JP2023513720A - 感染症の治療又は発症を制限するためのポリペプチド、組成物、及びそれらの使用 - Google Patents

感染症の治療又は発症を制限するためのポリペプチド、組成物、及びそれらの使用 Download PDF

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Abstract

配列番号１～８４、１３８～１４６、及び１６７～１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのナノ粒子、関連するナノ粒子組成物、及び感染症を治療又は発症を制限するためのそれらの使用が本明細書に開示される。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／９７７，０３６号、２０２０年６月３０日に出願された第６３／０４６，１５９号、及び２０２０年８月１１日に出願された第６３／０６４，２３５号に対する優先権を主張し、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＨＨＳＮ２７２２０１７０００５９Ｃ及びＲ０１ＧＭ１２０５５３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表に関する記載
コンピュータ可読形態の配列表が、電子的提出によって本出願とともに提出され、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。配列表は、２０２１年２月１１日に作成されたファイル名「２０－１００８－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれており、サイズは１０７７ｋｂである。
中国の武漢でこれまで知られていなかったウイルスが最近出現したことで、進行中のＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行が発生し、２０２０年８月６日時点で１８，７００，０００名を超える感染及び７００，０００名の死亡者を引き起こしている（ＷＨＯ）。２０２０年１月までに急速なウイルス単離及び配列決定により、新たに出現した人獣共通病原体がＳＡＲＳ－ＣｏＶと密接に関連するコロナウイルスであることが明らかになり、そのためＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ）から近縁のＲａＴＧ１３ウイルスが分離されたこと、及びレーキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｍａｌａｙａｎｕｓ）のメタゲノミクス解析でＲｍＹＮ０２ゲノム配列が同定されたことに基づいて、コウモリに由来すると考えられており、どちらも中国の雲南省からのものである。
一態様では、本開示は、配列番号１～８４、１３８～１４６、及び１６７～１８４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、式中、Ｘ１は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択であり、存在してもよいか、又は任意選択の残基の一部若しくは全てが存在しなくてもよい、ポリペプチドを提供する。様々な特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～１２及び１４２～１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、配列番号１～８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１又は５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示は、複数のそのようなポリペプチドを含むナノ粒子を提供する。
別の態様では、本開示は、
（ａ）複数の第１の集合体であって、各第１の集合体は複数の同一の第１のタンパク質を含む複数の第１の集合体と、
（ｂ）複数の第２の集合体であって、各第２の集合体は複数の第２のタンパク質を含む複数の第２の集合体と、を含むナノ粒子であって、
第１のタンパク質のアミノ酸配列は、第２のタンパク質の配列とは異なり、ここで、複数の第１の集合体は、複数の第２の集合体と非共有結合的に相互作用して、ナノ粒子を形成し、ナノ粒子は、少なくとも１つの第２のタンパク質に存在する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分をその表面に提示する。一実施形態では、第２のタンパク質は、配列番号８５～１２４又は１８５～１９３からなるか、又は配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの第２のタンパク質のＸ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分を含み、Ｘ２は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択である。別の実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の、スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメイン（ＥＣＤ）アミノ酸配列、Ｓ１サブユニットアミノ酸配列、Ｓ２サブユニットアミノ酸配列、Ｓ１受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）アミノ酸配列、及び／又はＮ末端に対するドメイン（ＮＴＤ）アミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくはホモログを含む。更なる実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５～１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、第１のタンパク質は、配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基は任意であり、存在してもよく、又は任意の残基の一部又は全部が存在しなくてもよい。
様々な他の態様において、本開示は、本明細書に開示される複数のナノ粒子を含む組成物、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ等の核酸分子、適切な制御配列に作動可能に連結された本明細書に開示される核酸分子を含む発現ベクター、本明細書に開示される、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、及び／又は発現ベクターを含む細胞、並びに本明細書に開示される、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、発現ベクター、及び／又は細胞を含む医薬組成物、キット、及びワクチンを提供する。
別の態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は発症を制限する方法を提供し、本明細書に開示される、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンを、感染症の治療又は発症を制限するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤナノ粒子免疫原の設計、インビトロ集合体、及び特性決定の図である。 融合前コンフォメーション（ＰＤＢ ６ＶＹＢ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ三量体の分子表面を表す図である。各プロトマーは明確に色付けされ、Ｎ－結合グリカンは濃い青色とした（位置Ｎ３４３のグリカンはＰＤＢ ６ＷＰＳに基づいてモデル化され、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）はＰＤＢ ６Ｍ０Ｊからモデル化された）。単一のオープンＲＢＤはボックス化されている。 ３３１位及び３４３位のＮ結合グリカンを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ ＲＢＤの分子表面を示す図である。ＡＣＥ２受容体結合部位又はＲＢＭは黒い輪郭で示されている。 三量体ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ（ライトブルーのＲＢＤ及びライトグレーのＩ５３－５０Ａ）及び五量体Ｉ５３－５０Ｂ（オレンジ）構成要素の構造モデルである。インビトロで混合すると、２０の三量体及び１２の五量体構成要素が集合して、正二十面体対称のナノ粒子免疫原が形成される。各ナノ粒子は、ＲＢＤの６０のコピーを表示する。 ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原の構造モデルである。簡単にするために表示されたＲＢＤ抗原及び１２残基のリンカーの単一方向が示されているが、これらの領域はＩ５３－５０ナノ粒子足場に対して柔軟であると予想される。 ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の非修飾のＩ５３－５０ナノ粒子と比較した動的光散乱（ＤＬＳ）である。 ネガティブ染色されたＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の代表的な電子顕微鏡写真である。サンプルは、１回の凍結／解凍サイクル後に画像化された。スケールバー、１００ｎｍ。 本明細書でバタフライプロットとして表されるモノマーＲＢＤと三量体ＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素との水素／重水素交換質量分析が、既知の中和Ａｂｓによって認識されるエピトープを含むＲＢＤ立体構造の保存を確認する図である。プロットでは、水平シーケンス軸に沿った各点は、重水素の取込みが３秒～２０時間監視されたペプチドを表す。バタフライプロットに表示される誤差範囲は、２つの実験の反復からの標準偏差を示す。以下の差異プロットは、モノマーＲＢＤ及びＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａが、ＲＢＤ全体の局所的な構造順序において実質的に同一であることを示している。 ５つのタンパク質サンプル、モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、及びＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ三量体構成要素のＮ－結合型グリコシル化部位Ｎ３３１及びＮ３４３に存在するグリカン集団を要約した円グラフである。両方の部位の複雑なグリカンの大部分はフコシル化されており、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）グリカンの少数集団は破線で示されている。オリゴ、オリゴマンノース。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原の抗原特性決定の図である。 ５０％又は１００％の原子価でＲＢＤ抗原を示す、ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子に結合する固定化ｍＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２ｍＡｂ、及びＳ３０９ｍＡｂのバイオレイヤー干渉法の図である。モノマーＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤは、参照として各実験に含まれていた。 会合相の末端付近の、８８０秒での結合信号は、パネル（Ａ）の各実験についてプロットされ、各ナノ粒子から得られた結合信号を比較できる。 ＲＢＤナノ粒子免疫原及びＳ－２Ｐ三量体の物理的及び抗原的安定性の図である。 塩酸グアニジンによる化学変性の図である。３５０／３２０ｎｍでの固有のトリプトファン蛍光発光の比率を使用して、タンパク質の三次構造を監視した。主な遷移は影付きの領域で示される。３つの独立した実験の１つからの代表的なデータが表示される。 ４週間にわたるＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びｎｓＥＭ安定性データの概要である。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、どのサンプルでも検出可能な分解は見られなかった。ｎｓＥＭは、３日間のインキュベーション後に２～８℃で、４週間後に２２～２７℃でＳ－２Ｐ三量体の実質的なアンフォールディングを明らかにした。Ｎ／Ａ、評価されていない。 ４週間にわたる抗原性データの要約である。抗原は、様々な温度で保存した後、バイオレイヤー干渉法によって、ｍＡＣＥ２－Ｆｃ（実線）及びＣＲ３０２２ｍＡｂ（破線）結合について分析された。プロットされた値は、各時点での対応する＜－７０℃サンプルに対して正規化された会合相の終わり近くの信号の振幅を表す。 ４週間にわたるＵＶ／ｖｉｓ安定性データの概要である。粒子散乱の尺度として、３２０／２８０ｎｍでの吸光度の比率がプロットされる。Ｓ－２Ｐ三量体及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のみが、周囲温度でのみ散乱の増加を示した。 ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＤＬＳは、全ての温度及び時点で検出可能な凝集体のない単分散種を示した。パネルＢ～Ｅのデータは、１回実施された４週間のリアルタイム安定性試験からのものである。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原は、ＢＡＬＢ／ｃ及びヒト免疫レパートリーマウスで強力な抗体応答を誘発する。 ＥＬＩＳＡで測定したプライム後（２週目）のＢＡＬＢ／ｃマウスの抗Ｓ結合力価である。 ＥＬＩＳＡで測定したブースト後（５週目）のＢＡＬＢ／ｃマウスの抗Ｓ結合力価である。各記号は個々の動物を表し、各グループの幾何平均は水平線で示される。点線は、アッセイの検出下限を表す。８ＧＳ、ＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０；１２ＧＳ、ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０；１６ＧＳ、ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０；ＨＣＳ、ヒト回復期血清。挿入図は、研究のタイムラインを示している。免疫化実験を２回繰り返し、代表的なデータを示す。 プライム後（２週目）のＫｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスの抗Ｓ結合力価であり、これは、再構成されていないヒト抗体変数及び定常領域生殖細胞レパートリーのトランスジェニックであり、ＥＬＩＳＡによって測定され、（Ａ）のようにプロットされる。 ブースト後（５週目）のＫｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスの抗Ｓ結合力価であり、これは、再構成されていないヒト抗体変数及び定常領域生殖細胞レパートリーのトランスジェニックであり、ＥＬＩＳＡによって測定され、（Ａ）のようにプロットされる。挿入図は、研究のタイムラインを示している。免疫化実験は１回行った。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原は、強力で防御的な中和抗体応答を誘発する。 モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、又はＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫したマウスからの、プライム後血清偽型ウイルス中和力価である。 モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、又はＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫したマウスからの、ブースト後血清偽型ウイルス中和力価である。各円は、個々の動物の相互ＩＣ５０を表す。各グループの幾何平均は、水平線で示される。検出限界は、灰色の点線で示される。動物実験は２回行われ、重複測定からの代表的なデータを示す。 （Ａ）で説明したように免疫したマウスからのプライム後血清生ウイルス中和力価である。 （Ａ）で説明したように免疫したマウスからのブースト後血清生ウイルス中和力価である。 （Ａ）で説明したように免疫化した、プライム後のＫｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスからの血清偽型ウイルス中和力価である。 （Ａ）で説明したように免疫化した、ブースト後のＫｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスからの血清偽型ウイルス中和力価である。動物実験は１回行い、中和アッセイは少なくとも２回行った。 ブーストの７週間後、１グループ当たり８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＭＡをチャレンジした図である。 ブーストの７週間後、１グループ当たり８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＭＡをチャレンジした図である。チャレンジの２日後、肺組織（Ｇ）及び鼻甲介（Ｈ）のウイルス力価を評価した。検出限界は、灰色の点線で示される。 ＲＢＤナノ粒子ワクチンは、マウス及び非ヒト霊長類の複数のエピトープを標的とする堅牢なＢ細胞応答及び抗体を誘発する。 ＲＢＤ＋Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ３－ＣＤ１３８－）の数は、各免疫群で検出された。 ＲＢＤ＋ＧＣ前駆体及びＢ細胞の数（ＣＤ３８＋／－ＧＬ７＋）は、各免疫群で検出された。 ＲＢＤ＋ＧＣ前駆体及びＢ細胞（ＣＤ３８＋／－ＧＬ７＋）の頻度である。 ＩｇＤ＋、ＩｇＭ＋、又はクラススイッチ（ＩｇＭ－ＩｇＤ－；ｓｗＩｇ＋）ＲＢＤ＋ＧＣ前駆体及びＢ細胞の頻度である。（Ａ～Ｄ）各グループの２つの実験でＮ＝６。統計的有意性は一元ＡＮＯＶＡによって決定され、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定は、ｐ値が０．０５未満の任意のグループに対して実行された。有意性は星印で示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 Ｋｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスにおけるブースト後（５週目）のＳ－２Ｐ ＥＬＩＳＡ結合力価（図４Ｄ）と偽型ウイルス中和力価（図５Ｆ）との比である。比率は、検査した全てのＨＣＳの［５匹のマウスのＧＭＴ（ＥＣ５０）］：［５匹のマウスのＧＭＴ（ＩＣ５０）］、又はＥＣ５０：ＩＣ５０である。値が低いほど、応答の品質が高いことを示す。 ブースト後（５週目）のＳ－２Ｐ ＥＬＩＳＡ結合力価（図４Ｂ）と、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける偽型ウイルス（図５Ｂ）又は生ウイルス（図５Ｄ）中和力価との比率である。比率は、検査した全てのＨＣＳの［１０匹のマウスのＧＭＴ（ＥＣ５０）］：［１０匹のマウスのＧＭＴ（ＩＣ５０）］、又はＥＣ５０：ＩＣ５０である。 モノマーＡＣＥ２、ＣＲ３０２２Ｆａｂ、及びＳ３０９Ｆａｂが結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤである。 競合ＢＬＩによるワクチン誘発Ａｂエピトープ特異性の決定である。 競合ＢＬＩによるワクチン誘発Ａｂエピトープ特異性の決定である。 競合ＢＬＩによるワクチン誘発Ａｂエピトープ特異性の決定である。ポリクローナルＮＨＰ Ｆａｂの希釈系列をＢＬＩチップでＲＢＤとプレインキュベートした。ポリクローナルＦａｂ濃度は、各希釈点に競合を追加することで維持した。ポリクローナルＦａｂの１：３希釈系列は、濃い色から薄い色まで表され、暗い灰色の線は、ａｐｏ－ＲＢＤ（競合なし）にロードされた競合を表す。（Ｈ）２００ｎＭのＡＣＥ２、（Ｉ）４００ｎＭのＣＲ３０２２、又は（Ｊ）２０ｎＭのＳ３０９との競合である。 ＲＢＤナノ粒子免疫原の追加特性決定である。 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬでのＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子、非修飾Ｉ５３－５０ナノ粒子、及び三量体ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素のサイズ排除クロマトグラフィーである。 １回の凍結／解凍サイクル前後の還元及び非還元条件下でのＳＥＣ精製ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥである。 １回の凍結／解凍サイクルの前後のＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の動的光散乱は、各サンプルで検出可能な凝集体がない単分散ナノ粒子を示す。 本明細書ではヒートマップとして表されている水素／重水素交換質量分析は、ＲＢＤ（ＰＤＢ６Ｗ４１）の構造アクセシビリティ及びダイナミクスを明らかにする。カラーコードは、重水素の取込みレベルを示す。モノマーＲＢＤ及びＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａの取り込みパターンは区別できず、各時点で単一のヒートマップに表示される。 上の棒グラフは、５つのタンパク質サンプル、すなわちモノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、及びＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ三量体構成要素のＮ－結合型グリコシル化部位Ｎ３３１及びＮ３４３での同様のグリカンプロファイルを示している。下、Ｓ－２Ｐ三量体に見られるＮ３３１及びＮ３４３以外の他のＮ結合グリコシル化部位に関する包括的なグリカンプロファイリングである。各棒グラフの軸は、０～８０％にスケーリングされる。Ｍ９～Ｍ５、９～５個のマンノース残基を持つオリゴマンノースは濃い灰色に着色されている。フコシル化の有無にかかわらず、ハイブリッド及びＦＨｙｂｒｉｄ、ハイブリッド型は灰色である。薄い灰色で示されている複雑なタイプのサブタイプは、アンテナ数及びフコシル化に基づいて分類される。 バイオレイヤー干渉法によるｈＡＣＥ２及びＣＲ３０２２Ｆａｂアフィニティの決定である。 固定化されたモノマーＲＢＤ及び三量体ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素へのモノマーｈＡＣＥ２結合の分析である。 固定化モノマーＲＢＤ及び三量体ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素へのＣＲ３０２２Ｆａｂ結合の分析である。アフィニティ定数（表５）は、６つの分析対象物濃度からの動態データを１：１結合モデルにグローバルフィッティングすることによって決定した。 部分原子価ＲＢＤナノ粒子の特性決定である。 ５０％の原子価でＲＢＤを表示する、ネガティブ染色されたＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の代表的な電子顕微鏡写真である。サンプルは、１回の凍結／解凍サイクル後に画像化された。スケールバー、１００ｎｍ。 ５０％の原子価でＲＢＤを表示する精製ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＲＢＤを持つサブユニット及び未修飾のＩ５３－５０Ａサブユニットの両方がゲル上に表示される。 ５０％原子価ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の凍結／解凍前後の動的光散乱（ＤＬＳ）である。凝集物又は組み立てられていない構成要素は観察されなかった。 原子価５０％のＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＵＶ／ｖｉｓ吸収スペクトルである。３２０ｎｍでの吸光度が低いことからわかるように、サンプルの濁度は低い。 ２８日目の安定性データである。 還元及び非還元条件における精製モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥである。分析したどの温度でも、４週間のインキュベーション後に免疫原の分解は観察されなかった。 ３つの温度で４週間のインキュベーション後のＢＬＩによる、モノマーＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体構成要素、及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子へのｍＡＣＥ２－Ｆｃ及びＣＲ３０２２ＩｇＧ結合の分析である。モノマーＲＢＤは、ナノ粒子構成要素及びナノ粒子ＢＬＩ実験の参照標準として使用した。ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子は、４週間後に高温で最小限の結合を失った。残りの抗原は、研究の過程でｍＡＣＥ２－Ｆｃ又はＣＲ３０２２ＩｇＧ結合を失うことはなかった。 ＵＶ／ｖｉｓ分光法は、近ＵＶで最小の吸光度を示し、これは、３つの温度で４週間のインキュベーション後に凝集／粒子が存在しないことを示唆しているが、周囲温度においておおよそ３２０ｎｍで顕著な吸光度を得たＳ－２Ｐ三量体は例外である。２２～２７℃のＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子サンプルは、以前のいくつかの時点で３２０ｎｍ付近に同様のピークを示した（補足項目２を参照）。 ３つの温度で４週間インキュベーションした後のＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子（上）及びＳ－２Ｐ三量体（下）のｎｓＥＭである。無傷の単分散ナノ粒子が全ての温度で観察され、分解又は凝集は観察されなかった。Ｓ－２Ｐ三量体は、－７０℃未満及び２２～２７℃のサンプルでは十分に折り畳まれたままであったが、２～８℃でインキュベートしたサンプルでは折り畳まれていなかった。スケールバー：ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０、１００ｎｍ；Ｓ－２Ｐ、５０ｎｍ。 ３つの温度で４週間のインキュベーション後のＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＤＬＳである。どの温度でも凝集は観察されなかった。 ワクチン誘発Ａｂ及び抗足場抗体力価のサブクラスである。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、プライム後（左）及びブースト後（右）の、（上）三量体Ｉ５３－５０Ａ構成要素、（中央）五量体Ｉ５３－５０Ｂ構成要素、及び（下）組み立てられたＩ５３－５０ナノ粒子に特異的なワクチン誘発ＩｇＧのレベルである。 ワクチン誘発免疫応答のＢ細胞ゲーティング戦略及び持続性である。 ＲＢＤ特異的Ｂ細胞、胚中心（ＧＣ）前駆体及びＢ細胞（ＣＤ３８＋／－ＧＬ７＋）、及びＢ細胞アイソタイプを評価するための代表的なゲーティング戦略である。上段、生存非ダブレットＢ細胞の数を測定するためのゲーティング戦略である。これらの細胞は、中央及び下の行に示されているように更に分析された。中段、ＡｄｄａＶａｘ（商標）を配合したモノマーＲＢＤで免疫したマウスの代表的なデータである。デコイに結合しなかったＲＢＤ＋ＣＤ３８＋／－ＧＬ７＋細胞は、抗原特異的ＧＣ前駆細胞及びＢ細胞としてカウントされた。下段、ＡｄｄａＶａｘ（商標）を配合したＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫したマウスの代表的なデータ。ＧＣ前駆体及びＢ細胞を更に分析して、Ｂ細胞受容体のアイソタイプを特性決定した。 ２０（ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０）又は２４（モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ、ＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０）週間のブースト後に回収された、血清中の（Ｂ）Ｓ特異的ＩｇＧのレベルである。 ２０（ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０）又は２４（モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ、ＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０）週間のブースト後に回収された、血清中の偽型ウイルス中和のレベルである。血清は、ＭＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジされなかった各グループの２匹の動物から採取された。 ＥＬＩＳｐｏｔで測定した、Ｓ－２Ｐ三量体又はＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄中のＳ－２Ｐ特異的Ａｂ分泌細胞の数である。ブーストの１７週間後に細胞を回収した（パネルＢ挿入図を参照）。動物実験は１回行った。統計的有意性は、両側の対応のないｔ検定によって決定された。＊、ｐ＝０．０２。
引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本出願では、別途記載されない限り、用いられる技術は、いくつかの周知の文献のいずれかに見出すことができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），´´Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ´´ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）．
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「約」は、記載されるパラメータの＋／－５％を意味する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は以下のように省略される。アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
本開示の任意の態様の全ての実施形態は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、組み合わせて使用することができる。
文脈上明らかに必要でない限り、発明を実施するための形態及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の語は、排他的意味の対語としての包括的意味、又は網羅的意味で、すなわち、「含むがそれらに限定されない」の意味で解釈されたい。単数又は複数を使用する語は、それぞれ、複数、単数も含む。更に、「本明細書における（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」、及び「以下に（ｂｅｌｏｗ）」という語、並びに類似の意味の語は、本出願で使用される場合、全体としての本出願を指すものであり、本出願のいかなる特定の部分を指すものではない。
第１の態様では、本開示は、配列番号１～８４、１３８～１４６、及び１６７～１８４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、式中、Ｘ１は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択であり、存在してもよいか、又は任意選択の残基の一部若しくは全てが存在しなくてもよい、ポリペプチドを提供する。
以下の実施例に示されるように、この態様のポリペプチドを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力で防御的な抗体応答を誘発する自己集合タンパク質ナノ粒子免疫原を生成することができる。ナノ粒子ワクチンは、５分の１低い用量にもかかわらず、融合前に安定化されたＳ外部ドメイン三量体よりも約１０倍高い中和抗体力価を誘導する。ナノ粒子免疫原によって誘発された抗体は、複数の異なるエピトープを標的とすることから、変異を容易に回避することに感受性ではなく、回復期のヒト血清よりも有意に低い結合：中和比を示すため、ワクチン関連の増強された呼吸器疾患のリスクが最小限に抑えられる可能性があることが示唆される。
本開示のこの態様の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列を以下に提供する。
Figure 2023513720000001
Figure 2023513720000002
Figure 2023513720000003
Figure 2023513720000004
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Figure 2023513720000035
＞ＨｅｘａＰｒｏ－１２ＧＳ－Ｈｅ－Ｉ５３５０Ａ＊－Ｈｉｓ：
（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ）ＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ（ＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１３８）
＞ＨｅｘａＰｒｏ－ＦＯ－１２ＧＳ－Ｈｅ－Ｉ５３５０Ａ＊－Ｈｉｓ：
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＞ＨｅｘａＰｒｏ－ｄｅｌＨＲ２－１２ＧＳ－Ｈｅ－Ｉ５３５０Ａ＊－Ｈｉｓ：
