TWI549699B - 脂質、脂質組合物及其使用方法 - Google Patents

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Description

脂質、脂質組合物及其使用方法
本發明係關於陽離子型脂質化合物、隱形脂質化合物及包含該等化合物之組合物。本發明亦係關於製造該等化合物及組合物之方法、及該等化合物及組合物例如將生物活性劑傳遞至細胞及組織中之方法及用途。本發明描述用於脂質調配物中以便將生物活性劑傳遞至特定細胞類型，尤其包括肝臟及腫瘤之陽離子型脂質的最佳pKa範圍，及使調配物最佳化之方法。
生物活性劑(包括治療相關性化合物)向個體之傳遞通常受化合物難以到達目標細胞或組織妨礙。詳言之，許多生物活性劑向活細胞之傳輸受到細胞之複雜膜系統高度限制。此等限制可能導致需要使用比達成結果所需高得多的濃度之生物活性劑，此舉會增加毒性作用及副作用之風險。此問題之一種解決方案為利用允許選擇性進入細胞中之特定載體分子。可使用脂質載體、生物可降解聚合物及各種結合物系統來改良生物活性劑向細胞之傳遞。
尤其難以傳遞至細胞中之一類生物活性劑為生物治療劑(包括核苷、核苷酸、聚核苷酸、核酸及衍生物)。一般而言，核酸在細胞或血漿中僅穩定持續有限時間。RNA干擾、RNAi療法、RNA藥物、反義療法及基因療法及其他療法之發展使對將活性核酸劑引入細胞中之有效方法的需要增加。為此，可使基於核酸之藥劑穩定且將其傳遞至細胞中之組合物受到特別關注。
已充分研究之用於改良外來核酸向細胞中傳輸之方法涉及使用病毒載體或陽離子型脂質。可使用病毒載體來將基因有效轉移至一些細胞類型中，但其一般不可用來將化學合成之分子引入細胞中。
替代方法為使用併有一部分與生物活性劑相互作用且另一部分與膜系統相互作用之陽離子型脂質的傳遞組合物(關於評述，請參見Felgner,1990,Advanced Drug Delivery Reviews,5,162-187及Felgner,1993,J. Liposome Res.,3,3-16)。已報導該等組合物含有脂質體。
自1965年Bangham(J. Mol. Biol. 13,238-252)對脂質體首先描述以來，持續關注且努力發展用於傳遞生物活性劑之基於脂質之載體系統。Philip Felgner等人,Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,84,7413-7417(1987)首先描述藉由使用帶正電脂質體將功能性核酸引入培養細胞中之方法。隨後K. L. Brigham等人,Am. J. Med. Sci.,298,278-281(1989)在活體內證明了該方法。
脂質體為引人注目之載體，因為其保護生物分子免於降解，同時改良其細胞吸收。在各種類別之脂質體中，通常使用含有陽離子型脂質之脂質體來傳遞聚陰離子(例如核酸)。可單獨使用陽離子型脂質及使用視情況包括其他脂質及兩親性分子(諸如磷脂醯乙醇胺)之陽離子型脂質形成該等脂質體。在此項技術中熟知脂質調配物之組合物以及其製備方法皆影響所得聚集體之結構及大小。
使用陽離子型脂質進行生物活性劑之細胞傳遞具有若干優點。由於靜電相互作用，故使用陽離子型脂質進行陰離子型化合物之囊封基本上為定量的。另外，咸信陽離子型脂質與帶負電細胞膜相互作用，從而引起細胞膜傳輸(Akhtar等人,1992,Trends Cell Bio.,2,139;Xu等人,1996,Biochemistry 35,5616)。
在Felgner對藉由使用帶正電脂質體將功能性核酸引入培養細胞中進行之早期研究之後，已在專利申請案EP 0 187 702中揭示基於通式I之陽離子型脂質化合物。
此等陽離子型脂質化合物一般由兩個烷基或烯基鏈連接至含氮「頭」基組成。亦揭示R3、R4及R5中之兩者或三者一起為N-啶基、N-哌啶基、N-吡咯啶基或N-嗎啉基。
自EP 0 187 702以來，已有多個其他研究者揭示陽離子型脂質化合物。相關專利申請案為WO 00/030444，其描述合成陽離子型脂質及脂質體。該申請案揭示具有多個不同頭基之陽離子型脂質化合物；一些實例之特徵在於一個以上頭基。所揭示之化合物包括式(II)化合物。
WO 2005/121348揭示基於脂質之調配物。其中所揭示之核酸-脂質粒子包含干擾RNA分子、具有約10至20個碳原子之烷基側鏈且具有不止單個不飽和位點之陽離子型脂質、非陽離子型脂質及抑制粒子聚集之結合脂質，諸如聚乙二醇(PEG)-脂質結合物或聚醯胺(ATTA)-結合物。該專利申請案中所揭示之特定陽離子型脂質化合物包括DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA。
Cullis及Bailey,Biochemistry 1994,33,12573-12580報導包含諸如以下之胺基脂質的脂質體。
與新型陽離子型脂質化合物有關之另一近期公開案為WO 2008/137758，其描述據報導適用於藥物傳遞及診斷之一系列胺基酸脂質化合物。
US 2006/0240554及相關申請案US 2008/0020058及US 2009/0048197亦與陽離子型脂質有關。已報導此等脂質能夠將生物活性劑，包括小核酸分子，諸如短干擾核酸(siNA)傳遞至細胞及/或組織中。
US 2006/0240554、US 2008/0020058及US 2009/0048197描述使用陽離子型脂質CLinDMA與膽固醇及PEG-DAG組合以將siRNA傳遞至細胞中。CLinDMA之結構闡述於下文中；分子之「頭部」為-N(Me)2基團。本文中亦將ClinDMA稱為E0173。
WO 2009/086558揭示以下化合物：
亦揭示具有以下通式之胺基脂質(其中R3及R4可接合以形成視情況經取代之具有4至6個碳原子及1或2個選自氮及氧之雜原子的雜環)：
對有利於將生物活性劑全身性及局部傳遞至細胞的其他陽離子型脂質存在需要。對相對於此項技術中已知之陽離子型脂質改良生物活性劑向細胞之全身性及局部傳遞的陽離子型脂質亦存在需要。另外對具有最佳物理特徵以便改良生物活性劑向特定器官及腫瘤，尤其肝臟外部之腫瘤之全身性及局部傳遞的脂質調配物存在需要。
本發明提供新穎陽離子型脂質及隱形脂質、及含有其之調配物、及其使用方法。亦提供使用該等脂質來傳遞治療有效量之藥物，尤其包括RNAi構築體，以便傳遞至有需要之個體的調配物。提供含有pKa在特定範圍內之陽離子型脂質之特定調配物，以供向肝臟及/或個體身體組織中之腫瘤投與治療有效量之藥物。通常(存在例外)，對傳遞至腫瘤最有效之調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約6.1或6.1以下之陽離子型脂質，不過特定範圍包括約5.0至約6.7，尤其包括約5.2至約6.3，或約5.4至約6.2，或約5.8至約6.1，視腫瘤類型而定；而對傳遞至肝臟最有效之調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約6.1或6.1以上之陽離子型脂質，不過特定範圍包括約5.1至約7.4，包括約5.3至約7.3，且尤其包括約5.9至約7.0，且在一實施例中為約6.2至約6.8。
調配物可另外由熟習此項技術者藉由調整調配物之其他態樣來最佳化，包括(但不限於)個別地選擇例如對於所靶向之細胞類型或器官最佳之陽離子型脂質之pKa；所用陽離子型脂質；所用隱形脂質；輔助脂質；所用中性脂質，包括中性脂質存在抑或不存在；所選輔助脂質、視情況選用之中性脂質、隱形脂質及陽離子型脂質之比率；N/P比率；粒度；給藥方案；所給劑量；調配方法；及其類似因素。
本發明提供陽離子型脂質(本文亦稱為「化合物」)及包含該等脂質之組合物。本發明亦提供製造該等化合物及組合物之方法，及該等化合物及組合物將生物活性劑(包括治療劑)傳遞至細胞(包括活體內傳遞)及最佳化該等調配物以供活體內傳遞至特定細胞類型及組織的方法及用途。本發明亦提供隱形脂質。
在一實施例中，本發明提供一種式(I)化合物：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；b不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；c不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L不存在或為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明亦提供一種包含式(I)化合物之醫藥組合物。此等組合物可包含生物活性劑，視情況與其他脂質組分組合。
本發明亦提供一種包含式(XI)化合物之醫藥組合物。此等組合物可包含生物活性劑，視情況與其他脂質組分組合。
在一實施例中，本發明提供一種式(XI)化合物：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：Z為選自PEG及基於聚(噁唑啉)、聚(環氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]及聚(胺基酸)之聚合物的親水性頭基組分，其中該聚合物可為線性或分支聚合物，且其中該聚合物可視情況經取代；其中Z係由n個次單元聚合而成；n為Z之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，其中n針對不同聚合物類型經最佳化；L1為視情況經取代之C1-10伸烷基或C1-10伸雜烷基連接基團，包括0、1、2個或2個以上醚基(例如-O-)、酯基(例如-C(O)O-)、丁二酸酯基(例如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、胺基甲酸酯基(例如-OC(O)-NR'-)、碳酸酯基(例如-OC(O)O-)、酮基(例如-C-C(O)-C-)；羰基(例如-C(O)-)；脲基(例如-NRC(O)NR'-)、胺基(例如-NR'-)、醯胺基(例如-C(O)NR'-)、亞胺基(例如-C(NR')-)、硫醚基(例如-S-)、黃原酸酯基(例如-OC(S)S-)及磷酸二酯基(例如-OP(O)2O-)；其中任一者可經0、1或多個Z基團取代；其中R'係獨立地選自-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸酯基或視情況經取代之C1-10伸烷基；X1及X2係獨立地選自碳或選自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基之雜原子；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同，或其中A1及A2連同其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之類固醇。
含有本發明脂質之組合物適用於例如傳遞治療化合物(例如一或多種生物活性劑)以供治療病症或疾病，尤其包括對調節患者之基因表現或向目標細胞或組織投與治療劑有反應之病症或疾病。因而，本發明之化合物及組合物可用於治療患者之疾病及病狀。詳言之，該等化合物可用於脂質體及/或脂質奈米粒子調配物組合物中以將生物活性劑，包括例如抗體、低分子量組合物、蛋白質治療劑及核酸組合物(諸如用於RNAi之siRNA)傳遞至細胞或組織。
在本發明之方法中，利用所述陽離子型脂質將生物活性劑傳遞至細胞，在此過程中生物活性劑可穿過上皮及內皮組織，諸如皮膚、黏膜、血管組織、胃腸組織、血腦障壁組織、眼部組織、肺部組織、肝臟組織、心臟組織、腎臟組織、腫瘤組織等。該等化合物及組合物可用於局部及全身性傳遞生物活性劑。
迄今為止，由於關於將治療有效量之RNAi組合物傳遞至大多數身體組織存在問題，故尚未實現RNAi領域之治療潛能。針對眼睛、皮膚、肺及肝臟中之組織時，RNAi治療劑具有一定效用。仍需要用於傳遞治療有效量之RNAi用以治療所有其他身體組織及癌症，包括轉移性癌症之組合物及方法。
本文所述之發現在於用於傳遞至腫瘤之調配物中陽離子型脂質之最佳pKa範圍低於肝臟。通常(存在例外)，具有對傳遞至腫瘤最有效之脂質的調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約5.0至約6.7，尤其包括約5.8至約6.1之陽離子型脂質，視腫瘤類型而定；而具有對傳遞至肝臟最有效之脂質的調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約5.1至約7.4，尤其包括約5.9至約7.0之陽離子型脂質。在一實施例中，在用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中pKa為約6.1或6.1以下之陽離子型脂質更有效；而在用於將生物活性劑傳遞至肝臟或肝細胞之調配物中，pKa為約6.1或6.1以上之陽離子型脂質更有效。
本文提供新穎陽離子型脂質及隱形脂質、及含有其之調配物；以及使用方法。描述具有特定pKa範圍之例示性陽離子型脂質，其中當活體內投與個體時，含有此等陽離子型脂質之調配物可將治療有效量之RNAi組合物傳遞至腫瘤。描述由具有另一pKa範圍之陽離子型脂質製備的其他調配物，其中當活體內投與個體時，含有此等陽離子型脂質之調配物可將治療有效量之RNAi組合物傳遞至肝臟。
本發明之陽離子型脂質
在一實施例中，本發明提供一種式(I)化合物：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；b不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；c不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L不存在或為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；及Y2為視情況經取代之類固醇。
在式I之一實施例中，a為視情況經取代之C1-2伸烷基。在式I之一實施例中，a為視情況經取代之C1伸烷基。在式I之一實施例中，b為視情況經取代之C0-2伸烷基。在式I之一實施例中，b為視情況經取代之C1伸烷基。在式I之一實施例中，c不存在或為視情況經取代之C1伸烷基。在式I之一實施例中，a、b及c未經取代。在式I之一實施例中，c不存在。
在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基或C3-20雜環炔基。在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基。在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C5-16基團。在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C5-12基團。
在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C5基團、C6基團或C7基團。在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C5基團或C6基團。
在式I之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起選自H1至H52。
在式I之一實施例中，X1為O。在式I之一實施例中，X2為O。
在式I之一實施例中，L包含至少一個雜原子。在式I之一實施例中，L包含至少一個O原子。在式I之一實施例中，L包含至少兩個雜原子。在式I之一實施例中，L包含至少兩個O原子取代。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基或C1-15伸雜烷基。在式I之一實施例中，Lc係選自式Lc-i至Lc-xxxxiii中之任一或多者。
在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-11基團。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-9基團。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C3-8基團。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C4-7基團。在式I之一實施例中，Lc為視情況經取代之C5、C6或C7基團。
在式I之一實施例中，d為0；e為0且f為1。
在式I之一實施例中，Y1為C12-28基團。在式I之一實施例中，Y1為C14-26基團。在式I之一實施例中，Y1為C16-24基團。在式I之一實施例中，Y1為C16-22基團。在式I之一實施例中，Y1具有至少一個烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1具有1、2或3個烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1在ω-3位具有烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1在ω-6位具有烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1在ω-9位具有烯烴基團。
在式I之一實施例中，Y1具有至少一個順式不飽和烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1具有至少兩個順式不飽和烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1具有至少三個順式不飽和烯烴基團。在式I之一實施例中，Y1係選自Y1-i至Y1-vii。
在式I之一實施例中，Y2經由視情況經取代之類固醇上之氧原子連接至L。在式I之一實施例中，Y2經由A類固醇環之3位上之氧原子連接至L。在式I之一實施例中，Y2為A類固醇環之3位之羥基的氫原子已移除之固醇。在式I之一實施例中，固醇為膽固醇。
本發明之第二實施例由式(II)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；b不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；c不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第三實施例由式(III)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第四實施例由式(IV)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第五實施例由式(V)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第六實施例由式(VI)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第七實施例由式(VII)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為0；Y1為視情況經取代之C16-22烯基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明之第八實施例由式(VIII)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為0；Y1為視情況經取代之C16-22烯基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為A類固醇環之3位經由羥基連接之膽固醇，該羥基之氫原子不存在。
本發明之第九實施例由式(IX)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇；及其中該化合物之pKa為約5.1至約7.4。
本發明之第十實施例由式(X)化合物表示：
或其醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇；及其中該化合物之pKa為約5.0至約6.7。
隱形脂質
本發明包括含有親水性頭基連接至脂質部分之「隱形脂質」。以下提供對隱形脂質之進一步表徵。
在一實施例中，提供一種式(XI)之隱形脂質組合物：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：Z為選自PEG及基於聚(噁唑啉)、聚(環氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]及聚(胺基酸)之聚合物的親水性頭基組分，其中該聚合物可為線性或分支聚合物，且其中該聚合物可視情況經取代；其中Z係由n個次單元聚合而成；n為Z之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，其中n針對不同聚合物類型經最佳化；L1為視情況經取代之C1-10伸烷基或C1-10伸雜烷基連接基團，包括0、1、2個或2個以上醚基(例如-O-)、酯基(例如-C(O)O-)、丁二酸酯基(例如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、胺基甲酸酯基(例如-OC(O)-NR'-)、碳酸酯基(例如-OC(O)O-)、酮基(例如-C-C(O)-C-)、羰基(例如-C(O)-)、脲基(例如-NRC(O)NR'-)、胺基(例如-NR'-)、醯胺基(例如-C(O)NR'-)、亞胺基(例如-C(NR')-)、硫醚基(例如-S-)、黃原酸酯基(例如-OC(S)S-)及磷酸二酯基(例如-OP(O)2O-)；其中任一者可經0、1或多個Z基團取代；其中R'係獨立地選自-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸酯基或視情況經取代之C1-10伸烷基；X1及X2係獨立地選自碳或選自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基之雜原子；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同，或其中A1及A2連同其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之類固醇。
在一實施例中，本發明提供一種式(XII)之隱形脂質：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中PEG為聚(乙二醇)次單元，其中PEG可為線性或分支PEG；n為PEG之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，較佳為約23個單元、約45個單元或約68個單元；L1為視情況經取代之C1-10伸烷基或C1-10伸雜烷基連接基團，其含有1、2個或2個以上醚基、酯基、丁二酸酯基、胺基甲酸酯基、碳酸酯基、酮基、羰基、脲基、胺基、醯胺基、亞胺基、硫醚基、黃原酸酯基及磷酸二酯基；其中任一者可經0、1或多個PEG基團取代；X1及X2係獨立地選自碳或氧；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同，或其中A1及A2連同其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之類固醇。
式(XI)及(XII)之隱形脂質當與例如式(I)之陽離子型脂質一起調配時提供與先前可比隱形脂質相比活體內效能增強之脂質奈米粒子。因此本發明提供具有改良功效及毒性之潛能的隱形脂質。由此提供含有此等隱形脂質之組合物及此等隱形脂質用於將生物活性劑傳遞至細胞之用途。
如表8中所提供，將使用相同方法且用其他方面一致但隱形脂質不同之組成調配的兩種例示性脂質奈米粒子傳遞至肝臟。含有先前技術隱形脂質S010且傳遞對因子VII(「FVII」)具特異性之siRNA構築體的脂質奈米粒子在投與肝臟時顯示72.2%之活體內抑制作用，而相比較而言含有隱形脂質S006之脂質奈米粒子顯示83.8%之活體內因子VII抑制作用。
在表9中提供之另一實例中，關於活體內傳遞至皮下腫瘤，比較6種具有除PEG/隱形脂質外其他方面一致之組成的脂質奈米粒子傳遞對保羅樣激酶1(Polo-Like Kinase 1，「PLK1」)具特異性之siRNA的有效性。含有先前技術隱形脂質S011之脂質奈米粒子在腫瘤組織中顯示46%之活體內PLK1抑制作用，而含有隱形脂質S004、S007、S009、S008及S005之脂質奈米粒子在腫瘤組織中分別顯示56%、65%、64%、60%及52%之活體內PLK1抑制作用。
當在用於傳遞生物活性劑(在此情況下為一或多種siRNA)之調配物及治療組合物中使用時，隱形脂質S001至S009及S012至S026個別地及藉此成類顯示改良之特徵。
本發明提供新穎隱形脂質。在本發明之一實施例中，隱形脂質為S001。在一實施例中，隱形脂質為S002。在一實施例中，隱形脂質為S003。在一實施例中，隱形脂質為S004。在一實施例中，隱形脂質為S005。在一實施例中，隱形脂質為S006。在一實施例中，隱形脂質為S007。在一實施例中，隱形脂質為S008。在一實施例中，隱形脂質為S009。在一實施例中，隱形脂質為S012。在一實施例中，隱形脂質為S013。在一實施例中，隱形脂質為S014。在一實施例中，隱形脂質為S015。在一實施例中，隱形脂質為S016。在一實施例中，隱形脂質為S017。在一實施例中，隱形脂質為S018。在一實施例中，隱形脂質為S019。在一實施例中，隱形脂質為S020。在一實施例中，隱形脂質為S021。在一實施例中，隱形脂質為S022。在一實施例中，隱形脂質為S023。在一實施例中，隱形脂質為S024。在一實施例中，隱形脂質為S025。在一實施例中，隱形脂質為S026。
用於傳遞生物活性劑之調配物
一般而言，儘管在先前技術中組織依賴性功效可藉由單獨改變隱形脂質來控制，但已意外發現關於特定組織之功效可藉由改變陽離子型脂質來控制。如下文所論述，已發現用於傳遞生物活性劑之脂質調配物可藉由僅改變調配物中所包括之陽離子型脂質來調節以先於一種細胞類型或器官優先靶向另一種細胞類型或器官。舉例而言，與含有pKa為約6.1或低於6.1之陽離子型脂質之調配物相比，在靶向肝臟之調配物中pKa為約6.1或6.1以上之陽離子型脂質更有效，該等含有pKa為約6.1或低於6.1之陽離子型脂質之調配物在活體內靶向腫瘤之調配物中相對更有效。通常(存在例外)，具有對傳遞至腫瘤最有效之脂質的調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約5.0至約6.7，尤其包括約5.2至約6.3、或約5.4至約6.2、或約5.8至約6.1之陽離子型脂質，視腫瘤類型而定；而具有對傳遞至肝臟最有效之脂質的調配物(如下文更詳細描述)含有pKa為約5.1至約7.4，包括約5.3至約7.3，包括約5.9至約7.0且在一實施例中包括約6.2至約6.8之陽離子型脂質。
在一實施例中，熟習此項技術者可藉由將具有所需pKa範圍之陽離子型脂質、隱形脂質、輔助脂質、視情況選用之基於烷基間苯二酚之脂質及視情況選用之中性脂質組合成調配物，包括例如脂質體調配物、脂質奈米粒子(LNP)調配物及其類似物來進一步最佳化以活體內傳遞至特定細胞及組織。在一實施例中，藉由調整此等不同類型之脂質之間的脂質莫耳比獲得進一步最佳化。在一實施例中，藉由調整以下中之一或多者來獲得進一步最佳化：所需粒度、N/P比率、調配方法及/或給藥方案(例如隨時間投與之劑量數、實際劑量(以mg/kg計)、劑量之時序、與其他治療劑之組合等)。熟習此項技術者已知與以上所列實施例有關的各種最佳化技術視為本發明之一部分。
在一實施例中，提供本發明之陽離子型脂質，其中用於傳遞治療有效量之生物活性劑的調配物包含至少一種陽離子型脂質、至少一種輔助脂質及至少一種隱形脂質。在一實施例中，該種調配物進一步包含至少一種中性脂質。在一實施例中，調配物經最佳化以用於傳遞生物活性劑以便傳遞至腫瘤。在一實施例中，調配物經最佳化以用於傳遞生物活性劑以便傳遞至肝臟。在一實施例中，調配物經最佳化以用於傳遞特定類型之生物活性劑。生物活性劑之例示性類型包括(但不限於)例如抗體、膽固醇、激素、抗病毒藥、肽、多肽、蛋白質、核蛋白、化學治療劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷衍生物、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、2,5-A反義嵌合體、異位酶、適體、核糖核酸酶、誘餌RNA分子及其類似物、及小核酸分子，諸如短干擾核酸(siRNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)。該等生物活性劑可視情況用一或多種其他化學及生物藥劑最佳化以增強其治療價值，例如調節諸如穩定性、半衰期、效能及/或免疫原性之生物特性的改良。
為將治療劑傳遞至腫瘤，較佳調配物選自傳遞足量生物活性劑以有效調節需要該投藥之個體中治療目標之活性的彼等調配物。
在生物活性劑為RNAi構築體之情況下，RNAi、siRNA、siNA或shRNA之有效量為使目標細胞中所表現之目標mRNA敲除(KD)至少20%或大於20%、50%或大於50%、60%或大於60%、70%或大於70%、75%或大於75%、80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、95%或大於95%或至多100%的量。一般而言，有效治療所需之治療相關性KD範圍之選擇可因所靶向路徑、細胞類型或組織及/或所治療之疾病或病症而改變。
本文報導R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成環狀「頭基」之上文所述類型之陽離子型脂質為有效用於脂質調配物中的陽離子型脂質。此外，目前報導環狀頭基之存在出乎意料地改變脂質調配物之特性，且特定言之其改變其他取代基之影響。
本發明陽離子型脂質化合物之頭基(亦即R1-N-R2)含有三級胺基。此特徵使化合物具有不同特性，例如其是否具有例如四級(陽離子型)胺基，此係因為氮之四級銨化將使原子具有固定電荷，從而移除其pH值反應性且使化合物具有極不同的特性。
在一特定情況下，與僅頭基不同之脂質E0173及E0172相比，本發明化合物E0027及E0014中環狀頭基之存在改變陽離子型脂質整體充當調配物中有效傳遞劑之能力。舉例而言，如下文更詳細描述，含有具有-N(Me)2頭基之特定陽離子型脂質(E0173，CLinDMA)之調配物當在用於傳遞對因子VII具特異性之RNAi構築體的調配物中使用時顯示98.5%之活體內因子VII抑制作用。當藉由用L伸雜烷基取代基(以下用箭頭標記)置換L伸烷基取代基來改質該化合物時，發現化合物(E0172)之活性降低：發現活體內因子VII抑制作用為40.8%。
相反，本發明之發明者發現，當環狀頭基存在時，使L伸烷基變為L伸雜烷基取代基具有相反作用：化合物之功效增加。舉例而言：
因此，本發明之一實施例包含L包含一或多個雜原子之彼等化合物。由揭示CLinDMA開始熟習此項技術者不會得到該等化合物，此係因為如上所述，由具有CLinDMA頭基之化合物開始，熟習此項技術者將發現包含兩個或兩個以上雜原子之L基團會降低最終化合物之功效，且因此不會提供包含該種基團之化合物。
不希望受任何理論束縛，一種可能性為本發明脂質調配物之功效與pKa有關。陽離子型脂質之pKa可藉由改變結構，例如藉由改變L中雜原子之數目或藉由改變頭基之性質來調整。
在一實例中，參考活體內siRNA實驗，例如在表8中，使用在肝臟中分別產生98.5%、40.8%、30.3%及97.4%之因子VII抑制作用的上述調配物(含有陽離子型脂質E0172、E0171、E0027及E0014)，發現其pKa值分別為6.7、8.5、5.7及6.4。
關於將藥劑傳遞至肝臟，對於本發明之一實施例而言，認為通常(存在例外)用於該等調配物中之最有效陽離子型脂質之pKa為約5.1至約7.4。在一實施例中，提供pKa為約5.3至約7.3之陽離子型脂質用於本發明之調配物以便進行肝臟傳遞。在一實施例中，提供pKa為約5.9至約7.0之陽離子型脂質用於本發明之調配物以便進行肝臟傳遞。在一實施例中，較佳脂質之pKa範圍為約6.2至約6.8以供在用於將生物活性劑傳遞至肝臟之調配物中使用。
本發明之意外發現為腫瘤組織對於功效具有不同最佳pKa範圍。因此，意欲脂質將生物活性劑傳遞至肝細胞時先前段落中之pKa範圍適用。
關於將生物活性劑傳遞至腫瘤，認為通常(存在例外)用於該等調配物之最有效本發明陽離子型脂質具有約5.0至約6.7之pKa，且因此在一實施例中為用於傳遞至腫瘤之較佳脂質。
在一通用實施例中，提供pKa為約5.0至約6.7之陽離子型脂質用於本發明之調配物中以用於將生物活性劑傳遞至一或多種腫瘤。在一實施例中，提供pKa為約5.2至約6.3之陽離子型脂質用於本發明之調配物中以用於將生物活性劑傳遞至一或多種腫瘤。在一實施例中，提供pKa為約5.4至約6.2之陽離子型脂質用於本發明之調配物中以用於將生物活性劑傳遞至一或多種腫瘤。在一實施例中，提供pKa為約5.8至約6.1之陽離子型脂質用於本發明之調配物中以用於將生物活性劑傳遞至一或多種腫瘤。
在一實施例中，調配物中所用之陽離子型脂質具有經最佳化以用於將生物活性劑傳遞至特定腫瘤或細胞類型之pKa。腫瘤類型可為原發性腫瘤或可為轉移性腫瘤。
在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.0至約6.7之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.3至約6.3之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.4至約5.9之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.8至約5.9之陽離子型脂質。
