EA022434B1 - Ингибитор фосфоинозитид-3-киназы, содержащий цинксвязывающий фрагмент - Google Patents

Abstract

Изобретение описывает соединение формулы Iфармацевтические композиции, содержащие такие соединения, и применение таких соединений при лечении заболеваний или нарушений, связанных с фосфоинозитид-3-киназой, таких как рак. Кроме того, изобретение относится к лечению нарушений, связанных с гистоновой деацетилазой, или заболеваний, связанных и с гистоновой деацетилазой и фосфоинозитид-3-киназой.

Description

Для настоящего изобретения испрашивается приоритет по предварительным заявкам США № 61/470,849, поданной 1 апреля 2011, и № 61/559,489, поданной 14 ноября 2011. Все содержание вышеуказанных заявок включаются в настоящее описание посредством ссылки.

Уровень техники

Фосфоинозитиды (ΡΙ), представляющие собой фосфорилированные производные фосфатидилинозитола, имеют большое значение в прокариотических клетках, регулируя процессы в ядре, динамику цитоскелета, прохождение сигналов и мембранный транспорт. Из числа ферментов, участвующих в ΡΙметаболизме, особое внимание привлекают Р13-киназы (ΡΙ3Κ), вследствие их онкогенных свойств и потенциального использования в качестве мишени для лекарственных средств. Р13-киназы фосфорилируют фосфатидилинозитолы или фосфоинозитиды в 3-положении инозитольного кольца (Ьшйто е! а1. 1оигиа1 οί Се11 8с1еиее 119, 605-614, 2006). 3-фосфорилированные фосфолипиды, образующиеся вследствие активности ΡΙ3Κ, связываются с плекстрин-гомологичным (РН) доменом протеинкиназы В (РКВ), вызывая транслокацию РКВ к клеточной мембране и последующее фосфорилирование РКВ. Фосфорилированная РКВ ингибирует белки, вызывающие апоптоз, такие как ΡΚΗΚ, Вай и каспазы, и, как полагают, играет важную роль в развитии рака. ΡΙ3Κ делятся на Ι-ΙΙΙ классы, причем класс I дополнительно подразделяется на классы Ια и Ι6. Полагают, что среди этих изоформ ферменты класса Ια играют самую важную роль в клеточной пролиферации в ответ на активацию тирозинкиназного пути факторами роста (Науака\\а е! а1., Вюогдашс & Мейюша1 СЬетОгу 14 6847-6858, 2006). Три часто встречающиеся при раке мутации постоянно активируют ΡΙ3Κα и, при экспрессии в клетках, они запускают онкогенную трансформацию и хроническую активацию нисходящих сигналов с помощью таких молекул, как РКВ, 86Κ и 4Е Ьр1, которые в большинстве случаев обнаруживаются в раковых клетках. (§1ерЬеи8 е! а1., Сиггеи! Θρίηίοη ίη ΡΙκιγтасо1оду, 5(4) 357-365, 2005). Следовательно, ΡI3-киназы представляют собой перспективные мишени для лечения пролиферативных заболеваний.

Существует несколько известных ингибиторов ΡI3-киназы, включая вортманнин и ЬУ294002. Хотя вортманнин является сильным ингибитором ΡΙ3Κ с низким наномолярным значением Κ'5(). он обладает низкой противоопухолевой активностью ίη νί\Ό. (Науака\\а е! а1., Вюогд. Мей. СЬет. 14(20), 6847-6858 (2006)). Не так давно сообщалось о группе морфолинзамещенных хиназолиновых, пиридопиримидиновых и тиенопиримидиновых соединений, являющихся эффективными при ингибировании ΡΙ3 киназы ρ110α. (Науаката, 6847-6858). При пероральном введении дозы морфолинзамещенного соединения тиенопиримидина (СЭС-0941) было показано подавление роста опухоли в ксенотрансплантатах глиобластомы ίη νί\Ό. (Ро1ке8 е! а1., 1оита1 оГ Мейюта1 СЬет181ту, 51, 5522-5532, 2008). Следующие публикации раскрывают ряд ингибиторов ΡI3-киназы на основе тиенопиримидина, пиридопиримидина и хиназолина: АО 2008/073785; АО 2008/070740; АО 2007/127183; патентная заявка США 20080242665.

Ацетилирование гистона представляет собой обратимую модификацию, в рамках которой диацетилирование катализируется семейством ферментов, называемых гистоновые деацетилазы (НЭАСк). НЭАС представлены у людей 18 генами и подразделяются на четыре разных класса (ί Мо1 Вю1, 2004, 338:1, 17-31). У млекопитающих НЭАС класса Ι (НЭАС1-3, и НЭАС8) родственны с НЭАС дрожжей ΚΡΌ3, класса 2 (НЭАС4-7, НЭАС9 и НЭАС10) родственны с дрожжевой НЭА1, класс 4 (НЭАС11), и класс 3 (особый класс, включающий сиртуины, имеющие отношение к δίτ2 дрожжей).

Скогйак, ВюсЬет. Е, 1990, 286: 23-38 сообщает, что гистоны подвергаются посттрансляционному ацетилированию Е-аминогрупп Ν-концевых остатков лизина, катализируемому гистоновой ацетилтрансферазой (НАТ1). Ацетилирование нейтрализует положительный заряд боковой цепи лизина и, как полагают, влияет на структуру хроматина. Действительно, доступ факторов транскрипции к хроматиновым матрицам увеличивается при гиперацетилировании гистонов, а в транскрипционно молчащих участках генома наблюдается накопление недоацетилированного гистона Н4 (Таии!ои е! а1., ^Оенсе, 1996, 272:408-411). В случае генов-супрессоров опухолей транскрипционное молчание вследствие модификации гистонов может приводить к онкогенной трансформации и раку.

Некоторые классы ингибиторов НЭАС в настоящее время проходят оценку в клинических исследованиях. Примеры включают производные гидроксамовой кислоты, сибероиланилид гидроксамовую кислоту (§АНА), ΡΧΌ101 и ЬАр824, которые в настоящее время проходят клинические испытания. Из класса бензамидных НЭАС-ингибиторов М8-275, МССЭ0103 и 0-994 достигли стадии клинических испытаний. Мойте е! а1. (АЬкйас! #4725, ААСК 2005) показали, что тиофенильная модификация бензамидов значительно увеличивает НЭАС-ингибирующую активность против НЭАС1.

Некоторые виды злокачественных новообразований эффективно лечат с помощью комбинирован- 1 022434 ного подхода; однако, режимы лечения, использующие смеси цитотоксических лекарственных средств, часто лимитируются дозами, ограничиваемыми соображениями токсичности и взаимодействия между лекарственными средствами. Более современные достижения на основе молекулярных таргетных (нацеленных) лекарственных препаратов предоставляют новые возможности для комбинированного лечения рака, давая возможность использовать одновременно несколько таргетных средств, или комбинируя такие новые способы лечения со стандартными химиотерапевтическими средствами или облучением для улучшения результата без достижения ограничивающей дозу токсичности. Однако возможность использования таких комбинаций в настоящее время ограничивается лекарственными средствами, демонстрирующими совместимые фармакологические и фармакодинамические свойства. Кроме того, нормативные испытания безопасности и эффективности комбинированных способов лечения могут быть более дорогими и длительными, чем соответствующие исследования в режиме монотерапии. Кроме того, после утверждения комбинированные подходы могут быть связаны с дополнительными затратами для пациентов, а также с ухудшенным соблюдением режима пациентами вследствие необходимости сложной системы дозирования.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к соединению формулы I

и его фармацевтически приемлемым солям, где К представляет собой водород или ацильную группу. Ацильная группа предпочтительно представляет собой К₁С(О)-, где Κι представляет собой замещенный или незамещенный С^С^-алкил, предпочтительно С^Сю-алкил и более предпочтительно С₁-С₆алкил; замещенный или незамещенный С₂-С₂4-алкенил, предпочтительно С₂-Сю-алкенил и более предпочтительно С₂-С₆-алкенил; замещенный или незамещенный С₂-С₂₄-алкинил, предпочтительно С_2-С₁₀алкинил, и более предпочтительно С₂-С₆-алкинил; замещенный или незамещенный арил, предпочтительно замещенный или незамещенный фенил; или замещенный или незамещенный гетероарил.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем.

Соединения формулы I и, в частности, соединение 1, обладают полезными свойствами с точки зрения их применения в качестве терапевтических средств, например для лечения рака и других заболеваний, а также расстройств, связанных с активностью Р13-киназы и/или активностью НИАС. Соединение 1, например, обладает сильной ингибирующей активностью по отношению к молекулярным мишеням Р13К и НИАС и сильной антипролиферативной активностью по отношению к целому ряду клеточных линий рака ίη νίΐτο. Соединение 1 имеет существенную пероральную биодоступность, как показано на животных моделях. При пероральном или внутривенном дозировании на мышах с ксенотрансплантатом опухоли это соединение показывает значительное поглощение опухолевой тканью и фармакодинамическую активность в опухолевой ткани. Соединение 1 также демонстрирует существенную противоопухолевую активность на мышиных моделях ксенотрансплантантной опухоли после перорального или внутривенного введения. Соединение также имеет благоприятный профиль безопасности, как показано, например, при проверке генотоксичности с использованием теста Эймса.

В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к применению соединения по изобретению при лечении заболеваний и нарушений, связанных с Р13К, таких как рак. Такие соединения дополнительно выступают в качестве НИАС ингибитора за счет их способности связываться с ионами цинка. Эти соединения действуют на множество терапевтических мишеней и являются эффективными при лечении целого ряда заболеваний. Кроме того, в некоторых случаях было обнаружено, что эти соединения обладают повышенной активностью по сравнению с активностью комбинаций отдельных молекул, каждая из которых отдельно обладает Р13-киназной ингибирующей активностью и НИАС-ингибирующей активностью. Другими словами, комбинация Р13-киназной ингибирующей активности и НИАСингибирующей активности в одной молекуле может обеспечить синергетический эффект по сравнению с ингибиторами Р13-киназы и НИАС, взятыми по отдельности.

Кроме того, эффективность отдельных ингибиторов Р13К-пути ограничивается появлением первичных/приобретенных генетических изменений и активации множества путей про-выживаемости и роста (Епде1тап (2009) №Циге Рс\зс\У5 Сапсег, 9: 550-562). Ингибирование Р13К с помощью отдельных ингибиторов Р13К-пути может на самом деле повышающим образом отрегулировать передачу сигнала в КАРМЕК-ЕКК-пути посредством снятия отрицательных обратных связей. Соединения по изобретению (за счет их комбинированной Р13К/НЭАС-ингибирующей активности) предоставляют возможность преодо- 2 022434 ления ограничений, имеющих место при лечении рака одноцелевыми ΡΙ3Κ ингибиторами. Соединения по изобретению вызывают разрушение регуляторных сетей рака в экспериментах ίη νίνο и ίη νίΐτο, обусловленное стойким ингибированием Р13К-АКТ-шТОК пути, ингибированием КАР-ΜΕΚ-ΕΚΚ пути и понижающей регуляцией уровней рецепторной тирозинкиназы (ΚΤΚ). В дополнение к этому, соединения по изобретению вызывают остановку клеточного цикла и апоптоз в линиях опухолевых клеток ίη νίΐτο путем повышающей регуляции опухолевых супрессоров р53 и р21. Соответственно, соединения по изобретению потенциально способны преодолевать первичную и приобретенную лекарственную резистентность и могут быть более эффективными, чем монолечение с использованием отдельных ингибиторов ΡΙ3Κ пути при использовании в медицинской практике.

Другой аспект настоящего изобретения касается способов ингибирования активности ΡΙ3 киназы путем контактирования Р13-киназы с эффективным ингибирующим количеством соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - график концентрации соединения 1 в плазме и опухолевой ткани в зависимости от времени после перорального введения бестимусным мышам с ксенотрансплантированной опухолью Н2122.

Фиг. 2А - график концентрации соединения 1 в плазме в зависимости от времени у мышей δοίά с ксенотрансплантированной опухолью Дауди после перорального введения в дозах 25, 50 и 100 мг/кг.

Фиг. 2В - график концентрации соединения 1 в опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью Дауди после перорального введения доз 25, 50 и 100 мг/кг.

Фиг. 2С - график концентрации соединения 1 в плазме и опухолевой ткани в зависимости от времени у мышей δαά с ксенотрансплантированной опухолью Дауди после перорального введения дозы 100 мг/кг.

Фиг. 3 - результаты вестерн-блоттинга экстрактов опухолевой ткани, полученной от контрольных и леченых соединением 1 (25, 50 и 100 мг/кг) мышей δαά с ксенотрансплантатом опухоли Дауди.

Фиг. 4 - график концентрации соединения 1 в плазме в зависимости от времени у собак породы бигль после перорального или внутривенного введения.

Фиг. 5А - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли Н2122, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 5В - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли Дауди, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 5С - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли ОРМ2, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 6 - график, показывающий уровни Т и В лимфоцитов в циркулирующей крови после лечения соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 7А-С - результаты вестерн-блоттинга экстрактов контрольных и обработанных соединением 1 клеток Н460 (Кга8, ΡΙ3Κ). СЭС представляет собой СЭС-0941;ЬВН-ЬВН-589.

Фиг. 8А-С - результаты вестерн-блоттинга экстрактов контрольных и обработанных соединением 1 клеток ΗΙ975 (ЕСРК, ΡΙ3Κ), ВТ474 (НЕК2, ΡΙ3Κ), Н1975 (ЕСРК, ΡΙ3Κ), А375 (В-Ка£) и ΚΡΜΙ-822 (р53').

Фиг. 9 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью Дауди, которых перорально лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 10 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью Дауди, которых лечили носителем, соединением 1, 8АН, СЭС-0941 или комбинацией 8АНА и СЭС-0941.

Фиг. 11 - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли §и-ЭНЬ4, которых перорально лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 12 - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли ОРМ2, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 13 - график роста опухоли в зависимости от времени у бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли ΜΜ18, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 14 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8СГЭ с ксенотрансплантатом опухоли ΜΜ1Κ, которых лечили соединением 1 или чистым носителем.

Фиг. 15 - результаты вестерн-блоттинга опухолевых экстрактов, полученных от мышей 8СГО, которых лечили соединением 1, с ксенотрансплантатами опухолей Дауди, 8иЭНЬ-4, Н8-§и11ап, ЭОНН-2, ΟΡΜ-2, ΜΜ1Κ или ΜΜ18.

Фиг. 16 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью Дауди, которых лечили соединением 1, САЬ-101 (Иделалисиб) или чистым носителем.

Фиг. 17 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью Дауди, которых лечили соединением 1, циклофосфамидом, комбинацией соединения 1 и циклофосфамида или чистым носителем.

Фиг. 18 - график роста опухоли в зависимости от времени у мышей 8сМ с ксенотрансплантированной опухолью ΜΜ18, которых лечили соединением 1, леналидомидом, комбинацией соединения 1 и леналидомида или чистым носителем.

- 3 022434

Подробное описание изобретения

В предпочтительном варианте осуществления соединение формулы I представлено формулой ниже:

(в дальнейшем называемой соединение 1, также называемом Ы-гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2-й]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамид) или его фармацевтически приемлемой солью.

Изобретение дополнительно описывает способы предотвращения или лечения заболеваний или нарушений, связанных с нарушенной пролиферацией, дифференцировкой или выживаемостью клеток. В одном варианте осуществления изобретение дополнительно раскрывает одно или более соединений по изобретению для применения в производстве медикамента, предназначенного для остановки или ослабления заболеваний, связанных с нарушенной пролиферацией, дифференцировкой или выживаемостью клеток. В предпочтительном варианте осуществления заболевание является злокачественным заболеванием. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения по изобретению.

Термин рак относится к любому раку, вызванному пролиферацией злокачественных неопластических клеток, такому как злокачественные опухоли, новообразования, карциномы, саркомы, лейкемия, лимфома и т.п. Например, раки включают, но не ограничиваются этим, мезотелиому, лейкемию и лимфому, такую как кожная Т-клеточная лимфома (СТСЬ), некожная периферическая Т-клеточная лимфома, лимфома, связанная с Т-клеточным лимфотропным вирусом человека (НТЬУ), такая как Т-клеточная лейкемия/лимфома взрослых (ЛТЬТ), В-клеточная лимфома, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, лимфома и множественная миелома, неходжкинская лимфома, острый лимфолейкоз (АЬЬ), хронический лимфолейкоз (СЬЬ), лимфома Ходжкина, лимфома Беркитта, Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых, острый миелолейкоз (АМЛ), хронический миелоидный лейкоз (СМЛ) или гепатоцеллюлярной карцинома. Дополнительные примеры включают миелодиспластический синдром, солидные опухоли детей, такие как опухоли мозга, нейробластома, ретинобластома, опухоль Вильямса, опухоли костей, саркому мягких тканей, общие солидные опухоли взрослых, такие как раки головы и шеи (например, раки рта, гортани, носоглотки и пищевода), урогенитальные раки (например, простаты, мочевого пузыря, почки, матки, яичника, яичка), рак легкого (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак), рак молочной железы, рак поджелудочной железы, меланома и другие раки кожи, рак желудка, рак мозга, опухоли, связанные с синдромом Горлина (например, медуллобластома, менингиома и т.д.) и рак печени. Дополнительные иллюстративные формы рака, которые можно лечить описываемыми соединениями, включают, но не ограничиваются этим, рак скелетной или гладкой мускулатуры, рак желудка, рак тонкого кишечника, карциному прямой кишки, рак слюнной железы, рак эндометрия, рак надпочечника, рак анального канала, рак прямой кишки, рак околощитовидной железы и рак гипофиза.

Описанные здесь соединения могут использоваться при предотвращении, лечении и изучении и других видов рака, например рака толстой кишки, семейного аденоматозного полипоза и наследственного неполипозного рака толстой кишки или меланомы. Кроме того, злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются этим, карциному губы, карциному гортани, карциному глотки, карциному языка, карциному слюнной железы, рак желудка, аденокарциному, рак щитовидной железы (медуллярную и папиллярную карциному щитовидной железы), карциному почки, карциному паренхимы почки, рак шейки матки, карциному матки, карциному эндометрия, хорион-карциому, карциному яичка, карциному мочевого пузыря, меланому, опухоли мозга, такие как глиобластома, астроцитома, менингиома, медуллобластома и периферические нейроэктодермальные опухоли, карциному желчного пузыря, бронхиальную карциному, множественную миелому, базалиому, тератому, ретинобластому, меланому сосудистой оболочки глаза, семиному, рабдомиосаркому, краниофарингеому, остеосаркому, хондросаркому, миосаркому, липосаркому, фибросаркому, саркому Юинга и плазмоцитому. В одном аспекте настоящее изобретение описывает использование одного или более соединений по изобретению в производстве медикамента для лечения рака.

В одном варианте осуществления соединения по изобретению используются для лечения гематологических злокачественных опухолей или гематологического предракового состояния. Гематологические раки включают лейкоз, лимфому и множественную миелому. Примеры включают лимфоцитарный лейкоз, такой как острый лимфоцитарный лейкоз, включая острый лимфобластный лейкоз предшественников В-клеток, острый лимфобластный лейкоз предшественников Т-клеток, лейкоз Беркитта и острый бифенотипический лейкоз; и хронический лимфоцитарный лейкоз, включая В-клеточный пролимфоци- 4 022434 тарный лейкоз; и миелогенный лейкоз, такой как острый миелогенный лейкоз, включая острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз и острый мегакариобластный лейкоз; и хронический миелогенный лейкоз, включая хронический моноцитарный лейкоз; острый моноцитарный лейкоз. Другие лейкозы включают волосатоклеточный лейкоз; Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз; и Т-клеточный лейкоз взрослых. Лимфомы включают лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, включая В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, такую как кожная Т-клеточная лимфома, и ΝΚ-клеточную лимфому. Гематологические предраковые состояния включают миелодиспластический синдром и миелопролиферативные нарушения, такие как первичный миелофиброз, истинная полицитемия и эссенциальная тромбоцитемия.

Показано, что соединения по изобретению вызывают обратимую лимфопению и поэтому являются полезными для устранения или уменьшения уровня циркулирующих в крови раковых клеток лимфоцитарного происхождения. Такие соединения также находят применение для лечения аутоиммунных нарушений или для модулирования иммунного ответа.

В одном варианте осуществления изобретение раскрывает способ уменьшения числа циркулирующих лимфоцитов у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления уменьшенное число циркулирующих лимфоцитов является обратимым, то есть число циркулирующих лимфоцитов возвращается к нормальному уровню после того, как прекращается введение доз соединения по изобретению. В одном варианте осуществления уменьшенное число циркулирующих лимфоцитов оказывает ниже нормального уровня, и при этом субъект является субъектом с лимфопенией. Предпочтительно субъект получает терапевтическую или профилактическую пользу от уменьшенного числа циркулирующих лимфоцитов. Такие субъекты включают субъектов, страдающих от гематологического заболевания, такого как гематологический рак, субъектов, страдающих от аутоиммунного расстройства, и субъектов, нуждающихся в модулировании иммунного ответа, таких как пациенты, страдающие от диабета, или реципиенты трансплантированных органов. У человека число циркулирующих лимфоцитов, например, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов или и тех и других может снижаться от нормального уровня до уровней, характерных для лимфопении. При некоторых заболеваниях число циркулирующих лимфоцитов является аномально высоким. При таких заболеваниях число циркулирующих лимфоцитов может быть уменьшено до нормального предела или до состояния лимфопении.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение включает применение одного или более соединений по изобретению в производстве медикамента, который предотвращает дальнейшую неправильную пролиферацию, дифференцировку или выживаемость клеток. Например, соединения по изобретению могут быть пригодны при предотвращении увеличения размера опухолей или достижения стадии метастазирования. Соединения по изобретению могут вводиться с целью прекращения развития и распространения рака или с целью вызвать апоптоз опухоли или ингибировать ангиогенез опухоли. В дополнение к этому настоящее изобретение включает использование описываемых соединений для предотвращения рецидива рака.

Данное изобретение дополнительно включает лечение или предотвращение заболеваний, связанных с нарушениями клеточной пролиферации, таких как гиперплазия, дисплазия и предраковые изменения. Дисплазия является ранней формой предракового изменения, которое распознается патологом при биопсии. Описываемые соединения могут быть введены с целью предотвращения продолжающегося развития или озлокачествления указанной гиперплазии, дисплазии или предраковых изменений. Примеры предраковых изменений могут наблюдаться на коже, в ткани пищевода, молочной железы и в эпителиальной ткани внутри цервикального канала шейки матки.

Комбинированная терапия включает введение описываемого соединения в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами (такими как, но не ограничиваясь этим, второе и иное антинеопластическое средство) и безмедикаментозными видами терапии (такими как, но не ограничиваясь этим, хирургическое лечение или облучение). Например, соединения по изобретению могут использоваться в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями, предпочтительно соединениями, способными увеличивать эффект соединения по изобретению. Соединения по изобретению могут вводиться одновременно (в виде единого препарата или отдельных препаратов) или последовательно с другим видом лекарственной терапии. В общем, комбинированная терапия предполагает введение двух или более лекарственных средств в одном цикле или курсе лечения.

В одном аспекте изобретения описываемые соединения могут вводиться в комбинации с одним или более отдельными средствами, которые модулируют протеинкиназы, участвующие в различных болезненных состояниях. Примеры таких киназ могут включать, но не ограничиваются этим: серин/треонин специфические киназы, рецепторные тирозин-специфические киназы и нерецепторные тирозинспецифические киназы. Серин/треониновые киназы включают митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК), мейоз-специфические киназы (ΜΕΚ), КАР и аигога-киназа. Примеры семейств рецепторных киназ включают рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРК) (например, НЕК2/пеи, НЕК3, НЕК4, ЕгЬВ, ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ, ЕгЬВ4, Хтгк, ОЕК, Ье!23); рецептор фактора роста фибробластов (РСР) (например, РСР-К1,СРР-К2/ВЕК/СЕК3, РСР-К3/СЕК2, РСР-К4/ТКР, КСР-К); рецептор фактора роста гепатоци- 5 022434 тов/рассеивающего фактора (НСРК) (например, МЕТ, ΚΌΝ, 8ЕА, 8ЕХ); инсулиновый рецептор (например, 1СР1-К); Ерй (например, СЕК5, СЕК8, ЕВК, ЕСК, ЕЕК, ЕНК-1, ЕНК-2, ЕЬК, ЕРН, ЕКК, НЕК, ΜΌΚ2, МЭК5, 8ЕК); Ах1 (например, Мсг/Жк. Кке); КЕТ; и рецептор фактора роста тромбоцитов (РЭСРК) (например, ΡΌΟΡα-Κ, ΡΌΟβ-Κ, С8Р1-К/РМ8, 8СР-К/С-К1Т, УЕСР-К/РЬТ, №КРЬК1, РЕТ3/РЕК2/8ТК-1). Семейства нерецепторных тирозинкиназ включают, но не ограничиваются этим, ВСК-АВЬ (например, р43^аЫ, АКС); ВТК (например, 1ТК/ЕМТ, ТЕС); С8К, РАК, РР8, 1АК, 8КС, ВМХ, РЕК, СОК и 8УК.