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＞ＨｅｘａＰｒｏ－ｄｅｌＨＲ２－ＦＯ－１２ＧＳ－Ｈｅ－Ｉ５３５０Ａ＊－Ｈｉｓ：
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ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ－５０Ａバリアント
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ＿Ｎ５０１Ｙ＿１６ＧＳ－ｈｅ－Ｉ５３－５０Ａ＊－Ｈｉｓ（ＵＫ）：
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＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿１６ＧＳ－ｈｅ－Ｉ５３－５０Ａ＊－Ｈｉｓ（南アフリカ）
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＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｂｒａｚｉｌ－ｖｅｒ＿Ｋ４１７Ｔ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ（ブラジル）：
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＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｅ４８４Ｋ：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１４５）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｌ４５２Ｒ：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＲＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１４６）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ＿Ｎ５０１Ｙ＿１６ＧＳ－ｈｅ－Ｉ５３－５０Ａ＊－Ｈｉｓ（ＵＫ）：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１４７）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ＿Ｋ４１７Ｎ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿１６ＧＳ－ｈｅ－Ｉ５３－５０Ａ＊－Ｈｉｓ（南アフリカ）
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＮＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１４８）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｂｒａｚｉｌ－ｖｅｒ＿Ｋ４１７Ｔ＿Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ（ブラジル）：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＴＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１４９）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｅ４８４Ｋ：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１５０）
＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ｎｏＲｐｋ＿１６ＧＳ＿Ｉ５３－５０Ａ＊＿Ｌ４５２Ｒ：
（ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡ）ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＲＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１５１）
様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～１２及び１４２～１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。様々な他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～８からなる群、又は配列番号１～４、配列番号５～８からなる群、又は配列番号１及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含み、例示的な実施形態として以下の例で提供される。
本出願全体を通して使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、その最も広い意味で使用されて、正規アミノ酸及び非正規アミノ酸を含む、サブユニットＤ又はＬアミノ酸の配列を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、化学合成又は組換え発現させることができる。ポリペプチドは、ペグ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、グリコシル化によって等、他の化合物に結合させてインビボでの半減期の増加を促進し得、あるいはＦｃ融合として、又は脱免疫化変異体で生成し得る。そのような結合は、共有結合又は非共有結合であることができ、当業者によって理解される。
第２の態様では、本開示は、本開示の第１の態様の任意の実施形態又は実施形態の組合わせによる複数のポリペプチドを含むナノ粒子を提供する。この態様では、複数（２、３、４、５、１０、２０、２５、５０、６０、１００、又はそれを超える）の本開示の第１の態様のポリペプチドは、任意の適切なナノ粒子中に存在する。
本開示の任意の実施形態又は態様のナノ粒子は、直径約１０ｎｍ～約１００ｎｍを含むがこれらに限定されない、意図する用途に適した任意のサイズであり得る。
第３の態様では、本開示は、
（ａ） 複数の第１の集合体であって、各第１の集合体は複数の同一の第１のタンパク質を含む複数の第１の集合体と、
（ｂ） 複数の第２の集合体であって、各第２の集合体は複数の第２のタンパク質を含む複数の第２の集合体と、を含むナノ粒子を提供し、
第１のタンパク質のアミノ酸配列は、第２のタンパク質の配列とは異なり、
複数の第１の集合体は、複数の第２の集合体と非共有結合的に相互作用して、ナノ粒子を形成し、
ナノ粒子は、その表面上に、少なくとも１つの第２のタンパク質に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分を提示する。
この態様では、ナノ粒子は、第１及び第２の集合体の非共有相互作用によって形成される三次元構造を形成する。複数（２、３、４、５、６、又はそれを超える）の第１のポリペプチドが自己集合して第１の集合体を形成し、複数（２、３、４、５、６、又はそれを超える）の第２のポリペプチドが自己集合して、第２の集合体を形成する。個々の自己集合タンパク質の非共有相互作用により、第１のタンパク質が第１の集合体に自己集合し、第２のタンパク質が第２の集合体に自己集合する。次いで、これらの第１及び第２の集合体の複数が界面を介して非共有結合的に自己集合して、ナノ粒子を生成する。第１の集合体における第１のポリペプチドの数は、第２の集合体における第２のポリペプチドの数と同じであっても異なっていてもよい。本開示のナノ粒子は、四面体、八面体、二十面体、十二面体、及びそれらの切断型を含むがこれらに限定されない、意図する用途に適した任意の形状及び／又は対称性を有することができる。例示的な一実施形態では、各第１の集合体は五量体であり、各第２の集合体は三量体である。
ナノ粒子への第１及び第２の集合体の集合体はランダムではないが、様々な集合体間の非共有相互作用（例えば、水素結合、静電気、ファンデルワールス、疎水性等）（すなわち、第１の集合体間、第２の集合体間、並びに第１及び第２の集合体間の相互作用の累積効果）によって決定される。その結果、本開示のナノ粒子は、高度に秩序化された構造を有するナノ粒子に第１及び第２の集合体を配向させる、対称的に繰り返される非天然の非共有結合のタンパク質－タンパク質界面を含む。ナノ粒子の形成は、第１及び第２の集合体の非共有相互作用によるものであるが、いくつかの実施形態では、一旦形成されると、ナノ粒子は、第１の集合体及び第２の集合体中のタンパク質間の共有結合によって安定化され得る。ジスルフィド結合及びイソペプチド結合を含むがこれらに限定されない任意の適切な共有結合を使用することができる。
本開示の集合体を生成するのに適した第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、所与のナノ粒子に適した任意の長さであり得る。第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、長さが３０～２５０アミノ酸であり得る。
一実施形態では、第２のタンパク質は、配列番号８５～１２４又は１８５～１９３（表２）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの第２のタンパク質のＸ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分を含み、Ｘ２は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択である。任意選択の残基が存在してもよいし、任意選択の残基の一部（すなわち、１、２、３、４、５、６、又はそれを超える）又は全てが存在しなくてもよい。
Figure 2023513720000036
Figure 2023513720000037
Figure 2023513720000038
Figure 2023513720000039
Figure 2023513720000040
Figure 2023513720000041
この第３の態様の様々な実施形態では、第２のタンパク質は、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号８５～８８からなる群、又は配列番号８５～８６からなる群、又は配列番号８５から選択されるアミノ酸配列を含み、例示的な実施形態として以下の例で提供される。
この第３の態様のナノ粒子は、少なくとも１つの第２のタンパク質に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分をその表面に示す。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分は、少なくとも１つの第２のタンパク質との融合タンパク質として存在し、それは、ナノ粒子中の単一の第２のタンパク質上に存在し得る（ナノ粒子上に単一のコピーとして存在する）か、又はナノ粒子中に存在する複数の第２のタンパク質中に存在し得る。様々な実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログは、ナノ粒子の第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に存在する。
これらの融合タンパク質では、第２のタンパク質をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログに直接結合させるか、又は第２のタンパク質及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログをリンカーを使用して結合させることができる。本開示を通して使用されるように、リンカーは、２つのポリペプチドを共有結合するために使用される短い（例えば、２～３０）アミノ酸配列である。本明細書に開示されるものを含むがこれらに限定されない、任意の適切なリンカー配列を使用することができる。
任意の適切なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログを使用することができる。この第３の態様の一実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の、スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメイン（ＥＣＤ）アミノ酸配列、Ｓ１サブユニットアミノ酸配列、Ｓ２サブユニットアミノ酸配列、Ｓ１受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）アミノ酸配列、及び／又はＮ末端に対する同一性ドメイン（ＮＴＤ）アミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくはホモログを含む。
様々な更なる実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５～１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ （ＲＢＤ）（配列番号１２５）
ＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴ（ＲＢＤ）（配列番号１２６）
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＳＧＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫ（スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号１２７）
（ＥＴＧＴ）ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＳＧＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫ（スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（存在していても、していなくてもよい、括弧内のシグナルペプチドに関連するＮ末端リンカーを含む））（配列番号１２８）
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＳＧＡＧＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫ（配列番号１２９）ｍｕホスファターゼシグナルペプチドであり、ＥＴＧＴはシグナルペプチドの切断後にレムナントとして残る
（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ）ＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ（配列番号１３０）
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（ＱＣ）ＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ（配列番号１３２）
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ＥＴＣＴＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ（配列番号１３６）
ＥＴＣＴＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴ（配列番号１３７）
特定の一実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤは、以下の例で、例示的な実施形態として提供される。様々な実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、Ｋ９０Ｎ、Ｋ９０Ｔ、Ｇ１１９Ｓ、Ｙ１２６Ｆ、Ｔ１５１Ｉ、Ｅ１５７Ｋ、Ｅ１５７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｎ１７４Ｙ、及びＬ１２５Ｒからなる群から選択される配列番号１２５に対して、１、２、３、４、５、６、７、又は８つの位置全てにおいて、変異を含み、以下の自然に発生する変異又は変異の組合わせ、
Ｎ１７４Ｙ（ＵＫバリアント）；
Ｋ９０Ｎ／Ｅ１５７Ｋ／Ｎ１７４Ｙ（南アフリカバリアント）；
Ｋ９０Ｎ又はＴ／Ｅ１５７Ｋ／Ｎ１７４Ｙ（ブラジルバリアント）；又は
Ｌ１２５Ｒ（ＬＡバリアント）のうちの１つを含む変異を含むが、これらに限定されない。
これらの天然に存在するバリアントのアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１２５内の位置に基づいているが、一般に、スパイクタンパク質の残基番号に基づいて記述されている（すなわち、スパイクのＫ４１７＝ＲＢＤのＫ９０；スパイクのＧ４４６＝ＲＢＤのＧ１１９；スパイクのＬ４５２＝ＲＢＤのＬ１２５；スパイクのＹ４５３＝ＲＢＤのＹ１２６；スパイクのＴ４７８＝ＲＢＤのＴ１５１；スパイクのＥ４８４＝ＲＢＤのＥ１５７；スパイクのＳ４９４＝ＲＢＤのＳ１６７；スパイクのＮ５０１＝ＲＢＤのＮ１７４である）。
様々な更なる実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％におけるＸ１が、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、残基６９－７０の欠失、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｔ４７８Ｉ、Ｅ４８４Ｋ、Ｓ４９４Ｐ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｌからなる群から選択される配列番号１３０に対して、１、２、３、４、５、６、７、又は８つの位置全てにおいて、変異を含み、以下の天然に存在する変異又は変異の組合わせ、
場合により、残基６９～７０、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、及び／又はＴ７１６Ｌの１つ又は両方の１、２、３、４、又は５個の欠失を更に含むＮ５０１Ｙ（ＵＫバリアント）；
Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｄ６１４Ｇ、及び／又はＡ７０１Ｖの１、２、３、４、又は５個を任意に更に含むＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（南アフリカバリアント）；
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ６１４Ｇ、及び／又はＨ６５５Ｙ（ブラジル変異体）のうちの１、２、３、４、又は５つを任意に更に含む、Ｋ４１７Ｎ又はＴ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ；又は
Ｌ４５２Ｒ（ＬＡバリアント）のうちの１つを含む変異を含むが、これらに限定されない。
当業者によって理解されるように、Ｘ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列（又は任意の他の開示された抗原）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列がと同一であり、それは、アミノ又はカルボキシ末端に追加のアミノ酸を含み得る。したがって、例えば、Ｘ１が、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列がと同一である場合、Ｘ１は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含み得、配列番号１２６のアミノ酸配列は、配列番号１２５と比較して、そのＮ末端に追加のアミノ酸を含む。
更なる実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、Ｋ９０Ｎ、Ｋ９０Ｔ、Ｅ１５７Ｋ、及びＮ１７４Ｙからなる群から選択される、配列番号１２５に対する、１、２、３、又は４つの変異全てを含む。
複数の第２の集合体は、合計で単一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含んでもよく、又は２つ以上の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含んでもよい。一実施形態では、合計で複数の第２の集合体は、２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む。１つの例示的なそのような実施形態では、複数の第２の集合体は、配列番号１～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、合計で２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超えるポリペプチドを含む。
一実施形態では、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第２のタンパク質の１００％におけるＸ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、全ての第２のタンパク質は同一である。
更なる実施形態では、全ての第２の集合体は、配列番号１～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含む。別の実施形態では、全ての第２のタンパク質は、配列番号１～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ナノ粒子は、複数の同一の第１のタンパク質を含む。一実施形態では、第１のタンパク質は、配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基は任意であり、存在してもよく、又は任意の残基一部（すなわち、１、２、３、４、５、６、又はそれを超える）又は全部が存在しなくてもよい。特定の実施形態では、第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
Figure 2023513720000042
Ｉ５３－５０－ｖ４五量体構成要素
（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＳ）ＮＱＨＳＱＫＤＱＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＦＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＫＩＧＧＥＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＫＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＤＧＭＭＮＶＱＬＤＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＮＡＫＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ（ＧＳＬＥＧＳ）（配列番号１５６）
Ｉ５３－５０－ｖ１五量体構成要素Ｂ
（Ｍ）ＮＱＨＳＨＫＤＨＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＥＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＤＧＭＭＮＶＱＬＤＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＫＡＨＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ（ＧＳ）（配列番号１５７）
Ｉ５３－５０－ｖ２五量体構成要素Ｂ
（Ｍ）ＮＱＨＳＨＫＤＨＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＦＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＤＧＭＭＮＶＱＬＤＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＮＡＫＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ（ＧＳ）（配列番号１５８）
Ｉ５３－５０－ｖ３五量体構成要素Ｂ
（Ｍ）ＮＱＨＳＨＫＤＨＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＦＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＤＧＭＭＮＶＱＬＤＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＮＡＫＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ（ＧＳ）（配列番号１５９）
例示的な実施形態では、第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。様々な更なるそのような実施形態では、第２の集合体の少なくとも１つ又は複数（２０％、３３％、４０％、５０％、７５％等）は、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含むか、又は全ての第２の集合体は、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含む。
特定の一実施形態において、
（ａ） 第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ） 全ての第２のタンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列に対して、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を含む。
特定の他の実施形態において、
（ａ） 第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ） 全ての第２のタンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、第２のタンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１は、配列番号１２５のアミノ酸配列に対して、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を含む。
更なる特定の実施形態において、
（ａ） 第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ） 全ての第２のタンパク質は、配列番号１～８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の一実施形態において、
（ａ） 第１のタンパク質は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ） 全ての第２のタンパク質は、配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む。
本開示は更に、本開示の任意の実施形態又は実施形態の組合わせの複数のナノ粒子を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、上に開示した特定の実施形態の複数のナノ粒子を含む。
第４の態様では、本開示は、本開示のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸配列は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）又はＤＮＡを含み得る。そのような核酸配列は、ポリＡ配列、修飾コザック配列、及びエピトープタグをコードする配列、輸送シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び細胞膜局在化シグナルを含むがこれらに限定されない、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するために有用な追加の配列を含み得る。本明細書の教示に基づいて、どの核酸配列が本発明のタンパク質をコードするかは、当業者には明らかであろう。
第５の態様では、本開示は、好適な制御配列に機能的に連結された本開示の任意の実施形態又は実施形態の組合わせの単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。「発現ベクター」は、核酸コード領域又は遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列と機能可能に連結するベクターを含む。本開示の核酸配列に作動可能に連結された「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列はそれらがその発現を指示するように機能する限り、核酸配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、介在性で翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在し、プロモーター配列は依然コード配列に「作動可能に連結された」とみなされ得る。他のそのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、及びリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベースの発現ベクターを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のタイプのものであり得る。哺乳動物系において開示される核酸の発現を促進するために使用される制御配列は、構成的（限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含む様々なプロモーターのいずれかによって促進される）又は誘導性（限定されないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含む多数の誘導性プロモーターのいずれかによって促進される）であり得る。
第６の態様では、本開示は、本開示の任意の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、及び／又は発現ベクターを含む細胞を提供し、細胞は、哺乳動物細胞等、原核細胞又は真核細胞のいずれかであり得る。一実施形態では、細胞は、本開示の核酸又は発現ベクターで一過性又は安定的にトランスフェクトされ得る。原核細胞及び真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、当技術分野で知られている任意の技術によって達成することができる。本発明によるポリペプチドを産生する方法は、本発明の追加的な部分である。この方法は、（ａ）本発明のこの態様に従って、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、宿主を培養するステップと、（ｂ）任意に、発現されたポリペプチドを回収するステップと、を含む。
第７の態様において、本開示は
（ａ） 本明細書の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、発現ベクター、及び／又は細胞と、
（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物／ワクチンを提供する。
以下の例に示すように、ナノ粒子免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力で防御的な抗体応答を誘発する。本開示のナノ粒子ワクチンは、５分の１よりも低い用量にもかかわらず、融合前安定化Ｓ外部ドメイン三量体よりもおよそ１０倍高い中和抗体力価を誘導する。ナノ粒子免疫原によって誘発された抗体は、複数の異なるエピトープを標的とすることから、変異を容易に回避することに感受性ではなく、回復期のヒト血清よりも有意に低い結合：中和比を示すため、ワクチン関連の増強された呼吸器疾患のリスクが最小限に抑えられる可能性があることが示唆される。
医薬組成物／ワクチンは、（ａ）凍結乾燥保護剤、（ｂ）界面活性剤、（ｃ）増量剤、（ｄ）張度調整剤、（ｅ）安定剤、（ｆ）防腐剤、及び／又は（ｇ）緩衝剤を更に含み得る。一部の実施形態において、医薬組成物中の緩衝剤は、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、ホスフェート緩衝剤、シトレート緩衝剤、又はアセテート緩衝剤である。組成物は、凍結乾燥保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール、又はトレハロースも含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態において、組成物は、グリシンのような増量剤を含む。更に他の実施形態において、組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ソルビタントリオレアスト（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、又はこれらの組合わせを含む。組成物はまた、張度調整剤、例えば、製剤をヒトの血液と実質的に等張又は等浸透圧にする化合物を含み得る。例示的な張度調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、及び塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態では、組成物は、安定剤、例えば、凍結乾燥又は液体形態のナノ構造の化学的及び／又は物理的不安定性を実質的に防止又は低減する分子を更に含む。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、及び塩酸アルギニンが挙げられる。