在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至HepG2樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.2至約6.2之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.3至約6.2之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至Hep3B樣腫瘤之調配物含有pKa為約5.6至約6.1之陽離子型脂質。在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至HepG2樣腫瘤之調配物含有pKa為約6.1之陽離子型脂質。
在一特定實施例中，經最佳化以用於傳遞至786-0樣腎腫瘤或其轉移灶之調配物含有pKa為約6.1之陽離子型脂質。
合理假定其他組織、適應症、腫瘤類型或投藥途徑可具有較佳脂質pKa範圍。對於脂質體或LNP調配物而言，亦合理假定各種組織、適應症、腫瘤類型或投藥途徑可具有較佳陽離子型脂質pKa範圍、N/P比率、粒度、所用陽離子型脂質、所用隱形脂質、所用輔助脂質、視情況使用所選中性脂質、各脂質組分之相對莫耳比率、調配方法、待傳遞之生物活性劑及包括所給劑量之給藥方案。以下描述獨立地或以協調方式將此等態樣中之每一者最佳化，且咸信無需過度實驗，該最佳化之許多特定態樣在熟習此項技術者之能力範圍內。
調配物可由熟習此項技術者藉由調整調配物之其他態樣來最佳化，包括(但不限於)個別地選擇例如對於所靶向之細胞類型或器官最佳之陽離子型脂質之pKa；所用陽離子型脂質；所用隱形脂質；所用輔助脂質；存在抑或不存在中性脂質；所用中性脂質(若存在)之選擇；所選輔助脂質、視情況選用之中性脂質、隱形脂質及陽離子型脂質之莫耳比；N/P比率；粒度；給藥方案；所給劑量；調配方法；及其類似因素。
式(I)至式(X)之化合物之實施例 a、b及c
在一實施例中、a為視情況經取代之C1-2伸烷基。在一實施例中、a為視情況經取代之C1伸烷基。
在一實施例中、b為視情況經取代之C0-2伸烷基。在一實施例中，b為視情況經取代之C1伸烷基。
在一實施例中，c不存在或為視情況經取代之C1伸烷基。在一實施例中，c不存在。
在一實施例中，a、b及c若存在則未經取代。
陽離子型脂質之頭基
在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基、C5雜芳基或C6雜芳基。在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基或C3-20雜環炔基。在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基。
在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之環狀C5-16基團。在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之環狀C5-12基團。在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之環狀C5基團、環狀C6基團或環狀C7基團。在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之環狀C5基團或環狀C6基團。
在本發明之一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成包含至少一個氧原子之環狀物質。
在一實施例中，R1及R2連同其所連接之氮原子一起選自表1中所提供之頭基H1至H52中之至少一者。
陽離子型脂質之pKa
在一實施例中，pKa範圍在所需範圍內之本文之陽離子型脂質較佳，尤其包括用於傳遞生物活性劑之調配物。
如上文所提及且如下所示，當在用於靶向肝臟之調配物中使用時，pKa為約5.1至約7.4之陽離子型脂質一般有效。在一實施例中，對於傳遞至肝臟，陽離子型脂質之pKa為約5.1至約7.4。在一實施例中，對於在特異性靶向肝臟之調配物中使用，陽離子型脂質之pKa為約5.3至約7.3。因此，在一實施例中，對於傳遞至肝臟，陽離子型脂質之pKa為約5.3至約7.3。在一實施例中，對於傳遞至肝臟，陽離子型脂質之pKa為約5.9至約7.0。在一實施例中，對於傳遞至肝臟，陽離子型脂質之pKa為約6.2至約6.8。
如上文所提及且下文以實驗說明，當在用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之調配物中使用時，pKa為約5.0至約6.7之陽離子型脂質尤其有效。因此，在一實施例中，對於傳遞至腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.0至約6.7。在一實施例中，對於傳遞至腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.2至約6.3。在一實施例中，對於傳遞至腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.4至約6.2。在一實施例中，對於傳遞至腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.8至約6.1。在一通用實施例中，對於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞，陽離子型脂質之pKa為約6.1或6.1以下。
可視腫瘤類型而定將在用於傳遞生物活性劑之調配物中使用之陽離子型脂質之pKa進一步最佳化。舉例而言，如表9、表10及表11中所提供，可將對PLK1 mRNA具特異性之RNAi構築體區別地以與LNP調配物中陽離子型脂質之pKa有關的方式傳遞至注射至小鼠側腹中之Hep3B、HepG2及786-0腎腫瘤中。進一步分析後，發現對於活體內敲除Hep3B腫瘤中之PLK1最佳之pKa範圍與用於HepG2及786-0腫瘤之最佳pKa範圍不同，但兩種範圍皆在如以上段落所列5.0至6.7之通用範圍內，且所有範圍一般均包括pKa低於對於傳遞至肝臟最佳之pKa的陽離子型脂質。
因此，在將生物活性劑活體內傳遞至Hep3B樣腫瘤之一實施例中，本發明之陽離子型脂質之pKa在約5.0至約6.7範圍內。在一實施例中，對於傳遞至Hep3B樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.3至約6.3。在一實施例中，對於傳遞至Hep3B樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.4至約5.9。在一實施例中，對於傳遞至Hep3B樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.8至約5.9。
此外，在將生物活性劑活體內傳遞至HepG2樣腫瘤之一實施例中，本發明之陽離子型脂質之pKa在約5.2至約6.2範圍內。在一實施例中，對於傳遞至HepG2樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.3至約6.2。在一實施例中，對於傳遞至HepG2樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約5.6至約6.1。在一實施例中，對於傳遞至HepG2樣腫瘤或786-0腎腫瘤樣腫瘤，陽離子型脂質之pKa為約6.1。
X 1 及X 2
在一實施例中，X1為O。在另一實施例中，X2為O。在一實施例中，X1與X2皆為O。
連接基團
在一實施例中，L包含至少一個雜原子。此意謂提供X2與Y2之間的直接連接之鏈具有至少一個雜原子。換言之，出於此等目的，L上取代基中之任何雜原子不計算在內。在一實施例中，L包含至少一個O原子。
在一實施例中，L包含至少兩個雜原子。在一實施例中，L包含至少兩個O原子。
在一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基或C1-15伸雜烷基。在一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基或C1-15伸雜烷基且d及e皆為零(0)。
在一實施例中，Lc係選自式Lc-i至式Lc-xxxxiii中之一者。在一實施例中，Lc係選自式Lc-i至Lc-xxxxiii中之一者且d及e皆為零(0)。
因為L包含至少一個雜原子之基團較佳，所以Lc較佳選自Lc-i、Lc-iv至Lc-vii及Lc-ix至Lc-xxxxiii。
在一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基。
在一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-11基團。在一實施例中，Lc為視情況經取代之C1-9基團。在一實施例中，Lc為視情況經取代之C3-8基團。在一實施例中，其中Lc為視情況經取代之C4-7基團。在一實施例中，Lc為視情況經取代之C5、C6或C7基團。
在一實施例中，d為0；e為0，且f為1。在一實施例中，d為0；e為0，且f為1，且Lc為上文所述鏈長度內之伸雜烷基。
陽離子型脂質之Y 1
在一實施例中，Y1為C12-28基團。在一實施例中，Y1為視情況經取代之C14-26基團。在一實施例中，Y1為視情況經取代之C16-24基團。在一實施例中，Y1為視情況經取代之C16-22基團。在一實施例中，視情況經取代之Y1鏈長度為18、19、20或21個原子。
在上文所述之碳範圍內，Y1較佳為烯基或雜烯基。
在一實施例中，Y1具有至少一個烯烴基團。在一實施例中，Y1具有1、2或3個烯烴基團。
在一實施例中，Y1在ω-3位具有烯烴基團。在另一實施例中，Y1在ω-6位具有烯烴基團。在另一實施例中，Y1在ω-9位具有烯烴基團。在一實施例中，Y1在ω-3、ω-6及ω-9位中之兩者或三者具有烯烴基團。在一實施例中，Y1在ω-6及ω-9位不飽和。在另一實施例中，Y1在ω-3、ω-6及ω-9位不飽和。在一實施例中，Y1在ω-9位不飽和。
在一實施例中，Y1具有至少一個順式不飽和烯烴基團。在一實施例中，Y1具有至少兩個順式不飽和烯烴基團。在一實施例中，Y1具有至少三個順式不飽和烯烴基團。至少一個順式不飽和烯烴基團可位於ω-3、ω-6及ω-9位中之一者、兩者或三者。脂質鏈中之不飽和論述於MacLachlan等人,Journal of Controlled Release 107(2005) 276-287中。
在一實施例中，Y1係選自如表2中所提供之Y1-i至Y1-vii。
Y 2
在一實施例中，Y2經由視情況經取代之類固醇上之氧原子連接至L。在一實施例中，Y2經由A類固醇環之3位上之氧原子連接至L。在一實施例中，Y2為位於A類固醇環之3位之羥基的氫原子已移除之固醇(且與L之連接係經由該羥基之氧原子)。
在一實施例中，該固醇係選自由以下組成之群：安那固醇(annasterol)；燕麥固醇(avenasterol)；β-植固醇(beta-sitosterol)；菜籽固醇(brassicasterol)；鈣化醇(calciferol)；油菜籽固醇(campesterol)；口角固醇(chalinosterol)；穿貝海綿固醇(chinasterol)；膽固烷醇(cholestanol)；膽固醇(cholesterol)；腎固醇(coprostanol)；環阿屯醇(cycloartenol)；去氫膽固醇(dehydrocholesterol)；鏈固醇(desmosterol)；二氫鈣化醇(dihydrocalciferol)；二氫膽固醇(dihydrocholesterol)；二氫麥角固醇(dihydroergosterol)；甲藻固醇(dinosterol)；表膽固醇(epicholesterol)；麥角固醇(ergosterol)；海藻固醇(fucosterol)；六氫感光固醇(hexahydrolumisterol)；六醇(hexaol)；羥基膽固醇(hydroxycholesterol)；羊毛固醇(lanosterol)；感光固醇(lumisterol)；帕克醇(parkeol)；多孔固醇(poriferasterol)；大褐馬尾藻固醇(saringosterol)；植固烷醇(sitostanol)；植固醇(sitosterol)；豆固烷醇(stigmastanol)；豆固醇(stigmasterol)；溫勃固醇(weinbersterol)；酵母固醇(zymosterol)；固醇膽汁酸(諸如膽酸；鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)；甘膽酸(glycocholic acid)；牛膽酸(taurocholic acid)；去氧膽酸(deoxycholic acid)及石膽酸(lithocholic acid))；及/或其醫藥學相關性鹽或醫藥學上可接受之衍生物。
在一實施例中，固醇為膽固醇。
用於傳遞生物活性劑之特定脂質
本發明之新穎陽離子型脂質及隱形脂質可用於傳遞治療上可接受之藥劑，包括例如生物活性劑。本發明通篇描述含有陽離子型脂質、隱形脂質及其他類型脂質之調配物。雖然咸信本文所揭示之脂質新穎且有用，但如下文所提供之例示性及非限制性揭示內容中所進一步描述，對於治療性用途而言某些特徵優於其他特徵。在一實施例中，脂質體、脂質奈米粒子或其他此類脂質調配物進一步包含生物有效藥劑。在一實施例中，脂質體、脂質奈米粒子或其他此類脂質調配物未加載其他成分。
在一實施例中，用於調配物中之各別脂質組分以套組形式提供。在一實施例中，套組含有產生脂質調配物之說明書。套組可包含現成調配物或需要在投與之前混合的各別或部分組分。套組可另外提供其他組分，諸如(但不限於)對照物、緩衝液、容器及傳遞組分，或可限於本發明之脂質及如本文所述之組分。
在一實施例中，套組含有至少一種脂質體或脂質體組分，包括(但不限於)陽離子型脂質、隱形脂質、輔助脂質及/或視情況選用之中性脂質中之一或多者。在一實施例中，套組另外包含生物活性劑。在一實施例中，套組另外包含一或多種對照脂質或對照劑、對照脂質體調配物、染色劑、緩衝液、使用說明書及其類似物。在一替代實施例中，將脂質體調配物預混合。一或多種套組化學組分可以脫水形式或水合形式提供。可使用在此項技術中已知用於本文所述之各種化合物及組合物之冷凍乾燥中脫水的各種方法中之任一者。
在本發明之一態樣中，提供下文所例示之特定化合物或其醫藥學上可接受之衍生物中之任一者。
在一實施例中，化合物係用於將生物活性劑傳遞至肝臟，且該化合物係選自E0024、E0014、E0052、E0118、E0175、E0177或E0083中之一或多者。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含一或多種選自E0024、E0014、E0052、E0118或E0083之化合物。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含化合物E0024。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含化合物E0014。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含化合物E0052。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含化合物E0118。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之組合物包含化合物E0083。
在一實施例中，化合物係用於將生物活性劑傳遞至腫瘤，且該化合物係選自E0011、E0008、E0025、E0026、E0076、E0077、E0085或E0088中之一或多者。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含一或多種選自E0011、E0008、E0025、E0026、E0076、E0077、E0085或E0088之化合物。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0011。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0008。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0025。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0026。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0076。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0077。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0085。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤之組合物包含化合物E0088。
脂質體、脂質奈米粒子及含有一或多種本文所述脂質之其他此類脂質調配物適用於活體外或活體內將核酸組合物傳遞至細胞或組織。治療相關性核酸組合物包括對一或多種與疾病或病症相關之基因有特異性之RNAi劑，其中用RNAi劑靶向細胞或組織中之內源性序列產生治療性或預防性作用。
通常(但不限於)，用於傳遞生物活性劑(尤其包括RNAi劑)之治療有效量之目標抑制作用產生至少70%之目標抑制作用，其中目標表現於肝臟中。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至肝臟之調配物中時提供至少70%之目標抑制作用。當經調配用於肝臟時提供至少70% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0007、E0008、E0011、E0014、E0015、E0016、E0017、E0018、E0019、E0022、E0024、E0025、E0026、E0032、E0034、E0040、E0042、E0043、E0045、E0048、E0049、E0051、E0052、E0053、E0054、E0055及E0118。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至肝臟之調配物中時提供至少80%之目標抑制作用。當經調配用於肝臟時提供至少80% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0008、E0011、E0014、E0016、E0017、E0018、E0019、E0022、E0024、E0025、E0026、E0032、E0034、E0040、E0042、E0043、E0045、E0048、E0052、E0053、E0054、E0055及E0118。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至肝臟之調配物中時提供至少90%之目標抑制作用。當經調配用於肝臟時提供至少90%KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0011、E0014、E0017、E0018、E0024、E0025、E0026、E0040、E0043、E0045、E0052、E0053、E0054、E0055及E0118。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至肝臟之調配物中時提供至少95%之目標抑制作用。當經調配用於肝臟時提供至少95%KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0014、E0017、E0018、E0024、E0026、E0040、E0043、E0052、E0054、E0055及E0118。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至肝臟之調配物中時提供至少98%之目標抑制作用。當經調配用於肝臟時提供至少98% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0014、E0017、E0018、E0024、E0052、E0054及E0118。
通常(但不限於)，用於傳遞生物活性劑(尤其包括RNAi劑)之治療有效量之目標抑制作用產生至少50%之目標抑制作用，其中目標為腫瘤。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中時提供至少50%之目標抑制作用。當經調配用於腫瘤或腫瘤細胞時提供至少50% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0008、E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077、E0085，E0088、E0095、E0104、E0178及E0179。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中時提供至少60%之目標抑制作用。當經調配用於腫瘤或腫瘤細胞時提供至少60%KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0008、E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077、E0085及E0088。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中時提供至少70%之目標抑制作用。當經調配用於腫瘤或腫瘤細胞時提供至少70% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077及E0088。在一實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中時提供至少80%之目標抑制作用。當經調配用於腫瘤或腫瘤細胞時提供至少80% KD之陽離子型脂質包括(但不限於)E0008、E0025及E0076。
在一特定實施例中，用於傳遞生物活性劑(尤其包括RNAi劑)之治療有效量之目標抑制作用產生至少30%之目標抑制作用，其中目標為HepG2樣腫瘤或786-0樣腫瘤。在一特定實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至HepG2樣腫瘤或786-0樣腫瘤之調配物中時提供至少30%之目標抑制作用，且包括E0056、E0076、E0085、E0104、E0175、E0176及E0177。在一特定實施例中，本發明之陽離子型脂質當提供於用於將RNAi傳遞至HepG2樣腫瘤或786-0樣腫瘤之調配物中時提供至少30%之目標抑制作用，且包括E0085、E0175及E0177。
用於向肝臟傳遞之特定陽離子型脂質
在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0014。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0017。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0018。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0024。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0052。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0054。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0118。
在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之較佳調配物含有pKa為約5.1至約7.4之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之較佳調配物含有pKa為約5.3至約7.3之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之較佳調配物含有pKa為約5.9至約7.0之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之較佳調配物含有pKa為約6.2至約6.8之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至肝臟之較佳調配物含有pKa為約6.1或高於6.1之陽離子型脂質。
用於向腫瘤傳遞之特定陽離子型脂質
在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0008。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0025。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0076。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0085。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0175。在一實施例中，較佳陽離子型脂質為E0177。
在一實施例中，用於將生物活性劑活體內傳遞至腫瘤之較佳調配物含有pKa為約5.0至約6.7之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑活體內傳遞至腫瘤之較佳調配物含有pKa為約5.2至約6.3之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑活體內傳遞至腫瘤之較佳調配物含有pKa為約5.4至約6.2之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑活體內傳遞至腫瘤之較佳調配物含有pKa為約5.8至約6.1之陽離子型脂質。在一實施例中，用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之較佳調配物含有pKa為約6.1或低於6.1之陽離子型脂質。
醫藥組合物及調配物
本發明提供一種包含至少一種本發明之陽離子型脂質化合物之醫藥組合物。本發明提供一種包含至少一種本發明之隱形脂質化合物之醫藥組合物。在一實施例中，存在至少一種其他脂質組分。該等組合物亦可含有生物活性劑，視情況與一或多種其他脂質組分組合。在一實施例中，一或多種組分、組合物及/或藥劑以套組形式提供。在一實施例中，含有本發明之脂質與一或多種生物活性劑組合之組合物提供為用於例如將治療有效量之一或多種生物活性劑傳遞至細胞或組織的調配物。在一實施例中，細胞或組織在需要治療或預防之個體中。在一實施例中，個體為需要治療有效量之生物活性劑的患者。如本文所用之個體包括人類與非人類動物。
其他脂質組分可為選自由以下組成之群的一或多者：陽離子型脂質、(視情況選用之)中性脂質、輔助脂質、隱形脂質及基於烷基間苯二酚之脂質。在一實施例中，本發明提供一種組合物，其包含：(a)陽離子型脂質，例如式I至式X中任一者之化合物，及/或本發明之E0001-E0171及E0175-E0180；(b)視情況選用之中性脂質，例如DSPC；(c)輔助脂質，例如含有膽固醇之輔助脂質；(d)隱形脂質，例如式XI或式XII中之一者或S001-S009及S012-S026中之任一或多者、或1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目錄號880150P，來自Avanti Polar Lipids)。在一實施例中，脂質組分位於脂質體調配物中，例如奈米粒子或其類似物。在一實施例中，脂質體調配物另外包含生物活性劑。在一實施例中，脂質體調配物另外包含治療有效量之生物活性劑。
其他組分可為例如選自由以下組成之已知陽離子型脂質之群的一或多者：氯化N,N-二油醯基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂醯基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)、氯化N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油醯基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、1,2-二油醯基胺甲醯基-3-二甲基銨-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基銨丙烷(DLTAP)、三氟乙酸二油醯基氧基-N-[2-精胺甲醯胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)、雙十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、DC-Chol、溴化1,2-雙十四烷基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基銨(DMRIE)、3-二甲基胺基-2-(膽固-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順，順-9,12-十八烷基二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順，順-9',12'-十八烷基二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)及N,N-二甲基-3,4-二油醯基氧基苄胺(DMOBA)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、1,2-N,N'-二油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)。在一實施例中，其他脂質組分為DOTAP或DLTAP。
在一實施例中，陽離子型脂質係選自式I之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式II之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式III之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式IV之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式V之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式VI之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式VII之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式VIII之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式IX之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自式X之脂質。在一實施例中，陽離子型脂質係選自E0001至E0171(E0001-E0171)及E0175至E0180(E0175-E0180)之清單。
其他脂質組分可例如為中性脂質。在一實施例中，中性脂質可為選自多種中性不帶電或兩性離子型脂質中任一者之一或多者。用於本發明之中性磷脂之實例包括：5-十七烷基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、膽固醇半丁二酸酯(CHEMS)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-軟脂醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-軟脂醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1-硬脂醯基-2-軟脂醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DAPC)、1,2-雙二十烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DEPC)、軟脂醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、軟脂醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺或其組合。在一實施例中，中性磷脂係選自由二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)組成之群。
其他脂質組分可為例如陰離子型脂質，例如能夠產生穩定複合物之陰離子型脂質。陰離子型脂質之實例為磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二醯基磷脂醯乙醇胺、N-丁二醯基磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯基磷脂醯乙醇胺及離胺醯基磷脂醯甘油。