В другом аспекте изобретения описываемые соединения могут вводиться в комбинации с одним или более отдельными средствами, которые модулируют некиназные биологические мишени или процессы. Такие мишени включают гистоновые деацетилазы (НЭАС), ДНК метилтрансферазу (^NΜТ), белки теплового шока (например, Н8Р90), белки, связанные с сигнальным путем йебдейод (например, 8ОИ1С йебдейод (белок, названный ежик Сони), белок ра!сйеб, белок ктооШеиеб) и протеосомы.

В предпочтительном варианте осуществления описываемые соединения могут быть скомбинированы с антинеопластическими средствами (например, небольшими молекулами, моноклональными антителами, антисмысловой РНК и гибридными белками), ингибирующими одну или более биологических мишеней, такими как золинза, тарцева, пресса, тайверб, гливек, сутент, спрайцел, нексавар, сорафиниб, ΟΝΡ2024, КС108, ВМ8387032, аффинитак, авастин, герцептин, эрбитукс, АС24322, ΡΌ325901, ΖΌ6474, ΡΌ184322, ОЬаЮбах, АВТ737, СПС-0449, ΙΡΙ-926, ВМ8833923, ЬПЕ225, РР-04449913 и АЕЕ788. Подобные комбинации могут увеличивать терапевтическую эффективность по сравнению с эффективностью, достигаемой с помощью любого из этих средств в отдельности, и могут предотвращать или задерживать появление резистентных мутационных вариантов.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления соединения по изобретению вводятся в комбинации с химиотерапевтическим средством. Химиотерапевтические средства включают большое число терапевтических воздействий в области онкологии. Эти средства вводятся на различных стадиях заболевания с целью уменьшения опухолей, разрушения раковых клеток, оставшихся после хирургического вмешательства, вызова ремиссии, поддержания ремиссии и/или облегчения симптомов, связанных с раковым заболеванием или его лечением. Примеры таких средств включают, но не ограничиваются этим, алкилирующие средства, такие как производные горчичного газа (азотистый иприт, циклофосфамид, хлорамбуцил, мелфалан, ифосфамид), этиленимины (тиотепа, гексаметилмеланин), алкилсульфонаты (бусульфан), гидразины и триазины (алтретамин, прокарбазин, дакарбазин и темозоломид), нитрозомочевины (кармустин, ломустин и стрептозоцин), ифосфамид и соли металлов (карбоплатин, цисплатин, и оксалиплатин); растительные алкалоиды, такие как подофиллотоксины (этопозид и тенизопид), таксаны (паклитаксель и доцетаксель), винкаалкалоиды (винкристин, винбластин, виндезин и винорельбин), и аналоги камптотекана (иринотекан и топотекан); противоопухолевые антибиотики, такие как хромомицины (дактиномицин и пликамицин), антрациклины (доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин, митоксантрон, валрубицин и идарубицин), и прочие антибиотики, такие как митомицин, актиномицин и блеомицин; антиметаболиты, такие как антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат, пеметрексед, ралтитрексед, аминоптерин), антагонисты пиримидина (5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, капецитабин и гемцитабин), антагонисты пурина (6-меркаптопурин и 6-тиогуанин) и ингибиторы аденозиндезаминазы (кладрибин, флударабин, меркаптопурин, клофарабин, тиогуанин, неларабин и пентостатин); ингибиторы топоизомеразы, такие как ингибиторы топоизомеразы Ι (иронотекан, топотекан) и ингибиторы топоизомеразы ΙΙ (амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид); моноклональные антитела (алемтузумаб, гемтузумаб, озогамицин, ритуксимаб, трастузумаб, ибритумомаб, тиоксетан, цетуксимаб, панитумумаб, тозитумомаб, бевацизумаб); и прочие антинеопластические средства, такие как ингибиторы рибонуклеотидредуктазы (гидроксимочевина); адренокортикальный стероидный ингибитор (митотан); ферменты (аспарагиназа и пегаспаргаза); противомикротрубочковые средства (эстрамустин); ретиноиды (бексаротен, изотретионин, третионин (АТКА) и леналидомид.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления соединения по изобретению вводятся в комбинации с хемопротективным средством. Хемопротективные средства предохраняют организм или сводят к минимуму побочные действия химиотерапии. Примеры таких средств включают, но не ограничиваются этим, амфостин, месну и дексразоксан.

В одном аспекте изобретения описываемые соединения вводятся в комбинации с лучевой терапией. В большинстве случаев облучение доставляется с внутренней стороны (имплантация радиоактивного материала около местоположения злокачественной опухоли) или снаружи с помощью устройства, использующего фотоны (рентгеновские лучи или гамма-лучи) или корпускулярное излучение. В случае, когда комбинированная терапия дополнительно включает лучевую терапию, лучевая терапия может быть проведена в любое подходящее время, при условии, что достигается полезный эффект от совместного действия комбинации терапевтических средств и лучевой терапии. Например, в соответствующих случаях полезный эффект по-прежнему достигается, когда лучевая терапия отодвигается во времени от введения терапевтических средств, возможно на дни или даже недели.

Следует понимать, что соединения по изобретению могут использоваться в комбинации с иммунотерапевтическим средством. Одной формой иммунотерапии является возбуждение активного системного

- 6 022434 опухоль-специфического иммунного ответа хозяина путем введения вакцинной композиции в удаленное от опухоли место.

Предлагаются различные типы вакцин, включая опухоль-антигенные вакцины и антиидиотипические вакцины. Другим подходом является использование опухолевых клеток, полученных от субъекта, которого необходимо лечить, или потомков таких клеток (смотри 8сЫтгтасЬет е! а1, (1995) 1. Сапсег Кек. С1ш. Опсо1. 12 1:487). В патенте США № 5,484,596, Наппа 1т., е! а1. заявлен способ лечения операбельной карциномы, предназначенный для предотвращения рецидива или метастазирования, включающий хирургическое удаление опухоли, диспергирование клеток с помощью коллагеназы, облучение клеток и вакцинирование пациента по меньшей мере тремя последовательными дозами около 10⁷ клеток.

Следует понимать, что соединения по изобретению могут успешно использоваться в сочетании с одним или более дополнительными терапевтическими средствами. Примеры подходящих средств для дополнительного лечения включают агонисты 5НТ], такие как триптан (например, суматриптан или наратриптан); агонист аденозина А1; ЕР лиганд; модулятор ΝΜΌΑ, такой как антагонист глицина; блокатор натриевых каналов (например, ламотригин; антагонист субстанции Р (например, ΝΚ₁ антагонист); каннабиоид; ацетаминофен или фенацетин; ингибитор 5-липоксигеназы; антагонист лейкотриеновых рецепторов; ΌΜΑΚΌ (например, метотрексат); габапентин и родственные соединения; трициклический антидепрессант (например, амитриптиллин); стабилизирующее нейрон антиэпилептическое лекарственное средство; ингибитор моноаминергического поглощения (например, венлафаксин); ингибитор матриксных металлопротеиназ; ингибитор синтазы оксида азота (N08), такой как ίΝΟδ, или ингибитор ηΝΟδ; ингибитор высвобождения или действия фактора некроза опухоли альфа; терапию антителами, такую как терапия моноклональными антителами; противовирусное средство, такое как нуклеозидный ингибитор (например, ламивудин), или модулятор иммунной системы (например, интерферон); опиоидный аналгетик; анестезирующее средство местного действия; стимулятор, включая кофеин; Н₂антагонист (например, ранитидин); ингибитор протонного насоса (например, омепразол); антацид (например, гидроксид алюминия или магния); средство, устраняющее метеоризм (например, симетикон); противоотёчное средство (например, фенилэфрин, фенилпропаноламин, псевдоэфедрин, оксиметазолин, эпинефрин, нафазолин, ксилометазолин, пропилгекседрин или леводезоксиэфедрин); противокашлевое средство (например, кодеин, гидрокодон, кармифен, карбетапентан или декстрометорфан); мочегонное средство; или седативные или неседативные антигистаминные средства.

Соединения по изобретению также могут использоваться при лечении нарушения, касающегося, имеющего отношение к или ассоциируемого с дисрегуляцией гистоновой деацетилазы (НЭАС). Известно, что существует целый ряд нарушений, связанных с или опосредованных, по меньшей мере частично, активностью НЭАС. когда активность НЭАС играет роль в инициировании начала заболевания, или заболевания, симптомы которого, как известно или как показано, ослабляются НОАС-ингибиторами. Нарушения этого типа, которые, как ожидается, должны поддаваться лечению соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваются этим: антипролиферативные нарушения (например, рак); нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Хантингтона, полиглутаминовое заболевание, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, эпилептические припадки, стрионигральную дегенерацию, прогрессирующий надъядерный паралич, торсионную дистонию, спастическую кривошею и дискинезии, семейный тремор, синдром Жилль де ла Туретта, болезнь диффузных телец Леви, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, внутримозговое кровоизлияние, первичный латеральный склероз, спинальную мышечную атрофию, боковой амиотрофический склероз, гипертрофическую интерстициальную полиневропатию, пигментную дегенерацию сетчатки, наследственную атрофию зрительного нерва, наследственную параплегию, прогрессирующую атаксию и синдром Шая-Дрейджера; метаболические заболевания, включая диабет 2 типа; дегенеративные болезни глаз, включая глаукому, возрастную макулярную дистрофию, глаукому КиЪеойс; воспалительные заболевания и/или нарушения иммунной системы, включая ревматоидный артрит (КА), остеоартрит, ювенильный хронический артрит, болезнь трансплантат против хозяина, псориаз, астму, спондилоартропатию, болезнь Крона, воспалительную болезнь кишечника, язвенный колит, алкогольный гепатит, диабет, синдром Шегрена, рассеянный склероз, анкилозирующий спондилоартрит, мембранозную гломерулопатию, дискогенную боль, системную красную волчанку; заболевания, затрагивающие ангиогенез, включая рак, псориаз, ревматоидный артрит; психологические нарушения, включая биполярное расстройство, шизофрению, манию, депрессию и деменцию; сердечнососудистые заболевания, включая предотвращение и лечение связанного с ишемией или реперфузией повреждения сосудистой и миокардиальной ткани, сердечную недостаточность, рестеноз и артериосклероз; фиброзные заболевания, включая фиброз печени, кистозный фиброз и ангиофиброму; инфекционные заболевания, включая грибковые инфекции, такие как кандидоз или СапбМа А1Ъ1сапк, бактериальные инфекции, вирусные инфекции, такие как простой герпес, полиовирус, риновирус и коксакивирус, протозойные инфекции, такие как малярия, инфекция ЬехкЬташа, инфекция Ттураиокота Ъгисек токсоплазмоз и кокцидиоз, и гематопоэтические нарушения, включая талассемию, анемию и серповидноклеточную анемию.

Соединения по изобретению также могут использоваться при лечении нарушения, касающегося, имеющего отношение к или ассоциируемого с дисрегуляцией ΡΙ3 киназы. Показано, что ΡΙ3 киназная

- 7 022434 активность непосредственно связана или вовлечена в целый ряд нарушений. Известно, что в некоторых случаях ΡΣ3 киназная активность участвует в инициировании заболевания, тогда как в других показано, что симптомы ослабляются при использовании ингибиторов активности ΡΙ3 киназы. Нарушения такого типа, которые, как предполагают, будут поддаваться лечению соединениями по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, рак, включая лейкоз, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак почки, рак желудка и рак мозга; рестеноз, атеросклероз, поражение костей, артрит, диабетическую ретинопатию, псориаз, доброкачественную гипертрофию предстательной железы, атеросклероз, воспаление, ангиогенез, иммунологические нарушения, панкреатит и болезнь почек.

В одном варианте осуществления соединения по изобретению могут использоваться для того, чтобы вызвать или ингибировать апоптоз, процесс физиологической смерти клетки, являющийся решающим для нормального развития и гомеостаза. Изменения апоптотических сигнальных путей способствуют развитию ряда заболеваний человека. Соединения по изобретению в качестве модуляторов апоптоза будут полезны при лечении целого ряда заболеваний человека с нарушениями апоптоза, включая рак (в частности, но не ограничиваясь этим, фолликулярную лимфому, карциному с мутациями р53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичника, и предраковые повреждения, такие как семейный адематозный полипоз), вирусные инфекции (включая, но не ограничиваясь этим, вирус герпеса, поксвирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус Синдбис и аденовирус), аутоиммунные заболевания (включая, но не ограничиваясь этим, системную красную волчанку, эритематоз, иммуноопосредованный гломерулонефрит, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительные заболевания кишечника и аутоиммунный сахарный диабет), нейродегенеративные заболевания (включая, но не ограничиваясь этим, болезнь Альцгеймера, деменцию, ассоциированную с синдромом приобретенного иммунодефицита (ΛΙΌδ), болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз, пигментный ретинит, спинальную мышечную дистрофию и мозжечковую дегенерацию), ΛΙΌδ, миелодиспластический синдром, апластическую анемию, ишемическое повреждение, связанное с инфарктом миокарда, инсульт и реперфузионное повреждение, аритмию, атеросклероз, заболевания печени, вызванные токсинами или алкоголем, гематологические заболевания, (включая, но не ограничиваясь этим, хроническую анемию и апластическую анемию), дегенеративные заболевания скелетно-мышечной системы (включая, но не ограничиваясь этим, остеопороз и артрит), чувствительные к аспирину риносинуситы, кистозный фиброз (муковисцидоз), рассеянный склероз, заболевания почек и боль, связанную с раковым заболеванием.

В одном аспекте изобретение описывает применение соединений по изобретению для лечения и/или предотвращения иммунного ответа или иммуно-опосредованных ответов и заболеваний, такого как предотвращение или лечение отторжения после трансплантации синтетических или органических трансплантированных материалов, клеток, органов или ткани для возмещения всей или части функции тканей, таких как сердце, почка, печень, костный мозг, кожа, роговица, сосуды, легкие, поджелудочная железа, кишечник, конечности, мышцы, нервная ткань, двенадцатиперстная кишка, тонкая кишка, клетки островка Лангерганса, включая ксенотранплантанты, и т.д.; для лечения или предотвращения болезни трансплантат против хозяина, аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, рассеянный склероз, миастения гравис (тяжелая миастения), диабет Ι типа, увеит, сахарный диабет в юношеском возрасте или недавно возникший сахарный диабет, базедова болезнь, псориаз, атопический дерматит, болезнь Крона, язвенный колит, васкулит, заболевания, опосредованные аутоантителами, апластическая анемия, синдром Эванса, аутоиммунная гемолитическая анемия, и тому подобного; и дополнительно для лечения инфекционных заболеваний, вызывающих неправильный иммунный ответ и/или активацию, таких как иммунная дисрегуляция, вызванная травмой или патогеном, включая, например, вызванную заражением вирусом гепатита В и С, вирусом иммунодефицита человека Ηΐν, инфекцию золотистым стафилококком, вирусный энцефалит, сепсис, паразитарные заболевания, при которых повреждение вызывается воспалительным ответом (например, проказа); и для предотвращения или лечения заболеваний системы кровообращения, таких как артериосклероз, атеросклероз, васкулит, нодозный полиартериит и миокардит. Кроме того, настоящее изобретение может использоваться для предотвращения/подавления иммунного ответа, связанного с генотерапией, например, введением чужеродных генов в аутологичные клетки и экспрессией закодированного продукта. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с иммунным ответом, или иммуно-опосредованного ответа или нарушения у субъекта, нуждающегося в лечении, при этом способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения по изобретению.

В одном аспекте изобретение описывает применение соединений по изобретению при лечении целого ряда нейродегенеративных заболеваний, неполный список которых включает:

I. Расстройства, отличающиеся прогрессирующей деменцией при отсутствии других выраженных неврологических симптомов, такие как болезнь Альцгеймера; старческое слабоумие; и болезнь Пика (ограниченная предстарческая атрофия).

II. Синдромы, объединяющие прогрессирующее слабоумие с другими выраженными неврологическими расстройствами, такие как: А) синдромы, появляющиеся в основном у взрослых (например, бо- 8 022434 лезнь Хантингтона, множественная системная атрофия, сочетающаяся с деменцией и атаксией и/или проявлениями болезни Паркинсона, прогрессирующий надьядерный паралич (болезнь СтилаРичардсона-Ольшевского), болезнь диффузных телец Леви и кортикодентатонигральная дегенерация; и В) синдромы, проявляющиеся в основном у детей или молодежи (например, болезнь ГалленворденаШпатца и прогрессирующая семейная миоклоническая эпилепсия).

III. Синдромы постепенно развивающихся нарушений положения и движения, такие как дрожательный паралич (болезнь Паркинсона), стриатонигральная дегенерация, прогрессирующий надъядерный паралич, торсионная дистония (торсионный спазм; деформирующая мышечная дистония), спастическая кривошея и другие дискинезии, семейный тремор и синдром Жилль де ла Туретта.

IV. Синдромы прогрессирующей атаксии, такие как мозжечковая дегенерация (например, мозжечковая кортикальная дегенерация и оливомостомозжечковая атрофия (ОРСА)) и спиноцеребеллярная дегенерация (атаксия Фридрейха и родственные нарушения).

V. Синдром расстройства центральной вегетативной нервной системы (синдром Шая-Джейджера).

VI. Синдром мышечной слабости и истощения без сенсорных изменений (болезнь двигательного нейрона, такая как боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия (например, детская спинальная мышечная атрофия (Верднига-Гофмана), юношеская спинальная мышечная атрофия (Вольфарта-Кугельберга-Веландера) и другие формы семейной спинальной мышечной атрофии), первичный латеральный склероз и наследственная параплегия.

VII. Синдромы, объединяющие мышечную слабость и истощение с сенсорными изменениями (прогрессирующая невральная мышечная атрофия; хронические семейные полиневропатии) такие как мышечная атрофия перонеального типа (болезнь Шарко-Мари-Тута), гипертрофическая интерстициальная полинейропатия (Дежерин-Сотта), и смешанные формы хронической прогрессирующей невропатии.

VIII. Синдромы прогрессирующей потери зрения, такие как пигментная дегенерация сетчатки (пигментная дистрофия сетчатки) и наследственная атрофия зрительного нерва (болезнь Лебера). Кроме того, соединения по изобретению могут вовлекаться в реконструкцию хроматина. Настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемые соли описанных выше соединений по изобретению. Изобретение также охватывает сольваты соединений по изобретению и фармацевтические композиции, содержащие такие сольваты, например гидраты, метанолаты или этанолаты. Термин сольват относится к твердой, предпочтительно кристаллической, форме соединения, в кристаллической структуре которой присутствуют молекулы растворителя. Сольватные соединения, содержащие конкретный растворитель, как правило, получают путем кристаллизации соединения из этого растворителя. Сольваты могут содержать ряд растворителей, включая воду, метанол и этанол. Термин гидрат относится к сольвату, в котором растворителем является вода, и включает, но не ограничивается этим, полугидрат, моногидрат, дигидрат, тригидрат и тому подобное. Кроме того, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие какую-либо твердую или жидкую физическую форму соединения по изобретению, включая кристаллические и кристаллосольватные формы. Например, соединения могут иметь кристаллическую форму, аморфную форму, и иметь любой размер частиц. Частицы могут быть микронизированными (тонкоизмельченными) или могут быть агломерированными, содержащими частицы, гранулами, порошками, маслами, масляными суспензиями или любыми другими формами, имеющими жидкую или твердую физическую форму.

Соединения по изобретению, их производные, фрагменты, аналоги, гомологи, фармацевтически приемлемые соли или сольваты могут быть включены в состав фармацевтических композиций, подходящих для введения, в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами. Такие композиции, как правило, содержат терапевтически эффективное количество какого-либо вышеуказанного соединения и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно, при лечении рака эффективное количество является количеством, эффективным для того, чтобы селективно вызывать терминальную дифференцировку соответствующих неопластических клеток, и меньшим, чем количество, вызывающее токсичность у пациента.

Соединения по изобретению могут быть введены любыми подходящими способами, включая, без ограничения, парентеральное, внутривенное, внутримышечное, подкожное введение, имплантацию, пероральное, подъязычное, буккальное, назальное, трансдермальное, местное, вагинальное, ректальное и чресслизистое введение или тому подобное. Местное введение также относится к использованию чрескожного введения, такого как трансдермальные пластыри или ионтофоретические устройства. Фармацевтические препараты включают твердые, полутвердые или жидкие препараты (таблетки, пилюли, пастилки, капсулы, суппозитории, кремы, мази, аэрозоли, порошки, жидкости, эмульсии, суспензии, сиропы, препараты для инъекций и т.д.), содержащие соединение по изобретению в качестве активного ингредиента и являющиеся пригодными для выбранного способа введения. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции вводятся перорально, и следовательно заключаются в состав, подходящий для перорального введения, т.е. в виде твердого или жидкого препарата. Подходящие твердые пероральные композиции включают таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, шарики, порошки для приготовления раствора и шипучие таблетки, порошки и тому подобное. Подходящие жидкие пероральные композиции включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобное. В одном ва- 9 022434 рианте осуществления настоящего изобретения композиция заключается в состав капсулы. В соответствии с этим вариантом осуществления композиции настоящего изобретения содержат в дополнение к активному соединению и инертному носителю или разбавителю твердую желатиновую капсулу.

Любой инертный эксципиент, обычно используемый в качестве носителя или разбавителя, может использоваться в композициях настоящего изобретения, такой как, например, камедь, крахмал, сахар, целлюлозный материал, акрилат или их смеси. Предпочтительным разбавителем является микрокристаллическая целлюлоза. Композиции могут дополнительно содержать дезинтегрирующее средство (например, кроскармелозу натрия) и смазывающее вещество (например, стеарат магния), и могут дополнительно содержать одно или более вспомогательных веществ, выбранных из связывающего вещества, буфера, ингибитора протеазы, поверхностно-активного вещества, солюбилизирующего средства, смягчителя, эмульгатора, стабилизирующего средства, средства, увеличивающего вязкость, подсластителя, пленкообразующего вещества или любой их комбинации. Кроме того, композиции настоящего изобретения могут иметь форму композиций с контролируемым высвобождением или композиций с немедленным высвобождением.

В случае жидких композиций, фармацевтически приемлемые носители могут быть водными или неводными растворами, суспензиями, эмульсиями или маслами. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. Примерами масел являются нефтяные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, оливковое масло, подсолнечное масло и жир из печени рыб. Растворы или суспензии также могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΛ); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение рН можно отрегулировать с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия.

Кроме того, композиции могут дополнительно содержать связывающие вещества (например, аравийскую камедь, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этилцеллюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, повидон), дезинтегрирующие средства (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, диоксид кремния, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гуаровую камедь, натрия крахмалгликолат, примогель), буферы (например, трисНС1, ацетат, фосфат) различных значений рН и ионной силы, вспомогательные вещества, такие как альбумин или желатин для предотвращения абсорбции на поверхности, детергенты (например, твин 20, твин 80, плюроник Р68, соли желчных кислот), ингибиторы протеазы, поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия), вещества, увеличивающие проникновение, солюбилизирующие средства (например, глицерин, полиэтиленглицерин, полиэтиленгликоль), глидант (вещество, способствующее скольжению) (например, коллоидный диоксид кремния), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия, бутилированный гидроксианизол), стабилизирующие вещества (например, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза), средства увеличивающие вязкость (например, карбомер, коллоидный диоксид кремния, этилцеллюлозу, гуаровую камедь), подсластители (например, сахарозу, аспартам, лимонную кислоту), вкусовые вещества (например, мяту перечную, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор), консервирующие вещества (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), смазывающие вещества (например, стеариновая кислота, стеарат магния, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия), вещества, повышающие текучесть (например, коллоидный диоксид кремния), смягчители (например, диэтилфталат, триэтилцитрат), эмульгаторы (например, карбомер, гидроксипропилцеллюлоза, лаурилсульфат натрия), полимерные покрытия (например, полоксамеры или полоксамины), средства, образующие покрытия и пленки (например, этилцеллюлоза, акрилаты, полиметакрилаты) и/или вспомогательные лекарственные средства (адьюванты).