ナノ粒子は、組成物中の唯一の活性剤であってもよく、又は組成物は、免疫系を一般的に刺激し、免疫応答全体を改善するためのアジュバントを含むがこれに限定されない、意図された用途に適した１つ又は複数の他の薬剤を更に含んでもよい。任意の適切なアジュバントを使用することができる。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物又は混合物を指す。例示的なアジュバントには、Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ（商標）、Ａｄｊｕｍｅｒ（商標）、アルブミン－ヘパリン微粒子、Ａｌｇａｌ Ｇｌｕｃａｎ、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、ミョウバン、抗原製剤、ＡＳ－２アジュバント、自己樹状細胞、自己ＰＢＭＣ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（商標）、Ｂ７－２、ＢＡＫ、ＢＡＹ Ｒ１００５、ブピバカイン、ブピバカイン－ＨＣｌ、ＢＷＺＬ、カルシトリオール、リン酸カルシウムゲル、ＣＣＲ５ペプチド、ＣＦＡ、コレラホロトキシン（ＣＴ）及びコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素Ａ１サブユニット－タンパク質Ａ Ｄ－フラグメント融合タンパク質、ＣｐＧ、ＣＲＬ１００５、サイトカイン含有リポソーム、Ｄ－ムラパルミチン、ＤＤＡ、ＤＨＥＡ、ジフテリアトキソイド、ＤＬ－ＰＧＬ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／ミョウバン複合体、鶏痘、フロイント完全アジュバント、ガンマイヌリン、ゲルブアジュバント、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＩＬ－１２（Ｎ２２２Ｌ）、ｈＴＮＦ－α、ＩＦＡ、ｐｃＤＮＡ３のＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ＤＮＡ、ＩＬ－１２プラスミド、ＩＬ－１２／ＧＭＣＳＦプラスミド（Ｓｙｋｅｓ）、ｐｃＤＮＡ３のＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｉｇプラスミド、ＩＬ－２／Ｉｇタンパク質，ＩＬ－４、ｐｃＤＮＡ３のＩＬ－４、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（商標）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）、共刺激分子に対する抗体を含む免疫リポソーム、インターフェロン－γ、インターロイキン－１β、インターロイキン－１２、インターロイキン－２、インターロイキン－７、ＩＳＣＯＭ（ｓ）（商標）、Ｉｓｃｏｐｒｅｐ７．０．３（商標）、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、脂質ベースのアジュバント、リポソーム、Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）、ＬＴ－ＯＡ又はＬＴ Ｏｒａｌアジュバント、ＬＴ－Ｒ１９２Ｇ、ＬＴＫ６３、ＬＴＫ７２、ＭＦ５９、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０、ＭＰＬ．ＴＭ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭＴＰ－ＰＥ、ＭＴＰ－ＰＥリポソーム、ムラメチド、ムラパルミチン、ＮＡＧＯ、ｎＣＴ天然コレラ毒素、非－イオン性界面活性剤小胞、コレラ毒素ｍＣＴ－Ｅ１１２Ｋの非毒性変異体Ｅ１１２Ｋ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐＣＩＬ－１０、ｐＣＩＬ１２、ｐＣＭＶｍＣＡＴ１、ｐＣＭＶＮ、ペプトマー－ＮＰ、プレウラン、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＡ、プルロニックＬ１２１、ＰＭＭＡ、ＰＯＤＤＳ（商標）、ポリｒＡ：ポリｒＵ、ポリソルベート８０、タンパク質コクリエート、ＱＳ－２１、ＱｕａｄｒｉＡサポニン、Ｑｕｉｌ－Ａ、リヒドラジェルＨＰＡ、リヒドラジェルＬＶ、ＲＩＢＩ、リビライクアジュバントシステム（ＭＰＬ、ＴＭＤ、ＣＷＳ）、Ｓ－２８４６３、ＳＡＦ－１、Ｓｃｌａｖｏペプチド、センダイプロテオリポソーム、センダイ含有脂質マトリックス、スパン８５、スペコール、スクワラン１、スクワレン２、ステアリルチロシン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）、スレオニルムラミルジペプチド（ＴＭＤＰ）、Ｔｙ粒子、及びＷａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄリポソームが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントの選択は、治療される対象に依存する。好ましくは、薬学的に許容されるアジュバントが使用される。
第８の態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は発症を制限する方法を提供し、本明細書の任意の実施形態の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチン（「免疫原性組成物」と呼ばれる）を、感染症の治療又は発症を制限するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。対象は、ヒト対象を含むが、これに限定されない任意の好適な哺乳動物対象であり得る。
方法がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を制限することを含む場合、免疫原性組成物は、感染していることは知られていないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露のリスクがある可能性がある対象に予防的に投与される。本明細書で使用される場合、「発症を制限すること」には、以下の１つ又は複数を達成することが含まれるが、これらに限定されない。（ａ）対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への免疫応答（抗体及び／又は細胞ベース）を生成する、（ｂ）対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を生成する、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露後の対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価の蓄積を制限する、及び／又は（ｃ）感染後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状の発症を制限又は防止する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の例示的な症状には、発熱、疲労、咳、息切れ、胸の圧迫感及び／又は痛み、嗅覚の喪失又は減少、味覚の喪失又は減少、肺炎、並びに限定されないが気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、及び上気道及び下気道感染症を含む呼吸器の問題が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していることが知られていない対象において免疫応答を生成し、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の感染及び症状の発症を制限するのに役立つ。一実施形態では、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の生成を含む。例示的なそのような実施形態では、免疫応答は、少なくとも１ｘ１０５の平均幾何力価を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体特異的応答の生成を含む。更なる実施形態では、免疫応答は、複数の抗原性エピトープに対する抗体の生成を含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療及び／又は制限するために有効である免疫原組成物の量を指す。本明細書の任意の実施形態の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンは、典型的には、上に開示したもの等の医薬組成物として製剤化され、経口、非経口、吸入スプレーによる、直腸、又は局所的に、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含む投与単位製剤を含む、任意の適切な経路を介して投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、注入技法、又は腹腔内を含む。ポリペプチド組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、又は他の微粒子送達システム、又は適切な組織（血液等）に導入される持続放出製剤を介して投与され得る。投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、療法的又は予防的応答）を提供するように調整され得る。適切な用量範囲は、例えば、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ～１００ｍｇのポリペプチド又はそのナノ粒子であり得る。組成物は、単回ボーラスで送達され得るか、又は担当医療従事者により決定されるように、２回以上（例えば、２、３、４、５回以上）投与され得る。
一実施形態では、投与は、免疫原性組成物の第１の用量及び第２の用量を投与することを含み、第２の用量は、第１の用量が投与された、約２週間～約１２週間、又は約４週間～約１２週間後に投与される。様々な更なる実施形態において、第２の用量は、第１用量の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間後に投与される。別の実施形態では、３回の用量を投与することができ、第２の用量は、第１の用量の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間後に投与され、第３の用量は、第２の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間後に投与される。
プライム－ブースト投与の様々な他の実施形態において、投与は、
（ａ） ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンのプライム用量を対象に投与することであって、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンは、配列番号１２５～１３７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、プライム用量を対象に投与することと、
（ｂ） 本明細書に開示される任意の実施形態又は組合わせの、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンのブースト用量を対象に投与することと、を含む。
別の実施形態では、投与は、
（ａ） 本明細書に開示される任意の実施形態又は組合わせのプライム用量を対象に投与することと、
（ｂ） ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンのブースト用量を対象に投与することであって、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンは、配列番号１２５～１３７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、ブースト用量を対象に投与することと、を含む。
これらの実施形態のいずれかにおいて、任意の適切なＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンを、本開示の免疫原性組成物と組み合わせて使用することができ、これには、開発されるワクチン、並びにＭｏｄｅｒｎａ、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ等から入手可能なワクチンが含まれるが、これらに限定されない。
方法の別の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むがこれに限定されない重症急性呼吸器（ＳＡＲＳ）ウイルスに感染しており、投与は、対象においてＳＡＲＳウイルスに対する免疫応答を誘発し、ＳＡＲＳ対象のウイルス感染症を治療することを含む。方法がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療を含む場合、免疫原性組成物は、すでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している対象、及び／又は対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した可能性が高いことを示唆する（上記のような）症状に罹患している対象に投与される。
本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療すること」には、以下のうちの１つ又は複数を達成することが含まれるが、これらに限定されない。（ａ）対照におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を低下させること、（ｂ）被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価の上昇を制限すること、（ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状の重症度を軽減すること、（ｄ）感染後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状の発症を制限又は防止すること、（ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状の悪化を抑制すること、（ｆ）以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症状があった被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状の再発を制限又は予防すること、及び／又は（ｅ）生存。
本開示は、本開示のナノ粒子及び組成物を調製するために使用され得るキットを更に提供する。一実施形態において、キットは、
（ａ） 本明細書に開示される任意の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチドと、
（ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質であって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよい、第１のタンパク質と、を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含み、第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、キットは、
（ａ） 第１の態様等の、本明細書に開示される任意の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸であって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよい、第１のタンパク質をコードする核酸と、を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含み、第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態では、キットは、
（ａ） 適切な制御配列に作動可能に連結された、第１の態様等の、本明細書に開示される任意の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチドをコードする核酸と含む発現ベクターと、
（ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターであって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、核酸は、適切な制御配列の作動可能に連結されている、発現ベクターと、を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含み、第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、キットは、
（ａ） 発現ベクターを含む細胞であって、発現ベクターは、適切な制御配列に作動可能に連結された、第１の態様等の、本明細書に開示される任意の実施形態又は実施形態の組合わせのポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞と、
（ｂ） 発現ベクターを含む細胞であって、発現ベクターは、配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸を含み、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、核酸は、適切な制御配列の作動可能に連結されている、発現ベクターを含む細胞と、を含むキット。
一実施形態では、ポリペプチドは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含み、第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。
実施例
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用に設計されたタンパク質ナノ粒子ワクチンによる強力な中和抗体応答の誘発
概要
進行中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２世界的流行を止めるには、安全で効果的で拡張可能なワクチンが緊急に必要である。ここでは、マウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力で防御的な抗体応答を誘発する自己集合タンパク質ナノ粒子免疫原の構造に基づく設計について説明する。ナノ粒子ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の６０コピーを免疫原性の高い配列で表示し、５分の１低い用量で、融合前に安定化されたＳエクトドメイン三量体よりも約１０倍高い中和抗体力価を誘導する。ナノ粒子免疫原によって誘発された抗体は、ＲＢＤ上の複数の異なるエピトープを標的とすることから、変異を容易に回避することに感受性ではなく、回復期のヒト血清よりも有意に低い結合：中和比を示すため、ワクチン関連の増強された呼吸器疾患のリスクが最小限に抑えられる可能性があることが示唆される。特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前安定化Ｓ三量体と比較して、タンパク質構成要素及び組み立てられたナノ粒子の高い収量及び安定性は、ナノ粒子ワクチンの製造が高度に拡張可能であることを示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤナノ粒子免疫原の設計、インビトロ集合体、及び特性決定
強力な中和Ａｂ応答を誘導するワクチン候補を設計するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ糖タンパク質のＲＢＤに注目した（図１Ａ－Ｂ）。この小さなモノマー抗原の限られた免疫原性を克服するために、２成分タンパク質ナノ粒子Ｉ５３－５０の外面にＲＢＤを多価表示した。Ｉ５３－５０は、３量体（Ｉ５３－５０Ａ）及び５量体（Ｉ５３－５０Ｂ）構成要素（全てのアミノ酸配列は表３に記載）から構築された正二十面体対称性を持つ、コンピューターで設計された２８ｎｍ、１２０サブユニット複合体である。ナノ粒子は、独立して発現及び精製されたＩ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂを単に混合することにより、インビトロで組み立てることができる。ＲＢＤ（残基３２８－５３１）は、８、１２、又は１６個のグリシン及びセリン残基を含むリンカーを使用して、Ｉ５３－５０Ａに遺伝的に融合されて（以下、ＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、又はＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａと呼ぶ）、ナノ粒子表面から伸びる抗原の柔軟な提示を可能にする（図１Ｃ）。全てのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構築物は、ウイルス抗原の適切なフォールディング及びグリコシル化を確実にするために、哺乳動物（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）細胞を使用して組換え発現した。精製ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａタンパク質の初期収率（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞１リットル当たり約３０ｍｇの精製タンパク質）は、融合前に安定化されたＳ－２Ｐ三量体よりも約２０倍高く（Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８； Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７； Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０； Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０２０）（～１．５ｍｇ／Ｌ）、プロモーターの最適化後、約６０ｍｇ／Ｌに増加した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａタンパク質を、大腸菌から精製した五量体Ｉ５３－５０Ｂと１：１のモル比（サブユニット：サブユニット）で混合して、ナノ粒子の集合体を開始した（図１Ｄ）。
Figure 2023513720000043
Figure 2023513720000044
Figure 2023513720000045
Figure 2023513720000046
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ターゲットの２０面体集合体に対応する主なピーク、及び集合体になっていない残りのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素を含むより小さいピークが明らかになった（図７Ａ及び７Ｂ）。動的光散乱（ＤＬＳ）及びネガティブ染色電子顕微鏡（ｎｓＥＭ）により、凍結／解凍の前後の様々なＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の均一性と単分散性が確認された（図１Ｅ、１Ｆ、及び図７Ｃ）。凍結／解凍前のＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０のＤＬＳによって測定された平均流体力学的直径及びパーセント多分散性は、非修飾Ｉ５３－５０ナノ粒子の３０（２２％）ｎｍと比較してそれぞれ３８．５（２７％）、３７（２１％）、及び４１（２７％）ｎｍであった。水素／重水素交換質量分析により、三量体ＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素上のＲＢＤの表示が、抗原のコンフォメーション及びいくつかの異なる抗体エピトープの構造順序を保持することが確認された（図１Ｇ及び図７Ｄ）。最後に、糖プロテオミクスを使用して、３つのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素全てが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ－２Ｐ外部ドメイン三量体と同様にＮ３３１及びＮ３４３の位置でＮ－グリコシル化されていることを示し（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、表示された抗原がそのネイティブの抗原特性を保持していることを再度示唆している（図１Ｈ及び図７Ｅ）。
Figure 2023513720000047
各実験は少なくとも２回実行され、提示された値及びフィッティングエラーは代表的な実験から得られたものである。対応する結合曲線及び適合を図８に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子構成要素及び免疫原の抗原特性決定
組換えヒトＡＣＥ２エクトドメイン及び２つのＳ特異的ｍＡｂ（ＣＲ３０２２及びＳ３０９）を使用して、Ｉ５３－５０Ａに融合したときのＲＢＤの抗原性、並びに組み立てられたナノ粒子免疫原のコンテキストでの複数のＲＢＤエピトープのアクセシビリティを特性決定した。ＣＲ３０２２及びＳ３０９はどちらもＳＡＲＳ－ＣｏＶに感染した個人から単離され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤと交差反応する。ＣＲ３０２２は弱く中和するＡｂであり、ＲＢＤが開くとアクセス可能になるが、ＡＣＥ２と相互作用するＲＢＤの表面である受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）とは異なるＲＢＤの保存された、潜在的なエピトープに結合する（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０； ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６； Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。Ｓ３０９は、サルベコウイルス間で保存され、オープン及びクローズプレフュージョンＳ配座状態の両方でアクセス可能なグリカン含有エピトープに結合することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方を中和する（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、モノマーのヒトＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）外部ドメインとモノマーのＲＢＤに対するＣＲ３０２２Ｆａｂの結合親和性を確認した。固定化ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質に対するこれらの試薬の平衡解離定数（ＫＤ）は、モノマーＲＢＤで得られた値とほぼ一致した（表４及び図８）。これらのデータは、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質がＲＢＤをその本来の立体構造で表示することを更に裏付けている。
高密度の多価抗原アレイのコンテキストで、ナノ粒子免疫原誘発Ａｂ応答の大きさ及び品質が特定のエピトープのアクセシビリティによって調節できる可能性を評価するために、固定化された二量体マカックＡＣＥ２（ｍＡＣＥ２－Ｆｃ）及びＣＲ３０２２及びＳ３０９ｍＡｂへのナノ粒子免疫原の結合を測定し、後者はＢ細胞活性化の中心であるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）－抗原相互作用を大まかに模倣している。このアプローチは、相互作用の多価の性質のためにＫＤ値の計算を可能にしないが、異なるナノ粒子構築物でのエピトープのアクセシビリティの定量的な比較を可能にする。５０％の原子価（ナノ粒子当たり約３０ＲＢＤ）でＲＢＤ抗原を表示するナノ粒子免疫原を調製するインビトロ集合体の汎用性を活用して、６０個のＲＢＤを表示する全原子価ナノ粒子を密度の低い抗原アレイと比較した（図９）。これは、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ及び融合抗原を欠く非修飾Ｉ５３－５０Ａの等モル混合物に五量体Ｉ５３－５０Ｂを加えることによって達成した。全てのＲＢＤナノ粒子が、固定化されたｍＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２、及びＳ３０９（図２Ａ）によく結合することを見出した（図２Ａ）。５０％及び１００％の原子価ＲＢＤ－８ＧＳ－及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の間で一貫した傾向はなかったが、１００％の原子価ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子は、３つ全てのバインダーに対して最高の結合シグナルをもたらした（図２Ｂ）。ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のリンカーが長いほど、ＡＣＥ２、ＣＲ３０２２、及びＳ３０９の標的となるエピトープへのアクセスが改善される可能性があるが、我々のデータでは他の考えられる説明を排除することはできない。中和抗体によって標的とされる複数の異なるエピトープが露出され、ナノ粒子の外側に提示されたＲＢＤ抗原アレイのコンテキストで結合にアクセスできると結論付ける。
ＲＢＤナノ粒子免疫原及びＳ－２Ｐ三量体の物理的及び抗原的安定性
最初に塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）で化学変性を使用して、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原の安定性を、組換えモノマーＲＢＤ及びＳ－２Ｐ外部ドメイン三量体と比較した（図３Ａ）。０～６．５ＭのＧｄｎＨＣｌでインキュベートしたサンプルからの蛍光発光スペクトルは、３つ全てのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子が４～５ＭのＧｄｎＨＣｌ間で遷移することを明らかにし、これは、少なくとも部分的なアンフォールディングを示し、一方でＳ－２Ｐ三量体は、２～４Ｍの間のより低い［ＧｄｎＨＣｌ］で遷移を示した。モノマーＲＢＤは、０～５ＭのＧｄｎＨＣｌに対して、協同性の低いアンフォールディング遷移を示した。次に一連の分析アッセイを使用して、精製後４週間にわたって物理的安定性及び抗原安定性を３つの温度でモニタリングした。＜－７０℃、２－８℃、及び２２－２７℃（図３Ｂ～Ｅ）。以前の報告と一致して、モノマーＲＢＤは非常に安定しており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１０Ａ）、ｍＡＣＥ２－Ｆｃ及びＣＲ３０２２結合（図１０Ｂ）、又は３２０／２８０ｎｍでのＵＶ／ｖｉｓ吸収の比率、粒子散乱の尺度（図１０Ｃ）による外観の変化はほとんどなかった。Ｓ－２Ｐ三量体は２～８℃で不安定であり、初期の時点でもｎｓＥＭによってアンフォールディングの明確な兆候が見られた（図９Ｄ）。ｎｓＥＭによってアンフォールディングが明らかになり、ＵＶ／ｖｉｓによってある程度の凝集が示された時（図１０Ｃ）、２２～２７℃では、最新の時点（２８日）までその構造がかなり良好に維持された。３つのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素は全て非常に安定しており、どの時点でも読取り値に実質的な変化は見られなかった（データは示していない）。最後に、ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子も４週間の研究で非常に安定しており、ＵＶ／ｖｉｓ吸光度の変化のみを示し、２２～２７℃で７日後に３２０ｎｍ付近のピークが現れた（データは示していない）。ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子サンプルの電子顕微鏡写真及びＤＬＳは、４週間にわたって全ての温度で単分散の整形式のナノ粒子を一貫して示した（図１０Ｄ、１０Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子が、Ｓ－２Ｐ外部ドメイン三量体よりも優れた高い物理的及び抗原的安定性を持っていることを示している。
ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原は、ＢＡＬＢ／ｃ及びヒト免疫レパートリーマウスで強力な中和抗体応答を誘発する
それぞれが５０％又は１００％の原子価でＲＢＤを表示する、３つのＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＳ－２Ｐ外部ドメイン三量体及びモノマーＲＢＤと比較した。１０匹のマウスのグループは、可溶性又は粒子状のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の０．９又は５μｇを含むＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント製剤で、０週目及び３週目に筋肉内に免疫された。プライムの３週間後、全てのＲＢＤナノ粒子は、８ｘ１０２～１ｘ１０４の範囲の幾何平均逆数半最大有効濃度で、強力なＳ特異的Ａｂ応答を誘発した（図４Ａ）。対照的に、モノマーＲＢＤ及び低用量のＳ－２Ｐ三量体は検出可能なレベルのＳ特異的Ａｂを誘発しなかったが、高用量のＳ－２Ｐ三量体は弱い応答を誘発した。２回目の免疫化の後、全てのＲＢＤナノ粒子グループのＳ特異的Ａｂ力価の増強が観察され、幾何平均力価（ＧＭＴ）は１ｘ１０５～２ｘ１０６の範囲であった（図４Ｂ）。これらのＳ特異的Ａｂのレベルは、ワシントン州の２９ＣＯＶＩＤ－１９ヒト回復期血清（ＨＣＳ）のパネル及びＮＩＢＳＣのベンチマーク２０／１３０ＣＯＶＩＤ－１９血漿のほとんどのサンプルと一致するか、それを上回った（図４Ａ～Ｂ、表５）。５μｇのＳ－２Ｐ三量体を２回免疫すると、ＲＢＤナノ粒子よりも１～２桁弱いＳ特異的 Ａｂ応答が誘導され、モノマーＲＢＤは２回の免疫後に検出可能な抗原特異的Ａｂを誘発しなかった。予想通り、Ｉ５３－５０足場に対するＡｂ応答も検出され、これは、全てのＲＢＤナノ粒子グループで大きさが一定であった（図１１）。これらのデータは、自己集合ナノ粒子足場でのＲＢＤの多価表示が、その免疫原性を劇的に改善することを示している。
