CN116096404A

CN116096404A - 多肽、组合物及其用于治疗或限制感染发展的用途

Info

Publication number: CN116096404A
Application number: CN202180028727.9A
Authority: CN
Inventors: N·P·金; D·维斯勒; C·沃基; A·C·沃尔斯; J·Y·王
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2021-02-12
Publication date: 2023-05-09
Also published as: EP4103230A1; WO2021163438A1; MX2022009860A; PE20230301A1; AU2021221139A1; JP2023513720A; BR112022016220A2; KR20220142472A; CA3167318A1; CO2022011467A2

Abstract

本文公开了多肽、其纳米颗粒、相关的纳米颗粒组合物及其用于治疗或限制感染发展的用途，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:1‑84、138‑146和167‑184组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列。

Description

多肽、组合物及其用于治疗或限制感染发展的用途

交叉引用

本申请要求2020年2月14日提交的美国临时申请序列号62/977,036、2020 年6月30日提交的美国临时申请序列号63/046,159和2020年8月11日提交的美国临时申请序列号63/064,235的优先权；其各自通过引用整体并入本文。

联邦资助声明

本发明是根据美国国立卫生研究院授予的批准号HHSN272201700059C和 R01GM120553在政府支持下进行。美国政府享有本发明的一定权利。

序列表声明：

序列表的计算机可读形式通过电子递交方式与本申请一同提交，并且通过引用整体并入本申请中。序列列表包含在2021年2月11日创建的文件中，文件名为“20-1008-PCT_SeqList_ST25.txt”并且大小为1077kb。

背景技术

截止2020年1月，快速病毒分离和测序揭示，新出现的人畜共患病原体是一种与SARS-CoV紧密相关的冠状病毒，并且因此被命名为SARS-CoV-2。 SARS-CoV-2被认为起源于蝙蝠，这是基于从中菊头蝠(Rhinolophus affinis)中分离出紧密相关的RaTG13病毒以及在马来菊头蝠(Rhinolophus malayanus)的宏基因组学分析中鉴定出RmYN02基因组序列。

发明内容

在一个方面，本公开提供了包含与选自由SEQ ID NO:1-84、138-146和 167-184组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中X1不存在或是氨基酸接头，并且其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些或全部可以不存在。在各种具体实施方式中，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:1-12和142-151组成的组中的氨基酸序列，包含由SEQ ID NO:1-8组成的组中的氨基酸序列，或者包含由SEQ ID NO:1或5组成的组中的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本公开提供了包含多个此类多肽的纳米颗粒。

在另一方面，本公开提供了纳米颗粒，其包含：

(a)多个第一组件，每个第一组件包含多个相同的第一蛋白；和

(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个第二蛋白；

其中所述第一蛋白的氨基酸序列不同于所述第二蛋白的序列；其中所述多个第一组件与所述多个第二组件非公价相互作用以形成所述纳米颗粒；并且其中所述纳米颗粒在其表面上展示出存在于至少一个所述第二蛋白中的 SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分。在一个实施方式中，所述第二蛋白包含与选自由SEQ ID NO:85-124或185-193或由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或至少100％同一性的氨基酸序列，其中至少一个第二蛋白的X1包含 SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分，X2不存在或是氨基酸接头，并且括号中的残基是任选的。在另一个实施方式中，至少20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与来自 SARS-CoV-2或其变体或同源物的刺突(S)蛋白细胞外结构域(ECD)氨基酸序列、 S1亚基氨基酸序列、S2亚基氨基酸序列、S1受体结合结构域(RBD)氨基酸序列和/或N末端结构域(NTD)氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与选自由SEQ ID NO:125-137 组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些或全部可以不存在。

在各种其他方面，本公开提供了包含多个本文公开的纳米颗粒的组合物，编码本文公开的多肽的核酸分子诸如mRNA，包含可操作地连接至合适的控制序列的本文公开的核酸分子的表达载体，包含本文公开的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸和/或表达载体的细胞，以及包含本文公开的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、表达载体和/或细胞的药物组合物、试剂盒和疫苗。

在另一方面，本公开提供了治疗或限制SARS-CoV-2感染发展的方法，其包括向有需要的受试者施用有效治疗或限制所述感染发展的量的本文公开的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗。

附图说明

图1(A-H).SARS-CoV-2RBD纳米颗粒免疫原的设计、体外组装和表征(A) 呈融合前构象(PDB 6VYB)的SARS-CoV-2S-2P三聚体的分子表面表示。每个原聚体都有不同的颜色，且N连接的聚糖呈深蓝色(基于PDB 6WPS对N343位置处的聚糖进行建模，并且由PDB 6M0J对受体结合基序(RBM)进行建模)。单个开放RBD用框标出。(B)包括位置331和343处的N连接的聚糖的SARS-CoV-2 S RBD的分子表面表示。ACE2受体结合位点或RBM用黑色轮廓指示。(C)三聚体RBD-I53-50A(RBD呈浅蓝色并且I53-50A呈浅灰色)和五聚体I53-50B(橙色)组分的结构模型。在体外混合时，20个三聚体和12个五聚体组分组装而形成具有二十面体对称性的纳米颗粒免疫原。每个纳米颗粒展示出RBD的60个拷贝。(D)RBD-12GS-I53-50纳米颗粒免疫原的结构模型。虽然为简单起见，显示了所展示的RBD抗原和12残基接头的单一取向，但预期这些区域相对于 I53-50纳米颗粒支架是灵活的。(E)与未修饰I53-50纳米颗粒相比，RBD-8GS-、 RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒的动态光散射率(DLS)。(F)负染色的 RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒的代表性电子显微镜照片。在一个冷冻/解冻循环之后对样品进行成像。比例尺，100nm。(G)单体RBD相对于三聚体RBD-8GS-I53-50A组分的氢/氘交换质谱法(此处表示为蝴蝶图)确认了RBD构象的保留，包括在由已知中和Ab识别的表位处。在图中，沿水平序列轴的每个点代表一个肽，其中对氘摄取监测3秒至20个小时。蝴蝶图上显示的误差线指示两个实验重复的标准偏差。以下的差异图表明，单体RBD和RBD- 8GS-I53-50A在RBD的局部结构排序上几乎是相同的。(H)饼图总结了五种蛋白质样品中N连接的糖基化位点N331和N343处存在的聚糖群体：单体RBD、 S-2P三聚体和RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50A三聚体组分。两个位点处的大部分复合聚糖被岩藻糖基化；非岩藻糖基化聚糖的小部分群体通过虚线衬托。Oligo，寡甘露糖。

图2(A-B).SARS-CoV-2RBD-I53-50纳米颗粒免疫原的抗原表征(A)固定化mACE2-Fc、CR3022 mAb和S309 mAb与RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD- 16GS-I53-50纳米颗粒结合的生物层干涉法，展示出50％或100％价态的RBD抗原。每个实验中包括单体SARS-CoV-2RBD作为参考。(B)针对图(A)中的每个实验对880s处、接近缔合阶段结束时的结合信号进行作图，以便能够比较从每个纳米颗粒获得的结合信号。

图3(A-E).RBD纳米颗粒免疫原和S-2P三聚体的物理和抗原稳定性(A) 通过盐酸胍进行的化学变性。使用350/320nm处的内在色氨酸荧光发射的比率来监测蛋白三级结构。阴影区域指示主要转变。示出了来自三个独立实验之一的代表性数据。(B)四周内SDS-PAGE和nsEM稳定性数据的总结。SDS-PAGE 在任何样品中均未显示可检测的降解。nsEM揭示S-2P三聚体在2-8℃下温育3 天之后和在22-27℃下四周之后明显展开。N/A，未评估。(C)四周内抗原性数据的总结。在不同温度下储存之后，通过生物层干涉法分析抗原的mACE2-Fc(实线)和CR3022 mAb(虚线)结合。绘制的值表示在每个时间点标准化到对应<-70℃ 样品的接近缔合阶段结束时的信号幅度。(B)四周内UV/vis稳定性数据的总结。对320/280nm处的吸光度的比率进行作图作为微粒散射的量度。只有S-2P三聚体和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒显示散射的任何增加，并且仅在环境温度下。 (E)RBD-12GS-I53-50纳米颗粒的DLS指示在所有温度下和时间点处都没有可检测的聚集体的单分散物种。图B–E中的数据来自进行一次的四周实时稳定性研究。

图4(A-D).RBD-I53-50纳米颗粒免疫原在BALB/c和人类免疫组库小鼠中引起有效的抗体应答(A–B)BALB/c小鼠中引发后(第2周)(A)和加强后(第5周) (B)的抗S结合滴度，通过ELISA测量。每个符号表示单个动物，并且每个组的几何平均值由水平线指示。点线表示测定的检测下限。8GS，RBD-8GS-I53-50； 12GS，RBD-12GS-I53-50；16GS，RBD-16GS-I53-50；HCS，人康复血清。插图描绘研究时间线。免疫化实验重复两次，并示出了代表性数据。Kymab Darwin^TM小鼠中(C–D)引发后(第2周)(C)和加强后(第5周)(D)的抗S结合滴度，所述小鼠对于非重排的人抗体可变区和恒定区种系组库是转基因的，通过ELISA测量并且如在(A)中作图。插图描绘研究时间线。免疫化实验进行一次。

图5(A-H).RBD-I53-50纳米颗粒免疫原引发有效和保护性中和抗体应答 (A–B)来自用单体RBD、S-2P三聚体或RBD-I53-50纳米颗粒免疫化的小鼠的引发后(A)或加强后(B)的血清假病毒中和滴度。每个圆圈表示单个动物的倒数 IC50。每个组的几何平均值由水平线指示。检测限显示为灰色点线。动物实验进行两次，并且示出了来自一式两份测量的代表性数据。(C-D)来自如(A)中所述免疫化的小鼠的引发后(C)或加强后(D)的血清活病毒中和滴度。(E-F)来自如 (A)中所述免疫化的Kymab Darwin^TM小鼠的引发后(E)和加强后(F)的血清假病毒中和滴度。动物实验进行一次，并且中和测定至少一式两份进行。(G-H)加强后七周，将每组八只BALB/c小鼠用SARS-CoV-2MA刺激。刺激后两天，评估肺组织(G)和鼻甲(H)中的病毒滴度。检测限描绘为灰色点线。

图6(A-J).RBD纳米颗粒疫苗在小鼠和非人灵长类动物中引发稳健的B细胞应答和靶向多个表位的抗体(A-B)跨每个免疫化组检测的(A)RBD+B细胞 (B220+CD3-CD138-)和(B)RBD+GC前体和B细胞(CD38+/-GL7+)的数量。(C-D) (C)RBD+GC前体和B细胞(CD38+/-GL7+)和(D)IgD+、IgM+或类别转换的(IgM -IgD-；swIg+)RBD+GC前体和B细胞的频率。(A-D)N＝6，跨每组的两个实验。通过单向ANOVA确定统计显著性，并且对于p值小于0.05的任何组进行Tukey 多重比较检验。显著性用星指示：*p<0.05，****p<0.0001。(E)加强后(第5周)Kymab Darwin^TM小鼠中S-2P ELISA结合滴度(图4D)与假病毒中和滴度(图5F) 的比率。所述比率是所测试的所有HCS的[五只小鼠的GMT(EC50)]:[五只小鼠的GMT(IC50)]或EC50:IC50。值越低表示质量应答越高。(F)加强后(第5周) BALB/c小鼠中S-2P ELISA结合滴度(图4B)与假病毒(图5B)或活病毒(图5D)中和滴度的比率。所述比率是所测试的所有HCS的[十只小鼠的GMT(EC50)]:[十只小鼠的GMT(IC50)]或EC50:IC50。(G)结合单体ACE2、CR3022 Fab和S309 Fab的SARS-CoV-2RBD。(H-J)通过竞争BLI确定疫苗引起的Ab表位特异性。将一系列稀释度的多克隆NHP Fab在BLI尖端上用RBD预温育。通过在每个稀释点添加竞争物来维持多克隆Fab浓度。一系列1:3稀释度的多克隆Fab从深色至浅色表示，其中深灰色线表示加载到apo-RBD(无竞争)的竞争物。与(H)200nM ACE2、(I)400nM CR3022或(J)20nM S309进行竞争。

图7(A-E).RBD纳米颗粒免疫原的另外表征。(A)Superose^TM 6Increase 10/300GL上RBD-I53-50纳米颗粒、未修饰的I53-50纳米颗粒和三聚体RBD- I53-50A组分的尺寸排阻色谱法。(B)SEC纯化的RBD-I53-50纳米颗粒在一个冷冻/解冻循环之前和之后的还原和非还原条件下的SDS-PAGE。(C)在一个冷冻/ 解冻循环之前和之后RBD-I53-50纳米颗粒的动态光散射指示每个样品中缺乏可检测聚集体的单分散纳米颗粒。(D)氢/氘交换质谱法，在此表示为热图，揭示了RBD(PDB 6W41)上的结构可达性和动力学。颜色代码指示氘摄取水平。单体 RBD和RBD-8GS-I53-50A具有难以区分的摄取模式，并且在每个时间点都呈现在单个热图中。(E)顶部，条形图揭示了五种蛋白质样品中N连接的糖基化位点N331和N343处的类似聚糖谱：单体RBD、S-2P三聚体和RBD-8GS-、RBD- 12GS-和RBD-16GS-I53-50A三聚体组分。底部，在S-2P三聚体中发现的除N331 和N343之外的其他N连接的糖基化位点上进行的全面聚糖图谱。每个条形图的轴范围为0％-80％。M9至M5，具有9至5个甘露糖残基的寡甘露糖，呈深灰色。杂交型和F杂交型(有或没有岩藻糖基化的杂交类型)是灰色的。复合物类型的亚型，以浅灰色显示，基于触角数和岩藻糖基化进行分类。

图8(A-B).通过生物层干涉法确定hACE2和CR3022 Fab亲和力。(A)单体hACE2与固定化单体RBD和三聚体RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53 -50A组分结合的分析。(B)CR3022 Fab与固定化单体RBD和三聚体RBD-8GS-、 RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50A组分结合的分析。通过将来自六个分析物浓度的动力学数据与1:1结合模型进行全局拟合来确定亲和常数(表5)。

