JP2018052987A - 亜鉛結合部分を有するホスホイノシチド3−キナーゼインヒビター - Google Patents
亜鉛結合部分を有するホスホイノシチド3−キナーゼインヒビター Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2011年4月1日に出願された米国仮特許出願第61/470,849号および2011年11月14日に出願された米国仮特許出願第61/559,489号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書中に援用される。
ホスファチジルイノシトールのリン酸化誘導体であるホスホイノシチド(PI)は、真核生物細胞に必須であり、核プロセス、細胞骨格動力学、シグナル伝達および膜輸送を調節する。PI代謝に関与する酵素の中で、PI3-キナーゼ(PI3K)は、その発癌性の性質および薬物標的としての潜在性のための注目を特に集めている。PI3-キナーゼは、ホスファチジルイノシトールまたはPIをイノシトール環の3位でリン酸化する(非特許文献1)。PI3K活性により生成された3リン酸化リン脂質は、プロテインキナーゼB(PKB)のプレックストリン相同(pleckstrin homology)(PH)ドメインに結合し、PKBの細胞膜への転流、続いてPKBのリン酸化を引き起こす。リン酸化PKBは、FKHR、Badおよびカスパーゼなどのアポトーシス誘導タンパク質を阻害し、癌の進行に重要な役割を果たしていると考えられている。PI3Kは、クラスI〜IIIに分類され、クラスIはさらに、クラスIaとIbに下位分類される。これらのアイソフォームの中で、クラスIa酵素は、増殖因子-チロシンキナーゼ経路活性化に応答する細胞増殖において最も重要な役割を果たすと考えられる(非特許文献2)。癌における3つの頻度の高い変異は、細胞中で発現した場合にPI3Kαを活性化し、これらの変異は、癌細胞中に共通して見られるPKB、S6Kおよび4E bp1などの分子による癌性トランスフォーメーションおよび下流シグナル伝達の慢性的な活性化を誘導する(非特許文献3)。このように、PI3キナーゼは、増殖性疾患の治療のための魅力的な標的である。
本発明は、式I:
〔1〕式I:
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、
〔2〕RがR1C(O)-であり、ここでR1が、置換もしくは非置換C1-C24アルキル;置換もしくは非置換C2-C24アルケニル、好ましくはC2-C10アルケニル、より好ましくはC2-C6アルケニル;置換もしくは非置換C2-C24アルキニル;置換もしくは非置換アリール;または置換もしくは非置換ヘテロアリールである、〔1〕記載の化合物、
〔3〕RがHまたはアセチルである、〔1〕記載の化合物、
〔4〕式:
〔5〕有効成分として〔1〕記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物、
〔6〕有効成分として〔1〕記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、経口投与用の医薬組成物、
〔7〕有効成分として〔4〕記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物、
〔8〕有効成分として〔4〕記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、経口投与用の医薬組成物、
〔9〕PI3Kに関連する疾患または障害の治療を必要とする被験体に、治療有効量の〔5〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、該被験体におけるPI3Kに関連する疾患または障害の治療方法、
〔10〕前記PI3Kに関連する疾患または障害が、細胞増殖性障害である、〔9〕記載の方法、
〔11〕細胞増殖性障害が癌である、〔10〕記載の方法、
〔12〕癌が、乳頭腫、ブラストグリオーマ(blastoglioma)、カポジ肉腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病およびバーキット病からなる群より選択される、〔11〕記載の方法、
〔13〕HDAC媒介性疾患の治療を必要とする被験体に、〔5〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、HDAC媒介性疾患の治療方法、
〔14〕PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療を必要とする被験体に、〔5〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療方法、
〔15〕PI3Kに関連する疾患または障害の治療を必要とする被験体に、治療有効量の〔7〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、該被験体におけるPI3Kに関連する疾患または障害の治療方法、
〔16〕前記PI3Kに関連する疾患または障害が、細胞増殖性障害である、〔13〕記載の方法、
〔17〕細胞増殖性障害が癌である、〔16〕記載の方法、
〔18〕癌が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病およびバーキット病からなる群より選択される、〔17〕記載の方法、
〔19〕HDAC媒介性疾患の治療を必要とする被験体に、〔7〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、HDAC媒介性疾患の治療方法、
〔20〕PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療を必要とする被験体に、〔7〕記載の医薬組成物を投与する工程を含む、PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療方法
に関する。
好ましい態様において、式Iの化合物は以下:
本発明を説明するために使用される種々の用語の定義が以下に列挙される。これらの定義は、他に具体的に限定されない限り、個々に、または大きな群の一部のいずれかとして本明細書および特許請求の範囲を通して使用される際の用語に適用される。
本発明の医薬組成物は、1種類以上の薬学的に許容され得る担体または賦形剤とともに製剤化された、治療有効量の本発明の化合物を含む。
本発明の化合物および方法は、以下の実施例に関連してより理解されるであろうが、これらは単なる例示として意図され、本発明の範囲を限定しない。開示される態様に対する種々の変更および改変は当業者に明らかであり、限定されることなく、本発明の化学構造、置換基、誘導体、製剤および/または方法に関するものなどのかかる変更および改変は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲から逸脱することなくなされ得る。
工程a:(Z)-エチル-2-(エトキシメチル)-3-メトキシアクリレート(化合物202)
ナトリウム(40.9g、1.78mol)をエタノール(750mL)に部分的に注意深く添加し、溶液を濃縮し、全てのナトリウム金属が消失した後でNaOEt粉末を得た。撹拌しながら、ヘキサン(1.0L)を添加して、混合物を氷水浴で冷却した。201(130g、0.89mol)およびギ酸エチル(131g、1.78mol)の混合物を0〜5℃で滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。氷水浴で冷却しながら硫酸ジメチル(224g、1.78mol)を滴下した。得られた混合物を50℃で2時間加熱した。混合物に塩化トリエチルアンモニウム(122g)および水酸化ナトリウム(20g)を添加した。次いで混合物を室温で4時間撹拌してろ過した。濾液を水で洗浄してNa2SO4で乾燥させた。これを濃縮して、無色油状物の表題の化合物を得て(140g、37%)、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
エタノール(500mL)中の化合物202(140g、0.745mol)、尿素(40.0g、0.697mol)および濃塩酸(34mL)の混合物を還流で一晩加熱した。反応液の体積の約50%を蒸発させた後、得られた懸濁物を濾過して、少量のエタノールで洗浄し、乾燥させて、白色固体の化合物203を得た(47g、37%)。LCMS: 171 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.19 (t, J = 7.2 Hz , 3H), 3.92 (s, 2H), 4.08 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 7.0 (s, 1H), 7.08 (d, J = 6.0 Hz , 1H), 8.83 (d, br, J = 4.8 Hz, 1H).
