JP2023521418A - コロナウイルスsタンパク質に特異的な化合物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、コロナウイルス(CoV)のSタンパク質(例えば、SARSコロナウイルスのSタンパク質(SARS-CoV-S)及び/またはSARSコロナウイルス2のSタンパク質(SARS-CoV-2-S))に対する結合特異性を有する抗体及びその抗原結合フラグメント(中和抗体、ならびにCoV-Sの同一の線状または立体構造エピトープ(複数可)に結合する及び/または結合が競合する抗体を含む)を対象とする。さらに、抗CoV-S抗体及びその結合フラグメントが1つ以上の機能的または検出可能な部分と結合体化している結合体が開示される。また、当該抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントを作製する方法も企図されている。本開示の他の実施形態は、コロナウイルスまたはそのSタンパク質に関連する疾患及び障害、ならびにコロナウイルスまたはそのSタンパク質の中和または阻害が治療上及び/または予防上有益と考えられる状態の診断、評価、及び治療のための、抗CoV-S抗体及びその結合フラグメントの使用を含む。【選択図】図1A
Description
関連出願
本出願は、2020年4月10日に出願された米国仮出願第63/008,545号、2020年5月7日に出願された米国仮出願第63/021,589号、2020年6月30日に出願された米国仮出願第63/046,313号、2020年11月10日に出願された米国仮出願第63/112,122号、2021年1月19日に出願された米国仮出願第63/138,886号、2021年1月29日に出願された米国仮出願第63/143,456号、2021年2月9日に出願された米国仮出願第63/147,495号、2021年2月12日に出願された米国仮出願第63/148,754号、2021年2月17日に出願された米国仮出願第63/150,413号、2021年2月22日に出願された米国仮出願第63/152,054号、及び2021年3月19日に出願された米国仮出願第63/163,400号の優先権の利益を主張する。これらの出願の各々の内容全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、2020年4月10日に出願された米国仮出願第63/008,545号、2020年5月7日に出願された米国仮出願第63/021,589号、2020年6月30日に出願された米国仮出願第63/046,313号、2020年11月10日に出願された米国仮出願第63/112,122号、2021年1月19日に出願された米国仮出願第63/138,886号、2021年1月29日に出願された米国仮出願第63/143,456号、2021年2月9日に出願された米国仮出願第63/147,495号、2021年2月12日に出願された米国仮出願第63/148,754号、2021年2月17日に出願された米国仮出願第63/150,413号、2021年2月22日に出願された米国仮出願第63/152,054号、及び2021年3月19日に出願された米国仮出願第63/163,400号の優先権の利益を主張する。これらの出願の各々の内容全体が参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表の全体が参照により本明細書に援用される。前述のASCIIコピーは2021年4月6日に作成され、名称は132280-00120_SL.txt、サイズは2,710,434バイトである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表の全体が参照により本明細書に援用される。前述のASCIIコピーは2021年4月6日に作成され、名称は132280-00120_SL.txt、サイズは2,710,434バイトである。
本開示は、概して、コロナウイルス(「CoV-S」)のSタンパク質に特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント、好ましくはヒト抗体及びその抗原結合フラグメント、及び/または親和性成熟バリアント、このような抗体を発現するように操作された組換え細胞、ならびにこのような抗体及びその抗原結合フラグメントを含む組成物、ならびに当該抗体、抗原結合フラグメント、及びその組成物の治療使用及び診断使用に関するものである。
コロナウイルス(「CoV」)は、遺伝子的には4つの主要な属:アルファコロナウイルス属(ACoV属)、ベータコロナウイルス属(BCoV属)、ガンマコロナウイルス属(CCoV属)、及びデルタコロナウイルス属(DCoV属)に分類され、ACoV及びBCoVは主に哺乳類に感染し、CCoV及びDCoVは主に鳥類に感染する(Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328)。ヒトに感染するコロナウイルスは1960年代半ばに初めて特定され、現在は7つのCoV種がヒト病原体として知られている。4つのCoV種、すなわちBCoV属のHCoV-HKU1及びHCoV-OC43ならびにACoV属のHCoV-229E及びHCoV-NL63がヒトの固有種であり、ほとんどの場合は小児患者において、軽度の呼吸器症状を引き起こす(Brielle E.S.,et al.,BioRxiv reprint,doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.10.986398)。他の3つのヒトCoV種、すなわちSARS-CoV、MERS-CoV、及びSARS-CoV-2(別名「2019-nCoV」)は、いずれもBCoV属のものであり、2002~2003年の重症急性呼吸器症候群(SARS)アウトブレイク、2012~2013年の中東呼吸器症候群(MERS)、及び現在の(2019年~)パンデミックである2019年のコロナウイルス疾患(「COVID-19」)を含めて、深刻なアウトブレイクを引き起こしている。
コロナウイルスのゲノムは、およそ26,000~32,000塩基の範囲のサイズであり、可変数(6~11)のオープンリーディングフレーム(「ORF」)を含む(Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328)。最初のORFは16の非構造タンパク質(「nsps」)をコードし、残りのORFはアクセサリータンパク質及び構造タンパク質をコードする。4つの主要な構造タンパク質は、スパイク表面糖タンパク質(「Sタンパク質」または「S」または「スパイクタンパク質」)、小型エンベロープタンパク質(「Eタンパク質」または「E」)、マトリックスタンパク質(「Mタンパク質」または「M」)、及びヌクレオカプシドタンパク質(「Nタンパク質」、または「N」)である。
宿主細胞上の受容体と結合する上で不可欠な役割を果たし、宿主トロピズムを決定するSタンパク質(Zhu Z.et al.,Infect Genet Evol.2018 Jul;61:183-184)は、ウイルス表面から突出したホモ三量体を形成する(Li F.Annu Rev Virol.2016 Sep 29;3(1):237-261)。Sタンパク質は処理されて、共有結合していない2つのサブユニットのS1及びS2となり、三量体S集合体内の各単量体は、S1サブユニット及びS2サブユニットのヘテロ二量体である。クライオEMでの研究により、S1サブユニットがN末端ドメイン(NTD)、C末端ドメイン(CTD)、及び2つのサブドメインという4つのドメインで構成されていることが明らかになった(Walls A.C.et al.,Nature 531,114-117(2016).;Tortorici M.A.and Veesler D.,Adv Virus Res.2019;105:93-116;Wrapp D.et al.,Science 367,1260-1263(2020))。CTDは、SARS-CoV及びSARS-CoV-2のいずれにおいても受容体結合ドメイン(RBD)として機能する(Li F.J Virol.2015 Feb;89(4):1954-64)。S2サブユニットには、融合ペプチド、七価のリピート1及び2、ならびに膜貫通ドメインが含まれ、これらの全てがウイルス及び宿主細胞膜の融合を媒介するのに必要とされる。
SARS-CoV及びSARS-CoV-2は、受容体としての宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合し、それを使用して宿主細胞に侵入する(Ge X.Y.et al.,Nature.2013 Nov 28;503(7477):535-8;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。特にRCE2に結合するRBD内のモチーフは、しばしば「ACE2結合モチーフ」と称される。SARS-CoVは、代替の受容体としてCD209L(別名L-SIGN)も使用することができる(Jeffers S.A.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Nov 2;101(44):15748-53)。これに対し、MERS-CoVは、Sタンパク質の異なるRBDを介して宿主細胞のジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4、別名CD26)に結合する。
また、コロナウイルスの細胞侵入は、宿主細胞のプロテアーゼによるSタンパク質のプライミングにもしばしば依存する。最近、SARS-CoV-2が、Sタンパク質のプライミングにセリンプロテアーゼTMPRSS2を使用し、侵入にACE2を使用することが分かった(Wu A.et al.2020 Mar 11;27(3):325-328;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。
SARS-CoV-2のゲノムは約29.8kbのヌクレオチドであり、15のnsps、4つの構造タンパク質(S、E、M、N)、及び8つのアクセサリータンパク質(3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b、及びorf14)をコードする(Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328)。SARS-CoV-2は、遺伝子的にはSARS様コウモリCoVに近く、またSARS-CoVにも近いものの、多くの配列の違いが確認されている。SARS-CoV-2をSARS-CoVまたはSARS様コウモリCoVと比較すると、380のアミノ酸の違いまたは置換が見出され、このうち27はSタンパク質内にあり、アミノ酸領域357~528のRBD(ただしACE2と直接相互作用する受容体結合モチーフ内ではない)内の6つの置換、及びアミノ酸領域569~655の支持サブドメイン(SD)内の6つの置換が含まれる。
COVID-19の治療で使用するために米国食品医薬品局(「FDA」)に承認されている数少ない薬物の1つは、ウイルス複製阻害剤のレムデシビルである。臨床試験では、レムデシビルが入院患者が回復するまでの時間を短縮することが実証されたが、より有効な治療法が非常に必要とされている。回復期血漿がFDAによる緊急使用許可ステータスを受けた。COVID-19患者に行う他の治療としては、副腎皮質ホルモンなどの抗炎症剤、ならびに酸素補給及び機械的換気支援などの症状を管理するための他の治療が挙げられる。いくつかの薬物、特に、他の感染症の防止または治療用に承認済みの薬物が現在臨床で試験されており、このような薬物には、例えば、ロピナビル・リトナビル(HIVプロテアーゼ阻害剤)、ABX464(ウイルスRNAスプライサー)、ファビラビル(インフルエンザウイルス感染に使用されるRNA依存性RNAポリメラーゼ阻害剤)、ニクロサミド及びイベルメクチン(駆虫剤)、ならびにBCGワクチン(結核用ワクチン)が含まれる。また、報告によれば、他の進行中の臨床試験では、IL-6受容体アンタゴニスト抗体、抗GM-CSFもしくは抗GM-CSF受容体抗体、抗TNF抗体、抗IL-1ベータ抗体、または抗補体成分5抗体が、炎症を阻害することでサイトカインストーム及び敗血症(一部のSARS-CoV-2感染患者で発現することがあり、死を引き起こす恐れがある)を潜在的に阻害しようとする試みにおいて使用されている。
COVID-19の治療で使用するために米国食品医薬品局(「FDA」)に承認されている数少ない薬物の1つは、ウイルス複製阻害剤のレムデシビルである。臨床試験では、レムデシビルが入院患者が回復するまでの時間を短縮することが実証されたが、より有効な治療法が非常に必要とされている。回復期血漿がFDAによる緊急使用許可ステータスを受けた。COVID-19患者に行う他の治療としては、副腎皮質ホルモンなどの抗炎症剤、ならびに酸素補給及び機械的換気支援などの症状を管理するための他の治療が挙げられる。いくつかの薬物、特に、他の感染症の防止または治療用に承認済みの薬物が現在臨床で試験されており、このような薬物には、例えば、ロピナビル・リトナビル(HIVプロテアーゼ阻害剤)、ABX464(ウイルスRNAスプライサー)、ファビラビル(インフルエンザウイルス感染に使用されるRNA依存性RNAポリメラーゼ阻害剤)、ニクロサミド及びイベルメクチン(駆虫剤)、ならびにBCGワクチン(結核用ワクチン)が含まれる。また、報告によれば、他の進行中の臨床試験では、IL-6受容体アンタゴニスト抗体、抗GM-CSFもしくは抗GM-CSF受容体抗体、抗TNF抗体、抗IL-1ベータ抗体、または抗補体成分5抗体が、炎症を阻害することでサイトカインストーム及び敗血症(一部のSARS-CoV-2感染患者で発現することがあり、死を引き起こす恐れがある)を潜在的に阻害しようとする試みにおいて使用されている。
Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328
Brielle E.S.,et al.,BioRxiv reprint,doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.10.986398
Zhu Z.et al.,Infect Genet Evol.2018 Jul;61:183-184
Li F.Annu Rev Virol.2016 Sep 29;3(1):237-261
Walls A.C.et al.,Nature 531,114-117(2016)
Tortorici M.A.and Veesler D.,Adv Virus Res.2019;105:93-116
Wrapp D.et al.,Science 367,1260-1263(2020)
Li F.J Virol.2015 Feb;89(4):1954-64
Ge X.Y.et al.,Nature.2013 Nov 28;503(7477):535-8
Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4
Jeffers S.A.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Nov 2;101(44):15748-53
1つの態様において、本開示は、コロナウイルス(CoV)またはCoVのスパイクタンパク質(Sタンパク質)(「CoV-S」)に結合する化合物に関する。いくつかの実施形態において、化合物は、CoV-Sに結合する単離抗体または抗原結合抗体フラグメントとすることができる。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、重鎖可変領域(VH)もしくはそのフラグメント、及び/または軽鎖可変領域(VL)もしくはそのフラグメントを含むことができる。ある特定の実施形態において、VHまたはそのフラグメントは、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、及び相補性決定領域3(CDR3)(これらはそれぞれVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3と称されることもある)を含むことができる。ある特定の実施形態において、VLまたはそのフラグメントは、CDR1、CDR2、及びCDR3(これらはそれぞれVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3と称されることもある)を含むことができる。いくつかの実施形態において、抗体もしくはその抗原結合抗体フラグメントは、重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3を含むことができる。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55691、ADI-55692、ADI-55693、ADI-55694、ADI-55695、ADI-55696、ADI-55697、ADI-55698、ADI-55699、ADI-55700、ADI-55701、ADI-55702、ADI-55703、ADI-55704、ADI-55705、ADI-55706、ADI-55707、ADI-55708、ADI-55709、ADI-55710、ADI-55711、ADI-55712、ADI-55713、ADI-55714、ADI-55715、ADI-55716、ADI-55717、ADI-55718、ADI-55719、ADI-55721、ADI-55722、ADI-55723、ADI-55724、ADI-55725、ADI-55726、ADI-55727、ADI-55728、ADI-55729、ADI-55730、ADI-55731、ADI-55732、ADI-55733、ADI-55734、ADI-55735、ADI-55736、ADI-55737、ADI-55738、ADI-55739、ADI-55740、ADI-55741、ADI-55742、ADI-55743、ADI-55744、ADI-55745、ADI-55746、ADI-55747、ADI-55748、ADI-55749、ADI-55750、ADI-55751、ADI-55752、ADI-55753、ADI-55754、ADI-55755、ADI-55756、ADI-55757、ADI-55758、ADI-55720、ADI-55760、ADI-55761、ADI-55762、ADI-55763、ADI-55765、ADI-55766、ADI-55767、ADI-55769、ADI-55770、ADI-55771、ADI-55775、ADI-55776、ADI-55777、ADI-55950、ADI-55951、ADI-55952、ADI-55953、ADI-55954、ADI-55955、ADI-55956、ADI-55957、ADI-55958、ADI-55959、ADI-55960、ADI-55961、ADI-55962、ADI-55963、ADI-55964、ADI-55965、ADI-55966、ADI-55967、ADI-55968、ADI-55969、ADI-55970、ADI-55972、ADI-55973、ADI-55974、ADI-55975、ADI-55976、ADI-55977、ADI-55978、ADI-55979、ADI-55980、ADI-55981、ADI-55982、ADI-55984、ADI-55986、ADI-55988、ADI-55989、ADI-55990、ADI-55992、ADI-55993、ADI-55994、ADI-55995、ADI-55996、ADI-55997、ADI-55998、ADI-55999、ADI-56000、ADI-56001、ADI-56002、ADI-56003、ADI-56004、ADI-56005、ADI-56006、ADI-56007、ADI-56008、ADI-56009、ADI-56010、ADI-56011、ADI-56012、ADI-56013、ADI-56014、ADI-56015、ADI-56016、ADI-56017、ADI-56018、ADI-56019、ADI-56020、ADI-56021、ADI-56022、ADI-56023、ADI-56024、ADI-56025、ADI-56026、ADI-56027、ADI-56028、ADI-56029、ADI-56030、ADI-56031、ADI-56032、ADI-56033、ADI-56034、ADI-56035、ADI-56037、ADI-56038、ADI-56039、ADI-56040、ADI-56041、ADI-56042、ADI-56043、ADI-56044、ADI-56045、ADI-56046、ADI-56047、ADI-56048、ADI-56049、ADI-56050、ADI-56051、ADI-56052、ADI-56053、ADI-56054、ADI-56055、ADI-56056、ADI-56057、ADI-56058、ADI-56059、ADI-56061、ADI-56062、ADI-56063、ADI-56064、ADI-56065、ADI-56066、ADI-56067、ADI-56068、ADI-56069、ADI-56070、ADI-56071、ADI-56072、ADI-56073、ADI-56074、ADI-56075、ADI-56076、ADI-56078、ADI-56079、ADI-56080、ADI-56081、ADI-56082、ADI-56083、ADI-56084、ADI-56443、ADI-56479、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗体もしくはその抗原結合抗体フラグメント、または抗CoV-S抗体の親和性成熟バリアントもしくはその抗原結合抗体フラグメントを含むことができ、任意選択で、CoV-SはSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sである。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、もしくはADI-56046、またはこれらの抗原結合抗体フラグメント、あるいはADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、及びADI-56046からなる群より選択される抗CoV-S抗体の親和性成熟バリアントを含むことができる。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55689、ADI-55688、もしくはADI-56046、またはこれらの抗原結合抗体フラグメント、あるいは抗CoV-S抗体ADI-55689、ADI-55688、もしくはADI-56046の親和性成熟バリアント、またはこれらの抗原結合抗体フラグメントを含むことができる。
さらなる特定の実施形態において、親和性成熟バリアントは、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988とすることができる。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合抗体フラグメントは、VH及び/またはVLを含むことができる。ある特定の実施形態において、VHは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つのVH CDR3と同一のアミノ酸配列を有するCDR3を含むことができ、任意選択で、VL CDR3は、VH CDR3が由来する同じ抗CoV-S抗体のVL CDR3と同一のアミノ酸配列を有するCDR3を含むことができ、抗CoV-S抗体は、本明細書ならびに図1、2及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つから選択することができる。ここでは、CoV-Sは、重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス(「SARS-CoV」)のスパイクタンパク質(「Sタンパク質」)(これを「SARS-CoV-S」と称することがある)であっても、SARS-CoV-2(別名「n2019-nCoV」)のSタンパク質(これを「SARS-CoV-2-S」と称することがある)であってもよい。任意選択で、CoV-Sは、配列番号1(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)のアミノ酸配列に対し少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するか、それを含むか、もしくはそれからなる配列、または配列番号5(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)に対し少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するか、それを含むか、もしくはそれからなる配列を含むことができる。
いくつかの好ましい実施形態において、VHは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体のVH CDR3と同一のアミノ酸配列を有するCDR3を含む。任意選択で、VLは、VH CDR3が由来する同じ抗CoV-S抗体のCDR3と同一のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
さらに任意選択で、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(a)SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sと交差反応することができ、(b)ADI-55708、ADI-55709、またはADI-55719と同一のVH CDR3ポリペプチド配列(ARGSLSREYDFLTAPQNGPWFDS(配列番号2108、2208、または3208))を含むことができ、任意選択で(c)ADI-55708、ADI-55709、またはADI-55719VHと同じVH CDR1ポリペプチド配列をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する抗CoV-S抗体のいずれかの抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つの少なくとも1、2、3、4、5つ、または6つ全ての相補性決定領域(CDR)を含むことができ、任意選択で、CoV-SはSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sである。任意選択で、CoV-Sは、配列番号1(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)または配列番号5(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)のアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの好ましい実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の少なくとも1、2、3、4、5つ、または6つ全ての相補性決定領域(CDR)を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する抗CoV-S抗体のいずれかの単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、(a)VH CDR1ポリペプチド、(b)VH CDR2ポリペプチド、(c)VH CDR3ポリペプチド、(d)VL CDR1ポリペプチド、(e)VL CDR2ポリペプチド、及び(f)VL CDR3ポリペプチドを含むことができる。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つのそれぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一であり得る。任意選択で、CoV-Sは、SARS-CoV-Sであっても「SARS-CoV-2-S」のものであってもよい。さらに任意選択で、CoV-Sは、配列番号1(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)または配列番号5(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)のアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体のそれぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一であり得る。
さらなる特定の実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体のそれぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一であり得る。
さらに好ましい実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体のそれぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一であり得る。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示する抗CoV-S抗体のいずれかの単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、CoV-Sに特異的に結合し、(a)VH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含むVHと、(b)VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVLとを含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列と同一であり得る:
(1)それぞれ配列番号104、106、108、114、116、及び118、
(2)それぞれ配列番号204、206、208、214、216、及び218、
(3)それぞれ配列番号304、306、308、314、316、及び318、
(4)それぞれ配列番号404、406、408、414、416、及び418、
(5)それぞれ配列番号504、506、508、514、516、及び518、
(6)それぞれ配列番号604、606、608、614、616、及び618、
(7)それぞれ配列番号704、706、708、714、716、及び718、
(8)それぞれ配列番号804、806、808、814、816、及び818、
(9)それぞれ配列番号904、906、908、914、916、及び918、
(10)それぞれ配列番号1004、1006、1008、1014、1016、及び1018、
(11)それぞれ配列番号1104、1106、1108、1114、1116、及び1118、
(12)それぞれ配列番号1204、1206、1208、1214、1216、及び1218、
(13)それぞれ配列番号1304、1306、1308、1314、1316、及び1318、
(14)それぞれ配列番号1404、1406、1408、1414、1416、及び1418、
(15)それぞれ配列番号1504、1506、1508、1514、1516、及び1518、
(16)それぞれ配列番号1604、1606、1608、1614、1616、及び1618、
(17)それぞれ配列番号1704、1706、1708、1714、1716、及び1718、
(18)それぞれ配列番号1804、1806、1808、1814、1816、及び1818、
(19)それぞれ配列番号1904、1906、1908、1914、1916、及び1918、
(20)それぞれ配列番号2004、2006、2008、2014、2016、及び2018、
(21)それぞれ配列番号2104、2106、2108、2114、2116、及び2118、
(22)それぞれ配列番号2204、2206、2208、2214、2216、及び2218、
(23)それぞれ配列番号2304、2306、2308、2314、2316、及び2318、
(24)それぞれ配列番号2404、2406、2408、2414、2416、及び2418、
(25)それぞれ配列番号2504、2506、2508、2514、2516、及び2518、
(26)それぞれ配列番号2604、2606、2608、2614、2616、及び2618、
(27)それぞれ配列番号2704、2706、2708、2714、2716、及び2718、
(28)それぞれ配列番号2804、2806、2808、2814、2816、及び2818、
(29)それぞれ配列番号2904、2906、2908、2914、2916、及び2918、
(30)それぞれ配列番号3004、3006、3008、3014、3016、及び3018、
(31)それぞれ配列番号3104、3106、3108、3114、3116、及び3118、
(32)それぞれ配列番号3204、3206、3208、3214、3216、及び3218、
(33)それぞれ配列番号3304、3306、3308、3314、3316、及び3318、
(34)それぞれ配列番号3404、3406、3408、3414、3416、及び3418、
(35)それぞれ配列番号3504、3506、3508、3514、3516、及び3518、
(36)それぞれ配列番号3604、3606、3608、3614、3616、及び3618、
(37)それぞれ配列番号3704、3706、3708、3714、3716、及び3718、
(38)それぞれ配列番号3804、3806、3808、3814、3816、及び3818、
(39)それぞれ配列番号3904、3906、3908、3914、3916、及び3918、
(40)それぞれ配列番号4004、4006、4008、4014、4016、及び4018、
(41)それぞれ配列番号4104、4106、4108、4114、4116、及び4118、
(42)それぞれ配列番号4204、4206、4208、4214、4216、及び4218、
(43)それぞれ配列番号4304、4306、4308、4314、4316、及び4318、
(44)それぞれ配列番号4404、4406、4408、4414、4416、及び4418、
(45)それぞれ配列番号4504、4506、4508、4514、4516、及び4518、
(46)それぞれ配列番号4604、4606、4608、4614、4616、及び4618、
(47)それぞれ配列番号4704、4706、4708、4714、4716、及び4718、
(48)それぞれ配列番号4804、4806、4808、4814、4816、及び4818、
(49)それぞれ配列番号4904、4906、4908、4914、4916、及び4918、
(50)それぞれ配列番号5004、5006、5008、5014、5016、及び5018、
(51)それぞれ配列番号5104、5106、5108、5114、5116、及び5118、
(52)それぞれ配列番号5204、5206、5208、5214、5216、及び5218、
(53)それぞれ配列番号5304、5306、5308、5314、5316、及び5318、
(54)それぞれ配列番号5404、5406、5408、5414、5416、及び5418、
(55)それぞれ配列番号5504、5506、5508、5514、5516、及び5518、
(56)それぞれ配列番号5604、5606、5608、5614、5616、及び5618、
(57)それぞれ配列番号5704、5706、5708、5714、5716、及び5718、
(58)それぞれ配列番号5804、5806、5808、5814、5816、及び5818、
(59)それぞれ配列番号5904、5906、5908、5914、5916、及び5918、
(60)それぞれ配列番号6004、6006、6008、6014、6016、及び6018、
(61)それぞれ配列番号6124、6106、6108、6114、6161、及び6118、
(62)それぞれ配列番号6204、6206、6208、6214、6216、及び6218、
(63)それぞれ配列番号6304、6306、6308、6314、6316、及び6318、
(64)それぞれ配列番号6404、6406、6408、6414、6416、及び6418、
(65)それぞれ配列番号6504、6506、6508、6514、6516、及び6518、
(66)それぞれ配列番号6604、6606、6608、6614、6616、及び6618、
(67)それぞれ配列番号6704、6706、6708、6714、6716、及び6718、
(68)それぞれ配列番号6804、6806、6808、6814、6816、及び6818、
(69)それぞれ配列番号6904、6906、6908、6914、6916、及び6918、
(70)それぞれ配列番号7004、7006、7008、7014、7016、及び7018、
(71)それぞれ配列番号7104、7106、7108、7114、7116、及び7118、
(72)それぞれ配列番号7204、7206、7208、7214、7216、及び7218、
(73)それぞれ配列番号7304、7306、7308、7314、7316、及び7318、
(74)それぞれ配列番号7404、7406、7408、7414、7416、及び7418、
(75)それぞれ配列番号7504、7506、7508、7514、7516、及び7518、
(76)それぞれ配列番号7604、7606、7608、7614、7616、及び7618、
(77)それぞれ配列番号7704、7706、7708、7714、7716、及び7718、
(78)それぞれ配列番号7804、7806、7808、7814、7816、及び7818、
(79)それぞれ配列番号7904、7906、7908、7914、7916、及び7918、
(80)それぞれ配列番号8004、8006、8008、8014、8016、及び8018、
(81)それぞれ配列番号8104、8106、8108、8114、8116、及び8118、
(82)それぞれ配列番号8204、8206、8208、8214、8216、及び8218、
(83)それぞれ配列番号8304、8306、8308、8314、8316、及び8318、
(84)それぞれ配列番号8404、8406、8408、8414、8416、及び8418、
(85)それぞれ配列番号8504、8506、8508、8514、8516、及び8518、
(86)それぞれ配列番号8604、8606、8608、8614、8616、及び8618、
(87)それぞれ配列番号8704、8706、8708、8714、8716、及び8718、
(88)それぞれ配列番号8804、8806、8808、8814、8816、及び8818、
(89)それぞれ配列番号8904、8906、8908、8914、8916、及び8918、
(90)それぞれ配列番号9004、9006、9008、9014、9016、及び9018、
(101)それぞれ配列番号10104、10106、10108、10114、10116、及び10118、
(102)それぞれ配列番号10204、10206、10208、10214、10216、及び10218、
(103)それぞれ配列番号10304、10306、10308、10314、10316、及び10318、
(104)それぞれ配列番号10404、10406、10408、10414、10416、及び10418、
(105)それぞれ配列番号10504、10506、10508、10514、10516、及び10518、
(106)それぞれ配列番号10604、10606、10608、10614、10616、及び10618、
(107)それぞれ配列番号10704、10706、10708、10714、10716、及び10718、
(108)それぞれ配列番号10804、10806、10808、10814、10816、及び10818、
(109)それぞれ配列番号10904、10906、10908、10914、10916、及び10918、
(110)それぞれ配列番号11004、11006、11008、11014、11016、及び11018、
(111)それぞれ配列番号11104、11106、11108、11114、11116、及び11118、
(112)それぞれ配列番号11204、11206、11208、11214、11216、及び11218、
(113)それぞれ配列番号11304、11306、11308、11314、11316、及び11318、
(114)それぞれ配列番号11404、11406、11408、11414、11416、及び11418、
(115)それぞれ配列番号11504、11506、11508、11514、11516、及び11518、
(116)それぞれ配列番号11604、11606、11608、11614、11616、及び11618、
(117)それぞれ配列番号11704、11706、11708、11714、11716、及び11718、
(118)それぞれ配列番号11804、11806、11808、11814、11816、及び11818、
(119)それぞれ配列番号11904、11906、11908、11914、11916、及び11918、
(120)それぞれ配列番号12004、12006、12008、12014、12016、及び12018、
(121)それぞれ配列番号12104、12106、12108、12114、12116、及び12118、
(122)それぞれ配列番号12204、12206、12208、12214、12216、及び12218、
(123)それぞれ配列番号12304、12306、12308、12314、12316、及び12318、
(124)それぞれ配列番号12404、12406、12408、12414、12416、及び12418、
(125)それぞれ配列番号12504、12506、12508、12514、12516、及び12518、
(126)それぞれ配列番号12604、12606、12608、12614、12616、及び12618、
(127)それぞれ配列番号12704、12706、12708、12714、12716、及び12718、
(128)それぞれ配列番号12804、12806、12808、12814、12816、及び12818、
(129)それぞれ配列番号12904、12906、12908、12914、12916、及び12918、
(130)それぞれ配列番号13004、13006、13008、13014、13016、及び13018、
(131)それぞれ配列番号13104、13106、13108、13114、13116、及び13118、
(132)それぞれ配列番号13204、13206、13208、13214、13216、及び13218、
(133)それぞれ配列番号13304、13306、13308、13314、13316、及び13318、
(134)それぞれ配列番号13404、13406、13408、13414、13416、及び13418、
(135)それぞれ配列番号13504、13506、13508、13514、13516、及び13518、
(136)それぞれ配列番号13604、13606、13608、13614、13616、及び13618、
(137)それぞれ配列番号13704、13706、13708、13714、13716、及び13718、
(138)それぞれ配列番号13804、13806、13808、13814、13816、及び13818、
(139)それぞれ配列番号13904、13906、13908、13914、13916、及び13918、
(140)それぞれ配列番号14004、14006、14008、14014、14016、及び14018、
(141)それぞれ配列番号14104、14106、14108、14114、14116、及び14118、
(142)それぞれ配列番号14204、14206、14208、14214、14216、及び14218、
(143)それぞれ配列番号14304、14306、14308、14314、14316、及び14318、
(144)それぞれ配列番号14404、14406、14408、14414、14416、及び14418、
(145)それぞれ配列番号14504、14506、14508、14514、14516、及び14518、
(146)それぞれ配列番号14604、14606、14608、14614、14616、及び14618、
(147)それぞれ配列番号14704、14706、14708、14714、14716、及び14718、
(148)それぞれ配列番号14804、14806、14808、14814、14816、及び14818、
(149)それぞれ配列番号14904、14906、14908、14914、14916、及び14918、
(150)それぞれ配列番号15004、15006、15008、15014、15016、及び15018、
(151)それぞれ配列番号15104、15106、15108、15114、15116、及び15118、
(152)それぞれ配列番号15204、15206、15208、15214、15216、及び15218、
(153)それぞれ配列番号15304、15306、15308、15314、15316、及び15318、
(154)それぞれ配列番号15404、15406、15408、15414、15416、及び15418、
(155)それぞれ配列番号15504、15506、15508、15514、15516、及び15518、
(156)それぞれ配列番号15604、15606、15608、15614、15616、及び15618、
(157)それぞれ配列番号15704、15706、15708、15714、15716、及び15718、
(158)それぞれ配列番号15804、15806、15808、15814、15816、及び15818、
(159)それぞれ配列番号15904、15906、15908、15914、15916、及び15918、
(160)それぞれ配列番号16004、16006、16008、16014、16016、及び16018、
(161)それぞれ配列番号16104、16106、16108、16114、16116、及び16118、
(162)それぞれ配列番号16204、16206、16208、16214、16216、及び16218、
(163)それぞれ配列番号16304、16306、16308、16314、16316、及び16318、
(164)それぞれ配列番号16404、16406、16408、16414、16416、及び16418、
(165)それぞれ配列番号16504、16506、16508、16514、16516、及び16518、
(166)それぞれ配列番号16604、16606、16608、16614、16616、及び16618、
(167)それぞれ配列番号16704、16706、16708、16714、16716、及び16718、
(168)それぞれ配列番号16804、16806、16808、16814、16816、及び16818、
(169)それぞれ配列番号16904、16906、16908、16914、16916、及び16918、
(170)それぞれ配列番号17004、17006、17008、17014、17016、及び17018、
(171)それぞれ配列番号17104、17106、17108、17114、17116、及び17118、
(172)それぞれ配列番号17204、17206、17208、17214、17216、及び17218、
(173)それぞれ配列番号17304、17306、17308、17314、17316、及び17318、
(174)それぞれ配列番号17404、17406、17408、17414、17416、及び17418、
(175)それぞれ配列番号17504、17506、17508、17514、17516、及び17518、
(176)それぞれ配列番号17604、17606、17608、17614、17616、及び17618、
(177)それぞれ配列番号17704、17706、17708、17714、17716、及び17718、
(178)それぞれ配列番号17804、17806、17808、17814、17816、及び17818、
(179)それぞれ配列番号17904、17906、17908、17914、17916、及び17918、
(180)それぞれ配列番号18004、18006、18008、18014、18016、及び18018、
(181)それぞれ配列番号18104、18106、18108、18114、18116、及び18118、
(182)それぞれ配列番号18204、18206、18208、18214、18216、及び18218、
(183)それぞれ配列番号18304、18306、18308、18314、18316、及び18318、
(184)それぞれ配列番号18404、18406、18408、18414、18416、及び18418、
(185)それぞれ配列番号18504、18506、18508、18514、18516、及び18518、
(186)それぞれ配列番号18604、18606、18608、18614、18616、及び18618、
(187)それぞれ配列番号18704、18706、18708、18714、18716、及び18718、
(188)それぞれ配列番号18804、18806、18808、18814、18816、及び18818、
(189)それぞれ配列番号18904、18906、18908、18914、18916、及び18918、
(190)それぞれ配列番号19004、19006、19008、19014、19016、及び19018、
(191)それぞれ配列番号19104、19106、19108、19114、19116、及び19118、
(192)それぞれ配列番号19204、19206、19208、19214、19216、及び19218、
(193)それぞれ配列番号19304、19306、19308、19314、19316、及び19318、
(194)それぞれ配列番号19404、19406、19408、19414、19416、及び19418、
(195)それぞれ配列番号19504、19506、19508、19514、19516、及び19518、
(196)それぞれ配列番号19604、19606、19608、19614、19616、及び19618、
(197)それぞれ配列番号19704、19706、19708、19714、19716、及び19718、
(198)それぞれ配列番号19804、19806、19808、19814、19816、及び19818、
(199)それぞれ配列番号19904、19906、19908、19914、19916、及び19918、
(200)それぞれ配列番号20004、20006、20008、20014、20016、及び20018、
(201)それぞれ配列番号20104、20106、20108、20114、20116、及び20118、
(202)それぞれ配列番号20204、20206、20208、20214、20216、及び20218、
(203)それぞれ配列番号20304、20306、20308、20314、20316、及び20318、
(204)それぞれ配列番号20404、20406、20408、20414、20416、及び20418、
(205)それぞれ配列番号20504、20506、20508、20514、20516、及び20518、
(206)それぞれ配列番号20604、20606、20608、20614、20616、及び20618、
(207)それぞれ配列番号20704、20706、20708、20714、20716、及び20718、
(208)それぞれ配列番号20804、20806、20808、20814、20816、及び20818、
(209)それぞれ配列番号20904、20906、20908、20914、20916、及び20918、
(210)それぞれ配列番号21004、21006、21008、21014、21016、及び21018、
(211)それぞれ配列番号21104、21106、21108、21114、21116、及び21118、
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
(1)それぞれ配列番号104、106、108、114、116、及び118、
(2)それぞれ配列番号204、206、208、214、216、及び218、
(3)それぞれ配列番号304、306、308、314、316、及び318、
(4)それぞれ配列番号404、406、408、414、416、及び418、
(5)それぞれ配列番号504、506、508、514、516、及び518、
(6)それぞれ配列番号604、606、608、614、616、及び618、
(7)それぞれ配列番号704、706、708、714、716、及び718、
(8)それぞれ配列番号804、806、808、814、816、及び818、
(9)それぞれ配列番号904、906、908、914、916、及び918、
(10)それぞれ配列番号1004、1006、1008、1014、1016、及び1018、
(11)それぞれ配列番号1104、1106、1108、1114、1116、及び1118、
(12)それぞれ配列番号1204、1206、1208、1214、1216、及び1218、
(13)それぞれ配列番号1304、1306、1308、1314、1316、及び1318、
(14)それぞれ配列番号1404、1406、1408、1414、1416、及び1418、
(15)それぞれ配列番号1504、1506、1508、1514、1516、及び1518、
(16)それぞれ配列番号1604、1606、1608、1614、1616、及び1618、
(17)それぞれ配列番号1704、1706、1708、1714、1716、及び1718、
(18)それぞれ配列番号1804、1806、1808、1814、1816、及び1818、
(19)それぞれ配列番号1904、1906、1908、1914、1916、及び1918、
(20)それぞれ配列番号2004、2006、2008、2014、2016、及び2018、
(21)それぞれ配列番号2104、2106、2108、2114、2116、及び2118、
(22)それぞれ配列番号2204、2206、2208、2214、2216、及び2218、
(23)それぞれ配列番号2304、2306、2308、2314、2316、及び2318、
(24)それぞれ配列番号2404、2406、2408、2414、2416、及び2418、
(25)それぞれ配列番号2504、2506、2508、2514、2516、及び2518、
(26)それぞれ配列番号2604、2606、2608、2614、2616、及び2618、
(27)それぞれ配列番号2704、2706、2708、2714、2716、及び2718、
(28)それぞれ配列番号2804、2806、2808、2814、2816、及び2818、
(29)それぞれ配列番号2904、2906、2908、2914、2916、及び2918、
(30)それぞれ配列番号3004、3006、3008、3014、3016、及び3018、
(31)それぞれ配列番号3104、3106、3108、3114、3116、及び3118、
(32)それぞれ配列番号3204、3206、3208、3214、3216、及び3218、
(33)それぞれ配列番号3304、3306、3308、3314、3316、及び3318、
(34)それぞれ配列番号3404、3406、3408、3414、3416、及び3418、
(35)それぞれ配列番号3504、3506、3508、3514、3516、及び3518、
(36)それぞれ配列番号3604、3606、3608、3614、3616、及び3618、
(37)それぞれ配列番号3704、3706、3708、3714、3716、及び3718、
(38)それぞれ配列番号3804、3806、3808、3814、3816、及び3818、
(39)それぞれ配列番号3904、3906、3908、3914、3916、及び3918、
(40)それぞれ配列番号4004、4006、4008、4014、4016、及び4018、
(41)それぞれ配列番号4104、4106、4108、4114、4116、及び4118、
(42)それぞれ配列番号4204、4206、4208、4214、4216、及び4218、
(43)それぞれ配列番号4304、4306、4308、4314、4316、及び4318、
(44)それぞれ配列番号4404、4406、4408、4414、4416、及び4418、
(45)それぞれ配列番号4504、4506、4508、4514、4516、及び4518、
(46)それぞれ配列番号4604、4606、4608、4614、4616、及び4618、
(47)それぞれ配列番号4704、4706、4708、4714、4716、及び4718、
(48)それぞれ配列番号4804、4806、4808、4814、4816、及び4818、
(49)それぞれ配列番号4904、4906、4908、4914、4916、及び4918、
(50)それぞれ配列番号5004、5006、5008、5014、5016、及び5018、
(51)それぞれ配列番号5104、5106、5108、5114、5116、及び5118、
(52)それぞれ配列番号5204、5206、5208、5214、5216、及び5218、
(53)それぞれ配列番号5304、5306、5308、5314、5316、及び5318、
(54)それぞれ配列番号5404、5406、5408、5414、5416、及び5418、
(55)それぞれ配列番号5504、5506、5508、5514、5516、及び5518、
(56)それぞれ配列番号5604、5606、5608、5614、5616、及び5618、
(57)それぞれ配列番号5704、5706、5708、5714、5716、及び5718、
(58)それぞれ配列番号5804、5806、5808、5814、5816、及び5818、
(59)それぞれ配列番号5904、5906、5908、5914、5916、及び5918、
(60)それぞれ配列番号6004、6006、6008、6014、6016、及び6018、
(61)それぞれ配列番号6124、6106、6108、6114、6161、及び6118、
(62)それぞれ配列番号6204、6206、6208、6214、6216、及び6218、
(63)それぞれ配列番号6304、6306、6308、6314、6316、及び6318、
(64)それぞれ配列番号6404、6406、6408、6414、6416、及び6418、
(65)それぞれ配列番号6504、6506、6508、6514、6516、及び6518、
(66)それぞれ配列番号6604、6606、6608、6614、6616、及び6618、
(67)それぞれ配列番号6704、6706、6708、6714、6716、及び6718、
(68)それぞれ配列番号6804、6806、6808、6814、6816、及び6818、
(69)それぞれ配列番号6904、6906、6908、6914、6916、及び6918、
(70)それぞれ配列番号7004、7006、7008、7014、7016、及び7018、
(71)それぞれ配列番号7104、7106、7108、7114、7116、及び7118、
(72)それぞれ配列番号7204、7206、7208、7214、7216、及び7218、
(73)それぞれ配列番号7304、7306、7308、7314、7316、及び7318、
(74)それぞれ配列番号7404、7406、7408、7414、7416、及び7418、
(75)それぞれ配列番号7504、7506、7508、7514、7516、及び7518、
(76)それぞれ配列番号7604、7606、7608、7614、7616、及び7618、
(77)それぞれ配列番号7704、7706、7708、7714、7716、及び7718、
(78)それぞれ配列番号7804、7806、7808、7814、7816、及び7818、
(79)それぞれ配列番号7904、7906、7908、7914、7916、及び7918、
(80)それぞれ配列番号8004、8006、8008、8014、8016、及び8018、
(81)それぞれ配列番号8104、8106、8108、8114、8116、及び8118、
(82)それぞれ配列番号8204、8206、8208、8214、8216、及び8218、
(83)それぞれ配列番号8304、8306、8308、8314、8316、及び8318、
(84)それぞれ配列番号8404、8406、8408、8414、8416、及び8418、
(85)それぞれ配列番号8504、8506、8508、8514、8516、及び8518、
(86)それぞれ配列番号8604、8606、8608、8614、8616、及び8618、
(87)それぞれ配列番号8704、8706、8708、8714、8716、及び8718、
(88)それぞれ配列番号8804、8806、8808、8814、8816、及び8818、
(89)それぞれ配列番号8904、8906、8908、8914、8916、及び8918、
(90)それぞれ配列番号9004、9006、9008、9014、9016、及び9018、
(101)それぞれ配列番号10104、10106、10108、10114、10116、及び10118、
(102)それぞれ配列番号10204、10206、10208、10214、10216、及び10218、
(103)それぞれ配列番号10304、10306、10308、10314、10316、及び10318、
(104)それぞれ配列番号10404、10406、10408、10414、10416、及び10418、
(105)それぞれ配列番号10504、10506、10508、10514、10516、及び10518、
(106)それぞれ配列番号10604、10606、10608、10614、10616、及び10618、
(107)それぞれ配列番号10704、10706、10708、10714、10716、及び10718、
(108)それぞれ配列番号10804、10806、10808、10814、10816、及び10818、
(109)それぞれ配列番号10904、10906、10908、10914、10916、及び10918、
(110)それぞれ配列番号11004、11006、11008、11014、11016、及び11018、
(111)それぞれ配列番号11104、11106、11108、11114、11116、及び11118、
(112)それぞれ配列番号11204、11206、11208、11214、11216、及び11218、
(113)それぞれ配列番号11304、11306、11308、11314、11316、及び11318、
(114)それぞれ配列番号11404、11406、11408、11414、11416、及び11418、
(115)それぞれ配列番号11504、11506、11508、11514、11516、及び11518、
(116)それぞれ配列番号11604、11606、11608、11614、11616、及び11618、
(117)それぞれ配列番号11704、11706、11708、11714、11716、及び11718、
(118)それぞれ配列番号11804、11806、11808、11814、11816、及び11818、
(119)それぞれ配列番号11904、11906、11908、11914、11916、及び11918、
(120)それぞれ配列番号12004、12006、12008、12014、12016、及び12018、
(121)それぞれ配列番号12104、12106、12108、12114、12116、及び12118、
(122)それぞれ配列番号12204、12206、12208、12214、12216、及び12218、
(123)それぞれ配列番号12304、12306、12308、12314、12316、及び12318、
(124)それぞれ配列番号12404、12406、12408、12414、12416、及び12418、
(125)それぞれ配列番号12504、12506、12508、12514、12516、及び12518、
(126)それぞれ配列番号12604、12606、12608、12614、12616、及び12618、
(127)それぞれ配列番号12704、12706、12708、12714、12716、及び12718、
(128)それぞれ配列番号12804、12806、12808、12814、12816、及び12818、
(129)それぞれ配列番号12904、12906、12908、12914、12916、及び12918、
(130)それぞれ配列番号13004、13006、13008、13014、13016、及び13018、
(131)それぞれ配列番号13104、13106、13108、13114、13116、及び13118、
(132)それぞれ配列番号13204、13206、13208、13214、13216、及び13218、
(133)それぞれ配列番号13304、13306、13308、13314、13316、及び13318、
(134)それぞれ配列番号13404、13406、13408、13414、13416、及び13418、
(135)それぞれ配列番号13504、13506、13508、13514、13516、及び13518、
(136)それぞれ配列番号13604、13606、13608、13614、13616、及び13618、
(137)それぞれ配列番号13704、13706、13708、13714、13716、及び13718、
(138)それぞれ配列番号13804、13806、13808、13814、13816、及び13818、
(139)それぞれ配列番号13904、13906、13908、13914、13916、及び13918、
(140)それぞれ配列番号14004、14006、14008、14014、14016、及び14018、
(141)それぞれ配列番号14104、14106、14108、14114、14116、及び14118、
(142)それぞれ配列番号14204、14206、14208、14214、14216、及び14218、
(143)それぞれ配列番号14304、14306、14308、14314、14316、及び14318、
(144)それぞれ配列番号14404、14406、14408、14414、14416、及び14418、
(145)それぞれ配列番号14504、14506、14508、14514、14516、及び14518、
(146)それぞれ配列番号14604、14606、14608、14614、14616、及び14618、
(147)それぞれ配列番号14704、14706、14708、14714、14716、及び14718、
(148)それぞれ配列番号14804、14806、14808、14814、14816、及び14818、
(149)それぞれ配列番号14904、14906、14908、14914、14916、及び14918、
(150)それぞれ配列番号15004、15006、15008、15014、15016、及び15018、
(151)それぞれ配列番号15104、15106、15108、15114、15116、及び15118、
(152)それぞれ配列番号15204、15206、15208、15214、15216、及び15218、
(153)それぞれ配列番号15304、15306、15308、15314、15316、及び15318、
(154)それぞれ配列番号15404、15406、15408、15414、15416、及び15418、
(155)それぞれ配列番号15504、15506、15508、15514、15516、及び15518、
(156)それぞれ配列番号15604、15606、15608、15614、15616、及び15618、
(157)それぞれ配列番号15704、15706、15708、15714、15716、及び15718、
(158)それぞれ配列番号15804、15806、15808、15814、15816、及び15818、
(159)それぞれ配列番号15904、15906、15908、15914、15916、及び15918、
(160)それぞれ配列番号16004、16006、16008、16014、16016、及び16018、
(161)それぞれ配列番号16104、16106、16108、16114、16116、及び16118、
(162)それぞれ配列番号16204、16206、16208、16214、16216、及び16218、
(163)それぞれ配列番号16304、16306、16308、16314、16316、及び16318、
(164)それぞれ配列番号16404、16406、16408、16414、16416、及び16418、
(165)それぞれ配列番号16504、16506、16508、16514、16516、及び16518、
(166)それぞれ配列番号16604、16606、16608、16614、16616、及び16618、
(167)それぞれ配列番号16704、16706、16708、16714、16716、及び16718、
(168)それぞれ配列番号16804、16806、16808、16814、16816、及び16818、
(169)それぞれ配列番号16904、16906、16908、16914、16916、及び16918、
(170)それぞれ配列番号17004、17006、17008、17014、17016、及び17018、
(171)それぞれ配列番号17104、17106、17108、17114、17116、及び17118、
(172)それぞれ配列番号17204、17206、17208、17214、17216、及び17218、
(173)それぞれ配列番号17304、17306、17308、17314、17316、及び17318、
(174)それぞれ配列番号17404、17406、17408、17414、17416、及び17418、
(175)それぞれ配列番号17504、17506、17508、17514、17516、及び17518、
(176)それぞれ配列番号17604、17606、17608、17614、17616、及び17618、
(177)それぞれ配列番号17704、17706、17708、17714、17716、及び17718、
(178)それぞれ配列番号17804、17806、17808、17814、17816、及び17818、
(179)それぞれ配列番号17904、17906、17908、17914、17916、及び17918、
(180)それぞれ配列番号18004、18006、18008、18014、18016、及び18018、
(181)それぞれ配列番号18104、18106、18108、18114、18116、及び18118、
(182)それぞれ配列番号18204、18206、18208、18214、18216、及び18218、
(183)それぞれ配列番号18304、18306、18308、18314、18316、及び18318、
(184)それぞれ配列番号18404、18406、18408、18414、18416、及び18418、
(185)それぞれ配列番号18504、18506、18508、18514、18516、及び18518、
(186)それぞれ配列番号18604、18606、18608、18614、18616、及び18618、
(187)それぞれ配列番号18704、18706、18708、18714、18716、及び18718、
(188)それぞれ配列番号18804、18806、18808、18814、18816、及び18818、
(189)それぞれ配列番号18904、18906、18908、18914、18916、及び18918、
(190)それぞれ配列番号19004、19006、19008、19014、19016、及び19018、
(191)それぞれ配列番号19104、19106、19108、19114、19116、及び19118、
(192)それぞれ配列番号19204、19206、19208、19214、19216、及び19218、
(193)それぞれ配列番号19304、19306、19308、19314、19316、及び19318、
(194)それぞれ配列番号19404、19406、19408、19414、19416、及び19418、
(195)それぞれ配列番号19504、19506、19508、19514、19516、及び19518、
(196)それぞれ配列番号19604、19606、19608、19614、19616、及び19618、
(197)それぞれ配列番号19704、19706、19708、19714、19716、及び19718、
(198)それぞれ配列番号19804、19806、19808、19814、19816、及び19818、
(199)それぞれ配列番号19904、19906、19908、19914、19916、及び19918、
(200)それぞれ配列番号20004、20006、20008、20014、20016、及び20018、
(201)それぞれ配列番号20104、20106、20108、20114、20116、及び20118、
(202)それぞれ配列番号20204、20206、20208、20214、20216、及び20218、
(203)それぞれ配列番号20304、20306、20308、20314、20316、及び20318、
(204)それぞれ配列番号20404、20406、20408、20414、20416、及び20418、
(205)それぞれ配列番号20504、20506、20508、20514、20516、及び20518、
(206)それぞれ配列番号20604、20606、20608、20614、20616、及び20618、
(207)それぞれ配列番号20704、20706、20708、20714、20716、及び20718、
(208)それぞれ配列番号20804、20806、20808、20814、20816、及び20818、
(209)それぞれ配列番号20904、20906、20908、20914、20916、及び20918、
(210)それぞれ配列番号21004、21006、21008、21014、21016、及び21018、
(211)それぞれ配列番号21104、21106、21108、21114、21116、及び21118、
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
特定の例示的な実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列と同一であり得る:
(1)それぞれ配列番号104、106、108、114、116、及び118、
(2)それぞれ配列番号204、206、208、214、216、及び218、
(3)それぞれ配列番号304、306、308、314、316、及び318、
(86)それぞれ配列番号8604、8606、8608、8614、8616、及び8618、
(123)それぞれ配列番号12304、12306、12308、12314、12316、及び12318、
(130)それぞれ配列番号13004、13006、13008、13014、13016、及び13018、
(140)それぞれ配列番号14004、14006、14008、14014、14016、及び14018、
(162)それぞれ配列番号16204、16206、16208、16214、16216、及び16218、
(175)それぞれ配列番号17504、17506、17508、17514、17516、及び17518、
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、または
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
(1)それぞれ配列番号104、106、108、114、116、及び118、
(2)それぞれ配列番号204、206、208、214、216、及び218、
(3)それぞれ配列番号304、306、308、314、316、及び318、
(86)それぞれ配列番号8604、8606、8608、8614、8616、及び8618、
(123)それぞれ配列番号12304、12306、12308、12314、12316、及び12318、
(130)それぞれ配列番号13004、13006、13008、13014、13016、及び13018、
(140)それぞれ配列番号14004、14006、14008、14014、14016、及び14018、
(162)それぞれ配列番号16204、16206、16208、16214、16216、及び16218、
(175)それぞれ配列番号17504、17506、17508、17514、17516、及び17518、
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、または
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
さらなる例示的な実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列と同一であり得る:
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
(212)それぞれ配列番号21204、21206、21208、21214、21216、及び21218、
(213)それぞれ配列番号21304、21306、21308、21314、21316、及び21318、
(214)それぞれ配列番号21404、21406、21408、21414、21416、及び21418、
(215)それぞれ配列番号21504、21506、21508、21514、21516、及び21518、
(216)それぞれ配列番号21604、21606、21608、21614、21616、及び21618、
(217)それぞれ配列番号21704、21706、21708、21714、21716、及び21718、
(218)それぞれ配列番号21804、21806、21808、21814、21816、及び21818、
(219)それぞれ配列番号21904、21906、21908、21914、21916、及び21918、
(220)それぞれ配列番号22004、22006、22008、22014、22016、及び22018、
(221)それぞれ配列番号22104、22106、22108、22114、22116、及び22118、
(222)それぞれ配列番号22204、22206、22208、22214、22216、及び22218、
(223)それぞれ配列番号22304、22306、22308、22314、22316、及び22318、
(224)それぞれ配列番号22404、22406、22408、22414、22416、及び22418、
(225)それぞれ配列番号22504、22506、22508、22514、22516、及び22518、
(226)それぞれ配列番号22604、22606、22608、22614、22616、及び22618、
(227)それぞれ配列番号22704、22706、22708、22714、22716、及び22718、
(228)それぞれ配列番号22804、22806、22808、22814、22816、及び22818、
(229)それぞれ配列番号22904、22906、22908、22914、22916、及び22918、
(230)それぞれ配列番号23004、23006、23008、23014、23016、及び23018、または
(231)それぞれ配列番号23104、23106、23108、23114、23116、及び23118。
言い換えれば、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つのVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3、及びVLアミノ酸配列と同一であり得る。
いくつかの好ましい実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3、ならびにVLアミノ酸配列と同一であり得る。
さらなる好ましい実施形態において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3、ならびにVLアミノ酸配列と同一であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する抗CoV-S抗体のいずれかの単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、以下の構造的特徴のうちの1つを有し得る:
(1)(a)VHは、配列番号102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(2)(a)VHは、配列番号202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(3)(a)VHは、配列番号302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(4)(a)VHは、配列番号402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(5)(a)VHは、配列番号502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(6)(a)VHは、配列番号602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(7)(a)VHは、配列番号702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(8)(a)VHは、配列番号802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(9)(a)VHは、配列番号902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(10)(a)VHは、配列番号1002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(11)(a)VHは、配列番号1102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(12)(a)VHは、配列番号1202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(13)(a)VHは、配列番号1302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(14)(a)VHは、配列番号1402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(15)(a)VHは、配列番号1502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(16)(a)VHは、配列番号1602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(17)(a)VHは、配列番号1702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(18)(a)VHは、配列番号1802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(19)(a)VHは、配列番号1902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(20)(a)VHは、配列番号2002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(21)(a)VHは、配列番号2102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(22)(a)VHは、配列番号2202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(23)(a)VHは、配列番号2302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(24)(a)VHは、配列番号2402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(25)(a)VHは、配列番号2502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(26)(a)VHは、配列番号2602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(27)(a)VHは、配列番号2702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(28)(a)VHは、配列番号2802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(29)(a)VHは、配列番号2902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(30)(a)VHは、配列番号3002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(31)(a)VHは、配列番号3102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(32)(a)VHは、配列番号3202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(33)(a)VHは、配列番号3302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(34)(a)VHは、配列番号3402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(35)(a)VHは、配列番号3502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(36)(a)VHは、配列番号3602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(37)(a)VHは、配列番号3702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(38)(a)VHは、配列番号3802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(39)(a)VHは、配列番号3902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(40)(a)VHは、配列番号4002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(41)(a)VHは、配列番号4102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(42)(a)VHは、配列番号4202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(43)(a)VHは、配列番号4302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(44)(a)VHは、配列番号4402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(45)(a)VHは、配列番号4502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(46)(a)VHは、配列番号4602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(47)(a)VHは、配列番号4702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(48)(a)VHは、配列番号4802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(49)(a)VHは、配列番号4902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(50)(a)VHは、配列番号5002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(51)(a)VHは、配列番号5102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(52)(a)VHは、配列番号5202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(53)(a)VHは、配列番号5302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(54)(a)VHは、配列番号5402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(55)(a)VHは、配列番号5502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(56)(a)VHは、配列番号5602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(57)(a)VHは、配列番号5702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(58)(a)VHは、配列番号5802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(59)(a)VHは、配列番号5902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(60)(a)VHは、配列番号6002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(61)(a)VHは、配列番号6102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(62)(a)VHは、配列番号6202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(63)(a)VHは、配列番号6302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(64)(a)VHは、配列番号6402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(65)(a)VHは、配列番号6502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(66)(a)VHは、配列番号6602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(67)(a)VHは、配列番号6702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(68)(a)VHは、配列番号6802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(69)(a)VHは、配列番号6902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(70)(a)VHは、配列番号7002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(71)(a)VHは、配列番号7102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(72)(a)VHは、配列番号7202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(73)(a)VHは、配列番号7302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(74)(a)VHは、配列番号7402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(75)(a)VHは、配列番号7502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(76)(a)VHは、配列番号7602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(77)(a)VHは、配列番号7702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(78)(a)VHは、配列番号7802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(79)(a)VHは、配列番号7902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(80)(a)VHは、配列番号8002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(81)(a)VHは、配列番号8102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(82)(a)VHは、配列番号8202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(83)(a)VHは、配列番号8302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(84)(a)VHは、配列番号8402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(85)(a)VHは、配列番号8502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(86)(a)VHは、配列番号8602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(87)(a)VHは、配列番号8702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(88)(a)VHは、配列番号8802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(89)(a)VHは、配列番号8902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(90)(a)VHは、配列番号9002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(91)(a)VHは、配列番号9102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(92)(a)VHは、配列番号9202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(93)(a)VHは、配列番号9302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(94)(a)VHは、配列番号9402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(95)(a)VHは、配列番号9502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(96)(a)VHは、配列番号9602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(97)(a)VHは、配列番号9702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(98)(a)VHは、配列番号9802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(99)(a)VHは、配列番号9902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(100)(a)VHは、配列番号10002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(101)(a)VHは、配列番号10102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(102)(a)VHは、配列番号10202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(103)(a)VHは、配列番号10302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(104)(a)VHは、配列番号10402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(105)(a)VHは、配列番号10502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(106)(a)VHは、配列番号10602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(107)(a)VHは、配列番号10702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(108)(a)VHは、配列番号10802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(109)(a)VHは、配列番号10902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(110)(a)VHは、配列番号11002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(111)(a)VHは、配列番号11102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(112)(a)VHは、配列番号11202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(113)(a)VHは、配列番号11302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(114)(a)VHは、配列番号11402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(115)(a)VHは、配列番号11502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(116)(a)VHは、配列番号11602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(117)(a)VHは、配列番号11702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(118)(a)VHは、配列番号11802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(119)(a)VHは、配列番号11902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(120)(a)VHは、配列番号12002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(121)(a)VHは、配列番号12102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(122)(a)VHは、配列番号12202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(123)(a)VHは、配列番号12302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(124)(a)VHは、配列番号12402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(125)(a)VHは、配列番号12502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(126)(a)VHは、配列番号12602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(127)(a)VHは、配列番号12702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(128)(a)VHは、配列番号12802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(129)(a)VHは、配列番号12902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(130)(a)VHは、配列番号13002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(131)(a)VHは、配列番号13102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(132)(a)VHは、配列番号13202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(133)(a)VHは、配列番号13302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(134)(a)VHは、配列番号13402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(135)(a)VHは、配列番号13502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(136)(a)VHは、配列番号13602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(137)(a)VHは、配列番号13702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(138)(a)VHは、配列番号13802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(139)(a)VHは、配列番号13902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(140)(a)VHは、配列番号14002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(141)(a)VHは、配列番号14102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(142)(a)VHは、配列番号14202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(143)(a)VHは、配列番号14302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(144)(a)VHは、配列番号14402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(145)(a)VHは、配列番号14502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(146)(a)VHは、配列番号14602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(147)(a)VHは、配列番号14702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(148)(a)VHは、配列番号14802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(149)(a)VHは、配列番号14902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(150)(a)VHは、配列番号15002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(151)(a)VHは、配列番号15102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(152)(a)VHは、配列番号15202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(153)(a)VHは、配列番号15302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(154)(a)VHは、配列番号15402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(155)(a)VHは、配列番号15502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(156)(a)VHは、配列番号15602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(157)(a)VHは、配列番号15702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(158)(a)VHは、配列番号15802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(159)(a)VHは、配列番号15902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(160)(a)VHは、配列番号16002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(161)(a)VHは、配列番号16102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(162)(a)VHは、配列番号16202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(163)(a)VHは、配列番号16302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(164)(a)VHは、配列番号16402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(165)(a)VHは、配列番号16502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(166)(a)VHは、配列番号16602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(167)(a)VHは、配列番号16702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(168)(a)VHは、配列番号16802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(169)(a)VHは、配列番号16902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(170)(a)VHは、配列番号17002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(171)(a)VHは、配列番号17102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(172)(a)VHは、配列番号17202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(173)(a)VHは、配列番号17302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(174)(a)VHは、配列番号17402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(175)(a)VHは、配列番号17502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(176)(a)VHは、配列番号17602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(177)(a)VHは、配列番号17702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(178)(a)VHは、配列番号17802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(179)(a)VHは、配列番号17902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(180)(a)VHは、配列番号18002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(181)(a)VHは、配列番号18102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(182)(a)VHは、配列番号18202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(183)(a)VHは、配列番号18302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(184)(a)VHは、配列番号18402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(185)(a)VHは、配列番号18502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(186)(a)VHは、配列番号18602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(187)(a)VHは、配列番号18702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(188)(a)VHは、配列番号18802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(189)(a)VHは、配列番号18902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(190)(a)VHは、配列番号19002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(191)(a)VHは、配列番号19102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(192)(a)VHは、配列番号19202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(193)(a)VHは、配列番号19302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(194)(a)VHは、配列番号19402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(195)(a)VHは、配列番号19502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(196)(a)VHは、配列番号19602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(197)(a)VHは、配列番号19702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(198)(a)VHは、配列番号19802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(199)(a)VHは、配列番号19902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(200)(a)VHは、配列番号20002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(201)(a)VHは、配列番号20102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(202)(a)VHは、配列番号20202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(203)(a)VHは、配列番号20302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(204)(a)VHは、配列番号20402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(205)(a)VHは、配列番号20502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(206)(a)VHは、配列番号20602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(207)(a)VHは、配列番号20702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(208)(a)VHは、配列番号20802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(209)(a)VHは、配列番号20902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(210)(a)VHは、配列番号21002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(211)(a)VHは、配列番号21102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(212)(a)VHは、配列番号21202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(213)(a)VHは、配列番号21302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(214)(a)VHは、配列番号21402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(215)(a)VHは、配列番号21502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(216)(a)VHは、配列番号21602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(226)(a)VHは、配列番号22602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(227)(a)VHは、配列番号22702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(228)(a)VHは、配列番号22802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(229)(a)VHは、配列番号22902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(230)(a)VHは、配列番号23002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(231)(a)VHは、配列番号23102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