图9(A-D).部分价态的RBD纳米颗粒的表征(A)负染色的RBD-8GS-、 RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒的代表性电子显微镜照片，展示出50％价态的RBD。在一个冷冻/解冻循环之后对样品进行成像。比例尺，100nm。(B) 纯化的RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒的SDS-PAGE，展示出50％价态的RBD。携带RBD和未修饰的I53-50A亚基两者在凝胶上均可见。 (C)冷冻/解冻之前和之后50％价态的RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53- 50纳米颗粒的动态光散射(DLS)。未观察到聚集体或未组装的组分。(D)50％价态的RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒的UV/vis吸收光谱。样品中的浊度较低，如320nm处的低吸光度指示。

图10(A-E).第28天的稳定性数据。(A)纯化的单体RBD、S-2P三聚体、 RBD-I53-50A组分和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒在还原和非还原条件下的 SDS-PAGE。在所分析的任何温度下温育四周之后，没有观察到任何免疫原的降解。(B)在三个温度下温育四周之后，通过BLI分析mACE2-Fc和CR3022 IgG 与单体RBD、RBD-I53-50A三聚体组分和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒的结合。单体RBD在纳米颗粒组分和纳米颗粒BLI实验中用作参考标准物。RBD-12GS- I53-50纳米颗粒在四周之后在较高温度下失去最小的结合；其余的抗原在研究过程中没有失去任何mACE2-Fc或CR3022 IgG结合。(C)UV/vis光谱在近UV中显示最小的吸光度，表明在三个温度下温育四周之后缺乏聚集/颗粒，S-2P三聚体除外，其在环境温度下在320nm左右获得显著的吸光度。RBD-12GS-I53-50 纳米颗粒样品在若干较早的时间点在22℃-27℃下在320nm附近表现出类似的峰(参见补充条目2)。(D)在三个温度下温育四周之后，RBD-12GS-I53-50纳米颗粒(顶部)和S-2P三聚体(底部)的nsEM。在所有温度下都观察到完整的单分散纳米颗粒，没有观察到降解或聚集。S-2P三聚体在<-70℃和22℃-27℃样品中保持良好折叠，但在2℃-8℃下温育的样品中展开。比例尺：RBD-12GS-I53-50，100nm；S-2P，50nm。(E)在三个温度下温育四周之后RBD-12GS-I53-50纳米颗粒的DLS。在任何温度下均未观察到聚集。

图11.疫苗引起的Ab和抗支架抗体滴度的亚类。在BALB/c小鼠中引发后 (左)和加强后(右)两周，对(顶部)三聚体I53-50A组分、(中间)五聚体I53-50B组分和(底部)组装I53-50纳米颗粒具有特异性的疫苗引起的IgG的水平。

图12(A-D).B细胞门控策略和疫苗引起的免疫应答的持久性。(A)用于评价RBD特异性B细胞、生发中心(GC)前体和B细胞(CD38+/-GL7+)和B细胞同种型的代表性门控策略。顶行，用于测量活的非双B细胞的数量的门控策略。进一步分析这些细胞，如在中间行和底行中所描绘。中间行，来自用AddaVax^TM配制的单体RBD免疫化的小鼠的代表性数据。将不结合诱饵的 RBD+CD38+/-GL7+细胞计数为抗原特异性GC前体和B细胞。底行，来自用AddaVax^TM配制的RBD-12GS-I53-50纳米颗粒免疫化的小鼠的代表性数据。进一步分析GC前体和B细胞以表征B细胞受体同种型。(B–C)在加强后20周 (RBD-16GS-I53-50)或24周(单体RBD、S-2P、RBD-8GS-I53-50和RBD-12GS-I53- 50)收集的血清中(B)S特异性IgG和(C)假病毒中和的水平。从每组中没有用 MA-SARS-CoV-2刺激的两只动物中收集血清。(D)用S-2P三聚体或RBD-16GS- I53-50纳米颗粒免疫化的BALB/c小鼠的骨髓中S-2P特异性Ab分泌细胞的数量，通过ELISpot测量。在加强后17周收获细胞(参见插图B)。动物实验进行一次。通过双尾非配对t检验确定统计显著性。*，p＝0.02。

具体实施方式

引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。在此申请中，除非另外声明，否则所用的技术可以见于任何若干熟知的参考文献，诸如：Molecular Cloning: ALaboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,第185卷,D.Goeddel编辑,1991.Academic Press,San Diego,CA),Methods in Enzymology中的“Guide to ProteinPurification”(M.P.Deutshcer编辑,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Innis等人1990.Academic Press, San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transfer and ExpressionProtocols,第109-128页,E.J.Murray编辑,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)；和the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。

除非上下文中另外明确指明，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种” 和“所述”包括复数个指示物。

如本文所使用，“约”意指所叙述的参数的+/-5％。

如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸 (Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro； P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

除非上下文另外明确规定，否则本公开任何方面的所有实施方式均可以组合使用。

除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包括”、 “包含”等应在包括性的意义上解释，而不是在排他性或穷举的意义上；也就是说，在“包括但不限于”的意义上解释。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，词语“本文”、“以上”和“以下”和类似含义的词语在本申请中使用时应是指整个本申请而非本申请的任何特定部分。

在第一方面，本公开提供了包含与选自由SEQ ID NO:1-84、138-146和167- 184组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中X1不存在或是氨基酸接头，并且其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些或全部可以不存在。

如以下示例中所示，这一方面的多肽可以用于生成引起针对SARS-CoV-2 的有效和保护性抗体应答的自组装蛋白纳米颗粒免疫原。纳米颗粒疫苗诱导的中和抗体滴度是融合前稳定化的S胞外结构域三聚体的大约十倍高，尽管剂量低于其五分之一。通过纳米颗粒免疫原引起的抗体靶向多个不同的表位，这表明它们可能不易于逃避突变，并且表现出比康复人血清显著更低的结合:中和比率，这可以使疫苗相关增强呼吸系统疾病的风险最小化。

本公开的这一方面的示例性多肽的氨基酸序列在下文中提供。

表1

>HexaPro-12GS-He-I5350A*-His：

>HexaPro-FO-12GS-He-I5350A*-His：

>HexaPro-delHR2-12GS-He-I5350A*-His：

>HexaPro-delHR2-FO-12GS-He-I5350A*-His：

RBD-noRpk-50A变体

>SARS-CoV-2 RBD_N501Y_16GS-he-I53-50A*-His(UK)：

>SARS-CoV-2 RBD_K417N_E484K_N501Y_16GS-he-I53-50A*-His(南非)

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_Brazil-ver_K417T_E484K_N501Y (巴西)：

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_E484K：

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_L452R：

>SARS-CoV-2 RBD_N501Y_16GS-he-I53-50A*-His(UK)：

>SARS-CoV-2 RBD_K417N_E484K_N501Y_16GS-he-I53-50A*-His(南非)

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_Brazil-ver_K417T_E484K_N501Y (巴西)：

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_E484K：

>SARS-CoV-2_RBD-noRpk_16GS_I53-50A*_L452R：

在各种实施方式中，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:1-12和142-151组成的组中的氨基酸序列。在各种其他实施方式中，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-8组成的组、或选自由SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:5-8组成的组、或选自由SEQ ID NO:1和5组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列，在以下实施例中作为示例性实施方式提供。

如在整个本申请中所用，术语“多肽”在其最广泛的意义上是指一系列亚基D 或L氨基酸，包括经典和非经典氨基酸本文所述的多肽可以化学合成或重组表达。所述多肽可以连接至其他化合物，以诸如通过聚乙二醇化、糖基化、磷酸化、糖基化促进体内半衰期的增加，或者可以作为Fc融合体或去免疫化变体产生。如本领域技术人员所理解的，这种连接可以是共价或非共价的。

在第二方面，本公开提供了包含多个根据本发明的第一方面的任何实施方式或实施方式的组合的多肽的纳米颗粒。在这一方面，多个(2、3、4、5、10、 20、25、50、60、100或更多个)本发明的第一方面的多肽存在于任何合适的纳米颗粒中。

本公开的任何实施方式或方面的纳米颗粒可以具有用于预期用途的任何合适的尺寸，包括但不限于约10nm至约100nm的直径。

在第三方面，本公开提供了纳米颗粒，其包含：

(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个第二蛋白；

其中所述第一蛋白的氨基酸序列不同于所述第二蛋白的序列；

其中所述多个第一组件与所述多个第二组件非共价相互作用以形成所述纳米颗粒；并且

其中所述纳米颗粒在其表面上展示出存在于至少一个所述第二蛋白中的 SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分。

在这一方面，所述纳米颗粒形成通过第一组件和第二组件的非共价相互作用形成的三维结构。多个(2、3、4、5、6或更多个)第一多肽自组装以形成第一组件，并且多个(2、3、4、5、6或更多个)第二多肽自组装以形成第二组件。单个自组装蛋白的非共价相互作用导致第一蛋白自组装成第一组件，并且第二蛋白自组装成第二组件。然后多个这些第一组件和第二组件通过界面非共价地自组装以产生纳米颗粒。第一组件中第一多肽的数量可以与第二组件中第二多肽的数量相同或不同。本公开的纳米颗粒可以具有施用于预期用途的任何形状和/ 或对称性，包括但不限于四面体、八面体、二十面体、十二面体和其截断形式。在一个示例性实施方式中，每个第一组件是五聚体，并且每个第二组件是三聚体。

第一组件和第二组件组装成纳米颗粒不是随机的，而是由各种组件之间的非共价相互作用(例如，氢键、静电作用、范德华力、疏水作用)(即，第一组件之间的相互作用、第二组件之间的相互作用和第一组件与第二组件之间的相互作用的累积效应)决定的。因此，本公开的纳米颗粒包括对称重复的、非天然的、非共价的蛋白质-蛋白质界面，其将第一组件和第二组件定向为具有高度有序结构的纳米颗粒。虽然纳米颗粒的形成是由于第一组件和第二组件的非共价相互作用，但在一些实施方式中，一旦形成，纳米颗粒可以通过第一组件和第二组件中的蛋白质之间的共价连接来稳定化。可以使用任何合适的共价键，包括但不限于二硫键和异肽键。

适用于产生本公开的组件的第一蛋白和第二蛋白可以是具有给定纳米颗粒的任何合适的长度。第一蛋白和第二蛋白的长度可以在30与250个氨基酸之间。

在一个实施方式中，所述第二蛋白包含与选自由SEQ ID NO:85-124或 185-193(表2)组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列，其中至少一个第二蛋白的X1包含SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分，X2不存在或是氨基酸接头，并且括号中的残基是任选的。所述任选残基可以存在，或者任选残基中的一些(即：1、2、3、4、5、6或更多)或全部可以不存在。

表2

在此第三方面的各种实施方式中，所述第二蛋白包含与选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列。在各种其他实施方式中，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组、或选自由SEQ ID NO:85-86或 SEQ ID NO:85组成的组中的氨基酸序列，在以下实施例中作为示例性实施方式提供。

此第三方面的纳米颗粒在其表面上展示出存在于至少一个所述第二蛋白中的SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分。在一个实施方式中， SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分作为与至少一个第二蛋白的融合蛋白存在；它可以存在于纳米颗粒中的单个第二蛋白上(存在于纳米颗粒的单个拷贝中)或存在于纳米颗粒的多个第二蛋白中。在各种实施方式中， SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物存在于纳米颗粒的至少20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％的第二蛋白中。

在这些融合蛋白中，第二蛋白可以直接与SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物接合，或者第二蛋白和SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物可以使用接头接合。如在整个本公开中所用，接头是用于共价接合两个多肽的短(例如，2-30) 氨基酸序列。可以使用任何合适的接头序列，包括但不限于本文公开的那些。

可以使用任何合适的SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物。在此第三方面的一个实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或 100％的第二蛋白中的X1包含与来自SARS-CoV-2或其变体或同源物的刺突(S) 蛋白细胞外结构域(ECD)氨基酸序列、S1亚基氨基酸序列、S2亚基氨基酸序列、 S1受体结合结构域(RBD)氨基酸序列和/或N末端结构域(NTD)氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在各种另外的实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的第二蛋白中的X1包含与选自由SEQ ID NO:125-137组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFH AIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYV SQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALE PLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLK YNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNIT NLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTK LNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNS NNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFP LQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNF NGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSV ITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCL IGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSGAGSVASQSIIAYTMSLGAENS VAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSF CTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPS KRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLT DEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYE NQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNF GAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLA ATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFT TAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVV IGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK(刺突(S)蛋白细胞外结构域(ECD)) SEQ ID NO:127

(ETGT)QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSN VTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKT QSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNC TFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQG FSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPR TFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIV RFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCY GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVE GFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKN KCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPC SFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVF QTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSGAGSVASQSIIAYTM SLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNL LLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQIL PDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLT VLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVT QNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVK QLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIR ASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPA QEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVS GNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASV VNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK(刺突(S)蛋白细胞外结构域 (ECD)，包括括号中的与信号肽相关的N末端接头，其可以存在或不存在)SEQ ID NO:128

MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETGTQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRG VYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFN DGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFL GVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRS YLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSET KCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAW NRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDE VRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFR KSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV VVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQ QFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNC TEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGI CASYQTQTNSPSGAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEI LPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNT QEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAG FIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSG WTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDS LSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAE VQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFC GKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVF VSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSF KEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQ ELGKYEQYIK(SEQ ID NO:129)mu磷酸酶信号肽，并且ETGT作为信号肽切割之后的残余物留下

在一个具体实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125(SARS-CoV-2 RBD，在以下实施例中作为示例性实施方式提供)的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在各种实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或100％的第二蛋白中的X1在1、2、3、4、5、6、7或全部8个位置处包含相对于SEQ ID NO:125的选自由K90N、K90T、G119S、Y126F、T151I、E157K、E157A、S167P、N174Y和L125R组成的组中的突变，包括但不限于包含以下天然存在的突变之一或突变组合的突变：

N174Y(UK变体)；

K90N/E157K/N174Y(南非变体)；

K90N或T/E157K/N174Y(巴西变体)；或

L125R(LA变体)。

这些天然存在的变体的氨基酸残基编号是基于其在SEQ ID NO:125中的位置，而它们通常是基于其在刺突蛋白中的残基数来描述(即：刺突中的K417＝ RBD中的K90；刺突中的G446＝RBD中的G119；刺突中的L452＝RBD中的 L125；刺突中的Y453＝RBD中的Y126；刺突中的T478＝RBD中的T151；刺突中的E484＝RBD中的E157；刺突中的S494＝RBD中的S167；刺突中的N501 ＝RBD中的N174)。

