TW202405000A

TW202405000A - Sars-cov2抗體及其用途

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Publication number: TW202405000A
Application number: TW112112742A
Authority: TW
Inventors: 勞拉沃克; 城西Ｉ卡庫
Original assignee: 美商英維德公司
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2023-04-01
Publication date: 2024-02-01
Also published as: WO2023193017A2; WO2023193017A3

Abstract

本發明係關於對冠狀病毒S蛋白(CoV-S)，諸如SARS冠狀病毒2 S蛋白(SARS-CoV-2-S)具有結合特異性的抗體及其抗原結合片段，包括中和抗體。該等抗體及其抗原結合片段包含本文所描述之VH、VL及CDR多肽之序列及編碼其等之聚核苷酸。本發明考慮與一或多種功能性或可偵測部分結合之抗CoV-S抗體及其結合片段之結合物。亦考慮製造該等抗CoV-S抗體及其抗原結合片段之方法。本發明之其他實施例考慮使用抗CoV-S抗體及其結合片段用於診斷、評估及治療與冠狀病毒或其S蛋白相關之疾病及病症，以及可因中和或抑制冠狀病毒或其S蛋白而在治療上受益之病狀。

Description

SARS-COV2抗體及其用途

本發明大體上係關於抗體及其抗原結合片段，較佳人類抗體及其抗原結合片段及/或親和力成熟之變異體、經工程改造以表現此類抗體之重組細胞及含有此類抗體及其抗原結合片段的組合物，其中此類抗體及其抗原結合片段結合至冠狀病毒S蛋白(「CoV-S」)；以及該等抗體、其抗原結合片段及組合物的治療及診斷用途。

冠狀病毒(「CoV」)在基因上分為四個主要屬：α冠狀病毒( Alphacoronavirus)屬(ACoV屬)；β冠狀病毒( Betacoronavirus)屬(BCoV屬)；γ冠狀病毒( Gammacoronavirus)屬(CCoV屬)；及δ冠狀病毒( Deltacoronavirus)屬(DCoV屬)，且ACoV及BCoV主要感染哺乳動物，而CCoV及DCoV主要感染鳥類(Wu A.等人，Cell Host Microbe.2020年3月11日; 27(3):325-328)。在1960年代中期首次鑑別出感染人類的冠狀病毒，且目前，已知有七個確定之CoV物種為人類病原體。四個CoV物種，亦即來自BCoV屬之HCoV-HKU1及HCoV-OC43以及來自ACoV屬之HCoV-229E及HCoV-NL63為人類之特有物種，且主要在小兒科患者中引起輕度呼吸系統症狀(Brielle E.S.等人，BioRxiv翻印, 2020.03.10)。其他三個人類CoV物種，亦即SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2 (亦稱為「2019-nCoV」)，皆來自BCoV屬，已引起嚴重爆發，包括2002-2003年之嚴重急性呼吸症候群(SARS)爆發、2012-2013年之中東呼吸症候群(MERS)爆發及當前(2019年-)之2019冠狀病毒病(「COVID-19」)大流行。

冠狀病毒之基因體的大小在大約26,000與32,000個鹼基之間之範圍內，包括可變數目(6至11)個開放閱讀框架(「ORF」) (Wu A.等人，Cell Host Microbe. 2020; 27(3):325-328)。第一個ORF編碼16種非結構蛋白(「nsp」)，且其餘ORF編碼輔助蛋白及結構蛋白。四種主要結構蛋白為棘表面醣蛋白(「S蛋白」或「S」或「棘蛋白」)、小包膜蛋白(「E蛋白」或「E」)、基質蛋白(「M蛋白」或「M」)及核殼體蛋白(「N蛋白」或「N」)。