(1)(a)VHは、配列番号102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(2)(a)VHは、配列番号202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(3)(a)VHは、配列番号302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(4)(a)VHは、配列番号402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(5)(a)VHは、配列番号502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(6)(a)VHは、配列番号602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(7)(a)VHは、配列番号702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(8)(a)VHは、配列番号802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(9)(a)VHは、配列番号902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(10)(a)VHは、配列番号1002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(11)(a)VHは、配列番号1102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(12)(a)VHは、配列番号1202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(13)(a)VHは、配列番号1302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(14)(a)VHは、配列番号1402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(15)(a)VHは、配列番号1502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(16)(a)VHは、配列番号1602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(17)(a)VHは、配列番号1702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(18)(a)VHは、配列番号1802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(19)(a)VHは、配列番号1902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号1912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(20)(a)VHは、配列番号2002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(21)(a)VHは、配列番号2102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(22)(a)VHは、配列番号2202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(23)(a)VHは、配列番号2302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(24)(a)VHは、配列番号2402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(25)(a)VHは、配列番号2502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(26)(a)VHは、配列番号2602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(27)(a)VHは、配列番号2702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(28)(a)VHは、配列番号2802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(29)(a)VHは、配列番号2902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号2912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(30)(a)VHは、配列番号3002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(31)(a)VHは、配列番号3102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(32)(a)VHは、配列番号3202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(33)(a)VHは、配列番号3302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(34)(a)VHは、配列番号3402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(35)(a)VHは、配列番号3502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(36)(a)VHは、配列番号3602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(37)(a)VHは、配列番号3702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(38)(a)VHは、配列番号3802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(39)(a)VHは、配列番号3902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号3912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(40)(a)VHは、配列番号4002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(41)(a)VHは、配列番号4102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(42)(a)VHは、配列番号4202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(43)(a)VHは、配列番号4302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(44)(a)VHは、配列番号4402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(45)(a)VHは、配列番号4502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(46)(a)VHは、配列番号4602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(47)(a)VHは、配列番号4702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(48)(a)VHは、配列番号4802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(49)(a)VHは、配列番号4902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号4912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(50)(a)VHは、配列番号5002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(51)(a)VHは、配列番号5102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(52)(a)VHは、配列番号5202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(53)(a)VHは、配列番号5302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(54)(a)VHは、配列番号5402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(55)(a)VHは、配列番号5502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(56)(a)VHは、配列番号5602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(57)(a)VHは、配列番号5702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(58)(a)VHは、配列番号5802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(59)(a)VHは、配列番号5902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号5912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(60)(a)VHは、配列番号6002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(61)(a)VHは、配列番号6102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(62)(a)VHは、配列番号6202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(63)(a)VHは、配列番号6302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(64)(a)VHは、配列番号6402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(65)(a)VHは、配列番号6502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(66)(a)VHは、配列番号6602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(67)(a)VHは、配列番号6702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(68)(a)VHは、配列番号6802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(69)(a)VHは、配列番号6902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号6912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(70)(a)VHは、配列番号7002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(71)(a)VHは、配列番号7102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(72)(a)VHは、配列番号7202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(73)(a)VHは、配列番号7302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(74)(a)VHは、配列番号7402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(75)(a)VHは、配列番号7502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(76)(a)VHは、配列番号7602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(77)(a)VHは、配列番号7702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(78)(a)VHは、配列番号7802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(79)(a)VHは、配列番号7902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号7912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(80)(a)VHは、配列番号8002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(81)(a)VHは、配列番号8102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(82)(a)VHは、配列番号8202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(83)(a)VHは、配列番号8302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(84)(a)VHは、配列番号8402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(85)(a)VHは、配列番号8502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(86)(a)VHは、配列番号8602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(87)(a)VHは、配列番号8702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(88)(a)VHは、配列番号8802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(89)(a)VHは、配列番号8902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(90)(a)VHは、配列番号9002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(91)(a)VHは、配列番号9102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(92)(a)VHは、配列番号9202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(93)(a)VHは、配列番号9302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(94)(a)VHは、配列番号9402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(95)(a)VHは、配列番号9502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(96)(a)VHは、配列番号9602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(97)(a)VHは、配列番号9702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(98)(a)VHは、配列番号9802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(99)(a)VHは、配列番号9902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号9912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(100)(a)VHは、配列番号10002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(101)(a)VHは、配列番号10102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(102)(a)VHは、配列番号10202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(103)(a)VHは、配列番号10302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(104)(a)VHは、配列番号10402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(105)(a)VHは、配列番号10502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(106)(a)VHは、配列番号10602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(107)(a)VHは、配列番号10702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(108)(a)VHは、配列番号10802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(109)(a)VHは、配列番号10902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号10912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(110)(a)VHは、配列番号11002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(111)(a)VHは、配列番号11102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(112)(a)VHは、配列番号11202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(113)(a)VHは、配列番号11302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(114)(a)VHは、配列番号11402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(115)(a)VHは、配列番号11502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(116)(a)VHは、配列番号11602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(117)(a)VHは、配列番号11702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(118)(a)VHは、配列番号11802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(119)(a)VHは、配列番号11902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号11912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(120)(a)VHは、配列番号12002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(121)(a)VHは、配列番号12102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(122)(a)VHは、配列番号12202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(123)(a)VHは、配列番号12302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(124)(a)VHは、配列番号12402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(125)(a)VHは、配列番号12502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(126)(a)VHは、配列番号12602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(127)(a)VHは、配列番号12702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(128)(a)VHは、配列番号12802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(129)(a)VHは、配列番号12902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(130)(a)VHは、配列番号13002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(131)(a)VHは、配列番号13102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(132)(a)VHは、配列番号13202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(133)(a)VHは、配列番号13302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(134)(a)VHは、配列番号13402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(135)(a)VHは、配列番号13502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(136)(a)VHは、配列番号13602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(137)(a)VHは、配列番号13702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(138)(a)VHは、配列番号13802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(139)(a)VHは、配列番号13902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(140)(a)VHは、配列番号14002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(141)(a)VHは、配列番号14102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(142)(a)VHは、配列番号14202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(143)(a)VHは、配列番号14302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(144)(a)VHは、配列番号14402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(145)(a)VHは、配列番号14502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(146)(a)VHは、配列番号14602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(147)(a)VHは、配列番号14702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(148)(a)VHは、配列番号14802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(149)(a)VHは、配列番号14902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(150)(a)VHは、配列番号15002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(151)(a)VHは、配列番号15102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(152)(a)VHは、配列番号15202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(153)(a)VHは、配列番号15302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(154)(a)VHは、配列番号15402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(155)(a)VHは、配列番号15502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(156)(a)VHは、配列番号15602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(157)(a)VHは、配列番号15702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(158)(a)VHは、配列番号15802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(159)(a)VHは、配列番号15902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号15912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(160)(a)VHは、配列番号16002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(161)(a)VHは、配列番号16102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(162)(a)VHは、配列番号16202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(163)(a)VHは、配列番号16302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(164)(a)VHは、配列番号16402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(165)(a)VHは、配列番号16502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(166)(a)VHは、配列番号16602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(167)(a)VHは、配列番号16702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(168)(a)VHは、配列番号16802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(169)(a)VHは、配列番号16902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(170)(a)VHは、配列番号17002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(171)(a)VHは、配列番号17102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(172)(a)VHは、配列番号17202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(173)(a)VHは、配列番号17302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(174)(a)VHは、配列番号17402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(175)(a)VHは、配列番号17502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(176)(a)VHは、配列番号17602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(177)(a)VHは、配列番号17702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(178)(a)VHは、配列番号17802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(179)(a)VHは、配列番号17902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(180)(a)VHは、配列番号18002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(181)(a)VHは、配列番号18102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(182)(a)VHは、配列番号18202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(183)(a)VHは、配列番号18302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(184)(a)VHは、配列番号18402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(185)(a)VHは、配列番号18502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(186)(a)VHは、配列番号18602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(187)(a)VHは、配列番号18702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(188)(a)VHは、配列番号18802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(189)(a)VHは、配列番号18902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号18912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(190)(a)VHは、配列番号19002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(191)(a)VHは、配列番号19102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(192)(a)VHは、配列番号19202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
(193)(a)VHは、配列番号19302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(194)(a)VHは、配列番号19402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(195)(a)VHは、配列番号19502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(196)(a)VHは、配列番号19602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(197)(a)VHは、配列番号19702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(198)(a)VHは、配列番号19802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(199)(a)VHは、配列番号19902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号19912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(200)(a)VHは、配列番号20002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(201)(a)VHは、配列番号20102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(202)(a)VHは、配列番号20202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(203)(a)VHは、配列番号20302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(204)(a)VHは、配列番号20402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(205)(a)VHは、配列番号20502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(206)(a)VHは、配列番号20602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(207)(a)VHは、配列番号20702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(208)(a)VHは、配列番号20802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(209)(a)VHは、配列番号20902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号20912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(210)(a)VHは、配列番号21002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(211)(a)VHは、配列番号21102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(212)(a)VHは、配列番号21202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(213)(a)VHは、配列番号21302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(214)(a)VHは、配列番号21402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(215)(a)VHは、配列番号21502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(216)(a)VHは、配列番号21602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(226)(a)VHは、配列番号22602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(227)(a)VHは、配列番号22702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(228)(a)VHは、配列番号22802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(229)(a)VHは、配列番号22902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(230)(a)VHは、配列番号23002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(231)(a)VHは、配列番号23102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する抗CoV-S抗体のいずれかの単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、以下の構造的特徴のうちの1つを有し得る:
(1)(a)VHは、配列番号102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(2)(a)VHは、配列番号202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(3)(a)VHは、配列番号302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(86)(a)VHは、配列番号8602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(123)(a)VHは、配列番号12302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(130)(a)VHは、配列番号13002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(140)(a)VHは、配列番号14002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(162)(a)VHは、配列番号16202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(175)(a)VHは、配列番号17502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
(1)(a)VHは、配列番号102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(2)(a)VHは、配列番号202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(3)(a)VHは、配列番号302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(86)(a)VHは、配列番号8602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号8612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(123)(a)VHは、配列番号12302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号12312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(130)(a)VHは、配列番号13002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号13012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(140)(a)VHは、配列番号14002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号14012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(162)(a)VHは、配列番号16202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号16212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(175)(a)VHは、配列番号17502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号17512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
さらなる実施形態において、
(212)(a)VHは、配列番号21202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(213)(a)VHは、配列番号21302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(214)(a)VHは、配列番号21402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(215)(a)VHは、配列番号21502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(216)(a)VHは、配列番号21602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(226)(a)VHは、配列番号22602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(227)(a)VHは、配列番号22702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(228)(a)VHは、配列番号22802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(229)(a)VHは、配列番号22902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(230)(a)VHは、配列番号23002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(231)(a)VHは、配列番号23102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
(212)(a)VHは、配列番号21202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(213)(a)VHは、配列番号21302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(214)(a)VHは、配列番号21402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(215)(a)VHは、配列番号21502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(216)(a)VHは、配列番号21602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(226)(a)VHは、配列番号22602のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22612のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(227)(a)VHは、配列番号22702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(228)(a)VHは、配列番号22802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(229)(a)VHは、配列番号22902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(230)(a)VHは、配列番号23002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(231)(a)VHは、配列番号23102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号23112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
さらなる好ましい実施形態において、
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
(217)(a)VHは、配列番号21702のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21712のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(218)(a)VHは、配列番号21802のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21812のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(219)(a)VHは、配列番号21902のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号21912のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(220)(a)VHは、配列番号22002のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22012のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(221)(a)VHは、配列番号22102のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22112のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(222)(a)VHは、配列番号22202のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22212のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(223)(a)VHは、配列番号22302のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22312のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;
(224)(a)VHは、配列番号22402のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22412のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる;または
(225)(a)VHは、配列番号22502のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、(b)VLは、配列番号22512のアミノ酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、コロナウイルスのスパイクタンパク質(「CoV-S」)に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の配列のうちの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6つ)を含む:
(a)配列X1X2FX3X4X5X6X7X8(配列番号23205)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はSまたはTであり、X4はS、R、G、H、T、A、またはKであり、X5はFまたはYであり、X6はY、A、D、G、P、またはVであり、X7はMまたはIであり、X8はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列X1TFX2SYYX3X4(配列番号23206)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はMまたはIであり、X4はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列FTFSSYYMN(配列番号23207)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列SISX1DGYX2TYYPDSLKG(配列番号23208)(X1はSまたはEであり、X2はNまたはSである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARDFSGHTAX1AGTGFEY(配列番号23209)(X1はWまたはVである)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列TSGX1SNX2GAGYX3VH(配列番号23210)(X1はNまたはSであり、X2はIまたはVであり、X3はDまたはYである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列GX1X2X3X4X5X6(配列番号23211)(X1はA、S、またはTであり、X2はSまたはTであり、X3はS、T、A、またはNであり、X4はR、L、またはTであり、X5はA、P、Q、H、またはNであり、X6はTまたはSである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列GX1SSX2X3S(配列番号23212)(X1はSまたはAであり、X2はRまたはLであり、X3はN、H、またはQである)を有するVL CDR2を有する軽鎖可変領域(VL);
(i)配列GSSSRNS(配列番号23213)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列QSYDSSLSVLYX1(配列番号23214)(X1はTまたはVである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(a)配列X1X2FX3X4X5X6X7X8(配列番号23205)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はSまたはTであり、X4はS、R、G、H、T、A、またはKであり、X5はFまたはYであり、X6はY、A、D、G、P、またはVであり、X7はMまたはIであり、X8はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列X1TFX2SYYX3X4(配列番号23206)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はMまたはIであり、X4はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列FTFSSYYMN(配列番号23207)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列SISX1DGYX2TYYPDSLKG(配列番号23208)(X1はSまたはEであり、X2はNまたはSである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARDFSGHTAX1AGTGFEY(配列番号23209)(X1はWまたはVである)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列TSGX1SNX2GAGYX3VH(配列番号23210)(X1はNまたはSであり、X2はIまたはVであり、X3はDまたはYである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列GX1X2X3X4X5X6(配列番号23211)(X1はA、S、またはTであり、X2はSまたはTであり、X3はS、T、A、またはNであり、X4はR、L、またはTであり、X5はA、P、Q、H、またはNであり、X6はTまたはSである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列GX1SSX2X3S(配列番号23212)(X1はSまたはAであり、X2はRまたはLであり、X3はN、H、またはQである)を有するVL CDR2を有する軽鎖可変領域(VL);
(i)配列GSSSRNS(配列番号23213)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列QSYDSSLSVLYX1(配列番号23214)(X1はTまたはVである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列ARDFSGHTAX1AGTGFEY(配列番号23209)(X1はWまたはVである)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列QSYDSSLSVLYX1(配列番号23214)(X1はTまたはVである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列ARDFSGHTAX1AGTGFEY(配列番号23209)(X1はWまたはVである)を有するVH CDR3、配列SISX1DGYX2TYYPDSLKG(配列番号23208)(X1はSまたはEであり、X2はNまたはSである)を有するVH CDR2、及び配列X1TFX2SYYX3X4(配列番号23206)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はMまたはIであり、X4はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH)と、配列QSYDSSLSVLYX1(配列番号23214)(X1はTまたはVである)を有するVL CDR3、配列GX1SSX2X3S(配列番号23212)(X1はSまたはAであり、X2はRまたはLであり、X3はN、H、またはQである)を有するVL CDR2、及び配列TSGX1SNX2GAGYX3VH(配列番号23210)(X1はNまたはSであり、X2はIまたはVであり、X3はDまたはYである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、コロナウイルスのスパイクタンパク質(「CoV-S」)に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の配列のうちの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6つ)を含む:
(a)配列X1X2FX3X4X5X6X7X8(配列番号23205)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はSまたはTであり、X4はS、R、G、H、T、A、またはKであり、X5はFまたはYであり、X6はY、A、D、G、P、またはVであり、X7はMまたはIであり、X8はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FTFSX1X2AMH(配列番号23215)(X1はRまたはKであり、X2はFまたはYである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列FTFSRFAMH(配列番号23216)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列AINLNGDSX1YYTDSVRG(配列番号23217)(X1はKまたはTである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列VKDGGYYDSSGPGH(配列番号23218)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列RASX1NX2X3X4X5LA(配列番号23219)(X1はEまたはQであり、X2はIまたはVであり、X3はL、A、またはNであり、X4はHまたはNであり、X5はYまたはWである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列RASENIX1HYLA(配列番号23220)(X1はLまたはAである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列RASENILHYLA(配列番号23221)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2X3X4RX5X6(配列番号23222)(X1はDまたはEであり、X2はA、S、T、またはVであり、X3はSまたはFであり、X4はS、A、T、K、N、またはRであり、X5はAまたはVであり、X6はT、S、またはPである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(j)配列DX1SX2RAT(配列番号23223)(X1はA、S、またはVであり、X2はKまたはRである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(k)配列DASRRAT(配列番号23224)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(l)配列QQRX1NWPQN(配列番号23225)(X1はAまたはSである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(a)配列X1X2FX3X4X5X6X7X8(配列番号23205)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はSまたはTであり、X4はS、R、G、H、T、A、またはKであり、X5はFまたはYであり、X6はY、A、D、G、P、またはVであり、X7はMまたはIであり、X8はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FTFSX1X2AMH(配列番号23215)(X1はRまたはKであり、X2はFまたはYである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列FTFSRFAMH(配列番号23216)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列AINLNGDSX1YYTDSVRG(配列番号23217)(X1はKまたはTである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列VKDGGYYDSSGPGH(配列番号23218)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列RASX1NX2X3X4X5LA(配列番号23219)(X1はEまたはQであり、X2はIまたはVであり、X3はL、A、またはNであり、X4はHまたはNであり、X5はYまたはWである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列RASENIX1HYLA(配列番号23220)(X1はLまたはAである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列RASENILHYLA(配列番号23221)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2X3X4RX5X6(配列番号23222)(X1はDまたはEであり、X2はA、S、T、またはVであり、X3はSまたはFであり、X4はS、A、T、K、N、またはRであり、X5はAまたはVであり、X6はT、S、またはPである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(j)配列DX1SX2RAT(配列番号23223)(X1はA、S、またはVであり、X2はKまたはRである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(k)配列DASRRAT(配列番号23224)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(l)配列QQRX1NWPQN(配列番号23225)(X1はAまたはSである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列VKDGGYYDSSGPGH(配列番号23218)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列QQRX1NWPQN(配列番号23225)(X1はAまたはSである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列VKDGGYDSSGPGH(配列番号23218)を有するVH CDR3、配列AINLNGDSX1YYTDSVRG(配列番号23217)(X1はKまたはTである)を有するVH CDR2、及び配列FTFSX1X2AMH(配列番号23215)(X1はRまたはKであり、X2はFまたはYである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH)と、配列QQRX1NWPQN(配列番号23225)(X1はAまたはSである)を有するVL CDR3、配列DX1SX2RAT(配列番号23223)(X1はA、S、またはVであり、X2はKまたはRである)を有するVL CDR2、及び配列RASENIX1HYLA(配列番号23220)を有するVL CDR1(X1はLまたはAである)を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、コロナウイルスのスパイクタンパク質(「CoV-S」)に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の配列のうちの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6つ)を含む:
(a)配列FPFX1GTYMT(配列番号23226)(X1はKまたはSである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FFX1FX2GX3X4MX5(配列番号23227)(X1はPまたはIであり、X2はKまたはSであり、X3はTまたはHであり、X4はWまたはY、X5はTまたはSである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列IIYSGGDTYYADSVKG(配列番号23228)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列X1X2YSGGX3TYYADX4VX5G(配列番号23229)(X1はVまたはIであり、X2はLまたはIであり、X3はDまたはSであり、X4はSまたはAであり、X5はKまたはQである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARDREMAIITERX1YGLDV(配列番号23230)(X1はTまたはSである)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列SGGSSNIGSNSVN(配列番号23231)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列SGX1X2X3NIX4SNX5VN(配列番号23232)(X1はGまたはSであり、X2はSまたはTであり、X3はSまたはAであり、X4はGまたはAであり、X5はSまたはGである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列X1X2SQRPS(配列番号23233)(X1はSまたはAであり、X2はNまたはVである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2X3X4RPS(配列番号23234)(X1はG、S、またはAであり、X2はNまたはVであり、X3はSまたはGであり、X4はNまたはQである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列AAWDDSLNTFRYV(配列番号23235)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(a)配列FPFX1GTYMT(配列番号23226)(X1はKまたはSである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FFX1FX2GX3X4MX5(配列番号23227)(X1はPまたはIであり、X2はKまたはSであり、X3はTまたはHであり、X4はWまたはY、X5はTまたはSである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列IIYSGGDTYYADSVKG(配列番号23228)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列X1X2YSGGX3TYYADX4VX5G(配列番号23229)(X1はVまたはIであり、X2はLまたはIであり、X3はDまたはSであり、X4はSまたはAであり、X5はKまたはQである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARDREMAIITERX1YGLDV(配列番号23230)(X1はTまたはSである)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列SGGSSNIGSNSVN(配列番号23231)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列SGX1X2X3NIX4SNX5VN(配列番号23232)(X1はGまたはSであり、X2はSまたはTであり、X3はSまたはAであり、X4はGまたはAであり、X5はSまたはGである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列X1X2SQRPS(配列番号23233)(X1はSまたはAであり、X2はNまたはVである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2X3X4RPS(配列番号23234)(X1はG、S、またはAであり、X2はNまたはVであり、X3はSまたはGであり、X4はNまたはQである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列AAWDDSLNTFRYV(配列番号23235)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの実施形態において、本開示は、コロナウイルスのスパイクタンパク質(「CoV-S」)に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の配列のうちの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6つ)を含む:
(a)配列GTFSSX1AIS(配列番号23236)(X1はYまたはDである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列GX1FX2SX3X4X5X6(配列番号23237)(X1はT、S、またはPであり、X2はSまたはTであり、X3はY、F、またはDであり、X4はV、G、またはAであり、X5はV、L、またはIであり、X6はSまたはTである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列GIIPIFVTANYAQKFQG(配列番号23238)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列GIX1PIFX2TX3X4YAQKFQX5(配列番号23239)(X1はIまたはMであり、X2はGまたはVであり、X3はAまたはTであり、X4はNまたはGであり、X5はGまたはDである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARGRMATIRGGQNYYYYYGMDV(配列番号23240)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列QASQDISNYLN(配列番号23241)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列QASQDIX1X2X3LN(配列番号23242)(X1はSまたはRであり、X2はNまたはKであり、X3はYまたはCである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列DASNLET(配列番号23243)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2SX3LX4X5(配列番号23244)(X1はV、A、S、T、D、E、K、またはRであり、X2はA、V、またはTであり、X3はS、N、T、またはKであり、X4はQ、E、K、またはRであり、X5はS、N、またはTである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(j)配列QQYDNLPLT(配列番号23245)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(k)配列QQX1X2X3LPX4T(配列番号23246)(X1はYまたはFであり、X2はDまたはEであり、X3はNまたはDであり、X4はLまたはIである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(l)配列QX1X2X3X4X5PX6X7(配列番号23247)(X1はQまたはHであり、X2はY、A、またはFであり、X3はDまたはEであり、X4はN、S、またはDであり、X5はL、YまたはFであり、X6はI、L、T、V、またはFであり、X7はTまたはAである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(a)配列GTFSSX1AIS(配列番号23236)(X1はYまたはDである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列GX1FX2SX3X4X5X6(配列番号23237)(X1はT、S、またはPであり、X2はSまたはTであり、X3はY、F、またはDであり、X4はV、G、またはAであり、X5はV、L、またはIであり、X6はSまたはTである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列GIIPIFVTANYAQKFQG(配列番号23238)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列GIX1PIFX2TX3X4YAQKFQX5(配列番号23239)(X1はIまたはMであり、X2はGまたはVであり、X3はAまたはTであり、X4はNまたはGであり、X5はGまたはDである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ARGRMATIRGGQNYYYYYGMDV(配列番号23240)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列QASQDISNYLN(配列番号23241)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列QASQDIX1X2X3LN(配列番号23242)(X1はSまたはRであり、X2はNまたはKであり、X3はYまたはCである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列DASNLET(配列番号23243)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列X1X2SX3LX4X5(配列番号23244)(X1はV、A、S、T、D、E、K、またはRであり、X2はA、V、またはTであり、X3はS、N、T、またはKであり、X4はQ、E、K、またはRであり、X5はS、N、またはTである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(j)配列QQYDNLPLT(配列番号23245)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(k)配列QQX1X2X3LPX4T(配列番号23246)(X1はYまたはFであり、X2はDまたはEであり、X3はNまたはDであり、X4はLまたはIである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(l)配列QX1X2X3X4X5PX6X7(配列番号23247)(X1はQまたはHであり、X2はY、A、またはFであり、X3はDまたはEであり、X4はN、S、またはDであり、X5はL、YまたはFであり、X6はI、L、T、V、またはFであり、X7はTまたはAである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの実施形態において、本開示は、コロナウイルスのスパイクタンパク質(「CoV-S」)に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の配列のうちの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6つ)を含む:
(a)配列FTFDDYAMH(配列番号23248)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FX1X2DDYAX3H(配列番号23249)(X1はTまたはIであり、X2はFまたはLであり、X3はMまたはVである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列GISWNSGX1INYADSVX2G(配列番号23250)(X1はTまたはSであり、X2はMまたはKである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列GIX1WNSGX2X3X4YADSVX5G(配列番号23251)(X1はSまたはTであり、X2はS、T、またはYであり、X3はIまたはLであり、X4はNまたはGであり、X5はKまたはMである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ASDSNYRDYYYHYGMDV(配列番号23252)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列RSSQSLLHSX1GYNYLD(配列番号23253)(X1はNまたはQである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列LGSNRAS(配列番号23254)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列X1X2X3X4RX5S(配列番号23255)(X1はLまたはGであり、X2はGまたはNであり、X3はSまたはNであり、X4はNまたはEであり、X5はAまたはSである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列MQALQTPRT(配列番号23256)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列MQX1X2X3X4X5X6X7T(配列番号23257)(X1はAまたはSであり、X2はLまたはIであり、X3はQまたはアミノ酸なしであり、X4はQまたはTであり、X5はT、P、またはVであり、X6はPまたはGであり、X7はR、I、またはVである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(a)配列FTFDDYAMH(配列番号23248)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(b)配列FX1X2DDYAX3H(配列番号23249)(X1はTまたはIであり、X2はFまたはLであり、X3はMまたはVである)を有するVH CDR1を含む重鎖可変領域(VH);
(c)配列GISWNSGX1INYADSVX2G(配列番号23250)(X1はTまたはSであり、X2はMまたはKである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(d)配列GIX1WNSGX2X3X4YADSVX5G(配列番号23251)(X1はSまたはTであり、X2はS、T、またはYであり、X3はIまたはLであり、X4はNまたはGであり、X5はKまたはMである)を有するVH CDR2を含む重鎖可変領域(VH);
(e)配列ASDSNYRDYYYHYGMDV(配列番号23252)を有するVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH);
(f)配列RSSQSLLHSX1GYNYLD(配列番号23253)(X1はNまたはQである)を有するVL CDR1を含む軽鎖可変領域(VL);
(g)配列LGSNRAS(配列番号23254)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(h)配列X1X2X3X4RX5S(配列番号23255)(X1はLまたはGであり、X2はGまたはNであり、X3はSまたはNであり、X4はNまたはEであり、X5はAまたはSである)を有するVL CDR2を含む軽鎖可変領域(VL);
(i)配列MQALQTPRT(配列番号23256)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び
(j)配列MQX1X2X3X4X5X6X7T(配列番号23257)(X1はAまたはSであり、X2はLまたはIであり、X3はQまたはアミノ酸なしであり、X4はQまたはTであり、X5はT、P、またはVであり、X6はPまたはGであり、X7はR、I、またはVである)を有するVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
いくつかの例示的な実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラであり得る。
いくつかの例示的な実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、二重特異性または多重特異性であり得る。
いくつかの例示的な実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメント、任意選択で親和性成熟バリアントは、少なくとも1つの第1の抗原結合ドメイン(「ABD」)及び少なくとも1つの第2のABDを含むことができる。
ここでは、以下の(a)及び(b)の特徴が満たされ得る:
(a)第1のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つから選択される第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる;及び/または
(b)第2のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つから選択される第2の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含むことができる。
(a)第1のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つから選択される第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる;及び/または
(b)第2のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つから選択される第2の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含むことができる。
任意選択で、第1の抗CoV-S抗体は、第2の抗CoV-S抗体と同じであっても、第2の抗CoV-S抗体と異なっていてもよい。
第1の抗CoV-S抗体及び第2の抗CoV-S抗体は、同じまたは異なるコロナウイルス種に結合することができる。任意選択で、第1のCoV-S及び第2のCoV-Sは、(i)ともにSARS-CoVであっても、(ii)ともにSARS-CoV-2であってもよい。
さらに任意選択で、第1の抗CoV-S抗体は、第2の抗CoV-S抗体と同じであっても、第2の抗CoV-S抗体と異なっていてもよい。さらに任意選択で、これらの抗体は、当該SARS-CoVまたはSARS-CoV-2が発現するCoV-S上の同じまたは異なるエピトープに結合することができる。代替的に、第1の抗CoV-S抗体及び第2の抗CoV-S抗体は、異なるコロナウイルスに結合することができ、任意選択で、第1のCoV-S及び第2のCoV-Sは、(i)それぞれSARS-CoV及びSARS-CoV-2のコロナウイルスである、または(ii)それぞれSARS-CoV-2及びSARS-CoVのコロナウイルスである。
さらに、いくつかの好ましい実施形態において、以下の特徴(a)及び(b)が満たされ得る:
(a)第1のABDが、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)。ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができること;ならびに
(b)第2のABDが、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479からなる群より選択される第2の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含むことができること。
いくつかの実施形態において、二重特異性または多重特異性の単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、少なくとも1つの第1のABD及び少なくとも1つの第2のABDを含むことができる。
ある特定の実施形態において、
(a)第1のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つ、もしくは前述のいずれかの親和性成熟バリアントから選択される第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる;及び/または
(b)第2のABDは、CoV-Sでなくてもよい抗原に結合し、任意選択で、抗原はサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくは免疫調節ポリペプチドである。ある特定の好ましい実施形態において、(a)において、第1のABDは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479からなる群より選択される、特に好ましくは、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される、第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる。
(a)第1のABDは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つ、もしくは前述のいずれかの親和性成熟バリアントから選択される第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる;及び/または
(b)第2のABDは、CoV-Sでなくてもよい抗原に結合し、任意選択で、抗原はサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくは免疫調節ポリペプチドである。ある特定の好ましい実施形態において、(a)において、第1のABDは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479からなる群より選択される、特に好ましくは、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される、第1の抗CoV-S抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、sc(Fv)2、ミニボディ、ダイアボディ、sdAb、BITEを含むことができる。
いくつかの実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、定常領域もしくはFc領域またはこれらの少なくとも1つのドメインを含むことができる。
ある特定の実施形態において、定常領域またはFc領域は、少なくとも1つのエフェクター機能、任意選択でFcR結合、FcRn結合、補体結合、グリコシル化、補体依存性細胞傷害(「CDC」)または抗体依存性細胞傷害(「ADCC」)を障害または強化する変異を含むことができる。
いくつかの実施形態において、定常またはFc領域は、霊長類由来であり、好ましくはヒト由来である。
ヒト定常またはFc領域は、任意選択で、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常またはFc領域から選択することができ、これらは任意選択で修飾されてもよく、任意選択で例えば、ドメイン欠失により、または少なくとも1つのエフェクター機能を障害または強化する1つ以上の変異を導入することにより、修飾されてもよい。
本開示はさらに、本明細書に記載の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体(「CAR」)に関する。
本開示はさらに、(a)本明細書に記載の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(b)薬物とを含む抗体-薬物結合体(「ADC」)に関する。
いくつかの実施形態において、薬物は以下のものとすることができる:(i)抗ウイルス薬(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、もしくはリトナビルである);(ii)駆虫薬(任意選択で、イベルメクチンであってもよい)(iii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコンであってもよい);(iv)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCGであってもよい);または(v)抗炎症薬(任意選択で、シクレソニドなどのステロイド、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ(toclizumab))、もしくはメタミゾールであってもよい);(vi)抗ヒスタミン薬(任意選択でベポタスチンであってもよい);(vii)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリルであってもよい);(viii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、ナファモスタットなどのセリンプロテアーゼ阻害剤であってもよい);または(ix)細胞傷害薬(任意選択で、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、ククルビタシン、カエトシン(chaetocin)、カエトグロボシン、クラミドシン、カリケアマイシン、ネモルビシン、クリプトフィシン、メンサカルシン、アンサミトシン、マイトマイシンC、ゲルダナマイシン、メケルカルマイシン(mechercharmycin)、レベッカマイシン、サフラシン、オキラクトマイシン、オリゴマイシン、アクチノマイシン、サンドラマイシン、ヒポテマイシン、ポリケトマイシン、ヒドロキシエリプチシン、チオコルチシン、メトトレキサート、トリプトリド、タルトブリン、ラクタシスチン、ドラスタチン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、テロメスタチン、ツバスタチンA、コンブレタスタチン、マイタンシノイド、MMAD、MMAF、DM1、DM4、DTT、16-GMB-APA-GA、17-DMAP-GA、JW55、ピロロベンゾジアゼピン、SN-38、Ro5-3335、プワイナフィシン、デュオカルマイシン、バフィロマイシン、タキソイド、ツブリシン、フェルレノール、ルシオールA、フマジリン、ハイグロリジン、グルコピエリシジン、アマニチン、アンサトリエニン、シネルビン、ファラシジン、ファロイジン、フィトスフォンゴシン(phytosphongosine)、ピエリシジン、ポロネチン、フォドフィロトキシン、グラミシジンA、サンギナリン、シネファンギン、ヘルボキシジエン、ミクロコリンB、ミクロシスチン、ムスコトキシンA、トリトキシン、トリポリンA、ミオセベリン、ミトキシンB、ノクオリンA、プソイドラリック酸B(psuedolaric acid B)、プセウロチンA(pseurotin A)、シクロパミン、クルブリン、コルチシン、アフィジコリン、エングレリン、コルディセピン、アポプトリジン、エポチロンA、リマキノン、イサトロポロン、イソフィスツラリン、キナルドペプチン、イキサベピロン、アエロプリシニン、アルギノシン、アグロケリン(agrochelin)、もしくはエポチロンであってもよい)。
また、本開示は、本明細書で開示する抗体または抗原結合抗体フラグメントのいずれかをコードする単離核酸にも関する。
いくつかの実施形態において、核酸は、以下を含むことができる:
(212)(a)配列番号21210の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21220の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(213)(a)配列番号21310の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21320の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(214)(a)配列番号21410の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21420の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(215)(a)配列番号21510の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21520の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(216)(a)配列番号21610の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21620の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(217)(a)配列番号21710の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21720の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(218)(a)配列番号21810の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21820の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(219)(a)配列番号21910の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21920の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(220)(a)配列番号22010の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22020の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(221)(a)配列番号22110の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22120の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(222)(a)配列番号22210の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22220の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(223)(a)配列番号22310の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22320の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(224)(a)配列番号22410の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22420の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(225)(a)配列番号22510の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22520の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(226)(a)配列番号22610の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22620の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(227)(a)配列番号22710の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22720の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(228)(a)配列番号22810の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22820の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(229)(a)配列番号22910の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22920の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(230)(a)配列番号23010の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号23020の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;あるいは
(231)(a)配列番号23110の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号23120の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列。