酢酸(500mL)中の化合物203(47g、280mmol)の溶液に、臭素(49.0g、307mmol)を添加した。混合物を還流で2時間加熱して、室温に冷却し、さらに0〜5℃で冷却して、ろ過し、黄色固体の表題の化合物204を得た(38g、54%)。LCMS: 169 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 1.28 (t, J = 7.2 Hz , 3H), 4.32 (q, J = 7.2 Hz , 2H), 9.00 (br, s, 2H).
化合物204(38.0g、153mmol)およびホスホリルトリクロライド(300mL)およびN,N-ジメチルアニリン(3mL)の混合物を還流で2時間加熱して、室温に冷却し、濃縮した。残渣を氷水で注意深く急冷し、炭酸ナトリウムでpHを7〜8に調整し、EtOAcで抽出した。合わせた有機物を氷水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して、カラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、10%で溶出)で精製し、白色固体の化合物R-2-1を得た(15g、52%)。LCMS: 187 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.36 (t, J = 7.5 Hz , 3H), 4.39 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 9.08 (s, 2H).
無水1,2-ジメトキシエタン(300mL)中のNaH(27g、鉱物油中60%、0.675mol)の混合物を40〜50℃に加熱し、メチル3,3-ジメトキシプロピオネート(205)(100g、0.675mol)を滴下した。得られた混合物を0.5時間撹拌して、無水ギ酸メチル(81g、1.35mol)を40〜50℃で滴下した。得られた混合物を40〜50℃(内部温度)で2時間撹拌し、その後これを0℃に冷却した。反応混合物をゆっくり25℃に温めて、一晩撹拌した。Et2O(150mL)を添加して、30分間撹拌した。得られた懸濁液を濾過した。固体をEt2O(100mL)で洗浄し、回収して、乾燥させ、オフホワイト固体の表題の化合物206を得た(82g、61%)。LCMS (m/z): 130.8 [M+1]+. 1HNMR (400 MHz, CD3OD): δ 3.36 (s, 6H), 3.60 (s, 3H), 5.34 (s, 1H), 8.92 (s, 1H).
DMF(300mL)中の塩酸グアニジン(42.2g、0.44mol)の混合物に、化合物206(80g、0.40mol)を添加した。得られた混合物を100℃で1時間加熱した。反応混合物をろ過して、その後冷却した。ろ過ケーキを50mLのDMFで洗浄し、合わせた濾液を濃縮すると、残渣が残り、これを冷EtOHに懸濁して、冷EtOH (50mL)で洗浄し、黄色固体の化合物207を得た(38g、61.5%)。LCMS (m/z): 154.2 [M+1]+, 195.1[M+42]+. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 3.88 (s, 3H), 8.77 (s, 2H).
化合物207(7g、0.046mol)を、濃塩酸(15.2mL)およびCH2Cl2(60mL)の混合物に添加した。冷却後、ZnCl2(18.6g、0.138mol)を15〜20℃で添加した。混合物を15〜20℃で0.5時間撹拌して、5〜10℃に冷却した。内部温度を5〜10℃に維持しながらNaNO2(9.5g、0.138mol)を分割して添加した。反応を約2時間続けた。反応混合物を氷水(50mL)に注いだ。有機層を分離して、水層をCH2Cl2(30mL*2)で抽出した。合わせた有機抽出物を濃縮して、粗生成物(4.2g)を得た。粗製の化合物をヘキサン(20mL)中に懸濁して、60℃で30分間撹拌し、ろ過した。濾液を濃縮して、オフホワイト固体の表題の化合物R-2-2を得た(3.5g、44.4%)。LCMS (m/z): 214.1[M+42]+. 1HNMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.00 (s, 3H), 9.15 (s, 2H).
アセトニトリル(1.0L)中の2-メトキシ-ピリジン(100g、0.92モル)、NBS(180g、1.0モル)の溶液を還流で21時間撹拌した。TLCは、反応が完了したことを示した。反応混合物を室温に冷却し、濃縮した。約900mlの溶媒を回収した。得られた懸濁物をろ過して、n-ヘキサン(約400mL)で洗浄した。濾液を再度濃縮して、粗生成物を得た。減圧下(30℃/約0.3mmHg)で粗生成物を蒸留し、透明油状物の表題の化合物を得た(146g、84%)。LCMS (m/z): 190.0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.90 (s, 3H), 6.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4Hz, 1H), 8.19 (s, 1H).
無水THF(180ml)中の化合物303(20g、0.11モル)の溶液に、n-BuLi(59mL、THF中2M)を-78℃で滴下して、得られた混合物を1時間撹拌した。トリイソプロピルボレート(37mL)を-78℃で添加して、反応混合物を室温に温め、一晩撹拌を続けた。TLC(ヘキサン/酢酸エチル=5:1)は、反応の完了を示した。4N HCl(90ml)で、混合物をpH3〜4に調整した。沈殿物をろ過して回収し、粗製化合物R-3-1を得た(21g、128%)。粗製化合物R-3-1(21g)を水(200ml)に溶解し、濃アンモニア溶液で溶液をpH8〜9に調整し、沈殿物をろ過して回収し、白色固体の純粋な表題の化合物R-3-1を得た(11g、67%)。LCMS (m/z): 154.1 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.86 (s, 3H), 6.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 8.05 (br, 2H), 8.52 (d, J = 2.0 Hz, 1H).