Figure 2023513720000048
Figure 2023513720000049
再構成されていないヒト抗体可変領域及び定常領域生殖細胞系レパートリーのトランスジェニックであるＫｙｍａｂ独自のＩｎｔｅｌｌｉＳｅｌｅｃｔ（商標）トランスジェニックマウスプラットフォーム（「Ｄａｒｗｉｎ」として知られる）を使用して、ＲＢＤナノ粒子免疫原に対する潜在的なヒト抗体応答のプロトタイプを作成した。記載されているキメラ抗体遺伝子座を持つ以前のマウスとは対照的に（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、本研究のマウスは、それらが完全にヒトカッパ軽鎖Ａｂを発現するように操作されたという点で異なっていた。５匹のＤａｒｗｉｎマウスのグループに、Ｓ－２Ｐ三量体、１００％ＲＢＤ－１２ＧＳ－、又は１００％ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子を０．９μｇ（ナノ粒子のみ）又は５μｇ（図４Ｃ）の抗原用量で筋肉内免疫した。ＲＢＤナノ粒子で免疫された全てのグルーは、プライム後のＳ指向性Ａｂ応答を誘発し（ＥＣ５０ ２ｘ１０３－１ｘ１０４）、これは３週目の２回目の免疫化によって大幅にブーストされた（ＥＣ５０は４ｘ１０５～８ｘ１０５の範囲）（図４Ｃ及び４Ｄ）。この動物モデルでは、Ｓ－２Ｐ三量体は、各免疫後にＲＢＤナノ粒子に匹敵するレベルのＳ特異的Ａｂｓを誘発した。
次に、偽型ウイルス及び生ウイルス両方の中和アッセイを使用して、各免疫原によって誘発される中和活性を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、全てのＲＢＤナノ粒子免疫原が、１回の免疫後に血清中和Ａｂｓを誘発し、逆数半最大阻害希釈率（ＩＣ５０）は、偽型ウイルスでは１ｘ１０２～５ｘ１０２（ＧＭＴ）であり、生ウイルス中和アッセイで３ｘ１０３～７ｘ１０３であった（図５Ａ及び５Ｃ）。Ｓ特異的Ａｂデータと一致して、低用量又は高用量のＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、又はＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の間で、５０％（偽型ウイルス中和のみ）又は１００％価で偽型ウイルス又は生ウイルスの中和に有意差は観察されなかった。３つ全ての１００％原子価ＲＢＤナノ粒子グループのＧＭＴは、偽型ウイルス中和アッセイで試験された２９のＨＣＳのパネルのＧＭＴと一致するか、又はそれを超えた（図５Ａ）。モノマーＲＢＤ又はＳ－２Ｐ三量体による免疫は、１回の免疫後に中和Ａｂｓを誘発しなかった（図５Ａ及び５Ｃ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合と同様に、ＤａｒｗｉｎマウスにおけるＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の高用量及び低用量の両方が、１回の免疫後のＨＣＳ（ＩＣ５０ １ｘ１０２）と同等の偽型ウイルス中和Ａｂ力価（ＩＣ５０ ８ｘ１０１～２．５ｘ１０２）誘発し、一方、５μｇのＳ－２Ｐ三量体は、同様のレベルの総Ｓ特異的Ａｂｓを誘発したにもかかわらず、検出可能なレベルの中和Ａｂｓを誘発しなかった（図５Ｅ）。
両方のマウスモデルで、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子による２回目の免疫により、中和Ａｂ力価が大幅に増加した。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、偽型ウイルス中和ＧＭＴは２ｘ１０３～３ｘ１０４に達し、ＨＣＳのものを１～２桁超え、生ウイルス中和力価は２ｘ１０４～３ｘ１０４に達した（図５Ｂ及び５Ｄ）。５μｇのＳ－２Ｐ三量体による２回目の免疫も、中和活性を強力に高めたが、偽型ウイルス及び生ウイルスの中和（それぞれ３ｘ１０２及び６ｘ１０３のＧＭＴ）は、ＲＢＤナノ粒子で免疫した動物の血清よりも依然として低かった。Ｓ－２Ｐ三量体及びＲＢＤナノ粒子の間の増加は、偽型ウイルス及び生ウイルス中和アッセイでそれぞれ７～９０倍及び４～９倍の範囲であった。０．９μｇ用量のＳ－２Ｐ三量体及び両方の用量のモノマーＲＢＤは、２回の免疫化後に検出可能な中和を引き出すことができなかった。Ｄａｒｗｉｎマウスでの２回目の免疫後に同様の偽型ウイルス中和の増加が観察されたが、力価はＢＡＬＢ／ｃマウスよりも全体的に低かった（図５Ｆ）。
これらのデータからいくつかの結論を導き出すことができる。第１に、ＲＢＤナノ粒子は、融合前安定化Ｓ－２Ｐ三量体によって、また２回の投与後にヒトへの感染によって誘発されるものを超える、２つのマウスモデルで強力な中和Ａｂ応答を誘発する。第２に、リンカーの長さ及び抗原の価数は、ＲＢＤナノ粒子の全体的な免疫原性に実質的に影響を及ぼさないが、ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０はリンカーが短いナノ粒子よりも免疫原性が高い可能性があることを示唆する傾向がある。これらの観察結果は、表４及び図２に示す抗原性及びアクセシビリティデータと一致しており、全てのＲＢＤナノ粒子免疫原で複数のエピトープがインタクトでアクセス可能であることを示している。最後に、各ナノ粒子免疫原の０．９μｇ及び５μｇ両方の用量による同等の中和Ａｂ力価の誘発は、Ｉ５３－５０ナノ粒子でのＲＢＤ提示により、ワクチンの製造及び配布の重要な考慮事項である用量節約が可能になることを示唆している。
ＡｄｄａＶａｘ（商標）のみ、モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、又はＲＢＤ－８ＧＳ－又はＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫した８匹のマウスに、マウス適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ）で、ブースト７週間後にチャレンジして、これらの免疫原がウイルス複製からの保護を与えるかどうかを決定する。ＲＢＤ－８ＧＳ及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子は、マウスの肺及び鼻甲介における検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ複製から完全に保護した（図５Ｇ～Ｈ）。モノマーＲＢＤ、０．９μｇのＳ－２Ｐ三量体、及びアジュバントコントロールによる免疫は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ複製から保護しなかった。これらの結果は、ＲＢＤナノ粒子が用量又は原子価のいずれかで強力な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ａｂ応答を誘導することを示す、偽型ウイルス及び生ウイルスの中和データを反映している。
ＲＢＤナノ粒子ワクチンは、マウス及び非ヒト霊長類の複数のエピトープを標的とする堅牢なＢ細胞応答及び抗体を誘発する
胚中心（ＧＣ）応答は、耐久性のあるＢ細胞記憶の形成における重要なプロセスであり、その結果、親和性が成熟したクラススイッチ記憶Ｂ細胞及び長寿命の形質細胞が形成される。したがって、モノマーＲＢＤ、Ｓ－２Ｐ三量体、及びＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、又はＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫したマウスにおける抗原特異的ＧＣ Ｂ細胞応答を評価した。ＲＢＤ特異的Ｂ細胞の量及び表現型を免疫の１１日後に評価し、ＧＣ前駆体及びＢ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ３－ＣＤ１３８－ＣＤ３８－ＧＬ７＋）のレベルを決定した（図１２）。ＲＢＤナノ粒子による免疫は、ＲＢＤ特異的Ｂ細胞及びＧＣ前駆体及びＢ細胞の拡大をもたらした（図６Ａ～Ｃ）。Ｓ－２Ｐ三量体は、ＲＢＤナノ粒子と比較して、ＲＢＤ特異的Ｂ細胞及びＧＣ前駆体及びＢ細胞の検出可能ではあるが低い数及び頻度をもたらし、一方モノマーＲＢＤ構築物は、感知できるＢ細胞応答を誘発しなかった。これらの知見と一致して、３つのＲＢＤナノ粒子及び三量体Ｓ－２Ｐによる免疫により、ＣＤ３８＋／－ＧＬ７＋ＩｇＭ＋及びクラススイッチ（ｓｗＩｇ＋）ＲＢＤ特異的Ｂ細胞が出現し、機能的なＧＣ前駆体及びＧＣ Ｂ細胞を示す（図６Ｄ）。ＲＢＤ－ナノ粒子及び程度は低いがＳ－２Ｐ構築物で免疫したマウスにおける堅牢なＧＣ Ｂ細胞応答並びにＩｇＭ＋及びｓｗＩｇ＋ＲＢＤ特異的Ｂ細胞の割合の増加は、進行中のＧＣ反応と一致しており、この時に、記憶Ｂ細胞及び長寿命の形質細胞が形成されるはずである。ＲＢＤナノ粒子ワクチンによって誘発される体液性応答の持続性を評価するために、ブーストの２０～２４週間後の血清Ａｂ応答を分析した。結合力価及び中和力価の両方の大きさは、全てのナノ粒子グループのブーストの２週間後のレベルと同様であり（図１２Ｂ、Ｃ）、設計された免疫原が強力なだけでなく、耐久性のある中和Ａｂｓも誘発することを示している。これは、骨髄中のＳ－２Ｐ特異的Ａｂ分泌細胞の数が、Ｓ－２Ｐ三量体と比較して、ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子で免疫化されたマウスで約３倍高かったため、ナノ粒子ワクチンによる長寿命の形質細胞の誘導が改善されたことが一因である可能性がある（図１２Ｄ）。
Ｓ－２Ｐ及びＲＢＤ－８ＧＳ－、ＲＢＤ－１２ＧＳ－、及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子及びＨＣＳによって誘発される中和抗体への結合の比率を、ナノ粒子免疫原によって誘発されるＡｂ応答の品質の尺度として比較した。Ｋｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウスでは、ナノ粒子ワクチンは、Ｓ－２Ｐ免疫マウスよりも低い（より良い）比率であったが、ＨＣＳよりは高かった（図６Ｅ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＲＢＤ－１２ＧＳ－及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０によって誘発された偽型ウイルス中和力価への結合の比率は、Ｓ－２Ｐ及びＨＣＳと比較して明らかに減少した（図６Ｆ）。このパターンは、生ウイルス中和力価を使用して比率を計算した場合に一貫していたが、生ウイルス中和アッセイで得られた値が高いため、グループ間の差の大きさは、より小さかった。これらの結果は、ＲＢＤ－１２ＧＳ及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原によって誘発されるＡｂ応答が、Ｓ－２Ｐ三量体による免疫から得られたもの、又は自然感染中に獲得されたものよりも高品質であることを示唆しており、これはおそらくほとんどの中和Ａｂｓの標的であるＲＢＤのエピトープに焦点を当てているからである。
我々は、ワクチン接種に対する免疫応答がヒトにより類似している非ヒト霊長類モデルにおいて、ナノ粒子免疫原による免疫化で誘発されるＡｂｓによって認識されるエピトープを特定することに着手した。マカックを２５０μｇのＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０（８８μｇのＲＢＤ抗原）で０週目及び４週目に免疫し、８週目に採取した血清が高レベルのＳ特異的抗体（ＥＣ５０約１ｘ１０６）を有していることを見出した。ポリクローナルＦａｂは、ｈＡＣＥ２、ＣＲ３０２２、及びＳ３０９との競合ＢＬＩで使用するために生成及び精製され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ上のＡｂｓを中和することによって標的とされる３つの異なる部位を認識する（図６Ｇ）。ポリクローナル血清は、それぞれの解離定数を超える濃度で、ｈＡＣＥ２、ＣＲ３０２２Ｆａｂ、及びＳ３０９Ｆａｂの結合を用量依存的に阻害した（図６Ｈ～Ｊ）。これらのデータは、１２ＧＳ－ＲＢＤ－Ｉ５３－５０による免疫化が、いくつかの重複しないエピトープを標的とするＡｂを誘発したことを示しており、特にコロナウイルスは、インフルエンザ又はヒト免疫不全ウイルス等のウイルスと比較した場合、素早く変異しないため、我々は、エスケープ変異の出現及び選択の可能性は限定されていると予想する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
考察
ここでは、２成分自己集合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤナノ粒子ワクチン候補が、複数の異なるＲＢＤエピトープを標的とする強力な中和Ａｂ応答を誘発することを示した。融合前に安定化された外部ドメイン三量体と比較して、ＲＢＤナノ粒子によって誘発されるより大きな中和Ａｂ応答は非常に有望である。我々のデータは、ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０及びＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０がＳ特異的Ａｂｓのほぼ１０倍高いレベルを誘発し、更に重要なことに、Ｓ－２Ｐ外部ドメイン三量体と比較して約１０倍高いレベルの中和活性を誘発することを示している。この効力の増強は、質量基準の５分の１低い抗原用量で維持され、ナノ粒子への提示にも投与量節約効果があることを示唆している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２世界的流行に対応するために前例のない数のワクチンを製造する必要性に対処するには、有効性の強化及び用量節約の両方が重要になる可能性がある。
ＲＢＤはモノマーとしては免疫原性が不十分であるが、我々のデータは、我々の設計において多価で提示された場合、免疫原性の高いワクチンの基礎を形成できることを立証している。ＲＢＤナノ粒子による免疫化で誘発される非常に低い結合：中和比は、Ｉ５３－５０上のＲＢＤの提示が、中和Ａｂｓによって認識されるエピトープに対する体液性応答に焦点を合わせていることを示唆している。高レベルの結合性でありながら中和しない、又は弱く中和するＡｂｓは、ワクチンに関連する呼吸器疾患の増強に寄与する可能性があるため、この測定基準は、ワクチンの安全性を示す重要な指標となる可能性がある。我々のデータは更に、ＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０が、ＲＢＤで同定された中和Ａｂｓによって認識される重複しないエピトープのいくつかを標的とするＡｂ応答を誘発したことを示している。複数の異なるエピトープを標的とするこのようなポリクローナル応答は、観察された中和の大きさを説明する可能性があり、エスケープ変異の選択又は出現のリスクを最小限に抑えるに違いない。最後に、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素の高い生産収率、及び抗原を含むＲＢＤナノ粒子の堅牢な安定性により、それらは大規模製造に適している。
参考文献
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Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．，Ｃａｎｉｅｌｓ，Ｔ．Ｇ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｋ．，Ｓｎｉｔｓｅｌａａｒ，Ｊ．Ｌ．，Ａｌｄｏｎ，Ｙ．，Ｂａｎｇａｒｕ，Ｓ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｏｋｂａ，Ｎ．Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｉｒｅａｕｘ，Ｍ．，Ｋｅｒｓｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｅｆｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｂｒｕｕｎ，Ｔ．Ｕ．Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｄｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｍ．（２０１８）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｒｕｇｇｅｄ Ｎａｎｏｓｃａｆｆｏｌｄ Ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｐｌｕｇ－ａｎｄ－Ｄｉｓｐｌａｙ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １２，８８５５－８８６６．
Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｋ．，Ｌｅｉｓｔ，Ｓ．Ｒ．，Ａｂｉｏｎａ，Ｏ．Ｍ．，Ｂｏｙｏｇｌｕ－Ｂａｒｎｕｍ，Ｓ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｈｉｍａｎｓｕ，Ｓ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．，Ｚｉｗａｗｏ，Ｃ．Ｔ．，ＤｉＰｉａｚｚａ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ．
Ｃｏｒｔｉ，Ｄ．，Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｐｅｄｏｔｔｉ，Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ，Ｌ．，Ａｇｎｉｈｏｔｈｒａｍ，Ｓ．，Ｆｅｔｔ，Ｃ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｂ．，Ｆｏｇｌｉｅｒｉｎｉ，Ｍ．，Ａｇａｔｉｃ，Ｇ．，Ｖａｎｚｅｔｔａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＭＥＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２，１０４７３－１０４７８．
Ｄａｉ，Ｌ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｘｕ，Ｋ．，Ｈａｎ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｅ．，Ａｎ，Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＣＯＶＩＤ－１９，ＭＥＲＳ，ａｎｄ ＳＡＲＳ．Ｃｅｌｌ．
Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｋ．Ｆ．，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｋ．，Ｇｕｍｉｎａ，Ｍ．Ｅ．，Ｐｅｔｒｉｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｘｕｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｏｎｔｏ，Ａ．Ｓ．，Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．（２０１８）．Ｓｅｒａ ｆｒｏｍ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ Ｎａｒｒｏｗｌｙ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｓｅｌｅｃｔ Ｖｉｒａｌ Ｅｓｃａｐｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２．
Ｄｉｎｎｏｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｌｅｉｓｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｄ．Ｒ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｓ．Ａ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．，Ｙｏｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｈｏｕ，Ｙ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａ ｍｏｕｓｅ－ａｄａｐｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２００６．０８１４９７．
Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ｋ．，Ｓｔａｌｌｓ，Ｖ．，Ｍａｎｎｅ，Ｋ．，Ｗａｔｔｓ，Ｂ．，Ｐａｒｋｓ，Ｒ．，Ｇｏｂｅｉｌ，Ｓ．Ｍ．Ｃ．，Ｊａｎｏｗｓｋａ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｌｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｏｌｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ． ｂｉｏＲｘｉｖ．
Ｅｒａｓｍｕｓ，Ｊ．Ｈ．，Ｋｈａｎｄｈａｒ，Ａ．Ｐ．，Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．Ａ．，Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｈｅｍａｎｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍｕｒａｐａ，Ｐ．，Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ，Ｓ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａｎ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２．
Ｆｏｌｅｇａｔｔｉ，Ｐ．Ｍ．，Ｅｗｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ａｌｅｙ，Ｐ．Ｋ．，Ａｎｇｕｓ，Ｂ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｂｅｌｉｊ－Ｒａｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ，Ｓ．，Ｂｅｌｌａｍｙ，Ｄ．，Ｂｉｂｉ，Ｓ．，Ｂｉｔｔａｙｅ，Ｍ．，Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２： ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ １／２，ｓｉｎｇｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｏ．（２００９）．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３－３４５．
Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｃｏｕｃｈ，Ｇ．Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ Ｆｅｒｒｉｎ，Ｔ．Ｅ．（２０１８）．ＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ： Ｍｅｅｔｉｎｇ ｍｏｄｅｒｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２７，１４－２５．
Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．（２０２０）．Ｒａｐｉｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８，９４５－９４６．
Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｍ．，Ｗｅｉｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｋ．Ｋ．（２０１３）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ａｎｄ ｎｏｉｓｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２４，１９０６－１９１２．
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ｋ．，Ｊａｎｏｗｓｋａ，Ｋ．，Ｓｔａｌｌｓ，Ｖ．，Ｇｏｂｅｉｌ，Ｓ．Ｍ．Ｃ．，Ｋｏｐｐ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｐａｒｋｓ，Ｒ．，Ｈｓｕ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎｅ－Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｓ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．，Ｈｅｒｒｌｅｒ，Ｔ．，Ｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｉｅｒｇｅｎｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｈｅｒｒｌｅｒ，Ｇ．，Ｗｕ，Ｎ．Ｈ．，Ｎｉｔｓｃｈｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃｅｌｌ １８１，２７１－２８０．ｅ２７８．
Ｈｏｕ，Ｙ．Ｊ．，Ｏｋｕｄａ，Ｋ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｄ．Ｒ．，Ａｓａｋｕｒａ，Ｔ．，Ｄｉｎｎｏｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｙｏｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｍａｓｃｅｎｉｋ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ．Ｃｅｌｌ １８２，４２９－４４６．ｅ４１４．
Ｈｓｉａ，Ｙ．，Ｂａｌｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｏｎｅｎ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｄ．，Ｓｈｅｆｆｌｅｒ，Ｗ．，Ｆｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．，Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ，Ｕ．，Ｘｕ，Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｐ．Ｓ．，Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｈｙｐｅｒｓｔａｂｌｅ ６０－ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｄｅｃａｈｅｄｒｏｎ．［ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ］．Ｎａｔｕｒｅ ５３５，１３６－１３９．
Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｈａｕｂ，Ｊ．Ｍ．，ＤｉＶｅｎｅｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｋｕｏ，Ｈ．Ｃ．，Ｊａｖａｎｍａｒｄｉ，Ｋ．，Ｌｅ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｈｕｏ，Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｒｅｎ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｄｕｙｖｅｓｔｅｙｎ，Ｈ．Ｍ．Ｅ．，Ｇｉｎｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｃａｒｒｉｑｕｅ，Ｌ．，Ｍａｌｉｎａｕｓｋａｓ，Ｔ．，Ｒｕｚａ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ Ｓｐｉｋｅ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ．
Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｂ．Ｊ．（２０２０）．Ｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６５，１－６．
Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｒｏｕｐｈａｅｌ，Ｎ．Ｇ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｍａｋｈｅｎｅ，Ｍ．，Ｃｏｌｅｒ，Ｒ．Ｎ．，ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａｎ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ － Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．
Ｋａｎｅｉｙｏ，Ｍ．，Ｂｕ，Ｗ．，Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｂａｘａ，Ｕ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｎａｒｐａｌａ，Ｓ．，Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ｐ．，Ｒａｏ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ｃｅｌｌ １６２，１０９０－１１００．
Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｄ．，ａｎｄ Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ．（２０１９ａ）．Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１９，Ｓ８８－Ｓ９６．
Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．（２０２０）．Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．
Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．，Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｆ．，Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ａ．Ｋ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ａｍｂｒｏｚａｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｒｅａｎｇａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９ｂ）．Ｍｏｓａｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｂｒｏａｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，３６２－３７２．
Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．，Ｗｅｉ，Ｃ．Ｊ．，Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．，ＭｃＴａｍｎｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｒａｏ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｏｎｇ，Ｗ．Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２０１３）．Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｈ１Ｎ１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４９９，１０２－１０６．
Ｋｅｅｃｈ，Ｃ．，Ａｌｂｅｒｔ，Ｇ．，Ｒｅｅｄ，Ｐ．，Ｎｅａｌ，Ｓ．，Ｐｌｅｓｔｅｄ，Ｊ．Ｓ．，Ｚｈｕ，Ｍ．，Ｃｌｏｎｅｙ－Ｃｌａｒｋ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｐａｔｅｌ，Ｎ．，Ｆｒｉｅｍａｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．０８．０５．２０１６８４３５．
Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．，Ｃａｎｃｈｏｌａ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｒａｎｄｔ，Ｃ．Ｄ．，Ｐｙｌｅｓ，Ｇ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｐａｒｒｏｔｔ，Ｒ．Ｈ．（１９６９）．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｐｒｉｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ８９，４２２－４３４．
Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ．，Ｓｈｅｆｆｌｅｒ，Ｗ．，Ｓａｗａｙａ，Ｍ．Ｒ．，Ｖｏｌｌｍａｒ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｕｍｉｄａ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｄｒｅ，Ｉ．，Ｇｏｎｅｎ，Ｔ．，Ｙｅａｔｅｓ，Ｔ．Ｏ．，ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，Ｄ．（２０１２）．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｍｉｃ ｌｅｖｅｌ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６，１１７１－１１７４．
Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒ，Ｒ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｐａｌｌｅｓｅｎ，Ｊ．，Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ａ．Ｂ．（２０１８）．Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅｓ ａｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８，１５７０１．
Ｋｒｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｒ．，Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｐｏｒｒａｓ，Ｃ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｃ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｓ．，Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｅｎｔ ＨＰＶ ｖａｃｃｉｎｅ－Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｓｔａ Ｒｉｃａ ＨＰＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｒｉａｌ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ３６，４７７４－４７８２．
Ｋｒｅｎｋｏｖａ，Ｊ．，Ｓｚｅｋｒｅｎｙｅｓ，Ａ．，Ｋｅｒｅｓｚｔｅｓｓｙ，Ｚ．，Ｆｏｒｅｔ，Ｆ．，ａｎｄ Ｇｕｔｔｍａｎ，Ａ．（２０１３）．Ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ ｏｎ ａ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １３２２，５４－６１．
Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｙ，Ａ．Ｔ．，Ｔｈｏｕｖｅｎｅｌ，Ｃ．Ｄ．，Ｐｏｒｔｕｇａｌ，Ｓ．，Ｋｅｉｔａｎｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．，Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．（２０１６）．Ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＭ（＋） Ｍｅｍｏｒｙ Ｂ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｒａｐｉｄ，Ｐｌａｓｔｉｃ，Ｅａｒｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ ｕｐｏｎ Ｍａｌａｒｉａ Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４５，４０２－４１４．
Ｋｕｍｒｕ，Ｏ．Ｓ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｉｄｄａｕｇｈ，Ｃ．Ｒ．，Ｐｒｕｓｉｋ，Ｔ．，ａｎｄ Ｖｏｌｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（２０１４）．Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｃｈａｉｎ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４２，２３７－２５９．
Ｌａｎ，Ｊ．，Ｇｅ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｓｈａｎ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｆａｎ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．
Ｌｅｅ，Ｅ．Ｃ．，Ｌｉａｎｇ，Ｑ．，Ａｌｉ，Ｈ．，Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｌ．，Ｂｅａｓｌｅｙ，Ａ．，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ－Ｇｅｒｄｅｓ，Ｔ．，Ｂｏｎｏｌｉ，Ｌ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，３５６－３６３．
Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｇｕｉａ，Ｒ．，Ｚｏｓｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ｓ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ａｙｅｒｓ，Ｔ．，Ｂｏｅｃｋｈ，Ｍ．，Ｈｕｒｔ，Ａ．Ｃ．，Ｌａｋｄａｗａｌａ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｐｅｒｓｏｎ－ｔｏ－ｐｅｒｓｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｅｓｃａｐｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｓｅｒｕｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｅｌｉｆｅ ８．
Ｌｅｔｋｏ，Ｍ．，Ｍａｒｚｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｖ．（２０２０）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓａｇｅ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌｉｎｅａｇｅ Ｂ ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．
Ｌｉ，Ｗ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｖａｓｉｌｉｅｖａ，Ｎ．，Ｓｕｉ，Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｅｒｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｎ，Ｍ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｕｚｕｒｉａｇａ，Ｋ．，Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４２６，４５０－４５４．
Ｌｉ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｚａｉ，Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｑ．，Ｌｉ，Ｙ．，ａｎｄ Ｃｈａｉｌｌｏｎ，Ａ．（２０２０）．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ２０１９－ｎＣｏＶ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ９２，５０１－５１１．
Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．，Ｍａｌｉｔｏ，Ｅ．，Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．（２０１６）．Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １４，５８－６８．
Ｍａｎｄｏｌｅｓｉ，Ｍ．，Ｓｈｅｗａｒｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｈａｎｋｅ，Ｌ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｐｕｓｈｐａｒａｊ，Ｐ．，Ｖｉｄａｋｏｖｉｃｓ，Ｌ．Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｃ．，Ｌｏｒｅ，Ｋ．，Ｄｏｐｉｃｏ，Ｘ．Ｃ．，Ｃｏｑｕｅｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００７．２０３１．２２８４８６．
Ｍａｒｃａｎｄａｌｌｉ，Ｊ．，Ｆｉａｌａ，Ｂ．，Ｏｌｓ，Ｓ．，Ｐｅｒｏｔｔｉ，Ｍ．，ｄｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｗ．，Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｄｇｅ，Ｅ．，Ｂｅｎｈａｉｍ，Ｍ．，Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ １７６，１４２０－１４３１ ｅ１４１７．
ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｍ．，Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｂｏｗｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｏｒｔｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｎａｃｈｅｒｙ，Ｖ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｊｒ．，Ｄｅｂｂｉｎｋ，Ｋ．，Ａｇｎｉｈｏｔｈｒａｍ，Ｓ．，Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ，Ｌ．Ｅ．，Ｐｌａｎｔｅ，Ｊ．Ａ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｏｂｅｙ，Ｔ．，Ｇｅ，Ｘ．Ｙ．，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ａ ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂａｔ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｓｈｏｗｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１，１５０８－１５１３．
Ｍｅｎａｃｈｅｒｙ，Ｖ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｊｒ．，Ｓｉｍｓ，Ａ．Ｃ．，Ｄｅｂｂｉｎｋ，Ｋ．，Ａｇｎｉｈｏｔｈｒａｍ，Ｓ．Ｓ．，Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ，Ｌ．Ｅ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｃｏｂｅｙ，Ｔ．，Ｐｌａｎｔｅ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｙａｌ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ ＷＩＶ１－ＣｏＶ ｐｏｉｓｅｄ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３，３０４８－３０５３．
Ｍｉｌｌｅｔ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｇ．Ｒ．（２０１６）．Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＬＶ）－ｂａｓｅｄ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ－ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏ Ｐｒｏｔｏｃ ６．
Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｙｋｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｋｉｔｃｈｉｎ，Ｎ．，Ａｂｓａｌｏｎ，Ｊ．，Ｇｕｒｔｍａｎ，Ａ．，Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｓ．Ｐ．，Ｎｅｕｚｉｌ，Ｋ．，Ｒａａｂｅ，Ｖ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｒ．，Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｐｈａｓｅ １／２ Ｓｔｕｄｙ ｔｏ Ｄｅｓｃｒｉｂｅ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ（ＢＮＴ１６２ｂ１）ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ １８ ｔｏ ５５ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ａｇｅ： Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｒｅｐｏｒｔ． ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０．２００６．２０３０．２０１４２５７０．
Ｐａｌｌｅｓｅｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒ，Ｒ．Ｎ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４，Ｅ７３４８－Ｅ７３５７．
Ｐｉｎｔｏ，Ｄ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｊ．，Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｓ．，Ｊａｃｏｎｉ，Ｓ．，Ｃｕｌａｐ，Ｋ．，Ｚａｔｔａ，Ｆ．，Ｄｅ Ｍａｒｃｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５８３，２９０－２９５．
Ｐｏｈ，Ｃ．Ｍ．，Ｃａｒｉｓｓｉｍｏ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ａｍｒｕｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈｅｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｆｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．，Ｙｅｏ，Ｎ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｔｏｒｒｅｓ－Ｒｕｅｓｔａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｔｗｏ ｌｉｎｅａｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｅｌｉｃｉｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，２８０６．
Ｐｏｌａｃｋ，Ｆ．Ｐ．，Ｔｅｎｇ，Ｍ．Ｎ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．，Ｅｘｎｅｒ，Ｍ．，Ｒｅｇｅｌｅ，Ｈ．，Ｌｉｒｍａｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｒａｂｏｌｄ，Ｒ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｋａｒｐ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６，８５９－８６５．
Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，Ｇａｅｂｌｅｒ，Ｃ．，Ｍｕｅｃｋｓｃｈ，Ｆ．，Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｊ．Ｃ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｃｈｏ，Ａ．，Ａｇｕｄｅｌｏ，Ｍ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｃ．Ｏ．，Ｇａｚｕｍｙａｎ，Ａ．，Ｆｉｎｋｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．
Ｒｏｃｋｘ，Ｂ．，Ｃｏｒｔｉ，Ｄ．，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｅ．，Ｓｈｅａｈａｎ，Ｔ．，Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｋ．，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．，ａｎｄ Ｂａｒｉｃ，Ｒ．（２００８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔ ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２，３２２０－３２３５．
Ｒｏｓｓｅｎ，Ｊ．Ｗ．，ｄｅ Ｂｅｅｒ，Ｒ．，Ｇｏｄｅｋｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｒａａｍｓｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｚｉｎｅｋ，Ｍ．Ｃ．，Ｖｅｎｎｅｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｒｏｔｔｉｅｒ，Ｐ．Ｊ．（１９９８）．Ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，４９７－５０３．
Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｍｕｉｋ，Ａ．，Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ｅ．，Ｖｏｇｌｅｒ，Ｉ．，Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．，Ｖｏｒｍｅｈｒ，Ｍ．，Ｂａｕｍ，Ａ．，Ｐａｓｃａｌ，Ｋ．，Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．，Ｍａｕｒｕｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ＜ｓｕｂ＞Ｈ＜／ｓｕｂ＞１ ｔｙｐｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ． ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０．２００７．２０１７．２０１４０５３３．
Ｓｅｙｄｏｕｘ，Ｅ．，Ｈｏｍａｄ，Ｌ．Ｊ．，ＭａｃＣａｍｙ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｒｋｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｈｕｒｌｂｕｒｔ，Ｎ．Ｋ．，Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ，Ｍ．Ｆ．，Ａｋｉｎｓ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ａ．Ｂ．，Ｗａｎ，Ｙ．－Ｈ．，Ｆｅｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００５．２０１２．０９１２９８．
Ｓｈａｎｇ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｇ．，Ｓｈｉ，Ｋ．，Ｗａｎ，Ｙ．，Ｌｕｏ，Ｃ．，Ａｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｇｅｎｇ，Ｑ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｉ，Ｆ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｎａｔｕｒｅ．
Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｘｔｏｎ，Ｎ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（２０１４）．Ｔｈｉｎｋｉｎｇ Ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ Ｔｒｉａｎｇｌｅ： Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｒｇｅｓｔ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ １，１１１－１３２．
Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｋ．，Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ｄ．Ａ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｖ．，Ｃａｓｓｏｔｔａ，Ａ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｓ．，Ｖａｎｚｅｔｔａ，Ｆ．，Ｍｉｎｏｌａ，Ａ．，Ｊａｃｏｎｉ，Ｓ．，Ｍｅｌｅ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，８２３－８２６．
Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｉｔｃｏｍｂｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｂａｒｓｎｅｓｓ，Ｌ．Ｏ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｎ．，Ｋａｔｚｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．（２０１２）．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｅｒｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９，２０６５－２０７７．
ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ，Ｅ．Ｎ．，Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｍａｒｉｓｓｅｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｏｘ，Ｆ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｂａｋｋｅｒ，Ａ．Ｑ．，Ｂｏｇａａｒｄｓ，Ｊ．Ａ．，ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ： ｓｙｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ３，ｅ２３７．
Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０１９）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ．Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １０５，９３－１１６．
Ｔｒａｇｇｉａｉ，Ｅ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｓｕｂｂａｒａｏ，Ｋ．，Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ，Ｌ．，Ｕｅｍａｔｓｕ，Ｙ．，Ｇｉｓｍｏｎｄｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．，Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．（２００４）．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ： ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０，８７１－８７５．
Ｕｅｄａ，Ｇ．，Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃ，Ａ．，Ｆａｌｌａｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｈｅｆｆｌｅｒ，Ｗ．，Ｃｏｐｐｓ，Ｊ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｄ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｍｏｙｅｒ，Ａ．，Ｙａｓｍｅｅｎ，Ａ．，Ｔｓｙｂｏｖｓｋｙ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｔａｉｌｏｒｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｅｌｉｆｅ ９．
Ｖｅｒｋｅｒｋｅ，Ｈ．Ｐ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｉｃｈ，Ｃ．Ａ．，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，Ｆｉｌｉｐａｖｉｃｉｕｓ，Ｍ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｏｖｅｒｂａｕｇｈ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｋ．Ｋ．（２０１６）．Ｅｐｉｔｏｐｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ－Ｌｉｋｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｔｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｖｅｒｓｅ ＨＩＶ－１ Ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０，９４７１－９４８２．
Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｊ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｗａｌｌ，Ａ．，ＭｃＧｕｉｒｅ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ １８１，２８１－２９２．ｅ２８６．
Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｏｓｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｆｒｅｎｚ，Ｂ．，Ｒｏｔｔｉｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．，ＤｉＭａｉｏ，Ｆ．，Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０１６ａ）．Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５３１，１１４－１１７．
Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｅｎｚ，Ｂ．，Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．，ＤｉＭａｉｏ，Ｆ．，Ｂｏｓｃｈ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０１６ｂ）．Ｇｌｙｃａｎ ｓｈｉｅｌｄ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｓｋｉｎｇ ｏｆ ａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３，８９９－９０５．
Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｊ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．，Ｂｏｓｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０１７）．Ｔｅｃｔｏｎｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４，１１１５７－１１１６２．
Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｊ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｊ．，Ｑｕｉｓｐｅ，Ｊ．，Ｃａｍｅｒｏｎｉ，Ｅ．，Ｇｏｐａｌ，Ｒ．，Ｄａｉ，Ｍ．，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｉｍｉｃｒｙ Ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７６，１０２６－１０３９．ｅ１０１５．
Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｄｒａｂｅｋ，Ｄ．，Ｏｋｂａ，Ｎ．Ｍ．Ａ．，ｖａｎ Ｈａｐｅｒｅｎ，Ｒ．，Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．，ｖａｎ Ｋｕｐｐｅｖｅｌｄ，Ｆ．Ｊ．Ｍ．，Ｈａａｇｍａｎｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．，ａｎｄ Ｂｏｓｃｈ，Ｂ．－Ｊ．（２０２０ａ）．Ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００３．２０１１．９８７９５８．
Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｎｉｕ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｌｕ，Ｇ．，Ｑｉａｏ，Ｃ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｙｕｅｎ，Ｋ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ｂ）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅｎｔｒｙ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２．Ｃｅｌｌ １８１，８９４－９０４．ｅ８９９．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｃｒｉｓｐｉｎ，Ｍ．（２０２０）．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｗｅｉｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｓｓ，Ｉ．Ｊ．（２００６）．Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｕｓｉｎｇ ＨＸ－Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １７，１７００－１７０３．
