電子卡尺測量腫瘤，並且每週2次測量體重。下式用於計算腫瘤體積：腫瘤體積=(長度X寬度²)/2

腫瘤體積的變化百分比，用於敘述在治療期間的化合物活性。

研究的結果整理於圖5A至5C，及圖9至12，其顯示針對各種腫瘤類型的活性組及對照組的腫瘤大小對時間的變化。圖5A、5B、5C及12顯示化合物1在H2122、Daudi及OPM2腫瘤模型有效。如圖9，化合物1以劑量依存方式抑制腫瘤生長。圖10比較化合物1劑量100 mg/Kg以及GDC-0941或vorinostat單獨或組合時的抗腫瘤活性。顯示的劑量是各治療的最大寬容劑量(MTD)，且治療前的腫瘤大小為157±65 mm³(mean±SE)。資料顯示化合物1比起vorinostat、GDC-0941或兩者的組合有效。最後，於以靜脈內(IV)投予50 mg/kg或口服(PO)投予100 mg/kg的化合物1後，於SU-DHL4擴散大B細胞淋巴瘤異體移植模型中，強烈抑制腫瘤生長(圖11)。治療前的腫瘤大小為147±21 mm³。

MM1S異體移植模型

將4週大的雌性SCID/Beige小鼠，於受控制的氣候下，養在通氣的小型隔離籠(INNOCAGE®IVC,Innovive Inc.,San Diego,CA)，使任食無菌的高脂肪飼食(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。將所有SCID/Beige用的籠舍及補給品，在使用前先以高壓蒸氣滅菌。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩 (針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

MM1S人類MM細胞(Goldman-Leikin RE,et al.,J Lab Clin Invest.1980；113：335-345)係來自多發型骨髓瘤病患的周邊血液。將冷凍保存的細胞於37℃水浴中解凍，並且於RPMI培養基+10%胎牛血清(FBS)中，5% CO₂的組織培養箱中培養。將細胞送到外部供應商檢查污染物及囓齒類的病原篩檢，以排除黴漿菌血漿(利用PCR)及/或病毒(利用MAP試驗，Mouse Antibody Production)的污染。當培養物中的細胞足夠植入，將其以無血清的Hank氏平衡鹽溶液洗滌(HBSS)。最後，將該細胞於HBSS中稀釋供植入。只使用多於90%存活率(利用台盼(trypan)藍排除法)的單一細胞懸浮液在注射，並且於最少7天的適應期後，使用1CC針筒及26G皮下注射器，小心避開血管，在小鼠的右側的後脅腹以皮下注射每隻動物2000萬個細胞懸浮於0.2 ml HBSS的注射液。如果在皮膚下出現形成圓形的質量，則代表已成功植入。每日對該已植入的小鼠監控一般健康情形及腫瘤發展。

在植入後的約2週，可檢測到腫瘤。以卡尺測量腫瘤大小。下式係用於計算腫瘤體積：腫瘤體積=(長度X寬度²)/2

腫瘤植入3週後，腫瘤達到平均194.6±37.9 mm³。腫瘤大小及形狀可接受的動物使用排序軟體，隨機指定給各8隻動物的2個群組，一組為載體控制組，一組為治療組。

將化合物1以如下配方及投藥：將7.5 mg/ml溶於30% Captisol+2當量的NaOH及HCl，並以口服胃管，依據各小鼠的體重，每日投藥，每週5天。控制組使用相同的投藥典範，以載體(30% Captisol)投藥。

在各動物探討時，以卡尺測量腫瘤，以上式決定腫瘤大小，並計算腫瘤大小的變化百分比。每週以體重計測量小鼠體重。研究持續進行直到：a)研究設計預定的最後日期；或b)發生健康問題，以兩者先發生者為準。此外，由以下腫瘤相關參數當作安樂死的依據：(1)腫瘤載重超過2500 mm³及/或(2)減少20%的起始體重。除了決定腫瘤大小的變化，最後的腫瘤測量值係使用於產生腫瘤重量改變比(T/C值)，其係由國家癌症研究機構(NCI)發展的標準公制，用來當作異體移植腫瘤評估T/C值，其係使用下式計算：% T/C=100 x△T/△C，若△T>0。若腫瘤發生退化(regression)，使用下式：% T/T₀=100 x△T/T0，若△T<0。

