BR112013025340B1 - Composto e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

composto, composição farmacêutica, método para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com pi3k num indivíduo necessitado, método para tratar doença mediada por hdac e método para tratar tanto doenças mediadas por pi3k como por hdac. a invenção provê um composto de fórmula i, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos, e o uso de tais compostos no tratamento de doenças e distúrbios relacionados a fosfoinositídeo 3-quinase, tal como câncer. o presente pedido refere-se ainda ao tratamento de distúrbios e doenças relacionados com histona desacetilase, bem como relacionados tanto com histona desacetilase como com fosfoinositídeo 3-quinase.

Description

Histórico da invenção

[0001] Os fosfoinositídeos (PIs), derivados fosforilados de fosfatidilinositol, são essenciais em células eucarióticas, regulando processos nucleares, dinâmicas citoesqueléticas, sinalização e tráfico de membranas. Entre as enzimas envolvidas no metabolismo de PI, as PI3-quinases (PI3K) atraíram atenção especial devido às suas propriedades oncogênicas e potencial como drogas alvo. As PI3-quinases fosforilam os fosfatidilinositóis ou PIs na terceira posição do anel inositol. (Lindmo et al., Journal de Cell Science 119, 605-614, 2006). Os fosfolipídeos 3-fosforilados gerados pela atividade da PI3K ligam-se ao domínio de homologia com a pleckstrina (PH) da proteína quinase B (PKB), causando a translocação de PKB para a membrana celular e posterior fosforilação de PKB. A PKB fosforilada inibe as proteínas indutoras de apoptose, tal como FKHR, Bad e caspases, e se supõe que desempenhe um papel importante na progressão do câncer. As PI3Ks são divididas em classes I-III, sendo a classe I também subclassificada em classes Ia e Ib. Entre essas isoformas, supõe-se que as enzimas da classe Ia desempenhem o papel mais importante na proliferação celular em resposta à ativação da via de fator de crescimento- tirosina quinase (Hayakawa et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 6847-6858, 2006). Três mutações frequentes no câncer ativam constitutivamente a PI3Kα e, quando expressadas em células, elas acionam a transformação oncogênica e a ativação crônica de sinalização a jusante (“downstream”) por moléculas tais como PKB, S6K e 4E bp1 comumente observadas em células cancerosas. (Stephens et al., Current Opinion in Pharmacology, 5(4) 357-365, 2005). Como tal, as PI3-quinases são alvos atrativos para o tratamento de doenças proliferativas.

[0002] Há vários inibidores de PI3-quinase conhecidos, incluindo Wortmannin e LY294002. Embora o Wortmannin seja um potente inibidor de PI3K com baixo valor IC50 nanomolar, possui baixa atividade antitumoral in vivo. (Hayakawa et al., Bioorg. Med. Chem. 14(20), 6847-6858 (2006)). Recentemente, um grupo de compostos de quinazolina, piridopirimidina e tienopirimidina substituídos com morfolina foram relatados como eficazes na inibição de PI3-quinase p110α. (Hayakawa, 6847-6858). A dosagem oral de um composto de tienopirimidina substituído com morfolina (GDC-0941) demonstrou supressão tumoral em xenoenxertos de glioblastoma in vivo. (Folkes et al., Journal de Medicinal Chemistry, 51, 5522-5532, 2008). As publicações a seguir descrevem uma série de inibidores de PI3-quinase baseados em tienopirimidina, piridopirimidina e quinazolina: WO 2008/073785; WO 2008/070740; WO 2007/127183; publicação de patente americana 20080242665.

LY294002 Wortmannin GDC-0941

[0003] A acetilação de histona é uma modificação reversível, com a desacetilação sendo catalisada por uma família de enzimas denominadas histona desacetilases (HDACs). As HDACs são representadas por 18 genes em humanos e divididas em quatro classes distintas (J Mol Biol, 2004, 338:1, 17-31). As HDACs classe I de mamíferos (HDAC1-3, e HDAC8) estão relacionadas com levedura RPD3 HDAC, classe 2 (HDAC4-7, HDAC9 e HDAC10) relacionadas com levedura HDA1, classe 4 (HDAC11) e classe 3 (uma classe distinta abrangendo sirtuínas que estão relacionadas com levedora Sir2).

[0004] Csordas, Biochem. J., 1990, 286: 23-38 ensina que as histonas estão sujeitas a acetilação pós-translacional dos grupos ε-amino de resíduos lisina N-terminais, uma reação catalisada por histona acetil transferase (HAT1). A acetilação neutraliza a carga positiva da cadeia lateral de lisina, e supõe-se que exerça impacto sobre a estrutura de cromatina. De fato, o acesso de fatores de transcrição a modelos de cromatina é aumentado pela hiperacetilação de histona, tendo sido observado um enriquecimento de histona H4 subacetilada nas regiões transcricionalmente silenciosas do genoma (Taunton et al., Science, 1996, 272:408-411). No caso de genes supressores de tumor, o silenciamento transcricional devido à modificação de histona pode levar à transformação oncogênica e ao câncer.

[0005] Várias classes de inibidores de HDAC estão sendo atualmente avaliadas por investigadores clínicos. Exemplos incluem derivados de ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), PXD101 e LAQ824, atualmente em desenvolvimento clínico. Na classe das benzamidas de inibidores de HDAC, MS- 275, MGCD0103 e CI-994 atingiram ensaios clínicos. Mourne et al. (Resumo #4725, AACR 2005), demonstram que a modificação de tiofenila de benzamidas aumentam significativamente a atividade inibitória de HDAC contra HDAC1.

[0006] Certos cânceres foram eficazmente tratados com esse método combinatório; porém, os regimes de tratamento utilizando um coquetel de fármacos citotóxicos são muitas vezes restritos por toxicidades limitantes da dose e interações medicamentosas. Avanços mais recentes com fármacos-alvo molecular geraram novas abordagens ao tratamento combinado para câncer, permitindo o uso simultâneo de agentes-alvo múltiplos, ou a combinação desses novos tratamentos com quimioterápicos ou radioterapia padrão para melhorar o resultado sem atingir toxicidades limitantes da dose. Porém, a capacidade de utilizar essas combinações se restringe atualmente a fármacos que apresentam propriedades farmacológicas e farmacodinâmicas compatíveis. Além disso, as exigências regulatórias para demonstrar segurança e eficácia nas terapias de combinação podem ser mais caras e morosas do que os ensaios correspondentes com agente único. Uma vez aprovadas, as estratégias de combinação podem também gerar aumento de custos para pacientes, redução de adesão ao tratamento por parte do paciente, devido aos paradigmas de dosagem mais complicados que são exigidos.

Sumário da Invenção

[0007] A presente invenção se refere a um composto de Fórmula I:

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde R é hidrogênio e um grupo acila. O grupo acila é preferivelmente R1C(O)-, onde R1 é alquila C1-C24 substituído ou não substituído, preferivelmente alquila C1-C10, e mais preferivelmente alquila C1-C6; alquenila C2-C24 substituído ou não substituído, preferivelmente alquenila C2-C10, e mais preferivelmente alquenila C2-C6; alquinila C2-C24 substituído ou não substituído, preferivelmente alquinila C2-C10, e mais preferivelmente alquinila C2-C6; arila substituído ou não substituído, preferivelmente fenila substituído ou não substituído; ou heteroarila substituído ou não substituído.

[0008] A invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um excipiente ou portador farmaceuticamente aceitável.

[0009] Os compostos de Fórmula I e, particularmente, o Composto I, possuem propriedades vantajosas para uso como agentes terapêuticos, tais como para tratamento de câncer e de outras doenças e distúrbios associados com a atividade de PI3 quinase e/ou com a atividade de HDAC. O composto I, por exemplo, possuem atividade inibitória potente contra alvos moleculares PI3K e HDAC e atividade antiproliferativa potente contra uma variedade de linhagens de células cancerosas in vitro. O composto I possui biodisponibilidade oral significativa conforme observado em modelos animais. Mediante dosagem oral ou intravenosa em camundongos portando tumor em xenoenxerto, o composto mostra captação significativa pelo tecido tumoral e atividade farmacodinâmica em tecido tumoral.

[0010] O Composto I também mostra atividade antitumoral substancial em modelos camundongo de tumor em xenoenxerto após administração oral ou intravenosa. O composto também possui perfil de segurança favorável, conforme demonstrado, por exemplo, através do ensaio de genotoxicidde utilizando o teste de Ames.

[0011] A invenção também se refere ao uso dos compostos da invenção no tratamento de doenças e distúrbios relacionados com PI3K, tal como câncer. Esses compostos também atuam como inibidor de HDAC em virtude de sua capacidade de se ligar a íons zinco. Os compostos são ativos em alvos terapêuticos múltiplos e eficazes no tratamento de uma variedade de doenças. Além disso, em alguns casos, descobriu-se que esses compostos apresentam atividade aumentada em comparação com as atividades de combinações de moléculas separadas tendo individualmente atividade inibitória de PI3-quinase e atividade inibitória de HDAC. Em outras palavras, a combinação de atividade inibitória de PI3-quinase e de HDAC em uma molécula simples pode prover um efeito sinérgico se comparado com os inibidores de PI3-quinase e HDAC separadamente.

[0012] Além disso, a eficácia de inibidores da via PI3K como agente único é limitada pela presença de alterações genéticas primárias/adquiridas e ativação de vias múltiplas para pró-sobrevivência e crescimento (Engelman (2009) Nature Reviews Cancer, 9: 550-562). A inibição de PI3K por inibidores de via PI3K como agente único pode regular para cima (“upregulate”) a sinalização da via RAF-MEK-ERK pela liberação de loops de realimentação negativa. Os compostos da invenção, em virtude de suas atividades inibitórias de PI3K/HDAC integrados, conferem o potencial de resolver as limitações no tratamento de câncer com inibidores de PI3K de alvo único. Os compostos da invenção interrompem as estruturas cancerosas em experimentos in vivo e in vitro, resultantes da inibição durável da via PI3K-AKT-mTOR, da inibição da via RAF-MEK-ERK, e da regulação para baixo (“downregulation”) dos níveis da proteína tirosina quinase receptora (RTK). Além disso, os compostos da invenção induzem a paragem do ciclo celular e a apoptose resultantes da regulação para cima (“upregulation”) de supressores tumorais p53 e p21 em linhagens tumorais celulares in vitro. Consequentemente, os compostos da invenção têm o potencial de superar a resistência a fármacos primária e adquirida, podendo ser mais eficazes que a monoterapia com inibidores de via PI3K com agente único em aplicações clínicas.

[0013] Outro aspecto da invenção provê métodos para inibir a atividade de PI3 quinase, contatando uma PI3 quinase com uma quantidade inibitória eficaz de um composto de Fórmula I, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Breve descrição dos desenhos

[0014] A Figura 1 é um gráfico de concentração de Composto I versus tempo em plasma e tecido tumoral após administração oral a camundongos atímicos portando tumor em xenoenxerto H2122;

[0015] A Figura 2A é um gráfico de concentração plasmática de Composto I versus tempo em camundongos Scid portando tumor Daudi em xenoenxerto após dosagem oral a 25, 50 e 100 mg/kg;

[0016] A Figura 2B é um gráfico de concentração de tumor versus tempo de Composto 1 em camundongos Scid portando tumor Daudi em xenoenxerto após dosagem oral a 25, 50 e 100 mg/kg;

[0017] A Figura 2C é um gráfico de concentração versus tempo no plasma e tecido tumoral de Composto 1 em camundongos Scid portando tumor Daudi em xenoenxerto após dosagem oral a 100 mg/kg;

[0018] A Figura 3 apresenta Western blots de extratos de tecido tumoral de camundongos Scid tratados com controle e Composto I (25, 50 e 100 mg/kg) portando xenoenxerto de tumor Daudi;

[0019] A Figura 4 é um gráfico de concentração plasmática versus tempo do Composto 1 em cães Beagle após dosagem oral ou intravenosa;

[0020] A Figura 5A é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos atímicos portando tumor em xenoenxerto H2122 tratados com Composto 1 ou veículo;

[0021] A Figura 5B é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos atímicos portando tumor Daudi em xenoenxerto tratados com Composto 1 ou veículo;

[0022] A Figura 6 é um gráfico mostrando níveis de sangue circulante de linfócitos T e B após tratamento com Composto 1 ou veículo;

[0023] As Figuras 7A a 7G apresentam Western blots de extratos de células H460 (Kras, PI3K) tratadas com controle e Composto 1. GDC é GDC-0941; LBH é LBH-589;

[0024] As Figuras 8A a 8C apresentam Western blots de extratos de células H1975 (EGFR, PI3K), BT474 (HER2, PI3K), H1975 (EGFR, PI3K), A375 (N-Raf) e RPMI-822 (p53) tratadas com controle e Composto 1;

[0025] A Figura 9 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor Daudi em xenoenxerto tratados oralmente com Composto 1 ou veículo;

[0026] A Figura 10 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor Daudi em xenoenxerto tratados com veículo, Composto 1, SAH, GDC-0941 ou uma combinação de SAHA e GDC-0941;

[0027] A Figura 11 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos atímicos portando tumor em xenoenxerto SU-DHL4 tratados oralmente com Composto 1 ou veículo;

[0028] A Figura 12 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos atímicos portando tumor em xenoenxerto OPM2 tratados com Composto 1 ou veículo;

[0029] A Figura 13 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor em xenoenxerto MM1R tratados com Composto 1 ou veículo;

[0030] A Figura 15 apresenta Western blots de extratos de tumor de camundongos Scid tratados com composto 1 portando tumores em xenoenxerto Daudi, SuDHL-4, HS-Sultan, DOHH-2, OPM-2, MM1R ou MM1S;

[0031] A Figura 16 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor Daudi tratados com Composto 1, CAL-101 ou veículo;

[0032] A Figura 17 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor Daudi tratados com Composto 1, ciclofosfamida, combinação de Composto 1 e ciclofosfamida ou veículo; e

[0033] A Figura 18 é um gráfico de crescimento tumoral versus tempo em camundongos Scid portando tumor MM1S tratados com Composto 1, lenalidomida, combinação de Composto 1 e de lenalidomida ou veículo.

Descrição detalhada da invenção

[0034] Em uma concretização preferida, o composto de Fórmula 1 é representado abaixo:

(adiante designado “Composto 1”, também designado N-hidroxi- 2-(((2-(6-metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidin-6-il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0035] A invenção também provê métodos para a prevenção ou tratamento de doenças ou condições envolvendo proliferação, diferenciação ou sobrevivência aberrante de células. Em uma concretização, a invenção também provê o uso de um ou mais compostos da invenção na manufatura de um medicamento para deter ou reduzir doenças que envolvem proliferação, diferenciação ou sobrevivência aberrante de células. Em uma concretização preferida, a doença é câncer. Em uma concretização, a invenção se refere a um método para tratar câncer em um indivíduo necessitado de tratamento, compreendendo administrar a dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção.

[0036] O termo “câncer” se refere a qualquer câncer causado pela proliferação de células neoplásicas malignas, tais como tumores, neoplasmas, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, e similares. Por exemplo, cânceres incluem, embora não se restrinjam a mesotelioma, leucemias e linfomas, tais como linfoma cutâneos de células T (CTCL), linfomas não-cutâneos de células T periféricas, linfomas associados com vírus linfotrófico de célula T humana (HTLV) tal como leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATLL), linfoma de células B, leucemias não-linfocíticas agudas, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielógena aguda, linfomas, e mieloma múltiplo, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfática aguda (ALL), leucemia linfática crônica (CLL), linfoma de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma-leucemia de células T no adulto, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (CML), ou carcinoma hepatocelular. Outros exemplos incluem síndrome mielodisplásica, tumores sólidos da infância, tais como tumores cerebrais, neuroblastoma, retinoblastoma, tumor de Wilms, tumores ósseos, e sarcomas de tecidos moles, tumores sólidos comuns de adultos, tais como câncer de cabeça e pescoço (ex: oral, laríngeo, nasofaríngeo e esofágico), câncer geniturinário (ex: próstata, bexiga, renal, uterino, ovariano, testicular), câncer de pulmão (ex: de pequenas células e não de pequenas células), câncer de mama, câncer pancreático, melanoma e outros cânceres de pele, câncer de estômago, tumores cerebrais, tumores relacionados com síndrome de Gorlin (ex: meduloblastoma, meningioma, etc.) e câncer hepático. Formas representativas adicionais de câncer que podem ser tratados com os compostos objeto incluem, embora não se restrinjam a câncer de músculo esquelético e liso, câncer de estômago, câncer de intestino delgado, carcinoma retal, câncer das glândulas salivares, câncer endometrial, câncer adrenal, câncer anal, câncer retal, câncer de paratireóide, e câncer pituitário.

[0037] Cânceres adicionais para os quais os compostos aqui descritos podem ser úteis em termos de prevenção, tratamento e estudo são, por exemplo, carcinoma do cólon, carcinoma polipótico adenomatoso familiar e câncer colorretal não- polipótico hereditário, ou melanoma. Além disso, cânceres incluem, embora não se restrinjam a carcinoma labial, carcinoma de laringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma de língua, carcinoma das glândulas salivares, carcinoma gástrico, adenocarcinoma, câncer de tireóide (carcinoma de tireóide medular e papilar), carcinoma renal, carcinoma do parênquima renal, carcinoma cervical, carcinoma do corpo uterino, carcinoma endometrial, carcinoma coriônico, carcinoma testicular, carcinoma urinário, melanoma, tumores cerebrais, tais como glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma, e tumores neuroectodérmicos periféricos, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma brônquico, mieloma múltiplo, basalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma coróide, seminoma, rabdomiosarcoma, craniofaringeoma, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, lipossarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Ewing, e plasmocitoma. Em um aspecto da invenção, a presente invenção provê o uso de um ou mais compostos da invenção na manufatura de um medicamento para tratamento de câncer.

[0038] Em uma concretização, os compostos da invenção são usados no tratamento de câncer hematológico ou condição hematológica pré-cancerosa. Cânceres hematológicos incluem leucemias, linfomas e mieloma múltiplo. Exemplos incluem leucemias linfocíticas, tais como leucemia linfocítica aguda, incluindo leucemia linfoblástica aguda de precursores B, leucemia linfoblástica aguda de precursores T, leucemia de Burkitt, bem como leucemia bifenotípica aguda; e leucemia linfocítica crônica, incluindo leucemia prolinfocítica de células B; e leucemias miológenas, tais como leucemia miológena aguda, incluindo leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, e leucemia megacarioblástica aguda; e leucemia mielógena crônica, inclusive leucemia monocítica crônica; leucemia monocítica aguda. Outras leucemias incluem leucemia de células pilosas; leucemia prolinfocítica de células T; leucemia linfocítica granular grande; e leucemia de células T no adulto. Linfomas incluem linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, inclusive linfomas de células B, linfomas de células T, tal como linfoma cutâneo de células T, e linfomas de células NK. Condições pré- cancerosas hematológicas incluem síndrome mielodisplásica e distúrbios mieloproliferativos, tais como mielofibrose primária, policitermia vera e trombocitemia essencial.

[0039] Compostos da invenção demonstraram induzir linfopenia reversível, sendo, portanto, utilizados para remover ou reduzir os níveis circulantes de células cancerosas da linhagem linfocítica. Esses compostos são também para uso no tratamento de distúrbios autoimunes, ou para modular uma resposta imune.

[0040] Em uma concretização, a invenção provê um método para reduzir a contagem de linfócitos circulante em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto da invenção. Em uma concretização preferida, a contagem reduzida de linfócitos circulantes é reversível, ou seja, a contagem de linfócitos circulante retorna á faixa normal após dosagem do composto da invenção ser interrompida. Em uma concretização, a contagem reduzida de linfócitos circulantes está abaixo da faixa normal e o indivíduo é linfopênico. Preferivelmente, o indivíduo extrai benefícios da contagem reduzida de linfócitos circulantes. Esses indivíduos incluem os que sofrem de doença hematológica, tal como câncer hematológico, os que sofrem de distúrbio autoimune, e os que requerem modulação de uma resposta imune, tais como os pacientes acometidos com diabete ou receptores de transplante de órgãos. Em um indivíduo humano, a contagem de linfócitos circulante, por exemplo, de linfócitos B, linfócitos T ou ambos, pode ser reduzida de uma faixa normal para uma faixa linfopênica. Em certas doenças, a contagem de linfócitos circulantes pode ser reduzida para a faixa normal ou para um estado linfopênico.

[0041] Em uma concretização, a presente invenção inclui o uso de um ou mais compostos da invenção na manufatura de um medicamento que também previna a proliferação, diferenciação ou sobrevivência aberrante de células. Por exemplo, compostos da invenção podem ser úteis para impedir que um tumor cresça ou atinja um estado metastático. Os compostos objeto podem ser administrados para interromper a progressão ou avanço do câncer ou para induzir apoptose tumoral ou para inibir a angiogênese tumoral. Além disso, a presente invenção inclui o uso do composto objeto para impedir a recorrência do câncer.

[0042] A presente invenção também abrange o tratamento ou prevenção de distúrbios proliferativos de células, tais como hiperplasias, displasias e lesões pré-cancerosas. A displasia é a forma mais inicial de lesão pré-cancerosa reconhecível em uma biópsia pelo patologista. Os compostos objeto podem ser administrados com a finalidade de impedir que ditas hiperplasias, displasias ou lesões pré-cancerosas continuem a se expandir ou de se tornarem cancerosas. Exemplos de lesões pré-cancerosas podem ocorrer na pela, tecido esofágico, tecido intraepitelial mamário e cervical.

[0043] “Terapia de combinação” inclui a administração dos compostos objeto em combinação com outros ingredientes biologicamente ativos (tais como, porém não restritos a um segundo agente antineoplásico diferente) e terapias não farmacológicas (tais como, porém não restritas a cirurgia ou tratamento radioterápico). Por exemplo, os compostos da invenção podem ser usados em combinação com outros compostos farmaceuticamente ativos, preferivelmente compostos que possam aumentar o efeito dos compostos da invenção. Os compostos da invenção podem ser administrados simultaneamente (como preparação única ou separada) ou sequencialmente com outro tratamento farmacológico. Em geral, uma terapia de combinação visa a administração de dois ou mais fármacos durante um ciclo único ou curso de tratamento.