(212)(a)配列番号21210の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21220の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(213)(a)配列番号21310の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21320の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(214)(a)配列番号21410の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21420の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(215)(a)配列番号21510の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21520の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(216)(a)配列番号21610の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21620の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(217)(a)配列番号21710の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21720の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(218)(a)配列番号21810の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21820の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(219)(a)配列番号21910の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号21920の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(220)(a)配列番号22010の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22020の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(221)(a)配列番号22110の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22120の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(222)(a)配列番号22210の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22220の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(223)(a)配列番号22310の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22320の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(224)(a)配列番号22410の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22420の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(225)(a)配列番号22510の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22520の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(226)(a)配列番号22610の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22620の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(227)(a)配列番号22710の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22720の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(228)(a)配列番号22810の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22820の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(229)(a)配列番号22910の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号22920の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;
(230)(a)配列番号23010の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号23020の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列;あるいは
(231)(a)配列番号23110の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列、及び/または(b)配列番号23120の核酸配列に対し少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列。
また、本開示は、本明細書で開示する核酸のいずれかを含むことができる単離細胞にも関する。
いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または哺乳類細胞、任意選択でヒト細胞、さらに任意選択でCHOもしくはHEK細胞とすることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト免疫細胞、任意選択でT、NK、Bまたは樹状細胞とすることができる。
本開示はさらに、本明細書で開示する抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントまたはCARを発現させる方法に関する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)本開示の抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントまたはCARを発現する細胞を、発現を可能にする条件下で培養することと、(b)任意選択で、抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントまたはCARを、細胞または細胞を含む培養基から単離することとを含むことができる。
本開示はさらに、CoV-Sに特異的に結合する抗体または抗原結合抗体フラグメントを同定する方法に関する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)SARS-CoVまたはSARS-CoV-2に感染した患者から得られた抗血清及び/またはB細胞を得ること(任意選択で、当該患者は、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2感染から回復した、または当該患者は、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2に感染した回復期患者である)と、(b)当該抗血清及び/またはB細胞をCoV-Sに接触させることと、(c)CoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することとを含む。任意選択で、CoV-Sは、SARS-CoVのスパイクタンパク質(「SARS-CoV-S」)またはSARS-CoV-2のスパイクタンパク質(「SARS-CoV-2-S」)である。さらに任意選択で、CoV-Sは、配列番号1(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)または配列番号5(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)のアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、CoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントがコロナウイルス感染性またはコロナウイルス増殖を中和、ブロック、または阻害することを検出することができ、任意選択で、当該コロナウイルスはSARS-CoVまたはSARS-CoV-2である。
ある特定の実施形態において、当該方法はさらに、CoV-Sに特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体フラグメントが、他のコロナウイルス(任意選択で、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される)に結合するかどうかを検出することができる。
このような検出方法のいずれかにおいて、当該方法はさらに、抗体またはその抗原結合抗体フラグメントの配列を決定することを含むことができる。
いくつかの実施形態において、これらの配列は、特定のCoV-Sに対する結合親和性を強化する及び/または潜在的に特異性を増加させるように親和性成熟または変異させることができる。
本開示はさらに、(a)本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(b)医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物を提供する。
本開示はさらに、対象がSARS-CoVもしくはSARS-CoV-2または別のコロナウイルスに感染したかどうかを判定する方法を提供し、これは、本明細書で開示する少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメントとの免疫反応に基づき、対象からの生物学的試料がSARS-CoV-Sタンパク質もしくはSARS-CoV-S-2タンパク質またはそれに相同な別のコロナウイルスSタンパク質を含み得るかどうかを検出することによって行う。試料は、任意選択で、血液、血漿、リンパ液、粘液、尿、及び/または糞便とすることができる。任意選択で、SARS-CoV Sは、配列番号1のアミノ酸配列(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)を含むことができる。
代替的に、SARS-CoV-2は、配列番号5のアミノ酸配列(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)を含むことができる。
このような判定方法は、任意選択で、ELISAまたはラジオイムノアッセイを含むことができる。
このような判定方法において、対象は任意選択で、ヒト、コンパニオンアニマル(例えば、イヌまたはネコ)、農業用動物(例えば、食肉生産に使用する動物)であってもよく、動物園の動物(例えば、トラまたはライオン)を含んでもよい。
このような判定方法において、試料は任意選択で、対象から異なる時期に試料を採取し、対象が回復したかどうかを評価するために、SARS-CoV-S、SARS-CoV-S-2、またはそれに相同な他のコロナウイルスのSタンパク質の有無またはレベルを検出することができる。ここで、SARS-CoV Sは、配列番号1(SARS-CoV-S、1288アミノ酸、アクセッション番号PDB:6VSB_B)のアミノ酸配列を含むことができ、任意選択で、SARS-CoV-2は、配列番号5(SARS-CoV-2-S、1273アミノ酸、GenBank:QHD43416.1)のアミノ酸配列を含むことができる。
本開示はさらに、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63から選択され得る別のコロナウイルスに対する免疫応答の誘発を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメントを投与することを含むことができる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(例えば、同じまたは異なるCoV-Sの同じまたは異なるエピトープに結合する)本開示の異なる抗体または抗原結合抗体フラグメントのカクテルを投与することを含むことができる。
ある特定の実施形態において、免疫応答は、少なくとも1つのコロナウイルス、任意選択でSARS-CoVまたはSARS-CoV-2、さらに任意選択で別のコロナウイルスに対する免疫保護(任意選択でその延長)を誘発する。
本開示はさらに、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2または別のコロナウイルス(例えば、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63)の感受性細胞への感染の阻害またはブロックを、それを必要とする対象において行う方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメント(例えば、上述のようなカクテル)を投与することを含むことができる。
本開示はさらに、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、または任意選択で別のコロナウイルス(例えば、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63)による感染を治療する方法、あるいは当該感染に関連する状態、症状、疾患、または障害の治療を、それを必要としている対象において行う方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメント、ADCまたはCAR(例えば、上述のようなカクテル)の治療有効量を対象に投与することを含むことができる。
いくつかの実施形態において、状態、症状、疾患、または障害は、気管支炎、肺炎、呼吸不全、急性呼吸不全、臓器不全、多臓器系不全、小児多系統炎症性症候群、急性呼吸窮迫症候群、血栓、心臓状態、心筋障害、心筋炎、心不全、心停止、急性心筋梗塞、不整脈、静脈性血栓塞栓症、集中治療後症候群、ショック、アナフィラキシーショック、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、虚血性脳卒中、脳内出血、微小血管障害性血栓症、精神障害、痙攣、非痙攣性てんかん重積状態、外傷性脳損傷、脳卒中、無酸素性脳損傷、脳炎、可逆性白質脳症、壊死性脳症、感染後脳炎、自己免疫媒介性脳炎、急性散在性脳脊髄炎、急性腎損傷、急性肝損傷、膵損傷、免疫性血小板減少症、亜急性甲状腺炎、胃腸合併症、アスペルギルス症、別のウイルスもしくは細菌への感受性増加、及び/または妊娠関連合併症、のうちの少なくとも1つを含む。
また、本開示は、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より任意選択で選択される他のコロナウイルスによる感染の防止を、それを必要とする対象において行う方法も提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメント、ADCまたはCAR(例えば、上述のようなカクテル)の予防有効量を対象に投与することを含むことができる。
また、本開示は、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より任意選択で選択される別のコロナウイルスに感染した対象が人工呼吸器を装着する必要性を防止する方法、あるいはSARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より任意選択で選択される別のコロナウイルスに感染した対象が人工呼吸器を装着する時間を低減する方法も提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメント、ADCまたはCAR(例えば、上述のようなカクテル)の予防有効量または治療有効量を対象に投与することを含むことができる。
本開示は、SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より任意選択で選択される別のコロナウイルスに感染した対象における肺炎の発症を防止する方法、あるいはSARS-CoVもしくはSARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より任意選択で選択される別のコロナウイルスに感染した対象における肺炎及び/または肺炎の症状を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、当該方法は、本開示の少なくとも1つの抗体または抗原結合抗体フラグメント、ADCまたはCAR(例えば、上述のようなカクテル)の予防有効量または治療有効量を対象に投与することを含むことができる。
このような方法のいずれにおいても、対象は任意選択でヒトであってもよく、コンパニオンアニマル、農業用動物、または動物園の動物を含んでもよい。
任意選択で、対象は、不良な臨床転帰に陥りやすくする少なくとも1つのリスク因子を有してもよい。
ある特定の実施形態において、リスク因子は、(i)高齢(例えば、55歳超、60歳超、または65歳超)、(ii)糖尿病、(iii)慢性呼吸疾患(例えば、喘息、嚢胞性線維症、別の線維性状態、またはCOPD)、(iv)肥満、(iv)高血圧、(v)心臓または心血管の状態(例えば、心臓の欠陥または異常)、(vi)慢性炎症または自己免疫疾患(例えば、ループスまたは多発性硬化症)、及び(vii)免疫低下状態(任意選択で、がん、化学療法、喫煙、骨髄もしくは臓器移植、免疫不全、制御が不十分なHIV感染もしくはAIDS、またはコルチコステロイドもしくは他の免疫抑制薬の長期使用によって引き起こされ得る)のうちの1つ以上を含むことができる。
ある特定の実施形態において、対象はさらに、少なくとも1つの他の薬物で治療されてもよい。ある特定の実施形態において、当該方法はさらに、対象に少なくとも1つの他の薬物を投与することを含む。任意選択で、このような1つの他の薬物は、(i)抗ウイルス薬(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、もしくはリトナビル)、(ii)駆虫薬(任意選択で、イベルメクチン)、(iii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコン)、(iv)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCG)、(v)抗炎症薬(任意選択で、ステロイド(例えば、シクレソニド)、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ)、もしくはメタミゾール)、(vi)抗ヒスタミン薬(任意選択で、ベポタスチン)、(vii)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリル)、及び/または(viii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、セリンプロテアーゼ阻害剤、さらに任意選択で、ナファモスタット)とすることができる。
ある特定の実施形態において、対象はさらに、少なくとも1つの他の薬物で治療されてもよい。ある特定の実施形態において、当該方法はさらに、対象に少なくとも1つの他の薬物を投与することを含む。任意選択で、このような1つの他の薬物は、(i)抗ウイルス薬(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、もしくはリトナビル)、(ii)駆虫薬(任意選択で、イベルメクチン)、(iii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコン)、(iv)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCG)、(v)抗炎症薬(任意選択で、ステロイド(例えば、シクレソニド)、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ)、もしくはメタミゾール)、(vi)抗ヒスタミン薬(任意選択で、ベポタスチン)、(vii)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリル)、及び/または(viii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、セリンプロテアーゼ阻害剤、さらに任意選択で、ナファモスタット)とすることができる。
ある特定の実施形態において、対象をさらに、(I)抗ウイルス剤(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、またはリトナビル)、及び(II)少なくとも1つの他の薬物で治療することができる。ある特定の実施形態において、当該方法はさらに、対象に、(I)抗ウイルス剤(任意選択でレムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、またはリトナビル)、及び(II)少なくとも1つの他の薬物を投与することを含むことができる。任意選択で、少なくとも1つの他の薬物は、(i)駆虫薬(さらに任意選択で、イベルメクチン)、(ii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコン)、(iii)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCG)、または(iv)抗炎症薬(任意選択で、ステロイド(例えば、シクレソニド))、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ(toclizumab))、もしくはメタミゾール、(v)抗ヒスタミン薬(任意選択で、ベポタスチン)、(vi)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリル)、及び/または(vii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、セリンプロテアーゼ阻害剤(例えば、ナファモスタット))とすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示の抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ある特定のVH CDR3配列を有すること、またはある特定のVH CDR3に類似するVH CDR3配列を有することによって特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(i)VH及びVL、または(ii)VHを含むことができ、VHは、配列番号2108、21708、22208、22408、22608、または22708のアミノ酸配列を有するCDR3を含むことができる。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、VH及びVLを含むことができ、VHはさらに、以下のアミノ酸配列を有するCDR1及びCDR3を含むことができる:それぞれ配列番号2104及び2108、それぞれ配列番号21704及び21708、それぞれ配列番号22204及び22208、それぞれ配列番号22404及び22408、それぞれ配列番号22604及び22608、またはそれぞれ配列番号22704及び22708。
さらなる実施形態において、本発明の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(I)VH及びVL、または(II)VHを含むことができ、VH CDR3のアミノ酸配列は、(i)配列番号1508のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号1508と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(ii)配列番号1308のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号1308と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(iii)配列番号808のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号808と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(iv)配列番号108のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号108と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(v)配列番号2108のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号2108と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(vi)配列番号108のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号108と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(vii)配列番号208のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号208と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(viii)配列番号308のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号308と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(ix)配列番号8608のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号8608と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(x)配列番号12308のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号12308と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xi)配列番号13008のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号13008と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xii)配列番号14008のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号14008と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xiii)配列番号16208のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号16208と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xiv)配列番号17508のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号17508と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xv)配列番号21708のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号21708と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xvi)配列番号22208のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号22208と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xvii)配列番号22408のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号22408と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;(xviii)配列番号22608のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号22608と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;あるいは(xix)配列番号22708のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号22708と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる;あるいは(xx)配列番号23008のアミノ酸配列と同一であるか、または配列番号23008と1、2、もしくは3アミノ酸だけ異なる。
1つの実施形態において、抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、任意選択で、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、さらに任意選択で、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、それぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むことができる。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55951、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56010、ADI-56032、ADI-56046、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988からなる群、好ましくは、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988からなる群、任意選択で、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体のそれぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む別の抗体または抗原結合抗体フラグメントと特異的に競合することができる。
ある特定の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントはFc領域を含むことができる。Fc領域は、野生型配列またはバリアント配列を含むことができ、任意選択で、配列番号11、12、13、14、15、16、または17のアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-SのS1サブユニットに結合することができる。
ある特定の実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sの受容体結合ドメイン(RBD)またはN末端ドメイン(NTD)に結合することができる。
ある特定の実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-SのACE2結合モチーフに結合することができ、任意選択でさらに抗体CR3022のエピトープに結合することができる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントはACE2と競合することができる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(i)ACE2及び抗体CR3022と競合する場合もあれば、(ii)ACE2と競合するが抗体CR3022とは競合しない場合もある。ある特定の実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(a)SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2のSタンパク質に結合することができ、かつ(b)HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43のいずれのSタンパク質にも結合することができない。
ある特定の実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、(a)SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2のSタンパク質に結合することができ、さらに(b)HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43のうちの少なくとも1つのSタンパク質に結合することもできる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2を中和することができる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、in vitroで、100nMでSARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2を中和することができる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、任意選択で、本明細書の実施例に記載されているいずれかの中和アッセイによる測定において、in vitroで(i)約100nM以下、約50nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約5nM以下、約2nM以下、約1nM以下、約500pM以下、約200pM以下、約100pM以下、約50pM以下、約20pM以下、約10pM以下、約5pM以下、約2pM以下、もしくは約1pM以下のIC50で、及び/または(ii)約500ng/mL以下、約200ng/mL以下、約100ng/mL以下、約50ng/mL以下、約20ng/mL以下、約10ng/mL以下、約20ng/mL以下、約10mg/mL以下、約5ng/mL以下、約2ng/mL以下、もしくは約1ng/mL以下のIC50で、SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2を中和することができる。
さらなる実施形態において、単離抗体または抗原結合抗体フラグメントは、CoV-S(任意のCoVのSタンパク質(例えば、限定されるものではないが、SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-2-S))に、(i)100nM以下、(ii)10nM以下、(iii)1nM以下、(iv)100pM以下、(v)10pM以下、(vi)1pM以下、または(vii)0.1pM以下のKD値で結合することができる。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは静脈内に投与される。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは筋肉内に投与される。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、約100mg~約2000mg、約200mg~約1500mg、約300mg~約600mg、約500mg~約1200mg、または約300mg~約1200mgの用量で投与される。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、約200mg、約300mg、約400mg、約500mg、約600mg、約700mg、約800mg、約900mg、約1000mg、約1100mg、約1200mg、約1300mg、約1400mg、約1500mg、約1600mg、約1700mg、約1800mg、約1900mgまたは約2000mgの用量で投与される。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、筋肉内に約300mg、静脈内に約500mg、筋肉内に約600mg、または静脈内に約1200mgの用量で投与される。
1つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは1回投与される。1つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは週1回投与される。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、1日1回、週1回、2週間に2回、月1回、または2か月に1回投与される。1つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、週1回で約4週間、週1回で約1か月間、週1回で約5週間、週1回で約6週間、週1回で約7週間、または週1回で約2か月間投与される。
1つの態様において、本開示は、(a)本明細書で開示する少なくとも1つの単離抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(b)当該抗体または抗原結合抗体フラグメントを使用するための説明とを含むキットにも関する。
いくつかの実施形態において、キットは、(i)対象内にCoVが存在するかどうかを判定すること、(ii)対象がCoV感染を有するかどうかを診断すること、(iii)CoVワクチンが防御免疫応答を誘発するかどうかを予測すること、または(iv)CoVワクチンが中和抗体応答を誘発するかどうかを予測することに使用するためのものとすることができる。
1つの態様において、本明細書では、CoV感染の防止または治療における抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントのin vivoでの有効性を予測する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象、または少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象に由来する細胞試料を準備することと、(b)抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントを当該少なくとも1例の第1の試験対象及び当該少なくとも1例の第2の対象に投与すること、または当該第1及び第2の対象からの細胞試料を当該抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントに接触させることと、(c)当該少なくとも1例の第1の試験対象及び当該少なくとも1例の第2の対象にCoVもしくは偽CoVを感染させるか、または当該少なくとも1例の第1の試験対象及び当該少なくとも1例の第2の対象から得られた細胞試料にCoVもしくは偽CoVを感染させることと、(d)(b)における抗体または抗原結合抗体フラグメントの投与が、好適な対照と比較して、(I)CoV関連症状の低減、(II)CoVウイルス血症の低減、(III)生存率の増加、(IV)体重の増加、または(V)抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントに接触させていない対照細胞試料と比較して、試験細胞試料の細胞への感染もしくは細胞中のウイルス増殖の低減、のうちの1つ以上をもたらすかどうか判定することとを含むことができる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)少なくとも1つの第1の細胞試料及び少なくとも1つの第2の細胞試料を準備することと、(b)少なくとも1つの第1の細胞試料を抗体または抗原結合抗体フラグメントに接触させることと、(c)当該少なくとも1つの第1の細胞試料及び少なくとも1つの第2の細胞試料をCoVまたは偽CoVに感染させることと、(d)抗体または抗原結合抗体フラグメントが、好適な対照と比較して、抗体または抗原結合抗体フラグメントに接触させていない対照細胞試料と比較して、試験細胞試料の細胞における(I)細胞生存率の増加、(II)細胞の感染の低減、(III)ウイルス増殖の低減、(IV)細胞ストレスもしくは死マーカーの低減、または(V)炎症性サイトカインの低減、のうちの1つ以上をもたらすかどうか判定することとを含むことができる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象、または少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象に由来する細胞試料を準備することと、(b)CoVもしくは偽CoVを当該少なくとも1例の第1の試験対象及び当該少なくとも1例の第2の対象に感染させるか、または少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象に由来する細胞試料に感染させることと、(c)抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントを当該少なくとも1例の第2の対象に投与するか、または少なくとも1例の第1の試験対象及び少なくとも1例の第2の対象に由来する細胞試料を抗体または抗原結合抗体フラグメントに接触させることと、(d)(c)における抗体または抗原結合抗体フラグメントの投与が、(I)CoV関連症状の低減、(II)CoVウイルス血症の低減、(III)生存率の増加、(IV)体重の増加、または(V)抗体もしくは抗原結合抗体フラグメントに接触させていない対照細胞試料と比較して、試験細胞試料の細胞への感染もしくは細胞中のウイルス増殖の低減、のうちの1つ以上をもたらすかどうかを判定することとを含むことができる。
いくつかの実施形態において、当該方法は、(a)少なくとも1つの第1の細胞試料及び少なくとも1つの第2の細胞試料を準備することと、(b)当該少なくとも1つの第1の細胞試料及び少なくとも1つの第2の細胞試料にCoVまたは偽CoVを感染させることと、(c)当該少なくとも1つの第1の細胞試料を抗体または抗原結合抗体フラグメントに接触させることと、(d)抗体または抗原結合抗体フラグメントが、好適な対照と比較して、抗体または抗原結合抗体フラグメントと接触させない対照細胞試料と比較して、試験細胞試料の細胞における(I)細胞生存率の増加、(II)細胞の感染の低減、(III)ウイルス増殖の低減、(IV)細胞ストレスまたは死マーカーの低減、または(V)炎症性サイトカインの低減、のうちの1つ以上をもたらすかどうかを判定することとを含むことができる。
1つの態様において、本明細書では、CoVまたはCoV-Sに結合する抗体または抗原結合抗体フラグメントをスクリーニングする方法が提供され、当該方法は、本明細書で開示するいずれかの抗体の1、2、3、4、5、または6つのCDRを含む抗体または抗原結合抗体フラグメントが、以下の特徴:(i)CoVのSタンパク質に結合する;(ii)CoV-SのS1サブユニットに結合する;(iii)CoV-SのRBDに結合する;(iv)CoV-SのNTDに結合する;(v)CoV-SのACE2結合モチーフに結合する;(vi)ACE2と競合する;(vii)抗体CR3022と競合する;(viii)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上を中和する;(ix)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上の偽ウイルスを中和する;(x)抗体または抗原結合抗体フラグメントと接触させてない対照細胞試料と比較して、感受性のある試験細胞試料における細胞への感染または細胞中のウイルス増殖の低減をもたらす;あるいは(xi)in vivoでCoV感染を防止または治療する、のうちの1つ以上を含み得るかどうかを含む。スクリーニングする際、本明細書で開示するいずれかの抗体、及び/または本明細書で開示する抗体のCDRの1つ以上を含む抗体を候補抗体または対照抗体として使用することができる。
1つの態様において、本開示は、少なくとも1つの親和性が成熟した第1の抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントと、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物にも関する。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つの第1の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3を含むVHと、VL CDR1 VL CDR2、VL CDR3を含むVLとを含むことができ、当該VH CDR1、当該VH CDR2、当該VH CDR3、当該VL CDR1、当該VL CDR2、及び当該VL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、それぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一である。
特定の実施形態において、当該第1の抗体または抗原結合抗体フラグメントのVH及びVLは、ADI-58120、ADI-58122、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、ADI-58130、ADI-58131、及びADI-58130_LCN30cQからなる群より選択される抗CoV-S抗体の、それぞれVH及びVLであり得る。
いくつかの実施形態において、第1の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、Fc領域を含むことができ、任意選択で、Fc領域は、配列番号11、12、13、14、15、16、または17のアミノ酸配列を含むことができる。
1つの実施形態において、第1の抗体または抗原結合抗体フラグメントのHC及びLCは、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、それぞれHC及びLCである。
ある特定の実施形態において、組成物はさらに、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3を含むVHと、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3を含むVLとを含む、少なくとも1つの第2の抗体または抗原結合抗体フラグメントを含むことができる。特定の実施形態において、当該VH CDR1、当該VH CDR2、当該VH CDR3、当該VL CDR1、当該VL CDR2、及び当該VL CDR3のアミノ酸配列は、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、及びADI-59988からなる群より選択される抗CoV-S抗体の、それぞれVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3のアミノ酸配列と同一であり得る。
いくつかの実施形態において、第2の抗体または抗原結合抗体フラグメントは、Fc領域を含むことができ、任意選択で、Fc領域は、配列番号11、12、13、14、15、16、または17のアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態において、本開示に従う抗体または抗原結合抗体フラグメントは、以下のものを含むことができる:
(217)配列番号21701のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21711のアミノ酸配列を含むLC;
(218)配列番号21801のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21811のアミノ酸配列を含むLC;
(219)配列番号21901のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21911のアミノ酸配列を含むLC;
(220)配列番号22001のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22011のアミノ酸配列を含むLC;
(221)配列番号22101のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22111のアミノ酸配列を含むLC;
(222)配列番号22201のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22211のアミノ酸配列を含むLC;
(223)配列番号22301のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22311のアミノ酸配列を含むLC;
(224)配列番号22401のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22411のアミノ酸配列を含むLC;
(225)配列番号22501のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22511のアミノ酸配列を含むLC;
(226)配列番号22601のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22611のアミノ酸配列を含むLC;
(227)配列番号22701のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22711のアミノ酸配列を含むLC;
(228)配列番号22801のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22811のアミノ酸配列を含むLC;
(229)配列番号22901のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22911のアミノ酸配列を含むLC;
(230)配列番号23001のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号23011のアミノ酸配列を含むLC;または
(231)配列番号23101のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号23111のアミノ酸配列を含むLC。
(217)配列番号21701のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21711のアミノ酸配列を含むLC;
(218)配列番号21801のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21811のアミノ酸配列を含むLC;
(219)配列番号21901のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号21911のアミノ酸配列を含むLC;
(220)配列番号22001のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22011のアミノ酸配列を含むLC;
(221)配列番号22101のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22111のアミノ酸配列を含むLC;
(222)配列番号22201のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22211のアミノ酸配列を含むLC;
(223)配列番号22301のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22311のアミノ酸配列を含むLC;
(224)配列番号22401のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22411のアミノ酸配列を含むLC;
(225)配列番号22501のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22511のアミノ酸配列を含むLC;
(226)配列番号22601のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22611のアミノ酸配列を含むLC;
(227)配列番号22701のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22711のアミノ酸配列を含むLC;
(228)配列番号22801のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22811のアミノ酸配列を含むLC;
(229)配列番号22901のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号22911のアミノ酸配列を含むLC;
(230)配列番号23001のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号23011のアミノ酸配列を含むLC;または
(231)配列番号23101のアミノ酸配列を含むHC及び配列番号23111のアミノ酸配列を含むLC。
さらなる実施形態において、本開示に従う組成物は、(A)上記のような(217)~(231)のHCとLCとの組合せを含む抗体または抗原結合抗体フラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの第1の抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(B)医薬的に許容される担体または賦形剤とを含むことができる。
またさらなる実施形態において、組成物はさらに、上記のような(217)~(231)のHCとLCとの組合せを含む抗体または抗原結合抗体フラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの第2の抗体または抗原結合抗体フラグメントを含むことができる。
さらに、本開示はさらに、本明細書に記載の抗CoV抗体またはその抗原結合抗体フラグメントのいずれか1つ以上との結合に関して競合する単離抗体及びその抗原結合抗体フラグメントを包含する。
また、本開示は、本明細書に記載の抗CoV抗体またはその抗原結合抗体フラグメントのいずれか1つ以上と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合抗体フラグメントも包含する。
本開示はさらに、本明細書に記載の抗CoV抗体またはその抗原結合抗体フラグメントのいずれか1つ以上の親和性成熟バリアントを包含する。
1つの態様において、本明細書では、SARS-CoV、SARS-CoV-2、及び/または任意選択でMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスによるコロナウイルス感染の治療を、それを必要とする対象において行う方法が開示され、当該方法は、対象に、ADI-58125と同じエピトープに結合する、及び/またはADI-58125との結合に関して競合する抗体またはその抗原結合抗体フラグメントの治療有効量を投与することを含む。
1つの態様において、本明細書では、SARS-CoV、ARS-CoV-2、及び/または任意選択でMERS-CoV、HCoV-HKU1、及びHCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスに感染した患者の死亡率、入院、機械的換気、またはこれらの組合せのリスクを減少させる方法が開示され、当該方法は、対象に、ADI-58125と同じエピトープに結合する、及び/またはADI-58125との結合に関して競合する単離抗体またはその抗原結合抗体フラグメントの治療有効量を投与することを含む。
別の態様において、本明細書では、SARS-CoV、SARS-CoV-2、及び/または任意選択でMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスによる対象の感染を防止する方法が開示され、当該方法は、対象に、ADI-58125と同じエピトープに結合する、及び/またはADI-58125との結合に関して競合する単離抗体またはその抗原結合抗体フラグメントの治療有効量を投与することを含む。
1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55688である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55689である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55690である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55691である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55692である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55693である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55694である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55695である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55696である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55697である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55698である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55699である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55700である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55701である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55702である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55703である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55704である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55705である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55706である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55707である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55708である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55709である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55710である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55711である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55712である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55713である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55714である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55715である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55716である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55717である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55718である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55719である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55721である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55722である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55723である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55724である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55725である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55726である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55727である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55728である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55729である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55730である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55731である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55732である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55733である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55734である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55735である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55736である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55737である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55738である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55739である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55740である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55741である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55742である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55743である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55744である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55745である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55746である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55747である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55748である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55749である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55750である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55751である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55752である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55753である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55754である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55755である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55756である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55757である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55758である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55720である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55760である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55761である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55762である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55763である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55765である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55766である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55767である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55769である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55770である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55771である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55775である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55776である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55777である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55950である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55951である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55952である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55953である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55954である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI
-55955である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55956である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55957である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55958である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55959である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55960である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55961である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55962である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55963である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55964である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55965である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55966である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55967である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55968である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55969である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55970である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55972である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55973である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55974である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55975である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55976である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55977である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55978である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55979である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55980である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55981である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55982である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55984である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55986である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55988である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55989である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55990である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55992である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55993である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55994である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55995である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55996である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55997である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55998である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55999である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56000である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56001である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56002である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56003である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56004である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56005 ADI-56006である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56007である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56008である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56009である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56010である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56011である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56012である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56013である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56014である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56015である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56016である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56017である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56018である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56019である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56020である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56021である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56022である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56023である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56024である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56025である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56026である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56027である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56028である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56029である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56030である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56031である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56032である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56033である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56034である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56035である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56037である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56038である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56039である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56040である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56041である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56042である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56043である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56044である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56045である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56046である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56047である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56048である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56049である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56050である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56051である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体ま
たはその抗原結合フラグメントは、ADI-56052である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56053である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56054である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56055である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56056である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56057である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56058である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56059である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56061である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56062である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56063である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56064である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56065である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56066である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56067である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56068である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56069である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56070である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56071である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56072である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56073である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56074である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56075 ADI-56076である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56078である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56079である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56080である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56081である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56082である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56083である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56084である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56443である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56479である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58120である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58121である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58122である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58123である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58124である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58125である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58126である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58127である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58128である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58129である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58130である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58131である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58130_LCN30cQである。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-59988である。
-55955である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55956である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55957である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55958である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55959である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55960である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55961である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55962である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55963である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55964である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55965である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55966である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55967である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55968である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55969である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55970である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55972である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55973である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55974である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55975である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55976である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55977である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55978である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55979である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55980である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55981である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55982である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55984である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55986である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55988である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55989である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55990である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55992である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55993である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55994である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55995である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55996である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55997である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55998である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-55999である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56000である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56001である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56002である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56003である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56004である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56005 ADI-56006である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56007である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56008である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56009である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56010である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56011である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56012である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56013である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56014である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56015である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56016である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56017である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56018である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56019である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56020である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56021である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56022である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56023である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56024である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56025である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56026である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56027である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56028である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56029である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56030である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56031である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56032である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56033である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56034である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56035である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56037である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56038である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56039である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56040である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56041である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56042である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56043である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56044である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56045である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56046である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56047である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56048である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56049である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56050である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56051である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体ま
たはその抗原結合フラグメントは、ADI-56052である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56053である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56054である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56055である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56056である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56057である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56058である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56059である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56061である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56062である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56063である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56064である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56065である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56066である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56067である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56068である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56069である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56070である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56071である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56072である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56073である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56074である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56075 ADI-56076である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56078である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56079である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56080である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56081である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56082である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56083である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56084である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56443である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-56479である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58120である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58121である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58122である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58123である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58124である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58125である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58126である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58127である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58128である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58129である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58130である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58131である。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58130_LCN30cQである。1つの実施形態において、図1、図2、または図36の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-59988である。
A.定義
本開示は、記載されている特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、及び試薬に限定されるものではなく、そのため変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、本開示の範囲は付属の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。本明細書で使用する単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの細胞」という言及には複数のこのような細胞が含まれ、「当該タンパク質」と言及された場合、1つ以上のタンパク質及び当業者に知られているその等価物への言及が含まれる、というようになる。本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、別段の指示がない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
本開示は、記載されている特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、及び試薬に限定されるものではなく、そのため変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、本開示の範囲は付属の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。本明細書で使用する単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの細胞」という言及には複数のこのような細胞が含まれ、「当該タンパク質」と言及された場合、1つ以上のタンパク質及び当業者に知られているその等価物への言及が含まれる、というようになる。本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、別段の指示がない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
スパイクタンパク質(Sタンパク質):本明細書で使用する場合、別段の記載がない限り、Sタンパク質は、任意のコロナウイルス形態のSタンパク質を含む。コロナウイルスSタンパク質(「CoV-S」)という用語は、任意のコロナウイルスのSタンパク質を表すために使用される。詳細には、「SARS-CoV-S」及び「SARS-CoV-2-S」は、SARS-CoVのSタンパク質及びSARS-CoV-2のSタンパク質を包含する。配列番号1は、1288アミノ酸を含むSARS-CoV-Sの例示的なポリペプチド配列である(アクセッション番号PDB:6VSB_B)。配列番号5は、1273アミノ酸を含むSARS-CoV-2-Sの例示的なポリペプチド配列である(GenBank:QHD43416.1)。配列番号2(3864ヌクレオチド)はSARS-CoV-S(配列番号1)をコードし、配列番号6(3822ヌクレオチド、NC_045512:21563.25384、GenBank:MN908947の対応領域も参照)は、SARS-CoV-2-S(配列番号5)をコードする。
いくつかの実施形態において、「SARS-CoV-S」及び「SARS-CoV-2-S」は、配列番号1及び5の任意の変異体、スプライスバリアント、アイソフォーム、オルソログ、ホモログ、及びバリアントを包含する。いくつかの実施形態において、CoV-Sは、配列番号1または配列番号5のいずれかに対し少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
