TWI510247B - 預防病毒的免疫方法及組合物 - Google Patents

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Description

預防病毒的免疫方法及組合物 【發明相關參考文獻】
本申請案主張優先權案為美國臨時專利申請案第61/164,385號，發明名稱為「預防流感的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月27日；美國臨時專利申請案第61/164,387號，發明名稱為「預防人類免疫缺陷病毒的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月28日；美國臨時專利申請案第61/164,388號，發明名稱為「預防黃熱病毒的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月28日；美國臨時專利申請案第61/164,388號，發明名稱為「預防黃熱病毒的免疫方法及組合物」，其係申請於2009年3月28日；美國臨時專利申請案第61/164,389號，發明名稱為「預防病毒感染的疫苗製造方法」其係申請於2009年3月28日；美國臨時專利申請案第61/313,676號，發明名稱為「預防流感的免疫方法及組合物」，申請於2010年3月12日，以上所有臨時專利申請之內容在此以參考方式全部併入。
【參考序列表】
本申請案包括序列表。序列表之電腦可讀取副本係透過EFS-Web以製作於2010年3月24日之ASCII檔案在此同時呈送，命名為SEQ_OPK50101_ST25，大小為42952字元。序列表包括的資訊在此以參考方式全部併入。
本發明一般係關於用於產生有效對抗病毒之強力、廣效反應性免疫原性組合物的部分糖基化病毒多肽。明確而言，本發明係關於利用單糖基化流感病毒血球凝集素(HA)肽產生具有強力對抗流感病毒之活性的疫苗。本發明係關於含有依此方法產生之糖蛋白和疫苗的醫藥組合物，以及係關於利用該去糖基化HA多肽於預防和治療流感病毒感染的方法。
在真核生物中，糖殘基通常連接至四個不同的胺基酸殘基。這些胺基酸殘基被分類為O-連接(絲胺酸、蘇胺酸和羥基離胺酸)和N-連接(天冬胺酸鹽)。於高基氏體或顆粒內質網(ER)內從核苷酸糖合成該O-連接糖。從一般前體及後續加工合成N-連接糖。已知添加N-連接糖鏈對折疊的穩定、避免內質網的分解、寡聚化、生物學活性和糖蛋白運輸而言極為重要。添加N-連接寡糖至特定Asn殘基在病毒之成熟蛋白的調節活性、穩定性或抗原性上扮演重要角色(Opdenakker G.等人,FASEB Journal 7：1330~1337；1993)。亦已認為N -糖基化係糖蛋白的折疊、輸送、細胞表面表現、分泌(Helenius,A,Mol. Bio. Of the Cell 5：253~265；1994)，保護蛋白被蛋白分解及強化糖蛋白溶解度(Doms等人,Virology 193：545~562；1993)所必需。病毒表面糖蛋白不僅為準確蛋白折疊所必需，亦提供對抗中和抗體如"聚糖屏障"的保護作用。因此，強宿主專一性的篩選經常伴隨可能N-連接糖基化的密碼子位置。隨後的N-連接糖化作用傾向被保留通過株和支系。
流感病毒具有三種主要類型：A、B和C。A型流感病毒可造成嚴重的疾病以及是造成人類流行病的唯一類型。H5N1株係一種A型流感病毒。B型株為散發性和小規模爆發的人類病例。C型株極少造成人類感染及不未造成大規模爆發。就A型流感病毒而言，僅H1、H2和H3亞型易於人類之間傳染。
A型流感病毒的爆發持續造成全球廣泛的罹患率和死亡率。據估計單是美國每年感染A型流感的族群為5至20%，此造成約200,000人住院及36,000人的死亡。建立綜合性防疫政策已經成為降低流感罹患率的有效方法。然而，病毒經常的基因漂移需每年重新配製疫苗，此將導致疫苗內病毒株與流行之間的不匹配。因此，對抗流感病毒的抗病毒療法為降低疾病嚴重程度及傳播的一種重要工具。
自從2003年高病原性H5N1流感病毒已爆發於禽類和野生鳥類(Li KS等人(2004)Nature 430：209~213)。在2010年2月時，這些病毒已不僅感染禽類亦造成478位人類的感染，其中286件造成死亡(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。該高病原性H5N1和2009豬源A型流感病毒已造成全球性的爆發並且更加關注該病毒可能進一步突變而造成致命的瘟疫(Garten RJ等人(2009)Science 325：197~201；Neumann G.等人(2009)Nature 459：931~939)。令人關心的是一流感病毒將獲得有效散佈於人類之間的能力，其所造成的流行病將成為一項威脅。因此，一流感疫苗必需為任何大流行應變計劃的一整合部分。
流感病毒為分節負鏈RNA病毒及屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。A型流感病毒由9個結構蛋白和密碼加上具有調控功能的一非結構NS1蛋白所構成。該非結構NS1蛋白在繁殖循環期間被大量合成以及位於感染細胞的胞漿和胞核內。該病毒基因組的分節性質可使其在一細胞與不同病毒株混合感染期間產生基因重組的機制(交換基因組片段)。該A型流感病毒可視顯露於其表面的不同血球凝集素(HA)和神經胺酸酶(NA)病毒蛋白被進一步分類成各種的亞型。藉由兩種病毒表面的糖蛋白，血球凝集素(HA或H)和神經胺酸酶(NA或N)可鑑定出A型流感病毒的亞型。依照其H和N蛋白的組合可鑑定各流感病毒的亞型。已有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。A型流感病毒可感染人、鳥、豬、馬和其他動物，但是野鳥這些病毒的天然宿主。目前僅一些A型流感亞型(即H1N1、H1N2和H3N2)流行於人類之間，但是16H和9NA亞型的全部組合已被鑑定於特別指水鳥和海鳥的禽類。此外，許多證據顯示H5和H7流感病毒亦可造成人類的疾病。
A型流感病毒的HA含有兩個不同結構區，亦即球狀頭部區和幹區。該球狀頭部區含有負責病毒附著至一標的細胞及參與HA之凝集活性的一受體結合位點。該幹區含有病毒封套和細胞內質膜之間膜融合所必需以及與融合活性有關的一融合肽(Wiley等人Ann. Rev. Biochem . 56：365~394(1987))。
感染流行性感冒之瞭解的重要貢獻係來自對血球凝集素(HA)的研究，一種結合至呼吸道內特異性唾液酸聚糖受體以使病毒進入細胞的病毒外套糖蛋白(Kuiken T等人(2006)Science 312：394~397；Maines TR等人(2009)Science 325：484~487；Skehel JJ,Wiley DC(2000)Ann. Rev. Biochem . 69：531~569；van Riel D.等人(2006)Science 312：399~399)。為穿越物種障礙及感染人類族群，禽AV必需從含α-2,3(禽)-連接的終端唾液酸聚糖改變其受體-結合優先性至α-2,6(人)-連接的唾液酸基序(Connor RJ等人(194)Virology 205：17~23)；以及此轉變僅經由兩次發生於1918年大流行的突變(Tumpey TM等人(2007)Science 315：655~659)。因此，瞭解該影響流感結合至聚糖受體的因素為發展用於控制任何未來具有大流行可能性交叉感染流感病毒之方法的關鍵。
針對此製造可誘發對抗H5N1流感病毒相異品系之強效中和抗體的一候選流感疫苗需求，發展出可中和一組具有各種H5N1支系假型HA之病毒粒子(virions)的共有H5N1血球凝集素(HA)序列疫苗(Chen MW.等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：13538~13543)。
HA係一種具有由一球狀頭部和一幹區組成之胞外域的同三聚體跨膜蛋白(Kuiken T等人(2006)Science 312：394~397)。該二區均攜帶可影響HA功能性(Chen ZY等人(2008)Vaccine 26：361~371；Ohuchi R等人(1997)J. Virol. 71：3719~3725)的N-連接寡糖(Keil W等人(1985)EMBO J. 4：2711~2720)。A型流感病毒的不同亞型之中，在頭部區的糖基化位點有廣泛的變異，然而該幹部寡糖則更為保留及需要融合活性(Ohuchi R等人(1997)J. Virol. 71：3719~3725)。接近抗原肽表位的聚糖干擾抗體的辦識(Skehel JJ等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：1779~1783)，以及接近HA之蛋白水解活化位點的聚糖調節其斷裂和影響流感病毒的感染性(Deshpande KL等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：36~40)。HA糖基化位點的缺失突變可影響病毒受體的結合(Gunther I等人(1993)Virus Res. 27：147~160)。
改變於或接近糖基化位點的肽序列可能改變HA的立體結構，而因此具有受體結合特異性和親和力。事實上，來自不同H5N1亞型的HA具有不同聚糖結合模式(Stevens J等人(2008)J. Mol. Biol. 381：1382~1394)。已於全病毒系統中研究H1和H3上糖基化位點的突變(Chandrasekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol. 26：107~113；Deom CM等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：3771~3775)。然而，仍未知糖基化的改變如何影響受體的結合特異性和親和力，其特別指最具病原性的H5N1 HA。
由於HA的低高度糖基化或無糖基化區持續地發生突變以逃避宿主的免疫系統，因此每年必需改變所製造的流感疫苗。
對抗異質性病原體之疫苗設計的目標為鑑定和設計有效且廣泛保護性抗原。在流行性感冒的例子中，已花費極大努力於實證檢驗保守的線性序列和區域但無成果。這些失敗的可取信理由為缺乏針對實際真正生產部位抗原性測試物件之反應以中和在建構一實際感染中之病原體上抗原的知識。
明確而言，在目前和未來疫苗製造中需要一種能維持或加強交叉中和表位之品質和抗原性而且可被用於設計和確認疫苗生產過程的交叉中和單株抗體。假設結合至疫苗的抗體可反映出結構完整性和抗原強度，此將可測定交叉中和抗體的結合，例如去糖基化HA多肽至該疫苗加工衍生物而可定量性測定其交叉中和潛力。為了最大化針對這些通用表位的反應將創造出一種可增加針對這些通用表位之免疫原性的衍生物。
根據本發明，揭示一種利用這些原則的疫苗。藉由從病毒糖蛋白部分移除糖以暴露出糖基化位點(其為高度保留及不產生突變或非侵犯性突變)以及在同時保留適當糖以保存該糖蛋白的三級結構。藉由部分去糖基化該糖蛋白使一特定糖基化位點保留一、二或三個糖單位而產生該部分糖基化病毒糖蛋白。在一些態樣中藉由未糖化一或多個特定糖基化位點及共軛一單-、雙-或三糖至該糖基化位點提供一蛋白或多肽可產生該部分糖基化糖蛋白。
揭示含有至少一部分糖基化HA、NA或M2糖蛋白及醫藥上可接受載劑的疫苗。在一些實例中，該部分糖基化HA糖蛋白係選自由部分糖基化流感病毒HI、H3和H5所構成的群組。在一些實例中，H5 HA於一或多個位置39、127、170、181、302、495和500的天冬胺酸殘基被糖基化。在一些實例中，該天冬胺酸殘基係於位置177。
揭示一種包括將含有至少一去糖基化HA糖蛋白及一醫藥上可接受載劑之疫苗投與至流感敏感性生物體的方法。在一些實例中，該去糖基化HA糖蛋白係選自由HI、H3和H5構成的群組。
在一些實例中該去糖基化於糖蛋白上的一或多個糖基化位點產生一單糖基化作用(留下一個糖分子)。在一些實例中該去糖基化於糖蛋白上的至少一個糖基化位點產生雙糖基化作用(留下兩個糖分子)。在一些實例中該去糖基化於糖蛋白上的至少一或多個糖基化位點產生三糖基化作用(留下三個糖分子)。在一些實例中該去糖基化於糖蛋白上的至少一個糖基化位點產生至少一個單糖基化、雙糖基化和三糖基化作用。
本發明係關於一種用於提高對病毒、細菌、真菌或其他來源病原體之免疫反應的免疫原性組合物，該組合物包含：來自病毒、細菌、真菌或其他來源病原體的一抗原糖蛋白，其中該糖蛋白被部分糖基化。
在一些態樣中，該病原體係病毒以及該部分糖基化抗原係病毒、病毒樣顆粒、病毒肽、蛋白質、多肽，或源自該病毒的片段、或部分含有病毒蛋白序列的一融合蛋白。
該病毒係選自流感病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、衣原體、腺病毒科、巨大腺病毒(mastadenovirus)、禽腺病毒、皰疹病毒科、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、單純皰疹病毒5、單純皰疹病毒6、光滑病毒科(leviviridae)、輕小病毒(levivirus)、腸桿菌噬菌體MS2、蘿莉病毒(allolevirus)、痘病毒科、痘病毒脊索亞科(chordopoxvirinae)、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、軟疣痘病毒屬、痘病毒昆蟲亞科、乳多瘤病毒科、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、副黏液病毒科、副黏液病毒、副流感病毒1、麻疹病毒屬、麻疹病毒、德國麻疹病毒屬、腮腺炎病毒、肺炎病毒亞科、肺炎病毒屬、間質肺炎病毒屬、禽肺炎病毒、人間質肺炎病毒、小RNA病毒科、腸病毒、鼻病毒、肝炎病毒、人A型肝炎病毒、心肌炎病毒、口蹄疫病毒屬、里奧病毒科、正里奧病毒、環狀病毒、輪狀病毒、多角體病毒屬、斐濟病毒屬、植物里奧病毒屬、水稻病毒屬、反轉錄病毒科、哺乳類B型反轉錄病毒、哺乳類C型反轉錄病毒、鳥類C型反轉錄病毒、D型反轉錄病毒群、BLV-HTLV反轉錄病毒、慢病毒(lentivirus)、人類免疫缺陷病毒1、人類免疫缺陷病毒2、HTLV-I和-II病毒、SARS冠狀病毒、單純皰疹病毒、伊波病毒(Epstein Barr virus)、巨細胞病毒、肝炎病毒(HCV、HAV、HBV、HDV、HEV)、剛地弓蟲病毒、梅毒螺旋體病毒、人類嗜T淋巴球病毒、腦炎病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、水痘帶狀疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹病毒、泡沫病毒屬、黃熱病毒科、C型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒科、B型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒新德比斯病毒(alphavirus sindbis virus)、風疹病毒屬、風疹病毒、棒狀病毒科、水泡病毒屬、莉莎病毒屬(lyssavirus)、流行熱病毒屬、胞內水稻黃矮炮彈病毒(cytorhabdovirus)、核內水稻黃矮炮彈病毒、沙狀病毒科(arenaviridae)、沙狀病毒屬、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、Ippy病毒、拉薩熱病毒(lassa virus)、冠狀病毒和曲狀病毒(torovirus)。
該病毒胜肽、蛋白、多肽或其片段係選自流感病毒神經胺酸酶；流感病毒血球凝集素；人呼吸道融合病毒(RSV)-病毒蛋白；RSV F糖蛋白；RSV G糖蛋白；單純皰疹病毒(HSV)病毒蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE；衣原體MOMP和PorB抗原；核心蛋白；登革熱病毒的基質蛋白或其他蛋白；麻疹病毒血球凝集素；單純皰疹病毒第2型糖蛋白gB；小兒麻痺病毒1 VP1；HIV 1的封套糖蛋白；B型肝炎表面抗原；白喉毒素；鏈球菌24H表位；纖毛淋病雙球菌；假性狂犬病病毒g50(gpD)；假性狂犬病病毒II(gpB)；假性狂犬病病毒III(gpC)；假性狂犬病病毒糖蛋白H；假性狂犬病病毒糖蛋白E；傳染性胃腸炎病毒糖蛋白195；傳染性胃腸炎病毒基質蛋白；豬輪狀病毒糖蛋白38；豬小病毒衣殼蛋白；猪痢疾蛇形螺旋體保護抗原；牛病毒性腹瀉糖蛋白55；新城疫病毒血球凝集素-神經胺酸酶；豬流感血球凝集素；口蹄疫病毒；豬瘟病毒；豬流感病毒；非洲豬瘟病毒；豬肺炎黴漿菌；牛傳染性鼻氣管炎病毒；牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G；傳染性喉氣管炎病毒；傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I；拉克錫病毒(La Crosse virus)糖蛋白；初生仔牛下痢症病毒；委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒；靜脈病毒(punta toro virus)；鼠白血病病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；B型肝炎病毒核心蛋白和B型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物；馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原，包括馬流感病毒A型/Alaska 91神經胺酸酶、馬流感病毒A型/Miami 63神經胺酸酶、馬流感病毒A型/Kentucky 81神經胺酸酶、馬皰疹病毒1型糖蛋白B和馬皰疹病毒1型糖蛋白D；牛呼吸道融合病毒或牛副流感病毒的抗原；牛呼吸道融合病毒附著蛋白(BRSV G)；牛呼吸道融合病毒融合蛋白(BRSV F)；牛呼吸道融合病毒核衣殼蛋白(BRSV N)；牛副流感病毒3型融合蛋白；牛副流感病毒3型凝集素神經胺酸酶；牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53；登革熱病毒糖蛋白E以及人C型肝炎病毒的糖蛋白E1或E2。
在一些態樣中，該糖基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化流感病毒血球凝集素。在一些具體實施例中，該去糖基化病毒抗原係選自由流感病毒H1、H3和H5構成之群組的單糖基化血球凝集素。在一些具體實施例中，該單糖基化流感病毒凝集素含胺基酸序列具有天冬胺酸鹽-Xaa -絲胺酸和天冬胺酸鹽-Xaa -蘇胺酸的N-糖化位點，該Xaa 係除脯胺酸之外的任何胺基酸。在一些態樣中，該單糖基化凝集素於糖化位點含有對HA受體結合呈現低特異性及較強親和力的一單GlcNAc糖。
在一些具體實施例中，該糖基化病毒抗原係以N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)及/或甘露糖雙-或三糖基化的流感病毒凝集素。在一些態樣中，該糖基化病毒抗原係以N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)單糖基化的流感病毒凝集素。
在一些態樣中，該單糖基化流感病毒凝集素含有包括共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)的多肽。在一些具體實施例中，該單糖基化共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)係於天冬胺酸殘基的位置39、170、181、302和495被糖基化。在其他態樣中，該單糖基化流感病毒血球凝集素含有選自由一NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序列(序列辦識編號：6)、一共有H1-A(序列辦識編號：8)和一共有H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的H1多肽序列。在一些具體實施例中，修飾該HA序列使其可表現於一適當的真核細胞內。
在一具體實施例中，該單糖基化流感病毒血球凝集素含有一季節性H1(布里斯本)多肽。
本發明亦係關於含有包括去糖基化至單-、雙-或三糖基化狀態之病毒糖蛋白的免疫原性多肽，及任選佐劑的疫苗，其中該疫苗能誘發對抗呼吸道病毒的免疫反應。在一些具體實施例中，該呼吸道病毒係一流感病毒及該病毒糖蛋白係血球凝集素(HA)。
在一些態樣中，該流感病毒係選自由禽流感病毒及季節性流感病毒構成之群組。在一些具體實施例中，該禽流感病毒係H5N1。在一些具體實施例中，該流感病毒係A型流感病毒。
在一態樣中，該病毒係呼吸道融合病毒(RSV)，以及該部分糖基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化RSVF(融合)、G(附著)或SH(低疏水性)糖蛋白，或其免疫原性片段。在一些具體實施例中，該單糖基化RSVG蛋白序列(序列辨識編號：12)於表6中所示一或多個可能N-糖基化位點的天冬胺酸殘基被部分糖基化。
在一態樣中，該病毒係黃熱病毒，以及該部分糖基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化登革熱病毒封套糖蛋白M、糖蛋白E，或其免疫原性片段。在一些具體實施例中，該單糖基化登革熱病毒糖蛋白E(序列辨識編號：13)於表7中所示一或多個N-糖基化位點N67和N153的天冬胺酸殘基被部分糖基化。
在一態樣中，該病毒係C型肝炎病毒，以及該部分糖基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化C型肝炎封套糖蛋白E1、糖蛋白E2，或其免疫原性片段。在一些具體實施例中，該單糖基化C型肝炎封套糖蛋白E1(序列辨識編號：14)於表8中所示一或多個N-糖基化位點N196、N209、N234、N305和N325的天冬胺酸殘基被部分糖基化。
在一態樣中，該病毒係人類免疫缺陷病毒(HIV)，以及該部分糖基化病毒抗原係單-、雙-或三糖基化HIV封套糖蛋白gp120、跨膜糖蛋白gp41，或其免疫原性片段。在一些具體實施例中，該單糖基化HIV封套糖蛋白gp120(序列辦識編號：15)係於如表9中所示天冬胺酸殘基的一或多個可能N-糖基化位點被部分糖基化。
本發明亦係關於一種疫苗組合物包含：流感HA多肽，其中該流感HA多肽被去糖基化至單糖基化狀態；以及醫藥上可接受載劑，其中當將該單糖基化HA多肽被導入生物體時，該多肽可誘發該生物體產生結合至流感病毒的抗體。
在一些態樣中，將該單糖基化HA多肽導入生物體可誘發該生物體產生中和季節性和禽流感病毒的抗體。
在一具體實施例中，該單糖基化流感病毒凝集素含有季節性H1(布里斯本)HA多肽以及當將該單糖基化HA多肽導入一生物體時，該H1(布里斯本)HA多肽可誘發該生物體產生中和NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)流感病毒的抗體。