[0044] Em um aspecto da invenção, os compostos objeto podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes separados que modulam a proteína quinases envolvidas em vários estados patológicos. Exemplos de tais quinases podem incluir, embora não se restrinjam a serina/treonina quinases específicas, tirosina quinases receptoras específicas, tirosina quinases não receptoras não específicas. As serina/treonina quinases incluem proteínas quinase ativadas por mitógeno (MAPK), quinase específica de fase meiótica (MEK), RAF e aurora quinase. Exemplos de famílias de quinase receptora incluem receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (ex: HER2/neu, HER3, HER4, ErbB, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Xmrk, DER, Let23); receptor de fator de crescimento fibroblástico (FGF) (ex: FGF-R1, GFF-R2/BEK/CEK3, FGF- R3/CEK2, FGF-R4/TKF, KGF/R); receptor de fator de crescimento/disseminação de hepatócitos (HGFR) (ex: MET, RON, SEA, SEX); receptor de insulina (ex: IGFI-R); Eph (ex: CEK5, CEK8, EBK, ECK, EEK, EHK-1, EHK-2, ELK, EPH, ERK, HEK, MDK2, MDK5, SEK); Axl (ex: Mer/Nyk, Rse); RET; e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) (ex: PDGF-α-R, PDGβ-R, CDF1-R/FMS, SCF-R/C-KIT, VEGF-R/FLT, NEK/FLK1, FLT3/FLK2/STK-1). Famílias de tirosina quinase não receptoras incluem, embora não se restrinjam a BCR-ABL (ex: p43abl, ARG); BTK (ex: ITK/EMT, TEC); CSK, FAK, FPS, JAK, SRC, BMX, FER, CDK e SYK).

[0045] Em outro aspecto da invenção, o composto objeto pode ser administrado em combinação com um ou mais agentes separados que modulam alvos ou processos biológicos não de quinase. Esses alvos incluem histona desacetilases (HDAC), DNA metiltransferase (DNMT), proteínas de choque térmico (ex: HSP90), proteínas relacionadas com via hedgegog (ex: sonic, patched e smoothened hedgegog) bem como proteossomas.

[0046] Em uma concretização preferida, os compostos objeto podem ser combinados com agentes antineoplásicos (ex: pequenas moléculas, anticorpos monoclonais, RNA antisentido e proteínas de fusão) que inibem um ou mais alvos biológicos tais como Zolinza, Tarceva, Iressa, Tykerb, Gleevec, Sutent, Sprycel, Nexavar, Sorafinib, CNF2024, RG108, BMS387032, Affinitak, Avastin, Herceptina, Erbitux, AG24322, PD325901, ZD6474, PD184322, Obatodax, ABT737, GDC-0449, IPI-926, BMS833923, LDE225, PF-04449913 e AEE788. Essas combinações podem aumentar a eficácia terapêutica em relação à eficácia obtida por qualquer um dos agentes isoladamente, podendo impedir ou retardar o aparecimento de variantes mutacionais resistentes.

[0047] Em certas concretizações preferidas, os compostos da invenção são administrados em combinação com um agente quimioterápico. Os agentes quimioterápicos abrange uma ampla gama de tratamentos terapêuticos no campo da oncologia. Esses agentes são administrados em vário estágios da doença com a finalidade de reduzir tumores, destruir células cancerosas remanescentes deixadas após cirurgia, induzir a remissão, manter a remissão e/ou aliviar sintomas relacionados com câncer ou com seu tratamento. Exemplos desses agentes incluem, embora não se restrinjam a agentes alquilantes tais como derivados de gás de mostarda (mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, malfalan, ifosfamida), etileniminas (tiotepa, hexametilmelanina), alquilssulfonatos (busulfan), hidrazinas e triazinas (altetramina, procarbazina, dacarbazina e temozolomida), nitrosoureias, (carmustine, lomustine e estreptozocina), ifosfamida, e sais metálicos (carboplatina, cisplatina e oxaliplatina); alcalóides vegetais, tais como podofilotoxinas (etoposídeo e tenisopídeo), taxanos (paclitaxel e docetaxel), alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, vindesina, e vinorelbina) e análogos de camptotecano (irinotecano e topotecano); antibióticos antitumorais tais como cromomicinas (dactinomicina e plicamicina), antraciclinas (doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, mitoxantrona, valrubicina e idarubicina) e antibióticos variados tais como mitomicina, actinomicina e bleomicina; antimetanólitos tais como antagonistas de ácido fólico (metotrexato, pemetrexed, raltitrexed, aminopterina), antagonistas de pirimidina (5- fluorouracil, floxuridina, citarabina, capecitabina e gemeitabina), antagonistas de purina (6-mercaptopurina e 6- tioguanina) e inibidores de adenosina desaminase (cladribina, fludarabina, mercaptopurina, clofarabina, tioguanina, nelarabina e pentostatina); inibidores de topoisomerase tais como inibidores de topoisomeraseI (ironotecano, topotecano) e inibidores de topoisomerase II (amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, teniposídeo); anticorpos monoclonais (alemtuzumab, gemtuzumab ozogamicina, rituximab, trastuzumab, ibritumoman tioxetan, cetuximab, panitumumab, tositumomab, bevacizumab); e antineoplásicos diversos tais como inibidores de ribonucleotídeo reductase (hidroxiureia); inibidor de esteróide adrenocortical (mitotane); enzimas (asparaginase e pegaspargase); agentes antimicrotúbulos (estramustina); retinóides (bexoroteno, isotretinoína, tretinoína (ATRA) e lenalidomida.

[0048] Em certas concretizações preferidas, os compostos da invenção são administrados em combinação com um agente quimioprotetor. Os agentes quimioprotetores atuam para proteger o corpo ou minimizar os efeitos colaterais da quimioterapia. Exemplos desses agentes incluem, embora não se restrinjam a amfostina, mesna e dexrazoxano.

[0049] Em um aspecto da invenção, os compostos objeto são administrados em combinação com terapia de radiação. A radiação é comumente administrada internamente (implantação de material radioativo próximo ao local do câncer) ou externamente de um aparelho que empregue radiação fotônica (raio X ou raio gama) ou particulada. Quando a terapia de combinação compreender também tratamento por radiação, o tratamento por radiação pode ser conduzido em qualquer tempo adequado, contanto que se obtenha um efeito benéfico da coação da combinação de agentes terapêuticos e do tratamento por radiação. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda obtido quando o tratamento por radiação é temporariamente retirado da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou até mesmo meses.

[0050] Será apreciado que os compostos da invenção podem ser usados em combinação com um agente imunoterapêutico. Uma forma de imunoterapia é a geração de uma resposta imune tumor-específica ativa sistêmica do hospedeiro administrando- se uma composição em vacina em um local distante do tumor. Vários tipos de vacinas foram propostas, inclusive vacinas tumor-antígeno isolados e vacinas antiidiotípicas. Outro método consiste em utilizar células de tumor do indivíduo a ser tratado, ou um derivado de tais células (revisado por Schirmacher et al., (1995) J Cancer Res. Clin Oncol. 12 1:487). Na patente americana No. 5.484.596, Hanna Jr. et al. reivindicam um método para tratar um carcinoma ressecável para evitar recorrência ou metástases, compreendendo remover cirurgicamente o tumor, dispersar as células com colagenase, irradiar as células, e vacinar o paciente com pelo menos três doses consecutivas de cerca de 107células.

[0051] Será apreciado que os compostos da invenção podem ser vantajosamente utilizados juntamente com um ou mais agentes terapêuticos adjuvantes. Exemplos de agentes para terapia adjuvante incluem um agonista 5HT1, tal como triptano (ex: sumatriptano ou naratriptano); um agonista de adenosina A1; um ligante EP; um modulador NMDA, tal como um antagonista de glicina; um bloqueador de canais de cálcio (ex: lamotrigina); um antagonista da substância P (ex: um antagonista NK1); um canabinóide; acetaminofen ou fenacetina; um inibidor de 5-lipoxigenase; um antagonista de receptor de leucotrieno; um DMARD (ex: metotrexato); gabapentina e compostos relacionados; um antidepressivo tricíclico (ex: amitriptilina); um medicamento antiepilético estabilizante neuronal; um inibidor de recaptação monoaminérgico (ex: venlafaxina); um inibidor de metaloproteinase de matriz; inibidor de óxido nítrico sintase (NOS), tal como iNOS ou inibidor de iNOS; um inibidor da liberação ou ação de fator de necrose tumoral, tal como um inibidor de nucleosídeos (ex: lamivudina) ou um modulador do sistema imune (ex: interferon); um analgésico opióide; um anestésico local; um estimulante, incluindo cafeína; um antagonista H2 (ex: ranitidina); um inibidor de bomba de prótons (ex: omeprazol); um antiácido (ex: hidróxido de alumínio ou magnésio); um antiflatulento (ex: simeticona); um descongestionante (ex: fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefedrina, oximetazolina, epinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilexedrina, ou levodesoxiefedrina); um antitussígeno (ex: codeína, hidrocodona, carmifen, carbetapentano, ou dextrametorfan); um diurético; ou anti-histamínico sedativo ou não sedativo.

[0052] Os compostos podem também ser usados no tratamento de um distúrbio envolvendo, relacionado ou associado à desrregulação de histona desacetilase (HDAC). Há vários distúrbios implicados por ou conhecidos por serem mediados, pelo menos em parte, pela atividade de HDAC, sendo que a atividade de HDAC é conhecida por desempenhar uma função no desencadeamento de início de doença, ou cujos sintomas são conhecidos ou demonstraram obter alívio mediante tratamento com inibidores de HDAC. Distúrbios desse tipo, dos quais se espera sejam passíveis de tratamento com os compostos da invenção incluem, embora não se restrinjam aos seguintes: distúrbios antiproliferativos (ex: câncer); doenças neurodegenerativas incluindo doença de Huntington, doença de poliglutamina, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, convulsões, degeneração estriatonigral, paralisia supranuclear progressiva, distonia de torção, torcicolo espasmódico e discinesias, tremor familiar, síndrome de Gilles de la Tourette, demência de corpos de Lewis difusa, doença de Pick, hemorragia intracerebral, esclerose lateral primária, atrofia muscular espinhal, esclerose lateral amiotrófica, polineuropatia intersticial hipertrófica, retinite pigmentosa, atrofia óptica hereditária, paraplegia espástica hereditária, ataxia progressiva e síndrome de Shy- Drager; doenças metabólicas inclusive diabete tipo 2, doenças degenerativas dos olhos, incluindo glaucoma, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma rubeótico; doenças inflamatórias e/ou distúrbios do sistema imune, inclusive artrite reumatóide (RA), osteoartrite, artrite crônica juvenil, doenças enxerto versus hospedeiro, psoríase, asma, espondiloartropatia, doença de Crohn, doença intestinal inflamatória, colite ulcerosa, hepatite alcoólica, diabete, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, espondilite anquilosante, glomerulopatia membranosa, dor discogênica, lúpus eritematoso sistêmico; doença envolvendo angiogênese, inclusive câncer, psoríase, artrite reumatóide; distúrbios psicológicos incluindo doença bipolar, esquizofrenia, mania, depressão e demência; doenças cardiovasculares, inclusive a prevenção e o tratamento de danos ao tecido vascular e miocárdico relacionado com isquemia ou reperfusão, insuficiência cardíaca, restenose e arterioesclerose; doenças fibróticas inclusive fibrose hepática, fibrose cística e angiofibroma; doenças infecciosas, inclusive infecções fúngicas, tais como candidíase ou Candica Albicans, infecções bacterianas, infecções virais, tais como Herpes simples, poliovírus, rinovírus e vírus de Coxsackie, infecções por protozoários, tais como malária, infecção por Leishmania, infecção por Tripanosoma brucei, toxoplasmose e coccidilose, e distúrbios hematopoiéticos, incluindo talassemia, anemia e anemia falciforme.

[0053] Os compostos da invenção podem também ser usados no tratamento de um distúrbio envolvendo, relacionado ou associado à desrregulação de PI3 quinase. A atividade de PI3 quinase está implicada ou demonstrou estar envolvida em uma variedade de distúrbios. Em certos casos, a atividade da PI3 quinase está envolvida no desencadeamento de início de doença, ao passo que em outros casos, os sintomas são conhecidos ou demonstraram ser aliviados por inibidores de atividade de PI3 quinase. Distúrbios desse tipo, dos quais se espera sejam passíveis de tratamento com os compostos da invenção incluem, embora não se restrinjam a cânceres, inclusive leucemia, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer renal, câncer gástrico e câncer cerebral; restenose, aterosclerose, distúrbios ósseos, artrite, retinopatia diabética, psoríase, hipertrofia benigna da próstata, inflamação, angiogênese, distúrbios imunológicos, pancreatite e doença renal.

[0054] Em uma concretização, os compostos da invenção podem ser usados para induzir ou inibir a apoptose, um processo de morte celular fisiológico crítico para o desenvolvimento e homeostase normal. As alterações nas vias apoptóticas contribuem para a patogênese de uma variedade de doenças humanas. Os compostos da invenção, como moduladores da apoptose, serão úteis no tratamento de uma variedade de doenças humanas com aberrações em apoptose, incluindo o câncer (particularmente, porém não restrito a linfomas foliculares, carcinomas com mutações p53, tumores hormônio- dependentes da mama, próstata e ovário, bem como lesões pré- cancerosas, tais como polipose adenomatosa familiar), infecções virais (inclusive porém não restritas a vírus da herpes, poxvírus, vírus de Epstein-Barr, vírus Sindbis e adenovírus), doenças autoimunes (inclusive, porém não restritas a lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite mediada por imunocomplexos, artrite reumatóide, psoríase, doenças intestinais inflamatórias, e diabete mellitus autoimune), distúrbios neurodegenerativos (inclusive, porém não restritos a mal de Alzheimer, demência relacionada com AIDS, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal e degeneração cerebelar), AIDS, síndromes mielodisplásticas, anemia aplástica, infartos do miocárdio associados com lesão isquêmica, AVS e lesão por reperfusão, arritmia, aterosclerose, doenças hepáticas induzidas por álcool ou toxinas, doenças hematológicas (inclusive, porém não restritas a anemia crônica e anemia aplástica), doenças degenerativas do sistema muscoloesquelético (inclusive, porém não restritas a osteoporose e artrite), rinosinusite sensível à aspirina, fibrose cística, esclerose múltipla, doenças renais, e dor oncológica.

[0055] Em um aspecto, a invenção provê o uso de compostos da invenção para o tratamento e/ou prevenção de resposta imune ou respostas e doenças imune-mediadas de materiais, células, órgãos ou tecidos sintéticos ou orgânicos para enxerto, para substitui toda ou parte da função de tecidos, tal como coração, rim, fígado, medula óssea, pele, córnea, vasos, pulmão, pâncreas, intestino, membros, músculo, tecido nervoso, duodeno, intestino delgado, célula de ilhota pancreática, incluindo xenotransplantes, etc; para tratar ou prevenir doenças enxerto-versus-hospedeiro, doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite de Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia gravis, diabete tipo I, uveíte, diabete melitus de início juvenil ou recente, uveíte, doença de Graves, psoríase, dermatite atópica, doença de Crohn, colite ulcerativa, vasculite, doenças mediadas por anticorpos, anemia aplástica, síndrome de Evans, anemia hemolítica autoimune, e similares; e também tratar doenças infecciosas que causam resposta e/ou ativação imune aberrante, tal como desregulação imune traumática ou induzida por patógeno, incluindo por exemplo, as causadas por infecções de hepatite B e C, HIV, infecção por Staphylococcus aureus, encefalite viral, sepse, doenças parasitárias nas quais o dano é induzido por resposta inflamatória (ex: lepra); e para prevenir ou tratar doenças circulatórias, tais como arterioesclerose, aterosclerose, vasculite, poliarterite nodosa e miocardite. Além disso, a presente invenção pode ser usada para prevenir/suprimir uma resposta imune associada com tratamento por terapia gênica, tal como a introdução de genes estranhos em células autólogas e expressão do produto codificado. Assim, em uma concretização, a invenção se refere a um método para tratar uma doença ou distúrbio de resposta imune ou uma resposta ou distúrbio imune-mediado em um indivíduo necessitado de tratamento, compreendendo administrar a dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção.

[0056] Em um aspecto, a invenção provê o uso de compostos da invenção no tratamento de uma variedade de doenças neurodegenerativas, cuja lista não exaustiva inclui: 1. Distúrbios caracterizados por demência progressiva na ausência de outros sinais neurológicos importantes, tais como mal de Alzheimer; demência senil do tipo Alzheimer; e doença de Pick (atrofia lobar); II. Síndromes combinando demência progressiva com outras anormalidades neurológicas importantes, tais como: A) síndromes que ocorrem principalmente em adultos (ex: doença de Huntington, atrofia sistêmica múltipla combinando demência com ataxia e/ou manifestação de doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva (Steel-Richardson-Olszewski), doença de corpo de Lewis difusa, e degeneração corticodentatonigral; e B) síndromes acometendo principalmente crianças ou adultos jovens (ex: doença de Hallervorden-Spatz e epilepsia mioclônica familiar progressiva); III. Síndromes com anormalidades de desenvolvimento gradual em postura e movimento, tais como paralisia agitans (mal de Parkinson), degeneração estriatonigral, paralisia supranuclear progressiva, distonia de torção (espasmo de torção; distonia muscular deformante), torcicolo espasmódico, e outras discinesias, tremor familiar, e síndrome de Gilles de la Tourette; IV. Síndromes de ataxia progressiva, tal como degenerações cerebelares (ex: degeneração cortical cerebelar e atrofia olivopontocerebelar (OPCA)); e degeneração espinocerebelar (ataxia de Friedreich e distúrbios relacionados); V. Síndrome de falha no sistema nervoso central autônomo (síndrome de Shy-Drager); VI. Síndromes de fraqueza e desgaste muscular sem alterações sensoriais (doença do neurônio motor tal como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal (ex: atrofia muscular espinhal infantil (Werdnig-Hoffman), atrofia muscular espinhal juvenil (Wohlfart-Kugelberg-Welander) e outras formas de atrofia muscular espinhal familiar), esclerose lateral primária, e paraplegia espástica hereditária; VII. Síndromes combinando fraqueza e desgaste muscular com alterações sensoriais (atrofia muscular neural progressiva; polineuropatias familiares crônicas), tais como atrofia peronial muscular (Charcot-Marie-Tooth), polineuropatia intersticial hipertrófica (Dejerine-Sottas) e formas variadas de neuropatia progressiva crônica; VIII. Síndromes de perda visual progressiva tal como degeneração pigmentar da retina (retinite pigmentosa) e atrofia óptica hereditária (doença de Leber). Além disso, os compostos da invenção podem estar implicados em remodelagem de cromatina.

[0057] A invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção, conforme acima descritos. A invenção também abrange solvatos dos compostos da invenção e composições farmacêuticas compreendendo tais solvatos, tais como hidratos, metanolatos ou etanolatos. O termo “solvato” se refere a um uma forma sólida, preferivelmente cristalina, de um composto que inclui a presença de moléculas de solvente na retícula cristalina. Um solvato de um composto compreendendo um dado solvente é tipicamente preparado mediante cristalização do composto a partir daquele solvente. Solvatos podem incluir uma variedade de solventes, inclusive água, metanol e etanol. O termo “hidrato” se refere a um solvato no qual o solvente é água e inclui, embora não se restrinja a hemidrato, monoidrato, diidrato, triidrato e similares. A invenção também abrange composições farmacêuticas compreendendo qualquer forma física sólida ou líquida do compostos da invenção, inclusive formas cristalinas e solvatadas cristalinas. Por exemplo, os compostos podem estar em forma cristalina, forma amorfa, e ter qualquer tamanho de partícula. As partículas podem ser micronizadas, ou aglomeradas, podem ser grânulos particulados, pós, óleos, suspensões oleosas ou qualquer outra forma de forma física sólida ou líquida.

[0058] Os compostos da invenção e seus derivados, fragmentos, análogos, homólogos, sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis, podem ser incorporados às composições farmacêuticas apropriadas para administração, juntamente com um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições tipicamente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos acima, e de um portador farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a quantidade eficaz no tratamento de câncer é uma quantidade eficaz para seletivamente induzir a diferenciação terminal de células neoplásicas adequadas e menor que uma quantidade que cause toxicidade em um paciente.

[0059] Os compostos da invenção podem ser administrados através de qualquer meio adequado, inclusive, sem limitação, administração parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, implantação, oral, sublingual, bucal, nasal, pulmonar, transdérmica, tópica, vaginal, retal, e transmucosal ou similares. A administração tópica pode também envolver o uso de administração transdérmica tal como adesivos transdérmicos ou dispositivos de iontoforese. Preparações farmacêuticas incluem uma preparação sólida, semissólida ou líquida (comprimido, grânulos, pastilha, cápsula, supositório, creme, pomada, aerossol, pó, líquido, emulsão, suspensão, xarope, injeção, etc) contendo um composto da invenção como ingrediente ativo, que seja apropriado para o modo selecionado de administração. Em uma concretização, as composições farmacêuticas são administradas oralmente, sendo assim formuladas em uma forma apropriada para administração oral, ou seja, como preparação sólida ou líquida. Formulações orais sólidas adequadas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, sachês, efervescentes, pós, e similares. Formulações orais líquidas apropriadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares. Em uma concretização da presente invenção, a composição é formulada em uma cápsula. De acordo com essa concretização, as composições da presente invenção compreendem, além do composto ativo e do portador ou diluente inerte, uma cápsula de gelatina dura.