在各种另外的实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的第二蛋白中的X1在1、2、3、4、5、6、7或全部8个位置处包含相对于SEQ ID NO:130的选自由L18F、T20N、P26S、残基69-70的缺失、 D80A、D138Y、R190S、D215G、K417N、K417T、G446S、L452R、Y453F、 T478I、E484K、S494P、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、A701V、T716L组成的组中的突变，包括但不限于包含以下天然存在的突变之一或突变组合的突变：

N501Y，任选地还包括残基69-70中一者或两者的缺失、A570D、D614G、 P681H和/或T716L中的1、2、3、4或5个(UK变体)；

K417N/E484K/N501Y，任选地还包括L18F、D80A、D215G、D614G和/或 A701V中的1、2、3、4或5个(南非变体)；

K417N或T/E484K/N501Y，任选地还包括L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、D614G和/或H655Y中的1、2、3、4或5个(巴西变体)；或

L452R(LA变体)。

如本领域技术人员将理解的，当X1包含与SEQ ID NO:125(或任何其他公开的抗原)的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列时，它可以在氨基或羧基末端处包括另外的氨基酸。因此，例如当X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列时，X1 可以包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列，其包括在N末端处相对于SEQ ID NO:125的另外的氨基酸。

在另一个实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的第二蛋白中的X1包含1、2、3或全部4个相对于SEQ ID NO:125 的突变，所述突变选自由K90N、K90T、E157K和N174Y组成的组。

所述多个第二组件可以总计包含单个SARS-CoV-2抗原，或者可以包含2 个或更多个不同的SARS-CoV-2抗原。在一个实施方式中，所述多个第二组件总计包含2、3、4、5、6、7、8或更多个不同的SARS-CoV-2抗原。在一个示例性的这种实施方式中，所述多个第二组件总计包含2、3、4、5、6、7、8或更多个包含SEQ ID NO:1-84中任一个的氨基酸序列的多肽。

在一个实施方式中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的第二蛋白中的X1包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在另一个实施方式中，100％的第二蛋白中的X1包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列，并且所有第二蛋白是相同的。

在另一个实施方式中，所有第二组件包含至少一个包含SEQ ID NO:1-84中任一个的氨基酸序列的第二蛋白。在另一个实施方式中，所有第二蛋白包含SEQ ID NO:1-84中任一个的氨基酸序列。

所述纳米颗粒包含多个相同的第一蛋白。在一个实施方式中，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些(即：1、2、3、4、5、6或更多)或全部可以不存在。在一个具体实施方式中，所述第一蛋白包含与SEQ ID NO:155的氨基酸序列具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列。

I53-50-v4五聚体组分

I53-50-v1五聚体组分B

I53-50-v2五聚体组分B

I53-50-v3五聚体组分B

在一个示例性实施方式中，所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。在各种另外的此类实施方式中，至少一个或多个(20％、33％、40％、50％、 75％等)第二组件包含至少一个包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列的第二蛋白，或者所有第二组件包含至少一个包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列的第二蛋白。

在一个具体实施方式中，

(a)第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，其中至少20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个具体实施方式中，

(a)第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，其中至少50％、60％、 70％、80％、90％或100％的第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个具体实施方式中：

(a)第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含选自由SEQ ID NO:1-8组成的组中的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中：

(a)第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列。

本公开还提供了包含多个本公开的任何实施方式或实施方式组合的纳米颗粒的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含多个以上公开的具体实施方式的纳米颗粒。

在第四方面，本公开提供了编码本公开的多肽或融合蛋白的核酸。所述核酸序列可以包含RNA(诸如mRNA)或DNA。此类核酸序列可以包含用于促进编码的蛋白的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polyA序列、修饰的Kozak 序列以及编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，对于本领域技术人员而言清楚的是，何种核酸序列将编码本发明的蛋白质。

在第五方面，本公开提供了表达载体，其包含可操作地连接至合适的控制序列的本公开的任何实施方式或实施方式组合的分离的核酸。“表达载体”包括将核酸编码区域或基因可操作地连接至能够实现基因产物表达的任何控制序列的载体。可操作地连接至本公开的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子的表达的核酸序列。控制序列不必与核酸序列邻接，只要所述控制序列起作用以引导所述核酸序列的表达即可。因此，例如，在启动子序列与核酸序列之间可以存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”至所述编码序列。其他此类控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。此类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任一种驱动，所述启动子包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF)或诱导型的(由许多诱导型启动子中的任一种驱动，所述诱导型启动子包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇响应性)。

在第六方面，本公开提供了细胞，其包含本公开的任何实施方式或实施方式组合的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸和/或表达载体，其中所述细胞可以是原核生物或真核生物，诸如哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞可以用本公开的核酸或表达载体瞬时或稳定地转染。表达载体向原核和真核细胞的这种转染可以通过本领域已知的任何技术来完成。产生根据本发明的多肽的方法是本发明的另外部分。所述方法包括以下步骤：(a)在有利于多肽表达的条件下培养根据本发明的这一方面的宿主，和(b)任选地，回收表达的多肽。

在第七方面，本公开提供了药物组合物/疫苗，其包含

(a)本文的实施方式或实施方式组合的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、表达载体和/或细胞；和

(b)药学上可接受的载剂。

如以下实施例中所示，纳米颗粒免疫原引起针对SARS-CoV-2的有效和保护性抗体应答。本公开的纳米颗粒疫苗诱导的中和抗体滴度是融合前稳定化的S 胞外结构域三聚体的大约十倍高，尽管剂量低于其五分之一。通过纳米颗粒免疫原引起的抗体靶向多个不同的表位，这表明它们可能不易于逃避突变，并且表现出比康复人血清显著更低的结合:中和比率，这可以使疫苗相关增强呼吸系统疾病的风险最小化。

所述组合物/疫苗还可以包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)增量剂； (d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲液。在一些实施方式中，药物组合物中的缓冲液是Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。组合物还可以包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施方式中，组合物包含防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。在其他实施方式中，组合物包含增量剂，如甘氨酸。在又其他实施方式中，组合物包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨糖醇三月桂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯或其组合。组合物还可以包含张力调节剂，例如使配制品与人血基本等渗或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露糖醇、右旋糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施方式中，组合物另外包含稳定剂，例如以冻干或液体形式基本上防止或减少纳米结构的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。

纳米颗粒可以是组合物中唯一的活性剂，或者组合物还可以包含一种或多种适用于预期用途的其他试剂，包括但不限于通常刺激免疫系统和改善整体免疫应答的佐剂。可以使用任何合适的佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。示例性佐剂包括但不限于Adju-Phos^TM、Adjumer^TM、白蛋白-肝素微粒、海藻葡聚糖、阿尔加穆林(Algammulin)、明矾、抗原配制品、 AS-2佐剂、自体树突状细胞、自体PBMC、Avridine^TM、B7-2、BAK、BAY R1005、布比卡因、盐酸布比卡因、BWZL、骨化三醇、磷酸钙凝胶、CCR5肽、CFA、霍乱全毒素(CT)和霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素A1-亚基-蛋白A D片段融合蛋白、CpG、CRL1005、含细胞因子的脂质体、D-Murapalmitine、DDA、DHEA、白喉类毒素、DL-PGL、DMPC、DMPG、DOC/明矾复合物、禽痘、弗氏(Freund’s) 完全佐剂、γ菊粉、Gerbu佐剂、GM-CSF、GMDP、hGM-CSF、hIL-12(N222L)、 hTNF-α、IFA、pcDNA3中的IFN-γ、IL-12DNA、IL-12质粒、IL-12/GMCSF质粒(Sykes)、pcDNA3中的IL-2、IL-2/Ig质粒、IL-2/Ig蛋白、IL-4、pcDNA3中的 IL-4、Imiquimod^TM、ImmTher^TM、含有针对共刺激分子的抗体的免疫脂质体、干扰素-γ、白介素-1β、白介素-12、白介素-2、白介素-7、ISCOM(s)^TM、Iscoprep 7.0.3^TM、钥孔戚血蓝素、基于脂质的佐剂、脂质体、洛索立宾(Loxoribine)、 LT(R192G)、LT-OA或LT口服佐剂、LT-R192G、LTK63、LTK72、MF59、 MONTANIDE ISA51、MONTANIDE ISA 720、MPL.TM.、MPL-SE、MTP-PE、 MTP-PE脂质体、Murametide、Murapalmitine、NAGO、nCT天然霍乱毒素、非离子型表面活性剂囊泡、霍乱毒素mCT-E112K的无毒突变体E112K、对羟基苯甲酸甲酯、pCIL-10、pCIL12、pCMVmCAT1、pCMVN、Peptomer-NP、Pleuran、 PLG、PLGA、PGA和PLA、Pluronic L121、PMMA、PODDS^TM、聚rA:聚rU、聚山梨醇酯80、螺旋蛋白(Protein Cochleates)、QS-21、QuadriA皂苷、Quil-A、 Rehydragel HPA、Rehydragel LV、RIBI、Ribilike佐剂系统(MPL、TMD、CWS)、 S-28463、SAF-1、Sclavo肽、Sendai脂蛋白体、含有Sendai的脂质基质、Span 85、Specol、角鲨烷1、角鲨烯2、硬脂酰酪氨酸、破伤风类毒素(TT)、Theramide^TM、苏氨酰基胞壁酰二肽(TMDP)、Ty颗粒和Walter Reed脂质体。佐剂的选择取决于待治疗的受试者。优选地，使用药学上可接受的佐剂。

在第八方面，本公开提供了治疗或限制SARS-CoV-2感染发展的方法，其包括向有需要的受试者施用有效治疗或限制所述感染发展的量的本文的任何实施方式的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗(被称为“免疫原性组合物”)。受试者可以是任何合适的哺乳动物受试者，包括但不限于人受试者。

当所述方法包括限制SARS-CoV-2感染时，将免疫原性组合物预防性地施用至未知被感染，但可能处于暴露于SARS-CoV-2风险中的受试者。如本文所用，“限制发展”包括但不限于完成以下一项或多项：(a)在受试者中生成针对 SARS-CoV-2的免疫应答(抗体和/或基于细胞)；(b)在受试者中生成针对 SARS-CoV-2的中和抗体，所述中和抗体(b)限制受试者在暴露于SARS-CoV-2 之后SARS-CoV-2滴度的积累；和/或(c)限制或预防感染之后SARS-CoV-2症状的发展。SARS-CoV-2感染的示例性症状包括但不限于发烧、疲劳、咳嗽、呼吸急促、胸闷和/或疼痛、嗅觉丧失或减弱、味觉丧失或减弱以及呼吸系统问题，包括但不限于肺炎、支气管炎、严重急性呼吸综合征(SARS)以及上下呼吸道感染。

在一个实施方式中，所述方法在未知感染SARS-CoV-2的受试者中生成免疫应答，其中所述免疫应答用于限制感染发展和SARS-CoV-2感染的症状。在一个实施方式中，所述免疫应答包括生成针对SARS-CoV-2的中和抗体。在一个示例性的这种实施方式中，所述免疫应答包括生成SARS-CoV-2刺突蛋白抗体特异性应答，其平均几何滴度为至少1x10⁵。在另一个实施方式中，所述免疫应答包含生成针对多个抗原表位的抗体。

如本文所用,“有效量”是指有效治疗和/或限制SARS-CoV-2感染的免疫原性组合物的量。本文的任何实施方式的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗通常被配制为药物组合物，诸如以上公开的那些，并且可以通过任何合适的途径施用，包括口服、肠胃外、通过吸入喷雾、直肠或者以含有常规药学上可接受的载剂、佐剂和媒介物的剂量单位配制品局部施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、颅内、胸内、输注技术或腹膜内。多肽组合物也可以通过微球、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)或其他微粒递送系统或引入合适组织(诸如血液)中的持续释放配制品来施用。可以调整剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。合适的剂量范围可以是，例如，0.1μg/kg-100mg/kg体重的多肽或其纳米颗粒。组合物可以在单次推注中递送，或者可以如由主治医务人员所确定多于一次(例如，2、3、4、5或更多次)进行施用。

在一个实施方式中，所述施用包括施用第一剂量和第二剂量的免疫原性组合物，其中第二剂量在施用第一剂量之后约2周至约12周或约4周至约12周进行施用。在各种另外的实施方式中，第二剂量在第一剂量之后约2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11或12周进行施用。在另一个实施方式中，可以施用第三剂量，其中第二剂量在第一剂量之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12周进行施用，并且第三剂量在第二剂量之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或12周进行施用。

在引发-加强给药的各种其他实施方式中，所述施用包括：

(a)向受试者施用引发剂量的DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗，其中DNA、 mRNA或腺病毒载体疫苗编码与SEQ ID NO:125-137的氨基酸序列具有至少 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和

(b)向受试者施用加强剂量的本文公开的任何实施方式或组合的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗。

在一个替代性实施方式中，所述施用包括：

(a)向受试者施用引发剂量的本文公开的任何实施方式或组合；和

(b)向受试者施用加强剂量的DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗，其中DNA、 mRNA或腺病毒载体疫苗编码与SEQ ID NO:125-137的氨基酸序列具有至少 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在这些实施方式中的任一个中，任何合适的DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗可以与本公开的免疫原性组合物结合使用，包括但不限于待开发的疫苗以及可从Moderna、Pfizer/BioNTech、Johnson&Johnson等获得的那些。

在所述方法的另一个实施方式中，受试者感染了严重急性呼吸系统(SARS) 病毒，包括但不限于SARS-CoV-2，其中所述施用在受试者中引起针对SARS病毒的免疫应答，所述免疫应答治疗受试者的SARS病毒感染。当所述方法包括治疗SARS-CoV-2感染时，将免疫原性组合物施用于已经感染SARS-CoV-2和/ 或患有指示受试者可能已经感染SARS-CoV-2的症状(如上所述)的受试者。

如本文所用，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括但不限于完成以下一项或多项：(a)降低受试者中的SARS-CoV-2滴度；(b)限制受试者中SARS-CoV-2 滴度的任何增加；(c)降低SARS-CoV-2症状的严重程度；(d)限制或预防感染之后SARS-CoV-2症状发展；(e)抑制SARS-CoV-2症状恶化；(f)限制或预防先前因SARS-CoV-2感染而出现症状的受试者中SARS-CoV-2症状复发；和/或 (e)存活。

本公开还提供了试剂盒，其可以用于制备本公开的纳米颗粒和组合物。在一个实施方式中，所述试剂盒包括：

(a)本文公开(诸如在第一方面中)的任何实施方式或实施方式组合的多肽；和

(b)第一蛋白，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在。

在一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列，并且第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，所述试剂盒包括：