在另一具體實施例中，該單糖基化流感病毒血球凝集素含有NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)多肽以及當將該單糖基化HA多肽導入生物體時，該NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)多肽可誘發該生物體產生中和季節性H1(布里斯本)HA流感病毒的抗體。
在一些態樣中，該疫苗進一步含有佐劑，其可被選自氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁、佛氏(Freund’s)不完全佐劑(IFA)、角鯊烯(squalene)、角鯊烷(squalane)、明礬和MF59。
本發明係關於免疫哺乳動物以對抗病毒性呼吸道感染的方法，該方法包含：將含有包括去糖基化病毒糖蛋白至單-、雙-或三糖基化狀態之免疫原性多肽的疫苗投與至感染呼吸道病毒的感受性哺乳動物，其中該疫苗能誘發對抗該呼吸道病毒的免疫反應。在一些具體實施例中，該呼吸道病毒係流感病毒以及該病毒糖蛋白係血球凝集素(HA)。該疫苗可經由腸道外投藥、吸入法、鼻內被投與，以及有時可用於預防。
在一些態樣中，該疫苗可誘發對抗病毒或不同於所選用部分糖基化病毒糖蛋白病毒之不同株相同病毒的免疫反應。在一些具體實施例中，該去糖基化病毒糖蛋白係單糖基化流感血球凝集素(HA)。
本發明提供可有效對抗A型流感病毒的疫苗。在一具體實施例中，該疫苗含有功能上模擬此處所述分子之中和表位的胜肽或多肽。在另一具體實施例中，該疫苗可有效對抗病毒抗原其含有功能上模擬此處所述分子之中和表位之的胜肽或多肽。在一具體實施例中，該病毒抗原係來自流感病毒或HIV-1、HIV-2病毒或黃熱病毒，例如登革熱病毒或C型肝炎病毒。
在另一具體實施例中，該疫苗係一種有效對抗A型流感病毒的疫苗，其含有功能上模擬此處所述分子之中和表位之的胜肽或多肽。在一具體實施例中，該分子係抗體。在另一具體實施例中，該抗體可結合HA抗原。在其他具體實施例中，該HA抗原係H5亞型。在其他具體實施例中，該HA抗原係H1亞型。在一其他具體實施例中，該抗原被呈現於該A型流感病毒的表面。在其他具體實施例中，該胜肽或多肽含有產生中和抗體的抗原決定部位。
從下列較佳具體實施例的描述配合下列的附圖將可更瞭解諸如此類的態樣，其雖然受變化和改良的影響但仍不偏離該揭示之新穎概念的精神和範圍。
下列本發明具體實施例的詳細說明係參考以相同之元件編號表示類似元件的附圖，以及其係藉由本發明可實施的特定具體實施例進行說明。這些具體實施例被詳細描述以使熟習本領域之技術者能實施本發明，以及必需瞭解可利用其他具體實施例並且進行邏輯上、構造上、功能上和其他的改變而不偏離本發明的範圍。因此，下列的詳細說明不被視為具有限制性的意義。
流感病毒的血球凝集素(HA)係一種具有由球狀頭部和幹區組成之胞外域的同三聚體跨膜蛋白。該二區均攜帶依照一般N糖基化徑路進行生合成的N-連接寡糖。特定位置的糖基化可影響HA的功能性。包圍該抗原肽表位的糖類干擾與抗體的接觸，以及此效應將導致流感病毒的抗原性漂移。先前對HA的研究亦顯示被糖基化的肽序列具有高度保留性，以及藉由失去接近該受體結合位點的複合聚糖鏈可影響該HA受體的結合特異性。此外，藉由接近斷裂位點之聚糖調節該HA的蛋白水解活性可影響流感病毒的感染性。在A型流感病毒的不同亞型中已顯示其頭部區在糖基化位點的構造和數目上有許多的變異，反之該幹部寡糖較為保留並且需要融合活性。全部這些發現已顯示HA糖基化對其活性的重要性。
病毒傳播開始於血球凝集素(HA)糖蛋白於流感病毒外套上以及於宿主細胞表面上含聚糖之唾液酸之間的關鍵性相互作用。為說明HA糖基化於此重要相互作用的角色，定義各種HA糖型，以及藉由利用合成SA晶片研究其結合親和力和特異性。截斷HA上的N-聚糖結構可增加SA結合親和力同時降低對不同SA配體的特異性。定量地劃分SA配體結構內各單糖和硫酸根基團對HA結合能的貢獻。已發現該硫酸根基團對全部糖基化HA而言可增加接近100倍(2.04 kcal/mol)的結合能，以及雙枝聚糖對單糖基化HA糖型亦相同。於各糖基化位點僅攜帶單一N-連接GlcNAc之對抗HA蛋白的抗體比完全糖基化HAs所誘發對抗流感亞型顯示具有較佳的結合親和力及中和活性。因此，於病毒表面糖蛋白上移除結構上非必需聚糖在用於設計對抗流感及其他人類病毒之疫苗上係一種極有效和通用的方法。
除非另有說明，否則此處使用之技術和科學名詞與熟習本領域之技術者通常所瞭解者的意義相同。Singleton等人，微生物學和分子生物學詞典 第二版，J. Wiley ＆ Sons(紐約，紐約1994)中提供本領域技術者許多用於本申請案之名詞的通則。
熟習本領域之技術者將瞭解可被用於本發明實務之類似或等同於此處所述的許多方法和材料。事實上，本發明在任何情況下非僅侷限於所述的方法和材料。就本發明的目的而言，下列的名詞被定義如下。
名詞"A型流感亞型"或"A型流感病毒亞型"可互用，以及指具有凝集素(H)病毒表面蛋白之特徵的A型流感病毒變異株而被標示以H數字舉例如H1、H3和H5。此外，該亞型進一步具有以N數字表示之神經胺酸酶(N)病毒表面蛋白的特徵，舉例如N1和N2。依此，可藉由H和N數字表示一亞型舉例如H1N1、H5N1和H5N2。此名詞特別包括各亞型內的全部病毒株(包括滅絕株)，其通常導因於突變及呈現不同的致病概貌。此類病毒株亦將被稱為一病毒亞型的各種"分離株"，包括全部過去、現在和未來的分離株。因此，在本文中名詞"病毒株"和"分離株"可互用。亞型含有以A型流感病毒為基礎的抗原。該抗原可以血球凝集素病毒表面蛋白為基礎以及可被稱為"HA抗原"。在一些實例中，此類抗原係基於舉例如H1亞型和一H5亞型的一特定亞型蛋白，其可分別被稱為H1抗原和H5抗原。
揭示於本發明之名詞"去糖基化"或"部分糖基化"蛋白意指具有一或多個移除自完全糖基化蛋白實例及該蛋白實質上保留其原始構形/折疊之聚糖結構的糖蛋白。一"去糖基化"蛋白包括一部分糖基化的蛋白，其中該糖基化過程可在一或多個糖基化位點留下單糖基化、雙糖基化或三糖基的糖蛋白。
一"部分糖基化"蛋白包括一"去糖基化"蛋白，其中一或多個糖被保留於各糖基化位點以及各部分糖基化位點與完全糖基化糖蛋白的實例比較含有一較小聚糖結構(含有較少的糖單位)，以及該部分糖基化蛋白實質上保留其原始構形/折疊。藉由完全糖基化糖蛋白實例中部分去糖基化至少一糖基化位點的聚糖結構而產生一"部分糖基化"蛋白。亦可藉由在一蛋白的未糖基化位點引入糖基化作用而在完全糖基化的糖蛋白實例中使該位置加入的糖基化序列較小於該聚糖結構的方法產生一"部分糖基化"蛋白。亦可藉由在序列的糖基化位點引入糖基化胺基酸單體(例如GlcNA-精胺酸基團)而使該加入的聚糖結構較小於完全糖基化之糖蛋白實例中在該位置的聚糖結構合成一病毒糖蛋白序列或其片段的方法產生一"部分糖基化"蛋白。
於此處可互用的名詞"核酸"和"多核苷酸"指單-或雙鏈RNA、DNA，或混合聚合物。多核苷酸包括基因組序列、基因組外序列和質體序列，以及可表現或可用於表現多肽的較小基因工程片段。
一"分離核酸"係實質上分離自其他基因組DNA序列以及如自然地伴隨一天然序列核糖體和聚合酶之蛋白質或複合物的一種核酸。該名詞包含已移除自其天然環境的一核酸序列，以及包括重組或選殖DNA分離物和化學合成類似物或藉由異源系統生物合成的類似物。一實質純核酸包括分離自該核酸的分離型。當然，此係指原始分離的核酸以及包括後來藉由人工加至該分離核酸的基因或序列。
名詞"多肽"具有習知的意義，即指一胺基酸的序列。該多肽的產品非侷限於一特定的長度。胜肽、低聚肽和蛋白質均屬於多肽的定義範圍內，以及除非另有明述否則此處可互用這些名詞。此名詞亦非指或排除多肽的表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化等，以及已知技術中天然和非天然的其他修飾。一多肽可為一全蛋白質，或其子序列。本發明文中重要的特殊多肽為含有CDRs及能結合一抗原或HIV-感染病毒的胺基酸子序列。
一"分離多肽"係已被鑑定和分離及/或收獲自其天然環境之成分者。在較佳具體實施例中，該分離多肽可被純化至(1)　當藉由Lowry法測定時大於95%重量比，以及最佳為大於99%重量比的多肽；(2)　藉由旋轉杯定序儀測定時至足以獲得至少N-端或內部胺基酸序列15個殘基的程度；或(3)　藉由SDS-PAGE時在還原或非還原條件下利用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳為銀染劑至同質化。由於不呈現多肽天然環境的至少一成分，因此分離多肽包括原位重組細胞內的多肽。然而，通常可藉由至少一種純化步驟製備分離多肽。
一"天然序列"多核苷酸係具有相同核苷酸序列作為源自天然之多核苷酸者。一"天然序列"多肽係具有相同胺基酸序列作為源自天然(例如來自任何品種)之多肽(例如抗體)者。此類天然序列多核苷酸和多肽可被分離自天然或可藉由重組或合成法被製備。
如此處所述之名詞，一多核苷酸"變體"係在一或多個取代、刪除、添加及/或插入上不同於特別揭示於此處之多核苷酸的一多核苷酸。此類變體可為天然或被合成產生，例如藉由藉由修飾本發明的一或多個多核苷酸序列以及如此處所述及/或利用本領域中任何習知的許多技術評估該多核苷酸的一或多種生物活性。
如此處所述之名詞，一多肽"變體"係在一或多個取代、刪除、添加及/或插入上不同於特別揭示於此處之多肽的一多肽。此類變體可為天然或被合成產生，例如藉由藉由修飾本發明的上述多肽序列以及如此處所述及/或利用本領域中任何習知的許多技術評估該多肽的一或多種生物活性。
可在本發明之多核苷酸和多肽的構造內進行修飾並且仍可獲得編碼一變體或具有所欲特性之衍生多肽的一功能性分子。當欲改變該多肽的胺基酸序列以產生一等效物，或甚至本發明的一改良、變異或部分多肽時，熟習本領域之技術者通常需改變該編碼DNA序列的一或多個密碼子。
例如，在蛋白結構內的某些胺基酸可以其他胺基酸被取代而不嚴重損及結合其他多肽(如抗原)或細胞的能力。由於一蛋白的結合能力及性質定義蛋白質的生物功能活性，因此可在蛋白序列及其基本DNA編碼序列內進行某些胺基酸序列的取代作用而仍可獲得具有相同性質的蛋白質。因此預期可在揭示組合物之胜肽序列或編碼該胜肽的對應DNA序列內進行各種的變化而不嚴重損及其生物學效用或活性。
在進行此類改變的過程中，必需考慮胺基酸的親水指數。親水胺基酸指數於授予一蛋白質之互動生物學功能上的重要性已為技術中所習知(Kyte和Doolittle，1982)。可接受的是胺基酸之相對親水性有助於定義該蛋白與其他分子相互作用之形成蛋白的二級結構，該其他分子為例如酵素、基質、受體、DNA、抗體、抗原等。各胺基酸具有根據其疏水性和電荷性質的親水指數(Kyte和Doolittle，1982)。這些值為：異白胺酸(+4.5)、纈胺酸(+4.2)、白胺酸(+3.8)、苯丙胺酸(+2.8)、半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)、甲硫胺酸(+1.9)、丙胺酸(+1.8)、甘胺酸(-0.4)、蘇胺酸(-0.7)、絲胺酸(-0.8)、色胺酸(-0.9)、酪胺酸(-1.3)、脯胺酸(-1.6)、組胺酸(-3.2)、麩胺酸鹽(-3.5)、麩醯胺酸(-3.5)、天門冬酸鹽(-3.5)、天門冬胺酸(-3.5)、離胺酸(-3.9)，及精胺酸(-4.5)。技術中已知某些胺基酸可被具有類似親水指數或分數的其他胺基酸所取代並且仍能產生具有類似生物學活性的蛋白質，即仍可獲得一生物學功能等效蛋白。在進行此類的改變中，胺基酸取代作用的親水指數較佳為在±2，更佳為在±1，最佳為在±0.5的範圍內。
技術中亦瞭解可根據親水性有效地進行類似胺基酸的取代作用。美國專利案4,554,101宣稱受鄰近胺基酸之親水性所支配的蛋白質最大局部平均親水性與該蛋白的生物學性質有關。如美國專利案4,554,101所詳述，具有下列親水值的胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)、離胺酸(+3.0)、天門冬酸鹽(+3.0±1)、麩胺酸鹽(+3.0±1)、絲胺酸(+0.3)、天門冬胺酸(+0.2)、麩醯胺酸(+0.2)、甘胺酸(0)、蘇胺酸(-0.4)、脯胺酸(-0.5±1)、丙胺酸(-0.5)、組胺酸(-0.5)、半胱胺酸(-1.0)、甲硫胺酸(-1.3)、纈胺酸(-1.5)、白胺酸(-1.8)、異白胺酸(-1.8)、酪胺酸(-2.3)、苯丙胺酸(-2.5)、色胺酸(-3.4)。已瞭解一胺基酸可被另一具有類似親水值的胺基酸所取代並且仍可獲得生物性等效物，以及特別指一免疫等效蛋白。在此類變化中，胺基酸的取代作用其親水值較佳為在±2，較佳為在±1，以及最佳為在±0.5的範圍內。
如上述概述，胺基酸取代作用因此通常係根據該胺基酸側鏈取代基的相對類似性，如其疏水性、親水性、電荷、大小等。採用上述各種特性之範例取代作用已為本領域技術者所習知以及包括：精胺酸和離胺酸；麩胺酸鹽和天門冬酸鹽；絲胺酸和蘇胺酸；麩醯胺酸和天門冬胺酸；以及纈胺酸、白胺酸和異白胺酸。
多肽含有在蛋白N-端的一訊息(或前導)序列，其共轉譯或轉譯後引導蛋白質的傳輸。該多肽亦可被共軛至連接子或易於該多肽(例如聚-His)之合成、純化或鑑定，或加強多肽至固態載體之結合的其他序列。
多肽的糖基化作用通常為N-連接或O-連接。N-連接指將糖基團附著至一天門冬胺酸殘基的側鏈。一"序列子(sequon)"係蛋白質內作為至一多糖(醣)之附著位點被稱為一N-連接聚糖的三個連續胺基酸序列。此係經由天門冬胺酸(Asn)之側鏈的氮原子連接至該蛋白的一多糖。一序列子可為Asn-Xaa -Ser或Asn-Xaa -Thr，該Xaa 係除了脯胺酸之外的任何胺基酸。因此，多肽內存在這些三肽序列可產生一潛在的糖基化位點。O-連接糖基化作用係指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖的其中一種糖被附著至一羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但是亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。雖然N-連接寡糖附著至一糖蛋白的過程中絕對需要該Asn-X-Ser/Thr序列子(Marshall RD,Biochem .Soc .Symposia 40：17~26；1974)，但是其存在不必然導致糖基化並且糖蛋白內的一些序列子可能保留未糖基化(Curling EM等人，Biochem. Journal 272：333~337；1990)。
聚糖晶片係用於研究糖-蛋白相互作用及提供用於流感病毒亞型之新平台的有力工具(Blixt O等人(2004)Proc .Natl .Acad .Sci . USA 101：17033~17038；Chandrasekaran A等人(2008)Nat .Biotechnol . 26：107~113；Liang PH等人(2007)J .Am .Chem .Soc . 129：11177~11184；Stevens J等人(2008)J. Mol .Biol . 381：1382~1394)。其模擬細胞表面上之聚糖以呈現高親和力和特異性的多價相互作用。利用此技術，具有受體特異性之各種天然和突變HAs的特性可提供用於辨別流感病毒亞型的新平台。
雖然為一種有力方法，但是藉由聚糖晶片之分析瞭解HA-聚糖的相互作用在兩個議題上變得更為複雜：第一，HA結合特異性可受空間配置以及該陣列化聚糖之組合物和所使用的結合偵測法的影響(Srinivasan A等人(2008)Proc .Natl .Acad .Sci . USA 105：2800~2805)。第二，於或接近糖基化位點的胜肽序列內變化可改變HA的三維結構，而因此改變受體結合的特異性和親和力。事實上，來自不同H5N1亞型的HA具有不同聚糖結合模式(Stevens J等人(2008)J .Mol .Biol . 381：1382~1394)。已於全病毒系統內研究H1和H3上糖基化位點的突變(Chandrasekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol . 26：107~113；Deom CM等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：3771~3775)。然而，仍未知糖基化內變化對受體結合特異性和親和力的影響，其特別指最具病原性的H5N1 HA。針對這些議題，發展出一種定量聚糖晶片的分析法以克服傳統HA結合實驗上的限制。
先前的試驗已經利用取得自昆蟲細胞之表現系統的HA(Chandrasekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol . 26：107~113)。然而，昆蟲細胞與哺乳動物細胞比較具有不同的細胞內糖基化作用，其明顯差異在於複合型N-聚糖終止於半乳糖以及昆蟲細胞內不產生唾液酸。
從人類細胞表現HA糖基化變體
針對人類細胞內的糖基化變化如何影響受體結合特異性和親和力，藉由利用流感H5N1 HA共有序列製備含有HA-結合配體之大量構造類似物的聚糖晶片以及數種已定義糖型的HA(Chen MW等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：13538~13543)於定量性結合分析。
藉由利用人類密碼子最適化用於表現的CHA5密碼子。如表1中所示，為避免蛋白質被酵素切割成HA1和HA2將該原始病毒蛋白酶切割位點PQRERRRKKRG(序列辨識編號：1)突變成PQRERG(序列辨識編號：2)。在HA構體的C端以附加殘基LVPRGS PGSGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWVLLSTFLG HHHHHH (序列辨識編號：3)取代該跨膜區(殘基：533~555)，斜體字為該凝血酶的切割點，劃底線者為噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列，以及粗體字者為His-標簽(Stevens J.等人(2006)Science 312：404~410)。
使用該H5共有序列以產生表現自HEK293人類細胞的HA糖基化變體。為產生高甘露糖型糖基化作用(HAhm )，使用缺少N-乙醯基葡胺糖基轉移酶I(GnTI- )的HEK293S細胞。為了進一步針對HA糖基化作用對受體結合親和力和特異性的效應，系統性地從原始複合型N-聚糖移除HA上的糖(第1A圖)。藉由神經胺酸酶(NA)的處理從HAfg 移除唾液酸殘基而產生去唾液酸HA(HAds )。使用內切糖苷酶H(EndoH)將全部聚糖結構截斷成一單GlcNAc殘基而產生單糖基化HA(HAmg )。因此，可產生總共四個糖型的HA：HAfg ─來自HEK293E細胞的完全糖基化HA；來自經神經胺酸酶(NA)處理之HAfg 的HAds 去唾液酸HA；HAhm ─來自缺少人類N-乙醯基葡胺糖基轉移酶I(GnTI- )HEK293S細胞的高甘露糖型HA；以及HAmg ─於其糖基化位點具有來自經內切糖苷酶H(EndoH)處理之HAhm 的單N-乙醯葡萄糖胺殘基HA(第1A和6圖)。藉由質譜分析確認該聚糖結構(第7、8、9圖)。該變體的圓二色性(circular dichroism)證實其具有類似的二級結構(第1C圖)。然後研究N-聚糖對不同糖型HA的唯一效應，假設這些樣本具有類似的蛋白三維結構以及在分析中不造成偏差(第1B圖)。應注意由於缺乏糖基化作用而無法於大腸桿菌中表現功能性HA。
此外，質譜儀分析證實(a) HAfg 優勢地含有複合型N-聚糖(第7A圖)；(b)　已從HAds 上的複合型N-聚糖移除唾液酸(第7B圖)；(c) HAhm 優勢地含有該高甘露糖型N-聚糖(第7C圖)；以及(d) HAmg 顯示HA上僅一N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)(第1和8圖)。
HA糖基化變體的聚糖晶片輪廓
藉由利用習知的三明治法檢查HA糖基化變體HAfg 、HAds 、HAhm 和HAmg 的聚糖晶片輪廓。該合成唾液酸聚糖陣列係由設計用於探測該流感病毒聚糖特異性之17α2,3(聚糖1~17)和7α2,6(聚糖21~27)的唾液酸糖苷(sialosides)所構成(請看第4圖)。製備具有終止於胺之五碳連接子的該合成唾液酸糖苷以及藉由在室溫的含水條件下形成一醯胺鍵而共價地附著於塗佈NHS載玻片上。該印刷程序係根據先前所述的標準晶片機械手印刷技術(Blixt O等人(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101：17033~17038；Wang CC等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：11661~11666)。將HA變體用於該唾液酸玻片然後雜合初級抗體，接著以共軛至Cy3的次級抗體進行偵測。此分析顯示H5N1 HA共有序列根據先前試驗可特異性地結合至α2,3唾液酸糖苷但非α2,6唾液酸糖苷(第2A圖)(Chandrasekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol. 26：107~113；Stevens J等人(2008)J. Mol. Biol. 381：1382~1394)。意外地，藉經由相對螢光強度的定量結合HAfg 、HAds 和HAhm ，至HAmg 與α2,3唾液酸糖苷的結合強度成功地變得較強(第2A圖)。
HA被與設計用於流感病毒之含17α2-3(聚糖1~17)和7 α2-6(聚糖21~27)唾液酸糖苷的合成聚糖晶片接觸(第4圖)，然後該HA蛋白被雜合未標示初級抗體接著藉由Cy3標示次級抗體進行偵測。該分析顯示共有序列的流感H5N1血球凝集素可特異性地結合至α2-3唾液酸糖苷，但非α2-6唾液酸糖苷(第2A圖)。意外地，與聚糖晶片分析比較HAfg 、HAds 和HAhm ，至HAmg 與α2-3唾液酸糖苷的結合強度成功地變得較強(第2A圖)。
定量性聚糖晶片
由於聚糖晶片分析僅提供相對的螢光強度而限制結合試驗中的可定量性，以及使用者無法從個別試驗中分辨至受體的結合親和力。為了能在結合試驗中進行準確地測定，引用此晶片平台至測定HA-聚糖定量地相互作用的解離常數。
設計一種定量性晶片以測定表面解離常數(Liang PH等人(2007)J. Am. Chem. Soc. 129：11177~11184)。為了避免抗體層疊造成的任何扭曲，以螢光染料Cy3直接標示HA(Srinivasan A等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：2800~2805)。藉由Cy3-標示HAs的序列稀釋進行直接結合試驗以建立相對結合強度。藉由繪製該HA濃度對各別24種唾液酸糖苷印於載玻片上之螢光強度測定表面上的解離常數。根據Langmuir等溫線計算該解離常數KD,surf 值(請看第2B圖)。該單HA-唾液酸糖苷的結合力弱，顯現解離常數為在克分子範圍內(KD =2.5x10-3 M)(Sauter NK等人(1989)Biochemistry 28：8388~8396)；然而，HA涉及可從定量性晶片分析中觀察之宿主細胞表面上與唾液酸糖苷的多價相互作用(表2)。隨著HAs上N-聚糖長度的減少而全方位地和實質性地降低該KD,surf 值(第2B圖)。