[0060] Qualquer excipiente inerte que seja comumente utilizado como portador ou diluente pode ser usado nas formulações da presente invenção, tal como, por exemplo, uma goma, amido, açúcar, material celulósico, acrilato, ou suas misturas. Um diluente preferido é celulose microcristalina. As composições podem ainda compreender um agente desintegrante (ex: croscarmelose sódica) e um lubrificante (ex: estearato de magnésio) e podem adicionalmente compreender um ou mais aditivos selecionados de um ligante, tampão, inibidor de protease, surfactante, agente solubilizante, plastificante, emulsificante, agente estabilizante, agente intensificador de viscosidade, adoçante, agente formador de película, ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, as composições da presente invenção podem estar na forma de formulações de liberação controlada ou imediata.

[0061] Para formulações líquidas, os portadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções, suspensões, emulsões ou óleos aquosos ou não aquosos. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Portadores aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, inclusive meios salinos e tamponados. Exemplos de óleos são os de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de oliva, óleo de girassol, e óleo de fígado de peixe. Soluções ou suspensões podem também incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para ajuste de tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

[0062] Além disso, as composições podem também compreender ligantes (ex: acácia, amido de milho, gelatina, carbômero, etil celulose, goma guar, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, povidona), agentes desintegrantes (ex: amido de milho, amido de batata, ácido algínico, dióxido de silício, croscarmelose sódica, crospovidona, goma guar, glicolato de amido de milho, Primogel), tampões (ex: tris-HCl, acetato, fosfato) de vários pHs e potência iônica, aditivos tais como albumina ou gelatina para evitar absorção por superfícies, detergentes (ex: Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), inibidores de protease, surfactantes (ex: lauril sulfato de sódio), intensificadores de permeação, agentes solubilizantes (ex: glicerol, polietileno glicerol, polietilenoglicol), um lubrificante (ex: dióxido de silício coloidal), antioxidantes (ex: ácido ascórbico, metabissulfito de sódio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (ex: hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose),. agentes intensificadores de viscosidade (ex: carbômero, dióxido de silício coloidal, etil celulose, goma guar), adoçantes (ex: sacarose, aspartame, ácido cítrico), agentes aromatizantes (ex: hortelã, salicilato de metila, ou aromatizante de laranja), conservantes (ex: timerosal, álcool benzílico, parabenos), lubrificantes (ex: ácido esteárico, estearato de magnésio, polietileno glicol, lauril sulfato de sódio), auxiliares de escoamento (ex: dióxido de silício coloidal), plastificantes (ex: dietil ftalato, citrato de trietila), emulsificantes (ex: carbômero, hidroxipropil celulose, lauril sulfato de sódio), revestimentos poliméricos (ex: poloxâmeros ou poloxaminas), revestimentos e agentes formadores de película (ex: etil celulose, acrilatos, polimetacrilatos), e/ou adjuvantes.

[0063] Em uma concretização, os compostos ativos são preparados com portadores que protegem o composto contra a eliminação rápida do organismo, tal como formulações de liberação controlada, inclusive implantes e sistemas de liberação microencapsulada. Polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para preparar tais formulações serão evidentes aos habilitados na técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente da Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossômicas (inclusive lipossomas direcionados a células infectadas com anticorpos monoclonais a antígenos virais) podem também ser usados como portadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, conforme descrito na patente americana No. 4.522.811.

[0064] É especialmente vantajoso formular composições orais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem, conforme aqui utilizada, se refere a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico necessário. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente de características inéditas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser obtido, e limitações inerentes ao estado da técnica de combinação de tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.

[0065] As formulações da invenção destinadas à administração oral podem incluir um ou mais intensificadores de permeação, inclusive ácidos graxos de cadeia longa ou seus sais, tais como ácido decanóico e decanoato de sódio.

[0066] Em uma concretização preferida, o composto pode ser formulado em uma solução aquosa para injeção intravenosa. Em uma concretização, os agentes solubilizantes podem ser adequadamente empregados. Um agente solubilizante particularmente preferido inclui ciclodextrinas e ciclodextrinas modificadas, tais como derivado de β- ciclodextrina substituído com ácido sulfônico ou sal do mesmo, inclusive β-ciclodextrina derivatizada com sulfobutila, tal como solfobutiléter-7-e-ciclodextrina, fornecida pela CyDex, Inc., sob a marca CAPTISOL®.

[0067] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou dispenser juntamente com instruções para administração.

[0068] A administração diária pode ser repetida continuamente por um período de vários dias a vários anos. O tratamento oral pode prosseguir entre uma semana e a vida inteira do paciente. Preferivelmente a administração pode ocorrer por cinco dias consecutivos após o que o paciente poderá ser avaliado para determinar se é necessária administração adicional. A administração pode ser contínua ou intermitente, por exemplo, tratamento por um vários dias consecutivos seguido de um período de descanso. Os compostos da presente invenção podem ser administrados intravenosamente no primeiro dia de tratamento, com administração oral no segundo dia e em todos os dias consecutivos.

[0069] A preparação de composições farmacêuticas que contenham um componente ativo é bem compreendida no estado da técnica, por exemplo, em processos de mistura, granulação ou formação de comprimidos. O ingrediente terapêutico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Para administração oral, os agentes ativos são misturados com aditivos normalmente utilizados para essa finalidade, tais como veículos, estabilizantes, ou diluentes inertes, e convertidos através de métodos costumeiros em formas adequadas para administração, tais como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina mole ou dura, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas, e similares, conforme detalhadas acima.

[0070] A quantidade do composto administrado ao paciente é menor que a quantidade que causaria toxicidade no paciente. Em certas concretizações, a quantidade do composto que é administrada ao paciente é menor que a quantidade que causa uma concentração do composto no plasma do paciente igual ou que excede o nível tóxico do composto. Preferivelmente, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 10 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 25 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 50 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 100 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 500 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 1000 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 2500 nM. Em uma concretização, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida em cerca de 5000 nM. A quantidade ótima do composto que deve ser administrada ao paciente na prática da presente invenção dependerá do composto específico utilizado e do tipo de câncer tratado.

Definições

[0071] Estão relacionadas abaixo as definições de vários termos utilizados para descrever a invenção. Essas definições aplicam-se aos termos utilizados em todo o relatório e nas reivindicações, salvo se restritos em casos específicos, seja individualmente ou como parte de um grupo maior.

[0072] O termo “acila” se refere a hidrogênio, alquila, cicloalquila parcial ou totalmente saturado, heterociclo parcial ou totalmente saturado, e grupos carbonila substituídos com heteroarila. Por exemplo, acila inclui grupos tais como alcanoíla (C1-C6) (ex: formila, acetila, propionila, butirila, valerila, caproíla, t-butilacetila, etc.), cicloalquilcarbonila (C3-C6) (ex: ciclopropilcarbonila, ciclobutilcarbonila, ciclopentilcarbonila, ciclohexilcarbonila, etc.), carbonila heterocíclico (ex: pirrolidinilcarbonila, pirrolid-2-ona-5- carbonila, piperidinilcarbonila, piperazinilcarbonila, tetraidrofuranilcarbonila, etc.), aroíla (ex: benzoíla) e heteroaroíla (ex: tiofenil-2-carbonila, tiofenil-3-carbonila, furanil-2-carbonila, furanil-3-carbonila, 1H-pirroil-2- carbonila, 1H-pirroil-3-carbonila, benzo[b]tiofenil-2- carbonila, etc.). Além disso, a porção alquila, cicloalquila, heterociclo, arila e heteroarila do grupo acila pode ser qualquer um dos grupos descritos nas respectivas definições. Quando indicado como “opcionalmente substituído”, o grupo acila pode ser não substituído ou opcionalmente substituído com um ou mais substituintes (tipicamente, de um a três substituintes) independentemente selecionados do grupo de substituintes relacionados abaixo na definição para “substituído”, ou a porção alquila, cicloalquila, heterociclo, arila e heteroarila do grupo acila pode ser substituída conforme acima descrito na lista preferida e mais preferida de substituintes, respectivamente.

[0073] O termo “alquila” abrange radicais lineares ou ramificados tendo de um a cerca de vinte átomos de carbono ou, preferivelmente, de um a cerca de doze átomos de carbono. Radicais alquila mais preferidos são radicais “alquila inferior” tendo de um a cerca de dez átomos de carbono. Os mais preferidos são radicais alquila inferior tendo de um a cerca de oito átomos de carbono. Exemplos desses radicais incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, ter-butila, pentila, isoamila, hexila e similares.

[0074] O termo “alquenila” abrange radicais lineares ou ramificados tendo pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono de dois a cerca de vinte átomos de carbono ou, preferivelmente, de dois a cerca de doze átomos de carbono. Radicais alquenila mais preferidos são radicais “alquenila inferior” tendo de dois a cerca de dez átomos de carbono, e mais preferivelmente de cerca de dois a cerca de oito átomos de carbono. Exemplos de radicais alquenila incluem etenila, alila, propenila, butenila e 4-metilbutenila. Os termos “alquenila” e “alquenila inferior” abrangem radicais tendo orientações “cis” e “trans” ou, alternativamente, orientações “E” e “Z”.

[0075] O termo “alquinila” abrange radicais lineares ou ramificados tendo pelo menos uma ligação tripla carbono- carbono de dois a cerca de vinte átomos de carbono ou, preferivelmente, de dois a cerca de doze átomos de carbono. Radicais alquinila mais preferidos são radicais “alquinila inferior” tendo de dois a cerca de dez átomos de carbono e mais preferivelmente de cerca de dois a cerca de oito átomos de carbono. Exemplos de radicais alquinila incluem propargila, 1-propinila, 2-propinila, 1-butino, 2-butinila e 1-pentinila.

[0076] O termo “arila”, isoladamente ou em combinação, significa um sistema aromático carbocíclico contendo um, dois ou três anéis, sendo que tais anéis podem ser unidos de forma pendente ou podem ser fundidos. O termo “arila” abrange radicais aromáticos, tais como fenila, naftila, tetraidronaftila, indano e bifenila.

[0077] Os termos “heterociclica”, “heterociclo”, “heterocíclico” ou “heterociclo” abrangem radicais em forma de anel contendo heteroátomo saturado, parcialmente insaturado e insaturado, que podem também ser denominados “heterociclila”, “heterocicloalquenila” e “heteroarila” correspondentemente, onde os heteroátomos podem ser selecionados de nitrogênio, enxofre e oxigênio. Exemplos de radicais heterociclila saturados incluem grupo heteromonocíclico saturado de 3 a 6 membros contendo de 1 a 4 átomos de carbono (ex: pirrolidinila, imidazolidinila, piperidino, piperazinila, etc.); grupo heteromonocíclico saturado de 3 a 6 membros contendo de 1 a 2 átomos de oxigênio e de 1 a 3 átomos de nitrogênio (ex: morfolinila, etc.); grupo heteromonocíclico saturado de 3 a 6 membros, contendo de 1 a 2 átomos de enxofre e de 1 a 3 átomos de nitrogênio (ex: tiazolidinila, etc.). Exemplos de radicais heterociclia parcialmente insaturados incluem diidrotiofeno, diidropirano, diidrofurano e diidrotiazol. Radicais heterociclila podem incluem um nitrogênio pentavalente, tal como em radicais tetrazólio e piridínio. O termo “heterociclo” também abrange radicais em que os radicais heterociclila são fundidos com radicais arila e cicloalquila. Exemplos de tais radicais bicíclicos fundidos incluem benzofurano, benzotiofeno e similares.

[0078] O termo “heteroarila” abrange radicais heterociclila insaturados. Exemplos de radicais heteroarila incluem grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 membros, preferivelmente de 5 ou 6 membros, contendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio, como por exemplo, pirrolila, pirrolinila, imidazolila, pirazolila, piridila, pirimidila, pirazinila, piridazinila, triazolila (ex: 4H-1,2,4-triazolila, 1H-1,2,3- triazolila, 2H-1,2,3-triazolila, etc.) tetrazolila (ex: 1H- tetrazolila, 2H-tetrazolila, etc.), etc.; grupo heterociclila condensado insaturado contendo de 1 a 5 átomos de nitrogênio, por exemplo, indolila, isoindolila, indolizinila, benzimidazolila, quinolila, isoquinolila, indazolila, benzotriazolila, tetrazolopiridazinila (ex: tetrazolo[1,5- b]piridazinila, etc.; grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 membros, preferivelmente de 5 ou 6 membros, contendo um átomo de oxigênio, por exemplo, piranila, furila, etc.; grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 membros, contendo um átomo de enxofre, por exemplo, tienila, etc.; grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 membros, preferivelmente de 5 ou 6 membros contendo de 1 a 2 átomos de oxigênio e de 1 a 3 átomos de nitrogênio, por exemplo, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila (ex: 1,2,4-oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, etc.); grupo heterociclila insaturado condensado contendo de 1 a 2 átomos de oxigênio e de 1 a 3 átomos de nitrogênio (ex: benzoxazolila, benzoxadiazolila, etc.); grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 membros, preferivelmente de 5 ou 6 membros, contendo de 1 a 2 átomos de enxofre e de 1 a 3 átomos de nitrogênio, por exemplo, tiazolila, tiadiazolila (ex: 1,2,4-tiadiazolila, 1,3,4- tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, etc.) etc.; grupo heterociclila insaturado condensado contendo de 1 a 2 átomos de enxofre e de 1 a 3 átomos de nitrogênio (ex: benzotiazolila, benzotiadiazolila, etc.) e similares.

[0079] O termo “heterocicloalquila” abrange radicais alquila substituídos com heterociclo. Radicais heterocicloalquila mais preferidos são radicais “heterocicloalquila inferior” tendo de um a seis átomos de carbono nos radicais heterociclo.

[0080] O termo "substituído"se refere à substituição de um ou mais radicais hidrogênio numa dada estrutura com o radical de um substituinte especificado, inclusive, embora não restrito a: halo, alquila, alquenila, alquinila, arila, heterociclila, tiol, alquiltio, ariltio, alquiltioalquila, ariltioalquila, alquilsulfonila, alquilsulfonilalquila, arilsulfonilalquila, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, aminocarbonila, alquilaminocarbonila, arilaminocarbonila, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, haloalquila, amino, trifluorometila, ciano, nitro, alquilamino, arilamino, alquilaminoalquila, arilaminoalquila, aminoalquilamino, hidroxi, alcoxialquila, carboxialquila, alcoxicarbonilalquila, aminocarbonilalquila, acila, aralcoxicarbonila, ácido carboxílico, ácido sulfônico, sulfonila, ácido fosfônico, arila, heteroarila, heterocíclico e alifático. Fica entendido que o substituinte pode ser também substituído.

[0081] Para simplificar, as porções químicas definidas e designadas em todo o relatório podem ser porções químicas univalentes (ex: alquila, arila, etc.) ou porções multivalentes sob as circunstâncias estruturais apropriadas claras para os habilitados da técnica. Por exemplo, uma porção "alquila" pode se referir a um radical monovalente (ex: CH3-CH2-) ou em outros casos, uma porção ligante bivalente pode ser "alquila", e nesses casos os habilitados na técnica entenderão o alquila como sendo um radical divalente (ex: -CH2-CH2-), que é equivalente ao termo "alquileno". De forma similar, em circunstâncias em que porções divalentes são necessárias e citadas como sendo "alcoxi", "alquilamino", "ariloxi", "alquiltio", "arila", "heteroarila", "heterocíclico", "alquila""alquenila", "alquinila", "alifático", ou "cicloalquila", os habilitados na técnica entenderão que os termos "alcoxi", "alquilamino", "ariloxi", "alquiltio", "arila", "heteroarila", "heterocíclico", "alquila", "alquenila", "alquinila", "alifático", ou "cicloalquila" referem-se à porção divalente correspondente.

[0082] Os termos "halogênio"ou "halo", conforme aqui utilizados, referem-se a um átomo selecionado de flúor, cloro, bromo e iodo.

[0083] Conforme aqui utilizado, o termo "proliferação aberrante" se refere a crescimento anormal de células.

[0084] A expressão "terapia adjuvante" abrange o tratamento de um indivíduo com agentes que reduzem ou evitam efeitos colaterais associados com a terapia combinada da presente invenção, inclusive, embora não restrita aos agentes, por exemplo, que reduzem o efeito tóxico de fármacos anticâncer, como por exemplo, os inibidores de reabsorção óssea, agentes cardioprotetores; prevenção ou redução da incidência de náusea e vômitos associados com quimioterapia, radioterapia ou operação; ou redução da incidência de infecções associadas com a administração de fármacos anticâncer mielossupressores.

[0085] O termo "angiogênese", conforme aqui utilizado, se refere à formação de vasos sanguíneos. Especificamente, a angiogênese é um processo em etapa múltipla no qual células endoteliais se degradam focalmente e invadem sua própria membrana basal, migram pelo estroma intersticial por um estímulo angiogênico, proliferam nas proximidades do terminal de migração, organizam-se em vasos sanguíneos, e religam-se à membrana basal recentemente sintetizada (vide Folkman et al., Adv. Cancer Res., Vol. 43, p. 175-203 (1985)). Agentes antioangiogênicos interferem nesse processo. Exemplos de agentes que interferem em várias dessas etapas incluem trombospondina-1, angiostatina, endostatina, interferon alfa e compostos tais como inibidores de metaloproteinase de matriz (MMP) que bloqueiam as ações de enzimas que limpam e criam vias para o seguimento de novos vasos sanguíneos em formação; compostos tais como inibidores de .alfa.v.beta.3, que interferem com moléculas que células de vasos sanguíneos utilizam para criar ponte entre um vaso sanguíneo parental e um tumor; agentes, tais como inibidores de COX-2 específicos, que impedem o crescimento de células que formam novos vasos sanguíneos; e compostos à base de proteína, que simultaneamente interferem com vários desses alvos.

[0086] O termo "apoptose", conforme aqui utilizado, se refere à morte celular programada sinalizada pelos núcleos em células humanas e animais de funcionamento normal, conforme assim determinar a idade ou estado de saúde e condição da célula. Um "agente indutor de apoptose" desencadeia o processo de morte celular programada.

[0087] O termo "câncer", conforme aqui utilizado, denota uma classe de doenças e distúrbios caracterizados por divisão descontrolada de células e a capacidade de essas células invadirem outros tecidos, seja por crescimento direto para dentro do tecido adjacente através de invasão ou pela implantação em locais distantes por metástase.

[0088] Os termos "composto" e “composto da invenção”, conforme aqui utilizados, referem-se a compostos de Fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos da invenção podem ser obtidos de diferentes formas, inclusive formas cristalinas e amorfas. Os compostos também podem ocorrer como solvatos, por exemplo, hidratos, ou solvatos de um solvente orgânico, preferivelmente um solvente farmaceuticamente aceitável. Os compostos também podem ocorrer em formas múltiplas, cristalinas ou polimórficas. Os compostos da invenção incluem também profármacos e ésteres farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula 1.

[0089] O termo "dispositivo" se refere a qualquer utensílio, geralmente mecânico ou elétrico, designado a realizar uma função específica.

[0090] Conforme aqui utilizado, o termo "displasia" se refere ao crescimento anormal de células, e tipicamente, se refere à forma mais precoce de lesão pré-cancerosa reconhecível numa biópsia por um patologista.

[0091] Conforme aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz dos compostos objeto" em relação ao método de tratamento objeto, se refere a uma quantidade do composto objeto que, quando liberada como parte do regime de dosagem desejado, causa, por exemplo, uma alteração na taxa de proliferação celular e/ou no estado de diferenciação e/ou na taxa de sobrevivência de uma célula segundo padrões clinicamente aceitáveis. Essa quantidade pode também aliviar até certo grau um ou mais sintomas de um distúrbio neoplásico, inclusive, embora não restrito a: 1) redução no número de células cancerosas; 2) redução no tamanho do tumor; 3) inibição (ou seja, desaceleração até certo grau, ou preferivelmente interrupção) de infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; 4) inibição (ou seja, desaceleração até certo grau, preferivelmente interrupção) de metástase tumoral; 5) inibição, até certo grau, do crescimento do tumor; 6) alívio ou redução até certo grau de um ou mais sintomas associados com o distúrbio; e/ou 7) alívio ou redução de efeitos colaterais associados com a administração de agentes anticâncer.

[0092] O termo "hiperplasia", conforme aqui utilizado, se refere à divisão ou crescimento celular excessivo.

[0093] A expressão "agente imunoterapêutico"se refere a agentes utilizados para transferir a imunidade de um doador imune, por exemplo, outra pessoa ou um animal, para um hospedeiro por inoculação. O termo abrange o uso de soro ou gamaglobulina contendo anticorpos produzidos por outro indivíduo ou por um animal; estimulação sistêmica não específica; adjuvantes; imunoterapia específica ativa; e imunoterapia adotiva. Imunoterapia adotiva se refere ao tratamento de uma doença através de terapia ou agentes que incluem inoculação no hospedeiro de linfócitos sensibilizados, fator de transferência, RNA imune, ou anticorpos em soro ou gamaglobulina.

[0094] O termo "inibição", no contexto de neoplasia, crescimento tumoral ou crescimento de célula tumoral, pode ser avaliado pelo aparecimento retardado de tumores primários ou secundários, desenvolvimento lento de tumores primários ou secundários, ocorrência reduzida de tumores primários ou secundários, severidade lenta ou reduzida de efeitos secundários de doenças, interrupção no crescimento e regressão de tumores, entre outros. No grau extremo, inibição completa é aqui designada como prevenção ou quimioprevenção.

[0095] O termo "metástase", conforme aqui utilizado, se refere à migração de células cancerosas do local de tumor original através dos vasos sanguíneos e linfáticos, para produzir cânceres em outros tecidos. A metástase é também o termo utilizado para um câncer secundário se desenvolvendo em um local distante.

[0096] O termo "neoplasma", conforme aqui utilizado, se refere à uma massa anormal de tecidos resultante de divisão excessiva de células. Os neoplasmas podem ser benignos (não cancerosos) ou malignos (cancerosos) e podem também ser denominados como tumor. O termo "neoplasia"é o processo patológico que resulta na formação de tumor.