(a)编码本文公开(诸如在第一方面中)的任何实施方式或实施方式组合的多肽的核酸；和

(b)编码第一蛋白的核酸，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159 组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在。

在另一个实施方式中，所述试剂盒包括：

(a)表达载体，所述表达载体包含编码本文公开(诸如在第一方面中)的任何实施方式或实施方式组合的多肽的核酸，所述核酸可操作地连接至合适的控制序列；和

(b)表达载体，所述表达载体包含编码第一蛋白的核酸，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，其中所述核酸可操作地连接至合适的控制序列。

在另一个实施方式中，所述试剂盒包括：

(a)包含表达载体的细胞，其中所述表达载体包含编码本文公开(诸如在第一方面中)的任何实施方式或实施方式组合的多肽的核酸，所述核酸可操作地连接至合适的控制序列；和

(b)包含表达载体的细胞，其中所述表达载体包含编码第一蛋白的核酸，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，其中所述核酸可操作地连接至合适的控制序列。

实施例

通过针对SARS-CoV-2的设计的蛋白纳米颗粒疫苗引起有效的中和抗体应答

概述

迫切需要一种安全、有效和可扩展的疫苗来阻止正在进行的SARS-CoV-2 大流行。在此，我们描述了自组装蛋白纳米颗粒免疫原的基于结构的设计，所述免疫原在小鼠中引起针对SARS-CoV-2的有效和保护性抗体应答。纳米颗粒疫苗在高度免疫原性阵列中展示出SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白受体结合结构域 (RBD)的60个拷贝，并且诱导的中和抗体滴度是融合前稳定化的S胞外结构域三聚体的大约十倍高，尽管剂量低于其五分之一。通过纳米颗粒免疫原引起的抗体靶向RBD上的多个不同的表位，这表明它们可能不易于逃避突变，并且表现出比康复人血清显著更低的结合:中和比率，这可以使疫苗相关增强呼吸系统疾病的风险最小化。蛋白质组分和组装纳米颗粒的高产量和稳定性，尤其是与 SARS-CoV-2预输注稳定化的S三聚体相比，指示纳米颗粒疫苗的制造将具有高度可扩展性。

SARS-CoV-2RBD纳米颗粒免疫原的设计、体外组装和表征

为了设计诱导有效中和Ab应答的候选疫苗，我们专注于SARS-CoV-2S糖蛋白的RBD(图1A-B)。为了克服这种小的单体抗原的有限免疫原性，我们在双组分蛋白纳米颗粒I53-50的外表面上多价地展示了RBD。I53-50是一种计算机设计的28nm、120亚基复合物，具有由三聚体(I53-50A)和五聚体(I53-50B)组分(所有氨基酸序列在表3中提供)构建的二十面体对称性。纳米颗粒可以通过简单地混合独立表达和纯化的I53-50A和I53-50B来在体外组装。使用包含8、12或 16个甘氨酸和丝氨酸残基的接头将RBD(残基328-531)基因融合至I53-50A(以下称为RBD-8GS-、RBD-12GS-或RBD-16GS-I53-50A)，以便能够灵活地呈现从纳米颗粒表面延伸的抗原(图1C)。所有RBD-I53-50A构建体均使用哺乳动物(Expi293F)细胞重组表达，以确保病毒抗原的适当折叠和糖基化。纯化的 RBD-I53-50A蛋白的初始产量(～30mg纯化蛋白/L Expi293F细胞)是融合前稳定化的S-2P三聚体的～20倍高(Kirchdoerfer等人,2018；Pallesen等人,2017；Walls 等人,2020；Wrapp等人,2020)(～1.5mg/L)，并且在启动子优化后增加至～60mg/L。将RBD-I53-50A蛋白与从大肠杆菌纯化的五聚体I53-50B以～1:1摩尔比(亚基: 亚基)混合以启动纳米颗粒组装(图1D)。

表3.此工作中使用的蛋白质的氨基酸序列(参见图1-6)

SARS-CoV-2RBD-I53-50纳米颗粒的尺寸排阻色谱法(SEC)揭示了对应于靶二十面体组件的主要峰和包含残留的未组装RBD-I53-50A组分的较小峰(图7A 和7B)。动态光散射(DLS)和负染色电子显微镜(nsEM)确认了各种RBD-I53-50 纳米颗粒在冷冻/解冻之前和之后的均匀性和单分散性(图1E、图1F和图7C)。 RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50在冷冻/解冻之前通过DLS测量的平均水动力直径和多分散性百分比分别为38.5nm(27％)、37nm(21％)和41nm (27％)，与之相比未修饰的I53-50纳米颗粒为30nm(22％)。氢/氘交换质谱法确认，在三聚体RBD-8GS-I53-50A组分上展示RBD保留了若干不同抗体表位的抗原构象和结构顺序(图1G和图7D)。最后，我们使用糖蛋白质组学显示，所有三种RBD-I53-50A组分在N331和N343位置处被N糖基化，类似于SARS-CoV-2 S-2P胞外结构域三聚体(Watanabe等人,2020)，再次表明展示的抗原保留了其天然抗原特性(图1H和图7E)。

每个实验至少进行两次，并且所呈现的值和拟合误差来源于代表性实验。对应的结合曲线和拟合在图8中呈现。

SARS-CoV-2RBD-I53-50纳米颗粒组分和免疫原的抗原表征

我们使用重组人ACE2胞外结构域和两个S特异性mAb(CR3022和S309) 来表征RBD在与I53-50A融合时的抗原性，以及在组装的纳米颗粒免疫原的背景下多个RBD表位的可达性。CR3022和S309均从感染SARS-CoV的个体分离，并与SARS-CoV-2RBD交叉反应。CR3022是一种弱中和性Ab，其与RBD 中的保守隐蔽表位结合，所述表位在RBD打开时变得可达，但与受体结合基序 (RBM)不同，所述受体结合基序是与ACE2相互作用的RBD的表面(Huo等人,2020；ter Meulen等人,2006；Yuan等人,2020)。S309通过与含有聚糖的表位结合来中和SARS CoV和SARS-CoV-2两者，所述表位在沙贝病毒中是保守的，并且在打开和闭合的融合前S构象状态下均可达(Pinto等人,2020)。

我们使用生物层干涉法(BLI)来确认单体人ACE2(hACE2)胞外结构域和 CR3022Fab对单体RBD的结合亲和力。用于固定化RBD-I53-50A融合蛋白的这些试剂的平衡解离常数(K_D)与针对单体RBD获得的那些紧密匹配(表4和图 8)。这些数据还确认RBD-I53-50A融合蛋白在其天然构象中展示出RBD。

为了评价纳米颗粒免疫原引起的Ab应答的量级和质量可以通过在致密多价抗原阵列的背景下特定表位的可达性来调节的可能性，我们测量了纳米颗粒免疫原与固定化二聚体猕猴ACE2(mACE2-Fc)以及CR3022和S309 mAb的结合，后者大致模拟对于B细胞激活重要的B细胞受体(BCR)-抗原相互作用。由于相互作用的多价性质，这种方法不允许计算K_D值，但确实能够对不同纳米颗粒结构中的表位可达性进行定性比较。我们通过利用体外组装的多功能性来制备展示出50％价态的RBD的纳米颗粒免疫原(～30个RBD/纳米颗粒)，从而将展示出60个RBD的全价纳米颗粒与密度较低的抗原阵列进行比较(图9)。这通过将五聚体I53-50B添加到RBD-I53-50A和缺乏融合抗原的未修饰的I53-50A的等摩尔混合物中来实现。我们发现所有RBD纳米颗粒与固定化mACE2-Fc、 CR3022和S309良好地结合(图2A)。虽然50％和100％价态RBD-8GS-和 RBD-12GS-I53-50纳米颗粒之间没有一致的趋势，但100％价态RBD-16GS-I53- 50纳米颗粒对所有三种粘合剂产生的结合信号最高(图2B)。RBD-16GS-I53-50 纳米颗粒中较长的接头可能能够更好地到达ACE2、CR3022和S309靶向的表位，尽管我们的数据不能排除其他可能的解释。我们的结论是，中和抗体所靶向的多个不同表位暴露在纳米颗粒外部上呈现的RBD抗原阵列的背景下并可被结合。

RBD纳米颗粒免疫原和S-2P三聚体的物理和抗原稳定性

我们首先使用盐酸胍(GdnHCl)的化学变性来将RBD-I53-50A融合蛋白和 RBD-12GS-I53-50纳米颗粒免疫原的稳定性与重组单体RBD和S-2P胞外结构域三聚体进行比较(图3A)。来自在0-6.5M GdnHCl中温育的样品的荧光发射光谱揭示，所有三种RBD-I53-50A融合蛋白和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒在4M 与5M GdnHCl之间经历转变，这指示至少部分展开，而S-2P三聚体在2M与 4M之间的较低[GdnHCl]下显示转变。单体RBD在0–5M GdnHCl上表现出不太合作的展开转变。然后，我们使用一套分析测定在纯化后四周内在三个温度下监测物理和抗原稳定性：<-70℃，2℃-8℃和22℃-27℃(图3B–E)。与先前报告一致，单体RBD被证明相当稳定，外观产生很少的变化，通过SDS-PAGE(图 10A)、mACE2-Fc和CR3022结合(图10B)或320/280nm处的UV/vis吸光度比率 (颗粒散射的量度)(图10C)测量。S-2P三聚体在2℃-8℃下不稳定，即使在较早时间点处也表现出展开的明显迹象，通过nsEM测量(图9D)。它在22℃-27℃下明显更好地维持其结构，直至最晚的时间点(28天)，此时通过nsEM显示展开是明显的，并且UV/vis指示一些聚集(图10C)。所有三种RBD-I53-50A组分都是高度稳定的，在任何时间点处都没有表现出任何读数的实质性变化(数据未示出)。最后，在为期四周的研究中，RBD-12GS-I53-50纳米颗粒也相当稳定，仅在UV/vis吸光度中显示变化，其中在22℃-27℃下7天之后在320nm附近出现峰(数据未示出)。RBD-12GS-I53-50纳米颗粒样品的电子显微照片和DLS在四周时间段内在所有温度下始终显示单分散、良好形成的纳米颗粒(图10D，图 10E)。总体上，这些数据显示RBD-I53-50A组分和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒具有高物理和抗原稳定性，优于S-2P胞外结构域三聚体。

RBD-I53-50纳米颗粒免疫原在BALB/c和人类免疫组库小鼠中引起有效的中和抗体应答。

我们将三个RBD-I53-50纳米颗粒(各自展示出50％或100％价态的RBD)在 BALB/c小鼠中的免疫原性与S-2P胞外结构域和单体RBD进行比较。在第0周和第3周用含0.9或5μg呈可溶性或颗粒形式的SARS-CoV-2抗原的AddaVax^TM佐剂配制品对10只小鼠的组在肌内进行免疫化。在引发后三周，所有RBD纳米颗粒都引起稳健的S特异性Ab应答，几何平均倒数半数最大有效浓度的范围在8×10²与1×10⁴之间(图4A)。相比之下，单体RBD和低剂量的S-2P三聚体没有诱导可检测水平的S特异性Ab，而高剂量的S-2P三聚体引起弱应答。在第二次免疫化后，我们观察到所有RBD纳米颗粒组的S特异性Ab滴度均增强，几何平均滴度(GMT)的范围为1×10⁵至2×10⁶(图4B)。这些水平的S特异性Ab 与一组来自华盛顿州的29个COVID-19人康复血清(HCS)和来自NIBSC的基准 20/130COVID-19血浆的大多数样品相匹配或超过大多数样品(图4A-B，表5)。用两个5μg剂量的S-2P三聚体免疫化诱导的S特异性Ab应答比RBD纳米颗粒弱～1-2个数量级，且单体RBD在两次免疫化后未引起可检测的抗原特异性Ab。如所预期的，我们还检测到对I53-50支架的Ab应答，所述应答在所有RBD纳米颗粒组中的量级是一致的(图11)。这些数据指示RBD在自组装纳米颗粒支架上的多价展示极大地提高了其免疫原性。

表5.患者康复血清的来源

*类别不相互排斥

**包括初级保健医生、紧急护理、急诊科

我们使用Kymab专有的IntelliSelect^TM转基因小鼠平台(称为‘Darwin’)对 RBD纳米颗粒免疫原的潜在人抗体应答进行原型设计，所述平台对于非重排的人抗体可变区和恒定区种系组库是转基因的。与已经描述的具有嵌合抗体基因座的先前小鼠(Lee等人,2014)相比，本研究中的小鼠的不同之处在于它们被工程化以表达完全人κ轻链Ab。将五只Darwin小鼠的组用S-2P三聚体、100％ RBD-12GS-或100％RBD-16GS-I53-50纳米颗粒在0.9μg(仅纳米颗粒)或5μg的抗原剂量下在肌内进行免疫化(图4C)。用RBD纳米颗粒免疫化的所有组在引发后引起S定向Ab应答(EC₅₀ 2×10³-1x10⁴)，所述应答在第3周通过第二次免疫化明显加强(EC₅₀范围为4×10⁵至8×10⁵)(图4C和图4D)。在此动物模型中，S-2P 三聚体在每次免疫化后引起的S特异性Ab水平与RBD纳米颗粒相当。

然后，我们使用假病毒和活病毒中和测定评价每种免疫原引起的中和活性。在BALB/c小鼠中，所有RBD纳米颗粒免疫原在单次免疫化之后引起血清中和 Ab，倒数半数最大抑制稀释度(IC₅₀)在假病毒中和测定中的范围为1×10²至5×10² (GMT)，在活病毒中和测定中的范围为3×10³至7×10³(图5A和图5C)。低剂量或高剂量的50％(仅假病毒中和)或100％价态的RBD-8GS-、RBD-12GS-或 RBD-16GS-I53-50纳米颗粒之间在假病毒或活病毒中和方面没有观察到显著差异，这与S特异性Ab数据一致。所有三个100％价态RBD纳米颗粒组的GMT 与在假病毒中和测定中测试的29个HCS的组相匹配或超过所述组(图5A)。用单体RBD或S-2P三聚体免疫化在单次免疫之后未引起中和Ab(图5A和图5C)。如在BALB/c小鼠中，Darwin小鼠中高剂量和低剂量的RBD-I53-50纳米颗粒在单次免疫之后均引起假病毒中和Ab滴度(IC₅₀ 8×10¹至2.5×10²)，这与HCS(IC₅₀ 1×10²)相当，而5μg的S-2P三聚体没有引起可检测水平的中和Ab(图5E)，尽管引起了类似水平的总S特异性Ab。