全部HA糖型顯示與受體聚糖以硫酸根基團在第三GlcNAc殘基之第6個位置的還原端(聚糖4和7)具有強結合力。此硫酸根基團對結合至H5HA而言極為重要(Chandr asekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol. 26：107~113；Stevens J等人(2008)J. Mol. Biol. 3811382~1394)。此外，已觀察到聚糖4為HAfg 的最佳配體，反之對HAmg 的配體而言聚糖13~15較聚糖6為佳，此顯示該配體結合位點內具有一可能的多價相互作用，或更多受體結合區暴露於較大的雙枝唾液酸糖苷(聚糖13和14)。有趣地，當其N-聚糖結構變得較不複雜時可實質上增加HA的結合力(第2B圖)。然而，對HAmg 的該KD,surf 值雖然顯示較強及類似至少數SA聚糖的結合力，但是其他HA變體對聚糖配體則呈現較弱及更具特異性的結合力(第2B和10圖)。因此，結合特異性及結合親和力具有一藉由受聚糖結構而調節的反向關係。此調節具有重要的生物學意義，其在HA上的糖可調節肺上皮細胞上聚糖受體的辨識程度。
歸因於受體唾液酸糖苷的結合能
動力學參數可被應用於熱力學參數以解釋分子內的相互作用。HA-聚糖相互作用的解離常數(KD,surf )可被用於計算結合力的Gibbs自由能變化(ΔGmulti )。ΔGmulti 為來自HA-聚糖相互作用之穩定能的定量測量值。系統性地降低HA上N-聚糖結構的複雜性/切割度與成功地降低ΔGmulti 有關(表2)。
表2顯示對於α2,3唾液酸糖苷1~15具有不同糖基化HA的熱動力學參數。其顯示對於α2,3唾液酸糖苷1~15之HA-聚糖相互作用的自由能變化(ΔG)和KD,surf 。藉由利用方程式ΔGmulti =-RTln (KD,surf -1 )可從KD,surf 值衍生出ΔG值。根據KD,surf 值計算出該ΔG值以獲得HA-聚糖結合鍵的自由能變化。未測定聚糖5和9的ΔG(HAfg )。ND代表未測定(*來自15個經鑑定HA-結合唾液酸糖苷，利用單因子ANOVA(P<0.05視為具有顯著性)表示四種HA糖型中之KD,surf 值的統計學上顯著性差異)。
HA變體之間在自由能變化(ΔΔG)上的差異係導因於獨特的聚糖結構(第10圖)，以及HAfg 和HAmg (ΔΔG HAfg →HAmg ；請看第10圖)之間具有最大的差異，此與修除大部N-糖基至單一GlcNAc時具有最大結合能差異的結果一致)。應注意除了聚糖4和7之外具有類似的ΔΔG值(第10圖)，此表示HA上聚糖對硫酸化α2,3三糖結合親和力無明顯影響(Chandrasekaran A等人(2008)Nat. Biotechnol . 26：107~113)。
HA受體的結合
藉由比較不同受體唾液酸糖苷間之自由能變化(ΔΔG值)的差異可說明HA-受體結合的分子細節(即貢獻自含有一聚糖受體的各結構成分)(第4和11圖)。詳細分析該負責HA結合之受體唾液酸糖苷的能量貢獻可揭露出用於設計新HA抑制劑之特異性的關鍵點。以β1,4(Galβ1~4)鍵結連接至半乳糖殘基的唾液酸糖苷α2,3比以Galβ1~3鍵結者具有較佳的結合親和力(Stevens J等人(2008)J. Mol. Biol . 381：1382~1394)。此可發現於Neu5Ac-α2,3-半乳糖(Neu5Acα2,3Gal)雙糖主鏈的比較(第4A圖，聚糖1，紅色箱形圖)，該三糖3和6僅在Gal和GlcNAc間鍵結上的差異。此處，全部HA變體的ΔΔG(1→3)為負(穩定化HA-受體相互作用)，反之全部HA變體的ΔΔG(1→6)為正(去穩定化HA-受體相互作用；第4A和11圖)。此觀察顯示Neu5Ac-α2,3Galβ1-4Glc/GlcNAc係與HA-結合袋相互作用的核心聚糖成分。此外，全部HA變體的ΔΔG(1→9)值為正，顯示在第三位置具有導因於β6-連接甘露糖的負擾動(第4A和11圖)。因此，結合能可受至遠端Neu5Ac-α2,3Gal雙糖配體之內糖殘基及其鍵結模式的影響(第4A圖)。此分析顯示在第三位置的一GlcNAc殘基有利於全部HA變體。然而，比較對聚糖13和14(第4E和11圖)至聚糖6的ΔΔG值，明顯呈現結合位點與雙枝唾液酸糖苷的多價相互作用，以及就HAmg 而言，此分子內親和力更強於第三糖結構效應所驅動的結合力。
接著，製備受體聚糖10、11、12和15。這些具有相同基本核心結構(聚糖8三糖)但是於第三位置具有不同伸長(聚糖11和12)或添加的α2,6唾液酸(聚糖15；第4B圖)。有趣的是該具有分枝α2,6唾液酸的唾液酸糖苷可大為增加HA親和力，反之延伸自聚糖8的較長α2,3唾液酸糖苷則具有較弱的HA結合力(ΔΔG(8→15)>ΔΔG(8→11)-ΔΔG(8→10)>ΔΔG(8→12)；第4B和11圖)。
聚糖3~5和6~7共用相同的三糖主鏈但在第三GlcNAc的非還原端上添加不同的硫酸基團(聚糖4)或岩藻糖殘基(聚糖5)。該硫酸基團可穩定化HA-受體聚糖相互作用高至2.044 kcal/mol(ΔΔG(6→7))，此為兩個受體唾液酸糖苷之間最大的能隙。全部HA變體之中，完全糖基化變體在自由能變化中具有最大差異，其值為ΔΔG(3→4)HAfg (-1.653 kcal/mol)和ΔΔG(6→7)HAfg (-2.044 kcal/mol)，以及更簡化的聚糖結構可獲得較低量的自由能；亦即HAfg >HAds >HAhm >HAmg 。因此，硫酸化聚糖可戲劇性地增強HA結合力，以及完全糖基化HA可最大化此對H5N1病因極為重要的效應(第4C和D圖)。另一方面，該岩藻糖化受體類似物大為降低糖基化HA變體的結合穩定度而呈現正ΔΔG(3→5)(第4C圖)。最大化硫酸根基團及岩藻糖立體塊之受體-結合袋內重要的結合相互作用將導致極大差異的ΔΔG(3→4)和ΔΔG(3→5)。由於移除唾液酸對結合具些微效應以及HAfg 對某些特定唾液酸化聚糖仍呈現強的親和力，因此HAfg 的弱結合力不似導因於其唾液酸化聚糖的競爭。
利用單糖基化HA設計疫苗
該單糖基化凝集素HAmg 與其完全糖基化副本比較顯示具有一類似次級結構以及對宿主受體具有較佳的結合親和力。近期研究亦指出至Asn的GlcNAc殘基為用於糖蛋白折疊和穩定化所需的最低N-聚糖成分(Hanson SR等人(2009)Proc. Natl. Acαd. Sci. USA 106：3131~3136)。由於對聚糖而言蛋白為優異免疫原，因此測試以該單糖基化HA作為對抗流感病毒的蛋白疫苗。比較來自HAfg 和HAmg 免疫抗血清之結合原始HAs及中和H5病毒的能力(第5圖)。事實上，與HAfg 對照之下，該來自HAmg 的抗血清顯示較強的病毒中和能力。該HAmg 抗血清除了H5亞型越南/1194,H5(安微)和H5(ID5/2005)之外亦結合至H1(New Caledonia /1999)(第5D圖)。值得注意的是，該HAmg 疫苗在一免疫試驗中較HAfg 疫苗更具有保護效果(第5C圖)。
第3圖中比較分離自人類之H1、H3和H5的胺基酸序列。當比較H1與H3以及H3與H5時，可觀察到全部以及接近N-糖基化位點之胺基酸序列的差異。H1和H5顯示全部胺基酸序列具有較高的類似度，以及接近N-糖基化位點具有更保留的序列。季節性(A/布里斯本/59/2007)和大流行(A/加州/07/2009)H1株顯示約具有79%的序列一致性。H1和H5之間的整體序列一致性為約63%，以及H3和H5、與H1和H3之間為約40%。此外，H1和H5之間的N-糖基化位點(示於第3圖的紅色箱形圖)和劃底線胜肽序列較H1/H3和H5之間更為保留。
本發明顯示HA上N-聚糖的系統性簡化可逐步增加對α2,3唾液酸糖苷但非α2,6唾液酸糖苷的結合力。發明者第一次指出HA之外和內聚糖對受體結合的效應以及定量性地分析HA-受體相互作用的結合親和力和能量貢獻。
HA糖基化作用影響流感HA的功能(Wagner R等人(2002)J. Gen. Virol. 83：601~609)。有趣的是，自從1968年由於增加流感H3N2上糖基化的程度，因此已降低病毒的罹患率、死亡率及肺部病毒力價(Vigerust DJ等人(2007)J. Virol. 81：8593~8600)。
在不侷泥於理論之下，發現附著至該糖基化位點之具有單一GlcNAc的HA顯示對α2,3唾液酸糖苷具有低特異性及較強的親和力而認為HA上的N-聚糖可造成接近該HA-受體結合區的立體障礙。對受體唾液酸糖苷的高特異性可避免病毒結合至位於人類肺上皮細胞表面上的其他特異性聚糖。另一方面，具有截斷聚糖的HA能以較高結合親和力及較低特異性辨認α2,3受體唾液酸糖苷，而認為減少HA上聚糖長度可能增加感染禽流感的危險。然而，仍不瞭解經由糖基化改變HA-受體的相互作用如何影響病毒的感染性以及病毒壽命中的NA活性。
具有單一GlcNAc的HA由於可保留HA的完整結構及可輕易地被製備(例如經由酵素)因此係一種用於流感的理想候選疫苗。其亦可暴露被大聚糖遮敞的保留性表位以誘發可辨認HA變體的較高力價免疫反應。此策略伴隨其他不同疫苗策略(Hoffmann E等人(2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102：12915~12920；Huleatt JW等人(2008)Vaccine 26：201~214；Scanlan CN等人(2007)J. Mol. Biol. 372：16~22；Yang ZY等人(2007)Science 317：825~828)以及HA-中和抗體的近期發現(Ekiert DC等人(2009)Science 324：246~251；Kashyap AK等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：5986~5991；Scheid JF等人(2009)Nature 458：636~640；Stevens J等(2006)Science 312：404~410；Sui JH等人(2009)Nat. Struct. Mol. Biol. 16：265~273)應有助於對抗病毒例如流感、C型肝炎病毒和HIV的疫苗開發而開啟一頁疫苗設計的新方向。
因此，測試具有單一GlcNAc的HA是否可作為流感的理想疫苗。就受益其與0.2~3唾液酸糖苷的強結合力而言，具有單一GlcNAc的HA可誘發辨認接近RBD區的較高力價免疫反應，顯示添加寡糖可為一種經由修飾或遮敝病毒上抗原表位以逃避免疫的有效方法。因此，移除大部分聚糖但保留至少單一GluNAc的策略為開啟未來疫苗設計的新方向，以及此概念有助於更深入瞭解其他抗病毒疫苗例如HCV、HBV和HIV的設計。其他迭代方法為保留具有二、三或更多聚糖的原始聚糖鏈。
以部分糖基化細胞表面糖蛋白作為疫苗
病毒的細胞表面糖蛋白為用於疫苗發展的極佳標的。然而，此類表面蛋白常被宿主高度糖基化以保護病毒免於宿主的免疫系統。此外，糖基化位點周圍的病毒蛋白序列通常被高度保留而因此成為用於疫苗設計的極佳抗原，然而，這些高度保留區域至少部分由於糖基化覆蓋數量或其阻斷區域而無法輕易地接近宿主的免疫系統。例如，限制成功製備對抗完整HIV疫苗的其一原因為病毒表面gp 120被高度糖基化。
該新疫苗更具免疫原性及預期該誘發的抗體具有對抗病毒和宿主所製造之完整糖蛋白的較佳中和活性。該抗體能攻擊很可能產生突變的低度或未糖基化區域以及較不可能突變及/或對突變較敏感的高度保留糖基化區域。如此產生的抗體由於此類抗體對蛋白較糖類具有高度親和力以及因而熱動力學地將推擠聚糖鏈離開與糖基化位點周圍之高度保留區的結合而將與標的蛋白部分相互作用。
在O-和N-連接的糖蛋白中，一級糖(N-糖蛋白的N-乙醯葡萄糖胺以及O-糖蛋白的N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺)為保留糖蛋白的三級結構所必需同時其餘的糖並不重要。以內切糖苷酶(endo H)處理N-糖蛋白將可移除糖鏈以及使該N-乙醯葡萄糖胺附著至該蛋白。甘露糖苷酶亦可被用於將N-糖蛋白切割成雙-或三聚糖，由於其可接近蛋白上保留糖蛋白位點甚至與雙-、三-和較大去糖基化蛋白之免疫系統的能力，因此其於此處被預期視為可能的疫苗。其他糖苷酶亦可被用於從O-糖蛋白移除糖鏈以及使該一級糖附著至該蛋白。
當以endoH處理表現於人類細胞內之來自禽流感(H5)的一完全糖基化血球凝集素(HA)以減少糖基化至一單糖基化狀態以及用於兔之免疫時，該產生的抗血清較產生自完全糖基化血球凝集素的抗血清具有更高的力價(第13A~13B圖)。其亦能中和來自其他禽流感株以及來自人流感之凝集素H1的血球凝集素，但是該來自完全糖基化HA的抗血清無法中和H1以及對該禽流感株而言更具特異性。
單糖基化H5抗血清能與H1產生交叉反應的可能原因為由於糖基化模式及H1和H5之間的相似性。利用兔抗血清獲得該資料(第13圖)。如第12~14圖所示，H3血球凝集素不具有如H5 HA對H1 HA相同程度的同源性。因此，產生自H1和H5的抗血清無法中和H3。然而，由於H3在保留區與H1和H5具有其他同源性，因此產生自去糖基化凝集素H3的抗血清除了凝集素H3之外可中和凝集素H1和凝集素H5。
製備單糖基化凝集素時，由於附著至該蛋白(即N-乙醯葡萄糖胺-蛋白)之具有最初三個糖(甘露糖-N-乙醯葡萄糖胺-N-乙醯葡萄糖胺)或僅具有單糖(N-乙醯葡萄糖胺)的糖蛋白在真核生物中具有高度保留性因此不需從人類細胞培養製造該糖蛋白。因此，可在酵母、桿狀病毒或其他真核宿主中製造該糖蛋白及以適當的糖苷酶例如用於N-連接糖蛋白的endoH或甘露糖苷酶處理該糖蛋白混合物以製備用作為疫苗的同質單糖基化蛋白。
在不侷泥於理論之下，假定N-連接聚糖較長於O-連接聚糖以及其為需被修剪以移除其餘糖鏈的N-連接聚糖。因此，該O-連接聚糖即使為完整亦不造成問題。
暴露至該免疫系統的一原始糖蛋白具有一N-連接分枝糖蛋白。由於該高度保留區的糖基化作用無法接近該免疫系統。因此，該免疫系統僅能靶向高度變異區，因而當該變異區產生突變時可降低生物體對多重病毒感染的敏感性。若該免疫系統能接近高度保留區時，則能引導抗體至這些不隨時間改變的序列而提供一種對抗病毒的接種途徑，該病毒具有突變的可變區及因而使現有抗體無法對抗該糖蛋白或被密實地糖基化而無法實質上接近該免疫系統。
因此，為使該蛋白能經由疫苗接近該免疫系統，移除該糖基化而暴露出原始病毒蛋白至該免疫系統。重要的是，從蛋白完全移除該糖已顯示會造成蛋白的變性；在許多病毒中的糖基化糖蛋白為至三級結構糖蛋白的關鍵組分。
藉由暴露經分離原始糖基化蛋白至N-糖苷酶如endoH或甘露糖苷酶以移除該糖，其將從該糖蛋白切斷全部除了第一、二或三個之外的糖而不使該蛋白失去其三級結構。然後該去糖基化蛋白與適當醫藥載劑被配製成疫苗並且被投與至一生物體。由於該高度保留糖基化區被去糖基化及暴露至該免疫系統因而產生對抗該高度保留區的抗體。
當病毒感染該經免疫生物體及該病毒糖蛋白暴露於免疫系統時，被引導至蛋白之高度保留區的該抗體因而存在於生物體的系統內。因此，由於抗體仍被引導至該糖蛋白的非突變保留區而與可變區的突變無關。
此外，由於降低該抗體結合至蛋白的熱動力學以及該糖被"推擠"而使該抗體結合至該高度保留區，因此糖基化無法阻擋抗體至該高度保留區的結合。重要的是，在病毒蛋白例如HIV之gp120中，此策略提供無法產生足夠抗體力價以有效對抗感染之免疫系統的一種用於接種之方法和組合物。
根據具體化這些原則的實施例中，一疫苗含有至少一種去糖基化凝集素以及一醫藥上可接受載劑。可利用表現糖基化蛋白的任何系統例如酵母和桿狀病毒製造該疫苗。一旦製出該蛋白，可利用適當方法例如凝膠電泳法、層析法或能分離蛋白的其他方法被分離。
幾近全部真核生物保留該糖蛋白位點的糖基化模式(GlcNAc-GlcNAc-Man)。因此，若保留最初1~3(可能更依賴被接種的生物以及產生該蛋白的生物)個糖時何種下游糖基化並不重要。因此，就人類疫苗而言，由於一旦除了第一至第三個糖之外全都被切斷時該模式與人類版糖蛋白的第一至第三個糖相同，因而可使用酵母製造該用於人類接種的蛋白。因此，本發明提供用於對抗病毒例如流感、HIV和黃熱病毒之高通量、高產量疫苗的一種獨特平台。
為生產該疫苗，分離該糖基化蛋白及然後利用一糖苷酶，或另一酵素或可選擇性地消化該糖而形成糖基化作用的方法(部分)去糖基化。然而，不論使用何種方法切斷該糖鏈其必需不影響劃底線蛋白的三級結構。
亦可利用合成方法製備該部分糖基化糖蛋白，或其片段。有兩種用於合成糖肽的方法：(i)逐步法：使用糖基化胺基酸作為固相合成的結構單元。此方法的優點為被"廣泛"用於製備各種的糖肽。此方法可製備具有一些寡糖基團的糖肽。(ii)收斂法：分開製備一寡糖基團或一胜肽基團，然後相互偶合。通常，此方法被用於製備N-糖肽。此方法需要用於胜肽基團內"糖基化點"的一特殊正交側鏈保護基。
在一具體實施例中，利用硫酯法合成連接至該胜肽之天冬胺酸殘基的N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)以構築該多肽片段(Merrifield RB；J .Am .Chem .Soc . 85：2149(1983))以及利用二甲基硫磷酸混合酐(Mpt-MA)法併入該糖肽基團(Guo ZW等人(1997)Angew .Chem .Int .Ed .Engl . 36：1464~1466)。
產生自單糖基化HA蛋白的交叉反應流感疫苗 (A)　接種季節性H1(布里斯本)單糖基化HA蛋白
利用一種血球凝集抑制檢測法偵測來自H1(布里斯本)接種的抗血清是否具有抑制NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)病毒凝集紅血球細胞的能力。如第15A圖所示，來自接種H1(布里斯本)之單糖基化HA(HAmg )的抗血清與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳抑制NIBRG-121(H1N1/2009)病毒凝集紅血球細胞的能力。
利用微量中和檢測法偵測來自H1(布里斯本)接種的抗血清是否具有中和NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)病毒感染MDCK細胞的能力。如第15B圖所示，來自H1(布里斯本)的單糖基化HA(HAmg )與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳中和NIBRG-121(H1N1/2009)病毒感染MDCK細胞的能力。
進行一種病毒攻毒試驗以證明接種來自H1(布里斯本)的單糖基化HA可對抗NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)病毒的攻毒。如第15C圖所示，單糖基化HA(布里斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)病毒的攻毒。對照之下，製造自不活化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對抗H1N1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)病毒感染的交叉保護能力。
第16A~16C圖顯示藉由產生自以單糖基化H1(布里斯本)HA作為抗原的抗血清可抑制WSN(H1N1)1933。第16A圖顯示其抑制WSN(H1N1)1933病毒凝集紅血球細胞的能力。第16B圖顯示抑制WSN(H1N1)1933病毒感染MDCK細胞的能力。第16C圖顯示其可保護BALB/c小鼠對抗WSN(H1N1)1933流感病毒的感染。該抗血清使用以布里斯本HA蛋白(5 ug)免疫的小鼠血清以及該攻毒病毒為WSN(H1N1)1933(100xLD50 )。
如第16A圖所示，來自接種H1(布里斯本)之單糖基化HA(HAmg )的抗血清與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳抑制WSN(H1N1)1933病毒凝集紅血球細胞的能力。如第16B圖所示，來自H1(布里斯本)的單糖基化HA(HAmg )與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳中和WSN(H1N1)1933病毒感染MDCK細胞的能力。如第16C圖所示，單糖基化HA(布里斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗WSN(H1N1)1933病毒的攻毒。對照之下，製造自不活化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對抗WSN(H1N1)1933病毒感染的交叉保護能力。
第17A~17C圖顯示藉由產生自以單糖基化H1(布里斯本)HA作為抗原的抗血清可抑制A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8。第17A圖顯示其抑制PR8病毒凝集紅血球細胞的能力。第17B圖顯示其抑制PR8病毒感染MDCK細胞的能力。第17C圖顯示其可保護BALB/c小鼠對抗PR8流感病毒的感染。該抗血清使用以布里斯本HA蛋白(5 ug)免疫的小鼠血清以及該攻毒病毒為PR8(100xLD50 )。
如第17A圖所示，來自接種H1(布里斯本)之單糖基化HA(HAmg )的抗血清與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳抑制PR8病毒凝集紅血球細胞的能力。如第17B圖所示，來自H1(布里斯本)的單糖基化HA(HAmg )與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳中和PR8病毒感染MDCK細胞的能力。如第17C圖所示，單糖基化HA(布里斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗PR8病毒的攻毒。對照之下，製造自不活化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對抗PR8病毒感染的交叉保護能力。
(B)接種新型H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)單糖基化HA蛋白
分離及修飾用於如實施例1所述之表現的流感H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)HA編碼序列。表3顯示經修飾2009年大流行A(H1N1)疫苗株H1/HA del-TM-FH6的序列其訊號肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶切割點，該噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His-標簽被劃底線，以及該連接序列為粗體字和被劃底線。
利用一種血球凝集抑制檢測法偵測來自H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)接種的抗血清是否具有抑制WSN(H1N1)病毒凝集紅血球細胞的能力。如第18A圖所示，來自接種H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)之單糖基化HA(HAmg )的抗血清與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳抑制WSN(H1N1)病毒凝集紅血球細胞的能力。