本明細書における「CoV感染の有効な治療または防止」とは、抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与した後に、対象からCoVを除去すること、対象におけるCoVの拡大を防止すること、または症状(例えば、発熱、咳、息切れ、鼻水、うっ血、結膜炎、及び/または胃腸症状)を除去または低減することを指す。いくつかの場合において、有効な治療は、対象が人工呼吸器を装着する必要性をなくすか、または人工呼吸器を装着する必要がある時間を低減することができる。治療は、単剤療法として、または別の活性薬剤(例えば、例として抗ウイルス剤または抗炎症剤)とともにもたらされ得る。
本明細書で使用する場合、「治療」とは、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の目的において、有益なまたは所望の臨床結果には、限定されるものではないが、COV-S関連状態(例えば、発熱または咳)の任意の側面における改善の1つ以上が含まれる。例えば、CoV感染治療の文脈において、これには重症度の軽減、発熱、咳、息切れ、及び他の関連症状の軽快化、再発頻度の低減、CoV関連症状を患う者のクオリティーオブライフの向上、ならびにCoV関連症状の治療に必要とされる他の薬物の用量の減少が含まれる。他の関連症状としては、限定されるものではないが、下痢、結膜炎、嗅覚消失、味覚消失が挙げられる。さらに他の軽快化または防止され得る症状としては、炎症、サイトカインストーム、及び/または敗血症が挙げられる。
「発生率の低減」または「予防」または「防止」とは、特定の疾患、状態、症状、または障害における重症度のいずれかの低減を意味する(疾患、状態、及び障害という用語は、本出願全体において互換的に使用される)。重症度の低減には、概して状態に使用される薬物及び/または治療法を低減することが含まれ、この低減は例えば、薬物または治療法の必要性、量、及び/または曝露を減らすことによって行われる。また、重症度の低減には、特定の状態、症状、または障害の持続期間、及び/または頻度を低減することも含まれる(例えば、個体における次のエピソード発作までの時間を遅らせる、または増加させることも含まれる)。これにはさらに、対象が人工呼吸器を装着する必要性をなくすこと、または対象が人工呼吸器を装着する必要のある時間を低減することが含まれる。
CoV感染症に関連する1つ以上の症状の「緩和」とは、抗CoV-Sアンタゴニスト抗体を投与しない場合と比較して、1つ以上の症状、例えば、発熱、咳、または息切れが軽減または改善されることを意味する。また、「緩和」には、症状の持続期間の短縮または低減も含まれる。この場合もまた、これには対象が人工呼吸器を装着する必要性をなくすこと、または対象が人工呼吸器を装着する必要のある時間を低減することが含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「CoV関連症状の制御」または別のCoV-S関連症状の「制御」とは、(治療前のレベルと比較して)状態の1つ以上の症状の重症度または持続期間を維持または低減することを指す。例えば、症状の持続期間または重症度または頻度は、治療前のレベルと比較して、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%のいずれかだけ低減される。症状の持続期間または重症度または頻度の低減は、例えば、2週間、4週間(1か月)、8週間(2か月)、16週間(3か月)、4か月、5か月、6か月、9か月、12か月など、任意の長さの時間で継続し得る。
本明細書で使用する場合、CoV-S関連状態(例えば、息切れ、気管支炎、肺炎(例えば、間質性))の発生を「遅らせる」とは、状態または疾患の進行を延期、妨害、低速化、遅延、安定化、及び/または先に延ばすことを意味する。この遅らせる時間の長さは、状態または疾患の履歴、及び/または治療される個体に応じて異なり得る。当業者には明らかなように、十分または大幅に遅らせることは、個体が症状を生じないという点において、実際上、防止することを包含し得る。症状の発生を「遅らせる」方法は、その方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠の中でその症状を生じる確率を低減する、及び/または所定の時間枠の中でその症状の程度を低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な数の対象を用いた臨床研究に基づいている。
咳や発熱などのCoV関連状態の「発生」または「進行」とは、障害の初期所見及び/または後に続く進行を意味する。咳または発熱の発生は、当技術分野で周知されているように、標準的な臨床技法を用いて検出可能であり、評価することができる。しかし、発生は、検出不可能な場合のある進行も指す。本開示の目的において、発生または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発生」には、出現(occurrence)、再発、及び発症が含まれる。本明細書で使用する場合、「発症」または「出現」には、初期の発症及び/または再発が含まれる。
本明細書で使用する場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効薬用量」または「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、及び/または挙動的症状、その合併症、ならびに疾患の発症中に現れる中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクの排除もしくは低減、疾患の重症度の軽減、または疾患の発生の遅延などの結果が含まれる。治療的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、症状の強度、持続期間、もしくは頻度を低減すること、CoV感染から生じる1つ以上の症状(疾患発生中に示されるその合併症及び中間病態表現型を含む)を減少させること、疾患を患う者のクオリティーオブライフを高めること、疾患の治療に必要とされる他の医薬品の用量を減少させること、別の医薬品の効果を増強すること、及び/または患者の疾患進行を遅らせること、対象に人工呼吸器を装着する必要性をなくすか、もしくは対象に人工呼吸器を装着する必要がある時間を低減すること、といった臨床結果が含まれる。
有効薬用量は、1回以上の投与で投与することができる。本開示の目的において、薬物、化合物、または医薬組成物の有効薬用量は、予防的または治療的治療を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的文脈において理解されるように、有効薬用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成される場合も達成されない場合もある。したがって、「有効薬用量」は1つ以上の治療薬剤を投与する文脈で検討することができ、単一薬剤は、望ましい結果が1つ以上の他の薬剤と併せて達成され得るか、または達成される場合、有効量で投与されるとみなすことができる。
「好適な宿主細胞」または「宿主細胞」には、概して、容易に利用可能な技法及び材料を用いて、主題の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントを組換えにより産生することができる任意の細胞が含まれる。例えば、本開示の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、従来の技法に従って、遺伝子操作された宿主細胞で産生することができる。好適な宿主細胞は、外来性DNAを用いて形質転換または形質移入し、培養下で成長させることができる細胞タイプであり、これには細菌、真菌細胞(例えば、酵母)、及び培養された高等真核細胞(多細胞生物の培養細胞を含む)、特に哺乳類の培養細胞、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類細胞が含まれる。例示的な実施形態において、これらの抗体はCHO細胞で発現させることができる。クローン化されたDNA分子を操作し、外来性DNAを様々な宿主細胞に導入するための技法は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,editors,New York,NY:Green and Wiley and Sons(1993)に開示されている。
いくつかの例示的な実施形態において、抗体は、交配コンピテント酵母、例えば、培養可で成長させることができる任意の半数体、二倍体、または四倍体酵母で発現させることができる。発酵発現法に有用な酵母は、半数体、二倍体、または他の多倍体の形態で存在し得る。
本明細書における「選択マーカー」とは、遺伝子または遺伝子フラグメントであって、例えば形質転換イベントを通じて、その遺伝子を受け取った細胞に成長表現型(物理的成長特性)を付与する、遺伝子または遺伝子フラグメントを指す。選択マーカーは、その選択マーカー遺伝子を受け取らない細胞が成長することができない条件下で、選択的成長培地中で細胞が生存し、成長することを可能にする。選択マーカー遺伝子は、概していくつかのタイプに分類され、これには正の選択マーカー遺伝子(例えば、2つの温度感受性(ts)変異体を交配した場合またはts変異体を形質転換した場合に、抗生物質または他の薬物、温度に対する耐性を細胞に付与する遺伝子)、負の選択マーカー遺伝子(例えば、その生合成遺伝子を有しない全ての細胞が必要とする特定の栄養素なしの培地中で成長する能力を細胞に付与する生合成遺伝子、または野生型遺伝子を有しない細胞によって成長できない能力を細胞に付与する変異誘発された生合成遺伝子)などが含まれる。
本明細書における「発現ベクター」とは、標的宿主細胞(例えば、細菌、昆虫、酵母、植物、両生類、爬虫類、鳥類、または哺乳類細胞(例えば、CHOもしくはHEK細胞))内で外来タンパク質を発現するための操作を容易にする要素を含むDNAベクターを指す。配列の操作及び形質転換のためのDNAの産生は、最初に細菌宿主(例えば、E.coli)内で実施することが好都合であり、通常、ベクターは、このような操作を容易にする配列(細菌の複製起点及び適切な細菌選択マーカーを含む)を含むことになる。選択マーカーは、選択培養基中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養基中で生存できない。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素に対する耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、または(c)複合培地から利用できない不可欠な栄養を補給するタンパク質をコードする。酵母の形質転換のための例示的なベクター及び方法については、例えば、Burke,D.,Dawson,D.,& Stearns,T.,Methods in yeast genetics:a Cold Spring Harbor Laboratory course manual,Plainview,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)で説明されている。本開示の方法で使用するための発現ベクターは、酵母または哺乳類特異的配列(形質転換された宿主株を識別するための選択性栄養要求マーカーまたは薬物マーカーを含む)を含むことができる。薬物マーカーをさらに使用して、酵母宿主細胞内のベクターのコピー数を増幅させてもよい。
目的ポリペプチドをコードする配列は、転写及び翻訳の調節配列と作用可能に結合し、所望の宿主細胞(例えば、酵母または哺乳類細胞)内でのポリペプチドの発現をもたらす。これらのベクター構成要素としては、限定されるものではないが、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1つ以上を挙げることができる。また、ポリペプチドの分泌のための配列(例えば、シグナル配列など)も含むことができる。発現ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込むことができるため、複製起点(例えば、酵母または哺乳類の複製起点)は任意選択である。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作用可能に結合」する。例えば、シグナル配列のDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのDNAに作用可能に結合する。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に結合する。概して、「作用可能に結合」とは、結合しているDNA配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合には、連続し、かつリーディングフレームにあることを意味する。ただし、エンハンサーは近接していなくてもよい。結合は、好都合な制限部位でのライゲーションにより、または当業者によく知られているPCR/組み換え法(GATEWAY(登録商標)Technology(DNAクローニングの汎用的方法);Invitrogen,Carlsbad California)によって遂行される。このような部位が存在しない場合、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流(5’)(概して約100~1000bp以内)にある非翻訳配列であり、プロモーターが作用可能に結合している特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する。このようなプロモーターは、誘導性、構成性、及び抑制性プロモーター(抑制剤の不在に応答して転写レベルが増加する)といったいくつかのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化(例えば、栄養分の有無または温度の変化)に応答して、その制御下にあるDNAから転写レベル増加を開始することができる。
また、プロモーターフラグメントは、宿主細胞(例えば、酵母や哺乳類細胞)、ゲノム内の同じ部位に発現ベクターを相同組換えし組み込むための部位としても機能する。代替的に、選択マーカーを相同組換えの部位として使用することができる。異なる真核細胞及び原核細胞で使用するのに適したプロモーターは周知されており、市販されている。
目的ポリペプチドは、直接的に組換え産生するだけでなく、異種ポリペプチド(例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチド)との融合ポリペプチドとしても組換え産生することができる。概して、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクター内に挿入されるポリペプチドコード配列の一部であってもよい。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞(例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞)内で利用可能な標準的な経路の1つを通じて認識及び処理される配列である。さらに、これらのシグナルペプチド配列は、発現システム内で分泌の増強をもたらすように操作することができる。また、目的分泌シグナルには、哺乳類及び酵母のシグナル配列も含まれ、これは分泌されるタンパク質と異種であっても、分泌されるタンパク質のネイティブ配列であってもよい。シグナル配列はプレペプチド配列を含み、いくつかの場合にはプロペプチド配列を含むことがある。多くのこのようなシグナル配列が当技術分野で知られており、これには免疫グロブリン鎖上に見られるシグナル配列、例えば、K28プレプロトキシン配列、PHA-E、FACE、ヒトMCP-1、ヒト血清アルブミンシグナル配列、ヒトIg重鎖、ヒトIg軽鎖などが含まれる。例えば、Hashimoto et al.,Protein Eng.,11(2):75(1998);及びKobayashi et.al.,Therapeutic Apheresis,2(4):257(1998)を参照)。
ベクターに転写活性化配列を挿入することにより、転写を増加させることができる。これらのアクチベーターは、通常約10~300bpのDNAのシス作用性エレメントであり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。転写エンハンサーは方向及び位置に比較的非依存的であり、転写ユニットの5’及び3’側、イントロン内、ならびにコード配列自体の中に見出されている。エンハンサーは、コード配列に対し5’または3’側の位置で発現ベクターにスプライシングされてもよいが、プロモーターから5’側の部位に位置することが好ましい。
真核生物の宿主細胞で使用される発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含むことができる。このような配列は、一般的に真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの非翻訳領域内の3’から翻訳終止コドンまでが利用可能である。これらの領域は、ポリアデニル化されたフラグメントとしてmRNAの非翻訳部分に転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
上記に挙げた成分のうちの1つ以上を含む好適なベクターの構築には、標準的なライゲーション技法またはPCR/組換え法が用いられる。単離プラスミドまたはDNAフラグメントを切断し、調整し、所望の形態で再ライゲーションするか、または組換え法により、必要とされるプラスミドを生成する。構築したプラスミドが正しい配列であることを確認するための解析については、ライゲーション混合物を使用して宿主細胞を形質転換し、必要に応じて抗生物質耐性(例えば、アンピシリンまたはゼオシン)によって好結果の形質転換体を選択する。形質転換体からのプラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析され、及び/またはシークエンシングされる。
フラグメントの制限及びライゲーションに代わる方法として、特異的付着(「att」)部位及び組換え酵素に基づく組換え法を使用して、DNA配列をベクターに挿入することができる。このような方法は、例えば、Landy,Ann.Rev.Biochem.,58:913-949(1989)によって説明されており、及び当業者に知られている。このような方法は、ラムダ及びE.coli-コード組換えタンパク質の混合物によって媒介される分子間DNA組換えを利用する。組換えは、相互作用するDNA分子上のatt部位間で生じる。att部位の説明については、Weisberg and Landy,Site-Specific Recombination in Phage Lambda,in Lambda II,p.211-250,Cold Spring Harbor,NY.:Cold Spring Harbor Press(1983)を参照。組換え部位を挟むDNAセグメントが切り替えられて、組換え後のatt部位は各親ベクターから供与された配列から構成されたハイブリッド配列となる。組換えは任意のトポロジーのDNA間で生じ得る。
att部位は、目的配列を適切なベクターにライゲーションすること、特定のプライマーの使用によりatt B部位を含むPCR産物を生成すること、att部位を含む適切なベクターにクローニングしたcDNAライブラリーを生成することなどにより、目的配列に導入することができる。
本明細書で使用する場合、フォールディングとは、ポリペプチド及びタンパク質の三次元構造を指し、アミノ酸残基間の相互作用が構造を安定化するように作用する。非共有結合の相互作用は構造を決定する上で重要であるが、通常、目的タンパク質は、2つのシステイン残基によって形成される分子内及び/または分子間で共有結合しているジスルフィド結合を有する。天然のタンパク質及びポリペプチド、またはその誘導体及びバリアントについては、適切なフォールディングは、典型的には最適な生物学的活性をもたらす配置であり、活性に関するアッセイ(例えば、リガンド結合、酵素活性など)によって好都合にモニターすることができる。
いくつかの場合において、例えば目的産物が合成起源の場合、生物学的活性に基づくアッセイはあまり意味のあるものではなくなる。このような分子の適切なフォールディングは、物理的特性、エネルギー的考察、モデリング研究などに基づいて決定することができる。
発現宿主は、フォールディング及びジスルフィド結合形成を増強する1つ以上の酵素、すなわちフォルダーゼ、シャペロニンなどをコードする配列の導入により、さらに修飾することができる。このような配列は、当技術分野で知られているように、ベクター、マーカーなどを用いて、宿主細胞内で構成的または誘導的に発現させることができる。好ましくは、配列は、所望の発現パターンに十分な転写調節要素を含めて、標的化方法論によって酵母ゲノムに安定的に組み込まれる。
例えば、真核生物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(「PDI」)は、タンパク質のシステイン酸化及びジスルフィド結合異性化の効率的な触媒であるだけでなく、シャペロン活性も示す。PDIの同時発現により、複数のジスルフィド結合を有する活性タンパク質の産生が容易になる。また、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(「BIP」)、シクロフィリンなどの発現も関心対象となる。
哺乳類の培養細胞は、本開示の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するための例示的な宿主である。前述のように、CHO細胞は抗体の発現に特に適している。哺乳類細胞内でモノクローナル抗体を製造するための多くの手順が当技術分野で知られている(Galfre,G.and Milstein,C.,Methods Enzym.,73:3-46,1981;Basalp et al.,Turk.J.Biol.,24:189-196,2000;Wurm,F.M.,Nat.Biotechnol.,22:1393-1398,2004;及びLi et al.,mAbs,2(5):466-477,2010を参照)。以下でさらに詳しく述べるように、哺乳類モノクローナル抗体製造スキームで用いられる一般的な宿主細胞株としては、限定されるものではないが、ヒト胚網膜芽細胞株PER.C6(登録商標)(Crucell N.V.,Leiden,The Netherlands)、NS0マウス骨髄腫細胞(Medical Research Council,London,UK)、CV1サル腎細胞株、293ヒト胚腎細胞株、BHKベビーハムスター腎細胞株、VEROアフリカミドリザル腎細胞株、ヒト子宮頚癌細胞株HELA、MDCKイヌ腎細胞株、BRLバッファローラット肝細胞、W138ヒト肺細胞、HepG2ヒト肝細胞、MMTマウス乳腺腫瘍細胞、TRI細胞、MRC5細胞、Fs4細胞、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはチャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)卵巣(CHO)細胞などが挙げられる。組換えモノクローナル抗体の産生に有用で最適化された当技術分野で知られているCHO細胞の多くの異なるサブクローンまたはサブ細胞株、例えば、DP12(CHO K1 dhfr-)細胞株、NS0細胞は、アザグアニンに耐性を有するNS-1細胞の非Ig分泌、非軽鎖合成サブクローンである。他のチャイニーズハムスター及びCHO細胞は市販されており(ATCCなど)、これにはCHO-DXB11(CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO1-15、CHODP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745などが含まれ、いずれも様々なパラメーターに対し最適化するように遺伝子改変されている。モノクローナル抗体は、一般的には、哺乳類細胞株内でモノクローナル抗体鎖を発現させ、バイオリアクター内の組織培養基に分泌させる、バッチ供給法を用いて製造される。バイオリアクターに培地(またはフィード)を継続的に供給して、組換えタンパク質の発現を最大化する。次に、収集した培地から組換えモノクローナル抗体を精製する。いくつかの状況において、ジスルフィド結合の還元などを通じて抗体を再構築するために追加ステップが必要となる。このような産生方法は単一バッチで10,000L以上という大きな規模にスケール変更することができる。このような細胞株及び方法論の使用により、今や20pg/細胞/日を得、10g/L以上という高い力価がもたらされる(10kL~25kLのバイオリアクターからの15~100kgに相当)は通例的なことである(Li et al.,2010)。この産生方法論の様々な詳細(抗体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすること、このような発現ベクターを用いて細胞に形質移入すること、形質移入細胞を選択すること、ならびにこのような細胞から組換えモノクローナル抗体を発現及び精製することを含む)については、以下に示す。
哺乳類細胞内での抗CoV-S抗体または抗原結合フラグメントを組換え産生については、概して、抗体またはそのフラグメントをコードする核酸を複製可能なベクターに挿入して、さらにクローニング(DNAの増幅)または発現させる。抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするDNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離または合成される。概して、ベクター構成要素としては、限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1つ以上が挙げられる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、及び他のエレメントの選択は、当業者の水準内で日常的な設計事案である。多くのこのようなエレメントが当技術分野で知られており、供給業者を通じて入手可能である。
本開示の抗体は、直接的に組換え産生するだけでなく、異種ポリペプチド(好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチド)との融合ポリペプチドとしても組換え産生することができる。好ましく選択される相同または異種のシグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)配列である。哺乳類細胞の発現においては、哺乳類シグナル配列及びウイルス分泌リーダー(例えば、単純ヘルペスgDシグナル)が利用可能である。
このような発現ベクター及びクローニングベクターは、概して、ベクターが1つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAから独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスに関して周知されており、例えば、プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、2muプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起源(シミアンウイルス40(「SV40」)、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス(「VSV」)、またはウシパピローマウイルス(「BPV」)は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。概して、複製起点の構成要素は、哺乳類発現ベクターには必要ではない(SV40起点は、典型的には、初期プロモーターを含むという理由のみで使用され得る)。
またこれらのベクターは、典型的には、選択遺伝子(選択マーカーとも称される)を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン)への耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、または(c)複合培地から利用できない必須の栄養素を供給するタンパク質をコードする(例えば、BacilliのためにD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)。
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。薬物選択は、概して、外来DNAが挿入された哺乳類の培養細胞を選択するために使用される。このような細胞は一般に「形質移入体」と称される。選択薬剤の存在下で培養され、目的遺伝子を後代に伝えることができる細胞は、「安定性形質移入体」と称される。このような優勢選択の例として、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンといった薬物が使用されている。例示的な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシンタイプ薬物(例えば、G-418など)の存在下で行われる。首尾よく異種遺伝子が形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生するため、選択レジメンを生き延びる。
また、選択システムは、目的遺伝子の発現レベルを増やす(「増幅」と称されるプロセス)ためにも使用することができる。形質移入体の増幅は、典型的には、低レベルの選択薬剤の存在下で細胞を培養し、次に選択薬剤の量を増やして、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することによって行われる。哺乳類細胞の例示的な好適な選択マーカーは、抗体核酸の取込みにコンピテントな細胞の同定を可能にするマーカーであり、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(「DHFR」)、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-I及び-II、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
例えば、哺乳類細胞の増幅可能な選択マーカーとして、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼがある。他の薬物耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)も使用することができる。DHFR選択遺伝子を用いて形質転換した細胞は、最初にDHFRの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート(「MTX」)を含む培養基中で全ての形質転換体を培養することによって同定される。野生型DHFRを用いる場合に適切な宿主細胞は、DHFR活性が欠落したチャイニーズハムスター卵巣(「CHO」)細胞株である。
代替的に、抗体、野生型DHFRタンパク質、及び別の選択マーカー(例えば、アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼ(「APH」))をコードするDNA配列を用いて形質転換または同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、選択マーカーとしてアミノグリコシド抗生物質(例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはG-418)などの選択薬剤を含む培地中で細胞を成長させることによって選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
このようなベクターは、抗体をコードするDNAの転写を促進するエンハンサー配列を含むことができる。哺乳類遺伝子(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、及びインスリン)からの多くのエンハンサー配列が知られている。頻繁に使用されるエンハンサーは、真核細胞ウイルスに由来するものである。その例としては、複製起点の後方側(bp100-270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる(真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについてはYaniv,Nature,297:17-18(1982)も参照)。エンハンサーは、抗体コード配列に対し5’または3’側の位置でベクターにスプライシングされてもよいが、プロモーターから5’側の部位に位置することが好ましい。
発現ベクター及びクローニングベクターは概して、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作用可能に結合するプロモーターも含むと考えられる。真核生物のためのプロモーター配列が知られている。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位からおよそ25~30塩基上流に位置するATに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から70~80塩基上流に見られる別の配列は、CNCAAT領域である(Nは任意のヌクレオチドである)。ほとんどの真核遺伝子の3’末端にあるのは、AATAAA配列であり、これはコード配列の3’末端にポリAテールを付加するためのシグナルであり得る。これらの配列の全てが核発現ベクターに好適に挿入される。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス(例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、BPV、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、最も好ましくはSV40)のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーター(例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター(このようなプロモーターが宿主細胞システムに適合することを条件とする))によって制御することができる。
SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含むSV40制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして好都合に得られる。BPVをベクターとして用いて哺乳類宿主内でDNAを発現させるシステムは、米国特許第4,419,446号に開示されている。このシステムの修正版は米国特許第4,601,978号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下におけるマウス細胞内でのヒトベータインターフェロンcDNAの発現に関してはReyes et al.,Nature,297:598-601(1982)も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
強力な転写プロモーター(例えば、SV40、サイトメガロウイルス、または骨髄増殖性肉腫ウイルスからのプロモーター)を使用することができる。例えば、米国特許第4,956,288号及び米国特許公開第20030103986号を参照。他の好適なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子(米国特許第4,579,821号及び第4,601,978号)からのプロモーターならびにアデノウイルス主要後期プロモーターが挙げられる。哺乳類細胞で使用するための発現ベクターとしては、pZP-1、pZP-9、及びpZMP21(これらはAmerican Type Culture Collection,10801 University Blvd,Manassas,VA.USAにそれぞれアクセッション番号98669、98668、及びPTA-5266で寄託されている)、ならびにこれらのベクターの派生物が挙げられる。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞)で使用される発現ベクターは、概して、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’(及び場合によっては3’)非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分内にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026及びそこに開示されている発現ベクターを参照。
主題抗体のクローニングまたは発現に適した宿主細胞としては、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が挙げられる。ただし、脊椎動物の細胞への関心が最も高く、脊椎動物細胞を培養下で増殖させることが通例の手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-1(ATCC番号CRL1650)及びCOS-7(ATCC CRL1651));ヒト胚腎臓株(293または293細胞、浮遊培養下の成長のためにサブクローニングされたもの(ATCC番号CRL1573;Graham et al.,J.Gen.Virol.,36:59-72(1977));ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL10、ATCC番号CRL1632;BHK570、ATCC番号CRL10314);CHO細胞(CHO-K1、ATCC番号CCL61;CHO-DG44、Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);ヒト子宮頚癌細胞(HELA、ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB8065);マウス乳腺腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982));MRC5細胞;FS4細胞;ならびにヒトヘパトーマ株(Hep G2)が挙げられる。さらなる好適な細胞株は当技術分野で知られており、American Type Culture Collection,Manassas,VAなどの公的寄託機関から入手可能である。
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、上記で論じられているようにプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で培養される。
本開示の抗体を産生するために使用される哺乳類宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販の培地、例えば、Ham’s F10(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)、最小必須培地(「MEM」;Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)、Roswell Park Memorial Institute-1640培地(「RPMI-1640」;Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)、及びダルベッコ変法イーグル培地(「DMEM」;Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)が宿主細胞の培養に適している。さらに、Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;第4,657,866号;第4,927,762号;第4,560,655号;もしくは第5,122,469号;WO90/03430;WO87/00195、または米国特許再発行第30,985号で説明されているいずれの培地も、宿主細胞用の培養基として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じてホルモン及び/または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩)、バッファー(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン薬)、微量元素(通常マイクロモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充物質を当業者に知られているであろう適切な濃度で含めてもよい。温度、pHなどの培養条件は、発現に選択した宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。培地及び培養条件の開発及び最適化の方法は、当技術分野で知られている(Gronemeyer et al.,Bioengineering,1(4):188-212,2014を参照)。
培養条件を最適化し、好ましい細胞株クローンを選択した後、これらの細胞は、最も典型的には、特定の選択された細胞株のために最適化され、この目的において選択された培地及びフィードを細胞培養物に継続的に供給することを伴う、バイオリアクター(多くのモデルが市販されている)におけるバッチ供給プロセスで(接着細胞または浮遊培養のいずれかで)培養される(Butler,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,68:283-291,2005;及びKelley,B.,mAb,1(5):443-452,2009を参照)。また、培地及びフィードを継続的に供給するとともに、同じ量の培地をバイオリアクターから採取する灌流システムも利用可能である(Wurm,2004)。合成培地も市販されており、これは、(例えば、動物構成要素(例えば、ウシ血清アルブミンなど)の使用による)外部の供給源からの汚染の可能性を回避してバッチ供給培養で細胞を成長させるために利用可能である。ただし、細胞密度、培養物の生存率、及び生産性を高める助けとなる、動物構成要素を含まない加水分解物も市販されている(Li et al.,2010)。細胞培養液を最適化するための多くの研究(ローラーボトルで利用可能なヘッドスペース、成長期及び発現期の間の酸化還元電位、産生時にジスルフィド結合を維持するための還元剤の存在などに対する細心の注意を含む)が実施されている(例えば、Hutterer et al.,mAbs,5(4):608-613,2013;及びMullan et al.,BMC Proceed.,5(Suppl 8):P110,2011を参照)。組換えモノクローナル抗体産生中の有害な酸化の可能性に対処するために様々な方法論が開発されている(例えば、米国特許第8,574,869号を参照)。培養細胞は、栄養素を継続的にまたは別々の投与量として供給することにより、成長させることができる。多くの場合、様々なプロセスパラメーター(例えば、細胞濃度、pH、温度、CO2、dO2、オスモル濃度、代謝産物(例えば、グルコース、乳酸、グルタミン、及びグルタミン酸)の量など)が、較正された解析装置への直接接続によるオンライン、またはオペレーターの介入によるオフラインのいずれかで、細胞成長中にプローブを使用することによりモニターされる。また、培養ステップは、典型的には、細胞選択のために当技術分野で知られている任意の手段により、培養下で成長する細胞が形質移入された組換え遺伝子を維持することの保証も伴う。
発酵後、すなわち、細胞の成長及び組換えタンパク質の発現が最大に達したら、典型的には、培養ステップの後には採取ステップが続き、細胞は培地から分離され、採取された細胞培養基がそれにより得られる(Liu et al.,mAbs,2(5):480-499,2010を参照)。典型的には、培養の後には様々な精製ステップ(カラムクロマトグラフィーなどを含む)が続き、細胞構成要素及び細胞培養基構成要素から組換えモノクローナル抗体を分離する。この組換えモノクローナル抗体産生の段階で必要となる正確な精製ステップは、タンパク質の発現部位、すなわち細胞自体のサイトゾル内、または細胞培養基中に排泄される、より一般的に好まれるタンパク質の経路に依存する。様々な細胞構成要素は、当技術分野で知られている技法(例えば、分画遠心分離技法、重力ベースの細胞沈殿、及び/またはサイズ排除クロマトグラフ/ろ過技法(タンジェンシャルフロー精密ろ過もしくは深層ろ過を含み得る))を用いて分離することができる(Pollock et al.,Biotechnol.Bioeng.,110:206-219,2013;及びLiu et al.,2010を参照)。細胞構成要素の遠心分離は、連続ディスクスタック遠心分離装置を使用し、次にデプス及びメンブレンフィルターを用いて清澄化することにより、大規模に達成することができる(Kelley,2009を参照)。最も多くの場合、清澄化後、組換えタンパク質をプロテインAクロマトグラフィーによってさらに精製し(これは、プロテインAが抗体のFcドメインに対する親和性が高いためである)、典型的には、低pH/酸性化溶出ステップが用いられる(典型的には、酸性化ステップは、予備的ウイルス不活性化ステップと組み合わせる)。また、酸性またはカチオン性の高分子電解質を用いた凝結/沈殿ステップも、浮遊培養下の動物細胞を可溶性タンパク質から分離するために用いることがある(Liu et al.,2010)。最後に、典型的には、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(「HIC」)、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(HCIC)、セラミックヒドロキシアパタイト(Ca5(PO4)3OH)2を用いたヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ならびにこれらの組合せを使用して、組換えモノクローナル抗体の溶液を仕上げる。所望のモノクローナル抗体の最終的な製剤化及び濃縮は、超遠心分離技法の使用によって達成することができる。精製収率は、典型的には70~80%である(Kelley,2009)。
本明細書における「所望のタンパク質」または「所望の抗体」という用語は互換的に使用され、概して、標的(すなわち、CoV-S)に特異的な親抗体、もしくはキメラもしくはヒト化抗体、または本明細書に記載のようにそれに由来するその結合部分を指す。「抗体」という用語は、エピトープに適合し認識する特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図されており、1つ以上の非共有結合相互作用により、分子構造とエピトープとの複合体が安定化される。原型の抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての供給源(例えば、ヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、その他の哺乳類、ニワトリ、その他の鳥類など)からの全てのタイプの免疫グロブリン(IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど)が「抗体」とみなされる。その例としては、キメラ抗体、ヒト抗体、及び他の非ヒト哺乳類抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(例えば、scFv)、キャメルボディ、ナノボディ、IgNAR(例えばサメに由来し得る一本鎖抗体)、小型モジュール免疫医薬(small-modular immunopharmaceutical)(「SMIP」)、及びFabs、Fab’、F(ab’)2などの抗体フラグメントが挙げられる(Streltsov et al.,Protein Sci.,14(11):2901-9(2005);Greenberg et al.,Nature,374(6518):168-73(1995);Nuttall et al.,Mol.Immunol.,38(4):313-26(2001);Hamers-Casterman et al.,Nature,363(6428):446-8(1993);Gill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.,(6):653-8(2006)を参照)。
例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、遺伝子操作によって産生することができる。この技法では、他の方法と同様に、抗体産生細胞を所望の抗原または免疫原に感作させる。抗体産生細胞から単離したメッセンジャーRNAを鋳型として使用して、PCR増幅を用いてcDNAを作製する。増幅された免疫グロブリンcDNAの適切なセクションを発現ベクターに挿入することにより、初期の抗原特異性を保持する1つの重鎖遺伝子及び1つの軽鎖遺伝子を各々含むベクターのライブラリーを産生する。重鎖遺伝子ライブラリー及び軽鎖遺伝子ライブラリーを組み合わせることによってコンビナトリアルライブラリーを構築する。この結果、重鎖及び軽鎖を同時発現するクローン(抗体分子のFabフラグメントまたは抗原結合フラグメントに類似する)のライブラリーがもたらされる。これらの遺伝子を保有するベクターが宿主細胞に同時形質移入される。形質移入宿主内で抗体遺伝子合成が誘導されると、重鎖及び軽鎖タンパク質が自己集合して、抗原または免疫原を用いたスクリーニングによって検出され得る活性抗体を産生する。
目的抗体コード配列としては、ネイティブ配列によってコードされた配列、及び遺伝暗号の縮重により本開示の核酸と配列が同一ではない核酸、ならびにこれらのバリアントが挙げられる。バリアントポリペプチドは、アミノ酸(「aa」)の置換、付加、または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸を除去するための置換(例えば、グリコシル化部位を変更するため、または機能にとって必要でない1つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失によるミスフォールディングを最小にするため)であり得る。バリアントは、タンパク質の特定の領域(例えば、機能ドメイン、触媒的アミノ酸残基など)の生物学的活性を保持または増強するように設計することができる。また、バリアントは、本明細書で開示するポリペプチドのフラグメント、特に生物学的に活性のフラグメント及び/または機能的ドメインに対応するフラグメントも含む。クローン化された遺伝子をin vitroで変異誘発する技法が知られている。また、通常の分子生物学的技法を用いて、タンパク質分解に対する耐性を改善したり、溶解特性を最適化したり、治療薬剤としてより好適なものにするように修飾されたポリペプチドも、本開示に含まれる。
キメラ抗体は、ある種の抗体産生細胞から得られたVL及びVH領域と、別の種の軽鎖及び重鎖定常領域とを組み合わせることにより、組換え手段によって作製することができる。典型的には、キメラ抗体は、主にヒトのドメインを有する抗体を産生するために、げっ歯類またはウサギの可変領域及びヒトの定常領域を利用する。このようなキメラ抗体の産生は当技術分野で周知されており、標準的な手段(例えば、米国特許第5,624,659号(その全体が参照により本明細書に援用される)に記載の手段)によって達成することができる。さらに、本開示のキメラ抗体のヒト定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4定常領域から選択され得ることが企図されている。
ヒト化抗体は、さらにヒトに近いイムノグロブリンドメインを含み、動物由来抗体については相補性決定領域のみを組み込むように操作された抗体である。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を慎重に調べ、それらの配列をヒト抗体鎖の構造に適合させることによって遂行される。このプロセスは、表面的には複雑であるものの、実際には簡単である。例えば、米国特許第6,187,287号を参照(その全体が参照により本明細書に援用される)。
全体の免疫グロブリン(またはその組換え対応物)に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント(例えば、Fab’、F(ab’)2、または他のフラグメント)を合成することができる。「フラグメント」または最小限の免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技法を利用して設計することができる。例えば、本開示で使用するための「Fv」免疫グロブリンは、融合した可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって産生することができる。抗体の組合せ、例えば、2つの異なるFv特異性を含むダイアボディも関心対象となる。別の実施形態において、低分子免疫医薬(「SMIP」)、キャメルボディ、ナノボディ、及びIgNARは、免疫グロブリンフラグメントに包含される。
免疫グロブリン及びそのフラグメントは、例えば、エフェクター部分(例えば、化学的リンカー)、検出可能部分(例えば、蛍光色素、酵素、毒素、基質、生物発光材料、放射性材料、化学発光部分など)を付加するために翻訳後修飾することができ、または特異的結合部分(例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンなど)を本開示の方法及び組成物に利用することができる。さらなるエフェクター分子の例は下記に示す。
ポリヌクレオチド配列が遺伝暗号に従って翻訳されてポリペプチド配列を生じる(すなわち、ポリヌクレオチド配列がポリペプチド配列を「コードする」)場合、ポリヌクレオチド配列はポリペプチド配列に「対応」しており、2つの配列が同じポリペプチド配列をコードする場合、あるポリヌクレオチド配列はもう1つのポリヌクレオチド配列に「対応」している。
DNAコンストラクトの「異種」領域またはドメインとは、より大きなDNA分子内の識別可能なDNAのセグメントであって、自然界ではより大きな分子とともに見出されることはないセグメントのことである。したがって、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、その遺伝子に隣接するDNAは、通常、供給源生物のゲノム内の哺乳類ゲノムDNAに隣接しない。異種領域の別の例は、コード配列自体が自然界に見出されないコンストラクト(例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むcDNA、またはネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列)である。アレルバリエーションまたは天然の変異事象は、本明細書で定義されるDNAの異種領域を生じない。
「コード配列」とは、タンパク質またはペプチド配列に対応する、またはそれをコードするコドンのインフレーム配列のことである。2つのコード配列は、その配列またはその相補配列が同じアミノ酸配列をコードする場合、互いに対応する。コード配列は適切な調節配列とともに転写されポリペプチドに翻訳され得る。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列の3’側に位置する。「プロモーター配列」とは、下流(3’方向)コード配列の転写を開始可能なDNA調節領域のことであり、典型的には、コード配列の転写に影響を及ぼす調節分子(例えば、転写因子)に結合するためのさらなる部位を含む。RNAポリメラーゼが細胞内のプロモーター配列に結合し、コード配列をmRNAに転写し、それが今度はコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、プロモーター配列の「制御下にある」か、またはプロモーターに「作用可能に結合している」。
脊椎動物における一般的な抗体の構造は、現在では十分に理解されている。Edelman,G.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190:5(1971)を参照。抗体は、分子量がおよそ23,000ダルトンの2つの同一な軽いポリペプチド鎖(「軽鎖」)及び分子量が53,000~70,000の2つの同一な重鎖(「重鎖」)からなる。4つの鎖は、「Y」構成のジスルフィド結合によって連結し、軽鎖は「Y」構成の開口部から始まり重鎖を挟む。「Y」構成の「枝」部分はFab領域と称され、「Y」構成の茎部分はFC領域と称される。アミノ酸配列の方向は、「Y」構成の上部のN末端から各鎖の底部のC末端に向かう。N末端は、それを誘発した抗原に対する特異性を有する可変領域を有し、長さはおよそ100アミノ酸であるが、軽鎖及び重鎖、ならびに抗体ごとに軽微な変化が存在する。
可変領域は各鎖内で、鎖の残りの長さを延長し、特定の抗体クラス内で抗体の特異性によって変化しない定常領域に結合している(すなわち、それを誘発する抗原)。免疫グロブリン分子のクラスを決定する5つの主要な定常領域のクラスが知られている(γ、μ、α、δ、及びε(ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、イプシロン)重鎖定常領域に対応するIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE)。定常領域またはクラスは、抗体の後続のエフェクター機能(補体の活性化(Kabat,E.A.,Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry,2nd Ed.p.413-436,New York,NY:Holt,Rinehart,Winston(1976)を参照)及び他の細胞応答(Andrews et al.,Clinical Immunology,pp.1-18,W.B.Sanders,Philadelphia,PA(1980);Kohl et al.,Immunology,48:187(1983))を含む)を決定し、一方可変領域は、それが反応する抗原を決定する。軽鎖は、κ(カッパ)またはλ(ラムダ)のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかとともに調製することができる。免疫グロブリンがハイブリドーマまたはB細胞のいずれかによって生成される場合、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、2つの重鎖の「テール」部分は共有結合のジスルフィド結合によって互いに結合している。
「可変領域」または「VR」という表現は、抗体と抗原との結合に直接関与する、抗体内の軽鎖及び重鎖の各対内にあるドメインを指す。各重鎖は、一端に可変領域(VH)を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変領域(VL)、他端に定常ドメインを有し、この軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1の定常ドメインとともに整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインとともに整列している。
「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「CDR」という表現は、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域に見られる超可変領域または相補性決定領域(「CDR」)のうちの1つ以上を指す(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.,Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health(1987)を参照)。これらの表現は、Kabatらによって定義された超可変領域(Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH Publication No.91-3242,Bethesda,MD:U.S.Dept of Health and Human Services,National Institutes of Health(1983))、または抗体の3次元構造における超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))を含む。各鎖内のCDRはフレームワーク領域(「FR」)によって近接して保持され、他方の鎖のCDRとともに抗原結合部位の形成に寄与する。CDR内には、CDRが抗体-抗原相互作用で使用する不可欠な接触残基に相当する選択性決定領域(「SDR」)として説明されているアミノ酸が存在する(Kashmiri et al.,Methods,36(1):25-34(2005)を参照)。
「エピトープ」または「結合部位」とは、抗原結合ペプチド(例えば、抗体)が特異的に結合する抗原上の区域または領域のことである。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる)、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基(例えば、特異的抗原結合ペプチドによって有効にブロックされるアミノ酸残基(言い換えれば、このアミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドの「フットプリント」内にある))を含むことができる。本明細書におけるエピトープという用語は、CoV-S(例えば、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S)の任意の特定の領域にある、抗CoV-S抗体に特異的に結合する両方のタイプのアミノ酸結合部位を含む。CoV-Sは多数の異なるエピトープを含むことができ、限定されるものではないが、これには(1)直鎖状ペプチド抗原決定基、(2)成熟CoV-S構造において互いに近くに位置する1つ以上の非連続アミノ酸からなる構造的抗原決定基、(3)全体または一部がCoV-Sタンパク質に共有結合した分子構造(例えば、炭水化物基)からなる翻訳後抗原決定基が含まれる。詳細には、「エピトープ」という用語は、既知の受け入れられている方法(例えば、アラニンスキャン技法または様々な長さでの様々なSタンパク質部分の使用)によって決定された、タンパク質またはペプチドにおける抗体の結合に関与している特定の残基(例えば、CoV-S)を含む。
ある抗体(例えば、第1の抗体)が別の抗体(例えば、第2の抗体)と「実質的に」または「少なくとも部分的に」同じエピトープに結合するという表現は、第1の抗体のエピトープ結合部位が、第2の抗体のエピトープ結合部位を構成する抗原上のアミノ酸残基の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上を含むことを意味している。また、第1の抗体が第2の抗体と実質的に同一または重複するエピトープに結合するということは、上記のように、第1の抗体及び第2の抗体が抗原への結合において競合することを意味する。したがって、モノクローナル抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という言葉は、抗体がその抗体と「競合する」ことを意味する。
目的抗体と「同じまたは重複するエピトープまたは決定基に結合する」という表現は、目的抗体が特異的に結合するCoV-S上の少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ)または全ての残基について当該抗体と「競合」することを意味する。本明細書に記載のモノクローナル抗体と実質的にまたは本質的に同じエピトープに結合する1つ以上の抗体の同定は、アラニンスキャンを用いて容易に決定することができる。さらに、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか1つ。多くのこのようなアッセイが日常的に実施されており、当技術分野で周知されている(例えば、1997年8月26日発行の米国特許第5,660,827号を参照(参照により具体的に本明細書に援用される))。本明細書に記載の抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、いかなる形でも、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じまたは実質的に同じまたは重複するエピトープに結合する抗体を同定するのに必要とされないことが理解されよう。
例えば、調べる試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、または異なるIgアイソタイプですらある場合、単純な競合アッセイを用いて、対照抗体を試験抗体と混合し、次にCoV-Sを含む試料に適用することができる。ELISA、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、及びBIACORE(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)解析に基づくプロトコルは、このような単純な競合試験で使用するのに適している。
ある特定の実施形態において、対照抗CoV-S抗体は、ある期間の間、様々な量の(例えば、約1:1、1:2、1:10または約1:100の比率において)試験抗体と予め混合してから、CoV-S(例えば、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S)抗原試料に適用する。他の実施形態では、対照及び様々な量の試験抗体を単に別々に加え、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S抗原試料に曝露中に混合してもよい。結合抗体を(例えば、分離または洗浄技法を用いて結合していない抗体を除去することにより)遊離抗体と区別したり、対照抗体を(例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的な二次抗体を使用することにより、または検出可能な標識で対照抗体を特異的に標識することにより)試験抗体と区別することができる限り、試験抗体が対照抗体のSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S抗原との結合を低減するか(これは、試験抗体が対照抗CoV-S抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す)を判定することができる。(CoV-Sに結合しない)完全に無関係な抗体の存在下での(標識された)対照抗体の結合は、対照の高値として機能する。対照の低値は、標識された対照抗体を、同じであるが標識されていない対照抗体とともにインキュベートすることによって得ることができ、この場合競合が生じ、標識された抗体の結合が低減される。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減した場合、実質的に同じエピトープを認識する(すなわち、標識対照抗体と競合する)試験抗体であることを意味する。例えば、約1:1または1:10~約1:100の試験抗体の任意の比率でSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sに対する対照抗体の結合を少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%(例えば、約65~100%)低減する任意の試験抗体は、対照抗体と実質的に同じまたは重複するエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなされる。
このような試験抗体が、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S(または別のCoV-S)抗原に対する対照抗体の結合を、試験抗体の不在下で観察される対照抗体の結合の、好ましくは少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%(例えば、約95%)低減することが好ましい。
また、試験抗体を、SARS-CoV-SもしくはSARS-CoV-2-S(または別のCoV-S)が固定された表面に飽和濃度で適用する単純な競合アッセイも有利に用いられ得る。単純な競合アッセイにおける表面は、BIACORE(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)チップ(または表面プラズモン共鳴(「SPR」)解析に適した他の媒体)であることが好ましい。SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sに結合する対照抗体によるCOV-Sコーティング表面との結合を測定する。この対照抗体単独によるSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S含有表面との結合を、試験抗体の存在下での対照抗体の結合と比較する。試験抗体の存在下で、対照抗体によるSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S含有表面との結合が顕著に低減した場合、これは、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識し、試験抗体が対照抗体と「競合」することを示す。対照抗体の結合を少なくとも約20%以上、少なくとも約40%以上、少なくとも約50%以上、少なくとも約70%以上低減する任意の試験抗体は、対照抗体と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなすことができる。このような試験抗体が、対照抗体によるSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sとの結合を少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、またはそれ以上)低減することが好ましい。対照抗体及び試験抗体の順序が逆になってもよいこと、すなわち、競合アッセイにおいて、対照抗体を最初に表面に結合させ、次に試験抗体を表面と接触させてもよいことは理解されよう。「サンドイッチ型」結合アッセイ(下記参照)を使用することが好ましい。代替的に、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S抗原に対しより大きな親和性を有する抗体を最初にSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S含有表面に結合させる。これは、第2の抗体で見られる結合の減少(抗体が競合していると仮定)がより大きな程度となることが予想されるからである。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、Saunal and Regenmortel,J.Immunol.Methods,183:33-41(1995)に示されており、この開示内容は参照により本明細書に援用される。
さらに、抗体がCOV-S上で、別の抗体または試験抗体が結合するエピトープと同じまたは重複するエピトープ(複数可)に結合するかどうかは、特にウェスタンブロットベースアッセイを用いて判定することができる。このアッセイでは、抗体が結合する抗原(CoV-Sタンパク質)に対応しタンパク質の重複部分(典型的には10~25、10~20、または10~15アミノ酸長)を含むペプチドのライブラリーを作製する。CoV-S配列を包含するこれらの異なる重複アミノ酸ペプチドを合成し、PEPSPOTS(商標)ニトロセルロース膜(JPT Peptide Technologies,Berlin,Germany)に共有結合させた。次に、製造業者の推奨に従ってブロットを作成し探索する。
本質的には、イムノブロットアッセイは次に、蛍光定量的手段により、ライブラリー内のどのペプチドが試験抗体と結合するかを検出し、それにより、抗原(すなわち、COV-S)上のどの残基が試験抗体と相互作用するかを特定することができる(米国特許第7,935,340号(参照により本明細書に援用される)を参照)。
様々なエピトープマッピング技法が当技術分野で知られている。例として、抗原及び抗体のX線共結晶化、NMR、SPR(例えば、25°または37℃で)、アレイベースのオリゴペプチドスキャン(または「pepscan解析」)、部位特異的変異誘発(例えば、アラニンスキャン)、変異誘発マッピング、水素-重水素交換、ファージディスプレイ、及び限定的タンパク質分解は、いずれも当技術分野で周知されているエピトープマッピング技法である(例えば、Epitope Mapping Protocols:Second Edition,Methods in Molecular Biology,editors Mike Schutkowski and Ulrich Reineke,2nd Ed.,New York,NY:Humana Press(2009)及びEpitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,editor Glenn Morris,1st Ed.,New York,NY:Humana Press(1996)(いずれもその全体が参照により本明細書に援用される)を参照)。
本明細書に記載のモノクローナル抗体と実質的にまたは本質的に同じエピトープに結合する1つ以上の抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つ)の同定は、抗体競合を評価することができる様々な免疫学スクリーニングアッセイのいずれか1つを用いて容易に決定することができる。多くのこのようなアッセイが日常的に実施されており、当技術分野で周知されている(例えば、1997年8月26日発行の米国特許第5,660,827号を参照(参照により本明細書に援用される))。本明細書に記載の抗体が結合するエピトープを決定することは、いかなる形でも、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するのに必要とされないことが理解されよう。
例えば、調べる試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、または異なるIgアイソタイプですらある場合、単純な競合アッセイを用いて、対照抗体(例えば、上記ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のうちの1つ)を試験抗体と混合し、次に、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S(各々に、上記ならびに図1、2、及び36に記載の抗体が結合することが知られている)のいずれかまたは両方を含む試料に適用することができる。ELISA、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、BIACORE(登録商標)(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)解析に基づくプロトコル(本明細書の実施例セクションに記載)は、このような単純な競合試験で使用するのに適している。
ある特定の実施形態において、当該方法は、CoV-S抗原試料に適用する前に一定期間、対照抗体を様々な量の試験抗体と予め混合する(例えば、約1:1、1:2、1:10、または約1:100の比率で)ことを含む。他の実施形態において、対照抗体及び様々な量の試験抗体を別々に加え、CoV-S抗原試料への曝露中に混ぜてもよい。(例えば、結合していない抗体を除去するために分離または洗浄技法を使用することにより)結合抗体を遊離抗体と区別したり、(例えば、種特異的またはアイソタイプ特異的二次抗体を使用することにより、または対照抗体を検出可能な標識で特異的に標識することにより)対照抗体を試験抗体と区別したりすることができる限り、当該方法は、試験抗体が、対照抗体によるCOV-S抗原との結合を低減すること(これは、試験抗体が対照抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体)と実質的に同じエピトープを認識することを示す)を判定するために使用することができる。(CoV-Sに結合しない)完全に無関係な抗体の存在下での(標識された)対照抗体の結合は、対照の高値として機能する。対照の低値は、標識された対照抗体を、同じであるが標識されていない対照抗体とともにインキュベートすることによって得ることができ、この場合競合が生じ、標識された抗体の結合が低減される。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減した場合、実質的に同じエピトープを認識する(すなわち、標識対照抗体と競合する)試験抗体であることを意味する。例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つによるSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S抗原の両方に対する結合を、約1:1または1:10~約1:100の間の本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の対照抗体、試験抗体の任意の比率で、少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、またはより好ましくは少なくとも約70%(例えば、約65~100%)低減する任意の試験抗体は、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のうちのいずれか1つと実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、このような試験抗体は、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つによるSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S抗原のうちの少なくとも一方、好ましくは各々に対する結合を、試験抗体の不在下で観察される本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つの結合の好ましくは少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約80%または少なくとも約90%(例えば、約95%)低減する。これらの方法は、他の対照抗体と競合する抗体を同定及び/または評価するように適合させることができる。
SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sのいずれかまたは両方が固定された表面に試験抗体を飽和濃度で適用する単純な競合アッセイも有利に用いることができる。単純な競合アッセイにおける表面は、OCTET(登録商標)及び/またはPROTEON(登録商標)に適した培地であることが好ましい。対照抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つ)によるCoV-Sコーティング表面に対する結合が測定される。この対照抗体単独によるCoV-S含有表面との結合を、試験抗体の存在下での対照抗体の結合と比較する。試験抗体の存在下で、対照抗体によるCoV-S含有表面との結合が顕著に低減した場合、これは、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識し、試験抗体が対照抗体と「競合」することを示す。対照抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか)によるSARS-CoV-S抗原及びSARS-CoV-2-S抗原の両方に対する結合を少なくとも約20%以上、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約70%またはそれ以上結合を低減する任意の試験抗体は、対照抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか)と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなすことができる。好ましくは、このような試験抗体は、対照抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つ)によるCoV-S抗原に対する結合を少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、またはそれ以上)低減する。対照抗体及び試験抗体の順序が逆になってもよいこと、すなわち、競合アッセイにおいて、対照抗体を最初に表面に結合させ、次に試験抗体を表面と接触させてもよいことは理解されよう。好ましくは、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sに対しよりより高い親和性を有する抗体を最初にCoV-S含有表面に結合させる。これは、第2の抗体で見られる結合の減少(抗体が競合していると仮定)がより大きな程度となることが予想されるからである。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、Saunal and Regenmortel,J.Immunol.Methods,183:33-41(1989)に示されており、この開示内容は参照により本明細書に援用される。
抗体、その抗原結合フラグメント、または抗体誘導体(例えば、本明細書で例示する抗CoV-S抗体のいずれかの親和性成熟抗体または抗原結合フラグメント)が、上記に定義されたエピトープ領域の1つ内に結合するかどうかの判定は、当業者に知られている方法で実施することができる。このようなマッピング/特性評価方法の別の例では、抗CoV-S抗体のエピトープ領域は、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sタンパク質中の露出したアミン/カルボキシルの化学修飾を用いたエピトープ「フットプリント」によって決定することができる。このようなフットプリンティング技法の1つの具体例は、質量分析によって検出される水素-重水素交換(「HXMS」)の使用であり、これを使用した場合、受容体及びリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素/重水素交換、結合、及び逆交換が生じ、タンパク質結合に関与するバックボーンアミド基は逆交換から保護されているため、重水素化したまま保たれる。関連領域は、この点において、ペプチド分解、高速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、及び/またはエレクトロスプレーイオン化質量解析によって同定することができる(例えば、Ehring H.,Analytical Biochemistry,267(2):252-259(1999)及びEngen,J.R.& Smith,D.L.,Anal.Chem.,73:256A-265A(2001)を参照)。好適なエピトープ同定技法の別の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング(「NMR」)であり、この場合、典型的には、遊離抗原及び抗原結合ペプチド(例えば、抗体)と複合体化した抗原の二次元NMRスペクトルのシグナルの位置を比較する。抗原は典型的には、15Nで選択的に同位体標識されているため、NMRスペクトルには抗原に対応するシグナルのみが現れ、抗原結合ペプチドからのシグナルは見られない。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸を起源とする抗原シグナルは、典型的には、複合体のスペクトルでは遊離抗原のスペクトルに比べて位置がシフトし、結合に関与するアミノ酸はそのように同定することができる。例えば、Ernst Schering Res.Found.Workshop,(44):149-67(2004);Huang et al.,J.Mol.Biol.,281(1):61-67(1998);及びSaito and Patterson,Methods,9(3):516-24(1996)を参照。また、エピトープマッピング/特性評価は質量解析(「MS」)法を用いて実施することもできる(例えば、Downard,J.Mass Spectrom.35(4):493-503(2000)及びKiselar and Downard,Anal.Chem.,71(9):1792-801(1999)を参照)。
プロテアーゼ消化技法は、エピトープマッピング及び同定の文脈でも有用であり得る。抗原決定基関連領域/配列は、プロテアーゼ消化により、例えば、トリプシンをSARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-Sに対し約1:50の比率で37℃、pH7~8で一晩(「o/n」)の消化に使用し、続いてペプチド同定のために質量分析(「MS」)を行うことにより、決定することができる。抗CoV-S抗体によってトリプシン切断から保護されたペプチドは、続いて、トリプシン消化に供された試料と、抗体とインキュベートした後に例えばトリプシンによる消化に供された試料とを比較することによって同定することができる(それによって、抗体のフットプリントが明らかになる)。キモトリプシンやペプシンのような他の酵素も、同様のエピトープ特性評価法で使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列がCoV-S結合ポリペプチドの文脈でCoV-Sの領域内にあるかどうかを解析するための迅速な方法を提供することができる。ポリペプチドが表面露出していない場合、免疫原性/抗原性の観点からは重要でない可能性が非常に高い(例えば、同様の技法の考察についてはManca,Ann.Ist.Super.Sanita.,27(1):15-9(1991)を参照)。
部位特異的変異誘発は、結合エピトープの特性評価に有用な別の技法である。例えば、「アラニンスキャン」部位特異的変異誘発(例えば、アラニンスキャン、アラニンスキャン変異誘発、アラニンスキャン変異、コンビナトリアルアラニンスキャン、またはアラニン点変異の作成としても知られている)において、タンパク質セグメント内の各残基は、例えば、直接ペプチドまたはタンパク質合成、部位特異的変異誘発、GENEART(商標)Mutagenesis Service(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA U.S.A.)、またはショットガン変異誘発などの方法論によってアラニン残基(または、野生型配列内にアラニンが存在する場合はバリンなどの別の残基)に置き換えられる。この技法を用いて、一連の分子の単一点変異体が生成される。生成される変異体の数は、分子の残基の数に相当し、各残基は1回に1つずつアラニン残基によって置き換えられる。アラニンは、他の多くのアミノ酸が有し得る二次構造の選好を模倣できる嵩高くない化学的に不活性のメチル官能基を有するため、概してネイティブ(野生型)残基の置き換えに使用される。続いて、ネイティブ残基をアラニンで置き換えることがアラニンスキャン変異体及びその結合パートナーの結合親和性に及ぼす影響は、限定されるものではないが、SPR結合実験などの方法を用いて測定することができる。変異が結合親和性の顕著な低減につながる場合、変異残基が結合に関与している可能性が非常に高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体(すなわち、アンフォールドタンパク質に結合しない抗体)を結合親和性実験の陽性対照として使用して、アラニン置換が全体的なタンパク質の三次構造に影響を及ぼしていないことを検証することができる(全体的なタンパク質のフォールドに対する変化は間接的に結合に影響を及ぼして、擬似陽性結果をもたらし得るため)。例えば、Clackson and Wells,Science,267:383-386(1995);Weiss et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(16):8950-8954(2000);及びWells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:1-6(1996)を参照)。実施例5では、本明細書で開示する抗CoV-S抗体に特異的に相互作用するCoV-Sの特異的エピトープまたは残基を同定している。
電子顕微鏡は、エピトープの「フットプリント」にも使用することができる。例えば、Wang et al.,Nature,355:275-278(1992)は、低温電子顕微鏡法、三次元画像再構成法、及びX線結晶解析の協調的応用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのカプシド表面上のFabフラグメントの物理的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための他の形態の「ラベルフリー」アッセイとしては、SPR(BIACORE(登録商標)システムとして市販;GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)及び反射型干渉分光法(「RifS」)(例えば、Fagerstam et al.,Journal of Molecular Recognition,3:208-14(1990);Nice et al.,J.Chromatogr.,646:159-168(1993);Leipert et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,37:3308-3311(1998);Kroger et al.,Biosensors and Bioelectronics,17:937-944(2002)を参照)。
「フレームワーク領域」または「FR」という表現は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のフレームワーク領域のうちの1つ以上を指す(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th edition,Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health(1987)を参照)。これらの表現は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のCDR間に介在するアミノ酸配列領域を含む。
「Fc領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。「Fc領域」は、ネイティブ配列Fc領域であってもバリアントFc領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は様々であるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位またはPro230位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸びていると定義される。Fc領域内の残基のナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスのナンバリングである。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health(1991)。免疫グロブリンのFc領域は、概して、CH2及びCH3という2つの定常ドメインを含む。
「Fc受容体」及び「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合する受容体を言い表したものである。好ましいFcRは、ネイティブ配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの(ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含む(これらの受容体のアレルバリアント及び代替的にスプライシングされた形態を含む)。FcγRII受容体には、FcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害受容体」)が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。FcR主については、Ravetch and Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92(1991);Capel et al.,Immunomethods,4:25-34(1994);及びde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41(1995)で概説されている。また「FcR」には新生児受容体FcRnも含まれ、これは、母体IgGの胎児への移行を担い(Guyer et al.,J.Immunol.,117:587(1976);及びKim et al.,J.Immunol.,24:249(1994))、主に、循環中の抗体の半減期を調節及び/または延長するように機能する。本開示の抗CoV-S抗体が無グリコシル化されている限りにおいて、発現システム及び/または配列の結果として、主題抗体はFcRn受容体には結合するが、Fcγ受容体には結合しない(または最小限に結合する)ことが予想される。
「機能的Fc領域」は、ネイティブ配列Fc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害(「CDC」);Fc受容体結合;抗体依存性細胞傷害(「ADCC」);食作用;細胞表面受容体の下方調節(例えば、B細胞受容体(「BCR」))などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、概して、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合することを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
「ネイティブ配列Fc領域」は、自然界に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾があるためにネイティブ配列のFc領域とは異なるアミノ酸配列を含むが、ネイティブ配列のFc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を依然保持する。好ましくは、バリアントFc領域は、ネイティブ配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、例えば、ネイティブ配列Fc領域内または親ポリペプチドのFc領域内に約1~約10個のアミノ酸置換、好ましくは約1~約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントFc領域は、ネイティブ配列Fc領域及び/または親ポリペプチドのFc領域に対し好ましくは少なくとも約80%の配列同一性、最も好ましくはそれに対し少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくはそれに対し少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントのFc領域は、Fc受容体(FcR)に結合することができる。FcRは、限定されるものではないが、Fcガンマ受容体(FcgR)、FcgRI、FcgRIIA、FcgRIIB1、FcgRIIB2、FcgRIIIA、FcgRIIIB、Fcイプシロン受容体(FceR)、FceRI、FceRII、Fcアルファ受容体(FcaR)、FcaRI、Fcアルファ/ミュー受容体(Fca/mR)、またはFc受容体(FcRn)であり得る。Fcは、IgM、IgD、IgG、IgE、またはIgAのアイソタイプであり得る。IgGアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であり得る。
Fc領域内のある特定のアミノ酸修飾は、Abエフェクター機能及び特性(例えば、限定されるものではないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、及び半減期)を調節することが知られている(Wang X.et al.,Protein Cell.2018 Jan;9(1):63-73;Dall’Acqua W.F.et al.,J Biol Chem.2006 Aug 18;281(33):23514-24.Epub 2006 Jun 21;Monnet C.et al,Front Immunol.2015 Feb 4;6:39.doi:10.3389/fimmu.2015.00039.eCollection 2015)。変異は、対称的であっても非対称的であってもよい。ある特定の場合において、非対称な変異(複数可)を有するFc領域を含む(すなわち、2つのFc領域が同一ではない)抗体は、ADCCなどのより優れた機能を提供し得る(Liu Z.et al.J Biol Chem.2014 Feb 7;289(6):3571-3590)。
本明細書で開示する抗体可変領域配列のいずれも、野生型(WT)FcまたはバリアントFcと組み合わせて使用することができる。特定の実施形態において、表1に記載のFc配列から選択されるFcを使用することができる。本明細書で開示する可変領域配列のいずれも、表1に示されるFcバリアントのいずれかを含む任意の適切なFcと組み合わせて使用して、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントを形成することができる。各FcのC末端のリジン(K)は存在しても存在しなくてもよい。
IgG1タイプFcは、任意選択で、1つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、例えば、N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、G236-deleted、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y、M428L、N434S、L328F、M252Y、S254T、T256E、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)(Dall’Acca W.F.et al.,J Biol Chem.2006 Aug 18;281(33):23514-24.Epub 2006 Jun 21;Wang X.et al.,Protein Cell.2018 Jan;9(1):63-73)、あるいは例えば、N434A、Q438R、S440E、L432D、N434L、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングはEUナンバリングに従う)を挙げることができる。Fc領域はさらに、1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、限定されるものではないが、A330L、L234F、L235E、P3318、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングは、KabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。IgG1タイプFcの具体的な例示的置換の組合せとしては、限定されるものではないが、M252Y、S254T、及びT256E(「YTE」バリアント);M428L及びN434A(「LA」バリアント);M428L及びN434S(「LS」バリアント);M428L、N434A、Q438R、及びS440E(「LA-RE」バリアント);L432D及びN434L(「DEL」バリアント);ならびにL234A、L235A、L432D、及びN434L(「LALA-DEL」バリアント)(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。特定の実施形態において、IgG1タイプFcバリアントは、配列番号:11、12、13、14、15、16、または17のアミノ酸配列を含むことができる。1つの実施形態において、FcバリアントはLAバリアントであり、配列番号13のアミノ酸配列を含む。
AbがIgG2である場合、Fc領域は任意選択で1つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、限定されるものではないが、P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。Fc領域は、任意選択でさらに1つ以上の追加のアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、限定されるものではないが、M252Y、S254T、T256E、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングは、KabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。
IgG3タイプFc領域は、任意選択で1つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、限定されるものではないが、E235Y(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。
IgG4タイプFc領域は、任意選択で1つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。このような置換としては、限定されるものではないが、E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q、及び/またはこれらの任意の組合せ(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)を挙げることができる。置換は、例えば、S228P(残基ナンバリングはKabatにおけるようにEUインデックスに従う)であってもよい。
いくつかの場合において、ヒト様Fc領域のグリカンは、エフェクター機能を修飾するように操作することができる(例えば、Li T.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2017 Mar 28;114(13):3485-3490.doi:10.1073/pnas.1702173114.Epub 2017 Mar 13を参照)。
本明細書で使用する場合、「単離」抗体とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。いくつかの実施形態において、単離抗体は、他の意図されない細胞性物質及び/または化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用する場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体またはその抗原結合部分と抗原との相互作用が、特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味する。例えば、抗体またはその抗原結合部位は、タンパク質全般ではなく特定のタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、標的、例えば、SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-S-2に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、複数のコロナウイルスのスパイクタンパク質、例えば、SARS-CoV-Sのスパイクタンパク質及びSARS-CoV-2-Sのスパイクタンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、2つの異なるが関連する抗原、例えばSARS-CoV1-Sのスパイクタンパク質及びSARS-CoV2-Sのスパイクタンパク質に、例えば保存エピトープを介して、特異的に結合する。
B.CoV-Sに対する結合活性を有する抗CoV-S抗体及びその結合フラグメント
CoV-Sとは、構造タンパク質としてビリオンの表面に発現するコロナウイルスのSタンパク質を指す。先に言及したように、Sタンパク質は、コロナウイルスが宿主細胞上の受容体と結合する上で不可欠な役割を果たし、宿主トロピズムを決定している(Zhu Z.et al.,Infect Genet Evol.2018 Jul;61:183-184)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2は、Sタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を介して宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合し、ACE2を受容体として使用して宿主細胞内に侵入する(Ge X.Y.et al.,Nature.2013 Nov 28;503(7477):535-8.doi:10.1038/nature12711.Epub 2013 Oct 30.;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。またSARS-CoVは、代替受容体としてCD209L(別名L-SIGN)も使用することができる(Jeffers S.A.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Nov 2;101(44):15748-53.Epub 2004 Oct 20)。MERS-CoVは、Sタンパク質の異なるRBDを介して宿主細胞のジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4、別名CD26)に結合する。コロナウイルスの細胞侵入は、Sタンパク質による宿主細胞の受容体への結合に依存するだけでなく、しばしば宿主細胞のプロテアーゼによるSタンパク質のプライミングにも依存し、最近では、SARS-CoV-2がSタンパク質のプライミングにセリンプロテアーゼTMPRSS2を使用し、次に侵入にACE2を使用することが分かっている(Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。
CoV-Sとは、構造タンパク質としてビリオンの表面に発現するコロナウイルスのSタンパク質を指す。先に言及したように、Sタンパク質は、コロナウイルスが宿主細胞上の受容体と結合する上で不可欠な役割を果たし、宿主トロピズムを決定している(Zhu Z.et al.,Infect Genet Evol.2018 Jul;61:183-184)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2は、Sタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を介して宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合し、ACE2を受容体として使用して宿主細胞内に侵入する(Ge X.Y.et al.,Nature.2013 Nov 28;503(7477):535-8.doi:10.1038/nature12711.Epub 2013 Oct 30.;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。またSARS-CoVは、代替受容体としてCD209L(別名L-SIGN)も使用することができる(Jeffers S.A.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Nov 2;101(44):15748-53.Epub 2004 Oct 20)。MERS-CoVは、Sタンパク質の異なるRBDを介して宿主細胞のジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4、別名CD26)に結合する。コロナウイルスの細胞侵入は、Sタンパク質による宿主細胞の受容体への結合に依存するだけでなく、しばしば宿主細胞のプロテアーゼによるSタンパク質のプライミングにも依存し、最近では、SARS-CoV-2がSタンパク質のプライミングにセリンプロテアーゼTMPRSS2を使用し、次に侵入にACE2を使用することが分かっている(Wu A.et al.,Cell Host Microbe.2020 Mar 11;27(3):325-328;Hoffmann M.et al.,Cell.2020 Mar 4.pii:S0092-8674(20)30229-4)。