在这两种小鼠模型中，用于RBD-I53-50纳米颗粒进行的第二次免疫化导致中和Ab抗体滴度大幅增加。在BALB/c小鼠中，假病毒中和GMT达到2×10³至3×10⁴，超过HCS 1-2个数量级，并且活病毒中和滴度达到2×10⁴至3×10⁴(图 5B和图5D)。用5μg的S-2P三聚体进行的第二次免疫化也强烈加强了中和活性，尽管假病毒和活病毒中和(GMT分别为3×10²和6×10³)仍然低于用RBD纳米颗粒免疫化的动物的血清。在假病毒和活病毒中和测定中，S-2P三聚体与RBD纳米颗粒之间的增加范围分别为7-90倍和4-9倍。0.9μg剂量的S-2P三聚体和两个剂量的单体RBD在两次免疫化之后未能引起可检测的中和。在Darwin小鼠中第二次免疫化之后观察到假病毒中和的类似增加，尽管滴度总体上低于 BALB/c小鼠(图5F)。

从这些数据可以得出若干结论。首先，RBD纳米颗粒在两种小鼠模型中引起有效的中和Ab应答，所述应答超过了融合前稳定化的S-2P三聚体引起的那些应答，并且在两个剂量之后，超过人类中通过感染引起的应答。第二，接头长度和抗原价态对RBD纳米颗粒的整体免疫原性没有实质性影响，尽管有一种趋势表明RBD-16GS-I53-50可能比具有较短接头的纳米颗粒更具免疫原性。这些观察与表4和图2中呈现的抗原性和可达性数据一致，这显示在所有RBD纳米颗粒免疫原中多个表位都是完整且可达的。最后，通过0.9和5μg剂量的每种纳米颗粒免疫原引起相当的中和Ab滴度，表明I53-50纳米颗粒上的RBD呈现能够节省剂量，这是疫苗制造和分配的关键考虑因素。

将用仅AddaVax^TM、单体RBD、S-2P三聚体或RBD-8GS-或RBD-12GS-I53- 50纳米颗粒免疫化的八只小鼠在加强后七周用小鼠适应的SARS-CoV-2病毒 (SARS-CoV-2MA)刺激，以确定这些免疫原是否具有防止病毒复制的保护作用。 RBD-8GS-和RBD-12GS-I53-50纳米颗粒提供防止在小鼠肺和鼻甲中出现可检测的SARS-CoV-2MA复制的完全保护作用(图5G-H)。用单体RBD、0.9μg S-2P 三聚体和佐剂对照进行免疫化不能防止SARS-CoV-2MA复制。这些结果反映了我们的假病毒和活病毒中和数据，从而显示RBD纳米颗粒在剂量或价态下诱导有效的抗SARS-CoV-2Ab应答。

RBD纳米颗粒疫苗在小鼠和非人灵长类动物中引起稳健的B细胞应答和靶向多个表位的抗体

生发中心(GC)应答是形成持久B细胞记忆的关键过程，导致形成亲和力成熟的类别转换的记忆B细胞和长寿浆细胞。因此，我们评价了用单体RBD、S-2P 三聚体和RBD-8GS-、RBD-12GS-或RBD-16GS-I53-50纳米颗粒免疫化的小鼠的抗原特异性GC B细胞应答。免疫化之后11天评估RBD特异性B细胞的数量和表型，以确定GC前体和B细胞(B220⁺CD3^–CD138^–CD38^–GL7⁺)的水平(图12)。用RBD纳米颗粒进行免疫化导致RBD特异性B细胞和GC前体以及B细胞的扩增(图6A-C)。与RBD纳米颗粒相比，S-2P三聚体产生可检测但数量和频率较低的RBD特异性B细胞和GC前体以及B细胞，而单体RBD构建体没有引起明显的B细胞应答。与这些发现一致，用三种RBD纳米颗粒和三聚体S-2P进行免疫化导致出现CD38^+/–GL7⁺IgM⁺和类别转换(swIg⁺)的RBD特异性B细胞，指示功能性GC前体和GC B细胞(图6D)。在用RBD纳米颗粒和在较小程度上 S-2P构建体免疫化的小鼠中，稳健的GC B细胞应答和增加比例的IgM⁺和swIg⁺ RBD特异性B细胞与正在进行的GC反应一致，其随着时间的推移应导致形成记忆B细胞和长寿浆细胞。为了评价RBD纳米颗粒疫苗引起的体液应答的持久性，我们分析了加强后20-24周的血清Ab应答。结合和中和滴度两者的量级与所有纳米颗粒组的加强后两周的水平类似(图12B，图12C)，这指示所设计的免疫原引起不仅有效且持久的中和Ab。这可能部分是由于纳米颗粒疫苗改善对长寿浆细胞的诱导，因为与S-2P三聚体相比，用RBD-16GS-I53-50纳米颗粒免疫化的小鼠骨髓中S-2P特异性Ab分泌细胞的数量是～3倍高(图12D)。

我们比较了S-2P以及RBD-8GS-、RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒和HCS引起的与中和抗体的结合比率，作为衡量纳米颗粒免疫原引起的Ab 应答的质量的量度。在Kymab Darwin^TM小鼠中，纳米颗粒疫苗的比率低于(优于) S-2P免疫化小鼠，但高于HCS(图6E)。在BALB/c小鼠中，与S-2P和HCS相比，RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50引起的与假病毒中和滴度的结合比率明显降低(图6F)。当使用活病毒中和滴度计算比率时，这种模式是一致的，尽管由于活病毒中和测定中获得的高值，各组之间的差值的量级较小。这些结果表明， RBD-12GS-和RBD-16GS-I53-50纳米颗粒免疫原引起的Ab应答质量高于用 S-2P三聚体免疫化获得或在自然感染期间获取的Ab应答，这可能是因为它集中在作为大多数中和Ab的靶标的RBD中的表位上。

我们着手在非人灵长类动物模型中鉴定在用纳米颗粒免疫原免疫化时引起的Ab识别的表位，所述模型在其对疫苗接种的免疫应答方面更类似于人类。我们在第0周和第4周用250μg的RBD-12GS-I53-50(88μg的RBD抗原)对豚尾猕猴进行免疫化，并且发现在第8周收集的血清具有高水平的S特异性Ab(EC₅₀～1×10⁶)。生成并纯化多克隆Fab，用于与hACE2、CR3022和S309进行竞争BLI，其识别SARS-CoV-2RBD上由中和Ab靶向的三个不同位点(图6G)。多克隆血清以剂量依赖性方式在高于其各自的解离常数的浓度下抑制hACE2、CR3022 Fab和S309 Fab的结合(图6H-J)。这些数据指示用12GS-RBD-I53-50进行免疫化引起靶向若干非重叠表位的Ab，我们预期这将限制逃逸突变体出现和选择的可能性，尤其是因为与病毒诸如流感或人类免疫缺陷病毒相比，冠状病毒不会快速突变(Li等人，2020；Smith等人，2014)。

讨论

在此我们显示了双组分自组装SARS-CoV-2RBD纳米颗粒疫苗候选物引起靶向多个不同RBD表位的有效中和Ab应答。与融合前稳定化的胞外结构域三聚体相比，RBD纳米颗粒引起的更大的中和Ab应答时非常有前途的。我们的数据指示与S-2P胞外结构域三聚体相比，RBD-12GS-I53-50和RBD-16GS-I53-50 引起的S特异性Ab水平是几乎10倍高，并且更重要的是，中和活性水平是大约十倍高。这种效力的增强维持在按质量计低于五分之一的抗原剂量下，这表明纳米颗粒上的呈现也具有剂量节省的作用。增强效力和节省剂量对于满足制造前所未有的疫苗剂量以应对SARS-CoV-2大流行的需求至关重要。

虽然RBD作为单体的免疫原性较差，但我们的数据表明，当我们的设计中多价呈现时，它可以形成高免疫原性疫苗的基础。在用RBD纳米颗粒免疫化时引起的极低的结合：中和比率表明，RBD在I53-50上的呈现将体液应答集中在中和Ab识别的表位上。此度量是疫苗安全性的潜在重要指标，因为高水平结合但非中和或弱中和Ab可能有助于疫苗相关的呼吸系统疾病增强。我们的数据还显示RBD-12GS-I53-50引起靶向由中和Ab识别的若干非重叠表位的Ab应答，所述表位已经在RBD中已经鉴定出来。此类靶向多个不同表位的多克隆应答可以解释观察到的中和的量级，并且应该使选择或出现逃逸突变的风险最小化。最后，RBD-I53-50A组分的高产量和携带抗原的RBD纳米颗粒的稳健稳定性使其适合大规模制造。

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方法

表6.资源

细胞系

HEK293F是女性人类胚胎肾细胞系，其经转化并适于在悬浮液中生长(LifeTechnologies)。将HEK293F细胞在293FreeStyle^TM表达培养基(Life Technologies) 中生长，在37℃下用8％CO₂培养，并在130rpm下振荡。Expi293F^TM细胞来源于HEK293F细胞系(Life Technologies)。将Expi293F^TM细胞在Expi293^TM表达培养基(Life Technologies)中生长，在36.5℃下用8％CO₂培养，并在150rpm下振荡。VeroE6是来自非洲绿猴的雌性肾上皮细胞。HEK293T/17是一种女性人类胚胎肾细胞系(ATCC)。HEK-ACE2粘附细胞系通过BEI Resources,NIAID,NIH 获得：表达人血管紧张素转化酶2的人类胚胎肾细胞(HEK-293T)，HEK-293T- hACE2细胞系，NR-52511。将所有粘附细胞在37℃下用8％CO₂在具有DMEM+10％FBS(Hyclone)+1％青霉素-链霉素的烧瓶中培养。除Expi293F以外的细胞系未经支原体污染测试，也未经过认证。

小鼠

四周大的雌性BALB/c小鼠是从Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine获得的。动物程序在华盛顿州西雅图华盛顿大学和北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学的机构动物护理和使用委员会的批准下进行。Kymab专有的IntelliSelect^TM转基因小鼠平台(被称为Darwin^TM)具有完整的人抗体基因座，具有非重排的人抗体可变和恒定种系组库。因此，由这些小鼠产生的抗体是完全人类的。

豚尾猕猴

在本研究中，对两只成年雄性豚尾猕猴(豚尾猴(Macaca nemestrina))进行免疫化。如先前所述，所有动物都被安置在华盛顿国家灵长类动物研究中心 (WaNPRC)，这是美国实验室动物护理国际认证协会(AAALAC)认可的机构 (Erasmus等人,2020)。对动物进行的所有程序均得到华盛顿大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

康复人血清

针对抗SARS-CoV-2S抗体应答分析在感染后1-60天内从31名通过PCR 检测呈SARS-CoV-2阳性的个体中收集的样品，并且在队列中维持29个具有抗 S Ab应答的个体(图4和图5)。招募个体作为在华盛顿州西雅图的华盛顿大学进行的HAARVI研究的一部分。表5中总结了这些个体的基线社会人口学和临床数据。这项研究得到了华盛顿大学人类学科部机构审查委员会(STUDY00000959 和STUDY00003376)的批准。所有实验均在至少两个技术和两个生物学重复中进行(用于ELISA和假病毒中和测定)。一个样品是来自NIBSC的20/130COVID-19 血浆。

质粒构造

通过GenScript将SARS-CoV-2RBD(BEI NR-52422)构建体合成为具有N末端μ磷酸酶信号肽和C末端八组氨酸标签(GHHHHHHHH)(SEQ ID NO:164)的 pcDNA3.1-。构建体的边界是N-₃₂₈RFPN₃₃₁ and ₅₂₈KKST₅₃₁-C(Walls等人,2020)。通过GenScript将SARS-CoV-2S-2P胞外结构域三聚体(GenBank： YP_009724390.1，BEI NR-52420)合成为具有N末端μ磷酸酶信号肽和C末端 TEV切割位点(GSGRENLYFQG)(SEQ ID NO:165)、T4纤维蛋白折叠子(GGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)(SEQ ID NO:166)和八组氨酸标签(GHHHHHHHH)(SEQ ID NO:164)的pCMV(Walls等人,2020)。所述构建体含有2P突变(残基986和987处的脯氨酸取代；(Pallesen等人,2017))和在弗林蛋白酶切割位点处的₆₈₂SGAG₆₈₅取代。使用8、12或16甘氨酸和丝氨酸残基的接头将SARS-CoV-2RBD遗传融合至三聚体I53-50A纳米颗粒组分的N末端。合成RBD-8GS-和RBD-12GS-I53-50A融合物并通过Genscript将其克隆到pCMV 中。使用Xba1和AvrII限制性位点以及Gibson组装将RBD-16GS-I53-50A融合物克隆到pCMV/R中(Gibson等人,2009)。所有携带RBD的组分都含有N末端 μ磷酸酶信号肽和C末端八组氨酸标签。将猕猴或人ACE2胞外结构域基因融合至编码凝血酶切割位点和C末端处的人Fc片段的序列。合成hACE2-Fc并且通过GenScript用BM40信号肽克隆。将质粒转化到大肠杆菌的NEB 5-α菌株 (New England Biolabs)中，以用于随后从细菌培养物中提取DNA(NucleoBond Xtra Midi^TM试剂盒)，以获得瞬时转染到Expi293F细胞中的质粒。本研究中使用的所有新型蛋白质的氨基酸序列可以在表3中找到。

瞬时转染

使用Expi293F表达培养基(Life Technologies)，在33℃、70％湿度、8％CO₂下在150rpm下旋转，在悬浮液中生长的Expi293F细胞中产生SARS-CoV-2S 和ACE2-Fc蛋白。用PEI-MAX^TM(Polyscience)转染培养物，细胞生长至300万个细胞/mL的密度并培养3天。通过离心(在4000rcf下5分钟)，添加PDADMAC 溶液至0.0375％的最终浓度(Sigma Aldrich，#409014)并且进行第二次旋转(在 4000rcf下5分钟)来使上清液澄清。

编码CR3022重链和轻链的基因从GenScript订购并克隆到pCMV/R中。使用PEIMAX^TM(Polyscience)转染试剂在Expi293F细胞中对重链和轻链质粒进行瞬时共转染来表达抗体。如上所述，在3或6天之后收获细胞上清液并使其澄清。