治療期間為15天。於本研究的最後一天，再次測量腫瘤大小及體重。

如圖13，於MM1S皮下性腫瘤模型，化合物1單一試劑抑制腫瘤生長。該T/C值據計算，基於第14天，為27.37%(p<0.0001,ANOVA)。於化合物1單一試劑治療組，未觀察到體重減輕或其他的副作用。

MM1R異體移植模型

將4週大的雌性SCID/Beige小鼠，於受控制的氣候下，養在通氣的小型隔離籠(INNOCAGE®IVC,Innovive Inc.,San Diego,CA)，使任食無菌的高脂肪飼食(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。將所有SCID/Beige用的籠舍及補給品，在使用前先以高壓蒸氣滅菌。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩(針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

MM1 R人類MM細胞(Goldman-Leikin RE,et al.,J Lab Clin Invest.1980；113：335-345)係來自多發型骨髓瘤病患的周邊血液。將冷凍保存的細胞於37℃水浴中解凍，並且於RPMI培養基+10%胎牛血清(FBS)中，5% CO₂的組織培養箱中培養。將細胞送到外部供應商檢查污染物及囓齒類的病原篩檢，以排除黴漿菌血漿(利用PCR)及/或病毒(利用MAP試驗，Mouse Antibody Production)的污染。當培養物中的細胞足夠植入，將其以無血清的Hank氏平衡鹽溶液洗滌(HBSS)。最後，將該細胞於HBSS中稀釋供植入。只使用多於90%存活率(利用台盼(trypan)藍排除法)的單一細胞懸浮液在注射，並且於最少7天的適應期後，使用1CC針筒及26G皮下注射器，小心避開血管，在小鼠的右側的後脅腹以皮下注射每隻動物1000萬個細胞懸浮於0.1 ml HBSS的注射液。如果在皮膚下出現形成圓形的質量，則代表已成功植入。每日對該已植入的小鼠監控一般健康情形及腫瘤發展。

腫瘤植入3週後，腫瘤達到平均131.7±28.7 mm³。腫瘤大小及形狀可接受的動物使用排序軟體，隨機指定給各8隻動物的2個群組，一組為載體控制組，一組為治療組。

在各動物探討時，以卡尺測量腫瘤，以上式決定腫瘤大小，並計算腫瘤大小的變化百分比。每週2次以體重計測量小鼠體重。研究持續進行直到：a)研究設計預定的最後日期；或b)發生健康問題，以兩者先發生者為準。此外，由以下腫瘤相關參數當作安樂死的依據：(1)腫瘤載重超過2500 mm³及/或(2)減少20%的起始體重。除了決定腫瘤大小的變化，最後的腫瘤測量值係使用於產生腫瘤重量改變比(T/C值)，其係由國家癌症研究機構(NCI)發展的標準公制，用來當作異體移植腫瘤評估T/C值，其係使用下式計算：% T/C=100 x△T/△C，若△T>0。若腫瘤發生退化(regression)，使用下式：% T/T₀=100 x△T/T0，若△T<0。

治療期間為18天。於本研究的最後一天，再次測量腫瘤大小及體重。

如圖14，於MM1R皮下性腫瘤模型，化合物1單一試劑抑制腫瘤生長。該T/C值據計算，基於第17天，為21.15%(p<0.0001,ANOVA)。於化合物1單一試劑治療組，未觀察到體重減輕或其他的副作用。

實施例15：化合物1對於循環淋巴細胞的作用

對於CD1野生型小鼠，檢驗化合物1對於循環T及B淋巴細胞作用的探討。對5隻小鼠，將化合物1如實施例8(b)(5 mg/mL)配方，以100 mg/kg的劑量口服投予連續5天。另5隻小鼠以載體處理。於各時間點從下頜的靜脈收集血液(包括投藥前，投藥中，及投藥後)。以流式細胞計數儀，針對T及B細胞定量分析血液。

也評估化合物1對於在淋巴器官、脾臟及淋巴節的T及B淋巴細胞水平的效果。將小鼠以化合物1以劑量100 mg/kg口服處理連續5天。將該等動物犧牲，收集淋巴器官。將細胞從組織物理性的溶出，並以流式細胞計數器分析。使用抗CD3及-CD19抗體，以染色T與B細胞。