В одном варианте осуществления активные соединения заключаются в композицию вместе с носителями, которые предохраняют от быстрого выведения соединения из организма, например, в состав композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантанты и системы микроинкапсулированной доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких композиций понятны специалистам в данной области техники. Материалы также можно получить коммерческим путем от компаний Αίζα Согрогайоп и Νονα РЬагшасеиОсаК 1пс. В качестве фармацевтически приемлемых носителей также могут использоваться липосомальные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки с помощью моноклональных антител к вирусным антигенам). Эти суспензии можно получить в соответствии с методами, известными специалистам в данной области техники, например, как описано в патенте США № 4522811.

Особенно выгодно создавать композиции для перорального приема в стандартной лекарственной

- 10 022434 форме для удобства введения и равномерности дозирования. Использованный в описании термин стандартная лекарственная форма относится к физически отдельным единицам, подходящим в качестве однократных дозировок для субъекта, которого необходимо лечить; каждая единица при этом содержит заранее определенное количество активного соединения, подсчитанное с целью получения желательного терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Требования к стандартным лекарственным формам изобретения обуславливаются и непосредственно зависят от характерных особенностей активного соединения и определенного терапевтического эффекта, которого нужно достичь, и ограничений, характерных в данной области техники для приготовления лекарственного средства, например, активного соединения для лечения индивидуумов.

Композиции по изобретению, предназначенные для перорального введения, могут включать одно или более веществ, увеличивающих проникновение, включая жирные кислоты с длинной цепью или их соли, такие как декановая кислота и деканоат натрия.

В одном предпочтительном варианте осуществления соединение может иметь форму водного раствора для внутривенной инъекции. В одном варианте осуществления могут использоваться солюбилизирующие средства. Особенно предпочтительные солюбилизирующие средства включают циклодекстрины и модифицированные циклодекстрины, такие как замещенное производное β-циклодекстрина сульфоновой кислоты или соль, включая сульфобутиловое производное β-циклодекстрина, такое как сульфобутилэфир-7-в-циклодекстрин, который продается компанией СуЭех, 1пс. под торговой маркой СЛРТТЗОЬ®.

Фармацевтические композиции могут быть заключены в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями для введения.

Ежедневное введение может продолжаться непрерывно в течение периода времени от нескольких дней до нескольких лет. Пероральное лечение может продолжаться в промежутке от одной недели и до конца жизни пациента. Предпочтительно введение происходит в течение пяти последовательных дней, после этого времени проводится оценка необходимости дальнейшего введения пациенту. Введение может быть непрерывным или прерывистым, например, лечение в течение ряда последовательных дней с последующим периодом отдыха. Соединения настоящего изобретения могут быть введены внутривенно в первый день лечения, пероральным путем во второй день лечения и потом в течение всех последующих дней.

Приготовление фармацевтической композиции, содержащей активный компонент, например, путем смешивания, гранулирования или формования таблеток, хорошо изучено в данной области техники. Активный терапевтический ингредиент часто смешивают с фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом эксципиентами. Для перорального введения активные вещества смешивают с добавками, общеупотребительными для этой цели, такими как разбавители, стабилизирующие вещества или инертные разбавители, и с помощью общепринятых методов придают им подходящие для введения формы, такие как таблетки с покрытием, твердые и мягкие желатиновые капсулы, водные, спиртовые и масляные растворы и тому подобное, как подробно описано выше.

Количество соединения, вводимое пациенту, меньше количества, которое может вызвать токсичность у пациента. В некоторых вариантах осуществления количество соединения, которое вводится пациенту, меньше, чем количество, приводящее к концентрации соединения в плазме у пациента, равной или превышающей токсичный уровень соединения. Предпочтительно концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 10 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 25 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 50 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 100 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 500 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 1000 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 2500 нМ. В одном варианте осуществления концентрация соединения в плазме пациента поддерживается около 5000 нМ. Оптимальное количество соединения, которое должно быть введено пациенту при осуществлении на практике настоящего изобретения, будет зависеть от конкретного используемого соединения и типа рака, который необходимо лечить.

Определения

Перечисленные далее определения различных терминов используются для описания этого изобретения. Эти определения применяются к терминам на всем протяжении данного описания и формулы изобретения, если иное не указано в конкретных случаях, как по отдельности так и для части большой группы.

Термин ацил относится к карбонильным группам, замещенным водородом, алкилом, частично насыщенным или полностью насыщенным циклоалкильном, частично насыщенным или полностью насыщенным гетероциклильном, арилом и гетероарилом. Например, ацил включает такие группы как (С₁С₆)алканоил (например, формил, ацетил, пропионил, бутирил, валерил, капроил, трет-бутилацетил и т.д.), (Сз-Сб)циклоалкилкарбонил (например, циклопропилкарбонил, циклобутилкарбонил, циклопентил- 11 022434 карбонил, циклогексилкарбонил, и т.д.), гетероциклический карбонил (например, пирролидинилкарбонил, пирролид-2-он-5-карбонил, пиперидинилкарбонил, пиперазинилкарбонил, тетрагидрофуранилкарбонил и т.д.), ароил (например, бензоил) и гетероароил (например, тиофенил-2-карбонил, тиофенил-3карбонил, фуранил-2-карбонил, фуранил-3-карбонил, 1Н-пирроил-2-карбонил, 1Н-пирроил-3-карбонил, бензо[Ь]тиофенил-2-карбонил и т.д.). В дополнение к этому, алкильная, циклоалкильная, гетероциклильная, арильная и гетероарильная часть ацильной группы может быть любой одной из групп, описанных в соответствующих определениях. Когда указано, что ацильная группа является необязательно замещенной, ацильная группа может быть незамещенной или, необязательно, замещенной одним или более заместителями (в большинстве случаев от одного до трех заместителей), независимо выбранными из группы заместителей, перечисленных ниже в определении для замещенный, или алкильная, циклоалкильная, гетероциклильная, арильная и гетероарильная часть ацильной группы может быть замещенной, как описано выше в списке предпочтительных и более предпочтительных заместителей, соответственно.

Термин алкил включает линейные или разветвленные радикалы, имеющие от одного до примерно двадцати атомов углерода или, предпочтительно, от одного до примерно двенадцати атомов углерода. Более предпочтительными алкильными радикалами являются низшие алкильные радикалы, имеющие от одного до примерно десяти атомов углерода. Наиболее предпочтительными являются низшие алкильные радикалы, имеющие от одного до примерно восьми атомов углерода. Примеры таких радикалов включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изоамил, гексил и тому подобное.

Термин алкенил включает линейные или разветвленные радикалы, имеющие по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, содержащие от двух до примерно двадцати атомов углерода или, предпочтительно, от двух до двенадцати атомов углерода. Более предпочтительные алкенильные радикалы представляют собой низшие алкенильные радикалы, имеющие от двух до примерно десяти атомов углерода и более предпочтительно от двух до примерно восьми атомов углерода. Примеры алкенильных радикалов включают этенил, аллил, пропенил, бутенил и 4-метилбутенил. Термины алкенил и низший алкенил включают радикалы, имеющие цис и транс ориентации или, альтернативно, Е и Ζ ориентации.

Термин алкинил включает линейные или разветвленные радикалы, имеющие по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, содержащие от двух до примерно двадцати атомов углерода или, предпочтительно от двух до примерно двенадцати атомов углерода. Более предпочтительными алкинильными радикалами являются низшие алкинильные радикалы, имеющие от двух до примерно десяти атомов углерода, и более предпочтительно от двух до примерно восьми атомов углерода. Примеры алкинильных радикалов включают пропаргил, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутил, 2-бутинил и 1пентинил.

Термин арил, отдельно или в какой-либо комбинации, означает карбоциклическую ароматическую систему, содержащую одно, два или три кольца, в которой такие кольца могут соединяться вместе обычным образом или же могут быть конденсированными. Термин арил включает ароматические радикалы, такие как фенил, нафтил, тетрагидронафтил, индан и бифенил.

Термины гетероциклил, гетероцикл, гетероциклический или гетероцикло включает насыщенные, частично ненасыщенные и ненасыщенные гетероатомсодержащие кольцевидные радикалы, которые также могут называться гетероциклил, гетероциклоалкенил и гетероарил соответственно, в которых гетероатомы могут быть выбраны из азота, серы и кислорода. Примеры насыщенных гетероциклильных радикалов включают насыщенную 3-6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую от 1 до 4 атомов азота (например, пирролидинил, имидазолидинил, пиперидино, пиперазинил и т.д.); насыщенную 3-6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую от 1 до 2 атомов кислорода и от 1 до 3 атомов азота (например, морфолинил и т.д.); насыщенную 3-6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую от 1 до 2 атомов серы и от 1 до 3 атомов азота (например, тиазолидинил и т.д.). Примеры частично ненасыщенных гетероциклических радикалов включают дигидротиофен, дигидропиран, дигидрофуран и дигидротиазол. Гетероциклические радикалы могут включать пятивалентный азот, как, например, в радикалах тетразолия и пиридиния. Термин гетероцикл также включает радикалы, в которых гетероциклические радикалы конденсированы с арильными или циклоалкильными радикалами. Примеры таких конденсированных бициклических радикалов включают бензофуран, бензотиофен и тому подобное.

Термин гетероарил включает ненасыщенные гетероциклические радикалы. Примеры гетероарильных радикалов включают ненасыщенную 3-6-членную, предпочтительно 5 или 6-членную, гетеромоноциклическую группу, содержащую от 1 до 4 атомов азота, например пирролил, пирролинил, имидазолил, пиразолил, пиридил, пиридинил, пиразинил, пиридазинил, триазолил (например, 4Н-1,2,4триазолил, 1Н-1,2,3-триазолил, 2Н-1,2,3-триазолил и т.д.) тетразолил (например, 1Н-тетразолил, 2Нтетразолил, и т.д.) и т.д.; ненасыщенную конденсированную гетероциклильную группу, содержащую от 1 до 5 атомов азота, например индолил, изоиндолил, индолизинил, бензимидазолил, хинолил, изохинолил, индазолил, бензотриазолил, тетразолопиридазинил (например, тетразоло [1,5-Ь] пиридазинил и т.д.) и т.д.; ненасыщенную 3-6-членную, предпочтительно 5- или 6-членную, гетеромоноциклическую группу,

- 12 022434 содержащую атом кислорода, например пиранил, фурил и т.д.; ненасыщенную 3-6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую атом серы, например, тиенил и т.д.; ненасыщенную 3-6-членную, предпочтительно 5- или 6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую 1-2 атома кислорода и от 1 до 3 атомов азота, например оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил (например, 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил и т.д.) и т.д.; ненасыщенную конденсированную гетероциклическую группу, содержащую 1-2 атома кислорода и от 1 до 3 атомов азота (например, бензо ксазолил, бензоксадиазолил и т.д.); ненасыщенную 3-6-членную, предпочтительно 5- или 6-членную гетеромоноциклическую группу, содержащую 1-2 атома серы и от 1 до 3 атомов азота, например тиазолил, тиадиазолил (например, 1,2,4-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, 1,2,5-тиадиазолил и т.д.) и т.д.; ненасыщенную конденсированную гетероциклильную группу, содержащую 1-2 атома серы и от 1 до 3 атомов азота (например, бензотиазолил, бензотиадиазолил и т.д.) и тому подобное.

Термин гетероциклоалкил включает гетероциклозамещенные алкильные радикалы. Более предпочтительными гетероциклоалкильными радикалами являются низшие гетероциклоалкильные радикалы, имеющие от одного до шести атомов углерода в гетероциклорадикалах.

Термин замещенный относится к замещению одного или более водородных радикалов в рассматриваемой структуре группой указанного заместителя, включая, но не ограничиваясь этим: гало, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил, тиол, алкилтио, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галоалкил, амино, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоновую кислоту, сульфоновую кислоту, сульфонил, фосфоновую кислоту, арил, гетероарил, гетероциклический и алифатический радикал. Понятно, что заместитель может быть далее дополнительно замещен.

В целях упрощения химические фрагменты, определенные и упоминаемые в настоящем документе, могут быть одновалентными химическими фрагментами (например, алкил, арил и т.д.) или многовалентными фрагментами в соответствующих структурных состояниях, что понятно специалистам в данной области техники. Например, алкильным фрагментом может называться одновалентный радикал (например, СН₃-СН₂-) или, в иных случаях, двухвалентный соединяющий фрагмент также может быть алкильным. В последнем случае специалистам в данной области техники понятно, что данный алкил является двухвалентным радикалом (например, -СН₂-СН₂-), который является эквивалентным термину алкилен. Аналогичным образом, в обстоятельствах, когда требуются двухвалентные фрагменты, являющиеся алкокси, алкиламино, арилокси, алкилтио, арил, гетероарильными, гетероциклическими, алкильными алкенильными, алкинильными, алифатическими или циклоалкильными группами, специалистам в данной области техники будет понятно, что термины алкокси, алкиламино, арилокси, алкилтио, арил, гетероарил, гетероциклический, алкил, алкенил, алкинил, алифатический или циклоалкильный относятся к соответствующему двухвалентному фрагменту.

Термины галоген или гало в настоящем изобретении относятся к атому, выбранному из фтора, хлора, брома и иода.

В настоящем изобретении термин нарушенная пролиферация относится к ненормальному клеточному росту.

Фраза дополнительная терапия включает лечение субъекта средствами, которые уменьшают или предотвращают побочные эффекты, связанные с комбинированной терапией по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь этим, например, такие средства, которые уменьшают токсическое действие противораковых лекарственных средств, например ингибиторы резорбции костей, кардиозащитные средства; предотвращают или уменьшают случаи возникновения тошноты и рвоты, связанной с химиотерапией, радиотерапией или оперативным вмешательством; или уменьшают случаи возникновения инфекции, связанной с введением миелосупрессивных противоопухолевых лекарственных средств.

Использованный в описании термин ангиогенез относится к образованию кровеносных сосудов. Конкретнее, ангиогенез представляет собой многоступенчатый процесс, при котором эндотелиальные клетки претерпевают фокальную деградацию и вторгаются через их собственную базальную мембрану, мигрируют через интерстициальную строму по направлению к ангиогенному стимулу, размножаются вблизи от мигрирующего конца, формируют кровеносные сосуды и снова прикрепляются к вновь синтезированной базальной мембране (смотри Ро1кшаи е! а1., Αάν. Сапсег Ке8., Уо1. 43, рр. 175-203 (1985)). Антиангиогенные средства вмешиваются в этот процесс. Примеры средств, которые вмешиваются в некоторые из этих стадий, включают тромбоспондин-1, ангиостатин, эндостатин, интерферон альфа и такие соединения, как ингибиторы матриксной металлопротеиназы (ММР), которые блокируют действие ферментов, расчищающих и создающих пути для прохождения вновь сформированных кровеносных сосудов; такие соединения как альфа-\'-бета-3 ингибиторы, мешающие молекулам, которые клетки кровеносных сосудов используют для соединения первичного кровеносного сосуда и опухоли; такие средства как специфические СОХ-2 ингибиторы, предотвращающие рост клеток, образующих новые кровеносные сосуды; и соединения на основе белков, которые одновременно затрагивают несколько из этих мишеней.

- 13 022434

Термин апоптоз при использовании в настоящем изобретении относится к программируемой клеточной смерти, которая запускается в нормально функционирующих клетках человека и животных, когда того требует возраст или состояние здоровья клетки. Средство, вызывающее (индуцирующее) апоптоз, инициирует (запускает) процесс программируемой смерти клетки.

Использованный в настоящем изобретении термин рак означает класс заболеваний или нарушений, отличающийся неконтролируемым делением клеток и способностью этих клеток вторгаться в другие ткани, или путем непосредственного врастания в соседнюю ткань путем инвазии, или путем внедрения в отдаленные места при метастазировании.

Использованные в настоящем изобретении термины соединение и соединение по изобретению относятся к соединениям формулы I и их фармацевтически приемлемым солям. Соединения по изобретению могут быть получены в различных формах, включая кристаллические и аморфные формы. Соединения также могут встречаться в виде сольватов, например гидратов, или сольватов органического растворителя, предпочтительно фармацевтически приемлемого растворителя. Соединения также могут встречаться в множественных кристаллических или полиморфных формах. Соединения по изобретению дополнительно включают фармацевтически приемлемые пролекарства и сложные эфиры соединения формулы I.

Термин устройство относится к любому аппарату, обычно механическому или электрическому, созданному для выполнения определенной функции.

Использованный в описании термин дисплазия относится к аномальному клеточному росту, и в большинстве случаев относится к ранней форме предракового поражения, которое распознается патологом при исследовании биопсийного материала.

Использованный в описании термин эффективное количество описываемых соединений, в отношении описываемого способа лечения, относится к количеству описываемого соединения, которое при введении его в качестве части необходимого режима дозирования, приводит, например, к изменению скорости клеточной пролиферации и/или состояния дифференцировки и/или уровня выживаемости клетки до клинически приемлемых стандартных значений. Это количество может дополнительно облегчать до некоторой степени один или несколько симптомов неопластического нарушения, включая, но не ограничиваясь этим: 1) уменьшение количества раковых клеток; 2) уменьшение размера опухоли; 3) ингибирование (т.е., замедление до некоторой степени, предпочтительно остановку) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; 4) ингибирование (т.е., замедление до некоторой степени, предпочтительно остановку) метастазирования опухоли; 5) ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли; 6) облегчение или уменьшение до некоторой степени одного или более симптомов, связанных с нарушением; и/или 7) облегчение или уменьшение побочных эффектов, связанных с введением противоопухолевых препаратов.

Использованный в описании термин гиперплазия относится к избыточному делению или росту клеток.

Фраза иммунотерапевтическое средство относится к средствам, используемым для передачи иммунитета иммунокомпетентного донора, например, другого человека или животного, хозяину с помощью инокуляции. Термин включает применение сыворотки или гамма глобулин содержащих антител, выработанных другим индивидуумом или животным; неспецифическое системное стимулирование; адьюванты; активную специфическую иммунотерапию; и адоптивную иммунотерапию. Адоптивная иммунотерапия относится к лечению заболевания с помощью лечения или средств, которые включают введение хозяину сенсибилизированных лимфоцитов, фактора переноса, иммунной РНК или антител в сыворотке или гаммаглобулина.

В контексте неоплазии ингибирование роста опухоли или роста опухолевой клетки можно определить по отсроченному появлению первичных или вторичных опухолей, замедленному развитию первичных или вторичных опухолей, уменьшенному появлению первичных или вторичных опухолей, замедленному проявлению или уменьшенной тяжести вторичных эффектов заболевания, остановке роста опухоли и регрессии опухолей, среди прочего. Особенно полное ингибирование называется предотвращением или хемопредотвращением.

Использованный в описании термин метастазирование относится к миграции раковых клеток из первоначального места локализации опухоли через кровеносные и лимфатические сосуды и появлению раковых опухолей в других тканях. Кроме того, термин метастазирование используется для вторичного рака, выросшего в отдаленном месте.

Использованный в описании термин новообразование относится к аномальной массе ткани, которая является результатом избыточного клеточного деления. Новообразования могут быть доброкачественными (не раковыми) или злокачественными (раковыми) и также могут называться опухолями. Термин новообразование (неоплазия) обозначает патологический процесс, который приводит к образованию опухоли.

Использованный в описании термин предраковый относится к состоянию, которое не является злокачественным, но вероятно станет злокачественным, если останется нелеченым.

Термин пролиферация относится к клеткам, проходящим деление (митоз).

- 14 022434

Фраза заболевание или нарушение, связанное с ΡΙ3 киназой, относится к заболеванию или нарушению, характеризующемуся несоответствующей активностью фосфоинозитид-3-киназы или сверхактивностью фосфоинозитид-3-киназы. Несоответствующая активность относится к (ί) экспрессии ΡΙ3 киназы в клетках, которые в норме не экспрессируют ΡΙ3 киназу; (ίί) увеличенной экспрессии ΡΙ3 киназы, приводящей к нежелательной пролиферации клеток, дифференцировке и/или росту; или (ίίί) уменьшенной экспрессии ΡΙ3 киназы, приводящей к нежелательному уменьшению пролиферации клеток, дифференцировке и/или росту. Сверхактивность ΡΙ3 киназы относится или к амплификации гена, кодирующего конкретную ΡΙ3 киназу, или выработке уровня активности ΡΙ3 киназы, который может коррелировать с нарушением клеточной пролиферации, дифференцировки и/или роста (то есть, в связи с тем, что уровень ΡΙ3 киназы увеличивается, тяжесть одного или более признаков клеточного нарушения увеличивается).

Фраза радиотерапевтическое средство относится к использованию электромагнитного и корпускулярного излучения при лечении новообразований.

Использованный в описании термин рецидив относится к возвращению рака после периода ремиссии. Это может происходить из-за неполного удаления клеток первоначального рака, и рецидив может появляться локально (в месте первоначального рака), регионально (поблизости от первоначального рака, возможно в лимфатических узлах или ткани) и/или отдаленно в результате метастазирования.

Термин лечение относится к любому процессу, действию, применению, терапии или тому подобному, при котором млекопитающее, включая человека, является объектом медицинской помощи с целью улучшения состояния млекопитающего, непосредственно или опосредованно.

Термин вакцина включает средства, которые стимулируют иммунную систему человека, чтобы повысить иммунный ответ против опухоли, воздействуя на клетки, экспрессирующие опухольассоциированные антигены (Теа).

Использованный в изобретении термин фармацевтически приемлемая соль относится к таким солям, которые с медицинской точки зрения являются пригодными для использования в контакте с тканями людей и низших животных без неспецифической токсичности, воспаления, аллергического ответа и тому подобного, и соответствуют приемлемому отношению польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области техники. Например, 8. М. Вегде, е1 а1. подробно описывает фармацевтически приемлемые соли в ί. ΡЬа^тасеиί^са1 8с1епсе§, 66: 1-19 (1977). Эти соли можно получить ίη 5Йи в ходе окончательного выделения и очистки соединений по изобретению, или отдельно путем взаимодействия свободного основания с подходящей органической кислотой или неорганической кислотой. Примеры фармацевтически приемлемых нетоксичных солей присоединения кислоты включают, но не ограничиваются этим, соли аминогруппы, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и хлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, лактобионовая кислота или малоновая кислота или с помощью других методов, используемых в данной области техники, таких как ионный обмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются этим, адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидроиодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, ртолуолсульфонат, ундеканоат, валерат и тому подобное. Иллюстративные соли щелочных и щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и тому подобное. Дополнительные фармацевтически приемлемые соли включают, где это целесообразно, нетоксичные аммониевые соли, четвертичные аммониевые соли и катионы амина, образованные с применением противоионов, таких как галид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, алкил сульфонат, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, сульфонат и арил сульфонат. Было обнаружено, что некоторые соли, такие как натриевые, калиевые и холиновые основные соли, а также кислые соли, такие как сульфат и метансульфонат, улучшают растворимость соединений формулы Ι в фармацевтически приемлемых водных средах. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль соединения 1 является холиновой солью. Предпочтительные соли соединения 1 включают соль натрия и соль калия. Другие предпочтительные соли включают сульфат и метансульфонат.

Использованный в описании термин фармацевтически приемлемые сложные эфиры относится к сложным эфирам, которые подвергаются гидролизу ίη νίνο и включают такие сложные эфиры, которые легко распадаются в организме человека с высвобождением исходного соединения или его соли. Подходящие сложноэфирные группы включают, например, группы, происходящие от фармацевтически приемлемых алифатических карбоновых кислот, в частности, алкановой, алкеновой, циклоалкановой и алкандионовой кислот, в которых каждый алкильный или алкенильный фрагмент преимущественно имеет не более, чем 6 атомов углерода. Примеры определенных сложных эфиров включают, но не ограничиваются этим, формиаты, ацетаты, пропионаты, бутираты, акрилаты и этилсукцинаты.