Ｗｏｏ，Ｐ．Ｃ．，Ｌａｕ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｉ，Ｋ．Ｓ．，Ｐｏｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｗｏｎｇ，Ｂ．Ｈ．，Ｔｓｏｉ，Ｈ．Ｗ．，Ｙｉｐ，Ｂ．Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｈ．，ａｎｄ Ｙｕｅｎ，Ｋ．Ｙ．（２００６）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｂａｔｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５１，１８０－１８７．
Ｗｒａｐｐ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｌ．，Ａｂｉｏｎａ，Ｏ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄ ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．（２０２０）．Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１２６０－１２６３．
Ｗｕ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｓｈｅｎ，Ｃ．，Ｐｅｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｚｈａｏ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｂｉ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａ ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｐａｉｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｌｏｃｋ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖｉｒｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＣＥ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８，１２７４－１２７８．
Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．，Ｑｕ，Ｋ．，Ｃｉａｚｙｎｓｋａ，Ｋ．Ａ．，Ｈｏｓｍｉｌｌｏ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｅｂｒａｈｉｍｉ，Ｓ．，Ｋｅ，Ｚ．，Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｓ．Ｈ．Ｗ．，Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，Ｌ．，Ｇｒｉｃｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ，ｃｌｏｓｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．，Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｊ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｃ．，Ｗａｌｌｓ，Ａ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｗ．，ＭｃＧｕｉｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．，Ｂｏｓｃｈ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｅｅｓｌｅｒ，Ｄ．（２０１８）．Ｇｌｙｃａｎ Ｓｈｉｅｌｄ ａｎｄ Ｆｕｓｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｉｎｅ－Ｔｕｎｅｄ ｆｏｒ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２．
Ｙａｎ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｘｉａ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｚｈｏｕ，Ｑ．（２０２０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７，１４４４－１４４８．
Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｄｕ，Ｌ．，Ｊｉａｎｇ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｚ．，Ｂａｒｉｃ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｌｉ，Ｆ．（２０１５）．Ｔｗｏ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｗｅｒｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ Ｂａｔ－ｔｏ－Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９，９１１９－９１２３．
Ｙｕ，Ｊ．，Ｔｏｓｔａｎｏｓｋｉ，Ｌ．Ｈ．，Ｐｅｔｅｒ，Ｌ．，Ｍｅｒｃａｄｏ，Ｎ．Ｂ．，ＭｃＭａｈａｎ，Ｋ．，Ｍａｈｒｏｋｈｉａｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｎｋｏｌｏｌａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｙｕａｎ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｎ．Ｃ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｄ．，Ｓｏ，Ｒ．Ｔ．Ｙ．，Ｌｖ，Ｈ．，Ｍｏｋ，Ｃ．Ｋ．Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．（２０２０）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．
Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ａ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｇ．（２０１２）．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂａｔ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｃｌｏｓｅｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ Ｓ１／Ｓ２ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８４，４９４２－４９４９．
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｄｕｙｖｅｓｔｅｙｎ，Ｈ．Ｍ．Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｈ．，Ｓｈｉｈ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ａ）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｈｕ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｓｏｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ｂ）．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂａｔ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｃｌｏｓｅｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ Ｓ１／Ｓ２ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ３０，２１９６－２２０３．ｅ２１９３．
Ｚｈｏｕ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｇ．，Ｈｕ，Ｂ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｓｉ，Ｈ．Ｒ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ｃ）．Ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂａｔ ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．
Ｚｈｕ，Ｆ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｈ．，Ｇｕａｎ，Ｘ．Ｈ．，Ｈｏｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｊ．Ｘ．，Ｗｕ，Ｓ．Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ａ）．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－５ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ： ａ ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３９５，１８４５－１８５４．
Ｚｈｕ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｈｕａｎｇ，Ｂ．，Ｓｈｉ，Ｗ．，Ｌｕ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０ｂ）．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，２０１９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．
Ｚｏｓｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｇｉｌｃｈｕｋ，Ｐ．，Ｃａｓｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｂｉｎｓｈｔｅｉｎ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｎｋｏｌｏｌａ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．，Ｒｅｉｄｙ，Ｊ．Ｘ．，Ｔｒｉｖｅｔｔｅ，Ａ．，Ｎａｒｇｉ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｎａｔｕｒｅ．
方法
Figure 2023513720000050
Figure 2023513720000051
Figure 2023513720000052
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｆは、懸濁液中で増殖するように形質転換され適応された女性のヒトヒト胎児由来腎臓細胞株である（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、３７℃、８％ＣＯ２で培養し、１３０ｒｐｍで振盪した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に由来する。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させ、３６．５℃、８％ＣＯ２で培養し、１５０ｒｐｍで振盪した。ＶｅｒｏＥ６は、アフリカミドリザル由来のメスの腎臓上皮細胞である。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７は、女性のヒト胎児由来腎臓細胞株（ＡＴＣＣ）である。ＨＥＫ－ＡＣＥ２接着細胞株は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌｓ（ＨＥＫ－２９３Ｔ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ２、ＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ、ＮＲ－５２５１１を通じて入手した。全ての接着細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むフラスコ内で、８％ＣＯ２で３７℃で培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ以外の細胞株は、マイコプラズマ汚染について試験されておらず、認証もされていない。
マウス
４週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから入手した。動物の手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，ＮＣの承認の下で行われた。Ｄａｒｗｉｎ（商標）として知られるＫｙｍａｂ独自のＩｎｔｅｌｌｉＳｅｌｅｃｔ（商標）トランスジェニックマウスプラットフォームは、再構成されていないヒト抗体変数及び一定の生殖細胞系列レパートリーを持つ完全なヒト抗体遺伝子座を有する。したがって、これらのマウスによって産生される抗体は完全にヒトのものである。
ブタオザル（Ｐｉｇｔａｉｌ ｍａｃａｑｕｅｓ）
この研究では、２匹の成体のオスのブタオザル（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）に免疫化した。前述のように、全ての動物はワシントン国立霊長類研究センター（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ：ＷａＮＰＲＣ）、実験動物ケア国際認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＡＡＡＬＡＣ）認定機関に収容した（Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。動物に対して行われた全ての手順は、ワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）の承認を得ていた。
回復期ヒト血清
ＰＣＲによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性と判定された３１名の個人から感染後１～６０日の間に採取されたサンプルは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗体応答についてプロファイリングされ、抗Ｓ Ａｂ応答を持つ２９名はコホートで維持した。（図４及び５）。個人は、ワシントン州シアトルのワシントン大学でのＨＡＡＲＶＩ研究の一環として登録された。これらの個人のベースラインの社会人口学的及び臨床データを表５に要約する。この研究は、ワシントン大学のヒト対象部門の治験審査委員会（ＳＴＵＤＹ０００００９５９及びＳＴＵＤＹ００００３３７６）によって承認された。全ての実験は、少なくとも２つの技術的複製及び２つの生物学的複製（ＥＬＩＳＡ及び偽型ウイルス中和アッセイ用）で行われた。１つのサンプルは、ＮＩＢＳＣの２０／１３０ ＣＯＶＩＤ－１９血漿である。
プラスミド構築
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（ＢＥＩ ＮＲ－５２４２２）構築物は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって、Ｎ末端ミューホスファターゼシグナルペプチド及びＣ末端オクタ－ヒスチジンタグ（ＧＨＨＨＨＨＨＨＨ）を有するｐｃＤＮＡ３．１－に合成された（配列番号１６４）。構築物の境界は、Ｎ－３２８ＲＦＰＮ３３１及び５２８ＫＫＳＴ５３１－Ｃである（Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ－２Ｐ外部ドメイン三量体（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿００９７２４３９０．１、ＢＥＩ ＮＲ－５２４２０）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって、Ｎ末端ミューホスファターゼシグナルペプチド及びＣ末端ＴＥＶ切断部位（ＧＳＧＲＥＮＬＹＦＱＧ）を有するｐＣＭＶ（配列番号１６５）、Ｔ４フィブリチンフォールドン（ＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ）（配列番号１６６）、及びオクタ－ヒスチジンタグ（ＧＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１６４）に合成された（Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。構築物は２Ｐ変異（残基９８６及び９８７でのプロリン置換；（Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７））及びフリン切断部位での６８２ＳＧＡＧ６８５置換を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤは、８、１２、又は１６個のグリシン及びセリン残基のリンカーを使用して、三量体Ｉ５３－５０Ａナノ粒子構成要素のＮ末端に遺伝的に融合された。ＲＢＤ－８ＧＳ－及びＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ融合物を合成し、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔによってｐＣＭＶにクローニングした。ＲＢＤ－１６ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａ融合体は、Ｘｂａ１及びＡｖｒＩＩ制限部位及びＧｉｂｓｏｎ集合体を使用してｐＣＭＶ／Ｒにクローニングした（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。全てのＲＢＤ担持構成要素には、Ｎ末端ミューホスファターゼシグナルペプチド及びＣ末端オクタ－ヒスチジンタグが含まれていた。マカック又はヒトＡＣＥ２外部ドメインは、Ｃ末端でトロンビン切断部位及びヒトＦｃフラグメントをコードする配列に遺伝的に融合された。ｈＡＣＥ２－Ｆｃは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってＢＭ４０シグナルペプチドとともに合成及びクローニングされた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクション用のプラスミドを得るために、細菌培養物からのその後のＤＮＡ抽出のために（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ（商標）キット）、プラスミドをＥ．コリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＮＥＢ５－α株に形質転換した。この研究で使用された全ての新規タンパク質のアミノ酸配列は、表３に記載されている。
一過性トランスフェクション
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ及びＡＣＥ２－Ｆｃタンパク質は、３３℃、湿度７０％、８％ＣＯ２、１５０ｒｐｍで回転するＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、懸濁液中で増殖させたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で生成した。ＰＥＩ－ＭＡＸ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して培養物をトランスフェクトし、細胞を１ｍＬ当たり３００万細胞の密度まで増殖させ、３日間培養した。遠心分離（４０００ｒｃｆで５分間）、０．０３７５％の最終濃度までＰＤＡＤＭＡＣ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、＃４０９０１４）を添加し、２回目のスピン（４０００ｒｃｆで５分間）によって上清を清澄化した。
ＣＲ３０２２重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文し、ｐＣＭＶ／Ｒにクローニングした。ＰＥＩ ＭＡＸ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）トランスフェクション試薬を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における重鎖及び軽鎖プラスミドの両方の一過性コトランスフェクションによって、抗体を発現させた。上記のように、細胞上清を回収し、３日又は６日後に清澄化した。
タンパク質精製
Ｈｉｓタグを含むタンパク質は、各清澄化された上清に１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を最終濃度４５ｍＭのまで、及び５ＭのＮａＣｌを最終濃度約３１０ｍＭのまで補充するバッチ結合法により、清澄化された上清から精製した。Ｔａｌｏｎコバルトアフィニティ樹脂（Ｔａｋａｒａ）を処理した上清に加え、穏やかに振盪しながら１５分間インキュベートした。０．２μｍフィルターを使用した真空濾過を使用して樹脂を収集し、重力カラムに移した。樹脂を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、タンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾールの３カラム容量で溶出した。次に、バッチ結合プロセスを繰り返し、１回目及び２回目の溶出を合わせた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して純度を評価した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質ＩＭＡＣ溶出液を＞１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのアルギニン、４．５％グリセロール、及び０．７５％ｗ／ｖの３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）への透析を、水和１０Ｋ分子量カットオフ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回行った。Ｓ－２Ｐ ＩＭＡＣ溶出画分を約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、水和１０Ｋ分子量カットオフ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％Ｌ－ヒスチジンに３回透析した。固有の不安定性のため、Ｓ－２Ｐ三量体は直ちに瞬間凍結し、－８０℃で保存した。
モノクローナル抗体及びヒト又はマカックＡＣＥ２－Ｆｃを発現する細胞の清澄化した上清を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ１５０ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）でＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（商標）２．６ｘ５ｃｍカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して精製した。結合した抗体を５カラム容量の２０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、次いで５カラム容量の２０ｍＭのＮａＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、３カラム容量の１００ｍＭのグリシンにより、ｐＨ３．０で溶出した。溶出液を２Ｍのトリズマ塩基で中和して、最終濃度５０ｍＭのとした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して純度を評価した。
組換えＳ３０９は、上記のように、重鎖及び軽鎖を発現するプラスミドで一過性にコトランスフェクトされたｅｘｐｉＣＨＯ細胞でＦａｂとして発現された（一過性トランスフェクションを参照）（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨｉＴｒａｐ（商標）タンパク質Ａ Ｍａｂ ｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（商標）カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用してタンパク質をアフィニティ精製し、続いてＨｉＴｒａｐ（商標）Ｆａｓｔ脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して２０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して脱塩した。タンパク質は０．２２μｍフィルターで滅菌し、使用するまで４℃で保存した。
細菌によるタンパク質の発現及び精製
Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．４．ＰＴ１タンパク質は、２Ｌバッフル付き振盪フラスコ又は１０Ｌ ＢｉｏＦｌｏ３２０Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で増殖したＬＢ（１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ）のＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）で発現した。細胞を３７℃でＯＤ６００約０．８まで増殖させ、次いで１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。発現温度を１８℃に下げ、細胞を約１６時間振とうした。細胞を採取し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．７５％ＣＨＡＰＳ中、１８，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｐを使用したマイクロ流体化によって溶解した。ライセートを２４，０００ｇで３０分間の遠心分離によって清澄化し、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ１５０ ＦＰＬＣシステム（Ｃｙｔｉｖａ）でのＩＭＡＣによる精製のために、２．６ｘ１０ｃｍのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。目的のタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％ＣＨＡＰＳ緩衝液のバックグラウンドで、３０ｍＭのから５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配で溶出した。ピーク画分をプールし、１０ＫのＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、滅菌濾過（０．２２μｍ）し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％のＣＨＡＰＳ緩衝液を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００又はＨｉＬｏａｄ（商標）Ｓ２００ｐｇ ＧＬ ＳＥＣカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。Ｉ５３－５０Ａは約０．６カラム容量（ＣＶ）溶出する。Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１は、約０．４５ＣＶで溶出する。サイジング後、ナノ粒子集合体に使用する前に、細菌由来の構成要素を試験して、エンドトキシンのレベルが低いことを確認した。
インビトロナノ粒子集合体
精製された個々のナノ粒子構成要素の総タンパク質濃度は、ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ８４５４）を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定し、吸光係数を計算することによって決定した（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。集合体工程は、次の順序で追加して室温で実行した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体融合タンパク質、その後、必要に応じて目的の最終濃度を達成するために追加の緩衝液、及び最後にＩ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体構成要素（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８中、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％のｗ／ｖのＣＨＡＰＳ）、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ：Ｉ５３－Ｂ．４ＰＴ１のモル比１．１：１。部分原子価ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子（５０％ＲＢＤ－Ｉ５３－５０）を生成するために、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ及び非修飾Ｉ５３－５０Ａ三量体の両方（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８中、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ）をわずかにモル過剰（１．１ｘ）でＩ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１に添加した。全てのＲＢＤ－Ｉ５３－５０インビトロ集合体は、残りの集合体とされていない成分を除去するために、その後のＳＥＣによる精製の前に、少なくとも３０分間穏やかに揺り動かしながら２～８℃でインキュベートした。目的に応じて様々なカラムを使用した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラムはナノ粒子サイズの推定に分析的に使用し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラムは小規模なパイロット集合体に使用し、ＨｉＬｏａｄ（商標）２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ｐｇカラムは、ナノ粒子の生成に使用した。集合した粒子は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６カラム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラムの空隙容量で約１１ｍＬで溶出する。組み立てられたナノ粒子は、カラム適用の直前及び分画のプール後に無菌濾過（０．２２μｍ）された。
ｈＡＣＥ２－Ｆｃ及びＣＲ３０２２消化
ｈＡＣＥ２－Ｆｃを、２．５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、トロンビン：タンパク質比１：３００ｗ／ｗでトロンビンプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。反応物を穏やかに揺り動かしながら周囲温度で１６～１８時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（商標）１０Ｋ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）を使用して反応混合物を濃縮し、滅菌濾過した（０．２２μＭ）。切断されたｈＡＣＥ２モノマーは、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ２５ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用したＨｉＳｃｒｅｅｎ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラム（Ｃｙｔｉｖａ）でのタンパク質Ａ精製（上記のタンパク質精製を参照）を使用して、切断されていないｈＡＣＥ２－Ｆｃ及び切断されたＦｃ領域から分離した。切断されたｈＡＣＥ２モノマーをフロースルーで収集し、滅菌濾過（０．２２μｍ）し、ＵＶ／ｖｉｓによって定量化した。
ＬｙｓＣ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を１０ｍＭのＴｒｉ ｐＨ８で１０ｎｇ／μＬに希釈し、ＣＲ３０２２ＩｇＧに１：２０００ｗ／ｗのＬｙｓＣ：ＩｇＧで添加し、続いて２３０ｒｐｍで軌道振とうしながら３７℃で１８時間インキュベートした。Ｕｌｔｒａｃｅｌ（商標）１０Ｋ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）を使用して切断反応物を濃縮し、滅菌濾過した（０．２２μＭ）。切断されたＣＲ３０２２ｍＡｂは、切断されていないＣＲ３０２２ＩｇＧ及び切断されたＩｇＧのＦｃ部分から、上記のようにプロテインＡ精製を使用して分離した。切断されたＣＲ３０２２をフロースルーで収集し、無菌濾過（０．２２μｍ）し、ＵＶ／ｖｉｓで定量化した。