利用微量中和檢測法偵測來自H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)接種的抗血清是否具有中和WSN(H1N1)病毒感染MDCK細胞的能力。如第18B圖所示，來自H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)的單糖基化HA(HAmg )與完全糖基化HA(HAfg )和未糖基化HA(HAug )相比證明具有較佳中和WSN(H1N1)病毒感染MDCK細胞的能力。
利用一種病毒攻毒試驗以證明接種來自H1(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)的單糖基化HA可對抗WSN(H1N1)1933或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8病毒的攻毒。單糖基化HA(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗WSN(H1N1)或PR8病毒的攻毒。對照之下，製造自不活化病毒之傳統流感疫苗的完全糖基化HA顯示無對抗WSN(H1N1)或PR8病毒感染的交叉保護能力。
來自其他流感病毒株的部分糖基化(例如單糖基化)HA可被用於配製有效預防或降低一或多種流感病毒株或亞型感染的強效疫苗。分離及修飾用於如實施例1所述之表現的流感HA編碼序列。選殖該HA以及表現於一真核表現系統內然後進行去糖基化以保留一至三個糖基(較佳為單糖基化)於糖基化位點。
表4顯示經修飾H1 A del-TM-FH6的共有序列其訊號肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶切割點，該噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His-標簽被劃底線，以及該連接序列為粗體字和被劃底線。
表5顯示經修飾H1-C del-TM-FH6的共有序列其訊號肽序列被劃底線及加粗體字，斜體字為凝血酶切割點，該噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列和His-標簽被劃底線，以及該連接序列為粗體字和被劃底線。
產生自本發明去糖基化HA胜肽的疫苗具有對抗呼吸道病毒的抗病毒活性，包括呼吸融合病毒(RSV)和各型流感病毒例如A型和B型流感病毒。本發明的抗病毒胜肽具有對抗許多流感病毒株的有益抗病毒活性，包括季節性、禽(例如H5N1株)和豬流感病毒。根據此處揭示的一些方法可預防或治療被這些病毒感染造成的疾病。
(C)H1/HA蛋白上的糖基化位點
該流感H1 HA分子具有四個不同的抗原區：Sa、Sb、Ca和Cb(LuohSM等人(1992)J. Virol. 66：1066~1073)。這些位置包括自從1918年浮現以來已產生抗體介導免疫需求之季節性人類H1N1病毒的HA分子內大部分可變胺基酸。
利用凝集抑制(HI)檢測法及接種/攻毒試驗，已證明2009年大流行H1N1病毒的抗原性類似流行於1918~1943年的人類H1N1病毒以及傳統豬H1N1病毒。已發現對抗類1918年或傳統豬H1N1疫苗的抗體可完全保護C57B/6小鼠對抗流感A/紐西蘭/602/2009分離病毒的致死性攻毒。增加對抗1918或A/加州/04/2009 HA蛋白之交叉反應單株抗體(mAbs)的被動免疫已發現可提供降低死亡率的完全保護作用。藉由2009H1N1病毒篩選所產生之mAb抗體逃避突變株的分析指出抗原區Sa係其中一保留交叉保護表位(Manicassamy B等人；PloS Pathogens 2010年1月/第6卷/第1期/e1000745)。
藉由HA結構的同源模擬法已顯示2009 H1N1和1918大流行病毒的HAs在已知抗原位點具有大量的共同胺基酸殘基，而認為兩種用於中和抗體交叉反應的HAs具有共同表位(Igarashi M等人；PloS ONE 2010年1月/第5卷/第1期/e8553)。存在於HA上Asn177殘基的一可能糖基化位點係在該抗原性保留Sa區內(請看第19圖)。使用攜帶在布里斯本H1之HA內之Asn177糖基化位點的突變蛋白免疫小鼠。測定對抗NIBRG-121的交叉保護作用。
來自接種攜帶來自H1(布里斯本)Asn177突變之單糖基化HA(HAmg )的抗血清與在Asn177攜帶突變之完全糖基化HA(HAfg )和在Asn177攜帶突變之未糖基化HA(HAug )比較證明具有抑制NIBRG-121病毒凝集紅血球細胞的能力。來自H1(布里斯本)在Asn177攜帶突變的單糖基化HA(HAmg )與在Asn177攜帶突變之完全糖基化HA(HAfg )和在Asn177攜帶突變之未糖基化HA(HAug )比較證明具有較佳中和NIBRG-121病毒感染MDCK細胞的能力。單糖基化HA(布里斯本)疫苗可保護BALB/c小鼠對抗NIBRG-121病毒的攻毒。對照之下，在Asn177攜帶突變之完全糖基化HA顯示低或無對抗NIBRG-121病毒感染的交叉保護能力。
此處"治療活性"或"活性"指其與人類，或與非人類哺乳動物或其他屬或生物中所欲治療效果一致的活性。可於體內或體外測定該治療活性。例如，可於細胞培養內檢測該所欲效力。
根據本發明揭示之疫苗的"抗病毒活性"指疫苗被接種生物體內所產生的一免疫反應，其中該免疫反應足以預防或改善與病毒感染有關例如一流感病毒的全面性病毒感染及/或症狀。產生自本發明揭示之去糖基化HA胜肽的疫苗證明具有利於對抗流感病毒的顯著抗病毒活性。此處"顯著抗病毒活性"可藉由與病毒模擬治療樣本比較該疫苗抑制至少約50%的病毒性凝集作用被測定。在某些具體實施例中，該抗病毒胜肽當與病毒模擬治療樣本比較時可抑制至少約60%的病毒凝集作用，更佳為至少約70%，更佳為至少約80%，更佳為至少約90%，以及更佳為至少約95%。
證明抗病毒組合物對病毒複製之抑制效應的方法已為技術中所習知。可於實驗動物內證明本發明作為抗病毒劑之疫苗的治療效果，例如利用小鼠模式(請看例如Jones等人；J. Virol. 2006第80卷第24號第11960~11967頁)。此外，本發明藥理上活性肽的治療效果可經由本領域中習知的技術被呈現於人類。
本發明的中和抗體可被附加地用作為流感A病毒抗原決定區之抗原表位測定的一種工具，以及被用於疫苗的發展。事實上，如下列實施例所述，發明者已於此處鑑定出數種可被用於引導疫苗設計的廣效反應性中和抗體。
因此，本發明的中和抗體可被用於篩選可被抗體結合之中和表位功能性模擬肽的胜肽或多肽，亦即其可被發展成對抗A型流感病毒感染的疫苗。在一具體實施例中，本發明提供一種有效對抗A型流感病毒的疫苗，其含有可被此處所述抗體結合之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多肽。在一具體實施例中，該疫苗含有可結合一血球凝集素(HA)抗原結合抗體之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多肽。在另一具體實施例中，該疫苗可被合成。在其他具體實施例中，該疫苗含有：(i)一減毒A型流感病毒，或其一部分；或(ii)一死毒A型流感病毒，或其一部分。在一其他具體實施例中，該疫苗含有可結合一血球凝集素(HA)抗原結合抗體之中和表位功能性模擬肽的一胜肽或多肽。該HA抗原可為H5亞型或H1亞型。在另一具體實施例中，該HA抗原被展示於A型流感病毒的表面。
流感病毒疫苗
流感H5 HA的N-糖基化位點序列被高度保留。該H5 HA具有原型序列N-X-(S/T)的總共15個N-糖基化位點。各單體於位置N27、N39、N170、N181和N500具有5個N-糖基化位點。HA結構上的聚糖可影響宿主受體的結合。H5 HA於位置39、127、170、181和500具有糖基化位點。
可利用流感病毒任何表面蛋白的部分糖基化版產生本發明的疫苗，包括HA、NA和M2。該A型流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白被呈現於其表面。A型流感病毒M2蛋白係一種97個胺基酸的整合膜蛋白，其被表現於具有18至23個胺基酸殘基之細胞外N-端區、約19個殘基之內部疏水區以及54個殘基之C-端胞質區的感染細胞表面Zebedee SL等人；J. Virol. ；1988年8月；62(8)：2762~2772)。
此外，藉由改變於N-或O-糖基化位點上用作為抗原蛋白的糖基化模式可產生該部分糖基化流感蛋白。
在另一具體實施例中，該疫苗的胜肽或多肽含有提高A型流感病毒中和抗體的抗原決定區。
在一更常見的態樣中，該包括但不侷限於抗體的中和分子被有效用於預防或治療病毒感染。因此，本發明的中和分子被用於免疫療法，例如利用一或多種此類分子的被動免疫，以及被用於發展針對該病毒抗原靶標的疫苗。
本發明提供用於預防和治療禽流感中和病毒感染的疫苗組合物。雖然在80年前已知免疫血清的被動免疫可用於預防感染(Luke,T.C.等人、Kilbane E.M.、Jackson J.L.和Hoffman S.L.(2006)Ann. Intern. Med. 145：599~609)，但是最近單株抗體的研究亦極具價值(Hanson,B.J.等人(2006)Respir. Res. 7：126；Huang,C.C.等人(2004)Proc. Nat. Acad. Sci. 101：2706~2711；Simmons C.P.等人(2007)Plos Med. 4/e178)。例如，Hanson等人指出一針對H5N1病毒的單株抗體於接種三天之後的小鼠即具有防止致死性感染的保護(Hanson,B.J.等人(2006)Respir. Res. 7：126)。
基於毀滅性大流行的可能性，已建議政府應保持例如此處所述中和抗體的庫存。已成功地被分離自對抗病毒感染之個體的純人源化抗體具有其價值。然而，即使已庫存此類的抗體，但是若編碼抗體結合表位的基因產生突變，則可能降低該抗體的效力。同樣，已有一些證據顯示細胞免疫可能加速該病毒的清除。儘管如此，若僅利用該被動免疫效應降低感染嚴重性，則必需於此時間點使用其他免疫效應細胞，其對於降低患有免疫不全、心血管疾病、呼吸道系統疾病和老年的病人而言極為重要。被動免疫可預防對抗病毒快速增殖的細胞活素風暴(cytokine storm)，其在1918年流感爆發期間甚至發生於健康的年輕成人。
呼吸道融合病毒(RSV)疫苗
人類呼吸道融合病毒(RSV)係一種導致呼吸道感染的病毒。其主要造成下呼吸道的感染以及嬰兒和孩童的院區感染。RSV係一種副黏液病毒科以及肺炎病毒屬的封套RNA病毒。目前無可使用的疫苗。
RSV病毒粒子含有三種表面糖蛋白F、G和SH(微疏水性)。於病毒表面的F蛋白造成細胞附近之細胞膜的融合而形成融合細胞(syncytia)。F(融合)和G(附著)糖蛋白的病毒必需進入細胞內以及其亦決定抗體的反應。已闡明RSV的構造和組合物以及詳述於Knipe,D.M.等人編輯"臨床病毒學 "教科書，Lippincott Williams ＆ Wilkins紐約(2001)，特別指第45章第1443~1485頁，Collins,P.、Chanock,R.M.和Murphy,B.R.所著的"呼吸道融合病毒"一章。
具有33 kDa未糖基化的RSV G蛋白當被完全糖基化(N-和O-連接糖基化)時約為90 kDa。F和G蛋白存在於RSV感染細胞表面上的蛋白複合物(Low K.W.等人,Biochem .Biophys .Res .Comm . 366(2)：2008,308~313)。
表6指出RSV糖蛋白G的序列具有劃底線的可能N-糖基化位點。
部分去糖基化RSV糖蛋白F和G可被用作為更有效的RSV疫苗。
黃熱病毒疫苗
黃熱病毒係屬於黃熱病毒科(Flαviviridae )。黃熱病毒係利用節肢動物例如蚊蟲傳播至其他脊髓動物宿主的小型、封套RNA病毒，以及包括黃熱病(YFV)、西尼羅河病毒(WNV)、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒(JE)和登革熱2病毒(Weaver SC、Barrett AD,Nat. Rev. Microbiol. 2：789~801,2004)。黃熱病毒由三種結構蛋白所構成：核心核殼蛋白C以及封最糖蛋白M和E。糖蛋白E係一種介導受體結合及融合的第II類病毒融合蛋白。第II類病毒融合蛋白被發現於黃熱病毒和阿爾發病毒。
糖蛋白E包含三種區域：區域I(雙聚合區)係一8-股β桶狀、區域II(中心區)係一由12個β股和2個α螺旋組成的延伸區，以及區域III(類免疫球蛋白區)係一具有10個β股的IgC-樣模塊。區域I和II為相互纏繞。
病毒表面上的該495 AA糖蛋白E雙聚體當暴露於低pH時不可逆地再聚集成融合三聚體，其如同內質體於酸性環境內所發現者。三聚體的形成導致造成暴露區域II頂部融合肽環的構型改變，其為藉由插入膜內以促使細胞膜和病毒套膜相互接觸之融合步驟所必需(Modis Y等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,100：6989~91；2003)。
登革熱病毒封套蛋白(E)在Asn-67和Asn-153含有兩個主要N-連接的糖蛋白位點。在大部分黃熱病毒保留於位置153的糖基化位點，同時位置67的位點為登革熱病毒所特有。黃熱病毒E蛋白上的N-連接寡糖側鏈與病毒形態形成、感染性和趨向性有關。登革熱病毒於位置67缺少N-糖基化而顯示降低對人類細胞的感染性(Mondotte JA等人,J. Virol. 81(3)：7136~7148(2007))。
表7指出該登革熱病毒糖蛋白E的序列具有在N-67和N-153劃底線的可能N-糖基化位點。
因此，登革熱病毒糖蛋白E的部分去糖基化可被用於更有效地產生和廣泛對抗黃熱病毒的疫苗。第21A~B圖所述模式中顯示獲得的登革熱3型病毒E蛋白雙聚體的部分去糖基化。第21B圖顯示單糖基化登革熱E蛋白。
C型肝炎病毒(HCV)為人類輸血後感染及社區非A、非B型肝炎感染的主要病原菌，其大約感染1%的全世界人口。HCV係黃熱病毒屬中的一員，其包括黃熱病毒和瘟疫病毒(Miller RH和Purcell RH,Proc. Natl. Acad. Sci . USA 87：2057~2061；1990)。
該C型肝炎病毒(HCV)基因組編碼兩個膜相關封套糖蛋白(E1和E2)，其相互作用而形成一非共價鍵異源二聚複合體。HCV糖蛋白E1和E2被N-連接糖基化所高度地修飾。視HCV基因型該E1蛋白由192個胺基酸所組成以及含有5至6個N-糖基化位點。視HCV基因型該E2蛋白由363至370個胺基酸所組成以及含有9~11個N-糖基化位點(Maertens G和Stuyver L,C型肝炎病毒的基因型和基因變異於：病毒性肝炎的分子醫學 ；Harrison T.J.和Zuckerman A.J.編輯,1977)。
一項最近的研究披露當以內切糖苷酶H部分糖基化時僅利用分別在HCV糖蛋白E1之胺基酸位置196、209、234、305和325的五個可能糖基化位點中的四個。於位置N2(196)和N3(234)的突變在組合E1E2複合體上僅具有此微的效應，反之於位置N1(196)以及主要於位置N4(305)的突變可戲劇性地降低形成非共價鍵E1E2複合體的效率(Meunier J.C.等人,J. Gen. Virol. (1999)80：887~896)。
表8指出C型肝炎分離HC-J6封套糖蛋白E1的序列在劃底線的位置196、209、234、305和325具有可能的N-糖基化位點。
因此，HCV糖蛋白E1和E2的部分去糖基化可被用於更有效地產生和廣泛對抗HCV的疫苗。
人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗
人類免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2及相關猿猴免疫缺陷病毒(SIV)可造成其各自宿主的CD4+ 淋巴球破壞，此將導致形成後天免疫缺乏症候群(AIDS)。HIV藉由病毒封套糖蛋白的介導進入宿主細胞內，其被組織成展示於病毒粒子表面上的寡聚合或可能三聚合的棘突。這些封套複合體藉由gp41跨膜封套糖蛋白被錨固於病毒套膜內。棘突的表面主要係由外部封套糖蛋白、gp120，聯合各次單位三聚合gp41糖蛋白複合體的非共價鍵相互作用所組成。
人類免疫缺陷1型(HIV-1)封套的gp120和gp41糖蛋白添加天冬胺酸鹽(N)-連接多糖鏈(即聚糖)不僅為校正蛋白折疊所必需，亦可提供對抗中和抗體作為"聚糖屏障"的保護作用(Wei X等人,Nature 422：307~312,2003)。代表病毒與宿主環境之間主要介面之人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)封套的表面糖蛋白(gp120)係目前已知最高度被糖基化的蛋白，其接近一半的分子量歸因於添加N-連接聚糖(Allan JS等人,Science 228：1091~1094,1985)。HIV-1封套的跨膜糖蛋白(gp41)亦被糖基化，但較低的糖化程度。添加N-連接聚糖為HIV-1 gp120被折疊成可結合至CD4受體的適當構形所必需，以及影響另類輔助受體CXCR4和CCR5的結合，該結合效應可介導融合及HIV-1進入宿主細胞內。
由於許多N-連接聚糖係HIV-1封套的高度保留成分，其本身可提供用於中和抗體的一理想標的。該廣效中和性人類單株抗體2G12結合至一含有附著至該gp120糖蛋白之N-連接聚糖的表位(Trloka A等人,J. Virol. 70：1100~1108,1996)。N-連接糖基化位點已被實驗室地刪除或修飾的HIV-1株對中和作用變得更為敏感(Koch等人,2003Virology 313：387~400)。
成熟gp120含有24個用於N-糖基化的可能位點，其辨識序列為Asn-Xaa-Ser/Thr(Kornfeld和Kornfeld,Ann. Rev. Biochem . 54：631~664,1985)。表9指出HIV-1 HXB2序列內的24個位點。劃底線者為可能的N-糖基化位點。
在HIV-1跨膜糖蛋白gp41中，該保留糖蛋白位點位於Asn621、Asn630和Asn642。
因此，HIV封套蛋白gp120或跨膜蛋白gp41的部分去糖基化可被用於更有效地產生和廣泛對抗黃熱病毒的疫苗。所形成的部分去糖基化HIV gp120蛋白三聚體示於第20A~B圖所描述的模型中。第20B圖顯示單糖基化HIV gp120蛋白三聚體。
製造部分糖基化細胞表面糖蛋白的方法
如同慣用的自動寡核苷酸合成儀，藉由例如化學方法直接合成該片段可輕易地製備本發明的多核苷酸，或其片段或變異株。同樣，藉由運用核酸複製技術例如美國專利案4,683,202的PCRTM 技術以及藉由分子生物學領域中技術者一般已知的其他重組DNA技術將選取序列導入重組製造用的重組載體。
本發明提供含有本發明一核酸的載體和宿主細胞，以及用於製造本發明之多肽的重組技術。本發明的載體包括能複製於任何類型細胞或有機體內者，包括例如質體、噬菌體、黏質體(cosmids)，以及迷你染色體。在各種具體實施例中，含有本發明一多核苷酸的載體為適合用於傳播或複製多核苷酸的載體，或適合用於表現本發明之多肽的載體。此類載體為技術中所習知以及可取得自市售商品。
可結合全部或部分合成的本發明多核苷酸，然後利用習知分子和細胞生物學技術插入一載體內，包括例如利用適當限制位點和限制酶次選殖該多核苷酸進入一線性化載體內。藉由聚合酶鏈鎖反應利用與多核苷酸各股互補的寡核苷酸引子擴增本發明的多核苷酸。這些引子亦包括易於次選殖入一載體的限制酶切割位點。該可複製載體通常包括，但不侷限於一或多種下列的成分：一信號序列、一複製起點，以及一或多種標記或選擇基因。
為表現本發明的多肽，編碼該多肽或功能相等物的核苷酸序列被插入一適當的表現載體，即含有用於轉錄和轉譯該插入編碼序列所需元件的載體。利用本領域技術者所習知的方法構建含有編碼重要多肽及適當轉錄和轉譯控制元件之序列的表現載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術，以及體內基因重組。此類技術已述於例如Sambrook J等人(1989)Molucular Cloning實驗室手冊 ，紐約Plainview市冷泉港出版及Ausubel F.M.等人(1989)現行分子生物學實驗手冊 ，John Wiley ＆ Sons，紐約紐約市。
可利用許多表現載體/宿主系統被含於及表現多核苷酸序列。這些包括，但不侷限於微生物例如以重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體轉殖的細菌；以酵母表現載體轉殖的酵母；感染病毒表現載體(桿狀病毒)的昆蟲細胞系統；以病毒表現載體(例如花椰菜鑲嵌病毒、CaMV、菸草鑲嵌病毒、TMV)或以細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉殖的植物細胞系統；或動物細菌系統。
已知為真核生物的任何啟動子序列均可被用於本發明。實際上全部真核細胞基因具有位於從轉錄起始位點上游約25至30個鹼基的一富含AT區。許多基因轉錄起始位點上游70至80個鹼基的另一序列係一CNCAAT區，該N為任何的核苷酸。大部分真核細胞基因的3'端係一AATAAA序列，其可為將聚A尾部加至該編碼序列3'端的信號序列。全部這些序列適合被插入真核細胞表現載體內。
在哺乳動物細胞系統中，通常較佳為使用來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。若此類啟動子與宿主細胞相容時，可藉由例如獲得自病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒以及最佳為猴病毒40(SV40)之基因組的啟動子；來自異源哺乳動物啟動子如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白的啟動子，及來自熱休克蛋白的啟動子控制哺乳動物宿主細胞內表現載體的多肽。若需產生含有編碼一多肽的多複本序列時，較佳為使用具有一適當選擇標記之根據SV40或EBV的載體。適當表現載體的一實施例為pcDNA-3.1(加州Carlsbad市Invitrogen公司)，其包括一CMV啟動子。
許多的病毒表現系統可用於表現哺乳動物的多肽。例如，在使用腺病毒作為一表現載體時，編碼標的多肽的序列可被接合入由晚期啟動子和三聯前導序列所組成的一腺病毒轉錄/轉複合體內。插入病毒基因組的一非必需E1或E3區可被用於獲得在感染宿主細胞內能表現該多肽的一活病毒(Logan,J.和Shenk,T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci . 81：3655~3659)。此外，轉錄增強子例如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子可被用於增強哺乳動物宿主細胞內的表現。