- 15 022434

Использованный в описании термин фармацевтически приемлемые пролекарства относится к таким пролекарствам соединения по настоящему изобретению, которые с медицинской точки зрения являются пригодными для использования в контакте с тканями людей и низших животных без избыточной токсичности, воспаления, аллергического ответа и тому подобного, соответствуют приемлемому отношению польза/риск, и являются эффективными для предполагаемого использования, а также к цвиттерионным формам соединения по настоящему изобретению, где это возможно. Использованный в описании термин пролекарство означает соединение, которое превращается ίη νίνο при метаболизме (например, путем гидролиза) в соединение по изобретению. Различные формы пролекарств известны в данной области техники, например, как указано в работах Випйдаагй, (ей.), Пе81дп оЕ Ргойгцдк, ЕЕеуаег (1985); ХУИйег, е1 а1. (ей.), МеШойк ш Еп/уто1оду, Уо1. 4, Асайепис Ргекк (1985); Кгодкдаагй-Ьагкеп, е1 а1., (ей). Пе81дп и АррНсайоп оЕ Ргойгцдк, Тех!Ьоок оЕ Эгид Оеьадп и Пеуе1ортеп1, СНар1ег 5, 113-191 (1991); Випйдаагй, е1 а1., 1оигпа1 оЕ Эгид ЭсЕусг Реу1е^5, 8:1-38(1992); Випйдаагй, ί. оЕ Ркагтасеийса1 8с1епсе8, 77:285 е! 8ец. (1988); ШдисЫ и 8Ее11а (ейв.) Ргойгцдк ак Nονе1 Эгид ОеПуегу 8у81ет8, Атепсап Скетка1 8оае1у (1975); и Вегпагй ТеьИа & 1оасЫт Мауег, Нуйго1у818 1п Эгид и Ргойгид Ме1аЬо118т: Скет181гу, Βίоскет181гу и Еп/уто1оду, 1оНп \УПеу и 8опк, Ый. (2002).

Использованный в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемый носитель включает все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства, средства, замедляющие абсорбцию, и тому подобные, совместимые с фармацевтическим введением, такие как стерильная апирогенная вода. Подходящие носители описаны в самом последнем издании Фармации (КеттдФп'к РЬагтасеийса1 8с1епсе8), общепринятом стандарте в данной области, которая включается в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, но не ограничиваются этим, воду, физраствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% сывороточный альбумин человека. Также могут использоваться липосомы и неводные растворители, такие как жирные масла. Использование таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением тех случаев, когда обычная среда или средство являются несовместимыми с активным соединением, подразумевается возможность их использования в композициях по изобретению. Кроме того, в состав композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.

В настоящем изобретении термин предраковый относится к состоянию, которое не является злокачественным, но вероятно станет злокачественным, если останется нелеченым.

Термин субъект, использованный в настоящем изобретении, относится к животному. Предпочтительно животное является млекопитающим. Более предпочтительно млекопитающее является человеком. Термин субъект также относится, например, к собакам, кошкам, лошадям, коровам, свиньям, морским свинкам, рыбам, птицам и тому подобному.

Соединения по настоящему изобретению могут быть модифицированы путем добавления соответствующих функциональностей для усиления выбранных биологических свойств. Такие модификации известны в данной области техники и могут включать модификации, увеличивающие биологическое проникновение в данную биологическую систему (например, кровь, лимфатическую систему, центральную нервную систему), увеличивающие пероральную доступность, увеличивающие растворимость для обеспечения возможности введения с помощью инъекции, изменяющие метаболизм и изменяющие скорость выведения.

Синтезированные соединения могут быть выделены из реакционной смеси и дополнительно очищены с помощью таких методов, как колоночная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография или перекристаллизация. Стоит отметить, что дополнительные методы синтеза соединений рассматриваемой формулы станут понятны специалистам в данной области техники. В дополнение к этому, разные стадии синтеза могут осуществляться в альтернативной последовательности или порядке с получением желательных соединений. Методы преобразований синтетической химии и использования защитных групп (использование защиты и снятие защиты), подходящие для синтеза описанных здесь соединений, известны в данной области техники и включают, например, описанные в К. Ьагоск, СотргеНепШ'е Огдапю ТгапкЕогтайопк, УСН РиЬйкЬегк (1989); Т.У. Огеепе и Р.О.М. ХУиК РгоЮсЕуе Огоирк ш Огдатс 8уйЬе818. 2й. Ей., 1оНп ХУПеу и 8опк (1991); Ь. Ыекег и М. Ыекег, Ыекег и Ыекег'к КеадеЫк Еог Огдатс 8уп1Ье818, 1оНп ХУПеу и 8опк (1994); и Ь. Расщепе, ей., Епсус1ореФа оЕ КеадеЫк Еог Огдапю 8уйЬе818, 1оНп ХУПеу и 8опк (1995), и последующие их редакции.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, заключенное в один состав с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.

Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент представляет собой нетоксичный, инертный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, материал для инкапсулирования или композицию вспомогательного вещества любого типа. Некоторыми примерами материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, являются сахара,

- 16 022434 такие как лактоза, глюкоза и сахароза; циклодекстрины, такие как альфа- (α), бета- (β) и гамма- (γ) циклодекстрины; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразная трагакантовая камедь; солод; желатин; тальк; такие эксципиенты для суппозиториев, как масло какао и воски; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатно-буферные растворы, а также другие нетоксичные совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красящие вещества, разделительные средства, покровные вещества, подсластители, вкусовые и ароматизирующие вещества, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композиции, по усмотрению разработчика рецептуры.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить перорально, парентерально, с помощью спрея для ингаляции, местно, ректально, назально, буккально, вагинально или через имплантированный резервуар, предпочтительно путем перорального введения или введения с помощью инъекции. Фармацевтические композиции этого изобретения могут содержать любые общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адьюванты (вспомогательные средства) или разбавители. В некоторых случаях значение рН композиции может быть отрегулировано с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов с целью увеличения стабильности созданного соединения или формы его доставки. Использованный в описании термин парентеральное введение включает подкожную, внутрикожную, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутрисуставную, внутригрудинную, подоболочечную, внутриочаговую и внутричерепную инъекцию или инфузию (вливание).

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным соединениям жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области техники, такие как, например, вода или другие растворители, солюблизирующие вещества и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропил енгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло пшеничных зародышей, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей композиции для перорального применения также могут включать такие адьюванты как увлажняющие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые вещества и ароматизирующие добавки.

Инъекционные формы, например, стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии, могут быть созданы в соответствии с известным уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих веществ и суспендирующих веществ. Стерильный препарат для инъекций также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор, суспензию или эмульсию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3бутандиоле. К числу приемлемых основ и растворителей, которые могут использоваться, относятся вода, раствор Рингера, И.8.Р. и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используются стерильные, жирные масла. Для этой цели может использоваться любая смесь жирных масел, содержащая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, используются при приготовлении инъецируемых препаратов.

Составы для инъекций могут быть простерилизованы, например, с помощью фильтрации через фильтр, удерживающий бактерии, или путем введения стерилизующих средств в форме стерильных твердых составов, которые можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъецируемой среде перед применением.

Для продления эффекта лекарственного средства часто желательно замедлить абсорбцию лекарственного средства из места подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить с помощью жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. При этом скорость абсорбции лекарственного средства зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристалла и формы кристалла. Альтернативно, замедленная абсорбция введенной парентерально лекарственной формы осуществляется в результате растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном разбавителе. Инъецируемые депоформы получают путем получения матрицы микроинкапсулированного лекарственного средства в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также природы отдельного использованного полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо инъецируемых композиций также получают путем включения

- 17 022434 лекарственного средства в липосомы и микроэмульсии, совместимые с тканями организма.

Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые можно приготовить путем смешивания соединения по изобретению с подходящими нераздражающими эксципиентами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воски, которые являются твердыми при комнатной температуре, и жидкими при температуре тела, и следовательно плавятся в прямой кишке и вагинальной полости и высвобождают активное соединение.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешивается по меньшей мере с одним инертным, фармацевтически приемлемым эксципиентом и носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат и/или: а) наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая кислота; Ь) связывающими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик; с) увлажняющими веществами, такими как глицерин; ά) дезинтегрирующими средствами, такими как агар-агар, карбонат кальция картофельный крахмал или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; е) веществами, замедляющими растворение, такими как парафин; £) веществами, ускоряющими всасывание, такими как соединения четвертичного аммония; д) увлажняющими веществами, такими как, например, цетиловый спирт и глицерин моностеарат; 1ι) адсорбирующими веществами, такими как каолин и бентонитовая глина; и ί) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма также может содержать буферные вещества.

Твердые композиции подобного типа также могут применяться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликолей с высоким молекулярным весом и тому подобного.

Твердые лекарственные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут изготавливаться с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области разработки фармацевтических препаратов. Они необязательно могут содержать опалесцирующие вещества, а также могут представлять собой композиции, которые высвобождают активный ингредиент(ы) только, или преимущественно, в определенном участке пищеварительного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры заливочных композиций, которые могут использоваться, включают полимерные вещества и воски.

Лекарственные формы для местного и чрескожного введения соединения по изобретению включают мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, средства для ингаляции или пластыри. При необходимости активный компонент в стерильных условиях смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и любыми необходимыми консервирующими веществами или буферами. В рамках данного изобретения также предусматриваются офтальмологические составы, глазные капли, глазные мази, порошки и растворы.

Мази, пасты, кремы и гели могут содержать в дополнение к активному соединению по настоящему изобретению, такие эксципиенты, как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовую камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк, окись цинка или их смеси.

Порошки и спреи могут содержать, в дополнение к соединениям по изобретению, эксципиенты, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикат кальция и полиамидный порошок или смеси этих веществ. Спреи могут дополнительно содержать традиционные распыляющие вещества (пропелленты), такие как хлорфторуглеводороды.

Чрескожные пластыри обладают дополнительным преимуществом, обеспечивая контролируемую доставку соединения в организм. Такие лекарственные формы можно изготовить путем растворения или распределения соединения в подходящей среде. Усиливающие абсорбцию вещества могут использоваться для увеличения потока соединения через кожу. Скорость может контролироваться или с помощью контролирующей скорость мембраны, или путем распределения соединения в полимерной матрице или геле. Для ингаляционной доставки используется терапевтическая композиция по изобретению в твердой или жидкой аэрозольной форме, которая непосредственно вводится пациенту (например, путем вдыхания в дыхательную систему). Твердые или жидкие аэрозольные формы активного соединения, приготовленные для осуществления настоящего изобретения на практике, содержат частицы пригодного для вдыхания размера, то есть частицы достаточно небольшого размера, чтобы проходить через рот и дыхательное горло после вдыхания, а также в бронхи и альвеолы легких. Доставка аэрозольных терапевтических средств, в частности антибиотиков в виде аэрозоля, известна в данной области техники (смотри, например, патент США № 5,767,068 УапЭеуаШег е! а1, патент США № 5,508,269 διηίΐΐι е! а1., и \УО 98/43650 МоПдотегу, которые включены в описание посредством ссылки). Обсуждение ингаляционной доставки антибиотиков также встречается в патенте США № 6,014,969, включенном в описание посредством ссылки.

Под терапевтически эффективным количеством соединения по изобретению подразумевается ко- 18 022434 личество соединения, оказывающее терапевтическое действие на субъекта, подвергающегося лечению, при приемлемом отношении польза/риск, применимом к любому медицинскому лечению. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е., может быть измерен с помощью какого-либо теста или маркера) или субъективным (т.е., у субъекта наблюдается показатель улучшения или субъект чувствует эффект). Эффективное количество описанного здесь соединения может находиться в пределах от примерно 0,1 мг/кг до примерно 500 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 до примерно 50 мг/кг. Эффективные дозировки также будут варьироваться в зависимости от способа введения, а также возможности совместного использования с другими средствами. Однако понятно, что решение об общем ежедневном употреблении соединения и композиций по настоящему изобретению будет приниматься лечащим врачом в рамках его медицинской суждения. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от целого ряда факторов, включая заболевание, требующее лечения, и тяжесть заболевания; активность определенного используемого соединения; конкретную используемую композицию; возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету пациента; время введения, способ введения и скорость выведения определенного используемого соединения; продолжительность лечения; используемые в комбинации или одновременно с конкретным применяемым соединением лекарственные средства; и подобные факторы, хорошо известные в медицине.

Общая ежедневная доза соединения по изобретению, которая вводится человеку или другому животному, в однократной дозе или дробных дозах, может составлять, например, от 0,01 до 50 мг/кг веса тела или более обычно от 0,1 до 25 мг/кг веса тела. Композиции с однократной дозировкой могут содержать указанное количество или доли от него, чтобы в сумме давать суточную дозу. В целом, режимы лечения по настоящему изобретению включают введение нуждающемуся в этом пациенту от примерно 10 мг до примерно 1000 мг соединения(й) по изобретению в день в однократной дозе или в нескольких дозах.

Соединения описанной здесь формулы могут быть введены, например, с помощью инъекции, внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно; или перорально, буккально, назально, через слизистую, местно, в виде офтальмологического состава, или с помощью ингаляции, в пределах дозировки от примерно 0,1 до примерно 500 мг/кг веса тела, в альтернативном варианте от 1 мг до 1000 мг/дозу, каждые 4-120 ч, или в соответствии с требованиями определенного лекарственного средства. Способы по изобретению предполагают введение эффективного количества соединения или композиции соединения с целью достижения желательного или заданного эффекта. В большинстве случаев фармацевтические композиции по изобретению будут вводиться от примерно 1 до примерно 6 раз в день или, альтернативно, в виде непрерывного вливания. Такое введение может использоваться в качестве хронической или острой терапии. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с фармацевтическими эксципиентами или носителями для получения стандартной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от пациента, подвергающегося лечению, и выбранного способа введения. Типичный препарат будет содержать от примерно 5% до примерно 95% активного соединения (вес/вес). Альтернативно, такие препараты могут содержать от примерно 20% до примерно 80% активного соединения.

В некоторых случаях могут потребоваться более низкие или более высокие дозы, чем описанные выше. Определенная дозировка и режим лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от целого ряда факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных средств, тяжесть и течение заболевания, состояние или симптомы, предрасположение пациента к заболеванию, состоянию или симптомам, и решения лечащего врача.

После улучшения состояния пациента может при необходимости вводиться поддерживающая доза соединения, композиции или комбинации по изобретению. В дальнейшем дозировка или частота введения, или и то, и другое, могут быть уменьшены, в зависимости от симптомов, до уровня, при котором улучшенное состояние сохраняется, в тех случаях, когда симптомы ослаблены до желательного уровня. Однако пациенты могут нуждаться в периодическом лечении на долгосрочной основе после возвращения симптомов заболевания.

Примеры

Соединения и способы по настоящему изобретению будут более понятны со ссылкой на следующие примеры, предназначенные только для иллюстрации, но не для ограничения объема настоящего изобретения. Различные изменения и модификации раскрытых вариантов осуществления будут очевидны специалистам в данной области техники, причем такие изменения и модификации, включая те, которые имеют отношение к химическим структурам, заместителям, производным, композициям и/или способам по изобретению, но не ограничиваясь только ими, могут быть осуществлены без отступления от сути настоящего изобретения и объема прилагаемых к настоящему описанию пунктов формулы изобретения.

Синтез соединения 1 и его метансульфонатной, натриевой, калиевой и холиновой солей показан на схемах ниже.

- 19 022434

Промежуточные соединения 107-1 или 107-2 могут быть получены при взаимодействии 106 с К-2-1 или К-2-2, соответственно. Схемы синтеза К-2-1 и К-2-2 показаны ниже.

Или альтернативным способом:

- 20 022434

Промежуточные соединения 108-1 и 108-2 могут быть получены с помощью реакции конденсации 107-1 или 107-2 с К-3-1 или К-3-2, где К-3-1 и К-3-2 можно получить в соответствии со следующей схемой:

он

Рс1С|₂(0ррГ) р.3.2

Пример 1. Получение Шгидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2-й] пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамида (соединение 1).

Стадия а. (2)-Этил-2-(этоксиметил)-3-метоксиакрилат (соединение 202). К этанолу (750 мл) осторожно по частям добавили натрий (40,9 г; 1,78 моль) и концентрировали раствор с получением №ЮЕ! порошка после исчезновения всего металлического натрия. При перемешивании добавили гексан (1,0 л) и смесь охладили на ледяной бане. Добавили по каплям смесь 201 (130 г; 0,89 моль) и этилформиата (131 г; 1,78 моль) при 0-5°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавили по каплям диметилсульфат (224 г; 1,78 моль) при охлаждении на ледяной бане. Полученную смесь нагревали при 50°С в течение 2 ч. К смеси добавили триэтилхлоридаммония (122 г) и гидроксид натрия (20 г). Затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч и профильтровали. Фильтрат промыли водой и высушили над №-ь8О4. Концентрировали с получением титульного соединения (140 г; 37%) в виде бесцветного масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия Ь. Этил-2-оксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-карбоксилат (соединение 203).

Смесь соединения 202 (140 г; 0,745 моль), мочевины (40,0 г; 0,697 моль) и концентрированной соляной кислоты (34 мл) в этаноле (500 мл) нагревали с обратным холодильником в течение ночи. После выпаривания ~50% объема реакции, полученную суспензию профильтровали, промыли небольшим количеством этанола и высушили с получением соединения 203 (47 г; 37%) в виде белого твердого вещества. ЬСМ8: 171 [М+1]+. Ή ЯМР (400 МН/, СЭС1₃): δ 1.19 (ΐ, 1=7.2 Н, 3Н), 3.92 (5, 2Н), 4.08 (ц, 1=7.2 Ш, 2Н), 7.0 (5, 1Н), 7.08 (й, 1= 6.0 Н , 1Н), 8.83 (й, Ьг, 1= 4.8 Ш, 1Н).

Стадия с. Этил 2-оксо-1,2-дигидропиримидин-5-карбоксилат (соединение 204).

К раствору соединения 203 (47 г; 280 ммоль) в уксусной кислоте (500 мл) добавили бром (49,0 г; 307 ммоль). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, охладили до комнатной температуры, дополнительно охладили до 0-5°С и фильтровали с получением титульного соединения 204 в виде желтого твердого вещества (38 г; 54%). ЬСМ§: 169 [М+1]+. ¹Н ЯМР (400 МН/, Э₂О): δ 1.28 (ΐ, 1=7.2 Н/, 3Н), 4.32 (ц, 1= 7.2 Н, 2Н), 9.00 (Ьг, 5, 2Н).

Стадия й. Этил 2-хлорпиримидин-5-карбоксилат (соединение К-2-1).

Смесь соединения 204 (38,0 г; 153 ммоль), фосфорил трихлорида (300 мл) и Ν,Ν-диметиланилина (3 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, охладили до комнатной температуры и концентрировали. Остаток осторожно погасили ледяной водой, отрегулировали значение рН до 7-8 с помощью карбоната натрия и экстрагировали Е!ОАс. Объединенные органические вещества промыли ледяной водой и рассолом, высушили над №₂8О₄, выпарили и очистили с помощью колоночной хроматографии (элюируя ЕίОАс/Ηеxаηе5, 10%) с получением соединения К-2-1 (15 г; 52%) в виде белого твердого вещества. ЬСМ8: 187 [М+1]+. Ή ЯМР (400 МН/, СЭС1₃): δ 1.36 (ΐ, I = 7.5 Ш, 3Н), 4.39 (ц, 1= 7.5 Н, 2Н), 9.08 (5, 2Н).

Стадия е. Натрий (7)-2-(диметоксиметил)-3-метокси-3-оксопроп-1-ен-1-олат (соединение 206).

Смесь NаΗ (27 г; 60% в минеральном масле, 0,675 моль) в безводном 1,2-диметоксиэтане (300 мл) нагрели до 40-50°С и по каплям добавили метил 3,3-диметоксипропионат (205) (100 г; 0,675 моль). Полученную смесь перемешивали в течение 0,5 ч, затем по каплям добавили безводный метилформиат (81 г; 1,35 моль) при 40-50°С. Полученную смесь перемешивали при 40-50°С (внутренняя температура) в течение 2 ч до того, как ее охладили до 0°С. Дали возможность реакционной смеси медленно нагреться до 25°С и перемешивали в течение ночи. Добавили Е!₂О (150 мл) и помешивали в течение 30 мин. Полученную суспензию профильтровали. Твердое вещество промыли Е!2О (100 мл), собрали и высушили с получением титульного соединения 206 (82 г; 61%) в виде беловатого твердого вещества. ЬСМ§ (т/ζ): 130.8 [М+1]+. ^!Н ЯМР (400 МШ, СЭ₃ОЭ): δ 3.36 (5, 6Н), 3.60 (5, 3Н), 5.34 (5, 1Н), 8.92 (5, 1Н).

Стадия Г. 2-Аминопиримидин-5-карбоновой кислоты метиловый эфир (соединение 207).

К смеси гуанидин гидрохлорида (42,2 г; 0,44 моль) в ЭМР (300 мл) добавили соединение 206 (80 г; 0,40 моль). Полученную смесь нагревали при 100°С в течение 1 ч. Реакционную смесь профильтровали

- 21 022434 перед охлаждением. Фильтрат промыли 50 мл ΌΜΡ и объединенный фильтрат концентрировали с получением остатка, который суспендировали в холодном ΕΐΟΗ и промыли холодным ΕΐΟΗ (50 мл) с получением соединения 207 (38 г; 61,5%) в виде твердого желтого вещества. ЬСМ§ (т/ζ): 154.2 [М+1]+, 195.1[М+42]+. ¹Н ЯМР (400 ΜΗζ, СВзОИ): δ 3.88 (5, 3Н), 8.77 (5, 2Η).

Стадия д. Метил-2-хлорпиримидин-5-карбоксилат (соединение К-2-2).

Соединение 207 (7 г; 0,046 моль) добавили к смеси концентрированной соляной кислоты (15.2 мл) и ί'Ή₂Ο₂ (60 мл). После охлаждения добавили ΖηΟ₂ (18,6 г; 0,138 моль) при 15-20°С. Смесь перемешивали при 15-20°С в течение 0,5 ч и охладили до 5-10°С. Добавили частями ΝαΝΟ₂ (9,5 г; 0,138 моль), сохраняя при этом внутреннюю температуру 5-10°С. Реакция продолжалась около ~2 ч. Реакционную смесь выливали в ледяную воду (50 мл). Органический слой отделили и экстрагировали водную фазу СИ₂С1₂ (30 мл*2). Объединенные органические экстракты концентрировали с получение сырого продукта (4,2 г). Сырое соединение суспендировали в гексане (20 мл), нагревали при 60°С в течение 30 мин и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением титульного соединения К-2-2 (3,5 г; 44,4%) в виде серовато-белого вещества. ЬСМ8 (т/ζ): 214.1[М+42]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, СОС1₃): δ 4.00 (5, 3Н), 9.15 (5, 2Η).

Стадия Ь. 5-Бром-2-метоксипиридин (соединение 303).

Раствор 2-метоксипиридина (100 г; 0,92 моль), ΝΒδ (180 г; 1,0 моль) в ацетонитриле (1,0 л) помешивали с обратным холодильником в течение 21 ч. ТЬС показала, что реакция завершилась. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры и концентрировали. Было собрано ~900 мл растворителя. Полученную суспензию профильтровали и промыли н-гексаном (~400 мл). Фильтрат вновь концентрировали до получения сырого продукта. Сырой продукт дистиллировали при пониженном давлении (30°С/~0,3 мм рт.ст.) с получением титульного соединения в виде прозрачного масла (146 г; 84%). ЬСМ§ (т/ζ): 190.0 [М+1]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, СОС1₃): δ 3.90 (5, 3Н), 6.65 (ά, 1= 8.8 Ηζ, 1Η), 7.62 (άά, 1= 8.8 Ηζ, 2.4Ηζ, 1Η), 8.19 (5, 1Η).

Стадия ΐ. 6-Метоксипиридин-3-ил-борная кислота (К-3-1).

К раствору соединения 303 (20 г; 0,11 моль) в безводном ТИР (180 мл) по каплям добавили н-ВиЫ (59 мл, 2М в ΤΗΡ) при -78°С, полученную смесь перемешивали в течение 1 ч. Добавили триизопропилборат (37 мл) при -78°С, реакционную смесь нагрели до комнатной температуры и продолжали перемешивать в течение ночи. ТЬС (гексаны/этилацетат =5:1) показала завершение реакции. Отрегулировали значение рН смеси до 3-4 с помощью 4Ν ΗΟ (90 мл). Осадок собрали фильтрованием с получением сырого соединения К-3-1 (21 г; 128%). Сырое соединение К-3-1 (21 г) растворили в воде (200 мл) и отрегулировали значение рН раствора до 8-9 с помощью концентрированного раствора аммония, осадок собрали фильтрованием с получением чистого титульного соединения К-3-1 в виде твердого белого вещества. (11 г; 67%). Ι.ίΆΙδ (т/ζ): 154.1 [М+1]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-1₆): δ 3.86 (5, 3Н), 6.76 (ά, 1= 8.4 Ηζ, 1Η), 7.99 (άά, 1 = 8.4 Ηζ, 2.0 Ηζ, 1Η), 8.05 (Ьг, 2Η), 8.52 (ά, 1= 2.0 Ηζ, 1Η).