バイオレイヤー干渉法（抗原性）
Ｏｃｔｅｔ（商標）Ｒｅｄ ９６Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でＢＬＩを使用して周囲温度で１０００ｒｐｍで振盪しながら抗原性アッセイを実施及び分析した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体構成要素及びモノマーＲＢＤをＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液（１ｘＨＥＰＥＳ－ＥＰ＋（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）、０．０５％脱脂乳、０．０２％アジ化ナトリウム）で４０μｇ／ｍＬに希釈した。モノマーｈＡＣＥ２及びＣＲ３０２２ＦａｂをＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で７５０ｎＭに希釈し、最終濃度３．１ｎＭになるように３倍に段階希釈した。試薬は、以下に説明するように、ブラック９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレートに１ウェル当たり２００μＬで適用した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素又はモノマーＲＢＤは、次のセンサーインキュベーション時間を使用することを除いて、製造元の指示（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）に従ってＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサーに固定化された。ＨＩＳ１Ｋバイオセンサーを水中で１０分間水和させた後、次いでＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で６０秒間平衡化させた。ＨＩＳ１Ｋチップに、希釈した三量体ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ構成要素又はモノマーＲＢＤを１５０秒間ロードし、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で３００秒間洗浄した。会合ステップは、免疫原が固定化されたＨＩＳ１Ｋバイオセンサーを、希釈したｈＡＣＥ２モノマー又はＣＲ３０２２Ｆａｂに６００秒間浸すことによって実行され、その後、バイオセンサーをＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液に６００秒間挿入することによって解離を測定した。Ｐａｌｌ（商標）ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ分析ソフトウェア（バージョン１２．０）を使用して、データからベースラインを差し引き、プロットを適合させた。図８のプロットは、会合及び解離の工程を示している。
バイオレイヤー干渉法（アクセシビリティ）
ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体、及びＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子へのｍＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２ＩｇＧ、及びＳ３０９ＩｇＧの結合を、Ｏｃｔｅｔ（商標）Ｒｅｄ９６システム（Ｐａｌｌ（商標）ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、周囲温度で１０００ｒｐｍで振盪して、アクセシビリティ実験及びリアルタイム安定性研究について分析した。タンパク質サンプルを、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で１００ｎＭに希釈した。次に、緩衝液、免疫原、及び分析物をブラック９６ウェルＧｒｅｉｎｅ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレートにウェル当たり２００μＬで適用した。プロテインＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）は、最初にＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で１０分間水和し、次に固定化ステップでＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈したｍＡＣＥ２－Ｆｃ、ＣＲ３０２２、又はＳ３０９ＩｇＧのいずれかに浸した。５００秒後、チップをＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液に６０秒間移してベースラインに到達させた。会合ステップは、ロードされたバイオセンサーを免疫原に３００秒間浸漬することによって実行され、その後の解離は、バイオセンサーをＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液に更に３００秒間浸漬することによって実行した。データは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェア（バージョン１２．０）を使用してプロットする前にベースラインを差し引いたものである。図２のプロットは、６００秒間の会合及び解離を示している。
ネガティブ染色電子顕微鏡
ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子は、最初に５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのアルギニン、４．５％ｖ／ｖグリセロール、０．７５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳで７５μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓ－２Ｐタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％Ｌ－ヒスチジンで０．０３ｍｇ／ｍＬに希釈し、３μＬのサンプルをグロー放電したばかりの３００メッシュ銅グリッドに適用した。サンプルをグリッド上で１分間インキュベートした後、グリッドを５０μＬの水滴に浸し、余分な液体をろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）で吸い取った。次に、グリッドを６μＬの０．７５％ｗ／ｖギ酸ウラニル染色液に浸した。染色液をろ紙で吸い取り、次いでグリッドを別の６μＬの染色液に浸し、約７０秒間インキュベートした。最後に、染色液を吸い取り、グリッドを１分間乾燥させた。調製されたグリッドは、ＴａｌｏｓモデルＬ１２０Ｃ電子顕微鏡で４５，０００倍（ナノ粒子）又は９２，０００倍（Ｓ－２Ｐ）で画像化した。
動的光散乱
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ＵＮｃｌｅ Ｎａｎｏ－ＤＳＦ（ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子サンプルの流体力学的直径（Ｄｈ）及び％多分散性（％Ｐｄ）を測定した。サンプルを８．８μＬの石英キャピラリーカセット（ＵＮｉ、ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に適用し、レーザーの自動減衰を使用して、それぞれ５秒の１０回の取得で測定した。ＲＢＤナノ粒子緩衝液中の４．５％ｖ／ｖグリセロールによる粘度の増加は、Ｄｈ測定においてＵＮｃｌｅ（商標）Ｃｌｉｅｎｔソフトウェアによって説明された。
グアニジンＨＣｌ変性
モノマーＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質、及びＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのアルギニン、４．５％ｖ／ｖグリセロール、０．７５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳで２．５μＭに希釈し、０Ｍ～６．５Ｍの範囲の塩化グアニジン［ＧｄｎＨＣｌ］（０．２５Ｍずつ増加）を３連で調製した。Ｓ－２Ｐ三量体も、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％Ｌ－ヒスチジン、及び同じＧｕＨＣｌ濃度範囲を使用して２．５μＭに希釈した。ピペッティングにより希釈物を１０倍混合した。次に、サンプルを周囲温度で１８～１９時間インキュベートした。Ｎａｎｏ－ＤＳＦ（ＵＮｃｌｅ（商標）、ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び８．８μＬ石英キャピラリーカセット（ＵＮｉ（商標）、ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、蛍光スペクトルを３連で収集し、２６６ｎｍで励起し、２５℃で２００ｎｍ～７５０ｎｍの発光を測定した。
エンドトキシン測定
ＥｎｄｏＳａｆｅ（商標）Ｎｅｘｇｅｎ－ＭＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して、タンパク質サンプル中のエンドトキシンレベルを測定した。サンプルは、エンドトキシンを含まないＬＡＬ試薬水で１：５０又は１：１００に希釈し、ＥｎｄｏＳａｆｅ（商標）ＬＡＬ試薬カートリッジのウェルに適用した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥｎｄｏＳｃａｎ（商標）－Ｖソフトウェアを使用して、エンドトキシン含有量を分析し、希釈倍率を自動的に逆算した。エンドトキシン値はＥＵ／ｍＬとして報告され、次いでＵＶ／ｖｉｓ測定に基づいてＥＵ／ｍｇに変換された。免疫化に適したサンプルのしきい値は、＜５０ＥＵ／ｍｇであった。
ＵＶ／ｖｉｓ
紫外可視分光光度法（ＵＶ／ｖｉｓ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｒｙ（商標）８４５４を使用して測定した。サンプルを１０ｍｍ、５０μＬの石英セル（Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）に適用し、吸光度を１８０～１０００ｎｍで測定した。測定及び単一参照波長のベースライン減算から得られた２８０ｎｍでの正味の吸光度を、計算された吸光係数及び分子量と共に使用して、タンパク質濃度を取得した。３２０／２８０ｎｍでの吸光度の比率を使用して、リアルタイム安定性研究サンプルの相対的な凝集レベルを決定した。サンプルをそれぞれの精製／機器ブランキング緩衝液で希釈して、０．１～１．０の吸光度を得た。ＵＶ／ｖｉｓ装置から生成された全てのデータは、８４５ｘＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅシステムソフトウェアで処理した。
グリカンプロファイリング
グリコフォームの分布及び占有率の決定等、部位特異的なグリコシル化プロファイルを特定するために、ボトムアップ質量分析（ＭＳ）アプローチを利用した。１ｍｇ／ｍＬのモノマー、８ＧＳ、１２ＧＳ、及び１６ＧＳのＲＢＤタンパク質の一定分量を調製して、４つのＲＢＤバリアントのＮ３３１及びＮ３４３でのグリコシル化プロファイルを評価した。１．５ｍｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ－２Ｐタンパク質を使用して、安定化されたスパイク外部ドメイン（Ｓ－２Ｐ）の包括的な糖プロファイリングを並行して実行した。全てのサンプルは、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、７Ｍの塩化グアニジニウム（ＧｄｎＨＣｌ）、及び５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液で、９０℃で３０分間分解した。新鮮なヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を１００ｍＭまで添加し、暗所で室温で１時間インキュベートすることにより、還元システインをアルキル化した。次いで、５０ｍＭの過剰のＤＴＴを添加して、残りのＩＡＡをクエンチした。サンプルを１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２ｍＭの塩化カルシウム溶液で１１倍に希釈することにより、ＧｎｄＨＣｌ濃度を０．６Ｍまで低下させた。次に、各サンプルを半分に分割した。半分（２７５μＬ）を１０単位の組換えペプチドＮ－グリカナーゼＦ（ＧＳＴ－ＰＮＧａｓｅ Ｆ）と混合し（Ｋｒｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、３７℃で１時間インキュベートして、グリコシル化されたＡｓｎを脱グリコシル化されたＡｓｐに変換する。
プロテアーゼ消化は次のように行った。全てのＲＢＤサンプル及び１つのＳ－２Ｐサンプルを、ＲＢＤは１：４０（ｗ／ｗ）、Ｓ－２Ｐは１：３０（ｗ／ｗ）の比率で３７℃で４時間消化し、続いて同じ比率と条件で一晩Ｇｌｕ－Ｃ消化する。他の３つのＳ－２Ｐサンプルは、トリプシン、キモトリプシン、及びα溶解性プロテアーゼをそれぞれ１：３０（ｗ／ｗ）の比率で使用して、３７℃で一晩消化した。使用した全ての消化プロテアーゼはＭＳグレード（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。翌日、消化反応を０．０２％ギ酸（ＦＡ、Ｏｐｔｉｍａ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ）でクエンチした。
４つのＳ－２Ｐサンプルのグリコフォーム測定は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したナノＬＣ－ＭＳによって実行した。消化解されたサンプルは、製造業者の推奨プロトコルに従って、Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩した。２ｃｍトラップ カラム及び３５ｃｍ分析カラムは、５μＭＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ（商標）Ｃ１８ＡＱビーズ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）を含むフューズドシリカ（内径１００μｍ）で新たに調製した。８μＬのサンプルを注入し、０．１％ＦＡ中の２％から３０％までのアセトニトリルの６０分間の直線勾配で分析し、続いて８０％アセトニトリルで１０分間分析した。ＥＴｈｃＤ法は次のように最適化された。イオン源：ポジティブモードで２．１ｋＶ、イオントランスファーチューブ温度：３５０℃、解像度：ＭＳ１＝１２００００、ＭＳ２＝３００００、ＡＧＣターゲット：ＭＳ１＝２ｅ５、ＭＳ２＝１ｅ５、及び注入時間：ＭＳ１＝５０ミリ秒、ＭＳ２＝６０ｍｓ。
糖ペプチドデータは、６ｐｐｍの前駆体及び１０ｐｐｍのフラグメント質量許容値を使用して、Ｂｙｏｎｉｃ（商標）及びＢｙｏｌｏｇｉｃ（商標）（バージョン３．８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）によって視覚化及び処理した。糖ペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ ＰＭＩ－ＳｕｉｔｅのＮ－グリカン３０９哺乳動物データベースを使用して検索し、正しいｃ－及びｚ－フラグメントイオンの割当てに基づいてスコアを付けた。真陽性の実体は、２０４（ＨｅｘＮＡｃイオン）及び３６６（ＨｅｘＮＡｃＨｅｘイオン）でのグリカンオキソニウムイオンｍ／ｚの存在、及び脱グリコシル化サンプル中の対応するスペクトルの不在によって更に検証した。各グリコフォームの相対存在量は、Ｂｙｏｌｏｇｉｃ（商標）で分析されたピーク面積によって決定した。グリコフォームは、以前の研究で説明されているように、オリゴ（オリゴマンノース）、ハイブリッド、複合体、及び複合体のサブタイプに分類された（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＨｅｘＮＡｃ（２）Ｈｅｘ（９－５）はＭ（ａｎｎｏｓｅ）９～Ｍ５であり、ＨｅｘＮＡｃ（３）Ｈｅｘ（５－６）はハイブリッドに分類され、ＨｅｘＮＡｃ（３）Ｈｅｘ（３－４）ＸはＡ１サブタイプであり、ＨｅｘＮＡｃ（４）ＸはＡ２／Ａ１Ｂであり、ＨｅｘＮＡｃ（５）ＸはＡ３／Ａ２Ｂであり、ＨｅｘＮＡｃ（６）ＸはＡ４／Ａ３Ｂサブタイプである。フコシル化を伴うハイブリッド及び複合体は、それぞれＦＨｙｂｒｉｄ及びＦＣｏｍｐｌｅｘ（例えば、ＦＡ１）として個別に記載されている。
４つのＲＢＤバリアントのグリカン占有分析及びグリコフォーム決定は、Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）に結合されたＳｙｎａｐｔＧ２－Ｓｉ（商標）ＴＯＦ質量分析計でＬＣ－ＭＳによって実施した。サンプルは、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １ｘ１００ｍｍ １．７μｍカラムで、３％から４０％Ｂまでの直線勾配で３０分かけて分離した（Ａ：９８％水、２％アセトニトリル、０．１％ＦＡ；Ｂ：１００％アセトニトリル、０．１％ＦＡ）。データ依存取得（ＤＤＡ）メソッドを、前駆体質量範囲３００～２０００、ＭＳ／ＭＳ質量範囲５０～２０００、７０～１００Ｖの勾配の衝突エネルギーで利用した。ＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）によって、最も多く、非重複アイソトープピークを決定し、統合した。特に明記しない限り、使用した全ての水及び有機溶媒はＭＳグレード（Ｏｐｔｉｍａ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ）であった。脱グリコシル化（Ａｓｐ）グリコペプチドに対する非グリコシル化（Ａｓｎ）のピーク面積比を使用して、各部位でのグリカン占有率を測定した。
水素／重水素交換質量分析
３μｇのモノマーＲＢＤ及びＲＢＤ－８ＧＳ－Ｉ５３－５０Ａを重水素化緩衝液（ｐＨ＊７．６、８５％Ｄ２Ｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で３、６０、１８００、及び７２０００秒間、それぞれ２３℃でインキュベートし、Ｈ／Ｄ交換ＨＤＸした。続いて、サンプルを氷冷クエンチ緩衝液（２００ｍＭのリン酸トリス（２－クロロエチル）ホスファート（ＴＣＥＰ）、８Ｍ尿素、０．２％ギ酸）と１：１で最終ｐＨ２．５に混合し、直ちに液体窒素で瞬間凍結した。前述のように、サンプルをインラインペプシン消化し、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ（商標）ＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）でＬＣ－ＭＳ－ＩＭＳによって分析した（Ｖｅｒｋｅｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）１８分間のグラジエントを適用した。完全な重水素化コントロールは、重水素化されていないサンプルＬＣ－ＭＳランからペプシン消化物溶出液を収集し、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、重水素化緩衝液で８５℃で１時間インキュベートし、他の全てのＨＤＸサンプルと同じようにクエンチすることによって作製した。内部交換標準（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ［ＰＰＰＩ］及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ［ＰＰＰＦ］）を各サンプルに追加して、全てのサンプルで一貫した標識条件を確保した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。非重水素化サンプルのペプシン消化物も、糖プロファイリングについて上記の設定でＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してナノＬＣ－ＭＳによって分析した。次に、データをＢｙｏｎｉｃ（商標）で処理して、ペプチド参照リストを取得した。ペプチドは、ＤｒｉｆｔＳｃｏｐｅ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して手動で検証し、直交保持時間（ｒｔ）及びドリフト時間（ｄｔ）座標で識別した。重水素取込み分析は、ＨＸ－Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２で実行した（Ｇｕｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３； Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。二項フィッティングを適用して、ペプチドスペクトルからピークを同定した。重水素取込みレベルは、完全に重水素化された基準に対して正規化した。
マウスの免疫化及びチャレンジ
メスのＢＡＬＢ／ｃ（在庫：０００６５１）マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから４週齢で購入し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）の認定を受けている、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡで維持された。６週齢で、投与群当たり１０匹のマウスにプライムを接種し、３週間後にマウスに２回目のワクチン接種を追加接種した。接種前に、免疫原懸濁液をＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と１：１ｖｏｌ／ｖｏｌで穏やかに混合して、最終濃度０．００９又は０．０５ｍｇ／ｍＬの抗原に到達させた。イソフルラン麻酔下で、免疫原の注射部位ごとに５０μＬ（合計１００μＬ）の２７ゲージ針（ＢＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、マウスを各後肢の腓腹筋に筋肉内注射した。血清を得るために、プライム及びブーストの２週間後に全てのマウスから採血した。おとがい下静脈穿刺によって血液を採取し、１．５ｍＬプラスチック製エッペンドルフチューブに室温で３０分間静置して凝固させた。２０００ｇで１０分間遠心分離することにより、血清をヘマトクリットから分離した。分離された血清中の補体因子及び病原体は、血清を５６℃で６０分間インキュベートすることにより熱不活性化された。血清は使用するまで４℃又は－８０℃で保存した。ブーストの６週間後、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡのＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ ＨｉｌｌにあるＡＡＡＬＡＣ ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ３（ＡＢＳＬ３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにマウスを輸出した。７日間の順応時間の後、マウスをケタミン／キシラジンの混合物で麻酔し、ワクチンの有効性を評価するために、マウスに適応したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＭＡ株の１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で鼻腔内にチャレンジした（ＩＡＣＵＣプロトコル２０－１１４．０）。感染後、肺及び鼻甲介組織を採取してプラークアッセイによりウイルス負荷を評価する感染後２日目の研究が終了するまで、体重を毎日モニタリングした。全ての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，ＮＣで、承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルに従って実施した。
免疫化（Ｋｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウス）
Ｋｙｍａｂ Ｄａｒｗｉｎ（商標）マウス（オス及びメスの混合、１０週齢）、投与群当たり５匹のマウスにプライムを接種し、３週間後に２回目のワクチン接種を行った。接種前に、免疫原懸濁液を１：１ｖｏｌ／ｖｏｌでＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と穏やかに混合して、最終濃度０．００９又は０．０５ｍｇ／ｍＬの抗原に到達させた。イソフルラン麻酔下で、免疫原の注射部位当たり２０μＬ（合計４０μＬ）の３０ゲージ針（ＢＤ）を使用して、マウスを各後肢の脛骨筋に筋肉内注射した。最終ブーストは、７週目にアジュバントなしで静脈内投与（５０ｕＬ）した。英国内務省のスケジュール１（ＣＯ２濃度の上昇）に従って５日後にマウスを屠殺し、脾臓、リンパ節、及び骨髄を凍結保存した。各投与（０、２、５、及び８週目の最終採血）の２週間後に全血（０．１ｍｌ）を採取した。２０００ｇで１０分間遠心分離することにより、血清をヘマトクリットから分離した。血清を－２０℃で保存し、ＥＬＩＳＡによる力価のモニタリングに使用した。全てのマウスは維持され、全ての手順は、英国内務省ライセンス７０／８７１８の下で、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ及びＥｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｙの承認を得て実施された。
ＥＬＩＳＡ
抗Ｓ－２Ｐ ＥＬＩＳＡのために、２５μＬの２μｇ／ｍＬのＳ－２Ｐを、ＰＢＳ中の３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）プレートにプレーティングし、４℃で一晩密封した。翌日、プレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してプレートをＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で４回洗浄し、ＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、マウス、ＮＨＰ、又はヒト血清の１：５段階希釈を２５μＬのＴＢＳＴで１：２５又は１：５０から開始し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は抗ヒト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗体を１：５，０００に希釈し、２５μＬを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、２５μＬのＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ）を各ウェルに室温で５分間添加した。２５μＬの１ＮのＨＣｌを添加して反応をクエンチした。プレートを直ちにＶａｒｉｏＳｋａｎＬｕｘ（商標）プレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で４５０ｎｍで読み取り、データをプロットし、非線形回帰シグモイド、４ＰＬを使用して（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ）に適合させ、曲線適合からＥＣ５０値を決定するために、Ｘはｌｏｇ（濃度）である。
偽型ウイルスの生成
ＭＬＶベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ、及びＷＩＶ－１シュードタイプは、前述のように調製した（Ｍｉｌｌｅｔ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，２０１６； Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。簡単に説明すると、製造元の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｓをコードするプラスミド、ＭＬＶ Ｇａｇ－Ｐｏｌパッケージング構築物、及びルシフェラーゼレポーターをコードするＭＬＶトランスファーベクターと共に使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭで３回洗浄し、トランスフェクション培地で３７℃で５時間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを６０時間添加した。上清を２，５００ｇスピンで回収し、０．４５μｍフィルターで濾過し、１００ｋＤａ膜で２，５００ｇで１０分間濃縮した後、一定分量にし、－８０℃に入れた。
偽型ウイルス侵入及び血清中和アッセイ
ＨＥＫ－ｈＡＣＥ２細胞を、３７℃のインキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）内で、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐで８％ＣＯ２と共にＤＭＥＭ中で培養した。感染の１日前に、４０μＬのポリリジン（Ｓｉｇｍａ）を９６ウェルプレートに入れ、回転させながら５分間インキュベートした。ポリリジンを除去し、プレートを５分間乾燥させ、次いで細胞をプレーティングする前にＤＭＥＭで１回洗浄した。翌日、細胞が８０％コンフルエントであることを確認した。半分の領域の９６ウェルプレートで、血清の１：３段階希釈をＤＭＥＭで行い、２２μＬの最終体積で１：３～１：６６の初期希釈を開始した。次いで、２２μＬの偽型ウイルスを連続希釈物に添加し、室温で３０～６０分間インキュベートした。ＨＥＫ－ｈＡＣＥ２プレート培地を除去し、４０μＬの血清／ウイルス混合物を細胞に添加し、８％ＣＯ２で３７℃において２時間インキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの２０％ＦＢＳ及び２％ＰｅｎＳｔｒｅｐ含有ＤＭＥＭを細胞に４８時間添加した。４８時間の感染後、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ－ＥＸ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を培養体積の半分で細胞に添加し（４０μＬ添加）、暗所で５分間インキュベートした後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で読み取った。測定は、各群からの１０個のマウス血清サンプル全てに対して、少なくとも２連で行った。相対ルシフェラーゼ単位をプロットし、細胞のみのゼロ値及び１：２ウイルスのみの１００％値を使用して、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ）で正規化した。対数（阻害剤）対正規化応答の非線形回帰を使用して、曲線適合からＩＣ５０値を決定した。マン・ホイットニー検定を使用して２つのグループを比較して、統計的に異なるかどうかを決定した。
生ウイルスの生成
ＯＲＦ７をナノルシフェラーゼ遺伝子（ｎａｎｏＬｕｃ）に置換したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｎａｎｏＬｕｃウイルス（ＷＡ１株）、マウス適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ）（Ｄｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を、以前に説明されたコロナウイルス逆遺伝学システムによって生成した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。組換えウイルスを、１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｆｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩ（ＧＥ＃ＳＨ３００６６０３ＨＩ）、１％非必須アミノ酸、及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ＃１１９９５０６５）で増殖したＥ６細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ１５８６）において、３７℃＋５％ＣＯ２インキュベーター内で生成した。組換え型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を生成するために、５´Ｔ７プロモーター及び３´ポリＡテールが隣接するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長ゲノムをまとめてコードする７つのＤＮＡフラグメントを連結し、インビトロで転写した。転写されたＲＮＡをＶｅｒｏ Ｅ６細胞にエレクトロポレーションして、Ｐ０ウイルスストックを生成した。シードウイルスをＶｅｒｏ Ｅ６細胞で低ｍｏｉで４８時間２回増幅して、プラークアッセイで力価を測定した作業ストックを作成した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。連結及びエレクトロポレーションの工程を含む全ての生ウイルス実験は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ－３）条件下で、負圧で、個人用電動空気清浄呼吸器を着用したＴｙｖｅｋスーツのオペレータによって行われた。
ルシフェラーゼベースの血清中和アッセイ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｎａｎｏＬｕｃ
アッセイの２４時間前に、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を２ｘ１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｎａｎｏＬｕｃウイルス１００ｐｆｕ（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を、１：１の比率で血清と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。各サンプルについて、１：２０（標準）又は１：２０００（高中和剤）の開始濃度で、８ポイントの３倍希釈曲線を作成した。ウイルス及び血清の混合物を各ウェルに加え、３７℃＋５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｍ３照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して製造業者のプロトコルに従って、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）によって測定した。パーセント阻害及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、次の式によって計算した。［１－（サンプルを含むＲＬＵ／モック処理を含むＲＬＵ）］ｘ１００％。５０パーセント阻害力価（ＩＣ５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）８．３．０において、シグモイド用量応答（可変勾配）曲線を使用してデータポイントを適合することによって計算した。
四量体の生成
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ三量体を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してビオチン化し、前述のようにストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で四量体化した（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６； Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳのＲＢＤドメインをビオチン化し、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で四量体化した。ＡＰＣデコイ試薬は、ＤｙＬｉｇｈｔ７５５抗体標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＳＡ－ＡＰＣをＤｙｌｉｇｈｔ（商標）７５５にコンジュゲートし、結合していないＤｙＬｉｇｈｔ７５５を洗浄し、除去し、無関係なビオチン化されたＨｉｓタグ付きタンパク質を過剰に加えてインキュベートすることによって生成した。ＰＥデコイは、ＡＦ６４７抗体標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＳＡ－ＰＥをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７に結合させることにより、同じ方法で生成した。
マウス免疫化、細胞濃縮、及びフローサイトメトリー
Ｂ細胞の表現型を調べるために、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（投与群ごとに３匹）に、０日目にＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントと１：１ｖｏｌ／ｖｏｌで混合した、５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（Ｓ－２Ｐ三量体又はＲＢＤ、ただしＩ５３－５０ナノ粒子からの質量は含まない）を含有する、注射部位当たり５０μＬのワクチン製剤で、筋肉内に免疫化した。全ての実験用マウスは、１１日目に鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を採取するために安楽死させた。実験は２回繰り返した。膝窩リンパ節及び鼠径リンパ節を回収し、個々のマウス用にプールした。細胞懸濁液は、リンパ節をすりつぶし、１００μＭのＮｉｔｅｘ（商標）メッシュで濾過することによって調製した。細胞を、２％ＦＢＳ及びＦｃブロック（２．４Ｇ２）を含むＰＢＳに再懸濁し、室温で２０分間、１０ｎＭデコイ四量体とインキュベートした。ＲＢＤ－ＰＥ四量体及びＳｐｉｋｅ－ＡＰＣ四量体を１０ｎＭの濃度で添加し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＰＥ及び抗ＡＰＣ磁気ビーズと共に氷上で３０分間インキュベートし、次いで磁化ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通した。結合したＢ細胞を、抗マウスＢ２２０（ＢＵＶ７３７）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ１３８（ＢＶ６５０）、ＣＤ３８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７００）、ＧＬ７（ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０）、ＩｇＭ（ＢＶ７８６）、ＩｇＤ（ＢＵＶ３９５）、ＣＤ７３（ＰＥ－Ｃｙ７）、及びＣＤ８０（ＢＶ６０５）を氷上で２０分間染色した。Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ（商標）で細胞を実行し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。細胞数は、Ａｃｃｕｃｈｅｃｋ（商標）細胞計数ビーズを使用して決定した。
ＮＨＰ免疫化
ブタオザルは、０日目及び２８日目に２５０μｇのＲＢＤ－１２ＧＳ－Ｉ５３－５０ナノ粒子（８８μｇのＲＢＤ抗原）で免疫化した。プライム後０、１０、１４、２８、４２、及び５６日目に血液を採取した。血清及び血漿は、前述のように採取した（Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ワクチン接種又は採血の前に、ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ（登録商標）；Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ）の筋肉内注射（１０ｍｇ／ｋｇ）で動物を鎮静させた。接種前に、免疫原懸濁液をＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と１：１ｖｏｌ／ｖｏｌで穏やかに混合して、最終濃度は０．２５０ｍｇ／ｍＬの抗原に到達させた。ワクチンは、０日目及び２８日目に注射部位当たり１ｍＬで両方の四頭筋に筋肉内送達した。全ての注射部位は、注射前に剃毛され、局所反応原性の兆候について注射後にモニタリングした。前述のように、各研究時点で、完全な身体検査及び一般的な健康状態の評価を動物に対して行い（Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、有害事象は観察されなかった。
競合バイオレイヤー干渉法
ＮＨＰ血清からのＦａｂの精製は、Ｂｏｙｏｇｌｕ－Ｂａｒｎｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０から採用した。簡単に説明すると、５６日目の血清１ｍＬをＰＢＳで１０ｍＬに希釈し、１ｍＬの３ｘＰＢＳ洗浄プロテインＡビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）と共に３７℃で一晩攪拌しながらインキュベートした。翌日、重力流カラムを使用してビーズをＰＢＳで十分に洗浄し、結合した抗体を０．１ＭグリシンｐＨ３．５で１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に最終濃度１００ｍＭまで溶出した。通過した血清及び初期の洗浄液は、一晩かけて再びビーズに再結合し、溶出を繰り返した。ＩｇＧを濃縮し（アミコン３０ｋＤａ）、緩衝液をＰＢＳに交換した。２ｘ消化緩衝液（４０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５、２０ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのシステイン）を、濃縮してプールしたＩｇＧに添加した。１ｘ消化緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのシステイン、ｐＨ６．５）で新たに洗浄した再懸濁固定化パパイン樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５００μＬを、２ｘ消化緩衝液中の精製ＩｇＧに加え、サンプルを３７℃で５時間撹拌した。上清を樹脂から分離し、樹脂洗浄液を集め、樹脂フロースルーと共にプールした。プールした上清を０．２２μｍで滅菌濾過し、重力流カラム中のＰＢＳ洗浄プロテインＡビーズに６回適用した。カラムを上記のように溶出し、パパイン手順を未消化のＩｇＧで一晩繰り返して収量を増加させた。プロテインＡフロースルーをプールし、濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ １０ ｋＤａ）、緩衝液をＰＢＳに交換した。純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
Ｏｃｔｅｔ（商標）Ｒｅｄ ９６Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ（商標）Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でＢＬＩを使用して、３０℃で１０００ｒｐｍで振盪しながらエピトープ競合を実行及び分析した。ＮＴＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ（商標）Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を水中で少なくとも１０分間水和し、１０ｘＫｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液（ＫＢ）（Ｐａｌｌ（商標）Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で６０秒間平衡化した。１０ｘＫＢ中の１０ｎｇ／μＬモノマーＲＢＤを１００秒間ロードした後、１０ｘＫＢで３００秒間ベースラインを取得した。次にチップを、１０ｘＫＢで希釈したポリクローナルＦａｂに、５０００ｎＭで開始して１：３の段階希釈で２０００秒間浸漬するか、１０ｘＫＢで維持した。チップは、ポリクローナルＦａｂ濃度に応じて様々なレベルで結合した。次いで、チップを同じ濃度のポリクローナルＦａｂ＋２００ｎＭのｈＡＣＥ２、４００ｎＭのＣＲ３０２２、又は２０ｎＭのＳ３０９のいずれかに浸し、３００～２０００秒間インキュベートした。Ｐａｌｌ（商標）Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ解析ソフトウェア（バージョン１２．０）を使用して、データをベースライン減算し、ポリクローナルＦａｂを事前にロードしてアライメントし、ＰＲＩＳＭ（商標）でプロットした。

Claims (59)

  1. 配列番号１～８４、１３８～１４６、及び１６７～１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、式中、Ｘ１は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択であり、存在し得るか、又は任意選択の残基の一部若しくは全てが存在しなくてもよい、ポリペプチド。
  2. 配列番号１～１２及び１４２～１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号１～８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプ
    チド
  5. 配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 配列番号１及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. 配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の複数のポリペプチドを含むナノ粒子。
  10. （ａ） 複数の第１の集合体であって、各第１の集合体は複数の同一の第１のタンパク質を含む、複数の第１の集合体と、
    （ｂ） 複数の第２の集合体であって、各第２の集合体は複数の第２のタンパク質を含む、複数の第２の集合体と、を含むナノ粒子であって、
    前記第１のタンパク質の前記アミノ酸配列は、前記第２のタンパク質の前記配列とは異なり、
    前記複数の第１の集合体は、前記複数の第２の集合体と非共有結合的に相互作用して、前記ナノ粒子を形成し、
    前記ナノ粒子は、その表面上に、前記少なくとも１つの第２のタンパク質に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分を提示する、ナノ粒子。
  11. 前記第２のタンパク質が、配列番号８５～１２４又は１８５～１９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの第２のタンパク質のＸ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原又はそのバリアント若しくはホモログの免疫原性部分を含み、Ｘ２は存在しないか、又はアミノ酸リンカーであり、括弧内の残基は任意選択である、請求項１０に記載のナノ粒子。
  12. 前記第２のタンパク質が、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
  13. 前記第２のタンパク質が、配列番号８５～８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
  14. 前記第２のタンパク質が、配列番号８５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
  15. 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の、スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメイン（ＥＣＤ）アミノ酸配列、Ｓ１サブユニットアミノ酸配列、Ｓ２サブユニットアミノ酸配列、Ｓ１受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）アミノ酸配列、及び／又はＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）アミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくはホモログを含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  16. 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、配列番号１２５～１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  17. 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  18. （ａ） 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、Ｋ９０Ｎ、Ｋ９０Ｔ、Ｇ１１９Ｓ、Ｙ１２６Ｆ、Ｔ１５１Ｉ、Ｅ１５７Ｋ、Ｅ１５７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｎ１７４Ｙ、及びＬ１２５Ｒからなる群から選択される配列番号１２５に対して、１、２、３、４、５、６、７、又は８つの位置全てにおいて変異を含み、以下の自然に発生する変異又は変異の組合わせ、
    Ｎ１７４Ｙ（ＵＫバリアント）；
    Ｋ９０Ｎ／Ｅ１５７Ｋ／Ｎ１７４Ｙ（南アフリカバリアント）；
    Ｋ９０Ｎ又はＴ／Ｅ１５７Ｋ／Ｎ１７４Ｙ（ブラジルバリアント）；又は
    Ｌ１２５Ｒ（ＬＡバリアント）、のうちの１つを含む変異を含むが、これらに限定されず、
    （ｂ） 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％におけるＸ１が、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、残基６９～７０の欠失、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｔ４７８Ｉ、Ｅ４８４Ｋ、Ｓ４９４Ｐ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｌからなる群から選択される配列番号１３０に対して、１、２、３、４、５、６、７、又は８つの位置全てにおいて変異を含み、以下の天然に存在する変異又は変異の組合わせ、
    場合により、１、２、３、４、又は５個の、残基６９～７０の１つ又は両方の欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、及び／又はＴ７１６Ｌを更に含むＮ５０１Ｙ（ＵＫバリアント）；
    Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｄ６１４Ｇ、及び／又はＡ７０１Ｖの１、２、３、４、又は５個を任意に更に含むＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（南アフリカバリアント）；
    Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ６１４Ｇ、及び／又はＨ６５５Ｙの１、２、３、４、又は５個を任意に更に含む、Ｋ４１７Ｎ又はＴ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（ブラジル変異体）；又は
    Ｌ４５２Ｒ（ＬＡバリアント）のうちの１つを含む変異を含むが、これらに限定されない、請求項１７に記載のナノ粒子。
  19. 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、Ｋ９０Ｎ、Ｋ９０Ｔ、Ｅ１５７Ｋ、及びＮ１７４Ｙからなる群から選択される、配列番号１２５に対する、１、２、３、又は４つ全ての変異を含む、請求項１７に記載のナノ粒子。
  20. 前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  21. 前記第２のタンパク質の１００％におけるＸ１が配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、全ての第２のタンパク質が同一である、請求項１１～２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  22. 前記複数の第２の集合体が合計で２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む、請求項１０～２１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  23. 前記複数の第２の集合体が、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含む合計で２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超えるポリペプチドを含む、請求項１０～２２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  24. 全ての第２の集合体が、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含む、請求項１０～２３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  25. 全ての第２のタンパク質が、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１０～２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  26. 前記第１のタンパク質が、配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基は任意であり、存在してもよく、又は前記任意の残基の一部又は全部が存在しなくてもよい、請求項１０～２５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  27. 前記第１のタンパク質が、配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０～２６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  28. 前記第１のタンパク質が配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、請求項１０～２７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  29. 前記少なくとも１つの第２の集合体が、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含む、請求項２８に記載のナノ粒子。
  30. 全ての第２の集合体が、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの第２のタンパク質を含む、請求項２８に記載のナノ粒子。
  31. 全ての第２のタンパク質が、配列番号８５～８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のナノ粒子。
  32. 各第１の集合体が五量体であり、各第２の集合体が三量体である、請求項１０～３１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  33. （ａ） 前記第１のタンパク質が、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ） 全ての第２のタンパク質が、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、前記第２のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、配列番号１２５のアミノ酸配列に対して、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１０～３２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  34. （ａ） 前記第１のタンパク質が、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ） 全ての第２のタンパク質が、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、前記第２のタンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＸ１が、配列番号１２５のアミノ酸配列に対して、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１０～３３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  35. （ａ） 前記第１のタンパク質が、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ） 全ての第２のタンパク質が、配列番号１～８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０～３４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  36. （ａ） 前記第１のタンパク質が、配列番号１５５のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ） 全ての第２のタンパク質が、配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む、請求項１０～３５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  37. 請求項１０～３６のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む組成物であって、好ましくは請求項３３～３６のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む、組成物。
  38. 請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子であって、好ましくは配列番号１～１２のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
  39. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含む、請求項４２に記載の核酸分子。
  40. 適切な制御配列に作動可能に連結された請求項３８又は３９に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  41. 請求項１～４０のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、及び／又は発現ベクターを含む、細胞。
  42. 医薬組成物であって、
    （ａ） 請求項１～４１のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、発現ベクター、及び／又は細胞と、
    （ｂ） 薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  43. 請求項３３～３６のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
  44. アジュバントを更に含む、請求項１～４３のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
  45. 請求項１～４４のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、及び／又は組成物を含む、ワクチン。
  46. 請求項３３～３６のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む、請求項４５に記載のワクチン。
  47. 請求項１～４６のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンを、感染症の治療又は発症を制限するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療又は発症を制限する方法。
  48. 請求項３３～３６のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子、請求項４３に記載の医薬組成物、又は請求項４６に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しておらず、前記投与が、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発症を制限する、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘発する、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. 前記投与が、第１の用量及び第２の用量を投与することを含み、前記第２の用量が、前記第１の用量が投与される約２週間～約１２週間、又は約４週間～約１２週間投与される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記投与が、
    （ａ） ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンのプライム用量を前記対象に投与することであって、前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンは、配列番号１２５～１３７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、前記対象に投与することと、
    （ｂ） 請求項１～５０のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンのブースト用量を前記対象に投与することと、を含む請求項５０に記載の方法。
  52. 前記投与が、
    （ａ） 請求項１～５１のいずれかに記載の、ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、核酸、医薬組成物、又はワクチンのプライム用量を前記対象に投与することと、
    （ｂ） ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンのブースト用量を前記対象に投与することであって、前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はアデノウイルスベクターワクチンは、配列番号１２５～１３７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、前記対象に投与することと、を含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記免疫応答が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の生成を含む、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記免疫応答が、少なくとも１ｘ１０５の平均幾何力価を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体特異的応答の生成を含む、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むがこれに限定されない重症急性呼吸器（ＳＡＲＳ）ウイルスに感染しており、前記投与が、前記対象のＳＡＲＳウイルス感染を治療する、前記対象のＳＡＲＳウイルスに対する免疫応答を誘発する、請求項４７～４８又は５３～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. キットであって、
    （ａ） 好ましくは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドと、
    （ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質であって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、好ましくは、前記第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質と、を含むキット。
  57. キットであって、
    （ａ） 好ましくは配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸と、
    （ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸であって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、好ましくは、前記第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質をコードする核酸と、を含むキット。
  58. キットであって、
    （ａ） 適切な制御配列に作動可能に連結された請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであって、好ましくは前記ポリペプチドが配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む、発現ベクターと、
    （ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターであって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、前記核酸は、適切な制御配列の作動可能に連結されており、好ましくは、前記第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、発現ベクターと、を含むキット。
  59. キットであって、
    （ａ） 適切な制御配列に作動可能に連結された請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞であって、好ましくは前記ポリペプチドが配列番号１又は５のアミノ酸配列を含む、発現ベクターを含む細胞と、
    （ｂ） 配列番号１５２～１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞であって、括弧内の残基は任意であり、存在してもしなくてもよく、前記核酸は、適切な制御配列に作動可能に連結されており、好ましくは、前記第１のタンパク質は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、発現ベクターを含む細胞と、を含むキット。
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