SARS-CoVのSタンパク質はSARS-CoV-Sと称され、例えば、配列番号1のアミノ酸配列(1288アミノ酸)を含むことができる。SARS-CoV-2のSタンパク質は、SARS-CoV-2-Sと称され、例えば、配列番号5のアミノ酸配列(1273アミノ酸)を含むことができる。
本開示は、CoVに特異的に結合する例示的な抗体及び抗原結合抗体フラグメントを提供し、これらの抗体及び抗原結合抗体フラグメントの少なくとも一部は、SARS-CoV-2-S及び/またはSARS-CoV-2-Sに特異的に結合する。異なるCoV種間で配列が類似するため、本開示のこのような抗体または抗原結合抗体フラグメントは、他のCoV種のSタンパク質とも交差反応し得る。
本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得る例示的なCoVのSタンパク質としては、例えば、コウモリSARS CoV(GenBankアクセッション番号FJ211859)、SARS CoV(GenBankアクセッション番号FJ211860)、BtSARS.HKU3.1(GenBankアクセッション番号DQ022305)、BtSARS.HKU3.2(GenBankアクセッション番号DQ084199)、BtSARS.HKU3.3(GenBankアクセッション番号DQ084200)、BtSARS.Rm1(GenBankアクセッション番号DQ412043)、BtCoV.279.2005(GenBankアクセッション番号DQ648857)、BtSARS.Rf1(GenBankアクセッション番号DQ412042)、BtCoV.273.2005(GenBankアクセッション番号DQ648856)、BtSARS.Rp3(GenBankアクセッション番号DQ071615)、SARS CoV.A022(GenBankアクセッション番号AY686863)、SARSCoV.CUHK-W1(GenBankアクセッション番号AY278554)、SARSCoV.GDO1(GenBankアクセッション番号AY278489)、SARSCoV.HC.SZ.61.03(GenBankアクセッション番号AY515512)、SARSCoV.SZ16(GenBankアクセッション番号AY304488)、SARSCoV.Urbani(GenBankアクセッション番号AY278741)、SARSCoV.civet010(GenBankアクセッション番号AY572035)、またはSARSCoV.MA.15(GenBankアクセッション番号DQ497008)、Rs SHC014(GenBank(登録商標)アクセッション番号KC881005)、Rs3367(GenBank(登録商標)アクセッション番号KC881006)、WiV1 S(GenBank(登録商標)アクセッション番号KC881007)が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体及び抗原結合抗体フラグメントは、既存のコウモリCoVまたは発生前のコウモリCoVに結合し中和することもできる。このような結合能力及び/または中和能力を有する抗体及び抗原結合抗体フラグメントは、コウモリのような動物リザーバーからのスピルオーバーによって引き起こされ得る将来のパンデミックにおいては特に有用となるであろう。実際に、ADI-55688、ADI-55689、ADI-55993、ADI-5600、ADI-56046、ADI-55690、ADI-56010、及びADI-55951は、真正コウモリコロナウイルスのWIV1を中和することが示された(Wec A.et al.,Science.2020 Jun 15;eabc7424.doi:10.1126/science.abc7424の図3Eを参照)。
代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが結合するCoVのSタンパク質は、他の種(例えば、コウモリ)からの発生前のコロナウイルスに特異的に結合し、これを中和することができる。
さらに代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得るCoVのSタンパク質としては、例えば、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Riyadh_2_2012(GenBankアクセッション番号KF600652.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_18_2013(GenBankアクセッション番号KF600651.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_17_2013(GenBankアクセッション番号KF600647.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_15_2013(GenBankアクセッション番号KF600645.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_16_2013(GenBankアクセッション番号KF600644.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_21_2013(GenBankアクセッション番号KF600634)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_19_2013(GenBankアクセッション番号KF600632)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Buraidah_1_2013(GenBankアクセッション番号KF600630.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Hafr-Al-Batin_1_2013(GenBankアクセッション番号KF600628.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_12_2013(GenBankアクセッション番号KF600627.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Bisha_1_2012(GenBankアクセッション番号KF600620.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Riyadh_3_2013(GenBankアクセッション番号KF600613.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Riyadh_1_2012(GenBankアクセッション番号KF600612.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_3_2013(GenBankアクセッション番号KF186565.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_1_2013(GenBankアクセッション番号KF186567.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_2_2013(GenBankアクセッション番号KF186566.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株Al-Hasa_4_2013(GenBankアクセッション番号KF186564.1)、中東呼吸器症候群コロナウイルス(GenBankアクセッション番号KF192507.1)、ベータコロナウイルスEngland 1-N1(GenBankアクセッション番号NC_019843)、MERS-CoV_SA-N1(GenBankアクセッション番号KC667074)、以下の中東呼吸器症候群コロナウイルス中東呼吸器症候群コロナウイルス分離株(GenBankアクセッション番号:KF600656.1、GenBankアクセッション番号:KF600655.1、GenBankアクセッション番号:KF600654.1、GenBankアクセッション番号:KF600649.1、GenBankアクセッション番号:KF600648.1、GenBankアクセッション番号:KF600646.1、GenBankアクセッション番号:KF600643.1、GenBankアクセッション番号:KF600642.1、GenBankアクセッション番号:KF600640.1、GenBankアクセッション番号:KF600639.1、GenBankアクセッション番号:KF600638.1、GenBankアクセッション番号:KF600637.1、GenBankアクセッション番号:KF600636.1、GenBankアクセッション番号:KF600635.1、GenBankアクセッション番号:KF600631.1、GenBankアクセッション番号:KF600626.1、GenBankアクセッション番号:KF600625.1、GenBankアクセッション番号:KF600624.1、GenBankアクセッション番号:KF600623.1、GenBankアクセッション番号:KF600622.1、GenBankアクセッション番号:KF600621.1、GenBankアクセッション番号:KF600619.1、GenBankアクセッション番号:KF600618.1、GenBankアクセッション番号:KF600616.1、GenBankアクセッション番号:KF600615.1、GenBankアクセッション番号:KF600614.1、GenBankアクセッション番号:KF600641.1、GenBankアクセッション番号:KF600633.1、GenBankアクセッション番号:KF600629.1、GenBankアクセッション番号:KF600617.1)、コロナウイルスNeoromicia/PML-PHE1/RSA/2011 GenBankアクセッション:KC869678.2、コウモリコロナウイルスTaper/CII_KSA_287/Bisha/Saudi Arabia/GenBankアクセッション番号:KF493885.1,Bat coronavirus Rhhar/CII_KSA_003/Bisha/Saudi Arabia/2013、GenBankアクセッション番号:KF493888.1,Bat coronavirus Pikuh/CII_KSA_001/Riyadh/Saudi Arabia/2013、GenBankアクセッション番号:KF493887.1,Bat coronavirus Rhhar/CII_KSA_002/Bisha/Saudi Arabia/2013、GenBankアクセッション番号:KF493886.1、コウモリコロナウイルスRhhar/CII_KSA_004/Bisha/Saudi Arabia/2013、GenBankアクセッション番号:KF493884.1、BtCoV.HKU4.2(GenBankアクセッション番号EF065506)、BtCoV.HKU4.1(GenBankアクセッション番号NC_009019)、BtCoV.HKU4.3(GenBankアクセッション番号EF065507)、BtCoV.HKU4.4(GenBankアクセッション番号EF065508)、BtCoV 133.2005(GenBankアクセッション番号NC 008315)、BtCoV.HKU5.5(GenBankアクセッション番号EF065512);BtCoV.HKU5.1(GenBankアクセッション番号NC_009020)、BtCoV.HKU5.2(GenBankアクセッション番号EF065510)、BtCoV.HKU5.3(GenBankアクセッション番号EF065511)、ヒトコロナウイルス2c Jordan-N3/2012(GenBankアクセッション番号KC776174.1;ヒトコロナウイルス2c EMC/2012(GenBankアクセッション番号JX869059.2)、アブラコウモリコロナウイルスHKU5分離株(GenBankアクセッション番号:KC522089.1、GenBankアクセッション番号:KC522088.1、GenBankアクセッション番号:KC522087.1、GenBankアクセッション番号:KC522086.1、GenBankアクセッション番号:KC522085.1、GenBankアクセッション番号:KC522084.1、GenBankアクセッション番号:KC522083.1、GenBankアクセッション番号:KC522082.1、GenBankアクセッション番号:KC522081.1、GenBankアクセッション番号:KC522080.1、GenBankアクセッション番号:KC522079.1、GenBankアクセッション番号:KC522078.1、GenBankアクセッション番号:KC522077.1、GenBankアクセッション番号:KC522076.1、GenBankアクセッション番号:KC522075.1、GenBankアクセッション番号:KC522104.1、GenBankアクセッション番号:KC522104.1、GenBankアクセッション番号:KC522103.1、GenBankアクセッション番号:KC522102.1、GenBankアクセッション番号:KC522101.1、GenBankアクセッション番号:KC522100.1、GenBankアクセッション番号:KC522099.1、GenBankアクセッション番号:KC522098.1、GenBankアクセッション番号:KC522097.1、GenBankアクセッション番号:KC522096.1、GenBankアクセッション番号:KC522095.1、GenBankアクセッション番号:KC522094.1、GenBankアクセッション番号:KC522093.1、GenBankアクセッション番号:KC522092.1、GenBankアクセッション番号:KC522091.1、GenBankアクセッション番号:KC522090.1、GenBankアクセッション番号:KC522119.1、GenBankアクセッション番号:KC522118.1、GenBankアクセッション番号:KC522117.1、GenBankアクセッション番号:KC522116.1、GenBankアクセッション番号:KC522115.1、GenBankアクセッション番号:KC522114.1、GenBankアクセッション番号:KC522113.1、GenBankアクセッション番号:KC522112.1、GenBankアクセッション番号:KC522111.1、GenBankアクセッション番号:KC522110.1、GenBankアクセッション番号:KC522109.1、GenBankアクセッション番号:KC522108.1、GenBankアクセッション番号:KC522107.1、GenBankアクセッション番号:KC522106.1、GenBankアクセッション番号:KC522105.1)、アブラコウモリコロナウイルスHKU4分離株(GenBankアクセッション番号:KC522048.1、GenBankアクセッション番号:KC522047.1、GenBankアクセッション番号:KC522046.1、GenBankアクセッション番号:KC522045.1、GenBankアクセッション番号:KC522044.1、GenBankアクセッション番号:KC522043.1、GenBankアクセッション番号:KC522042.1、GenBankアクセッション番号:KC522041.1、GenBankアクセッション番号:KC522040.1、GenBankアクセッション番号:KC522039.1、GenBankアクセッション番号:KC522038.1、GenBankアクセッション番号:KC522037.1、GenBankアクセッション番号:KC522036.1、GenBankアクセッション番号:KC522048.1、GenBankアクセッション番号:KC522047.1、GenBankアクセッション番号:KC522046.1、GenBankアクセッション番号:KC522045.1、GenBankアクセッション番号:KC522044.1、GenBankアクセッション番号:KC522043.1、GenBankアクセッション番号:KC522042.1、GenBankアクセッション番号:KC522041.1、GenBankアクセッション番号:KC522040.1、GenBankアクセッション番号:KC522039.1、GenBankアクセッション番号:KC522038.1、GenBankアクセッション番号:KC522037.1、GenBankアクセッション番号:KC522036.1、GenBankアクセ
ッション番号:KC522061.1、GenBankアクセッション番号:KC522060.1、GenBankアクセッション番号:KC522059.1、GenBankアクセッション番号:KC522058.1、GenBankアクセッション番号:KC522057.1、GenBankアクセッション番号:KC522056.1、GenBankアクセッション番号:KC522055.1、GenBankアクセッション番号:KC522054.1、GenBankアクセッション番号:KC522053.1、GenBankアクセッション番号:KC522052.1、GenBankアクセッション番号:KC522051.1、GenBankアクセッション番号:KC522050.1、GenBankアクセッション番号:KC522049.1、GenBankアクセッション番号:KC522074.1、GenBankアクセッション番号:KC522073.1、GenBankアクセッション番号:KC522072.1、GenBankアクセッション番号:KC522071.1、GenBankアクセッション番号:KC522070.1、GenBankアクセッション番号:KC522069.1、GenBankアクセッション番号:KC522068.1、GenBankアクセッション番号:KC522067.1、GenBankアクセッション番号:KC522066.1、GenBankアクセッション番号:KC522065.1、GenBankアクセッション番号:KC522064.1、GenBankアクセッション番号:KC522063.1、またはGenBankアクセッション番号:KC522062.1)を挙げることができる。
ッション番号:KC522061.1、GenBankアクセッション番号:KC522060.1、GenBankアクセッション番号:KC522059.1、GenBankアクセッション番号:KC522058.1、GenBankアクセッション番号:KC522057.1、GenBankアクセッション番号:KC522056.1、GenBankアクセッション番号:KC522055.1、GenBankアクセッション番号:KC522054.1、GenBankアクセッション番号:KC522053.1、GenBankアクセッション番号:KC522052.1、GenBankアクセッション番号:KC522051.1、GenBankアクセッション番号:KC522050.1、GenBankアクセッション番号:KC522049.1、GenBankアクセッション番号:KC522074.1、GenBankアクセッション番号:KC522073.1、GenBankアクセッション番号:KC522072.1、GenBankアクセッション番号:KC522071.1、GenBankアクセッション番号:KC522070.1、GenBankアクセッション番号:KC522069.1、GenBankアクセッション番号:KC522068.1、GenBankアクセッション番号:KC522067.1、GenBankアクセッション番号:KC522066.1、GenBankアクセッション番号:KC522065.1、GenBankアクセッション番号:KC522064.1、GenBankアクセッション番号:KC522063.1、またはGenBankアクセッション番号:KC522062.1)を挙げることができる。
代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得るCoVのSタンパク質としては、例えば、FCov.FIPV.79.1146.VR.2202(GenBankアクセッション番号NV_007025)、感染性胃腸炎ウイルス(TGEV)(GenBankアクセッション番号NC_002306;GenBankアクセッション番号Q811789.2;GenBankアクセッション番号DQ811786.2;GenBankアクセッション番号DQ811788.1;GenBankアクセッション番号DQ811785.1;GenBankアクセッション番号X52157.1;GenBankアクセッション番号AJ011482.1;GenBankアクセッション番号KC962433.1;GenBankアクセッション番号AJ271965.2;GenBankアクセッション番号JQ693060.1;GenBankアクセッション番号KC609371.1;GenBankアクセッション番号JQ693060.1;GenBankアクセッション番号JQ693059.1;GenBankアクセッション番号JQ693058.1;GenBankアクセッション番号JQ693057.1;GenBankアクセッション番号JQ693052.1;GenBankアクセッション番号JQ693051.1;GenBankアクセッション番号JQ693050.1)、またはブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)(GenBankアクセッション番号NC_001961.1;GenBankアクセッション番号DQ811787)を挙げることができる。
代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得るCoVのSタンパク質としては、例えば、BtCoV.1A.AFCD62(GenBankアクセッション番号NC_010437)、BtCoV.1B.AFCD307(GenBankアクセッション番号NC_010436)、BtCov.HKU8.AFCD77(GenBankアクセッション番号NC_010438)、BtCoV.512.2005(GenBankアクセッション番号DQ648858)、ブタ流行性下痢ウイルスPEDV.CV777(GenBankアクセッション番号NC_003436、GenBankアクセッション番号DQ355224.1、GenBankアクセッション番号DQ355223.1、GenBankアクセッション番号DQ355221.1、GenBankアクセッション番号JN601062.1、GenBankアクセッション番号N601061.1、GenBankアクセッション番号JN601060.1、GenBankアクセッション番号JN601059.1、GenBankアクセッション番号JN601058.1、GenBankアクセッション番号JN601057.1、GenBankアクセッション番号JN601056.1、GenBankアクセッション番号JN601055.1、GenBankアクセッション番号JN601054.1、GenBankアクセッション番号JN601053.1、GenBankアクセッション番号JN601052.1、GenBankアクセッション番号JN400902.1、GenBankアクセッション番号JN547395.1、GenBankアクセッション番号FJ687473.1、GenBankアクセッション番号FJ687472.1、GenBankアクセッション番号FJ687471.1、GenBankアクセッション番号FJ687470.1、GenBankアクセッション番号FJ687469.1、GenBankアクセッション番号FJ687468.1、GenBankアクセッション番号FJ687467.1、GenBankアクセッション番号FJ687466.1、GenBankアクセッション番号FJ687465.1、GenBankアクセッション番号FJ687464.1、GenBankアクセッション番号FJ687463.1、GenBankアクセッション番号FJ687462.1、GenBankアクセッション番号FJ687461.1、GenBankアクセッション番号FJ687460.1、GenBankアクセッション番号FJ687459.1、GenBankアクセッション番号FJ687458.1、GenBankアクセッション番号FJ687457.1、GenBankアクセッション番号FJ687456.1、GenBankアクセッション番号FJ687455.1、GenBankアクセッション番号FJ687454.1、GenBankアクセッション番号FJ687453、GenBankアクセッション番号FJ687452.1、GenBankアクセッション番号FJ687451.1、GenBankアクセッション番号FJ687450.1、GenBankアクセッション番号FJ687449.1、GenBankアクセッション番号AF500215.1、GenBankアクセッション番号KF476061.1、GenBankアクセッション番号KF476060.1、GenBankアクセッション番号KF476059.1、GenBankアクセッション番号KF476058.1、GenBankアクセッション番号KF476057.1、GenBankアクセッション番号KF476056.1、GenBankアクセッション番号KF476055.1、GenBankアクセッション番号KF476054.1、GenBankアクセッション番号KF476053.1、GenBankアクセッション番号KF476052.1、GenBankアクセッション番号KF476051.1、GenBankアクセッション番号KF476050.1、GenBankアクセッション番号KF476049.1、GenBankアクセッション番号KF476048.1、GenBankアクセッション番号KF177258.1、GenBankアクセッション番号KF177257.1、GenBankアクセッション番号KF177256.1、GenBankアクセッション番号KF177255.1)、HCoV.229E(GenBankアクセッション番号NC_002645)、HCoV.NL63.Amsterdam.I(GenBankアクセッション番号NC_005831)、BtCoV.HKU2.HK.298.2006(GenBankアクセッション番号EF203066)、BtCoV.HKU2.HK.33.2006(GenBankアクセッション番号EF203067)、BtCoV.HKU2.HK.46.2006(GenBankアクセッション番号EF203065)、またはBtCoV.HKU2.GD.430.2006(GenBankアクセッション番号EF203064)を挙げることができる。
代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得るCoVのSタンパク質としては、例えば、HCoV.HKU1.C.N5(GenBankアクセッション番号DQ339101)、MHV.A59(GenBankアクセッション番号NC001846)、PHEV.VW572(GenBankアクセッション番号NC007732)、HCoV.OC43.ATCC.VR.759(GenBankアクセッション番号NC_005147)、またはウシ腸管コロナウイルス(BCoV.ENT)(GenBankアクセッション番号NC_003045)を挙げることができる。
代替的に、本開示の抗体または抗原結合抗体フラグメントが特異的に結合し得るCoVのSタンパク質としては、例えば、BtCoV.HKU9.2(GenBankアクセッション番号EF065514)、BtCoV.HKU9.1(GenBankアクセッション番号NC_009021)、BtCoV.HkU9.3(GenBankアクセッション番号EF065515)、またはBtCoV.HKU9.4(GenBankアクセッション番号EF065516)を挙げることができる。
いくつかの場合において、本開示に従う抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、CoV-S(例えば、SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-2-S、及び/または上に挙げたCoV Sタンパク質のいずれか)に、(i)100nM以下、(ii)約10nM以下、(iii)約1nM以下、(iv)約100pM以下、(v)約10pM以下、(vi)約1pM以下、または(vii)約0.1pM以下の解離定数(KD)で結合する。
本開示は、任意選択で親和性成熟していてもよいCoV-S(ヒトCoV-Sを含む)に結合する例示的な抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。CoV-Sに結合する他の抗体またはその抗原結合フラグメント(異なるCDR及びエピトープ特異性を有するものを含む)は、本明細書の開示内容を用いて、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて得ることができる。このような抗体及びその抗原結合フラグメントは、in vivoでCoV-Sの生物学的作用をアンタゴナイズするため、COV-S関連状態(特にコロナウイルス感染を含む)の治療または防止に有用である。好ましい実施形態において、本開示に従う抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントの1つ以上のCDR、VL鎖、及び/またはVH鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本開示に従う抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、COV-S及び宿主細胞上のその受容体(複数可)(例えば、ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4、もしくはCD26)または宿主細胞上のSタンパク質プライミングタンパク質(例えば、TMPRSS2)の相互作用を妨害、ブロック、低減、または調節すると考えられる。Sタンパク質の受容体との結合がブロックまたは低減されると、CoVビリオンは細胞への侵入が妨げられ得、すなわち、さらなる細胞への感染が防止される。また、Sタンパク質がSタンパク質プライミングタンパク質に結合するのを防止された場合、Sタンパク質が活性化されないため、受容体を介した宿主細胞侵入が低減され得、すなわち、さらなる細胞への感染が防止される。
いくつかの場合において、本開示に従う抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、「中和性」であり、例えば、CoV-Sと宿主受容体またはプライミングタンパク質との特異的相互作用を実質的または完全に防止する。その結果、CoVビリオンは、例えばFc受容体に媒介される食作用または細胞外でのビリオンの時間増加による単なる食作用により、食細胞などの宿主の免疫細胞によって実質的または完全に除去され得る。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、CoV-Sが宿主細胞上のその受容体またはプライミングタンパク質に特異的に結合するのを防止する位置及び/または方法でCoV-Sとの結合を保つことにより、CoV-Sを中和する。その結果、CoVビリオンは実質的にまたは完全に細胞への侵入を防止され得、すなわち、さらなる細胞への感染が防止される。ある特定の実施形態において、本開示に従う抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意選択で、本明細書の実施例に記載されているいずれかの中和アッセイによる測定において、in vitroで(i)約100nM以下、約50nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約5nM以下、約2nM以下、約1nM以下、約500pM以下、約200pM以下、約100pM以下、約50pM以下、約20pM以下、約10pM以下、約5pM以下、約2pM以下、もしくは約1pM以下のIC50で、及び/または(ii)約500ng/mL以下、約200ng/mL以下、約100ng/mL以下、約50ng/mL以下、約20ng/mL以下、約10ng/mL以下、約20ng/mL以下、約10mg/mL以下、約5ng/mL以下、約2ng/mL以下、もしくは約1ng/mL以下のIC50で、CoV(例えば、SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2)を中和することができる。
いくつかの場合において、本開示に従う抗CoV-S抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそのカクテルは、コロナウイルス感染宿主またはコロナウイルス感染に感受性を有する者(例えば、医療従事者)に投与されると、宿主がウイルスに対する有効な細胞媒介免疫応答を開始できるようにするのに十分な、及び/または他の治療法(例えば、薬物、抗ウイルス剤、もしくは他の生物製剤)により応答できるようにするのに十分な、宿主におけるコロナウイルスに対する中和応答(例えば、T細胞媒介性またはサイトカイン媒介性免疫応答)を促進することができる。
前述のように、本開示に従う抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは様々な用法を有する。例えば、主題の抗体及びフラグメントは、予防的または治療的用途、及び結合アッセイにおける診断に有用であり得る。主題の抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、CoV-S(特に、ヒトCoV-Sまたはそのリガンド)のアフィニティー精製及びCoV-S活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに有用である。いくつかの抗体またはその抗原結合フラグメントは、宿主細胞上のCoV-Sの受容体(複数可)(例えば、ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4、またはCD26)もしくは宿主細胞上のSタンパク質プライミングタンパク質(例えば、TMPRSS2)との結合の阻害、またはCOV-S媒介性活性及び/または生物学的作用の阻害に有用である。
本明細書で使用する場合、「COV-Sに関連する1つ以上の生物学的作用」という用語は、COV-Sに媒介され、誘導され、または他の形で起因し得る生物学的作用、例えば、結合特性、機能特性、及び生物学的意義のある他の特性を指す。非限定的なCOV-Sの例示的な生物学的作用としては、宿主細胞上のその受容体(複数可)(例えば、ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4、またはCD26)または宿主細胞上のSタンパク質プライミングタンパク質(例えば、TMPRSS2)へのCOV-Sの結合、ウイルス侵入を可能にするための宿主細胞の活性化、CoVの細胞内への侵入の結果としての(例えば、宿主細胞上のMHC分子のCoV抗原(複数可)の提示を介した)免疫細胞の活性化、及び炎症をもたらすことが挙げられる。主題抗CoV-S抗体は、これらの例示的なCoV-Sの生物学的活性の1つ、組合せ、または全てを阻害可能である。例えば、本明細書で提供する抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、CoVビリオンを中和したりCoVビリオンの感染性を低減したりすることができる。
本開示に従う抗体またはその抗原結合フラグメントは、様々な治療用途に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、CoVに関連する症状(例えば、限定されるものではないが、CoV-S感染に関連する症状)の治療に有用である。CoVは、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63を含む任意のCoVとすることができ、また、本明細書の上記で挙げた任意のCoV種であってもよい。
CoV感染関連の症状の具体的な例としては、発熱、咳、空咳、息切れまたは息苦しさ、疲労、痛み、鼻水、うっ血、咽喉痛、結膜炎、胸痛、頭痛、筋肉痛、悪寒、嗅覚消失及び味覚消失、ならびに下痢を含む胃腸症状がある。コロナウイルス感染に関連する合併症及び/または疾患/障害としては、例えば、気管支炎、肺炎、呼吸不全、急性呼吸不全、臓器不全、多臓器系不全、小児多系統炎症性症候群、急性呼吸窮迫症候群(血液中及び臓器中の酸素の低下を引き起こす重篤な肺の状態)、血栓、心臓状態、心筋障害、心筋炎、心不全、心停止、急性心筋梗塞、不整脈、静脈性血栓塞栓症、集中治療後症候群、ショック、アナフィラキシーショック、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、虚血性脳卒中、脳内出血、微小血管障害性血栓症、精神障害、痙攣、非痙攣性てんかん重積状態、外傷性脳損傷、脳卒中、無酸素性脳損傷、脳炎、可逆性白質脳症、壊死性脳症、感染後脳炎、自己免疫媒介性脳炎、急性散在性脳脊髄炎、急性腎損傷、急性肝損傷、膵損傷、免疫性血小板減少症、亜急性甲状腺炎、胃腸合併症、アスペルギルス症、別のウイルスもしくは細菌への感受性増加、及び/または妊娠関連合併症を挙げることができる。ある特定の疾患及び状態(例えば、高血圧、1型糖尿病、肝疾患、過体重、慢性肺疾患(嚢胞性線維症、肺線維症、及び喘息を含む)、移植、免疫抑制剤の使用、またはHIV感染による免疫系低下、ならびに脳及び神経系の状態)は、CoV感染に関連した合併症及び疾患のリスクを高める可能性がある。
主題の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、単独で、または他の活性薬剤または薬物(他の生物製剤を含む)とともに、CoV-Sのin vivo作用のブロック、阻害、または中和、あるいはCoV-Sと宿主細胞上のその受容体(複数可)(例えば、ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4、もしくはCD26)または宿主細胞上のSタンパク質プライミングタンパク質(例えば、TMPRSS2)との相互作用をブロックまたは阻害することが治療上望ましい任意の対象を治療するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、対象の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメント(例えば、ADI-58125)は、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用することができ、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADI-58122、ADI-58127、ADI-58129、ADI-58131、またはその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントはADI-58122である。1つの実施形態において、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントはADI-58127である。1つの実施形態において、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントはADI-58129である。1つの実施形態において、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントはADI-58131である。
本開示に従う例示的な抗CoV抗体及びその抗原結合フラグメントならびにその特異的なCDRをこのセクションで特定する。便宜上、各例示抗体またはその抗原結合フラグメント、及び対応する配列は、図1、2、及び36に示されているように、特定の命名法によって別々に識別される。
本開示を構成する抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、CoV-S(例えば、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-S2)に対し結合親和性を有する。本開示のいくつかの抗体は、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-S2に同様のKD(M)で結合し、一方本開示のいくつかの抗体は、SARS-CoV-S2よりも低いKD(M)(すなわち、より高い親和性)でSARS-CoV-Sに結合し、本開示のいくつかの抗体は、SARS-CoV-Sよりも低いKD(M)(すなわち、より高い親和性)でSARS-CoV-S-2に結合する。抗体における異なるCoV-Sタンパク質に対する親和性は、図7~12及び図14に示されている。
C.抗CoV-S抗体ポリペプチド配列及びそれをコードする核酸配列
本明細書で開示する抗体
抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメント、具体的には本明細書で提供されるものとしては、図1、2、及び36に示されるような抗体ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55691、ADI-55692、ADI-55693、ADI-55694、ADI-55695、ADI-55696、ADI-55697、ADI-55698、ADI-55699、ADI-55700、ADI-55701、ADI-55702、ADI-55703、ADI-55704、ADI-55705、ADI-55706、ADI-55707、ADI-55708、ADI-55709、ADI-55710、ADI-55711、ADI-55712、ADI-55713、ADI-55714、ADI-55715、ADI-55716、ADI-55717、ADI-55718、ADI-55719、ADI-55721、ADI-55722、ADI-55723、ADI-55724、ADI-55725、ADI-55726、ADI-55727、ADI-55728、ADI-55729、ADI-55730、ADI-55731、ADI-55732、ADI-55733、ADI-55734、ADI-55735、ADI-55736、ADI-55737、ADI-55738、ADI-55739、ADI-55740、ADI-55741、ADI-55742、ADI-55743、ADI-55744、ADI-55745、ADI-55746、ADI-55747、ADI-55748、ADI-55749、ADI-55750、ADI-55751、ADI-55752、ADI-55753、ADI-55754、ADI-55755、ADI-55756、ADI-55757、ADI-55758、ADI-55720、ADI-55760、ADI-55761、ADI-55762、ADI-55763、ADI-55765、ADI-55766、ADI-55767、ADI-55769、ADI-55770、ADI-55771、ADI-55775、ADI-55776、ADI-55777、ADI-55950、ADI-55951、ADI-55952、ADI-55953、ADI-55954、ADI-55955、ADI-55956、ADI-55957、ADI-55958、ADI-55959、ADI-55960、ADI-55961、ADI-55962、ADI-55963、ADI-55964、ADI-55965、ADI-55966、ADI-55967、ADI-55968、ADI-55969、ADI-55970、ADI-55972、ADI-55973、ADI-55974、ADI-55975、ADI-55976、ADI-55977、ADI-55978、ADI-55979、ADI-55980、ADI-55981、ADI-55982、ADI-55984、ADI-55986、ADI-55988、ADI-55989、ADI-55990、ADI-55992、ADI-55993、ADI-55994、ADI-55995、ADI-55996、ADI-55997、ADI-55998、ADI-55999、ADI-56000、ADI-56001、ADI-56002、ADI-56003、ADI-56004、ADI-56005、ADI-56006、ADI-56007、ADI-56008、ADI-56009、ADI-56010、ADI-56011、ADI-56012、ADI-56013、ADI-56014、ADI-56015、ADI-56016、ADI-56017、ADI-56018、ADI-56019、ADI-56020、ADI-56021、ADI-56022、ADI-56023、ADI-56024、ADI-56025、ADI-56026、ADI-56027、ADI-56028、ADI-56029、ADI-56030、ADI-56031、ADI-56032、ADI-56033、ADI-56034、ADI-56035、ADI-56037、ADI-56038、ADI-56039、ADI-56040、ADI-56041、ADI-56042、ADI-56043、ADI-56044、ADI-56045、ADI-56046、ADI-56047、ADI-56048、ADI-56049、ADI-56050、ADI-56051、ADI-56052、ADI-56053、ADI-56054、ADI-56055、ADI-56056、ADI-56057、ADI-56058、ADI-56059、ADI-56061、ADI-56062、ADI-56063、ADI-56064、ADI-56065、ADI-56066、ADI-56067、ADI-56068、ADI-56069、ADI-56070、ADI-56071、ADI-56072、ADI-56073、ADI-56074、ADI-56075、ADI-56076、ADI-56078、ADI-56079、ADI-56080、ADI-56081、ADI-56082、ADI-56083、ADI-56084、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988、及びこれらの抗原結合フラグメントが挙げられる。任意のFcバリアント(限定されるものではないが、表1に具体的に開示されているバリアントを含む)を、本明細書で開示する任意の可変配列と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、FcバリアントはLAバリアントであり、配列番号13のアミノ酸配列を含む。1つの実施形態において、抗体ADI-58125は、配列番号13のFcバリアントを含む。
本明細書で開示する抗体
抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメント、具体的には本明細書で提供されるものとしては、図1、2、及び36に示されるような抗体ADI-55688、ADI-55689、ADI-55690、ADI-55691、ADI-55692、ADI-55693、ADI-55694、ADI-55695、ADI-55696、ADI-55697、ADI-55698、ADI-55699、ADI-55700、ADI-55701、ADI-55702、ADI-55703、ADI-55704、ADI-55705、ADI-55706、ADI-55707、ADI-55708、ADI-55709、ADI-55710、ADI-55711、ADI-55712、ADI-55713、ADI-55714、ADI-55715、ADI-55716、ADI-55717、ADI-55718、ADI-55719、ADI-55721、ADI-55722、ADI-55723、ADI-55724、ADI-55725、ADI-55726、ADI-55727、ADI-55728、ADI-55729、ADI-55730、ADI-55731、ADI-55732、ADI-55733、ADI-55734、ADI-55735、ADI-55736、ADI-55737、ADI-55738、ADI-55739、ADI-55740、ADI-55741、ADI-55742、ADI-55743、ADI-55744、ADI-55745、ADI-55746、ADI-55747、ADI-55748、ADI-55749、ADI-55750、ADI-55751、ADI-55752、ADI-55753、ADI-55754、ADI-55755、ADI-55756、ADI-55757、ADI-55758、ADI-55720、ADI-55760、ADI-55761、ADI-55762、ADI-55763、ADI-55765、ADI-55766、ADI-55767、ADI-55769、ADI-55770、ADI-55771、ADI-55775、ADI-55776、ADI-55777、ADI-55950、ADI-55951、ADI-55952、ADI-55953、ADI-55954、ADI-55955、ADI-55956、ADI-55957、ADI-55958、ADI-55959、ADI-55960、ADI-55961、ADI-55962、ADI-55963、ADI-55964、ADI-55965、ADI-55966、ADI-55967、ADI-55968、ADI-55969、ADI-55970、ADI-55972、ADI-55973、ADI-55974、ADI-55975、ADI-55976、ADI-55977、ADI-55978、ADI-55979、ADI-55980、ADI-55981、ADI-55982、ADI-55984、ADI-55986、ADI-55988、ADI-55989、ADI-55990、ADI-55992、ADI-55993、ADI-55994、ADI-55995、ADI-55996、ADI-55997、ADI-55998、ADI-55999、ADI-56000、ADI-56001、ADI-56002、ADI-56003、ADI-56004、ADI-56005、ADI-56006、ADI-56007、ADI-56008、ADI-56009、ADI-56010、ADI-56011、ADI-56012、ADI-56013、ADI-56014、ADI-56015、ADI-56016、ADI-56017、ADI-56018、ADI-56019、ADI-56020、ADI-56021、ADI-56022、ADI-56023、ADI-56024、ADI-56025、ADI-56026、ADI-56027、ADI-56028、ADI-56029、ADI-56030、ADI-56031、ADI-56032、ADI-56033、ADI-56034、ADI-56035、ADI-56037、ADI-56038、ADI-56039、ADI-56040、ADI-56041、ADI-56042、ADI-56043、ADI-56044、ADI-56045、ADI-56046、ADI-56047、ADI-56048、ADI-56049、ADI-56050、ADI-56051、ADI-56052、ADI-56053、ADI-56054、ADI-56055、ADI-56056、ADI-56057、ADI-56058、ADI-56059、ADI-56061、ADI-56062、ADI-56063、ADI-56064、ADI-56065、ADI-56066、ADI-56067、ADI-56068、ADI-56069、ADI-56070、ADI-56071、ADI-56072、ADI-56073、ADI-56074、ADI-56075、ADI-56076、ADI-56078、ADI-56079、ADI-56080、ADI-56081、ADI-56082、ADI-56083、ADI-56084、ADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988、及びこれらの抗原結合フラグメントが挙げられる。任意のFcバリアント(限定されるものではないが、表1に具体的に開示されているバリアントを含む)を、本明細書で開示する任意の可変配列と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、FcバリアントはLAバリアントであり、配列番号13のアミノ酸配列を含む。1つの実施形態において、抗体ADI-58125は、配列番号13のFcバリアントを含む。
図1、2、及び36は、個々の抗体のVH、VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3、VH FR4、VL、VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3、及びVL FR4に割り当てられた配列番号、ならびに個々の抗体のVH及びVLの核酸配列に割り当てられた配列番号を示したものである。
例えば、抗体ADI-55688の場合、
(i)ADI-55688のVHは、配列番号102のアミノ酸配列を含み、
(ii)ADI-55688のVH FR1は、配列番号103のアミノ酸配列を含み、
(iii)ADI-55688のVH CDR1は、配列番号104のアミノ酸配列を含み、
(iv)ADI-55688のVH FR2は、配列番号105のアミノ酸配列を含み、
(v)ADI-55688のVH CDR2は、配列番号106のアミノ酸配列を含み、
(vi)ADI-55688のVH FR3は、配列番号107のアミノ酸配列を含み、
(vii)ADI-55688のVH CDR3は、配列番号108のアミノ酸配列を含み、
(viii)ADI-55688のVH FR4は、配列番号109のアミノ酸配列を含み、
(ix)ADI-55688のVHは、配列番号110の核酸配列によってコードされ、
(x)ADI-55688のVLは、配列番号112のアミノ酸配列を含み、
(xi)ADI-55688のVL FR1は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、
(xii)ADI-55688のVL CDR1は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、
(xiii)ADI-55688のVL FR2は、配列番号115のアミノ酸配列を含み、
(xiv)ADI-55688のVL CDR2は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、
(xv)ADI-55688のVL FR3は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、
(xvi)ADI-55688のVL CDR3は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、
(xvii)ADI-55688のVL FR4は、配列番号119のアミノ酸配列を含み、
(xviii)ADI-55688のVLは、配列番号120の核酸配列によってコードされる。
(i)ADI-55688のVHは、配列番号102のアミノ酸配列を含み、
(ii)ADI-55688のVH FR1は、配列番号103のアミノ酸配列を含み、
(iii)ADI-55688のVH CDR1は、配列番号104のアミノ酸配列を含み、
(iv)ADI-55688のVH FR2は、配列番号105のアミノ酸配列を含み、
(v)ADI-55688のVH CDR2は、配列番号106のアミノ酸配列を含み、
(vi)ADI-55688のVH FR3は、配列番号107のアミノ酸配列を含み、
(vii)ADI-55688のVH CDR3は、配列番号108のアミノ酸配列を含み、
(viii)ADI-55688のVH FR4は、配列番号109のアミノ酸配列を含み、
(ix)ADI-55688のVHは、配列番号110の核酸配列によってコードされ、
(x)ADI-55688のVLは、配列番号112のアミノ酸配列を含み、
(xi)ADI-55688のVL FR1は、配列番号113のアミノ酸配列を含み、
(xii)ADI-55688のVL CDR1は、配列番号114のアミノ酸配列を含み、
(xiii)ADI-55688のVL FR2は、配列番号115のアミノ酸配列を含み、
(xiv)ADI-55688のVL CDR2は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、
(xv)ADI-55688のVL FR3は、配列番号117のアミノ酸配列を含み、
(xvi)ADI-55688のVL CDR3は、配列番号118のアミノ酸配列を含み、
(xvii)ADI-55688のVL FR4は、配列番号119のアミノ酸配列を含み、
(xviii)ADI-55688のVLは、配列番号120の核酸配列によってコードされる。
同様に、抗体ADI-55689の場合、
(i)ADI-55689のVHは、配列番号202のアミノ酸配列を含み、
(ii)ADI-55689のVH FR1は、配列番号203のアミノ酸配列を含み、
(iii)ADI-55689のVH CDR1は、配列番号204のアミノ酸配列を含み、
(iv)ADI-55689のVH FR2は、配列番号205のアミノ酸配列を含み、
(v)ADI-55689のVH CDR2は、配列番号206のアミノ酸配列を含み、
(vi)ADI-55689のVH FR3は、配列番号207のアミノ酸配列を含み、
(vii)ADI-55689のVH CDR3は、配列番号208のアミノ酸配列を含み、
(viii)ADI-55689のVH FR4は、配列番号209のアミノ酸配列を含み、
(ix)ADI-55689のVHは、配列番号210の核酸配列によってコードされ、
(x)ADI-55689のVLは、配列番号212のアミノ酸配列を含み、
(xi)ADI-55689のVL FR1は、配列番号213のアミノ酸配列を含み、
(xii)ADI-55689のVL CDR1は、配列番号214のアミノ酸配列を含み、
(xiii)ADI-55689のVL FR2は、配列番号215のアミノ酸配列を含み、
(xiv)ADI-55689のVL CDR2は、配列番号216のアミノ酸配列を含み、
(xv)ADI-55689のVL FR3は、配列番号217のアミノ酸配列を含み、
(xvi)ADI-55689のVL CDR3は、配列番号218のアミノ酸配列を含み、
(xvii)ADI-55689のVL FR4は、配列番号219のアミノ酸配列を含み、
(xviii)ADI-55689のVLは、配列番号220の核酸配列によってコードされる。
(i)ADI-55689のVHは、配列番号202のアミノ酸配列を含み、
(ii)ADI-55689のVH FR1は、配列番号203のアミノ酸配列を含み、
(iii)ADI-55689のVH CDR1は、配列番号204のアミノ酸配列を含み、
(iv)ADI-55689のVH FR2は、配列番号205のアミノ酸配列を含み、
(v)ADI-55689のVH CDR2は、配列番号206のアミノ酸配列を含み、
(vi)ADI-55689のVH FR3は、配列番号207のアミノ酸配列を含み、
(vii)ADI-55689のVH CDR3は、配列番号208のアミノ酸配列を含み、
(viii)ADI-55689のVH FR4は、配列番号209のアミノ酸配列を含み、
(ix)ADI-55689のVHは、配列番号210の核酸配列によってコードされ、
(x)ADI-55689のVLは、配列番号212のアミノ酸配列を含み、
(xi)ADI-55689のVL FR1は、配列番号213のアミノ酸配列を含み、
(xii)ADI-55689のVL CDR1は、配列番号214のアミノ酸配列を含み、
(xiii)ADI-55689のVL FR2は、配列番号215のアミノ酸配列を含み、
(xiv)ADI-55689のVL CDR2は、配列番号216のアミノ酸配列を含み、
(xv)ADI-55689のVL FR3は、配列番号217のアミノ酸配列を含み、
(xvi)ADI-55689のVL CDR3は、配列番号218のアミノ酸配列を含み、
(xvii)ADI-55689のVL FR4は、配列番号219のアミノ酸配列を含み、
(xviii)ADI-55689のVLは、配列番号220の核酸配列によってコードされる。
他の全ての抗体におけるこのような配列及びアイソタイプに対応するアミノ酸配列及び核酸配列及び配列識別子は、図1、2、及び36に開示する。
本開示の抗体の変形形態及びこのような変形形態をコードするポリヌクレオチド配列
1つの実施形態において、本明細書では、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つの、(i)VH CDR3と同じであるVH CDR、(ii)VH CDR3及びVL CDR3の両方と同じであるVH CDR3及びVL CDR3、(iii)対応するCDR(複数可)と同じである少なくとも1、2、3、4、5、もしくは6つのCDR、または(iv)6つのCDRと全て同じである6つのCDR、を含む抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントが開示される。
1つの実施形態において、本明細書では、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つの、(i)VH CDR3と同じであるVH CDR、(ii)VH CDR3及びVL CDR3の両方と同じであるVH CDR3及びVL CDR3、(iii)対応するCDR(複数可)と同じである少なくとも1、2、3、4、5、もしくは6つのCDR、または(iv)6つのCDRと全て同じである6つのCDR、を含む抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントが開示される。
さらなる実施形態において、本明細書では、任意選択で親和性成熟していてもよい抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントであって、すぐ上の段落のCDR要件(i)~(iv)のうちの1つを含み、さらに、(a)VHが、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つのVHのアミノ酸配列に対し、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(b)VLが、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つのVLのアミノ酸配列に対し、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントが開示される。
さらなる実施形態において、本開示は、任意選択で親和性成熟していてもよい抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントであって、すぐ上の段落のVH及びVLの要件(i)~(iv)のうちの1つを含み、さらに、(a)重鎖が、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つの重鎖のアミノ酸配列に対し、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(b)軽鎖が、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つの軽鎖のアミノ酸配列に対し、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントを企図している。
さらなる実施形態において、本開示は、任意選択で親和性成熟していてもよい抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントであって、すぐ上の段落のCDRの要件(i)~(iv)のうちの1つを含み、さらに(a)VHが、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つのVHと同一であり、(b)VLが、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の本開示の抗体のいずれか1つのVLと同一である、抗CoV-S抗体または抗原結合抗体フラグメントを企図している。
他の実施形態において、本開示は、任意選択で親和性成熟していてもよい抗体及び抗原結合フラグメントであって、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体の1つと同じエピトープに結合するCOV-Sに対する結合特異性を有する、抗体及び抗原結合フラグメントを含む。
他の実施形態において、本開示は、任意選択で親和性成熟していてもよい、COV-Sに対する結合特異性を有する抗体及び抗原結合フラグメントであって、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗体及び抗原結合フラグメントを含む。
他の実施形態において、抗CoV-S抗体及び抗原結合フラグメントは、任意選択で親和性成熟していてもよく、上記のFR、CDR、VH及びVL配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列(これらの全てを含む)、またはこれらに対し少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一である配列のうちの1つ以上の組合せを含むか、または代替的にそれからなることができる。
さらなる実施形態において、抗原結合フラグメントは、COV-Sに対する結合特異性を有するFabフラグメントを含むか、または代替的にそれからなる。Fabフラグメントは、好ましくは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つのVH及びVL配列、またはそれに対し少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む。この実施形態はさらに、COV-Sに対する結合特異性を保持しながら、このようなVH及びVL配列の付加、欠失、及びバリアントを含むFabを含む。
いくつかの実施形態において、Fabフラグメントは、親完全抗体の酵素消化(例えば、パパイン)により産生することができる。別の実施形態において、抗CoV-S抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つ)及びそのFabフラグメントは、哺乳類細胞(例えば、CHO、NSO、またはHEK293細胞)、真菌、昆虫、または微生物システム(例えば、酵母細胞)での発現によって産生することができる。
さらなる実施形態において、本明細書では、COV-Sに対する結合特異性を有する抗体ポリペプチド(本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つのVH及びVLを含む)、ならびにフラグメント、バリアント、任意選択で親和性成熟バリアント、ならびに上記に記載のFR、CDR、VH及びVL配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列のうちの1つ以上の組合せ(これらの全てを含む)、またはこれらに少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列をコードするポリヌクレオチドが開示される。
他の実施形態において、本開示は、(i)本明細書ならびに図1、図2、及び図36に記載の抗体のいずれか1つのVHと同じであるVHと、(ii)本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の別の抗体のVLと同じであるVLとを含む単離抗CoV-S抗体及び抗原結合フラグメント、またはそのバリアントであって、任意選択で、当該VHもしくはVLポリペプチドのフレームワーク領域残基(「FR残基」)及び/またはCDR残基のうちの1つ以上が別のアミノ酸残基で置換され、その結果、COV-Sに特異的に結合する抗CoV-S抗体がもたらされる、単離抗CoV-S抗体及び抗原結合フラグメント、またはそのバリアントを企図している。
また、本開示は、これらの抗体のヒト化、霊長類化、及び他のキメラ形態も含む。キメラ及びヒト化抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常領域に由来するFcを含むことができる。
いくつかの実施形態において、キメラまたはヒト化抗体もしくはフラグメントまたはVHもしくはVLポリペプチドは、1つ以上のヒト抗体(例えば、クローンヒトB細胞集団から同定されたヒト抗体)を起源とするか、またはそれに由来する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書で開示する抗CoV-S抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示する抗CoV-S抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書で開示する抗体またはその抗原結合フラグメントとのCoV-Sの結合に関して競合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書で開示する抗体または抗原結合フラグメントのいずれかをコードする核酸分子を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書で開示する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬または診断組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、対象におけるCoV-Sレベルの上昇に関連する状態を治療または防止するための方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、本明細書で開示する少なくとも1つの単離抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与することを含む。
いくつかの態様において、本開示は、対象におけるCOV-Sとその受容体(例えば、ACE2、L-SIGN、CD209L、DPP4、CD26)またはSタンパク質プライミングタンパク質(例えば、TMPRSS2)との結合を阻害する方法を提供し、当該方法は、本明細書で開示する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与することを含む。例えば、ADI-55689、ADI-55993、ADI-56000、ADI-56046、ADI-56010、ADI-55688、ADI-56032、ADI-55690、及びADI-55951のうちの1つ以上を投与することで、COV-Sがその受容体(例えば、ACE2)に結合するのを阻害することができる。
いくつかの態様において、本開示は、CoV-Sに選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体またはその抗原結合フラグメントはCoV-2に、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、または10-13M以下のKDで結合し、好ましくは5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、または10-12M以下のKDで結合し、より好ましくは、約100pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約25pM未満、約1pM未満、約10pM~約100pM、約1pM~約100pM、または約1pM~約10pMのKDで結合する。好ましくは、抗CoV-S抗体または抗原結合フラグメントは、SARS-CoV-SまたはSARS-CoV-2-S以外のCoVのSタンパク質に対し交差反応性を有する。
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、エフェクター部分(例えば、化学的リンカー)、検出可能部分(例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光材料、放射性材料、及び化学発光部分)、または機能的部分(例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞傷害剤、及び放射性材料)を付加するために翻訳後修飾することができる。
また、抗体及びその抗原結合フラグメントは、さらなる利点(例えば、ポリペプチドの溶解性、安定性、及び循環時間(in vivo半減期)の増加、または免疫原性の減少)をもたらすために化学修飾されてもよい(米国特許第4,179,337号を参照)。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール)から選択することができる。抗体及びそのフラグメントは、分子内のランダムな位置または分子内の所定の位置で修飾することができ、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の結合した化学部分を含むことができる。
ポリマーは任意の分子量とすることができ、分岐していても分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱い及び製造の容易さにおいて約1kDa~約100kDaである(「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物において、記載された分子量より大きい分子もあれば小さい分子もあることを示す)。所望の治療プロファイル(例えば、所望の持続放出期間、もしある場合は生物学的活性への影響、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の既知の効果)に応じて他のサイズが使用されることもある。例えば、ポリエチレングリコールの平均分子量は、約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、または100,000kDaとすることができる。分枝状ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第5,643,575号;Morpurgo et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,56:59-72(1996);Vorobjev et al.,Nucleosides and Nucleotides,18:2745-2750(1999);及びCaliceti et al.,Bioconjug.Chem.,10:638-646(1999)で説明されており、これらの各々の開示内容は、参照により本明細書に援用される。
当業者に利用可能な結合方法は多数存在する(例えば、EP0 401 384(参照により本明細書に援用される)(PEGをG-CSFとカップリングする方法を開示);及びMalik et al.,Exp.Hematol.,20:1028-1035(1992)(塩化トレジルを用いたGM-CSFのペグ化を報告)を参照)。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基(例えば、遊離アミノまたはカルボキシル基)を介し、アミノ酸残基を通じて共有結合することができる。反応性基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合することができる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基及びN末端アミノ酸残基を挙げることができ、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、及びC末端アミノ酸残基を挙げることができる。またスルフヒドリル基も、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として使用することができる。治療目的において好ましいのは、アミノ基での結合であり、例えば、N末端やリジン基での結合である。
上記のように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいずれかとの結合を介してタンパク質に結合することができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基との共有結合を介しポリペプチドに結合することができる。ポリエチレングリコールを特定のアミノ酸残基(例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはシステイン)または2つ以上のアミノ酸残基(例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、及びこれらの組合せ)に結合するために1つ以上の反応化学を用いることができる。
代替的に、in vivo半減期が増加した抗体またはその抗原結合フラグメントを、アルブミン(限定されるものではないが、組換えヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む(例えば、米国特許第5,876,969号、EP0 413 622、及び米国特許第5,766,883号(その全体が参照により本明細書に援用される)を参照))あるいは他の循環血液タンパク質(例えば、トランスフェリンまたはフェリチン)との融合によって産生することができる。好ましい実施形態において、本開示のポリペプチド及び/または抗体(そのフラグメントもしくはバリアントを含む)は、ヒト血清アルブミンの成熟形態(すなわち、EP0 322 094の図1及び2に示されるヒト血清アルブミンのアミノ酸1~585)(その全体が参照により本明細書に援用される)と融合している。本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本開示に包含される。
検出可能部分に関して、さらに例示的な酵素としては、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。さらなる例示的な蛍光材料としては、限定されるものではないが、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン、フィコエリトリン、及びダンシルクロリドが挙げられる。さらなる例示的な化学発光部分としては、限定されるものではないが、ルミノールが挙げられる。さらなる例示的な生物発光材料としては、限定されるものではないが、ルシフェリン及びイクオリンが挙げられる。さらなる例示的な放射性材料としては、限定されるものではないが、ヨウ素125(125I)、炭素14(14C)、硫黄35(35S)、トリチウム(3H)、及びリン32(32P)が挙げられる。
抗体またはその抗原結合フラグメントを検出可能部分などと結合体化するための方法は当技術分野で知られており、例えば、Hunter et al.,Nature,144:945(1962);David et al.,Biochemistry,13:1014(1974);Pain et al.,J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygren,J.,Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)に記載されている方法がある。
本明細書に記載の実施形態はさらに、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、SMIP、キャメルボディ、ナノボディ、IgNAR、ポリペプチド、可変領域、及びCDRに実質的に相同なバリアント及び等価物を含む。これらは、例えば、保存的置換変異(すなわち、1つ以上のアミノ酸を類似のアミノ酸で置換すること)を含むことができる。例えば、保存的置換とは、あるアミノ酸を同じ一般的なクラス内の別のアミノ酸に置換することであり、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に、ある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換することである。保存的アミノ酸置換の意図は、当技術分野で周知されている。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の抗原結合フラグメント、可変領域、及びCDRのポリペプチド配列のいずれか1つ以上に対し少なくとも90%以上の配列相同性を有するポリペプチド配列を企図している。より好ましくは、本開示は、本明細書に記載の抗原結合フラグメント、可変領域、及びCDRのポリペプチド配列のいずれか1つ以上に対し少なくとも95%以上の配列相同性を有するポリペプチド配列、さらに好ましくは少なくとも98%以上の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも99%以上の配列相同性を有するポリペプチド配列を企図している。
核酸配列及びアミノ酸配列の間の相同性を判定する方法は、当業者に周知されている。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の抗原結合フラグメント、可変領域、及びCDRの上で挙げたポリペプチドホモログが、さらに抗CoV-S活性を有することを企図している。抗CoV-S活性の非限定的な例は本明細書に記載されており、例えば、CoV-Sがその受容体(例えば、ACE2またはL-SIGNまたはSタンパク質プライミングタンパク質)に結合するのを阻害して、細胞へのCoVの侵入を低減する能力である。
他の実施形態において、本開示はさらに、前述の配列のいずれか(限定されるものではないが、抗イディオタイプ抗体を含む)に結合する抗体の生成及び使用をさらに企図している。例示的な実施形態において、このような抗イディオタイプ抗体は、抗CoV-S抗体の作用を調節、低減、または中和するために、抗CoV-S抗体を受けた対象に投与することができる。このような抗体は、抗CoV-S抗体の存在を特徴とする自己免疫疾患の治療にも有用であり得る。このような抗体(例えば、抗イディオタイプ抗体)のさらなる例示的な使用は、本開示の抗CoV-S抗体の検出のための使用であり、例えば、対象の血液または他の体液中に存在する抗CoV-S抗体のレベルをモニターするための使用である。例えば、1つの実施形態において、本開示は、対象における当該抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントのin vivoレベルをモニターするために、または当該抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントを投与されている対象において当該抗CoV-S抗体を中和するために、抗イディオタイプ抗体を使用する方法を提供する。
本開示は、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のいずれかが本明細書に記載の他のポリヌクレオチド配列に置換されているものを含む抗CoV-S抗体も企図している。例えば、限定されるものではないが、本開示は、本明細書に記載のVL及びVH配列のいずれかの組合せを含む抗体を企図しており、そしてさらに、本明細書に記載のCDR配列のいずれかを本明細書に記載の他のCDR配列のいずれかに置換することによって得られる抗体を企図している。
本開示の別の実施形態は、哺乳類細胞(例えば、CHO、NSO、もしくはHEK-293細胞)、または真菌、昆虫、または微生物(例えば、酵母細胞)システム内での発現のために発現ベクターに組み込まれるこのようなポリヌクレオチドを企図している。本明細書に記載の本開示の1つの実施形態において、Fabフラグメントは、好適な宿主内で完全長ポリヌクレオチドを発現させた後に、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つを酵素消化(例えば、パパイン)させることによって産生することができる。別の実施形態において、抗CoV-S抗体(例えば、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つ)またはそのFabフラグメントは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体(好ましくは、ある特定の実施形態ではADI-57983(プライマー変異あり)、ADI-57978(プライマー変異あり)、ADI-56868(プライマー変異あり)、ADI-56443(プライマー変異あり)、ADI-56479(プライマー変異あり)、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、ADI-58129、ADI-58130、ADI-58131、ADI-58130_LCN30cQ、またはADI-59988)のいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを、哺乳類細胞(例えば、CHO、NSO、もしくはHEK293細胞)、真菌、昆虫、または微生物システム(例えば、酵母細胞)内で発現させることによって産生することができる。
また、当該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞及びベクターも企図されている。
本開示はさらに、本明細書に記載の可変重鎖及び軽鎖ポリペプチド配列ならびに個々のCDR(超可変領域)をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに当該ベクター配列を含む宿主細胞を企図している。1つの実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞(例えば、CHO細胞)である。1つの実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。
D.抗CoV-S抗体を含む抗体-薬物結合体
いくつかの態様において、本開示はさらに、(a)本明細書に記載の任意の抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(b)当該抗体または抗原結合抗体フラグメントと直接的または間接的に(例えば、リンカーを介して)結合体化した薬物とを含む、抗体-薬物結合体(ADC)を対象とする。
いくつかの態様において、本開示はさらに、(a)本明細書に記載の任意の抗体または抗原結合抗体フラグメントと、(b)当該抗体または抗原結合抗体フラグメントと直接的または間接的に(例えば、リンカーを介して)結合体化した薬物とを含む、抗体-薬物結合体(ADC)を対象とする。
いくつかの態様において、薬物は、限定されるものではないが、細胞傷害薬、アポトーシス薬、免疫賦活薬、抗微生物薬、抗細菌薬またはワクチン、抗ウイルス薬、駆虫薬、抗寄生虫薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン、抗線維化薬、免疫抑制薬、ステロイド、気管支拡張薬、ベータブロッカー、ACE阻害剤、酵素、セリンプロテアーゼ阻害剤、毒素、放射性同位体、化合物、低分子、低分子阻害剤、タンパク質、ペプチド、ベクター、プラスミド、ウイルス粒子、ナノ粒子、DNA分子、RNA分子、siRNA、shRNA、マイクロRNA、オリゴヌクレオチド、及び造影薬であり得る。
抗ウイルス薬は、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、またはリトナビルであり得る。駆虫薬はイベルメクチンであり得る。抗寄生虫薬は、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、またはアトバコンであり得る。抗細菌薬またはワクチンは結核ワクチンBCGであり得る。抗炎症薬は、シクレソニド、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ(toclizumab))、またはメタミゾールであり得る。抗ヒスタミン剤はベポタスチンであり得る。ACE阻害剤はモエキシプリルであり得る。CoV-Sのプライミングを阻害する薬物はセリンプロテアーゼ阻害剤(例えば、ナファモスタット)であり得る。
毒素は、細菌性、真菌性、植物性、もしくは動物性の毒素、またはそのフラグメントであり得る。例としては、限定されるものではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、アルファサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ダイアンチンタンパク質、またはPhytolacca Americanaタンパク質が挙げられる。
細胞傷害薬または抗増殖薬は、例えば、限定されるものではないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ククルビタシン、カエトシン(chaetocin)、カエトグロボシン、クラミドシン、カリケアマイシン、ネモルビシン、クリプトフィシン、メンサカルシン、アンサミトシン、マイトマイシンC、ゲルダナマシン、メケルカルマイシン(mechercharmycin)、レベッカマイシン、サフラシン、オキラクトマイシン、オリゴマイシン、アクチノマイシン、サンドラマイシン、ヒポテマイシン、ポリケトマイシン、ヒドロキシエリプチシン、チオコルヒチン、メトトレキサート、トリプトリド、タルトブリン、ラクタシスチン、ドラスタチン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、テロメスタチン、ツバスタチンA、コンブレタスタチン、メイタンシノイド、MMAD、MMAF、DM1、DM4、DTT、16-GMB-APA-GA、17-DMAP-GA、JW55、ピロロベンゾジアゼピン、SN-38、Ro5-3335、プワイナフィシン、デュオカルマイシン、バフィロマイシン、タキソイド、ツブリシン、フェルレノール、ルシオールA、フマジリン、ハイグロリジン、グルコピエリシジン、アマニチン、アンサトリエニン、シネルビン、ファラシジン、ファロイジン、フィトホンゴシン(phytosphongosine)、ピエリシジン、ポロネチン、フォドフィロトキシン、グラミシジンA、サンギナリン、シネファンギン、ヘルボキシジエン、ミクロコリンB、ミクロシスチン、ムスコトキシンA、トリトキシン、トリポリンA、ミオセベリン、ミトキシンB、ノクオリンA、プソイドラリック酸B(psuedolaric acid B)、プセウロチンA(pseurotin A)、シクロパミン、クルブリン、コルチシン、アフィジコリン、エングレリン、コルディセピン、アポプトリジン、エポチロンA、リマキノン、イサトロポロン、イソフィスツラリン、キナルドペプチン、イキサベピロン、アエロプリシニン、アルギノシン、アグロケリン(agrochelin)、エポチロン、またはこれらの誘導体であり得る(例えば、Polaakis P.et al.,Pharmacol Rev.2016 Jan;68(1):3-19.doi:10.1124/pr.114.009373を参照)(薬物は、Creative Biolabs(登録商標)を含む多くのベンダーから入手することができる)。
放射性同位体は、例えば、限定されるものではないが、At211、I131、In131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、またはLuの放射性同位体であり得る。
ある特定の実施形態において、薬物は、限定されるものではないが、MMAEまたはMMAFであり得る。
いくつかの実施形態において、Abまたは抗原結合Abフラグメントは、薬物と直接的に結合体化してADCを形成する。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合抗体フラグメントは、薬物と間接的に結合体化してADCを形成する。
任意の適切な結合体化法を使用してADCを生成することができる(例えば、Nolting B.Methods Mol Biol.2013;1045:71-100;Jain N.et al.,Pharm Res.2015 Nov;32(11):3526-40;Tsuchikama K.et al.,Protein Cell.2018 Jan;9(1):33-46;Polakis P.et al.,Pharmacol Rev.2016 Jan;68(1):3-19)。結合体化の実施に使用され得る方法の例としては、限定されるものではないが、化学的結合体化及び酵素的結合体化が挙げられる。
化学的結合体化は、例えば、限定されるものではないが、リジンアミドカップリング、システインカップリング、及び/または遺伝子操作による非天然アミノ酸の組込みを利用することができる。酵素的結合体化は、例えば、限定されるものではないが、ソルターゼを用いたペプチド転移、微生物トランスグルタミナーゼを用いたペプチド転移、及び/またはN-グリカン操作を利用することができる。
ある特定の態様において、1つ以上のクリーバブルリンカーを結合体化に使用することができる。クリーバブルリンカーは、例えば、限定されるものではないが、細胞外環境と細胞内環境との間の差(pH、酸化還元電位など)に応答して、または特定のリソソーム酵素に反応することにより、薬剤の切断を可能にすることができる。
クリーバブルリンカーの例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾンリンカー、カテプシンB応答性リンカーを含むペプチドリンカー(例えば、バリン-シトルリン(vc)リンカー)、ジスルフィドリンカー(例えば、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)(SPP)リンカーまたはN-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ブタノエート(SPDB)リンカー)、及びピロリン酸ジエステルリンカーが挙げられる。
代替的にまたは同時に、1つ以上の非クリーバブルリンカーを使用することができる。非クリーバブルリンカーの例としては、チオエーテルリンカー(例えば、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC))及びマレイミドカプロイル(mc)リンカーが挙げられる。概して、非クリーバブルリンカーはクリーバブルリンカーよりもタンパク質分解に対する耐性が高く、安定している。
E.抗CoV-S抗原結合抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体
いくつかの実施形態において、本開示に従うCoV-Sに特異的な化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)とすることができる。詳細には、本開示のCARは、CoV-Sに結合する抗原結合(AB)ドメインと、膜貫通(TM)ドメインと、細胞内シグナル伝達(ICS)ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、CARは、ABドメイン及び当該TMドメインを連結するヒンジを含むことができる。いくつかの実施形態において、CARは、1つ以上の共刺激(CS)ドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態において、本開示に従うCoV-Sに特異的な化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)とすることができる。詳細には、本開示のCARは、CoV-Sに結合する抗原結合(AB)ドメインと、膜貫通(TM)ドメインと、細胞内シグナル伝達(ICS)ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、CARは、ABドメイン及び当該TMドメインを連結するヒンジを含むことができる。いくつかの実施形態において、CARは、1つ以上の共刺激(CS)ドメインを含むことができる。
ABドメイン
本開示に従うCARは、COV-Sに結合する抗原結合(AB)ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CARのABドメインは、本明細書で開示する抗COV-S抗原結合抗体フラグメントのいずれかを含むことができる。
本開示に従うCARは、COV-Sに結合する抗原結合(AB)ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CARのABドメインは、本明細書で開示する抗COV-S抗原結合抗体フラグメントのいずれかを含むことができる。
いくつかの実施形態において、CARのABドメインは、本明細書で開示する抗COV-S抗体の抗原結合ドメインのいずれかを含むことができる。
いくつかの実施形態において、CARのABドメインは、本明細書で開示する抗COV-S抗体、抗COV-S抗原結合抗体フラグメント、抗COV-S多特異的Ab、抗COV-S多特異的抗原結合抗体フラグメント、及び抗COV-S ADCのいずれか、またはそのABDを含むことができる。
いくつかの実施形態において、CARのABドメインは抗COV-S scFvを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ABドメインは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つのVH及びVLを含むscFvに対し、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ABドメインは、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗体のいずれか1つと、COV-Sへの結合に関して競合することができる。
ヒンジ
いくつかの実施形態において、CARは、ABドメインとTMドメインとの間にヒンジ配列を含むことができる。当業者であれば、ヒンジ配列が柔軟性を促進する短いアミノ酸配列であることを理解するであろう(例えば、Woof J.M.et al.,Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004)を参照)。ヒンジ配列は、任意の好適な配列に由来するまたはそこから得られる任意の好適な分子であり得る。
いくつかの実施形態において、CARは、ABドメインとTMドメインとの間にヒンジ配列を含むことができる。当業者であれば、ヒンジ配列が柔軟性を促進する短いアミノ酸配列であることを理解するであろう(例えば、Woof J.M.et al.,Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004)を参照)。ヒンジ配列は、任意の好適な配列に由来するまたはそこから得られる任意の好適な分子であり得る。
いくつかの実施形態において、ヒンジ配列の長さは、CARの細胞外部分の所望の長さに基づいて最適化することができるが、標的分子内のエピトープの位置に基づく場合がある。例えば、エピトープが標的分子内の膜近傍領域にある場合、より長いヒンジが最適であり得る。
いくつかの実施形態において、ヒンジは、免疫グロブリンFc領域、例えば、IgG1 Fc領域、IgG2 Fc領域、IgG3 Fc領域、IgG4 Fc領域、IgE Fc領域、IgM Fc領域、またはIgA Fc領域の少なくとも一部分に由来するかまたはそれを含むことができる。ある特定の実施形態において、ヒンジは、そのCH2及びCH3ドメイン内に含まれるIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM、またはIgA免疫グロブリンFc領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、対応する免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分も含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒンジは、修飾免疫グロブリンFc領域、例えば、修飾IgG1 Fc領域、修飾IgG2 Fc領域、修飾IgG3 Fc領域、修飾IgG4 Fc領域、修飾IgE Fc領域、修飾IgM Fc領域、または修飾IgA Fc領域の少なくとも一部分に由来するかまたはそれを含む。修飾免疫グロブリンFc領域は、1つ以上の変異(例えば、点変異、挿入、欠失、重複)を有することができるが、その結果、ヒンジとFc受容体(FcR)との結合障害を引き起こす1つ以上のアミノ酸置換、修飾、または欠失がもたらされることがある。いくつかの態様において、修飾免疫グロブリンFc領域は、ヒンジと、限定されるものではないが、FcγRI、FcγR2A、FcγR2B1、Fcγ2B2、Fcγ3A、Fcγ3B、FcεRI、FcεR2、FcαRI、Fcα/μR、またはFcRnを含む1つ以上のFcRとの結合障害を引き起こす1つ以上のアミノ酸置換、修飾、または欠損をもたらす、1つ以上の変異を伴って設計することができる。
いくつかの態様において、免疫グロブリン定常領域の一部分は、ABドメイン(例えば、scFvまたはナノボディ)とTMドメインとの間のヒンジとして機能し得る。ヒンジは、ヒンジが存在しない場合と比較して、抗原結合後のCAR発現細胞の応答性が増加する長さとすることができる。いくつかの例において、ヒンジの長さは、12アミノ酸程度であるか、または12アミノ酸以下である。例示的なヒンジとしては、少なくとも約10~229アミノ酸、約10~200アミノ酸、約10~175アミノ酸、約10~150アミノ酸、約10~125アミノ酸、約10~100アミノ酸、約10~75アミノ酸、約10~50アミノ酸、約10~40アミノ酸、約10~30アミノ酸、約10~20アミノ酸、または約10~15アミノ酸(挙げられた範囲のいずれかの終点間の任意の整数を含む)を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒンジは、約12個以下のアミノ酸、約119個以下のアミノ酸、または約229個以下のアミノ酸を有する。例示的なヒンジとしては、CD28ヒンジ、IgG4ヒンジ単独、CH2及びCH3ドメインに結合したIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに結合したIgG4ヒンジが挙げられる。例示的なヒンジとしては、限定されるものではないが、Hudecek M.et al.(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153、国際特許出願公開第WO2014031687号、米国特許第8,822,647号または公開出願第US2014/0271635号に記載されているものが挙げられる。
既知のヒンジ配列としては、CD8α分子またはCD28分子に由来するものが挙げられる。
膜貫通(TM)ドメイン
TMドメインに関して、CARは、CARのABドメインと融合したTMドメインを含むように設計することができる。ABドメインとTMドメインとの間ヒンジ配列を挿入することができる。TMドメインは、天然または合成供給源に由来することができる。供給源が天然の場合、ドメインは膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。典型的には、TMドメインは膜貫通タンパク質の単一の膜貫通αへリックスを示し、内在性タンパク質としても知られている。TMドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ、もしくはCD3ゼータ、及び/またはこれらの機能的バリアントを含むTMドメイン(例えば、構造的(例えば、膜貫通)特性の実質的部分を保持するもの)に由来する(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域(複数可)を含む)ことができる。
TMドメインに関して、CARは、CARのABドメインと融合したTMドメインを含むように設計することができる。ABドメインとTMドメインとの間ヒンジ配列を挿入することができる。TMドメインは、天然または合成供給源に由来することができる。供給源が天然の場合、ドメインは膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。典型的には、TMドメインは膜貫通タンパク質の単一の膜貫通αへリックスを示し、内在性タンパク質としても知られている。TMドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ、もしくはCD3ゼータ、及び/またはこれらの機能的バリアントを含むTMドメイン(例えば、構造的(例えば、膜貫通)特性の実質的部分を保持するもの)に由来する(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域(複数可)を含む)ことができる。
代替的に、TMドメインは合成であってもよく、この場合、TMドメインは、主にロイシンやバリンなどの疎水性残基を含む。フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三つ組が合成TMドメインの各末端に見られることが好ましい。TMドメインは概して、膜内で熱力学的に安定している。それは、単一のαヘリックス、膜貫通βバレル、グラミシジンAのβヘリックス、または任意の他の構造であり得る。膜貫通ヘリックスの長さは通常約20アミノ酸である。
よく使用されるTMドメインは、CD28(例えば、ヒトCD28)のTM領域である。しばしば、短い(例えば、長さが2~10アミノ酸の)オリゴまたはポリペプチドスペーサーを使用して、CARのTMドメインとICSドメイン(複数可)との間の結合を形成する。
細胞内シグナル伝達(ICS)ドメイン及び共刺激(CS)ドメイン
CARのICSドメインまたは細胞質ドメインは、概して、CARが配置された細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を作動または誘発する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性(サイトカインの分泌を含む)であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ICSドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の一部分を指す。通常、全体のICSドメインを用いることができるが、多くの場合において全体の鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲内において、このような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ICSドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分なICSドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
CARのICSドメインまたは細胞質ドメインは、概して、CARが配置された細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を作動または誘発する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性(サイトカインの分泌を含む)であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ICSドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の一部分を指す。通常、全体のICSドメインを用いることができるが、多くの場合において全体の鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲内において、このような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ICSドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分なICSドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