此等探討的結果如圖6，其顯示血液淋巴細胞隨時間的變化。投藥化合物1後，顯示T及B淋巴細胞在血液水平相較於對照組有明顯地可逆的減少。類似的效果可見於脾臟及淋巴節的淋巴細胞水平。此等器官都顯示在投藥化合物1後，相對於對照組，T與B淋巴細胞有顯著減少。

實施例16：化合物1對於骨髓中的造血細胞的作用

骨髓從實施例12犧牲的小鼠移除。從小鼠的長骨收集骨髓內容物，並以流式細胞計數儀分析。使用淋巴細胞前身及成熟淋巴細胞的各種標記。此等結果顯示：以化合物1處理，造成周邊T與B淋巴細胞數減少，且同時，相較於對照組，會誘導骨髓淋巴細胞前身細胞的代償性增加。

實施例17：迷你沙門氏菌(Salmonella)/哺乳動物-微粒體反轉突變試驗法

本研究係用於評估化合物1，於2株Salmonella typhimurium(TA98與TA100)的基因體的組胺酸的哺乳動物微粒體酵素(S9-mix)存在或不存在下，誘導反轉突變的能力。

使用在致突變試驗的受測菌株為Salmonella typhimurium測試株TA98(用於檢測框架偏移的反轉突變)，以及TA100(用於偵測點反轉突變)。該試驗係於存在以及不存在S9混合物以及同時的載體(DMSO,20 μl/井)實施，並使用正對照組，使用6井平盤，二重複。對該等化合物的每一個，使用5個濃度，係以2X連續系列稀釋者，範圍為1000至62.5 μg/井(等於在標準Ames分析法中的5000至312.5 μg/平盤)。於37℃溫育48-72小時後，觀察平盤以得知化合物不溶性及細胞毒性，並且掃描以計數反突變的菌落。可再現的超過每日平均控制值2倍增加(>2x載體對照組)的反突變的菌落，認為是對各菌株有基因突變的正回應。

將化合物1溶於二甲亞碸(DMSO)，其當作負對照組(載體)。將2-硝基茀及疊氮化鈉，當做在各不存在針對TA98與TA100的S9時的正對照組。2-胺基蒽當作存在針對TA98 與TA100之S9時的正對照組。

結果

化合物1，當以50 mg/ml的濃度溶於DMSO時，形成褐紫紅色的溶液，其係最濃縮的原液溶液。該測試品直到以2X連續系列稀釋到3.125 mg/ml時，仍維持淡褐紫紅色。當該測試品與軟瓊脂在250μg/井及以上的濃度混合在一起時，觀察到該測試品的沉澱。溫育48-72小時之後，僅於不存在S9混合物，有250 μg/井的TA98及TA100的情形，於解剖顯微鏡觀察到些微的測試品的沉澱，於存在與不存在S9混合物，有500及1000 μg/井的TA98及TA100時，觀察到測試品沉澱及些微至中度的背景坪(background lawn)的小量減少。當於存在及不存在S9混合物以及菌株TA98與TA100測試時，比起平均對照組，未有反突變菌落的平均數增加的證據(表5)。

目前的研究結果顯示：當測試品的濃度最大到1000 μg/井(等於標準Ames試驗法中的5000 μg/平盤)時，在存在或不存在微粒體酵素，化合物物1不會引起菌株TA98與TA100的正突變回應。

實施例18：於腫瘤細胞株之藥效學探討

培養腫瘤細胞株H460(Kras、PI3K)、BT474(HER2、 PI3K)、A375(B-Raf)及H1975(EGFR、PI3K)，並以DMSO單獨處理(載體控制組)或0.1 μmol/L化合物1或參考化合物處理16小時。於SDS及2-巰基乙醇存在下製備細胞萃取物，並且解析(resolve)於聚丙烯醯胺凝膠。將蛋白轉移到硝基纖維濾紙，並使用標準程序，以含指出的初級抗體的阻斷溶液(Li-Cor Bioscience)實施點墨。從Cell Signaling Technology購買對抗p-EGFR、EGFR、p-HER2、HER2、p-HER3、HER3、p-MET、MET、p-bRaf、p-cRaf、pMEK、MEK、p-ERK、ERK及微管蛋白(tubulin)的初級抗體。使用結合於IRdye 680、800CW的二次抗體，並且以Li-Cor Odyssey Imager偵測信號。