蛋白质纯化

通过分批结合方法从澄清的上清液中纯化含有His标签的蛋白质，其中向每个澄清的上清液补充1M Tris-HCl pH 8.0至45mM的最终浓度和5M NaCl至～310mM的最终浓度。将Talon钴亲和树脂(Takara)添加到经处理的上清液中，并在轻轻振荡下使其温育15分钟。使用真空过滤和0.2μm过滤器收集树脂并转移至重力柱。将树脂用20mM Tris pH8.0、300mM NaCl洗涤，并且将蛋白质用 3个柱体积的20mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、300mM咪唑洗脱。然后重复批次结合工艺，并且将第一洗脱液和第二洗脱液合并。使用SDS-PAGE来评估纯度。将RBD-I53-50A融合蛋白IMAC洗脱液浓缩至>1mg/mL，并在水合10K分子量截留透析盒(Thermo Scientific)中三轮透析到50mM Tris pH 7、185mM NaCl、 100mM精氨酸，4.5％甘油和0.75％w/v 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)中。将S-2P IMAC洗脱级分浓缩至～1mg/mL，并在水合10K分子量截留透析盒中透析三次到50mM Tris pH 8、150mM NaCl、0.25％L-组氨酸。由于固有的不稳定性，立即对S-2P三聚体进行速冻并储存在-80℃下。

在AKTA Avant150 FPLC(Cytiva)上使用MabSelect PrismA^TM 2.6×5cm柱(Cytiva)纯化表达单克隆抗体和人或猕猴ACE2-Fc的细胞的澄清上清液。将结合的抗体用5个柱体积的20mM NaPO₄、150mM NaCl pH 7.2洗涤，然后用5个柱体积的20mM NaPO₄、1MNaCl pH 7.4洗涤，并且用3个柱体积的pH 3.0的 100mM甘氨酸洗脱。将洗脱液用2M Trizma碱中和至50mM最终浓度。使用 SDS-PAGE来评估纯度。

将重组S309在用表达重链和轻链的质粒瞬时共转染的expiCHO细胞中表达为Fab，如上所述(参见瞬时转染)(Stettler等人,2016)。使用HiTrap^TM蛋白质A Mab选择Xtra^TM柱(Cytiva)对蛋白质进行亲和纯化，接着使用HiTrap^TM快速脱盐柱(Cytiva)针对20mM NaPO₄、150mM NaCl pH 7.2进行脱盐。用0.22μm过滤器对蛋白质进行灭菌并储存在4℃下，直至使用。

微生物蛋白表达和纯化

在2L挡板摇瓶或10L BioFlo 320发酵罐(Eppendorf)中生长的LB(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl)中的Lemo21(DE3)(NEB)中表达I53-50A和I53- 50B.4.PT1蛋白。使细胞在37℃下生长至OD600～0.8，并且用1mM IPTG诱导。将表达温度降低至18℃，并且将细胞振荡～16h。使用微流体M110P在18,000psi 下，在50mM Tris、500mM NaCl、30mM咪唑、1mM PMSF、0.75％CHAPS中通过微流化收获并裂解细胞。通过在24,000g下离心30min来使裂解液澄清，并施加至2.6×10cm Ni Sepharose^TM 6FF柱(Cytiva)以在AKTAAvant150FPLC系统 (Cytiva)上通过IMAC纯化。在50mM Tris pH 8、500mM NaCl、0.75％CHAPS 缓冲液的背景下，在30mM至500mM咪唑的线性梯度上洗脱感兴趣的蛋白质。汇集峰级分，在10KMWCO离心过滤器(Millipore)中浓缩，无菌过滤(0.22μm) 并使用50mM Tris pH 8、500mMNaCl、0.75％CHAPS缓冲液施加至Superdex^TM 200Increase 10/300或HiLoad^TM S200 pg GLSEC柱(Cytiva)。I53-50A在～0.6个体积(CV)下洗脱。I53-50B.4PT1在～0.45CV下洗脱。确定大小之后，对细菌衍生的组分进行测试以确认低水平的内毒素，然后用于纳米颗粒组装。

体外纳米颗粒组装

通过使用UV/vis分光光度计(Agilent Cary 8454)测量280nm处的吸光度并计算消光系数(Gasteiger等人,2005)，确定纯化的单个纳米颗粒组分的总蛋白质浓度。在室温下进行组装步骤，按以下顺序添加：RBD-I53-50A三聚体融合蛋白，接着是实现所需最终浓度需要的另外的缓冲液，以及最终I53-50B.4PT1五聚体组分(在50mM Tris pH 8、500mMNaCl、0.75％w/v CHAPS中)，RBD-I53-50A: I53-B.4PT1的摩尔比为1.1:1。为了产生部分价态RBD-I53-50纳米颗粒(50％ RBD-I53-50)，将RBD-I53-50A和未修饰的I53-50A三聚体(在50mM Tris pH 8、 500mM NaCl、0.75％w/v CHAPS中)添加到稍微摩尔过量(1.1×)的I53-50B.4PT1 中。将所有RBD-I53-50体外组件在2℃-8℃下温育，轻轻摇动至少30分钟，随后通过SEC进行后续纯化，以去除残留的未组装组件。根据目的利用不同的柱： Superose^TM6Increase 10/300GL柱用于分析纳米颗粒尺寸估计，Superdex^TM 200 Increase 10/300GL柱用于小规模试验组装，并且HiLoad^TM 26/600Superdex^TM 200pg柱用于纳米颗粒产生。将组装颗粒在Superose^TM 6柱上并且在Superdex^TM 200柱的空隙体积中在～11mL下洗脱。在柱施加之前和级分汇集后立即对组装的纳米颗粒进行无菌过滤(0.22μm)。

hACE2-Fc和CR3022消化

在2.5mM CaCl₂存在下在1:300w/w凝血酶:蛋白质比率下用凝血酶蛋白酶 (SigmaAldrich)消化hACE2-Fc。将反应物在环境温度下在轻轻摇动下温育16-18 小时。在温育后，使用Ultracel^TM 10K离心过滤器(Millipore Amicon Ultra)浓缩反应混合物并进行无菌过滤(0.22μM)。使用

avant 25 FPLC(Cytiva)，在 HiScreen MabSelect SuRe^TM柱(Cytiva)上使用蛋白质A纯化(参见以上蛋白质纯化) 将切割的hACE2单体与未切割的hACE2-Fc和切割的Fc区分离。在通过的流量中收集切割的hACE2单体，进行无菌过滤(0.22μm)，并通过UV/vis定量。

将LysC(New England BioLabs)在10mM Tris pH 8中稀释至10ng/μL，并在 1:2000w/w LysC:IgG下添加至CR3022 IgG中，并且随后在37℃下温育18小时，在230rpm下轨道振荡。使用Ultracel^TM 10K离心过滤器(Millipore Amicon Ultra) 浓缩切割反应物并进行无菌过滤(0.22μM)。使用如上所述的蛋白质A纯化将切割的CR3022 mAb与未切割的CR3022 IgG和切割的IgG的Fc部分分离。在通过的流量中收集切割的CR3022，进行无菌过滤(0.22μm)，并通过UV/vis定量。

生物层干涉法(抗原性)

在环境温度下，在1000rpm下振荡，在Octet^TM Red 96系统(Pall FortéBio/Sartorius)上进行抗原性测定并使用BLI分析。将RBD-I53-50A三聚体组分和单体RBD在动力学缓冲液(1×HEPES-EP+(Pall FortéBio)、0.05％脱脂牛奶和0.02％叠氮化钠)中稀释至40μg/mL。将单体hACE2和CR3022 Fab在动力学缓冲液中稀释至750nM，并连续稀释三倍，最终浓度为3.1nM。将试剂在200μL/孔下施加至黑色96孔Greiner Bio-one微板，如下所述。根据制造商说明书(FortéBio) 将RBD-I53-50A组分或单体RBD固定到抗Penta-HIS(HIS1K)生物传感器上，但使用以下传感器温育时间。将HIS1K生物传感器在水中水合10分钟，并且然后在动力学缓冲液中平衡60秒。向HIS1K尖端加载稀释的三聚体RBD-I53-50A组分或单体RBD持续150秒，并且用动力学缓冲液洗涤300秒。通过将具有固定化免疫原的HIS1K生物传感器浸入稀释的hACE2单体或CR3022 Fab中600 秒来进行缔合步骤，然后通过将生物传感器插入回到动力学缓冲液中600秒来测量解离。将数据减去基线，并且使用Pall^TM FortéBio/Sartorius分析软件(12.0 版本)来拟合图。图8中的图示出了缔合和解离步骤。

生物层干涉法(可达性)

在环境温度下，在1000rpm下振荡，使用Octet^TM Red 96系统(Pall^TM FortéBio/Sartorius)针对可达性实验和实时稳定性研究分析mACE2-Fc、CR3022 IgG和 S309 IgG与单体RBD、RBD-I53-50A三聚体和RBD-I53-50纳米颗粒的结合。将蛋白质样品在动力学缓冲液中稀释至100nM。然后将缓冲液、免疫原和分析物在200μL/孔下施加至黑色96孔GreinerBio-one微板。首先将蛋白质A生物传感器(FortéBio/Sartorius)在动力学缓冲液中水合10分钟，然后在固定化步骤中浸入在动力学缓冲液中稀释至10μg/mL的mACE2-Fc、CR3022或S309 IgG中。在500秒之后，将尖端转移至动力学缓冲液中60秒以达到基线。通过将加载的生物传感器浸入免疫原中300秒来进行缔合步骤，并且随后通过将生物传感器浸入回到动力学缓冲液中再持续300秒来进行解离。将数据减去基线，然后使用FortéBio分析软件(12.0版本)来作图。图2中的图示出了600秒的缔合和解离。

负染色电子显微镜

首先将RBD-I53-50纳米颗粒在50mM Tris pH 7、185mM NaCl、100mM精氨酸、4.5％v/v甘油、0.75％w/v CHAPS中稀释至75μg/mL，并且将S-2P蛋白在50mM Tris pH 8、150mM NaCl、0.25％L-组氨酸中稀释至0.03mg/mL，然后将3μL样品施加至刚辉光放电的300目铜网格上。将样品在网格上温育1分钟，然后将网格浸入50μL水滴中并用滤纸(Whatman)吸走的过量液体。然后将网格浸入6μL的0.75％w/v甲酸双氧铀染色剂中。用滤纸吸走染色剂，然后将网格浸入另外6μL染色剂中并温育～70秒。最后，将染色剂吸走，并且使网格干燥1 分钟。在Talos型号L120C电子显微镜中在45,000×(纳米颗粒)或92,000×放大率(S-2P)下对制备的网格进行成像。

动态光散射

使用动态光散射(DLS)来在UNcle Nano-DSF(UNchained Laboratories)上测量RBD-I53-50纳米颗粒样品的流体动力学直径(Dh)和多分散性％(％Pd)。将样品施加至8.8μL石英毛细管盒(UNi，UNchained Laboratories)，并使用激光的自动衰减通过10次采集进行测量，每次采集5秒。在Dh测量中UNcle^TM客户端软件考虑了由于RBD纳米颗粒缓冲液中的4.5％v/v甘油而导致的粘度增加。

盐酸胍变性

将单体RBD、RBD-I53-50A融合蛋白和RBD-I53-50纳米颗粒免疫原在 50mM TrispH 7.0、185mM NaCl、100mM精氨酸、4.5％v/v甘油、0.75％w/v CHAPS和盐酸胍[GdnHCl]中稀释至2.5μM，盐酸胍的范围为0M至6.5M，以 0.25M增量增加，并且一式三份制备。使用50mMTris pH 8、150mM NaCl、0.25％ L-组氨酸和相同浓度范围的GuHCl，将S-2P三聚体稀释至2.5μM。将稀释液通过移液混合10×。然后将样品在环境温度下温育18-19小时。使用Nano-DSF (UNcle^TM，UNchained Laboratories)和8.8μL石英毛细管盒(UNi^TM，UNchainedLaboratories)，一式三份收集荧光光谱，在266nm处激发，并且在25℃下测量 200nm至750nm的发射。

内毒素测量

使用EndoSafe^TM Nexgen-MCS系统(Charles River)测量蛋白质样品中的内毒素水平。将样品在无内毒素LAL试剂水中以1:50或1:100稀释，并施加至 EndoSafe^TM LAL试剂筒的孔中。使用Charles River EndoScan^TM-V软件分析内毒素含量，自动回溯计算稀释因子。将内毒素值报告为EU/mL，然后基于UV/vis 测量值将其转换为EU/mg。我们对适用于免疫化的样品的阈值为<50EU/mg。

UV/vis

使用Agilent Technologies Cary^TM 8454测量紫外-可见光分光光度法(UV/vis)。将样品施加至10mm 50μL石英液槽(Starna Cells,Inc.)，并在180至1000nm 范围内测量吸光度。通过测量和单参考波长基线减法获得的280nm处的净吸光度与计算的消光系数和分子量一起使用，以获得蛋白质浓度。使用320/280nm 处的吸光度的比率来确定实时稳定性研究样品中的相对聚集水平。用相应的纯化/仪器消隐缓冲液稀释样品，以获得0.1与1.0之间的吸光度。在845x UV/可见光系统软件中处理由UV/vis仪器产生的所有数据。

聚糖图谱

为了鉴定位点特异性糖基化谱，包括糖型分布和占用率确定，利用自下而上的质谱(MS)方法。制备1mg/mL单体、8GS、12GS和16GS RBD蛋白质的等分试样，以评价4种RBD变体在N331和N343处的糖基化谱。使用1.5mg/mL SARS-CoV-2S-2P蛋白对稳定化的刺突胞外结构域(S-2P)并行进行全面聚糖图谱。将所有样品在含有25mM Tris(pH 8.0)、7M盐酸胍(GdnHCl)和50mM二硫苏糖醇(DTT)的溶液中在90℃下变性30分钟。通过添加新鲜的碘乙酰胺(IAA) 至100mM并在室温下在黑暗中温育1小时来对还原的半胱氨酸进行烷基化。然后添加50mM过量的DTT以淬灭剩余的IAA。通过将样品用10mM Tris(pH 8.0)、 2mM氯化钙溶液稀释11倍，将GndHCl浓度降低至0.6M。然后将每个样品分成两半。将一半(275μL)与10个单位的重组肽N-聚糖酶F(GST-PNGase F)混合 (Krenkova等人,2013)并在37℃下温度1小时，以便将糖基化的Asn转换为去糖基化的Asp。