[0097] Conforme aqui utilizado, o termo "pré-canceroso"se refere a uma condição não maligna, mas que possivelmente pode se tornar maligna, se não tratada.

[0098] O termo "proliferação"se refere a células que sofrem mitose.

[0099] A expressão “doença ou distúrbio relacionado com PI3 quinase” se refere a uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade não apropriada de fosfoinositídeo-3-quinase ou a superatividade do fosfoinositídeo-3-quinase. Atividade não apropriada se refere: (i) expressão de PI3 quinase em células que normalmente não expressão PI3 quinase; (ii) expressão aumentada de PI3 quinase, levando à proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular indesejados; ou, (iii) expressão reduzida de PI3 quinase, levando a reduções indesejadas na proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular. Superatividade da PI3 quinase se refere à amplificação do gene que codifica uma PI3 quinase específica ou a produção de um nível de atividade de PI3 quinase que pode estar correlacionada com distúrbio na proliferação, diferenciação e/ou crescimento celular (ou seja, à medida que aumenta o nível da PI3 quinase, aumenta a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio celular).

[0100] A expressão "agente radioterapêutico"se refere ao uso de radiação eletromagnética ou particulada no tratamento de neoplasias.

[0101] O termo "recorrência", conforme aqui utilizado, se refere à recidiva de câncer após um período de remissão. Pode ocorrer devido à incompleta remoção de células do câncer inicial e pode ocorrer localmente (no mesmo local do câncer inicial), regionalmente (nas proximidades do câncer inicial, possivelmente nos nódulos linfáticos ou tecido), e/ou distalmente como resultado de metástase.

[0102] O termo "tratamento" se refere a qualquer processo, ação, aplicação, terapia, ou similar, em que um mamífero, inclusive um ser humano, é submetido à assistência médica com o objetivo de melhorar a condição do mamífero, direta ou indiretamente.

[0103] O termo "vacina" inclui agentes que induzem o sistema imune do paciente a montar uma resposta imune contra o tumor, atacando células que expressem antígenos associados com tumor (Teas).

[0104] Conforme aqui utilizado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável"se refere aos sais que são, no escopo do critério médico válido, apropriados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevidas, e similares, e compatíveis com uma relação risco/benefício razoável. Sais farmaceuticamente aceitáveis são bastante conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, S.M. Berge et al., descreve sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes na J.Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação final dos compostos da invenção, ou separadamente reagindo-se a função de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Exemplos de sais de adição de ácido atóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluem, embora não se restrinjam a sais de um grupo amino formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, e ácido perclórico, ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido lactobiônico ou ácido malônico, ou utilizando outros métodos utilizados no estado da técnica, tal como troca iônica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, embora não se restrinjam a adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforssulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilssulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidroxi- etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2- naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, perssulfato, 3- fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p- toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato, e similares. Sais de álcalis ou de metal alcalinoterroso incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similares. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, cátions atóxicos de amônio, amônio quaternário, e cátions amina formados utilizando contraíons, tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono, sulfonato de aril sulfonato. Certos sais tais como sais básicos de sódio, potássio e colina, bem como sais ácidos tais como sais de sulfato e metanossulfonato demonstraram melhorar a solubilidade de compostos de Fórmula I em meios aquosos farmaceuticamente aceitáveis. Em uma concretização, o sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 é o sal de colina. Sais preferidos de Composto 1 incluem o sal de sódio e o sal de potássio. Outros sais preferidos incluem sais de sulfato e de metanossulfonato.

[0105] Conforme aqui utilizado, o termo "éster farmaceuticamente aceitável"se refere a ésteres que hidrolisam in vivo e que incluem aqueles que se decompõem rapidamente no corpo humano para liberar o composto parental ou um sal do mesmo. Grupos éster apropriados incluem, por exemplo, os derivados de ácidos carboxílicos alifáticos farmaceuticamente aceitáveis, particularmente ácidos alcanóicos, alquenóicos, cicloalcanóicos e alcanodióicos, nos quais cada porção alquila ou alquenila vantajosamente não tem mais do que 6 átomos de carbono. Exemplos de ésteres específicos incluem, embora não se restrinjam a formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos e etilsuccinatos.

[0106] O termo "profármacos farmaceuticamente aceitáveis", conforme aqui utilizado, se refere aos profármacos dos compostos da presente invenção que são, no escopo do critério médico válido, apropriados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevidas, e similares, e compatíveis com uma relação risco/benefício razoável e eficazes para seu uso pretendido, bem como formas zwitteriônicas, quando possível, dos compostos da presente invenção.

[0107] "Profármaco", conforme aqui utilizado, significa um composto que é conversível in vivo por meios metabólicos (ex: por hidrólise) em um composto da invenção. Várias formas de profármacos são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, conforme discutido em Bundgaard (ed.), Design de Prodrugs, Elsevier (1985); Widder et al. (ed.) Methods de Enzymology, vol. 4, Academic Press (1985); Krogsgaard-Larsen, et al., (ed.). "Design and Application de Prodrugs, Textbook de Drug Design and Development, Capítulo 5, 113-191 (1991); Bundgaard et al., Journal de Drug Deliver Reviews, 8:1-38 (1992); Bundgaard, J. de Pharmaceutical Sciences, 77:285 et seq. (1988); Higuchi e Stella (eds.). Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems, American Chemical Society (1975); e Bernard Testa & Joachim Mayer, "Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry and Enzymology," John Wiley and Sons, Ltd. (2002).

[0108] Conforme aqui utilizado, o termo "portador farmaceuticamente aceitável"pretende incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica, tais como água estéril livre de pirogênio. Portadores apropriados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão no campo, aqui incorporado por referência. Exemplos preferidos de tais portadores ou diluentes incluem, embora não se restrinjam a água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose, e albumina humana sérica a 5%. Lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixos, podem também ser usados. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bastante conhecido no estado da técnica. Exceto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, é previsto seu uso nas composições. Compostos ativos complementares podem também ser incorporados às composições.

[0109] Conforme aqui utilizado, o termo “pré-canceroso” se refere a uma condição não maligna, mas que possivelmente pode se tornar maligna, se não tratada.

[0110] O termo "indivíduo", conforme aqui utilizado, se refere a um animal. Preferivelmente, o animal é um mamífero. Mais preferivelmente, o mamífero é um ser humano. Um indivíduo também se refere, por exemplo, a cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, porquinho-da-índia, pássaros e similares.

[0111] Os compostos da presente invenção podem ser modificados adicionando a eles funcionalidades apropriadas para aumentar as propriedades biológicas seletivas. Tais modificações são conhecidas no estado da técnica e podem incluir as que aumentam a penetração biológica num determinado sistema biológico (ex: sangue, sistema linfático, sistema nervoso central), que aumentam a disponibilidade oral, a solubilidade para permitir a administração por injeção, que alteram o metabolismo e a taxa de excreção.

[0112] Os compostos sintetizados podem ser separados de uma mistura de reação e purificados através de um método tal como cromatografia de coluna, cromatografia líquida de alta pressão, ou recristalização. Conforme pode ser apreciado pelo habilitado na técnica, outros métodos para sintetizar os compostos das fórmulas da presente invenção serão evidentes aos habilitados na técnica. Adicionalmente, as várias etapas sintéticas podem ser conduzidas em uma sequência ou ordem alternada para dar os compostos desejados. Transformações químicas sintéticas e metodologias de proteção de grupo (proteção e desproteção) úteis na sintetização dos compostos aqui descritos são conhecidas no estado da técnica e incluem, por exemplo, aquelas tais como descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene e P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, ed., Encyclopedia de Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), e suas edições posteriores.

Composições farmacêuticas

[0113] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção formulado juntamente com um ou mais portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0114] Preferivelmente, o portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável significa um enchimento, diluente, material encapsulante ou auxiliar de formulação atóxico, inerte, sólido, semisólido ou líquido de qualquer tipo. Alguns exemplos de materiais que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; ciclodextrinas, tais como αlfα-(α), beta-(β) e gama-(Y)ciclodextrinas; amidos, tais como amido de milho e fécula de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis tais como propileno glicol; ésteres tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis atóxicos, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, segundo o critério do formulador.

[0115] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por via oral, parenteral, spray para inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginal, ou através de um reservatório implantado, preferivelmente através de administração oral ou por injeção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem conter quaisquer portadores, adjuvantes ou veículos convencionais atóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitáveis para aumentar a estabilidade do composto formulado ou de sua forma de liberação. O termo parenteral, conforme aqui utilizado, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intracisternal, intratecal, intralesional e intracraniana.

[0116] Formas líquidas de dosagem para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas de dosagem líquidas contêm diluentes inertes comumente utilizados no estado da técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3- butileno glicol, dimetilformamida, óleos (especialmente, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, rícino e gergelim), glicerol, álcool tetraidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitan, e suas misturas. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes, tais como agentes molhantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes.

[0117] Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões injetáveis estéreis aquosas ou oleaginosas, podem ser formuladas de acordo com o estado da técnica, utilizando agentes dispersantes ou molhantes e agentes de suspensão. A preparação estéril injetável pode também ser uma solução, suspensão ou emulsão estéril injetável num diluente ou solvente atóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, solução de Ringer, solução de cloreto de sódio U.S.P. e isotônica. Além disso, óleos estéreis, fixos são convencionalmente empregados como solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, inclusive mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tais como ácido oleico, são usados na preparação de injetáveis.

[0118] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração em filtro retentor de bactérias, ou incorporando-se agentes esterilizantes na forma de composições estéreis sólidas que podem ser dissolvidas ou dispersadas em água estéril ou outro meio estéril injetável antes do uso.

[0119] Para prolongar o efeito de um fármaco, é frequentemente desejável desacelerar a absorção do fármaco da injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado mediante o uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco depende então de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrada parenteralmente é conduzida dissolvendo-se ou suspendendo-se o fármaco em veículo oleoso. Formas "depot"injetáveis são preparadas formando-se matrizes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo- poliglicolídeo. Dependendo da relação fármaco-polímero e da natureza do polímero específico empregado, a taxa de liberação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formas "depot"injetáveis são também preparadas aprisionando-se o fármaco em lipossomas ou microemulsões que sejam compatíveis com tecidos corporais.

[0120] Composições para administração retal ou vaginal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados misturando-se os compostos da presente invenção com excipientes ou portadores não irritantes apropriados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol ou uma cera para supositório, que são sólidos à temperatura ambiente ou líquidos à temperatura corporal e que, portanto, derretem na cavidade retal ou vaginal e liberam o composto ativo.

[0121] Formas sólidas de dosagem para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Nessas formas sólidas de dosagem, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente ou portador inerte farmaceuticamente aceitável, tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou: a) cargas ou diluentes, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico; b) ligantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarose, e acácia, c) umectantes, tais como glicerol, d) agentes desintegrantes, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, fécula de batata ou amido de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio, e) agentes retardantes de solução, tal como parafina, f) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário, g) agentes molhantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, h) absorventes, tais como caolim e argila bentonítica, e i) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e suas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem pode também compreender agentes tamponantes.

[0122] Composições sólidas de tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas gelatinosas moles e duras, utilizando excipientes como lactose ou açúcar lácteo (lactose), bem como polietileno glicóis de alto peso molecular, e similares.

[0123] As formas sólidas de dosagem de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e capas, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos conhecidos no estado da técnica de formulação farmacêutica. Podem opcionalmente conter agentes opacificantes e podem também ter uma composição tal que liberem o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, ou preferencialmente, numa certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de forma retardada. Exemplos de composições incrustantes que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

[0124] Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um composto da presente invenção incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalalantes ou adesivos. O componente ativo é misturado sob condições estéreis com um portador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários. Formulação oftálmica, colírios, pomadas oftálmicas, pós e soluções são também previstos no escopo da presente invenção.

[0125] As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um composto ativo da presente invenção, excipientes, tais como gorduras, óleos, graxas vegetais, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou suas misturas.

[0126] Pós e sprays podem conter, além dos compostos da presente invenção, excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e poliamida em pó, ou misturas dessas substâncias. Os sprays podem adicionalmente conter propelentes habitualmente empregados, tais como clorofluoroidrocarbonos.

[0127] Adesivos transdérmicos possuem a vantagem adicional de prover liberação controlada de um composto ao organismo. Tais formas de dosagem podem ser preparadas dissolvendo-se ou dispensando-se o composto num meio apropriado. Melhoradores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A taxa pode ser controlada provendo-se uma membrana controladora de taxa ou dispersando- se o composto numa matriz polimérica ou gel.

[0128] Para liberação pulmonar, uma composição terapêutica da invenção é formulada e administrada a um paciente na forma particulada sólida ou líquida, através de administração direta, por exemplo, inalação no sistema respiratório. Formas particuladas sólidas ou líquidas do composto ativo preparadas para a prática da presente invenção incluem partículas de tamanho respirável: ou seja, partículas com um tamanho suficientemente pequeno que passem pela boca e laringe mediante inalação e que penetrem nos brônquios e alvéolos dos pulmões. A liberação de agentes terapêuticos aerossolizados, particularmente antibióticos aerossolizados, é conhecida no estado da técnica (vide, por exemplo, patente americana No. 5.767.068 de VanDevanter et al., patente americana No. 5.508.269 de Smith et al., e WO 98/43650 de Montgomery, todos aqui incorporados por referência). Uma discussão sobre a liberação pulmonar de antibióticos é também encontrada na patente americana No. 6.014.969, aqui incorporada por referência.

[0129] Por "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto entende-se uma quantidade do composto que confere um efeito terapêutico sobre o indivíduo tratado, a uma relação risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento médico. O efeito terapêutico pode ser objetivo (ou seja, mensurável através de algum teste ou marcador) ou subjetivo (ou seja, o indivíduo dá uma indicação de ou experimenta um efeito). Uma quantidade eficaz do composto descrita acima pode variar de cerca de 0,1 mg/Kg a cerca de 500 mg/Kg, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 50 mg/Kg. Doses eficazes também variam dependendo da via de administração, bem como da possibilidade de uso concomitante com outros agentes. Fica entendido, porém, que a utilização diária total dos compostos e composições da presente invenção será decidida pelo médico no escopo do critério médico válido. O nível de dose específica terapeuticamente eficaz para qualquer paciente específico dependerá de uma variedade de fatores, inclusive do distúrbio a ser tratado e da gravidade do distúrbio; da atividade do composto específico empregado; da composição específica empregada; da idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; do período de administração, via de administração, taxa de excreção do composto específico empregado; da duração do tratamento; fármacos utilizados em combinação ou concomitantemente com o composto específico empregado e fatores similares conhecidos no estado da técnica médica.

[0130] A dose diária total dos compostos da presente invenção administrada a um ser humano ou outro animal em doses únicas ou divididas pode ser em quantidades, por exemplo, de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal ou mais geralmente de 0,1 a 25 mg/kg de peso corporal. Composições em dose única podem conter essas quantidades ou submúltiplos da mesma, para compor a dose diária. Em geral, os regimes de tratamento, de acordo com a presente invenção, compreendem a administração a um paciente necessitado de tal tratamento, de cerca de 10 mg a cerca de 1000 mg do(s) composto(s) da presente invenção por dia em doses únicas ou múltiplas.

[0131] Os compostos das fórmulas aqui descritas podem, por exemplo, ser administrados através de injeção, por via intravenosa, intraarterial, subdérmica, intraperitoneal, intramuscular, ou subcutânea; ou por via oral, bucal, nasal, transmucosal, tópica, numa preparação oftálmica, ou por inalação, com uma dosagem variando de cerca de 0,1 a cerca de 500 mg/kg de peso corporal, alternativamente dosagens entre 1 mg e 1000 mg/dose, a cada 4 a 120 horas, ou de acordo com as exigências do fármaco específico. Os métodos da presente invenção contemplam a administração de uma quantidade eficaz de composto ou de composição do composto para obter o efeito desejado ou estipulado. Tipicamente, as composições farmacêuticas da presente invenção serão administradas de cerca de 1 a cerca de 6 vezes por dia ou alternativamente, como infusão contínua. Tal administração pode ser empregada na forma de tratamento crônico ou agudo. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com excipientes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo específico de administração. Uma preparação típica conterá de cerca de 5% a cerca de 95% de composto ativo (em peso). Alternativamente, essas preparações poderão conter de cerca de 20% a cerca de 80% de composto ativo.

[0132] Doses menores ou maiores que as citadas acima podem ser necessárias. Regimes específicos de dosagem e tratamento para qualquer paciente em particular dependerão de uma variedade de fatores, inclusive da atividade do composto específico empregado, da idade, peso corporal, condição geral de saúde, sexo, dieta, período de administração, taxa de excreção, combinação farmacológica, gravidade e curso da doença, condição ou sintomas, disposição do paciente em relação à doença, condição ou sintomas, e critério do médico.

[0133] Mediante melhora na condição do paciente, uma dose de manutenção de um composto, composição ou combinação da presente invenção pode ser administrada, se necessário. Posteriormente, a dosagem ou frequência de administração, ou ambas, pode ser reduzida, como função dos sintomas, em um nível no qual a condição de melhora seja mantida quando os sintomas tiverem sido atenuados ao nível desejado. Os pacientes podem, porém, necessitar de tratamento intermitente a longo prazo, em qualquer recorrência de sintomas da doença. Exemplos

[0134] Os compostos e processos da presente invenção serão melhor compreendidos em relação aos exemplos a seguir, que pretendem ilustrar e não restringir o escopo da invenção. Várias alterações e modificações às concretizações descritas serão evidentes aos habilitados na técnica e tais alterações e modificações incluindo, sem restrição, as relacionadas com estruturas químicas, substituintes, derivados, formulações e/ou métodos da invenção, poderão ser efetuadas sem fugir do e espírito da invenção e do escopo das reivindicações anexas.

[0135] A síntese do Composto 1 e de seus sais de metanossulfonato, sódio, potássio e colina, é ilustrada nos esquemas abaixo.

[0136] O intermediário 107-1 ou 107-2 podem ser preparados reagindo-se 106 com R-2-1 ou R-2-2, rspectivamente. Os esquemas sintéticos para a síntese de R-2-1 e R-2-2 são ilustrados abaixo:

ou através de um método alternativo:

[0137] Os Intermediários 108-1 e 108-2 podem ser preparados através de reação de acoplamento de 107-1 ou 107-2 onde R-3-1 e R-3-2 podem ser preparados Exemplo 1:Preparação de N-hidroxi-2-(((2-(6-metoxipiridin-3- il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-il)metil) (metil)amino)pirimidino-5-carboxamida (Composto 1)

Etapa a: (Z)-etil-2-(etoximetil)-3-metoxiacrilato (Composto 202)

[0138] Sódio (30,9 g, 1,78 mol) foi adicionado a etanol (750 ml) em porções cuidadosamente a solução concentrada para dar NaOEt em pó após todo o metal sódio desapareceu. Sob agitação, hexano (1,0 L) foi adicionado e a mistura resfriada com banho gelado. Uma mistura de 201 (130g, 0,89 mol) e formiato de etila (131 g, 1,78 mol) foi adicionada gota a gota a 0-5°C. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. Sulfato de dimetila (224 g, 1,78 mol) foi adicionado gota a gota com resfriamento de banho gelado. A mistura resultante foi aquecida a 50°C por 2 horas. À mistura adicionou-se cloreto de trietilamônio (122 g) e hidróxido de sódio (20 g). A mistura foi então agitada à temperatura ambiente por 4 horas e filtrada. O filtrado foi lavado com água e secado sobre Na2SO4. Foi concentrada para dar o composto título (140g, 37%) na forma de um óleo incolor que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional.

Etapa b: 2-oxo-l,2,3,4-tetraidropirimidino-5-carboxilato de etila (Composto 203)

[0139] Uma mistura do composto 202 (140g, 0,745 mol), ureia (40.0g, 0,697 mol) e ácido clorídrico concentrado (34 ml) em etanol (500 ml) foi aquecida sob refluxo da noite para o dia. Após evaporação de ~50% de volume de reação, a suspensão resultante foi filtrada, lavada com pequena quantidade de etanol e secada para dar o composto 203 (47 g, 37%) na forma de um sólido branco. LCMS: 171 [M+l]. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.19 (t, J= 7.2 Hz , 3H), 3.92 (s, 2H), 4.08 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 7.0 (s, 1H), 7.08 (d, J= 6.0 Hz , 1H), 8.83 (d, br, J= 4.8 Hz, 1H).

Etapa c: 2-oxo-l,2-diidropirimidino-5-carboxilato de etila (Composto 204)

[0140] A uma solução de composto 203 (47g, 280 mmol) em ácido acético (500 ml) adicionou-se bromo (49,0g, 307 mmol). A mistura foi aquecida sob refluxo por 2 horas, resfriada à temperatura ambiente, novamente resfriada a 0-5°C e filtrada para dar o composto título 204 na forma de um sólido amarelo (38g, 54%). LCMS: 169 [M+l]-. 1H NMR (400 MHz, D20): δ 1.28 (t, J = 7.2 Hz , 3H), 4.32 (q, J= 7.2 Hz , 2H), 9.00 (br, s, 2H).

Etapa d: 2-cloropirimidino-5-carboxilato de etila (Composto R-2-1)

[0141] Uma mistura de composto 204 (38.0 g, 153 mmol) e de tricloreto de fosforila (300 ml) e de N,N-dimetilanilina (3 ml) foi aquecida sob refluxo por 2 horas, resfriada à temperatura ambiente e concentrada. O resíduo foi rapidamente resfriado cuidadosamente com água gelada, pH ajustado em 7-8 com carbonato de sódio e extraído com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água gelada e salmoura, secadas sobre Na2SO4, evaporadas e purificadas através de cromatografia de coluna (eluídas com EtOAc/hexanos, 10%) para dar o composto R-2-1 (15g, 52%) na forma de um sólido branco. LCMS: 187 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.36 (t, J= 7.5 Hz , 3H), 4.39 (q, J= 7.5 Hz, 2H), 9.08 (s, 2H).