免疫細胞化學係對於生長為單層的培養物的細胞實施，將該培養物以圖例所指處理，然後固定於4%(w/v)聚甲醛。於1×PBS清洗後，以含己指出的初級抗體及IRDye 680-或800CW結合之二次抗體的Li-Cor阻斷溶液進行免疫染色。針對細胞內western法，使用Li-Cor Odyssey紅外線造影機來檢測及定量結果。

針對以組織學檢驗藥效學標記，收集腫瘤異體移植物並且包埋於石蠟，製備4-5-mm的切片。將切片固定於載玻片，與初級抗體反應後，與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)結合之次級抗體反應(Envision polymer-HRP,Dako,Glostrup,Denmark)反應。然後使用二胺基聯苯胺(DAB)，如供應商建議之條件實施成色反應。以蘇木素(hematoxylin)進行切片的相反染色。

本研究的結果整理於圖7A-7g及8A-8C。化合物1抑制於KRAS-以及PI3KCA-突變H460非小細胞肺癌(NSCLC)細胞之HDAC活性，及PI3K路徑信息化。將細胞在實施西方點墨法或細胞內western法前，以DMSO單獨(載體控制組)或包含測試化合物處理1小時。圖7A顯示化合物1於1 μmol/L會增加乙醯基化組蛋白3(Ac-H3)、微管蛋白(tubulin)(Ac-Tub)及p53(Ac-p53)的水平。該化合物也會上調總p53及p21的含量。圖7B-7E的資料顯示化合物1以劑量依存的方式增加乙醯基化微管蛋白(圖7B)、乙醯基化組蛋白3(圖7C)、乙醯基化p53(圖7D)及乙醯基化p21(圖7E)的水平。獲得的IC₅₀值啟示在檢驗的癌細胞，化合物1有可匹敵於LBH 589的HDAC抑制能力。於1 μmol/L，化合物1抑制AKT的活化，及下游的蛋白4EBP-1及p70S6信息化(圖7F)。化合物1也持續且有效地以劑量依存方式抑制Akt的磷酸化(圖7G)。

PI3K抑制劑治療癌症的主要限制在於活化RAF-MEK-ERK路徑。HDAC抑制劑能經由外生(epigenetic)的修飾抑制癌細胞中的該信息路徑的激酶水平。於有各種突變的腫瘤細胞中，例如H460細胞的KRAS及PI3K突變、A375細胞的B-Raf突變、BT-474細胞的HER2與PI3K突變，及H1975細胞的EGFR突變，100 nM化合物1會壓抑Raf、MEK及ERK的活化。該有效的HDAC抑制劑LBH 589在有些此等西方點墨試驗法中顯示了類似的活性(圖8A)。

除了抑制PI3K及MEK路徑，以1 μM化合物1處理 RPMI-8226骨髓瘤細胞16小時，會抑制p-STAT3(Y-705)及p-Src(圖8B)。

於EGFR-L858R-T790M雙突變H1975 NSCLC細胞以及HER2-過度表現BT-474乳癌細胞，在溫育16小時後，化合物1顯示會降低受體酪胺酸激酶EGFR、HER2、HER3及MET的磷酸化水平及總量。在將此等細胞以LBH 589處理也觀察到類似的激酶下調現象(圖8C)。

實施例19. PI3K110 α,β,γ及δ於血液性異體移植腫瘤模型中的表現

將6~8週大的雌性免疫不全的小鼠(Beige/SCID)，飼養在通氣的微型隔離籠，於受控的氣候下，任食無菌高脂飼料(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。SCID beige小鼠的所有的籠舍及補給品都是可拋式，並在購買使用前以Innovive照射。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩(針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

人類血液學癌症細胞株係從人類癌症病患獲得。將冷凍保存的細胞於37℃水浴中解凍，並且於RPMI培養基+10-15%胎牛血清(FBS)中，5% CO₂的組織培養箱中培養。將細胞送到外部供應商檢查污染物及囓齒類的病原篩檢，以排除黴漿菌血漿(利用PCR)及/或病毒(利用MAP試驗，Mouse Antibody Production)的污染。