蛋白酶消化按以下方式进行：将所有RBD样品和一个S-2P样品在RBD的 1:40(w/w)比率和S-2P的1:30(w/w)比率下在37℃下用Lys-C消化4小时，接着在相同的比率和条件下进行Glu-C消化，持续过夜。将其他三个S-2P样品在1:30 (w/w)比率下在37℃下分别用胰蛋白酶、糜蛋白酶和α溶酶蛋白酶消化过夜。所有使用的消化蛋白酶都是MS级(Promega)。第二天，通过0.02％甲酸(FA， Optima^TM，Fisher)淬灭消化反应。

使用Orbitrap Fusion^TM质谱仪(Thermo Fisher)通过纳米LC-MS进行四个 S-2P样品的糖型确定。消化的样品通过Sep-Pak C18筒(Waters)按照制造商建议的方案进行脱盐。在具有5μM ReproSil-Pur^TM C18 AQ珠(Dr.Maisch)的熔融二氧化硅(100μm ID)中新鲜制备2cm捕获柱和35cm分析柱。注射8μL样品，并且在0.1％FA中从2％至30％乙腈以60分钟线性梯度运行，然后用80％乙腈运行 10分钟。如下优化EThcD方法：离子源：2.1kV，用于正向模式；离子转移管温度：350℃；分辨率：MS¹＝120000，MS²＝30000；AGC靶标：MS¹＝2e⁵，MS²＝1e⁵；和注射时间：MS¹＝50ms，MS²＝60ms。

使用6ppm前体和10ppm片段质量误差，通过Byonic^TM和Byologic^TM(3.8 版本，Protein Metrics Inc.)对糖肽数据进行可视化和处理。在Protein Metrics PMI- Suite中使用N-聚糖309哺乳动物数据库检索糖肽，并基于正确c-和z-碎片离子的分配进行评分。通过在204(HexNAc离子)和366(HexNAcHex离子)处存在聚糖氧杂离子m/z以及去糖基化样品中其对应光谱的缺失，进一步验证真阳性实体。通过Byologic^TM中分析的峰面积确定每种糖型的相对丰度。糖型分为Oligo (寡甘露糖)、杂交型和复合物以及复合物中的亚型，在先前研究中描述(Watanabe 等人,2020)。HexNAc(2)Hex(9-5)是M(甘露糖)9至M5；HexNAc(3)Hex(5-6)分类为杂交型；HexNAc(3)Hex(3-4)X是A1亚型；HexNAc(4)X是A2/A1B；HexNAc(5)X是A3/A2B亚型并且HexNAc(6)X是A4/A3B亚型。具有岩藻糖基化的杂交型和复合物形式分别被单独列为F杂交型和F复合物(例如，FA1)。

在与Acquity^TM UPLC系统(Waters)耦合的Synapt G2-Si^TM TOF质谱仪上通过 LC-MS进行四种RBD变体的聚糖占用率分析和糖型确定。在30分钟内以3％至40％B的线性梯度在Waters CSH C18 1x 100mm 1.7μm柱上解析样品(A：98％水，2％乙腈，0.1％FA；B：100％乙腈，0.1％FA)。采用数据依赖性采集(DDA) 方法，前体质量范围为300-2000，MS/MS质量范围为50-2000，碰撞能量从70V 升至100V。确定最丰富和非重叠同位素峰的色谱峰，并且将其与MassLynx^TM (Waters)进行整合。除非特别声明，所使用的所有水和有机溶剂都是MS级(Optima^TM，Fisher)。使用非糖基化(Asn)与去糖基化(Asp)糖肽的峰面积比来测量每个位点处的聚糖占用率。

氢/氘交换质谱法

在23℃下，将3μg单体RBD和RBD-8GS-I53-50A在氘化缓冲液(pH*7.6， 85％D₂O，Cambridge Isotope Laboratories,Inc.)中温育和H/D交换(HDX)，分别进行3、60、1800和72000秒。随后将样品与冰冷的淬灭缓冲液(200mM三(2- 氯乙基)磷酸盐(TCEP)，8M尿素，0.2％甲酸)1:1混合，最终pH为2.5，并且立即在液氮中速冻。应用18分钟梯度，在如先前所述的Synapt G2-Si^TM TOF质谱仪(Waters)(Verkerke等人,2016)上通过LC-MS-IMS在线消化和分析样品。通过从未氘化样品LC-MS运行中收集胃蛋白酶消化洗脱液，通过speedvac干燥，在 85℃下在氘化缓冲液中温育1小时，并与所有其他HDX样品相同淬灭来进行了完全氘化控制。在每个样品中添加内部交换标准物(Pro-Pro-Pro-Ile[PPPI]和 Pro-Pro-Pro-Phe[PPPF])，以确保所有样品的标记条件一致(Zhang等人,2012)。在如上针对聚糖图谱所述的条件下，使用Orbitrap Fusion^TM质谱仪(Thermo Fisher) 通过纳米LC-MS也分析未氘化样品的胃蛋白酶消化液。然后通过Byonic^TM处理数据以获得肽参考列表。使用DriftScope^TM(Waters)手动验证肽，并且使用正交保留时间(rt)和漂移时间(dt)坐标进行鉴定。用HX-Express v2进行氘摄取分析 (Guttman等人,2013；Weis等人,2006)。应用二项式拟合，从肽光谱中鉴定峰。相对于完全氘化标准物对氘摄取水平进行标准化。

小鼠免疫化和刺激

雌性BALB/c(群：000651)小鼠在四周大时购自缅因州巴尔港的The JacksonLaboratory，并且在华盛顿州西雅图华盛顿大学的比较医学设施中维护饲养，由美国国际实验动物护理认证协会(AAALAC)认证。在六周大时，向10只小鼠/ 给药组接种引发免疫化，并且在三周后通过第二次疫苗接种对小鼠进行加强。在接种之前，将免疫原悬浮液与AddaVax^TM佐剂(Invivogen，圣迭戈，加利福尼亚州)以1:1vol/vol轻轻混合，以达到0.009或0.05mg/mL抗原的最终浓度。在异氟烷麻醉下，使用27号针(BD，圣迭戈，加利福尼亚州)，向小鼠的每个后腿的腓肠肌中肌内注射免疫原，每个注射部位50μL(总计100μL)。为了获得血清，所有小鼠在引发和加强免疫化之后两周进行采血。通过颏下静脉穿刺收集血液，并且在室温下在1.5mL塑料Eppendorf管中静置30分钟以允许凝固。通过在 2000g下离心10分钟来将血清从血细胞容量计中分离通过在56℃下温育60分钟，对分离血清中的补体因子和病原体进行热灭活。将血清储存在4℃或-80℃ 下，直至使用。在加强后六周，将小鼠从华盛顿州西雅图华盛顿大学的比较医学设施转移到教堂山北卡罗来纳大学的AAALAC认证的动物生物安全等级3 (ABSL3)实验室。经过7天的适应时间之后，用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，并且用10⁵个噬菌斑形成单位(pfu)的小鼠适应的SARS-CoV-2MA菌株进行鼻内刺激，以评价疫苗功效(IACUC方案20-114.0)。在感染之后，每日监测体重，直至感染后两天研究终止，此时收获肺和鼻甲组织以通过噬菌斑测定评价病毒负载。所有实验均在华盛顿州西雅图华盛顿大学和北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学根据批准的机构动物护理和使用委员会方案进行。

免疫化(Kymab Darwin^TM小鼠)

向Kymab Darwin^TM小鼠(雄性磁性混合，10周大，5只小鼠/给药组)接种引发免疫化，并且在三周后通过第二次疫苗接种进行加强。在接种之前，将免疫原悬浮液与AddaVax^TM佐剂(Invivogen)以1:1vol/vol轻轻混合，以达到0.009或 0.05mg/mL抗原的最终浓度。在异氟烷麻醉下，使用30号针(BD)，向小鼠的每个后腿的胫骨肌中肌内注射免疫原，每个注射部位20μL(总计40μL)。在第7周静脉内(50uL)施用最后一次增强，没有佐剂。5天后，根据英国内政部安排1(CO₂浓度上升)处死小鼠，并冷冻保存脾脏、淋巴结和骨髓。每个剂量之后2周收集全血(0.1ml)(第0、2、5周和第8周末端采血)。通过在2000g下离心10分钟来将血清从血细胞容量计中分离将血清储存在-20℃下，并且用于通过ELISA监测滴度。对所有小鼠进行维护饲养，并且所有程序均根据英国内政部许可证70/8718 并经惠康信托基金会桑格研究所动物福利和伦理审查机构批准进行。

ELISA

对于抗S-2P ELISA，将25μL的2μg/mL S-2P接种到在PBS中的384孔NuncMaxisorp^TM(ThermoFisher)板上，并在4℃下密封过夜。第二天，使用板洗涤机 (BioTek)在Tris缓冲盐水Tween(TBST)中将板洗涤4×，并在37℃下用在TBST 中的2％BSA封闭1h。将板在TBST中洗涤4×，并且从1:25或1:50开始在25μL TBST中制备小鼠、NHP或人血清的1:5连续稀释液，并在37℃下温育1小时。将板在TBST中洗涤4×，然后将抗小鼠(Invitrogen)或抗人(Invitrogen)辣根过氧化物酶缀合抗体以1:5,000稀释，并且将25μL添加到每个孔中并在37℃下温度 1h。将板在TBST中洗涤4×，并且在室温下将25μL的TMB(SeraCare)添加到每个孔中，持续5min。通过添加25μL的1N HCl将反应物淬灭。在VarioSkanLux^TM读板器(ThermoFisher)上在450nm处立即读取板，并且使用非线性回归S形函数 4PL(X是log(浓度))对数据作图并在Prism^TM(GraphPad)中拟合，以从曲线拟合中确定EC₅₀值。

假病毒产生

如前所述制备基于MLV的SARS-CoV-2S、SARS-CoV S和WIV-1假型 (Millet和Whittaker,2016；Walls等人,2020)。简而言之，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine^TM 2000(Life Technologies)将HEK293T细胞用S编码质粒、 MLV Gag-Pol包装构建体和编码荧光素酶报告子的MLV转移载体共转染。用 Opti-MEM将细胞洗涤3×，并且在37℃下用转染培养基温育5h。添加含有10％ FBS的DMEM，持续60h。通过2,500g旋转收获上清液，通过0.45μm过滤器过滤，用100kDa膜在2,500g下浓缩10min，并且然后等分试样并置于-80℃下。

假病毒进入和血清中和测定

将HEK-hACE2细胞在37℃培养箱(ThermoFisher)中在含10％FBS(Hyclone) 和1％PenStrep的DMEM中用8％CO₂培养。在感染前一天，将40μL聚赖氨酸 (Sigma)置于96孔板中并旋转温育5min。去除聚赖氨酸，将板干燥5min，然后在接种细胞之前用DMEM洗涤1×。第二天，检查细胞处于80％汇合下。在半区域96孔板中，在DMEM中以1:3和1:66的初始稀释度开始制备血清的1:3 连续稀释液，最终体积为22μL。然后将22μL假病毒添加到连续稀释液中并在室温下温育30-60min。去除HEK-hACE2板培养基，并且将40μL血清/病毒混合物添加到细胞中，并在37℃下用8％CO₂温育2h。接种后，将40μL含有20％ FBS和2％PenStrep的DMEM添加到细胞中，持续48h。在48-h感染后，将One- Glo-EX^TM(Promega)以一半培养体积(添加40μL)添加到细胞中，并在黑暗中温育 5min，然后在Varioskan^TM LUX读板器(ThermoFisher)上读取。至少一式两份对每组的所有十个小鼠血清样品进行测量。仅使用细胞的零值和仅使用1:2病毒的100％值，在Prism^TM(GraphPad)中对相对荧光素酶单位作图并进行标准化。使用 log(抑制剂)相对于标准化应答的非线性回归来从曲线拟合中确定IC₅₀值。使用曼-惠特尼检验来比较两个组，以确定它们是否在统计学上不同。

活病毒产生

通过先前所述的冠状病毒反向遗传学系统(Hou等人,2020)产生其中ORF7 被纳米荧光素酶基因(nanoLuc)替换的SARS-CoV-2-nanoLuc病毒(WA1菌株)和小鼠适应的SARS-CoV-2(SARS-CoV-2MA)(Dinnon等人,2020)。在37℃+5％ CO₂培养箱中，在补充10％Hyclone^TM Fetal Clone II(GE#SH3006603HI)、1％非必需氨基酸和1％Pen/Strep的DMEM高葡萄糖培养基(Gibco#11995065)中生长的Vero E6细胞(ATCC-CRL1586)中生成重组病毒。为了生成重组SARS-CoV-2，在体外连接并转录7个DNA片段，所述片段共同编码侧翼为5′T7启动子和3′ polyA尾的SARS-CoV-2的全长基因组。将转录的RNA电穿孔到Vero E6细胞中以生成P0病毒储液。将种子病毒在低moi的Vero E6细胞中扩增两次，持续 48h，以产生通过噬菌斑测定滴定的工作储液(Hou等人,2020)。所有活病毒实验，包括连接和电穿孔步骤，均由穿着Tyvek防护服并佩戴个人动力空气净化呼吸器的操作员在负压下在生物安全等级3(BSL-3)条件下进行。

基于荧光素酶的血清中和测定，SARS-CoV-2-nanoLuc

在测定之前24小时将Vero E6细胞以2x10⁴个细胞/孔接种在96孔板中。将 100pfu的SARS-CoV-2-nanoLuc病毒(Hou等人,2020)与血清在1:1比率下混合，并在37℃下温育1h。对于起始浓度为1:20(标准)或1:2000(高中和剂)的样品，生成8点、3倍稀释曲线。将病毒和血清混合物添加到每个孔中并在37℃+5％ CO₂下温育48h。使用SpectraMax^TM M3光度计(Molecular Device)，按照制造商方案，通过Nano-Glo^TM荧光素酶测定系统(Promega，威斯康星州)测量荧光素酶活性。通过以下等式计算抑制百分比和50％抑制浓度(IC50)：[1-(样品的RLU/ 模拟处理的RLU)]×100％。通过使用S形剂量应答(可变斜率)曲线拟合数据点，在GraphPad Prism^TM 8.3.0中计算50％抑制滴度(IC₅₀)。