既知のICSドメインの例としては、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を協調して開始するT細胞受容体(TCR)及び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
1つのICSドメインから生成されるシグナルだけでは、細胞の完全な活性化には不十分な場合があり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要となり得る。このような場合、CARの細胞質部分に共刺激ドメイン(CSドメイン)を含めることができる。CSドメインは、このような二次シグナルまたは共刺激シグナルを伝達するドメインである。いくつかの場合において、本開示のCARは2つ以上のCSドメインを含むことができる。CSドメイン(複数可)は、ICSドメインの上流にもICSドメインの下流にも配置することができる。
T細胞活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、TCRを通じて抗原依存的に一次活性化を開始するもの(一次細胞質シグナル伝達配列)、及び抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達配列)によって媒介される。一次細胞質シグナル伝達配列は、TCR複合体の一次活性化を刺激的な様式または阻害的な様式のいずれかで調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、すなわちITAMとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。このような細胞質シグナル伝達配列がCARのICSまたはCSドメインに含まれてもよい。
ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、リンパ球受容体鎖のICSドメイン、TCR/CD3複合体タンパク質、Fc受容体サブユニット、IL-2受容体サブユニット、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66d、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、Fcε RI、DAP10、及びDAP12に由来するものが挙げられる。よく使用されているICSドメインは、CD3ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの場合において、CD3ζ ICSドメインは、他の細胞質ドメイン(複数可)のうちの1つ以上と組み合わされることがある。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ ICSドメイン及びCSドメインを含むことができ、ここで、CS領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部分を指す。共刺激分子とは、リンパ球が抗原に対し効率的に応答するのに必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
共刺激分子の例としては、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、Tollリガンド受容体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8 α、CD8 β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CRTAM、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、CD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。CARのICSドメイン及びCSドメイン(複数可)は、ランダムなまたは指定の順序で、任意選択で短い(例えば、長さが2~10アミノ酸の)オリゴまたはポリペプチドリンカーを介して、互いに結合することができる。
例示的なCARコンストラクト
CARコンストラクトは、以下の形式:「ABドメイン-ヒンジ-TMドメイン-CSドメイン-ICSドメイン」を含むことができる。
CARコンストラクトは、以下の形式:「ABドメイン-ヒンジ-TMドメイン-CSドメイン-ICSドメイン」を含むことができる。
CARは、以下の例示的なコンストラクトのいずれかに対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。以下の例示的なコンストラクトにおいて、「抗CoV-S scFv」は、本明細書ならびに図1、2、及び36に記載の抗CoV-S抗体のいずれか1つのVH及びVLを(VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHの順で)結合することによって生成されたscFvであり得る。
いくつかの実施形態において、リーダー配列(LS)を、CARをコードするポリヌクレオチド配列の上流に配置することができる。リーダー配列は、細胞表面でのCARの発現を促進する。
さらなる修飾
本開示に従うCAR、それをコードするヌクレオチド配列、それをコードするベクター、及び当該CARをコードするヌクレオチド配列を含む細胞は、様々な特徴を提供または選択するために、さらに修飾、操作、最適化、または付加することができる。このような特徴としては、限定されるものではないが、有効性、持続性、標的特異性、免疫原性の低減、多標的化、免疫応答の強化、拡大、成長、オフターゲット作用の低減、対象毒性の低減、標的細胞毒性の改善、疾患緩和免疫細胞の誘引の改善、検出、選択、標的化などが挙げられる。例えば、細胞は、別のCARを発現するか、または自殺機構を有するように操作することができ、また、内在性受容体または分子(例えば、TCR及び/またはMHC分子)の発現を除去または変更するように修飾することができる。
本開示に従うCAR、それをコードするヌクレオチド配列、それをコードするベクター、及び当該CARをコードするヌクレオチド配列を含む細胞は、様々な特徴を提供または選択するために、さらに修飾、操作、最適化、または付加することができる。このような特徴としては、限定されるものではないが、有効性、持続性、標的特異性、免疫原性の低減、多標的化、免疫応答の強化、拡大、成長、オフターゲット作用の低減、対象毒性の低減、標的細胞毒性の改善、疾患緩和免疫細胞の誘引の改善、検出、選択、標的化などが挙げられる。例えば、細胞は、別のCARを発現するか、または自殺機構を有するように操作することができ、また、内在性受容体または分子(例えば、TCR及び/またはMHC分子)の発現を除去または変更するように修飾することができる。
いくつかの実施形態において、CARをコードするベクターまたは核酸配列はさらに、他の遺伝子をコードする。ベクターまたは核酸配列は、2つ以上のプラスミドの同時形質移入、複数もしくは双方向のプロモーターの使用、またはバイシストロンもしくはマルチシストロンベクターの作成を含む多数の技法を用いて、複数の遺伝子を同時発現できるように構築することができる。マルチシストロンベクターの構築は、IRESエレメントまたは2Aペプチド(例えば、T2A、P2A、E2A、もしくはF2A)のコード化を含むことができる(例えば、Kim,J.H.,et al.,“High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice”,PLoS One.2011;6(4)を参照)。CAR発現細胞はさらに、1つ以上の内在性遺伝子に対する破壊を含むことができる。
有効性
本開示のCAR及びこれらのCARを発現する細胞は、標的分子を発現する細胞に対する有効性を改善するようにさらに修飾することができる。細胞は、COV-Sを発現する細胞であってもよい。COV-Sを発現する細胞は、がん細胞、血管細胞、または任意の他の標的疾患関連細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、標的分子を発現する細胞に対する細胞傷害性(例えば、がん細胞に対する細胞傷害性)の増加によって測定することができる。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、細胞傷害性メディエーター(例えば、IFNγ、パーフォリン、及びグランザイムB)の産生増加によって測定することもできる。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、CAR発現細胞が対象に投与されたときに、疾患のシグネチャーサイトカインが低減したり疾患の症状が軽快したりすることによって示されてもよい。低減され得る他のサイトカインとしては、TGF-ベータ、IL-6、IL-4、IL-10、及び/またはIL-13が挙げられる。有効性の改善は、COV-S特異的免疫細胞応答(例えば、T細胞細胞傷害性)によって示されてもよい。がんの場合、有効性の改善は、より良好な腫瘍細胞傷害性、腫瘍へのより良好な浸潤、免疫抑制メディエーターの低減、体重減少の低減、腹水の低減、腫瘍負荷の低減、及び/または寿命の増加によって示されてもよい。自己免疫疾患の場合、自己反応性細胞の反応性の低減、または自己反応性T細胞、B細胞、もしくはAbの減少が、有効性の改善に相当し得る。いくつかの実施形態において、CARの有効性を評価するために遺伝子発現プロファイルを調べてもよい。
本開示のCAR及びこれらのCARを発現する細胞は、標的分子を発現する細胞に対する有効性を改善するようにさらに修飾することができる。細胞は、COV-Sを発現する細胞であってもよい。COV-Sを発現する細胞は、がん細胞、血管細胞、または任意の他の標的疾患関連細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、標的分子を発現する細胞に対する細胞傷害性(例えば、がん細胞に対する細胞傷害性)の増加によって測定することができる。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、細胞傷害性メディエーター(例えば、IFNγ、パーフォリン、及びグランザイムB)の産生増加によって測定することもできる。いくつかの実施形態において、有効性の改善は、CAR発現細胞が対象に投与されたときに、疾患のシグネチャーサイトカインが低減したり疾患の症状が軽快したりすることによって示されてもよい。低減され得る他のサイトカインとしては、TGF-ベータ、IL-6、IL-4、IL-10、及び/またはIL-13が挙げられる。有効性の改善は、COV-S特異的免疫細胞応答(例えば、T細胞細胞傷害性)によって示されてもよい。がんの場合、有効性の改善は、より良好な腫瘍細胞傷害性、腫瘍へのより良好な浸潤、免疫抑制メディエーターの低減、体重減少の低減、腹水の低減、腫瘍負荷の低減、及び/または寿命の増加によって示されてもよい。自己免疫疾患の場合、自己反応性細胞の反応性の低減、または自己反応性T細胞、B細胞、もしくはAbの減少が、有効性の改善に相当し得る。いくつかの実施形態において、CARの有効性を評価するために遺伝子発現プロファイルを調べてもよい。
1つの態様において、CAR発現細胞は、免疫抑制性メディエーター(限定されるものではないが、プロスタグランジンE2(PGE2)及びアデノシンを含む)の活性を回避または中和するようにさらに修飾される。いくつかの実施形態において、この回避または中和は直接的である。他の実施形態において、この回避または中和は、1つ以上の結合パートナー(例えば、エズリン)を伴うプロテインキナーゼA(PKA)の阻害を介して媒介される。具体的な実施形態において、CAR発現細胞はさらに、ペプチド「調節サブユニットIアンカー破壊因子」(RIAD:regulatory subunit I anchoring disruptor)を発現する。RIADは、プロテインキナーゼA(PKA)とエズリンとの会合を阻害し、それにより、PKAのTCR活性化阻害を防止すると考えられている(Newick K.et al.Cancer Immunol Res.2016 Jun;4(6):541-51)。
いくつかの実施形態において、CAR発現細胞は、エピトープの拡散と整合した広範な免疫応答を誘導することができる。
いくつかの実施形態において、CAR発現細胞はさらに、ホーミング機構を含む。例えば、細胞は、1つ以上の刺激性ケモカインもしくはサイトカインまたはこれらの受容体を遺伝子導入的に発現することができる。特定の実施形態において、細胞は、1つ以上の刺激性サイトカインを発現するように遺伝子修飾されている。ある特定の実施形態において、本発明の細胞が疾患部位により有効に蓄積することを補助するために1つ以上のホーミング機構が使用される。いくつかの実施形態において、CAR発現細胞は、CAR活性化時に誘導性サイトカインを放出するように(例えば、自然免疫細胞を標的細胞に誘引または活性化するように)さらに修飾される(いわゆる第4世代CARまたはTRUCKS)。いくつかの実施形態において、CARは、疾患部位への輸送を増加させるためにホーミング分子(例えば、CCR4またはCCR2b)を同時発現することができる。
CARの発現の制御
いくつかの場合において、CARまたはCAR発現細胞CARの活性を調節することが有利であり得る。例えば、(例えば、二量体化ドメインと融合したカスパーゼを用いた)アポトーシスの誘導(例えば、Di et al.,N Engl.J.Med.2011 Nov.3;365(18):1673-1683)を、本開示のCAR療法における安全スイッチとして使用することができる。別の例では、CAR発現細胞は、二量体化薬(例えば、リミドゥシド(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)またはAP20187(Ariad)とも呼ばれる)を投与するとカスパーゼ-9を活性化し細胞のアポトーシスに至らせる、誘導性カスパーゼ-9(iCaspase-9)分子を発現してもよい。iCaspase-9分子は、二量体化化学誘導物質(CID:chemical inducer of dimerization)結合ドメインを含み、これはCIDの存在下で二量体化を媒介する。その結果、CAR発現細胞の誘導的及び選択的な枯渇をもたらす。いくつかの場合において、iCaspase-9分子は、CARコードベクター(複数可)とは別に核酸分子によってコードされる。いくつかの場合において、iCaspase-9分子は、CARコードベクターと同じ核酸分子によってコードされる。iCaspase-9は、CAR発現細胞の任意の毒性を回避するための安全スイッチをもたらし得る。例えば、Song et al.Cancer Gene Ther.2008;15(10):667-75;Clinical Trial Id.No.NCT02107963;及びDi et al.N.Engl.J.Med.2011;365:1673-83を参照。
いくつかの場合において、CARまたはCAR発現細胞CARの活性を調節することが有利であり得る。例えば、(例えば、二量体化ドメインと融合したカスパーゼを用いた)アポトーシスの誘導(例えば、Di et al.,N Engl.J.Med.2011 Nov.3;365(18):1673-1683)を、本開示のCAR療法における安全スイッチとして使用することができる。別の例では、CAR発現細胞は、二量体化薬(例えば、リミドゥシド(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)またはAP20187(Ariad)とも呼ばれる)を投与するとカスパーゼ-9を活性化し細胞のアポトーシスに至らせる、誘導性カスパーゼ-9(iCaspase-9)分子を発現してもよい。iCaspase-9分子は、二量体化化学誘導物質(CID:chemical inducer of dimerization)結合ドメインを含み、これはCIDの存在下で二量体化を媒介する。その結果、CAR発現細胞の誘導的及び選択的な枯渇をもたらす。いくつかの場合において、iCaspase-9分子は、CARコードベクター(複数可)とは別に核酸分子によってコードされる。いくつかの場合において、iCaspase-9分子は、CARコードベクターと同じ核酸分子によってコードされる。iCaspase-9は、CAR発現細胞の任意の毒性を回避するための安全スイッチをもたらし得る。例えば、Song et al.Cancer Gene Ther.2008;15(10):667-75;Clinical Trial Id.No.NCT02107963;及びDi et al.N.Engl.J.Med.2011;365:1673-83を参照。
CAR療法を調節するための代替的な戦略としては、例えば、CAR発現細胞の削除によって、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の誘導によって、CAR活性を不活性化またはオフにする低分子または抗体の利用が挙げられる。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、細胞死を誘導可能な分子(例えば、ADCCまたは補体誘導細胞死)によって認識される抗原を発現してもよい。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、抗体または抗体フラグメントによって標的化されることが可能な受容体を発現してもよい。このような受容体の例としては、EpCAM、VEGFR、インテグリン(例えば、インテグリンαvβ3、α4、αI3/4β3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受容体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受容体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/バシギン、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、及びEGFR、ならびにこれらの切断バージョン(例えば、1つ以上の細胞外エピトープを保持するが細胞質ドメイン内の1つ以上の領域が欠如したバージョン)が挙げられる。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、切断された上皮成長因子受容体(EGFR)(シグナル伝達能力が欠如しているが、ADCCを誘導可能な分子(例えば、セツキシマブ(ERBITUX(登録商標)))によって認識されるエピトープを保持する)を発現して、セツキシマブの投与によってADCC及びその後のCAR発現細胞の枯渇を誘導することができる(例えば、WO2011/056894及びJonnalagadda et al.,“Gene Ther.2013;20(8)853-860を参照)。
いくつかの実施形態において、CAR細胞は、例えばRQR8などの自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、WO2013153391Aを参照(その全体が参照により本明細書に援用される)。このポリヌクレオチドを含むCAR細胞の場合、自殺ポリペプチドはCAR細胞の表面で発現することができる。また、自殺ポリペプチドは、アミノ末端にシグナルペプチドを含んでもよい。別の戦略としては、本明細書に記載のCAR発現細胞内で、CD32抗原及びCD20抗原の両方からの標的エピトープを組み合わせた高度にコンパクトなマーカー/自殺遺伝子を発現させることが挙げられ、これはリツキシマブと結合し、例えばADCCによって、CAR発現細胞の選択的枯渇をもたらす(例えば、Philip et al.,Blood 2014;124(8)1277-1287を参照)。CAR発現細胞を枯渇させるための他の方法としては、CAMPATH(登録商標)の投与が挙げられる。これは、成熟リンパ球(例えば、CAR発現細胞)に選択的に結合しこれを標的とし、例えばADCCの誘導によって破壊する、抗CD52モノクローナル抗体である。他の実施形態において、CAR発現細胞は、CARリガンド(例えば、抗イディオタイプ抗体)を用いて選択的に標的とすることができる。いくつかの実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性(例えば、ADCCまたはADC活性)を生じてCAR発現細胞の数を低減することができる。他の実施形態において、CARリガンド(例えば、抗イディオタイプ抗体)は、細胞死を誘導する薬剤(例えば、毒素)と結合してCAR発現細胞の数を低減することができる。代替的に、CAR分子自体を、後述のように、活性を調節できるように(例えばオンにしたりオフにしたりできるように)構成することができる。
いくつかの実施形態において、CAR療法の安全性及び有効性を最適化するために、CAR活性を制御することができる調節可能なCAR(RCAR)が望ましい。いくつかの実施形態において、RCARはポリペプチドのセットを含み、最も単純な実施形態では典型的には2つであり、本明細書に記載の標準CARの構成要素(例えば、ABドメイン及びICSドメイン)は、別々のポリペプチドまたはメンバーに分割されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのセットは二量体化スイッチを含み、これは、二量化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば、ABドメインをICSドメインに結合させることができる。このような調節可能なCARについてのさらなる説明及び例示的な構成は、本明細書及び国際公開第WO2015/090229号(その全体が参照により本明細書に援用される)に示されている。
1つの態様において、RCARは、2つのポリペプチドまたはメンバー、すなわち、1)ICSドメイン(例えば、本明細書に記載の一次ICSドメイン)及び第1のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバーと、2)ABドメイン(例えば、本明細書に記載のように、本明細書に記載の標的分子に特異的に結合するドメイン)及び第2のスイッチドメインを含む抗原結合メンバーとを含む。任意選択で、RCARは、本明細書に記載のTMドメインを含む。1つの実施形態において、TMドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー、抗原結合メンバー、またはその両方に配置され得る。別段の指示がない限り、本明細書でRCARのメンバーまたはエレメントが説明される場合、その順序は示される通りであってもよいが、他の順序も含まれる。言い換えれば、1つの実施形態では、その順序は本文に示された通りであるが、他の実施形態では、その順序が異なることがある。例えば、膜貫通領域の片側のエレメントの順序は、例と異なっていてもよく、例えば、ICSドメインに対するスイッチドメインの配置は異なることがあり、例えば反転していることがある。
いくつかの実施形態において、CARを発現する免疫細胞は、CARを一過性に発現するに過ぎないことがある。例えば、細胞は、本発明のCARをコードする核酸配列を含むmRNAで形質転換することができる。この方向において、本開示は、細胞に直接形質移入することができるRNAコンストラクトも含む。形質移入に使用するmRNAを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のin vitro転写(IVT)と、それに続くポリAの付加とを含み、3’及び5’非翻訳配列(「UTR」)と、5’キャップ及び/または内部リボソーム入口部位(IRES)と、発現すべき核酸と、典型的には50~2000塩基長のポリAテールとを含むコンストラクト(配列番号23193)が産生される。このように産生されたRNAは、種々の細胞に効率的に形質移入することができる。1つの実施形態において、鋳型はCARのための配列を含む。1つの実施形態において、RNA CARベクターはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。
標的特異性
CAR発現細胞は、第1のCARに加えて、さらに1つ以上のCARを含むことができる。これらの追加のCARは、第1のCARの標的分子に特異的であっても特異的でなくてもよい。いくつかの実施形態において、1つ以上の追加のCARは、阻害性または活性化CARとして作用することができる。いくつかの態様において、いくつかの実施形態のCARは、刺激性または活性化CARであり、他の態様において、それは共刺激性CARである。いくつかの実施形態において、細胞はさらに、阻害性CAR(iCAR;Fedorov et al.,Sci.Transl.Medicine,2013 Dec;5(215):215ra172)を含み、これは例えば、第1のCARの標的分子以外の抗原を認識するCARであり、それにより、第1のCARによって送達される活性化シグナルは、阻害性CARとそのリガンドとの結合によって減少または阻害されて、例えば、オフターゲット作用を低減する。
CAR発現細胞は、第1のCARに加えて、さらに1つ以上のCARを含むことができる。これらの追加のCARは、第1のCARの標的分子に特異的であっても特異的でなくてもよい。いくつかの実施形態において、1つ以上の追加のCARは、阻害性または活性化CARとして作用することができる。いくつかの態様において、いくつかの実施形態のCARは、刺激性または活性化CARであり、他の態様において、それは共刺激性CARである。いくつかの実施形態において、細胞はさらに、阻害性CAR(iCAR;Fedorov et al.,Sci.Transl.Medicine,2013 Dec;5(215):215ra172)を含み、これは例えば、第1のCARの標的分子以外の抗原を認識するCARであり、それにより、第1のCARによって送達される活性化シグナルは、阻害性CARとそのリガンドとの結合によって減少または阻害されて、例えば、オフターゲット作用を低減する。
いくつかの実施形態において、CARのABドメインは、免疫結合体であるかまたはその一部であり、このときABドメインは、1つ以上の異種分子(複数可)(例えば、限定されるものではないが、細胞傷害剤、造影剤、検出可能部分、多量体化ドメイン、または他の異種分子)と結合体化している。細胞傷害剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及びLuの放射性同位体)、化学療法剤、成長阻害剤、酵素及びそのフラグメント(例えば、核酸分解酵素)、抗生物質、毒素(例えば、低分子毒素または酵素活性毒素)が挙げられる。いくつかの実施形態において、ABドメインは、1つ以上の細胞傷害剤(例えば、化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらのフラグメント)、あるいは放射性同位元素)と結合体化している。
いくつかの実施形態において、持続性を高めるために、細胞をさらに修飾して、生存促進シグナルを過剰発現させたり、抗生存シグナルを反転させたり、Bcl-xLを過剰発現させたり、hTERTを過剰発現させたり、Fasを欠如させたり、TGF-βドミナントネガティブ受容体を発現させたりすることができる。持続性は、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、及びIL-15)の投与によっても促進することができる。
F.B細胞スクリーニング及び単離
1つの実施形態において、本開示は、少なくとも1つのCoV-S抗原特異的細胞を単離するために使用することができる抗原特異的B細胞のクローン集団を調製及び単離することが企図されており、このクローン集団は、所望のCoV-S抗原に特異的なCoV-Sに対するモノクローナル抗体またはこのような抗体に対応する核酸配列を産生するために使用することができる。抗原特異的B細胞のクローン集団を調製及び単離する方法は、例えば、Carvalho-Jensenらに対する米国特許公開第US2007/0269868号(その開示内容の全体が参照により本明細書に援用される)で教示されている。また、抗原特異的B細胞の当該クローン集団を調製及び単離する方法も、本明細書の実施例で教示されている。サイズまたは密度によって細胞集団を「富化」する方法は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,627,052号を参照。これらのステップは、抗原特異性による細胞集団の富化に加えて使用することができる。
1つの実施形態において、本開示は、少なくとも1つのCoV-S抗原特異的細胞を単離するために使用することができる抗原特異的B細胞のクローン集団を調製及び単離することが企図されており、このクローン集団は、所望のCoV-S抗原に特異的なCoV-Sに対するモノクローナル抗体またはこのような抗体に対応する核酸配列を産生するために使用することができる。抗原特異的B細胞のクローン集団を調製及び単離する方法は、例えば、Carvalho-Jensenらに対する米国特許公開第US2007/0269868号(その開示内容の全体が参照により本明細書に援用される)で教示されている。また、抗原特異的B細胞の当該クローン集団を調製及び単離する方法も、本明細書の実施例で教示されている。サイズまたは密度によって細胞集団を「富化」する方法は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,627,052号を参照。これらのステップは、抗原特異性による細胞集団の富化に加えて使用することができる。
G.抗体及びそのフラグメントを産生する方法
別の実施形態において、本開示は、抗CoV-S抗体及びそのフラグメントを産生するための方法を企図している。抗体を産生する方法は、当業者に周知されている。例えば、キメラ抗体を産生する方法は、現在当技術分野で周知されている(例えば、Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:8651-55(1984);Neuberger et al.,Nature,314:268-270(1985);Boulianne,G.L.et al.,Nature,312:643-46(1984)を参照(これらの各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される))。
別の実施形態において、本開示は、抗CoV-S抗体及びそのフラグメントを産生するための方法を企図している。抗体を産生する方法は、当業者に周知されている。例えば、キメラ抗体を産生する方法は、現在当技術分野で周知されている(例えば、Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:8651-55(1984);Neuberger et al.,Nature,314:268-270(1985);Boulianne,G.L.et al.,Nature,312:643-46(1984)を参照(これらの各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される))。
上述のように、ヒト化抗体を産生する方法は、現在当技術分野で周知されている(例えば、Queenらに対する米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及び第6,180,370号;Winterに対する米国特許第5,225,539号及び第6,548,640号;Carterらに対する米国特許第6,054,297号、約6,407,213号、及び約6,639,055号;Adairに対する米国特許第6,632,927号;Jones,P.T.et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann,L.et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen,M.et al.,Science,239:1534-36(1988)を参照(これらの各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される))。
また、CoV-S結合特異性を有する本開示の抗体ポリペプチドは、当業者に周知されている従来の技法を用いて、プロモーター(任意選択で真核生物または原核生物のオペロンの構成要素として)と抗体重鎖をコードするDNA配列とを含む発現ベクターを構築することによっても産生することができ、このとき、抗体特異性に必要とされるCDRをコードするDNA配列は、非ヒト細胞源(例えば、ウサギまたはげっ歯類のB細胞源)に由来し、一方、抗体鎖の残りの部分をコードするDNA配列は、ヒト細胞源に由来する。
第2の発現ベクターは、当業者に周知されている同じ従来の手段を用いて産生され、当該発現ベクターは、プロモーター(任意選択で、真核生物または原核生物のオペロンの構成要素として)と抗体軽鎖をコードするDNA配列とを含み、このとき、抗体特異性に必要とされるCDRをコードするDNA配列は、非ヒト細胞源(例えば、ウサギまたはげっ歯類のB細胞源)に由来し、一方、抗体鎖の残りの部分をコードするDNA配列は、ヒト細胞源に由来する。
発現ベクターを、当業者に周知されている従来の技法によって宿主細胞に形質移入して、形質移入された宿主細胞を産生し、当該形質移入された宿主細胞を、当業者に周知されている従来の技法によって培養して、当該抗体ポリペプチドを産生する。
宿主細胞は、上述の2つの発現ベクター(第1の発現ベクターは、プロモーターをコードするDNA(任意選択で、真核生物または原核生物のオペロンの構成要素として)と軽鎖由来のポリペプチドとを含み、第2のベクターは、プロモーターをコードするDNA(任意選択で、真核生物または原核生物のオペロンの構成要素として)と重鎖由来のポリペプチドとを含む)で同時形質移入してもよい。2つのベクターは異なる選択マーカーを含むが、好ましくは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの実質的に等しい発現を達成する。代替的に、重鎖及び軽鎖ポリペプチドをともにコードするDNAを含む単一のベクターを使用してもよい。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA、ゲノムDNA、または両方を含むことができる。
抗体ポリペプチドの発現に使用される宿主細胞は、細菌細胞(例えば、E.coli)であっても真核細胞(例えば、P.pastoris)であってもよい。1つの実施形態において、この目的のために十分に定義されたタイプの哺乳類細胞(例えば、骨髄腫細胞、CHO細胞株、NSO細胞株、またはHEK293細胞株)を使用することができる。
ベクターを構築することができる一般的な方法、宿主細胞の作製に必要な形質移入方法、及び当該宿主細胞から抗体ポリペプチドを生産するために必要な培養方法のいずれにも、従来の技法が含まれる。抗体の産生に使用する細胞株は哺乳類細胞株であることが好ましいが、他の任意の好適な細胞株、例えば、E.coli由来細菌株などの細菌細胞株または酵母細胞株を代替的に使用してもよい。
同様に、ひとたび産生された抗体ポリペプチドは、当技術分野の標準的な手順(例えば、クロスフローろ過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(「HIC」)など)に従って精製することができる。
また、本明細書に記載の抗体ポリペプチドは、本開示の抗体ポリペプチドと同じ治療用途に有用と考えられるペプチドまたは非ペプチドミメティックいずれかの設計及び合成にも使用することができる(例えば、Saragobi et al.,Science,253:792-795(1991)(その内容全体が参照により本明細書に援用される)を参照)。
別の実施形態において、本開示は、CoV-Sに結合する抗体の重鎖及び軽鎖をヒト化するための方法を企図している。抗CoV-S抗体に適用することができる抗体の重鎖及び軽鎖をヒト化するための例示的な方法は、本明細書で明らかにされており、また当技術分野では通常のものである。
H.スクリーニングアッセイ
ここで説明するスクリーニングアッセイは、CoV-S関連の疾患または障害の症状を示す対象におけるCoV-S関連の疾患及び障害の治療に有用であり得る高親和性抗CoV-S抗体を同定するのに使用することができる。
ここで説明するスクリーニングアッセイは、CoV-S関連の疾患または障害の症状を示す対象におけるCoV-S関連の疾患及び障害の治療に有用であり得る高親和性抗CoV-S抗体を同定するのに使用することができる。
いくつかの実施形態において、抗体は診断ツールとして使用される。当該抗体は、試料及び/または対象に存在するCoV-Sの量をアッセイするのに使用することができる。当業者には理解されるであろうように、このような抗体は中和抗体ではなくてもよい。いくつかの実施形態において、診断用抗体は中和抗体ではない。いくつかの実施形態において、診断用抗体は、中和抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、この2つの抗体は互いに競合しない。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する抗体は、CoV-Sのレベルの変化に関連する疾患または障害をスクリーニング/診断するために、哺乳類の組織または細胞におけるCoV-Sの検出のためのアッセイキット及び/または方法で使用または提供される。キットは、CoV-Sに結合する抗体と、(存在する場合)抗体とCoV-Sとの結合及び任意選択でCoV-Sタンパク質レベルを示すための手段とを含む。抗体の存在を示すための様々な手段が使用され得る。例えば、フルオロフォア、他の分子プローブ、または酵素を抗体に結合し、抗体の存在を様々な方法で観察することができる。このような障害をスクリーニングするための方法は、キットの使用を伴う場合もあれば、単に本開示の抗体のうちの1つを使用し、抗体が試料中のCoV-Sに結合するかどうかを判定することを伴う場合もある。当業者には理解されるように、CoV-Sのレベルが高いかまたは上昇すると、その結果、試料中のCoV-Sに結合する抗体の量が多くなる。したがって、抗体結合の程度を使用して、試料中にどの程度CoV-Sが含まれているかを判定することができる。CoV-Sの量が所定の量(例えば、CoV-S関連障害を有しない人が有するであろう量または範囲)よりも多い対象または試料は、CoV-S媒介性障害を有するものと特徴付けることができる。
本開示はさらに、本開示の抗CoV-S抗体のCoV-Sとの結合を検出するためのキットを提供する。詳細には、当該キットは、抗CoV-S抗体またはその免疫反応性フラグメントに対し特異的に反応性であるCoV-Sの存在を検出するために使用することができる。また、当該キットは、基質に結合した抗体、抗原に反応性の二次抗体、抗原に対する二次抗体の反応を検出するための試薬も含むことができる。このようなキットはELISAキットであってもよく、基質と、一次抗体及び二次抗体(適切な場合)と、他の任意の必要な試薬(例えば、検出可能部分、酵素基質、及び発色試薬(例えば、本明細書に記載のもの))とを含むことができる。また、診断キットはイムノブロットキットの形態もとることができる。また、診断キットは化学発光キット(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)の形態もとることができる。また、診断キットは、ランタニドベースの検出キット(PerkinElmer,San Jose,CA)とすることもできる。
熟練した臨床医であれば、生物学的試料には、限定されるものではないが、血清、血漿、尿、糞便試料、唾液、粘液、胸水、滑液、及び髄液が含まれることを理解するであろう。
I.CoVに関連する疾患及び障害の症状の緩和もしくは低減、または治療もしくは防止の方法
別の実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、CoV-Sに関連する疾患及び障害の症状の緩和もしくは低減、または治療もしくは防止に有用である。また、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントならびに組合せは、以下にさらに詳細に記載するように、医薬組成物の形態で、CoV-Sに関連する疾患及び障害の治療を必要とする患者に治療有効量で投与することもできる。
別の実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントは、CoV-Sに関連する疾患及び障害の症状の緩和もしくは低減、または治療もしくは防止に有用である。また、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメントならびに組合せは、以下にさらに詳細に記載するように、医薬組成物の形態で、CoV-Sに関連する疾患及び障害の治療を必要とする患者に治療有効量で投与することもできる。
CoV感染の症状としては、発熱、咳、鼻水、うっ血、咽喉痛、気管支炎、肺炎、息切れ、胸痛、頭痛、筋肉痛、悪寒、疲労、結膜炎、下痢、嗅覚消失、及び味覚消失を挙げることができる。コロナウイルス感染に関連する合併症及び/または疾患/障害としては、例えば、気管支炎、肺炎、呼吸不全、急性呼吸不全、臓器不全、多臓器系不全、小児多系統炎症性症候群、急性呼吸窮迫症候群(血液中及び臓器中の酸素の低下を引き起こす重篤な肺の状態)、血栓、心臓状態、心筋障害、心筋炎、心不全、心停止、急性心筋梗塞、不整脈、静脈性血栓塞栓症、集中治療後症候群、ショック、アナフィラキシーショック、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、虚血性脳卒中、脳内出血、微小血管障害性血栓症、精神障害、痙攣、非痙攣性てんかん重積状態、外傷性脳損傷、脳卒中、無酸素性脳損傷、脳炎、可逆性白質脳症、壊死性脳症、感染後脳炎、自己免疫媒介性脳炎、急性散在性脳脊髄炎、急性腎損傷、急性肝損傷、膵損傷、免疫性血小板減少症、亜急性甲状腺炎、胃腸合併症、アスペルギルス症、別のウイルスもしくは細菌への感受性増加、及び/または妊娠関連合併症を挙げることができる。ある特定の疾患及び状態、例えば、高血圧、1型糖尿病、肝疾患、過体重、慢性肺疾患(嚢胞性線維症、肺線維症、及び喘息を含む)、移植、免疫抑制剤の使用、またはHIV感染に起因する免疫系低下、ならびに脳及び神経系の状態は、CoV感染に関連する合併症及び疾患のリスクを増加させ得る。
また、主題の抗CoV-S抗体及び抗原結合フラグメントは、単独で、または他の活性薬剤(例えば、オピオイド及び非オピオイド鎮痛剤(例えば、NSAID))とともに使用して、鎮痛を誘発することができる。いくつかの実施形態において、アスピリン及び/またはアセトアミノフェンは、ともに主題の抗CoV-S抗体または抗原結合フラグメントとともに摂取することができる。アスピリンは、別のタイプの非ステロイド性抗炎症化合物である。
主題抗体は可能性として、任意選択で、以下のうちの1つ以上と組み合わせることができる:(i)抗ウイルス薬(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、もしくはリトナビル)、(ii)駆虫薬(任意選択で、イベルメクチン)、(iii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコン)、(iv)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCG)、または(v)抗炎症薬(任意選択で、ステロイド(例えば、シクレソニド)、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ(toclizumab))、もしくはメタミゾール)、(vi)抗ヒスタミン薬(任意選択で、ベポタスチン)、(vii)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリル)、または(viii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、セリンプロテアーゼ阻害剤、さらに任意選択で、ナファモスタット)。疼痛管理を増加または強化するために。これにより、このような鎮痛性化合物を、より長い持続期間で、または薬用量を低減して投与することが可能となり、それに伴う有害な副作用を軽減することができる。
医薬製剤が投与される対象は、例えば、このような治療、防止、及び/または緩和を必要とする、あるいは別の形でCoV-S媒介性活性の阻害または減弱から利益を得る、任意のヒトまたは非ヒト動物とすることができる。例えば、対象は、前述の疾患または障害のいずれかに罹患していると診断された、または罹患するリスクがあるとみなされた個体とすることができる。いくつかの場合において、対象は、CoV感染の進行状態にあることがあり、例えば、人工呼吸器を装着している対象であり得る。いくつかの場合において、対象は、CoV治療または回復予後の不良に相関する1つ以上のリスク因子(例えば、高齢、肥満、糖尿病など、及び過去に確認された他の因子)を有する者とすることができる。本開示はさらに、CoVまたはCoV-S活性に関連する任意の疾患または障害(上述の例示的な疾患、障害、及び状態のいずれかを含む)の治療、防止、及び/または緩和のための医薬品の製造における、本明細書で開示する任意の医薬製剤の使用を含む。
J.投与
1つの実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはそのCoV-S結合フラグメント、ならびに当該抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せは、対象に、0.1mg/mlから約0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200mg/ml(±10%誤差)のいずれか1つの間の濃度で、対象に投与される。
1つの実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはそのCoV-S結合フラグメント、ならびに当該抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せは、対象に、0.1mg/mlから約0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200mg/ml(±10%誤差)のいずれか1つの間の濃度で、対象に投与される。
別の実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体及びそのフラグメントは、レシピエント対象の体重の約0.01から100.0または200.0mg/kgの間の用量で対象に投与される。ある特定の実施形態において、患者に投与するための初期的な候補薬用量は、CoV-S関連疾患のタイプ及び重症度に応じて、例えば、1回以上の別々の投与による、または連続注入による、約1μg/kg~50mg/kg(例えば、0.1~20mg/kg)の抗体である。別の実施形態において、患者に投与するための初期的な候補薬用量は、約1μg/kg~15mg/kg(例えば、0.1mg/kg~10mg/kg)の抗体である。典型的な1日の薬用量は、約1μg/kg~100mg/kgまたはそれ以上の範囲とすることができ、これは、いくつかの要因、例えば、治療を受ける特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の要因に依存する。ただし、他の薬用量レジメンが有用な場合がある。
例えば、本明細書で論じている相対的薬用量(mg/kg)に加えて、主題となる抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、絶対的用量(mg)で対象に投与される場合がある。したがって、1つの実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体及びその抗原結合フラグメントは、投与経路にかかわらず、約1マイクログラム~約1000ミリグラムの用量で対象に投与される。
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはその抗CoV-S抗原結合フラグメント、及び当該抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せは、26週以下に1回の頻度で、例えば、16週以下に1回、8週以下に1回、4週以下に1回、2週以下に1回、1週以下に1回、または1日以下に1回の頻度で、レシピエント対象に投与される。
好ましい実施形態に従えば、抗体を含む医薬品または医薬組成物は、経口、舌下、頬側、局所、経直腸、吸入経由、経皮、皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内、心臓内投与経由、骨内、皮内、腹腔内、経粘膜、経膣、硝子体内、上皮内、関節内、関節周囲、または局所のうちの1つ以上から選択される経路を介し、対象に末梢投与される。
Fabフラグメントは、2週間以下に1回、1週間以下に1回、1日以下に1回、1日に複数回、及び/または数時間ごとに1回投与することができる。1つの実施形態において、患者は、所望の結果を得るために有効な1日当たり0.1mg/kg~40mg/kgのFabフラグメントの投与を受け、これは1日1~6回の分割用量または連続灌流形態でもたらされる。
所与の患者に投与される抗体またはFabの濃度が、上記に示した例示的な投与濃度よりも高い場合も低い場合もあることを理解されたい。
当業者であれば、通例の実験を通じて、例えば、本明細書の開示内容ならびにGoodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Brunton,L.L.et al.editors,11th edition,New York,New York:McGraw-Hill(2006);Howland,R.D.et al.,Pharmacology,Volume 864,Lippincott’s illustrated reviews.,Philadelphia,PA:Lippincott Williams & Wilkins(2006);及びGolan,D.E.,Principles of pharmacology:the pathophysiologic basis of drug therapy,Philadelphia,PA:Lippincott Williams & Wilkins(2007)の教示内容を指針として、有効な薬用量及び投与頻度を決定することができるであろう。
別の実施形態において、本明細書に記載の抗CoV-S抗体またはそのCoV-S結合フラグメント、ならびに当該抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せは、医薬製剤において対象に投与される。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
「医薬組成物」または「医薬品」とは、対象、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトへの投与に適した化学的または生物学的組成物を指す。このような組成物は、多数の経路のうちの1つ以上を介した投与用に具体的に製剤化することができ、このような経路としては、限定されるものではないが、頬側、表皮、硬膜外、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、脊髄内、髄腔内、静脈内、経口、非経口、浣腸または座薬による経直腸、皮下、真皮下、舌下、経皮、及び経粘膜が挙げられる。さらに、投与は、注射、粉末、液体、ゲル、滴剤、または他の投与手段によって行うことができる。
1つの実施形態において、抗CoV-S抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに当該抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せは、任意選択で、1つ以上の活性薬剤と組み合わせて投与することができる。このような活性薬剤としては、(i)抗ウイルス薬(任意選択で、レムデシビル、ファビピラビル、ダルナビル、ネルフィナビル、サキナビル、ロピナビル、もしくはリトナビル)、(ii)駆虫薬(任意選択で、イベルメクチン)、(iii)抗寄生虫薬(任意選択で、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、もしくはアトバコン)、(iv)抗細菌ワクチン(任意選択で、結核ワクチンBCG)、または(v)抗炎症薬(任意選択で、ステロイド(例えば、シクレソニド)、TNF阻害剤(例えば、アダリムマブ)、TNF受容体阻害剤(例えば、エタネルセプト)、IL-6阻害剤(例えば、クラザキズマブ)、IL-6受容体阻害剤(例えば、トシリズマブ(toclizumab))、もしくはメタミゾール)、(vi)抗ヒスタミン薬(任意選択で、ベポタスチン)、(vii)ACE阻害剤(任意選択で、モエキシプリル)、または(viii)CoV-Sのプライミングを阻害する薬物(任意選択で、セリンプロテアーゼ阻害剤、さらに任意選択で、ナファモスタット)が挙げられる。
抗ヒスタミン剤は、ヒスタミンの作用または細胞(例えば、マスト細胞)からのヒスタミンの放出に対抗する任意の化合物とすることができる。抗ヒスタミン剤としては、限定されるものではないが、アクリバスチン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベタタスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、セチリジン、セチリジンアナログ、クロルフェニラミン、クレマスチン、CS560、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、HSR609、ヒドロキシジン、レボカバスチン、ロラタジン、メスコポラミン、ミゾラスチン、ノラステミゾール、フェニンダミン、プロメタジン、ピリラミン、テルフェナジン、及びトラニラストが挙げられる。
CoV感染症の場合、呼吸器症状がしばしば追加の細菌感染によって増悪する。そのため、このような活性薬剤は抗生物質であってもよく、限定されるものではないが、アミカシン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルバセフェム、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、シラスタチン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、ダルフォプリスチン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、フルクロキサシリン、フォスフォマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲンタマイシン、グリコペプチド、ハービマイシン、イミペネム、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モノバクタム、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリン、ピペラシリン、プラテンシマイシン、ポリミキシンB、ポリペプチド、プロントシル、ピラジナミド、キノロン、キヌプリスチン、リファンピシン、リファンピン、ロキシスロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミド、テイコプラニン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、テトラサイクリン、チカルシリン、チニダゾール、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、及びバンコマイシンが挙げられる。
活性薬剤には、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチコステロイド、コルチゾール、酢酸コルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、ステロイド、及びトリアムシノロンも含まれる。これらの活性薬剤の任意の好適な組合せも企図されている。
「医薬賦形剤」または「医薬的に許容される賦形剤」とは、活性治療薬剤が製剤化される担体のことであり、通常は液体である。1つの実施形態において、活性治療薬剤は、本明細書に記載のヒト化抗体、またはその1つ以上のフラグメントである。賦形剤は概して、製剤に対しいかなる薬理学的活性ももたらさないが、化学的及び/または生物学的安定性ならびに放出特性はもたらし得る。例示的な製剤は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Gennaro,A.editor,19th
edition,Philadelphia,PA:Williams and Wilkins(1995)(参照により援用される)に記載されている。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」または「賦形剤」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤が含まれる。1つの実施形態において、担体は非経口投与に適している。代替的に、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、または舌下投与に適し得る。医薬的に許容される担体としては、無菌水溶液または分散液、及び無菌注射溶液または分散液を即時調製するための無菌散剤が挙げられる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知されている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本開示の医薬組成物でこれらを使用することが企図されている。補助的活性化合物も組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、典型的には、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定していなければならない。本開示は、医薬組成物が凍結乾燥形態で存在することを企図している。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール)、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。本開示はさらに、医薬組成物中に安定剤を含めることを企図している。適切な流動性は、例えば、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。
多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール(例えば、マンニトール及びソルビトール)、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の吸収は、吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチン)を含めることによって延長することができる。さらに、アルカリ性ポリペプチドは、時間放出製剤(例えば、徐放性ポリマーを含む組成物)中で製剤化することができる。活性化合物は、化合物を急速な放出から保護する担体(インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む)とともに調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリ乳酸-ポリグリコールコポリマー(「PLG」)を使用してもよい。このような製剤を調製するための多くの方法が当業者に知られている。
引用された実施形態の各々について、化合物は、様々な投与形態によって投与することができる。当業者に知られている生物学的に許容される任意の投与形態及びその組合せが企図されている。このような投与形態の例としては、限定されるものではないが、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、顆粒、粒子、微粒子、分散性顆粒、カシェ剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、注入剤(皮下、筋内、静脈内、及び皮内を含む)、点滴、及びこれらの組合せが挙げられる。
本開示の様々な例示された実施形態についての上記の説明は、網羅的であることも、本開示を開示する正確な形態に限定することも意図していない。本開示の具体的な実施形態及び本開示の例が、例示目的で本明細書に記載されているが、関連技術の当業者が認識するであろうように、本開示の範囲内で様々な等価的変更が可能である。本開示の本明細書で示す教示は、本明細書に記載されている例以外に、他の目的にも適用することができる。
ある特定の抗CoV-S抗体ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本特許出願書類に添付された配列表に開示されており、当該配列表の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
背景技術、発明を実施するための形態、及び実施例で引用された各文書(特許、特許出願、論文、アブストラクト、マニュアル、書籍、または他の開示を含む)の開示内容全体は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
以下の実施例は、当業者に主題開示の作製方法及び使用方法を完全に開示及び説明するために提示されるものであり、本発明とみなされるものの範囲を制限することは意図されていない。使用する数字(例えば、量、温度、濃度など)については正確さを保証するように努力が払われているが、ある程度の実験的誤差及び偏差は許容されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
実施例1:SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-2-Sに選択的に結合する抗体の選択及び調製(SARSサバイバーの血液試料を使用)
他のCoVに対する抗体応答の研究から、S糖タンパク質が中和抗体(nAb)の主要な標的であることが示されている(Jiang,C.Hillyer,L.Du,Trends Immunol.2020 Apr 24.pii:S1471-4906(20)30087-9)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2が、そのSタンパク質に約80%のアミノ酸の同一性を有することを考えれば、1つの免疫学的な重要な問題は、この抗原の保存表面の免疫原性に関わるものである。最近の研究では、回復期のSARSまたはCOVID-19の血清に交差中和活性がほとんどないことが示されており、このことから、保存抗原部位がnAbの標的となることはほとんどないことが示唆される(X.Ou et al.,Nat Commun.2020 Mar 27;11(1):1620)。これに対応して、SARS-CoV感染またはワクチン接種によって誘導されたヒト及びマウスのmAbの小パネルの研究では、SARS-CoV-2との交差反応性が稀であることが示されている(D.Wrapp et al.,Science.2020 Mar 13;367(6483):1260-1263;Q.Wang et al.,Cell.2020 Apr 7.pii:S0092-8674(20)30338-X)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2の間で共有されている保存エピトープを定義するために、2003年SARSサバイバーのメモリーB細胞レパートリーからSARS-CoV-2交差反応性抗体を探索した。
他のCoVに対する抗体応答の研究から、S糖タンパク質が中和抗体(nAb)の主要な標的であることが示されている(Jiang,C.Hillyer,L.Du,Trends Immunol.2020 Apr 24.pii:S1471-4906(20)30087-9)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2が、そのSタンパク質に約80%のアミノ酸の同一性を有することを考えれば、1つの免疫学的な重要な問題は、この抗原の保存表面の免疫原性に関わるものである。最近の研究では、回復期のSARSまたはCOVID-19の血清に交差中和活性がほとんどないことが示されており、このことから、保存抗原部位がnAbの標的となることはほとんどないことが示唆される(X.Ou et al.,Nat Commun.2020 Mar 27;11(1):1620)。これに対応して、SARS-CoV感染またはワクチン接種によって誘導されたヒト及びマウスのmAbの小パネルの研究では、SARS-CoV-2との交差反応性が稀であることが示されている(D.Wrapp et al.,Science.2020 Mar 13;367(6483):1260-1263;Q.Wang et al.,Cell.2020 Apr 7.pii:S0092-8674(20)30338-X)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2の間で共有されている保存エピトープを定義するために、2003年SARSサバイバーのメモリーB細胞レパートリーからSARS-CoV-2交差反応性抗体を探索した。
試料
SARS-CoV感染から17年経過した対象(2003年SARSアウトブレイクサバイバー)からヘパリン化血液(50~100cc)を入手した(ドナー名「VRC#202367」)。試料を処理して血漿を取得し、末梢血由来のB細胞を単離した。単離細胞及び血漿を分注して-80℃で凍結保存した。
SARS-CoV感染から17年経過した対象(2003年SARSアウトブレイクサバイバー)からヘパリン化血液(50~100cc)を入手した(ドナー名「VRC#202367」)。試料を処理して血漿を取得し、末梢血由来のB細胞を単離した。単離細胞及び血漿を分注して-80℃で凍結保存した。
抗原及び抗体
組換えSARS-CoV及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質の産生:SARS-CoV-2のプレフュージョンS外部ドメインを発現させるために、残基986及び987にプロリン置換を有する2019-nCoV S(GenBank:MN908947)の残基1~1208をコードする遺伝子、フリン切断部位(残基682~685)の「GSAS」置換(配列番号23196として開示されている「GSAS」)、C末端T4フィブリチン三量化モチーフ、HRV3Cプロテアーゼ切断部位、TwinStrepタグ及び8XHisタグ(配列番号23197)を合成し、哺乳類発現ベクターpαH(DOI:10.1126/science.abb2507)にクローニングした。SARS-CoVのプレフュージョンS外部ドメインも同様にして発現させた。発現コンストラクトの設計は、関連するベータコロナウイルスSタンパク質の発現について過去に説明された戦略に基づくものであった(DOI:10.1073/pnas.1707304114及びDOI:10.1038/s41598-018-34171-7)。SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするこれらの発現ベクターを使用して、ポリエチレンイミンを用いてFreeStyle293F細胞(Thermo 134 Fischer)に一過性に形質移入した。135 StrepTactin樹脂(IBA)またはプロテインA樹脂(Pierce)を用いてろ過した細胞上清からタンパク質を精製した後、2mMトリスpH8.0、138 200mM NaCl、及び0.02% NaN3中のSuperose6 10/300カラム(GE 137 Healthcare)またはSuperdex200 10/300 Increaseカラム(GE Healthcare)のいずれかを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて追加136精製に供した。最終的なタンパク質調製物を、さらに150mM NaClを追加したリン酸緩衝生理食塩水pH7.4中で保存した。使用するまで少ない分注量で-70℃で保存した。
組換えSARS-CoV及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質の産生:SARS-CoV-2のプレフュージョンS外部ドメインを発現させるために、残基986及び987にプロリン置換を有する2019-nCoV S(GenBank:MN908947)の残基1~1208をコードする遺伝子、フリン切断部位(残基682~685)の「GSAS」置換(配列番号23196として開示されている「GSAS」)、C末端T4フィブリチン三量化モチーフ、HRV3Cプロテアーゼ切断部位、TwinStrepタグ及び8XHisタグ(配列番号23197)を合成し、哺乳類発現ベクターpαH(DOI:10.1126/science.abb2507)にクローニングした。SARS-CoVのプレフュージョンS外部ドメインも同様にして発現させた。発現コンストラクトの設計は、関連するベータコロナウイルスSタンパク質の発現について過去に説明された戦略に基づくものであった(DOI:10.1073/pnas.1707304114及びDOI:10.1038/s41598-018-34171-7)。SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするこれらの発現ベクターを使用して、ポリエチレンイミンを用いてFreeStyle293F細胞(Thermo 134 Fischer)に一過性に形質移入した。135 StrepTactin樹脂(IBA)またはプロテインA樹脂(Pierce)を用いてろ過した細胞上清からタンパク質を精製した後、2mMトリスpH8.0、138 200mM NaCl、及び0.02% NaN3中のSuperose6 10/300カラム(GE 137 Healthcare)またはSuperdex200 10/300 Increaseカラム(GE Healthcare)のいずれかを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて追加136精製に供した。最終的なタンパク質調製物を、さらに150mM NaClを追加したリン酸緩衝生理食塩水pH7.4中で保存した。使用するまで少ない分注量で-70℃で保存した。
B細胞シングルソーティング
MBCソーティングのために、MACS B細胞単離キット(Miltenyi Biotec;カタログ番号130-091-151)を用いてB細胞を精製し、続いて抗ヒトCD19(PE-Cy7)、CD3(PerCP-Cy5.5)、CD8(PerCP-Cy5.5)、CD14(PerCP-Cy5.5)、CD16(PerCP-Cy5.5)、IgM(BV711)、IgD(BV421)、IgA(AF488)、IgG(BV605)、CD27(BV510)、CD71(APC-Cy7)、ならびに二重標識(APC及びPE)SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体の混合物(各25nM)を用いて染色した。実験ごとに新鮮な四量体を調製し、SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体に反応性を示すB細胞をシングルセルソーティングした。シングルセルを20uL/ウェルの溶解バッファー[5uLの5X第1ストランドcDNAバッファー(Invitrogen)、0.625uLのNP-40(New England Biolabs)、0.25uL RNaseOUT(Invitrogen)、1.25uLジチオスレイトール(Invitrogen)、及び12.6uL dH2O]が入った96ウェルPCRプレートに入れてBD FACS Aria II(BD Biosciences)を用いてソーティングした。プレートを直ちに-80℃で保存した。FlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
MBCソーティングのために、MACS B細胞単離キット(Miltenyi Biotec;カタログ番号130-091-151)を用いてB細胞を精製し、続いて抗ヒトCD19(PE-Cy7)、CD3(PerCP-Cy5.5)、CD8(PerCP-Cy5.5)、CD14(PerCP-Cy5.5)、CD16(PerCP-Cy5.5)、IgM(BV711)、IgD(BV421)、IgA(AF488)、IgG(BV605)、CD27(BV510)、CD71(APC-Cy7)、ならびに二重標識(APC及びPE)SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体の混合物(各25nM)を用いて染色した。実験ごとに新鮮な四量体を調製し、SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体に反応性を示すB細胞をシングルセルソーティングした。シングルセルを20uL/ウェルの溶解バッファー[5uLの5X第1ストランドcDNAバッファー(Invitrogen)、0.625uLのNP-40(New England Biolabs)、0.25uL RNaseOUT(Invitrogen)、1.25uLジチオスレイトール(Invitrogen)、及び12.6uL dH2O]が入った96ウェルPCRプレートに入れてBD FACS Aria II(BD Biosciences)を用いてソーティングした。プレートを直ちに-80℃で保存した。FlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
図6Aに示すように、フローサイトメトリー解析により、クラススイッチメモリーB細胞のおよそ0.15%がSARS-CoV-2 S反応性であることが明らかになった。これはSARS-CoVナイーブドナー試料で観察されたバックグラウンド染色の約3倍であった。注目すべきことに、抗原特異的メモリーB細胞の出現頻度は、感染から採血までの間隔が長いこと(17年)と、SARS-CoV特異的メモリーB細胞が典型的にはわずか6年後に検出不可能なレベルまで衰えることを示した先行研究(Tang F.et al.,J Immunol.2011 Jun 15;186(12):7264-8)とを考慮すれば、予想よりも高いものであった。
抗体可変遺伝子の増幅及びクローニング
抗体可変遺伝子(IgH、IgK、及びIgL)を、過去に説明されているように(Tiller et al,J Immunol 2008)IgG及びIgM特異的プライマーのカクテルを用いて、逆転写PCR及びネステッドPCRによって増幅した。第2ラウンドのPCRで使用するプライマーは、消化された発現ベクターに対し5’及び3’相同性の40塩基対を含み、これによりS.cerevisiaeへの相同組換えによるクローニングが可能になった。化学的形質転換のための酢酸リチウム法を使用して、PCR産物をS.cerevisiaeにクローニングした(Gietz and Schiestl,Nat Protoc 2007)。10uLの未精製重鎖及び軽鎖PCR産物及び200ngの消化された発現ベクターを形質転換反応ごとに使用した。形質転換後、シークエンシング及び特性評価のために個々の酵母コロニーを採取した。315種のSARS-CoV-2反応性B細胞から同族抗体の重鎖及び軽鎖の対をレスキューし、クローニングした。配列、生殖系列の起源、及びアイソタイプを決定した。生殖系列配列に対する核酸置換数、及び生殖系列コード配列に対するアミノ酸変化数も解析した。
抗体可変遺伝子(IgH、IgK、及びIgL)を、過去に説明されているように(Tiller et al,J Immunol 2008)IgG及びIgM特異的プライマーのカクテルを用いて、逆転写PCR及びネステッドPCRによって増幅した。第2ラウンドのPCRで使用するプライマーは、消化された発現ベクターに対し5’及び3’相同性の40塩基対を含み、これによりS.cerevisiaeへの相同組換えによるクローニングが可能になった。化学的形質転換のための酢酸リチウム法を使用して、PCR産物をS.cerevisiaeにクローニングした(Gietz and Schiestl,Nat Protoc 2007)。10uLの未精製重鎖及び軽鎖PCR産物及び200ngの消化された発現ベクターを形質転換反応ごとに使用した。形質転換後、シークエンシング及び特性評価のために個々の酵母コロニーを採取した。315種のSARS-CoV-2反応性B細胞から同族抗体の重鎖及び軽鎖の対をレスキューし、クローニングした。配列、生殖系列の起源、及びアイソタイプを決定した。生殖系列配列に対する核酸置換数、及び生殖系列コード配列に対するアミノ酸変化数も解析した。
結果を図3~6に示す。配列解析により、約半数のクローンが拡大クローン系統のメンバー(VH1-69とVK2-30との組合せ(青色で表示)、または他の組合せ(例えば、VH1-69とVK2-30ではないVLとの組合せ)(濃い灰色で表示))であり、他の半数がユニークであることが明らかになった(図6C)。この結果は、抗原特異的メモリーB細胞レパートリー内のクローン拡大の程度が限定的であることを示した他の一次ウイルス感染症についての多くの研究とは対照的である(Rogers T.F.et al.,Sci Immunol.2017 Aug 18;2(14);Goodwin E.,et al.,Immunity.2018 Feb 20;48(2);Bornholdt Z.A.,et al.,Science.2016 Mar 4;351(6277):1078-83;Wec A.Z.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2020 Mar 24;117(12):6675-6685)。さらに、多くのクローン的に無関係な抗体が、VH1-69/VK2-30の集中的な生殖系列系遺伝子対合を示した(図6C)。予想されたように、単離抗体のほぼ全てが体細胞変異し、クローン拡大系統のメンバーは、ユニークなクローンより高いレベルの体細胞超変異(SHM)を示した(図6D)。最後に、インデックスソーティング解析により、結合抗体の33%及び66%が、それぞれIgA+及びIgG+メモリーB細胞を起源とすることが示された(図6E)。これらの結果は、SARS-CoV感染が、このドナーにおける長寿命で交差反応性のメモリーB細胞(MBC)を高頻度に誘発したことを示唆するものである。
IgG及びFabフラグメントの発現及び精製
IgGを、過去に説明されているように(Bornholdt et al,Science 2016,PMID:26912366)、24ウェルプレートで成長させたS.cerevisiae培養物中で発現させた。6日後、培養物を遠心分離によって採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってIgGを精製した。結合した抗体を200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)で1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。315種のクローン化抗体のうち、202種が予備的結合スクリーニングでSARS-CoV-2 Sに結合した(図6B)。
IgGを、過去に説明されているように(Bornholdt et al,Science 2016,PMID:26912366)、24ウェルプレートで成長させたS.cerevisiae培養物中で発現させた。6日後、培養物を遠心分離によって採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってIgGを精製した。結合した抗体を200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)で1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。315種のクローン化抗体のうち、202種が予備的結合スクリーニングでSARS-CoV-2 Sに結合した(図6B)。
組換えクローニングを用いて抗体CR3022をS.cerevisiae内でクローニングした。CR3022の可変領域配列を、相同なオーバーハングを有するgBlockフラグメント(IDT)として合成し、これを上記のようにクローニングし発現させた。
IgGをパパインで30℃で2時間消化することによってFabフラグメントを生成した。ヨードアセトアミドを加えることにより消化を終了させ、Fab及びFcの混合物をプロテインAアガロースに通してFcフラグメント及び未消化のIgGを除去した。次に、プロテインA樹脂のフロースルーをCaptureSelect(商標)IgG-CH1アフィニティー樹脂(ThermoFischer Scientific)に通し、200mM酢酸/50mM NaCl pH3.5で1/8容量の2M Hepes pH8.0に溶出した。次にFabフラグメントをPBS pH7.0にバッファー交換した。
実施例2:結合性測定値の測定値(SARS-CoV及びSARS-CoV-2のSタンパク質)
次に、プレフュージョン安定化SARS-CoV及びSARS-CoV-2のSタンパク質に対する抗体の見かけ上の結合親和性(KD App)を測定した(D.Wrapp et al.,Cryo-EM structure of 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.Science 367,1260-1263(2020))。
次に、プレフュージョン安定化SARS-CoV及びSARS-CoV-2のSタンパク質に対する抗体の見かけ上の結合親和性(KD App)を測定した(D.Wrapp et al.,Cryo-EM structure of 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.Science 367,1260-1263(2020))。
バイオレイヤー干渉動態学的測定(BLI):
一価の見かけ上のKDを定量するため、ForteBio Octet HTX装置(Molecular Devices)を用いたバイオレイヤー干渉法(BLI)により、組換えSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質抗原に対するIgG結合性を測定した。IgGを抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(Molecular Devices)に捕捉し(1.5nm)、PBSF(0.1%w/v BSAを含むPBS)中で少なくとも30分間静置した。PBSF中で短時間(60秒)のベースラインステップの後、IgGを装填したバイオセンサーチップをSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質(PBSF中100nM)に曝露し(180秒、1000rpmの軌道振とう)、次にPBSFに浸漬して(180秒、1000rpmの軌道振とう)、バイオセンサーチップ表面からの抗原の任意の解離を測定した。結合応答が0.1nmを超えるデータは、ForteBio Data Analysis Software(version 11.1)を用いてアラインメントし、インターステップ補正し(結合ステップへ)、1:1結合モデルにフィッティングさせた。
一価の見かけ上のKDを定量するため、ForteBio Octet HTX装置(Molecular Devices)を用いたバイオレイヤー干渉法(BLI)により、組換えSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質抗原に対するIgG結合性を測定した。IgGを抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(Molecular Devices)に捕捉し(1.5nm)、PBSF(0.1%w/v BSAを含むPBS)中で少なくとも30分間静置した。PBSF中で短時間(60秒)のベースラインステップの後、IgGを装填したバイオセンサーチップをSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質(PBSF中100nM)に曝露し(180秒、1000rpmの軌道振とう)、次にPBSFに浸漬して(180秒、1000rpmの軌道振とう)、バイオセンサーチップ表面からの抗原の任意の解離を測定した。結合応答が0.1nmを超えるデータは、ForteBio Data Analysis Software(version 11.1)を用いてアラインメントし、インターステップ補正し(結合ステップへ)、1:1結合モデルにフィッティングさせた。
二価の見かけ上のKDを定量するため、ForteBio Octet HTX装置(Molecular Devices)を用いたBLIにより、SARS-CoV-2 NTD及びRBDに対するIgGの結合性を測定した。組換えビオチン化抗原をストレプトアビジンバイオセンサー(Molecular Devices)に固定し、PBSF(0.1%w/v BSAを含むPBS)中で少なくとも30分間静置した。PBSF中で短時間(60秒)のベースラインステップの後、抗原を装填したバイオセンサーチップをIgG(PBSF中100nM)に曝露し(180秒、1000rpmの軌道振とう)、次にPBSF中に浸漬(180秒、1000rpmの軌道振とう)して、バイオセンサーチップ表面からのIgGの任意の解離を測定した。結合応答が0.1nmを超えるデータは、ForteBio Data Analysis Software(version 11.1)を用いてアラインメントし、インターステップ補正し(結合ステップへ)、1:1結合モデルにフィッティングさせた。
SARS-CoV-2 S1サブユニットをAcro Biosystems(カタログ番号S1N-C52H3)から購入し、SARS-CoV-2 S2サブユニットはSino Biological(カタログ番号S2N-C52H5)から購入した。
全ての試験抗体の結合動態を図7に示す。各抗体におけるSARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sに対する結合親和性(KD[M])を図14Aにドットプロットで示す。多くのmAb(202種中153種)はSARS-CoV-2とSARS-CoV Sの両方に結合を示したが、一部のmAbはSARS-CoV-2 Sに特異的であるように思われた。mAbがSARS-CoVに感染したことのあるドナーから単離したものであることを考慮すると、この結果は予想外であった。これは、感染SARS-CoV株と結合試験に使用した組換えSARS-CoV Sタンパク質(Tor2)との違いに関連する可能性がある。あるいは、この結果は、組換えプレフュージョン安定化SARS-CoVとSARS-CoV-2 Sタンパク質の安定性または抗原性の固有の差に起因する可能性がある。実際に、組換えSARS-CoV Sに結合しなかった抗体の約30%が、形質移入細胞の表面に発現したSARS-CoV Sに反応性を示しており、組換え形態及び細胞発現形態のSの抗原性の違いを示すいくらかの証拠をもたらした(図20F)。興味深いことに、高度に変異しクローン拡大した抗体のほとんどが、10nM未満のKD
AppでSARS-CoV及びSARS-CoV-2 Sの両方に結合した(図14B)。
実施例3:結合性測定値の動態(循環性/季節性CoV種のSタンパク質)
次に、これらの抗体が、自然循環性HCoVに事前曝露することによって誘導された既存のMBCを起源とするかどうかを調べた。なお自然循環性HCoVは、Sタンパク質においてSARS-CoV及びSARS-CoV-2に対し最大32%のアミノ酸同一性を共有する。したがって、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43のSタンパク質に対する結合親和性を、実施例2と同様の方法で測定及び解析した。229E、NL63、及びOC43のSタンパク質をSino Biological社から購入した(カタログ番号40605-V08B、40604-V08B、及び40607-V08B)。
次に、これらの抗体が、自然循環性HCoVに事前曝露することによって誘導された既存のMBCを起源とするかどうかを調べた。なお自然循環性HCoVは、Sタンパク質においてSARS-CoV及びSARS-CoV-2に対し最大32%のアミノ酸同一性を共有する。したがって、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43のSタンパク質に対する結合親和性を、実施例2と同様の方法で測定及び解析した。229E、NL63、及びOC43のSタンパク質をSino Biological社から購入した(カタログ番号40605-V08B、40604-V08B、及び40607-V08B)。
結果を図22~25に示す。
実施例2及び3の結果に基づき、各抗体の結合特異性/反応性の広さを判定した(図12)。所与の標的に対する結合応答値(nM)が0.1以上の抗体を結合物質とみなし、「可」と表示した。また、結合応答値が0.099や0.098のような四捨五入で0.1に切り上げることができる抗体も結合物質と同定し、「可」と表示した。所与の標的に対する結合応答値(nM)が0.1未満の抗体を非結合物質とみなし、「否」と表示した。SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-2-Sに対しては「可」であるが、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43の全てのSタンパク質に対しては「否」である抗体を「SARS1-2特異的」と分類した。SARS-CoV-S及び/またはSARS-CoV-2-Sに対して「可」であり、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、及びHCoV-OK43のSタンパク質の少なくとも1つに対して「可」である抗体を「広範」(結合物質)と分類した。
多特異性(多反応性とも称される)は、抗体の薬物動態不良に関連しており(Wu et al.,J Mol Biol 368:652-665, 2007;Hotzel et al.,2012,MAbs 4(6):753-760)、そのため開発性不良にもつながり得る非常に望ましくない特性である。抗体は、多特異性試薬(PSR)との相互作用のレベルにより、減少または増加した開発性を有するものとして検出できる。WO2014/179363を参照。PSRとの相互作用の増加を示す抗体は「多特異的」ポリペプチドと称され、開発性が(より)低い。低い多特異性スコアに基づいて高められた開発性を有すると選択または特定されたSARS2抗体は「開発性あり」とみなされる。
各抗体の多特異性を、過去に説明されているように測定した(L.Shehata et al.,Affinity Maturation Enhances Antibody Specificity but Compromises Conformational Stability.Cell reports 28, 3300-3308 e3304(2019))。簡潔に説明すると、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から得た可溶性膜タンパク質(SMP)及び可溶性細胞質タンパク質(SCP)画分を、NHS-LC-ビオチン(Thermo Fisher Scientific;カタログ番号21336)を用いてビオチン化した。酵母の表面に提示されたIgGを、1:10に希釈したビオチン化CHO細胞調製物とともに氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞を0.1% BSAを含む氷冷PBS(PBSF)で2回洗浄し、ExtrAvidin-R-PE(Sigma-Aldrich)、抗ヒトLC-FITC(Southern Biotech)、及びヨウ化プロピジウムを含む50μLの二次標識混合物中で15分間インキュベートした。細胞をPBSFで2回洗浄し、PBSFに再懸濁し、FACSCanto II(BD Biosciences)において実行した。結合の平均蛍光強度を、低、中、及び高の多特異性を示す対照抗体を用いて正規化して、非特異的結合を評価した。結果を図13A~13Cの表及び図13Dのグラフ(臨床抗体と比較したもの)に示す。
多特異性スコアは、開発性に基づいて抗体をランク付けする際に、1つまたは多くの指標のうちの1つとして有用であり得る。例えば、図13Dのように、抗体をクリーン(0.11未満)、低(0.33未満)、中(0.66未満)、及び高(0.66超)にランク付けすることができる。図13A~13Cでは、抗体のスコアが0.10未満の場合はA、スコアが0.10以上の場合はBにカテゴリー化した。図13Dで可視化されているように、大多数の交差反応性(すなわち、SARS-CoV及びSARS-CoV-2に結合する)抗体に多特異性が欠如していた。これは、観察された広範な結合活性が非特異的交差反応性に起因しないことを実証するものである。
実施例2及び3の結果をさらに解析し、図14のグラフにまとめている。交差反応性(すなわち、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sに結合する)抗体の過半数(89/153)が、SARS-CoV及びSARS-CoV-2 Sの両方に10nM超のKDAppで結合した(図14A及び図14B)。図14Bに示されているように、10nM超のKDApp値を有するこのようなSARS-CoV/SARS-CoV-2交差反応性抗体の80%超は、循環性CoVのうちの1つ以上に反応性を示し、そのサブセットは循環性CoV Sタンパク質と優先的に結合することを示した。このことから、これらのB細胞が最初に季節性CoV曝露によって誘導され、続いてSARS-CoV感染によって活性化及び拡大した可能性があることが示唆される。あるいは、このドナーがSARS-CoV感染後に経験した循環性HCoV感染が、この交差反応性メモリーB細胞(MBC)プールを拡大した可能性も考えられる。この仮説に整合して、広範な交差反応性抗体は、SARS-CoV及びSARS-CoV-2のみを認識した抗体と比較して、体細胞超変異(「SHM」)及びクローン拡大について有意に高いレベルを示し、想起記憶B細胞応答に整合するものであった(図14C及び図14D)。注目すべきことに、広範結合mAbの72%がVH1-69/VK2-30生殖系列系遺伝子対を利用しており、共通の抗原部位に対する生殖系列媒介性認識が示唆された(図14B及び図14H)。インデックスソーティング解析により、多くの広範結合抗体の大部分がIgAメモリーB細胞に由来し(粘膜起源を示す)、一方、ほとんどのSARS-CoV/SARS-CoV-2交差反応性抗体がIgGメモリーB細胞に由来することが明らかになった(図14E)。
3例全てのナイーブドナーからSARS-CoV-2 S反応性抗体が同定されたものの、回復期SARSドナーから同定された交差反応性抗体と比較して低いレベルのSHM、クローン拡大、ならびにSARS-CoV及びSARS-CoV-2 S両方に対する結合親和性を示した(図14F及び図14G)。まとめると、これらの結果は、SARS-CoV感染が、循環性CoVによって誘導された既存の交差反応性メモリーB細胞の活性化及び拡大、またはその逆をもたらした可能性があることを示唆している。
上記の結果が抗原原罪(「OAS」)現象に起因するのか、または期待されたように、循環性HCoV特異的B細胞受容体が、セルソーティングに使用したSARS-CoV-2のS四量体に貪欲に結合したことに起因するのかを調べるため、ELISAによって流行性HCoVに曝露したサルベコウイルスナイーブドナーにおいても、同様に広範に結合した抗体が存在するかどうかについて評価した。循環性HCoV曝露の血清学的証拠を有し、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2の感染歴を有しない3例の健康な成人ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)試料を得、蛍光標識したSARS-CoV-2 Sプローブを用いて対応するB細胞を染色した(図14I及び図14J)。フローサイトメトリー解析により、3例のナイーブドナーにおける総B細胞の0.06~0.1%がSARS-CoV-2反応性を示した(図14K)。350種超のSARS-CoV-2反応性MBCをソーティングし、シングルセルRT-PCRによって増幅し、141のVH/VL対をクローニングし、完全長IgGとして発現させた。3例全てのナイーブドナーから限られた数のSARS-CoV-2 S反応性抗体が同定されたものの、回復期SARSドナーから同定された交差反応性抗体と比較して有意に低いレベルのSHM、クローン拡大、ならびにSARS-CoV及びSARS-CoV-2 S両方に対する結合親和性を示した(図14F及び図14Gならびに図14L)。まとめると、これらの結果は、SARS-CoV感染が、循環性HCoV曝露によって誘導された既存の交差反応性MBCの活性化及び拡大をもたらした可能性があることを示唆している。
実施例4:エピトープマッピング
SARS-CoV-2-Sの異なるサブユニット及びドメインコンストラクトを用いて、Forte bioキット及び酵母ベースの競合アッセイを用いてエピトープマッピングを実施した。ある特定の抗体による単量体タンパク質との結合性を測定するには技術的課題を伴うため、これらの試験は、SARS-CoV-2に対するKD Appが10nM未満である65種の結合物質に限定した(図7)。
SARS-CoV-2-Sの異なるサブユニット及びドメインコンストラクトを用いて、Forte bioキット及び酵母ベースの競合アッセイを用いてエピトープマッピングを実施した。ある特定の抗体による単量体タンパク質との結合性を測定するには技術的課題を伴うため、これらの試験は、SARS-CoV-2に対するKD Appが10nM未満である65種の結合物質に限定した(図7)。
結合試験に使用したドメイン/サブユニットは、S1サブユニット、S2サブユニット、RBD、及びNTDであり、S1及びNTDへの結合については、一価の結合及び二価(「貪欲型(AVID)」)の結合の両方を測定した。
図15~18の結果をさらに図19及び図21Fにまとめている。ここでもまた、結合応答値が0.1以上の抗体を結合物質とみなした(「可」と表示)。そしてここでも、結合応答値が0.099や0.098のような四捨五入で0.1に切り上げることができる抗体を結合物質とみなし、「可」と表示した。結合応答値が0.1未満の抗体を非結合物質とみなした(「否」と表示)。
図15~19及び21Fに示されているように、75%の抗体がS1内のエピトープを認識し、一方残りの25%はS2内のエピトープに結合し、49種のS1指向抗体のうち21種(43%)及び28種(57%)がそれぞれRBD及びNTDを認識した。
競合試験については、各抗体における組換えヒトACE2(「hACE2」)及び市販抗体CR3022(受容体結合部位以外の保存エピトープを標的とする)との競合を試験した(M.Yuan et al.,A highly conserved cryptic epitope in receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV,Science,(2020))。
結果を図21A~21Eに示す。示されているように、抗体のうち6種はhACE2のみと競合し、3種はCR3022のみと競合し、4種はhACE2及びCR3022の両方と競合し、7種はhACE2及びCR3022のいずれとも競合しなかった。
実施例5:細胞結合アッセイ
SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2のSタンパク質をコードするプラスミドまたは空のプラスミドを、形質移入試薬PEIを用いてHEK-293細胞に一過性に形質移入した。抗体を、SARS-CoV-2-Sを発現するように操作したHEK-293細胞または空のプラスミドを形質移入したHEK-293細胞(「野生型」細胞または「WT」細胞)とともにインキュベートし、結合性を測定した。WT細胞と比較したSタンパク質発現細胞への結合倍率及びEC50[nM]値を計算した。SARS-CoV-2-S細胞結合の結果を図20A~20Eに示し、SARS-CoV-S細胞結合の結果を図20Fに示す。
SARS-CoVもしくはSARS-CoV-2のSタンパク質をコードするプラスミドまたは空のプラスミドを、形質移入試薬PEIを用いてHEK-293細胞に一過性に形質移入した。抗体を、SARS-CoV-2-Sを発現するように操作したHEK-293細胞または空のプラスミドを形質移入したHEK-293細胞(「野生型」細胞または「WT」細胞)とともにインキュベートし、結合性を測定した。WT細胞と比較したSタンパク質発現細胞への結合倍率及びEC50[nM]値を計算した。SARS-CoV-2-S細胞結合の結果を図20A~20Eに示し、SARS-CoV-S細胞結合の結果を図20Fに示す。
実施例6:マイクロタイター中和アッセイ
SARS-CoV/SARS-CoV-2交差反応性抗体の中和効力を評価するため、VSV及びマウス白血病ウイルス(MLV)ベースの偽型システムならびにSARS-CoV及びSARS-CoV-2の真正ウイルスをともに用いて中和アッセイを実施した。抗体の数が多いため、最初の中和スクリーニングは、単一濃度の精製IgGを用いた真正ウイルスアッセイにて実施した。
SARS-CoV/SARS-CoV-2交差反応性抗体の中和効力を評価するため、VSV及びマウス白血病ウイルス(MLV)ベースの偽型システムならびにSARS-CoV及びSARS-CoV-2の真正ウイルスをともに用いて中和アッセイを実施した。抗体の数が多いため、最初の中和スクリーニングは、単一濃度の精製IgGを用いた真正ウイルスアッセイにて実施した。
6-1:真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和アッセイ
Vero E6細胞にSARS-CoV-2/MT020880.1またはSARS-CoV/UrbaniをMOI=0.01で接種し、37℃/5% CO2/湿度80%で培養した。感染から50時間後に、細胞を-80℃で1時間凍結し、室温で解凍し、上清を収集し、約2500xgで10分間遠心分離することによって清澄化した。清澄化した上清を分注し、-80℃で保存した。SARS-CoV-2ウイルスストックのシークエンシングデータは、ワシントン州分離株MT020880.1と比較して、スパイク糖タンパク質に単一の変異(H655→Y)があることを示した。SARS-CoVストックについてのシークエンシングデータは利用できない。
Vero E6細胞にSARS-CoV-2/MT020880.1またはSARS-CoV/UrbaniをMOI=0.01で接種し、37℃/5% CO2/湿度80%で培養した。感染から50時間後に、細胞を-80℃で1時間凍結し、室温で解凍し、上清を収集し、約2500xgで10分間遠心分離することによって清澄化した。清澄化した上清を分注し、-80℃で保存した。SARS-CoV-2ウイルスストックのシークエンシングデータは、ワシントン州分離株MT020880.1と比較して、スパイク糖タンパク質に単一の変異(H655→Y)があることを示した。SARS-CoVストックについてのシークエンシングデータは利用できない。
予備滴定量の真正SARS-CoV-2/MT020880.1またはSARS-CoV/Urbaniを、それぞれ0.4及び0.2の最終感染多重度において、モノクローナル抗体の段階希釈液とともに室温で1時間インキュベートした。96ウェルプレートに入った単層のVero-E6細胞に抗体-ウイルス混合液を適用し、加湿インキュベーター内で37℃で1時間インキュベートした。次に感染培地を除去し、細胞を1XPBSで1回洗浄し、続いて新鮮な細胞培養基を加えた。感染から24時間後に培養基を除去し、細胞を1×PBSで1回洗浄した。PBSを除去し、プレートをホルマリン固定液に浸し、0.2% トリトン-Xにより室温で10分間透過処理し、ブロッキング溶液で処理した。感染細胞をAlexaFluor 488と結合体化した二次検出抗体(ヤギαウサギ)で染色した後に、SARS-CoV及びSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質を認識する交差反応性一次検出抗体(Sino Biological)5を用いて感染細胞を検出した。Operettaハイコンテンツイメージング装置を用いて感染細胞を計数し、Harmonyソフトウェア(Perkin Elmer)を用いてデータ解析を実施した。
6-2:rVSV-SARS-CoV-2中和アッセイ
eGFPレポーターを発現し、そのネイティブ糖タンパク質の代わりにSARS-CoV-2スパイクタンパク質遺伝子(配列番号6)をコードする組換え水疱性口内炎ウイルス(rVSV)を、過去に説明されているようにプラスミドベースレスキューによって生成する(Whelan et al.,1995;PMID:7667300及びKleinfelter et al.,2015;PMID: 26126854)。生成したウイルスがどのようなものかは、RT-PCR増幅後にスパイクタンパク質コード遺伝子をサンガーシークエンシングを行うことによって確認される。
eGFPレポーターを発現し、そのネイティブ糖タンパク質の代わりにSARS-CoV-2スパイクタンパク質遺伝子(配列番号6)をコードする組換え水疱性口内炎ウイルス(rVSV)を、過去に説明されているようにプラスミドベースレスキューによって生成する(Whelan et al.,1995;PMID:7667300及びKleinfelter et al.,2015;PMID: 26126854)。生成したウイルスがどのようなものかは、RT-PCR増幅後にスパイクタンパク質コード遺伝子をサンガーシークエンシングを行うことによって確認される。
予備滴定量のrVSV-SARS2 Sウイルスをモノクローナル抗体の段階希釈液とともに室温で1時間インキュベートする。384ウェルプレートに入った単層のHuh7.5.1細胞に抗体-ウイルス混合液を適用する。一晩インキュベートした後、eGFP陽性ウイルス感染細胞をCytation-5 imager(Biotek)を用いて計数し、搭載されたGen5ソフトウェアで解析する。
6-3:SARS-CoV-MLV及びSARS-CoV-2-MLV偽ウイルス粒子中和アッセイ
偽ウイルスを生成するため、SARS-CoV(AAP13567)及びSARS-CoV2(NC_045512)スパイク遺伝子(哺乳類発現用にコドン最適化)を、それぞれ18及び28アミノ酸のc末端欠失で合成し(IDT)、pCDNA3.3(ThermoFisher)にクローニングした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド(addgene#18760)を修飾して、IRESをCMVプロモーターで置き換えた。Endo-Free plasmid maxi kits(Qiagen;#12362)を用いてこれらのプラスミド及びMLV gag/pol(addgene#14887)を精製した。無菌条件下で、Lipofectamine 2000(ThermoFischer Scientific, 11668019)を製造者の指示に従って用いて、これらのプラスミドをHEK293T細胞に同時形質移入し、単一ラウンドの感染コンピテントな偽ウイルスを産生した。6ウェルプレートの1ウェルあたり0.5ug SARS-CoV-2または1ug SARS-CoV-1 S、2ug gag/pol、及び2ug MLVルシフェラーゼを使用した。形質移入から16時間後に培地を交換した。SARS S偽型ウイルス粒子を含む上清を形質移入から48時間後に収集し、分注し、中和アッセイ用に-80℃で凍結した。