當培養物中的細胞到達所望的數目，收集並以無血清的Dulbecco氏磷酸緩衝鹽液(DPBS)洗滌。將後以DPBS稀釋細胞供植入。只使用多於90%存活率(利用台盼(trypan)藍排除法)的單一細胞懸浮液在注射。於7天的適應期後，使用0.5CC針筒及26G皮下注射器，小心避開血管，在小鼠的右側的後脅腹以皮下(SC)注射每隻動物1000~2000萬個細胞懸浮於0.1 ml DPBS的注射液。如果在皮膚下出現形成圓形的質量，則代表已成功植入。每日對該已植入的小鼠監控一般健康情形及腫瘤發展。

在植入後的約2週半，可檢測到腫瘤。以卡尺測量腫瘤大小。下式係用於計算腫瘤體積：腫瘤體積=(長度X寬度²)/2

當腫瘤大小到達約150-300 mm³，將小鼠分成4組，包括3個治療組(25 mg/kg、50 mg/kg及100 mg/kg)以及1個控制組。在投藥化合物1之後，於15分鐘、1、3、6及24個小時收集腫瘤(每個時間點3隻小鼠)。腫瘤係於將小鼠以CO₂安樂死後，依上列時間點收集。將樣本放在乾冰中直到移到-80℃冷凍庫供西方點墨法。

蛋白質係依製造商指示，使用均質機(Tissuelyser,Qiagen,Valencia,CA)從腫瘤萃取。將固持組織管的轉接器冷凍於-20℃，且使用前將溶解緩衝液及珠冷藏於4℃。

將100-200 μg組織於補充有磷解酶抑制劑(1：100 v/v,Tyr & Ser/Thr phosphatase inhibitor cocktails,Upstate)的300 μl T-PER Mammalian Tissue Protein Extraction試劑(Pierce,Rockford,IL)中均質。每一循環後以目視檢查樣本(時間：0.15分鐘；頻率：30Hz)直到組織完全均質為止。在多數的情形，需要約4個循環。將組織溶解物以14,000 rpm於4℃離心10分鐘。收集200 μl上清液並保持於-80℃。蛋白質濃度，使用BCA Protein Assay套組(Pierce,Rockford,IL)依製造商指示分析。

將30 μg的總蛋白質萃取物於NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上解析，並使用Bio-Rad Semi-Dry Transfer Machine轉移到硝基纖維素膜(Bio-Rad)。將該等點墨物與10 ml阻斷緩衝液(Odyssey Infrared Imaging System)一起溫育1小時，然後於振盪器中與初級抗體一起於4℃探查終夜。初級抗體包括PI3激酶p110 α(#4249,1：1000,Cell Signaling)、PI3激酶p110 β(#3011,1：1000，Cell Signaling))、PI3激酶p110 γ(#5405,1：1000,Cell Signaling)、PI3激酶p110 δ(SC-7176(1：1000,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。於每個試驗中，使用GAPDH(甘油醛3-磷酸去氫酶，1/30,000,Abcam,Cambridge,MA)，當作內部控制。

將該膜以Tris緩衝鹽夜Tween-20(TBST；DAKO)中洗4次，並於室溫與紅外線結合的二次抗體(1：10000)：抗兔結合-IR Dye 800(Rockland)，或抗小鼠結合-Alexa 680(Molecular Probes)溫育1小時。將該膜以TBST清洗，然後放在Odyssey Infrared Imaging System中供造影及分析。

結果如圖15，其顯示PI3K p110同型異構物、AKT及從數種非Hodgkin氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤異體移植物而來的pAKT。此結果顯示AKT的活化係由多重PI3K P110同型異構物所驅使。

實施例20：於Daudi異體移植腫瘤模型比較化合物1與CAL-101

將6~8週大的雌性SCID beige小鼠(CD-1 Beige SCID)，飼養在通氣的微型隔離籠，於受控的氣候下，任食無菌高脂飼料(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。SCID beige小鼠的所有的籠舍及補給品都是可拋式，並在購買使用前由Innovive照射。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩(針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