無水ジオキサン(500mL)中の化合物303(55g、0.29mol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-オクタメチル-2,2'-ビ(1,3,2-ジオキサボロラン)(90g、0.35mol)、酢酸カリウム(57g、0.58mol)およびビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(2.2g、3mmol)の混合物を、N2雰囲気下、108℃で一晩加熱した。反応混合物を濃縮して、ヘキサン/酢酸エチルで溶出されるカラムクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物R-3-2を得た(58g、84%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.30 (s, 12H), 3.88 (s, 3H), 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 8.0 Hz, 2.0Hz, 1H), 8.41 (d, J = 2.0Hz, 1H).
尿素法:メチル3-アミノチオフェン-2-カルボキシレート(101)(90.0g、573mmol、1.0等量)および尿素(277.6g、4.6mol、8.0当量)の混合物を、190℃で3〜4時間加熱し、室温に冷却した。反応混合物に水性NaOH(10%、800mL)を添加した。常温で1時間撹拌した後、ろ過して固体を除去した。HClを用いて濾液をpH3〜4に酸性化し、沈殿した固体をろ過して回収し、水で洗浄して、真空下で乾燥させ、オフホワイト固体の所望の生成物化合物102を得た(87g、89%)。m.p.:280〜285℃. LCMS (m/z): 169.0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6): δ 6.92 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 11.0-11.5 (br, 2H).
温度を20℃未満に維持しながら、酸塩化リン(152mL、1.67mol、7.0当量)をアセトニトリル(250mL)中の化合物102(40g、238mmol、1.0当量)およびN,N-ジメチルアニリン(22.5mL、179mmol、0.75当量)の冷溶液にゆっくり添加した。混合物を85℃に加熱して、24時間撹拌した。反応混合物を15℃に冷却して、氷冷水の混合物(360mL)にゆっくり注いだ。得られたスラリーをろ過して、冷水(200mL)ですすいだ。ケーキを真空オーブン中、40℃で24時間かけて乾燥させ、オフホワイト固体の化合物103を得た(40.5g、83%)。M.p.:245〜250℃. LCMS (m/z): 205.0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.75 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.71 (d, J = 5.2 Hz, 1H).
化合物103(34.2g、167mmol、1.0当量)およびメタノール(500mL)の混合物にモルホリン(31.2mL、367mmol、2.2当量)をゆっくり添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿物をろ過して回収し、メタノールで洗浄して、真空下で乾燥させ、明黄色固体の所望の生成物化合物104を得た(39g、91%)。M.p.: 250〜255℃. LCMS (m/z): 256.0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.76 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.92 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 7.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 5.2 Hz, 1H).
THF(無水、320mL)中の化合物104(20g、78.4mmol、1.0当量)の懸濁物に、窒素下、-78℃でn-BuLi(ヘキサン中2.4M、40.8mL、102mmol、1.3当量)をゆっくり添加した。得られたスラリーを-60℃まで温めると、茶色透明溶液になった。反応混合物を再度-78℃に冷却して、DMF(無水、9.1mL、118mmol、1.5当量)をゆっくり添加した。得られた溶液を-78℃で0.5時間撹拌して、1時間かけて0℃まで温め、HCl水溶液(0.25M、660mL)および氷水(320mL)の混合物にゆっくり注いだ。得られたスラリーを0〜10℃で0.5時間撹拌し、ろ過して、冷水で洗浄し、真空下で乾燥させ、黄色固体の化合物105を得た(22g、98%)。M.p.:260〜265℃. LCMS (m/z): 284.0 [M+1]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.77 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.96 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 8.30 (s, 1H), 10.21 (s, 1H).
メタノール(125mL)中の化合物105(20.0g、70.4mmol、1.0等量)の溶液に、メチルアミンのメタノール溶液(27%v/v、75mL、563.2mmol)を窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空下で溶媒を除去し、粗製の固体生成物を得て、これを窒素下でメタノール(550mL)およびTHF(220mL)に溶解した。臭化水素ナトリウム(8g、211.2mmol)を分割して添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。真空下で反応混合物を蒸発させ、水(300mL)を添加した。メチレンクロライドで水性混合物を抽出し、合わせた抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濃縮した。残渣を6M HCl(230mL)に溶解し、30分間撹拌した。水溶液をメチレンクロライドで数時間洗浄し、NaOH(4N)でpH9〜10に調整した。沈殿した固体をろ過して回収し、乾燥させ(60℃、6時間)、明黄色固体を得た(18g、85%)。M.p.: 240〜245℃. LCMS (m/z): 299 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.32 (s, 3H), 3.74 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.88 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.96 (s, 2H), 7.24 (s, 1H).
CH3CN(400mL)中の106(10g、33.6mmol)およびR-2-1(6.8g、36.4mmol)の混合物に、室温で、ジイソプロピルエチルアミン(220mL、1.26mol)を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を蒸発させ、その後メチレンクロライド(300mL)を添加した。有機層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮すると残渣が残った。残渣に酢酸エチルを添加し、得られた混合物を氷/水浴温度で50分間撹拌した。得られた固体をろ過して回収し、白色固体の表題の生成物107-1を得た(10.6g、70%)。LCMS: 449 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 3.25 (s, 3H), 3.71 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.83 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.29 (m, 2H), 5.21 (s, 2H), 7.39 (s, 1H), 8.87 (s, 2H).
化合物106(25g、84mmol)、CH3CN(500mL)およびR-2-2(16g、92mmol)の混合物を室温で撹拌した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(500mL、2.9mol)を添加した。溶液を一晩撹拌して、蒸発させた。メチレンクロライド(500mL)を添加後、有機層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣に酢酸エチル(200mL)を添加し、混合物を氷/水浴中で50分間撹拌した。白色固体の表題の生成物を回収した(29.4g、81%)。LCMS (m/z): 435.2 [M+1]+. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 3.25 (s, 3H), 3.71 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.82-3.84 (m, 7H), 5.21 (s, 2H), 7.39 (s, 1H), 8.87 (s, 2H).