偽ウイルスを生成するため、SARS-CoV(AAP13567)及びSARS-CoV2(NC_045512)スパイク遺伝子(哺乳類発現用にコドン最適化)を、それぞれ18及び28アミノ酸のc末端欠失で合成し(IDT)、pCDNA3.3(ThermoFisher)にクローニングした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド(addgene#18760)を修飾して、IRESをCMVプロモーターで置き換えた。Endo-Free plasmid maxi kits(Qiagen;#12362)を用いてこれらのプラスミド及びMLV gag/pol(addgene#14887)を精製した。無菌条件下で、Lipofectamine 2000(ThermoFischer Scientific, 11668019)を製造者の指示に従って用いて、これらのプラスミドをHEK293T細胞に同時形質移入し、単一ラウンドの感染コンピテントな偽ウイルスを産生した。6ウェルプレートの1ウェルあたり0.5ug SARS-CoV-2または1ug SARS-CoV-1 S、2ug gag/pol、及び2ug MLVルシフェラーゼを使用した。形質移入から16時間後に培地を交換した。SARS S偽型ウイルス粒子を含む上清を形質移入から48時間後に収集し、分注し、中和アッセイ用に-80℃で凍結した。
(参考文献)に記載されているマウス白血病偽ウイルスアッセイを用いて、モノクローナル抗体によるSARS-CoV-1及びSARS-CoV-2の中和を評価した。簡潔に説明すると、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むSARSスパイク(S)タンパク質偽型マウス白血病ウイルス(MLV)を様々なmAbで滴定し、続いてhACE2発現Hela細胞に加え、発光アッセイを用いて感染をモニターした。
中和アッセイを、過去に報告されているものにわずかな修正を加えて実施した(PMID:24291345)。滅菌白色96ウェル半面プレート(Corning;#3688)内で、25μlのSARS1またはSARS2偽型MLVベクターを、直ちに25μlの段階希釈(培地を用いて5倍希釈)mAbと混合し、37℃で1時間インキュベートして偽型ウイルスを抗体中和した。10,000HeLa-hACE2細胞/ウェル(20μg/mlデキストランを含む50ul培地中)を、抗体ウイルス混合物に直接加えた。プレートを37℃で42~48時間インキュベートした。感染後、1×ルシフェラーゼ溶解バッファー(25mM Gly-Gly pH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA、1%トリトンX-100)を用いてHeLa-hACE2細胞を溶解した。次に、ルシフェラーゼ基質(Promega、PR-E2620)を製造業者の指示に従って用いて、ルシフェラーゼ強度をルミノメーターで読み取った。以下の式を用いて中和のパーセンテージを計算した。
6-1~6-3の結果を図22に示す。図23F及び23Gは、選択された抗体に関する中和結果を示す。
また、真正ウイルス中和の結果を、実施例4のエピトープ解析の結果とともに解析した。図23A及び図23Bに示されているように、真正ウイルスシステムを用いて、202種の抗体のうち9種が100nMで40%超の中和を示し、この9種の抗体のうち8種はRBDに結合し(図23A)hACE2と競合し(図23B)、9種の抗体のうち1種はNTDに結合している(図23A)。9種の抗体のうち、7種が90%超の中和を示した(図22及び図23A)。これらの中和抗体は7種全てがRBDに結合し、hACE2と競合する(図22、23A、及び23B)。8種のRBD指向抗体のうち、4種はhACE2及びCR3022の両方に重複するエピトープに結合し(図30D)、他の4種はhACE2のエピトープにのみ重なるエピトープを認識した(図23C)。このことから、RBD内に重複するが異なる少なくとも2つの中和エピトープが存在することが示唆された。RBDに結合するがhACE2と競合しない抗体は、いずれも100nMで中和を示さなかった(図23C)。
滴定試験はさらに、nAbが真正SARS-CoV-2に対し0.6~20μg/mlの範囲のIC50を示し、重要なことには、どの抗体もウイルスの未中和画分を残さないことを実証した(図23D)。
興味深いことに、細胞表面Sに対する結合親和性と中和活性との間にはほとんど相関が観察されなかった(図23E)。例えば、全てのS2指向抗体及びNTD指向抗体のサブセットは、組換え及び細胞表面S両方に高い親和性で結合したが、これらの抗体はいずれも有意な中和活性を示さなかった。同様に、hACE2結合部位以外のエピトープを標的としたRBD指向抗体は、hACE2競合抗体と比較して、細胞表面Sに同様のまたはより高い親和性ですら結合したにもかかわらず、中和活性をほとんど示さなかった。
さらに、真正ウイルスに対する40%超の中和を示した9種の抗体について、異なるウイルスシステムを用いた中和データを図25にまとめている。図25における2種以上のウイルス/偽ウイルスシステムを用いて中和を示した7種の抗体のIC50値及びKD値を図26にまとめている。これらの抗体は、その結合特性及び中和特性に基づき、さらなる親和性成熟における理想的な候補として選択されたものである。
8種の抗体によるMLV偽型SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和を図23Fに示す。8種全ての抗体がSARS-CoV及びSARS-CoV-2偽MLVの両方を中和した。7種の抗体による真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和を図23Gに示す。7種の抗体全てがSARS-CoV及びSARS-CoV-2の両方を中和した。ADI-55688、ADI-55689、ADI-55993、及びADI-56046(矢印)を、さらに実施例12で親和性成熟に供した。図24は、偽システム(MLVまたはrVSV)を用いて得られた中和結果が、真正ウイルスを用いて得られた結果と十分に相関することを示している。
実施例7:VH CDR3に基づく抗体のクラスター解析
以下のパラメーターを用いて、VH CDR3のアミノ酸配列に基づき、BDインデックス番号1~71が割り当てられた抗体に対しクラスタリング解析を実施した。
以下のパラメーターを用いて、VH CDR3のアミノ酸配列に基づき、BDインデックス番号1~71が割り当てられた抗体に対しクラスタリング解析を実施した。
1)レーベンシュタイン距離<=3
2)クラスターをマージするアグレッシブクラスタリング
3)縮小したアルファベット:(AST)、(G)、(P)、(FWY)、(ILVMC)、(DE)、(NQH)、(RK)
図27A~27Cは、VH CDR3に基づくクラスターを示し、図28A~28Bは、2つ以上の抗体を含むクラスター(クラスター1~5)についてのサンプルプロットを示している。
クラスター1に分類される抗体は、ADI-55702、ADI-55704、ADI-55706、ADI-55723、ADI-55725、ADI-55726、ADI-55728、ADI-55731、ADI-55739、ADI-55741、ADI-55743、ADI-55745、及びADI-55748である。クラスター2に分類される抗体は、ADI-55700、ADI-55705、ADI-55712、ADI-55717、ADI-55736、ADI-55742、及びADI-55747である。クラスター3に分類される抗体は、ADI-55695、ADI-55698、及びADI-55714である。クラスター4に分類される抗体は、ADI-55688、ADI-55691、及びADI-55693である。クラスター5に分類される抗体は、ADI-55708、ADI-55709、及びADI-55719である。これらの抗体のうち、ADI-55700、ADI-55688、ADI-55708、ADI-55709、ADI-55719は交差反応性を有すると判定された抗体である。詳細には、実施例2及び実施例6の結果を比較し、クラスター5抗体のADI-55708、ADI-55709、及びADI-55719はいずれも交差反応性抗体であり、興味深いことには同一のVH CDR3配列(ARGSLSREYDFLTAPQNGPWFDS(配列番号2108、2208、または3208))を共有していた。このことから、この特定のVH CDR3配列と、このVH CDR3ポリペプチドを含む抗体がSARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sと交差反応する能力との間に構造-特徴の関係が存在することが示唆される。さらに、これらの3つの抗体はVH CDR1も共有しているため、VH CDR1もまた構造-特徴の関係(すなわち、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sと交差反応する能力)に寄与している可能性がある。
実施例8:FRNTアッセイ
SARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質結合ELISAのために、96ウェルプレート(Corning;カタログ番号3690)を、PBSで希釈したSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質5μg/mlでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを洗浄し、次にPBS中の5%脱脂粉乳(NFDM)により37℃で1時間ブロックした。ウェルをPBSで3回洗浄し、5% NFDM-PBS中のヒト血漿の段階希釈液を加え、37℃で1時間インキュベートした。次にプレートをPBSで3回洗浄し、二次交差吸着抗ヒトIgG-HRP(Thermo Fisher Scientific;カタログ番号31413)または抗ヒトIgM(Sigma Aldrich;カタログ番号AP114P)検出抗体を5% NFDM-PBS中1:8000希釈で37℃で1時間加えた。PBSで3回洗浄した後、検出試薬(Thermo Scientific;カタログ番号34029)を製造業者の推奨に従って加え、Spectramaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて450nM波長で吸光度を測定した。
SARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質結合ELISAのために、96ウェルプレート(Corning;カタログ番号3690)を、PBSで希釈したSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質5μg/mlでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを洗浄し、次にPBS中の5%脱脂粉乳(NFDM)により37℃で1時間ブロックした。ウェルをPBSで3回洗浄し、5% NFDM-PBS中のヒト血漿の段階希釈液を加え、37℃で1時間インキュベートした。次にプレートをPBSで3回洗浄し、二次交差吸着抗ヒトIgG-HRP(Thermo Fisher Scientific;カタログ番号31413)または抗ヒトIgM(Sigma Aldrich;カタログ番号AP114P)検出抗体を5% NFDM-PBS中1:8000希釈で37℃で1時間加えた。PBSで3回洗浄した後、検出試薬(Thermo Scientific;カタログ番号34029)を製造業者の推奨に従って加え、Spectramaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて450nM波長で吸光度を測定した。
実施例9:in vivo有効性
治療及び/または予防有効性
試験動物、好ましくは哺乳類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、またはサル)を複数の群に分ける。本開示の抗体またはそのフラグメントを少なくとも1つの群に投与する。少なくとも1つの群には、このような抗体またはそのフラグメントを投与しない。次に、動物にコロナウイルス(SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、または季節性CoV)を感染させる。代替的に、抗体またはそのフラグメントをCoVによる感染の前に投与してもよい。抗体またはそのフラグメントは、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または他の適切な経路により投与することができる。
治療及び/または予防有効性
試験動物、好ましくは哺乳類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、またはサル)を複数の群に分ける。本開示の抗体またはそのフラグメントを少なくとも1つの群に投与する。少なくとも1つの群には、このような抗体またはそのフラグメントを投与しない。次に、動物にコロナウイルス(SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、または季節性CoV)を感染させる。代替的に、抗体またはそのフラグメントをCoVによる感染の前に投与してもよい。抗体またはそのフラグメントは、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または他の適切な経路により投与することができる。
各動物の体重をモニターする。発熱または可動性などの症状もモニターする場合がある。定期的に血清などの試料を採取し、ウイルス負荷を測定する。生存率を追跡する。動物は、体重及び/またはウイルス血症及び/または挙動及び/または症状(複数可)の所定のカットオフ値に基づいて屠殺することができる。
実施例10:CoVワクチン有効性の予測
本開示の抗体のいくつかはCoVを中和する(「nAb」)。抗体のいくつかはCoVを中和しない(「非nAb」)。所与のCoVワクチン組成物が防御免疫応答(例えば、ワクチンを対象に投与した際の中和抗体)を誘発するかどうかを予測するためのこれらの抗体の使用が想定される。これは、ワクチン組成物とnAb及び/または非Abとの結合を定量化し、組成物がnAbに結合するか、十分に結合するか、またはより多く結合するかを判定することによって達成される。
本開示の抗体のいくつかはCoVを中和する(「nAb」)。抗体のいくつかはCoVを中和しない(「非nAb」)。所与のCoVワクチン組成物が防御免疫応答(例えば、ワクチンを対象に投与した際の中和抗体)を誘発するかどうかを予測するためのこれらの抗体の使用が想定される。これは、ワクチン組成物とnAb及び/または非Abとの結合を定量化し、組成物がnAbに結合するか、十分に結合するか、またはより多く結合するかを判定することによって達成される。
異なるワクチン組成物を(場合によってはスクリーニング目的で)比較して、どのワクチンが防御免疫応答(例えば、中和抗体)をより多く、またはより良好に誘発することが予測されるかを判定することができる。例えば、これは、異なるnAb(複数可)及び非nAb(複数可)のパネルを用意し、どのワクチン組成物がnAb(複数可)に非nAb(複数可)よりも多く結合するかを試験することによって行うことができる。nAb(複数可)により多く結合するワクチン組成物は、防御免疫応答をより有効に誘発することが予測される。
さらに、CoV-Sは高グリコシル化タンパク質であるため、Sタンパク質の調製方法によってグリコシル化が異なる可能性がある。例えば、細胞のタイプ、発現方法及び/または条件、精製方法及び/または条件、あるいは保存状態ですらもグリコシル化に影響を及ぼし得る。これらの要因は全て、推定上のワクチンが、ワクチン接種を受けた個体が防御免疫を開始するために十分な免疫応答を誘発するエピトープを少なくとも1つ含むかどうかに影響を及ぼし得る。この抗体は、推定上のワクチンが、中和抗体を誘発するために適切なグリコシル化を有するCoV-Sタンパク質を発現するかどうかを判定するのに役立ち得ることが予想される。
既知及び発生前のコロナウイルスに対し広範に防御するワクチンが緊急に必要とされている。ワクチンの目的が、ヒトに感染するCoVに対し広範に防御的である免疫応答を誘導することである場合、ワクチン組成物が広範なCoV種に結合する抗体に結合するかどうか試験しようと考えることができる。ワクチンの目的が、主にSARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2に対する免疫応答の誘導である場合、ワクチン組成物がSARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2に結合する抗体に結合するかどうかを試験しようと考えることができる。
このワクチン有効性予測の目的において、少なくとも1つの抗体とその使用方法の説明書を含むキットが想定されている。説明書は、ワクチン有効性予測試験の実施方法を教示するものであり得る。
また、このようなキットは、CoV感染の診断、対象または対象からの検体におけるCoVの存在の検出、CoV感染の治療、またはCoV感染の防止で使用するためのものでもあり得る。
実施例11:抗CoV-S抗体スクリーニング
本明細書で開示する抗体配列を用いて、さらなる抗体またはそのフラグメントをスクリーニングまたは発見することができる。例えば、本明細書で開示する抗体のいずれか1つの6つのCDRのうちの少なくとも1つを含む1つ以上の抗体を、最初に調製することができる。次に、このような抗体(複数可)を、以下の(flowing)特徴のうちの1つ以上を提供するかどうか試験することができる:(i)CoVのSタンパク質に結合する;(ii)CoV-SのS1サブユニットに結合する;(iii)CoV-SのRBDに結合する;(iv)CoV-SのNTDに結合する;(v)CoV-SのACE2結合モチーフに結合する;(vi)ACE2(例えば、hACE2)と競合する;(vii)抗体CR3022と競合する;(viii)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上を中和する;(iv)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上の偽ウイルスを中和する;あるいは(x)CoV感染をin vivoで防止または治療する。このような試験には、使用する方法は、本出願で開示する方法に限定されず、当分野の任意の他の試験方法及び/または技法を使用することができる。
本明細書で開示する抗体配列を用いて、さらなる抗体またはそのフラグメントをスクリーニングまたは発見することができる。例えば、本明細書で開示する抗体のいずれか1つの6つのCDRのうちの少なくとも1つを含む1つ以上の抗体を、最初に調製することができる。次に、このような抗体(複数可)を、以下の(flowing)特徴のうちの1つ以上を提供するかどうか試験することができる:(i)CoVのSタンパク質に結合する;(ii)CoV-SのS1サブユニットに結合する;(iii)CoV-SのRBDに結合する;(iv)CoV-SのNTDに結合する;(v)CoV-SのACE2結合モチーフに結合する;(vi)ACE2(例えば、hACE2)と競合する;(vii)抗体CR3022と競合する;(viii)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上を中和する;(iv)SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、もしくはHCoV-OK43、またはこれらのバリアントのうちの1つ以上の偽ウイルスを中和する;あるいは(x)CoV感染をin vivoで防止または治療する。このような試験には、使用する方法は、本出願で開示する方法に限定されず、当分野の任意の他の試験方法及び/または技法を使用することができる。
なお、中和抗体だけでなく、非中和抗体もCoV感染の防止及び/または治療に有用である可能性があることに留意されたい。例えば、このような非中和抗体は、例えば、抗体が細胞表面上のCoVに結合する場合、依然として抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(「ADCC」)及び/または補体依存性細胞傷害(「CDC」)を媒介することができる。さらに、このような非中和抗体またはその抗原結合フラグメントは、ADCやCARコンストラクトの一部として使用することができる。これは、ADCまたはCARの細胞傷害性をもたらすのが必ずしも抗原結合ドメインではなく、結合体化された薬物または宿主細胞機構が関与する場合もあるためである。したがって、抗原結合ドメインは単にCoVと結合するだけでよく、それ自体が必ずしも中和能を有する必要はない。さらに、非中和抗体は、試料中のCoVを検出するため、または実施例10に記載のようにワクチン有効性の予測に使用するためにも使用することもできる。
実施例12:SARS-CoV-2中和抗体の親和性成熟
ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868をそれぞれADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046の親和性成熟によって得た。
ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868をそれぞれADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046の親和性成熟によって得た。
抗体の親和性成熟は、後述するように重鎖及び軽鎖の可変領域に多様性を導入することによって実施した。
VH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3の選択:重鎖を多様化するため、IDT社からVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3に変化を伴ったフォワードプライミングオリゴを取り寄せた。PCRによる重鎖可変領域全体の構築及び増幅のために、上記のCDRに相同性を含むFR1~FR4オリゴを逆プライミング方向で取り寄せた。重鎖可変領域(FR1~FR4)を親の軽鎖プラスミドを含む酵母内で形質転換した。ライブラリーの多様性を1×107とし、2つのラウンドのFACSで選択を実施し、抗原滴定を用いて最も親和性の高いビオチン化SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合物質に対しソーティングした。
VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3の選択:それぞれのCDRに変化を有するフォワードプライミングオリゴを取り寄せることにより、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3の多様化を得た。PCRによる軽鎖可変領域全体の構築及び増幅のために、上記のCDRに相同性を含むFR1~FR4オリゴを逆プライミング方向で取り寄せた。軽鎖可変領域(FR1~FR4)を親の重鎖プラスミドを含む酵母内で形質転換した。1×106のライブラリー多様性を用いて、選択を2ラウンドのFACSで実施した。ビオチン化SARS-CoV-2スパイクタンパク質を滴定することにより、親和性圧力をかけた。
組み合わせた重鎖及び軽鎖の選択(図30Cに示すスキーム):VH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3成熟サイクルの最高親和性IgGからの可変領域(FR1~FR4)を、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3成熟サイクルの最高親和性IgGと組み合わせ、酵母内で形質転換した。選択は2つのラウンドのFACSで実施し、最も親和性の高いビオチン化SARS-CoV-2 S1タンパク質結合物質を富化した。FACSを介してインプット重鎖または軽鎖IgGよりも優れた親和性を有する抗体を選択するため、最終ソーティング集団を最終ラウンドのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3/VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3成熟アウトプットと比較した。親和性成熟後代を、実施例13及び14に記載のようにSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する親和性及びSARS-CoV及びSARS-CoV-2中和能についてアッセイし、結果に基づき、ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868(それぞれADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046の親和性成熟後代)をそれぞれ最適後代として選択した。
図30Dはさらに、親和性成熟後代ライブラリーにおけるSARS-CoV-2-SのS1サブユニットとの結合性が、それぞれの親抗体ADI-55689、ADI-55688、またはADI-56046よりもはるかに高いことを示す。
選択された抗体のVH及びVLならびにVH及びVLのCDR及びFRの配列を図36A及び図36Bに示す。生殖系列または生殖系列コード配列に対する配列変化は体細胞変異によって引き起こされ、縮重プライマーによって引き起こされる変化は、本明細書では「プライマー変異」とも称される。
実施例13:親抗体及び親和性成熟後代抗体における結合性測定値(SARS-CoV-2-S)の動態
親抗体(すなわち、親和性成熟前)、ADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046、ならびに親和性成熟を介して生じたサイクル1及びサイクル2の後代(実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868を含む)を、実施例12を実施例1に記載の方法でFabとして発現させ、実施例2に記載の方法で、プレフュージョン安定化SARS-CoV-2 Sタンパク質に対する各Fabの見かけ上の結合親和性(KD App)をBLI(4時間インキュベート)により決定した。結果を図30Aに示す。この図面では、SARS-CoV-2-Sに対する親和性について、サイクル1の後代がそれぞれの親よりも、またサイクル2の後代においてはそれぞれのサイクル1の後代よりも著しく改善(およそ25~630倍の改善)したことが示されている。
親抗体(すなわち、親和性成熟前)、ADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046、ならびに親和性成熟を介して生じたサイクル1及びサイクル2の後代(実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868を含む)を、実施例12を実施例1に記載の方法でFabとして発現させ、実施例2に記載の方法で、プレフュージョン安定化SARS-CoV-2 Sタンパク質に対する各Fabの見かけ上の結合親和性(KD App)をBLI(4時間インキュベート)により決定した。結果を図30Aに示す。この図面では、SARS-CoV-2-Sに対する親和性について、サイクル1の後代がそれぞれの親よりも、またサイクル2の後代においてはそれぞれのサイクル1の後代よりも著しく改善(およそ25~630倍の改善)したことが示されている。
実施例14:親抗体及び親和性成熟後代を用いたマイクロタイター中和アッセイ
14-1:真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和アッセイ
実施例13で得られた親抗体(すなわち、親和性成熟前)ADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046、ならびに親和性成熟後代(ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868を含む)による真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和は、実施例6の6-1で説明された方法を用いて測定した。結果を図30Bに示す。この図面では、親和性成熟により、SARS-CoV及びSARS-CoV-2の両方を中和する能力が著しく改善したことが示されている。
14-1:真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和アッセイ
実施例13で得られた親抗体(すなわち、親和性成熟前)ADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046、ならびに親和性成熟後代(ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868を含む)による真正SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和は、実施例6の6-1で説明された方法を用いて測定した。結果を図30Bに示す。この図面では、親和性成熟により、SARS-CoV及びSARS-CoV-2の両方を中和する能力が著しく改善したことが示されている。
実施例13及び14の結果に基づき、SARS-CoV-2のSタンパク質親和性の改善が中和性の改善につながることが分かった。ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868のIC50値も図31Aに示す。
14-2:SARS-CoV-MLV及びSARS-CoV-2-MLV偽ウイルス粒子中和アッセイ
実施例6の6-3に記載されている方法を用いて、実施例13で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868によるSARS-CoV及びSARS-CoV-2 MLV偽ウイルス粒子の中和を測定した。
実施例6の6-3に記載されている方法を用いて、実施例13で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868によるSARS-CoV及びSARS-CoV-2 MLV偽ウイルス粒子の中和を測定した。
結果を図30Bに示す。この図面では、14-1における真正ウイルス中和試験の結果と非常に類似する結果が示されている。ADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868のIC50値も図31Aに示す。
実施例15:回復期COVID-19患者の血液試料を用いたSARS-CoV-2-Sに選択的に結合する抗体の選択及び調製
ADI-56443及びADI-56479を、それぞれSARS-CoV-2のスパイク(S)タンパク質のRBD及びNTDに対し高い親和性を有する強力な中和抗体として同定した。
ADI-56443及びADI-56479を、それぞれSARS-CoV-2のスパイク(S)タンパク質のRBD及びNTDに対し高い親和性を有する強力な中和抗体として同定した。
試料
感染から1か月後の対象2名(2019~2020年SARS-CoV-2アウトブレイクサバイバー)からヘパリン加血液(50~100cc)を得た(ドナー名:「EMC10」及び「EMC15」)。試料を処理して血漿を取得し、末梢血由来のB細胞を単離した。単離細胞及び血漿を分注して-80℃で凍結保存した。
感染から1か月後の対象2名(2019~2020年SARS-CoV-2アウトブレイクサバイバー)からヘパリン加血液(50~100cc)を得た(ドナー名:「EMC10」及び「EMC15」)。試料を処理して血漿を取得し、末梢血由来のB細胞を単離した。単離細胞及び血漿を分注して-80℃で凍結保存した。
抗原及び抗体
組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質の産生:SARS-CoV-2のプレフュージョンS外部ドメインを発現させるために、残基986及び987にプロリン置換を有する2019-nCoV S(GenBank:MN908947)の残基1~1208をコードする遺伝子、フリン切断部位(残基682~685)の「GSAS」置換(配列番号23196として開示されている「GSAS」)、C末端T4フィブリチン三量化モチーフ、HRV3Cプロテアーゼ切断部位、TwinStrepタグ及び8XHisタグ(配列番号23197)を合成し、哺乳類発現ベクターpαH(DOI:10.1126/science.abb2507)にクローニングした。発現コンストラクトの設計は、関連するベータコロナウイルスSタンパク質の発現について過去に説明された戦略に基づくものであった(DOI:10.1073/pnas.1707304114及びDOI:10.1038/s41598-018-34171-7)。SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするこれらの発現ベクターを使用して、ポリエチレンイミンを用いてFreeStyle293F細胞(Thermo 134 Fischer)に一過性に形質移入した。135 StrepTactin樹脂(IBA)またはプロテインA樹脂(Pierce)を用いてろ過した細胞上清からタンパク質を精製した後、2mMトリスpH8.0、138 200mM NaCl、及び0.02% NaN3中のSuperose6 10/300カラム(GE 137 Healthcare)またはSuperdex200 10/300 Increaseカラム(GE Healthcare)のいずれかを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて追加136精製に供した。最終的なタンパク質調製物を、さらに150mM NaClを追加したリン酸緩衝生理食塩水pH7.4中で保存した。使用するまで少ない分注量で-70℃で保存した。
組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質の産生:SARS-CoV-2のプレフュージョンS外部ドメインを発現させるために、残基986及び987にプロリン置換を有する2019-nCoV S(GenBank:MN908947)の残基1~1208をコードする遺伝子、フリン切断部位(残基682~685)の「GSAS」置換(配列番号23196として開示されている「GSAS」)、C末端T4フィブリチン三量化モチーフ、HRV3Cプロテアーゼ切断部位、TwinStrepタグ及び8XHisタグ(配列番号23197)を合成し、哺乳類発現ベクターpαH(DOI:10.1126/science.abb2507)にクローニングした。発現コンストラクトの設計は、関連するベータコロナウイルスSタンパク質の発現について過去に説明された戦略に基づくものであった(DOI:10.1073/pnas.1707304114及びDOI:10.1038/s41598-018-34171-7)。SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするこれらの発現ベクターを使用して、ポリエチレンイミンを用いてFreeStyle293F細胞(Thermo 134 Fischer)に一過性に形質移入した。135 StrepTactin樹脂(IBA)またはプロテインA樹脂(Pierce)を用いてろ過した細胞上清からタンパク質を精製した後、2mMトリスpH8.0、138 200mM NaCl、及び0.02% NaN3中のSuperose6 10/300カラム(GE 137 Healthcare)またはSuperdex200 10/300 Increaseカラム(GE Healthcare)のいずれかを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて追加136精製に供した。最終的なタンパク質調製物を、さらに150mM NaClを追加したリン酸緩衝生理食塩水pH7.4中で保存した。使用するまで少ない分注量で-70℃で保存した。
B細胞シングルソーティング
MBCソーティングのために、MACS B細胞単離キット(Miltenyi Biotec;カタログ番号130-091-151)を用いてB細胞を精製し、続いて抗ヒトCD19(PE-Cy7)、CD3(PerCP-Cy5.5)、CD8(PerCP-Cy5.5)、CD14(PerCP-Cy5.5)、CD16(PerCP-Cy5.5)、IgM(BV711)、IgD(BV421)、IgA(AF488)、IgG(BV605)、CD27(BV510)、CD71(APC-Cy7)、及び二重標識(APC及びPE)SARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体(25nM)を用いて染色した。実験ごとに新鮮な四量体を調製し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体に反応性を示すB細胞をシングルセルソーティングした。シングルセルを20uL/ウェルの溶解バッファー[5uLの5X第1ストランドcDNAバッファー(Invitrogen)、0.625uLのNP-40(New England Biolabs)、0.25uL RNaseOUT(Invitrogen)、1.25uLジチオスレイトール(Invitrogen)、及び12.6uL dH2O]が入った96ウェルPCRプレートに入れてBD FACS Aria II(BD Biosciences)を用いてソーティングした。プレートを直ちに-80℃で保存した。FlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
MBCソーティングのために、MACS B細胞単離キット(Miltenyi Biotec;カタログ番号130-091-151)を用いてB細胞を精製し、続いて抗ヒトCD19(PE-Cy7)、CD3(PerCP-Cy5.5)、CD8(PerCP-Cy5.5)、CD14(PerCP-Cy5.5)、CD16(PerCP-Cy5.5)、IgM(BV711)、IgD(BV421)、IgA(AF488)、IgG(BV605)、CD27(BV510)、CD71(APC-Cy7)、及び二重標識(APC及びPE)SARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体(25nM)を用いて染色した。実験ごとに新鮮な四量体を調製し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質四量体に反応性を示すB細胞をシングルセルソーティングした。シングルセルを20uL/ウェルの溶解バッファー[5uLの5X第1ストランドcDNAバッファー(Invitrogen)、0.625uLのNP-40(New England Biolabs)、0.25uL RNaseOUT(Invitrogen)、1.25uLジチオスレイトール(Invitrogen)、及び12.6uL dH2O]が入った96ウェルPCRプレートに入れてBD FACS Aria II(BD Biosciences)を用いてソーティングした。プレートを直ちに-80℃で保存した。FlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
抗体可変遺伝子の増幅及びクローニング
抗体可変遺伝子(IgH、IgK、及びIgL)を、過去に説明されているように(Tiller et al,J Immunol 2008)IgG及びIgM特異的プライマーのカクテルを用いて、逆転写PCR及びネステッドPCRによって増幅した。第2ラウンドのPCRで使用するプライマーは、消化された発現ベクターに対し5’及び3’相同性の40塩基対を含み、これによりS.cerevisiaeへの相同組換えによるクローニングが可能になった。化学的形質転換のための酢酸リチウム法を使用して、PCR産物をS.cerevisiaeにクローニングした(Gietz and Schiestl,Nat Protoc 2007)。10uLの未精製重鎖及び軽鎖PCR産物及び200ngの消化された発現ベクターを形質転換反応ごとに使用した。形質転換後、シークエンシング及び特性評価のために個々の酵母コロニーを採取した。個々のB細胞から同族抗体の重鎖及び軽鎖の対をレスキューし、クローニングした。配列、生殖系列の起源、及びアイソタイプを決定した。生殖系列配列に対する核酸置換数、及び生殖系列コード配列に対するアミノ酸変化数も解析した。2つの同定された抗体、ADI-56443及びADI-56479のVH及びVLの配列ならびにVH及びVLのCDR及びFRの配列を図36A及び図36Bに示す。生殖系列コード配列に対する配列変化を赤色(体細胞変異によって生じたもの)及び橙色(縮重プライマーによって生じたもの;本明細書では「プライマー変異」とも称される)で示している。生殖系列起源及びアイソタイプについては図31及び図35に示している。
抗体可変遺伝子(IgH、IgK、及びIgL)を、過去に説明されているように(Tiller et al,J Immunol 2008)IgG及びIgM特異的プライマーのカクテルを用いて、逆転写PCR及びネステッドPCRによって増幅した。第2ラウンドのPCRで使用するプライマーは、消化された発現ベクターに対し5’及び3’相同性の40塩基対を含み、これによりS.cerevisiaeへの相同組換えによるクローニングが可能になった。化学的形質転換のための酢酸リチウム法を使用して、PCR産物をS.cerevisiaeにクローニングした(Gietz and Schiestl,Nat Protoc 2007)。10uLの未精製重鎖及び軽鎖PCR産物及び200ngの消化された発現ベクターを形質転換反応ごとに使用した。形質転換後、シークエンシング及び特性評価のために個々の酵母コロニーを採取した。個々のB細胞から同族抗体の重鎖及び軽鎖の対をレスキューし、クローニングした。配列、生殖系列の起源、及びアイソタイプを決定した。生殖系列配列に対する核酸置換数、及び生殖系列コード配列に対するアミノ酸変化数も解析した。2つの同定された抗体、ADI-56443及びADI-56479のVH及びVLの配列ならびにVH及びVLのCDR及びFRの配列を図36A及び図36Bに示す。生殖系列コード配列に対する配列変化を赤色(体細胞変異によって生じたもの)及び橙色(縮重プライマーによって生じたもの;本明細書では「プライマー変異」とも称される)で示している。生殖系列起源及びアイソタイプについては図31及び図35に示している。
IgG及びFabフラグメントの発現及び精製
IgGを、過去に説明されているように(Bornholdt et al,Science 2016,PMID:26912366)、24ウェルプレートで成長させたS.cerevisiae培養物中で発現させた。6日後、培養物を遠心分離によって採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってIgGを精製した。結合した抗体を200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)で1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。
IgGを、過去に説明されているように(Bornholdt et al,Science 2016,PMID:26912366)、24ウェルプレートで成長させたS.cerevisiae培養物中で発現させた。6日後、培養物を遠心分離によって採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってIgGを精製した。結合した抗体を200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)で1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。
組換えクローニングを用いてCR3022をS.cerevisiae内でクローニングした。CR3022の可変領域配列を、相同なオーバーハングを有するgBlockフラグメント(IDT)として合成し、これを上記のようにクローニングし発現させた。
IgGをパパインで30℃で2時間消化することによってFabフラグメントを生成した。ヨードアセトアミドを加えることにより消化を終了させ、Fab及びFcの混合物をプロテインAアガロースに通してFcフラグメント及び未消化のIgGを除去した。次に、プロテインA樹脂のフロースルーをCaptureSelect(商標)IgG-CH1アフィニティー樹脂(ThermoFischer Scientific)に通し、200mM酢酸/50mM NaCl pH3.5で1/8容量の2M Hepes pH8.0に溶出した。次にFabフラグメントをPBS pH7.0にバッファー交換した。
IgGをパパインで30℃で2時間消化することによってFabフラグメントを生成した。ヨードアセトアミドを加えることにより消化を終了させ、Fab及びFcの混合物をプロテインAアガロースに通してFcフラグメント及び未消化のIgGを除去した。次に、プロテインA樹脂のフロースルーをCaptureSelect(商標)IgG-CH1アフィニティー樹脂(ThermoFischer Scientific)に通し、200mM酢酸/50mM NaCl pH3.5で1/8容量の2M Hepes pH8.0に溶出した。次にFabフラグメントをPBS pH7.0にバッファー交換した。
実施例16:回復期COVID-19患者から単離した抗体との結合測定値(SARS-CoV-2及び季節性CoVのSタンパク質)の動態
バイオレイヤー干渉動態学的測定(BLI):
SARS-CoV-2またはHKU1のプレフュージョン安定化Sタンパク質に対する、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479の見かけ上の結合親和性(KD Apps)を、実施例2に記載のようにしてBLI(4時間インキュベート)によって定量した。結果は図32B及び32Gに示されている。この図面では、ADI-56443及びADI-56479がいずれも、SARS-CoV-2-Sには結合するがHKU1-Sには結合しないことが示されている。
バイオレイヤー干渉動態学的測定(BLI):
SARS-CoV-2またはHKU1のプレフュージョン安定化Sタンパク質に対する、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479の見かけ上の結合親和性(KD Apps)を、実施例2に記載のようにしてBLI(4時間インキュベート)によって定量した。結果は図32B及び32Gに示されている。この図面では、ADI-56443及びADI-56479がいずれも、SARS-CoV-2-Sには結合するがHKU1-Sには結合しないことが示されている。
FRNTアッセイ:
実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479を実施例15に記載のようにしてヒトIgGとして発現させ、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sタンパク質に対する見かけ上の結合親和性(KD App)を定量した。
実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479を実施例15に記載のようにしてヒトIgGとして発現させ、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sタンパク質に対する見かけ上の結合親和性(KD App)を定量した。
SARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質結合ELISAのために、96ウェルプレート(Corning;カタログ番号3690)を、PBSで希釈したSARS CoVまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質5μg/mlでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを洗浄し、次にPBS中の5%脱脂粉乳(NFDM)により37℃で1時間ブロックした。ウェルをPBSで3回洗浄し、5% NFDM-PBS中のヒト血漿の段階希釈液を加え、37℃で1時間インキュベートした。次にプレートをPBSで3回洗浄し、二次交差吸着抗ヒトIgG-HRP(Thermo Fisher Scientific;カタログ番号31413)または抗ヒトIgM(Sigma Aldrich;カタログ番号AP114P)検出抗体を5% NFDM-PBS中1:8000希釈で37℃で1時間加えた。PBSで3回洗浄した後、検出試薬(Thermo Scientific;カタログ番号34029)を製造業者の推奨に従って加え、Spectramaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて450nM波長で吸光度を測定した。
結果からは、ADI-56443及びADI-56479がいずれもSARS-CoV-2-Sに結合することが示された(データは示さず)。
実施例17:ADI-56443及びADI-56479を用いたマイクロタイター中和アッセイ
17-1:真正SARS-CoV-2中和アッセイ
実施例6の6-1に記載の方法を用いて、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479による真正SARS-CoV-2の中和を測定した。結果を図31A及び図33に示す。ADI-56443及びADI-56479はいずれも真正SARS-CoV-2を効率的に中和した。
17-1:真正SARS-CoV-2中和アッセイ
実施例6の6-1に記載の方法を用いて、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479による真正SARS-CoV-2の中和を測定した。結果を図31A及び図33に示す。ADI-56443及びADI-56479はいずれも真正SARS-CoV-2を効率的に中和した。
17-2:rVSV-SARS-CoV-2中和アッセイ
実施例6の6-2に記載されている方法を用いて、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479によるSARS-CoV-2 rVSV偽ウイルス粒子の中和を測定した。
実施例6の6-2に記載されている方法を用いて、実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479によるSARS-CoV-2 rVSV偽ウイルス粒子の中和を測定した。
結果を図31A及び図33に示す。ADI-56443及びADI-56479の両方がSARS-CoV-2 rVSV偽ウイルスを効率的に中和した。
実施例18:開発性プロファイル解析
実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479の各々について、「開発性」の複数の生物物理的測定基準に対する許容性をアッセイパネル(PSR、HIC、及びTm)を用いて評価した。
実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479の各々について、「開発性」の複数の生物物理的測定基準に対する許容性をアッセイパネル(PSR、HIC、及びTm)を用いて評価した。
多特異性(多反応性とも称される)は、抗体の薬物動態不良に関連しており(Wu et al.,J Mol Biol 368:652-665, 2007;Hotzel et al.,2012,MAbs 4(6):753-760)、そのため開発性不良にもつながり得る非常に望ましくない特性である。抗体は、多特異性試薬(PSR)との相互作用のレベルにより、減少または増加した開発性を有するものとして検出できる。WO2014/179363を参照。PSRとの相互作用の増加を示す抗体は「多特異的」ポリペプチドと称され、開発性が(より)低い。低い多特異性スコアに基づいて高められた開発性を有すると選択または特定されたSARS2抗体は「開発性あり」とみなされる。
各抗体の多特異性を、過去に説明されているように測定した(L.Shehata et al.,Affinity Maturation Enhances Antibody Specificity but Compromises Conformational Stability.Cell reports 28, 3300-3308 e3304(2019))。簡潔に説明すると、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から得た可溶性膜タンパク質(SMP)及び可溶性細胞質タンパク質(SCP)画分を、NHS-LC-ビオチン(Thermo Fisher Scientific;カタログ番号21336)を用いてビオチン化した。酵母の表面に提示されたIgGを、1:10に希釈したビオチン化CHO細胞調製物とともに氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞を0.1% BSAを含む氷冷PBS(PBSF)で2回洗浄し、ExtrAvidin-R-PE(Sigma-Aldrich)、抗ヒトLC-FITC(Southern Biotech)、及びヨウ化プロピジウムを含む50μLの二次標識混合物中で15分間インキュベートした。細胞をPBSFで2回洗浄し、PBSFに再懸濁し、FACSCanto II(BD Biosciences)において実行した。結合の平均蛍光強度を、低、中、及び高の多特異性を示す対照抗体を用いて正規化して、非特異的結合を評価した。結果を図31Bにまとめている。
多特異性スコアは、開発性に基づいて抗体をランク付けする際に、1つまたは多くの指標のうちの1つとして有用であり得る。例えば、抗体をクリーン(0.11未満)、低(0.33未満)、中(0.66未満)、及び高(0.66超)にランク付けすることができる。抗体のスコアが0.10未満の場合はA、スコアが0.10以上の場合はBにカテゴリー化した。検査した抗体は全て「A」であった。
リード抗体の疎水性相互作用を評価するため、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を実施した。このアッセイの方法論については、過去に説明されている(Estep P,et al.(2015)An alternative assay to hydrophobic interaction chromatography for high-throughput characterization of monoclonal antibodies. MAbs7(3):553-561を参照)。簡潔に説明すると、解析の前に、5μg IgG試料(1mg/mL)に移動相A溶液(1.8M硫酸アンモニウム及び0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.5)を、最終硫酸アンモニウム濃度が約1Mに達するように添加した。Sepax Proteomix HIC butyl-NP5カラムを移動相A及び移動相B溶液(0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.5)の直線勾配(1mL/分の流量、20分)で使用し、280nMでUV吸光度をモニターしてた。結果を図31Bにまとめている。
最後に、DSFを用いてTmを測定した。Bio-RadのCFX96 Real-Time Systemを用いて、先に説明されたプロトコル(32)に基づきTmを定量した。簡潔に説明すると、20μLの1mg/mL試料を10μLの20×SYPRO orangeと混合した。プレートを40℃~95℃にかけて0.5℃/2分の速度でスキャンした。FabのTmを、BioRad解析ソフトウェアから生データの一次導関数を用いて割り当てた。結果を図31Bにまとめている。図31Bは、さらにpI(等電点)値を示している。
総合すると、ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、ADI-56479は、好都合な開発性プロファイルを有する。
実施例19:エピトープマッピング
実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479について、SARS-CoV-2-Sの異なるサブユニット及びドメインコンストラクトを用いて、ForteBioベースの競合アッセイを用いてエピトープマッピングを実施した。
実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479について、SARS-CoV-2-Sの異なるサブユニット及びドメインコンストラクトを用いて、ForteBioベースの競合アッセイを用いてエピトープマッピングを実施した。
結合試験に使用したドメイン/サブユニットは、S1サブユニット、S2サブユニット、RBD、及びNTDであり、RBD及びNTDへの結合については、一価の結合及び二価(「貪欲型(AVID)」)の結合の両方を測定した。
競合試験については、各抗体における組換えヒトACE2(「hACE2」)及び市販抗体CR3022(受容体結合部位以外の保存エピトープを標的とする)との競合を試験した(M.Yuan et al.,A highly conserved cryptic epitope in receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV,Science,(2020))。
結果を図31A及び図32Aにまとめている。ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、及びADI-56443はRBD内のエピトープを認識してhACE2と競合し、一方ADI-56479はNTD内のエピトープを認識した。ADI-56443及びADI-56479の結合データも図32B~32Gに示されており、ADI-56443の競合結果は図32Hに示されている。
実施例20:交差競合
ForteBio Octet HTX instrument(Molecular Devices)を用いて、組換えSARS-CoV-2 RBDへの結合に対する抗体の交差競合を評価した。全ての結合ステップを25℃及び1000rpmの軌道振とう速度で実施した。全ての試薬はPBSFバッファー(0.1% w/v BSAを含むPBS)で製剤化した。IgG(100nM)を抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(Molecular Devices)に1.0nM~1.4nMのセンサー応答となるように捕捉し、バイオセンサー上に残っている占有されていない結合部位を不活性IgG(0.5mg/mL)でブロックし、次にPBSF中で少なくとも30分間平衡化させた。センサー表面のタンパク質と二次分子との間との任意の交差相互作用を評価するため、装填及びブロックしたセンサーを競合IgG(300nM)に曝露した(90秒)後にビニング解析を行った。PBSF中での短いベースラインステップ(60秒)の後、IgGを装填したバイオセンサーチップをSARS-CoV-2 RBD-SD1抗原(100nM)に曝露し(180秒)、次に競合IgG(300nM)に曝露した(180秒)。ForteBio Data Analysis Software version 11.0を用いてデータをy軸に対し正規化し、インターステップ補正を行った。二次分子が追加的に結合すれば、エピトープが占有されていない(非競合物質である)ことを示し、結合しなければエピトープがブロックされている(競合物質である)ことを示す。結合応答値が0.1未満の抗体を非結合物質とみなした。
ForteBio Octet HTX instrument(Molecular Devices)を用いて、組換えSARS-CoV-2 RBDへの結合に対する抗体の交差競合を評価した。全ての結合ステップを25℃及び1000rpmの軌道振とう速度で実施した。全ての試薬はPBSFバッファー(0.1% w/v BSAを含むPBS)で製剤化した。IgG(100nM)を抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(Molecular Devices)に1.0nM~1.4nMのセンサー応答となるように捕捉し、バイオセンサー上に残っている占有されていない結合部位を不活性IgG(0.5mg/mL)でブロックし、次にPBSF中で少なくとも30分間平衡化させた。センサー表面のタンパク質と二次分子との間との任意の交差相互作用を評価するため、装填及びブロックしたセンサーを競合IgG(300nM)に曝露した(90秒)後にビニング解析を行った。PBSF中での短いベースラインステップ(60秒)の後、IgGを装填したバイオセンサーチップをSARS-CoV-2 RBD-SD1抗原(100nM)に曝露し(180秒)、次に競合IgG(300nM)に曝露した(180秒)。ForteBio Data Analysis Software version 11.0を用いてデータをy軸に対し正規化し、インターステップ補正を行った。二次分子が追加的に結合すれば、エピトープが占有されていない(非競合物質である)ことを示し、結合しなければエピトープがブロックされている(競合物質である)ことを示す。結合応答値が0.1未満の抗体を非結合物質とみなした。
注目すべきことに、ADI-56443は、ADI-55689、ADI-55688、及びADI-56046と競合せず(図32I及び32J)、同様にADI-57983、ADI-57978、ADI-56868と競合しないことが予想される。
実施例21:プライマー変異固定
上記の実施例12及び15で説明したように、実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479は、縮重プライマーの使用に起因する「プライマー変異」を少なくとも1つ含んでいた。ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479の可変領域配列内の「プライマー変異(複数可)」を生殖系列コードアミノ酸(複数可)に戻して固定し、得られた抗体をそれぞれADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130と名付けた。アミノ酸の変化については図34でも説明している。ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130のVH及びVL配列を図36A及び36Bに示し、生殖系列コード配列または生殖系列配列に比べて異なるアミノ酸及びヌクレオチドの数を図35にまとめている。
上記の実施例12及び15で説明したように、実施例12で得られたADI-57983、ADI-57978、及びADI-56868、ならびに実施例15で得られたADI-56443及びADI-56479は、縮重プライマーの使用に起因する「プライマー変異」を少なくとも1つ含んでいた。ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479の可変領域配列内の「プライマー変異(複数可)」を生殖系列コードアミノ酸(複数可)に戻して固定し、得られた抗体をそれぞれADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130と名付けた。アミノ酸の変化については図34でも説明している。ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130のVH及びVL配列を図36A及び36Bに示し、生殖系列コード配列または生殖系列配列に比べて異なるアミノ酸及びヌクレオチドの数を図35にまとめている。
さらに、ADI-58130のバリアント(ADI-58130との違いは可変領域配列内の1アミノ酸のみ)が得られ、これをADI-58130-LCN30cQと名付けた。このバリアントは、軽鎖CDR1内で「N」の代わりに「Q」を有する。ADI-58130-LCN30cQの可変領域配列は図36A及び図36Bにも示している。
これら6種の抗体(ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130、ならびにADI-58130-LCN30cQ)のいずれかの可変領域配列、または本明細書に記載の他の抗体を、野生型またはバリアントFc領域とともに使用することができる。野生型Fcを含むFcバリアントの例を表1に示す。ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、またはADI-58130の可変領域配列及び表1に示すFc配列のうちの1つを用いた例示的抗体の重鎖及び軽鎖配列を表2に示し、それぞれの抗体に別々のADI IDを割り当てている(配列番号については図36A及び36Bを参照)。
実施例22:親和性成熟後抗体の親和性
親和性成熟前のADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126における、SARS-CoV-2 RBD-SD1(SD1はサブドメイン1)及びそれぞれの親抗体に対する親和性を、後述のSPRを用いて測定した。図37Aに示すように、親和性成熟後抗体は、それぞれの親抗体に比べて25~630倍の結合の改善を示した。
親和性成熟前のADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126における、SARS-CoV-2 RBD-SD1(SD1はサブドメイン1)及びそれぞれの親抗体に対する親和性を、後述のSPRを用いて測定した。図37Aに示すように、親和性成熟後抗体は、それぞれの親抗体に比べて25~630倍の結合の改善を示した。
BLIによって測定したADI-58124及びその親抗体(親和性成熟前及び後)の親和性(SARS-CoV-2 Sタンパク質に対するFabとして表される)を図37Bに示す。
また、IgGまたはFabとして発現するADI-58125における、SARS-CoV-2 Sタンパク質、SARS-CoV-2 Sタンパク質RBD、SARS-CoV Sタンパク質、SARS-CoV Sタンパク質RBD、及びWIV-1 Sタンパク質RBDに対する親和性も、後述のSPRによって測定した。結合動態の結果を図37Cにまとめている。
以下に、使用した方法について簡単に説明する。
IgG及びFabフラグメントの発現及び精製:
モノクローナル抗体を、Wec A.et al.,Science.2020 Jun 15;eabc7424で説明されている通りに、S.cerevisiae培養物中で完全長IgGとして産生した。簡潔に説明すると、30℃、650rpm、及び80%相対湿度においてInfors Multitron振とうインキュベーターに入れた24ウェルプレートで酵母培養物をインキュベートした。6日後、IgGを含む上清を遠心分離によって採取し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。結合したIgGを200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)で1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。
構造試験用のFabフラグメントも、Wec A.et al.,Science.2020 Jun 15;eabc7424で説明されている通りに生成した。簡潔に説明すると、IgGをパパインで30℃で2時間消化し、続いてヨードアセトアミドを加えることにより消化を終了した。Fcフラグメント及び任意の未消化IgG画分を除去するため、混合物をプロテインAアガロースに通した。次に、プロテインA樹脂のフロースルーをCaptureSelect(商標)IgG-CH1アフィニティー樹脂(ThermoFisher Scientific)に通し、捕捉したFabを200mM酢酸/50mM NaCl(pH3.5)から1/8容量の2M Hepes(pH8.0)に溶出し、PBS(pH7.0)にバッファー交換した。
表面プラズモン共鳴(SPR)Fab動態結合測定:
SEC精製SARS-CoV-2 RBD-SD1をBiacore X100(GE Life Sciences)のNiNTAセンサーチップに約500RUの応答レベルとなるように固定した。次に、Fabを漸増濃度で、18.75~300nM(ADI-55688)、1.56~25nM(ADI-56046)、6.25~100nM(ADI-55689)、または1.25~20nM(ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126)の範囲となるよう注入した。センサーチップは0.35M EDTA及び0.1M NaOHを用いてサイクル間で二重に再生した。得られたデータからダブルリファレンスを差し引き、Biacore Evaluation Softwareを用いて1:1結合モデルにフィッティングさせた。
次のいくつかの実施例では、ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、ADI-58130、及び/またはADI-58130-LCN30cQ、及び/または非野生型Fc領域を含むそれらのバリアントを、SARS-CoV-2に特異的な臨床抗体と比較した。表3は、現在臨床試験下にある抗SARS-CoV-2抗体のVH、VL、HC、及びLCの配列をそれぞれ示したものである。
実施例23:親和性成熟後抗体の抗体開発性
in vitro操作は、オフターゲット結合及びin vivoでのクリアランス加速の潜在的なリスクを伴う多特異性につながる可能性がある(S. A. Sievers,et al.,Curr Opin HIV AIDS 10,151-159(2015))ことから、ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-581230、ならびにこれらのFcバリアントの多特異性について、ヒトにおける血清半減期を予測することが示されている過去に説明されているアッセイ(L.Shehata et al.,Cell Rep 28,3300-3308 e3304(2019))を用いて評価した。このアッセイでは3つの抗体全てに多反応性が見られず、薬物動態学的挙動が不良となるリスクが低いことが示された(図38A)。また、3つの抗体は、臨床承認済み抗体で観察される範囲内の低い疎水性、低い自己相互作用傾向、及び熱安定性を示した(図38A~38D)。このことから、in vitro操作のプロセスが、下流の挙動(例えば、製造の容さ、高濃度への製剤化能力、及び長期安定性)にしばしば関連する生物物理的特性に負の影響を及ぼさなかったことが示唆される。
in vitro操作は、オフターゲット結合及びin vivoでのクリアランス加速の潜在的なリスクを伴う多特異性につながる可能性がある(S. A. Sievers,et al.,Curr Opin HIV AIDS 10,151-159(2015))ことから、ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-581230、ならびにこれらのFcバリアントの多特異性について、ヒトにおける血清半減期を予測することが示されている過去に説明されているアッセイ(L.Shehata et al.,Cell Rep 28,3300-3308 e3304(2019))を用いて評価した。このアッセイでは3つの抗体全てに多反応性が見られず、薬物動態学的挙動が不良となるリスクが低いことが示された(図38A)。また、3つの抗体は、臨床承認済み抗体で観察される範囲内の低い疎水性、低い自己相互作用傾向、及び熱安定性を示した(図38A~38D)。このことから、in vitro操作のプロセスが、下流の挙動(例えば、製造の容さ、高濃度への製剤化能力、及び長期安定性)にしばしば関連する生物物理的特性に負の影響を及ぼさなかったことが示唆される。
以下に、使用した方法について簡単に説明する。
多反応性アッセイ:
抗体の多特異性試薬結合を過去に説明されているように実施した(8)。簡潔に説明すると、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から抽出した可溶性膜タンパク質(SMP)及び可溶性細胞質タンパク質(SCP)画分を、NHS-LC-ビオチン(Thermo Fisher Scientific)試薬を用いてビオチン化した。酵母提示IgGを、ビオチン化SMP及びSCPの1:10希釈ストックとともに氷上で20分間インキュベートし、続いてPBSFで2回洗浄し、ExtrAvidin-R-PE(Sigma-Aldrich)、抗ヒトLC-FITC(Southern Biotech)、及びヨウ化プロピジウム(Invitrogen)を含む50μlの二次標識混合物により、氷上で15分間染色した。続いて、PBSFにより二次試薬から細胞を洗い出し、BD FACS Canto II(BD Biosciences)でフローサイトメトリー解析を行うためにPBSFに再懸濁した。
アフィニティー捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS):
抗体が自己会合する傾向を測定するため、過去に説明されているプロトコルに基づいてAC-SINSを実施した(Liu Y et al.,MAbs. Mar-Apr 2014;6(2):483-92)。簡潔に説明すると、ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG Fc抗体(捕捉;Jackson ImmunoResearch Laboratories)及びポリクローナルヤギ非特異的抗体(非捕捉;Jackson ImmunoResearch Laboratories)を20mM酢酸ナトリウム(pH4.3)にバッファー交換し、0.4mg/mlに濃縮した。4:1の体積比の捕捉:非捕捉を調製し、1:9の体積比で20nmの金ナノ粒子(AuNP;Ted Pella Inc.)とともに室温で1時間さらにインキュベートした。次にチオール化PEG(Sigma-Aldrich)を使用してAuNPの空の部位をブロックし、0.22μm PVDF膜(Millipore)でろ過した。続いてコーティング粒子を試験抗体溶液に加え、室温で2時間インキュベートした後、プレートリーダーで510~570nMの吸光度を測定した。データ点をExcelの2次多項式でフィッティングさせて最大吸光度時の波長を得た。値は、試料及びバックグラウンドのプラズモン波長の差(Δλmax)として報告する。
Fabの融解温度:
Fabフラグメントの見かけ上の融解温度(TmApp)を、過去に説明されている通りにして得た(He F.et al.,J Pharm Sci.2011 Dec;100(12):5126-41)。簡潔に説明すると、20μlの試験抗体溶液(1mg/ml)を10μlの20×SYPRO orangeと混合した。CFX96 Real-Time System(BioRad)を用いて、毎分0.25℃の速度で40℃から95℃にかけてプレートをスキャンした。BioRad解析ソフトウェアにより、生データの一次導関数からTmAppを計算した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC):
抗体の疎水性について、過去に説明されているようにしてHICを用いて評価した(Estep P.et al.,MAbs.2015;7(3):553-61)。試験抗体試料をA相溶液(1.8M硫酸アンモニウム及び0.1M pH6.5リン酸ナトリウム)で希釈し、最終濃度を1.0M硫酸アンモニウムとした。Sepax Proteomix HIC butyl-NP5カラムを用いて、A相溶液からB相溶液(0.1M pH6.5リン酸ナトリウム)への直線勾配を1.0ml/分の流量で20分間実行した。ピーク保持時間を、280nMのUV吸光度のモニターから得た。
実施例24:親和性成熟後抗体の中和可能性
SARS-CoV-2 S結合親和性の改善が中和効力の増強につながるかどうかを判定するため、各系統(ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126を含む)から9~14種の親和性成熟後代を選択し、マウス白血病ウイルス(MLV)偽ウイルスアッセイにおいてSARS-CoV-2中和活性を評価した(T.Giroglou,et al.,J Virol 78,9007-9015(2004))。また、複数の臨床中和抗体(nAb)の中和活性もベンチマークとして測定した(S309、REGN10933、REGN10987、及びCB6/JS016)(D.Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020).;R.Shi et al.,Nature 584,120-124(2020).;J.Hansen et al.,Science 369,1010-1014(2020))。全ての親和性成熟抗体が、それらの親クローンに比べて改善された中和活性を示し、各系統からの最も強力な中和物質(ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126)は、臨床SARS-CoV-2 nAb対照で観察されたものと同等またはそれ以下の中和IC50を示した(図39A)。
SARS-CoV-2 S結合親和性の改善が中和効力の増強につながるかどうかを判定するため、各系統(ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126を含む)から9~14種の親和性成熟後代を選択し、マウス白血病ウイルス(MLV)偽ウイルスアッセイにおいてSARS-CoV-2中和活性を評価した(T.Giroglou,et al.,J Virol 78,9007-9015(2004))。また、複数の臨床中和抗体(nAb)の中和活性もベンチマークとして測定した(S309、REGN10933、REGN10987、及びCB6/JS016)(D.Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020).;R.Shi et al.,Nature 584,120-124(2020).;J.Hansen et al.,Science 369,1010-1014(2020))。全ての親和性成熟抗体が、それらの親クローンに比べて改善された中和活性を示し、各系統からの最も強力な中和物質(ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126)は、臨床SARS-CoV-2 nAb対照で観察されたものと同等またはそれ以下の中和IC50を示した(図39A)。
実施例25:親和性成熟後抗体の中和幅
SARS-CoV-2親和性操作のプロセスが中和の幅に影響を及ぼすかどうかを調べるため、ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126、ならびにそれぞれの親抗体について、代表的な真正クレードIサルベコウイルスのパネル(SARS-CoV、SHC014、SARS-CoV-2、及びWIV-1)に対する中和活性を評価した。MLV-SARS-CoV-2アッセイの結果と整合して、ADI-58124は、真正SARS-CoV-2に対する非常に強力な中和活性を臨床SARS-CoV-2 nAbで観察されるものと同等またはそれ以下のIC50で示した(図39B~39D)。さらに、臨床nAbとは対照的に、ADI-58124は、SARS-CoV及び2つのSARS関連コウモリウイルスに対しても、4~8ng/mlのIC50で顕著な中和効力を示した(図39B~39D)。注目すべきことに、ADI-58126及び臨床用nAbのS309も4種全てのサルベコウイルスを交差中和したが、ADI-58124よりも顕著に低い効力であった。最後に、ADI-58120については、SARS-CoV-2、SARS-CoV、及びWIV1を強力に中和したが、SHC014に対しては活性が欠如していた。
SARS-CoV-2親和性操作のプロセスが中和の幅に影響を及ぼすかどうかを調べるため、ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126、ならびにそれぞれの親抗体について、代表的な真正クレードIサルベコウイルスのパネル(SARS-CoV、SHC014、SARS-CoV-2、及びWIV-1)に対する中和活性を評価した。MLV-SARS-CoV-2アッセイの結果と整合して、ADI-58124は、真正SARS-CoV-2に対する非常に強力な中和活性を臨床SARS-CoV-2 nAbで観察されるものと同等またはそれ以下のIC50で示した(図39B~39D)。さらに、臨床nAbとは対照的に、ADI-58124は、SARS-CoV及び2つのSARS関連コウモリウイルスに対しても、4~8ng/mlのIC50で顕著な中和効力を示した(図39B~39D)。注目すべきことに、ADI-58126及び臨床用nAbのS309も4種全てのサルベコウイルスを交差中和したが、ADI-58124よりも顕著に低い効力であった。最後に、ADI-58120については、SARS-CoV-2、SARS-CoV、及びWIV1を強力に中和したが、SHC014に対しては活性が欠如していた。
その強力な交差中和及び有利な生物物理的特性に基づき、ADI-58124及びADI-58125を、2つの代替的な真正SARS-CoV-2中和アッセイで中和活性をさらに評価するために選択した。そしてそれらのアッセイでは高い効力(IC50約1ng/ml)が確認された(図39B~39E、図39N、及び図39O)。興味深いことに、ADI-58124、ADI-58125、CB6/JS016、REGN10987、及びREGN10933は、このアッセイにおいて、Vero及びHeLa-ACE2標的細胞でいずれも100%中和に達したのに対し、S309はVero標的細胞では完全な中和を示したが、HeLa-ACE2標的細胞ではおよそ40%中和でプラトー状態となった(図39E及び図39O)。また、S309は、HeLa-ACE2標的細胞でMLV-SARS-CoV-2も中和できなかった(図39A)。この理由は明らかでないが、S309エピトープ内のグリカンの不均一性(D.Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020))に加えて、2つのタイプの標的細胞間で受容体発現またはプロテアーゼ切断効率が異なることに関連する可能性がある(T.F.Rogers et al.,Science 21,956-963(2020))。SARS-CoV-2 D614Gが優勢なパンデミック形態として台頭していることから(B.Korber et al.,Cell 182,812-827 e819(2020))、ADI-58124は、このバリアントに対する中和活性についてもMLV偽ウイルスアッセイで評価した。予想されたように、RBD以外のD614G置換の位置に基づき、ADI-58124は野生型(WT)SARS-CoV-2と同等の効力でD614Gバリアントを中和した(図39F)。
ADI-58120、ADI-58124、及びADI-58126、及び/または非野生型Fcを有するこれらのバリアントによる真正及び偽コロナウイルスの中和を図39G~Mに示している。
以下に、使用した方法について簡単に説明する。
HeLa-hACE2安定性細胞株:
真正SARS-CoV-2中和アッセイ用の安定性ヒトACE2(hACE2)発現HeLa細胞を、過去に説明されている通りに生成した(Wec A.et al.,Science.2020 Jun 15;eabc7424)。簡潔に説明すると、hACE2(NM_001371415)をpBOB内でクローニングし、Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を製造者のプロトコルに従って用いて、レンチウイルスベクターpMDL(Addgene;#12251)、pREV(Addgene;#12253)、及びpVSV-G(Addgene;#8454)をHEK293T細胞に同時形質移入した。形質移入から16時間後に培養基を交換し、形質移入から32時間後にhACE2レンチウイルスを含む上清を採取した。採取した上清に10μg/mlのポリブレン(Sigma)を加えたものを用いて、播種前のHeLa細胞に形質導入した。形質導入から12時間後、SARS-CoV-2 Sベースプローブを用いたフローサイトメトリーによって細胞表面での発現を確認した。
真正SARS-CoVウイルスの生成及び中和アッセイ:
真正SARS-CoVウイルスを生成するために、Veroアフリカミドリザル腎細胞(Vero E6、ATCC-CRL1586)をダルベッコ変法イーグル培地(DMEM高グルコース;Gibco、カタログ番号11995065)、2%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS、Atlanta Biologicals)、0.05%トリプシン-EDTA溶液(Gibco)、1% PS(Gibco)、及び1% GlutaMAX(Gibco)中で成長させた。Vero E6細胞にSARS-CoV/Urbaniを感染させ(MOI=0.01)、以下の条件下でインキュベートした:37℃、5% CO2、80%相対湿度(RH)。感染から50時間後に細胞を-80℃で1時間凍結し、次に室温で解凍した。上清を収集し、2500xgで10分間の遠心分離によって清澄化してから、-80℃で保存するために分注した。
ウイルス中和は、過去に説明されているように評価した(Wec A.et al.,Science.2020 Jun 15;eabc7424.doi:10.1126/science.abc7424)。簡潔に説明すると、SARS-CoV/Urbani(MOI=0.2)を段階希釈した抗体に加え、室温で1時間インキュベートした。96ウェルプレートに入ったVero E6細胞の単層に抗体-ウイルス混合液を加え、37℃、5% CO2、及び80% RHで1時間インキュベートした。次に、細胞を1×PBSで1回洗浄し新鮮な細胞培養液を加えることにより、培地を交換した。感染から24時間後、1×PBSにより培地から細胞を洗い出し、次にホルマリン固定液で処理し、0.2%トリトン-Xにより室温で10分間透過処理し、最後にブロッキング溶液で処理した。固定し透過処理した細胞を、最初にSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質を認識する一次抗体(Sino Biological)で染色し、次にAlexaFluor 488結合体化ヤギ抗ウサギ抗体で二次抗体染色した。Operettaハイコンテンツイメージング装置によって感染細胞を計数し、Harmonyソフトウェア(Perkin Elmer)を用いてデータを解析した。
SARS-CoV-2 WT及びD614G Sを表示するMLV偽ウイルスの生成及び中和アッセイ:
MLV偽ウイルスを生成するため、SARS-CoV-2野生型(WT;NC_045512)及びD614Gバリアントスパイク遺伝子(IDT)のコドン最適化配列(いずれもC末端に28アミノ酸欠失あり)をコードするpCDNA3.3プラスミド(Thermo Fisher)と、IRESを置き換えるためにCMVプロモーターで修飾したルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド(Addgene;#18760)と、MLV Gag-Polプラスミド(Addgene;#14887)とを、Endo-Free Plasmid Maxi Kit(Qiagen)を用いて精製した。シングルラウンド感染コンピテント偽ウイルスを生成するため、Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を製造者の指示に従って用いて、6ウェルプレートにおいて2μgのMLV Gag-Pol、2μgのMLVルシフェラーゼ、及び0.5μgのSARS-CoV-2 WT SまたはSARS-CoV-2 D614G SのいずれかでHEK293T細胞に形質移入した。形質移入から16時間後に細胞培養基を交換した。形質移入から48時間後にSARS-CoV-2 S偽型ウイルス粒子を含む上清を採取し、分注し、-80℃で凍結した。
MLVベースSARS-CoV-2 WT及びD614G偽ウイルスの抗体中和を、過去に説明されている発光アッセイ(Sarzotti-Kelsoe M.et al.,J Immunol Methods.2014 Jul;409:131-46.)にわずかな修正を加えて用いて、これらの偽ウイルスによるHeLa-hACE2細胞の感染をモニターすることによって評価した。SARS-CoV-2 WTまたはD614G偽型MLVベクターを段階希釈した抗体と混合し、37℃で1時間インキュベートし、次に10,000個のHeLa-hACE2細胞を加えた。37℃で42~48時間感染を生じさせた。続いて、1×ルシフェラーゼ溶解バッファー(25mM Gly-Gly pH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA、1%トリトンX-100)を用いてHeLa-hACE2細胞を溶解した。Bright-Gloルシフェラーゼ基質(Promega、PR-E2620)を製造業者の指示に従って用いて、ルミノメーターでルシフェラーゼ強度を測定した。中和パーセンテージは、100*(1-[試料の光の相対単位(RUL)-バックグラウンドの平均RUL]/[ウイルスのみ対照の平均RUL-バックグラウンドの平均RUL])として計算した。
CoVリバースジェネティックスによるナノルシフェラーゼ(nLuc)ウイルスの生成:
マウス適合SARS-CoV-1(MA15)、マウス適合SARS-CoV-2(MA2)、及び野生型SARS-CoV-2ナノルシフェラーゼ(nLuc)ウイルスを、過去に説明されている通りにCoVリバースジェネティックスによって生成した(Hou Y.J.et al.,Cell.2020 Jul 23;182(2):429-446.e14.)。WIV-1-nluc及びSHC014-nlucは、ORF7及び8をnLucで置き換えることによって生成した。続いてnLucウイルスを、後述のVero E6標的細胞を用いたルシフェラーゼベース抗体中和アッセイに使用した。
真正SARS-CoV-2、WIV-1、及びSHC014のナノルシフェラーゼ中和アッセイ:
Vero E6細胞をDMEM高グルコース培地(Gibco;カタログ番号11995065)(10% fetal clone II(GE;カタログ番号SH3006603HI)+1% 非必須アミノ酸及び1% Pen/Strep(成長培地)を補充)中で、37℃、5% CO2で成長させた。アッセイの24時間前に、黒色の組織培養処理96ウェルプレート(Corning;カタログ番号3603)に、Vero E6細胞を2×104細胞/ウェルで播種した。ウイルス滴定曲線から所定量のプラーク形成単位(PFU)を成長培地中で希釈した。抗体を成長培地中で希釈して、15、7.5、3.75、または0.74μg/mlのいずれかの開始濃度の8点の3倍希釈曲線を得た。SARS1-MA15-nLuc(75Pfu/ウェル)、SARS2-nLuc(100Pfu/ウェル)、SARS2-MA2-nLuc(85Pfu/ウェル)、SHC014-nLuc(20Pfu/ウェル)、及びWIV1-nLuc(250Pfu/ウェル)ウイルスを1:1の比率でAbと混合し、37℃で1時間インキュベートした。ウイルス及びAbの混合物を各ウェルに加え、37℃、5% CO2で48時間(SARS1-MA15、SARS2-MA2、及びSARS2-nLuc)または24時間(SHC014-nLuc及びWIV1-nLuc)インキュベートした。SpectraMax M3ルミノメーター(Molecular Device)を用いて、製造業者のプロトコルに従い、Nano-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega;カタログ番号N1130)によってルシフェラーゼ活性を測定した。以下の式:[1-(試料によるRLU/モック処置によるRLU)]×100%によって阻害パーセントを計算した。GraphPad Prism 8.3.0において、シグモイド用量応答(可変勾配)曲線を用いてデータ点をフィッティングさせることにより、50パーセント阻害力価(IC50)を計算した。全ての生ウイルス実験は、陰圧でのバイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下で、Tyvekスーツを着用し個人用電動ファン付き呼吸用保護具を装着したオペレーターが実施した。
真正SARS-CoV-2ウイルスの生成及び中和アッセイ:
真正SARS-CoV-2ウイルスを、Vero E6細胞内で過去に説明されている通りに産生した(Rogers T.F.et al.,Science.2020 Aug 21;369(6506):956-963)。簡潔に説明すると、Vero E6 細胞を完全DMEM(Corning;カタログ番号15-013-CV)(10% FBS、1xPenStrep(Corning;カタログ番号C20-002-CL)、2mM(Corning;カタログ番号25-005-CL)を補充)中で、37℃、5% CO2で一晩成長させた。細胞を、0.5の感染多重度の2mlのSARS-CoV-2株USA-WA1/2020(BEI Resources;カタログ番号NR-52281)とともに34℃、5% CO2で30分間インキュベートし、次に30mlの完全DMEMを直接加えた。感染から5日後、上清を1000×gで5分間遠心分離し、0.22μMフィルターを用いてろ過し、-80℃で凍結した。
2つの細胞ベースアッセイを用いて、生きている複製真正SARS-CoV-2に対する抗体中和を評価した。Vero E6 細胞及びHeLa-hACE2安定細胞株を完全DMEM(Corning;カタログ番号15-013-CV)(10% FBS、1xPenStrep(Corning;カタログ番号C20-002-CL)、2mM L-グルタミン(Corning;カタログ番号25-005-CL)を補充)中で、37℃、5% CO2で成長させた。HeLa-hACE2またはVero E6標的細胞のいずれかを50μlの完全DMEM(Corning;カタログ番号15-013-CV)に懸濁したものを、96ウェルのハーフウェルプレートにおよそ8000細胞/ウェルで播種し、一晩成長させた。SARS-CoV-2の1000プラーク形成単位(PFU)/ウェルを滴定量の抗体に加え、30分間インキュベートした。続いて、ウイルス-抗体混合液をHeLa-hACE2細胞またはVero E6細胞のいずれかとともに、37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。培養後、感染培地を除去した。細胞を4%ホルムアルデヒドに1時間浸し、次にPBSで3サイクル洗浄した後、100μl/ウェルの透過処理バッファー(1%トリトン-Xを含む1xPBS)とともに穏やかに振とうしながらインキュベートした。次に、プレートを100μlの3% w/vウシ血清アルブミンにより室温(RT)で2時間ブロックし、続いて洗浄バッファー(0.1% Tween-20を含む1×PBS)でブロッキング溶液から洗い出した。
回復期のSARS-CoV-2コホート参加者に由来するCC6.29、CC6.33、L25-dP06E11、CC12.23、CC12.25からなる抗体混合物を用いてプレート上のSARS-CoV-2ウイルスを検出した(T.F.Rogers et al.,Science 369,956-963(2020))。プールした抗体を2μg/mlの濃度でウェルに加え(50μl/ウェル)、室温で2時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄液で3回洗浄し、0.5μg/mlペルオキシダーゼ結合体化AffiniPureヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc;カタログ番号109-035-088)を用いて室温で2時間染色し、次に洗浄バッファーで6回洗浄した。HRP基質(Roche;カタログ番号11582950001)を100:1の体積比の溶液A:Bで新たに調製し、これを各ウェルに加えた。マイクロプレート発光リーダー(BioTek;Synergy 2)を用いて化学発光を測定した。
3000~1PFUの段階希釈したウイルスの標準曲線を、以下のように4パラメーターロジスティック回帰を用いて相対発光量(RLU)に対しプロットした:y=a+(b-a)/(1+(x/x0)c)(y=RLUの変数、x=PFUの変数であり、a、b、c、及びx0は標準曲線によってフィッティングしたパラメーターである)。標準曲線によって生成したパラメーターを用いて、サンプルRLU値をPFU値に変換し(x=x0×logc[(b-y)/(y-a)])、次の式で中和パーセンテージを計算した:中和=100×[(VC-ADI-58124処置)/(VC-CC)(VC=ビヒクル処置対照の平均、CC=細胞のみ対照の平均(いずれの変数もPFU値)。中和曲線のロジスティック回帰フィッティングを用いて、50パーセント阻害力価(IC50)を決定した。
実施例26:親和性成熟後抗体のさらなる中和幅の評価
次に、酵母の表面に発現する17種の代表的なサルベコウイルスRBDのパネルに対する見かけ上の結合親和性(KD App)を測定することにより、ADI-58124、ADI-58125、及び他の臨床抗体によるサルベコウイルス認識の幅を評価した(T.N.Starr et al.,Cell 182,1295-1310(2020))。ADI-58125及びADI-58124は同じCDR配列を共有しており、半減期を延長する目的で操作されたFc領域のみが異なる。
次に、酵母の表面に発現する17種の代表的なサルベコウイルスRBDのパネルに対する見かけ上の結合親和性(KD App)を測定することにより、ADI-58124、ADI-58125、及び他の臨床抗体によるサルベコウイルス認識の幅を評価した(T.N.Starr et al.,Cell 182,1295-1310(2020))。ADI-58125及びADI-58124は同じCDR配列を共有しており、半減期を延長する目的で操作されたFc領域のみが異なる。
クレードIから13種のウイルスを選択し(最も近い既知のSARS-CoV-2近縁種(GD-Pangolin及びRaTG13)から最も異なるもの(SHC014及びRs4231)までに相当)、さらに関係が遠いクレード2及び3からACE2を宿主受容体として利用しない4種のウイルスを選択した(M.Letko,A.Marzi,V.Munster,Nat Microbiol 5,562-569(2020))(図40A)。また、組換えhACE2及び上記の臨床SARS-CoV-2 nAbも対照として含めた。過去の報告(D.Wrapp et al.,Science 367,1260-1263(2020);T.N.Starr et al.,Cell 182,1295-1310(2020))に整合して、hACE2はクレードI RBDのみを認識し、SARS-CoVよりも高い親和度でSARS-CoV-2に結合した(図40B)。加えて、臨床SARS-CoV-2 nAbのCB6/JS016、REGN10987、及びREGN10933は、公表された報告と同等のKD
AppでSARS-CoV-2 RBDに結合した(図40B)(R.Shi et al.,Nature 584,120-124(2020);J.Hansen et al.,Science 369,1010-1014(2020))。注目すべきことに、S309はこの発現プラットフォームで結合の減少を示した。これは、酵母内で高マンノース化している可能性があるN-グリカンを含むエピトープを認識したことによる可能性が考えられる(D. Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020))。
その広範な中和活性に整合して、S309、ADI-58124、及びADI-58126は、クレードIサルベコウイルスのRBDに対し著しく広範な結合反応性を示し、ADI-58124及びADI-58126は13種中12種のウイルスに、S309は13種全てに強力に結合した(図40B)。これに対し、ADI-58120は13種中9種のウイルスに結合し、CB6/JS016、REGN10987、及びREGN10933は、SARS-CoV-2に最も近い進化近縁種(複数可)のみに結合し、これらの狭い中和プロファイルに整合した(図39B及び図40B)。注目すべきことに、ADI-58124は、発明者らのアッセイにおいて検出可能なhACE2結合を示したあらゆるクレードIサルベコウイルスRBDに高い親和性(KDApp 0.24~1.12nM)で結合した。この知見は、hACE2を受容体として利用することができるサルベコウイルス間でのADI-58124エピトープ保存が高い程度であることを支持するものである。
最近のいくつかの研究からは、一般的に誘発されるSARS-CoV-2のnAbに耐性を有するRBD変異体がヒト集団内で低レベルで循環していることが示されている(B.Korber et al.,Cell 182,812-827(2020).;Y.Weisblum et al.,bioRxiv,(2020))。RBDに単一の点変異を含む自然循環性SARS-CoV-2バリアントに対するADI-58124の結合の幅を評価した。ADI-58120、ADI-58126、及び臨床SARS-CoV-2 nAbも比較対象として含めた。上記の酵母表面ディスプレイプラットフォームを用いて、GISAIDデータベースで報告された最も頻繁に観察される36種のSARS-CoV-2 RBDバリアントと、過去に説明されているSARS-CoV-2 nAb(Y.Shu,J.McCauley,Euro Surveill 22,30494(2017).;B.Korber et al.,Cell 182,812-827(2020).;Y.Weisblum et al.,bioRxiv,(2020))に対し耐性を有することが示されたいくつかの自然循環性SARS-CoV-2バリアントとを発現させた。36種のSARS-CoV-2バリアントのうちの1種以上がADI-58120、CB6/JS016、REGN10987、及びREGN10933に対し耐性(WT結合の25%未満)を示した。注目すべきことに、REGN10987及びREGN10933について同定された耐性バリアントは、過去のin vitro中和エスケープ試験で同定されたものと部分的に重複しており、これは、発明者らのRBDディスプレイプラットフォームを抗体エスケープ変異の予測に使用することの妥当性を確認するものである(A.Baum et al.,Science 369,1014-1018(2020))。これに対し、ADI-58124、ADI-58126、及びS309は、WT SARS-CoV-2の50%以上の親和性で36種全てのバリアントに結合した(図40C)。この結果は、これら3種のmAbについて観察された著しい中和の幅(図39B、図40B、及び図40D)と合わせて、エピトープ保存とウイルスエスケープに対する耐性との間の潜在的なつながりを示唆するものである。
ADI-58125に対する結合の幅を同じ方法で定量した。結果を図40E~40Fに示す。
ADI-58125は、他の臨床抗体とは異なり、内在性抗体応答の標的とされない残基に結合する。実際に、他の臨床抗体は、頻繁な変異に供される残基(例えば、部位における変異の頻度が約10-2~10-4であることが示された残基439、453、417、484、494、490、444、446、または484)の周辺で結合し、いくつかの最も頻度が高い変異(例えば、N439K(累積発生率1.49%)及びY453F(累積発生率0.365%))もこれらの領域内にある(Greaney et al.,Comprehensive mapping of mutations ot the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies,BioRxiv,2020)。例えば、他の「クラス1」抗体(例えば、C105、CC12.1、CC12.3、COVA2-4、B38、Ly-Cov16、及びREGN10933)は、Q493R、Y453F、F486V、及びK417Nの周辺の残基に結合する。他の「クラス2」抗体(例えば、C104、P2B-2F6、BD23、Ab2-4、5A6、及びLy-CoV555)は、E484K、F490L、及びS494Pの周辺の残基に結合する。他の「クラス3」抗体(例えば、C135及びREGN10987)は、N440K、K444N、V445E、N439S、及びG446Vの周辺で結合する。最後に、他の「クラス4」抗体(例えば、CR3022及びEY6A)は、異なる領域/残基に結合する。しかし、変異の頻度が高いこれらの領域は全て、ADI-58125の結合エピトープ以外で生じた。その他の変異としては、S477N(累積発生率5.69%)、N501Y(累積発生率1.39%)、E484K、K417N、S494P、L452R、G446V、F490S、L452M、L455F、E484Q、F486L、及びG485Rが挙げられる(Greaney et al.,BioRxiv,2020)。
さらに、ADI-58125は、これまでに報告された全ての一般的な循環性SARS-CoV-2バリアント(例えば、英国系統、南アフリカ系統、新たに出現したB.1.1.7系統、及び/またはミンク株)に結合することができた(図40G)。B.1.1.7バリアントは多数の変異を保有しており、慢性感染患者内で発生した可能性が示唆されている(Kemp et al.,Recurrent emergence and transmission of a SARS-COV-2 spike deletion H69/H70,BioRxiv,2020;Gupta et al.,Biorxiv,2020;これらの各々の内容全体が参照により明示的に本明細書に援用される)。このバリアントのいくつかの変異は、H69位及びH70位の欠失を含むSタンパク質内にあり、Sタンパク質は他のSARS-CoV-2バリアント内で自然発生的に進化しており、また感染性を高めるものと仮定されている(KempSA et al.,BioRxiv 2021)。このSタンパク質内における不釣り合いな数の変異は、免疫エスケープを強く示唆するものである。NTD欠失は、しばしばRBD変異N501Y、Y453F、N439K、ならびにE484K及びK417Nと同時発生する。
ADI-58125は、検出可能なヒトACE2結合を示す全てのRBDを含む13種のクレード1サルベコウイルスのうちの12種に高い親和性で結合することができた。B.1.351及びP.1バリアント(回復期及びワクチン接種者の血清による中和に対する耐性増加に関連している)に存在する変異を保有するRBDは、低減した親和性でいくつかの臨床抗体に結合した(図40H)。これに対し、ADI-58125は、全ての一般的なSARS-CoV-2バリアントに加えて、B.1.1.7、B.1.351、及びP.1バリアントに対しても高い親和性結合を保持した(図40I)。同様に、ADI-58122及びADI-58127もP.1株に対し高い親和性を保持した。実際に、バリアントは多くのモノクローナル抗体による中和を回避することができるが、これらの3つの抗体(ADI-58122、ADI-58125、及びADI-58127)はバリアントに対する中和活性低減をほとんど示さず、またP.1バリアントも中和し、全て100%中和でプラトーに達した。一方、REGN10987及びS309は100%中和に達することができなかった(図40I及び図50C)。真正B.1.1.7及びB.1.351バリアントは、ADI-58125の中和に対し完全な感受性を保った(データは示さず)。
ADI-58125は、クレード1サルベコウイルス及び他の抗体療法に耐性を有するSARS-CoV-2バリアントからのRBDに対し例外的な幅の結合を示す。B.1.1.7、B.1.351、及びP.1バリアントに対する結合親和性の喪失は観察されず、B.1.1.7及びB.1.351バリアントに対するADI-58125の中和効力が維持された。ADI-58125のユニークで幅広い中和活性は、他の臨床段階mAbに耐性を有するSARS-CoV-2の新興バリアント及びパンデミックの可能性を備えた発生前のSARS様ウイルスに対する有効な予防薬剤及び治療薬剤である可能性を強調するものである。
ELISAによるACE2のS阻害