Стадия ρ 2-Метокси-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин (соединение К-3-2).

Смесь соединения 303 (55 г; 0,29 моль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолан) (90 г; 0,35 моль), ацетата калия (57 г; 0,58 моль) и бис(трифенилфосфин)палладия(11) хлорида (2,2 г; 3 ммоль) в безводном диоксане (500 мл) нагревали при 108°С в атмосфере Ν₂ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очистили с помощью колоночной хроматографии, элюируя гексан/этилацетатом, с получением титульного соединения К-3-2 (58 г; 84%). 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₂): δ 1.30 (5, 12Н), 3.88 (5, 3Н), 6.81 (ά, 1= 8.0 Ηζ, 1Η), 7.88 (άά, 1= 8.0 Ηζ, 2.0Ηζ, 1Η), 8.41 (ά, 1 = 2.0Ηζ, 1Η).

Стадия к. Тиено[3,2Д]пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дион (соединение 102).

Метод с использованием мочевины. Смесь метил-3-аминотиофен-2-карбоксилата (101) (90,0 г; 573 ммоль; 1,0 экв.) и мочевины (277,6 г; 4,6 моль; 8,0 экв.) нагревали при 190°С в течение 3-4 ч и охладили до комнатной температуры. К реакционной смеси добавили водный ΝαΟΗ (10%, 800 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч твердое вещество удалили фильтрованием. Фильтрат подкислили ΗΟ до значения рН 3-4, осажденное твердое вещество собрали фильтрованием, промыли водой и высушили под вакуумом с получением искомого продукта - соединения 102 - в виде сероватобелого твердого вещества (87 г; 89%), т.пл.: 280-285°С. ^СΜδ (т/ζ): 169.0 [М+1]+. 'Η ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₆): δ 6.92 (ά, 1 = 5.2 Ηζ, 1Η), 8.05 (ά, 1= 5.2 Ηζ, 1Η), 11.0-11.5 φρ2Η).

ΚΟСN метод. К смеси 3-аминотиофен-2-карбоксилата (101) (100,0 г; 636,9 ммоль; 1,0 экв.), уксусной кислоты (705 мл) и воды (600 мл) медленно добавили раствор цианата калия (154,8 г; 1,91 моль; 3,0 экв.) в воде (326 мл) в течение 1 ч. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч, профильтровали и промыли водой (500 мл). Осадок загрузили в подходящий по размеру реактор и добавили 2М водный раствор гидроксида натрия (1,65 л), кашицу перемешивали в течение 2 ч, после чего Ρί’Μδ подтвердила образование искомого продукта. Смесь охладили до 10°С и добавили 3 М водную соляную кислоту (1,29 л) до значения рН 5.0 ~ 6.0. Кашицу профильтровали, промыли водой (700 мл) и высушили в вакуумном сушильном шкафу при 50°С в течение 24 ч до получения соединения 102 (100 г; 94%) в виде серовато-белого твердого вещества. ^СΜδ (т/ζ): 169.1 [М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₆): δ 6.92 (ά,1= 5.2 Ηζ, 1Η), 8.04 (ά,1= 5.2 Ηζ, 1Η), 11.14 (5, 1Η), 11.51 (5, 1Η).

- 22 022434

Стадия 1. 2,4-Дихлортиено[3,2-Д]пиримидин (соединение 103).

Хлорокись фосфора (152 мл; 1,67 моль; 7,0 экв.) медленно добавили к охлажденному раствору соединения 102 (40 г; 238 ммоль; 1,0 экв.) и Ν,Ν-диметиланилина (22,5 мл; 179 ммоль; 0,75 экв.) в ацетонитриле (250 мл) при сохранении температуры ниже 20°С. Затем смесь нагрели до 85°С и перемешивали в течение 24 ч. Реакционную смесь охладили до 15°С, и затем медленно вылили в смесь льда и холодной воды (360 мл). Полученную кашицу профильтровали, промыли холодной водой (200 мл). Осадок высушили в вакуумном сушильном шкафу при 40°С в течение 24 ч с получением соединения 103 (40,5 г; 83%) в виде серовато-белого твердого вещества. Т.пл.:245-250°С. ЬСМ§ (т/ζ): 205.0 [М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 7.75 (ά, ί = 5.2 Ηζ, 1Η), 8.71 (ά, ί=5.2Ηζ, 1Η).

Стадия т. 2-Хлор-4-морфолинотиено[3,2-Д]пиримидин (соединение 104) К смеси соединения 103 (34,2 г; 167 ммоль; 1,0 экв.) и метанола (500 мл) медленно добавили морфолин (31,2 мл; 367 ммоль; 2,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Осадок собрали фильтрованием, промыли метанолом и высушили в вакууме с получением искомого продукта - соединения 104 - в виде светло-желтого твердого вещества (39 г; 91%). Т.пл.: 250-255°С. ЬСМ§ (т/ζ): 256.0 [М+1]+. ΊI ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 3.76 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.92 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 7.42 (ά, ί= 5.2 Ηζ, 1Η), 8.32 (ά, ί= 5.2 Ηζ, 1Η).

Стадия п. 2-Хлор-4-морфолинотиено[3,2^]пиримидин-6-карбальдегид (Соединение 105).

К суспензии соединения 104 (20 г; 78,4 ммоль; 1,0 экв.) в ΤΗΡ (безводный, 320 мл) при -78°С медленно добавили н-ВиЫ (в гексанах, 2,4 М; 40,8 мл; 102 ммоль; 1,3 экв.) в атмосфере азота. Полученной кашице позволили нагреться до -60°С с превращением в прозрачный бурый раствор. Затем реакционную смесь вновь охладили до -78°С и медленно добавили ΌΜΡ (безводный, 9,1 мл; 118 ммоль; 1,5 экв.). Полученный раствор перемешивали при -78°С в течение 0,5 ч, нагрели до 0°С в течение 1 ч и медленно вылили в смесь водной ΗΟ (0,25 М; 660 мл) и ледяной воды (320 мл). Полученную кашицу перемешивали при 0-10°С в течение 0,5 ч, профильтровали, промыли холодной водой и высушили в вакууме до получения соединения 105 в виде желтого твердого вещества (22 г; 98%). Т.пл.:260-265°С. Εί’Μδ (т/ζ): 284.0 [М+1]+ Ή ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 3.77 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.96 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 8.30 (5, 1Η), 10.21 (5, 1Η).

Стадия о. (2-Хлор-4-морфолин-4-ил-тиено[3,2^]пиримидин-6-илметил)метиламин (соединение

106).

К раствору соединения 105 (20,0 г; 70,4 ммоль; 1,0 экв.) в метаноле (125 мл) добавили раствор метиламина в метаноле (27% об./об.; 75 мл; 563,2 ммоль) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, растворитель удалили под вакуумом с получением сырого твердого продукта, который растворили в метаноле (550 мл) и ΤΗΡ (220 мл) в атмосфере азота. По частям добавили борогидрид натрия (8 г; 211,2 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь выпарили в вакууме и добавили воду (300 мл). Водную смесь экстрагировали метиленхлоридом, а объединенные экстракты высушили над Να₂8Ο.·ι и концентрировали. Осадок растворили в 6М ΗΟ (230 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Водный раствор промыли метиленхлоридом в течение нескольких минут и довели значение рН до 9-10 с помощью ΝαΟΗ (4Ν). Осажденное твердое вещество собрали фильтрованием и высушили (60°С, 6 ч) с получением светло-желтого твердого вещества (18 г; 85%). Т.пл.: 240-245°С. Εί’Μδ (т/ζ): 299 [М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 2.32 (5, 3Н), 3.74 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.88 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.96 (5,2Η), 7.24 (5, 1Η).

Стадия р(а). 2-[(2-Хлор-4-морфолин-4-ил-тиено[3,2^]пиримидин-6-илметил)метиламино]пиримидин-5-карбоновой кислоты этиловый эфир (соединение 107-1).

К смеси соединений 106 (10 г; 33,6 ммоль) и К-2-1 (6,8 г; 36,4 ммоль) в ^ΑΝ (400 мл) при комнатной температуре добавили диизопропилэтиламин (220 мл; 1,26 моль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем смесь выпарили и добавили метиленхлорид (300 мл). Органическую фазу промыли водой, высушили над Να₂8Ο₄ и концентрировали в вакууме до получения осадка. К осадку добавили этилацетат и полученную смесь перемешивали при температуре бани с ледяной водой в течение 50 мин. Полученное твердое вещество собрали фильтрованием с получением титульного продукта 107-1 в виде твердого белого вещества (10,6 г; 70%). Εί’Μδ: 449 [М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 1.30 (ΐ, ί= 7.2 Ηζ, 3Η), 3.25 (5, 3Η), 3.71 (ΐ, ί= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.83 (ΐ, ί= 4.8 Ηζ, 4Η), 4.29 (т, 2Η), 5.21 (5, 2Η), 7.39 (5, 1Η), 8.87 (5, 2Η).

Стадия р(Ь). 2-[(2-Хлор-4-морфолин-4-ил-тиено[3,2^]пиримидин-6-илметил)метиламино]пиримидин-5-карбоновой кислоты метиловый эфир (соединение 107-2).

Смесь соединения 106 (25 г; 84 ммоль), ^ΑΝ (500 мл) и К-2-2 (16 г; 92 ммоль) перемешивали при комнатной температуре. Добавили диизопропилэтиламин (ΌΙΡΕΆ) (500 мл; 2,9 моль). Раствор перемешивали в течение ночи и выпарили. После добавления метиленхлорида (500 мл) органическую фазу промыли водой, высушили с помощью Να₂8Ο₄ и концентрировали в вакууме. К осадку добавили этилацетат (200 мл) и смесь перемешивали при температуре бани с ледяной водой в течение 50 мин. Титульный продукт собрали в виде белого твердого вещества (29,4 г; 81%). ^СΜδ (т/ζ): 435.2 [М+1]+. 'Н ЯМР

- 23 022434 (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₆): 3.25 (5, 3Н), 3.71 (ΐ, 1= 5.2 Ηζ, 4Η), 3.82-3.84 (т, 7Η), 5.21 (5, 2Η), 7.39 (5, 1Η), 8.87 (5, 2Η).

Стадия ц(а). Этил-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2-б]пиримидин-6-ил)метил) (метил)амино)пиримидин-5-карбоксилат (соединение 108-1).

Метод А. Смесь соединения 107-1 (12 г; 26,7 ммоль), К-3-1 (4,9 г; 32 ммоль), ΝαΗΟΘβ (6,7 г; 80,1 ммоль) и бис(трифенилфосфин)палладия(11) хлорида (188 мг; 0,267 ммоль) в смешанных растворителях толуоле (80 мл), этаноле (50 мл) и воде (10 мл)-нагревали при 108°С в течение 4,5 ч в атмосфере N2. ТЬС показала завершение реакции. Затем реакционную смесь охладили до комнатной температуры и добавили воду (20 мл). Полученное твердое вещество собрали фильтрованием и затем суспендировали в этаноле (100 мл). Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и профильтровали. Собранное твердое вещество промыли этанолом и высушили в вакууме с получением титульного соединения 108-1 в виде белого твердого вещества (10 г; 72%).

Метод В. Смесь соединения 107-1 (1,5 г; 3,34 ммоль), К-3-2 (1,6 г; 6,68 ммоль), Ν;·ιΗίΌ₃, (0,84 г; 10,0 ммоль) и бис(трифенилфосфин) палладия(11) хлорида (118 мг; 0,167 ммоль) в смешанных растворителях толуоле (24 мл), этаноле (15 мл) и воде (3 мл) нагревали при 108°С в атмосфере Ν₂. Реакционную смесь разделили между дихлорметаном и водой. Органический слой отделили, промыли рассолом, высушили над Ν;·ι₃δΟ₃, профильтровали и выпарили в вакууме с получением осадка, который очистили с помощью колоночной хроматографии, элюируя гексаном/этилацетатом, с получением соединения 108-1 в виде белого твердого вещества (1,7 г; 98 %). Т.пл.198-202°С. ЬСМ8: 522.30 [М+1]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟά₆): δ 1.31 (ΐ, I = 7.2 Ηζ, 3Η), 3.28 (5, 3Η), 3.76 (ΐ, 1= 4.4 Ηζ, 4Η), 3.93 (ΐ, 1= 4.4 Ηζ, 4Η), 3.94 (5, 3Η), 4.30 (ц, 1= 7.2 Ηζ, 2Η), 5.24 (5, 2Η), 6.92 (ά, 1= 8.8 Ηζ, 1Η), 7.47 (5, 1Η), 8.57 (άά, 1= 8.8 Ηζ, 2.0Ηζ, 1Η), 8.88 (5, 2Η), 9.15 (ά, 1= 2.0 Ηζ, 1Η).

Стадия ц(Ь). Метил-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2Ц]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксилат (соединение 108-2).

К смеси соединения 107-2 (20 г; 46,0 ммоль), В-3-1 (9,2 г; 60,2 ммоль; 1,3 экв.) в диоксане (540 мл) при комнатной температуре добавили твердый Ν;·ιΗί'Ό₃, (11,6 г; 138,1 ммоль, 3 экв.), а затем добавили воду (40 мл). Полученную смесь дегазировали, пропуская Ν₂ через поверхность раствора. Затем добавили бис(трифенилфосфин)палладия(П) хлорид (323 мг; 0,46 ммоль; 0,01 экв.) и полученную смесь нагревали при 108°С в течение 15 ч. ТЬС и ^’Μδ показали завершение реакции. Реакционную смесь фильтровали через целит, пока она была еще горячая (>90°С), и промыли диоксаном (70 мл). Фильтрат постепенно охладили до комнатной температуры, при этом во время периода охлаждения образовались белые мелкие кристаллы. Суспензию профильтровали и промыли диоксаном (80 мл) с получением титульного соединения 108-2 в виде белого твердого вещества (18 г; 78%). БСМ8 (т/ζ): 508.3 [М+1]+. 'Η ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₆): δ 3.28 (5, 3Н), 3.76 (ΐ, I = 4.8 Ηζ, 4Η), 3.82 (5, 3Η); 3.92 (т, 4Η), 3.93 (5, 3Η), 5.20 (5, 2Η), 6.91 (ά, 1= 8.8Ηζ, 1Η), 7.47 (5, 1Η), 8.57 (άά, 1= 8.8Ηζ, 2.4Ηζ, 1Η), 8.88 (5, 2Η), 9.15 (ά, 1= 2.0Ηζ, 1Η).

Стадия г. ^Гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено [3,2^]пиримидин-6-ил) метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамид (соединение 1).

Получение раствора гидроксиламин метанола.

Смесь ΝΗ₂ΟΗ.ΗΟ (80 г; 1,12 моль) в МеОН (400 мл) нагревали при 60-65°С в течение 1 ч до образования прозрачного раствора. Затем его охладили в бане с ледяной водой. К охлажденной смеси по каплям добавили раствор ΚΟΗ (96 г; 1,68 моль) в МеОН (240 мл) при поддержании температуры реакции 010°С. Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и затем профильтровали через воронку, наполненную безводным Ν;·ι₃δΟ₃ (700 г), при постоянном давлении. Фильтрат собрали под действием ледяной бани и хранили в холодильнике для будущего использования.

Получение соединения 1 из соединения 108-1.

Соединение 108-1 (10 г; 19 ммоль) суспендировали в вышеупомянутом свежеприготовленном растворе гидроксиламин метанола (1,79М; 350 мл). К этой смеси добавили дихлорметан (100 мл). Реакционную колбу запечатали, и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 5 ч до того, как она превратилась в прозрачный раствор. Реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 9 ч и профильтровали, чтобы удалить все нерастворимые твердые вещества. рН фильтрата отрегулировали до значения 6-7, добавляя уксусную кислоту, до образования твердого осадка. Твердое вещество собрали фильтрованием, промыли водой и минимальным количеством метанола, высушили в вакууме при 60°С в течение 5 ч с получением соединения 1 в виде белого твердого вещества (9,2 г; 96%). т.пл. 177-180°С. ^'.’Μδ: 509.3 [М+1]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜδΟ-ά₆): δ 3.24 (5, 3Н), 3.76 (ΐ, 1= 5 Ηζ, 4Η), 3.92 (ΐ, 1= 5 Ηζ, 4Η), 3.92 (5, 3Η), 5.20 (5, 2Η), 6.90 (ά, I = 8.8 Ηζ, 1Η), 7.44 (5, 1Η), 8.57 (άά, I = 8.8 Ηζ, 2.4Ηζ, 1Η), 8.75 (5, 2Η), 9.01 (5, 1Η), 9.14 (ά, Ι=2.0Ηζ, 1Η), 11.08 (5,1Η).

Получение соединения 1 из соединения 108-2.

К суспензии соединения 108-2 (31 г; 61,1 ммоль) в дихлорметане (310 мл) при комнатной температуре добавили вышеупомянутый свежеприготовленный раствор гидроксиламин метанола (1,79М; 744 мл). Реакционную колбу запечатали, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционная смесь превратилась в прозрачный раствор. Реакционный раствор профильтро- 24 022434 вали, чтобы удалить любое нерастворимое твердое вещество. Затем к фильтрату добавили воду (310 мл) и во время добавления твердое вещество не образовалось. Добавили уксусную кислоту (18,5 мл) чтобы отрегулировать значение рН до 10,20 (под непрерывным контролем рН-метра) при перемешивании. Внутренняя температура не изменялась во время добавления уксусной кислоты. Полученную реакционную смесь продолжали перемешивать в течение следующих 4 ч. Постепенно образовывался белый твердый осадок. Суспензию профильтровали и промыли минимальным количеством метанола (100 мл х 3). Собранное белое твердое вещество ресуспендировали в метаноле (620 мл) и воде (124 мл) до получения суспензии. К вышеуказанной суспензии дополнительно добавили уксусную кислоту (11 г) до получения значения рН 5-6. Наблюдалось изменение твердой формы. Суспензию продолжали перемешивать в течение следующих 2 часов, профильтровали через бумажный фильтр и промыли минимальным количеством метанола (100 мл х 3). Собранное белое твердое вещество высушили в сушильном шкафу (50°С) в течение 12 час до получения титульного соединения 1 в виде белого твердого вещества (23,6 г; 76,0%). т. р.: 255-259°С. ЬСМ8 (т/ζ): 509.3 [М+1]+. 'II ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Θ-ά₆): 5 3.24 (5, 3Н), 3.76 (1, 1= 5.2 Ηζ, 4Н), 3.92 (1, 1= 5.2Ηζ, 4Н), 3.92 (5, 3Н), 5.20 (5, 2Н), 6.91 (ά, 1 = 8.4Ηζ, 1Н), 7.45 (5, 1Н), 8.57 (άά, 1= 8.4Ηζ, 2.4 Ηζ, 1Н), 8.75 (5, 2Н), 9.07 (5, 1Н), 9.14 (ά, 1=2.4 Ηζ, 1Η), 11.14 (5, 1Η).

Пример 2. Получение Ы-гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2^]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамид метансульфоната (соединение 2).

Метод А. К смеси соединения 1 (300 мг; 0,59 ммоль) и МеОН/Е1₂О (3/1, 40 мл) добавили раствор метансульфоновой кислоты (114 мг; 1,18 ммоль) в МеОН (3 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 3 ч. Осадок собрали фильтрованием и промыли Е1₂О с получением соединения 2 в виде белого твердого вещества (260 мг; 73%).

Метод В. К суспензии соединения 1 (1,5 г; 2,95 ммоль) в дихлорметане/ МеОН (40 мл/ 10 мл) добавили метансульфоновую кислоту (341 мг; 3,55 ммоль) в 2 мл МеОН при комнатной температуре (15°С) до образования прозрачного раствора. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционная смесь по-прежнему оставалась прозрачной. К смеси добавили этилацетат (40 мл) и продолжали перемешивать в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученный осадок собрали фильтрованием с получением соединения 2 в виде белого твердого вещества (1,45 г; 83%).

Т.пл.: 179-185°С. ЬСМ8: 509.3 [М+1]+. Ή ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 2.35 (5, 3Н), 3.26 (5, 3Н), 3.78 (ΐ, 1= 9.6 Ηζ, 4Η), 3.95 (5, 3Η), 4.03 (ΐ, 1= 9.2 Ηζ, 4Η), 5.24 (5, 2Η), 6.99 (ά, 1= 8.8 Ηζ, 1Η), 7.50 (5, 1Η), 8.54 (άά, 1= 8.8 Ηζ, 2.4 Ηζ, 1Η), 8.76 (5, 2Η), 9.12 (ά, 1 = 2.4 Ηζ, 1Η), 11.11 (Ьг, 1Η).

Пример 3. Получение Ы-гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2^]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамида натриевой соли (соединение 3).

К суспензии соединения 1 (300 мг; 0,59 ммоль) в метаноле (30 мл) при 0°С медленно добавили третΒιιΟΝα (85 мг; 0,88 ммоль). Полученную смесь нагрели до комнатной температуры и продолжали перемешивать в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали, осадок измельчили и промыли этанолом, а затем профильтровали с получением соединения 3 в виде белого твердого вещества (230 мг; 73%). Т.пл.: 178-183°С. ЬСМ8: 509.3 [М+1]+. 'II ЯМР (400 ΜΗζ, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 3.17 (5, 3Н), 3.75 (5, 4Н), 3.92 (5, 7Н), 5.16 (5, 2Н), 6.90 (ά, 1= 8.4 Ηζ, 1Η), 7.42 (5, 1Η), 8.57 (ά, 1= 8.0 Ηζ, 1Η), 8.65 (5, 2Η), 9.14 (5, 1Η).

Пример 4. Получение ^гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2^]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамида калиевой соли (соединение 4).

К смеси соединения 1 (400 мг; 0,78 ммоль) в метаноле (50 мл) добавили трет-ВиОК (132 мг; 1,17 ммоль) при 0°С в атмосфере Ν2. Смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч и продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Нерастворимое твердое вещество удалили фильтрованием, а фильтрат охладили до -20°С. Добавили к фильтрату Е1₂О (100 мл). Реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 1 ч. Добавили гексан (70 мл) и продолжали перемешивать смесь при -20°С в течение 2 часов. Твердое вещество собрали фильтрованием и высушили в вакууме с получением соединения 4 в виде белого твердого вещества (150 мг; 35%). Т.пл.: 174-179°С. ЬСМ§: 509.3[М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ОМ8ОЦ₆): δ 3.16 (5, 3Н), 3.74-3.76 (т, 4Н), 3.90-3.93 (т, 7Н), 5.15 (5, 2Н), 6.90 (ά, 1= 8.4Ηζ, 1Н), 7.43 (5, 1Н), 8.39 (Ьг, 1Н), 8.58 (ά, 1 = 8.8Ηζ, 1Н), 8.62 (5, 2Н), 9.15 (5, 1Н).

Пример 5. Получение ^гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2^]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамида холиновой соли (соединение 5).

К раствору соединения 1 (200 мг; 0,39 ммоль) в ЭСМ/МеОН (60 мл/12 мл) добавили гидроксид холина (106 мг; 0,39 ммоль, 45% в МеОН). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем концентрировали, чтобы удалить ~ 30 мл растворителя. Добавили этилацетат (60 мл) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. После появления небольшого количества осадка смесь концентрировали, чтобы удалить ~ 40 мл растворителя, и дополнительно добавили этилацетат (60 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и профильтровали с получением соединения 5 в виде белого твердого вещества (180 мг; 76%). Т.пл.: 181-185°С. ЬСМ§: 509.3[М+1]+. 'Н ЯМР (400 ΜΗζ, ОМ8ОЦ₆): δ 3.11 (5, 9Н), 3.17 (5, 3Н), 3.40 (ΐ, 1= 4.8 Ηζ, 2Н), 3.75 (ΐ, 1= 4.8 Ηζ, 4Η), 3.84 (Ьг, 2Η), 3.90-3.93 (т, 7Η), 5.15 (5, 2Η), 6.89 (ά, 1= 8.8 Ηζ, 1Η), 7.41 (5, 1Η), 8.57 (άά, 1= 8.8 Ηζ, 2.4 Ηζ, 1Η), 8.64 (5, 2Η), 9.14(ά,1=2.0 Ηζ, 1Η).