在細菌系統中，視表現多肽的用途選擇許多表現載體中的任一種。例如，當需要大量時，使用易於純化之可高度表現融合蛋白的載體。此類載體包括，但不侷限於多功能大腸桿菌選殖和表現載體如BLUESCRIPT(Stratagene)，該編碼重要多肽的序列可被接合入具有β-半乳糖苷酶之胺基端Met和子序列7殘基序列框內的載體，因而可產生一雜合蛋白；pIN載體(Van Heeke,G和S.M. Schuster(1989)J .Biol .Chem . 264：5503~5509)；及其類似物。亦可以麩胱苷肽S-轉移酶(GST)使用pGEX載體(威斯康辛Madison市Promega公司)表現作為融合蛋白的外源多肽。通常，此類正合蛋白為水溶性以及藉由吸附至麩胱苷肽-瓊脂珠接著於存在游離麩胱苷肽下的透析可輕易地從裂解細胞被純化。此類系統製造的蛋白質被設計成包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶斷裂位點，因而可從任意的GST基團釋出該經選殖的重要多肽。
在釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )中，使用許多含有組成型或誘導型啟動子例如α因子、醇氧化酶和PGH的載體。其他用於酵母宿主之適當啟動子序列的實施例包括磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶的啟動子，例如烯醇酶(enolase)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶，及葡萄糖激酶。就評論而言請看Ausubel等人(同上)和Grant等人(1987)Methods Enzymol . 153：516~544。其他酵母為具有生長條件控制轉錄之附加優點的誘導型啟動子包括用於醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之降解酵素、金屬硫蛋白(metallothionein)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用之酵素的啟動子區。用於酵母表現的適合載體和啟動子進一步說明於EP 73,657。在酵母中糖基化HCV表面蛋白的表現已揭示於WO 96/04385。酵母增強子亦有利地與酵母啟動子共同使用。
在使用植物表現載體的實例中，可藉由任何數目的啟動子驅動編碼多肽之序列的表現。例如，可單獨使用病毒啟動子例如CaMV的35S和19S，或結合來自TMV的ω前導序列(Takamatsu,N.(1987)EMBO J. 6：307~311)。或者，使用植物啟動子例如小亞單位RUBISCO或熱休克啟動子(Coruzzi,G.等人(1984)EMBO. J. 3：1671~1680；Broglie,R.等人(1984)Science 224：838~843；以及Winter,J.等人(1991)Results Probl. Cell Differ. 17：85~105)。這些構體可藉由直接DNA轉殖或病原介導轉染被導入植物細菌。此類技術已述於許多常見的文獻中(請看例如Hobbs,S.或Murry,L.E.於McGraw Hill科學和技術年鑑 (1992)紐約州紐約市McGraw Hill第191~196頁)。
亦使用一種昆蟲系統表現一標的多肽。例如，在一此類系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)作為秋黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞或擬尺蠖幼蟲(Trichoplusia larvae)內表現外來基因的載體。編碼該多肽的序列被選殖入該病毒的一非必需區如多角體蛋白(polyhedrin)基因，然後受到多角體蛋白啟動子的控制。成功插入該多肽編碼序列使該多角體蛋白基因不活化及產生缺乏外鞘蛋白的重組病毒。該重組病毒然後被用於感染例如表現該標的多肽的秋黏蟲細胞或擬尺蠖幼蟲(Engelhard,E.K.等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. 91：3224~3227)。
藉由控制各種糖苷酶組合的用途完成重組表面糖蛋白的部分去糖基化，例如以神經胺酸酶移除唾液酸、以α-1-甘露糖苷酶(Sigma)切斷外部甘露糖殘基，或以可有效地切斷N-連接高甘露糖和複合聚糖之內F-N聚糖酶(德國Mannheim市Boehringer Mannheim生物化學公司)的處理。
藉由併入常用於胜肽合成的方法例如胺基酸殘基及/或胜肽片段偶合的傳統溶液以及必需的固相技術合成本發明的HA胜肽。可使用技術中習知的任何方法合成該胜肽，例如Schroeder和Lubke於"The Peptides "第1卷校園版紐約州紐約市第2~128頁(1965)；"The Peptides：分析 、合成 、生物學 "(E. Gross等人編輯)校園版紐約州紐約市第1~8卷(1979~1987)；Stewart和Young於"固相胜肽合成 "第2版,Pierce Chem. Co.,Rockford,I11(1984)；Wild等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89：10537(1992)；以及Rimsky等人,J. Virol. ,72：986(1998)；Chan ＆ White於"Fmoc固相胜肽合成：實踐入門 ",牛津大學出版(2000)。在一些具體實施例中，可利用糖基化胺基酸合成該糖肽而使糖基化胺基酸如GlcNAc-Asn(加州Covington市V-Labs)被併入該胜肽的適當糖基化位點。
本發明所揭示的疫苗可藉由局部、鼻內或腸道外如經由皮下注射、肌肉內注射、靜脈注射、腹腔內注射或皮內注射至溫血動物如人、馬、其他哺乳動物等的投藥被用作為一抗病毒劑。可單獨或混合使用該抗病毒肽。此外，可單獨投與該抗病毒肽或作為進一步含有一或多種醫藥上可接受載劑之組合物的一部分，其混合比例視該胜肽的溶解度及化學性質、所選擇投藥和標準生物學投藥途徑而定。由於本發明的胜肽可靶向病毒及/或細胞表面的蛋白以確保其藥效，因此於此類調配物內的載劑必需不含或實質上無(例如濃度高於90、95、98或99重量%)結合至該胜肽的蛋白。
醫藥組合物
根據另一態樣，本發明揭示的疫苗和去糖基化蛋白可被含於醫藥或醫用營養組合物或含有熟習本領域技術者詳讀本揭示時能辨識之其他活性劑、載劑、載體、佐劑、賦形劑或助劑的配製物內。
本發明所揭示的疫苗將有利地包含有效佐劑量的一佐劑肽。如熟習本領域之技術者所瞭解，佐劑肽或胜肽的最適濃度需視所使用特定胜肽、病人的特性、所使用的免疫原，以及尋求治療或預防之病毒感染性質而定。熟習本揭示之醫學和藥學領域的技術者可輕易地判定這些因素。通常，該佐劑肽最佳為投與可產生不導致任何有害或有毒副作用之佐劑活性的濃度。一般而言，較佳為一有效佐劑量。一有效佐劑量指對一經投與免疫原能產生免疫反應的佐劑肽數量。
本發明組合物內所含的適合佐劑包括技術中所習知者，例如非用於人類的佛氏完全佐劑(CFA)、佛氏不完全佐劑(IFA)、角鯊烯、角鯊烷、明礬和各種的油類，其全部已為技術中所習知並且可供應自市售的許多來源，例如來自諾華藥廠(如MF59佐劑)。
該醫藥或醫用營養組合物較佳為含有至少一種醫藥上可接受載劑。在此類醫藥組合物中，該疫苗或去糖基化蛋白所形成的"活性化合物"亦被稱為"活性劑"。此處所述的"醫藥上可接受載劑"包括醫藥上可相容的溶劑、分散介質、塗料、抗菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑等。補充活性化合物亦可被併入該組合物內。根據所欲的投藥途徑配製一醫藥組合物。投藥途徑的實施例包括腸道外例如靜脈內、皮內、皮下、口服(如吸入)、經皮(局部)、經黏膜，以及直腸投藥。用於腸道外、皮內或皮下投藥的溶液或懸浮液包括下列的成分：滅菌稀釋液例如注射用水、食鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇，或其他合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如四醋酸乙二胺(EDTA)；緩衝劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用於調節張力的物質例如氯化鈉或右旋糖。可利用酸或鹼調節pH，例如鹽酸或氫氧化鈉。該腸道外製劑可被置於玻璃瓶、拋棄式針筒，或玻璃或塑膠製成的多劑量瓶內。
用於含胜肽組合物的適當醫藥上可接受載劑已述於標準藥理教科書中。請看例如"雷明登製藥科學 "第18版，賓州Easton市Mack出版公司(1990)。適當醫藥上可接受載劑的特殊非限制性實施例包括水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其組合。此外，若需要時該組合物可進一步含有微量的輔助物質例如濕潤劑或乳化劑、可加強組合物之抗病毒效果的pH緩衝劑。
此處的生物體指人類以及非人類靈長類(例如大猩猩、獼猴、絹猴)；牲畜動物(例如羊、牛、馬、驢和豬)；伴侶動物(例如犬、貓)；實驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)；野生動物(例如狐、鹿)；以及可受益於本發明製劑的任何其他生物。受益於本發明所揭示的製劑並非限制於任何類型的動物。一生物體不論其為人類或非人類生物均可被稱為一患者、個體、動物、宿主，或接受者。
就腸道外投藥而言，本發明所揭示的胜肽或其所產生的疫苗可單獨或結合其他醫藥上可接受載劑經由靜脈內、皮下、肌肉內、腹腔內或皮內注射被投藥。就藉由注射投藥而言，較佳為使用滅菌水性載劑溶液內的抗病毒肽其亦可含有其他溶質例如緩衝劑或防腐劑以及產生等張溶液的足量醫藥上可接受鹽或葡萄糖。本發明揭示的抗病毒肽可被製成技術中習知的治療上可接受鹽型。
適合注射用的醫藥組合物包括滅菌水溶液(可溶於水)或用於臨時製備滅菌可注射溶液或分散液的分散和滅菌粉末。就靜脈內投藥而言，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(紐澤西州Parsippany市BASF公司)或磷酸鹽緩衝液(PBS)。在任何情況下，該組合物必需為無菌並且為可注射液體。其必需穩定存在於製造和儲存條件下以及被保存於無微生物例如細菌和真菌污染的環境。該載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)，及其適當混合物的溶劑或分散介質。
可藉由例如利用塗佈如卵磷脂、藉由維持分散體的所需粒徑以及藉由使用表面活性劑維持適當的流動性。預防微生物的污染可藉由加入各種抗菌和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫枊汞鈉(thimerosal)等。在許多情況下，該組合物較佳為含有等張劑，例如糖；聚合醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。延長可注射組合物的吸收可藉由將可延遲吸收的例如單硬脂酸鋁和明膠加入組合物內。
滅菌可注射溶液的製備可藉由將所需量的活性組合物併入含有上述其一列舉成分或其組合的適當溶劑內，需要時繼之以過濾滅菌。通常，分散液的製備可藉由將活性化合物併入含有一鹼性分散介質和上述列舉所需其他成分的一滅菌載劑內。在以滅菌粉末製造滅菌可注射溶液的實例中，其製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥所產生的活性成分粉末加上來自其先前滅菌過濾溶液的任何其他所需成分。
疫苗亦可被口服投藥。口服組合物通常含有一惰性稀釋劑或一可食用載劑。就口服治療的投藥目的而言，該活性化合物可併入賦形劑及被製成錠劑、喉錠或膠囊如明膠膠囊。利用液體載劑亦可製備用作為漱口液的口腔組合物。醫藥上相容黏合劑或佐劑材料亦可為該組合物的一部分。錠劑、藥丸、膠囊、喉錠等可含有任何下列的成分或類似性質的化合物：一黏合劑例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；一賦形劑例如澱粉或乳糖；一分解劑例如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；一潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；一滑動劑例如二氧化矽膠體；一甜味劑例如蔗糖或糖精；或調味劑例如薄荷、甲基水楊酸或香橙調味粉。
由於本發明的胜肽和疫苗已顯示具有對抗呼吸道病毒的活性，因此其亦可局部地被輸送至呼吸系統例如進入鼻腔、鼻竇、竇膜或肺臟。該含有一或多種胜肽或疫苗的胜肽、疫苗或醫藥組合物可藉由任何適當方法例如經由口腔或鼻內的吸入被輸送至呼吸系統。本發明組合物可為分散粉末或液體鼻噴劑、懸浮液、滴鼻劑、一凝膠或藥膏、經由一輸管或導管，其可藉由注射器、packtail、小紗布，或黏膜下的輸注。該胜肽或疫苗可以噴霧劑的方式被方便地輸送，其係利用加壓組或噴霧器及一適當的推噴劑例如，但不侷限於二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓噴霧劑的實例中，可藉由計量閥控制其傳送的劑量。用於一吸入器或吹藥器的膠囊和明膠匣盒可被配製成含有該胜肽及一適當粉末基質例如乳糖或澱粉的粉末混合物。鼻內配製物的實施例及投藥方法請看PCT公開案WO01/41782、WO00/33813及美國專利案6,180,603、6,313,093和5,624,898。藉由引述將後者引證的美國專利案併入於此以及供各種的用途。用於一噴霧調配物的推噴劑可含有加壓空氣、氮、二氧化碳，或一烴基低沸點溶劑。本發明的胜肽或疫苗可藉由噴霧器等的噴霧劑型式被方便地輸送。在一些態樣中，該活性成分較佳為被微粒化而可在投與乾粉末配製物時實質上將全部的活性成分吸入肺內，因而該活性成分較佳為具有低於100微米、較佳為低於20微米，以及最佳為在1至10微米範圍內的粒徑。在一具體實施例中，一或多種的胜肽或疫苗被包裝入可經由例如鼻腔噴劑或吸入器的吸入法輸送預設及有效量胜肽的裝置內。
亦可藉由經黏膜或經皮進行全身性投藥。就經黏膜或經皮投藥而言，配製物內可使用適合滲透載劑的滲透劑。此類滲透劑通常已為技術中所習知，以及包括例如用於經黏膜投藥的清潔劑、膽鹽及褐黴酸(fusidic)衍生物。可透過使用鼻內噴霧或栓劑完成經黏膜的投藥。就經皮投藥而言，該活性化合物被配製成技術中所習知的藥膏、油膏、凝膠或乳霜。該化合物亦可被製備成栓劑(例如與習知的栓劑基質如可可脂和其他甘油脂)或用於直腸輸送的滯留灌腸劑。
根據實施例，利用可保護該化合物避免迅速從體內被清除的載劑製備該活性化合物例如一控釋配製沕包括植入物及微膠囊化輸送系統。可使用生物可分解、生物相容性聚合物例如乙烯醋酸乙酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯，及聚乳酸。熟習本領域之技術者將瞭解此類配製物的製備方法。該材料可從市面上購自Alza公司及Nova製藥公司。亦可使用微脂粒懸浮劑(包括靶向感染細胞之具有單株抗體對細胞特異性抗原的脂質體)用作為醫藥上可接受載劑。其製備可根據本領域技術者所熟知的方法，例如述於美國專利案號4,522,811，藉由引述將其併入於此。
口服或腸道外組合物較佳為被配製成單位劑型以便於投藥及劑量的一致性。此處單位劑型指適合用於被治療生物體作為單一劑量的實體上分開單位；各單位含有一預設量以及併用所需醫藥載劑以產生所欲治療效應的活性化合物。
熟習本領域之技術者將瞭解此處所述的治療包括預防以及已形成之感染或症狀的治療。可治療性或預防性地投與本發明所揭示的胜肽和疫苗。治療較佳為開始於感染或在該哺乳動物暴露於能造成呼吸道病毒感染之病毒時或之前，以及持續直至病毒不再出現或活動於呼吸道內為止。然而，該治療亦可開始於感染後、在該哺乳動物暴露於能造成呼吸道病毒感染之病毒後，或已形成感染症狀之後。
將可進一步瞭解用於治療或預防流感之本發明抗病毒肽數量不僅視所選擇特定胜肽亦仍需視投藥途徑、被治療疾病的性質以及該病人的年齡和狀況而定，並且最後決定於巡診醫生或獸醫的判斷。然而一般而言，適當劑量的範圍為每天每公斤體重在約0.01至750毫克/公斤，較佳為在0.1至100毫克/公斤/天的範圍，以及最佳為在0.5至25毫克/公斤/天的範圍。
該胜肽或疫苗的投藥可方便地利用單位劑型，例如每單位劑型含有10至1500毫克，更佳為20至1000毫克，最佳為50至700毫克的活性成分，例如1毫克/公斤即75毫克/75公斤體重。
疫苗內所含各流感病毒株的免疫原濃度係可誘發免疫反應而無明顯副作用的數量。此數量將視所使用免疫原和其類型以及含於疫苗內的佐劑肽數量而不同。通常，當藉由SRD測定時疫苗內所含免疫原的數量係每毫升從約1至約1000微克，更佳為每毫升從約3至約300微克以及最佳為每毫升從約10至約15微克。在初次免疫之後，生物體可在其後的適當間隔時間接受一或數次的加強免疫。
可在細胞培養或實驗動物內依照標準藥學程序測定此類組合物的毒性和治療效率，例如測定其LD50 (族群中50%致死的劑量)和ED50 (族群中50%產生治療效應的劑量)。毒性和治療效應之間的劑量比為其治療指數以及其可被表示為LD50 /ED50 比。較佳為使用具有高治療指數的化合物。雖然可使用具有毒性副作用的化合物，但是必需小心選擇僅靶向不損傷未感染細胞位置之化合物因而可降低該副作用的輸送系統。
配製用於人類的系列範圍劑量可利用獲得自細胞培養檢測法及動物試驗的資料。此類化合物的劑量較佳為在極低或無毒性ED50 的循環濃度範圍內。該劑量視所使用的劑型及投藥途徑可在該範圍內。就用於本發明方法的任何化合物而言，可從細胞培養檢測法初步測定該治療有效劑量。一劑量可被配製於動物模式內以達到包括在細胞培養內測定之IC50 (即達到半最大抑制症狀的受測化合物濃度)的一循環血漿濃度範圍。此類資料可被用以更準確地測定人類中的有效劑量。可測定血漿中濃度，例如利用高效液態層析法。
如此處所定義，該活性化合物的治療有效量(即一有效劑量)可在從約0.001至100克/公斤體重的範圍，或顯而易見及無不當實驗下技術者所瞭解的其他範圍。熟練之技士將瞭解某些因素可能影響有效治療一生物體所需的劑量和時間，包括但不侷限於該疾病或障礙的嚴重度、先前療法、該生物體的健康狀態或年齡，以及其他存在的疾病。
在無意圖限制本發明的範圍之下，下列為根據本發明具體實施例的範例儀器、設備、方法及其相關結果。注意，為了讀者的方便標題或副標題可被用於實例中，但是其非為限制本發明的範圍。此外，此處已建議和揭示某些理論；然而，在不考慮任何特定理論或行動方案之下祗要本發明係根據本發明而執行時其不論對錯與否不應限制本發明的範圍。
實施例1：構建用於HA表現的基因
流感H5N1 HA序列係來自共有序列H5、CHA5(Chen MW等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci . USA 105：13538~13543)。藉由利用人類密碼子最佳化用於表現CHA5的密碼子。原始病毒蛋白酶切割位點PQRERRRK KRG被突變成PQRERG以避免蛋白被酵素切割形成HA I和HA2。在HA構體的C端以附加殘基(LVPRGSP GSGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWV LLSTFLG HHHHHH )取代該跨膜區(殘基：533~555)，斜體字為該凝血酶的切割點，劃底線者為噬菌體T4 fibritin-foldon三聚合序列，以及粗體字者為His-標簽(Stevens J.等人(2006)Science 312：404~410)。經修飾HA序列被選殖入pTT載體以供蛋白表現(Durocher Y等人(2002)Nucleic Acids Res . 30：E9)。
實施例2：蛋白的表現和純化
藉由利用乙烯亞胺以及被培養於補充以0.5%胎牛血清的Freestyle 293表現培養基(Invitrogen公司加州Carlsbad市)內將編碼分泌型HA的質體轉染入HEK293 EBNA(ATCC編號CRL-10852)或GnTI-HEK293S細胞的人類胚胎腎細胞株(Reeves PJ等人(2002)Proc .Natl .Acad .Sci . USA 99：13419~13424)。轉染72小時之後收集上清液以及藉由離心使其澄清。利用如先前所述的鎳螯合層析法純化HA蛋白(Wei CJ等人(2008)J .Virol . 82：6200~6208)以獲得完全糖基化HAfg 及高甘露糖型HAhm 。為獲得未經唾液酸修飾的HA蛋白─該去唾液酸HAds ─以20毫克分子梭菌神經胺酸酶(NA；Sigma)在37℃將該純化蛋白處理2小時。於NA處理之後，再一次純化該蛋白而從NA被分離。以EndoH(NEB)在37℃將該純化HAhm 處理2小時以產生在糖基化位點具有單一GlcNAc的HA蛋白，即為單糖基化HAmg 。以SDS PAGE、聚糖晶片以及質譜法(MS)分析全部的純化HA蛋白。
實施例3：從糖蛋白釋出用於MS分析的N-聚糖
以10毫克分子二硫代蘇糖醇(DTT；Sigma)在37℃將該純化HA糖蛋白還原1小時。以50毫克分子碘乙醯胺(IAA；Merck)在黑暗中將該還原樣本烷基化1小時以及藉由雙蒸餾(ddH2 O)被脫鹽，然後在旋轉乾燥機內進行乾燥。首先以胰蛋白酶(Roche)於50毫克分子碳酸氫銨的pH 8.3緩衝液內以1：20(重量/重量)適當酵素對蛋白比例在37℃將該經還原和烷基化HA蛋白萃取物消化4小時，接著再以第二胰蛋白酶(Roche)消化，然後裝載於反向C18層析管柱(Waters公司)上。以N-糖苷酶F(Roche)於50毫克分子的pH 8.3碳酸氫銨內在37℃進一步將該樣本培養16小時，然後以兩倍的N-糖苷酶F培養。藉由C18層析管柱程序將從含有N-聚糖之胜肽/糖肽所分離的釋出N-聚糖收集流通部分於5%醋酸(AcOH)內。以5% AcOH於20%、40%和60%1-丙醇內透析該胜肽。
實施例4：MALDI-MS和MS/MS分析
利用NaOH/二甲亞碸漿法過甲基化全部的聚糖樣本。在旋蓋玻璃瓶內將NaOH/DMSO漿混合乾燥聚糖樣本然後瓶內加入300微升碘甲烷(Merck)，以及將玻璃瓶輕微振盪25分鐘。藉由逐滴加入~1毫升ddH2 O終止該反應，然後加入等量的氯仿。將過甲基化聚糖萃取入底部有機層及藉由ddH2 O重複萃取移除額外NaOH和其他親水性污染物。藉由氮氣蒸發氯仿。就聚糖圖譜而言，在乙腈內以1：1比例混合過甲基化聚糖與10毫克/毫升之50%乙腈內的2,5-二羥基苯甲酸(DHB)，噴滴於加熱標靶板上，及以乙腈再結晶於板上。於反射模式操作的ABI 4700蛋白質分析儀(Applied Biosystems)上取得所需的資料。射出雷射(5赫；每頻譜發射10次)累積至當結合及穩定時達到滿意的訊噪比。在TOF/TOF儀器上，人工獲得高能量CID MS/MS資料以及一般包含在5000~5500設定雷射能之總共125次射注雷射的40次頻譜。
實施例5：聚糖晶片的製造