スパイクタンパク質がACE2に結合するのをブロックするのに要するADI-58125の阻害濃度中央値(IC50)を競合ELISAアッセイで測定した。ADI-58125は、0.022mM(3.3ng/ml)のナノモル以下のIC50でACE2結合を強力にブロックした(図40J)。既知のACE2競合物質であるREGN10933はS結合を阻害し、一方既知の非競合物質であるS309は最小限のS結合阻害を示したことから、このアッセイの使用の妥当性が確認された。ADI-58125の強力なブロック作用は、その高い結合親和性と一致しており、SARS-CoV-2に対する強力な中和の主要な機構としてACE2阻害を支持するものである。
以下に、使用した方法について簡単に説明する。
サルベコウイルスの系統樹及びアラインメント:
代表的なサルベコウイルスRBD-SD1配列を、Letkoら及びStarrらによって精選された配列セットに基づいて選択した(Letko M.et al.,Nat Microbiol 5,562-569(2020);T.N. Starr et al.,Cell 182,1295-1310(2020))。ACE2を利用する他の4種のサルベドウイルス(Frankfurt1、CS24、Civet 007-2004、及びA021)は、これまでの精選セットで研究されていなかったが、各々がRBD-ACE2界面にユニークな配列を有し、クレードI系統樹にわたるさらなる配列距離に及ぶため、ここではこれらを加えた。ACE2の代替となる受容体を使用することが知られている限らせたセットのクレード2及びクレード3のメンバーを対照として含めた(Letko M.et al.,Nat Microbiol 5,562-569(2020))。mafftアラインメントしたRBD-SD1配列の最尤法を用いてサルベコウイルスの系統樹を作成した(図40A)。サルベコウイルスRBD配列の多重配列アラインメントをJalviewで可視化した(図41J)。各サルベコウイルスのアミノ酸配列を配列同一性パーセンテージによって色分けし、残基ごとの全体的保存度を、アミノ酸の物理化学的特性により重み付けした数値インデックスとして計算した(Livingstone C.D.et al.,Comput Appl Biosci.1993 Dec;9(6):745-56)。
循環性SARS-CoV-2バリアントのGISAID解析:
ゲノム配列をGISAIDデータベースからダウンロードし、Wuhan-Hu-1スパイク配列のアミノ酸残基319~591を用いて全てのRBD-SD1配列を抽出するために、Needleman-Wunschアルゴリズムの内部実装を介して参照Wuhan-Hu-1配列(ENA QHD43416.1)に対しペアワイズアラインメントした。不完全はRBD-SD1ヌクレオチド配列、曖昧な(「n」)ベースコールを含むもの、及び「X」、「*」、または「-」を含む翻訳配列を解析から除外した。2020年7月14日時点で解析した63551配列のうち少なくとも6回観測されたRBD-SD1配列バリアント、ならびにGISAIDデータベースでも観測されたいくつかの文献対照及び抗体エスケープ変異体を、抗体結合を評価するためのパネル36バリアントとして収集した。
GISAIDデータベースの配列数はCOVID-19のパンデミック開始以来一貫して増加しているため、2020年10月19日に再びGISAIDデータベースから配列を取り出し、各バリアントの「罹患パーセント」を計算した。バリアントの出現数をデータベース内の完全配列の総数で割ることにより「罹患パーセンテージ」を計算した。
SARS-CoV-2バリアント及び相同サルベコウイルスRBD-SD1のクローニング:
SARS-CoV-2のスパイクRBD-SD1(Uniprot:P0DTC2により定義される残基319~591)及び追加の関連サルベコウイルス(HKU3、ENA AAY88866.1;Rf1-2004、ENA ABD75323.1;BM48-31、ENA ADK66841;Pangolin_GX-P2V GISAID MT072864.1;RaTG13、ENA QHR63300.2;SARS-CoV-2、ENA QHD43416.1;GD-Pangolin、ENA MT121216.1;Rs4231、ENA ATO98157.1;WIV1、ENA AGZ48831.1;Civet 007-2004、ENA AAU04646.1;A021、ENA AAV97986.1;Frankfurt 1、ENA BAE93401.1;SARS-CoV-1、ENA AAP13441;CS24、ENA ABF68959;LYRa11、ENA AHX37558.1;Rs4081、ENA KY417143.1)をgBlock(IDT)として取り寄せ、N末端でフレキシブルGly4Serリンカー(配列番号23194)及びヘマグルチニン(HA)タグをコードする酵母ディスプレイ発現ベクター内でクローニングした。2つの連続するGly4Serリンカー(配列番号23195)は、C末端でRBD-SD1をAga2pに接続する。GISAIDデータベースで観察された36種の循環性SARS-CoV-2バリアント配列(T323I、P330S、V341I、A344S、N354D、S359N、V367F、N370S、F377L、V382L、P384L、P384S、R403K、R408I、Q414R、N439K、N440K、K444N、G446V、Y453F、A475V、G476S、S477N、T478I、P479S、V483A、E484D、E484K、F490L、F490S、Q493R、S494P、N501Y、A520S、A522V、A522S)を上記の同じベクターに挿入した。A352Sバリアントは、gBlock内に存在するエラーのため除外した。Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research)を製造業者のプロトコルに従って用いて、プラスミドをS.cerevisiae(EBY100)内で形質転換し、トリプトファン補助栄養マーカーによって選択した。
RBD-SD1の酵母表面ディスプレイ:
RBD発現を誘導するため、新鮮な酵母培養物を選択的SDCAA培地に0.2のOD600密度で接種し、培養物が0.8~1.0のOD600に達するまで30℃及び180rpmで成長させた。次に、細胞を2400xgで3分間遠心分離し、等体積のSGCAA(6.7g/L酵母窒素ベース、4.0g/Lドロップアウトアミノ酸ミックス、0.46g/L NaH2PO4、0.88g/L Na2HPO4、7.7g/L NaCl、2%ガラクトース、2%ラフィノース)に再懸濁し、20℃、200rpmで16~20時間インキュベートした。
酵母ディスプレイRBDバリアントに対する抗体結合:
結合の幅を評価するため、IgG及びhACE2(C末端IgG1 Fc結合体として二価で発現;Sino Biological;カタログ番号10108-H02H)を17種のサルベコウイルスRBDのパネルに対し試験した。最初に、100nMの単一濃度でのIgGまたはhACE2の結合を定量した。簡潔に説明すると、1ウェルあたり0.2ODの誘導細胞を96ウェルプレートに分注し、PBSFによりSGCAA培地から洗い出した。次に、細胞を100μlの100nM IgGまたはhACE2に再懸濁し、室温で30分間インキュベートした。続いて、細胞をPBSFで2回洗浄し、アロフィコシアニン(APC)-結合体化モノクローナルマウス抗ヘマグルチニンタグ(HA)50μlで標識した。11抗体(BioLegend;カタログ番号901524)、フィコエリトリン(PE)-結合体化ヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体(Southern Biotech、カタログ番号2040-09)、及びプロピジウムヨウ化物(Invitrogen;カタログ番号P1304MP)で20分、氷上で処理した。各サルベコウイルスRBDについて、二次試薬対照を含めた。細胞をPBSFで2回洗浄してから、BD FACS Canto II(BD Biosciences)においてフローサイトメトリーにより解析した。
サルベコウイルス間のRBD発現の違いを考慮するため、HAタグシグナルを基準に結合シグナルを正規化した(MFI抗ヒトIgG PE/MFI抗HA APC)。正規化した比が1.0を下回る結合は、試験濃度において非結合(NB)とみなした。比が1.0を上回るものを滴定して、見かけ上の結合親和性(KD
App)を計算した。
滴定は、上記のように100nM~0.048nMのIgGまたはhACE2の2倍希釈系列として実施してKD
App値を得た。平均抗ヒトIgG PE MFIシグナルを0~100に正規化し(MFI[ADI-58124またはhACE2濃度]-MFI最小値)*100/(1-MFI最小値)、以下の式を用いてGraphPad Prismで非線形回帰曲線としてフィッティングした:Y=Yx=min+X*(Yx=max-Yx=min)/(KD
App+X)(XはIgGまたはhACE2濃度、Yは正規化された結合シグナルである)。フック効果(最大MFI濃度より高い濃度で収集されたPE MFIとして定義される)を示す点を解析から除外した。本発明抗体及び臨床抗体及びhACE2のKD
App(nM)をヒートマップとして表示している(図40B)。
SARS-CoV-2バリアントに対する結合親和性の潜在的な違いのダイナミックレンジを最大化するため、各抗体のそれぞれのSARS-CoV-2 KD
Appで結合実験を行った。結合シグナルを以下の式:MFI抗hu IgG PE/MFI抗HA APC-MFIバックグラウンド抗hu IgG PE/MFIバックグラウンド抗HA APCを用いて正規化し、参照WT SARS-CoV-2株RBD-SD1の正規化シグナルに対するパーセントとして計算する。
実施例27:親和性成熟後抗体による抗原認識のさらなる解析。
最初に、ADI-58124が認識する抗原表面へのさらなる洞察を得るため、変異誘発した酵母表面ディスプレイRBDライブラリーを生成し、数ラウンドの選択を実施して、ADI-58124に対する結合の消失を示すRBDバリアントを特定した(図41A~41C)。組換えhACE2及びADI-58124結合部位とは異なる非重複エピトープを標的とする2つのRBD指向mAb(S309及びCR3022)の混合物を用いて最終ラウンドのポジティブ選択を実施して、RBDの立体構造を大きく破壊する変異を除外した(D.Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020).;M.Yuan et al.,Science 368,630-633(2020))。単一アミノ酸置換をコードする選択されたRBD変異体を、ADI-58124、組換えhACE2、CR3022、及びS309との結合について個別に試験し、部位特異的ノックダウン変異を確認した(図41B及び図41D)。わずか4つのRBD位置での置換(D405E、G502E/R/V、G504A/D/R/S/V、及びY505C/N/S)がADI-58124結合を特異的に妨げた(図41E~41F)。これらの4つの残基は、クレードIサルベコウイルス亜属間で著しく保存され、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、SHC014、及びWIV1ウイルス間で不変である(図41G)。これは、ADI-58124が示す結合の幅及び中和についての分子的な説明をもたらすものである。これらの残基がクレードIサルベドウイルス間で保存されていることに整合して、ADI-58124の結合に影響を及ぼす置換は、2020年10月19日時点において、GISAIDデータベースに寄託されているSARS-CoV-2の完全長配列には存在しなかった。注目すべきことに、ADI-58124の結合を妨げる4つの同定された変異のうちの3つが、hACE2結合部位内にある(Lan J.et al.,Nature.2020 May;581(7807):215-220)、各位置の少なくとも1つの変異(G502E/R/V、G504V、及びY505C/N/S)もhACE2結合を妨げた(図41E~41F)。これは、循環性SARS-CoV-2分離株の間にそれらがない説明となる可能性がある。これらの結果は、ADI-58124エピトープの進化的保存がACE2結合に直接的に関連している可能性を示唆している。
最初に、ADI-58124が認識する抗原表面へのさらなる洞察を得るため、変異誘発した酵母表面ディスプレイRBDライブラリーを生成し、数ラウンドの選択を実施して、ADI-58124に対する結合の消失を示すRBDバリアントを特定した(図41A~41C)。組換えhACE2及びADI-58124結合部位とは異なる非重複エピトープを標的とする2つのRBD指向mAb(S309及びCR3022)の混合物を用いて最終ラウンドのポジティブ選択を実施して、RBDの立体構造を大きく破壊する変異を除外した(D.Pinto et al.,Nature 583,290-295(2020).;M.Yuan et al.,Science 368,630-633(2020))。単一アミノ酸置換をコードする選択されたRBD変異体を、ADI-58124、組換えhACE2、CR3022、及びS309との結合について個別に試験し、部位特異的ノックダウン変異を確認した(図41B及び図41D)。わずか4つのRBD位置での置換(D405E、G502E/R/V、G504A/D/R/S/V、及びY505C/N/S)がADI-58124結合を特異的に妨げた(図41E~41F)。これらの4つの残基は、クレードIサルベコウイルス亜属間で著しく保存され、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、SHC014、及びWIV1ウイルス間で不変である(図41G)。これは、ADI-58124が示す結合の幅及び中和についての分子的な説明をもたらすものである。これらの残基がクレードIサルベドウイルス間で保存されていることに整合して、ADI-58124の結合に影響を及ぼす置換は、2020年10月19日時点において、GISAIDデータベースに寄託されているSARS-CoV-2の完全長配列には存在しなかった。注目すべきことに、ADI-58124の結合を妨げる4つの同定された変異のうちの3つが、hACE2結合部位内にある(Lan J.et al.,Nature.2020 May;581(7807):215-220)、各位置の少なくとも1つの変異(G502E/R/V、G504V、及びY505C/N/S)もhACE2結合を妨げた(図41E~41F)。これは、循環性SARS-CoV-2分離株の間にそれらがない説明となる可能性がある。これらの結果は、ADI-58124エピトープの進化的保存がACE2結合に直接的に関連している可能性を示唆している。
次に、ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130のエピトープをさらに理解するため、SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードする組換え水疱性口内炎ウイルス(rVSV-SARS-CoV-2-S、Wuhan-Hu-1分離株由来)をサロゲート組換えスクリーニングシステムとして用いて、抗体耐性のSARS-CoV-2 Sタンパク質を誘導した。事前に滴定したrVSV-SARS-CoV-2-Sを段階希釈量の試験抗体と混合し、Vero細胞とともにインキュベートし、繰返し継代した。最終継代から得られた潜在的耐性ウイルスを用いて中和アッセイを実施した。
ADI-58120、ADI-58124、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130による変異型SARS-CoV-2 Sを含む偽ウイルス(rVSV)の中和について図41H~41Jに示す。図41H~41Jに示すIC50値の増加に基づくと、Sタンパク質内のN440H及びN440D置換が独立して、ADI-58120による中和に耐性を付与し、G504D及びG504S置換が独立して、ADI-58124による中和に耐性を付与し、T415I置換がADI-58126による中和に対する耐性を付与し、F490S置換がADI-58128による中和に対する耐性を付与し、Y145D、K150E、及びW152R置換が独立して、ADI-58130による中和に対する耐性を付与した。したがって、残基440はADI-58120の提唱されるエピトープ残基であり、残基504はADI-58124の提唱されるエピトープ残基であり、残基415がADI-58126の提唱されるエピトープ残基であり、残基490がADI-58128の提唱されるエピトープ残基であり、残基145、150、及び152はADI-58130の提唱されるエピトープ残基である。
ADI-58124についてのRBD酵母ライブラリーベース試験及び抗体耐性Sタンパク質選択試験に使用した方法を以下に示す。ADI-58120、ADI-58126、ADI-58128、及びADI-58130についても本質的に同じ方法を使用した。
ePCRライブラリーの構築及びRBD変異体の選択:
iProof High-Fidelity PCR system(Bio-Rad;カタログ番号1725310)を製造業者の推奨に従って用いて、SARS-COV-2 RBD-SD1 gBlock(IDT)をポリメラーゼ鎖反応(PCR)によって増幅した。増幅したDNAを精製し(Nucleospin Gel and PCR Clean-up Kit;Macherey-Nagel;カタログ番号740609.250)、続いてGeneMorph II Random Mutagenesis Kit(Agilent Technologies;カタログ番号200550)を用いて、エラープローンPCR(ePCR)により、0~4.5変異のDNAのキロベース当たり標的ヌクレオチド変異頻度で変異誘発した。変異誘発したDNA産物を、前述のように、エレクトロポレーションによって酵母内にクローニングした。形質転換したePCR酵母ライブラリーのサブセットをトリプトファンドロップアウト寒天プレート(Teknova;カタログ番号C6099)にプレーティングし、クローナル酵母細胞をサンガーシークエンシングすることにより、ePCRライブラリーを検証した。前述のようにクローニングしたWT SARS-CoV-2 RBD-SD1を、後続の選択作業での参照として使用した。
FACS選択を実施する前に、ePCR RBD-SD1ライブラリー及びWT RBD-SD1酵母を上記のようにして誘導した。ADI-58124への結合が減少した変異体を選択するため、上記と同様の形式で酵母細胞をADI-58124で染色した。簡潔に説明すると、誘導細胞を、PBSF中でEC80濃度に希釈したADI-58124 IgG(酵母ディスプレイWT RBD-SD1上でADI-58124を滴定することによって定量した)とともに、氷上で30分間インキュベートした(図41A~41D)。次に細胞をPBSFで2回洗浄し、二次染色混合物中で染色し、BD FACS Aria II(Becton Dickerson)で解析した。図40Aに示すように、HA-タグ発現を示すがWT RBD-SD1酵母と比較してADI-58124結合が低減した酵母集団のサブセットをソーティングし、SDCAA培地中で30℃で48時間増殖させた。この選択手順を第2ラウンドまで繰り返して、ADI-58124結合ノックダウン変異をコードする酵母をさらに富化した。最終ラウンドの選択では、誘導ライブラリーを、hACE2、S309、及びCR3022のそれぞれのEC80濃度の混合物で染色した。WT RBD-SD1染色酵母の結合プロファイルを反映する染色集団のサブセットをソーティングし、単一コロニーのサンガーシークエンシング用に寒天プレートにプレーティングした。シークエンシングから同定された単一のアミノ酸置換を有する個々のクローンを培養し、誘導し、BD FACS Canto II(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリー解析により、それぞれのEC80濃度のADI-58124、S309、CR3022、及び可溶性hACE2に対する結合を評価した。前述のように、結合シグナルを正規化し、参照WT RBD-SD1に対する結合シグナルのパーセンテージとして計算した。
変異体SARS-CoV-2 Sを含む偽ウイルスrVSVエスケープ試験:
ADI-58124の最大阻害率の90%をもたらす濃度(IC90)を9点中和アッセイで推定した。簡潔に説明すると、予備滴定量のrVSV-SARS2 Sウイルスを、ADI-58124の段階希釈液とともに室温で1時間インキュベートした。スクリーニングのために、96ウェルプレートに入ったVero細胞の単層に抗体-ウイルス混合液を適用した。7時間インキュベートした後、eGFP陽性ウイルス感染細胞をCytation-5 imager(Biotek)を用いて計数し、搭載されたGen5ソフトウェア(バージョン3.04)(Biotek)で解析した。
抗体による選択を行う前の日にVero細胞を12ウェルプレートにプレーティングし、翌日に細胞が約80%コンフルエントとなるようにした。親RVSV-SARS-CoV-2 Sウイルスを、感染後8時間で12ウェルプレートにおいて約2%のウイルス感染が得られるように滴定した。翌日、ADI-58124を推定IC90で、異なる感染多重度(3つの異なる処置で3倍ずつ増加)のrVSV-SARS-CoV-2 Sウイルスとともに、室温で1時間インキュベートした。また、同じ3つの濃度のウイルスを、ADI-58124を含まない、ただし対照としてのビヒクル(リン酸緩衝食塩水)を含むウェルでも試験した。ウイルスとADI-58124との混合物によりVero細胞に感染させた。感染から8~10時間後、その後は12時間ごとに、プレートをeGFP発現の徴候に関しモニターした。感染からおよそ2~3日後、ADI-58124処置したウェルでほとんどの細胞が感染した時期にウイルスを採取した。上清を4℃で1分間、15,000rpmで遠心分離して細胞デブリを除去し、次に分注して80℃で保存した。採取したウイルスを、潜在的抗体耐性rVSV-SARS- CoV-2 Sウイルスを探索するためのADI-58124を用いた選択における第1継代(P1)とした。
P2のために、最もウイルス接種量が少ないウェルからのウイルスを、P1のアッセイで選択したADI-58124の濃度を2倍にしてインキュベートした。混合物をインキュベートし、次にVero細胞に加え、P1で説明したように採取した。選択プロトコルを3回継代を行うまで繰り返し、3回継代した時点で、親ウイルス及び潜在的耐性ウイルス集団を比較してADI-58124に対する耐性を推定するための中和アッセイを実施した。ウイルス集団がADI-58124の中和において10倍以上のIC50の変化を示したら、単一のウイルスクローンをプラーク精製した。プラーク精製ウイルスを、IC90濃度の抗体の存在下でVero細胞上で増幅して、あらゆる潜在的な親遺伝子型への復帰を防止した。精製ウイルスクローンをADI-58124とともにインキュベートして、上述のような中和アッセイにおける親ウイルスと比較して、抗体に対する耐性を検証した。RNeasy Mini Kit(Qiagen;カタログ番号74136)を製造業者の指示に従って用いて、700μLの耐性クローンの上清からRNAを抽出した。SuperScript(登録商標)III First-Strand Synthesis Kit(Invitrogen、カタログ番号18080051)を用いたRT-PCRによってS遺伝子を増幅し、QIAQuick Gel Extraction Kit(Qiagen、カタログ番号28706)を製造業者のプロトコルに従って使用することにより、PCR産物をゲル精製した。ゲル精製したPCR産物を、サンガーシークエンシングして遺伝子型を同定するためにGenewiz(South Plainfield,NJ)に送付した。
P2のために、最もウイルス接種量が少ないウェルからのウイルスを、P1のアッセイで選択したADI-58124の濃度を2倍にしてインキュベートした。混合物をインキュベートし、次にVero細胞に加え、P1で説明したように採取した。選択プロトコルを3回継代を行うまで繰り返し、3回継代した時点で、親ウイルス及び潜在的耐性ウイルス集団を比較してADI-58124に対する耐性を推定するための中和アッセイを実施した。ウイルス集団がADI-58124の中和において10倍以上のIC50の変化を示したら、単一のウイルスクローンをプラーク精製した。プラーク精製ウイルスを、IC90濃度の抗体の存在下でVero細胞上で増幅して、あらゆる潜在的な親遺伝子型への復帰を防止した。精製ウイルスクローンをADI-58124とともにインキュベートして、上述のような中和アッセイにおける親ウイルスと比較して、抗体に対する耐性を検証した。RNeasy Mini Kit(Qiagen;カタログ番号74136)を製造業者の指示に従って用いて、700μLの耐性クローンの上清からRNAを抽出した。SuperScript(登録商標)III First-Strand Synthesis Kit(Invitrogen、カタログ番号18080051)を用いたRT-PCRによってS遺伝子を増幅し、QIAQuick Gel Extraction Kit(Qiagen、カタログ番号28706)を製造業者のプロトコルに従って使用することにより、PCR産物をゲル精製した。ゲル精製したPCR産物を、サンガーシークエンシングして遺伝子型を同定するためにGenewiz(South Plainfield,NJ)に送付した。
実施例28:SARS-CoV-2-S結合競合解析
新規抗体のエピトープをさらに理解するため、BLIを用いて競合結合解析を行った。最初に、SARS-CoV-2-Sとの結合に関するACE2と各抗体との間の競合を解析した。図42A~42Bに示されているように、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、及びADI-58129はACE2と競合し、一方ADI-58130及びADI-58131は競合しなかった。S309以外の全ての臨床抗体はACE2と競合した。2つの異なる抗体間の競合も解析した。結果を図42C~42Gに示す。
新規抗体のエピトープをさらに理解するため、BLIを用いて競合結合解析を行った。最初に、SARS-CoV-2-Sとの結合に関するACE2と各抗体との間の競合を解析した。図42A~42Bに示されているように、ADI-58120、ADI-58121、ADI-58122、ADI-58123、ADI-58124、ADI-58125、ADI-58126、ADI-58127、ADI-58128、及びADI-58129はACE2と競合し、一方ADI-58130及びADI-58131は競合しなかった。S309以外の全ての臨床抗体はACE2と競合した。2つの異なる抗体間の競合も解析した。結果を図42C~42Gに示す。
以下に、競合結合試験で使用した方法を示す。
ACE2競合結合試験:
バイオセンサー装置、センサーチップ、アッセイバッファー、及びアッセイ条件:AHCセンサーチップを搭載したForteBio Octet HTX(Sartorius Bioanalytical Instruments,Bohemia,NY)を用いて、PBSFバッファーシステム中25℃でBLI解析を実施した。
試薬の調製:ストック溶液をPBSFバッファーで100nMの濃度に希釈することにより、SARS-CoV-2 S及びACE2タンパク質をバルクで調製した。
抗体の製剤化:抗体をそのストック濃度から100nMに希釈した。
センサーチップの調製:AHCセンサーチップをPBSFバッファーに10分間浸漬し、次にIgGが入ったウェルに曝露した(約60秒)。次に、装填したセンサーをPBSFバッファーに15分間浸漬した。IgG装填センサーチップを無関係のIgG(アダリムマブ、0.5mg/mL)に曝露する(10分間)ことにより、センサーチップ上に残っているFc捕捉部位をブロックした。装填及びブロックしたこれらのセンサーチップをPBSFバッファーに30分間浸漬し、次に競合結合実験に進んだ。
実験ステップ:各実験サイクルは、センサーチップをPBSFバッファーに浸漬し(180秒)、安定したベースラインを確立することにより開始した。この後に、IgG装填センサーチップをACE2が入ったウェルに曝露した(180秒)。このステップは、IgGとACE2との間に相互作用があるかどうかを示すために必要である。センサーチップを新鮮なPBSFバッファーウェルに短時間浸漬した(60秒)後、SARS-CoV-2のSタンパク質が入ったウェルに浸漬した(180秒)。次に、センサーチップを直ちにACE2タンパク質が入ったウェルに浸漬し(180秒)、ACE2と抗体結合SARS-CoV-2 Sタンパク質との任意の会合をモニターした。
データ処理:SARS-CoV-2 S及びACE2の曝露ステップを分離するようにデータを切り出し、次にForteBio Data Analysis software version 11.1.3.10を用いてx軸及びy軸に整列させた。
バイオレイヤー干渉法を用いた競合結合実験:
ForteBio Octet HTX(Sartorius Bioanalytical Instruments)を用いて可溶性SARS-CoV-2 Sタンパク質への結合に対する抗体間の競合を評価した。全ての試薬をPBSF中で100nMに希釈した。AHCセンサーチップにADI-58124 IgGを装填し、次に不活性IgGに曝露して、任意の残りのFc捕捉部位をブロックした。続いて、チップをPBSF中で30分間平衡化した。ADI-58124装填センサーチップをhACE2、CR3022、またはS309が入ったウェルに移して、ADI-58124との任意の相互作用をチェックした。次に、センサーチップを新鮮なPBSFバッファーが入ったウェルに装填し(60秒)、次にSARS-CoV-2のSタンパク質に曝露し(180秒)、最後にhACE2、CR3022、またはS309に曝露した(180秒)。SARS-CoV-2のSタンパク質及びhACE2、CR3022、またはS309の曝露ステップのみを含むようにデータを切り出し、ForteBio Data Analysis software version 11.1.3.10を用いてx軸及びy軸に整列させた。
実施例29:親和性成熟後抗体によるFc媒介性エフェクター機能
ADI-58125及びADI-58124は同じCDR配列を共有し、半減期延長の目的で操作されたFc領域のみが異なる。Fc媒介性エフェクター機能はウイルス中和とは無関係に防御に貢献する可能性があるため、ADI-58124及びADI-58125と、異なるFcガンマ受容体(FcgR)、新生児Fc受容体(FcRn)、及び補体構成要素C1qとの結合を試験した。結果を図43A~43Cに示す。
ADI-58125及びADI-58124は同じCDR配列を共有し、半減期延長の目的で操作されたFc領域のみが異なる。Fc媒介性エフェクター機能はウイルス中和とは無関係に防御に貢献する可能性があるため、ADI-58124及びADI-58125と、異なるFcガンマ受容体(FcgR)、新生児Fc受容体(FcRn)、及び補体構成要素C1qとの結合を試験した。結果を図43A~43Cに示す。
図43Aは、これらの試験されたFcgRタンパク質のいずれの結合においても、ADI-58124及びADI-58125との結合に有意な差がないことを示している。このことは、ADI-58124におけるFc半減期延長LA変異が、ここでの試験で評価したいずれのFcgRタンパク質との結合にも影響を及ぼさないことを示唆している。機能的には、ADI-58125は、FcgRとの相互作用により媒介される正常なエフェクター機能を有しており、これがADI-58125のSARS-CoV-2中和活性に寄与する可能性がある。
図43Bは、pH6.0において、ADI-58124及びADI-58125 Fcバリアントが、ヒト及びカニクイザルのFcRnに対しわずかに異なる結合プロファイルをもたらすことを示している。概して、各IgGは、ヒトFcRnに対するよりもわずかに強力にカニクイザルFcRnに結合する。ヒト及びカニクイザル両方のFcRnに対し、ADI-58125(LA Fc)はpH6.0においてADI-58124(WT Fc)より高い親和性で結合した。pH6.0におけるADI-58125のFcRnに対する親和性の増強は、in vivo半減期の延長につながると予想される。ADI-58124もADI-58125も、pH7.4ではFcRnに結合しなかった。
図43Cは、ADI-58124及びADI-58125がC1qに対し同等の親和性を有することを示しており、そのためADI-58125のLA変異は、IgG1 Fc媒介性補体経路活性化に影響を及ぼさないと予想される。
以下に、Fc結合の評価に使用した方法を示す。
FcgR結合試験:
バイオセンサー装置、センサーチップ、ランニングバッファー、及びアッセイ条件:SPR解析は、CAPセンサーチップを搭載したBiacore 8K光学バイオセンサー(Global Life Sciences Solutions USA,Marlborough,MA)を用いて、HBS-EP+バッファーシステム(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性剤P20)中25℃で行った。(Global Life Sciences Solutions USA,Marlborough,MA)。実験期間中、試料コンパートメントを10℃で維持した。このアッセイ方向により、ビオチン化試料をセンサー表面に再現可能に捕捉することが可能となる。
表面の調製:各解析の前に、最初にセンサーチップ表面を3パルス(10μL/分で60秒)の再生液(0.25M NaOH中6Mグアニジン-HCl)でコンディショニングした。
抗原の調製:ストック試料を6.0nMの試験濃度でHBS-EP+バッファーで希釈することにより、SARS-CoV-1 RBDをバルクで調製した。
ADI-58124及びADI-58125の製剤化:両方の抗体をそのストック濃度から27.0nMの濃度に希釈した。
FcgRの製剤化:FcgRIタンパク質をそのストック濃度から32nMに希釈し、次に1.0nMの濃度まで段階希釈(2倍)した。全ての他のFcgRタンパク質をそのストック濃度から1024nMに希釈し、次に8.0nMの濃度まで段階希釈(2倍)した。
実験ステップ:各実験サイクルは、HBS-EP+バッファー中のビオチンCAPture試薬(Global Life Sciences Solutions USA;ロット番号10275955)の1:20溶液をフローセル1及び2に注入(2μL/分で300秒)することで開始した。この後に、ビオチン化抗原をセル2に注入した(10μL/分で180秒)。抗原がセンサー表面に捕捉されたら、ADI-58124またはADI-58125をフローセル1及び2に注入した(30μl/分で180秒)。IgGの解離を120秒間モニターした後にFcgRを注入した(180秒)。センサー表面からのFcgRの解離を180秒間モニターした。最後に、再生液をフローセル1及び2に注入(10μL/分で120秒)することにより、別のサイクルのためにセンサー表面が調製される。
モデル/フィット:最初にデータを、FcgRの会合及び解離を伴うステップのみを含むように切り出した。Biacore Insight Evaluation software version 3.0.11.15423を用いて、この選択したデータをアラインメントし、ダブルリファレンスを差し引き、1:1結合モデルに非線形最小二乗法フィッティングを行った。
FcRn結合試験:
バイオセンサー装置、センサーチップ、ランニングバッファー、及びアッセイ条件:SPR解析は、CM3またはCM5センサーチップを搭載したBiacore 8K光学バイオセンサー(Global Life Sciences Solutions USA,Marlborough,MA)を用いて、25℃で行った。実験期間中、試料コンパートメントを10℃で維持した。
装置ランニングバッファー:これらの試験は、HBS-EP+バッファーシステム(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性剤PS20)中pH6.0またはpH7.4で行った。
抗体の調製:pHスカウティング試験が、各IgGをセンサー表面に直接固定するためのバッファーのpH及びおよその濃度を決定する一助となった。
表面の調製:センサー表面を以下のように調製した:EDC及びNHSの1:1混合液をフローセル1及び2に注入し(420秒)、抗体をフローセル2に注入し(120秒)、最後にエタノールアミンをフローセル1及び2に注入した(420秒)。
FcRnの製剤化:バッファーpH6.0で実施する実験においては、ヒト及びカニクイザルのFcRnをそのストック濃度からHBS-EP+バッファー(pH6.0)で60.0nMの濃度に希釈し、0.029nMまで段階希釈(2倍)した。バッファーpH7.4で実施する実験においては、ヒト及びカニクイザルのFcRnをそのストック濃度からHBS-EP+バッファー(pH7.4)で128nMの濃度に希釈し、1.0nMまで段階希釈(2倍)した。
実験ステップ:各実験サイクルは、FcRnをフローセル1及び2に注入(30μuL/分で180秒)することで開始した。FcRnの解離を180~300秒間観察してから、HBS-EP+バッファー(pH7.4)を2回注入(30μuL/分で20秒)することでセンサー表面を再生した。これにより、別のサイクルのためにセンサー表面が調製される。
モデル/フィット:Biacore Insight Evaluation software version 3.0.11.15423を用いて、データをアラインメントし、ダブルリファレンスを差し引き、1:1結合モデルに非線形最小二乗法フィッティングを行った。
C1q結合試験:
バイオセンサー装置、センサーチップ、アッセイバッファー、及びアッセイ条件:SAセンサーチップを搭載したForteBio Octet HTX(Sartorius Bioanalytical Instruments,Bohemia,NY)を用いて、PBSFバッファー中25℃でBLI解析を実施した。これらのアッセイ条件は、Zhouら(2)から適合させた。
抗原の調製:ストック試料をPBSFバッファーで100nMのローディング濃度に希釈することにより、ビオチン化SARS-CoV RBDをバルクで調製した。
センサーチップの調製:AHCセンサーチップをPBSFバッファーに10分間浸漬し、次にビオチン化SARS-CoV RBDが入ったウェルに曝露した(300秒)。PBSF中でさらに20分間インキュベートした後、抗原装填センサーをIgGが入ったウェルに曝露した(90秒)。
抗体の製剤化:ADI-58124及びADI-58125をそのストック濃度から100nMに希釈した。
C1qの製剤化:C1qのストック溶液をPBSFバッファーで10nMに希釈し、次に0.625nMの濃度まで段階希釈(2倍)した。
実験ステップ:各実験サイクルは、センサーチップをPBSFに浸漬し(60秒)、安定したベースラインを確立することにより開始した。次に、センサーチップをC1qまたはブランクバッファーが入ったウェルに浸漬した(180秒)。次に、センサーチップを直ちにPBSFバッファーが入った新鮮なウェルに浸漬して(180秒)、センサーチップ表面からのC1qの解離をモニターした(最初の30秒)。
モデル/フィット:ForteBio Data Analysis software version 11.1.3.10を用いて、データをx軸及びy軸に整列させ、1:1結合モデルに非線形最小二乗法フィッティングを行った。
続いて、ADI-58124及びADI-58125における、抗体依存性ナチュラルキラー細胞活性化及び脱顆粒(ADNKDA)、単球及び好中球による抗体依存性細胞食作用(ADCP及びADNP)、ならびに抗体媒介性補体沈着(ADCD)を誘導する能力について、過去に説明されたin vitroアッセイ(B.M.Gunn et al.,Cell Host Microbe 24,221-233(2018))を用いて評価した。臨床SARS-CoV-2 nAbのS309及びREGN10987も比較対象として含めた。ADI-58124及びADI-58125は非常に多機能性のプロファイルを示し、その結果、単球及び好中球による食作用の誘導、補体構成要素C3の沈着、NK細胞の脱顆粒(ADCCのサロゲートマーカー)及び活性化の誘導をもたらした(図43D~43E)。興味深いことに、ADI-58124、ADI-58125、S309、及びREGN10957は同等の食作用の動員を示した一方で、これらの抗体は補体沈着及びNK細胞活性化に関しては異なっており、S309はADI-58124、ADI-58125、及びREGN10987と比べて補体沈着の低減を示し、ADI-58124及びADI-58125はS309及びREGN10987の両方よりも優れたNK細胞活性化を示した(図43D~43E)。まとめると、ADI-58124及びADI-58125は、現在のリードSARS-CoV-2臨床抗体と同等またはそれ以上の効力で多様なFc媒介性エフェクター活性をロバストに作動させる。
以下に、この実施例で使用した方法について簡単に説明する。
Ab依存性ナチュラルキラー細胞活性化及び脱顆粒(ADNKDA):
RosetteSep Human NK cell Enrichment Cocktail(Stem Cell Technologies;カタログ番号15065)を用いてヒトドナーの末梢血から初代ヒトNK細胞を富化し、10% FBS(Hyclone;SH30071.03)、1% Pen/Strep(Gibco;カタログ番号15070-063)、1% L-グルタミン(Corning;カタログ番号25-005-CI)、1% HEPES(Corning;カタログ番号25-060-CI)、及び5ng/mlの組換えヒトIL-15(StemCell Technologies;カタログ番号78031)を補充したRPMI-1640(Corning;カタログ番号15-040-CV)中で一晩培養した。MaxiSorp 96ウェルプレート(Thermo Scientific;カタログ番号442404)に、組換えSARS-CoV-2受容体結合ドメインを200ng/ウェルにおいて、4℃で一晩コーティングした。ウェルをPBSで洗浄し5% BSAでブロックした後に、PBS中5倍希釈系列で希釈した抗体(10μg/ml~0.32ng/ml)を加え、37℃で2時間インキュベートした。結合していない抗体をPBSで洗浄することによって除去し、4μg/mlブレフェルジンA(Biolegend;カタログ番号420601)、5μg/ml GolgiStop(BD Biosciences;カタログ番号554724)、及び抗CD107a抗体(Clone H4A3 PE-Cy7;Biolegend;カタログ番号328618)の存在下で、5×104細胞/ウェルで5時間加えた。細胞の表面発現をCD16(Clone 3G8 Pacific Blue;Biolegend;カタログ番号302032)、CD56(Clone 5.1H11 AlexaFluor488;Biolegend;カタログ番号362518)、及びCD3(Clone UCHT1 Alexa Fluor700;Biolegend;カタログ番号300424)で染色した。細胞を、製造業者の指示に従ってFix/Perm(Biolegend;カタログ番号421002)で固定及び透過処理し、細胞内IFNγ(Clone B27 PE、Biolegend、カタログ番号506507)及びTNFα(Clone Mab11 APC;Biolegend;カタログ番号502912)について染色した。細胞をCytek Aurora spectral flow cytometerで解析した。
単球及び好中球によるAb依存性細胞食作用(ADCP及びADNP):
ADNP:HL-60前骨髄芽細胞(ATCCカタログ番号CCL-240)を、20%ウシ胎児血清及び1% Pen/Strepを含むIscoveのダルベッコ変法培地(ATCCカタログ番号30-2005)中で維持した。HL-60細胞を、1.3% DMSOの存在下で5日間成長させることにより好中球に分化させた。組換えSARS-CoV-2受容体結合ドメインを、カルボジイミドカップリングにより蛍光ビーズ(Thermo Scientific;カタログ番号F8819)に結合した。抗体をHL-60培養基に5倍希釈曲線で希釈し(1μg/ml~0.32ng/ml)、RBDコーティングビーズとともに37℃で2時間インキュベートした。(5×104細胞/ウェル)を37℃で18時間インキュベートした。次に、細胞をCD11b(Clone M1/70 APC-Fire750;Biolegend;カタログ番号101262)及びCD16(Clone 3G8 Pacific Blue;Biolegend;カタログ番号302032)について染色し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより解析した。CD11b+及びCD16+の細胞の蛍光ビーズの取込みについて解析した。以下の式を用いて食作用スコアを求めた:(FITC+細胞のパーセンテージ)×(FITC+細胞の幾何平均蛍光強度(gMFI))/100,000。
ADCP:10% FBS、1% Pen/Strep、1% L-グルタミン、及びb-メルカプトエタノールを補充したRPMI-1640中でTHP-1単球を維持した。組換えSARS-CoV-2 RBDコーティングビーズをADNPについて説明されているように作成した。抗体をTHP-1培養基に5倍希釈曲線で希釈し(5μg/ml~64pg/ml)、RBDコーティングビーズとともに37℃で2時間インキュベートした。結合していない抗体を遠心分離によって除去してから、THP-1細胞を2.5×104細胞/ウェルで加えた。細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって解析した。食作用スコアを上述のようにして求めた。
Ab媒介性補体沈着(ADCD):
組換えSARS-CoV-2受容体結合ドメインコーティングビーズをADNPについて説明されているように作成した。抗体を5倍希釈系列でRPMI-1640(5μg/ml~64pg/ml)5μg/ml中に希釈し、RBDコートビーズとともに37℃で2時間インキュベートした。結合していない抗体を遠心分離によって除去してから、カルシウム及びマグネシウムを補充したベロナールバッファー(Boston Bioproducts;カタログ番号IBB-300)中に希釈した再構成モルモット補体(Cedarlane Labs;カタログ番号CL4051)を37℃で20分間加えた。ビーズを15mMのEDTAを含むPBSで洗浄し、FITC結合体化抗モルモットC3抗体(MP Biomedicals;カタログ番号855385)で染色した。ビーズへのC3沈着をフローサイトメトリーによって解析した。全てのビーズのFITCのgMFIを測定した。
ADI-58124及びADI-58125について、CD16a活性化によって測定される抗体依存性細胞傷害誘導能力を比較した。図43F(SARS-CoV-2 Sタンパク質(上)またはSARS-CoV-2 Sタンパク質RBD(下)に結合した際のCD16a活性化を示す)に示されているように、ADI-58124及びADI-58125は、ともに同等のADCC活性を示した。この結果は、CD16の活性化がRBDとの結合によって駆動されることも示している。
図43A~43Eの結果に基づけば、ADI-58125の半減期を延長するためのFc領域のM428L/N434A修飾は、野生型Fcを含むADI-58124抗体のFcエフェクター機能を変化させなかった。さらに、ADI-58125は複数のFcエフェクター活性を示しており、これはSARS-CoV-2感染のクリアランス及び制御に不可欠である可能性がある。
以下に、ADCCの評価に使用した方法について簡単に説明する。
ADCC活性の評価:
ADCCアッセイでは、高結合96ウェルプレート(Corning;カタログ番号3361)にコーティングした抗原に対する抗体架橋を介したJurkat-Luciaエフェクター細胞(Invivogen;jktl-nfat-cd16)の活性化を評価した。Jurkat-Lucia細胞は、細胞表面Fc受容体CD16A(FcgRIIIA;V158高親和性アロタイプ)を安定的に発現する。また、Jurkat-Lucia細胞は、6つのNFAT応答エレメントと融合したISG54最小プロモーターの制御下でLuciaルシフェラーゼレポーター遺伝子も安定的に発現する。抗体-抗原複合体のFcに結合したJurkat-Luciaは、CD16Aを活性化してルシフェラーゼ発現をもたらす。
SARS-CoV-2 Sタンパク質(Hexapro S-2P(Hsieh,C.L.,et al.,(2020). Structure-based Design of Prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spikes.bioRxiv.doi:10.1101/2020.05.30.125484)またはRBD(Wrapp,D.et al.,(2020).Science,367(6483),1260-1263.doi:10.1126/science.abb2507)をアッセイ開始前日にプレートにコーティングした。アッセイ当日、コーティングプレートをブロックし、抗体希釈液(5つの濃度、1:3希釈、2000ng/mL~25ng/mLまで)を対照とともにプレートに加えた。次にJurkat-Lucia細胞を1×105細胞/ウェルで加え、プレートを37℃、5% CO2でインキュベートした。24時間後、アッセイ上清をQUANTI-Lucルシフェラーゼ基質(Invivogen,rep-qlc1)と混合することにより、試料のルシフェラーゼ活性をアッセイした。SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)を用いて発光を測定した。
実施例30:親和性成熟後抗体によるin vivo効果
マウス適合SARS-CoV(MA15)及びマウス適合SARS-CoV-2(MA10)を用いたCOVID-19の免疫担当マウスモデルにおいて、広範なin vivo防御をもたらすADI-58125の能力を試験した(A.Roberts et al.,PLoS Pathog 3,e5(2007);S.R.Leist et al. Cell,(2020))。Balb/cマウスに対し、103PFU用量のMA15またはMA10による鼻腔内チャレンジを行う12時間前に、腹腔内注射による200μgのADI-58125またはPBSで予防的に処置した。全てのマウスの体重減少及び呼吸機能の変化を毎日モニターし、感染から2日後または4日後にマウスの群を安楽死させて、肺内のウイルス増殖の測定及び肺の病理組織の解析ができるようにした。両方のウイルスに感染したシャム処置マウスにおいて、気道抵抗の計算された尺度であるPenhの増加とともに、かなりの進行性の体重減少が見られた(Leist S.R.et al.,A Mouse-Adapted SARS-CoV-2 Induces Acute Lung Injury and Mortality in Standard Laboratory Mice Mice.Cell(2020))。これに対し、ADI-58125で予防的に処置したマウスは、採取時において体重減少は最小限であり、Penhの変化はなく、肉眼的病態の徴候はないことが示された(図44A及び図44B)。さらに、予防的抗体処置により、感染から2日後及び4日後(dpi)の両方で肺内のウイルス複製が防止された。次に、治療的設定においてSARS-CoV-2 MA10に対するADI-58125の抗ウイルス作用能力を調べた。マウスに対し、103PFU用量のMA10により鼻腔内チャレンジを行った12時間後に、200μgのADI-58125またはPBSで処置した。治療用ADI-58125を投与したマウスは、中程度のレベルの体重減少、中程度の呼吸機能変化、及びいくつかの肉眼的肺病態が認められ、これは予防的処置マウスを有意に上回ったがシャム処置マウスを有意に下回った(図44C)。また、治療用抗体処置の結果、シャム処置マウスと比較して、4dpiでは肺のウイルス負荷が有意に低減したが、2dpiでは有意に低減しなかった。結論として、ADI-58125処置は、SARS-CoV MA15及びSARS-CoV-2 MA10のいずれに感染したマウスにおいても疾患負荷を低減することができる。
マウス適合SARS-CoV(MA15)及びマウス適合SARS-CoV-2(MA10)を用いたCOVID-19の免疫担当マウスモデルにおいて、広範なin vivo防御をもたらすADI-58125の能力を試験した(A.Roberts et al.,PLoS Pathog 3,e5(2007);S.R.Leist et al. Cell,(2020))。Balb/cマウスに対し、103PFU用量のMA15またはMA10による鼻腔内チャレンジを行う12時間前に、腹腔内注射による200μgのADI-58125またはPBSで予防的に処置した。全てのマウスの体重減少及び呼吸機能の変化を毎日モニターし、感染から2日後または4日後にマウスの群を安楽死させて、肺内のウイルス増殖の測定及び肺の病理組織の解析ができるようにした。両方のウイルスに感染したシャム処置マウスにおいて、気道抵抗の計算された尺度であるPenhの増加とともに、かなりの進行性の体重減少が見られた(Leist S.R.et al.,A Mouse-Adapted SARS-CoV-2 Induces Acute Lung Injury and Mortality in Standard Laboratory Mice Mice.Cell(2020))。これに対し、ADI-58125で予防的に処置したマウスは、採取時において体重減少は最小限であり、Penhの変化はなく、肉眼的病態の徴候はないことが示された(図44A及び図44B)。さらに、予防的抗体処置により、感染から2日後及び4日後(dpi)の両方で肺内のウイルス複製が防止された。次に、治療的設定においてSARS-CoV-2 MA10に対するADI-58125の抗ウイルス作用能力を調べた。マウスに対し、103PFU用量のMA10により鼻腔内チャレンジを行った12時間後に、200μgのADI-58125またはPBSで処置した。治療用ADI-58125を投与したマウスは、中程度のレベルの体重減少、中程度の呼吸機能変化、及びいくつかの肉眼的肺病態が認められ、これは予防的処置マウスを有意に上回ったがシャム処置マウスを有意に下回った(図44C)。また、治療用抗体処置の結果、シャム処置マウスと比較して、4dpiでは肺のウイルス負荷が有意に低減したが、2dpiでは有意に低減しなかった。結論として、ADI-58125処置は、SARS-CoV MA15及びSARS-CoV-2 MA10のいずれに感染したマウスにおいても疾患負荷を低減することができる。
Vero E6細胞を用いたルシフェラーゼベースアッセイにより、ADI-58125によるマウス適合SARS-CoV及びSARS-CoV-2の中和が図44Dに示されているように確認された。
以下に、使用したin vivo方法について簡単に説明する。
動物試験:
12か月齢の雌Balb/cマウス(Envigo、047系統)に対し、感染12時間前(予防)または感染12時間後(治療)に、腹腔内(IP)注射により200μgのADI-58125 IgGで処置した。マウスにケタミン/キシラジンで麻酔をかけた後に、1000PFUのSARS-CoV-MA15またはSARS2-CoV-2-MA10(34、35)で鼻腔内接種を介しチャレンジした。マウスの体重及び呼吸機能を毎日4日間モニターした。呼吸機能を、過去に説明されているように(51)、30分の順化期間及び5分の測定ウィンドウを伴って全身プレチスモグラフィー(DSI)によりモニターした。ウイルス肺力価をプラークアッセイにより測定し、右肺の下葉を評価した。感染から2日後及び4日後に屠殺したマウスに肉眼病理所見を実施した。肺における肉眼病理所見を4点方式でスコア化した(0が出血なし、4が完全な出血に相当)。全ての動物飼育及び実験は、BSL3にて、University of North Carolina at Chapel HillのInstitutional Animal Care and Use Committeeガイドライン(AAALAC Institutional Number 329)に従って実施した。
マウス適合ウイルス中和:
ADI-58125を8種の異なる濃度で成長培地中に希釈して潜在的阻害曲線を得た。SARS1-MA-nLuc(75PFU/ウェル)及びSARS2-MA2-nLuc(85PFU/ウェル)ウイルスをADI-58125と1:1で混合し、インキュベートした。プレーティングしたVero E6細胞のウェルにウイルス及びADI-58125の混合物を加え、インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を測定し、シグモイド線量応答曲線を用いてデータ点をフィッティングすることにより阻害パーセント(IC50を含む)を計算した。
ADI-58125を8種の異なる濃度で成長培地中に希釈して潜在的阻害曲線を得た。SARS1-MA-nLuc(75PFU/ウェル)及びSARS2-MA2-nLuc(85PFU/ウェル)ウイルスをADI-58125と1:1で混合し、インキュベートした。プレーティングしたVero E6細胞のウェルにウイルス及びADI-58125の混合物を加え、インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を測定し、シグモイド線量応答曲線を用いてデータ点をフィッティングすることにより阻害パーセント(IC50を含む)を計算した。
実施例31:潜在的ADE作用
SARS-CoVや他の呼吸器ウイルスの研究から、抗SARS-CoV-2抗体が、Fc受容体を介して免疫細胞に取り込まれて、ウイルス増殖の増大及び/または炎症の増強をもたらす抗体依存性増強(ADE)を引き起こし得るかについて疑問が提起されている。SARS-CoV-2に特異的な本開示に従う抗体及び臨床抗体がADEを誘導する可能性を試験するため、試験抗体の存在下での食細胞による偽ウイルスの摂取について調べた。図45A~Cに示されているように、ADI-58124及びADI-58125は、THP-1及びRaji細胞のいずれにおいても感染のADEを媒介しなかった。
SARS-CoVや他の呼吸器ウイルスの研究から、抗SARS-CoV-2抗体が、Fc受容体を介して免疫細胞に取り込まれて、ウイルス増殖の増大及び/または炎症の増強をもたらす抗体依存性増強(ADE)を引き起こし得るかについて疑問が提起されている。SARS-CoV-2に特異的な本開示に従う抗体及び臨床抗体がADEを誘導する可能性を試験するため、試験抗体の存在下での食細胞による偽ウイルスの摂取について調べた。図45A~Cに示されているように、ADI-58124及びADI-58125は、THP-1及びRaji細胞のいずれにおいても感染のADEを媒介しなかった。
以下に、ADE解析で使用した方法について簡単に示す。
レポーターウイルス粒子の産生:
SARS-CoV-2 Sを発現するCoV2pp、VSV ΔG(rLuc)レポーターウイルス粒子、すなわちRVPがDr.Benhur Lee(Icahn School of Medicine at Mount Sinai,New York City,NY)から提供された。SARS-COV-2 RVPの産生と滴定については、(Oguntuyo K.Y.et al.,Quantifying absolute neutralization titers against SARS-CoV-2 by a standardized virus neutralization assay allows for cross-cohort comparisons of COVID-19 sera. Version 2.medRxiv. Preprint.2020 Aug 15[revised 2020 Aug 27])で説明されている。簡潔に説明すると、293T細胞に、SARS-COV-2糖タンパク質を過剰発現するように形質移入した。好適なインキュベート後、形質移入後の細胞をVSV-deltaG-rLucレポーターウイルスに感染させた。感染から2日後に上清を収集した。CoV2ppを有するVSVdeltaG-rLuc粒子を処理し保存した。
抗体依存性増強アッセイ:
Geisel School of Medicine, Dartmouth College(Lebanon,NH)にあるDr. Paul Guyre研究室で抗体依存性増強アッセイを実施した。IC50を上回る濃度からおよそIC50を100倍下回る濃度までの範囲の抗体濃度の存在下で、THP-1(ヒト単球由来細胞株、ATCC TIB-202)またはRaji細胞(ヒトB細胞由来細胞株、ATCC CCL-86)へのRVPの取込みを評価することにより、in vitro ADEを判定した。乳白色96ウェルプレート(BRANDプレート;カタログ番号781965)で無血清無色素RPMI培地(Gibco;11835-030)を希釈液として用いて抗体希釈液を調製した。100ng/mLから開始して1:5の段階希釈による一連の試験抗体濃度を調製し、最終抗体濃度は100、20、4、0.8、0.16、及び0.032ng/mLとなった。対照抗体は、最高濃度(100ng/mL)のみで試験した。
抗体プレートに加える前に、RVP、CoV2pp、VSV ΔG(rLuc)を37℃で3分間解凍し、次に氷上に置いた。20μLのRVPを各ウェルに加えた。RVP及び抗体の混合物を37℃、5% CO2で1時間インキュベートした。次に、RajiまたはTHP-1細胞を2e5細胞/ウェルの濃度で加え、プレートを37℃、5% CO2で18~24時間インキュベートした。
RVP取込みに関連するルシフェラーゼ活性を測定するため、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット(Promega;E2820)を使用した。溶解バッファー及びウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬を、ルシフェラーゼアッセイキットから製造業者の説明書に従って調製した。プレートをインキュベーターから取り出し、1200rpmで5分間遠心分離して細胞をペレット化した。細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS;Corning;21-040-CV)で洗浄し、次に1200rpmで5分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、全てのウェルからPBSを吸引した。50μLの1X溶解バッファーを用いて細胞を溶解し、プレートをロッカー上で15分間インキュベートした。SpectraMax i3X luminometerを使用して、ルシフェラーゼアッセイ試薬(100μL)を各ウェルに注入し、直ちに発光を測定した。GraphPad Prism 8を用いてヒストグラムによりデータをプロットした。
実施例32:抗体組合せのin vivoでの治療及び予防効果
治療及び/または予防有効性
試験動物、好ましくは哺乳類(例えば、マウス、ラット、ハムスター(例えば、シリアンハムスター)、ウサギ、ブタ、またはサル)を複数の群に分ける。ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479、またはこれらのフラグメント、あるいはこのようなIgG及び/またはこれらのフラグメントの混合物、とりわけ異なるエピトープを認識し、及び/または互いに競合しない抗体、例えば、「ADI-57983及びADI-56443」を、少なくとも1群に投与する。少なくとも1つの群には、このような抗体またはそのフラグメントを投与しない。次に、動物にコロナウイルス(例えば、SARS-CoV、SARS-CoV-2など)を感染させる。代替的に、抗体またはそのフラグメントをCoVによる感染の前に投与してもよい。抗体またはそのフラグメントは、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、または他の適切な経路により投与することができる。
治療及び/または予防有効性
試験動物、好ましくは哺乳類(例えば、マウス、ラット、ハムスター(例えば、シリアンハムスター)、ウサギ、ブタ、またはサル)を複数の群に分ける。ADI-57983、ADI-57978、ADI-56868、ADI-56443、及びADI-56479、またはこれらのフラグメント、あるいはこのようなIgG及び/またはこれらのフラグメントの混合物、とりわけ異なるエピトープを認識し、及び/または互いに競合しない抗体、例えば、「ADI-57983及びADI-56443」を、少なくとも1群に投与する。少なくとも1つの群には、このような抗体またはそのフラグメントを投与しない。次に、動物にコロナウイルス(例えば、SARS-CoV、SARS-CoV-2など)を感染させる。代替的に、抗体またはそのフラグメントをCoVによる感染の前に投与してもよい。抗体またはそのフラグメントは、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、または他の適切な経路により投与することができる。
各動物の体重をモニターする。発熱または可動性などの症状もモニターする場合がある。定期的に血清などの試料を採取し、ウイルス負荷を測定する。生存率を追跡する。動物は、体重及び/またはウイルス血症及び/または挙動及び/または症状(複数可)の所定のカットオフ値に基づいて屠殺することができる。
in vivo試験に使用することができる群分けとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる:
第1群:陰性対照;
第2群:ADI-58124(もしくはそのFcバリアント)のみ、ADI-58124(もしくはそのFcバリアント)のみ、またはADI-58126(もしくはそのFcバリアント)のみ(RBD結合広範中和物質);
第3群:ADI-581230(またはそのFcバリアント)のみ(NTD結合物質);
第4群:ADI-58124(またはそのFcバリアント)+ADI-581230(またはそのFcバリアント)(RBD結合広範中和物質+NTD結合物質);
第5群:ADI-58128(またはそのFcバリアント)のみ(RBD結合物質、ADI-57983との競合なし);
第6群:ADI-58124(またはそのFcバリアント)+ADI-58128(またはそのFcバリアント)(RBD結合広範中和物質+非競合RBD結合物質);
第7群:ADI-58124(またはそのFcバリアント)+ADI-581230(またはそのFcバリアント)(NTD結合物質)+ADI-58128(またはそのFcバリアント)(RBD結合物質、ADI-57983との競合なし)。
群間で適切な比較ができるように一致したFcを使用する。
1mg未満、例えば3μgの治療または予防用量が投与され得る。
実施例33:COVID-19の防止におけるADI-58125の有効性及び安全性を評価するための第2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照臨床試験
RT-PCRで確認された症候性COVID-19の防止においてADI-58125の有効性及び安全性を評価するための第2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験を設計する。
RT-PCRで確認された症候性COVID-19の防止においてADI-58125の有効性及び安全性を評価するための第2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験を設計する。
本試験は、SARS-CoV-2及びCOVID-19を獲得するリスクを高める場所や状況にある成人及び青年5,716例を伴う。SARS-CoV-2の状態に関して、ベースライン血清学的検査/RT-PCRを収集する。本試験の期間は各参加者当たり約12か月とする。これは、治療薬(300mgのADI-58125またはプラセボ)投与後12か月間の経過観察に対応する。治療薬(ADI-58125またはプラセボ)は筋肉内に投与する。
本試験の結果は、幅広い集団でのADI-58125のCOVID-19防止における即時かつ持続的な有効性を実証する。
実施例34:軽度または中等度COVID-19を有する外来参加者の治療におけるADI-58125の有効性及び安全性を評価するための第1/2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照臨床試験
疾患進行リスクの高い参加者において軽度または中等度COVID-19の治療におけるADI-58125の有効性及び安全性を評価するため、第1/2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験を設計する。
本試験は、軽度または中等度のCOVID-19を有し、症状期間が5日以下、SARS-CoV-2検査が陽性である1,734例のハイリスク成人及び青年の参加者を伴う。本試験は各参加者当たりおよそ6か月間続き、これは治療薬(ADI-58125またはプラセボ)投与後6か月間の経過観察に対応する。治療薬(ADI-58125またはプラセボ)は、静脈内または筋肉内に投与する。
疾患進行リスクの高い参加者において軽度または中等度COVID-19の治療におけるADI-58125の有効性及び安全性を評価するため、第1/2/3相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験を設計する。
本試験は、軽度または中等度のCOVID-19を有し、症状期間が5日以下、SARS-CoV-2検査が陽性である1,734例のハイリスク成人及び青年の参加者を伴う。本試験は各参加者当たりおよそ6か月間続き、これは治療薬(ADI-58125またはプラセボ)投与後6か月間の経過観察に対応する。治療薬(ADI-58125またはプラセボ)は、静脈内または筋肉内に投与する。
実施例35:モデルベースアプローチによる用量レジメン選択
薬剤固有の物理化学的特性の影響を含めて、半減期が延長されたモノクローナル抗体の薬物動態(PK)を特性評価するために、QSP/PBPKモデルを開発及び修正した。非ヒト霊長類のPKデータを使用して、予測濃度及び実測濃度の比較を通じてモデルを評価した。次に、測定されたPKをより十分に説明するためにモデルを再フィッティングし、ヒトにおける予防試験用の用量を選択するのに使用した。
薬剤固有の物理化学的特性の影響を含めて、半減期が延長されたモノクローナル抗体の薬物動態(PK)を特性評価するために、QSP/PBPKモデルを開発及び修正した。非ヒト霊長類のPKデータを使用して、予測濃度及び実測濃度の比較を通じてモデルを評価した。次に、測定されたPKをより十分に説明するためにモデルを再フィッティングし、ヒトにおける予防試験用の用量を選択するのに使用した。
治療用の用量の正当性を裏付けるため、肺区画を、ADI-58125のSARS-Cov-2との相互作用の2つの主要部位である上気道と下気道で置き換えることによってQSP/PBSKモデルをさらに修正し、このモデルをウイルスの感染時間経過モデルと結び付けた。
予防用の用量選択については、シミュレート患者の90%超が、単回の300mg筋肉内(IM)用量の後に最低6か月間、血清ADI-58125濃度をin vitro IC90の100~200倍超で維持すると予測された(図46)。150mg及び450mgの用量も同様の結果を示した(データは示さず)。同様に、シミュレート患者の90%超が、ADI-58125の肺間質液濃度をin vitro IC90の18倍超で6か月超維持すると予想された。シミュレート患者の90%超が、ADI-58125の濃度をin vitro IC50の500倍超で最低6か月間維持すると予想された。この閾値は、COVID-19ワクチンBNT62b1(Mulligan,2020)により35日目(2回目の接種から7日後)に観察された50%のSARS-CoV-2幾何平均力価に類似しており、このワクチンは最近、2回目の接種から7日後にCOVID-19の予防において90%超の有効性を達成したことが発表されている(Pfizer,2020)。
治療用の用量選択については、シミュレート患者の90%超が、600mg筋肉内(図47A)の単回用量または1時間にわたる1200mg静脈内(図47B)の単回用量の後、最低28日間、in vitro IC50の500倍超の血清中和抗体濃度及びin vitro IC50の100倍超の上下気道ELF濃度を維持すると予測された。これに対し、LY-CoV555レジメンは、患者の90%超においてわずか21日間in vitro IC50の500倍超の血清中和抗体濃度を維持し(図47C)、LY-CoV555もREGN10987レジメも、患者の90%超において21日目より後にはELF目標を維持しない(図47D)。
ADI-58125における選択された治療薬用量(600筋肉内及び1200mg静脈内)がウイルス動態に及ぼす影響をさらに、ベースラインウイルス負荷が高い対象(107コピー/mL超)において、REGN-COV2(カシリビマブ/イムデビマブ)2400mg静脈内と比較して評価した。ADI-58125 600mg筋肉内用量の効果の中央値は、1日の期間にわたってREGN-COV2レジメンの効果に近づき(図48A)、一方、ADI-58125 1200mg静脈内用量は、REGN-COV2レジメンの効果に一致した(図48B)。ADI-58125 600mg筋肉内及びADI-58125 1200mg静脈内がREGN-COV2レジメンで観察されたウイルス負荷の変化に一致する可能性を、各々の提唱される用量レベルごとに1000例の患者でシミュレーションした。ADI-58125 600mg筋肉内用量は、2日の期間にわたってREGN-COV2レジメンの効果の90%に近づき(図48C)、ADI-58125 1200mg静脈内用量は、直ちにREGN-COV2レジメンの効果に一致した(図48D)。600mg筋肉内用量において最大効果に到達するのが遅くなることが臨床転帰に影響を及ぼすかは不明であるが、このレジメンの最大効果のおよそ66%及び90%がそれぞれ12時間及び24時間までに達成されるという予測に注目することが重要である。さらに、筋肉内レジメンの試験は、COVID-19を有する自由行動下の患者のための外来設定において、投与が比較的容易であることを考慮すると、患者、医療従事者、及びヘルスケアシステムに対する一様な潜在的利益によってさらに支持される。
実施例36:健康な参加者におけるADI-58125の安全性、忍容性、及びPKを評価するための第1相無作為化二重盲検単回漸増用量試験
健康な参加者におけるADI-58125の安全性、忍容性、及び薬物動態を評価するために、第I相無作為化二重盲検単回漸増用量試験を設計する。
健康な参加者におけるADI-58125の安全性、忍容性、及び薬物動態を評価するために、第I相無作為化二重盲検単回漸増用量試験を設計する。
本試験は、約18~50歳の健康なボランティアを伴う。参加者を3つの用量コホート:300mg IM(筋肉内)、500mg IV(静脈内)、または600mg IMに分ける。各コホートは10例の参加者を含み、8例の個体に実薬処置を投与し、2例の個体にプラセボ対照を投与する。
実施例37:非臨床安全性試験
GLPラットの22日間反復用量試験において、注射部位の局所反応を含め、ADI-58125に関連する毒性所見は認められなかった。ADI-58125のヒト組織へのオフターゲット結合は、ヒト組織交差反応性IHC試験において観察されず、ラットを毒性評価のための適切な種として使用することが支持された。
GLPラットの22日間反復用量試験において、注射部位の局所反応を含め、ADI-58125に関連する毒性所見は認められなかった。ADI-58125のヒト組織へのオフターゲット結合は、ヒト組織交差反応性IHC試験において観察されず、ラットを毒性評価のための適切な種として使用することが支持された。
ヒト組織間反応性データ
免疫組織化学(IHC)染色法を使用して、ビオチン化試験物質Biotin-ADI-58125及び対照物質Biotin-562における、37種の異なる凍結正常ヒト組織パネルに対する結合活性を定量した。リン酸緩衝食塩水(PBS、0.1mol/L)を試薬対照とした。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ及び安定性ジアミノベンジジン(DAB)を発色に使用した。陽性対照細胞は200221_165_S9sh細胞(SARS-CoV-2スパイクタンパク質形質移入HEK293細胞)とし、陰性対照細胞は非形質移入HEK293細胞とした。方法開発及び検証試験の間、試験物質及び対照物質の両方をビオチン化した。凍結した正常ヒト組織を、抗CD31(抗内皮細胞)モノクローナル抗体染色によって検証した。
免疫組織化学(IHC)染色法を使用して、ビオチン化試験物質Biotin-ADI-58125及び対照物質Biotin-562における、37種の異なる凍結正常ヒト組織パネルに対する結合活性を定量した。リン酸緩衝食塩水(PBS、0.1mol/L)を試薬対照とした。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ及び安定性ジアミノベンジジン(DAB)を発色に使用した。陽性対照細胞は200221_165_S9sh細胞(SARS-CoV-2スパイクタンパク質形質移入HEK293細胞)とし、陰性対照細胞は非形質移入HEK293細胞とした。方法開発及び検証試験の間、試験物質及び対照物質の両方をビオチン化した。凍結した正常ヒト組織を、抗CD31(抗内皮細胞)モノクローナル抗体染色によって検証した。
ヒト凍結組織において特異的なビオチン-ADI-58125染色は観察されず、ビオチン-ADI-58125を用いたIHCによる陽性膜染色を有するヒト組織切片はなかった。そのため、ADI-58125の正常ヒト組織に対する交差反応性(オフターゲット結合)は認められなかった。
GLPラット毒性試験
170頭のSprague-Dawley(SD)ラット(雌雄各85頭)をランダムに4群に割り付けて、週1回(1、8、15、及び22日目)、静脈内注入(30もしくは300mg/kg)または筋肉内注射(30mg/kg)によって投与したときのADI-58125の毒性及び毒物動態を対照群と比較して定量した。300mg/kg静脈内、30mg/kg筋肉内、及び対照群から雌雄各5頭のラットを21日間の回復観察に割り付けた。予定された剖検を23日目(投与期)及び44日目(回復期)に実施した。評価基準には、生存能(罹患率及び死亡率)、臨床的観察、体重、摂餌量、臨床病理(血液学、血清化学、凝固、及び尿検査)、臓器重量、肉眼的観察結果、病理組織学評価、及びTKが含まれた。試験設計は、開始前にFDAの同意を得ていた。
170頭のSprague-Dawley(SD)ラット(雌雄各85頭)をランダムに4群に割り付けて、週1回(1、8、15、及び22日目)、静脈内注入(30もしくは300mg/kg)または筋肉内注射(30mg/kg)によって投与したときのADI-58125の毒性及び毒物動態を対照群と比較して定量した。300mg/kg静脈内、30mg/kg筋肉内、及び対照群から雌雄各5頭のラットを21日間の回復観察に割り付けた。予定された剖検を23日目(投与期)及び44日目(回復期)に実施した。評価基準には、生存能(罹患率及び死亡率)、臨床的観察、体重、摂餌量、臨床病理(血液学、血清化学、凝固、及び尿検査)、臓器重量、肉眼的観察結果、病理組織学評価、及びTKが含まれた。試験設計は、開始前にFDAの同意を得ていた。
最大300mg/kg/用量の静脈内注入または30mg/kg/用量の筋肉内注射により、ADI-58125を成体ラットに週1回22日間(合計4回用量)投与した結果、いかなる試験物質に関する死亡も有害事象ももたらされなかった。無毒性量(NOAEL)は、静脈内注入の場合300mg/kg/用量、筋肉内注射の場合30mg/kg/用量とみなした。
実施例38:前臨床PK/PD試験:非ヒト霊長類における非GLP薬物動態
非ヒト霊長類(NHP)における非GLP薬物動態試験を実施した。図49Aに示されているように、雌雄のカニクイザルにおいて、10mg/kgの用量でのADI-58125の静脈内注入または筋肉内注射を行った後のPKまたは平均血清濃度に性差は認められなかった。
非ヒト霊長類(NHP)における非GLP薬物動態試験を実施した。図49Aに示されているように、雌雄のカニクイザルにおいて、10mg/kgの用量でのADI-58125の静脈内注入または筋肉内注射を行った後のPKまたは平均血清濃度に性差は認められなかった。
薬物動態パラメーターを評価した。静脈内投与後は平均約473時間、筋肉内投与後は平均約533時間と長い半減期が確認され、生体利用能は約100%であった(図49B)。
実施例39:ADI-58122及びADI-58125が英国(B.1.1.7)、南アフリカ(B.1.351)、ブラジル(B.1.1.128)、及びB.1.429(南カリフォルニア)SARS-CoV-2のバリアントを強力に中和
ADI-58122とADI-58125についての中和アッセイを、上記のように英国(B.1.1.7)及び南アフリカ(B.1.351)SARS-CoV-2バリアントに対し実施した。図50A~50Cに示されているように、ADI-58122及びADI-58125はいずれも、英国(B.1.1.7)、南アフリカ(B.1.351、)及び/またはブラジル(P.1)SARS-CoV-2バリアントを0.05μg/mL未満のIC50で100%の中和プラトーで強力に中和する。これら2つの広範な中和物質は、英国株及び南アフリカ株に対する中和IC50値が、ほとんどのSARS-CoV-2のみの中和物質より低かった(図51)。
ADI-58122とADI-58125についての中和アッセイを、上記のように英国(B.1.1.7)及び南アフリカ(B.1.351)SARS-CoV-2バリアントに対し実施した。図50A~50Cに示されているように、ADI-58122及びADI-58125はいずれも、英国(B.1.1.7)、南アフリカ(B.1.351、)及び/またはブラジル(P.1)SARS-CoV-2バリアントを0.05μg/mL未満のIC50で100%の中和プラトーで強力に中和する。これら2つの広範な中和物質は、英国株及び南アフリカ株に対する中和IC50値が、ほとんどのSARS-CoV-2のみの中和物質より低かった(図51)。
ADI-58125の結合親和性についても、英国(B.1.1.7)及び南アフリカ(B.1.351)のSARS-CoV-2バリアントに加えて、ブラジルSARS-CoV-2バリアント(B.1.1.128)及び新たに出現した南カリフォルニアバリアント(B.1.429)に対し評価した。図52A及び52Bに示されているように、ADI-58125は、4つ全てのバリアントのRBDに対し高い結合親和性を保持し、一方他の抗体(例えば、LYCoV-555、LYCoV-016、及びREGN10933)は、バリアント(例えば、南アフリカバリアントまたは南カリフォルニアバリアント)のRBDへの結合における有効性が低かった。
実施例40:ハムスターにおけるin vivo有効性試験
ADI-58125の予防有効性をハムスターにおいてin vivoで評価した。簡潔に説明すると、5~6週齢の雌のシリアンハムスターに対し、1e5 pfuのSARS-2/WA-1による鼻腔内チャレンジを行う24時間前に、一連のADI-58125の用量(n=40;9.25~2000μg)または対照mAb(シャムアイソタイプマッチIgG)(n=20;9.25または2000μg)を腹腔内投与して、ADI-58125の予防的有効性を評価した(図53A)。ウイルスチャレンジの前に、血清抗体力価を測定した。ADI-58125の予防有効性をウイルス負荷(プラークアッセイ、ゲノムRT-PCR、サブゲノムRT-PCR)、体重、及び病理組織学的検査によって評価した。ハムスターの体重を6日間にわたって毎日計測した。3日目及び6日目に、抗体力価、ウイルス負荷、及び肺病理組織学的検査を評価した。
ADI-58125の予防有効性をハムスターにおいてin vivoで評価した。簡潔に説明すると、5~6週齢の雌のシリアンハムスターに対し、1e5 pfuのSARS-2/WA-1による鼻腔内チャレンジを行う24時間前に、一連のADI-58125の用量(n=40;9.25~2000μg)または対照mAb(シャムアイソタイプマッチIgG)(n=20;9.25または2000μg)を腹腔内投与して、ADI-58125の予防的有効性を評価した(図53A)。ウイルスチャレンジの前に、血清抗体力価を測定した。ADI-58125の予防有効性をウイルス負荷(プラークアッセイ、ゲノムRT-PCR、サブゲノムRT-PCR)、体重、及び病理組織学的検査によって評価した。ハムスターの体重を6日間にわたって毎日計測した。3日目及び6日目に、抗体力価、ウイルス負荷、及び肺病理組織学的検査を評価した。
図53Bに示されているように、ウイルス負荷におけるADI-58125用量依存的な減少が観察された。具体的には、最高用量(2000μg)を投与したハムスターは、肺試料内に検出可能なウイルスが認められなかった。同様の傾向か、ゲノムRNA及びサブゲノムRNAについても観察された(データは示さず)。55μg以上のADI-58125用量は、対照と比較して体重減少からの保護に関連性があり(図53C)、333及び2000μgの用量を投与したハムスターは、限定的な肺炎の病理組織学的証拠を示した(データは示さず)。これらのデータは、ADI-58125の予防的投与がハムスターモデルにおいて用量依存的なSARS-CoV-2感染からの保護をもたらすことを実証するものである。
実施例41:非ヒト霊長類におけるin vivo有効性試験
ADI-58125の予防有効性をさらに、非ヒト霊長類(NHP)においてin vivoで評価した。簡潔に説明すると、アカゲザル(チャレンジ時に3歳超;体重3~10kg;群当たり4頭)に対し、1e6 pfuのSARS-2/WA-1による鼻腔内/気管内チャレンジを行う3日前に、ADI-58125を5mg/kgもしくは25mg/kg(n=8)で、または対照mAb(25mg/kg、n=4)で静脈内投与して、ADI-58125の予防有効性を評価した(図54A)。ウイルスチャレンジの前に、血液試料を収集し、毎日の薬物動態試料及びウイルス(鼻咽頭、中咽頭(毎日)、及び気管支肺胞洗浄(1、3、及び5日目))を評価した。ADI-58125の予防有効性をウイルス負荷(プラークアッセイ、ゲノムRT-PCR、サブゲノムRT-PCR)、胸部放射線写真の臨床疾患、及び病理組織学的検査によって評価した。NHPモデルでは、ゲノムRNAのクリアランスの加速とサブゲノムRNAの不検出が、鼻咽頭及び気管支肺胞洗浄の両試料において20mg/kg用量で観察され、上下気道におけるウイルス複製に及ぼすADI-58125の有意な影響が実証された(図54B)。ハムスター及びNHPいずれの動物モデルにおいても、ADI-58125の任意の用量レベルでウイルス複製を増強する証拠が観察されなかった。これらのデータは、ADI-58125が、NHPモデルにおいて5~25mg/kgの用量範囲でSARS-CoV-2感染からの強力な保護をもたらすことを実証した。これらの結果は、ヒトにおけるCOVID-19の予防についてのADI-58125のさらなる検討を支持するものである。
ADI-58125の予防有効性をさらに、非ヒト霊長類(NHP)においてin vivoで評価した。簡潔に説明すると、アカゲザル(チャレンジ時に3歳超;体重3~10kg;群当たり4頭)に対し、1e6 pfuのSARS-2/WA-1による鼻腔内/気管内チャレンジを行う3日前に、ADI-58125を5mg/kgもしくは25mg/kg(n=8)で、または対照mAb(25mg/kg、n=4)で静脈内投与して、ADI-58125の予防有効性を評価した(図54A)。ウイルスチャレンジの前に、血液試料を収集し、毎日の薬物動態試料及びウイルス(鼻咽頭、中咽頭(毎日)、及び気管支肺胞洗浄(1、3、及び5日目))を評価した。ADI-58125の予防有効性をウイルス負荷(プラークアッセイ、ゲノムRT-PCR、サブゲノムRT-PCR)、胸部放射線写真の臨床疾患、及び病理組織学的検査によって評価した。NHPモデルでは、ゲノムRNAのクリアランスの加速とサブゲノムRNAの不検出が、鼻咽頭及び気管支肺胞洗浄の両試料において20mg/kg用量で観察され、上下気道におけるウイルス複製に及ぼすADI-58125の有意な影響が実証された(図54B)。ハムスター及びNHPいずれの動物モデルにおいても、ADI-58125の任意の用量レベルでウイルス複製を増強する証拠が観察されなかった。これらのデータは、ADI-58125が、NHPモデルにおいて5~25mg/kgの用量範囲でSARS-CoV-2感染からの強力な保護をもたらすことを実証した。これらの結果は、ヒトにおけるCOVID-19の予防についてのADI-58125のさらなる検討を支持するものである。
本発明を十分に説明し可能なものにしてきたが、本発明はさらに、以下の特許請求の範囲によって説明される。概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本開示を本明細書及び特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に限定するように解釈してはならない。したがって、本発明は、本開示によって限定されるものではなく、本発明の範囲は、もっぱら以下の特許請求の範囲によって定められるものとする。
本開示は、上記の説明及び実施例で詳細に説明した以外の方法でも実施することができる。本開示の多数の変更及び変形は、上記の教示の観点から可能であり、そのため、添付の特許請求の範囲内である。
Claims (46)
- コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号22302に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号22312に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号22302に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含むVHと、配列番号22312に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含むVLとを含む、請求項1に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1または請求項2に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記VHが、配列番号22304を含むVH相補性決定領域1(CDR1)、配列番号22306を含むVH相補性決定領域2(CDR2)、及び配列番号22308を含むVH相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記VLが、配列番号22314を含むVL CDR1、配列番号22316を含むVL CDR2、及び配列番号22318を含むVL CDR3を含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。 - コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号22304を含むVH CDR1、配列番号22306を含むVH CDR2、及び配列番号22308を含むVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号22314を含むVL CDR1、配列番号22316を含むVL CDR2、及び配列番号22318を含むVL CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが、配列番号22302に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、VLが、配列番号22312に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項4に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが、配列番号22302に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、VLが、配列番号22312に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項4または請求項5に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが配列番号22302を含み、前記VLが配列番号22312を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
重鎖可変領域(VH)であって、
配列ARDFSGHTAX1AGTGFEY(配列番号23209)(X1はWまたはVである)を有するVH CDR3、
配列SISX1DGYX2TYYPDSLKG(配列番号23208)(X1はSまたはEであり、X2はNまたはSである)を有するVH CDR2、及び
配列X1TFX2SYYX3X4(配列番号23206)(X1はFまたはYであり、X2はTまたはSであり、X3はMまたはIであり、X4はHまたはNである)を有するVH CDR1を含む、前記VHと、
軽鎖可変領域(VL)であって、
配列QSYDSSLSVLYX1(配列番号23214)(X1はTまたはVである)を有するVL CDR3、
配列GX1SSX2X3S(配列番号23212)(X1はSまたはAであり、X2はRまたはLであり、X3はN、H、またはQである)を有するVL CDR2、及び
配列TSGX1SNX2GAGYX3VH(配列番号23210)(X1はNまたはSであり、X2はIまたはVであり、X3はDまたはYである)を有するVL CDR1を含む、前記VLとを含む、前記単離抗体またはその抗原結合抗体フラグメント。 - コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
重鎖可変領域(VH)であって、配列VKDGGYYDSSGPGH(配列番号23218)を有するVH CDR3、配列AINLNGDSX1YYTDSVRG(配列番号23217)(X1はKまたはTである)を有するVH CDR2、及び配列FTFSX1X2AMH(配列番号23215)(X1はRまたはKであり、X2はFまたはYである)を有するVH CDR1を含む、前記VHと、
軽鎖可変領域(VL)であって、配列QQRX1NWPQN(配列番号23225)(X1はAまたはSである)を有するVL CDR3、配列DX1SX2RAT(配列番号23223)(X1はA、S、またはVであり、X2はKまたはRである)を有するVL CDR2、及び配列RASENIX1HYLA(配列番号23220)(X1はLまたはAである)を有するVL CDR1を含む、前記VLとを含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。 - コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域(VH)であって、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される抗体のVH CDR1、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVH CDR2、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVH CDR3を含む、前記VHと、軽鎖可変領域(VL)であって、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR1、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR2、及び図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR3を含む、前記VLとを含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記VHが、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体の前記VL配列に対し少なくとも90%の同一性を有する配列と、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体の前記VL配列に対し少なくとも90%の同一性を有するVL配列とを含む、請求項10に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- コロナウイルス(「CoV-S」)のスパイクタンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、図1及び図36に列挙された抗体からなる群より選択される抗体のVHタンパク質配列に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域(VH)と、図2に列挙された抗体のVLタンパク質配列に対し少なくとも90%の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項12に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記重鎖可変領域(VH)が、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVH CDR1、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVH CDR2、及び図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVH CDR3を含み、
軽鎖可変領域(VL)が、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR1、図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR2、及び図1、図2、または図36に列挙された抗体からなる群より選択される前記抗体のVL CDR3を含む、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記COV-Sが、SARS-CoVのスパイクタンパク質(「SARS-CoV-S」)またはSARS-CoV-2のスパイクタンパク質(「SARS-CoV-2-S」)である、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、SARS-CoV-S及びSARS-CoV-2-Sと交差反応する、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- SARS-CoV-Sが、配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、SARS-CoV-2-Sが、配列番号5のアミノ酸配列に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項14または請求項15に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- SARS-CoV-2-Sが、B.1.1.7バリアント、B.1.351バリアント、B.1.1.28バリアント、B.1.429バリアント、B.1.427バリアントまたはB.1.525バリアントである、請求項14~16のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2を中和する、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- SARS-CoV及び/またはSARS-CoV-2を約100nM以下のIC50で中和する、請求項18に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 約100nM以下のKD値でCoV-Sに結合する、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、ヒト型、ヒト化、霊長類化、キメラ、二重特異性、または多重特異性である、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記その抗原結合フラグメントが、Fab、Fab2、またはscFvを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントと結合に関して競合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 先行請求項のいずれか1項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 先行請求項のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬物とを含む、抗体薬物結合体(「ADC」)。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合部分を含む、キメラ抗原受容体(「CAR」)。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項26に記載のCARをコードする、単離核酸。
- 請求項27の単離核酸を含む、あるいは請求項1~24のいずれか1項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項26のCARを発現する、単離細胞。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載のADC、または請求項26に記載のCARを含む、組成物。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載のADC、または請求項26に記載のCARと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 第2の抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含み、前記第2の抗体またはその抗原結合フラグメントが、ADI-58122、ADI-58127、ADI-58129、またはADI-58131からなる群より選択される、請求項30に記載の医薬組成物。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体、請求項25に記載のADC、請求項26に記載のCAR、請求項29に記載の組成物、または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物と、使用説明書とを含む、キット。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項26に記載のCARを産生する方法であって、前記方法が、(a)前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前記CARを発現する細胞を、発現を可能にする条件下で培養することと、(b)前記細胞から、または前記細胞を含む培養基から、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前記CARを単離することとを含む、前記方法。
- 対象がSARS-CoVまたはSARS-CoV-2に感染しているかどうかを判定する方法であって、前記方法が、請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのうちの少なくとも1つとの免疫反応に基づき、前記対象からの生物学的試料がSARS-CoV-Sタンパク質またはSARS-CoV-2-Sタンパク質を含むかどうかを検出することを含む、前記方法。
- SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、前記方法が、請求項1~24のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載の少なくとも1つのADC、または請求項26に記載の少なくとも1つのCAR、または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスによる感受性細胞の感染を、それを必要とする対象において防止する方法であって、前記方法が、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項23に記載の少なくとも1つのADC、または請求項26に記載の少なくとも1つのCAR、または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスによる対象のコロナウイルス感染症を、それを必要としている対象において治療する方法であって、前記方法が、請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載の少なくとも1つのADC、または請求項26に記載の少なくとも1つのCAR、または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスによる対象の感染の症状を、それを必要としている対象において治療する方法であって、前記方法が、請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載の少なくとも1つのADC、または請求項26に記載の少なくとも1つのCAR、または請求項30もしくは請求項31に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記症状が、気管支炎、肺炎、呼吸不全、急性呼吸不全、臓器不全、多臓器系不全、小児多系統炎症性症候群、急性呼吸窮迫症候群、血栓、心臓状態、心筋障害、心筋炎、心不全、心停止、急性心筋梗塞、不整脈、静脈性血栓塞栓症、集中治療後症候群、ショック、アナフィラキシーショック、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、虚血性脳卒中、脳内出血、微小血管障害性血栓症、精神障害、痙攣、非痙攣性てんかん重積状態、外傷性脳損傷、脳卒中、無酸素性脳損傷、脳炎、可逆性白質脳症、壊死性脳症、感染後脳炎、自己免疫媒介性脳炎、急性散在性脳脊髄炎、急性腎損傷、急性肝損傷、膵損傷、免疫性血小板減少症、亜急性甲状腺炎、胃腸合併症、アスペルギルス症、別のウイルスもしくは細菌への感受性増加、及び/または妊娠関連合併症、のうちの少なくとも1つを含む、請求項38に記載の方法。
- SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E、及びHCoV-NL63からなる群より選択される別のコロナウイルスに感染した対象の死亡率、入院、機械的換気、またはこれらの組合せのリスクを減少させる方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項1~24のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項25に記載のADC、または請求項26に記載のCARの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項34~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記対象を不良な臨床転帰に陥りやすくする少なくとも1つのリスク因子を有する、請求項34~41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのリスク因子が、55歳超、60歳超、または65歳超からなる群より選択される高齢、糖尿病、慢性呼吸器状態、肥満、高血圧、心臓または心血管状態、慢性炎症または自己免疫状態、及び免疫低下状態からなる群より選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、筋肉内または静脈内に投与される、請求項34~43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、約100mg~約2000mg、約200mg~約1500mg、約300mg~約600mg、約500mg~約1200mg、または約300mg~約1200mgの用量で投与される、請求項34~44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが1回投与されるか、または週1回投与される、請求項34~45のいずれか1項に記載の方法。
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