- 25 022434

Пример 6. Получение Ы-гидрокси-2-(((2-(6-метоксипиридин-3-ил)-4-морфолинотиено[3,2-й]пиримидин-6-ил)метил)(метил)амино)пиримидин-5-карбоксамид сульфата (соединение 6).

К суспензии соединения 1 (200 мг; 0,39 ммоль) в ^СΜ/ΜеΟΗ (30 мл/7,5 мл) добавили серную кислоту (77 мг; 0,79 ммоль, в 1 мл МеОН) с образованием прозрачного раствора. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Появлялся осадок, затем добавили третбутилметиловый эфир (60 мл). Полученную смесь продолжали перемешивать в течение 1 ч при комнатной температуре. Твердое вещество собрали фильтрованием с получением соединения 6 в виде белого твердого вещества (180 мг; 76%). Т.пл.: 243-246°С. ^Μ8: 509.3 [М+1]+. ^!Н ЯМР (400 Μ^ ΌΜ8Ο-4₆): δ 3.26 (5, 3Н), 3.78 (ΐ, ί = 4.8 Щ 4Н), 3.96 (5, 3Н), 4.03 (ΐ, ί = 4.4 Щ 4Н), 5.24 (5, 3Н), 6.98 (4, ί = 8.4 Н, 1Н), 7.50 (5 , 1Н), 8.54 (άά, ί = 8.8 Щ 2.4 Н, 1Н), 8.76 (5, 2Н), 9.12 (4, ί = 2.0 Н, 1Н), 11.06 (Ьг.1Н).

Пример 7. Исследование активности ΡΙ3 киназы.

Для определения способности соединения 1 ингибировать различные изоформы и мутанты ΡΙ3Κ были использованы следующие методы анализа.

ΡΙ3Κα

Активность ΡΙ3Κα была измерена с помощью люминесцентного метода анализа активности киназы Α^Ρ-С1ο. ΡΙ3Κα, комплекс из Ν-концевого С8Т-меченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р110а и немеченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р85а был коэкспрессирован в инфицированной бакуловирусом 8Г9 системе клеточной экспрессии (СепВапк, инвентарный номер для ρ110α - И79143; для р85а - ХМ_043865). Белки были очищены с помощью одностадийной аффинной хроматографии с использованием глутатион-агарозы. Был проведен конкурентный анализ, чтобы измерить количество АДФ, произведенного из АТФ, в присутствии очищенной рекомбинантной ΡΙ3Κα (р110а/р85а) и ΡΙΡ2. ΡΙ3Κα инкубировали с 20 мкМ ΡΙΡ2 субстрата в рабочем буферном растворе (50 мМ №ΡΕ8, рН 7,4, 150 мМ №С1, 5 мМ ΜβΟ₂. 3 мкМ ортованадата Να, 1 мМ ЭТТ, 10 мкМ высокой очистки АТФ и 0,5% 3Μ8Ο) в течение 30 мин при 30°С. Затем количество полученного при реакции АДФ измеряли с помощью метода анализа Α^Ρ-С1ο. Исследование проводили в два этапа; сначала добавили равный объем реактива Α^Ρ-С^Ο™ (Ρ^οтеда) для завершения киназной реакции и истощения оставшейся АТФ. На второй стадии добавили реагент для обнаружения киназы, который одновременно превращает АДФ в АТФ. Вновь синтезированную АТФ измерили с использованием совместной реакции люцифераза/люциферин. Значение Ю₅₀, определенное для соединения 1 в этом анализе, составляло менее 100 нМ.

С помощью описанного выше общего метода также была определена способность соединения 1 ингибировать мутанты ΡΙ3Κα - Н1047К и Ε545Κ. Значение Κ₅₀, определенное для обоих мутантов, оказалось 100 нм.

ΡΙ3Κβ

Активность ΡΙ3Κβ была измерена с помощью метода резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (ТК-РКЕТ) с использованием флуоресцентной технологии (НТКР) с временным разрешением. ΡΙ3Κβ, комплекс из Ν-концевого гистидин-меченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р110в и немеченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р85а был коэкспрессирован в инфицированной бакуловирусом 8Г21 системе клеточной экспрессии (СепВапк, инвентарный номер для р110в - ΝΜ_006219; для р85а - ХМ_043865). Белки были очищены с помощью одностадийной аффинной хроматографии с использованием глутатион-агарозы. Был проведен конкурентный анализ, чтобы измерить количество АДФ, получаемой из АТФ, в присутствии очищенной рекомбинантной РЭЮета (ρ110β/ρ85α). ΡΙ3Κβ инкубировали с 10 мкМ ΡΙΡ2 субстрата в рабочем буферном растворе (20 мМ IΙΕΡΕ8. рН 7; 10 мМ №С1, 4 мМ Μ§α₂, 2 мМ ЭТТ, 10 мкМ АТР и 1% 1)\18О) в течение 30 мин при 30°С. Затем продукт реакции смешали с ΡΙΡ3 детекторным белком, меченым европием антителом, биотин-меченым ΡIΡ3-образцом и аллофикоцианин-меченым стрептавидином. Образуется сенсорный комплекс, генерирующий стабильный ТК-РКЕТ сигнал в реакционной смеси. Интенсивность этого сигнала уменьшается, так как ΡΙΡ3, который вырабатывается при ферментативной активности, заменяет связывание биотин-меченого образца с ΡIΡ3-детектором, и количество несвязанного биотинмеченого ΡΙΡ3 образца в смеси увеличивается. Сигнал ТК-РКЕТ определяли с помощью ридера для микропланшетов (фоновое значение вычитали).

Значение ГС50, определенное для соединения 1 в этом исследовании, составляло от 100 до 1000 нМ.

ΡΙ3Κδ

Активность ΡΙ3Κδ была измерена с помощью метода флуоресцентной поляризации. ΡΙ3Κδ, комплекс из Ν-концевого гистидин-меченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р110δ и немеченого рекомбинантного полноразмерного человеческого р85а был коэкспрессирован в инфицированной бакуловирусом 8Г9 системе клеточной экспрессии. (СепВапк, инвентарный номер для ρ110δ ΝΜ_005026). Белки очищали с помощью одностадийной аффинной хроматографии с использованием глутатион-агарозы. Был проведен конкурентный анализ, чтобы измерить количество ΡΙΡ3, произведенного из ΡΙΡ2, в присутствии очищенной рекомбинантной ΡΙ3Κδ (р110δ/р85α). ΡΙ3Κδ инкубировали с 10

- 26 022434 мкМ ΡΙΡ2 субстрата в рабочем буферном растворе (20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5), 10 мМ ЫаС1, 4 мМ М§С1₂, 2 мМ ΌΤΤ, 10 мкМ АТР и 1% ΌΜ8Θ) в течение 1 ч при 30°С. Затем продукт реакции смешали с ΡΙΡ3 детекторным белком и флуоресцентным ΡΙΡ3 образцом. Величина поляризации (ιηΡ) уменьшается, так как связывание флуоресцентного образца с ΡΙΡ3 -детектором заменяется ΡΙΡ3, который вырабатывается при ферментативной активности, и количество несвязанного флуоресцентного образца в смеси увеличивается. Величину поляризации (ιηΡ) определяли с помощью ридера для микропланшетов (фоновое значение вычитали).

Значение Ι^₀, определенное для соединения 1 в этом исследовании, составляло меньше чем 100 нМ.

ΡΒΚγ

Активность ΡΙ3Κγ была измерена с помощью метода резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (ΤΚ-ΡΚΕΤ) с использованием флуоресцентной технологии (НТРЕ) с временным разрешением. Ν-концевая гистидин-меченая человеческая ΡΙ3Κδ была экспрессирована в инфицированной бакуловирусом 8Г9 системе клеточной экспрессии (ОепВапк, инвентарный номер ΑΕ327656). Белки были очищены с помощью одностадийной аффинной хроматографии с использованием глутатионагарозы. Был проведен конкурентный анализ, чтобы измерить количество ΡΙΡ3, произведенное из ΡΙΡ2 в присутствии очищенной рекомбинантной ΡΙ3Κγ φ120γ). ΡΙ3Κγ (2 нМ) инкубировали с 10 мкМ ΡΙΡ2 субстрата в рабочем буферном растворе (20 мМ ΗΕΡΕ8, рН 7,5; 10 мМ №С1, 4 мМ М§С1₂, 2 мМ ΌΤΤ, 10 мкМ АТР и 1% ΌΜ8Θ) в течение 30 мин при 30°С. Затем продукт реакции смешали с ΡΙΡ3 детекторным белком, меченым европием антителом, биотин-меченым ΡIΡ3-образцом и аллофикоцианин-меченым стрептавидином. Образуется сенсорный комплекс, генерирующий стабильный ΤΚ-ΡΚΕΤ сигнал в реакционной смеси. Интенсивность этого сигнала уменьшается, так как ΡΙΡ3, который вырабатывается при ферментативной активности, заменяет связывание биотин-меченого образца с ΡIΡ3-детектором, и количество несвязанного биотин-меченого ΡΙΡ3 образца в смеси увеличивается. Сигнал ΤΚ-ΡΚΕΤ определяли с помощью ридера для микропланшетов (фоновое значение вычитали).

Значение !С50, определенное для соединения 1 в этом исследовании, составляло от 100 до 1000 нМ.

Пример 8. Исследование активности ΗΌΑΟ

НОАС-ингибирующая активность была оценена с помощью системы Вюто1 Со1ог бе Ьук кук1ет (ΑΚ-500, Вюто1, Ρ1утоиΐЬ Меейпд, ΡΑ). Вкратце, ядерные экстракты клеток НеЬа использовали в качестве источника Η^ΑС. Разные концентрации исследуемых соединений получали путем серийного разведения в диметилсульфоксиде (ΌΜ8Θ) и добавляли к ядерным экстрактам клеток НеЬа в присутствии колориметрического искусственного субстрата. Конечный образец для анализа содержал 50 мМ Трис/С1, рН 8,0; 137 мМ №С1, 2.7 мМ ΚΟ и 1 мМ М§С1₂. Реакции проводили при комнатной температуре (25°С) в течение 1 ч до добавления проявителя для завершения. Относительная активность ферментов была измерена с помощью микропланшетного ридера \νΑΡΕΑί' УюЮг ΙΙ 1420 в виде интенсивности флуоресценции (возбуждение: 350-380 нм; излучение: 440-460 нм). Данные были проанализированы с помощью Отар№ай Ρ^^8т (ν4.0ί·ι) с использованием сигмоидальной кривой доза-эффект, подходящей для вычисления Ю». Значение ТС₅₀, определенное для соединения 1 в этом исследовании, было меньше чем 100 нМ.

Также была определена активность соединения 1 в отношении изотипов Η^ΑС. Исследования специфичности Η^ΑС проводили с помощью прибора ΒΡ8 Вюкиепсе (8ап О1едо, СΑ), следуя стандартной методике работы. Вкратце, очищенные Г1ад- (человеческая Η^ΑС-1), ΝίΌΡ2- (человеческая Η^ΑС3), Ο8Τ- (человеческие Η^ΑС4, 6, 7, 10 и 11) или Н15- (человеческие Η^ΑС 2, 5, 8 и 9) меченые ферменты были экспрессированы в клетках 8Г9 насекомого и очищены перед использованием. Используемым субстратом для Η^ΑС1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 и 11 служил Η^ΑС субстрат 3, разработанный компанией ΒΡ8 ВюксЕ епсе. Для других Η^ΑС ферментов использовали субстрат Η^ΑС Класс 2а. Все ферментативные реакции проводили в двух повторах при 37°С в течение 30 мин, за исключением ферментного анализа Η^ΑС11, который проводили при комнатной температуре в течение 3 ч.

Таблица ниже показывает результаты для каждой из Η^ΑС 1-11, с указанными далее значениями ТС50:1 > 1000 нМ; 100 нМ < ΙΙ< 1000 нМ; 10 нМ < ΙΙΙ< 100 нМ; ГУ < 10 нМ.

НРАС	1	2	3	8	4	5	6	7	9	10	11
1С5о	IV	IV	IV	II	II	II	III	II	II	IV	IV

Пример 9. Исследование клеточной пролиферации.

Линии клеток рака человека получали из Американской коллекции типовых культур (Манасса, Вирджиния) и высевали в количестве от 5000 до 10000 на лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты с культуральной средой, согласно рекомендации поставщика. Затем клетки инкубировали с соединениями в различных концентрациях в течение 72 ч в культуральной среде с добавлением 0,5% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8). Ингибирование роста оценивали с помощью метода анализа содержания аденозинтрифосфата (АТР), используя набор Ρ^отеда Се1ГП1ет-О1о. Набор Ρ^отеда Се1ГП1етО1о представляет собой систему регистрации АТФ с использованием люциферазы светлячков. Вкратце, чтобы лизировать клетки и стабилизировать АТФ, в лунку с 84 мкл культуральной среды добавили 16 мкл лизированных клеток (се11 1ίδίδ) млекопитающего и субстратного раствора. Смесь встряхивали и ин- 27 022434 кубировали в течение 30 минут, после этого была измерена люминесценция. Значения 1С50 вычисляли с помощью программного обеспечения ΡΚΙ3Μ (СтарЬРаб Зой^ате) с использованием сигмоидальной кривой доза-эффект.

Таблица 1 показывает антипролиферативную активность в этих анализах с использованием клеток соединения 1 и контрольных соединений ЗАНА, СПС-0941 и комбинации ЗАНА и СПС-0941. В этих анализах использовали следующее обозначение: I > 10,000 нМ, 10,000 нМ > II > 1000 нМ, 1000 нМ > III > 100 нМ, 100 нМ > IV > 10 нМ и V < 10 нт для ГС».

Таблица 1

Тип линии раковых клеток	ЗАНА	ООС- 0941	ЗАНА/ СОС0941	Соед. 1
Толстая кишка	\\ΊΟγ	II	I	III	IV
НСТ116	II	II	III	V
53У403	II	I	II	V
5\У620	II	I	III	V
83У1-116	и	I	п	V
Т-84	И	п	III	IV
чкстс	Η358	II	II	II	V
Η292	II	и	III	V
Η2122	II	и	III	V
Η460	I	I	II	IV
Α549	II	II	II	IV
Са1и6	II	I	II	IV
Поджелудочная железа	М1аРаса2	п	I	II	IV
СаРап2	II	I	III	IV
СРРАС-1	II	I	II	IV
РА14С-1	II	II	II	IV
ЗШ1990	и	I	II	V
Молочная железа	НСС1500	н	I	II	V
НСС1806	II	I	II	IV
МОА-МВ-231	II	I	II	IV
ЗКВгЗ	п	I	II	IV
ΒΤ474	II	III	III	V
ΜΰΑ-ΜΒ-361	II	III	IV	V
НАСС-893	II	п	III	IV
ΜϋΑ-ΜΒ-453	III	III	III	V
МСР-7	II	III	III	V
Τ47Ο	II		III	IV
ΖΚ.-75-1	II	III	п	IV
МОА-МВ-468	II	III	II	IV
ΑΙΧ	ΜΟΙ.Τ-4	III	III	III	V
5ЦР-В15	III	II	III	V
АМЬ	НЬ-60	III	III	III	V
и937	III	II	III	V
ТНР-1	I	II	III	IV
МУ-4-11	III	II	III	V
В-клеточная лимфома	РГеЛГег	II	ш	III	V
Кап	п	I	и	IV
кь	III	II	III	V
ΏΟΗΗ2	III	IV	IV	V
Сгап1а 519	II	I	III	V
5ч-ОНЬ4	II	III	III	V
ОаисН	и	I	III	IV
Т-клеточная лимфома	НН	III	III	III	V
ш	III	I	III	V
НиТ78	IV	III	IV	V
смь	К562	II	п	III	IV
МЕО-01	II	I	II	V

Тип линии раковых клеток	ЗАНА	СЮС- 0941	ЗАНА/ ΟϋΟ0941	Соед.1
Множественная миелома	ΚΡΜΙ-8226	II	I	III	V
ОРМ-2	III	IV	III	V
АКН77	и	I	III	V

Пример 10. Композиции соединения 1.

a. Соединение 1 в 30% каптисоле (10 мг/мл).

Во флакон, содержащий соединение 1 (10 мг), добавили 30% каптисол (0,937 мл). Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин. К смеси добавили гидроксид натрия (1 Ν; 39,3 мкл; 2 экв.) и обрабатывали ультразвуком, перемешивая на вортексе, до получения прозрачного раствора (рН 12). Затем регулировали значение рН раствора до 10 с помощью соляной кислоты (1Ν; 23,6 мкл; 1,2 экв.).

b. Соединение 1 в 30% каптисоле (7,5 мг/мл).

Во флакон, содержащий соединение 1 (7,5 мг), добавили 30% каптисол (0,941 мл). Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин. К смеси добавили гидроксид натрия (1 Ν; 29,5 мкл; 2 экв.) и обрабатывали ультразвуком, перемешивая на вортексе, до получения прозрачного раствора (рН 12). Затем регу- 28 022434 лировали значение рН раствора до 5 с помощью соляной кислоты (1Ν; 29,5 мкл; 2 экв.).

с. Соединение 1 в С10/РЕ01450/РЕ0400 (5 мг/мл).

Во флакон, содержащий соединение 1 (5 мг), деканоат натрия (20 мг), РЕ0400 (40 мкл) и РЕО1450 (40 мг) добавили Н₂О (0,88 мл) и Ν;·ιΟΗ (1 Ν, 24,6 мкл; 2,5 экв.). Смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали на вортексе до получения прозрачного раствора, затем регулировали значение рН раствора до 10 с помощью НС1 (1Ν; 7,4 мкл; 0,75 экв.).

Пример 11. Исследование фармакокинетики и фармакодинамики на мышах-опухоленосителях.

Бестимусные мыши с опухолью Н2122.

Для фармакокинетических исследований использовали бестимусных мышей с ксенотрансплантатом опухоли Н2122 (линия клеток немелкоклеточного рака легкого человека). Составляли смесь соединения 1 в воде с деканоатом натрия и РЕ0400 (5 мг/мл) и вводили перорально (РО) через зонд каждому животному в дозе 50 мг/кг. В разные моменты времени после введения соединения подвергали эвтаназии с использованием СО2 трех мышей (на временную точку) и брали для анализа кровь и опухолевые ткани. Кровь собирали в пробирки, содержащие гепарин натрий. Плазму отделяли центифугированием. Плазму и ткани хранили при -80°С для последующих анализов. Для анализа концентраций соединения в плазме и опухолевых тканях использовали систему РЕ 8аех АР1-3000 ЬС-Μδ/Μδ (АррБей ВюзузЮтз, 1пс., Роз!ег СБу, СА).

Результаты этого исследования суммированы на фиг. 1 и в табл. 2, ниже. Фиг. 1 - график концентрации соединения 1 в плазме и опухолевой ткани в зависимости от времени после перорального введения. Результаты показывают, что соединение 1 преимущественно накапливается в опухолевой ткани. Это подтверждается результатами, представленными в табл. 3, которые показывают значительно более длительный период полужизни соединения 1 в опухолевой ткани, чем в плазме, а также значительно большее время воздействия (экспозицию) соединения 1 (АИС) на опухолевую ткань.

Таблица 2

Параметр	Плазма	Опухоль
Период полувыведения (часы)	5,9	10,1
С„акс (НГ/МЛ)	186	154
Площадь под кривой (нг/мл*час)	478	2126
Биодосгупность (%)	7,8	14,8

Мыши 8СГО с опухолями Дауди.

Клетки Дауди (линия клеток неходжкинской лимфомы) прививали самкам мышей δαά (мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом). После образования опухолей животным вводили перорально с помощью зонда 25, 50 или 100 мг/кг соединения 1, в 30% каптисоле, рН 10, при концентрации 1,875; 3,75 или 7,5 мг/мл, соответственно.

В разные моменты времени после введения соединения подвергали эвтаназии с использованием СО2 трех мышей на каждую временную точку и брали для анализа кровь и опухолевые ткани. Кровь собирали в пробирки, содержащие гепарин натрий. Плазму отделяли центифугированием. Плазму и ткани хранили при -80°С для последующих анализов. Для анализа концентраций соединения в плазме использовали систему РЕ 8с1ех АР1-3000 ЬС-Μδ/Μδ (АррБеБ ВюзузЮтз, 1пс., Роз!ег СБу, СА).

Результаты этого исследования суммированы на фиг. 2А, 2В и 2С и в табл. 3, ниже. Фиг. 2А представляет собой график концентрации соединения 1 в плазме в зависимости от времени после перорального введения и показывает, что воздействие соединения зависит от дозы. Фиг. 2В представляет собой график концентрации соединения 1 в опухолевой ткани в зависимости от времени после перорального введения. Результаты показывают, что соединение 1 преимущественно накапливается в опухолевой ткани дозо-зависимым образом. Концентрации в плазме и опухоли после введения дозы 100 мг/кг сравниваются на фиг. 2С, которая показывает, что опухолевая ткань преимущественно поглощает соединение 1. Это подтверждается результатами, представленными в табл. 3, которые показывают значительно более длительный период полужизни соединения 1 в опухолевой ткани, чем в плазме, а также значительно большее время воздействия (экспозицию) соединения 1 (АИС) на опухолевую ткань.

Таблица 3

Параметр	Плазма	Опухоль
Период полувыведения (часы)	7,73	12,62
Смаке (НГ/МЛ)	2285,39	1044,7
Площадь под кривой (нг/мл*час)	1899,26	3973,56
Тмакс (ч)	0,24	0,10

- 29 022434

Фармакодинамика

Для оценки фармакодинамики (ΡΌ) опухоли извлекали после обработки однократной дозой соединения 1 25, 50 и 100 мг/кг. Белок экстрагировали из опухолевых тканей с использованием Т188ие1у8ег (Οίадеи, Уа1еис1а, СА) в соответствии с инструкциями производителя. Обычно использовали 30 мкг белка для ^В-анализа, как описано выше. Клеточные лизаты разгоняли с использованием гелей NиΡАСЕ №уех 4-12% В18-Тг18 де1з (1иубгодеи) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Вю-Каб БаЬогаЮпе5, Негси1е8, СА). Блоты окрашивали разными первичными антителами в течение ночи при 4°С. САРЭН (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, 1:30,000, АЬеат, СатЬпбде, МА) использовали в качестве внутреннего контроля для каждого анализа. Затем мембраны инкубировали с инфракрасно-мечеными вторичными антителами (1:10000), конъюгированными с 1К Эуе-800 (Коск1аиб 1ттииосйет1са18, 1ис. СбЬейзуШе, РА) или конъюгированными с А1еха 680 Циубгодеи). Мембраны визуализировали с помощью системы Обуззеу 1иГгагеб 1тадшд 8у51ет (Ы-Сог В1о1есЬио1оду, Ьтсо1и, ΝΞ).

Результаты этого исследования представлены на фиг. 3, которая показывает результаты вестернблоттинга экстрактов опухолевой ткани от трех групп с разными дозами. Эти результаты показывают, что соединение 1 ингибирует путь Р13К-АКТ-тТОК, подавляет пути КАР-МЕК-ЕКК, понижает уровни белка КТК и повышает уровни белков-супрессоров опухолей р53 и р21.

Пример 12. Фармакокинетические исследования на собаках.

Также проводили фармакокинетическое исследование соединения 1 на собаках породы бигль, используя внутривенное введение дозы 5 мг/кг в воде с деканоатом натрия/РЕС400 (5 мг/мл) и пероральное введение дозы 5 мг/кг с деканоатом натрия /РЕС4000/РЕС1450 (рН 10) в энтеральные капсулы. Плазму собирали в разные моменты времени и определяли концентрацию соединения 1 с помощью БС-М8/М8. Результаты исследования показаны на фиг. 4 и в табл. 4 ниже. Фиг. 4 - это график концентрации в плазме в зависимости от времени при пероральном и внутривенном введении. При пероральном введении в плазме достигаются значительные уровни соединения 1.

Таблица 4

Параметр	IV	РО капсула
Период полувыведения (часы)	1,85	4,88
Смаке (нг/мл)	6156,16	312,1
Площадь под кривой (нг/мл*час)	2977,47	450,4
Биодоступность(%)		15,1

Пример 13. Фармакокинетическое исследование на крысах.