Daudi人類Burkitt氏淋巴瘤細胞係從人類Burkitt氏淋巴瘤病患取得。將冷凍保存的細胞於37℃水浴中解凍，並且於RPMI培養基+15%胎牛血清(FBS)、1% Penstrep及1% Glutamax中，5% CO₂的組織培養箱中培養。將細胞送到外部供應商檢查污染物及囓齒類的病原篩檢，以排除黴漿菌血漿(利用PCR)及/或病毒(利用MAP試驗，Mouse Antibody Production)的污染。當培養物中的細胞到達所望的數目，以離心收集。收集之後，以無血清的Dulbecco氏磷酸緩衝的鹽液(DPBS)清洗細胞。最後，將細胞以DPBS稀釋供植入。只使用多於90%存活率(利用台盼(trypan)藍排除法)的單一細胞懸浮液在注射。於最少7天的適應期後，使用0.5CC針筒及26G皮下注射器，小心避開血管，在小鼠的右側的後脅腹以皮下(SC)注射每隻動物2000萬個細胞懸浮於0.1 ml DPBS的注射液。如果在皮膚下出現形成圓形的質量，則代表已成功植入。每日對該已植入的小鼠監控一般健康情形及腫瘤發展。

當腫瘤植入4週後，腫瘤大小平均到達約300±126 mm³，將帶有可接受的腫瘤大小與形狀的小鼠使用排序軟體隨機分成3組，包括1組載體對照組及2個治療組。

將化合物1以如下配方及投藥：將化合物1(7.5 mg/ml)溶於30% Captisol+2當量的NaOH，並以2當量HCl平衡，並以口服胃管從星期一到星期五每日投藥。控制組使用相同的投藥典範，如同100mg/kg體積(6.67 ul/g)以載體(30% Captisol)投藥。

於各動物研究，以卡尺測量腫瘤，使用上式決定腫瘤大小，並且計算腫瘤大小改變的百分比。每週2次使用體重計測量小鼠體重。研究持續進行直到：a)研究設計預定的最後日期；或b)發生健康問題，以兩者先發生者為準。此外，由以下腫瘤相關參數當作安樂死的依據：(1)腫瘤載重超過2500 mm³及/或(2)減少20%的起始體重。除了決定腫瘤大小的變化，最後的腫瘤測量值係使用於產生腫瘤重量改變比(T/C值)，其係由國家癌症研究機構(NCI)發展的標準公制，用來當作異體移植腫瘤評估T/C值，其係使用下式計算：% T/C=100 x△T/△C，若△T>0。若腫瘤發生退化(regression)，使用下式：% T/T₀=100 x△T/T0，若△T<0。

針對載體及CAL-101組，治療期間為15天，其由於腫瘤大小超過體重的10%，故需要提早結束，針對化合物1，治療期間為18天。在該探討的最後一天，再次測量腫瘤大小及體重。

研究結果如圖16，其將活性組及對照組的腫瘤生長以治療時間的函數顯示。化合物1組相較於CAL-101組及對照組，腫瘤生長顯著降低。

實施例21.於Daudi異體移植腫瘤模型，化合物1與環磷醯胺的組合

將6~8週大的雌性SCID beige小鼠(CD-1 Beige SCID)，飼養在通氣的微型隔離籠，於受控的氣候下，任食無菌高脂飼料(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。SCID beige小鼠的所有的籠舍及補給品都是可拋式，並在購買使用前以Innovive照射。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩(針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

當腫瘤植入4週後，腫瘤大小平均到達約189±47 mm³，將帶有可接受的腫瘤大小與形狀的小鼠使用排序軟體隨機分成4組，包括1組載體對照組及3個治療組。

將化合物1以如下配方及投藥：將化合物1(7.5 mg/ml)溶於30% Captisol+2當量的NaOH，並以2當量HCl平衡，並以75mg/kg口服胃管從星期一到星期五每日投藥。控制組使用如同100mg/kg體積(6.67 ul/g)相同的投藥典範，以載體(30% Captisol)投藥。將環磷醯胺(“CTX”)以5mg/ml溶於0.9% NS，並於第0天以50mg/kg以靜脈內對動物投藥(尾部靜脈注射)。使用相同的投藥時程，以化合物1與CTX兩者對於組合組投藥。對照組，使用與組合組相同的投藥典範，以載體(30% Captisol)及0.9% NS投藥。