適合中性及陰離子型脂質亦包括US 2009/0048197段落[0119]中所述之彼等脂質。
在一實施例中，所投與組合物中脂質之總量為每毫克生物活性劑(例如siRNA)約5至約30毫克脂質，在另一實施例中為每毫克生物活性劑(例如siRNA)約5至約25毫克脂質，在另一實施例中為每毫克生物活性劑(例如siRNA)約7至約25毫克脂質，且在一實施例中為每毫克生物活性劑(例如siRNA)約7至約15毫克脂質。
此項技術中可獲得各種將生物活性劑加載於諸如脂質體及脂質奈米粒子之脂質組合物中之方法，包括被動與主動加載方法。任一者均涵蓋於本發明之範疇內。所用確切方法可基於一多重因素進行選擇，該等因素包括(但不限於)例如待加載之生物活性劑、加載後所欲使用之儲存方法、所得粒子之大小及預期給藥方案。方法包括例如在脂質體形成或復水時機械混合藥物及脂質、將所有組分溶解於有機溶劑中且將其濃縮成乾燥膜、形成pH值或離子梯度以將活性劑引入脂質體內部、產生跨膜電位及離子載體介導之加載。參見例如至少以下實例68、實例69及實例77、PCT公開案第WO 95/08986號、美國專利第5,837,282號、美國專利第5,837,282號及美國專利第7,811,602號。
所投與生物活性劑之劑量將視許多因素而定，諸如生物活性劑之特性及目標患者(例如動物物種)。因此在將siRNA投與動物時將調整生物活性劑之濃度，通常為每劑量0.1 mg/ml至10 mg/ml之濃度。
siRNA之總量可藉由若干方法量測。HPLC方法包括陰離子交換、逆相(RP)或尺寸排阻(SEC)。亦可使用螢光方法。在所有此等方法中，須將奈米粒子溶解以在量測總siRNA含量之前自奈米粒子釋放siRNA。
在一實施例中，組合物包含構成組合物中存在之總脂質之約10%至約80%、約20%至約70%或約30%至約60%之陽離子型脂質組分。此等百分比為相對於最終脂質粒子中脂質組分之總莫耳數的莫耳百分比。
在一實施例中，組合物包含構成組合物中存在之總脂質之約0%至約50%、約0%至約30%或約10%至約20%之中性脂質組分。在一實施例中，組合物之中性脂質組分係視情況選用。在一實施例中，組合物無中性脂質組分。此等百分比為相對於最終脂質粒子中脂質組分之總莫耳數的莫耳百分比。
在一實施例中，組合物包含構成組合物中存在之總脂質之約5%至約80%、約20%至約70%或約30%至約50%之輔助脂質組分。此等百分比為相對於最終脂質粒子中脂質組分之總莫耳數的莫耳百分比。
在一實施例中，組合物包含構成組合物中存在之總脂質之約0%至約10%、約1%至約6%或約2%至約5%之隱形脂質組分。此等百分比為相對於最終脂質粒子中脂質組分之總莫耳數的莫耳百分比。
在一實施例中，組合物包含構成調配物中存在之總脂質之約30%至約60%的陽離子型脂質組分、構成調配物中存在之總脂質之約0%至約30%的中性脂質、構成調配物中存在之總脂質之約18%至約46%的輔助脂質、及構成調配物中存在之總脂質之約2%至約4%的隱形脂質。此等百分比為相對於最終脂質粒子中脂質組分之總莫耳數的莫耳百分比。
本發明之脂質體組合物可以許多方法中之任一者投與，該等方法包括非經腸、靜脈內、全身性、局部、經口、瘤內、肌肉內、皮下、腹膜內、吸入或任何此類傳遞方法。在一實施例中，組合物係非經腸投與，亦即關節內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投與。在一特定實施例中，脂質體組合物藉由靜脈內輸注或藉由腹膜內快速注射投與。
本發明之脂質體組合物可調配為適於向個體傳遞之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物通常進一步包含一或多種緩衝液(例如中性緩衝鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質、多肽或胺基酸(諸如甘胺酸)、抗氧化劑、抑細菌劑、螯合劑(諸如EDTA或麩胱甘肽)、佐劑(例如氫氧化鋁)、使調配物與接受者之血液等張、低張或弱高張之溶質、懸浮劑、增稠劑及/或防腐劑。或者，本發明之組合物可調配為冷凍乾燥產物。
在本發明中使用之適合調配物可見於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.，增刊第17版(1985)。通常，靜脈內組合物將包含脂質體懸浮於諸如水性載劑之可接受載劑中之溶液。
傳遞生物活性劑之方法及相關用途
本發明之陽離子型及隱形脂質適用於傳遞生物活性劑所用之調配物。含有本發明之新穎脂質之調配物可呈各種形成，包括(但不限於)形成傳遞劑之粒子(包括微粒、奈米粒子)及適用於將各種分子傳遞至細胞之轉染劑。特定調配物有效向諸如細胞培養物、個體或生物體中之相關細胞及/或組織轉染或傳遞生物活性劑，諸如抗體(例如單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、奈米抗體及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白質、化學治療劑及其他類型之抗贅生劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、反義DNA或RNA組合物、嵌合DNA:RNA組合物、異位酶、適體、核糖核酸酶、誘餌及其類似物、質體及其他形式之表現載體及小核酸分子、RNAi劑、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)分子。以上生物活性劑之清單僅為例示性的，且不欲有限制性。該等化合物可經純化或部分純化，且可為天然存在或合成的，且可經化學改質。
含有生物活性劑之該等調配物適用於例如提供組合物以預防、抑制或治療細胞、個體或生物體之疾病、病狀或性狀。疾病、病狀或性狀包括(但不限於)增生性疾病(包括癌症)、發炎性疾病、移植及/或組織排斥反應、自體免疫性疾病或病狀、年齡相關性疾病、神經或神經退化性疾病、呼吸道疾病、心血管疾病、眼部疾病、代謝性疾病、皮膚疾病、聽覺疾病、肝臟疾病、腎臟或腎疾病等。
每劑量所投與活性劑之量為高於最低治療劑量但低於毒性劑量之量。每劑量之實際量可由醫師根據許多因素來確定，該等因素為諸如患者之病史、使用其他療法、待提供之生物活性劑及疾病性質。在整個治療中可根據患者對治療之反應及任何治療相關性副作用之存在或嚴重程度來調整所投與生物活性劑之量。已由適當管理機構批准之化合物之例示性劑量及治療為已知的且熟習此項技術者可獲得。參見例如Physician's Desk Reference,第64版,Physician's Desk Reference Inc.(2010)，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.(1985)及Remington The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams & Williams Publishers(2005)。
在一實施例中，將單次劑量之生物活性劑投與有需要之患者。在一實施例中，投與多次劑量，其中多次劑量可同時、依序或交替投與。在一實施例中，多次劑量中投與相同調配物。在一實施例中，多次劑量中調配物不同。在各種實施例中，劑量可一天或歷時連續1、2、3、4天或4天以上投與一次。在一實施例中，劑量每週投與一次。在一實施例中，劑量每隔一週投與一次。在一實施例中，視患者對治療之反應而定，患者接受至少兩個過程且可能更多的治療方案。在單藥劑方案中，總治療過程由患者及醫師基於觀測到之反應及毒性來確定。以上給藥方案視為例示性方案。其他給藥方案涵蓋在本發明之範疇內且視所需治療作用而定。
在一實施例中，本發明提供一種將生物活性劑傳遞至細胞之方法，其包含向細胞投與包含生物活性劑及本發明之化合物的組合物。
該細胞可在活體內或活體外。
本發明提供一種用於治療之式(I)化合物。亦提供式I化合物之子集，該等子集在式II至式X中進一步區分。本文中一般將式I至式X之化合物稱為陽離子型脂質。
本發明進一步提供一種用於治療之式(XI)化合物。亦提供式XI化合物之子集，該子集在式XII中進一步區分。本文中一般將式XI及式XII之化合物稱為隱形脂質。
本發明進一步提供一種治療疾病或病狀之方法，其包含與治療該疾病或病狀之生物活性劑組合向患者投與治療有效量之含有至少一種式(I)化合物之組合物的步驟。本發明亦提供一種含有至少一種式(XI)化合物之組合物，其係用於治療疾病或病狀。
本發明亦提供式(I)化合物用於製造用於治療疾病或病狀之藥劑的用途。在一實施例中，藥劑含有治療疾病或病狀之生物活性劑。本發明亦提供治療疾病或病狀之生物活性劑用於製造用於治療疾病或病狀之藥劑的用途，其中該藥劑亦含有式(I)或式XI之化合物。
本發明亦提供一種治療疾病或病狀之方法，其包含以含有至少一種本發明組合物之調配物向患者投與治療有效量之生物活性劑的步驟。在一實施例中，該疾病或病狀為肝臟疾病、腫瘤或疾病。在一實施例中，疾病或病狀可藉由投與siRNA劑來治療。
本發明亦提供一種用於治療患者之疾病或病狀之本發明組合物。在一實施例中，該疾病或病狀為肝臟疾病、腫瘤或由mRNA編碼之蛋白質介導之疾病。
本發明亦提供一種含有式(I)及/或式XI之化合物之產物。在一實施例中，該產物進一步包含生物活性劑作為在治療中同時、各別或依序使用之組合製劑。
投藥及調配 概要
對於醫藥用途，本發明之化合物及組合物可作為藥劑之至少一部分藉由腸內或包括靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、氣管(氣霧劑)、經口、鼻內、直腸、陰道、頰內、鼻咽、胃腸或舌下投藥之非經腸途徑投與。投藥可為全身性或局部投藥。局部投藥可包括例如導管插入術、植入、滲透泵、直接注射、皮膚/經皮施用、支架置入術、耳/眼滴劑或門靜脈投藥。應評估式(I)及/或式XI之化合物之生物醫藥特性，諸如溶解性及溶液穩定性(整個pH值範圍內)、滲透性等，以選擇最適用於治療所提出病症之劑型及投藥路徑。
本發明之化合物及組合物一般(但不一定)作為調配物與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑聯合投與。術語「賦形劑」包括除本發明化合物、其他脂質組分及生物活性劑以外之任何成分。賦形劑可賦予調配物功能性(例如藥物釋放速率控制)及/或非功能性(例如加工助劑或稀釋劑)特徵。賦形劑之選擇在很大程度上將視諸如特定投藥模式、賦形劑對溶解性及穩定性之影響及劑型性質之因素而定。
典型醫藥學上可接受之賦形劑包括：
●　稀釋劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素及/或甘胺酸；
●　潤滑劑，例如二氧化矽、滑石、硬脂酸、其鎂鹽或鈣鹽及/或聚乙二醇；
●　黏合劑，例如矽酸鎂鋁、澱粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯啶酮；
●　崩解劑，例如澱粉、瓊脂、褐藻酸或其鈉鹽，或起泡混合物；及/或
●　吸收劑、著色劑、調味劑及/或甜味劑。
賦形劑可為可視情況含有緩衝液(例如PBS緩衝液)及/或糖之水溶液載劑。
醫藥學上可接受之賦形劑之詳盡論述可在Gennaro,Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000,第20版(ISBN: 0683306472)中獲得。
經口投藥
本發明之化合物及組合物可經口投與。經口投藥可包括吞服，以便化合物進入胃腸道；及/或頰內、經舌或舌下投藥，化合物藉此直接由口進入血流。
非經腸投藥
本發明之化合物及組合物可非經腸投與。本發明之化合物及組合物可直接投與血流、皮下組織、肌肉或內臟器官中。適於投藥之方式包括靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌肉內、滑膜內及皮下投藥。適於投藥之裝置包括針(包括微針)注射器、無針注射器及輸注技術。
非經腸調配物通常為水溶液或油溶液。在溶液為水溶液之情況下，賦形劑為諸如糖(包括且限於葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳pH值為3至9)，但對於一些應用而言，其可更適當地調配為無菌非水溶液或待與諸如無菌無熱原質水(WFI)之適合媒劑聯合使用的乾燥形式。
非經腸調配物可包括由諸如聚酯(亦即聚乳酸、聚丙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚己內酯、聚羥基丁酸酯)、聚原酸酯及聚酸酐之可降解聚合物得到之植入物。此等調配物可經由手術切開投與皮下組織、肌肉組織或直接投與特定器官中。
藉由例如冷凍乾燥在無菌條件下製備非經腸調配物可使用熟習此項技術者熟知之標準醫藥技術容易地完成。
製備非經腸溶液中所用之化合物及組合物之溶解性可藉由使用適當調配技術，諸如併入共溶劑及/或諸如界面活性劑、微胞結構及環糊精之溶解性增強劑來增加。
吸入及鼻內投藥
本發明之化合物可鼻內或藉由吸入投與，通常以乾粉(單獨，作為混合物，例如與乳糖之乾燥摻合物，或作為混合組分粒子，例如與諸如磷脂醯膽鹼之磷脂混合)形式自乾粉吸入器投與，以氣霧劑噴霧形式在使用或不使用適合推進劑(諸如1,1,1,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)下自加壓容器、泵、噴射器、霧化器(較佳為使用電流體動力學以產生精細薄霧之霧化器)或噴霧器投與，或以滴鼻劑形式投與。對於鼻內使用，粉末可包含生物黏著劑，例如聚葡萄胺糖或環糊精。
加壓容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器含有本發明化合物之溶液或懸浮液，其包含例如乙醇、乙醇水溶液或適用於分散、增溶或延長釋放本發明組合物的替代藥劑、作為溶劑之推進劑及視情況選用之界面活性劑，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯、油酸或寡聚乳酸。
在用於乾粉或懸浮液調配物中之前，將化合物或組合物微米尺寸化至適於藉由吸入傳遞之大小(通常小於5微米)。此可藉由任何適當粉碎方法達成，諸如螺旋噴射研磨、流化床噴射研磨、超臨界流體加工以形成奈米粒子、高壓均質化或噴霧乾燥。
用於吸入器或吹入器中之膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素製成)、發泡藥及藥筒可經調配以含有本發明之化合物或組合物之粉末混合物、適合粉末基質(諸如乳糖或澱粉)及效能改質劑(諸如1-白胺酸、甘露糖醇或硬脂酸鎂)。乳糖可無水或呈單水合物形式，較佳為後者。其他適合賦形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖及海藻糖。
可使用例如PGLA將用於吸入/鼻內投藥之調配物調配為即刻釋放型及/或改進釋放型。改進釋放調配物包括延遲釋放調配物、持續釋放調配物、脈衝釋放調配物、控制釋放調配物、靶向釋放調配物及程式化釋放調配物。
經皮投藥
適用於經皮施用之調配物包括治療有效量之本發明化合物或組合物與載劑。有利載劑包括可吸收之藥理學上可接受之溶劑以幫助穿過宿主之皮膚。經皮裝置特徵上呈繃帶形式，其包含襯底元件、含有化合物(視情況連同載劑)之儲集器、視情況選用之速率控制障壁(用於在控制及預定速率下於宿主皮膚傳遞化合物持續較長時間)及用於將裝置固定於皮膚之構件。
作為本發明之目標之細胞及器官
本發明之化合物、組合物、方法及用途可用以將生物活性劑傳遞至患者之一或多種以下細胞或器官：肝臟或肝臟細胞(例如肝細胞)；腎臟或腎臟細胞；腫瘤或腫瘤細胞；CNS或CNS細胞(中樞神經系統，例如腦及/或脊髓)；PNS或PNS細胞(周邊神經系統)；肺或肺細胞；血管結構或血管細胞；皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)；眼睛或眼部細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)，及耳或耳細胞(例如內耳、中耳及/或外耳之細胞)。
在一實施例中，本發明中本發明之化合物、組合物、方法及用途係用於將生物活性劑傳遞至肝臟細胞(例如肝細胞)。在一實施例中，本發明中本發明之化合物、組合物、方法及用途係用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞(例如原發性腫瘤或轉移性癌細胞)。
對於將生物活性劑傳遞至肝臟或肝細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、門靜脈注射、導管插入術、支架置入術)使本發明之化合物或組合物與患者之肝臟或肝細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至腎臟或腎細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入術、支架置入術)使本發明之化合物或組合物與患者之腎臟或腎細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入術、支架置入術)使本發明之化合物或組合物與患者之腫瘤或腫瘤細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至CNS或CNS細胞(例如腦細胞及/或脊髓細胞)，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、導管插入術、支架置入術、滲透泵投與(例如鞘內或心室))使本發明之化合物或組合物與患者之CNS或CNS細胞(例如腦細胞及/或脊髓細胞)接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至PNS或PNS細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射)使本發明之化合物或組合物與患者之PNS或PNS細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至肺或肺細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接肺部投與至肺組織及細胞)使本發明之化合物或組合物與患者之肺或肺細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至血管結構或血管細胞，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如夾持、導管插入術、支架置入術)使本發明之化合物或組合物與患者之血管結構或血管細胞接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接皮膚施用、離子導入療法)使本發明之化合物或組合物與患者之皮膚或皮膚細胞(例如真皮細胞及/或濾泡細胞)接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至眼睛或眼部細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射、眼內注射、眼周注射、離子導入療法、使用滴眼劑、植入物)使本發明之化合物或組合物與患者之眼睛或眼部細胞(例如黃斑、中央窩、角膜、視網膜)接觸以促進傳遞。
對於將生物活性劑傳遞至耳或耳細胞(例如內耳、中耳及/或外耳之細胞)，在一實施例中，如此項技術中一般所已知諸如經由非經腸投與(例如靜脈內、肌肉內、皮下投與)或局部投與(例如直接注射)使本發明之化合物或組合物與患者之耳或耳細胞(例如內耳、中耳及/或外耳之細胞)接觸以促進傳遞。
疾病或病狀之治療
可藉由本發明治療之疾病或病狀包括與在患者中調節基因、基因表現、蛋白質、蛋白質活性、細胞路徑及其類似方面相關之彼等疾病或病狀。藉由本發明治療之疾病或病狀可為選自由以下組成之群的一或多者：增生性疾病(例如腫瘤)；發炎性疾病；移植及/或組織排斥反應(同種異體移植排斥反應)；自體免疫性疾病；感染性疾病；年齡相關性疾病；神經或神經退化性疾病(例如亨丁頓氏病(Huntington's disease))；代謝性疾病；心血管疾病；呼吸道疾病；眼部疾病；皮膚疾病；聽覺疾病(例如聽力下降、耳聾)；肝臟疾病(例如肝炎、HCV、HBV、糖尿病、肝硬化、肝細胞癌)及腎臟/腎疾病(例如多囊性腎病)。在一特定實施例中，本發明治療增生性疾病，例如腫瘤或腫瘤細胞。在一特定實施例中，本發明治療肝臟疾病，例如肝炎、HCV、HBV、糖尿病、肝硬化及某些肝細胞癌。
熟習此項技術者將能選擇生物活性劑，其與本發明化合物組合以傳遞治療有效量之藥劑。在藥劑為RNAi治療劑之情況下，所需治療作用為調節所關注疾病或病狀中牽涉之目標基因之表現。在一實施例中，基因表現之減少及由此得到之各別蛋白質/RNA含量之降低在一定程度上減輕疾病或病狀之症狀。
功效
化合物、組合物、方法及用途可涉及適於減少或抑制或改善疾病或病症之投與條件。在一實施例中，將治療有效量之RNAi劑投與有需要之患者，其中患者中目標基因之表現量與未經治療之患者相比降低。
在一實施例中，所關注之疾病或病狀中牽涉之目標基因的表現相對於未經治療之患者降低約10%，更佳約20%，更佳約30%，更佳約40%，更佳約50%，更佳約60%，更佳約70%，更佳約80%，更佳約90%，更佳約95%，更佳約98%且最佳約100%。
定義
如本發明通篇所用，諸如「一」之冠詞係指一種(個)或一種以上(一個以上)(至少一種(至少一個))該冠詞之文法賓語。
式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)及式(XII)之化合物及其衍生物
如本文所用之術語「本發明之(脂質)化合物」、「式(I)之(脂質)化合物」、「(脂質)化合物」、「陽離子型脂質」等(亦即均指本發明之陽離子型脂質)及/或「隱形脂質」包括其醫藥學上可接受之衍生物及其多晶型物、異構體及經同位素標記之變體。此外，該等術語包括式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)及式(X)之化合物(陽離子型脂質)；及式(XI)及式(XII)之化合物(隱形脂質)；及本文所揭示之其實施例。
醫藥學上可接受之衍生物
術語「醫藥學上可接受之衍生物」包括式(I)化合物之任何醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。在一實施例中，醫藥學上可接受之衍生物為式(I)化合物之醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。
醫藥學上可接受之鹽
術語「醫藥學上可接受之鹽」包括由醫藥學上可接受之無毒酸或鹼(包括無機或有機酸及鹼)製備之鹽。關於醫藥學上可接受之鹽之評述，請參見Stahl及Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties,Selection and Use(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。
溶劑合物及水合物
本發明之化合物可以非溶劑化形式與溶劑化形式存在。術語「溶劑合物」包括包含本發明化合物及一或多種醫藥學上可接受之溶劑分子(諸如水或C1-6醇，例如乙醇)之分子錯合物。術語「水合物」意謂溶劑為水之「溶劑合物」。
異構形式
本發明之化合物可以一或多種幾何、光學、對映異構、非對映異構及互變異構形式存在，包括(但不限於)順式及反式形式、E-及Z-形式、R-、S-及內消旋形式、酮及烯醇形式。所有該等異構形式均包括於本發明中。異構形式可呈異構性純或增濃形式，以及異構體之混合物(例如外消旋或非對映異構混合物)。
因此，本發明至少提供例如：
‧式(I)化合物之立體異構混合物；
‧式(I)化合物之非對映異構性增濃或非對映異構性純異構體；或
‧式(I)化合物之對映異構性增濃或對映異構性純異構體。
適當時，異構體可藉由應用或改適已知方法(例如層析技術及再結晶技術)自其混合物分離。適當時，異構體可藉由應用或改適已知方法(例如不對稱合成)來製備。
同位素標記
本發明包括醫藥學上可接受之經同位素標記的式(I)化合物，其中一或多個原子經具有相同原子序數但原子質量或質量數與通常在自然界中發現的原子質量或質量數不同之原子置換。
適於包括在本發明化合物中之同位素的實例包括氫之同位素，諸如2H及3H；碳之同位素，諸如11C、13C及14C；氯之同位素，諸如36Cl；氟之同位素，諸如18F；碘之同位素，諸如123I及125I；氮之同位素，諸如13N及15N；氧之同位素，諸如15O、17O及18O；磷之同位素，諸如32P；及硫之同位素，諸如35S。某些經同位素標記之式(I)化合物，例如併有放射性同位素之彼等化合物適用於藥物及/或基質組織分佈研究中。放射性同位素3H及14C鑒於其併入之簡易性及現成偵測方式而尤其適用於此目的。
以正電子發射同位素(諸如11C、18F、15O及13N)取代可適用於正電子發射斷層掃描(PET)研究。
經同位素標記之式(I)化合物一般可由熟習此項技術者已知之習知技術，或由與本文所述類似之方法，使用適當經同位素標記之試劑替代先前所用之未經標記之試劑來製備。
治療定義
如本文所用之「治療」包括改善、洽愈及預防性處理。如本文所用之「患者」意謂需要治療之動物，較佳為哺乳動物，較佳為人類。
「生物活性劑」較佳為治療性化合物，亦即適用於治療或預防疾病或病狀之化合物。
生物活性劑包括(但不限於)例如抗體、膽固醇、激素、抗病毒藥、肽、多肽、蛋白質、核蛋白、化學治療劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷衍生物、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、2,5-A反義嵌合體、異位酶、適體、核糖核酸酶、誘餌RNA分子及其類似物、及小核酸分子(諸如RNA抑制劑(RNAi)，包括例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA))。在一實施例中，生物活性劑較佳為核苷或核苷衍生物，例如核酸、寡核苷酸、聚核苷酸(例如siNA、miRNA、RNAi、反義分子、適體、核糖核酸酶、誘餌、核糖核酸酶、2-5A、三鏈體形成寡核苷酸)，且較佳為siRNA、miRNA、siRNA抑制劑或miRNA抑制劑。
在一實施例中，生物活性劑為siNA(短干擾核酸)分子。在一實施例中，siNA為siDNA。在一實施例中，siNA為siRNA。在一實施例中，siNA為miRNA。
在一實施例中，生物活性劑為小核酸分子(出於方便之目的，以下稱為「siNA」分子)，其下調目標基因之表現，例如其中目標基因包含目標編碼序列或其中目標基因包含目標非編碼序列或參與目標基因表現之調節元件。
siNA可為單股、雙股或多股。在一實施例中，其為雙股。
在一實施例中，siNA包含未經修飾之核苷酸及/或非核苷酸。在一實施例中，siNA包含至少一個或一個以上經修飾之核苷酸及/或非核苷酸。在一實施例中，經修飾之核苷酸包含經修飾之鹼基部分。在一實施例中，經修飾之核苷酸包含經修飾之糖部分。在一實施例中，經修飾之核苷酸包含經修飾之主鏈部分。在一實施例中，siNA包含經修飾之鹼基部分、經修飾之糖部分及/或經修飾之主鏈部分中的一或多者。
在一實施例中，siNA分子包含約15至約40個(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、23、33、34、35、36、37、38、39或40個)鹼基對，在一子實施例中包含約15至約30個(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個)鹼基對，在一子實施例中包含約15至約28個鹼基對，在一子實施例中包含約17至約25個鹼基對，在一子實施例中包含約18至約23個鹼基對，在另一子實施例中包含約19至約22個鹼基對。在一實施例中，siNA包含約17個鹼基對。在一實施例中，siNA包含約18個鹼基對。在一實施例中，siNA包含約19個鹼基對。在一實施例中，siNA包含約20個鹼基對。在一實施例中，siNA包含約21個鹼基對。
在一實施例中，siNA分子之兩個股各獨立地包含約15至約40個(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、23、33、34、35、36、37、38、39或40個)核苷酸，在一子實施例中包含約15至約30個(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個)核苷酸，在一子實施例中包含約15至約28個核苷酸，在一子實施例中包含約17至約25個核苷酸，在一子實施例中包含約18至約23個核苷酸，在另一子實施例中包含約19至約22個核苷酸。在一實施例中，各股長約17個核苷酸。在一實施例中，各股長約18個核苷酸。在一實施例中，各股長約19個核苷酸。在一實施例中，各股長約20個核苷酸。在一實施例中，各股長約21個核苷酸。
在一實施例中，siNA分子經由RISC複合物，亦即RNA干擾(RNAi)引導目標RNA裂解。
在一實施例中，siNA分子包含第一及第二股，siNA之第一股包含與siNA分子之目標RNA具有足夠互補性之核苷酸序列以經由RNA干擾引導目標RNA裂解，且該siNA分子之第二股包含與第一股互補之核苷酸序列。
在一實施例中，短干擾核酸(siNA)分子為化學合成之雙股分子。
在一實施例中，siNA抑制目標基因或目標基因家族之表現，其中該等基因或基因家族序列共享序列同源性。可如此項技術中所已知使用序列比對鑑別該等同源序列。該等siNA分子可例如使用完全互補序列或藉由併入非典型鹼基對(例如可提供額外目標序列之錯配及/或擺動鹼基對)設計成靶向該等同源序列。
在一實施例中，雙股siNA分子不含任何核糖核苷酸。在另一實施例中，雙股siNA分子包含一或多個核糖核苷酸。
在一實施例中，下調目標基因表現之siNA分子包含反義區，其中該反義區包含與目標基因或其部分之核苷酸序列互補之核苷酸序列；及有義區，其中該有義區包含與目標基因或其部分之核苷酸序列實質上類似之核苷酸序列。在一實施例中，反義區及有義區獨立地包含約15至約30個(例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個)核苷酸。在一實施例中，反義區包含與由目標基因或其部分編碼之RNA之核苷酸序列互補的核苷酸序列，且有義區包含與反義區互補之核苷酸序列。
在一實施例中，雙股siNA分子包含一個鈍端。在一實施例中，siNA分子包含兩個鈍端，亦即無任何突出未配對核苷酸的對稱末端。
在一實施例中，siNA分子之各片段之所有核苷酸與該siNA分子另一股上之互補核苷酸鹼基配對。
在一實施例中，siNA分子包含一或多種以下特徵：錯配、凸出、環及擺動鹼基對，各自可調節siNA分子之活性以介導RNA干擾。
在一實施例中，有義區經由諸如聚核苷酸連接子或非核苷酸連接子之連接子分子連接至反義區。
在一實施例中，siNA分子具有一或多個經修飾之嘧啶及/或嘌呤核苷酸。在一實施例中，有義區中之嘧啶核苷酸為2'-0-甲基嘧啶核苷酸或2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且有義區中存在之嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸。在另一實施例中，有義區中之嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且有義區中存在之嘌呤核苷酸為2'-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一實施例中，有義區中之嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且有義區中存在之嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸。在一實施例中，反義區中之嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且反義區中存在之嘌呤核苷酸為2'-O-甲基嘌呤核苷酸或2'-去氧嘌呤核苷酸。
在一實施例中，有義股具有非互補區。該非互補區中存在之核苷酸視情況均為2'-去氧核苷酸。
在一實施例中，包含有義區之聚核苷酸在股之5'-末端、3'-末端或5'-末端與3'-末端兩者包括末端帽部分。在一實施例中，包含反義股之聚核苷酸在股之5'-末端、3'-末端或5'-末端與3'-末端兩者包括末端帽部分。在一實施例中，末端帽部分為倒轉去氧無鹼基部分或甘油基部分。末端帽部分之其他實例在此項技術，例如WO 2005/021749及WO 2007/128477中已知。
在一實施例中，siNA在聚核苷酸主鏈中具有亞磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯鍵聯。在一實施例中，siNA具有至少一個硫代磷酸酯鍵聯。在一實施例中，siNA具有至少一個二硫代磷酸酯鍵聯。
在一實施例中，核苷酸修飾存在於siNA中對由核糖核酸酶裂解敏感之特別選擇之位置，諸如具有嘧啶核苷酸之位置。
在一實施例中，siNA分子各股之兩個3'末端核苷酸各為2'-去氧-嘧啶核苷酸，諸如2'-去氧-胸苷。
所投與本發明化合物及生物活性劑(例如治療性化合物)之量應為用於治療疾病或病狀之治療有效量及用於預防疾病或病狀之預防有效量。
術語「治療有效量」係指治療或改善目標疾病或病狀所需之本發明化合物及生物活性劑(例如治療性化合物)之量。本文所用之術語「預防有效量」係指預防目標疾病或病狀所需之本發明化合物及生物活性劑(例如治療性化合物)之量。確切劑量一般將視投與時患者之狀況而定。確定劑量時可能考慮到之因素包括患者疾病病況之嚴重程度、患者之總體健康狀況、年齡、體重、性別、飲食、投藥之時間、頻率及途徑、生物活性劑(例如治療性化合物)之特性、反應敏感性及患者對療法之耐受性或反應。精確量可藉由常規實驗確定，但最終可在於臨床醫師之判斷。一般而言，有效量將為每天0.01 mg/kg(藥物之質量相比於患者之質量)至每天1000 mg/kg，例如每天1 mg/kg至每天100 mg/kg。可將組合物個別地投與患者或可與其他藥劑、藥物或激素組合投與。