Целью этого исследования было определение фармакокинетики соединения 1 в плазме у самцов крыс 8ргадие-ЭаМеу после перорального введения соединения 1.

Соединение 1 растворили в 30% каптисоле в воде с получением концентрации 10 мг/мл (рН 10) для перорального введения. Полученный прозрачный желтый раствор хранили при комнатной температуре до применения.

В этом исследовании использовали трех самцов крыс 8ргадие-ЭаМеу из лаборатории СЬаг1е8 Куег. Рацион с высоким содержанием жира (ΑΉΡΌ, Ό12492ί) от Кезеагсб Ю1е15 1ис. предоставлялся в неограниченном режиме на протяжении прижизненной части исследования. Соединение 1 вводили однократно с помощью перорального зонда (РО) в дозе 20 мг/кг.

Образцы крови (примерный объем 150 мкл) собирали из хвостовой вены через 0,25, 0,5; 1, 3, 6 и 24 часа после введения дозы. Образцы крови помещали в пробирки, содержащие гепарин натрий и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 6 мин при 4°С, чтобы отделить плазму от образцов. После центрифугирования полученную плазму переносили в чистые пробирки и хранили в замороженном виде при -80°С для дальнейших биоанализов.

Концентрации соединения 1 и его первичного метаболита в образцах плазмы определяли с помощью системы РЕ 8с1ех АР1-3000 БС-М8/М8 (РЕ-8с1ех., РоМег Сбу, СА).

Фармакокинетические параметры определяли из средних показателей концентрация-время у исследуемых субъектов. Для вычисления параметров использовали компартментное моделирование ^ΙΝΝΟΝΣΙΝ® РгоГе881оиа1 5.2. Любые концентрации ниже предела количественного определения (нижний количественный предел = 1 нг/мл) были исключены из вычисления параметров у отдельных животных.

После перорального введения средние значения С_макс и Т_макс соединения 1 составляли 39,5 мкг/л и 0,1 ч, соответственно. Среднее значение АИС(0-да) было 163,6 мкг/л*ч. Значение времени полужизни (Т_1/2) составляло 11,7 ч.

Пример 14. Оценка соединения 1 на моделях с ксенотрансплантатами опухолей.

А. Модели с ксенотрансплантатами опухолей 8и-ЭНЬ4, Н2122, Оаиб| и ОРМ2.

Клетки 8и-ЭНЬ4 (линия клеток диффузной В-крупноклеточной лимфомы), клетки Н2122 (линия клеток Ν8ί'Έί'.' человека), клетки Дауди (линия клеток неходжкинской лимфомы) и клетки ОРМ2 (линия опухолевых клеток множественной миеломы) имплантировали бестимусным мышам или мышам 8с1б (тяжелый комбинированный иммунодефицит). После образования опухолей животных с достаточным

- 30 022434 размером опухолей случайным образом делили на группы - группу для введения активного вещества (соединение 1) и контрольную группу (введение чистого носителя). Соединение 1 было включено в состав для перорального введения, как в примере 7(Ъ), и вводилось с помощью перорального зонда, исходя из веса тела каждого отдельного животного. Контрольные группы обрабатывали носителем, используя те же самые режимы дозирования что и в соответствующих группах с введением активного соединения.

Группа с опухолью Н2122 (бестимусные мыши) сначала получала соединение 1 в дозе 75 мг/кг два раза в день, а затем 50 мг/кг два раза в день, начиная с Дня-11 в течение пяти дней в неделю из-за потери веса тела при дозе 75 мг/кг. В одном исследовании группа с опухолью Дауди (мыши 8сШ) получала соединение 1 в дозах 25, 50 или 100 мг/кг пять дней в неделю. В другом исследовании группа с опухолью Даули получала дозу 50 мг/кг два раза в неделю в течение пяти дней в неделю. В другом исследовании эффективность перорально введенного соединения 1 на модели с опухолью Дауди сравнивали с пероральным введением СЭС-0941 и вориностата, каждого отдельно и в комбинации. Группа с опухолью ОРМ2 получала соединение 1 в дозах 50 мг/кг два раза в день в течение пяти дней в неделю. Группа с опухолью 8И-ЭНЬ4 получала 100 мг/кг перорально или 50 мг/кг внутривенно.

Во время исследования опухоли измеряли с помощью электронного штангенциркуля, а вес тела определяли два раза в неделю. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина X ширина²)/2.

Процент изменения объема опухоли использовали для описания активности соединения в течение периода лечения.

Результаты этих исследований суммированы на фиг. 5А-5С и 9-12, которые показывают размер опухоли в зависимости от времени для группы с введением активного соединения и контрольной группы для каждого из типов опухоли. Фиг. 5А, 5В, 5С и 12 показывают, что соединение 1 является эффективным на опухолевых моделях Н2122, Дауди и ОРМ2. Как показано на фиг. 9, соединение 1 ингибировало рост опухоли Дауди дозо-зависимым образом. Фиг. 10 сравнивает противоопухолевую активность соединения 1 в дозе 100 мг/кг на модели с опухолью Дауди с моделью СЭС-0941 или вориностата в отдельности или в комбинации. Указанные дозы являются максимально переносимой дозой (МТЭ) для каждого вида лечения, при этом размер опухоли до лечения составлял 157±65 мм³ (среднее ± 8Е). Результаты показывают, что соединение 1 является более эффективным, чем вориностат, СЭС-0941, или их комбинация. Наконец, соединение 1 сильно ингибировало рост опухоли на модели ксенотрансплантата диффузной В-крупноклеточной лимфомы 8и-ЭНЬ4 после внутривенного введения (Ιν) в дозе 50 мг/кг или перорально (РО) в дозе 100 мг/кг (фиг. 11). Размер опухоли до лечения был 147±21 мм³.

Модель ксенотрансплантата ММ18

Самок мышей 8СГО/Ве1де в возрасте 4 недель содержали в проветриваемых микроизолированных клетках (ГНКОСАСЕ®^С, ΙηηονίνΌ Ιικ.. 8ап Э1едо, СА) с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (ТгоЫаЪ-КМН 2000) ай ПЪПит и обеспечивали стерильной водой. Все клетки и питание для мышей 8СГЭ/Ве1де стерилизовали автоклавированием перед использованием. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Клетки ММ человека ММ Ι8 (Со1йтап-Ье1кт КЕ, е! а1., ί ЬаЪ С’Пп Ιηνοδί. 1980;1 13:335-345) первоначально были получены из периферической крови пациентов с множественной миеломой. Замороженные клетки оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде КΡМI плюс 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8) в инкубаторе для культур тканей при 5% СО₂. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью МАΡ теста, на выработку мышиных антител). Когда клеток в культуре становилось достаточно для имплантации, их промывали безсывороточным сбалансированным солевым раствором Хенкса (НВ88). В заключение клетки разводили в НВ88 для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью клеток больше, чем 90%, (метод вытеснения трипанового синего). Затем 20 миллионов клеток, суспендированных в 0,2 мл НВ88, вводили каждому животному подкожно в область правого заднего паха минимум после 7 дневного периода акклиматизации, используя 1СС шприц с гиподермальной иглой 26С и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли поддавались обнаружению примерно через 2 недели после имплантации. Размер опухоли измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

Через три недели после имплантации опухоли достигали в среднем размера 194,6±37,9 мм³. Животных с подходящим размером и формой опухоли делили случайным образом на две группы по восемь животных в каждой группе, используя программу для сортировки, одну группу с введением носителя и

- 31 022434 одну лечебную группу.

Соединение 1 заключали в композицию и вводили, как указано далее: 7,5 мг/мл растворяли в 30% каптисоле с 2 эквивалентами №ГОН и НС1 (каждого) и вводили перорально с помощью зонда каждый день пять раз в неделю, исходя из веса тела каждой мыши. Контрольной группе вводили носитель (30% каптисол) в том же режиме дозирования.

Во время исследования объем опухоли у каждого животного измеряли штангенциркулем, размер опухоли определяли с помощью указанной выше формулы и вычисляли изменение размера опухоли в процентах. Для определения веса тела мышей взвешивали два раза в неделю. Исследование продолжалось до или: а) наступления заранее определенной даты окончания в плане исследования; или Ь) начала проблем со здоровьем, в зависимости от того, что произойдет раньше. В дополнение к этому, основанием для эвтаназии служили следующие, связанные с опухолью, параметры: (1) масса опухоли, превышающая 2500 мм³, и/или (2) потеря >20% исходного веса тела. В дополнение к определению изменений размера опухоли, последнее измерение опухоли использовали для получения отношения изменения веса опухоли (значение Т/С), стандартного показателя, разработанного Национальным институтом рака (Νί'Ί) для оценки ксенотрансплантатов опухолей, значения Т/С вычисляли, используя следующую формулу:

% Т/С = 100 X ДТ/ДС, если ДТ > 0.

Однако, в тех случаях, когда наблюдалась регрессия опухолей, использовали следующую формулу: % Т/Т₀ = 100 х ДТ/Т0, если ДТ < 0.

Лечебный период продолжался 15 дней. Размер опухоли и вес тела опять измеряли в последний день исследования.

Как показано на фиг. 13, монотерапия соединением 1 ингибировала рост опухоли на подкожной модели ММ1§. Значения Т/С составляли 27,37% (р<0,0001, ΑΝΟνΑ) на день 14. Не наблюдалось потери веса тела и других побочных эффектов в лечебной группе с монотерапией соединением 1.

Модель ксенотрансплантатаММ1К

Самок мышей §СГО/Ве1де в возрасте 4 недели содержали в проветриваемых микроизолированных клетках (INNΟСΑΟΕ®IVС, 1пиоу1уе 1пс., §аи И1едо, СА) с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (РгоЬ1аЬ-КМН 2000) аД ПЬЯнт и поили стерильной водой. Все клетки и питание для мышей §СГО/Ве1де стерилизовали автоклавированием перед использованием. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Клетки ММ человека ММ1К первоначально были получены из периферической крови пациентов с множественной миеломой (ОоМтап-Ье1кт КЕ, е! а1., 1 ЬаЬ СПп 1иуе8П 1980, 113:335-345). Замороженные клетки оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде КРМ1 плюс 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ§) в инкубаторе для культур тканей при 5% СО₂. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью МАР теста, на выработку мышиных антител). Когда клеток в культуре становилось достаточно для имплантации, их промывали безсывороточным сбалансированным солевым раствором Хенкса (НВ§§). В заключение клетки разводили в НВ§§ для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью клеток больше, чем 90%, (метод вытеснения трипанового синего), затем 15 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл НВ§§, вводили каждому животному подкожно в область правого заднего паха минимум после 7 дневного периода акклиматизации, используя 1СС шприц с гиподермальной иглой 260 и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли обнаруживались примерно через 2 недели после имплантации. Размер опухоли измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

Через три недели после имплантации опухоли достигали в среднем размера 131,7±28,7 мм³. Животных с подходящим размером и формой опухоли делили случайным образом на две группы по восемь животных в каждой группе, используя программу для сортировки, одну группу с введением носителя и одну лечебную группу.

Соединение 1 заключали в композицию и вводили, как указано далее: 7,5 мг/мл растворяли в 30% каптисоле с 2 эквивалентами №ГОН и НС1 (каждого) и вводили перорально с помощью зонда каждый день пять раз в неделю, исходя из веса тела каждой мыши. Контрольной группе вводили носитель (30% каптисол) в том же режиме дозирования.

Во время исследования объем опухоли у каждого животного измеряли штангенциркулем, размер опухоли определяли с помощью указанной выше формулы и вычисляли изменение размера опухоли в процентах. Для определения веса тела мышей взвешивали два раза в неделю. Исследование продолжа- 32 022434 лось до или: а) наступления заранее определенной даты окончания в плане исследования; или Ь) начала проблем со здоровьем, в зависимости от того, что произойдет раньше. В дополнение к этому, основанием для эвтаназии служили следующие, связанные с опухолью, параметры: (1) масса опухоли, превышающая 2500 мм³, и/или (2) потеря >20% исходного веса тела. В дополнение к определению изменений размера опухоли, последнее измерение опухоли использовали для получения отношения изменения веса опухоли (значение Т/С), стандартного показателя, разработанного Национальным институтом рака (ΝΟ!) для оценки ксенотрансплантатов опухолей, значения Т/С вычисляли, используя следующую формулу:

% Т/С = 100 X ΔΤ/ДС, если ΔΤ > 0.

Однако, в тех случаях, когда наблюдалась регрессия опухолей, использовали следующую формулу: % Т/Т₀ = 100 х ΔΤ/Γ0, если ΔΤ < 0.

Лечебный период продолжался 18 дней. Размер опухоли и вес тела опять измеряли в последний день исследования.

Как показано на фиг. 14, монотерапия соединением 1 ингибировала рост опухоли на подкожной модели ММ1К. Значения Т/С составляли 21,15% (р<0,0001, ΑΝΟνΑ) на день 17. Не наблюдалось потери веса тела и других побочных эффектов в лечебной группе с монотерапией соединением 1.

Пример 15. Действие соединения 1 на циркулирующие лимфоциты.

Исследование действия соединения 1 на циркулирующие Т и В лимфоциты проводили на мышах дикого типа СИ1. Пяти мышам вводили соединение 1, заключенное в состав, как в примере (Ь), (5 мг/мл) в дозе 100 мг/кг перорально в течение пяти последовательных дней. Другие пять мышей получали чистый носитель. Кровь собирали в разные моменты времени (до введения дозы, во время введения дозы и после введения дозы) из челюстной вены. Количество Т и В-клеток в образцах крови анализировали с помощью проточного питометра.

Также оценивали воздействие соединения 1 на уровни Т и В лимфоцитов в лимфоидных органах, селезенке и лимфатических узлах. Мыши получали соединение 1 перорально в дозе 100 мг/кг в течение пяти последовательных дней. Животных умерщвляли и извлекали лимфоидные органы. Клетки физически отделяли от тканей и анализировали с помощью проточного цитометра. Анти-СЭЗ И анти-СИ19 антитела использовали для окрашивания Т и В клеток, соответственно.

Результаты этих исследований показаны на фиг. 6 - графике, показывающем уровни лимфоцитов в крови в зависимости от времени. Соединение 1 показывает значительное обратимое снижение уровней в крови и Т и В лимфоцитов по сравнению с контролем. Сходное действие на уровни лимфоцитов наблюдалось в селезенке и лимфатических узлах. В этих органах наблюдалось значительное уменьшение и Т и В лимфоцитов после введения дозы соединения 1 по сравнению с контролями.

Пример 16. Действие соединения 1 на гематопоэтические клетки в костном мозге.

У мышей, умерщвленных в примере 12, также извлекали костный мозг. Костный мозг собирали из трубчатых костей мышей и анализировали с помощью проточного цитометра. Для зрелых лимфоцитов и предшественников использовали различные маркеры. Результаты показали, что обработка соединением 1 вызывала, одновременно с уменьшением количества периферических Т и В лимфоцитов, компенсаторное увеличение клеток-предшественников лимфоцитов по сравнению с контролями.

Пример 17. Анализ обратной мутации с помощью мини-теста 8а1топе11а/микросомы млекопитающих.

Это исследование проводилось с целью оценки способности соединения 1 вызывать обратные мутации в присутствии или в отсутствие микросомального фермента млекопитающих (89-т1х) в локусе гистидина в геноме 2 штаммов 8а1топе11а 1ур1йтипит (ТА98 и ТА 100).

В этом исследовании мутагенности тест-штаммами были штаммы 8а1топе11а 1ур1йтипит ΤΑ98 (для обнаружения обратной мутации сдвига рамки) и ТА100 (для обнаружения точечной обратной мутации). Анализ проводили и в присутствии и в отсутствие 89-пйх одновременно с носителем (ΌΜ8Ο, 20 мкл/лунку) и положительными контролями в двойной повторности, используя 6-луночные планшеты. Пять концентраций с последовательным разведением 2Х в пределах от 1000 до 62,5 мкг/лунку (эквивалентно 5000 - 312,5 мкг/чашку в стандартном тесте Эймса) были проверены для каждого соединения. После инкубации при 37°С в течение 48-72 ч планшеты исследовали в отношении нерастворимости и цитотоксичности соединения и проводили поиск и подсчет колоний ревертантов. Воспроизводимое двукратное увеличение (>2х по сравнению с контролем-носителем) колоний ревертантов по сравнению со среднесуточным контрольным значением считается положительным ответом генной мутации для каждого штамма.

Соединение 1 растворили в диметилсульфоксиде (ΌΜ8Ο), который служил также отрицательным контролем (носитель). 2-нитрофлуорен и азид натрия служили в качестве положительных контролей при отсутствии 89 для ТА98 и ТА100, соответственно. 2-Аминоантрацен служил в качестве положительного контроля в присутствии 89 для ТА98 и ТА 100.

Результаты

При растворении соединения 1 в ΌΜ8Ο в концентрации 50 мг/мл получили темно-каштановый раствор, который был самым концентрированным стоковым раствором. Тестируемый образец представлял

- 33 022434 собой раствор от светло-каштанового цвета до бесцветного при всех 2Х последующих разведениях вплоть до 3,125 мг/мл. Когда тестируемый образец и мягкий агар смешивали вместе при концентрации 250 мкг/лунку и выше, наблюдалось осаждение тестируемого образца. После 48-72 ч инкубации под стереоскопическим микроскопом было видно слабое осаждение тестируемого образца при 250 мкг/лунку на штаммах ТА98 и ТА100 только при отсутствии 89-т1х, также наблюдалось осаждение тестируемого образца и небольшое уменьшение Ьаскдгоипй 1а\\п от слабого до умеренного при дозе 500 и 1000 мкг/лунку на штаммах ТА98 и ТА100 в присутствии и в отсутствие 89-пи.х. Не наблюдалось значительного увеличения среднего количества колоний ревертантов по сравнению со средним контролем при тестировании в присутствии или в отсутствие 89-Ш1Х на штаммах ТА98 и ТА 100 (табл. 5).

Результаты текущего исследования показали, что соединение 1 не вызывает положительного мутагенного ответа в штаммах ТА98 и ТА100 в присутствии или в отсутствие микросомальных ферментов, при проверке тестируемых образцов вплоть до максимальной концентрации 1000 мкг/лунку (эквивалентно 5000 мкг/чашку в стандартном тесте Эймса).

Таблица 5. Результаты исследования мутагенности соединения 1

	Концентр. мкг/лунку	Ревертантов на лунку
ТА98	ТА 100	Васкдгоипс! ЬаилГ
		1	2	среднее	1	2	среднее	ТА98/ТА100
			Микросомы: нет (-89)
ϋΜ80	-	5	б	б	26	32	29	4/4
Соединение 1	62.5	4	4	4	34	30	32	4/4
Соединение 1	125	4	6	5	32	34	33	4/4
Соединение 1	250	6	5	6	34	29	32	4,ьр/4,зр
Соединение 1	500	5	3	4	33	31	32	3,5р/3,5р
Соединение 1	1000	4	5	5	28	26	27	3,тр/3,тр
Положительный контроль а	55	63	59*	>300	>300	>300*	4/4

Микросомы (+39)

ВМ8О	-	6	6	6	34	33	34	4/4
Соединение 1	62.5	4	6	5	34	30	32	4/4
Соединение 1	125	6	3	5	28	30	29	4/4
Соединение 1	250	8	6	7	30	28	29	4/4
Соединение 1	500	6	6	6	32	37	35	3,ьр/3,5р
Соединение 1	1000	6	7	7	33	34	34	3,тр/3,тр
Положительный контроль	>300	>300	>300*	>300	>300	>300*	4/4

^аТА98: 2-нитрофлуорен; 0,4 мкг/лунку; ТА 100: Азид натрия, 2,0 мкг/лунку ^ЬТА98 и ТА 100: 2-аминоантрацен, 0,8 мкг/лунку ^с система оценки Васк^гоцпй Επτνη:

5, увеличенный рост по сравнению контролями-растворителями,

4. сходно с контролем-носителем (нормальное состояние, токсичность отсутствует),

3. уменьшение меньше, чем на 25% (меньше, чем 25% цитотоксичность),

2. уменьшение более, чем на 25%, но меньше, чем на 50% (меньше, чем 50% цитотоксичность),

1. уменьшение более, чем на 50% (более, чем 50% цитотоксичность),

0. нет роста (100% цитотоксичность).

8р=слабый осадок тр=умеренный осадок Ьр=болыной осадок *: положительное увеличение

Пример 18. Фармакодинамическое исследование на линиях опухолевых клеток.

Культивированные линии опухолевых клеток Н460 (Кгаз, Р13К), ВТ474 (НЕК2, Р13К), А375 (В-КаТ) и Н1975 (ЕСРК, Р13К) обработали только ΌΜ8Ο (контроль носителем) или ΌΜ8Ο с соединением 1 (0,1 мкмоль/л) или эталонным соединением в течение 16 часов. Клеточные экстракты готовили в присутствии 8Ό8 и 2-меркаптоэтанола и разгоняли в полиакриламидных гелях. Белки переносили на нитроцеллюлозный фильтр и проводили блоттинг с помощью стандартных методов, используя блокирующие растворы (Ы-Сог Вюзаепсе) содержащие указанное первичное антитело. Первичные антитела к р-ЕСРК, ЕСРК, р-НЕК2, НЕК2, р-НЕК3, НЕК3, р-МЕТ, МЕТ, р-ЬКаТ, р-сКаТ, рМЕК, МЕК, р-ЕКК, ЕКК и тубулину покупали у компании Се11 81дпа1ш§ ТесЬпо1о§у.

Использовали вторичные антитела, конъюгированные с ГКйуе 680, 800С\У. а сигнал обнаруживали с помощью Ы-Сог Ойуккеу 1тадег.

Иммуногистохимическое исследование проводили на клетках, растущих в монослойной культуре, которые обрабатывали, как указано в подписях к фигуре, а затем фиксировали в 4% (вес./об.) параформальдегиде. После промывки 1хРВ8, проводили иммуноокрашивание в блокирующем растворе Ы-Сог, содержащем указанные первичные антитела и вторичные антитела, конъюгированные с ГКЭуе 680 или 800С\У. При проведении анализа т-се11-\уе51егп использовали инфракрасное устройство формирования изображений Ы-Сог Ойу55еу для обнаружения и количественного анализа результатов.

- 34 022434

Для гистологического исследования фармакодинамических маркеров, извлекали ксенотрансплантаты опухолей и заливали парафином, а затем делали срезы 4-5 мм. Срезы помещали на предметные стекла и проводили реакцию с первичными антителами, а затем конъюгированными с пероксидазой хрена вторичными антителами (Епу15ЮП ро^тет-Н^, Эако, С1о5!гир, Эеитагк). Затем проводили цветную реакцию, используя диаминобензидин (ЭЛВ), как рекомендовано производителем. Для контрастного окрашивания использовали гематоксилин.

Результаты этого исследования суммированы на фиг. 7А-7д и 8А-8С. Соединение 1 ингибирует активность НЭАС и сигнальный путь ΡΙ3Κ в ХКАЗ- и ΡI3ΚСА-мутантных Н460 клетках немелкоклеточного рака легкого (ΝδΕΈί'.’). Клетки обрабатывали одним ЭМ8О (контроль носителем) или ЭМ8О, содержащим исследуемые соединения, в течение 1 часа перед проведением вестерн-блоттинга или ш-се11\уе5!ет. Фиг. 7А показывает, что соединение 1 в дозе 1 мкмоль/л увеличивает уровни ацетилированного гистона 3 (Ас-Н3), тубулина (Ас-ТиЬ) и р53 (Ас-р53). Соединение также повышает общее содержание р53 и р21. Данные, представленные на фиг. 7В-7Е, показывают, что соединение 1 повышает уровни ацетилированного тубулина (фиг. 7В), ацетилированного гистона 3 (фиг. 7С), ацетилированного р53 (фиг. 7Ό) и ацетилированного р21 (фиг. 7Е) дозо-зависимым образом. Полученные значения Κ.'₅₀ означают, что соединение 1 обладает аналогичной НЭАС-ингибирующей активностью относительно ЬВН 589 в проверенных раковых клетках. В дозе 1 мкмоль/л Соединение 1 ингибирует активацию АКТ и нижерасположенные сигнальные белки 4ЕВР-1 и р70§6 (фиг. 7Р). Соединение 1 также постоянно и сильно ингибирует фосфорилирование Ак! дозо-зависимым образом (фиг. 7С).