方法A:トルエン(80ml)、エタノール(50ml)および水(10ml)の混合溶媒中の化合物107-1(12g、26.7mmol)、R-3-1(4.9g、32mmol)、NaHCO3(6.7g、80.1mmol)およびビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(188mg、0.267mmol)の混合物を、N2雰囲気下、108℃で4.5時間加熱した。TLCは、反応が完了したことを示した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、水(20ml)を添加した。得られた固体をろ過して回収し、次いでエタノール(100mL)に懸濁した。懸濁物を室温で30分間撹拌してろ過した。回収した固体をエタノールで洗浄し、真空下で乾燥させ、白色固体の表題の化合物108-1を得た(10g、72%)。
m.p.198〜202℃. LCMS: 522.30 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 3.28 (s, 3H), 3.76 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.93 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.94 (s, 3H), 4.30 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 5.24 (s, 2H), 6.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 8.8 Hz, 2.0Hz, 1H), 8.88 (s, 2H), 9.15 (d, J = 2.0 Hz, 1H).
ジオキサン(540mL)中の化合物107-2(20g、46.0mmol)、B-3-1(9.2g、60.2mmol、1.3当量)の混合物に、室温で固体のNaHCO3(11.6g、138.1mmol、3当量)を添加して、その後水(40mL)を添加した。溶液の表面にN2を通過させることにより、得られた混合物を脱気した。次いで、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(323mg、0.46mmol、0.01当量)を添加して、得られた混合物を108℃で15時間加熱した。TLCおよびLCMSは、反応の完了を示した。反応混合物がまだ熱い(>90℃)うちに、セライトに通してろ過し、ジオキサン(70mL)で洗浄した。濾液を徐々に室温まで冷却し、冷却期間中に白色微結晶が形成された。懸濁物をろ過して、ジオキサン(80mL)で洗浄し、白色固体の表題の化合物108-2を得た(18g, 78%)。LCMS (m/z): 508.3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.28 (s, 3H), 3.76 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.82 (s, 3H); 3.92 (m, 4H), 3.93 (s, 3H), 5.20 (s, 2H), 6.91 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 8.8Hz, 2.4Hz, 1H), 8.88 (s, 2H), 9.15 (d, J = 2.0Hz, 1H).
ヒドロキシルアミンメタノール溶液の調製
MeOH(400mL)中のNH2OH.HCl(80g、1.12mol)の混合物を60〜65℃で1時間加熱すると、透明な溶液が形成された。次いで、これを氷水浴中で冷却した。反応温度を0〜10℃に維持しつつ、冷混合物にMeOH(240mL)中のKOH(96g、1.68mol)の溶液を滴下した。得られた混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで、無水Na2SO4(700g)を充填した定圧漏斗でろ過した。ろ過物を氷浴下で回収し、その後の使用のために冷蔵庫で保存した。
化合物108-1(10g、19mmol)を、上記の新たに調製したヒドロキシルアミンメタノール溶液(1.79M、350ml)に懸濁した。この混合物にジクロロメタン(100mL)を添加した。反応フラスコを密封して、混合物を室温で5時間撹拌すると、その後、透明な溶液になった。反応をさらに9時間撹拌し、不溶性固体をろ過して除去した。酢酸を添加して、濾液をpH6〜7に調整すると、固体沈殿物が形成された。固体をろ過して回収し、水および最少量のメタノールで洗浄し、真空下、60℃で5時間乾燥させ、白色固体の化合物1を得た(9.2g, 96%)。m.p. 177〜180℃. LCMS: 509.3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.24 (s, 3H), 3.76 (t, J = 5 Hz, 4H), 3.92 (t, J = 5 Hz, 4H), 3.92 (s, 3H), 5.20 (s, 2H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4Hz, 1H), 8.75 (s, 2H), 9.01 (s, 1H), 9.14 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 11.08 (s,1H).
ジクロロメタン(310mL)中の化合物108-2(31g、61.1mmol)の懸濁物に、室温で上述の新たに調製したヒドロキシルアミンメタノール溶液(1.79M、744ml)を添加した。反応フラスコを密封して、反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物は透明の溶液になった。反応溶液をろ過して、不溶性の固体を除去した。次いで、濾液に水(310mL)を添加したが、添加中に固体は形成されなかった。撹拌しながら酢酸(18.5mL)を添加し、pHを10.20に調整した(pHメーターにより継続してモニタリング)。酢酸の添加中に内部温度の変化はなかった。得られた反応混合物を継続してさらに4時間撹拌した。徐々に白色固体が形成された。懸濁物をろ過して、最少量のメタノール(100mLx3)で洗浄した。回収した白色固体をメタノール(620mL)および水(124mL)に再懸濁して懸濁物を形成した。上記の懸濁物に、さらに酢酸(11g)を添加し、pHを5〜6に調整した。固体形成の変化を観察した。懸濁物をさらに2時間撹拌し続けて、ろ紙でろ過して、最少量のメタノール(100mLx3)で洗浄した。回収した白色固体をオーブン(50℃)中で12時間乾燥させ、白色固体の表題の化合物1を得た(23.6g, 76.0%)。m. p.: 255〜259℃. LCMS (m/z): 509.3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.24 (s, 3H), 3.76 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.92 (t, J = 5.2Hz, 4H), 3.92 (s, 3H), 5.20 (s, 2H), 6.91 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 8.4Hz, 2.4Hz, 1H), 8.75 (s, 2H), 9.07 (s, 1H), 9.14 (d, J = 2.4Hz, 1H), 11.14 (s,1H).
方法A:化合物1(300mg、0.59mmol)およびMeOH/Et2O(3/1、40mL)の混合物に、MeOH(3mL)中のメタンスルホン酸(114mg、1.18mmol)の溶液を0℃で添加した。得られた混合物を0℃で3時間撹拌した。沈殿物をろ過して回収し、Et2Oで洗浄して、白色固体の化合物2を得た(260mg、73%)。
m.p.: 179〜185℃. LCMS: 509.3 [M+1] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.35 (s, 3H), 3.26 (s, 3H), 3.78 (t, J = 9.6 Hz, 4H), 3.95 (s, 3H), 4.03 (t, J = 9.2 Hz, 4H), 5.24 (s, 2H), 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 8.54 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 8.76 (s, 2H), 9.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 11.11 (br, 1H).