在任何治療方法或相關用途中，本發明之化合物或組合物可以一定療程投與患者，例如以各種時間間隔投與，諸如在療程中每天一次、在療程中每兩天一次、在療程中每三天一次、在療程中每四天一次、在療程中每五天一次、在療程中每六天一次、在療程中每週一次、在療程中每隔一週一次、在療程中每月一次等。在一實施例中，療程為每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週一次。在一實施例中，療程為約1至約52週或更長(例如無限期)。在一實施例中，療程為約1至約48個月或更長(例如無限期)。
在一實施例中，療程包括初始療程，諸如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週或10週以上一次歷時固定時間間隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或10x以上)，隨後為維持療程，諸如每4、6、8、10、15、20、25、30、35、40週或40週以上一次歷時另一固定時間間隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或10x以上)。
如本文所用之「增生性疾病」意謂如此項技術中所已知特徵為不受調節之細胞生長或複製之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型。在一實施例中，增殖性疾病為癌症。在一實施例中，增殖性疾病為腫瘤。在一實施例中，增生性疾病包括(但不限於)例如液體腫瘤，諸如白血病，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、多發性骨髓瘤及慢性淋巴細胞性白血病；及實體腫瘤，例如AIDS相關性癌症，諸如卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；乳癌；骨癌；腦癌；頭頸癌、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、腺瘤、鱗狀細胞癌、喉癌、膽囊及膽管癌、視網膜癌、食道癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、子宮內膜癌、黑素瘤、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細胞肺癌)、胰臟癌、肉瘤、韋爾姆斯氏瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肉瘤、上皮癌、腎細胞癌、膽囊腺癌、子宮內膜肉瘤、多重藥物抗性癌症。在一實施例中，增生性疾病包括與腫瘤血管生成相關之新血管生成、黃斑變性(例如濕性/乾性年齡相關性黃斑變性)、角膜新血管生成、糖尿病性視網膜病變、新生血管性青光眼、近視性變性(myopic degeneration)。在一實施例中，增生性疾病包括再狹窄及多囊性腎病。
如本文所用之「發炎性疾病」意謂如此項技術中所已知特徵為發炎性或過敏性過程之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型。發炎性疾病包括(但不限於)例如炎症(例如急性及/或慢性炎症)、呼吸道疾病、動脈粥樣硬化、牛皮癬、皮膚炎、再狹窄、哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、敗血性休克、類風濕性關節炎、發炎性腸病、發炎性盆腔病、疼痛、眼部發炎性疾病、乳糜瀉、肺結核、矽肺病及其他肺塵埃沉著病。
如本文所用之「自體免疫性疾病」意謂如此項技術中所已知特徵為自體免疫性之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型。自體免疫性疾病包括(但不限於)例如多發性硬化症、糖尿病、狼瘡、硬皮症、肌肉纖維疼痛、移植排斥反應(例如預防同種異體移植排斥反應)、惡性貧血、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、皮膚肌炎、重症肌無力、紅斑狼瘡、多發性硬化症及格雷氏病(Grave's disease)。
「傳染性疾病」意謂與諸如病毒、細菌、真菌、朊病毒或寄生蟲之感染物相關之任何疾病、病症或病狀。
「神經性疾病」意謂影響中樞或周邊神經系統之任何疾病、病症或病狀。神經性疾病包括(但不限於)周邊或中樞神經系統之疾病或病症，包括例如阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、動脈瘤、腦損傷、腕隧道症候群、腦動脈瘤、慢性疼痛、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、癲癇症(Epilepsy)、亨丁頓氏病、腦膜炎、癲癇(Seizure Disorder)及其他神經性疾病、病症及症候群。
「呼吸道疾病」意謂影響呼吸道之任何疾病或病狀。呼吸道疾病包括(但不限於)例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性鼻炎、竇炎、過敏症、吸呼困難(impeded respiration)、呼吸窘迫症候群、囊腫性纖維化、肺循環血壓過高或血管收縮及肺氣腫。
「心血管疾病」意謂影響心臟及血管結構之任何疾病或病狀。心血管疾病包括(但不限於)例如冠心病(CHD)、腦血管疾病(CVD)、主動脈瓣狹窄、周邊血管疾病、心肌梗塞(心臟病發作)、心律不整及充血性心臟衰竭。
如本文所用之「眼部疾病」意謂眼睛及相關結構之任何疾病、病狀、性狀、基因型或表型。眼部疾病包括(但不限於)例如囊樣黃斑部水腫、糖尿病性視網膜病變、格子樣變性(lattice degeneration)、視網膜靜脈阻塞、視網膜動脈阻塞、黃斑變性(例如年齡相關性黃斑變性，諸如濕性AMD或乾性AMD)、弓蟲病(toxoplasmosis)、色素性視網膜炎、結膜撕裂傷、角膜撕裂傷、青光眼及其類似疾病。
「代謝性疾病」意謂影響代謝路徑之任何疾病或病狀。代謝性疾病可導致異常代謝過程，其可為先天性(歸因於遺傳性酶異常(先天性代謝異常))或後天性(歸因於內分泌器官之疾病或諸如肝臟之代謝上重要之器官的衰竭)。在一實施例中，代謝性疾病包括肥胖症、胰島素抗性及糖尿病(例如I型及/或II型糖尿病)。
「皮膚疾病」意謂皮膚、真皮或其中諸如毛髮、毛囊等之任何次結構之任何疾病或病狀。皮膚疾病、病症、病狀及性狀可包括牛皮癬、異位性皮膚炎、皮膚癌(諸如黑素瘤及基底細胞癌)、掉髮、脫毛及色素沉著改變。
「聽覺疾病」意謂聽覺系統(包括耳、諸如內耳、中耳、外耳、聽神經及其中之任何次結構)之任何疾病或病狀。聽覺疾病、病症、病狀及性狀可包括聽力下降、耳聾、耳鳴、眩暈、平衡及運動病症。
在一實施例中，疾病或病狀為肝臟疾病、腫瘤、由FVII介導之疾病及/或由PLK1介導之疾病。由FVII介導之疾病包括異常血液凝固及腫瘤；因此該等疾病包括血栓症(例如靜脈血栓栓塞、肺栓塞及中風)。
生物化學術語及定義
術語「脂質」係指一組有機化合物，其包括(但不限於)脂肪酸酯，且特徵為不溶於水但可溶於許多有機溶劑中。可將脂質分成至少三個類別(1)「簡單脂質」，其包括脂肪及油類以及蠟；(2)「複合脂質」，其包括磷脂及糖脂，及(3)「衍生脂質」，諸如類固醇。
如本文所用之術語「陽離子型脂質」意謂具有陽離子電荷之任何親脂性化合物，諸如式(I)化合物
其中該等定義係如本文其他地方所述。陽離子型脂質之其他實例在上文標題「組合物」下闡述。
輔 助脂質
如本文所用之術語「輔助脂質」意謂在一定程度上增強轉染之脂質(例如轉染包括生物活性劑之奈米粒子)。輔助脂質藉以增強轉染之機制可包括例如增強粒子穩定性及/或增強膜融合性。輔助脂質包括類固醇及烷基間苯二酚。輔助脂質之實例為膽固醇、5-十七烷基間苯二酚及膽固醇半丁二酸酯。
隱形脂質
如本文所用之術語「隱形脂質」意謂增加奈米粒子可在活體內(例如在血液中)存在之時間長度之脂質。在一實施例中，隱形脂質包含親水性聚合物頭基可操作地連接於脂質部分。在一實施例中，脂質體調配物中之隱形脂質屏蔽奈米粒子表面，且藉此降低血液蛋白質造成之調理作用及單核吞噬細胞系統之巨噬細胞的攝取。適用於本發明之隱形脂質之結構包括(但不限於)例如如式XI及式XII中所提供之化合物。其他預期隱形脂質及關於該等脂質之生物化學的資訊可見於Romberg等人,Pharmaceutical Research,第25卷，第1期,2008,第55-71頁及Hoekstra等人,Biochimicaet Biophysica Acta 1660(2004) 41-52中。
在一實施例中，隱形脂質包含選自以下之群：PEG(有時稱為聚(環氧乙烷))及基於聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚胺基酸及聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]之聚合物。在一實施例中，輔助脂質能夠「除去」，如Romberg等人所述。本發明之特定隱形脂質提供於例如式XI及式XII中，其可另外由熟習此項技術者進行取代。其他適合PEG脂質揭示於例如WO 2006/007712中。
特定適合隱形脂質包括聚乙二醇-二醯基甘油或聚乙二醇-二醯基糖醯胺(PEG-DAG)結合物，其包括包含二烷基甘油或二烷基糖醯胺基團且烷基鏈長度獨立地包含約C4至約C40個飽和或不飽和碳原子的彼等結合物。二烷基甘油或二烷基糖醯胺基團可進一步包含一或多個經取代之烷基。在任何本文所述之實施例中，PEG結合物可選自PEG-二月桂基甘油、PEG-雙十四烷基甘油(目錄號GM-020，來自NOF)、PEG-雙軟脂醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油、PEG-二月桂基糖醯胺、PEG-雙十四烷基糖醯胺、PEG-雙軟脂醯基糖醯胺及PEG-二硬脂醯基糖醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6-二氧雜辛基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇))、PEG-DMB(3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、S001、S002、S003、S004、S005、S006、S007、S008、S009、S010、S011、S012、S013、S014、S015、S016、S017、S018、S019、S020、S021、S022、S023、S024、S025、S026、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目錄號880150P，來自Avanti Polar Lipids)。S010及S011分別以標記IVa及IVc揭示於WO 2009/086558中。
除非另外指出，否則如本文所用之術語「PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。在一實施例中，PEG為視情況經取代之乙二醇或環氧乙烷之線性或分支聚合物。在一實施例中，PEG未經取代。在一實施例中，PEG例如經一或多個烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在一實施例中，該術語包括PEG共聚物，諸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯(參見例如J. Milton Harris,Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications(1992))；在另一實施例中，該術語不包括PEG共聚物。在一實施例中，PEG之分子量為約130至約50,000，在一子實施例中為約150至約30,000，在一子實施例中為約150至約20,000，在一子實施例中為約150至約15,000，在一子實施例中為約150至約10,000，在一子實施例中為約150至約6000，在一子實施例中為約150至約5000，在一子實施例中為約150至約4000，在一子實施例中為約150至約3000，在一子實施例中為約300至約3000，在一子實施例中為約1000至約3000且在一子實施例中為約1500至約2500。
在某些實施例中，PEG為「PEG-2K」，亦稱為「PEG 2000」，其平均分子量為約2000道爾頓(dalton)。本文中PEG-2K由下式(XIIa)表示，其中n為45，意謂數量平均聚合度包含約45個次單元。然而，可使用此項技術中已知之其他PEG實施例，包括例如數量平均聚合度包含約23個次單元(n=23)及/或68個次單元(n=68)之彼等PEG實施例。
RNA干擾及RNAi調配物之定義
「脂質奈米粒子」意謂包含複數個(亦即一個以上)藉由分子間力物理上彼此相關之脂質分子的粒子。脂質奈米粒子可為例如微球體(包括單層及多層微脂粒，例如脂質體)、乳液中之分散相、微胞或懸浮液中之內相。
脂質奈米粒子之大小為約1至約2,500 nm、約1至約1,500 nm、約1至約1,000 nm，在一子實施例中為約50至約600 nm，在一子實施例中為約50至約400 nm，在一子實施例中為約50至約250 nm，且在一子實施例中為約50至約150 nm。除非另外指示，否則本文所提及之所有尺寸均為完全形成之奈米粒子之平均尺寸(直徑)，如利用Malvern Zetasizer藉由動態光散射所量測。將奈米粒子樣品稀釋於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以便計數率為約200至400 kct。資料以強度量度之加權平均值提供。
在一實施例中，生物活性劑與脂質奈米粒子(例如微脂粒)相關且較佳藉此囊封。
在一實施例中，脂質奈米粒子包含生物活性劑、本發明之化合物、中性脂質、輔助脂質及隱形脂質。
在一實施例中，脂質體粒子在血清中穩定。
如本文所用之術語「短干擾核酸」(siNA)係指能夠藉由以序列特異性方式介導RNA干擾(RNAi)或基因靜止(gene silencing)來抑制或下調基因表現或病毒複製之任何核酸分子。其包括短干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、短干擾寡核苷酸及經化學修飾之短干擾核酸分子。siRNA負責RNA干擾，亦即動物及植物中序列特異性轉錄後基因靜止之過程。siRNA藉由核糖核酸酶III裂解自與靜止基因目標同源或對靜止基因目標具特異性之較長雙股RNA(dsRNA)產生。
「RNA干擾」(RNAi)意謂如此項技術中一般已知，抑制或下調細胞中基因表現之生物過程，參見例如Zamore及Haley,2005,Science,309,1519-1524；Zamore等人,2000,Cell,101,25-33；Elbashir等人,2001,Nature,411,494-498；及Kreutzer等人,PCT公開案WO 00/44895；Fire,PCT公開案WO 99/32619；Mello及Fire,PCT公開案WO 01/29058；及其類似文獻。
如本文所用之RNAi相當於用於描述序列特異性RNA干擾之其他術語，諸如轉錄後基因靜止、轉譯抑制、轉錄抑制或後生學。舉例而言，含有本發明脂質之調配物可與siNA分子聯合使用以在轉錄後層面及/或轉錄前層面使基因後生靜止。在一非限制性實例中，藉由siNA分子調節基因表現可由siNA經由RISC介導之RNA(編碼或非編碼RNA)裂解或者如此項技術中所已知之轉譯抑制產生。在另一實施例中，藉由siNA調節基因表現可由轉錄抑制產生，諸如例如Janowski等人,2005,Nature Chemical Biology,1,216-222中所報導。
「RNAi抑制劑」意謂可下調(例如降低或抑制)細胞或患者中之RNA干擾功能或活性的任何分子。RNAi抑制劑可藉由與RNAi路徑之任何組分(包括蛋白質組分(諸如RISC)或核酸組分(諸如miRNA或siRNA))相互作用或干擾該等組分之功能來下調、降低或抑制RNAi(例如RNAi介導之目標聚核苷酸裂解、轉譯抑制或轉錄靜止)。RNAi抑制劑可為siNA分子、反義分子、適體或與細胞或患者中之RISC、miRNA、或siRNA或RNAi路徑之任何其他組分相互作用或干擾該等組分之功能的小分子。藉由抑制RNAi(例如RNAi介導之目標聚核苷酸裂解、轉譯抑制或轉錄靜止)，RNAi抑制劑可用以調節(例如上調或下調)目標基因之表現。在一實施例中，使用RNA抑制劑藉由經由轉譯抑制、轉錄靜止或RISC介導之聚核苷酸(例如mRNA)裂解干擾(例如降低或防止)基因表現之內源性下調或抑制來上調基因表現。因此藉由干擾基因表現之內源性遏制、靜止或抑制之機制，可使用本發明之RNAi抑制劑來上調基因表現以治療由功能下降產生之疾病或病狀。在本文之各種實施例中，術語「RNAi抑制劑」可與術語「siNA」互換使用。
如本文所用之術語「酶性核酸」係指在受質結合區與指定基因目標具有互補性以及具有用以特異性裂解目標RNA藉此使目標RNA分子失活之酶活性的核酸分子。互補區允許酶性核酸分子與目標RNA充分雜交且因此允許裂解。100%之互補性較佳，但低至50%-75%之互補性亦可適用於本發明(參見例如Werner及Uhlenbeck,1995,Nucleic Acids Research,23,2092-2096；Hammann等人，1999,Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.,9,25-31)。核酸之鹼基、糖基及/或磷酸酯基可經修飾。術語酶性核酸可與諸如核糖核酸酶、催化RNA、酶性RNA、催化DNA、適體酶或適體結合核糖核酸酶、可調節核糖核酸酶、催化寡核苷酸、核酶、DNA酶、RNA酶、核糖核酸內切酶、核酸內切酶、小酶(minizyme)、引導酶(leadzyme)、寡酶(oligozyme)或DNA酶之短語互換使用。所有此等術語均描述具有酶活性之核酸分子。酶性核酸分子之關鍵特徵為其具有與一或多個目標核酸區域互補之特異性受質結合位點，及其在使分子具有核酸裂解及/或連接活性之彼受質結合位點中或周圍具有核苷酸序列(參見例如Cech等人，美國專利4,987,071；Cech等人，1988,260 JAMA 3030)。本發明之核糖核酸酶及酶性核酸分子可例如如此項技術或本文其他地方所述經化學修飾。
如本文所用之術語「反義核酸」係指藉助於RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白質核酸；Egholm等人，1993 Nature 365,566)相互作用結合至目標RNA且改變目標RNA之活性的非酶性核酸分子(關於評述，請參見Stein及Cheng,1993 Science 261，1004及Woolf等人，美國專利5,849,902)。反義DNA可化學合成或經由使用單股DNA表現載體或其等效物表現。本發明之反義分子可例如如此項技術中所述經化學修飾。
如本文所用之術語「RNase H活化區」係指能夠結合於目標RNA以形成可由細胞RNase H酶識別之非共價複合物的核酸分子區域(長度一般大於或等於4至25個核苷酸，長度較佳為5至11個核苷酸)(參見例如Arrow等人，美國專利5,849,902;Arrow等人，美國專利5,989,912)。RNase H酶結合於核酸分子-目標RNA複合物且裂解目標RNA序列。
如本文所用之術語「2-5A反義嵌合體」係指含有5'-磷酸化2'-5'-連接型腺嘌呤核苷酸殘基之反義寡核苷酸。此等嵌合體以序列特異性方式結合至目標RNA，且活化細胞2-5A依賴性核糖核酸酶，該核糖核酸酶轉而又裂解目標RNA(Torrence等人,1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,1300；Silverman等人,2000,Methods Enzymol.,313,522-533；Player及Torrence,1998,Pharmacol. Ther.,78,55-113)。2-5A反義嵌合體分子可例如如此項技術中所述經化學修飾。
如本文所用之術語「三鏈體形成寡核苷酸」係指以序列特異性方式結合至雙股DNA形成三股螺旋結構之寡核苷酸。顯示該三股螺旋結構之形成抑制目標基因之轉錄(Duval-Valentin等人,1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,504；Fox,2000,Curr. Med. Chem.,7,17-37；Praseuth等人,2000,Biochim. Biophys. Acta,1489,181-206)。本發明之三鏈體形成寡核苷酸可例如如此項技術中所述經化學修飾。
如本文所用之術語「誘餌RNA」係指經設計優先結合預定配位體之RNA分子或適體。該結合可引起目標分子之抑制或活化。誘餌RNA或適體可與天然存在之結合目標競爭結合特定配位體。類似地，誘餌RNA可經設計以結合受體且阻斷效應分子之結合，或可經設計以結合所關注之受體且防止與受體相互作用。本發明之誘餌分子可例如如此項技術中所述經化學修飾。
如本文所用之術語「單股DNA」(ssDNA)係指包含線性單股之天然存在或合成之去氧核糖核酸分子，例如ssDNA可為有義或反義基因序列或EST(表現序列標籤)。
如本文所用之術語「異位酶」係指異位酶性核酸分子，包括例如美國專利第5,834,186號、第5,741,679號、第5,589,332號、第5,871,914號及PCT公開案第WO 00/24931號、第WO 00/26226號、第WO 98/27104號及第WO 99/29842號。
如本文所用之「適體」意謂特異性結合目標分子之聚核苷酸組合物，其中該聚核苷酸之序列與細胞中通常由目標分子識別之序列不同。另外適體可為結合目標分子之核酸分子，其中目標分子不會天然結合於核酸。目標分子可為任何所關注之分子。本發明之適體分子可例如如此項技術中所述經化學修飾。
「調節」意謂使基因之表現、或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的含量、或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性獲得上調或下調、或不存在，以致表現、含量或活性大於或小於無調節劑時所觀測到之值。舉例而言，在一實施例中，術語「調節」意謂「抑制」。在一實施例中，在本發明之術語內，調節路徑表示上調或下調生物路徑中在治療上有意義之組分及/或端點，該生物路徑含有例如蛋白質、酶或由目標mRNA所靶向或編碼之物質或由其調節。
「抑制」、「下調」或「降低」意謂使基因之表現、或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的含量、或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性降至低於在天然環境中，例如在核酸分子(例如siNA)不存在下所觀測到之值。在一實施例中，利用siNA分子進行之抑制、下調或降低低於在非活性或減活分子存在下觀測到之程度。在一實施例中，利用siNA分子進行之抑制、下調或降低低於在例如具有零亂序列或錯配之siNA分子存在下觀測到之程度。在一實施例中，核酸分子對基因表現之抑制、下調或降低在核酸分子存在下之程度大於其不存在下之程度。在一實施例中，基因表現之抑制、下調或降低與轉錄後靜止，諸如RNAi介導之目標核酸分子(例如RNA)裂解或轉譯抑制相關。在一實施例中，基因表現之抑制、下調或降低與轉錄前靜止相關。
「上調」或「促進」意謂使基因之表現、或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的含量、或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性增至高於在天然環境中，例如在核酸分子(例如siNA)不存在下所觀測到之值。在一實施例中，siNA分子對基因表現之上調或促進高於在非活性或減活分子存在下所觀測到之程度。在一實施例中，siNA分子對基因表現之上調或促進高於在例如具有零亂序列或錯配之siNA分子存在下所觀測到之程度。在一實施例中，核酸分子對基因表現之上調或促進在核酸分子存在下之程度大於其不存在下之程度。在一實施例中，基因表現之上調或促進與抑制RNA介導之基因靜止(諸如下調、抑制或靜止所欲上調相關基因之表現之編碼或非編碼RNA目標的RNAi介導之裂解或靜止)相關。
「基因」或「目標基因」意謂編碼RNA之核酸，例如核酸序列，包括(但不限於)編碼多肽之結構基因。基因或目標基因亦可編碼功能性RNA(FRNA)或非編碼RNA(ncRNA)，諸如小短暫RNA(small temporal RNA，stRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干擾RNA(siRNA)、小核仁RNA(snRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉移RNA(tRNA)及其前驅體RNA。該等非編碼RNA可用作調節功能性或調節性細胞代謝過程中所涉及之FRNA或ncRNA之活性時siNA介導之RNA干擾的目標核酸分子。因此，引起疾病之異常FRNA或ncRNA活性可利用siNA分子進行調節。
如本文所用之「目標」意謂由目標基因編碼之任何目標蛋白質、肽或多肽。術語「目標」亦指編碼具有目標活性，諸如由目標RNA編碼之任何目標蛋白質、肽或多肽之核酸序列。術語「目標」亦意欲包括其他目標編碼序列，諸如其他目標同功異型物、突變型目標基因、目標基因之剪接變異體及目標基因多形現象。「目標核酸」意謂表現或活性將受到調節之任何核酸序列。目標核苷酸可為DNA或RNA。
「非典型鹼基對」意謂任何非華特生-克里克鹼基對(non-Watson Crick base pair)，諸如錯配及/或擺動鹼基。
「有義區」意謂siNA分子中與siNA分子之反義區具有互補性之核苷酸序列。另外，siNA分子之有義區可包含與目標核酸序列具有同源性之核酸序列。在一實施例中，siNA分子之有義區稱為有義股或過客股(passenger strand)。
「反義區」意謂siNA分子中與目標核酸序列具有互補性之核苷酸序列。另外，siNA分子之反義區可視情況包含與siNA分子之有義區之具有互補性的核酸序列。在一實施例中，siNA分子之反義區稱為反義股或引導股。
「目標核酸」或「目標聚核苷酸」意謂表現或活性將受到調節之任何核酸序列。目標核酸可為DNA或RNA。在一實施例中，本發明之目標核酸為目標RNA。在一實施例中，本發明之目標核酸為目標DNA。
「互補性」意謂核酸可藉由傳統華特生-克里克或其他非傳統類型，諸如虎克斯汀鹼基配對(Hoogsteen base pairing)與另一核酸序列形成氫鍵。在一實施例中，各股長度在15與40個核苷酸之間的本發明之雙股核酸分子(諸如siNA分子)在雙股核酸分子之兩個股之間包含約10%與約100%之間(例如約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%)的互補性。互補性百分比指示核酸分子中可經由形成氫鍵與第二核酸序列配對(例如華特生-克里克鹼基配對)之連續殘基之百分比。
化學術語及定義
出於說明本說明書之目的，將應用以下定義，且合適時以單數形式使用之術語亦將包括複數，且反之亦然。
鹵基
如本文所用之術語「鹵素」或「鹵基」係指氟基、氯基、溴基及碘基。術語「鹵素」(或「鹵基」)包括氟、氯、溴及碘。
如本文所用之術語「鹵烷基」係指如本文所定義之烷基，其經一或多個如本文所定義之鹵基取代。鹵烷基可為單鹵烷基、二鹵烷基或多鹵烷基，包括全鹵烷基。單鹵烷基可在烷基中具有一個碘基、溴基、氯基或氟基。二鹵烷基及多鹵烷基可在烷基中具有兩個或兩個以上相同鹵基原子或不同鹵基之組合。多鹵烷基通常含有至多12、或10、或8、或6、或4、或3、或2個鹵基。鹵烷基之非限制實例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基及二氯丙基。全鹵烷基係指所有氫原子均經鹵基原子置換之烷基。
烷基、伸烷基、烯基、炔基、環烷基等
本文所用之術語「烷基」、「伸烷基」、「烯基」及「炔基」係指直鏈與分支鏈非環狀形式。其環狀類似物稱為環烷基、環烯基等。
術語「烷基」包括單價直鏈或分支鏈飽和非環狀烴基。如本文所用之術語「烷基」係指具有至多50個碳原子之完全飽和之分支鏈或未分支烴部分。除非另外規定，否則烷基係指具有1至50個碳原子、1至40個碳原子、1至30個碳原子、1至20個碳原子、1至16個碳原子、1至16個碳原子、1至10個碳原子、1至7個碳原子或1至4個碳原子之烴部分。烷基之代表性實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基及其類似基團。在一實施例中，烷基為C1-10烷基，在另一實施例中為C1-6烷基，在另一實施例中為C1-4烷基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基或第三丁基。
術語「環烷基」包括單價飽和環狀烴基。在一實施例中，環烷基為C3-10環烷基，在另一實施例中為C3-6環烷基，諸如環戊基及環己基。
術語「烷氧基」意謂烷基-O-，其中烷基係如上文所定義。烷氧基之代表性實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基、環丙氧基-、環己氧基-及其類似基團。通常，烷氧基具有約1至7個、更佳約1至4個碳。
術語「烯基」包括具有至少一個碳-碳雙鍵且在一實施例中無碳-碳參鍵之單價直鏈或分支鏈不飽和非環狀烴基。如本文所用之術語「伸烷基」係指具有1至50個碳原子之如上文所定義之二價烷基。其包含1至50個碳原子，除非另外規定，否則伸烷基係指具有1至50個碳原子、1至40個碳原子、1至30個碳原子、1至20個碳原子、1至16個碳原子、1至10個碳原子、1至7個碳原子或1至4個碳原子之部分。伸烷基之代表性實例包括(但不限於)亞甲基、伸乙基、伸正丙基、伸異丙基、伸正丁基、伸第二丁基、伸異丁基、伸第三丁基、伸正戊基、伸異戊基、伸新戊基、伸正己基、3-甲基伸己基、2,2-二甲基伸戊基、2,3-二甲基伸戊基、伸正庚基、伸正辛基、伸正壬基、伸正癸基及其類似基團。在一實施例中，烯基為C2-10烯基，在另一實施例中為C2-6烯基，在另一實施例中為C2-4烯基。
術語「環烯基」包括具有至少一個碳-碳雙鍵之單價部分不飽和環狀烴基。在一實施例中，環烯基為C3-10環烯基，在另一實施例中為C5-10環烯基，例如環己烯基。
術語「炔基」包括具有至少一個碳-碳參鍵且在一實施例中無碳-碳雙鍵之單價直鏈或分支鏈不飽和非環狀烴基。在一實施例中，炔基為C2-10炔基，在另一實施例中為C2-6炔基，在另一實施例中為C2-4炔基。
術語「環炔基」包括具有至少一個碳-碳參鍵之單價部分不飽和環狀烴基。在一實施例中，環炔基為C6-10環烯基，在另一實施例中為C8-10環炔基。
術語「伸烷基」包括二價直鏈或分支鏈飽和非環狀烴基。在一實施例中，伸烷基為C1-10伸烷基，在另一實施例中為C1-6伸烷基，在另一實施例中為C1-4伸烷基，諸如亞甲基、伸乙基、伸正丙基、伸異丙基或伸第三丁基。
術語「伸烯基」包括具有至少一個碳-碳雙鍵且在一實施例中無碳-碳參鍵之二價直鏈或分支鏈不飽和非環狀烴基。在一實施例中，伸烯基為C2-10伸烯基，在另一實施例中為C2-6伸烯基，在另一實施例中為C2-4伸烯基。
術語「伸炔基」包括具有至少一個碳-碳參鍵之二價直鏈或分支鏈不飽和非環狀烴基。在一實施例中，伸炔基為C2-10伸炔基，在另一實施例中為C2-6伸炔基，在另一實施例中為C2-4伸炔基。
雜烷基等
如本文所用之術語「雜原子」係指氮(N)、氧(O)、磷(P)或硫(S)原子，尤其為氮或氧。
術語「雜烷基」包括至多六個碳原子，在一實施例中至多五個碳原子，在另一實施例中至多四個碳原子，在另一實施例中至多三個碳原子，在另一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且較佳O、S(O)q或N)置換之烷基，其限制條件為仍保留至少一個烷基碳原子。雜烷基可經C連接或經雜原子連接，亦即其可經由碳原子或經由O、S(O)q、N、P(O)r或Si連接至分子之其餘部分。應注意S(O)q及P(O)r在下文中定義。
術語「雜環烷基」包括至多六個碳原子，在一實施例中至多五個碳原子，在另一實施例中至多四個碳原子，在另一實施例中至多三個碳原子，在另一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之環烷基，其限制條件為仍保留至少一個環烷基碳原子。雜環烷基之實例包括環氧乙基、硫雜環丙烷基、氮丙啶基、氧雜環丁烷基、硫烷基、氮雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、四氫哌喃基、四氫硫哌喃基、哌啶基、1,4-二氧雜環己烷基、1,4-氧硫雜環己烷基、嗎啉基、1,4-二噻烷基、哌嗪基、1,4-氮雜噻烷基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚烷基、氮雜環庚烷基、1,4-二氧雜環庚烷基、1,4-氧硫雜環庚烷基、1,4-氧氮雜環庚烷基、1,4-二硫雜環庚烷基、1,4-硫氮雜環庚烷基及1,4-二氮雜環庚烷基。雜環烷基可經C連接或N連接，亦即其可經由碳原子或經由氮原子連接至分子之其餘部分。
術語「雜烯基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之烯基，其限制條件為仍保留至少一個烯基碳-碳雙鍵。雜烯基可經C連接或雜原子連接，亦即其可經由碳原子或經由O、S(O)q或N連接至分子之其餘部分。