四聚体产生

使用EZ-Link^TM Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(ThermoFisher)将重组SARS- CoV-2S-2P三聚体生物素化，并且用链霉亲和素-APC(Agilent)四聚化，如先前所述(Krishnamurty等人,2016；Taylor等人,2012)。将SARS-CoV-2S的RBD结构域生物素化并用链霉亲和素-APC(Agilent)四聚化。通过使用DyLight 755抗体标记试剂盒(ThermoFisher)将SA-APC与Dylight^TM 755缀合，洗涤并去除未结合的DyLight 755，并用过量的非相关生物素化His标记的蛋白质温育来生成APC 诱饵试剂。通过用AF647抗体标记试剂盒(ThermoFisher)将SA-PE与Alexa Fluor 647缀合来以相同的方式生成PE诱饵。

小鼠免疫化、细胞富集和流式细胞术

对于B细胞的分型，在第0天用每个注射部位50μL的含有5μg与AddaVax^TM佐剂以1:1vol/vol混合的SARS-CoV-2抗原(S-2P三聚体或RBD，但不包括来自 I53-50纳米颗粒的质量)的疫苗配制品对6周大的雌性BALB/c小鼠(三只/给药组) 进行肌内免疫化。将所有实验小鼠在第11天安乐死以收获腹股沟和腘淋巴结。将实验重复两次。收集个体小鼠的腘和腹股沟淋巴结并汇集。通过捣碎淋巴结并通过100μM Nitex^TM网过滤来制备细胞悬浮液。将细胞重悬浮在含有2％FBS 和Fc嵌段(2.4G2)的PBS中，并且在室温下用10nM诱饵四聚体温育20min。在 10nM的浓度下添加RBD-PE四聚体和刺突-APC四聚体并在冰上温育20min。洗涤细胞，在冰上用抗PE和抗APC磁珠温育30min，然后经过磁化的LS柱 (Miltenyi Biotec)。将结合的B细胞在冰上用抗小鼠B220(BUV737)、CD3(PerCP- Cy5.5)、CD138(BV650)、CD38(Alexa Fluor^TM 700)、GL7(eFluor^TM 450)、IgM (BV786)、IgD(BUV395)、CD73(PE-Cy7)和CD80(BV605)染色20min。将细胞在Cytek Aurora^TM上运行并使用FlowJo^TM软件(Treestar)分析。使用Accucheck^TM细胞计数珠确定细胞计数。

NHP免疫化

在第0天和第28天将豚尾猕猴用250μg的RBD-12GS-I53-50纳米颗粒(88μg RBD抗原)免疫化。在引发后第0、10、14、28、42和56天收集血液。收集血清和血浆，如先前所述(Erasmus等人,2020)。在接种疫苗或采血之前，通过肌内注射(10mg/kg)氯胺酮使动物镇静(

Henry Schein)。在接种之前，将免疫原悬浮液与AddaVax^TM佐剂(Invivogen，圣迭戈，加利福尼亚州)以1:1vol/vol 轻轻混合，以达到0.250mg/mL抗原的最终浓度。在第0天和第28天将疫苗肌内递送到两个四头肌中，每个注射部位1mL。在注射之前将所有注射部位剃毛，并在注射后监测局部反应原性的任何迹象。如先前所述，在每个研究时间点，对动物进行全面身体检查和总体健康评价(Erasmus等人,2020)，并且没有观察到不良事件。

竞争生物层干涉法

从NHP血清纯化Fab改编自(Boyoglu-Barnum等人,2020)。简而言之，将1 mL第56天的血清用PBS稀释至10mL，并用1mL的3×PBS洗涤的蛋白质A 珠(GenScript)温育，在37℃下搅拌过夜。第二天，使用重力流柱用PBS彻底洗涤珠，并且将结合的抗体用0.1M甘氨酸pH3.5洗脱到1M Tris-HCl(pH 8.0)中以达到100mM的最终浓度。将流动通过的血清和早期洗涤液再次与珠重结合过夜，以用于第二次重复洗脱。将IgG浓缩(Amicon 30kDa)并缓冲交换到PBS中。将2×消化缓冲液(40mM磷酸钠pH 6.5，20mM EDTA，40mM半胱氨酸)添加到浓缩并汇集的IgG中。将在1×消化缓冲液(20mM磷酸钠，10mM EDTA，20mM 半胱氨酸，pH 6.5)中新鲜洗涤的500μL重悬浮的固定化木瓜蛋白酶树脂(Thermo Fisher Scientific)添加到在2×消化缓冲液中的纯化IgG中，并且将样品在37℃下搅拌5h。将上清液与树脂分离，并且收集树脂洗涤液并与通过的树脂流量汇集。将汇集的上清液在0.22μm下无菌过滤，并将6×施加至重力流柱中的PBS洗涤的蛋白质A珠。如上所述洗脱所述柱，并且用未消化的IgG重复木瓜蛋白酶程序过夜以增加产率。将通过的蛋白质A流量汇集，浓缩(Amicon 10kDa)并缓冲交换到PBS中。通过SDS-PAGE检查纯度。

在30℃在1000rpm下振荡，在Octet^TM Red 96系统(Pall^TM FortéBio/Sartorius)上进行表位竞争并使用BLI分析。将NTA生物传感器(Pall^TM FortéBio/Sartorius) 在水中水合至少10分钟，并且然后在10×动力学缓冲液(KB)(Pall^TM Forté Bio/Sartorius)中平衡60秒。加载在10×KB中的10ng/μL单体RBD，持续100 秒，然后在10×KB中进行基线采集，持续300秒。然后将尖端浸入在10×Kb 中的以5000nM开始1:3连续稀释度稀释的多克隆Fab中，持续2000秒，或维持在10×KB中。根据多克隆Fab浓度，尖端以不同水平结合。然后将尖端浸入相同浓度的多克隆Fab中，加上200nM hACE2、400nM CR3022或20nM S309 并温育300-2000秒。使用Pall^TM FortéBio/Sartorius分析软件(12.0版本)将数据减去基线并与具有多克隆Fab的预加载对齐，并在PRISM^TM中作图。

Claims

1.一种多肽，其包含与选自由SEQ ID NO:1-84、138-146和167-184组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列，其中X1不存在或是氨基酸接头，并且其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些或全部可以不存在。

2.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1-12和142-151组成的组中的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1-8组成的组中的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组中的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:5-8组成的组中的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1和5组成的组中的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

9.一种纳米颗粒，其包含多个根据权利要求1-8中任一项所述的多肽。

10.一种纳米颗粒，其包含：

(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个第二蛋白；

其中所述纳米颗粒在其表面上展示出存在于至少一个所述第二蛋白中的SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分。

11.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述第二蛋白包含与选自由SEQ ID NO:85-124或185-193组成的组中的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列，其中至少一个第二蛋白的X1包含SARS-CoV-2抗原或其变体或同源物的免疫原性部分，X2不存在或是氨基酸接头，并且括号中的残基是任选的。

12.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述第二蛋白包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列。

13.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述第二蛋白包含选自由SEQ ID NO:85-86组成的组中的氨基酸序列。

14.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述第二蛋白包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的纳米颗粒，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与来自SARS-CoV-2或其变体或同源物的刺突(S)蛋白细胞外结构域(ECD)氨基酸序列、S1亚基氨基酸序列、S2亚基氨基酸序列、S1受体结合结构域(RBD)氨基酸序列和/或N末端结构域(NTD)氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的纳米颗粒，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与选自由SEQ ID NO:125-137组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

17.根据权利要求11-16中任一项所述的纳米颗粒，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其中：

(a)至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1在1、2、3、4、5、6、7或全部8个位置处包含相对于SEQ ID NO:125的选自由K90N、K90T、G119S、Y126F、T151I、E157K、E157A、S167P、N174Y和L125R组成的组中的突变，包括但不限于包含以下天然存在的突变之一或突变组合的突变：

N174Y(UK变体)；

K90N/E157K/N174Y(南非变体)；

K90N或T/E157K/N174Y(巴西变体)；或

L125R(LA变体)；或者

(b)至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1在1、2、3、4、5、6、7或全部8个位置处包含相对于SEQ ID NO:130的选自由L18F、T20N、P26S、残基69-70的缺失、D80A、D138Y、R190S、D215G、K417N、K417T、G446S、L452R、Y453F、T478I、E484K、S494P、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、A701V、T716L组成的组中的突变，包括但不限于包含以下天然存在的突变之一或突变组合的突变：

N501Y，任选地还包括残基69-70中一者或两者的缺失、A570D、D614G、P681H和/或T716L中的1、2、3、4或5个(UK变体)；

K417N/E484K/N501Y，任选地还包括L18F、D80A、D215G、D614G和/或A701V中的1、2、3、4或5个(南非变体)；

L452R(LA变体)。

19.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含1、2、3或全部4个相对于SEQ ID NO:125的突变，所述突变选自由K90N、K90T、E157K和N174Y组成的组。

20.根据权利要求11-19中任一项所述的纳米颗粒，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。

21.根据权利要求11-20中任一项所述的纳米颗粒，其中100％的所述第二蛋白中的X1包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列，并且所有第二蛋白是相同的。

22.根据权利要求10-21中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多个第二组件总计包含2、3、4、5、6、7、8或更多个不同的SARS-CoV-2抗原。

23.根据权利要求10-22中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多个第二组件总计包含2、3、4、5、6、7、8或更多个包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的氨基酸序列的多肽。

24.根据权利要求10-23中任一项所述的纳米颗粒，其中所有第二组件包含至少一个包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的氨基酸序列的第二蛋白。

25.根据权利要求10-24中任一项所述的纳米颗粒，其中所有第二蛋白包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的氨基酸序列。

26.根据权利要求10-25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在，或者任选残基中的一些或全部可以不存在。

27.根据权利要求10-26中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

28.根据权利要求10-27中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。

29.根据权利要求28所述的纳米颗粒，其中所述至少一个第二组件包含至少一个包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列的第二蛋白。

30.根据权利要求28所述的纳米颗粒，其中所有第二组件包含至少一个包含选自由SEQID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列的第二蛋白。

31.根据权利要求28所述的纳米颗粒，其中所有第二蛋白包含选自由SEQ ID NO:85-88组成的组中的氨基酸序列。

32.根据权利要求10-31中任一项所述的纳米颗粒，其中每个第一组件是五聚体并且每个第二组件是三聚体。

33.根据权利要求10-32中任一项所述的纳米颗粒，其中：

(a)所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

34.根据权利要求10-33中任一项所述的纳米颗粒，其中：

(a)所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述第二蛋白中的X1包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

35.根据权利要求10-34中任一项所述的纳米颗粒，其中：

(a)所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

36.根据权利要求10-35中任一项所述的纳米颗粒，其中：

(a)所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列；

(b)所有第二蛋白包含SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列。

37.一种组合物，其包含多个根据权利要求10-36中任一项所述的纳米颗粒，优选地包含多个根据权利要求33-36中任一项所述的纳米颗粒。

38.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，优选地编码SEQ IDNO:1-12的氨基酸序列。

39.根据权利要求42所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包含mRNA。

40.一种表达载体，其包含可操作地连接至合适的控制序列的根据权利要求38或39所述的核酸分子。

41.一种细胞，其包含根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸和/或表达载体。

42.一种药物组合物，其包含

(a)根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、表达载体和/或细胞；和

(b)药学上可接受的载剂。

43.根据权利要求46所述的药物组合物，其包含多个根据权利要求33-36中任一项所述的纳米颗粒。

44.根据任一项前述权利要求所述的组合物或药物组合物，其还包含佐剂。

45.一种疫苗，其包含根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸和/或组合物。

46.根据权利要求45所述的疫苗，其包含多个根据权利要求33-36中任一项所述的纳米颗粒。

47.一种治疗或限制SARS-CoV-2感染发展的方法，其包括向有需要的受试者施用有效治疗或限制所述感染发展的量的根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗。

48.根据权利要求47所述的方法，其包括向所述受试者施用多个根据权利要求33-36中任一项所述的纳米颗粒、根据权利要求43所述的药物组合物或根据权利要求46所述的疫苗。

49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述受试者未感染SARS-CoV-2，其中所述施用在所述受试者中引起针对SARS-CoV-2的免疫应答，所述免疫应答限制所述受试者的SARS-CoV-2感染发展。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述施用包括施用第一剂量和第二剂量，其中所述第二剂量在施用所述第一剂量之后约2周至约12周或约4周至约12周进行施用。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述施用包括：

(a)向所述受试者施用引发剂量的DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗，其中所述DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗编码与SEQ ID NO:125-137的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和

(b)向所述受试者施用加强剂量的根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗。

52.根据权利要求50所述的方法，其中所述施用包括

(a)向所述受试者施用引发剂量的根据任一项前述权利要求所述的多肽、纳米颗粒、组合物、核酸、药物组合物或疫苗；和

(b)向所述受试者施用加强剂量的DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗，其中所述DNA、mRNA或腺病毒载体疫苗编码与SEQ ID NO:125-137的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

53.根据权利要求47-52中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括生成针对SARS-CoV-2的中和抗体。

54.根据权利要求47-53中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括生成SARS-CoV-2刺突蛋白抗体特异性应答，其平均几何滴度为至少1x 10⁵。

55.根据权利要求47-48或53-54中任一项所述的方法，其中所述受试者感染了严重急性呼吸系统(SARS)病毒，包括但不限于SARS-CoV-2，其中所述施用在所述受试者中引起针对所述SARS病毒的免疫应答，所述免疫应答治疗所述受试者的SARS病毒感染。

56.一种试剂盒，其包括：

(a)根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，优选地其中所述多肽包含SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列；和

(b)第一蛋白，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，优选地其中所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。

57.一种试剂盒，其包括：

(a)编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的核酸，优选地其中所述多肽包含SEQID NO:1或5的氨基酸序列；和

(b)编码第一蛋白的核酸，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，优选地其中所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。

58.一种试剂盒，其包括：

(a)包含编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接至合适的控制序列，优选地其中所述多肽包含SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列；和

(b)包含编码第一蛋白的核酸的表达载体，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，其中所述核酸可操作地连接至合适的控制序列，优选地其中所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。

59.一种试剂盒，其包括：

(a)包含表达载体的细胞，其中所述表达载体包含编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的核酸，所述核酸可操作地连接至合适的控制序列，优选地其中所述多肽包含SEQID NO:1或5的氨基酸序列；和

(b)包含表达载体的细胞，其中所述表达载体包含编码第一蛋白的核酸，所述第一蛋白包含与选自由SEQ ID NO:152-159组成的组中的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的并且可以存在或不存在，其中所述核酸可操作地连接至合适的控制序列，优选地其中所述第一蛋白包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。