Etapa e:(Z)-2-(dimetoximetil)-3-metoxi-3-oxoprop-1-en-l- olato de sódio (Composto 206)

[0142] Uma mistura de NaH (27g, 60% em óleo mineral, 0,675mol) em 1,2-dimetoxietano anidro (300 m l) foi aquecida a 40-50°C e 3,3-dimetoxi propionato de metila (205) (100g, 0,675 mol) foi adicionada gota a gota. A mistura resultante foi agitada por 0,5 h e formiato de metila anidro (81 g, 1,35 mol) foi adicionado gota a gota a 40-50°C. A mistura resultante foi agitada a 40-50°C (temperatura interna) por 2 horas antes de ser resfriadaa 0°C. A mistura de reação foi deixada aquecer a 25°C lentamente a agitada da noite para o dia. Et2O (150 ml) foi adicionado e agitado por 30 minutos. A suspensão resultante foi filtrada. O sólido foi lavado com Et2O (100ml), coletado e secado para dar o composto título 206 (82g, 61%) na forma de um sólido esbranquiçado. LCMS (m/z): 130,8 [M+l]+. 1HNMR (400 MHz, CD3OD): δ 3,36 (s, 6H), 3,60 (s, 3H), 5,34 (s, 1H), 8,92 (s, 1H).

Etapa f: Metil éster de ácido 2-Amino-pirimidino-5- carboxílico (Composto 207)

[0143] A uma mistura de cloridrato de guanidina (42,2 g, 0,44 mol) em DMF (300 mL) adicionou-se o composto 206 (80 g, 0,40 mol) . A mistura resultante foi aquecida a 100°C por 1 hora. A mistura de reação foi filtrada antes do resfriamento. A torta de filtro foi lavada com 50 ml de DMF e o filtrado combinado foi concentrado para deixar um resíduo que foi suspenso em EtOH frio e lavado com EyOH frio (50 ml) para dar o composto 207 (38g, 61,5%) na forma de um sólido amarelo. LCMS (m/z): 154,2 [M+l]+, 195,1 [M+42]+. 1H NMR(400 MHz, CD3OD): δ 3,88 (s, 3H), 8,77 (s, 2H).

Etapa g: 2-cloropirimidino-5-carboxilato de metila (Composto R-2-2)

[0144] O Composto 207 (7 g, 0,046 mol) foi adicionado a uma mistura de ácido clorídrico concentrado (15,2 ml) e CH2Cl2 (60 ml). Após resfriamento, ZnCl2 (18,6g, 0,138 mol) foi adicionado a 15-20°C. A mistura foi agitada a 15-20°C por 0,5 h e resfriada a 5-10°C, NaNO2 (9,5 g, 0,138 mol) foi adicionado em porções, mantendo-se ao mesmo tempo a temperatura interna a 5-10°C. A reação prosseguiu por ~2h. A mistura de reação foi despejada em água gelada (50 ml). A camada orgânica foi separada e a fase aquosa extraída com CH2Cl2 (30 ml*2). Os extratos orgânicos combinados foram concentrados para dar o produto bruto (4,2 g). O composto bruto foi suspenso em hexano (20 ml), aquecido a 60°C por 30 minutos e filtrado. O filtrado foi concentrado para dar o composto título R-2-2 (3,5g, 44,4%) na forma de um sólido esbranquiçado. LCMS (m/z): 214,1 [M+42]+. 1HNMR (400 MHz, CDCl3): δ 4,00 (s, 3H), 9,15 (s, 2H).

Etapa h: 5-bromo-2-metoxipiridina (Composto 303)

[0145] Uma solução de 2-metoxipiridina (100g, 0,92 mol), NBS (180 g, 1,0 mol) em acetonitrila (1,0L) foi agitada sob refluxo por 21 horas. TLC mostrou que a reação estava concluída. A mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente e concentrada. ~900ml de solvente foram coletados. A suspensão resultante foi filtrada e lavada com n-hexano (~400ml). O filtrado foi concentrado novamente para dar o produto bruto. O produto bruto foi destilado à pressão reduzida (30°C/~0,3 mmHg) para dar o composto título na forma de um óleo claro (146 g, 84%). LCMS (m/z): 190,0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3,90 (s, 3H), 6,65 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 7,62 (dd, J= 8,8 Hz, 2,4Hz, 1H), 8,19 (s, 1H).

Etapa i: Ácido 6-metoxipiridin-3-ilborôinico (R-3-1):

[0146] A uma solução de composto 303 (20g, 0,11 mol) em THF anidro (180 ml) adicionou-se gota a gota n-BuLi (59 ml, 2M em THF) a -78°, a mistura resultante foi agitada por 1 hora. Borato de triisopropila (37 ml) foi adicionado a -78°C e a mistura de reação aquecida à temperatura ambiente e agitação prosseguiu da noite para o dia. TLC (hexanos/acetato de etila=5:1) mostrou reação completa. A mistura teve pH ajustado em 3-4 com HCl 4N (90 ml). O precipitado foi coletado por filtração para dar o composto bruto R-3-1 (21g, 128%). O composto bruto R-3-1 (21g) foi dissolvido em água (200 ml) e a solução teve pH ajustado em 8-9 com solução de amônia concentrada, o precipitado foi coletado por filtração para dar o composto título puro R-3-1 na forma de um sólido branco (11g, 67%). LCMS (m/z): 154,1 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,86 (s, 3H), 6,76 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,99 (dd, J= 8,4 Hz, 2,0 Hz, 1H), 8,05 (br, 2H), 8,52 (d, J= 2,0 Hz, 1H).

Etapa j: 2-metoxi-5-(4,4,5,5,-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan- 2-il)piridina (Composto R-3-2)

[0147] Uma mistura de composto 303 (55g, 0,29 mol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(l,3,2-dioxaborolano) (90g, 0,35 mol), acetato de potássio (57g, 0,58 mol) e cloreto de bis(trifenilfosfino)paládio(II) (2,2 g, 3 mmol) em dioxano anidro (500 ml) foi aquecido a 108°C sob atmosfera de N2 da noite para o dia. A mistura de reação foi concentrada e purificada através de cromatografia de coluna eluída com hexanos/acetato de etila para dar o composto título R-3-2 (58g, 84 %). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1,30 (s,12H), 3,88 (s, 3H), 6,81 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,88 (dd, J= 8,0 Hz, 2,0Hz, 1H), 8,41 (d, J = 2,0Hz, 1H).

Etapa k: Tieno[3,2-d]pirimidino-2,4(lH,3H)-diona (Composto 102)

[0148] Método ureia: Uma mistura de 3-aminotiofeno-2- carboxilato de metila (101) (90,0 g, 573 mmol, 1,0 eq) e ureia (277,6 g, 4,6 mol, 8,0 eq) foi aquecida a 190°C por 3-4 h e resfriada à temperatura ambiente. À mistura de reação adicionou-se NaOH aq. (10%, 800 ml). Após agitação à temperatura ambiente por 1 hora, o sólido foi removido por filtração. O filtrado foi acidificado com HCl até pH 3-4, o sólido precipitado coletado por filtração, lavado com água e secado em vácuo para dar o produto composto desejado 102 na forma de um sólido esbranquiçado (87g, 89%). m.p.:280-285°C. LCMS (m/z): 169,0 [M+1]1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 6,92 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 8,05 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 11,0-11,5 (br, 2H).

[0149] Método KOCN: A uma mistura de 3-aminotiofeno-2- carboxilato (101) (100,0 g, 636,9 mmol, 1,0 eq), ácido acético (705 ml) e água (600 ml) adicionou-se uma solução de cianato de potássio (154,8g, 1,91mol, 3,0 eq) em água (326 mL) lentamente durante o período de 1 hora. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 20 h, filtrada e enxaguada com água (500 ml). A torta foi carregada para um reator adequadamente dimensionado, com adição de hidróxido de sódio aquoso 2M (1,65 L), a pasta agitada por 2 horas. LCMS confirmou a formação do produto desejado. A mistura foi resfriada a 10°C e ácido clorídrico aquoso 3M (1,29 L) foi adicionado até atingir pH = 5,0 ~6,0. A pasta foi filtrada, enxaguada com água (700 ml) e secada em forno a vácuo a 50°C por 24 horas para dar o composto 102 (100g, 94%) na forma de um sólido esbranquiçado. LCMS (m/z): 169,1 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSC-d6): δ 6,92 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 8,04 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 11,14 (s, 1H), 11,51 (s, lH).

Etapa 1: 2,4-diclorotieno[3,2-d]pirimidina (Composto 103)

[0150] Oxicloreto fosforoso (152 ml, 1,67 mol, 7,0 eq) foi adicionado lentamente à solução gelada de composto 102 (40g, 238 mmol, 1,0 eq) e N,N-dimetilanilina (22,5 ml, 179 mmol, 0,75 eq) em acetonitrila (250 ml) enquanto a temperatura era mantida abaixo de 20°C. A mistura foi então aquecida a 85°C e agitada por 24 horas. A mistura de reação foi resfriada a 15°C e então despejada lentamente sobre uma mistura de gelo e água gelada (360 ml). A pasta resultante foi filtrada, lavada com água gelada (200 ml). A torta foi secada em forno a vácuo a 40°C por 24 horas para dar o composto 103 (40,5g, 83%) na forma de um sólido esbranquiçado. M.p.:245-250°C. LCMS (m/z): 205,0 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,75 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 8,71 (d, J= 5,2 Hz, 1H).

Etapa m: 2-Cloro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina (Composto 104)

[0151] A uma mistura de composto 103 (34,2 g, 167 mmol, 1,0 eq) e metanol (500 mL) adicionou-se morfolina (31,2 mL, 367 mmol, 2,2 eq) lentamente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. O precipitado foi coletado por filtração, lavado com metanol e secado em vácuo para dar o composto do produto desejado 104 na forma de um sólido amarelo claro (39g, 91%). M.p.: 250-255°C. LCMS (m/z): 256,0 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,76 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,92 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 7,42 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 8,32 (d, J= 5,2 Hz, 1H).

Etapa n :2-cloro-4-morfolinotieno [3, 2-d] pirimidino-6- carbaldeído (Composto 105)

[0152] A uma suspensão de composto 104 (20 g, 78,4 mmol, 1,0 eq) em THF (anidro, 320 mL) a -78°C adicionou-se n-BuLi (em hexanos, 2,4M, 40,8 ml, 102 mmol, 1,3 eq) lentamente sob nitrogênio. A pasta resultante foi deixada aquecer a -60°C para se transformar em uma solução marrom clara. A mistura de reação foi então resfriada a -78°C novamente e DMF (anidro, 9,1 ml, 118 mmol, 1,5 eq) foi adicionado lentamente. A solução resultante foi agitada a -78°C por 0,5h, aquecida a 0°C durante 1 hora e despejada lentamente em uma mistura de HCl aquoso (0,25 M, 660 ml) e água gelada (320 ml). A pasta resultante foi agitada a 0-10°C por 0,5 h, filtrada, lavada com água gelada e secada em vácuo para dar o composto 105 na forma de um sólido amarelo (22g, 98%). M.p.:260-265°C. LCMS (m/z): 284,0 [M+1]1 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,77 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,96 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 8,30 (s, 1H), 10,21 (s, 1H).

Etapa o: (2-Cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidin-6- ilmetil)- metilamina (Composto 106)

[0153] A uma solução de composto 105 (20,0 g, 70,4 mmol, 1,0 eq) em metanol (125 mL) adicionou-se solução de metilamina em metanol (27% v/v, 75 mL, 563,2 mmol) sob atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia e o solvente removido em vácuo para dar um produto bruto sólido, que foi dissolvido em metanol (550 ml) e THF (220 ml) sob nitrogênio. Boroidreto de sódio (8g, 211,2 mmol) foi adicionado em porções e a mistura de reação agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A mistura de reação foi evaporada em vácuo e água (300 ml) foi adicionada. A mistura aquosa foi extraída com cloreto de metileno e os extratos combinados foram secados sobre Na2SO4 e concentrados. O resíduo foi dissolvido em HCl 6M (230 ml) e agitado por 30 minutos. A solução aquosa foi lavada com cloreto de metileno várias vezes, e teve pH ajustado em 9-10 com NaOH (4N). O sólido precipitado foi coletado por filtração e secado (60°C, 6h) para dar um sólido amarelo-claro (18g, 85%). M.p.: 240-245°C. LCMS (m/z): 299 [M+1]. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 2,32 (s, 3H), 3,74 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,88 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,96 (s, 2H), 7,24 (s, 1H).

Etapa p(a): Metil éster de ácido 2-[(2-Cloro-4-morfolin-4-il- tieno[3,2-d]pirimidin-6-ilmetil)-metil-amino]-pirimidino-5- carboxílico (Composto 107-1)

[0154] A uma mistura de 106 (10 g, 33,6 mmol) e R-2-1 (6,8 g, 36,4 mmol) em CH3CN (400 mL) à temperatura ambiente adicionou-se diisopropiletilamina (220 ml, 1,26 mol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A mistura foi então evaporada, seguida por adição de cloreto de metileno (300 ml). A fase orgânica foi lavada com água, secada sobre Na2SO4 e concentrada em vácuo para deixar um resíduo. Ao resíduo adicionou-se acetato de etila e a mistura resultante foi agitada à temperatura de água gelada por 50 minutos. O sólido resultante foi coletado por filtração para dar o composto título 107-1 na forma de um sólido branco (10,6g, 70%). LCMS: 449 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1,30 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,71 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,83 (t, J= 4,8 Hz, 4H), 4,29 (m, 2H), 5,21 (s, 2H), 7,39 (s, 1H), 8,87 (s, 2H).

Etapa p(b): Metil éster de ácido 2-[(2-cloro-4-morfolin-4-il- tieno[3,2-d]pirimidin-6-ilmetil)-metil-amino]-pirimidino-5- carboxílico (Composto 107-2)

[0155] Uma mistura de composto 106 (25 g, 84 mmol), CH3CN (500 mL) e R-2-2 (16 g, 92 mmol) foi agitada à temperatura ambiente. Diisopropiletilamina (DIPEA) (500 ml, 2,9 mol) foi adicionada. A solução foi agitada da noite para o dia e evaporada. Após cloreto de metileno (500ml) ser adicionado, a fase orgânica foi lavada com água, secada sobre Na2SO4 e concentrada em vácuo. Ao resíduo adicionou-se acetato de etila (200 ml) e a mistura foi agitada em banho de água gelada por 50 minutos. O produto título foi coletado na forma de um sólido branco (29,4 g, 81%). LCMS (m/z): 435,2 [M+l]+. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 3,25 (s, 3H), 3,71 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,82-3,84 (m, 7H), 5,21 (s, 2H), 7,39 (s, 1H), 8,87 (s, 2H).

Etapa q(a):Etil-2- ( ( (2- (6-metoxipiridin-3-il) -4- morfolinotieno[3, 2-d] pirimidin-6-il) metil) (metil)amino)pirimidino-5-carboxilato (Composto 108-1)

[0156] Método A: Uma mistura de composto 107-1 (12 g, 26,7 mmol), R-3-1 (4,9 g, 32 mmol), NaHC03 (6,7 g, 80,1 mmol) e cloreto de bis(trifenilfosfino)paládio(II) (188 mg, 0,267 mmol) em solventes mistos de tolueno (80 ml), etanol (50 ml) e água 910 ml) foi aquecida a 108°C por 4,5 h sob atmosfera de N2. TLC mostrou reação completa. A mistura de reação foi então resfriada à temperatura ambiente e água (20 ml) foi adicionada. O sólido resultante foi coletado por filtração e foi então suspenso em etanol (100 ml). A suspensão foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos e filtrada. O sólido coletado foi lavado com etanol e secado em vácuo para dar o composto título 108-1 na forma de um sólido branco (10g, 72%).

[0157] Método B: Uma mistura de composto 107-1 (1,5g, 3,34 mmol), R-3-2 (1,6g, 6,68 mmol), NaHCO3 (0,84 g, 10,0 mmol) e cloreto de bis(trifenilfosfino)paládio(II) (118 mg, 0,167 mmol) em solventes mistos de tolueno (24 ml), etanol (15 ml) e água (3 ml) foi aquecida a 108°C sob atmosfera de N2da noite para o dia. A mistura de reação foi dividida em diclorometano e água. A camada orgânica foi separada e lavada com salmoura, secada sobre Na2SO4, filtrada e evaporada em vácuo para dar um resíduo que foi purificado através de cromatografia de coluna eluído com hexanos/acetato de etila para dar o composto 108-1 na forma de um sólido branco (1,7g, 98%). m.p. l98-202°C. LCMS: 522,30 [M+l]1. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6): δ 1,31 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 3,28 (s, 3H), 3,76 (t, J= 4,4 Hz, 4H), 3,93 (t, J= 4,4 Hz, 4H), 3,94 (s, 3H), 4,30 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 5,24 (s, 2H), 6,92 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 7,47 (s, 1H), 8,57 (dd, J= 8,8 Hz, 2,0Hz, 1H), 8,88 (s, 2H), 9,15 (d, J= 2,0 Hz, 1H).

Etapa q(b):Metil-2- ( ( (2- (6-metoxipiridin-3-il) -4- morfolinotieno[3, 2-d] pirimidin-6-il)metil) (metil)amino)pirimidino-5-carboxilato (Composto 108-2)

[0158] A uma mistura de composto 107-2 (20 g, 46,0 mmol), B-3-1 (9,2 g, 60,2 mmol, 1,3 eq.) em dioxano (540 mL) à temperatura ambiente adicionou-se NaHCO3 sólido (11,6 g, 138,1 mmol, 3 eq.) seguido de adição de água (40 ml). A mistura resultante foi degaseificada passando-se N2 pela superfície da solução. Cloreto de bis(trifenilfosfino) paládio (II) (323 mg, 0,46 mmol, 0,01eq.) foi então adicionado e a mistura resultante foi aquecida a 108°C por 15 h. TLC e LCMS mostrou reação completa. A mistura de reação foi filtrada em placa de celite enquanto ainda estava quente (>90°C) e lavada com dioxano (70 ml). O filtrado foi gradualmente resfriado à temperatura ambiente e cristais brancos finos se formaram durante o período de resfriamento. A suspensão foi filtrada e lavada com dioxano (80 ml) para dar o composto título 108-2 na forma de um sólido branco (18g, 78%).LCMS (m/z): 508,3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6): δ 3,28 (s, 3H), 3,76 (t, J= 4,8 Hz, 4H), 3,82 (s, 3H); 3,92 (m, 4H), 3,93 (s, 3H), 5,20 (s, 2H), 6,91 (d, J= 8,8Hz, 1H), 7,47 (s, 1H), 8,57 (dd, J= 8,8Hz, 2,4Hz, 1H), 8,88 (s, 2H), 9,15 (d, J= 2,0Hz, 1H).

Etapa r :N-hidroxi-2- ( ( (2- (6-metoxipiridin-3-il) -4- morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-il)metil) (metil)amino) pirimidino-5-carboxamida (Composto 1) Preparação de solução de hidroxilamina metanol

[0159] Uma mistura de NH2OH.HCl (80 g, 1,12 mol) em MeOH (400 mL) foi aquecida a 60-65°C por 1h para formar uma solução clara. Foi então resfriada em banho de água gelada. À mistura gelada adicionou-se uma solução de KOH (96g, 1,68 mol) em MeOH (240 ml) gota a gota, enquanto se mantinha a temperatura de reação a 0-10°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C por 30 minutos e então filtrada em funil de pressão constante carregado com Na2SO4 anidro (700g). O filtrado foi coletado em banho gelado e armazenado em refrigerador para uso futuro.

Preparação de Composto 1 a partir de composto 108-1

[0160] O composto 108-1 (10g, 19 mmol) foi suspenso na solução de hidroxilamina metanol recentemente preparada (1,79 M, 350 ml). A esta mistura adicionou-se diclorometano (100 ml). O frasco de reação foi vedado e a mistura agitada à temperatura ambiente por 5h antes de se tornar uma solução clara. A reação foi agitada por mais 9 horas e filtrada para remover qualquer sólido insolúvel. O filtrado teve seu pH ajustado em 6-7 com adição de ácido acético para formar precipitado sólido. O sólido foi coletado por filtração e lavado com água e quantidade mínima de metanol, secado em vácuo a 60°C por 5 horas para dar o composto 1 na forma de um sólido branco. (9,2g, 96%). m.p. 177-180°C. LCMS: 509,3 [M+l]1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,24 (s, 3H), 3,76 (t, J= 5 Hz, 4H), 3,92 (t, J= 5 Hz, 4H), 3,92 (s, 3H), 5,20 (s, 2H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 7,44 (s, 1H), 8,57 (dd, J= 8,8 Hz, 2,4Hz, 1H), 8,75 (s, 2H), 9,01 (s, 1H), 9,14 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 11,08 (s,lH).