術語「雜環烯基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之環烯基，其限制條件為仍保留至少一個環烯基碳-碳雙鍵。雜環烯基之實例包括3,4-二氫-2H-哌喃基、5-6-二氫-2H-哌喃基、2H-哌喃基、1,2,3,4-四氫吡啶基及1,2,5,6-四氫吡啶基。雜環烯基可經C連接或N連接，亦即其可經由碳原子或經由氮原子連接至分子之其餘部分。在一實施例中，本發明之雜環烯基包括C3-C10環烯基。在一實施例中，本發明之雜環烯基包括C5-C10環烯基。
術語「雜炔基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之炔基，其限制條件為仍保留至少一個炔基碳-碳參鍵。雜炔基可經C連接或雜原子連接，亦即其可經由碳原子或經由O、S(O)q或N連接至分子之其餘部分。
術語「雜環炔基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之環炔基，其限制條件為仍保留至少一個炔基碳-碳參鍵。雜環烯基可經C連接或N連接，亦即其可經由碳原子或經由氮原子連接至分子之其餘部分。雜環炔基之實例包括氮雜環辛-4-炔。在一實施例中，本發明包括C3-C10雜環炔基。在一實施例中，本發明包括C5-C10雜環炔基。
術語「伸雜烷基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之伸烷基，其限制條件為仍保留至少一個伸烷基碳-碳鍵。
術語「伸雜烯基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之伸烯基，其限制條件為仍保留至少一個伸烯基碳-碳雙鍵。
術語「伸雜炔基」包括至多三個碳原子，在一實施例中至多兩個碳原子，在另一實施例中一個碳原子各獨立地經O、S(O)q或N置換之伸炔基，其限制條件為仍保留至少一個伸炔基碳-碳參鍵。
芳基
術語「芳基」包括單價芳族環狀烴基，諸如苯基或萘基(例如1-萘基或2-萘基)。一般而言，芳基可為單環或多環稠合環芳族基。較佳芳基為C6-C14芳基。如本文所用之術語「芳基」係指環部分中具有6至20個碳原子之芳族烴基。通常，芳基為具有6至20個碳原子之單環雙環或三環芳基，且包括一或多個芳族環稠合至一或多個非芳族烴環。非限制性實例包括苯基、萘基或四氫萘基。
芳基之其他實例為乙烯合蒽、乙烯合萘、乙烯合菲、蒽、薁、、蔻、丙二烯合茀、茀、as-二環戊二烯并苯、s-二環戊二烯并苯、茚、萘、莪、苝、丙烯合萘、菲、苉、、芘、苒及茹之單價衍生物。
術語「芳基烷基」意謂經芳基取代之烷基，例如苄基。
術語「伸芳基」包括二價芳族環狀烴基，諸如伸苯基。一般而言，伸芳基可為單環或多環稠合環芳族基。較佳伸芳基為C6-C14伸芳基。伸芳基之其他實例為乙烯合蒽、乙烯合萘、乙烯合菲、蒽、薁、、蔻、丙二烯合茀、茀、as-二環戊二烯并苯、s-二環戊二烯并苯、茚、萘、莪、苝、丙烯合萘、菲、苉、、芘、苒及茹之二價衍生物。
雜芳基
術語「雜芳基」包括另外含有一或多個獨立地選自O、S、N及NRN之雜原子之單價雜芳族環狀烴基，其中RN在下文中定義(且在一實施例中為H或烷基(例如C1-6烷基))。如本文所用之術語「雜芳基」係指具有1至8個選自N、O或S之雜原子的5-14員單環或雙環或三環芳族環系統。通常，雜芳基為5至10員環系統(例如5至7員單環或8至10員雙環)或5至7員環系統。典型雜芳基包括2-噻吩基或3-噻吩基、2-呋喃基或3-呋喃基、2-吡咯基或3-吡咯基、2-咪唑基、4-咪唑基或5-咪唑基、3-吡唑基、4-吡唑基或5-吡唑基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基、3-異噻唑基、4-異噻唑基或5-異噻唑基、2-噁唑基、4-噁唑基或5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基或5-異噁唑基、3-1,2,4-三唑基或5-1,2,4-三唑基、4-1,2,3-三唑基或5-1,2,3-三唑基、四唑基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基、3-噠嗪基或4-噠嗪基、3-吡嗪基、4-吡嗪基或5-吡嗪基、2-吡嗪基、及2-嘧啶基、4-嘧啶基或5-嘧啶基。
術語「雜芳基」亦指其中雜芳族環稠合至一或多個芳基環、環脂族環或雜環基環之基團，其中該基團或連接點位於雜芳族環上。非限制性實例包括本文作為H15及H29提供之彼等頭基。
一般而言，雜芳基可為單環或多環(例如雙環)稠合環雜芳族基。在一實施例中，雜芳基含有5至13個環成員(例如5至10個成員)及1、2、3或4個獨立地選自O、S、N及NRN之環雜原子。在一實施例中，雜芳基可為5、6、9或10員雜芳基，例如5員單環、6員單環、9員稠合環雙環或10員稠合環雙環雜芳基。
單環雜芳族基包括含有5至6個環成員及1、2、3或4個選自O、S、N或NRN之環雜原子的雜芳族基。
在一實施例中，5員單環雜芳基含有1個為-NRN-基團、-O-原子或-S-原子之環成員，及視情況1至3個為=N-原子之環成員(例如1或2個環成員)(其中5個環成員中其餘成員為碳原子)。
5員單環雜芳基之實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、異噁唑基、噁唑基、異噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3噁二唑基、1,2,4噁二唑基、1,2,5噁二唑基、1,3,4噁二唑基、1,3,4噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、1,3,5三嗪基、1,2,4三嗪基、1,2,3三嗪基及四唑基。
6員單環雜芳基之實例為吡啶基、噠嗪基、嘧啶基及吡嗪基。
在一實施例中，6員單環雜芳基含有1或2個為=N-原子之環成員(其中6個環成員中其餘成員為碳原子)。
雙環雜芳族基包括含有9至13個環成員及1、2、3、4個或4個以上選自O、S、N或NRN之環雜原子的稠合環雜芳族基。
在一實施例中，9員雙環雜芳基含有1個為-NRN-基團、-O-原子或-S-原子之環成員，及視情況1至3個為=N-原子之環成員(例如1或2個環成員)(其中9個環成員中其餘成員為碳原子)。
9員稠合環雙環雜芳基之實例為苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、異吲哚基、吲唑基、嘌呤基、吲哚啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,2-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]噠嗪基及咪唑并[1,2-c]嘧啶基。
術語「雜芳基烷基」意謂經雜芳基取代之烷基。
術語「伸雜芳基」包括含有一或多個獨立地選自O、S、N及NRN之雜原子之二價雜芳族環狀烴基，其中RN在下文中定義(且在一實施例中為H或烷基(例如C1-6烷基))。一般而言，伸雜芳基可為單環或多環(例如雙環)稠合環雜芳族基。在一實施例中，伸雜芳基含有5至13個環成員(較佳5至10個成員)及1、2、3或4個獨立地選自O、S、N及NRN之環雜原子。在一實施例中，伸雜芳基可為5、6、9或10員伸雜芳基，例如5員單環、6員單環、9員稠合環雙環或10員稠合環雙環伸雜芳基。術語「伸雜芳基」包括以上所論述各雜芳基之二價衍生物。
術語「芳基」、「芳族」、「雜芳基」及「雜芳族」亦包括經部分還原之基團。因此舉例而言，「雜芳基」包括一個環已還原成飽和環之稠合物質(例如1,2,3,4-四氫-1,8-啶-2-基)。
概要
除非另外明確指示，否則在本文中將基團之組合稱為一個部分，例如芳基烷基之情況下，最後提及之基團含有該部分藉以連接至分子之其餘部分的原子。
在提及烷基或其他基團之碳原子經O、S(O)q、N或P(O)r置換之情況下，意欲：置換(其中E不可為H)；-CH=經-N=或-P(O)r=置換；≡C-H經≡N或≡P(O)r置換；或-CH2-經-O-、-S(O)q-、-NRN-或-P(O)rRN-置換，其中RN為H或視情況經取代之C1-6烷基、C1-6雜烷基、C3-6環烷基、C3-6雜環烷基、C2-6烯基、C2-6雜烯基、C3-6環烯基、C3-6雜環烯基、苯基或含有5或6個環成員之雜芳基。RN較佳為H、C1-6烷基或C3-6環烷基。
q獨立地為0、1或2。在一實施例中，q為0。
r獨立地為0或1。在一實施例中，r為0。
在提及碳原子經Si置換之情況下，意欲碳原子交換為矽原子，但化學鍵在其他方面仍保持相同。因此舉例而言，-CH2-經-SiH2-置換；-CH=經-SiH=置換；且≡C-H經≡Si-H置換。
作為說明，關於碳原子數已給出之上述含雜原子基團(諸如雜烷基等)，例如C3-6雜烷基，意欲該基團為3至6個鏈碳原子中之一或多者經O、S(O)q或N置換之基於C3-6烷基之基團。因此，C3-6雜烷基將例如含有少於3至6個鏈碳原子。舉例而言，儘管吡啶基含有5個碳原子，但將吡啶基歸類為C6雜芳基。
在提及下文提供之特定官能基或化學部分之情況下，預期化學實體如下：醚基(例如-O-)；酯基(例如-C(O)O-)；丁二酸酯基(例如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))；胺基甲酸酯基(例如-OC(O)-NR'-)；碳酸酯基(例如-OC(O)O-)；酮基(例如-C-C(O)-C-)；羰基(例如-C(O)-)；脲基(例如-NRC(O)NR'-)；胺基(例如-NR'-)；醯胺基(例如-C(O)NR'-)；亞胺基(例如-C(NR')-)；硫醚基(例如-S-)；黃原酸酯基(例如-OC(S)S-)；磷酸二酯基(例如-OP(O)2O-)；其中R'可獨立地選自H、-NH-、-O-、-S-、磷酸酯基或視情況經取代之C1-10伸烷基。
pKa
除非另外明確指示，否則本文提及之所有pKa均在標準溫度及壓力下在水中量測。此外，除非另外指出，否則所有對pKa之提及均為提及使用以下技術量測之pKa。
藉由稱重脂質且接著溶解於乙醇中來製備脂質於乙醇中之2 mM溶液。藉由首先製備TNS於甲醇中之3 mM溶液且接著用乙醇稀釋至0.3 mM來製備螢光探針TNS於乙醇：甲醇9：1中之0.3 mM溶液。
製備含有濃度分別為20 mM、25 mM、20 mM及150 mM之磷酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉之水性緩衝液。將緩衝液分成8個部分且用12 N HCl或6 N NaOH將pH值調整4.44至4.52、5.27、6.15至6.21、6.57、7.10至7.20、7.72至7.80、8.27至8.33及10.47至11.12。混合400 μL 2 mM脂質溶液與800 μL 0.3 mM TNS溶液。
使用Tecan Genesis RSP150高輸送量液體處理機及Gemini軟體，將7.5 μL探針/脂質混合物添加至含242.5 μL緩衝液之1 mL 96孔板中(NUNC 260252型，Nalgae Nunc International)。對所有8份緩衝液進行此操作。
於1 mL 96孔板中混合後，將100 μL各探針/脂質/緩衝液混合物轉移至250 μL黑色透明底96孔板中(COSTAR 3904型，Corning)。
使用軟體SoftMax pro 5.2及以下參數在SpectraMax M5分光光度計上進行螢光量測：
讀取模式：　螢光，頂部讀取
波長：　Ex 322 nm，Em 431 nm，在420 nm自動截斷
靈敏性：　讀數6，PMT：自動
自動混合：　之前：關
自動校準：　開
檢定板類型：96孔標準clrbtm
讀取孔：　讀取整個板
穩定時間：關
管柱波優先：管柱優先
支架速度：正常
自動讀取：關
量測之後，自各探針/脂質/緩衝液混合物減去96孔板上空孔之背景螢光值。接著將螢光強度值校正為最低pH值下之值。接著在Microsoft Excel軟體中繪製校正之螢光強度相對於pH值之圖。用平滑線連接8個點。
找出線上經校正螢光強度等於0.5之點。找出與等於0.5之經校正螢光強度對應之pH值，且視為脂質之pKa。
使用此方法測定之pKa精確至約0.2個pKa單位。
不存在之基團
當式(I)中之基團a、b或c「不存在」時，意謂存在單鍵作為替代，亦即基團a、b或c之兩側之兩個基團彼此直接鍵結。
取代
如本文所用之術語「視情況經取代」當應用於芳基、雜芳基、環烷基或雜環基中之任一者時，除非另作說明，否則係指該基團未經取代或經一或多個，通常1、2、3、4或5個適合非氫取代基取代，各取代基係獨立地選自由以下組成之群：(a)　烷基；(b)　羥基(或經保護羥基)；(c)　鹵基；(d)　側氧基(oxo)，亦即=O，或烷基亞胺基，亦即=N-烷基；(e)　胺基、烷基胺基或二烷基胺基；(f)　烷氧基；(g)　環烷基；(h)　羧基；(i)　雜環氧基，其中雜環氧基表示雜環基經由氧橋鍵結；(j)　烷基-O-C(O)-；(k)　巰基；(l)　硝基；(m)　氰基；(n)　胺磺醯基或磺醯胺基；(o)　芳基；(p)　烷基-C(O)-O-；(q)　芳基-C(O)-O-；(r)　芳基-S-；(s)　芳氧基；(t)　烷基-S-；(u)　甲醯基，亦即HC(O)-；(v)　胺甲醯基；(w)　芳基-烷基-；及(x)　經烷基、環烷基、烷氧基、羥基、胺基、烷基-C(O)-NH-、烷基胺基、二烷基胺基或鹵素取代之芳基。
如本文所用之術語「視情況經取代」當應用於烷基或含有烷基之基團中之任一者時，除非另作說明，否則係指該基團未經取代或經一或多個，通常1、2或3個適合非氫取代基取代，各取代基係獨立地選自由以下組成之群：鹵基、羥基(或經保護羥基)或烷氧基。
本發明化合物之基團(例如烷基、環烷基、烷氧基、烯基、環烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、雜烷基、雜環烷基、雜烯基、雜環烯基、雜炔基、伸雜烷基、伸雜烯基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基或雜芳基雜烷基等)可經取代或未經取代，在一實施例中未經取代。通常，取代涉及用取代基名義上置換氫原子，或在經=O取代之情況下置換兩個氫原子。
在經取代之情況下，各基團上一般將有1至5個取代基，在一實施例中1至3個取代基，在一實施例中1或2個取代基，在一實施例中1個取代基。一實施例包括在同一原子上有一個以上取代基，例如縮醛基。
在一實施例中，取代基獨立地為Sub1或Sub2(在一實施例中為Sub2)，其中：Sub1獨立地為鹵素、三鹵甲基、三鹵乙基、-NO2、-CN、-N+(Rs)2O-、-CO2H、-CO2Rs、-SO3H、-SORs、-SO2Rs、-SO3Rs、-OC(=O)ORs、-C(=O)H、-C(=O)Rs、-OC(=O)Rs、=O、-NRs 2、-C(=O)NH2、-C(=O)NRs 2、-N(Rs)C(=O)ORs、-N(Rs)C(=O)NRs 2、-OC(=O)NRs 2、-N(Rs)C(=O)Rs、-C(=S)NRs 2、-NRsC(=S)Rs、-SO2NRs 2、-NRsSO2Rs、-N(Rs)C(=S)NRs 2、-N(Rs)SO2NRs 2、-Rs或-ZsRs，其中：Zs獨立地為O、S或NRs；Rs獨立地為H或C1-6烷基、C1-6雜烷基、-(Alka)f-C3-6環烷基、-(Alka)f-C3-6雜環烷基、C2-6烯基、C2-6雜烯基、-(Alka)f-C3-6環烯基、-(Alka)f-C3-6雜環烯基、C2-6炔基、C2-6雜炔基、-(Alka)f-C6-14芳基、-(Alka)f-C6-14芳基或-(Alka)f雜芳基(其中雜芳基含有5至13個環成員)，其中f為0或1；Alka為C1-6伸烷基或C1-6伸雜烷基；及Rs本身視情況經1至3個取代基Sub2取代(在一實施例中未經取代)；Sub2獨立地為鹵素、三鹵甲基、三鹵乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(=O)OC1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、-OC(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(=O)N(C1-6烷基)2、-OC(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=O)C1-6烷基、-C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6雜烷基、-C3-6環烷基、-C3-6雜環烷基、-C2-6烯基、-C2-6雜烯基、-C3-6環烯基、-C3-6雜環烯基、-C2-6炔基、-C2-6雜炔基、-C6-14芳基、-C5-13雜芳基、-Zt-C1-6烷基、-Zt-C3-6環烷基、-Zt-C2-6烯基、-Zt-C3-6環烯基或-Zt-C2-6炔基；及Zt獨立地為O、S、NH或N(C1-6烷基)。
儘管Sub1中之Rs可視情況經1至3個取代基Sub2取代，但Sub2未經取代。然而，在一實施例中，Rs未經取代。
在一實施例中，Rs為H或C1-6烷基，視情況經1至3個取代基Sub2取代。
在一實施例中，Sub2獨立地為鹵素、三鹵甲基、三鹵乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6環烷基、-C3-6雜環烷基、-Zt-C1-6烷基或-Zt-C3-6環烷基。
在一實施例中，在經取代之基團為非環狀(例如烷基、雜烷基、烯基等)之情況下，Sub1不為Rs且Sub2不為-C1-6烷基、-C1-6雜烷基、-C2-6烯基、-C2-6雜烯基、-C2-6炔基或-C2-6雜炔基。
在除Sub2外之基團具有至少兩個可經取代之位置的情況下，該基團可經伸烷基、伸烯基、伸炔基、伸雜烷基、伸雜烯基或伸雜炔基鏈(在一實施例中含有1至6個原子，在一實施例中含有3至6個原子，且在一實施例中含有3或4個原子)之兩端取代以形成環狀部分。彼鏈視情況經1至3個取代基Sub2取代。在一實施例中，彼鏈未經取代。因此，術語視情況經取代之「環烷基」、「環烯基」、「環炔基」、「雜環烷基」、「雜環烯基」、「雜環炔基」、「芳基」及「雜芳基」包括稠合物質。舉例而言，「視情況經取代之環烷基」包括兩個環烷基環經稠合之物質，且「視情況經取代之雜芳基」包括雜環烷基環稠合至芳族環之物質(例如5,6,7,8-四氫-1,8-啶-2-基)。
在除Sub2外之基團具有可經取代兩次之原子的情況下，彼原子可經伸烷基、伸烯基、伸炔基、伸雜烷基、伸雜烯基或伸雜炔基鏈(在一實施例中含有2至8個原子，在一實施例中含有3至6個原子，且在一實施例中含有4或5個原子)之兩端取代以形成環狀部分。彼鏈視情況經1至3個取代基Sub2取代。在一實施例中，彼鏈未經取代。因此，術語視情況經取代之「環烷基」、「環烯基」、「環炔基」、「雜環烷基」、「雜環烯基」、「雜環炔基」、「芳基」及「雜芳基」包括螺物質。
作為說明，當基團具有雜原子時，取代基可鍵結至雜原子。因此舉例而言，「視情況經取代之雜烷基」包括-CH2-N(Sub1)-CH2-、-CH(Sub1)-NH-CH2-及-CH(Sub1)-N(Sub1)-CH2-等。
修飾語術語
當在清單前有修飾語時，意欲該修飾語理解為應用於清單中之各條目。舉例而言，短語「視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基」意謂清單中之四個條目各者，亦即C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基及C6-20雜芳基可視情況經取代。
當基團藉由第一修飾語表徵，且接著隨後，同一基團藉由後續修飾語表徵時，意謂該基團同時藉由兩個修飾語表徵。舉例而言，若將基團描述為「C3-20雜環炔基」(第一修飾語)，且接著隨後將同一基團描述為「C5-16」(後續修飾語)，則意謂C5-16雜環炔基。
類固醇
如本文所用之術語「類固醇」係指包含以下結構之任何基團(本文將此結構稱為「類固醇骨架」)。
僅出於說明之目的，上文將類固醇骨架繪成完全飽和的。然而，術語類固醇亦意欲涵蓋在類固醇骨架中存在不飽和之情況。舉例而言，術語類固醇涵蓋包含完全不飽和(非累積雙鍵最大值)基本骨架之基團，15H-環戊二烯并[a]菲：
術語類固醇亦涵蓋包含部分不飽和類固醇骨架之基團。
術語類固醇亦涵蓋類固醇骨架之「開環」衍生物，亦即已發生環裂解之基團；類固醇骨架之「降」及「高」衍生物，其分別包括環收縮及擴大(參見D. Hellwinkel,Systemic Nomenclature of Organic Chemistry,Springer出版,2001,ISBN: 3-540-41138-0,關於「開環」請見第203頁及關於「降」及「高」請見第204頁)。然而，在一實施例中，術語「類固醇」不涵蓋該等「開環」衍生物。在另一實施例中，術語「類固醇」不涵蓋該等「降」衍生物。在另一實施例中，術語「類固醇」不涵蓋該等「高」衍生物。因此，在一實施例中，術語「類固醇」不涵蓋該等開環、降及高衍生物。
術語類固醇亦涵蓋在結構標記之類固醇骨架中一或多個碳原子經雜原子置換之情況。在一此類實施例中，至多6個碳原子，在一實施例中至多5個碳原子，在另一實施例中至多4個碳原子，在另一實施例中至多3個碳原子，在另一實施例中至多2個碳原子，在另一實施例中1個碳原子各獨立地經O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且較佳O、S(O)q或N)置換。然而，在一實施例中，術語「類固醇」包含「類固醇基本骨架」不包含雜原子之物質。
根據以下所述之慣例對類固醇環系統進行編號。
術語類固醇涵蓋固醇、類固醇激素、膽汁酸及膽汁酸之鹽。固醇為在A環之3位具有羥基之任何類固醇。
不飽和
根據標準用法，ω-3位係指鏈之(甲基)末端之第三個鍵；ω-6位係指鏈之(甲基)末端之第六個鍵且ω-9位係指鏈之(甲基)末端之第九個鍵。
PDI
縮寫字PDI表示多分散性指數。除非另外指示，否則本文提及之所有PDI均為完全形成之奈米粒子之PDI，如在Malvern Zetasizer上藉由動態光散射所量測。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋奈米粒子樣品以便計數率為約200至400 kct。
一般定義
術語「包含」涵蓋「包括」以及「由......組成」，例如「包含」X之組合物可能僅由X組成或可能包括其他某物，例如X+Y。
詞語「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含」Y之組合物可能完全不含Y。必要時，本發明之定義可省略詞語「實質上」。
與數值x有關之術語「約」意謂例如x±10%。在一實施例中，相對於所有所揭示之數值，術語「約」均不存在。
為避免產生疑問，在一化合物、組合物、方法或用途之上下文中明確揭示之任何特徵因此無疑亦揭示於多種化合物、組合物、方法及用途之上下文中。舉例而言，若本文明確揭示本發明之化合物具有特徵「A」，則本文無疑揭示根據本發明之治療方法，其涉及具有特徵「A」之本發明化合物。
此外，本文已描述本發明之各種實施例。應認識到各實施例中說明之特徵可與其他指定特徵組合以提供其他實施例。
本發明陽離子型脂質之化學合成
途徑A闡述可用以合成本發明化合物之通用方法。途徑CDT說明可如何製備膽固醇二甘醇甲苯磺酸酯試劑。
環氧化物(實例1)
將亞油醇(48.7 g，183 mmol)添加至圓底燒瓶中且溶解於THF(400 mL)中。使用冰浴冷卻所得溶液，且添加氫化鈉(13.16 g，329 mmol)。在室溫下攪拌所得漿料1小時。整份添加表溴醇且在室溫下持續反應。攪拌4小時後，再添加氫化鈉(13.16 g，329 mmol)。在室溫下再攪拌1小時後，添加表溴醇之另一等分試樣(32.5 g，238 mmol)。接著加熱反應物至50℃隔夜。接著使反應物冷卻至室溫且用水淬滅。添加EtOAc且收集所得有機層，用鹽水洗滌且經硫酸鈉乾燥。藉由旋轉蒸發移除揮發物且藉由二氧化矽層析用EtOAc/庚烷純化所得殘餘物得到所需環氧化物。
膽 固醇甲苯磺酸酯(實例2)
將膽固醇(50 g，129 mmol)溶解於DCM(55 mL)及吡啶(150 mL)中。使所得溶液冷卻至0℃且以整份添加呈固體狀之甲苯磺醯氯。使反應物緩慢升溫至室溫隔夜。藉由旋轉蒸發濃縮反應物且添加MeOH(500 mL)，產生白色固體。持續攪拌30分鐘，且藉由過濾收集沈澱物，用MeOH洗滌且在真空下乾燥得到所需甲苯磺酸酯。
膽固醇二甘醇(實例3)
將膽固醇甲苯磺酸酯(73 g，128 mmol)溶解於1,4-二噁烷(750 mL)中。添加二乙二醇(294 mL，3077 mmol)且加熱反應物至溫和回流隔夜。冷卻所得溶液至室溫且藉由旋轉蒸發濃縮。將所得凝膠溶解於DCM中且與水一起攪拌。收集所得有機層且用DCM萃取水層一次。合併有機層，經硫酸鈉乾燥，且藉由旋轉蒸發濃縮。經二氧化矽用EtOAc/庚烷純化粗產物，得到所需膽固醇二甘醇。
膽固醇二甘醇甲苯磺酸酯(實例4)
於DCM(160 mL)及吡啶(60 mL)中攪拌膽固醇二甘醇(51.5 g，103 mmol)。添加甲苯磺醯酐(38.7 g，119 mmol)且在室溫下攪拌所得溶液隔夜。藉由旋轉蒸發濃縮反應物且經二氧化矽用EtOAc/庚烷純化所得殘餘物，得到所需產物。
3-哌啶基-1,2-丙二醇1-亞油基醚(實例5)
將實例1之環氧化物(1.0 g，3.1 mmol)溶解於EtOH(17 mL)中。添加哌啶(0.45 mL，4.65 mmol)且在微波反應器中加熱混合物至140℃維持5分鐘。冷卻至室溫後，藉由旋轉蒸發濃縮混合物且經二氧化矽用MeOH/DCM純化，得到所需胺基醇。
最終化合物1(實例6)
於甲苯(15 mL)中攪拌實例5之胺基醇(0.447 mg，1.09 mmol)且整份添加NaH(0.102 g，4.24 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物30分鐘，且整份添加實例4之甲苯磺酸酯。加熱反應物至回流隔夜。冷卻至室溫(「rt」)後，藉由添加飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應。攪拌所得混合物5分鐘，且接著藉由旋轉蒸發濃縮。經二氧化矽用MeOH/DCM直接純化所得殘餘物得到粗產物，再經二氧化矽用EtOAc/庚烷純化得到所需化合物。
以下化合物(其結構在下文闡述)可藉由途徑A方法製造。
E0011；E0002；E0003；E0013；E0015；E0006；E0008；E0001；E0022；E0026；E0030；E0037；E0038；E0039；E0042；E0050；E0055；E0061；E0062；E0063；E0064；E0065；E0066；E0068；E0069；E0070；E0071；E0072；E0073；E0074；E0075；E0076；E0077；E0078；E0079；E0080；E0081；E0082；E0083；E0084；E0085；E0086；E0087；E0088；E0089；E0090；E0091；E0092；E0093；E0094；E0095；E0096；E0107；E0109；E0023；E0024；E0025；E0031；E0033；E0034；E0043；E0046；E0059；E0067；E0014；E0119；E0016；E0004；E0005；E0017；E0018；E0019；E0120；E0007；E0020；E0010；E0021；E0027；E0028；E0029；E0032；E0035；E0009；E0040；E0041；E0044；E0048；E0049；E0052；E0053；E0057；E0119；E0120；E0121；E0124；E0126；E0127；E0147；E0149；E0158；E0051；E0067；E0112；E0113；E0114；E0118；E0159；E0170；及E0171。
途徑B亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例7
將膽固醇(3.33 g，8.62 mmol)、二甘醇酐(1 g，8.62 mmol)、DMAP(0.263 g，2.154 mmol)、CH2Cl2(35 ml)及攪拌棒添加至圓底燒瓶中。在室溫下攪拌反應物3天。
濃縮反應混合物，且藉由急驟層析法經IntelliFlash 280(AnaLogix)使用SF40-80G管柱：0-2 CV，100% CH2Cl2；2-10 CV，100:0 CH2Cl2:(MeOH 10% AcOH)至90:10 CH2Cl2:(MeOH 10% AcOH)之線性梯度；10-25 CV，90:10 CH2Cl2:(MeOH 10% AcOH)至85:15 CH2Cl2:(MeOH 10% AcOH)之線性梯度純化殘餘物。產物與膽固醇共溶離。合併含有產物之溶離份且在真空中濃縮得到白色漿料，接著用庚烷稀釋(膽固醇可溶於庚烷中)且在冰浴中冷卻。濾出白色固體，用庚烷洗滌，且置放於真空下，得到1.50 g(35%)純產物。
實例8
將實例5之胺基醇(105.3 mg，0.258 mmol)、DMAP(22 mg，0.180 mmol)及實例7之羧酸(135.6 mg，0.270 mmol)稱重至小瓶中。添加二氯甲烷(2.5 mL)，之後添加EDC.HCl(67.1 mg，0.350 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。
經由急驟層析法經IntelliFlash 280(AnaLogix)使用SF15-24G管柱：0-3 CV，100% CH2Cl2；3-25 CV，100:0 CH2Cl2:MeOH至95:5 CH2Cl2:MeOH之線性梯度純化粗反應混合物。產物仍不純。再次經由急驟層析法經IntelliFlash 280(AnaLogix)使用SF15-24G管柱純化殘餘物。0-3 CV，100%庚烷；3-30 CV，100:0庚烷：乙酸乙酯至65:35庚烷：乙酸乙酯之線性梯度。含產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且在真空中濃縮得到38 mg(13%)呈澄清液體狀之純產物。
以下化合物(其結構在下文中闡述)可藉由途徑B方法製造：E0036及E0047。
途徑C亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例9
將2-(2-氯乙氧基乙醇)(5.01 g，40.2 mmol)稱重至圓底燒瓶中且溶解於DMF(100 ml)中。攪拌溶液，添加NaN3(2.89 g，44.5 mmol)，且使溫度升至80℃。溶液變混濁。攪拌反應物隔夜。
次日早晨，不再對反應物加熱且用300 mL水稀釋。用乙酸乙酯洗滌此溶液以萃取產物(4×100 mL)。用硫酸鈉乾燥有機相且濃縮成液體。根據1H NMR，此液體含有44重量%之DMF。產物(5.19 g(98%))未經進一步純化即用於下一步驟。
實例10
在圓底燒瓶中將實例9之疊氮醇(5.25 g，22.42 mmol)及吡啶(3 mL，37.1 mmol)溶解於CH2Cl2(45 ml)中且於冰浴中攪拌。一旦冷卻，整份添加甲苯磺醯氯(4.70 g，24.66 mmol)。將反應物儲存於冰箱中隔夜。
第二天，用CH2Cl2(50 mL)稀釋反應物且用1 M HCl(2×40mL)萃取以移除吡啶。用鹽水(40 mL)洗滌有機相一次且濃縮。經由急驟層析法經IntelliFlash 280(AnaLogix)使用SF40-115G管柱：0-20CV，100:0庚烷：乙酸乙酯至50:50庚烷：乙酸乙酯之線性梯度純化殘餘物。含產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且在真空中濃縮得到估算純度為90%之產物：0.61 g(10%)。
實例11
如實例6中但使用實例5之胺基醇及實例10之甲苯磺酸酯進行。
實例12
在小瓶中將實例11之烷基疊氮化合物(334 mg，0.641 mmol)溶解於THF(4 mL)及水(0.400 mL)中。向此溶液中添加三甲基膦於THF中之溶液(2.5 mL，2.500 mmol三甲基膦)，且攪拌反應物隔夜。次日早晨，根據TLC反應似乎完全。蒸發溶劑且將殘餘物溶解於10 mL MeOH中。將溶液加載於用MeOH預先平衡之SCX(10 g)管柱上，用50 mLMeOH洗滌，接著用4×10 mL含7 M NH3之MeOH溶離。產物溶離於第二、第三及第四溶離份中；彙集此等溶離份且濃縮。根據TLC(且根據氣味)，仍存在三甲基膦，因此將殘餘物溶解於50 mL EtOAc中且用3×15 mL由於添加NaHCO3而使得略呈鹼性之水洗滌。用Na2SO4乾燥有機相且濃縮成無色液體：232 mg(73%)。
實例13
在圓底燒瓶中將實例12之胺(232 mg，0.469 mmol)溶解於CH2Cl2(5 mL)中。向此溶液中添加膽固醇氯甲酸酯(316 mg，0.703 mmol)及DMAP(86 mg，0.703 mmol)。在室溫下攪拌溶液隔夜。
經由急驟層析法經IntelliFlash 280(AnaLogix)使用SF15-24G管柱：0-5 CV，100% CH2Cl2；5-15 CV，100:0 CH2Cl2：MeOH至95:5 CH2Cl2:MeOH之線性梯度；15-30，95:5 CH2Cl2:MeOH直接純化粗反應混合物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成淡黃色油狀物：339 mg(80%)。
以下化合物(其結構在下文中闡述)可藉由途徑C方法製造：E0054；E0097；E0099；E0103；E0148；E0169；E0175；及E0176。
途徑D亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實 例14