於各動物研究中，以卡尺測量腫瘤，使用上式決定腫瘤大小，並計算腫瘤大小改變百分比。每週2次以體重計測量小鼠體重。研究持續進行直到：a)研究設計預定的最後日期；或b)發生健康問題，以兩者先發生者為準。此外，由以下腫瘤相關參數當作安樂死的依據：(1)腫瘤載重超過2500 mm³及/或(2)減少20%的起始體重。除了決定腫瘤大小的變化，最後的腫瘤測量值係使用於產生腫瘤重量改變比(T/C值)，其係由國家癌症研究機構(NCI)發展的標準公制，用來當作異體移植腫瘤評估T/C值，其係使用下式計算：% T/C=100 x△T/△C，若△T>0。若腫瘤發生退化(regression)，使用下式：% T/T₀=100 x△T/T0，若△T<0。

治療週期為2週。在研究的最後一天再次測量腫瘤大小及體重。

研究結果如圖17，其針對對照組及治療組，將腫瘤生長以治療時間的函數顯示。單一試劑的情形，化合物1與環磷醯胺在此模型的活性類似。化合物1與環磷醯胺的組合顯示比起任一試劑單獨時有實質較大的效力。

實施例22.於MM1S異體移植模型，組合化合物1以及Lenalidomide

將4週大的雌性SCID/Beige小鼠，飼養在通氣的微型隔離籠(INNOCAGE®IVC,Innovive Inc.,San Diego,CA)，於受控的氣候下，任食無菌高脂飼料(Problab-RMH 2000)，並提供無菌水。SCID/Beige小鼠的所有的籠舍及補給品在使用前都經過高溫高壓滅菌。由受訓過的動物設施人員及檢查人員每天包括周末/假日檢查小鼠。所有的動物程序，係於無菌條件下，於生物安全室(注射時)或層流罩(針對動物飼養及非侵入性程序)實施。

將冷凍保存的MM1S人類MM細胞於37℃水浴中解凍，並且於RPMI培養基+10%胎牛血清(FBS)，5% CO₂的組織培養箱中培養。將細胞送到外部供應商檢查污染物及囓齒類的病原篩檢，以排除黴漿菌血漿(利用PCR)及/或病毒(利用MAP試驗，Mouse Antibody Production)的污染。當培養物中的細胞足以供植入，將其以無血清的Hank氏經平衡的鹽溶液(HBSS)洗滌。最後，將細胞以HBSS稀釋供植入。只使用多於90%存活率(利用台盼(trypan)藍排除法)的單一細胞懸浮液在注射。於最少7天的適應期後，使用1CC針筒及26G皮下注射器，小心避開血管，在小鼠的右側的後脅腹以皮下(SC)注射每隻動物2000萬個細胞懸浮於0.2 ml HBSS的注射液。如果在皮膚下出現形成圓形的質量，則代表已成功植入。每日對該已植入的小鼠監控一般健康情形及腫瘤發展。

當腫瘤植入3週後，腫瘤大小平均到達約192±32mm³，將帶有可接受的腫瘤大小與形狀的小鼠使用排序軟體隨機分成6組，各7隻動物，包括1組載體對照組及6個治療組。

將化合物1以如下配方及投藥：將化合物1(7.5 mg/ml)溶於30% Captisol+2當量的NaOH，並以2當量HCl平衡，並以75mg/kg口服胃管從星期一到星期五每日投藥。將Lenalidomide(Selleck,2.5mg/ml)於MCT(0.5%甲基纖維素及0.2% Tween80)中配方，並於12.5 mg/kg或25mg/kg的劑量投藥。對於2個組合組，投藥75 mg/kg的化合物1+一種劑量水平的lenalidomide(12.5或25 mg/kg)。對照組，使用與組合組相同的投藥典範，以載體(30% Captisol)及MCT投藥。

治療週期為17天。在研究的最後一天再次測量腫瘤大小及體重。

研究結果如圖18，其將腫瘤生長以治療時間的函數顯示。結果顯示於單一試劑的情形，化合物1於75 mg/Kg PO的劑量比起Lenalidomide於12.5或25 mg/Kg PO的劑量有效。結果也顯示化合物1與lenalidomide的組合顯示比起任一試劑單獨時有顯著較大的效力。

在此引用的專利及科學文獻建立起熟習該技術領域者可得的知識。所有在此引用的美國專利及公開或未公開的美國專利申請案引入於此當作參考。所有的在此引用的公開的外國專利及專利申請案納入於此當作參考。所有其他在此引用的公開參考文獻、文件、手稿及科學文獻納入於此當作參考。