Preparação de Composto 1 a partir de composto 108-2

[0161] A uma suspensão de composto 108-2 (31 g, 61,1 mmol) em diclorometano (310 mL) à temperatura ambiente adicionou-se a solução de hidroxilamina metanol recentemente preparada acima (1,74M, 744 ml). O frasco de reação foi vedado e a mistura de reação agitada à temperatura ambiente por 5 horas. A mistura de reação tornou-se uma solução clara. A solução de reação foi filtrada para remover qualquer sólido insolúvel. Ao filtrado adicionou-se então água (310 ml) e não houve formação de sólido durante a adição. Ácido acético (18,5 ml) foi adicionado para ajuste de pH a 10.20 (continuamente monitorado por pHmetro) durante agitação. Não houve alteração na temperatura interna durante adição de ácido acético. A agitação da mistura de reação resultante prosseguiu por mais 4 horas. Houve formação gradual de sólido branco. A suspensão foi filtrada e lavada com quantidade mínima de metanol (100 ml x 3). O sólido branco coletado foi resuspenso em metanol (620 ml) e água (124 ml) para formar uma suspensão. À suspensão acima ácido acético adicional foi acrescentado (11g) para ajustar o pH em 5-6. Observou-se alteração na forma sólida. A suspensão continuou a ser agitada por mais 2 horas e filtrada em filtro de papel, lavada com quantidade mínima de metanol (100 ml x 3). O sólido branco coletado foi secado em forno (50°C) por 12 horas para dar o composto título 1 na forma de sólido branco (23,6g, 76,0%). m.p.: 255259°C. LCMS (m/z): 509,3 [M+l]1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,24 (s, 3H), 3,76 (t, J= 5,2 Hz, 4H), 3,92 (t, J= 5,2Hz, 4H), 3,92 (s, 3H), 5,20 (s, 2H), 6,91 (d, J= 8,4Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 8,57 (dd, J= 8,4Hz, 2,4Hz, 1H), 8,75 (s, 2H), 9,07 (s, 1H), 9,14 (d, J= 2,4Hz, 1H), 11,14 (s,lH). Exemplo 2: Preparação de metanossulfonato de N-hidroxi-2- (((2-(6-metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin- 6-il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida (Composto 2)

[0162] Método A: A uma mistura de Composto 1 (300 mg, 0,59 mmol) e MeOH/Et20 (3/1, 40 mL) adicionou-se uma solução de ácido metanossulfônico (114 mg, 1,18 mmol) em MeOH (3 mL) a 0°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C por 3 horas. O precipitado foi coletado por filtração e lavado com Et2O para dar o composto 2 na forma de um sólido branco (260 ml, 73%).

[0163] Método B: A uma suspensão de Composto 1 (1,5 g, 2,95 mmol) em diclorometano/MeOH (40 ml/10 ml) adicionou-se ácido metanossulfônico (341 mg, 3,55 mmol) em 2 ml de MeOH à temperatura ambiente (15°C) para formar uma solução clara. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A mistura de reação ainda estava clara. Acetato de etila (40 ml) foi adicionado à mistura e a agitação prosseguiu por 3 horas à temperatura ambiente. O precipitado resultante foi coletado por filtração para dar o Composto 2 na forma de um sólido branco (1,45g, 83%). m.p.: 179-185°C. LCMS: 509,3 [M+l]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO- D6): δ 2,35 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 3,78 (t, J= 9,6 Hz, 4H), 3,95 (s, 3H), 4,03 (t, J= 9,2 Hz, 4H), 5,24 (s, 2H), 6,99 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 7,50 (s, 1H), 8,54 (dd, J= 8,8 Hz, 2,4 Hz, 1H), 8,76 (s, 2H), 9,12 (d, J= 2,4 Hz, 1H), 11,11 (br, 1H). Exemplo 3: Preparação de sal sólido de N-hidroxi-2-(((2-(6- metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida (Composto 3)

[0164] A uma suspensão de Composto 1 (300 mg, 0,59 mmol) em metanol (30 mL) a 0°C adicionou-se lentamente n-BuONa (85 mg, 0,88 mmol). A mistura resultante foi aquecida à temperatura ambiente e a agitação prosseguiu por 2 horas. A reação foi concentrada e o resíduo triturado e lavado com etanol seguido de filtração para dar o Composto 3 na forma de um sólido branco (230 mg, 73%). m.p.: 178-183°C. LCMS: 509,3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,17 (s, 3H), 3,75 (s, 4H), 3,92 (s, 7H), 5,16 (s, 2H), 6,90 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 8,57 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 8,65 (s, 2H), 9,14 (s, 1H). Exemplo 4: Preparação de sal potássico de N-hidroxi-2-(((2- (6-metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida (Composto 4)

[0165] A uma mistura de Composto 1 (400 mg, 0,78 mmol) em metanol (50 mL) adicionou-se t-BuOK (132 mg, 1,17 mmol) a 0°C sob N2. A mistura foi agitada a 0°C por 1 hora e a agitação prosseguiu à temperatura ambiente por 1,5h. O sólido insolúvel foi removido por filtração e o filtrado resfriado a -20°C. Et20 (100 mL) foi adicionado ao filtrado. A mistura resultante foi agitada a -20°C por 1 hora. Hexanos (70 ml) foi adicionado e a mistura continuou a ser agitada a -20°C por 2 horas. O sólido foi coletado por filtração e secado em vácuo para dar o Composto 4 na forma de um sólido branco (150 mg, 35%). m.p.: 174-179°C. LCMS: 509,3[M+1]-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,16 (s, 3H), 3,74-3,76 (m, 4H), 3,90-3,93 (m, 7H), 5,15 (s, 2H), 6,90 (d, J= 8,4Hz, 1H), 7,43 (s, 1H), 8,39 (br, 1H), 8,58 (d, J= 8,8Hz, 1H), 8,62 (s, 2H), 9,15 (s, 1H). Exemplo 5: Preparação de sal de N-hidroxi-2-(((2-(6- metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida colina (Composto 5)

[0166] A uma solução de Composto 1 (200 mg, 0,39 mmol) em DCM/MeOH (60 mL/12 mL) adicionou-se hidróxido de colina (106 mg, 0,39 mmol, 45% em MeOH). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e foi então concentrada para remover ~30 ml do solvente. Acetato de etila (60 ml) foi adicionado e a mistura agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Após uma pequena quantidade de precipitação ter ocorrido, a mistura foi concentrada para remover ~40ml do solvente e acetato de etila adicional (60 ml) foi adicionado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e filtrada para dar Composto 5 na forma de um sólido branco (180 mg, 76%). m.p.: 181-185°C. LCMS: 509,3[M+1]1. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 3,11 (s, 9H), 3,17 (s, 3H), 3,40 (t, J= 4,8Hz, 2H), 3,75 (t, J= 4,8Hz, 4H), 3,84 (br, 2H), 3,90-3,93 (m, 7H), 5,15 (s, 2H), 6,89 (d, J= 8,8Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 8,57 (dd, J= 8,8Hz, 2,4Hz, 1H), 8,64 (s, 2H), 9,14 (d, J= 2,0Hz, 1H). Exemplo 6: Preparação de sulfato de N-hidroxi-2-(((2-(6- metoxipiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)(metil)amino)pirimidino-5-carboxamida(Composto 6)

[0167] A uma suspensão de Composto 1 (200 mg, 0,39 mmol) em DCM/MeOH (30 mL/7,5 mL) adicionou-se ácido sulfúrico (77 mg, 0,79 mmol, em 1 mL MeOH) para formar uma solução clara. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A precipitação ocorreu e ter-butil metil éter (60 ml) foi então adicionado. A mistura resultante continuou a ser agitada por 1 hora à temperatura ambiente. O sólido foi coletado por filtração para dar o composto 6 na forma de um sólido branco (180 mg, 76%). M.p.: 243-246°C. LCMS: 509,3 [M+l]-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3,26 (s , 3H), 3,78 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,96 (s, 3H), 4,03 (t, J = 4,4 Hz, 4H), 5,24 (s, 3H), 6,98 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,50 (s , 1H), 8,54 (dd, J = 8,8 Hz, 2,4 Hz, 1H), 8,76 (s, 2H), 9,12 (d, J = 2,0 Hz, 1H) , 11,06 (br , 1H). Exemplo 7: Ensaio de Atividade de PI3 Quinase

[0168] Os ensaios seguintes foram usados para determinar a capacidade de o Composto 1 inibir várias isoformas e mutantes de PI3K. PI3Kα

[0169] A atividade de PI3Kα foi medida utilizando ensaio de quinase luminescente ADP-Glo. PI3Kα, um complexo de p110α humana de extensão completa recombinante marcada com GST N- terminal e p85α humana de extensão completa recombinante não marcada, foi coexpressado em um sistema de expressão de células Sf9 infectadas com Baculovírus. (No. acesso GenBank para p110α, U79143; para p85α, XM_043865). As proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade de etapa única utilizando glutationa-agarose. Um ensaio competitivo foi conduzido para medir a quantidade de ADP gerada de ATP na presença de PI3Kα recombinante purificada (p110α/p85α) e PIP2. Pl3Kα foi incubada com 20 μM substrato PIP2 no tampão de reação (50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3 uM Nortovanadato, 1 mM DTT, 10μM ATP ultrapura e 0,5% DMSO) por 30 minutos a 30°C. O ADP gerado na reação foi então medido através de ensaio de ADP-Glo. O ensaio foi conduzido em duas etapas: na primeira um volume igual de reagente ADP-GLOTM (Promega) foi adicionado para terminar a reação de quinase e depletar o ATP remanescente. Na segunda etapa, o Reagente de Detecção de Quinase foi adicionado, o que simultaneamente converte ADP em ATP. O ATP recentemente sintetizado foi medido utilizando reação de luciferase/luciferina acoplada. O IC50 determinado para o Composto 1 neste ensaio foi inferior a 100 nM.

Pl3Kβ

[0170] A atividade de PI3Kβ foi medida utilizando ensaio de transferência de energia por ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET) utilizando tecnologia de fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF). PI3Kβ, um complexo de p110β humana de extensão completa recombinante marcada com histidina N-terminal e p85α humana de extensão completa recombinante não marcada foram coexpressadas em um sistema de expressão de células Sf21 infectadas com Baculovírus. (No. Acesso Genbank para p110β, NM_006219; para p85α, XM_043865). As proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade em etapa única utilizando glutationa-agarose. Um ensaio competitivo foi conduzido para medir a quantidade de PIP3 gerada de PIP2 na presença de PI3Kbeta recombinante purificada (p110α/p85α). PI3Kβ foi incubada com 10 μM substrato PIP2 no tampão de reação (20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM DTT, 10 μM ATP e 1% DMSO) por 30 minutos a 30°C. O produto de reação foi então misturado com uma proteína detectora de PIP3, anticorpo marcado com európio, sonda PIP3 marcada com biotina e estreptavidina marcada com aloficocianina. Um complexo sensor é formado para gerar um sinal TR-FRET estável na mistura de reação. A intensidade desse sinal diminui à medida que a sonda marcada com biotina, que se liga ao detector de PIP3, é deslocada pelo PIP3 produzido por atividade enzimática e a quantidade de sonda PIP3 marcada com biotina não ligada na mistura aumenta. O sinal de TR-FRET foi determinado utilizando-se leitor de microplacas com subtração de fundo.

[0171] O IC 50 determinado para o Composto 1 neste ensaio estava entre 100 e 1000 nM.

Pl3Kδ

[0172] A atividade de PI3Kδ foi medida utilizando ensaio de polarização fluorescente. PI3Kδ, um complexo de p110δ humana de extensão completa recombinante marcada com histidina N-terminal e p85α humana de extensão completa recombinante não marcada, foi coexpressado em um sistema de expressão de células Sf9 infectadas com Baculovírus. (No. acesso GenBank para p110δ, NM_005026). As proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade de etapa única utilizando glutationa-agarose. Um ensaio competitivo foi conduzido para medir a quantidade de PIP3 gerada de PIP2 na presença de PI3Kδ recombinante purificada (p110δ/p85α). Pl3Kδ foi incubada com 10 μM substrato PIP2 no tampão de reação (20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 uM DTT, 10μM ATP e 1% DMSO) por 1 hora a 30°C. O produto de reação foi então misturado com uma proteína detectora de PIP3 e com sonda PIP3 fluorescente. Os valores de polarização (mP) diminuem à medida que a sonda fluorescente, que se liga ao detector de PIP3, é deslocada pelo PIP3 produzido por atividade enzimática e a quantidade de sonda fluorescente não ligada na mistura aumenta. O valor de grau de polarização (mP) foi determinado utilizando-se leitor de microplacas com subtração de fundo.

[0173] O IC 50 determinado para o Composto 1 neste ensaio foi inferior a 100 nM.

PI3KY

[0174] A atividade de PI3KY foi medida utilizando ensaio de transferência de energia por ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET) utilizando tecnologia de fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF). PI3Kδ humana marcada com histidina N-terminal foi expressada em um sistema de expressão de células Sf9 infectadas com Baculovírus. (No. Acesso Genbank AF327656). As proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade em etapa única utilizando glutationa-agarose. Um ensaio competitivo foi conduzido para medir a quantidade de PIP3 gerada de PIP2 na presença de PI3KY recombinante purificada (p120y) . PI3KY (2 nM) foi incubada com 10 μM substrato PIP2 no tampão de reação (20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM DTT, 10 μM ATP e 1% DMSO) por 30 minutos a 30°C. O produto de reação foi então misturado com uma proteína detectora de PIP3, anticorpo marcado com európio, sonda PIP3 marcada com biotina e estreptavidina marcada com aloficocianina. Um complexo sensor é formado para gerar um sinal TR-FRET estável na mistura de reação. A intensidade desse sinal diminui à medida que a sonda marcada com biotina, que se liga ao detector de PIP3, é deslocada pelo PIP3 produzido por atividade enzimática e a quantidade de sonda PIP3 marcada com biotina não ligada na mistura aumenta. O sinal de TR-FRET foi determinado utilizando-se leitor de microplacas com subtração de fundo.

[0175] O IC50 determinado para o Composto 1 neste ensaio estava entre 100 e 1000 nM.

Exemplo 8: Ensaio de Atividade de HDAC

[0176] A atividade inibitória de HDAC foi avaliada utilizando o sistema Biomol Color de Lys (AK-500, Biomol, Plymouth Meeting, PA). Resumidamente, os extratos nucleares de célula HeLa foram usados como fonte de HDACs. Concentrações diferentes de compostos de teste foram diluídos em série em dimetilssulfóxido (DMSO) e adicionados aos extratos nucleares de células HeLa na presença de um substrato artificial colorimétrico. A condição final de ensaio continha 50 mM Tris/Cl, pH 8,0, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl e 1 mM MgCl2. As reações foram conduzidas à temperatura ambiente (25°C) por 1 hora antes da adição de revelador para conclusão das mesmas. A atividade enzimática relativa foi medida no leitor de microplacas WALLAC Victor II 1420 como intensidade de fluorescência (excitação: 350-380 nm; emissão: 440-460 nm). Os dados foram analisados utilizando GraphPad Prism (v4.0a) com curva dose-resposta sigmoidal ajustada para cálculo de IC50. O IC50 determinado para o Composto 1 neste ensaio foi inferior a 100 nM.

[0177] As atividades do Composto 1 contra isótipos de HDAC foram também determinadas. Ensaios de especificidade de HDAC foram conduzidos em BPS Bioscience (San Diego, CA), após seu procedimento operacional padrão. Resumidamente, as enzimas sinalizadoras purificadas e marcadas (HDAC-1 humana), NCOR2- (HDAC3 humana), GST-(HDAC4, 6, 7, 10 e 11 humanas) ou His- (HDAC 2, 5, 8 e 9 humanas) foram expressadas em células Sf9 de insetos e purificadas antes do uso. O substrato utilizado para HDAC1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 e 11 era o Substrato 3 de HDAC desenvolvido pela BPS Bioscience. Para outras enzimas HDAC, foi utilizado o substrato de classe 2a de HDAC. Todas as reações enzimáticas foram conduzidas em duplicata a 37°C por 30 minutos, com exceção de que o ensaio enzimático HDAC11, que foi conduzido à temperatura ambiente por 3 horas.

[0178] A tabela abaixo estabelece os resultados para cada uma das HDACs 1-11, com valores IC50 providos como segue: 1>1000 nM; 100 nM<11<1000 nM; 10 nM<111<100 nM; IV<10 nM.

Exemplo 9: Ensaio de Proliferação de Células

[0179] Linhagens de células humanas cancerosas foram adquiridas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e plaqueadas a 5.000 a 10.000 por cavidade em placas de fundo plano de 96 cavidades com meio de cultura, conforme sugerido pelo fornecedor. As células foram então incubadas com compostos a várias concentrações por 72 horas em meio de cultura complementado com 0,5% de soro fetal bovino (FBS) (v/v). A inibição de crescimento foi obtida através de ensaio de teor de adenosina trifosfato (ATP) utilizando kit Promega CellTiter-Glo. O kit Promega CellTiter-Glo é um sistema de monitoramento de ATP baseado em luciferase de pirilampo. Resumidamente, 16 μl de lise celular de mamífero e solução de substrato foram adicionados a 84 μl de meio de cultura por cavidade para lisar as células e estabilizar a ATP. A mistura foi sacudida e incubada por 30 minutos e posteriormente foi medida a luminescência. Os valores IC50 foram calculados utilizando software PRISM (GraphPad Software) com ajuste de curva dose-resposta sigmoidal.

[0180] A Tabela 1 mostra a atividade antiproliferativa nesses ensaios baseados em célula do Composto 1 e dos compostos de referência SAHA, GDC-0941 e combinação de SAHA e GDC-0941. Nesses ensaios, foi utilizada a seguinte graduação: 1 > 10.000 nM, 10.000 nM >II >1000 nM, 1000 nM > III >100 nM, 100 nM > IV >10 nM, e V < 10 nM para IC50. Tabela 1

Exemplo 10: Formulações de Composto 1 a. Composto 1 em 30% Captisol (10 mg/mL):

[0181] A um frasco contendo composto 1 (10 mg) adicionou- se 30% Captisol (0,937 ml). A mistura foi sonificada por 2 minutos. À mistura adicionou-se hidróxido de sódio (1N, 39,3 μl, 2 eq.) e sonificada/turbilhonada para dar uma solução clara (pH = 12). A solução teve então pH ajustado em 10 com ácido clorídrico (1N, 23,6 μl, 1,2 eq.).

b. Composto 1 em 30% Captisol (7,5 mg/mL):

[0182] A um frasco contendo composto 1 (7,5 mg) adicionou- se 30% Captisol (0,941 ml). A mistura foi sonificada por 2 minutos. À mistura adicionou-se hidróxido de sódio (1N, 29,5 μl, 2 eq.) e sonificada/turbilhonada para dar uma solução clara (pH = 12). A solução teve então pH ajustado em 5 com ácido clorídrico (1N, 29,5 μl, 2 eq.).

c. Composto 1 em C10/PEG1450/PEG400 (5mg/ml):

[0183] A um frasco contendo composto 1 (5 mg), decanoato de sódio (20 mg), PEG400 (40 μl) e PEG1450 (40 mg) adicionou- se H2O (0,88 ml) e NaOH (1N, 24,6 μl, 2,5 eq.). A mistura foi sonificada e turbilhonada para dar uma solução clara que teve então pH ajustado em 10 com HCl (1N, 7,4 μl, 0,75 eq.).

Exemplo 11: Estudos Farmacocinéticos e Farmacodinâmicos em Camundongos portadores de Tumor Camudongos Atímicos portando tumores H2122

[0184] Camudongos atímicos portando tumores em xenoenxerto H2122 (linhagem celular de câncer de pulmão humano não de pequenas células) foram utilizados para estudos farmacocinéticos. O Composto 1 foi formulado em água com decanoato de sódio e PEG400 (5 mg/ml) e administrado oralmente (PO) via gavagem para cada animal a uma dose de 50 mg/kg. Em vários pontos no tempo após administração do composto, três camundongos por ponto no tempo foram submetidos à eutanásia com CO2, tendo sido coletados sangue e tecidos tumorais. O sangue foi coletado em tubos contendo heparina sódica. O plasma foi separado via centrifugação. O plasma e os tecidos foram armazenados a -80°C para análise posterior. Um sistema PE Sciex API-3000 LC-MS/MS (Applied Biosystems, Inc., Foster City,m CA) foi usado para analisar concentrações do composto no plasma e tecidos tumorais.

[0185] Os resultados deste estudo estão resumidos na Figura 1 e Tabela 2 abaixo. A Figura 1 é um gráfico de concentração do composto 1 no plasma e tecido tumoral versus tempo após administração oral. Os resultados mostram que o Composto 1 se acumula preferencialmente no tecido tumoral. Isso é corroborado pelos resultados constantes da Tabela 3, que mostram uma meia-vida significativamente maior do Composto 1 no tecido tumoral do que no plasma, bem como exposição significativamente maior de tecido tumoral ao Composto 1 (AUC).

Camundongos SCID portando tumores Daudi

[0186] Células Daudi (linhagem celular de linfoma não- Hodgkin) foram implantadas em camundongas Scid (imunodeficientes severos graves). Após estadiamento dos tumores, os animais foram dosados através de gavagem oral com 25, 50 ou 100 mg/kg de Composto 1, formulado em 30% Captisol, pH 10, a uma concentração de 1,875, 3,75 ou 7,5 mg/mL, respectivamente.

[0187] Em vários pontos no tempo após administração do composto, três camundongos por ponto no tempo foram submetidos à eutanásia com CO2, tendo sido coletados sangue e tecidos tumorais. O sangue foi coletado em tubos contendo heparina sódica. O plasma foi separado via centrifugação. O plasma e os tecidos foram armazenados a -80°C para análise posterior. Um sistema PE Sciex API-3000 LC-MS/MS (Applied Biosystems, Inc., Foster City,m CA) foi usado para analisar concentrações do composto no plasma.

[0188] Os resultados deste estudo estão resumidos nas Figuras2A, 2B e 2C e Tabela 3 abaixo. A Figura 2A é um gráfico de concentração do Composto 1 no plasma versus tempo após administração oral e mostra uma exposição ao composto dependente da dose. A Figura 2B é um gráfico de concentração de Composto 1 em tecido tumoral versus tempo após administração oral. Os resultados mostram que o Composto 1 é preferencialmente se acumula no tecido tumoral de forma dependente da dose. As concentrações em plasma e tumor após dose de 100 mg/kg são comparadas na Figura 2C, mostrando que o tecido tumoral preferencialmente absorve o Composto 1. Isso é corroborado pelos resultados da Tabela 3, que mostra uma meia-vida significativamente mais longa do Composto 1 em tecido tumoral do que no plasma, bem como uma exposição significativamente maior de tecido tumoral ao Composto 1 (AUC).