在0℃下向二乙二醇乙烯基醚(3.96 g，30 mmol)於CH2Cl2中之溶液中添加吡啶(4.85 mL)，之後添加甲苯磺醯氯(6.86 g，36 mmol)。在0℃下10分鐘後，使反應物升溫至室溫且攪拌隔夜。
在飽和NaHCO3水溶液與乙酸乙酯之間萃取反應物。合併有機萃取物，乾燥且濃縮。經由急驟層析法用30%乙酸乙酯/70%庚烷溶離來純化殘餘物：5.45 g(63%)。
實例15
在室溫下向實例14之乙烯基醚(1.0 g，3.49 mmol)於CH2Cl2中之溶液中添加膽固醇(0.675 g，1.746 mmol)，之後添加PPTS(0.878 g，3.49 mmol)。在室溫下攪拌反應物5小時。根據TLC產物極接近於膽固醇溶離且略具UV活性。在飽和NaHCO3水溶液與乙酸乙酯之間萃取反應物。合併有機萃取物，乾燥且濃縮。經由急驟層析法用30%乙酸乙酯/70%庚烷溶離來純化粗殘餘物：700 mg(60%)。
實例16
如實例6中但使用實例5之胺基醇及實例15之甲苯磺酸酯進行。
以下化合物(其結構在下文中闡述)可藉由途徑D方法製造：E0058。
途徑E亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例17
如實例6中但使用實例5之胺基醇及實例14之甲苯磺酸酯進行。
實例18
在室溫下將1 N HCl水溶液(0.38 mL，0.38 mmol)逐滴添加至實例17之乙烯基醚(100 mg，0.19 mmol)於4 mL 1:1乙醇/THF中之溶液中。1小時後，在飽和NaHCO3水溶液與乙酸乙酯之間萃取反應物。合併有機萃取物，乾燥且濃縮成油狀物，其未經進一步純化即用於下一步驟：85 mg(90%)。
實例19
如實例8中但使用實例18之胺基醇及膽固醇半丁二酸酯作為羧酸進行。
以下化合物(其結構在下文中闡述)可藉由途徑E方法製造：E0060；E0104；E0129；E0130；E0143；E0150；E0151；E0152；E0161；E0162；E0163；E0164；E0165；E0177；E0178；及E0179。
途徑F亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例20
在室溫下向實例18之胺基醇(600 mg，1.21 mmol)於甲苯(12 mL)中之溶液中添加60% NaH(97 mg，2.42 mmol)(反應物變為黃色)。10分鐘後，添加膽固醇氯甲酸酯(815 mg，1.815 mmol)。接著加熱反應物至80℃(反應物變為橙色)且攪拌隔夜。
冷卻反應混合物且於鹽水與乙酸乙酯之間萃取。合併有機萃 物，用Na2SO4乾燥，且濃縮成油狀物。經由急驟層析法用5% MeOH/95% CH2Cl2純化粗油狀物：720 mg(66%)。
以下化合物(其結構在下文中闡述)可藉由途徑F方法製造。
E0056；E0122；E0123；E0138；及E0139。
途徑G亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例21
將實例5之胺基醇(12.4 mmol)於THF(10 mL)中之溶液及DIAD(3 mL)於THF(10 mL)中之溶液同時添加至PPh3(2.5 g)及鄰苯二甲醯亞胺(2.5 g)於THF(50 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。濃縮反應物至乾燥且直接用於下一步驟。
實例22
於乙醇(25 mL)中攪拌實例21之物質且添加甲胺於THF中之溶液。在室溫下攪拌反應物16小時，且接著濃縮至乾燥。藉由二氧化矽層析純化粗物質。
實例23
於DMF(5 mL)中攪拌實例22之胺(0.22 mmol)以及膽固醇半丁二酸酯(0.25 mmol)、HATU(0.26 mmol)。添加N-甲基嗎啉(0.55 mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。在真空下濃縮所得溶液且用EtOAc稀釋。相繼用水及鹽水洗滌所得有機層，且濃縮成黃色液體。經中性氧化鋁純化所得殘餘物得到淡黃色液體。
以下化合物可藉由途徑G方法製造：E0098；E0100；E0101；E0105；E0106；及E0108。
途徑H亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例24
向實例22之胺(3.55 mmol)於DCM(10 mL)中之溶液中添加DIEA(5.7 mmol)及膽固醇氯甲酸酯(6.0 mmol)。在室溫下攪拌所得反應物隔夜。用EtOAc(50 mL)稀釋反應物，且相繼用水及鹽水洗滌。濃縮所得有機層得到殘餘物，且藉由二氧化矽層析純化得到淡黃色液體。
E0102可使用途徑H方法製備。
途徑I亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
實例25
向實例22之胺(0.33 mmol)於DCM(25 mL)中之溶液中添加BOC甘胺酸(0.36 mmol)、HATU(0.36 mmol)及DIEA(0.66 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。用飽和NH4Cl水溶液洗滌所得反應混合物，經硫酸鈉乾燥且濃縮成粗固體，其未經進一步純化即使用。
實例26
於DCM(15 mL)中攪拌前一步驟之物質且添加TFA(5 mL)。在室溫下攪拌所得溶液隔夜。濃縮所得混合物至乾燥且添加1.5 N HCl(20 mL)。用EtOAc洗滌溶液，且接著用固體NaHCO3調整至pH>7。用DCM萃取所得混合物，且所得有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮成粗固體，其未經進一步純化即使用。
實例27
於DCM(20 mL)中攪拌前一步驟之物質且添加DIEA(0.53 mmol)。向此溶液中添加膽固醇氯甲酸酯(0.53 mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。接著用(50 mL)稀釋反應物且用1.5 N HCl、10% NaHCO3水溶液及鹽水洗滌所得溶液。所得有機層經硫酸鈉乾燥，且濃縮成固體。
E0110及E0111可使用途徑I方法製備。
實例28至32亦表示可用以合成本發明化合物之途徑。
實例28
使用途徑A方法製備之經BOC保護之陽離子型脂質(150 mg)與三乙基矽烷(0.5 mL)一起攪拌且整份添加TFA(10 mL)。2小時後，濃縮反應物至乾燥。經二氧化矽用含0至15% MeOH之DCM純化所得殘餘物，且濃縮成玻璃狀油狀物。
E0012可使用此方法製造。
實例29
於THF(2 mL)中攪拌使用途徑A方法製備之經TBDMS保護之陽離子型脂質(135 mg，0.138 mmol)且添加TBAF之溶液(0.28 mL，1.0 M THF溶液，0.28 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。經二氧化矽用含0至20% MeOH之DCM直接純化反應物得到澄清油狀物。
E0045可使用此方法製造。
實例30至實例31亦表示可用以合成本發明化合物之途徑。
實例30
經15分鐘向攪拌之三聚甲醛(536 mg)於TMSCl(9.4 mL)中懸浮液中逐滴添加亞油醇(5.0 g)。一旦反應物變清澈，即在減壓下濃縮且立即用於下一步驟。
實例31
向攪拌之環氧丙醇(1.5 mL)於THF(50 mL)中之溶液中添加實例30之化合物(5.8 g)、DIEA(9.5 mL)、碘化四丁銨(6.8 g)。在室溫下攪拌反應物5小時。藉由過濾移除固體且用乙醚洗滌。收集濾液且用水及鹽水洗滌。所得有機層經硫酸鈉乾燥，且在減壓下濃縮成粗油狀物。藉由已經含有3%三乙胺之移動相預先處理之二氧化矽層析純化粗物質。使用含EtOAc之庚烷溶離物質得到1.65 g呈澄清液體狀之純產物。
可使用實例30及此實例31之步驟製造用於製造E0115、E0116、E0117及E0160之起始物質。
實例32
於THF(20 mL)中攪拌乙二醇(0.30 g)且添加60重量%氫化鈉(0.19 g)。攪拌所得混合物20分鐘。添加甲磺酸亞油酯(1.64 g)且加熱反應物至50℃維持2小時，且接著至回流隔夜。冷卻反應物至室溫且再攪拌24小時。向反應物中添加飽和氯化銨水溶液且用DCM萃取所得混合物。所得有機層經硫酸鈉乾燥，且濃縮成粗油狀物。經二氧化矽使用含EtOAc之庚烷純化粗物質得到640 mg所需產物。
實例30至32之方法可用於合成亞油基鏈與分子核心之間具有間隔基的脂質(例如E0055)。
途徑J亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
途徑J
實例33
向膽固醇(10 g、26 mmol)及硼烷-THF(5滴)於DCM(30 mL)中之溶液中添加重氮乙酸乙酯(3.5 mL，52 mmol)。攪拌5分鐘後，濃縮反應混合物且藉由二氧化矽層析用己烷/EtOAc純化，得到9 g所需產物。
實例34
向實例33之化合物(9 g，19 mmol)於EtOH(110 mL)中之溶液中添加NaOH(3 g，76 mmol)。加熱所得混合物至70℃維持3小時。冷卻反應物至室溫且濃縮。將殘餘物溶解於水中且用2 N HCl酸化且用DCM(2×)萃取。合併所得有機層且濃縮得到8 g所需產物。
實例35
將EDC(1.8 g，9.8 mmol)及DMAP(80 mg，0.66 mmol)添加至實例34之化合物(2.2 g，4.9 mmol)於DCM(5 mL)中之溶液中。攪拌反應物10分鐘，且接著添加乙醇(1.5 g)，且在室溫下攪拌反應物隔夜。用DCM稀釋反應物且用水洗滌。濃縮所得有機層得到殘餘物，且經二氧化矽用氯仿/MeOH純化得到呈油狀之所需產物。
以下化合物可藉由途徑J方法製造：E0125；E0128；E0131；E0140；及E0144。
途徑K亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
途徑K
實例36
向N-Boc-β丙胺酸(1.25 g，6.61 mmol)於DCM(6 mL)中之溶液中添加EDC(2.5 g，13 mmol)、HOBt(0.3 g，2 mmol)及TEA(2 mL，13 mmol)。攪拌所得混合物30分鐘。添加胺基醇(2 g)於DCM(4 mL)中之溶液且攪拌反應物10小時。用DCM稀釋反應物，且用飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌。所得有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮成油狀物，該油狀物經二氧化矽用MeOH/DCM純化。濃縮產物得到2.65 g油狀物。
實例37
於DCM(10 mL)中攪拌實例36之化合物(2.6 g)且添加TFA(10 mL)。3小時後，濃縮反應物至乾燥且直接用於下一步驟。
實例38
向實例37之化合物(2 g)於DCM(20 mL)中之溶液中添加DIEA(2.7 mL，15.7 mmol)及DMAP(80 mg，0.6 mmol)，之後添加膽固醇氯甲酸酯(2.1 g，4.7 mmol)。在室溫下攪拌反應物3小時。用DCM稀釋反應物且用水洗滌。濃縮所得有機層且經二氧化矽用MeOH/氯仿純化得到2.1 g所需產物。
以下化合物可藉由途徑K方法製造：E0133；E0134；E0135；E0136；E0137；E0141；E0132；E0142；E0145；E0166；及E0168。
途徑L亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
途徑L
實例39
向乙醇(2.5 g，5.8 mmol)於DCM(10 mL)中之溶液中添加對硝基氯甲酸酯及TEA，在室溫下攪拌反應物隔夜。用DCM稀釋反應物且用水洗滌。所得有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮成油狀物，且經二氧化矽用EtOAc/己烷純化得到所需產物。
實例40
於MePh(10 mL)中攪拌醇(1.3 g，2.9 mmol)。添加NaH(0.46 g，11.4 mmol)且在室溫下攪拌反應物30分鐘。添加實例39之化合物(1.7 g，1.2 mmol)且在室溫下攪拌反應物16小時。於冰浴中冷卻反應物且用水淬滅。用EtOAc萃取所得混合物。合併有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮成粗油狀物。物質經二氧化矽用EtOAc/己烷純化得到1 g所需產物。
E0146可使用途徑L技術來製造。
實例41、實例42及實例43
保存實例41、實例42及實例43且有意留作空白。
途徑X亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
途徑X
實例44
在室溫下向2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-基)乙醇(800 mg，5.47 mmol)、三乙胺(0.915 mL，6.57 mmol)及N,N-二甲胺基吡啶(134 mg，1.10 mmol)於二氯甲烷(25 mL)中之溶液中添加甲苯磺醯氯(1.10 g，5.75 mmol)。在室溫下攪拌反應物3小時。用飽和NaHCO3水溶液稀釋反應物，且用乙酸乙酯萃取。乾燥有機相，濃縮且藉由二氧化矽急驟層析法用乙酸乙酯/庚烷梯度純化粗產物：1.24 g，75%。
實例45
在燒瓶中組合實例44之甲苯磺酸酯(1.03 g，3.43 mmol)及嗎啉(2.97 mL，34.3 mmol)。密封燒瓶且在60℃下加熱隔夜。用乙酸乙酯稀釋反應混合物且用飽和NaHCO3水溶液洗滌。乾燥有機相，濃縮且藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物：670 mg，91%。
實例46
在0℃下將實例45之胺(530 mg，2.46 mmol)溶解於二噁烷(15 mL)中。向冷卻溶液中添加濃HCl(水溶液，7.39 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。添加過量固體K2CO3以中和酸。藉由過濾移除固體且用丙酮洗滌。濃縮濾液且藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物：320 mg，74%。
實例47
於DCM(12 mL)中攪拌實例46中前一步驟之二醇(320 mg，1.8 mmol)與咪唑(249 mg，3.65 mmol)。向此溶液中添加TBDPSCl(0.475 mL，1.8 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。用DCM稀釋反應物且用飽和碳酸氫鈉洗滌。所得有機層經硫酸鈉乾燥，濃縮成油狀物，且經二氧化矽用DCM/MeOH純化得到650 mg所需產物。
實例48
向含前一步驟之物質(640 mg，1.5 mmol)之甲苯(15 mL)中添加氫化鈉(124 mg，於油中60重量%，3.1 mmol)。20分鐘後，添加膽固醇試劑(1.17 g，1.86 mmol)且加熱反應物至回流隔夜。冷卻至室溫後，用鹽水淬滅反應且用乙酸乙酯萃取。乾燥所得有機層，濃縮，且經二氧化矽用EtOAc/庚烷純化得到560 mg所需產物。
實例49
向含前一步驟之物質(660 mg，0.76 mmol)之THF(6 mL)中添加TBAF於THF中之1 M溶液(1.5 mL，1.5 mmol)。在室溫下攪拌反應物2小時，且接著用EtOAc稀釋。用鹽水洗滌所得有機層，乾燥且濃縮成粗產物，該粗產物經二氧化矽用MeOH/DCM純化。
實例50
在室溫下將實例49之胺基醇(280 mg，0.443 mmol)溶解於甲苯(4 mL)中，且接著添加60% NaH(44 mg，1.1 mmol)。20分鐘後，添加甲苯磺酸油醇酯(在與實例10中所述類似之方法中由油醇製備)(187 mg，0.443 mmol)。回流反應物3小時。冷卻反應物至室溫，用乙酸乙酯稀釋且用鹽水洗滌。乾燥有機相，濃縮且藉由二氧化矽急驟層析法用乙酸乙酯/庚烷梯度純化粗產物：183 mg，47%。
E0180可藉由途徑X方法製造。
途徑Y亦表示可用以合成本發明化合物之通用方法。
途徑Y
實例51
向膽固醇(700 mg，1.8 mmol)於DCM(20 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(750 g，5.4 mmol)及DMAP(22 mg，0.18 mmol)，逐滴添加溴乙醯溴(0.19 mL，2.2 mmol)。於冰浴中攪拌90分鐘後，過濾反應物，濃縮且經二氧化矽用DCM/庚烷純化得到850 mg所需產物。
實例52
向胺基醇(1.08 g，2.37 mmol)於MePh(20 mL)中之溶液中添加NaH(190 mg，於油中60重量%，4.74 mmol)。在回流下加熱混合物10分鐘，且接著添加溴乙醯基膽固醇(1.20 g，2.37 mmol)。在回流下攪拌反應物2小時且冷卻至室溫。向反應物中添加水及EtOAc及鹽水。收集所得有機層，乾燥且濃縮成粗物質，在管柱用含1%乙酸之DCM平衡後將粗物質經二氧化矽用EtOAc/庚烷純化。純化後，合併含有產物之溶離份且用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，之後濃縮得到700 mg所需產物。
E0167可使用途徑Y方法來製造。
實例53
隱形脂質結構及合成
表3中提供隱形脂質S001至S026之結構。以下實例54至實例67說明隱形脂質之合成。
實例54：S001
將膽固醇半丁二酸酯(608 mg，1.25 mmol)及N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(240 mg，1.25 mmol，EDC.HCl)溶解於無水二氯甲烷(4 mL)中，且接著添加N,N-二甲胺基吡啶(305 mg，2.50 mmol)及聚(乙二醇)甲醚(500 mg，0.250 mmol，Mn為約2,000 g/mol，Sigma-Aldrich)。在室溫下攪拌反應混合物。72小時後，將全部反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：304 mg，48.6%。
利用四氫呋喃之尺寸排阻層析法顯示單窄峰。1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例55：S002
步驟1
將β-丙胺酸鹽酸鹽(1.00 g，7.16 mmol)、膽固醇氯甲酸酯(3.06 g，6.81 mmol)及三乙胺(2.0 ml，14 mmol)溶解於無水氯仿(25 ml)中。在室溫下攪拌溶液隔夜。次日早晨，蒸發溶劑且將殘餘物溶解於乙酸乙酯(100 mL)中且用1 M HCl、鹽水洗滌且經Na2SO4乾燥。產物濃縮成白色固體且未經進一步純化即用於下一步驟：3.31 g，90.0%。
步驟2
將前一步驟之產物(甲酯)(298 mg，0.578 mmol)溶解於四氫呋喃(2 mL)中且添加1 M NaOH(2.0 mL，2.0 mmol)，得到兩相溶液。在室溫下攪拌溶液，形成乳液。2小時後，用10 mL水稀釋反應混合物且用1 M HCl酸化。將產物萃取至乙酸乙酯(100 mL)中。有機相用鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥且濃縮成白色固體。1H NMR指示存在少量甲酯起始物質(約5 mol%)，但認為純度足以不經進一步純化即用於下一步驟：252 mg，83.0%。
步驟3
將N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(96 mg，0.50 mmol)、前一步驟之產物(羧酸)(252 mg，0.477 mmol)、N,N-二甲胺基吡啶(122 mg，1.00 mmol)及聚(乙二醇)甲醚(200 mg，0.100 mmol，Mn為約2,000 g/mol，Sigma-Aldrich)溶解於無水二氯甲烷(5.0 mL)中且在室溫下攪拌。24小時後，將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：151 mg，60.3%。
利用四氫呋喃之尺寸排阻層析法顯示單窄峰。1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例56：S003
將PEG-NH2(500 mg，0.250 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)、膽固醇氯甲酸酯(449 mg，1.00 mmol)、N,N-二甲胺基吡啶(122 mg、1.00 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(148 mg，1.15 mmol)溶解於5 mL 1:1甲苯：二氯甲烷中且在室溫下攪拌。72小時後，添加N,N-二甲基乙二胺(0.2 mL)以淬滅過量膽固醇氯甲酸酯。攪拌30分鐘後，將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：376 mg，57.8%。
利用四氫呋喃之尺寸排阻層析法顯示單窄峰。1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例57：S004
步驟1
在氮氣下向空氣加熱槍乾燥之圓底燒瓶中添加十八醛(500 mg，1.86 mmol)及四氫呋喃(10 mL)。經由注射器添加氯化十八烷基鎂於四氫呋喃中之0.5 M溶液(7.5 mL，3.8 mmol)且使反應物升溫至40℃。添加完成時，攪拌反應物1小時。不再對反應物加熱且用1 mL乙酸淬滅。達到室溫後，用二氯甲烷稀釋溶液且用水、0.1 M NaOH、1 M HCl及鹽水洗滌。有機相用硫酸鈉乾燥且過濾。自熱庚烷中結晶粗物質兩次，得到呈白色粉末狀之產物：195 mg，20.0%。
步驟2
在40℃下將前一步驟之產物(醇)(194 mg，0.371 mmol)溶解於二氯甲烷(4 ml)中且接著添加吡啶(100 μl，1.24 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(93 mg，0.46 mmol)。在40℃下攪拌反應物隔夜且接著冷卻至室溫。藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷/二氯甲烷梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：219 mg，86.0%。
步驟3
在室溫下將前一步驟之產物(碳酸4-硝基苯酯)溶解於甲苯(5 ml)中。添加PEG-NH2(800 mg，0.400 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)、N,N-二甲胺基吡啶(50 mg，0.409 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(200 μl，1.145 mmol)且在室溫下攪拌溶液。72小時後，將反應物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。為移除4-硝基苯酚雜質，將產物溶解於二氯甲烷(10 mL)中且添加來自Silicycle之Si-胺清除樹脂(2.0 g，目錄號R52030B)。在室溫下攪動溶液1小時，過濾以移除樹脂，且濃縮成淡黃色固體：806 mg，97.0%。
利用N,N-二甲基甲醯胺之尺寸排阻層析法顯示單窄峰。1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例58：S005
步驟1
在圓底燒瓶中，在溫和加熱下將三十五烷-18-酮(750 mg，1.48 mmol)溶解於四氫呋喃(40 mL)中。在含有酮之溶液冷卻至室溫後，逐滴添加氫化鋁鋰於乙醚中之4 M溶液(0.74 mL，2.96 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。添加固體硫酸鈉十水合物，且攪拌漿料20分鐘以淬滅過量氫化鋁鋰。濾出固體，且濾液用庚烷稀釋且用1 M HCl洗滌。有機相用硫酸鈉乾燥且濃縮成白色固體。粗產物之純度足以不經進一步純化即用於下一步驟：650 mg，86.0%。
步驟2
在室溫下向前一步驟之產物(醇)(200 mg，0.393 mmol)及吡啶(78 mg，0.98 mmol)於二氯甲烷(10 mL)中之溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(99 mg，0.49 mmol)。在35℃下加熱反應混合物4小時。接著用庚烷稀釋反應混合物，相繼用1 M HCl及飽和碳酸氫鈉萃取。有機相用硫酸鈉乾燥，濃縮且藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷：乙酸乙酯梯度純化。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：200 mg，76%。
步驟3
將前一步驟之產物(碳酸4-硝基苯酯)(260 mg，0.386 mmol)溶解於甲苯(4 mL)中，之後添加PEG2k(620 mg，0.310 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)、N,N-二甲胺基吡啶(40 mg，0.33 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(200 μl，1.15 mmol)。在室溫下攪拌溶液隔夜。將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。為移除4-硝基苯酚雜質，將粗產物溶解於1:1二氯甲烷：甲醇中且經由10 g Bond Elut NH2管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成淡黃色固體：631 mg，78.0%。
利用N,N-二甲基甲醯胺之尺寸排阻層析法顯示單窄峰。1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例59：S007
步驟1
向圓底燒瓶中添加金屬鎂(0.201 g，8.27 mmol)及催化量之碘，之後添加四氫呋喃(30 mL)及1-溴十四烷(2.17 g，7.82 mmol)。回流混合物2小時，且接著冷卻至室溫。添加十八醛(0.600 g，2.24 mmol)於四氫呋喃(5 mL)中之溶液，且在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。反應混合物用乙酸乙酯稀釋，用1 M HCl洗滌，用硫酸鈉乾燥且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷/乙酸乙酯梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：310 mg，29.7%。
步驟2
將前一步驟之產物(醇)(310 mg，0.664 mmol)溶解於二氯甲烷(15 mL)中。接著添加吡啶(0.134 mL，1.66 mmol)，之後添加氯甲酸4-硝基苯酯(167 mg，0.830 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。反應物用乙酸乙酯稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，用硫酸鈉乾燥且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷/乙酸乙酯梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：315 mg，75.0%。
步驟3
在室溫下向前一步驟之產物(碳酸4-硝基苯酯)(315 mg，0.498 mmol)於甲苯(10 mL)中之溶液中添加N,N-二甲胺基吡啶(48.7 mg，0.399 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.174 ml，0.997 mmol)，之後添加PEG-NH2(798 mg，0.399 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)。在室溫下攪拌黃色溶液隔夜。將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：540 mg，54.3%。
1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
實例60：S008
步驟1
在氮氣下向乾燥圓底燒瓶中添加1-碘十六烷(0.705 g，2.00 mmol)及乙醚(15 mL)。冷卻溶液至-78℃(溶液變為白色漿料)且逐滴添加第三丁鋰於庚烷中之1.7 M溶液(2.59 mL，4.40 mmol)。攪拌20分鐘後，使反應混合物升溫至室溫且再攪拌2小時。向反應混合物中逐滴添加十八醛(0.268 g，1.00 mmol)於乙醚(3 mL)中之溶液(放熱)。反應物用冰冷1 M HCl淬滅，用二氯甲烷萃取，用硫酸鈉乾燥且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷/二氯甲烷梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：150 mg，30.3%。
步驟2
將前一步驟之產物(醇)(200 mg，0.404 mmol)溶解於二氯甲烷(6 mL)中。接著添加吡啶(0.082 mL，1.01 mmol)，之後添加氯甲酸4-硝基苯酯(102 mg，0.505 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。反應物用乙酸乙酯稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，用硫酸鈉乾燥且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用庚烷/乙酸乙酯梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：220 mg，82.0%。
步驟3
在室溫下向前一步驟之產物(碳酸4-硝基苯酯)(230 mg，0.348 mmol)於甲苯(6 mL)中之溶液中添加N,N-二甲胺基吡啶(42.6 mg，0.348 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.152 ml，0.871 mmol)，之後添加PEG-NH2(697 mg，0.348 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)。在室溫下攪拌黃色溶液隔夜。將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮：600 mg，68.3%。
1H NMR光譜中觀測到之峰及積分值與預期產物一致。
S009可以與針對S008所述類似之方式製備。
實例61：S010及S011
S010及S011可例如分別如PCT公開案WO 2009086558化合物IVa及化合物Ivc中所提供來製備。該等化合物可如WO 2009086558之實例19中所提供來合成。
實例62：S01 2
S012可以與針對S001所述類似之方式，利用PEG-NH2(「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)替代聚(乙二醇)甲醚來製備。
實例63：S006及S013至S024
S006、S013、S014、S015、S016、S017、S018、S019、S020、S021、S022、S023及S024可以與針對S004所述類似之方式來製備。
實例64：S025
步驟1
將合成本文所述化合物S004之步驟2之產物(碳酸4-硝基苯酯)(285 mg，0.414 mmol)懸浮於N,N-二甲基甲醯胺(5 mL)中，之後添加D-麩胺酸二甲酯(145 mg，0.828 mmol)、N,N-二異丙基乙胺(0.145 ml，0.828 mmol)及N,N-二甲胺基吡啶(101 mg，0.828 mmol)。在60℃下加熱溶液隔夜。將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用乙酸乙酯/庚烷梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：131 mg，44%。
步驟2
將前一步驟之產物(二甲酯)(0.160 g，0.221 mmol)溶解於四氫呋喃(5 mL)中，且添加LiOH(52.9 mg，2.21 mmol)於水(5 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應物72小時。溶液用氯仿稀釋且用1 N HCl(水溶液)且接著用鹽水洗滌。有機相用硫酸鈉乾燥且過濾。濾液濃縮成白色固體：130 mg，85%。
步驟3