メタノール(30mL)中の化合物1(300mg、0.59mmol)の懸濁物に、0℃でt-BuONa(85mg、0.88mmol)をゆっくり添加した。得られた混合物を室温に温め、継続して2時間撹拌した。反応を濃縮して、残渣を粉砕し、エタノールで洗浄し、その後ろ過し、白色固体の化合物3を得た(230mg、73%)。m.p.: 178〜183℃. LCMS: 509.3 [M+1] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.17 (s, 3H), 3.75 (s, 4H), 3.92 (s, 7H), 5.16 (s, 2H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 8.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.65 (s, 2H), 9.14 (s, 1H).
メタノール(50mL)中の化合物1(400mg、0.78mmol)の混合物に、t-BuOK(132mg、1.17mmol)を、0℃、N2下で添加した。混合物を0℃で1時間撹拌して、室温で1.5時間継続して撹拌した。不溶性の固体をろ過して除去し、濾液を-20℃に冷却した。Et2O(100mL)を濾液に添加した。得られた混合物を-20℃で1時間撹拌した。ヘキサン(70mL)を添加して、混合物を-20℃で2時間継続して撹拌した。固体をろ過して回収し、真空下で乾燥させ、白色固体の化合物4を得た(150mg、35%)。m.p.: 174〜179℃. LCMS: 509.3[M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.16 (s, 3H), 3.74-3.76 (m, 4H), 3.90-3.93 (m, 7H), 5.15 (s, 2H), 6.90 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 8.39 (br, 1H), 8.58 (d, J = 8.8Hz, 1H), 8.62 (s, 2H), 9.15 (s, 1H).
DCM/MeOH(60mL/12mL)中の化合物1(200mg、0.39mmol)の溶液に、水酸化コリン(106mg、0.39mmol、MeOH中45%)を添加した。混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、濃縮して約30mLの溶媒を除去した。酢酸エチル(60mL)を添加して、混合物を室温で2時間撹拌した。少量の沈殿が生じた後、混合物を濃縮して約40mLの溶媒を除去し、さらに酢酸エチル(60mL)を添加した。混合物を室温で2時間撹拌し、ろ過し、白色固体の化合物5を得た(180mg、76%)。m.p.: 181〜185℃. LCMS: 509.3[M+1]+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 3.11 (s, 9H), 3.17 (s, 3H), 3.40 (t, J = 4.8Hz, 2H), 3.75 (t, J = 4.8Hz, 4H), 3.84 (br, 2H), 3.90-3.93 (m, 7H), 5.15 (s, 2H), 6.89 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 8.57 (dd, J = 8.8Hz, 2.4Hz, 1H), 8.64 (s, 2H), 9.14 (d, J = 2.0Hz, 1H).
DCM/MeOH(30mL/7.5mL)中の化合物1(200mg、0.39mmol)の懸濁物に、硫酸(1mLのMeOH中77mg、0.79mmol)を添加すると、透明の溶液が形成された。反応混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿が生じて、次いでtert-ブチルメチルエーテル(60mL)を添加した。得られた混合物を室温で1時間継続して撹拌した。固体をろ過して回収し、白色固体の化合物6を得た(180mg、76%)。M.p.: 243〜246℃. LCMS: 509.3 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.26 (s , 3H), 3.78 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.96 (s, 3H), 4.03 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 5.24 (s, 3H), 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.50 (s , 1H), 8.54 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 8.76 (s, 2H), 9.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 11.06 (br, 1H).
以下のアッセイを使用して、化合物1がPI3Kの種々のアイソフォームおよび変異体を阻害する能力を決定した。
PI3Kα活性は、ADP-Glo発光キナーゼアッセイを使用して測定した。PI3Kα(N末端GSTタグ付加組み換え全長ヒトp110αとタグ付加されていない組み換え全長ヒトp85αの複合体)を、バキュロウイルスを感染させたSf9細胞発現系中で共発現させた。(p110αについてのGenBank受託番号U79143;p85αについての受託番号XM_043865)。グルタチオン-アガロースを使用した1工程親和性クロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。競合アッセイを行って、精製された組み換えPI3Kα(p110α/p85α)およびPIP2の存在下で、ATPから生じたADPの量を測定した。反応バッファ(50mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、3uM オルトバナジウム酸Na、1mM DTT、10μM超純粋ATPおよび0.5% DMSO)中、30分間、30℃で、PI3Kαを20μM PIP2基質とインキュベートした。次いで、反応中に生じたADPをADP-Gloアッセイにより測定した。該アッセイは2工程で行った;第1に、等容量のADP-GLOTM試薬(Promega)を添加して、キナーゼ反応を終結させ、残存ATPを枯渇させた。第2工程で、ADPをATPに同時に変換するキナーゼ検出試薬を添加した。新たに合成されたATPは、共役ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応を使用して測定した。このアッセイにおいて化合物1について測定されたIC50は100nM未満であった。