Farmacodinâmica

[0189] Os tumores foram coletados para avaliação de PD após tratamento com uma dose única de Composto 1 a 25 mg/kg, 50 mg/kg e 100 mg/kg. A proteína foi extraída dos tecidos tumorais utilizando um Tissuelyser (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com instruções do fabricante. 30μg de proteína foi rotineiramente utilizada para análise WB conforme acima descrito. Os lisados de célula foram resolvidos em géis BisTris 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os “blots” foram sondados com vários anticorpos primários da noite para o dia a 4°C. GAPDH (gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, 1:30.000, Abeam, Cambridge, MA) foi usado como controle interno para cada ensaio. As membranas foram então incubadas com anticorpos secundários marcados com infravermelho (1:10000) conjugados a IR Dye-800 (Rockland Immunochemicals, Inc. Gilbertsville, PA) ou conjugados a Alexa-680 (Invitrogen). As membranas foram analisadas pelo Sistema Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biotechnology, Lincoln, NE).

[0190] Os resultados deste estudo constam da Figura 3, que apresenta Western blots de extratos de tecido tumoral de três grupos de dose. Esses resultados mostram que o Composto 1 inibe a via de PI3K-AKT-mTOR, suprime as vias de RAF-MEK-ERK, regula para baixo os níveis de proteína RTK, e regula para cima os níveis de supressores tumorais p53 e p21.

Exemplo 12: Estudo Farmacocinético em Cães

[0191] Um estudo farmacocinético do Composto 1 em cães Beagle foi também conduzido utilizando administração iv a 5 mg/kg em água com decanoato de sódio/PEG400 (5 mg/ml) e administração oral a 5 mg/kg com decanoato de sódio/PEG4000/PEG1450 (pH 10) em cápsulas entéricas. O plasma foi coletado em vários pontos de tempo e analisados quanto à concentração de Composto 1 através de LC-MS/MS. Os resultados do estudo são mostrados na Figura 4 e Tabela 4 abaixo. A Figura 4 é um gráfico de concentração plasmática versus tempo tanto para dosagem oral como iv. Níveis plasmáticos significativos do Composto 1 são obtidos via dosagem oral.

Exemplo 13: Estudo Farmacocinético em Ratos

[0192] A finalidade deste estudo foi a de determinar a farmacocinética plasmática do Composto 1 em ratos Sprague- Dawley após administração oral do Composto 1.

[0193] O Composto 1 foi dissolvido em 30% Captisol em água para dar uma concentração nominal de 10 mg/ml (pH=10) para administração oral. A solução amarela-clara resultante foi armazenada à temperatura ambiente até o momento da dosagem.

[0194] Três ratos Sprague-Dawley da Charles River Laboratories foram usados neste estudo. Uma dieta com alto teor de gordura (VHFD, D12492i) da Research Diet Inc. foi fornecida à vontade durante toda a parte “em vida” do estudo. O Composto 1 foi administrado através de uma dose oral única por gavagem (PO) a 20 mg/kg.

[0195] Amostras de sangue (volume aproximado de 150 μL) foram coletadas através da veia caudal a 0,25, 0,5, 1, 3, 6, e 24 horas pós-dose. As amostras de sangue foram colocadas em tubos contendo heparina sódica e centrifugadas a 8000 rpm por 6 minutos a 4°C para separar o plasma das amostras. Após centrifugação, o plasma resultante foi transferido para tubos limpos e armazenados congelados a -80°C com bioanálise pendente.

[0196] As concentrações do Composto 1 e de seu metabólito primário nas amostras de plasma foram determinadas através do sistema PE Sciex API-3000 LC-MS/MS (PE-Sciex, Foster City, CA).

[0197] Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados a partir dos dados de concentração média-tempo nos sujeitos de teste. Um modelo comportamental de WINNONLIN® Professional 5.2, foi usado no cálculo dos parâmetros. Concentrações abaixo do limite de quantificação (limite inferior de quantificação = 1 ng/mL) foram omitidas do cálculo de parâmetros em animais individuais.

[0198] Após administração oral do Composto 1, os valores médios de Cmax e Tmax para o Composto 1 foram de 39,5 μg/L e 0,1 hora, respectivamente. O valor médio de AUC(o-~) foi de 163,6 μg/L*h. O valor da meia-vida (T1/2) foi de 11,7 h.

Exemplo 14: Avaliação do Composto 1 em Modelos de Tumor em Xenoenxerto A. Modelos de Tumor em Xenoenxerto SU-DHL4, H2122, Daudi e OPM2

[0199] Células de SU-DHL4 (linhagem celular de linfoma de grandes células B difuso), H2122 (linhagem celular de NSCLC humano), Daudi (linhagem celular de linfoma não-Hodgkin) e OPM2 (linhagem celular de tumor mieloma múltiplo) foram implantadas em camundongos atímicos ou Scid (imunodeficientes complexos graves). Após estadiamento dos tumores, os animais com tamanho de tumor suficiente foram aleatoriamente designados em grupos ativo (Composto 1) e controle (veículo). O Composto 1 foi formulado para administração oral como no Exemplo 7(b) e administrado através de gavagem oral baseada no peso corpóreo de cada animal individual. Os grupos controle foram tratados com veículo utilizando o mesmo esquema de dosagem do grupo ativo correspondente.

[0200] O grupo de tumor H2122 (camundongos atímicos) receberam o Composto 1 a doses de 75 mg/kg duas vezes ao dia inicialmente e então 50 mg/kg duas vezes ao dia do Dia 11 por cinco dias por semana devido à perda de peso corpóreo em 75 mg/kg. Em um estudo, o grupo de tumor Daudi (camundongos Scid) receberam o Composto 1 a doses de 25, 50 ou 100 mg/kg cinco dias por semana. Em outro estudo, o grupo de tumor Daudi foi dosado a 50 mg/kg duas vezes ao dia cinco dias por semana. Em outro estudo, a eficácia de Composto 1 administrado oralmente no modelo tumor Daudi foi comparado com GDC-0941 oral e vorinostat oral, tanto individualmente como em combinação. O grupo tumor OPM2 recebeu Composto 1 a doses de 50 mg/kg duas vezes por dia cinco dias por semana. O grupo tumor SU-DHL4 foi dosado a 100 mg/kg oralmente ou 50 mg/kg intravenosamente.

[0201] Os tumores foram medidos durante o período de estudo com um calibrador eletrônico e os pesos corpóreos medidos duas vezes por semana. A fórmula a seguir foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0202] A porcentagem de alteração no volume do tumor foi usada para descrever a atividade do composto durante o período de tratamento.

[0203] Os resultados desses estudos estão resumidos nas Figuras 5A a 5C e 9 a 12, que mostram o tamanho do tumor versus tempo para grupos ativo e controle, para cada tipo de tumor. As Figuras 5A, 5B, 5C e 12 mostram que o Composto 1 é eficaz em modelos de tumor H2122, Daudi e OPM2. Conforme ilustra a Figura 9, o Composto 1 inibiu o crescimento de tumor Daudi de forma dose-dependente. A Figura 10 compara a atividade antitumoral do Composto 1 a 100 mg/kg no modelo Daudi com GDC-0941 ou vorinostat isoladamente ou em combinação. As doses indicadas são a dose máxima tolerada (MTD) de cada tratamento, e o tamanho do tumor no pré- tratamento era de 157 ± 65 mm3(média ± SE). Os dados indicam que o Composto 1 é mais eficaz que o vorinostat, GDC-0941 ou uma combinação de ambos. Finalmente, o Composto 1 inibiu fortemente o crescimento do tumor no modelo xenoenxerto de linfoma de grandes células B difuso SU-DHL4 após administração intravenosa a 50 mg/kg ou oralmente (PO) a 100 mg/kg (Figura 11). O tamanho do tumor no pré-tratamento era de 147±21 mm3.

Modelo Xenoenxerto MM1S

[0204] Camundongas SCID/Beige com 4 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas (INNOCAGE®IVC, Innovive Inc., San Diego, CA) em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige foram esterilizados em autoclave antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não-invasivos).

[0205] Células MM1S de MM humano (Goldman-Leikin RE, et al., J Lab Clin Invest. 1980, 113:335-345) foram originalmente obtidas de sangue periférico de um paciente com mieloma múltiplo. As células criopreservadas foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI mais 10% soro fetal bovino (FBS) em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de contaminantes e patógenos de roedores com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (através do teste MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos). Quando as células em cultura eram suficientes para implantação, elas foram lavadas com solução salina balanceada Hank livre de soro (HBSS). Finalmente, as células foram diluídas em HBSS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção e 20 milhões de células por animal suspensas em 0,2 ml de HBSS foram injetados subcutaneamente na região do flanco direito da camundonga após um período mínimo de 7 dias de aclimatação, utilizando uma seringa de 1CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada por formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0206] Os tumores puderam ser detectados cerca de duas semanas após implantação. O tamanho do tumor foi medido com um calibrador. A fórmula a seguir foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0207] Três semanas após implantação do tumor, os tumores atingiram um tamanho médio de 194,6 ± 37,9 mm3. Animais com tamanho e formato de tumor aceitáveis foram aleatoriamente designados em dois grupos de oito animais cada, utilizando software de classificação, um grupo controle de veículo e um grupo de tratamento.

[0208] O Composto 1 foi formulado e dosado como segue: 7,5 mg/ml foram dissolvidos em 30% Captisol com 2 equivalentes molares de NaOH e HCl cada e dosados através de gavagem oral diariamente cinco vezes por semana, com base no peso corpóreo de cada camundongo. O grupo controle foi dosado com veículo (30% Captisol) utilizando o mesmo paradigma de dosagem.

[0209] Durante cada estudo animal, os tumores foram medidos com calibradores, o tamanho do tumor determinado utilizando a fórmula acima mencionada e calculadas as alterações percentuais de tamanho do tumor. Os pesos corpóreos das camundongas foram medidos com uma balança duas vezes por semana. Os estudos prosseguiram até: a) a data final predeterminada indicada no projeto de estudo; ou b) desencadeamento de problemas de saúde, o que primeiro ocorresse. Além disso, os seguintes parâmetros relacionados com tumor garantiram o procedimento de eutanásia: (1) carga tumoral excedendo 2500 mm3 e/ou (2) perda de >20% do peso corpóreo inicial. Além da determinação de alterações no tamanho do tumor, utilizou-se a última medição do tumor para gerar a relação de alteração de peso de tumor (valor T/C), uma métrica padrão desenvolvida pelo Nacional Cancer Institute (NCI) para avaliação de tumor em xenoenxerto. Os valores T/C foram calculados utilizando-se a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ΔT/ΔCse ΔT>0.Nos casos de regressão de tumor, porém, foi utilizada a seguinte fórmula: %T/T0 = 100 x ΔT/T0 se ΔT<0.

[0210] O período de pré-tratamento foi de 15 dias. Os tamanhos de tumor e pesos corpóreos foram medidos novamente no último dia de estudo.

[0211] Conforme mostra a Figura 14, o agente único do Composto 1 inibiu o crescimento do tumor no modelo de tumor subcutâneo MM1S. Os valores T/C são calculados como 27,37% (P<0,0001, ANOVA) baseados no dia 14. Não se observou perda de peso corpóreo ou outros efeitos colaterais no grupo de tratamento com agente único do Composto 1.

Modelo de Xenoenxerto MM1R

[0212] Camundongas SCID/Beige com 4 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas (INNOCAGE®IVC, Innovive Inc., San Diego, CA) em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige foram esterilizados em autoclave antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não-invasivos).

[0213] Células MM1R de MM humano foram originalmente obtidas de sangue periférico de um paciente com mieloma múltiplo. (Goldman-Leikin RE, et al., J Lab Clin Invest. 1980, 113:335-345). As células criopreservadas foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI mais 10% soro fetal bovino (FBS) em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de contaminantes e patógenos de roedores com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (através do teste MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos). Quando as células em cultura eram suficientes para implantação, elas foram lavadas com solução salina balanceada Hank livre de soro (HBSS). Finalmente, as células foram diluídas em HBSS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção e 15 milhões de células por animal suspensas em 0,1 ml de HBSS foram injetados subcutaneamente na região do flanco direito da camundonga após um período mínimo de 7 dias de aclimatação, utilizando uma seringa de 1CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada por formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0214] Os tumores puderam ser detectados cerca de duas semanas após implantação. O tamanho do tumor foi medido com um calibrador. A fórmula a seguir foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0215] Três semanas após implantação do tumor, os tumores atingiram um tamanho médio de 131,7 ± 28,7 mm3. Animais com tamanho e formato de tumor aceitáveis foram aleatoriamente designados em dois grupos de oito animais cada, utilizando software de classificação, um grupo controle de veículo e um grupo de tratamento.

[0216] O Composto 1 foi formulado e dosado como segue: 7,5 mg/ml foram dissolvidos em 30% Captisol com 2 equivalentes molares de NaOH e HCl cada e dosados através de gavagem oral diariamente cinco vezes por semana, com base no peso corpóreo de cada camundongo. O grupo controle foi dosado com veículo (30% Captisol) utilizando o mesmo paradigma de dosagem.

[0217] Durante cada estudo animal, os tumores foram medidos com calibradores, o tamanho do tumor determinado utilizando a fórmula acima mencionada e calculadas as alterações percentuais de tamanho do tumor. Os pesos corpóreos das camundongas foram medidos com uma balança duas vezes por semana. Os estudos prosseguiram até: a) a data final predeterminada indicada no projeto de estudo; ou b) desencadeamento de problemas de saúde, o que primeiro ocorresse. Além disso, os seguintes parâmetros relacionados com tumor garantiram o procedimento de eutanásia: (1) carga tumoral excedendo 2500 mm3 e/ou (2) perda de >20% do peso corpóreo inicial. Além da determinação de alterações no tamanho do tumor, utilizou-se a última medição do tumor para gerar a relação de alteração de peso de tumor (valor T/C), uma métrica padrão desenvolvida pelo Nacional Cancer Institute (NCI) para avaliação de tumor em xenoenxerto. Os valores T/C foram calculados utilizando-se a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ΔT/ΔCse ΔT>0.Nos casos de regressão de tumor, porém, foi utilizada a seguinte fórmula: %T/T0 = 100 x ΔT/T0 se ΔT<0.

[0218] O período de pré-tratamento foi de 18 dias. Os tamanhos de tumor e pesos corpóreos foram medidos novamente no último dia de estudo.

[0219] Conforme mostra a Figura 14, o agente único do Composto 1 inibiu o crescimento do tumor no modelo de tumor subcutâneo MM1R. Os valores T/C são calculados como 21,15% (P<0,0001, ANOVA) baseados no dia 17. Não se observou perda de peso corpóreo ou outros efeitos colaterais no grupo de tratamento com agente único do Composto 1.

Exemplo 15: Efeito de Composto 1 sobre Linfócitos Circulantes

[0220] Um estudo examinando o efeito do Composto 1 sobre linfócitos T e B circulantes foi conduzido em camundongos tipo selvagem CD1. Cinco camundongos foram tratados com Composto 1 formulado como no Exemplo 8(b) (5 mg/ml) a 100 mg/kg oralmente por cinco dias consecutivos. Outros 5 camundongos foram tratados com veículo. O sangue foi coletado em vários pontos de tempo (inclusive pré-dosagem, durante a dosagem e pós-dosagem) da veia mandibular. O sangue foi analisado com citômetro de fluxo para quantificação de células T e B.

[0221] O efeito do Composto 1 sobre níveis de linfócitos T e B em órgãos linfóides, baço e linfonodos, também foi avaliado. Os camundongos foram tratados com Composto 1 oralmente a 100 mg/kg por cinco dias consecutivos. Os animais foram sacrificados e os órgãos linfóides coletados. As células foram fisicamente dissociadas dos tecidos e analisadas com citômetro de fluxo. Anticorpos anti-CD3 e CD19 foram usados para corar células T e B, respectivamente.

[0222] Os resultados desses estudos são mostrados na Tabela 6, um gráfico apresentando níveis de linfócitos no sangue ao longo do tempo. O Composto 1 mostra uma redução reversível significativa nos níveis sanguíneos de linfócitos T e B em comparação com controle. Um efeito similar é observado em níveis de linfócitos no baço e linfonodos. Esses dois órgãos mostram uma redução significativa tanto nos linfócitos T como B, após dosagem com Composto 1 em comparação com controles. Exemplo 16: Efeito de Composto 1 sobre Células Hematopoiéticas em Medula Óssea

[0223] A medula óssea foi também removida dos camundongos sacrificados no Exemplo 12. O conteúdo de medula óssea foi coletado dos ossos longos dos camundongos e analisados com citômetro de fluxo. Foram usados vários marcadores para progenitor e linfócitos maduros. Os resultados demonstraram que o tratamento com Composto 1, embora causem uma redução nas contagens de linfócitos T e B periféricos, induzem um aumento compensatório em células de progenitor de linfócito em medula óssea em comparação com controles. Exemplo17: Ensaio de Mutação Reserva de Salmonella/Microssoma de Mamífero

[0224] Este estudo foi conduzido para avaliar a capacidade de o Composto 1 induzir mutações reversas na presença ou ausência de enzima microssomal de mamífero (S9-mix) no local da histadina no genoma de 2 cepas de Salmonella typhimurium (TA98 e TA100).

[0225] As cepas para teste utilizadas no ensaio de mutagenicidade foram as cepas de Salmonella typhimurium TA98 (para detectar mutação reversa por deslocação do quadro de leitura) e TA100 (para detectar mutação reversa pontual). O ensaio foi conduzido tanto na presença como na ausência de mistura S9 juntamente com veículo (DMSO, 20 μl/cavidade) e controles positivos em duplicata utilizando placas com 6 cavidades. Cinco concentrações com diluições 2X seguintes variando de 1000 a 62,5 μg/cavidade (equivalente a 5000 a 312,5 μg/placa em ensaio Ames padrão) foram testadas para cada um dos compostos. Após incubação a 37°C por 48-72 horas, as placas foram observadas quanto à insolubilidade e citotoxicidade do composto, e escaneadas para contagem de colônias revertentes. Um aumento duplo reprodutível (> 2x do controle de veículo) de colônias revertentes em relação ao valor de controle médio diário é considerado uma resposta positiva de mutação gênica para cada cepa.

[0226] O Composto 1 foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) que também serviu como controle negativo (veículo). 2- nitrofluoreno e azida sódica serviram como controles positivos na ausência de S9 para TA98 e TA100, respectivamente. 2-aminoantraceno serviu como controles positivos na presença de S9 para TA98 e TA100.

Resultados

[0227] O Composto 1 formou uma solução de cor marrom quando dissolvido em DMSO a uma concentração de 50 mg/ml, sendo pois a solução mais concentrada. O artigo de teste permaneceu como uma solução de cor marrom-clara a incolor em todas as diluições 2X seguintes até 3.125 mg/ml. A precipitação do artigo de teste foi observada quando o artigo de teste e o ágar mole foram misturados juntos a uma concentração de 250 μg/cavidade e acima. Após 48-72 horas de incubação, observou-se leve precipitação do artigo de teste em microscopia de dissecação a 250 μg/cavidade com TA98 e TA100 na ausência apenas de mistura S9, precipitação do artigo de teste e redução secundária de tapete de fundo (camada de crescimento bacteriano contínuo e uniforme) foram observados de forma leve a moderada a 500 e 1000 μg/cavidade com TA98 e TA100 na presença e ausência de mistura S9. Não houve evidência de aumento significativo no número médio de colônias revertentes em comparação com o controle médio quando testadas na presença e ausência de mistura S9 com cepas TA98 e TA100 (Tabela 5).

[0228] Os resultados do estudo atual demonstraram que o Composto 1 não induziu uma resposta mutagênica positiva com cepas TA98 e TA100 na presença e ausência de enzimas microssomais quando os artigos de teste eram testados até a concentração máxima de 1000 μg/cavidade (equivalente a 5000 μg/placa em ensaio Ames padrão).

aTA98: 2—nitrofluoreno, 0,4μg/cavidade/ TA100: azida sódica, 2,0 μg/cavidade bTA98 e TA100: 2-aminoantraceno, 0,8μg/cavidade cCódigos de avaliação do tapete de fundo (“background lawn”): 5. crescimento aumentado em comparação com os controles solvente, 4. similar ao controle de veículo (normal, sem toxicidade), 3. menos que 25% redução (menos que 25% citotoxicidade), 2. mais de 25%, porém menos que 50% de redução (menos que 50% citotoxicidade), 1. mais de 50% redução (mais de 50% citotoxicidade), sem crescimento (100% citotoxicidade). sp=leve precipitado mp=precipitado moderado hp = precipitado pesado *: aumento positivo

Exemplo 18: Estudo Farmacodinâmico em Linhagens de Células Tumorais

[0229] Linhagens de células tumorais H460 (Kras, PI3K), BT474 (HER2, PI3K), A375 (B-Raf) e H1975 (EGFR, PI3K) foram cultivadas e tratadas com DMSO isoladamente (controle de veículo) ou 0, 1 μmol/L Composto 1 ou composto de referência por 16 horas. Os extratos de células foram preparados na presença de SDS e 2-mercaptoetanol e resolvidos em géis de poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para filtro de nitrocelulose e o “blotting” foi conduzido utilizando procedimentos padrão com soluções de bloqueio (Li-Cor Bioscience) contendo o anticorpo primário indicado. Anticorpos primários contra p-EGFR, EGFR, p-HER2, HER2, p- HER3, HER3, p-MET, MET, p-bRaf, p-cRaf, pMEK, MEK, p-ERK, ERK e tubulina foram adquiridos da Cell Signalling Technology. Anticorpo secundário conjugado com IRdye 680, 800CW foram usados e o sinal detectado com aparelho Li-Cor Odyssey Imager.

[0230] Foi conduzida imunocitoquímica em células crescidas em cultura monocamada e tratadas conforme indicam as legendas da figura, sendo então fixadas 4% (em peso) de paraformaldeído. Após lavagem em 1xPBS, foi conduzida imunocoloração em solução de bloqueio Li-Cor contendo os anticorpos primários indicados e anticorpos secundários conjugados a IRDye 680 ou 800CW. Para o ensaio “In-cell Western”, foi utilizado um aparelho de imagem por infravermelho Li-Cor Odyssey para detecção e quantificação dos resultados.