以化學方法製備24種用於HAs的含唾液酸聚糖，以及用於製造晶片。從一384-孔平板於塗佈NHS玻片(Nexterion H玻片；南美SCHOTT公司)上藉由自動銷(SMP3；TeleChem國際公司)沈積~0.7奈升之各種濃度含胺聚糖於點樣溶液(300毫莫耳磷酸鹽緩衝液；pH 8.5；含0.005% Tween 20)內進行晶片的印刷(BioDot；Cartesian科技公司)。該用於唾液酸糖苷的玻片從各行具有12重複以水平放置於各次陣列內的底至頂部沾有100微克分子濃度的其一聚糖1~17和21~27，以及各玻片被設計成可進行其他培養試驗的16網格。使印製玻片在80%濕度的大氣下反應一小時接著乾燥隔夜，以及在使用前將其儲存於室溫下的防潮箱內。在結合試驗之前，以乙醇胺(50毫克分子乙醇胺於pH 9.2的硼酸鹽緩衝液內)阻斷這些玻片然後以水和pH 7.4的PBS緩衝液清洗兩次。
實施例6：標示以Cy3-NHS酯的血球凝集素
以PBS(pH=7.4)將各HA蛋白樣本稀釋至1毫克/毫升的終濃度，然後標示以Cy3Mono NHS酯(5微升，0.2毫克/毫升)(GE Healthcare，英國)。反應於冰上進行18小時之後，各試管內加入20微升的PBS內500毫克分子甘胺酸以冷卻該反應。然後於冰上將該溶液再培養30分鐘。藉由將各溶液通過具有30仟道耳頓切割分子量的尺寸排阻旋轉過濾器(Microcon YM-30；Milipore公司美國)移除未反應染料分子。為了獲得染料/蛋白質的比例，藉由利用NanoDrop ND-IOO分光光度計(美國NanoDrop科技公司)以用於在280奈米(蛋白質)及在552奈米(Cy3；莫耳消光係數為在此波長的150,00 M-1 cm-1 )雙吸光測量的PBS稀釋標示蛋白的各樣本。校正280奈米之CyDye吸光度(約8%在552奈米的吸光度)的計算之後，從雙吸收測量的結果產生染料/蛋白質的比例。
實施例7：間接結合試驗
於0.005% Tween 20/PBS的pH 7.4緩衝液內製備HA糖基化變體，以及加入以蓋玻片覆蓋聚糖晶片上的網格。在加濕盒內振盪培養1小時之後，以0.005% Tween 20/PBS 的pH 7.4緩衝液將該玻片清洗三次。接著，將兔抗-H5N1 HA抗體加至該玻片並且在加濕盒內培養1小時。在以0.005% Tween 20/PBS緩衝液清洗三次之後，將Cy3-共軛山羊抗兔IgG抗體加至該玻片並且在加濕盒內再培養1小時。以0.05% Tween 20/PBS的pH 7.4緩衝液將該玻片清洗三次；以PBS緩衝液清洗三次；及以水洗清三次，然後乾燥。以微陣列螢光晶片判讀器(GenePix Pro 6.0；Molecular Devices公司)在595奈米(Cy3)掃描該玻片。
實施例8：直接結合試驗
於0.005% Tween 20/PBS緩衝液(pH 7.4)內製備HA糖基化Cy3-標示HA蛋白，以及加入以蓋玻片覆蓋聚糖晶片上的網格。在加濕盒內振盪培養1小時之後，以0.005% Tween 20/PBS緩衝液(pH 7.4)將該玻片清洗三次；以PBS緩衝液(pH 7.4)清洗三次；及以水洗清三次，然後乾燥。以微陣列螢光晶片判讀器(GenePix Pro 6.0；美國Molecular Devices公司)在595奈米(Cy3)掃描該玻片。
實施例9：微量中和檢測法
以半數組織培養感染劑量(TCID50 )定量該新鮮製備H5N1(NIBRG-14)病毒(英國Potters Bar市國家生物製品檢定所)。在96-孔平板內以等量混合100倍TCID50 的病毒與2倍序列稀釋的血清儲備液，以及在37℃培養1小時。將該混合物置於平板的MDCK細胞(每孔內含有1.5x104 個細胞)上，然後在37℃培養16~20小時。以PBS清洗該細胞，於丙酮/甲醇溶液(1：1的體積/體積)內固定，及以5%脫脂乳阻斷。以抗流感ANP(Sui JH等人(2009)Nat. Struct. Mol. Biol. 16：265~273)的mAb藉由間接ELISA偵測該病毒抗原。
實施例10：小鼠、接種及攻毒
雌性6至8週齡BALB/c小鼠(數目=15)在第0和2週以肌肉內免疫於50微升pH 7.4之PBS及混合50微升之1毫克/毫升氫氧化鋁(Alum；Sigma公司)內的20微克純化HAfg 或HAmg 蛋白。在免疫後第14天收集血液，及收集各小鼠的血清樣本。以基因改造H5N1病毒NIBRG-14經由鼻腔刺激以致死劑量(100倍的50%小鼠致死劑量)免疫該經免疫小鼠。刺激後14天期間每天監控該小鼠的存活率。利用中央研究院委員會的動物實驗管理小組評估全部動物實驗。
實施例11：血球凝集素(HA)檢測
如Jones等人J. of Virology 80(24)：11960~11967(2006)中所述，在圓底96-孔微滴定盤內藉由PBS內病毒樣本的兩倍稀釋製備雞紅血球的血球凝集素(cRBCs；Lampire生物實驗室，賓州Pipersville市)。以每50微升(HAU/50微升)樣本的血球凝集素單位表示其力價。
實施例12：病毒血球凝集素的純化
改良如Johansson等人J. of Virology ；1989第63(3)卷第1239~1246頁中所述從流感病毒顆粒純化病毒粒子相關血球凝集素(HA)。簡言之，從感染雞蛋的尿囊液及如上述純化的蔗糖收集病毒。將病毒粒再懸浮於0.5毫升的醋酸鈉緩衝液(0.05克分子醋酸鈉、2毫克分子CaCl次2、0.2毫克分子EDTA，至pH 7.0)內，通過18號針頭均質化，以及混合等量的醋酸鈉緩衝液內15%辛烷基葡糖苷(辛基-β-d-硫代葡萄糖苷；Fisher科技公司，喬治亞州Norcross市)，接著激烈攪拌5分鐘。該懸浮液在4℃以18,400 xg離心60分鐘，然後小心地移除上清液及保留富含HA部分。將2%含水鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB，Bio-World，俄亥俄州Dublin市)加入該HA部分至0.1% CTAB的終濃度，以及將該樣本放置於以含0.1%辛烷基葡糖苷之0.05克分子Tris-鹽酸(pH 7.5)預膨脹及平衡的DEAE-葡聚糖凝膠(A-50；瑞典Uppsala市GE Healthcare公司)離子交換管柱(床，0.7x6.0釐米)。藉由具有低鹽HA沖提液(0.05克分子Tris-HCl、0.1克分子NaCl、0.1% Triton X-100，至pH 7.5)以及再一次以高鹽HA沖提液的重力收集20個0.5毫升餾分物。藉由在非還原條件下的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法接著藉由膠態考馬斯藍染色法檢測個別餾分物的HA活性及分析純度。根據製造商的指示藉由BCA檢測法測定蛋白質的濃度(伊利諾州Rockford市Pierce公司)。
實施例13：晶片數據分析
使用GenePix Pro軟體(Axon儀器公司)於擷取數據的螢光分析。從信號的各觀察點減去局部背景。從分析中去除<100之明顯缺陷、無可偵測信號或淨螢光的觀察點。從重複觀察點平均相同晶片內的"比值中數"。相同晶片於相同條件下進行HA結合至晶片的分析(第2A圖)以及相關常數的測定(第2B圖)以確保數據的常態化。
為測定KD,surf 值，利用布售非線性回歸程式Grad Pad PRISM(Graph-Pad)，假設配體結合至一或兩個獨立位點，藉由適配該數據至朗繆爾等溫(方程式1)分析該平衡結合資料。
一種測量表面活性糖類數量的Fmax 係其最大的螢光強度；(P)係總HA蛋白濃度，以及KD,surf 係表面糖類與該蛋白之間的平衡解離常數。
重複測量各樣本的KD,surf 值以及至少計算4次以獲得KD,surf 的平均值。藉由利用KD,surf 值，從下列方程式(2)和(3)可獲得其熱力學參數。
Fobs =Fmax (P)/(KD,surf +(P))　{方程式1}
KD,surf =KA,suri -1 　{方程式2}
Δ Gmulti =RTln (KA,surf )　{方程式1}
KA,surf 代表方程式(1)中的結合常數。方程式(2)中，R=1.987cal mol-1 K-1 ；T為絕對溫度，以及在298K之下進行該試驗。藉由利用微軟優算程式計算各樣本的這些值。藉由單因子變異數分析(ANOVA)利用GraphPad PRISM(GraphPad)進行不同HA糖型之KD，surf 的統計分析。
實施例14：藉由ELISA測定血清內的HA-特異性抗體
從HEK293純化HA蛋白以及於96-孔平板(5微克/毫升)上塗佈隔夜。將小鼠血清100倍稀釋以作為用於HA結合測定的儲備血清。該塗佈HA平板與2倍系列稀釋的血清培養1小時。藉由利用HRP-共軛抗小鼠抗體偵測HA-特異性IgG。藉由選擇其讀取值高於免疫前1：50稀釋血清的稀釋值計算其稀釋終點(Stevens J等人(2006)Science 312：404~410)。藉由LTK生物實驗室製備來自兔的抗血清。藉由混合完全或不完全佐劑之約0.25~0.35毫克的HA蛋白免疫兔子。在六次免疫之後從該兔子收集血液，其程序為每2週免疫一次。
實施例15：HA的糖基化位點分析
來自H1、H3和H5流感病毒的總共297株全長HA序列係調用自美國國家生物技術中心(NCBI)資料庫以及藉由EMBL-EBI的ClustalW2程式進行比對(Larkin MA等人(2007)Bioinformatics 23：2947~2948)。該序列數據係來自1918至2000年代以及係分離自人類。為減少冗餘，在一國家內僅選定一次用於分析的病毒株。用於比對的序列包括：H1(AAX56530、AAY78939、ABA18037、ABB51962、ABC42750、ABD60867、ABD62061、ABE11690、ABF47869、ABF82830、ABF82852、ABG37362、ABI19015、ABI21211、ABI95294、ABI96103、ABK39995、ABK57092、ABK57093、ABK79970、ABO32948、ABO32970、ABR15885、ABS71664和ABS76427)；H3(AAT08000、AAT12654、AAX11455、AAY58320、AAZ32943、AAZ43394、ABA26700、ABA26777、ABB51961、ABB71825、ABC42596、ABC42607、ABC42629、ABC43017、ABD15713、ABD59850、ABD61359、ABF17954、ABG37450和ABG37461)；H5(AAS65618、AAT39065、AAT73273、AAT73274、AAT73275、AAT84153、AAV32636、ABC72655、ABD28180、ABD28182、ABE97624、ABI16504、ABI36144、ABI36439、ABO10181、ABO36644和ABP51968)。藉由生物序列分析中心預測網(www.cbs.dtu.dk/services/)預測N-連接糖基化HA序列。就天門冬胺酸(Asn)而言，含胺基酸模式Asn-Xaa -(Ser/Thr)的序列，該Xaa 可為除了脯胺酸之外的任何胺基酸(Gavel Y等人(1990)Protein Eng. 3：433~442)，繼之以絲胺酸或蘇胺酸。藉由利用PRISM程式(GraphPad)和Jalview(Waterhouse AM等人(2009)Bioinformatics 25：1189~1191)製備資料分析的結果。
實施例16：用於合成HA糖肽的化學方法
藉由二甲基硫磷酸混合酐法(Mpt-MA)進行HA糖肽的逐步合成(Inazu,T等人(1997)於1996年胜肽化學 (Kitada,C編輯)第41~44頁，蛋白研究基金會，大阪)。藉由用於N-糖基化但無糖鏈之具有一共同序列"Asn-X- Ser/Thr"的硫酯法可合成HA糖蛋白。藉由利用供應Boc策略程式的自動化合成儀製備肽片段。藉由利用DCC/HOBt作為活化試劑進行偶合反應。藉由Mpt-MA法利用Boc-Asn(GlcNAc)-OH(3當量)偶合Asn(GlcNAc)殘基。進行1小時的偶合反應然後在監控下再重複一次。以含10%苯甲醚的無水HF處理之後進行HPLC純化，可獲得糖肽硫酯。此糖肽硫酯片段被偶合其他肽片段，其係藉由硫酯片段縮合法被分開製備。在去保護及形成雙硫鍵之後，可獲得GlcNAc-HA類似物。
或者，藉由肽基Ash之β-羧基與糖基胺的偶合反應進行收斂法合成HA糖肽(請看Cohen-Abisfeld,S.T.和Lansbury,P.T.(1993)J. Am. Chem. Soc. 115：10531~10537)。
實施例17：用於合成HA糖肽的化學酵素法
藉由利用協同化學法的酵素法製備含複合寡糖的糖肽。利用內切-β-N-乙醯基葡萄糖胺酶(endo-β-Glc NAc-ase)的轉糖苷活性進行N-糖肽的合成(Takegawa,K等人(1995)J. Biol. Chem. 270：3094~3099)。內切-β-N-乙醯基葡萄糖胺酶水解N-連接寡糖之N,N'-二乙醯幾丁二糖基團間的糖苷鍵，以及將釋出寡糖片段轉移至一羥基化合物。以兩步驟進行endo-β-GlcNAc-ase的N-糖肽合成。首先，藉由化學途徑製備含GlcNAc胜肽。然後藉由endo-β-GlcNAc-ase的轉糖基化反應將糖基化供體的一寡糖片段轉移至作為糖基化受體的該糖肽之GlcNAc基團。
本發明雖然已於此處描述特定具體實施例以作為說明之目的，但是可進行各種的改良而不偏離本發明的精神及範圍。因此，本發明非僅侷限於申請專利範圍附件。
本發明雖然已配合其詳細描述做為說明，但是上述描述僅為說明之目的而並非限制本發明申請專利範圍附件內所界定的範圍。其他態樣、優點和修改仍屬於申請專利範圍附件的範圍內。
熟習本領域技術者均可取得此處引證之專利和科學文獻所建立的知識。藉由引述將全部引證的美國專利案和已公告或未公告美國專利申請案併入於此。
藉由併入於此以供參考的引述登錄號表示基因庫和NCBI的遞交號。於此藉由引述併入全部其他的公開文獻、文件、手稿和科學文獻。
本發明雖然特別顯示及說明於其參考的較佳具體例中，但是熟習本技藝者應瞭解其可有各種形式和細部的變化而仍不偏離包含於本發明申請專利附件的精神和範圍。
<210>　7
<211>　1720
<212>　DNA
<213>　A型流感病毒
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<213>　A型流感病毒
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<210>　12
<211>　298
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<213>　人呼吸道融合病毒
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<210>　13
<211>　495
<212>　PRT
<213>　登革熱病毒
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<211>　192
<212>　PRT
<213>　C型肝炎病毒
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<210>　15
<211>　478
<212>　PRT
<213>　第1型人免疫缺陷病毒
<400>　15
下列附圖構成本專利說明書的一部分以及被用於進一步說明本發明所揭示的某些態樣，配合此處所示特定具體實施例的詳細說明藉由參考一或多種這些附圖可更加瞭解本發明。本專利或申請文件含有至少一種以顏色區別的附圖。在被要求及繳清所需費用之下承辦人將提供含顏色附圖之此專利或專利申請公開案的副本。
第1A~1C圖為示意圖及具有不同糖基化HA的圓二色譜。(第1A圖)具有不同糖基化HA蛋白的四種變體：HAfg ，HA(一種表現於HEK293E細胞內之具有典型複合型N-聚糖的共有序列(Chen MW等人(2008)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：13538~13543))；HAds ，造成從HAfg 移除唾液酸的經NA處理HA；HAhm ，表現於GnTI-HEK293S細胞內之具有高甘露糖型N-聚糖的HA；以及HAmg ，僅在其N-糖基化位點具有GlcNAc的經內切H處理HA(第1B圖)。具有附著至其N-糖基化位點之代表不同N-聚糖HAfg 、HAds 、HAhm 和HAmg 的構造。產生灰色之具有蛋白資料庫識別碼2FK0(Viet04 HA)以及綠色之N-連接聚糖的蛋白構造。
全部N-聚糖被GlyProt(Bohne-Lang A等人(2005)Nucleic Acids Res . 33：W214~W219)所模型化，以及產生PyMOL的圖形(www.pymol.org)。(第1C圖)HAfg 、HAds 、HAhm 和HAmg 的圓二色譜證明具有類似次級結構的四種不同糖基化HA蛋白。
第2A~2B圖顯示具有不同糖基化HA的聚糖晶片分析。(第2A圖)為HA變體HAfg 、HAds 、HAhm 和HAmg 的聚糖晶片分析。以顏色分類聚糖的相關鍵結，主要為17α2,3唾液酸糖苷(黃)或7α2,6唾液酸糖苷(藍)。晶片上聚糖的構造被示於第2B圖。以對應α2,3唾液酸糖苷1~15之HA變體的KA,surf 值表示HA變體HAfg 、HAdS 、HAhm 和HAmg 的結合常數。
第3圖顯示布里斯本H1；最近HAs之加州H1、H3和H5；以及自從2000年之H1、H3和H5的序列比對分析。如圖3顯示，胺基酸序列為來自H1N1A/布里斯本/59/2007的HA(SEQ ID NO：16)；來自H1N1 A/加州/07/2009的HA(SEQ ID NO：17)；來自H5N1 A/越南/1203/2004的HA(SEQ ID NO：18)；以及來自H3N2A布里斯本/10/2007的HA(SEQ ID NO：19)。季節性流感HA係來自A/布里斯本/59/2007。全球性流感HA係來自A/加州/07/2009。H5係來自A/越南/1203/2004。H3係來自A布里斯本/10/2007。H5 HA上的N-糖基化位點被示於紅色框內。該比對顯示H1和H5 HAs之間於其N-糖基化位置具有類似性，反之H3則具有不同於H1和H5的低保留糖基化位置。
第4A~4F圖顯示歸因於糖或修飾對應不同糖基化HAs之HA聚糖相互作用的結合能。藉由減去指定參考聚糖之△G值(標示於紅色框內；請看表S3)可獲得這些值。(第4A圖)聚糖2、3、6和8~10具有僅不同於非還原端第三糖之雙糖聚糖1的相同主鏈。計算△△G值以證明改變第三糖的結合能差異。(第4B圖)聚糖10~12和15具有雙糖聚糖8但是不同線性延伸之糖構造或添加一分枝糖的相同主鏈。(第4C圖)聚糖4和5具有三糖聚糖3但是與非還原端不同分枝岩藻糖或第三位置上硫酸根的相同主鏈。(第4D圖)聚糖6和7不同於聚糖7非還原端之第三位置上的硫酸根。(第4E圖)聚糖13和14為具有不同內糖變化的α 2,3雙枝唾液酸糖苷。(第4F圖)聚糖16和17為極少或未結合至HA的α 2,6唾液酸糖苷(編號21~27)。
第5A~5D圖顯示作為疫苗之HAfg 和HAmg 的比較。(第5A圖)利用ELISA分析來自HAfg 和HAmg 抗血清之間，以及各種HAs的結合。與HAfg 抗血清的比較中，HAmg 抗血清顯示對H5(越南1194/2004和CHA5)有較佳的結合。此外，該HAmg 抗血清亦結合至H1(加州07/2009和WSN)。(第5B圖)H5N1(NIBRG-14)病毒與HAfg 和HAmg 抗血清的微量中和作用。與HAfg 抗血清的比較中，HAmg 抗血清顯示對抗感染MDCK細胞的流感病毒具有較佳的中和活性(P<0.0001)。(第5C圖)對抗H5N1病毒之致死劑量攻毒的疫苗保護作用。各注射兩劑HAfg 、HAmg 和對照PBS的HA蛋白疫苗以免疫BALB/c小鼠。以致死劑量H5N1(NIBRG-14)病毒經鼻攻毒該經免疫小鼠。攻毒後，記錄14天的存活率。(第5D圖)藉由ELISA測定來自HAmg 之兔抗血清與不同HAs的結合力。對抗HAmg 之兔抗血清證明對H5(CHA5和越南/1194)具有強結合力。此外，亦觀察與H5(安徽和ID5/2005)和H1(新喀里多尼亞/1999)的相互作用。
第6A~6C圖顯示H5 HA蛋白的構建、純化及凝膠過濾層析。(第6A圖)將編碼改變切割位點HA之胞外域的DNA選殖入哺乳動物表現載體、pTT(Durocher Y等人(2002)Nucl.Acids Res.30：E9)內，而使HEK293細胞培養有效分泌HA蛋白。HA的原始蛋白酶切割位點被突變成PQRERG以避免HA0被處理成HA1和HA2。為穩定HA蛋白的三聚體構型，其為噬菌體三聚合片段的"foldon"序列被轉殖入該質體構體內，以及His-標簽亦被加入純化用的COOH端。藉由表現載體的瞬時轉染法進行HA蛋白的表現。(第6B圖)藉由SDS/PAGE分析該經純化HA蛋白。M指示標記。第1行：HAfg ，純化自293E細胞的HA；第2行：HAds ， 被HA消化的HAfg ；第3行：HAhm ，純化自293S細胞的HA(Reeves PJ等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99：13419~13424)；第4行：HAmg ，被內切H消化的HAhm 。(第6C圖)藉由凝膠過濾層析法分析該經HA純化蛋白。洗提峰顯示在凝膠過濾之後該HAfg 三聚體>200kDa(紅色線)，該HAds 三聚體>200kDa(黑色線)，該HAhm 三聚體>200kDa(藍線)，以及該HAmg 三聚體>180kDa(綠色線)。該圖形代表與蛋白標記貼合之HA蛋白的重疊洗提曲線(虛線)。
第7A~7C圖顯示來自不同HA蛋白之全甲基化N-聚糖的質譜儀分析。來自不同HA蛋白之全甲基化N-聚糖的MS分析。(第7A圖)MALDI-MS譜顯示表現自HEK293E之HA的N-聚糖如主波峰偵測和表S1列舉的註釋包含主要為核心海藻糖化、雙枝、三枝和四枝複合型N-聚糖構造。根據組合物進行排列，其中僅少數進一步藉由MS/MS分析獲得證實。各種程度的唾液酸化為其主要特徵。(第7B圖)經NA的處理，無法再偵測出全部被指定為唾液酸化N-聚糖的信號(例如m/z 2605、3054、3503、3864、4226)，伴隨增加無唾液酸化三枝和四枝構造的信號強度(m/z 2693、3142)，此與唾液酸被完全移除相符合。(第7C圖)源自表現於GnTI┐-缺乏HEK293S株HA之N-聚糖的MALDI-MS譜顯示主要為相當於在m/z 1579之Man5GlcNAc2的信號，以及於糖基化過程中被不完全修剪之高甘露糖型的N-聚糖小波峰(m/z 1783至2396；Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2)。
第8A~8D圖顯示HA變體的MALDI-TOF分析。 HAfg 的分子量為75186.343(第8A圖)，HAds 為75290.023(第8B圖)，HAhm 為69314.645(第8C圖)，以 及HAmg 為63314.761(第8D圖)。
第9圖顯示HA三聚體之全甲基化N-聚糖的MALDI譜中所觀察到的主要分子離子的配置。
第10圖顯示對應α 2,3唾液酸糖苷1~15之HA糖基化變體的△△G，仟卡/莫耳。藉由從前者HA減去後者HA的-G值可獲得最左欄的部分(例如，△△G(HAfg →HAds )=△G(HAds )-△G(HAfg ))。ND表示未被測定。