在室溫下將前一步驟之產物(二酸)(130 mg，0.187 mmol)懸浮於二氯甲烷(9 mL)及庚烷(1.5 mL)中。向懸浮液中添加N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(107 mg，0.560 mmol)，之後添加羥基苯并三唑(86 mg，0.56 mmol)。30分鐘後，添加PEG-NH2(411 mg，0.411 mmol，Mn為約1000 g/mol，「mPEG-Amine，1k」，Creative PEGWorks)及N,N-二異丙基乙胺(65 μL，0.374 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。將反應混合物加載於10 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用50:50二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用50:50二氯甲烷：甲醇溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用二氯甲烷/甲醇梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：376 mg，57.8%。
實例65：S026
步驟1
將合成本文所述化合物S004之步驟1之產物(醇)(200 mg，0.382 mmol)、丁二酸酐(38 mg，0.38 mmol)及N,N-二甲胺基吡啶(12 mg，0.096 mmol)稱重至燒瓶中且懸浮於氯仿中(3.5 mL)。在70℃下攪拌反應混合物隔夜。將反應混合物加載於1 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用二氯甲烷二氯甲烷預平衡)上且用二氯甲烷溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮。進一步藉由二氧化矽急驟層析法用乙酸乙酯/庚烷梯度純化粗產物。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：134 mg，56%。
步驟2
將前一步驟之產物(羧酸)(75 mg，0.12 mmol)、N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(35 mg，0.18 mmol)及羥基苯并三唑(28 mg，0.18 mmol)溶解於無水氯仿(1 mL)中且在室溫下攪拌0.5小時。接著添加PEG-NH2(265 mg，0.132 mmol，Mn為約2000 g/mol，「Sunbright MEPA-20H」，NOF Corp.)及N,N-二異丙基乙胺(32 μl，0.18 mmol)且在室溫下攪拌溶液隔夜。將反應混合物加載於2 g Bond Elut SCX管柱(來自Varian；用二氯甲烷二氯甲烷：甲醇預平衡)上且用二氯甲烷溶離。含有產物之溶離份藉由TLC鑑別，合併且濃縮成白色固體：240 mg，76%。
此等隱形脂質之表徵資料如下表4及表5中。
實例66
結果之概述表
所合成之化合物呈示於下表中。為避免產生疑問，已以使取代基重疊之方式繪製一些取代基，但化合物之真實結構仍非常清晰。舉例而言，表示法
並不表示化學上不可能存在之3員含氫環，而是作為替代表示以下。
表6提供本發明之陽離子型脂質之結構。
對於除E0180外之各以上化合物，Y2為A類固醇環之3位經由氧原子連接至L之膽固醇(該羥基上之氫原子不存在)；X1及X2為O；a=亞甲基；b=亞甲基且c不存在；而對於E0180而言，a=伸乙基。
除以下表徵資料外，亦測定所有脂質之1H NMR以評估純度及合成中可能存在之任何烯烴異構化作用。特定言之，將通常位於0.68 ppm或接近0.68 ppm之膽固醇來源單峰之積分與5.2至5.5 ppm範圍中之烯烴來源信號相比較。將所需順式非共軛烯烴及膽固醇烯性氫之烯烴積分與對應於異構化產物之高於5.5 ppm之任何新信號相比較。在所有情況下，如藉由比較1H NMR中之積分信號所測定，異構化度小於10%。
實例67
以下提供各種脂質之NMR特徵。
E0008
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.25-5.48(m,5H),3.69-3.86(m,2H),3.55-3.69(m,7H),3.34-3.55(m,4H),3.07-3.25(m,1H),2.70-3.01(m,4H),2.30-2.53(m,3H),2.15-2.30(m,1H),1.78-2.14(m,11H),1.42-1.66(m,12H),0.97-1.42(m,34H),0.81-0.97(m,16H),0.68(s,3H) ppm。
E0006
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.25-5.47(m,5H),3.56-3.85(m,11H),3.48-3.56(m,1H),3.36-3.48(m,3H),3.11-3.27(m,1H),2.66-2.83(m,4H),2.41-2.49(m,2H),2.30-2.41(m,1H),2.15-2.28(m,1H),1.72-2.12(m,11H),0.96-1.70(m,60H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ140.9,130.2,130.1,128.0,127.9,121.6,79.5,72.0,71.7,71.6,70.9,69.4,67.3,60.2,60.1,59.7,56.8,56.1,50.2,42.3,39.8,39.5,39.0,37.2,36.8,36.2,35.8,31.9,31.9,31.5,29.7,29.5,29.5,29.3,29.3,29.0,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.2,25.6,24.3,23.8,22.8,22.7,22.6,22.6,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0003
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.22-5.46(m,7H),3.66-3.93(m,5H),3.54-3.66(m,6H),3.35-3.54(m,4H),3.07-3.23(m,1H),2.73-2.89(m,4H),2.39-2.73(m,4H),2.28-2.39(m,1H),2.28-2.39(m,1H),1.70-2.12(m,10H),1.20-1.65(m,24H),0.94-1.19(m,13H),0.77-0.94(m,14H),0.66(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ140.9,130.4,130.0,128.3,128.1,127.8,127.6,121.6,79.5,71.6,70.8,70.7,69.2,67.3,60.1,56.7,56.1,54.2,50.1,42.3,39.7,39.5,39.0,37.2,36.8,36.2,35.8,31.9,31.8,31.5,29.5,29.4,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,25.8,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,22.5,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0002
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.26-5.44(m,5H),3.68-3.84(m,3H),5.54-3.68(m,7H),3.32-3.54(m,6H),3.09-3.24(m,1H),2.68-2.80(m,2H),2.27-2.58(m,3H),2.12-2.27(m,1H),1.69-2.12(m,9H),1.41-1.69(m,20H),1.19-1.40(m,20H),0.95-1.19(m,11H),0.78-0.95(m,12H),0.66(s,3H) ppm。
E0001
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.10-7.24(m,3H),6.96-7.10(m,1H),5.21-5.48(m,5H),3.73-3.90(m,3H),3.37-3.72(m,11H),3.10-3.25(m,1H),2.72-2.86(m,2H),2.28-2.42(m,1H),2.14-2.28(m,1H),1.92-2.14(m,6H),1.78-1.92(m,4H),1.22-1.78(m,34H),0.95-1.22(m,13H),0.84-0.95(m,13H),0.68(s,3H) ppm。
E0004
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.24-5.44(m,5H),3.66-3.83(m,2H),3.54-3.65(m,7H),3.34-3.51(m,4H),3.11-3.23(m,1H),2.94-3.10(m,2H),2.56-2.87(m,6.5H),2.41-2.50(d,J=5.02 Hz,2H),2.29-2.40(m,2.5H),1.96-2.26(m,8H),1.62-1.96(m,8H),1.62-1.96(m,11H),1.40-1.61(m,11H),1.22-1.40(m,20H),0.81-1.21(m,26H),0.66(s,3H)ppm。
13C NMR(CDCl3,400 MHz)δ142.5,140.9,139.7,130.1,130.1,128.7,127.9,127.9,125.8,121.5,79.4,77.2,71.8,71.6,70.8,70.8,69.3,67.3,63.1,59.3,56.7,56.1,53.6,53.3,50.1,49.9,42.2,39.7,39.4,39.0,37.2,36.8,36.1,35.7,31.9,31.8,31.5,29.6,29.5,29.4,29.3,29.3,28.3,28.2,27.9,27.2,27.1,27.0,26.9,26.1,25.6,24.8,24.2,23.8,22.8,22.5,21.3,21.0,19.3,18.6,14.0,11.8 ppm。
E0005
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.28-5.44,(m,3H),3.69-3.82(m,2H),3.57-3.67(m,7H),3.48-3.64(m,1H),3.39-3.48(m,3H),3.33(s,3H),3.12-3.24(m,2H),2.70-2.86(m,4H),2.42-2.47(d,J=6.02 Hz,2H),2.33-2.42(m,3H),1.97-2.10(m,5H),1.76-1.97(m,7H),1.42-1.64(m,12H),1.23-1.42(m,20H),0.97-1.23(m,12H),0.81-0.97(m,13H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ140.9,130.2,130.1,127.9,127.9,121.5,79.5,77.5,72.5,72.1,70.9,70.8,69.3,67.3,63.1,59.3,56.7,56.1,55.5,52.0,51.7,50.1,42.3,39.8,39.5,39.0,37.2,36.8,36.2,35.8,31.9,31.9,31.5,31.0,29.7,29.5,29.5,29.3,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.1,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0007
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.26-5.44(m,5H),3.84-3.94(t,J=5.56 Hz,4H),3.68-3.87(m,2H),3.56-3.67(m,7H),3.47-3.54(m,1H),3.38-3.47(m,3H),3.11-3.23(m,1H),2.73-2.82(t,J=6.44 Hz,2H),2.42-2.57(m,5H),,2.32-2.41(m,1H),2.11-2.27(m,2H),1.97-2.10(m,6H),1.76-1.96(m,7H),1.66-1.75(m,2H),1.41-1.62(m,9H),1.22-1.41(m,20H),0.81-1.22(m,25H),0.67(s,3H) ppm。
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ141.0,130.1,130.1,127.9,127.9,121.5,96.2,79.5,77.6,72.2,71.6,70.9,70.8,69.4,67.3,63.1,59.3,59.1,56.8,56.1,50.5,50.2,42.3,39.8,39.5,39.1,37.2,36.8,36.2,35.7,32.8,31.9,31.9,31.5,29.7,29.5,29.4,29.3,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.1,25.6,25.6,24.3,23.8,22.8,22.5,21.0,19.3,18.7,14.0,11.8 ppm。
E0009
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.27-5.44(m,5H),4.07-4.22(m,2H),3.67-3.83(m,2H),3.55-3.67(m,6H),3.37-3.52(m,4H),3.12-3.25(m,1H),2.81-2.90(m,1H),2.73-2.81(t,J=6.53 Hz,2H),2.42-2.64(m,3H),2.15-2.41(m,4H),1.76-2.11(m,11H),1.64-1.72(m,4H),1.42-1.63(m,12H),1.21-1.41(m,22H),0.81-1.22(m,26H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ140.9,130.2,130.1,127.9,127.9,121.5,79.5,77.2,72.7,72.0,71.6,71.5,70.8,69.4,67.3,61.9,59.5,56.7,56.5,56.1,50.1,49.3,49.3,42.3,39.7,39.5,39.0,37.2,36.8,36.2,35.8,31.9,31.9,31.5,29.7,29.5,29.5,29.3,29.3,28.4,28.3,28.2,28.0,27.4,27.4,27.2,27.2,26.5,26.1,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,22.6,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0170
1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 5.26-5.45(m,5H),3.68-3.82(m,2H),3.56-3.68(m,7H),3.38-3.53 m,4H),3.11-3.24(m,1H),2.73-2.82(t,J=6.53 Hz,2H),2.56-2.69(m,4H),2.50-2.56(m,2H),2.32-2.41(m,1H),2.09-2.27(m,2H),1.77-2.09(m,13H),1.42-1.63(m,9H),1.21-1.42(m,20H),0.83-1.21(m,25H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3) δ 140.9,130.2,130.1,128.0,127.9,124.4,122.0,121.5,119.6,79.5,77.6,77.2,71.8,71.6,70.9,70.8,69.4,67.3,58.7,56.7,56.1,50.7,50.1,42.3,39.7,39.5,39.0,37.2,36.8,36.1,35.8,34.0,31.9,31.8,31.5,29.6,29.5,29.4,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.1,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,21.0,19.3,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0171
1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 5.27-5.46(m,5H),3.58-3.82(m,9H),3.38-3.54(m,4H),3.13-3.26(m,1H),2.74-2.82(m,2H),2.31-2.50(m,6H),2.16-2.2(m,1H),1.70-2.10(m,12H),1.24-1.65(m,33H),0.97-1.23(m,13H),0.82-0.97(m,19H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ141.0,130.2,130.1,127.9,127.9,121.5,79.5,77.2,73.2,72.5,72.3,71.6,70.9,70.8,69.3,67.3,66.0,61.9,60.9,60.2,56.7,56.1,50.7,50.1,42.3,39.8,39.5,39.0,38.7,37.2,36.8,36.2,35.8,31.9,31.9,31.5,29.7,29.5,29.5,29.3,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.1,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
E0010
1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ5.26-5.45(m,5H),3.53-3.84(m,9H),3.37-3.53(m,4H),3.13-3.24(m,1H),2.91-3.00(m,1H),2.74-2.86(m,2H),2.28-2.43(m,2H),2.10-2.28(m,2H),1.42-2.10(m,32H),0.82-1.41(m,50H),0.68(s,3H) ppm。
13C NMR(400 MHz,CDCl3)δ141.0,130.2,130.1,127.9,127.9,121.5,79.5,77.2,71.9,71.6,70.9,70.8,69.1,67.3,66.7,56.8,56.1,55.5,54.6,54.0,50.1,42.3,42.1,42.0,39.8,39.5,39.0,37.2,36.8,36.2,35.8,33.2,32.6,31.9,31.9,31.5,30.7,29.7,29.5,29.5,29.3,29.3,28.3,28.2,28.0,27.2,27.2,26.2,26.1,25.8,25.6,24.3,23.8,22.8,22.6,21.0,19.4,18.7,14.1,11.8 ppm。
化合物之其他表徵資料陳述於下表7中。
aE0050為非對映異構體之混合物，該等非對映異構體之兩種非對映異構組分在二氧化矽上具有不同Rf值。
所用方法如下，其中指示：
*1-Zorbax 300SB C3 150×4.6，1 mL/min，水：MeCN w/0.1% TFA，經15分鐘40%至100%，100%維持5分鐘，ELSD偵測。
*2-Zorbax RX-SIL 250×4.6，0.7 mL/min，己烷：EtOH 4：6，ELSD偵測。
*3-Zorbax NH2 250×4.6，1 mL/min，己烷：IPA，經10分鐘30%至60%，60%維持5分鐘，ELSD偵測器。
*4-Xbridge C8，150×4.6 mm，1 mL/min，水：MeCN w/0.1% TFA，經15分鐘30%至100%，100%維持5分鐘，ELSD偵測。
*5-Zorbax Eclipse XDB-C18 250×4.6，1 mL/min，水：MeCN w/0.1% TFA，50%維持5分鐘，接著經5分鐘50%至100%，接著在100%下維持12分鐘，ELSD偵測器。
*6-Zorbax Eclipse XDB-C18 250×4.6，1 mL/min，水：MeOH w/0.1% TFA，50%維持5分鐘，接著經5分鐘50%至100%，接著在100%下維持5分鐘，ELSD偵測器。
*7-Zorbax Eclipse XDB-C18 250×4.6，1 mL/min，水：MeOH w/0.1% TFA，經2分鐘50%至70%，經3分鐘70%至100%，接著在100%下維持5分鐘，ELSD偵測器。
*8-Acquity BEH Shield RP 18 50×2.1，0.5 mL/min，65℃，水：IPA w/0.0125% TFA，經1.5分鐘30%至50%，經10.5分鐘50%至75%，經0.6分鐘75%至90%，接著在90%下維持0.4分鐘，CAD偵測器。
實例68
製備組合物
本發明化合物較佳以脂質奈米粒子形式投與。因此，本發明組合物較佳包含脂質奈米粒子，其包含本發明化合物及視情況選用之一或多種其他脂質組分。
為達成尺寸減小及/或增強粒子尺寸之均質性，熟習此項技術者可使用下文所述之方法步驟，用不同組合進行實驗。另外，熟習此項技術者可利用音波處理、過濾或用於脂質體調配之其他尺寸化技術。
本發明組合物之製造方法通常包含在第一儲集器中提供包含生物活性劑之水溶液，提供包含脂質之有機溶液之第二儲集器，及接著使該水溶液與有機脂質溶液混合。第一儲集器視情況與第二儲集器流體連通。混合步驟之後視情況為培育步驟、過濾步驟及稀釋及/或濃縮步驟。
在一實施例中，生物活性劑及/或脂質存在於適合緩衝液中。在一實施例中，生物活性劑存在於諸如檸檬酸鹽緩衝液之水性緩衝液中。在一實施例中，脂質存在於諸如乙醇之有機醇中。
在一實施例中，培育步驟包含在室溫下且視情況避光使來自混合步驟之溶液於容器中靜置約0至約100小時(較佳約0至約24小時)。
在一實施例中，稀釋步驟在培育步驟之後。稀釋步驟可包括例如使用抽汲裝置(例如蠕動泵)用水性緩衝液(例如檸檬酸鹽緩衝液)進行稀釋。
在一實施例中，過濾步驟為超濾。在一實施例中，超濾包含濃縮稀溶液，隨後例如聯合適合超濾膜(例如GE中空纖維濾筒或等效物)使用適合抽汲系統(例如抽汲裝置，諸如蠕動泵或其等效物)進行透濾。
該方法應使得形成脂質奈米粒子。在一實施例中，脂質奈米粒子包含生物活性劑。
在一實施例中，混合步驟提供清澈單一相。
在一實施例中，在混合步驟後，移除有機溶劑得到粒子懸浮液，其中生物活性劑由脂質囊封，例如囊封於脂質雙層中。
有機溶劑之選擇通常涉及考慮溶劑極性及在粒子形成後期可移除溶劑之容易程度。
較佳亦用作增溶劑之有機溶劑之量足以提供生物活性劑與脂質之清澈單一相混合物。
有機溶劑可選自以下一或多種(例如兩種)：氯仿、二氯甲烷、乙醚、環己烷、環戊烷、苯、甲苯、甲醇及其他脂族醇(例如C1至C8)，諸如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇，第三丁醇、異丁醇、戊醇及己醇。
混合步驟可藉由許多方法進行。例如藉由機械方法。諸如渦旋混合器。
用於移除有機溶劑之方法通常涉及透濾或在減壓下蒸發或使惰性氣流(例如氮氣或氬氣)吹過混合物。
在其他實施例中，該方法進一步包含添加適用於使用本發明組合物實現細胞轉型之非脂質聚陽離子。適合非脂質聚陽離子之實例包括(但不限於)溴化己二甲胺(hexadimethrine bromide)(以商標銷售，來自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.,USA)或己二甲胺(hexadimethrine)之其他鹽。其他適合聚陽離子包括例如聚-L-鳥胺酸、聚-L-精胺酸、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、聚烯丙胺及聚伸乙亞胺之鹽。
在某些實施例中，脂質奈米粒子之形成可在單相系統(例如Bligh及Dyer單相或水溶液與有機溶劑之類似混合物)或在適合混合下在兩相系統中進行。
脂質奈米粒子可在單相或雙相系統中形成。在單相系統中，將陽離子型脂質及生物活性劑各自溶解於一定體積之單相混合物中。組合兩種溶液提供單一混合物，複合物在該混合物中形成。在雙相系統中，陽離子型脂質結合於生物活性劑(其以水相形式存在)，且將其「拉」進有機相中。
在一實施例中，脂質奈米粒子藉由包含以下之方法來製備：(a)使生物活性劑與包含非陽離子型脂質及清潔劑之溶液接觸以形成化合物-脂質混合物；(b)使陽離子型脂質與化合物-脂質混合物接觸以中和生物活性劑之一部分負電荷且形成生物活性劑與脂質之電荷中性混合物；及(c)自電荷中性混合物移除清潔劑。
在一組實施例中，中性脂質及清潔劑之溶液為水溶液。使生物活性劑與中性脂質及清潔劑之溶液接觸通常藉由將生物活性劑之第一溶液與脂質及清潔劑之第二溶液混合到一起來完成。生物活性劑溶液亦較佳為清潔劑溶液。本發明方法中所用之中性脂質之量通常基於所用陽離子型脂質之量來確定，且通常為陽離子型脂質之量的約0.2至5倍，較佳為所用陽離子型脂質之量的約0.5至約2倍。
使由此形成之生物活性劑-脂質混合物與陽離子型脂質接觸以中和與本發明所關注之分子(或其他聚陰離子物質)相關之一部分負電荷。所用陽離子型脂質之量通常為足以中和生物活性劑之至少50%負電荷之量。負電荷較佳將中和至少70%，更佳中和至少90%。
用以移除清潔劑之方法通常涉及透析。若存在有機溶劑，則移除通常藉由透濾或在減壓下蒸發或使惰性氣流(例如氮氣或氬氣)吹過混合物來完成。
本文揭示用於製造本發明組合物之裝置。該裝置通常包括用於容納包含生物活性劑之水溶液的第一儲集器及用於容納有機脂質溶液之第二儲集器。該裝置通常亦包括經組態以按實質上相等之流速將水溶液及有機脂質溶液抽汲至混合區或混合室中之抽汲機構。在一實施例中，混合區或混合室包含T型耦接或其等效物，其允許水流及有機流體流在輸入至T型連接器中時組合且所得組合之水溶液及有機溶液自T型連接器流出至收集儲集器或其等效物中。
實例69
製造組合物之實例方法
藉由衝擊噴射方法混合相等體積之溶解於醇中之脂質與溶解於檸檬酸鹽緩衝液中之siRNA來形成脂質奈米粒子(LNP)。脂質溶液含有醇中濃度為8至16 mg/mL之本發明之陽離子型脂質化合物或比較脂質、輔助脂質(膽固醇)、視情況選用之中性脂質(DSPC)及PEG(PEG)脂質，目標為12 mg/mL。本發明調配物中各脂質組分之相對莫耳比報導於表8至表11中。在LNP調配物含有四種脂質組分之情況下，莫耳比對應於在表之前四欄中出現之脂質類型，按其出現之次序。在LNP調配物含有三種脂質組分之情況下，無中性脂質。
對於陽離子型脂質而言，脂質之比率在20至70莫耳百分比範圍內，目標為40至60，輔助脂質之莫耳百分比在20至70之範圍內，目標為30至50，中性脂質之莫耳百分比在0至30之範圍內，PEG脂質之莫耳百分比在1至之範圍內，目標為2至5。siRNA溶液之濃度在檸檬酸鈉：氯化鈉緩衝液(pH 4)中0.7至1.0 mg/mL之範圍內，目標為0.8至0.9 mg/mL。藉由衝擊噴射方法混合相等量之脂質乙醇溶液與溶解於檸檬酸鹽緩衝液中之siRNA以10至120 mL/min之總流速穿過ID在0.25至2.0 mm範圍內之管形材料來形成LNP。在稀釋步驟之前，使混合之LNP溶液在室溫下靜置0至48小時。接著濃縮溶液且藉由超濾方法使用MW截斷為30至100 KD之薄膜用適合緩衝液透濾。將最終產物無菌過濾且儲存於4℃下。
實例70： 小鼠模型中之活體內轉染
雌性CD-1小鼠來自Charles River Labs且以無限制標準實驗室食物及水供養。給藥時動物稱重為約25公克。以單次給藥經由側尾靜脈靜脈內投與根據個別動物體重以(每公斤所用siRNA的毫克數)計算之各種劑量濃度(10 ml/kg注射體積)的經調配siRNA。
如下文實例中所提供，經調配siRNA由對目標mRNA序列具特異性之雙股siRNA序列構成，且呈含有陽離子型脂質、隱形脂質及中性脂質之脂質核苷酸粒子(LNP)形式。用於靶向肝臟之siRNA構築體對因子VII具特異性。用於靶向腫瘤之siRNA構築體對PLK1-424具特異性，如由Judge等人所公開，參見J Clin Invest. 2009 Mar;119(3):661-73；doi: 10.1172/JCI37515。
1. FVII siRNA雙鏈體序列
5' UUu AAU UGA AAC cAA GAc Auu 3'(SEQ ID NO:1)
5' uGu cuu GGu uuc AAu uAA Auu 3'(SEQ ID NO:2)
2. PLK1-424 siRNA雙鏈體序列
5' UAU UUA AgG AGG GUG AuC Uuu 3'(SEQ ID NO:3)
5' AGA Uca cCC Ucc uuA AAU auu 3'(SEQ ID NO:4)
此等序列中使用以下縮寫：
A=腺苷
U=尿苷
G=鳥苷
C=胞苷
a=2'-O-甲基-腺苷
u=2'-O-甲基-尿苷
g=2'-O-甲基-鳥苷
c=2'-O-甲基-胞苷
實例71： 因子VII活性檢定
以單次給藥經由側尾靜脈靜脈內投與根據個別動物體重以每公斤所用siRNA的毫克數計算之各種劑量濃度(10 ml/kg注射體積)的經調配因子VII siRNA。注射後約48小時，藉由吸入CO2使小鼠安樂死，之後經由腔靜脈放血。將血液收集於含有0.105 M檸檬酸鈉抗凝血劑之管中以進行血漿因子VII活性分析。在一些情況下，收集小塊(約50 mg)肝臟且於液氮中速凍用於隨後之mRNA定量。
使用來自Hyphen Biomedical之Biophen FVII套組(目錄號221304)檢定自經注射小鼠收集之血漿的因子VII活性。使用來自媒劑對照動物之所彙集血漿等分試樣製備檢定標準曲線。將所有樣品稀釋至標準曲線之線性範圍內且報導相對因子VII活性。
在一些情況下，使用Qiagen's RNeasy分離套組(目錄號74106)根據製造商之方案製備總肝臟RNA。因子VII mRNA藉由定量PCR分析且相對於GAPDH校正。mRNA偵測使用Applied Biosystems因子VII基因表現檢定Mm00487333_m1及小鼠GAPDH內源性對照物(目錄號4352339E)。
FVII檢定之結果陳述於下表8中。
1其中空白單元格指示不存在中性脂質。
2其中AVANTI表示AVANTI 880150P。
3其中GM-020表示GM-020 NOF。
4其中脂質類型在莫耳比中出現時脂質類型之次序對應於該等脂質在表之前四欄出現之次序。在莫耳比中僅列舉三種脂質之情況下，中性脂質不存在。
實例72： Hep3B腫瘤研究
在雌性裸小鼠中藉由將含7×106個細胞之100 μl PBS皮下注射至左側腹部建立Hep3B腫瘤。在接種後10至14天當腫瘤達到100 mm3之平均尺寸時將小鼠隨機化成處理組。經由側尾靜脈靜脈內投與根據個別動物體重以每公斤所用siRNA的毫克數計算之各種劑量濃度(10 ml/kg注射體積)的siRNA調配之LNP調配物。在各種時間點藉由吸入CO2使小鼠安樂死，且收集腫瘤以進行mRNA定量。在LNP調配物中使用具有多種pKa(5.3至6.6)之脂質。使用數位測徑規在兩個維度(寬度×長度)上量測腫瘤以評估腫瘤生長。使用方程[a×b×b/2]計算腫瘤體積，其中a等於最大直徑且b等於最小直徑。
實例73：HepG2肝臟腫瘤研究
在雌性裸小鼠中藉由將含5×106個細胞之100 μl PBS皮下注射至左側腹部建立HepG2腫瘤。在接種後10至14天當腫瘤達到150 mm3之平均尺寸將小鼠隨機化成處理組。經由側尾靜脈靜脈內投與根據個別動物體重以每公斤所用siRNA的毫克數計算之3×3 mg/kg劑量濃度(10 ml/kg注射體積)的siRNA調配之LNP調配物。在各種時間點藉由吸入CO2使小鼠安樂死，且在最後給藥之後24小時收集腫瘤以進行mRNA定量。在LNP調配物中使用具有多種pKa(5.3至6.6)之脂質。使用數位測徑規在兩個維度(寬度x長度)上量測腫瘤以評估腫瘤生長。使用方程[a×b×b/2]計算腫瘤體積，其中a=最大直徑且b=最小直徑。
實例74：786-0腎腫瘤研究
如之前所述藉由皮下注射含10×106個細胞之200 μl PBS建立786-0腫瘤。植入後4週，將腫瘤尺寸在200至250 mm3範圍內之小鼠隨機化成處理組。接著靜脈內投與5或10 mg/kg劑量濃度之siRNA調配之LNP。單次給藥後48小時，收集腫瘤用於進行mRNA定量。
實例75：量測腫瘤組織中之PLK-1及GAPDH mRNA KD
在組織溶解緩衝液中用Qiagen均質機使約30至50 mg腫瘤組織均質化，隨後離心以使溶胞物澄清。使用RNeasy分離套組(目錄號74106)根據製造商之方案分離總RNA。PLK-1 mRNA藉由定量PCR分析且相對於人類GAPDH校正。mRNA偵測使用Applied Biosystems人類PLK-1基因表現檢定Hs00983229_m1及人類GAPDH內源性對照物(目錄號4326317E)。