Одним значительным ограничением ΡΙ3Κ ингибиторов при лечении рака является активация пути КЛР-МЕΚ-ЕКΚ. НЭАС- ингибиторы способны ингибировать уровни киназы в этом пути передачи сигнала в раковых клетках через эпигенетическую модификацию. В опухолевых клетках с различными мутациями, такими как мутации ХКАЗ и ΡΙ3Κ в клетках Н460, мутация В-КаГ в клетках А375, мутации НЕК2 и ΡΙ3Κ в клетках ВТ-474 и мутации ЕСРК в клетках Н1975, Соединение 1 (100 нМ) подавляло активацию КаГ, МЕΚ и ЕК1<. Сильный НЭАС-ингибитор ЬВН 589 продемонстрировал подобную активность в некоторых из этих исследованиях с использованием вестерн-блоттинга (фиг. 8А).

В дополнение к ингибированию ΡΙ3Κ и МЕК путей, обработка клеток миеломы КΡМI-8226 Соединением 1 (1 мкМ) в течение 16 ч ингибировала р-8ТАТ3 (Υ-705) и р-Згс (фиг. 8В).

Было показано, что в ЕСРК-Б858К-Т790М дважды-мутантных Н1975 ЖСБС клетках и НЕК2сверхэкспрессирующих ВТ-474 клетках рака молочной железы соединение 1 уменьшает уровни фосфорилированной и общей рецепторной тирозинкиназы ЕСРК, НЕК2, НЕК3 и МЕТ после инкубации в течение 16 часов. Сходная понижающая регуляция той же самой киназы наблюдалось после обработки этих клеток ЬВН 589 (фиг. 8С).

Пример 19. Экспрессия ΡΙ3Κ110 α, β, γ и δ на моделях ксенотрансплантатов гематологических опухолей.

Самок иммунодефицитных мышей (Ве1де/ЗСГО) в возрасте 6-8 недель содержали в проветриваемых микро-изолированных клетках с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (ТгоЬ1аЬ-КМН 2000) без ограничения и давали стерильную воду. Все одноразовые клетки и питание для бежевых мышей ЗСГО покупали у компании Iηηον^νе и перед использованием облучали. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Линии клеток гематологического рака человека первоначально были получены от пациентов, больных раком. Замороженные клетки оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде КΡМI плюс 10-15% эмбриональной бычьей сыворотки (РВЗ) в инкубаторе для культур тканей при 5% СО₂. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью МЛΡ теста, на выработку мышиных антител).

Когда клетки в культуре достигали необходимого количества, их собирали и промывали бессывороточным фосфатно-буферным раствором в модификации Дульбекко (ΌΡΕδ). Наконец, клетки разводили в ΩΡΕδ для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью клеток больше, чем 90% (использовали метод вытеснения трипанового синего). После семидневного периода акклиматизации от 10 до 20 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл ΩΡΗδ, вводили каждому животному подкожно ^С) в область правого заднего паха, используя 0,5СС шприц с гиподермальной иглой 26С и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли поддавались обнаружению примерно через 2,5 недели после имплантации. Размер опухоли измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

- 35 022434

Когда размер опухоли достигал примерно 150-300 мм³, мышей разбивали на четыре группы, включая три лечебные группы (25 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг) и одну контрольную группу. Мышей подвергали эвтаназии, используя СО₂. Опухоли извлекали через 15 мин, 1, 3, 6, 24 ч (3 мыши на каждую точку) после введения соединения 1. Образцы помещали в сухой лед до переноса в морозильник -80°С для Вестернблот анализов.

Белок извлекали из опухолевой ткани, используя гомогенизатор (Т1ззие1узег, 01адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям производителя. Приспособление для удерживания пробирок с тканью замораживали при -20°С, а лизирующий буфер и гранулы охлаждали при 4°С перед использованием.

100-200 мкг ткани гомогенизировали в 300 мкл реактива для экстракции белка из тканей млекопитающих Т-РЕК (Р1егсе, КоскГогБ, 1Ь) с добавлением ингибиторов фосфатазы (1:100 об/об, Туг & §ег/ТЬг ркозркаЮзе 1пЫЪБог соскаБз, Ирз1а1е). Образцы контролировали визуально после каждого цикла (время: 0,15 мин; частота: 30 Гц) до полной гомогенизации ткани. В большинстве случаев требовалось приблизительно четыре цикла. Лизаты тканей центрифугировали при 14000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. 200 мкл супернатанта отбирали и держали при -80°С. Концентрацию белка измеряли с помощью набора ВСА Рго1еш Аззау (Р1егсе, КоскГогБ, 1Ь) согласно инструкциям производителя.

мкг общего белкового экстракта разгоняли на гелях NиΡΑСЕ Шуе.х 4-12% В1з-Тпз (1пуБгодеп) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Вю-КаБ), используя Вю-КаБ §ет1-Эту ТгапзГег МасЫпе. Блоты инкубировали с 10 мл блокирующего буфера (ОБуззеу 1пГгагеБ 1тадшд 8уз1ет) в течение 1 ч, а затем исследовали с помощью первичных антител в течение ночи при 4°С на шейкере. Первичные антитела включали Р13 киназу р110а (#4249, 1:1000, Се11 81дпа1шд), Р13 киназу р110Ц (#3011, 1:1000, Се11 §1дпа1шд), Р13 киназу р110 γ (#5405, 1:1000, Се11 §1дпа1тд), Р13 киназу р110 δ (8С-7176 (1:1000, §айа ί’Γΐιζ Вю1есЬпо1оду, 8айа Επιζ, СА). САРЭН (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа, 1/30,000, АЪеат, СатЪпБде, МА) использовалась в качестве внутреннего контроля для каждого анализа.

Мембрану четыре раза промывали Тпз-ЪиТТетеБ заПпе Т\уееп-20 (ТВ8Т; ЭАКО) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с инфракрасно-конъюгированными вторичными антителами (1:10000): антикролик конъюгированные-1К Эуе 800(Коск1апБ), или антимышь конъюгированные-А1еха 680(Мо1еси1аг РгоЪез). Мембрану промывали ТВ8Т, а затем помещали в систему ОБуззеу 1пТгагеБ 1тадшд 8уз1ет для визуализации и изучения.

Результаты, представленные на фиг. 15, показывают вестерн-блоты изоформ Р13К рПО, АКТ и рАКТ, полученных от нескольких ксенотрансплантатов неходжкинской лимфомы и множественной миеломы. Результаты показывают, что активацией АКТ управляет несколько Р13К Р110 изоформ.

Пример 20. Сравнение соединения 1 и САЬ-101 на модели ксенотрансплантата опухоли Дауди.

Самок бежевых мышей 8СГО (СО-Ι Ве1де 8СГО) в возрасте 6-8 недель содержали в проветриваемых микро-изолированных клетках с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (РгоЪ1аЪ-КМН 2000) без ограничения и поили стерильной водой. Все одноразовые клетки и питание для бежевых мышей 8СГО покупали у компании 1ппо\ауе и перед использованием облучали. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Клетки Дауди лимфомы Беркитта человека были первоначально получены от пациента с лимфомой Беркитта. Замороженные клетки оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде КРМ1-1640 плюс 15% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8), 1% Репз1гер и 1% С1и!атах в инкубаторе для культур тканей при 5% СО₂. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью МАР теста, на выработку мышиных антител).

Когда клетки в культуре достигали необходимого количества, их собирали центрифугированием. Затем клетки промывали бессывороточным фосфатно-буферным раствором в модификации Дульбекко (ОРВ§). Наконец, клетки разводили в ЭРВ8 для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью клеток больше, чем 90% (метод вытеснения трипанового синего). Затем 20 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл ЭРВЗ, вводили каждому животному подкожно в область правого заднего паха после минимально 7 дневного периода акклиматизации, используя 0,5СС шприц с гиподермальной иглой 26С и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли можно было обнаружить примерно через 2 недели после имплантации. Размер опухоли измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

Через четыре недели после имплантации опухоли достигали среднего размера 300±126 мм³. Животных с подходящей формой и размером опухолей случайным образом разделили на три группы по семь мышей в каждой, используя программу для сортировки, одну группу с введением носителя и две лечебные группы.

- 36 022434

Группы	Количество мышей	Соединения	Доза ( мг/кг)	Режим
1	7	30% СарНзо!	0	(ПонедПятн), РО**
2	7	САЬ-101	30	ВЮ*** (Понед-Пятн)
3	7	Соединение 1	100	рё* (ПонедПятн), РО**

*0ά = введение один раз в день, **РО = пероральное введение через зонд, ***ΒΙΌ, два раза в день

Соединение 1 заключали в композицию и вводили, как указано далее: Соединение 1 (7,5 мг/мл) растворили в 30% каптисоле с 2 эквивалентами ΝαΟΗ, сбалансированными 2 эквивалентами Η0. и вводили перорально с помощью зонда каждый день с понедельника по пятницу. Контрольной группе вводили носитель (30% каптисол) в том же режиме дозирования, 100 мг/кг объема (6,67 мкл/г).

Во время исследования объем опухоли у каждого животного измеряли штангенциркулем, размер опухоли определяли с помощью указанной выше формулы и вычисляли изменение размера опухоли в процентах. Для определения веса тела мышей взвешивали два раза в неделю. Исследование продолжалось до или: а) наступления заранее определенной даты окончания в плане исследования; или Ь) начала проблем со здоровьем, в зависимости от того, что произойдет раньше. В дополнение к этому, основанием для эвтаназии служили следующие, связанные с опухолью, параметры: (1) масса опухоли, превышающая 2500 мм³, и/или (2) потеря >20% исходного веса тела. В дополнение к определению изменений размера опухоли, последнее измерение опухоли использовали для получения отношения изменения веса опухоли (значение Т/С), стандартного показателя, разработанного Национальным институтом рака (ΝΟ) для оценки ксенотрансплантатов опухолей, значения Т/С вычисляли, используя следующую формулу:

% Т/С = 100 X ДТ/ДС, если ΔΤ > 0.

Однако в тех случаях, когда наблюдалась регрессия опухолей, использовали следующую формулу: % Т/Т₀ = 100 х ΔΉ^, если ΔΤ < 0.

Лечебный период для групп с введением носителя и САЬ-101 продолжался 15 дней (более раннее завершение было связано с тем, что размер опухоли превышал 10% веса тела), и 18 дней для группы с введением соединения 1. Размер опухоли и вес тела вновь измеряли в последний день исследования.

Результаты исследования, представленные на фиг. 16, показывают, что рост опухоли в группах с активным веществом и контрольной группе зависит от продолжительности лечения. Группа с введением Соединения 1 продемонстрировала значительное уменьшение роста опухоли по сравнению с САЬ-101 и контрольной группой.

Пример 21. Комбинация соединения 1 и циклофосфамида на модели ксенотрансплантатов опухоли Дауди.

Самок бежевых мышей δΟΌ (СО-1 Веще δΟΌ) в возрасте 6-8 недель содержали в проветриваемых микро-изолированных клетках с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (РгоЫаЬ-ΚΜΗ 2000) без ограничения и поили стерильной водой. Все одноразовые клетки и питание для бежевых мышей δΟΌ покупали у компании 1ппоу1уе и перед использованием облучали. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Клетки Дауди лимфомы Беркитта человека были первоначально получены от пациента с лимфомой Беркитта. Замороженные клетки оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде ΚΡΜΙ-1640 плюс 15% эмбриональной бычьей сыворотки (ΡΒδ), 1% Реп51гер и 1% 01и1ата\ в инкубаторе для культур тканей при 5% СО₂. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью ΜΑΡ теста, на выработку мышиных антител).

Когда клетки в культуре достигали необходимого количества, их собирали центрифугированием. Затем клетки промывали бессывороточным фосфатно-буферным раствором в модификации Дульбекко (ΌΡΒδ). Наконец, клетки разводили в ΌΡΒδ для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью клеток больше, чем 90% (метод вытеснения трипанового синего), затем 20 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл ΌΡΒδ, вводили каждому животному подкожно в область правого заднего паха после минимально 7 дневного периода акклиматизации, используя 0,5СС шприц с гиподермальной иглой 260 и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли можно было обнаружить примерно через 2 недели после имплантации. Размер опухоли

- 37 022434 измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

Через четыре недели после имплантации опухоли достигали среднего размера 189±47 мм . Животных с подходящей формой и размером опухолей случайным образом разделили на четыре группы по восемь мышей в каждой, используя программу для сортировки, одну группу с введением носителя и три лечебные группы.

Группы	Количество мышей	Соединения	Доза (мг/кг)	Режим
1	8	30% каптисол 0.9%Ν5	0	<3<1* (Понед-Пятн), РО**
2	8	Соединение 1	75	О<3* (Понед-Пятн), РО**
3	8	СТХ	50	День-0, в/в
4	8	Соединение 1 +СТХ	75 50	рс1* (Понед-Пятн), РО** День-0, в/в

*0ά = введение один раз в день, **РО = пероральное введение через зонд, ***ВГО, два раза в день.

Соединение 1 заключали в композицию и вводили, как указано далее. Соединение 1 (7,5 мг/мл) растворили в 30% каптисоле с 2 эквивалентами ΝαΟΗ, сбалансированными 2 эквивалентами ΗΟ, и вводили перорально с помощью зонда каждый день с понедельника по пятницу в дозе 75 мг/кг. Циклофосфамид (СТХ) растворяли в 0,9% Νδ (физраствор) в дозе 5 мг/мл, и вводили животным внутривенно ίν (в хвостовую вену) в дозе 50 мг/кг в День-0. Группе с комбинацией вводили и соединение 1 и СТХ, используя тот же самый режим введения. Контрольной группе вводили носитель (30% каптисол) и 0,9% Νδ в том же режиме дозирования как комбинацию.

Во время исследования объем опухоли у каждого животного измеряли штангенциркулем, размер опухоли определяли с помощью указанной выше формулы и вычисляли изменение размера опухоли в процентах. Для определения веса тела мышей взвешивали два раза в неделю. Исследование продолжалось до или: а) наступления заранее определенной даты окончания в плане исследования; или Ь) начала проблем со здоровьем, в зависимости от того, что произойдет раньше. В дополнение к этому, основанием для эвтаназии служили следующие, связанные с опухолью, параметры: (1) масса опухоли, превышающая 2500 мм³, и/или (2) потеря >20% исходного веса тела. В дополнение к определению изменений размера опухоли, последнее измерение опухоли использовали для получения отношения изменения веса опухоли (значение Т/С), стандартного показателя, разработанного Национальным институтом рака (ΝΟ) для оценки ксенотрансплантатов опухолей, значения Т/С вычисляли, используя следующую формулу: % Т/С = 100 х ΔΤ/ДС, если ΔΤ > 0. Однако в тех случаях, когда наблюдалась регрессия опухолей, использовали следующую формулу: % Т/Т₀ = 100 х ΔΤ/Γ0, если ΔΤ < 0.

Лечебный период продолжался 2 недели. Размер опухоли и вес тела опять измеряли в последний день исследования.

Результаты этого исследования, представленные на фиг. 17, показывают, что рост опухоли в группах с активным веществом и контрольной группе зависит от продолжительности лечения. В качестве монотерапии, Соединение 1 и циклофосфамид обладают сходной активностью на этой модели. Комбинация соединения 1 и циклофосфамида показала существенно большую эффективность, чем каждое средство в отдельности.

Пример 22. Соединение 1 в комбинации с леналидомидом на модели ксенотрансплантата опухоли

ММ.

Самок мышей δСI^/Βе^де в возрасте 4 недель содержали в проветриваемых микроизолированных клетках (INNΟСΑСΕ®IVС, ΙηηονίνΌ 1пс., δαη О1едо, СА) с регулируемым климатом, кормили стерильным кормом с высоким содержанием жира (РгоЫаЬ-ΚΜΗ 2000) αά ПЬОнт и поили стерильной водой. Все клетки и питание для мышей δСI^/Βе^де стерилизовали автоклавированием перед использованием. Мыши подвергались ежедневной проверке, включая выходные и праздничные дни, обученным персоналом вивария и исследователями. Все процедуры на животных проводили в стерильных условиях в кабине биологической безопасности (для инъекций) или вытяжном шкафу с ламинарным потоком (для содержания животных и неинвазивных процедур).

Замороженные клетки ММ человека ΜΜ1δ оттаивали на водяной бане 37°С и культивировали в среде ΚΡΜΙ плюс 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ΡΒδ) в инкубаторе для культур тканей при 5% СО2. Клетки посылали внешним поставщикам для скрининга загрязнений и патогенов грызунов с целью исключить заражение микоплазмой (с помощью ПЦР) и/или вирусом (с помощью ΜΑΡ теста, на выработку мышиных антител). Когда клеток в культуре становилось достаточно для имплантации, их промывали безсывороточным сбалансированным солевым раствором Хенкса (ΗΒδδ). В заключение клетки разводили в ΗΒδδ для имплантации. Для инъекций использовали только одноклеточные суспензии с жизне- 38 022434 способностью клеток больше, чем 90%, (метод вытеснения трипанового синего), затем 20 миллионов клеток, суспендированных в 0,2 мл НВ88, вводили каждому животному подкожно в область правого заднего паха минимум после 7 дневного периода акклиматизации, используя 1СС шприц с гиподермальной иглой 26С и избегая попадания в кровеносные сосуды. На успешную имплантацию указывало формирование круглой, растущей массы под кожей. Ежедневно контролировали состояние здоровья и развитие опухолей у мышей с имплантированной опухолью.

Опухоли поддавались обнаружению примерно через две недели после имплантации. Размер опухоли измеряли штангенциркулем. Для вычисления объема опухоли использовали следующую формулу:

Объем опухоли = (длина х ширина²)/2.

Через три недели после имплантации опухоли достигали в среднем размера 192±32 мм³. Животных с подходящим размером и формой опухоли делили случайным образом на шесть групп по 7 животных в каждой группе, используя программу для сортировки, одну группу с введением носителя и шесть лечебных групп.

Группы	Количество мышей	Соединения	Доза (мг/кг)	Режим
1	7	30% каптисол МСТ	0	ζΜ* (Понед-Пятн), РО** СО* (Понед-Пятн), РО**
2	7	Соединение 1	75	Ос1* (Понед-Пятн), РО**
3	7	Леналидомид	12.5	Οά* (Понед-Пятн), РО**
4	7	Леналидомид	12.5	Οά* (Понед-Пятн), РО**
5	7	Соединение 1 +Леналидомид	75 12.5	Οά* (Понед-Пятн), РО** ζ>ά* (Понед-Пятн), РО**
6	7	Соединение 1 +Леналидомид	75 25	0<1* (Понед-Пятн), РО** ()4* (Понед-Пятн), РО**

(7,5 мг/мл) растворили в 30% каптисоле с 2 эквивалентами №ЮН. сбалансированными 2 эквивалентами НС1, и вводили перорально с помощью зонда каждый день с понедельника по пятницу в дозе 75 мг/кг. Леналидомид (8е11еск, 2,5 мг/мл) заключали в состав с МСТ (0,5% метилцеллюлоза и 0,2% Твин80) и вводили в дозе 12,5 мг/кг или 25 мг/кг. Двум группам с комбинацией вводили соединение 1 в дозе 75 мг/кг плюс одну дозу леналидомида (или 12,5 или 25 мг/кг). Контрольной группе вводили носитель (30% каптисол) и МСТ, используя тот же режим дозирования как для комбинации.

Во время исследования объем опухоли у каждого животного измеряли штангенциркулем, размер опухоли определяли с помощью указанной выше формулы и вычисляли изменение размера опухоли в процентах. Для определения веса тела мышей взвешивали два раза в неделю. Исследование продолжалось до или: а) наступления заранее определенной даты окончания в плане исследования; или Ь) начала проблем со здоровьем, в зависимости от того, что произойдет раньше. В дополнение к этому, основанием для эвтаназии служили следующие, связанные с опухолью, параметры: (1) масса опухоли, превышающая 2500 мм³, и/или (2) потеря >20% исходного веса тела. В дополнение к определению изменений размера опухоли, последнее измерение опухоли использовали для получения отношения изменения веса опухоли (значение Т/С), стандартного показателя, разработанного Национальным институтом рака (ΝΟ) для оценки ксенотрансплантатов опухолей, значения Т/С вычисляли, используя следующую формулу: % Т/С = 100 х ДТ/ДС, если ДТ > 0. Однако в тех случаях, когда наблюдалась регрессия опухолей, использовали следующую формулу: % Т/Т₀ = 100 х ДТ/Т0, если ДТ < 0.

Лечебный период продолжался 17 дней. Размер опухоли и вес тела снова измеряли в последний день исследования.

Результаты этого исследования представлены на фиг. 18, которая показывает рост опухолей в зависимости от времени лечения. Результаты показывают, что соединение 1 в дозе 75 мг/кг РО является более эффективным, чем леналидомид в дозе 12,5 или 25 мг/кг РО в виде монотерапии. Результаты также показывают, что комбинация соединения 1 и леналидомида является существенно более эффективной, чем любое соединение в отдельности.

Патентная и научная литература, упомянутая в данном описании, относится к знаниям, доступным специалистам в данной области техники. Все патенты Соединенных Штатов и опубликованные или неопубликованные патентные заявки Соединенных Штатов, процитированные в данном описании, включаются в текст посредством ссылки. Все опубликованные иностранные патенты и патентные заявки, процитированные в данном документе, включаются в текст посредством ссылки. Все другие опубликованные ссылки, документы, неопубликованные рукописи и научная литература, процитированные в этом описании, включаются в текст посредством ссылки.

Хотя данное изобретение подробно продемонстрировано и описано со ссылками на предпочтительные варианты его осуществления, специалистам в данной области техники понятно, что возможны и различные изменения в форме и деталях без выхода за пределы настоящего изобретения, объем которого определен в прилагаемых пунктах формулы изобретения.

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ или его фармацевтически приемлемая соль, в котором К представляет собой водород или ЩС^)-, где К₁ представляет собой С₁-С₂₄-алкил, С₂-С₂₄-алкенил или фенил.
2. 2. Соединение по п.1, в котором К₁ представляет собой С₁-С₁₀-алкил или фенил.
3. 3. Соединение по п.2, в котором К₁ представляет собой С₁-С₆-алкил.
4. 4. Соединение по п.1, в котором К представляет собой Н или ацетил.
5. 5. Соединение по п.1, представленное формулой или его фармацевтически приемлемая соль.
6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
7. 7. Фармацевтическая композиция, подходящая для перорального введения и содержащая в качестве активного ингредиента соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента соединение по п.5 и фармацевтически приемлемый носитель.
9. 9. Фармацевтическая композиция, подходящая для перорального введения и содержащая в качестве активного ингредиента соединение по п.5 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. 10. Способ лечения заболевания или нарушения, связанного с РВК, у субъекта, нуждающегося в этом, где данный способ включает стадию, на которой субъекту вводят терапевтически эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, где К представляет собой водород или К^^)-, где К₁ представляет собой С₁-С₂₄-алкил, С₂-С₂₄алкенил или фенил.
11. 11. Способ по п.10, в котором указанное заболевание или нарушение, связанное с РПК, является нарушением клеточной пролиферации.
12. 12. Способ по п.11, в котором нарушение клеточной пролиферации является раком.
13. 13. Способ по п.12, в котором рак выбран из группы, состоящей из папилломы, глиобластомы, саркомы Капоши, меланомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, рака головы, рака шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцеллюлярной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина и болезни Беркитта.
14. 14. Способ лечения Η^ΑС-опосредованного заболевания, включающий стадию, на которой субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вводят терапевтически эффективное количество соединения формулы I

    - 40 022434 или его фармацевтически приемлемой соли, где К представляет собой водород или К₁С(О)-, где К₁ представляет собой С₁-С₂₄-алкил, С₂-С₂₄алкенил или фенил.
15. 15. Способ лечения заболевания, опосредованного и И3К, и НОЛС, включающий стадию, на которой субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вводят терапевтически эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, где К представляет собой водород или К₁С(О)-, где К₁ представляет собой С₁-С₂₄-алкил, С₂-С₂₄алкенил или фенил.
16. 16. Способ по п.10, в котором К представляет собой водород.
17. 17. Способ по п.16, в котором указанное заболевание или нарушение, связанное с И3К, является нарушением клеточной пролиферации.
18. 18. Способ по п.17, в котором нарушение клеточной пролиферации является раком.
19. 19. Способ по п.18, в котором рак выбран из группы, состоящей из папилломы, глиобластомы, саркомы Капоши, меланомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, рака головы, рака шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцеллюлярной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина и болезни Беркитта.