PI3Kβの活性は、ホモジニアス時間分解蛍光(homogenous time-resolved fluorescence)(HTRF)技術を利用した時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR-FRET)アッセイを使用して測定した。P13Kβ(N末端ヒスチジンタグ付加組み換え全長ヒトp110βとタグ付加されていない組み換え全長ヒトp85αの複合体)を、バキュロウイルスを感染させたSf21細胞発現系において共発現させた。(p110βについてのGenBank受託番号NM_006219;p85αについての受託番号XM_043865)。グルタチオン-アガロースを使用した1工程親和性クロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。競合アッセイを行って、精製された組み換えPI3Kβ(p110β/p85α)の存在下でPIP2から生じたPIP3の量を測定した。反応バッファ(20mM HEPES、pH7.5、10mM NaCl、4mM MgCl2、2mM DTT、10μM ATPおよび1% DMSO)中、30分間、30℃で、PI3Kβを10μM PIP2基質とインキュベートした。次いで、反応生成物をPIP3検出体(detector)タンパク質、ユーロピウム標識抗体、ビオチン標識PIP3プローブおよびアロフィコシアニン標識ストレプトアビジンと混合した。センサー複合体(sensor complex)を形成させて、反応混合物中に安定なTR-FRETシグナルを生成する。このシグナル強度は、PIP3検出体に結合したビオチン標識プローブが酵素活性により生成されたPIP3と置き換えられ、混合物中の未結合ビオチン標識PIP3プローブの量が増加すると、減少する。TR-FRETシグナルは、バックグラウンドを差し引いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
PI3Kδの活性は、蛍光偏光アッセイを使用して測定した。P13Kδ(N末端ヒスチジンタグ付加組み換え全長ヒトp110δとタグ付加されていない組み換え全長ヒトp85αの複合体)を、バキュロウイルスを感染させたSf9細胞発現系において共発現させた。(p110δについてのGenBank受託番号NM_005026)。グルタチオン-アガロースを使用した1工程親和性クロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。競合アッセイを行って、精製された組み換えPI3Kδ(p110δ/p85α)の存在下でPIP2から生成されたPIP3の量を測定した。反応バッファ(20mM HEPES(pH7.5)、10mM NaCl、4mM MgCl2、2mM DTT、10μM ATPおよび1% DMSO)中、1時間、30℃で、PI3Kδを10μMのPIP2基質とインキュベートした。次いで、反応生成物を、PIP3検出体タンパク質および蛍光PIP3プローブと混合した。偏光(mP)値は、PIP3検出体に結合した蛍光プローブが、酵素活性により生じたPIP3と置き換えられ、混合物中の結合していない蛍光プローブの量が増加すると、減少する。偏光度(mP)値は、バックグラウンドを差し引いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
PI3Kγの活性は、ホモジニアス時間分解蛍光(HTRF)技術を利用した時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR-FRET)アッセイを使用して測定した。N末端ヒスチジンタグ付加ヒトP13Kδを、バキュロウイルスを感染させたSf9細胞発現系中で共発現させた。(GenBank受託番号AF327656)。タンパク質は、グルタチオン-アガロースを使用した1工程親和性クロマトグラフィーにより精製される。競合アッセイを行って、精製された組み換えPI3Kγ(p120γ)の存在下でPIP2から生成されたPIP3の量を測定した。反応バッファ(20mM HEPES、pH7.5、10mM NaCl、4mM MgCl2、2mM DTT、10μM ATPおよび1% DMSO)中、30分間、30℃で、PI3Kγ(2nM)を10μM PIP2基質とインキュベートした。次いで、反応生成物を、PIP3検出体タンパク質、ユーロピウム標識抗体、ビオチン標識PIP3プローブおよびアロフィコシアニン標識ストレプトアビジンと混合した。センサー複合体が形成されると、反応混合物中に安定なTR-FRETシグナルが生じる。このシグナル強度は、PIP3検出体に結合したビオチン標識プローブが、酵素活性により生じたPIP3と置き換えられ、混合物中の結合していないビオチン標識PIP3プローブの量が増加すると、減少する。TR-FRETシグナルは、バックグラウンドを差し引いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
HDAC阻害活性は、Biomol Color de Lys system (AK-500, Biomol, Plymouth Meeting, PA)を使用して評価した。簡潔に、HeLa細胞核抽出物をHDACの供給源として使用した。異なる濃度の試験化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)に逐次希釈して、比色人工基質の存在下でHeLa細胞核抽出物に添加した。最終アッセイ条件は、50mM Tris/Cl、pH8.0、137mM NaCl、2.7mM KClおよび1mM MgCl2を含んだ。反応は、室温(25℃)で1時間行い、その後終結のために顕色剤を添加した。WALLAC Victor II 1420マイクロプレートリーダー中で、蛍光強度として相対酵素活性を測定した(励起:350〜380nm;発光:440〜460nm)。S字状用量応答曲線がIC50計算値に適合するGraphPad Prism (v4.0a)を使用してデータを分析した。このアッセイにおいて化合物1について測定されたIC50は100nM未満であった。
ヒト癌細胞株をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から購入し、提供者によって提案されるように、96ウェル平底プレートの1ウェルあたり、培養培地と共に5,000〜10,000個で平板培養した。0.5%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS)を補充した培養培地中で72時間、細胞を、種々の濃度の化合物とインキュベートした。Promega CellTiter-Gloキットを使用して、増殖阻害をアデノシン三リン酸(ATP)含有量アッセイにより評価した。Promega CellTiter-Gloキットは、ホタルルシフェラーゼに基づくATPモニタリングシステムである。簡潔に、1ウェルあたり16μlの哺乳動物細胞溶解液および基質溶液を、84μlの培養培地に添加して細胞を溶解し、ATPを安定化した。混合物を振盪して、30分間インキュベートし、その後発光を測定した。S字状用量応答曲線が適合するPRISMソフトウェア(GraphPad Software)を使用してIC50値を計算した。
a. 30% Captisol中の化合物1(10mg/mL):
化合物1(10mg)を含むバイアルに30% Captisol(0.937ml)を添加した。混合物を2分間超音波処理した。混合物に水酸化ナトリウム(1N、39.3μl、2当量)を添加して、超音波処理/ボルテックスにかけ、透明な溶液(pH=12)を得た。次いで、該溶液を、塩酸(1N、23.6μl、1.2当量)でpH=10に調整した。
化合物1(7.5mg)を含むバイアルに30% Captisol(0.941ml)を添加した。混合物を2分間超音波処理した。混合物に水酸化ナトリウム(1N、29.5μl、2当量)を添加して、超音波処理/ボルテックスにかけ、透明な溶液(pH=12)を得た。次いで、該溶液を、塩酸(1N、29.5μl、2当量)でpH=5に調整した。
化合物1(5mg)、デカン酸ナトリウム(20mg)、PEG400(40μl)およびPEG1450(40mg)を含むバイアルに、H2O(0.88ml)およびNaOH(1N、24.6μl、2.5当量)を添加した。混合物を超音波処理してボルテックスにかけ、透明な溶液を得て、これをHCl(1N、7.4μl、0.75当量)でpH=10に調整した。
H2122腫瘍保有ヌードマウス