實例72、73、74及75之腫瘤實驗中PLK1 mRNA含量之敲除(「KD」)結果陳述於下表中且計算為抑制百分比(PLK1抑制%)。表9中報導靶向Hep3B肝臟腫瘤之結果。表10中報導靶向HepG2肝臟腫瘤之結果。表11中報導靶向786-0腎腫瘤之結果。所有表中之pKa係指陽離子型脂質之pKa。在指示多次劑量(例如3×5)之情況下，第一個編號指示所給劑量數且第二個數字指示每劑量中所用之量，以每公斤小鼠所用之siRNA(生物活性劑)毫克數表示。一般而言，以24小時時間間隔投與多次劑量，且在最後給藥之後24小時收集組織用於進行mRNA定量。
1空白單元格指示省略中性脂質。
2其中脂質類型在莫耳比中出現時脂質類型之次序對應於該等脂質在表之前四欄出現之次序。在莫耳比中僅列舉三種脂質之情況下，中性脂質不存在。
3其中「間苯二酚」表示5-十七烷基苯-1,3-二醇。
1空白單元格指示省略中性脂質。
2其中脂質類型在莫耳比中出現時脂質類型之次序對應於該等脂質在表之前四欄出現之次序。在莫耳比中僅列舉三種脂質之情況下，中性脂質不存在。
1空白單元格指示省略中性脂質。
2其中脂質類型在莫耳比中出現時脂質類型之次序對應於該等脂質在表之前四欄出現之次序。在莫耳比中僅列舉三種脂質之情況下，中性脂質不存在。
在上表中，N/P比率等於以下：(最初調配之陽離子型脂質之莫耳數)/(最初調配之siRNA之莫耳數×每siRNA中陰離子型電荷之總數)。
實例76：脂質調配物之最佳化
認為利用例如如上表中所示之陽離子型脂質及隱形脂質對調配物進行進一步最佳化在熟練從業者之知識範圍內且無需不當實驗即可進行。舉例而言，可將調配物之至少一個參數最佳化，包括(但不限於)個別選擇例如對於所靶向細胞類型或器官最佳之陽離子型脂質之pKa；所用陽離子型脂質；所用隱形脂質；輔助脂質；所用中性脂質；中性脂質存在抑或不存在；所選輔助脂質、視情況選用之中性脂質、隱形脂質及陽離子型脂質之比率；N/P比率；粒度；給藥方案；所給劑量；調配方法；及其類似因素。
在一實施例中，當選擇更佳中性脂質時，熟練從業者更通常將選擇DSPC而非DOPC。在一些實施例中，例如對於表9中之E0177及表10中之E0104，僅此等兩種中性脂質之選擇不同之組合物中，使用DSPC時相比於使用DOPC時KD較低或KD甚至為零，所有其他態樣均認為相同。在某些組合物中，完全省略中性脂質，例如對於表9中之E0085之至少一種調配物而言，會產生與存在中性脂質相比較高之PLK1抑制百分比，或對於E0011而言當調配物中DSPC之量逐漸降低時會引起敲除百分比逐漸增加。
亦可對劑量(mg/kg)及給藥方案進行最佳化，例如所給劑量數及該等劑量之時序。舉例而言，在表9中所示之一實驗中，投與0.1 mg/kg具有E0178之調配物產生零(0)%KD，但投與1.0 mg/kg產生35%之KD。若個體不耐受較大劑量，則可如表9中經若干天以多個較小劑量投與全部治療方案，其中用含有E0011及S004之調配物傳遞1×10 mg/kg siRNA及3×5 mg/kg siRNA分別產生70%之KD及67%之KD。
實例77：用於傳遞核酸複製子之脂質體
如下文所述用脂質體傳遞各長約10,000個核苷酸之各種核酸複製子。將核酸囊封於基本上藉由Jeffs等人，(2005)Pharmaceutical Research 22(3):362-372及Maurer等人，(2001) Biophysical Journal,80: 2310-2326之方法製成之脂質體中。
參考脂質體由10% DSPC(兩性離子脂質，亦即中性脂質)、40% DlinDMA(陽離子型脂質)、48%膽固醇(輔助脂質)及2% PEG結合之DMG(隱形脂質)製成。使用Heyes等人，(2005) J Controlled Release 107:276-87之程序合成DlinDMA脂質(1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷)。DSPC(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)係購自Genzyme。膽固醇係獲自Sigma-Aldrich。PEG-結合之DMG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、DOTAP(氯化1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷鹽)及DC-chol(3β-[N-(N',N'二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇鹽酸鹽)可自Avanti Polar Lipids獲得。
簡言之，將脂質溶解於乙醇(2 ml)中，將複製子溶解於緩衝液(2 ml，100 mM檸檬酸鈉，pH 6)中且使此等物質與2 ml緩衝液混合，之後平衡1小時。用6 ml緩衝液稀釋混合物，接著過濾。所得產物含有脂質體，囊封效率為約95%。
用市售套組測定囊封核酸之百分比及核酸濃度。用1X TE緩衝液(來自套組)稀釋脂質體10×或100×，隨後添加染料。另外，用含有0.5% Triton X之1X TE緩衝液稀釋脂質體10×或100×，隨後添加染料(以破壞脂質體且因此檢定總核酸)。此後，將等量染料添加至各溶液中，且接著在添加染料之後將約180 μL各溶液一式兩份加載至96孔板中。利用微板讀取器讀取螢光(Ex 485 nm，Em 528 nm)。
為評估核酸之活體內表現，複製子中編碼報導體酶(SEAP；分泌性鹼性磷酸酶)。使用化學發光鹼性磷酸受質在用1X Phospha-Light稀釋緩衝液以1:4稀釋之血清中量測表現量。在第0天對8至10週齡BALB/c小鼠(5隻/組)肌肉內注射0.1 μg或1 μg核酸劑量，每條腿注射50 μl。亦在無脂質體(於PBS中)下投與1 μg相同載體。
在1 μg劑量下，囊封會使SEAP含量增加約 log，且在第6天0.1 μg囊封劑量之表現與1 μg未囊封劑量下所見之表現量相似。因此，相對於裸核酸對照物，將核酸調配於脂質體中時表現增加，甚至在1/10劑量下仍有增加。
其他SEAP實驗顯示明顯活體內劑量反應，其中在傳遞少至1 ng核酸後仍可見到表現。比較囊封及裸複製子之表現的實驗指示0.01 μg囊封核酸等同於1 μg裸核酸。在0.5 μg劑量之核酸下，囊封物質在第6天可得到高達12倍之表現；在0.1 μg劑量下在第6天表現量可高達24倍。
作為使用參考脂質(DlinDNRA)之替代，使用本發明之陽離子型脂質。使用DlinDNRA(參見上文)作為陽離子型脂質形成參考脂質體。如下文所述且如表中所示，DlinDNRA連續經各種陽離子型脂質置換。使用2% PEG2000-DNRG與(01)40%陽離子型脂質、10% DSPC及48%膽固醇或(02)60%陽離子型脂質及38%膽固醇形成兩種不同類型之各脂質體。因此，(01)與(02)脂質體之比較顯示中性兩性離子脂質之影響。
利用上文所述之SEAP報導體測試此等脂質體。下表12顯示脂質體之尺寸(Z平均值及多分散性指數)、各脂質體中核酸囊封之百分比以及注射後第1天及第6天偵測到之SEAP活性。SEAP活性與由DlinDMA、膽固醇及PEG-DMG製成之「DlinDMA(02)」脂質體相關。
本發明之其他態樣
本發明包含含有至少一種陽離子型脂質、至少一種輔助脂質及至少一種隱形脂質之用於傳遞生物活性劑的組合物，其中該生物活性劑係用於傳遞至選自以下之組織或細胞：(a)肝臟或肝細胞，其中該組合物具有pKa為約6.2或6.2以上之陽離子型脂質；及(b)腫瘤或腫瘤細胞，其中該組合物具有pKa為約6.2或6.2以下之陽離子型脂質。
本發明包含含有至少一種陽離子型脂質、至少一種輔助脂質及至少一種隱形脂質之用於傳遞生物活性劑的組合物，其中該生物活性劑係用於傳遞至選自以下之組織或細胞：(a)肝臟或肝細胞，其中該組合物具有pKa為約5.1至約7.4之陽離子型脂質；及(b)腫瘤或腫瘤細胞，其中該組合物具有pKa為約5.0至約6.7之陽離子型脂質。
本發明包含段落[00706]或[00707]之組合物，其中該組合物進一步包含視情況選用之中性脂質。
本發明包含段落[00706]、[00707]或[00708]中任一者之組合物，其中生物活性劑之對於疾病或病症之治療性治療有效。
本發明包含段落[00709]之組合物，其中該生物活性劑係用於傳遞至肝臟或肝細胞且陽離子型脂質1之pKa為至少約5.1至約7.4。
本發明包含段落[00709]之組合物，其中該生物活性劑係用於傳遞至腫瘤或腫瘤細胞且段落1之化合物之pKa為約5.0至約6.7。
本發明包含段落[00711]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.2至約6.3。
本發明包含段落[00711]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.4至約6.2。
本發明包含段落[00711]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.8至約6.1。
本發明包含段落[00711]至段落[00714]中任一或多者之組合物，其中藉由選擇以下至少一者使該組合物最佳化：隱形脂質、調配方法、N/P比率、粒度及陽離子型脂質、視情況選用之中性脂質、輔助脂質、隱形脂質及視情況選用之基於烷基間苯二酚之脂質的莫耳比。
本發明包含段落[00709]之組合物，其中生物活性劑係用於傳遞至肝臟或肝細胞，該組合物包含含有至少一種pKa為約5.1至約7.4之陽離子型脂質的調配物。
本發明包含段落[00716]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.3至約7.3。
本發明包含段落[00716]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.9至約7.0。
本發明包含段落[00716]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約6.2至約6.8。
本發明包含段落[00716]至段落[00719]中任一或多者之組合物，其中藉由選擇以下至少一者使該組合物最佳化：隱形脂質、調配方法、N/P比率、粒度及陽離子型脂質、視情況選用之中性脂質、輔助脂質、隱形脂質及視情況選用之基於烷基間苯二酚之脂質的莫耳比。
本發明包含段落[00715]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.4至約5.9以供傳遞至Hep3B樣腫瘤。
本發明包含段落[00715]之組合物，其中陽離子型脂質之pKa為約5.6至約6.1以供傳遞至HepG2樣腫瘤及786-0樣腫瘤。
本發明包含治療疾病或病狀之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之段落[00706]至[007222]中任一者之組合物的步驟。
本發明包含段落[00723]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤、肝臟疾病或可對用RNAi構築體治療起反應之疾病。
本發明包含段落[00723]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約5.0至約6.7。
本發明包含段落[00723]之方法，其中疾病或病狀位於肝臟中，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約5.1至約7.4。
本發明包含式(I)化合物：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；b不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；c不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L不存在或為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其中a係選自視情況經取代之C1-2伸烷基及視情況經取代之C1伸烷基。
本發明包含段落[00727]或[00728]之化合物，其中b係選自視情況經取代之C0-2伸烷基及視情況經取代之C1伸烷基。
本發明包含段落[00727]至段落[00729]中任一者之化合物，其中c不存在或為視情況經取代之C1伸烷基。
本發明包含段落[00727]至段落[00730]中任一者之化合物，其中a、b及c未經取代。
本發明包含段落[00727]至段落[00731]中任一者之化合物，其中R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基或C3-20雜環炔基。
本發明包含段落[00727]至段落[00732]中任一者之化合物，其中R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成選自視情況經取代之環狀C5-16基團及視情況經取代之環狀C5-12基團的化合物。
本發明包含段落[00733]之化合物，其中R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之環狀C5基團、C6基團或C7基團。
本發明包含段落[00727]至[00734]中任一者之化合物，其中R1及R2連同其所連接之氮原子一起選自頭基H1至H52中之至少一者。
本發明包含段落[00727]至段落[00735]中任一者之化合物，其中X1為O。
本發明包含段落[00727]至段落[00736]中任一者之化合物，其中X2為O。
本發明包含段落[00727]至段落[00737]中任一者之化合物，其中L包含至少一個雜原子。
本發明包含段落[00738]之化合物，其中L包含至少一個O原子。
本發明包含段落[00727]至段落[00739]中任一者之化合物，其中Lc係選自式Lc-i至式Lc-xxxxiii中之一者：
本發明包含段落[00727]至段落[00740]中任一者之化合物，其中d為0；e為0，且f為1。
本發明包含段落[00727]至段落[00741]中任一者之化合物，其中Y1為C12-28基團。
本發明包含段落[00727]至段落[00742]中任一者之化合物，其中Y1具有至少一個烯烴基團。
本發明包含段落[00743]之化合物，其中Y1具有至少一個順式不飽和烯烴基團。
本發明包含段落[00727]至段落[00741]中任一者之化合物，其中Y1係選自Y1-i至Y1-vii。
本發明包含段落[00727]至段落[00745]中任一者之化合物，其中Y2經由視情況經取代之類固醇上之氧原子連接至L。
本發明包含段落[00746]之化合物，其中Y2為A類固醇環之3位之羥基的氫原子已移除之固醇。
本發明包含段落[00746]之化合物，其中該固醇係選自由以下組成之群：安那固醇；燕麥固醇；β-植固醇；菜籽固醇；鈣化醇；油菜籽固醇；口角固醇；穿貝海綿固醇；膽固烷醇；膽固醇；腎固醇；環阿屯醇；去氫膽固醇；鏈固醇；二氫鈣化醇；二氫膽固醇；二氫麥角固醇；甲藻固醇；表膽固醇；麥角固醇；海藻固醇；六氫感光固醇；六醇；羥基膽固醇；羊毛固醇；感光固醇；帕克醇；多孔固醇；大褐馬尾藻固醇；植固烷醇；植固醇；豆固烷醇；豆固醇；溫勃固醇；酵母固醇；固醇膽汁酸(包括選自膽酸；鵝去氧膽酸；甘膽酸；牛膽酸；去氧膽酸及石膽酸之一或多者)；及/或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物。
本發明包含段落[00748]之化合物，其中固醇為膽固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(II)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；b不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；c不存在或為視情況經取代之C1-4伸烷基；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(III)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(IV)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(V)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(VI)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(VII)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C16-22烯基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(VIII)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O；X2為O；Y1為視情況經取代之C16-22烯基；L為-Lc-，其中Lc為視情況經取代之C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；及Y2為A類固醇環之3位經由羥基連接之膽固醇，該羥基之氫原子不存在。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(IX)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇；且其中化合物之pKa為約5.1至約7.4。
本發明包含段落[00727]之化合物，其包含式(X)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中：R1及R2連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之C3-20雜環烷基、C3-20雜環烯基、C3-20雜環炔基或C5-20雜芳基；a為亞甲基；b為亞甲基；c不存在；X1為O或S；X2為O或S；Y1為視情況經取代之C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L為-(La)d-(Lb)e-(Lc)f-，其中La為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；Lb為視情況經取代之C6-14伸芳基或C5-13伸雜芳基；Lc為視情況經取代之C1-15伸烷基、C1-15伸烯基、C1-15伸炔基、C1-15伸雜烷基、C1-15伸雜烯基或C1-15伸雜炔基；d為0或1；e為0或1；及f為0或1；其限制條件為L包含一或多個雜原子，及Y2為視情況經取代之類固醇；且其中化合物之pKa為約5.0至約6.7。
本發明包含段落[00727]至段落[00758]中式I至式X中任一者之化合物，其中該化合物係選自E0001至E0171及E0175至E0180中之任一或多者。
本發明包含式(XI)之隱形脂質
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中Z為選自PEG及基於聚(噁唑啉)、聚(環氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]及聚(胺基酸)之聚合物之親水性頭基組分，其中該聚合物可為線性或分支聚合物，且其中該聚合物可視情況經取代；其中Z係由n個次單元聚合而成；n為Z之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，其中n針對不同聚合物類型經最佳化；L1為視情況經取代之C1-10伸烷基或C1-10伸雜烷基連接基團，包括0、1、2個或2個以上醚基(例如-O-)、酯基(例如-C(O)O-)、丁二酸酯基(例如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、胺基甲酸酯基(例如-OC(O)-NR'-)、碳酸酯基(例如-OC(O)O-)、酮基(例如-C-C(O)-C-)、羰基(例如-C(O)-)、脲基(例如-NRC(O)NR'-)、胺基(例如-NR'-)、醯胺基(例如-C(O)NR'-)、亞胺基(例如-C(NR')-)、硫醚基(例如-S-)、黃原酸酯基(例如-OC(S)S-)及磷酸二酯基(例如-OP(O)2O-)；其中任一者可經0、1或多個Z基團取代；其中R'係獨立地選自H、-NH-、-O-、-S-、磷酸酯基或視情況經取代之C1-10伸烷基；X1及X2係獨立地選自碳或選自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基之雜原子；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同，或其中A1及A2連同其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00760]之隱形脂質，其包含式(XII)：
或其鹽或醫藥學上可接受之衍生物，其中PEG為聚(乙二醇)次單元，其中PEG可為線性或分支聚合物；n為PEG之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，較佳為約23個單元、約45個單元或約68個單元；L1為視情況經取代之C1-10伸雜烷基連接基團，其含有一個、兩個或兩個以上醚基、酯基、丁二酸酯基、胺基甲酸酯基、碳酸酯基、酮基、羰基、脲基、胺基、醯胺基、亞胺基、硫醚基、黃原酸酯基及磷酸二酯基；其中任一者可經0、1或多個PEG基團取代；X1及X2係獨立地選自碳或氧；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同，或其中A1及A2連同其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之類固醇。
本發明包含段落[00760]及[00761]中任一者之化合物，其中該化合物係選自S001至S009及S012至S026中之任一或多者。
本發明包含段落[00727]至[00759]中任一者之化合物，其中該化合物之pKa為約5.1至約7.4，以供在用於將生物活性劑傳遞至肝臟或肝細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00727]至[00759]中任一者之化合物，其中該化合物之pKa為約6.2或6.2以上，以供在用於將生物活性劑傳遞至肝臟或肝細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00764]之化合物，其中該化合物之pKa為約5.9至約7.0，以供在用於將生物活性劑傳遞至肝臟或肝細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00727]至[00759]中任一者之化合物，其中該化合物之pKa為約5.0至約6.7，以供在用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00727]至[00759]中任一者之化合物，其中該化合物之pKa為約5.4至約6.2，以供在用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00727]至[00759]中任一者之化合物，其中該化合物之pKa為約6.2或6.2以下，以供用於將生物活性劑傳遞至腫瘤或腫瘤細胞之調配物中使用。
本發明包含段落[00727]至[00768]中任一者之化合物，其係在用於傳遞生物活性劑之調配物中使用以供治療。
本發明包含含有一或多種段落[00727]至[00769]中任一者之化合物的組合物，其係在用於傳遞生物活性劑之調配物中使用以供治療。
本發明包含段落[00770]之組合物，其除段落[00727]至[00769]中任一者之化合物外進一步包含至少一種其他脂質組分。
本發明包含段落[00706]至[00722]及段落[00771]中任一者之組合物，其包含含有一或多種脂質組分之脂質調配物，其中該脂質組分係選自由一或多種以下組成之群：陽離子型脂質、視情況選用之中性脂質、輔助脂質、隱形脂質及視情況選用之基於烷基間苯二酚之脂質。
本發明包含段落[00772]之組合物，其中隱形脂質係選自式XI或式XII之隱形脂質。
本發明包含段落[00772]之組合物，其中將組合物之至少一個參數最佳化，包括(但不限於)個別地選擇例如對於所靶向之細胞類型或器官最佳之陽離子型脂質之pKa；所用陽離子型脂質；所用隱形脂質；輔助脂質；所用中性脂質；中性脂質存在抑或不存在；所選輔助脂質、視情況選用之中性脂質、隱形脂質及陽離子型脂質之比率；N/P比率；粒度；給藥方案；所給劑量；調配方法；及其類似因素。
本發明包含段落[00706]至[00722]及段落[00770]至[00774]中任一者之組合物，其進一步包含生物活性劑。
本發明包含段落[00775]之組合物，其中該生物活性劑係選自由以下組成之群：抗體、膽固醇、激素、抗病毒藥、肽、多肽、蛋白質、核蛋白、化學治療劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷衍生物、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、2,5-A反義嵌合體、異位酶、適體、誘餌RNA分子及其類似物、及小核酸分子，諸如RNA干擾劑(RNAi)、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)。
本發明包含段落[00776]之組合物，其中該生物活性劑為核苷或核苷衍生物。
本發明包含段落[00777]之組合物，其中該生物活性劑係選自RNAi、siNA、RNAi抑制劑、miRNA、siRNA及shRNA。
本發明包含段落[00772]之組合物、其中陽離子型脂質係選自一或多種以下陽離子型脂質：E0007、E0008、E0011、E0014、E0015、E0016、E0017、E0018、E0019、E0022、E0024、E0025、E0026、E0032、E0034、E0040、E0042、E0043、E0045、E0048、E0049、E0051、E0052、E0053、E0054、E0055及E0118。
本發明包含段落[00772]之組合物、其中陽離子型脂質係選自陽離子型脂質E0008、E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077、E0085、E0088、E0095、E0104、E0178及E0179。
本發明包含段落[00772]之組合物、該組合物包含至少一種選自以下之陽離子型脂質：E0008、E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077、E0085、E0088、E0095、E0104、E0178及E0179。
本發明包含段落[00772]之組合物，該組合物包含至少一種選自以下之陽離子型脂質：E0011、E0025、E0026、E0075、E0076、E0077及E0088。
本發明包含段落[00772]之組合物，其中隱形脂質係選自以下隱形脂質：S001、S002、S003、S004、S005、S006、S007、S008、S009、S010、S011、S012、S013、S014、S015、S016、S017、S018、S019、S020、S021、S022、S023、S024、S025及S026。
本發明包含以上化合物、調配物及/或組合物中之任一或多者，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
本發明包含包含有以上化合物、調配物及組合物中之任一或多者及使用說明書之套組。
本發明包含治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包含以包含一或多種段落[00706]至[00722]及段落[00770]至[00783]中任一者之組合物的調配物投與治療有效量之生物活性劑的步驟。
本發明包含向細胞或組織傳遞生物活性劑之方法，該方法包含向細胞或組織投與段落[00706]至[00722]及段落[00770]至[00783]中任一者之組合物。
本發明包含段落[00787]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤、肝臟疾病或可對用RNAi構築體治療起反應之疾病。
本發明包含段落[00787]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約5.0至約6.7。
本發明包含段落[00787]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約6.2或6.2以下。
本發明包含段落[00787]之方法，其中疾病或病狀為腫瘤，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約5.0至約6.7。
本發明包含段落[00787]之方法，其中疾病或病狀位於肝臟中，且組合物中陽離子型脂質之pKa為約5.1至約7.4。
本發明包含段落[00786]至[00792]之方法，其中該生物活性劑係選自由以下組成之群：抗體、膽固醇、激素、抗病毒藥、肽、多肽、蛋白質、核蛋白、化學治療劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷衍生物、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、2,5-A反義嵌合體、異位酶、適體、誘餌RNA分子及其類似物、及小核酸分子，諸如RNA干擾劑(RNAi)、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)及短髮夾RNA(shRNA)。
本發明包含段落[00793]之方法，其中該生物活性劑為核苷或核苷衍生物。
本發明包含段落[00794]之方法、其中該生物活性劑係選自RNAi、siNA、RNAi抑制劑、miRNA、siRNA及shRNA。
除非另外定義、否則本文所用技術及科學術語之含義與熟悉本發明所屬領域之專家通常所理解之含義相同。
除非另外指示，否則設想未明確詳細描述之所有其他方法、步驟、技術及操作可執行及已以熟習此項技術者已知之方式執行。舉例而言，提及標準手冊及通用背景技術及其中所引用之其他參考文獻。
本發明之申請專利範圍為非限制性的且於下文提供。
儘管本文已詳細揭示特定實施例及申請專利範圍，但其僅出於說明之目的作為實例且不欲對隨附申請專利範圍的範疇或任何相應未來申請案之申請專利範圍之標的物的範疇造成限制。詳言之，發明者預期可對本發明進行各種替代、改變及修改而不背離如申請專利範圍所界定之本發明之精神及範疇。咸信起始物質、相關生物材料或脂質體組裝方法之選擇對於瞭解本文所述實施例之一般技術者為常識。認為其他態樣、優點及修改均在以下申請專利範圍之範疇內。隨後申請之相應申請案中申請專利範圍範疇之改寫可歸因於各個國家專利法之限制且不應解釋為放棄申請專利範圍之標的物。

Claims (8)

  1. 一種式(XI)之隱形脂質(stealth lipid)， 或其鹽，其中Z為PEG；其中Z係由n個次單元聚合而成；n為Z之數量平均聚合度，在10與200個單元之間，其中n針對不同聚合物類型經最佳化；L1為視情況經取代之C1-10伸雜烷基連接基團，包括1、2個或2個以上酯基、丁二酸酯基、胺基甲酸酯基、碳酸酯基、酮基、羰基、脲基、胺基、醯胺基、亞胺基、硫醚基、黃原酸酯基及磷酸二酯基；其中任一者可經0、1或多個Z基團取代；其中R'係獨立地選自H、-NH-、-O-、-S-、磷酸酯基或視情況經取代之C1-10伸烷基；X1及X2係獨立地選自碳或選自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基之雜原子；及A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同。
  2. 如請求項1之隱形脂質或其鹽，其中該酯基係-C(O)O-、該丁二酸酯基係-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)、該胺基甲酸酯基係-OC(O)-NR'-、該碳酸酯基係-OC(O)O-、該酮基 係-C-C(O)-C-、該羰基係-C(O)-、該脲基係-NR'C(O)NR'-、該胺基係-NR'-、該醯胺基係-C(O)NR'-、該亞胺基係-C(NR')-、該硫醚基係-S-、該黃原酸酯基係-OC(S)S-及該磷酸二酯基係-OP(O)2O-。
  3. 如請求項1之隱形脂質或其鹽，其係式(XII)之隱形脂質 其中PEG為聚(乙二醇)次單元，其中PEG可為線性或分支PEG；n為PEG之平均數量聚合度，在10與200個單元之間；L1為視情況經取代之C1-10伸雜烷基連接基團，其含有1、2個或2個以上酯基、丁二酸酯基、胺基甲酸酯基、碳酸酯基、酮基、羰基、脲基、胺基、醯胺基、亞胺基、硫醚基、黃原酸酯基(xanthate)及磷酸二酯基；其中任一者可經0、1或多個PEG基團取代；X1及X2係獨立地選自碳或氧；A1及A2係獨立地選自C6-30烷基、C6-30烯基及C6-30炔基，其中A1及A2可相同或不同。
  4. 如請求項1至3中任一項之隱形脂質或其鹽，其中該隱形脂質係選自：
  5. 如請求項1至3中任一項之隱形脂質或其鹽，其中該隱形 脂質係。
  6. 一種如請求項1之隱形脂質之用途，其係用於製備治療疾病或病狀之藥劑，其中該疾病或病狀為癌症、肝臟疾病或可對用RNAi構築體治療起反應之疾病。
  7. 一種調配物之用途，其係用於製備治療疾病或病狀的藥劑，其中該調配物係包含生物活性劑及如請求項1至3中任一項之隱形脂質，其中該疾病或病狀為腫瘤、肝臟疾病或可對用RNAi構築體治療起反應之疾病。
  8. 一種隱形脂質，其係 或其鹽。
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