雖本發明已參照其較佳具體例具體顯示及敘述，但熟習該技術領域之人士可了解在不偏離本發明範圍所附的申請專利範圍之下可以有各種形式及細節的改變。

圖1顯示對於帶有H2122異體移植腫瘤之裸小鼠以口服投予化合物1後，血漿及腫瘤組織的化合物1濃度對時間的變化。

圖2A顯示以口服劑量25、50及100 mg/kg對於帶有Daudi異體移植腫瘤之Scid小鼠投予化合物1後，化合物1的血漿濃度對時間的變化。

圖2B顯示以口服劑量25、50及100 mg/kg對於帶有Daudi異體移植腫瘤之Scid小鼠投予化合物1後，化合物1的腫瘤濃度對時間的變化。

圖2C顯示以口服劑量100 mg/kg對於帶有Daudi異體移植腫瘤之Scid小鼠投予化合物1後，化合物1於血漿及腫瘤組織的濃度對時間的變化。

圖3顯示從對照組及經化合物1處理(25、50及100 mg/Kg)之帶有Daudi異體移植腫瘤之Scid小鼠萃取的腫瘤組織萃取物的西方墨點圖。

圖4顯示對於米格魯犬以口服或靜脈內投藥後，化合物1血漿濃度對時間的變化。

圖5A顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有H2122異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖5B顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有Daudi異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖5C顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有OPM2異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖6顯示經化合物1或載體(vehicle)處理後，在血液循環的T及B淋巴球的水平。

圖7A至7G顯示從對照組及經化合物1處理的H460(Kras、PI3K)細胞萃取的萃取物的西方墨點圖。GDC為GDC-0941；LBH為LBH-589。

圖8A至8C顯示從對照組及經化合物1處理的H1975(EGFR、PI3K)、BT474(HER2、PI3K)、H1975(EGFR、PI3K)、A375(B-Raf)及RPMI-822(p53^-)細胞萃取的萃取物的西方墨點圖。

圖9經以化合物1或載體(vehicle)口服處理的帶有Daudi異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖10顯示經以化合物1、SAH、GDC-0941或組合SAHA及GDC-0941處理的帶有Daudi異體移植腫瘤的Scid小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖11顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有SU-DHL4異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖12顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有OPM2異體移植腫瘤的裸小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖13顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有MM1S異體移植腫瘤的SCID小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖14顯示經化合物1或載體(vehicle)處理的帶有MM1R異體移植腫瘤的SCID小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖15顯示從經化合物1處理的帶有Daudi、SuDHL-4、HS-Sultan、DOHH-2、OPM-2、MM1R或MM1S異體移植腫瘤的SCID小鼠而來的萃取物的西方墨點圖。

圖16顯示經化合物1、CAL-101或載體(vehicle)處理的帶有Daudi腫瘤的SCID小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖17顯示經化合物1、環磷醯胺、組合化合物1及環磷醯胺或載體(vehicle)處理的帶有Daudi腫瘤的SCID小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

圖18顯示經化合物1、lenalidomide、組合化合物1及lenalidomide或載體(vehicle)處理的帶有MM1S腫瘤的SCID小鼠的腫瘤生長對時間的變化。

Claims

一種下式化合物：或其藥學上容許之鹽。
一種如申請專利範圍第1項所述之化合物的苯磺酸鹽或甲烷磺酸鹽。
一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1或2項所述之化合物及藥學上容許之載劑。
如申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物，其係調配為口服投予。
一種申請專利範圍第1或2項所述之化合物在製備治療PI3K相關疾病或病症之藥物的用途。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中，該PI3K相關疾病或病症為細胞增殖疾病。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中，該細胞增殖疾病為癌症。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中，該細胞增殖疾病係選自由以下構成的群組：乳突瘤、神經膠母細胞瘤(blastoglioma)、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、星狀細胞瘤、頭癌、頸癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、直腸結腸癌、甲狀腺癌、胰臟癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、淋巴瘤、Hodgkin氏疾病及Burkitt氏疾病。
一種申請專利範圍第1或2項所述之化合物在製備治療HDAC所媒介的疾病之藥物的用途。
一種申請專利範圍第1或2項所述之化合物在製備治療PI3K及HDAC兩者所媒介的疾病之藥物的用途。