H2122(ヒト非小細胞肺癌細胞株)異種移植片腫瘍を保有するヌードマウスを薬物動態学的研究に使用した。デカン酸ナトリウムおよびPEG400(5mg/ml)と共に化合物1を水中で製剤化し、それぞれの動物に50mg/kgの用量で、胃管栄養法により経口(PO)投与した。化合物投与後の種々の時点で、1時点当たり3匹のマウスをCO2で安楽死させて血液および腫瘍組織を採取した。血液はヘパリンナトリウムを含むチューブに回収した。遠心分離により血漿を分離した。血漿および組織をその後の分析のために-80℃で保存した。PE Sciex API-3000 LC-MS/MSシステム(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)を使用して、血漿および腫瘍組織中の化合物濃度を分析した。
Daudi(非ホジキンリンパ腫細胞株)細胞を雌Scid(重症複合型免疫不全)マウスに移植した。腫瘍の定着後に、動物に、30% Captisol、pH10中に調製した25、50または100mg/kgの化合物1を、それぞれ1.875、3.75または7.5mg/mLの濃度で経口胃管栄養法により投与した。
25mg/Kg、50mg/kgおよび100mg/kgでの化合物1の単一用量での治療後のPD評価のために腫瘍を回収した。製造業者の指示書に従って、Tissuelyser (Qiagen, Valencia, CA)を使用して、腫瘍組織からタンパク質を抽出した。上述のように、WB分析のために30ugのタンパク質を常套的に使用した。細胞溶解物をNuPAGE Novex 4〜12% Bis-Trisゲル(Invitrogen)で分離して、ニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に転写した。4℃で一晩かけて、ブロットに種々の一次抗体で、プローブした(probed)。それぞれのアッセイについて、GAPDH(グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、1:30,000、Abcam, Cambridge, MA)を内部対照として使用した。次いで膜を、赤外線標識(infrared labeled)二次抗体(1:10000)のIR Dye-800 (Rockland Immunochemicals, Inc. Gilbertsville, PA)複合体またはAlexa 680(Invitrogen)複合体とインキュベートした。膜を、Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biotechnology, Lincoln, NE)で画像化した。
デカン酸ナトリウム/PEG400(5mg/ml)と共に水中で5mg/kgでのiv投与およびデカン酸ナトリウム/PEG4000/PEG1450(pH 10)と共に腸溶性カプセル中で5mg/kgでの経口投与を使用して、ビーグル犬における化合物1の薬物動態学的研究も行った。血漿を種々の時点で採取し、化合物1の濃度についてLC-MS/MSにより分析した。該研究の結果を以下の図4および表4に示す。図4は、経口投与およびiv投与の両方についての時間に対する血漿濃度のグラフである。経口投与により化合物1の有意な血漿レベルが達成される。
この研究の目的は、化合物1の経口投与後の雄Sprague-Dawleyラットにおける化合物1の血漿薬物動態学を決定することであった。
A. SU-DHL4、H2122、DaudiおよびOPM2の異種移植片腫瘍モデル
SU-DHL4(びまん性大B細胞リンパ腫細胞株)、H2122(ヒトNSCLC細胞株)、Daudi(非ホジキンリンパ腫細胞株)およびOPM2(多発性骨髄腫瘍細胞株)の細胞をヌードマウスまたはScid(重症複合型免疫不全)マウスのいずれかに移植した。腫瘍の定着後、十分な腫瘍サイズを有する動物を、無作為に活性(化合物1)群および対照(ビヒクル)群に割り当てた。経口投与のために実施例7(b)と同様に化合物1を調製し、それぞれの個々の動物の体重に基づいて、経口胃管栄養法により送達した。対照群は、対応する活性群と同じ投与スケジュールを使用してビヒクルで処理した。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を使用して腫瘍体積を計算した。
4週齢の雌SCID/ベージュ(Beige)マウスを、換気されたマイクロ隔離(micro-isolator)ケージ(INNOCAGE(登録商標)IVC, Innovive Inc., San Diego, CA)中、調節された環境下で収容し、滅菌高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCID/ベージュマウスのための全ての収容物および供給物は、使用前にオートクレーブにより滅菌した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)内の滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を使用して、腫瘍体積を計算した。
4週齢の雌SCID/ベージュマウスを、換気されたマイクロ隔離ケージ(INNOCAGE(登録商標)IVC, Innovive Inc., San Diego, CA)中、調節された環境下で収容し、滅菌高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCID/ベージュマウスのための全ての収容物および供給物は、使用前にオートクレーブにより滅菌した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)内の滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を使用して、腫瘍体積を計算した。
CD1野生型マウスにおいて、循環TおよびBリンパ球に対する化合物1の効果を調べる試験を行った。5匹のマウスを、実施例8(b)のように調製された化合物1(5mg/mL)を用いて、5日間連続で、100mg/kgで経口的に処理した。別の5匹のマウスはビヒクルで処置した。種々の時点(投与前、投与中および投与後など)で、下顎静脈から血液を採取した。TおよびB細胞定量化のためにフローサイトメーターを用いて血液を分析した。
実施例12において屠殺したマウスから骨髄も取り出した。該マウスの長骨から骨髄成分を回収し、フローサイトメーターを用いて分析した。前駆リンパ球および成熟リンパ球についての種々のマーカーを使用した。結果は、化合物1による処理は、対照と比較して、末梢のTおよびBリンパ球数の減少をもたらしながら骨髄リンパ球前駆細胞の代償的な増加を誘導したことを示した。
この研究は、2系統のネズミチフス菌(TA98およびTA100)のゲノム中のヒスチジン座で、哺乳動物ミクロソーム酵素(S9-mix)の存在下または非存在下のいずれかで、化合物1が復帰突然変異を誘導する能力を評価するために行った。
化合物1は、50mg/mlの濃度でDMSOに溶解した場合に栗色の溶液を形成し、これを最も濃いストック溶液とした。試験品(test article)は、3.125mg/mlまでの全ての2X連続希釈において、明るい栗色から無色の溶液のままであった。試験品とソフト寒天を250μg/ウェル以上の濃度で一緒に混合した場合、試験品の沈殿が観察された。48〜72時間のインキュベーション後、試験品の沈殿は、S9混合物の非存在下のみでTA98およびTA100を用いて、250μg/ウェルで、解剖用顕微鏡下にわずかに見られ、試験品沈殿およびバックグラウンド菌叢の少量の減少は、S9混合物の存在下および非存在でTA98およびTA100を用いて500および1000μg/ウェルで、わずか〜中程度で見られた。株TA98およびTA100を用いてS9混合物の存在下および非存在下で試験した場合、平均対照と比較して、復帰突然変異体コロニーの平均数の有意な増加の証拠はなかった(表5)。