[0231] Para exame histológico de marcadores farmacodinâmicos, xenoenxertos em tumor foram coletados e incluídos em parafina, sendo então preparados cortes de 4-5 mm. Os cortes foram montados em slides e reagidos com anticorpos primários seguido de anticorpo secundário conjugado à enzima horseradish peroxidase (polímero-HRP da Envision, Dako, Glostrup, Dinamarca). A reação colorida foi então conduzida utilizando diaminobenzidina (DAB) conforme recomendação do fabricante. A contracoloração dos cortes foi realizada com hematoxilina.

[0232] Os resultados deste estudo estão resumidos nas Figuras 7A-7ge 8A-8C. O Composto 1 inibe a atividade de HDAC e a sinalização da via de PI3K em células de câncer pulmonar não de pequenas células H460 KRAS e PI3K-mutante. As células foram tratadas com DMSO isoladamente (controle de veículo) ou contendo compostos de teste durante 1 hora antes da realização do ensaio Western Blot ou In-cell Western. A Figura 7A mostra que o Composto 1 a 1 μmol/L aumenta os níveis de histona acetilada 3 (Ac-H3), tubulina (Ac-Tub) e p53 (Ac-p53). O composto também regula para baixo o teor de p53 e p21 total. Os dados citados nas Figuras 7B-7E mostram que o Composto 1 aumenta os níveis de tubulina acetilada (Figura 7B), histona acetilada 3 (Figura 7C), p53 acetilado (Figura 7D) e p21 acetilado (Figura 7E) de forma dependente da dose. Os valores IC50 resultantes sugerem que o Composto 1 possui potência inibitória de HDAC comparável a LBH 589 nas células cancerosas examinadas. A 1 μmol/L, o Composto 1 inibe a ativação de AKT e as proteínas de sinalização descendente 4EBP-1 e p70S6 (Figura 7F). O Composto 1 também inibe persistente e potencialmente a fosforilação de Akt de forma dependente da dose (Figura 7G).

[0233] Uma limitação importante de inibidores de PI3K no tratamento de câncer é a ativação da via RAF-MEK-ERK. Os inibidores de HDAC podem inibir os níveis de quinase nesta via de sinalização em células cancerosas via modificação epigenética. Em células tumorais com várias mutações, tal como mutações KRAS e PI3K em células H460, a mutação B-Raf em células A375, mutações HER2 e PI3K em células BT-474 e mutações EGFR em células H1975, 100 nM de Composto 1 suprimiram a ativação de Raf, MEK e ERK. O potente inibidor de HDAC LBH 589 mostrou atividades similares em alguns desses ensaios Western blot (Figura 8A).

[0234] Além da inibição das vias de PI3K e MEK, o tratamento de células de mieloma RPMI-8226 com 1 μM de Composto 1 durante 16 horas inibiram p-STAT3 (Y-705) e p-Src (Figura 8B).

[0235] Em células EGFR-L858R-T790M-duplo mutante H1975 de NSCLC (câncer pulmonar não de pequenas células) e células de câncer de mama BT-474 com superexpressão de HER2, o Composto 1 demonstrou reduzir os níveis de receptor fosforilado e total de tirosina quinases EGFR, HER2, HER3 e MET após incubação por 16 horas. Observou-se regulação para baixo similar das mesmas quinases após tratamento dessas células com LBH 589 (Figura 8C).

Exemplo 19: Expressão de PI3K110 μ, β, Y e δ em Modelos Tumor em Xenoenxerto Hemotológico

[0236] Camundongas imunodeficientes (Beige/SCID) com 6-8 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas, em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige eram descartáveis e foram adquiridos irradiados da Innovive antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não-invasivos).

[0237] Linhagens celulares de câncer hematológico humano foram originalmente obtidas da pacientes humanos com câncer. As células criopreservadas foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI mais 10-15% soro fetal bovino (FBS) em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de contaminantes e patógenos de roedores com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (pelo teste de MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos).

[0238] Quando as células em cultura atingiram o número desejado, foram coletadas e lavadas com solução salina tamponada com fosfato livre de soro da Dulbecco (DPBS). Finalmente, as células foram diluídas em DPBS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção. Após um período de 7 dias de aclimatação, de 10 a 20 milhões de célula por animal suspensas em 0,1 ml de DPBS foram injetadas subcutaneamente (SC) na região do flanco direito do animal utilizando seringa de 0,5CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada pela formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0239] Os tumores foram detectáveis cerca de duas semanas e meia após implantação. O tamanho do tumor foi medido com calibrador. A fórmula seguinte foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0240] Quando os tamanhos de tumor atingiam cerca de 150300 mm3, os camundongos eram separados em quatro grupos incluindo três grupos de tratamento (25 mg/kg, 50 mg/kg e 100 mg/kg) e um grupo controle. Após dosagem com Composto 1, os tumores foram coletados em 15 minutos, 1, 3, 6, 24 horas (3 camundongos para cada ponto no tempo). Os tumores foram coletados de acordo com os pontos no tempo relacionados acima; em seguida os camundongos foram sacrificados com CO2. As amostras foram colocadas no gelo seco até serem transferidas para um freezer a -80°C para análise Western blot.

[0241] Proteína foi extraída dos tecidos tumorais utilizando um homogeneizador (Tissuelyser, Qiagen, Valencia, CA) de acordo com instruções do fabricante. Os adaptadores para reter os tubos com tecido foram congelados a -20°C e o tampão de lise e esferas foram resfriados a 4°C antes do uso.

[0242] 100-200 μg de tecido foram homogeneizados em 300 μl de reagente para Extração de Proteína de Tecido de Mamífero T-PER (Pierce, Rockford, IL) suplementado com inibidores de fosfatase (1:100 em volume, coquetéis de inibidor de Tyr & Scr/Thr fosfatase, Upstate). Os corpos de prova foram examinados visualmente após cada ciclo (tempo: 0,15 minutos; frequência: 30 Hz) até que os tecidos estivessem totalmente homogeneizados. Foram necessários aproximadamente quatro ciclos na maioria dos casos. Os lisados de tecido foram centrifugados a 14.000 rpm a 4°C por 10 minutos. 200 μl de sobrenadante foram coletados e mantidos a -80°C. A concentração de proteína foi medida utilizando o kit de Ensaio de Proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) de acordo com instruções do fabricante.

[0243] 30 μg de extrato de proteína total foram resolvidos em géis Bis-Tris 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) utilizando uma Máquina de Transferência Bio-Rad Semi-Dry. Os blots foram incubados com 10ml de tampão de bloqueio (Odyssey Infrared Imaging System) por 1 hora e então sondados com o anticorpo primário da noite para o dia a 4°C em um agitador. Os blots foram sondados com o anticorpo primário da noite para o dia a 4°C. Os anticorpos primários incluíam PI3 quinase p110α (#4249, 1:1000, Sinalização celular), PI3 Quinase p110β (#3011, 1:1000, Sinalização celular), PI3 Quinase p110y (#5405, 1:1000, Sinalização celular), PI3 quinase p110δ (SC-7176 (1:1000 , Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, 1/30.000, Abcam, Cambridge, MA) foi usado como controle interno para cada ensaio.

[0244] A membrana foi lavada quatro vezes com solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TBST;DAKO) e incubada por 1 hora à temperatura ambiente com os anticorpos secundários conjugados marcados com infravermelho (1:10000): anti-coelho conjugados a IR Dye-800 (Rockland) e anti-camundongo conjugados a Alexa 680 (Molecular Probes). A membrana foi lavada com TBST e então colocadas no sistema Odyssey Infrared Imaging System para obtenção de imagens e análise.

[0245] Os resultados constam da Figura 15, que mostra ensaios Western blot de isoformas p110 de PI3K, AKT e pAKT de vários xenoenxertos de linfoma não Hodgkin e de mieloma múltiplo. Os resultados mostram que a ativação de AKT é realizada por isoformas P110 de PI3K.

Exemplo 20: Comparação do Composto 1 e de CAL-10 no Modelo Tumor em Xenoenxerto Daudi

[0246] Camundongas SCID/Beige com 6-8 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas, em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige eram descartáveis, e foram adquiridos irradiados da Innovive antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não- invasivos).

[0247] Células Daudi de linfoma de Burkitt humano foram originalmente obtidas de um paciente humano com linfoma de Burkitt. As células criopreservadas foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI-1640 mais 15% soro fetal bovino (FBS), 1% Penstrep, e 1% Glutamax em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de patógenos com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (através do teste MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos). Quando as células em cultura atingiram os números desejados, foram coletadas por centrifugação. Após a coleta, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato livre de soro da Dulbecco (DPBS). Finalmente, as células foram diluídas em DPBS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção e 20 milhões de célula por animal suspensas em 0,1 ml de DPBS foram injetadas subcutaneamente (SC) na região do flanco direito do camundongo após um período mínimo de 7 dias de aclimatação, utilizando seringa de 0,5CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada pela formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0248] Os tumores foram detectáveis cerca de duas semanas após implantação. O tamanho do tumor foi medido com calibrador. A fórmula seguinte foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0249] Quatro semanas após implantação do tumor, os tumores atingiram um tamanho médio de 300 ± 126 mm3. Animais com tamanho e formato de tumor aceitáveis foram aleatoriamente designados em três grupos de sete animais cada, utilizando software de classificação, um grupo controle de veículo e dois grupos de tratamento.

* Qd = dosagem uma vez ao dia. * *PO = dosagem por gavagem oral. * **BID, duas vezes ao dia

[0250] O Composto 1 foi formulado e dosado como segue: Composto 1 (7,5 mg/ml) foi dissolvido em 30% Captisol com 2 equivalentes molares de NaOH, balanceado com 2 equivalentes molares de HCl e dosado via gavagem oral diariamente de segunda a sexta-feira. O grupo controle foi dosado com veículo (30% Captisol) utilizando o mesmo paradigma de dosagem de 100 mg/kg de volume (6,67 μl/g).

[0251] Durante cada estudo animal, os tumores foram medidos com calibradores, o tamanho do tumor determinado utilizando a fórmula acima mencionada e calculadas as alterações percentuais de tamanho do tumor. Os pesos corpóreos das camundongas foram medidos com uma balança duas vezes por semana. Os estudos prosseguiram até: a) a data final predeterminada indicada no projeto de estudo; ou b) desencadeamento de problemas de saúde, o que primeiro ocorresse. Além disso, os seguintes parâmetros relacionados com tumor garantiram o procedimento de eutanásia: (1) carga tumoral excedendo 2500 mm3 e/ou (2) perda de >20% do peso corpóreo inicial. Além da determinação de alterações no tamanho do tumor, utilizou-se a última medição do tumor para gerar a relação de alteração de peso de tumor (valor T/C), uma métrica padrão desenvolvida pelo Nacional Cancer Institute (NCI) para avaliação de tumor em xenoenxerto. Os valores T/C foram calculados utilizando-se a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ΔT/ΔCse ΔT>0.Nos casos de regressão de tumor, porém, foi utilizada a seguinte fórmula: %T/T0 = 100 x ΔT/T0 se ΔT<0.

[0252] O período de tratamento foi de 15 dias para os grupos veículo e CAL-101, que exigiu término antecipado devido ao tamanho do tumor ter excedido 10% do peso corpóreo, e 18 dias para o grupo de Composto 1. Os tamanhos de tumor e pesos corpóreos foram medidos novamente no último dia do estudo.

[0253] Os resultados do estudo são apresentados na Figura 16, que mostra crescimento de tumor para os grupos ativo e controle como função de tempo de tratamento. O grupo do Composto 1 mostrou crescimento significativamente reduzido de tumor em comparação com os grupos CAL-101 e controle.

Exemplo 21: Combinação de Composto 1 e de Ciclofosfamida em modelo tumor em xenoenxerto Daudi

[0254] Camundongas SCID/Beige (CD-1 Beige SCID) com 6-8 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas, em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige eram descartáveis, e foram adquiridos irradiados da Innovive antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não-invasivos).

[0255] Células Daudi de linfoma de Burkitt humano foram originalmente obtidas de um paciente humano com linfoma de Burkitt. As células criopreservadas foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI-1640 mais 15% soro fetal bovino (FBS), 1% Penstrep, e 1% Glutamax em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de patógenos com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (através do teste MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos). Quando as células em cultura atingiram os números desejados, foram coletadas por centrifugação. Após a coleta, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato livre de soro da Dulbecco (DPBS). Finalmente, as células foram diluídas em DPBS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção e 20 milhões de célula por animal suspensas em 0,1 ml de DPBS foram injetadas subcutaneamente (SC) na região do flanco direito do camundongo após um período mínimo de 7 dias de aclimatação, utilizando seringa de 0,5CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada pela formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0256] Os tumores foram detectáveis cerca de duas semanas após implantação. O tamanho do tumor foi medido com calibrador. A fórmula seguinte foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0257] Quatro semanas após implantação do tumor, os tumores atingiram um tamanho médio de 189 ± 47 mm3. Animais com tamanho e formato de tumor aceitáveis foram aleatoriamente designados em quatro grupos de oito animais cada, utilizando software de classificação, um grupo controle de veículo e três grupos de tratamento.

* Qd = dosagem uma vez ao dia. * *PO = dosagem por gavagem oral. * **BID, duas vezes ao dia.

[0258] O Composto 1 foi formulado e dosado como segue: Composto 1 (7,5 mg/ml) foi dissolvido em 30% Captisol com 2 equivalentes molares de NaOH, balanceado com 2 equivalentes molares de HCl e dosado via gavagem oral diariamente de segunda a sexta-feira a 75 mg/kg. Ciclofosfamida (“CTX”) foi dissolvida em 0,9% NS a 5 mg/ml, e dosada iv (injeção na veia caudal) em animais a 50 mg/kg no dia 0. O grupo de combinação foi dosado tanto com Composto 1 como com CTX utilizando o mesmo esquema de dosagem. O grupo controle foi dosado com veículo (30% Captisol) e 0,9% NS utilizando o mesmo paradigma da combinação.

[0259] Durante cada estudo animal, os tumores foram medidos com calibradores, o tamanho do tumor determinado utilizando a fórmula acima mencionada e calculadas as alterações percentuais de tamanho do tumor. Os pesos corpóreos das camundongas foram medidos com uma balança duas vezes por semana. Os estudos prosseguiram até: a) a data final predeterminada indicada no projeto de estudo; ou b) desencadeamento de problemas de saúde, o que primeiro ocorresse. Além disso, os seguintes parâmetros relacionados com tumor garantiram o procedimento de eutanásia: (1) carga tumoral excedendo 2500 mm3 e/ou (2) perda de >20% do peso corpóreo inicial. Além da determinação de alterações no tamanho do tumor, utilizou-se a última medição do tumor para gerar a relação de alteração de peso de tumor (valor T/C), uma métrica padrão desenvolvida pelo Nacional Cancer Institute (NCI) para avaliação de tumor em xenoenxerto. Os valores T/C foram calculados utilizando-se a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ΔT/ΔC se ΔT>0. Nos casos de regressão de tumor, porém, foi utilizada a seguinte fórmula: %T/T0 = 100 x ΔT/T0 se ΔT<0.

[0260] O período de tratamento foi de 2 semanas. Os tamanhos de tumor e pesos corpóreos foram medidos novamente no último dia do estudo.

[0261] Os resultados do estudo são apresentados na Figura 17, que mostra crescimento de tumor para os grupos ativo e controle como função de tempo de tratamento. Como agentes únicos, o Composto 1 e ciclofosfamida apresentam atividade similar neste modelo. A combinação de Composto 1 e de ciclofosfamida mostraram eficácia significativamente maior do que qualquer um dos dois agentes isoladamente.

Exemplo 22:Composto 1 em combinação com Lenalidomida no Modelo Xenoenxerto MM1S

[0262] Camundongas SCID/Beige com 4 semanas de vida foram acondicionadas em gaiolas microisolantes ventiladas (INNOCAGE®IVC, Innovive Inc., San Diego, CA) em ambiente controlado, alimentadas com dieta estéril com alto teor de gordura (Problab-RMH 2000) à vontade e receberam água esterilizada. Todo alojamento e suprimentos para as camundongas SCID/Beige foram esterilizados em autoclave antes do uso. As camundongas foram inspecionadas diariamente inclusive finais de semana/feriados por pessoal e investigadores treinados. Todos os procedimentos com os animais foram conduzidos em condições estéreis em câmara de biossegurança (para injeções) ou capela de fluxo laminar (para procedimentos veterinários e não-invasivos).

[0263] Células MM1S de MM humano foram descongeladas em banho maria a 37°C e cultivadas em meio RPMI mais 10% soro fetal bovino (FBS) em incubadora de cultura de tecidos a 5% CO2. As células foram enviadas a fornecedores externos para triagem de contaminantes e patógenos de roedores com o objetivo de excluir a contaminação por micoplasma (através de PCR) e/ou vírus (através do teste MAP, Produção de Anticorpos em Camundongos). Quando as células em cultura eram suficientes para implantação, elas foram lavadas com solução salina balanceada Hank livre de soro (HBSS). Finalmente, as células foram diluídas em HBSS para implantação. Apenas suspensões de célula simples com mais de 90% de viabilidade (por exclusão pelo azul de triptano) foram usadas para injeção e 20 milhões de células por animal suspensas em 0,2 ml de HBSS foram injetados subcutaneamente na região do flanco direito da camundonga após um período mínimo de 7 dias de aclimatação, utilizando uma seringa de 1CC com agulha hipodérmica 26G, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. A implantação bem sucedida foi indicada por formação de uma massa arredondada e saliente sob a pele. As camundongas implantadas foram monitoradas diariamente quanto à saúde geral e desenvolvimento de tumor.

[0264] Os tumores puderam ser detectados cerca de duas semanas após implantação. O tamanho do tumor foi medido com um calibrador. A fórmula a seguir foi usada no cálculo do volume do tumor: Volume do tumor = (comprimento x largura2)/2

[0265] Três semanas após implantação do tumor, o tumor atingiu um tamanho médio de 192 ± 32 mm3. Animais com tamanho e formato de tumor aceitáveis foram aleatoriamente designados em 6 grupos de 7 animais cada, utilizando software de classificação, um grupo controle de veículo e seis grupos de tratamento.

[0266] O Composto 1 foi formulado e dosado como segue: Composto 1 (7,5 mg/ml) foi dissolvido em 30% Captisol com 2 equivalentes molares de NaOH, balanceado com 2 equivalentes molares de HCl e dosado via gavagem oral diariamente de segunda a sexta-feira a 75 mg/kg. Lenalidomida (Selleck, 2,5 mg/ml) foi formulada em MCT (0,5% metil celulose e 0,2% Tween 80) e dosada a 12,5 mg/kg ou 25 mg/kg. Os dois grupos de combinação foram dosados com Composto 1 a 75 mg/kg mais um nível de dose de lenalidomida (de 12,5 ou 25 mg/kg). O grupo controle foi dosado com veículo (30% Captisol) e MCT utilizando o mesmo paradigma da combinação.

[0267] Durante cada estudo animal, os tumores foram medidos com calibradores, o tamanho do tumor determinado utilizando a fórmula acima mencionada e calculadas as alterações percentuais de tamanho do tumor. Os pesos corpóreos das camundongas foram medidos com uma balança duas vezes por semana. Os estudos prosseguiram até: a) a data final predeterminada indicada no projeto de estudo; ou b) desencadeamento de problemas de saúde, o que primeiro ocorresse. Além disso, os seguintes parâmetros relacionados com tumor garantiram o procedimento de eutanásia: (1) carga tumoral excedendo 2500 mm3 e/ou (2) perda de >20% do peso corpóreo inicial. Além da determinação de alterações no tamanho do tumor, utilizou-se a última medição do tumor para gerar a relação de alteração de peso de tumor (valor T/C), uma métrica padrão desenvolvida pelo Nacional Cancer Institute (NCI) para avaliação de tumor em xenoenxerto. Os valores T/C foram calculados utilizando-se a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ΔT/ΔC se ΔT>0. Nos casos de regressão de tumor, porém, foi utilizada a seguinte fórmula: %T/T0 = 100 x ΔT/T0 se ΔT<0.

[0268] O período de tratamento foi de 17 dias. Os tamanhos de tumor e pesos corpóreos foram medidos novamente no último dia do estudo.

[0269] Os resultados do estudo são apresentados na Figura 18, que mostra crescimento de tumor como função de tempo de tratamento. Os resultados mostram que o Composto 1 a 75 mg/kg PO é mais eficaz do que a Lenalidomida a dosagens de 12,5 ou 25 mg/kg de PO como agentes únicos. Os resultados também mostram que a combinação de Composto 1 e lenalidomida é significativamente mais eficaz do que qualquer um dos compostos administrados isoladamente.

[0270] A patente e literatura científica aqui citada estabelece o conhecimento que está disponível no estado da técnica. Todas as patentes e pedidos de patente americanos publicados ou não publicados aqui citados são incorporados por referência. Todas as patentes e pedidos de patente estrangeiros publicados aqui citados são aqui incorporados por referência. Todas as outras referências, documentos, manuscritos e literatura científica aqui citados são aqui incorporados por referência.

[0271] Embora a presente invenção tenha sido especialmente mostrada e descrita com referência a concretizações preferidas das mesmas, fica entendido aos habilitados na técnica que várias alterações quanto à forma e detalhes podem ser feitas sem fugir do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações em anexo.

Claims (3)

1. Composto, caracterizadopelo fato de ser representado pela fórmula:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, o composto conforme definido na reivindicação 1, e um portador farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica, para administração oral, caracterizadapelo fato de compreender, como um ingrediente ativo, um composto conforme definido na reivindicação 1, e um portador farmaceuticamente aceitável.

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