第11圖顯示對應HA變體之不同唾液酸糖苷配體間之結合游離能的差異。以△△G，仟卡/莫耳表示其值。藉由從前者HA減去後者HA的△G值可獲得最左欄的部分(例如，△△G(1→2)=△G(2)-△G(1))。ND表示未被測定。
第12圖顯示產生自完全糖基化、高甘露糖和單糖基化H5 HA之抗血清對抑制越南1203HA假型病毒轉導入HEK 293細胞內的能力。高甘露糖和單糖基化HA抗血清均可抑制病毒的侵入，但是完全糖基化HA抗血清則否。
第13A~13B圖顯示兔HAfg 和HAmg 抗血清之血球凝集分析的結果。第13A圖顯示對H1、H3和H5血球凝集分析中之完全糖基化共有H5 HA抗血清的結果。第13B圖顯示單糖基化H5 HA抗血清的結果。該單糖基化H5 HA抗血清不僅對H5亦對H1具有良好血球凝集抑制活性。兩者抗血清對H3的血球凝集均無影響。
第14圖顯示與H3相比(0.9Å的均方根偏差(RMSD))H5和H1的蛋白結構較為類似(2.5Å的均方根偏差(RMSD))。
第15A~15C圖顯示利用單糖基化H1(布里斯本)HA作為抗原可產生抑制NIBRG-121(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株)的抗血清。第15A圖顯示 NIBRG-121(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株)病毒對抑制紅血球凝集的能力。第15B圖顯示NIBRG-121(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株)病毒對抑制感染MDCK細胞的能力。第15C圖顯示BALB/c小鼠對感染NIBRG-121(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株)流感病毒的保護作用。所使用的抗血清係來自經布里斯本HA蛋白(5微克)免疫的小鼠以及該用於攻毒的病毒係NIBRG-121(100xLD50 )。
第16A~16C圖顯示產生自作為抗原之單糖基化H1(布里斯本)HA的抗血清對WSN(H1N1)1933的抑制作用。第16A圖顯示WSN(H1N1)1933病毒對抑制紅血球凝集的能力。第16B圖顯示WSN(H1N1)1933病毒對抑制感染MDCK細胞的能力。第16C圖顯示BALB/c小鼠對感染WSN(H1N1)1933流感病毒的保護作用。所使用的抗血清係來自經布里斯本HA蛋白(5微克)免疫的小鼠以及該用於攻毒的病毒係WSN(H1N1)1933(100xLD50 )。
第17A~17C圖顯示產生自作為抗原之單糖基化H1(布里斯本)HA的抗血清對A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8的抑制作用。第17A圖顯示PR8病毒對抑制紅血球凝集的能力。第17B圖顯示PR8病毒對抑制感染MDCK細胞的能力。第17C圖顯示BALB/c小鼠對感染PR8流感病毒的保護作用。所使用的抗血清係來自經布里斯本HA蛋白(5微克)免疫的小鼠以及該用於攻毒的病毒係PR8(100x LD50 )。
第18A~18B圖顯示利用單糖基化H1(2009年大流行A型(H1N1)疫苗株；示於圖中的加州/2009)HA作為抗原可產生抑制WSN(H1N1)的抗血清。第18A圖顯示WSN(H1N1)病毒對抑制紅血球凝集的能力。第18B圖 顯示WSN(H1N1)病毒對抑制感染MDCK細胞的能力。
第19圖顯示H1 HA蛋白上糖基化位點的結構比較。
第20圖顯示完全糖基化型(第20A圖)和單糖基化型(第20B圖)的第3型登革熱病毒封套糖蛋白E雙聚體。產生自GlyProt服務網具有4個可能複合型N-聚糖之PDB碼1UZG的模型。
第21圖顯示完全糖基化型(第21A圖)和單糖基化型(第21B圖)的人類免疫缺陷病毒封套糖蛋白gp120三聚體。產生自每單聚體具有13個可能複合型N-聚糖之PDB碼2BF1的模型。
<110> 中央研究院
<120> 預防病毒的免疫方法及組合物
<130> OPK-50101US
<140> US 12/748,265
<141> 2010-03-26
<150> US 61/164,385
<151> 2009-03-27
<150> US 61/164,387
<151> 2009-03-28
<150> US 61/164,388
<151> 2009-03-28
<150> US 61/164,389
<151> 2009-03-28
<150> US 61/313,676
<151> 2010-03-12
<160> 19
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> A型流感病毒
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<213> 人類呼吸道融合病毒
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<213> A型流感病毒
<400> 19

Claims (40)

  1. 一種用於提高免疫反應的免疫原性組合物，該組合物包含：部分糖基化的流感病毒糖蛋白，其係選自來自流感病毒株H1、H3及H5之血球凝集素(HA)或其片段所組成之群組，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白含有至少一糖基化位點且在該至少一糖基化位點被部分糖基化至單-、雙-或三糖狀態。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其進一步包括完全或部分糖基化的表面糖蛋白或其片段，其係選自流感病毒神經胺酸酶；流感病毒凝集素；流感病毒M2蛋白；人呼吸道融合病毒(RSV)-病毒蛋白；RSV F糖蛋白；RSV G糖蛋白；單純皰疹病毒(HSV)病毒蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE；衣原體MOMP和PorB抗原；核心蛋白；登革熱病毒之基質蛋白或其他蛋白；麻疹病毒凝集素；單純皰疹病毒第2型糖蛋白gB；小兒麻痺病毒1 VP1；HIV 1之封套糖蛋白；B型肝炎表面抗原；白喉毒素；鏈球菌24H表位；纖毛淋病雙球菌；假性狂犬病病毒g50(gpD)；假性狂犬病病毒II(gpB)；假性狂犬病病毒III(gpC)；假性狂犬病病毒糖蛋白H；假性狂犬病病毒糖蛋白E；傳染性胃腸炎病毒糖蛋白195；傳染性胃腸炎病毒基質蛋白；豬輪狀病毒糖蛋白38；豬小病毒衣殼蛋白；猪痢疾蛇形螺旋體保護抗原；牛病毒性腹瀉糖蛋白55；新城疫病毒凝集素-神經胺酸酶；豬流感凝集素；豬流感神經胺酸酶；口蹄疫病毒；豬瘟病毒；豬流感病毒； 非洲豬瘟病毒；豬肺炎黴漿菌；牛傳染性鼻氣管炎病毒；牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G；傳染性喉氣管炎病毒；傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I；拉克錫病毒糖蛋白；初生仔牛下痢症病毒；委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒；靜脈病毒；鼠白血病病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；B型肝炎病毒核心蛋白和B型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物；馬流感病毒或馬皰疹病毒之抗原，包括馬流感病毒A型/Alaska 91神經胺酸酶、馬流感病毒A型/Miami 63神經胺酸酶、馬流感病毒A型/Kentucky 81神經胺酸酶、馬皰疹病毒1型糖蛋白B和馬皰疹病毒1型糖蛋白D；牛呼吸道融合病毒或牛副流感病毒之抗原；牛呼吸道融合病毒附著蛋白(BRSV G)；牛呼吸道融合病毒融合蛋白(BRSV F)；牛呼吸道融合病毒核衣殼蛋白(BRSVN)；牛副流感病毒3型融合蛋白；牛副流感病毒3型凝集素神經胺酸酶；牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53；登革熱病毒糖蛋白E以及人C型肝炎病毒之糖蛋白E1或E2的表面糖蛋白。
  3. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係利用一或多種化學或酵素法藉由部分去糖基化所產生。
  4. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白含N-糖化位點，其含有天冬胺酸鹽-Xaa -絲胺酸和天冬胺酸鹽-Xaa -蘇胺酸的胺基酸序列，該Xaa 係除脯胺酸之外的任何胺基酸。
  5. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係以N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)及/或甘露糖糖基化。
  6. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係單糖基化流感病毒凝集素(HA)。
  7. 如申請專利範圍第6項之免疫原性組合物，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係以N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)糖基化的單糖基化流感病毒凝集素。
  8. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素含具有Sa區的N-糖基化位點。
  9. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中所述部分糖基化係於位於HA的位置177的天冬胺酸殘基。
  10. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素對HA受體的結合具有較低的特異性及較強的親和力，其係相對於對應的流感病毒凝集素在去糖基化前對HA受體結合之特異性及親和力而言。
  11. 如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素結合唾液酸化HA-受體，其中該受體在標的細胞上。
  12. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素含有包括共有H5 HA序列(序列辨識編號：4)的 多肽。
  13. 如申請專利範圍第12項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素係於該共有H5 HA序列(序列辨識編號：4)的一或多個位置39、127、170、181、302、495和500的天冬胺酸殘基被糖基化。
  14. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素含有選自由季節性NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序列(序列辦識編號：6)、共有H1-A(序列辦識編號：8)和共有H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的H1多肽序列。
  15. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素含有選自由共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)、NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序列(序列辦識編號：6)、共有H1-A(序列辦識編號：8)和共有H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的HA序列，其中該HA序列藉由取代HA上的跨膜區被修飾成能表達於一適當真核細胞內並由其分泌。
  16. 如申請專利範圍第7項之免疫原性組合物，其中該以GlcNAc糖基化的單糖基化流感病毒凝集素含有季節性H1多肽。
  17. 一種疫苗包含：(a)免疫原性多肽，其包含部分糖基化的流感病毒糖蛋白，其係選自來自流感病毒株H1、H3及H5之血球凝集素(HA)或其免疫 活性片段所組成之群組，其在一或多個糖基化位點被部分糖基化至單-、雙-或三糖狀態；以及(b)選擇性佐劑，其中該疫苗能誘發對抗病毒的免疫反應。
  18. 如申請專利範圍第17項之疫苗，其中該流感病毒係禽流感病毒或人流感病毒。
  19. 如申請專利範圍第18項之疫苗，其中該禽流感病毒係H5N1。
  20. 如申請專利範圍第17項之疫苗，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係單糖基化流感病毒HA多肽，而當將該單糖基化流感病毒HA多肽導入一生物體時，該單糖基化流感病毒HA多肽可誘發該生物體產生結合至呼吸道病毒的抗體，其中該呼吸道病毒為禽類或人類流感病毒。
  21. 如申請專利範圍第17項之疫苗，其中該部分糖基化的流感病毒糖蛋白係單糖基化流感病毒HA多肽，其含有部分糖基化N-糖基化位點，含有天冬胺酸鹽-Xaa -絲胺酸和天冬胺酸鹽-Xaa -蘇胺酸的胺基酸序列，該Xaa 係除脯胺酸之外的任何胺基酸。
  22. 如申請專利範圍第21項之疫苗，其中該N-糖基化位點含有單GlcNAc，且其中該單糖基化流感病毒HA多肽對HA受體結合呈現低特異性及較強親和力，其係相對於對應的流感病毒凝集素在去糖基化前對HA受體結合之特異性及親和力而言。
  23. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該單糖基 化流感病毒HA多肽含具有Sa區的N-糖基化位點。
  24. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽含有於HA多肽(SEQ ID NO：10)位置177天冬胺酸殘基的N-糖基化位點。
  25. 如申請專利範圍第22項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽結合唾液酸化HA受體，其中該受體在標的細胞上。
  26. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽含有包括共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)的多肽。
  27. 如申請專利範圍第26項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽係於該共有H5 HA序列(序列辦識編號：4)的一或多個位置39、170、181、302和495的天冬胺酸殘基被糖基化。
  28. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽含有選自由NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)序列(序列辦識編號：6)、共有H1-A(序列辦識編號：8)和共有H1-C(序列辦識編號：10)序列構成之群組的H1多肽序列。
  29. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該該單糖基化流感病毒HA多肽含有季節性H1HA多肽以及當將該該單糖基化流感病毒HA多肽導入生物體時，該H1HA多肽可誘發該生物體產生中和NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)、WSN(H1N1)1933，或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8株流感病毒的抗體。
  30. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該單糖基化流感病毒HA多肽含有NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)多肽以及當將該單糖基化流感病毒HA多肽導入生物體時，該NIBRG-121(2009年大流行A(H1N1)疫苗株)多肽可誘發該生物體產生中和季節性H1(布里斯本)HA、WSN(H1N1)1933，或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8株流感病毒的抗體。
  31. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該生物體係哺乳動物或鳥類。
  32. 如申請專利範圍第20項之疫苗，其中該疫苗具有對抗一或多株流感病毒的抗病毒活性。
  33. 如申請專利範圍第17項之疫苗，其中該佐劑係選自氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁、佛氏不完全佐劑(IFA)、角鯊烯、明礬和MF59。
  34. 一種製備免疫原性組合物的方法，其包含：提供糖基化流感病毒血球凝集素(HA)蛋白，其係來自流感病毒株H1、H3或H5或其免疫活性片段；移除該糖基化流感病毒HA蛋白上結合至一或多個糖基化位點的聚糖之至少一部分，而形成一具有部分糖基化位點之部分糖基化流感病毒HA蛋白，其中至少一單糖、雙糖或三糖保持結合至該部分糖基化流感病毒HA蛋白之該部分糖基化位點以及其中該部分糖基化流感病毒HA蛋白保留免疫上活性構形；以及將該部分糖基化流感病毒HA蛋白配製成一免疫原性組合物。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其進一步包含：提供包含適合用於表達該糖基化流感病毒HA蛋白或其免疫上活性片段之構體的真核宿主細胞；以及從該真核宿主細胞分離該糖基化流感病毒HA蛋白。
  36. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該部分糖基化流感病毒HA蛋白保留該糖基化流感病毒HA蛋白於其天然狀態的三級結構。
  37. 如申請專利範圍第34項之方法，其中利用糖苷酶、神經胺酸酶、α-1-甘露糖苷酶、內切F-N聚糖酶，或選擇性消化該糖於N-或O-連接糖基化位點的酵素移除該聚糖部分。
  38. 如申請專利範圍第34項之方法，其中利用選擇性消化該糖於N-或O-連接糖基化位點的化學方法移除該聚糖部分。
  39. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該真核宿主係選自酵母菌、昆蟲細胞、桿狀病毒、哺乳動物細胞，及人類細胞。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該真核宿主係HEK293E細胞。
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2784189T3 (es) 2009-03-27 2020-09-23 Academia Sinica Métodos y composiciones para la inmunización contra virus
WO2011044152A1 (en) * 2009-10-05 2011-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer Protection against pandemic and seasonal strains of influenza
US8956859B1 (en) * 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
TWI537385B (zh) 2010-11-04 2016-06-11 中央研究院 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法
CN102955589A (zh) * 2011-08-18 2013-03-06 宸鸿光电科技股份有限公司 触控面板的控制系统及控制方法
CN103018442B (zh) * 2011-09-23 2014-11-19 华中农业大学 猪肺炎支原体间接elisa抗体检测试剂盒及应用
JP2015519348A (ja) * 2012-05-23 2015-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ インフルエンザワクチン構築物
EP2900259B1 (en) * 2012-09-28 2020-04-15 Kline, Ellis Glycosidase regimen for treatment of infectious disease
CN103353526B (zh) * 2013-07-23 2015-10-21 河南枫华生物科技有限公司 一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒
CN104391112A (zh) * 2014-05-27 2015-03-04 中国农业科学院特产研究所 检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及elisa试剂盒
CN104195113B (zh) * 2014-08-07 2017-05-03 扬州大学 H5亚型禽流感疫苗候选株rS‑156‑/170+/181‑及其构建方法及应用
CN104195114A (zh) * 2014-09-05 2014-12-10 青岛易邦生物工程有限公司 一种禽肺病毒及其应用
EP3240568A4 (en) 2014-12-30 2018-05-30 Georgia State University Research Foundation, Inc. Recombinant influenza virus vaccines for influenza and respiratory syncytial virus
EP3103474A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-14 Institut Pasteur Live recombinant measles-m2 virus and its use in eliciting immunity against influenza viruses
EP4349405A3 (en) 2015-10-22 2024-06-19 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
EP3423088A4 (en) * 2016-02-29 2019-11-13 The Curators Of The University Of Missouri CANCER IMMUNOTHERAPY