腫瘍細胞株H460(Kras、PI3K)、BT474(HER2、PI3K)、A375(B-Raf)およびH1975(EGFR、PI3K)を培養して、DMSO単独(ビヒクル対照)または0.1μmol/Lの化合物1または参照化合物で16時間処置した。SDSおよび2-メルカプトエタノールの存在下で細胞抽出物を調製し、ポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに転写して、示される一次抗体を含むブロッキング溶液(Li-Cor Bioscience)を用いて、標準的な手法を用いてブロッティングを行った。p-EGFR、EGFR、p-HER2、HER2、p-HER3、HER3、p-MET、MET、p-bRaf、p-cRaf、pMEK、MEK、p-ERK、ERKおよびチューブリンに対する一次抗体は、Cell Signaling Technologyから購入した。IRdye 680、800CWと共役した二次抗体を使用して、Li-Cor Odyssey Imagerを用いてシグナルを検出した。
6〜8週齢の雌免疫不全マウス(ベージュ/SCID)を、換気したマイクロ隔離ケージ中、調節した環境で収容し、滅菌した高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCIDベージュマウスのための全ての収容物および供給物は使い捨てであり、使用前に放射線照射したものをInnoviveから購入した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)内で、滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を用いて、腫瘍体積を計算した。
6〜8週齢の雌SCIDベージュマウス(CD-1ベージュSCID)を、換気したマイクロ隔離ケージ中、調節された環境で収容、滅菌高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCIDベージュマウスについて全ての収容物および供給物は、使い捨てであり、使用前に放射線照射したものをInnoviveから購入した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)中、滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を用いて、腫瘍体積を計算した。
6〜8週齢の雌SCIDベージュマウス(CD-1ベージュSCID)を、換気したマイクロ隔離ケージ中、調節された環境で収容し、滅菌高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCIDベージュマウスについての全ての収容物および供給物は、使い捨てであり、使用前に放射線照射したものをInnoviveから購入した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)中、滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を用いて、腫瘍体積を計算した。
4週齢の雌SCID/ベージュマウスを、換気したマイクロ隔離ケージ(INNOCAGE(登録商標)IVC, Innovive Inc., San Diego, CA)中、調節された環境で収容し、滅菌高脂肪食(Problab-RMH 2000)を自由に摂取できるように与え、滅菌水を与えた。SCID/ベージュマウスについての全ての収容物および供給物は、使用前にオートクレーブにより滅菌した。訓練を受けた動物施設職員および研究者が、週末/休日を含む毎日、マウスを検査した。全ての動物手順は、生体安全キャビネット(注射用)または薄流フード(動物管理手順および非侵襲性手順用)中、滅菌条件下で行った。
腫瘍体積=(長さX幅2)/2
を用いて、腫瘍体積を計算した。
Claims (20)
- RがR1C(O)-であり、ここでR1が、置換もしくは非置換C1-C24アルキル;置換もしくは非置換C2-C24アルケニル、好ましくはC2-C10アルケニル、より好ましくはC2-C6アルケニル;置換もしくは非置換C2-C24アルキニル;置換もしくは非置換アリール;または置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項1記載の化合物。
- RがHまたはアセチルである、請求項1記載の化合物。
- 有効成分として請求項1記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
- 有効成分として請求項1記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、経口投与用の医薬組成物。
- 有効成分として請求項4記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
- 有効成分として請求項4記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む、経口投与用の医薬組成物。
- PI3Kに関連する疾患または障害の治療を必要とする被験体に、治療有効量の請求項5記載の医薬組成物を投与する工程を含む、該被験体におけるPI3Kに関連する疾患または障害の治療方法。
- 前記PI3Kに関連する疾患または障害が、細胞増殖性障害である、請求項9記載の方法。
- 細胞増殖性障害が癌である、請求項10記載の方法。
- 癌が、乳頭腫、ブラストグリオーマ(blastoglioma)、カポジ肉腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病およびバーキット病からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- HDAC媒介性疾患の治療を必要とする被験体に、請求項5記載の医薬組成物を投与する工程を含む、HDAC媒介性疾患の治療方法。
- PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療を必要とする被験体に、請求項5記載の医薬組成物を投与する工程を含む、PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療方法。
- PI3Kに関連する疾患または障害の治療を必要とする被験体に、治療有効量の請求項7記載の医薬組成物を投与する工程を含む、該被験体におけるPI3Kに関連する疾患または障害の治療方法。
- 前記PI3Kに関連する疾患または障害が、細胞増殖性障害である、請求項13記載の方法。
- 細胞増殖性障害が癌である、請求項16記載の方法。
- 癌が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病およびバーキット病からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
- HDAC媒介性疾患の治療を必要とする被験体に、請求項7記載の医薬組成物を投与する工程を含む、HDAC媒介性疾患の治療方法。
- PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療を必要とする被験体に、請求項7記載の医薬組成物を投与する工程を含む、PI3K媒介性疾患およびHDAC媒介性疾患の両方の治療方法。
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