US11266734B2 (en) 2016-06-15 2022-03-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
US20180128545A1 (en) 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US20190343951A1 (en) * 2017-01-13 2019-11-14 National Research Council Of Canada Method of optimizing peptide immuno-epitope by glycosylation, optimized peptide thereof and its use for conjugate vaccines
CN107973840A (zh) * 2017-01-13 2018-05-01 浙江海隆生物科技有限公司 CHO细胞表达牛传染性病气管炎病毒gD蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
WO2019063844A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Universiteit Antwerpen VACCINATION AGAINST SYNCYTIAL RESPIRATORY VIRUS
CN111511395B (zh) 2017-11-03 2024-10-15 武田疫苗股份有限公司 用于将寨卡病毒灭活和用于确定灭活完全性的方法
JP2021505549A (ja) 2017-11-30 2021-02-18 タケダ ワクチン, インコーポレイテッドTakeda Vaccines, Inc. ジカワクチン及び免疫原性組成物、ならびにその使用方法
CN109134624A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 天康生物股份有限公司 禽流感病毒血凝素抗原及其制备方法、应用和禽流感疫苗
CN109307772B (zh) * 2018-10-12 2021-12-24 华南农业大学 一种伪狂犬病毒gE和gB IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法
WO2020092365A1 (en) * 2018-10-29 2020-05-07 Binh Ha Rsv virus-like particles and methods of use thereof
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CN110184298B (zh) * 2019-05-15 2023-05-16 武汉璟泓科技股份有限公司 Hiv突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
KR102393872B1 (ko) * 2019-08-28 2022-05-04 엠브릭스 주식회사 바이러스 외피를 손상시키는 m2 단백질 유래 항바이러스 펩타이드 및 그의 용도
CN110568190A (zh) * 2019-08-30 2019-12-13 深圳国际旅行卫生保健中心 登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法
US20230398090A1 (en) * 2020-03-27 2023-12-14 Beech Tree Labs, Inc. Method of treating coronavirus infection by administration of ethyl mercury or thiol derivative thereof
CN116075315A (zh) * 2020-05-08 2023-05-05 刘扶东 嵌合流感疫苗
CN113322271A (zh) * 2020-06-24 2021-08-31 西南交通大学 基于酵母表面展示系统的covid-19亚单位疫苗
EP4260862A4 (en) 2020-12-11 2024-05-22 Advanced Protein Technologies Corp. ANTIVIRAL COMPOSITION CONTAINING FUCOSYLLACTOSE AS ACTIVE INGREDIENT
CN114632089B (zh) * 2020-12-16 2024-08-13 北京瑞博开拓医药科技有限公司 含酰基糖胺基团化合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用及疾病的治疗方法
US20240310376A1 (en) * 2021-01-29 2024-09-19 Flowmetric Life Sciences, Inc Detecting SARS-CoV-2 and Other Infective Agents
CA3215117A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Becton, Dickinson And Company Methods for enhancing specificity and sensitivity of group a streptococcus immunoassay
NZ796294A (en) * 2021-04-12 2024-07-05 Acad Sinica Improved coronavirus vaccine
WO2023131872A2 (en) * 2022-01-04 2023-07-13 Bartov Noa Rectal administration techniques
CN114106207B (zh) * 2022-01-24 2022-04-26 诺未科技（北京）有限公司 Ccl5的用途
WO2023178228A1 (en) * 2022-03-16 2023-09-21 Pharmalectin, Inc. Lectin-binding carbohydrates for treating viral infections
CN117229370A (zh) * 2022-06-08 2023-12-15 中科南京生命健康高等研究院 H5n6禽流感广谱性疫苗的开发及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007150054A2 (en) * 2006-06-24 2007-12-27 Mrugesh Shah Immunogenic compositions having altered glycosylations

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3953592A (en) 1973-09-27 1976-04-27 Recherche Et Industrie Therapeutiques (R.I.T.) Live influenza virus vaccines and preparation thereof
US4318903A (en) 1978-07-12 1982-03-09 Smithkline-Rit Live influenza virus vaccine and the preparation thereof
US4338296A (en) 1979-10-16 1982-07-06 Smithkline-Rit Influenza virus and process of producing a vaccine therefrom
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
JPS62501263A (ja) 1984-11-29 1987-05-21 スクリツプス　クリニツク　アンド　リサ−チ　フアウンデ−シヨン 脱グリコシル化ウイルス糖タンパク質に関連するポリペプチド類および抗体
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
DE3619720A1 (de) 1986-06-12 1987-12-17 Behringwerke Ag Hauptglykoprotein des menschlichen cytomegalovirus, seine herstellung und verwendung
NZ224422A (en) 1987-05-05 1990-11-27 Molecular Eng Ass Composition adapted for intranasal immunisation against viral infection comprising a glycoprotein complexed with a lipid
US5624898A (en) 1989-12-05 1997-04-29 Ramsey Foundation Method for administering neurologic agents to the brain
US6103238A (en) * 1992-03-13 2000-08-15 President And Fellows Of Harvard College Selectively deglycosylated human immunodeficiency virus type 1 envelope vaccines
EP0992580B1 (en) 1993-11-04 2005-03-09 Innogenetics N.V. Immunodominant human T-cell epitopes of Hepatitis C virus
DE69526636D1 (de) 1994-07-29 2002-06-13 Innogenetics Nv Gereinigte hepatitis-c-virus hüllproteine zur diagnostischen und therapeutischen verwendung
US20020045594A1 (en) 1997-02-14 2002-04-18 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
AU6535898A (en) * 1997-03-14 1998-10-12 President And Fellows Of Harvard College Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins
US6908617B1 (en) * 1997-11-10 2005-06-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Glycosylated modified primate lentivirus envelope polypeptides
JP2002531489A (ja) 1998-12-09 2002-09-24 カイロン コーポレイション 中枢神経系への神経栄養剤の投与
DE60036705T2 (de) 1999-05-12 2008-07-24 Statens Serum Institut Adjuvanskombinationen zur immunisierung und für vakzinen
FR2799974B1 (fr) * 1999-10-25 2001-11-30 Aventis Pasteur Complexe deglycosyle proteine env/cd4 et son utilisation pour la vaccination contre le vih
AU783208B2 (en) 1999-12-09 2005-10-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Method for administering a cytokine to the central nervous system and the lymphatic system
JP2003528925A (ja) 2000-04-03 2003-09-30 ザ ユニバーシティー オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エドゥケーション 低温適応型ウマインフルエンザウイルス
WO2002000856A2 (en) * 2000-06-30 2002-01-03 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology (Vib) Protein glycosylation modification in pichia pastoris
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
DE60229126D1 (de) * 2001-05-25 2008-11-13 Dobeel Corp Pre-s-protein von hepatitis-b-virus (hbv) als adjuvans und komponente eines hbv-impfstoffs
WO2003046150A2 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Neose Technologies, Inc. Glycoprotein remodeling using endoglycanases
US20030124652A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells
US7442375B2 (en) * 2002-12-13 2008-10-28 Case Western Reserve University Compositions of beta-defensin inducing agents
GB0416487D0 (en) * 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
AU2005322353B2 (en) 2004-12-23 2011-09-01 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
JP2008533175A (ja) 2005-03-16 2008-08-21 ユニバーシティ・オブ・オックスフォード Ｈｉｖ−１のためのマンノース免疫原
AU2006267174A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross-beta structure
FR2889572B1 (fr) * 2005-08-03 2009-01-30 Eaton Sam Sa Monegasque Electrovanne de regulation de pression a blocs electromagnetique et hydraulique distincts
US8206949B2 (en) 2005-11-15 2012-06-26 Glycofi, Inc. Production of glycoproteins with reduced O-glycosylation
ES2310072B1 (es) 2005-12-23 2009-11-16 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Nuevos peptidos determinantes antigenicos t colaboradores (/dth).
CU23544A1 (es) 2006-02-28 2010-06-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica
ES2534332T3 (es) * 2006-03-07 2015-04-21 Vaxinnate Corporation Composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas
WO2007133855A2 (en) 2006-03-27 2007-11-22 University Of Maryland Biotechnology Institute Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants
KR20090050056A (ko) * 2006-08-14 2009-05-19 메사츄세츠 인스티튜트 어브 테크놀로지 헤마글루티닌 폴리펩티드 및 시약 그리고 방법
US20100074916A1 (en) * 2006-10-10 2010-03-25 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Avian influenza vaccine
CA2676028A1 (en) 2007-01-18 2008-11-27 Samuel Bogoch Methods of determining lethality of pathogens and malignancies involving replikin peak genes
WO2008094687A2 (en) 2007-01-31 2008-08-07 New York University Gep, a novel chondrogenic growth factor and target in cartilage disorders
TW200907058A (en) 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
ES2784189T3 (es) 2009-03-27 2020-09-23 Academia Sinica Métodos y composiciones para la inmunización contra virus
EP2421892A1 (en) 2009-04-20 2012-02-29 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
WO2011044152A1 (en) 2009-10-05 2011-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer Protection against pandemic and seasonal strains of influenza
TWI537385B (zh) * 2010-11-04 2016-06-11 中央研究院 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007150054A2 (en) * 2006-06-24 2007-12-27 Mrugesh Shah Immunogenic compositions having altered glycosylations

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Munk K et al., Carbohydrate masking of an antigenic epitope of influenza virus haemagglutinin independent of oligosaccharide size. Glycobiology. 1992 Jun;2(3):233-40 *
S. Yasamin Mir-Shekari et al., The Glycosylation of the Influenza A Virus Hemagglutinin by Mammalian Cells. Vol. 272, No. 7, Issue of February 14, pp. 4027–4036, 1997. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2011009930A (es) 2012-05-08
ES2784189T3 (es) 2020-09-23
IL248607B1 (en) 2023-01-01
WO2010111687A3 (en) 2012-07-05
AU2016203431B2 (en) 2018-03-08
IL215430A0 (en) 2011-12-29
TW201102084A (en) 2011-01-16
EP2411049A2 (en) 2012-02-01
KR20170124619A (ko) 2017-11-10
AU2016203431A1 (en) 2016-06-16
CO6460701A2 (es) 2012-06-15
KR20140014348A (ko) 2014-02-06
IL248607B2 (en) 2023-05-01
US8741311B2 (en) 2014-06-03
EP2411049B1 (en) 2020-01-15
EP2411049A4 (en) 2013-12-04
AU2010229675A1 (en) 2011-10-27
CN103200961A (zh) 2013-07-10
AU2010229675B2 (en) 2016-02-25
CN107375919A (zh) 2017-11-24
US20100247571A1 (en) 2010-09-30
US20200046826A1 (en) 2020-02-13
KR101793195B1 (ko) 2017-11-02
HK1246650A1 (zh) 2018-09-14
CA2756206A1 (en) 2010-09-30
US20150335728A1 (en) 2015-11-26
CL2014002415A1 (es) 2015-01-02
IL215430A (en) 2016-11-30
CN107375919B (zh) 2022-07-29
US10307475B2 (en) 2019-06-04
US11672853B2 (en) 2023-06-13
BRPI1012635A2 (pt) 2016-06-21
WO2010111687A2 (en) 2010-09-30
IL248607A (en) 2016-12-29
CL2011002354A1 (es) 2012-06-15
CN103200961B (zh) 2017-10-27

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