S蛋白在結合至宿主細胞上之受體方面起重要作用且決定宿主向性(Zhu Z.等人，Infect Genet Evol. 2018; 61:183-184)，形成自病毒表面突出之同三聚體(Li F. Annu Rev Virol.2016年9月29日;3(1):237-261.電子版2016年8月25日)。S蛋白被加工成兩個非共價締合之次單元S1及S2，且三聚S組裝體中之各單體為S1及S2次單元之異二聚體。冷凍電鏡(Cryo-EM)研究揭露，S1次單元包含四個域：N端域(NTD)、C端域(CTD)及兩個子域(Walls A. C.等人， Nature531, 114-117 (2016).; Tortorici M. A.及Veesler D., Adv Virus Res. 2019;105:93-116. doi: 10.1016/bs.aivir.2019.08.002. 電子版2019年8月22日.; Wrapp D.等人， Science367, 1260-1263 (2020))。CTD充當SARS-CoV及SARS-CoV-2兩者之受體結合域(RBD) (Li F. J Virol. 2015年2月;89(4):1954-64. doi: 10.1128/JVI.02615-14. 電子版2014年11月26日)。S2次單元含有融合肽、七肽重複區1及2以及跨膜域，其皆為介導病毒與宿主細胞膜之融合所需的。

SARS-CoV及SARS-CoV-2結合至宿主細胞之血管收縮素轉化酶2 (ACE2)且使用其作為受體來進入宿主細胞(Ge X.Y.等人，Nature. 2013年11月28日;503(7477):535-8; Hoffmann M.等人，Cell. 2020年3月4日)。RBD內特定地結合至RCE2之模體通常稱為「ACE2結合模體」。SARS-CoV亦可使用CD209L (亦稱為L-SIGN)作為替代受體(Jeffers S. A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2004年11月2日;101(44):15748-53. 電子版2004年10月20日)。相比之下，MERS-CoV經由S蛋白之不同RBD結合宿主細胞之二肽基肽酶4 (「DPP4」，亦稱為CD26)。

冠狀病毒之細胞進入通常亦取決於宿主細胞蛋白酶對S蛋白之激活(priming)。近來，已發現SARS-CoV-2使用絲胺酸蛋白酶TMPRSS2進行S蛋白激活且使用ACE2以進入(Wu A.等人，Cell Host Microbe. 2020;27(3):325-328; Hoffmann M.等人，Cell. 2020年3月4日)。

SARS-CoV-2之基因體係約29.8 kb核苷酸且編碼15種非結構蛋白，四種結構蛋白(S、E、M及N)及八種輔助蛋白(3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b及orf14) (Wu A.等人，Cell Host Microbe. 2020年3月11日;27(3):325-328)。雖然SARS-CoV-2在基因上接近類SARS蝙蝠CoV以及SARS-CoV，但已鑑別出許多序列差異。當將SARS-CoV-2與SARS-CoV或SARS樣蝙蝠CoV相比較時，發現380個胺基酸差異或取代，其中有27個在S蛋白質中，包括在RBD中之胺基酸區357-528處(但不在與ACE2直接相互作用的受體結合模體中)的6個取代以及在基礎子域(SD)中之胺基酸區569-655處的6個取代。

自COVID爆發以來，已產生SARS-CoV-2之多種變異體。其中，奧密克戎(Omicron，ο)變異體為具有大量突變之高度分化變異體，包括棘蛋白中之26至32個突變，其中一些與體液免疫逃脫潛能及較高傳播性相關。ο為傳播速度快得多的一種變異體，其自2021年11月25日之第一例報導增長到創紀錄的已經係δ之水平若干倍的全球病例激增。此外，ο導致完全疫苗接種個體中的突破性感染增加。因此，疫苗接種及先前感染提供之保護大大降低。

因此，存在對用於治療SAR-CoV-2、尤其ο變異體之新治療，例如抗體的研發之未滿足需求。

本發明係基於針對迄今所描述之所有SARS-CoV-2關注變異體(VOC)具有廣泛活性的抗體之發現。特定言之，所揭示之抗體自ο/BA.1突破性感染供體分離且顯示出針對所有SARS-CoV-2 VOC，包括ο變異體BA.1及其子譜系，例如BF.7、BQ.1.1、BA.2.75及/或XBB.1呈現廣泛活性。此等抗體代表用於治療性研發之有前景的候選物且提供用於研發誘導廣泛中和抗體反應之疫苗的構架。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表3及表5中任一VH序列組成之群的胺基酸序列，及其中該VL包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表4及表6中任一VL序列組成之群的胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL來自表3至表6中之相同抗體。在另一實施例中，VH及VL來自表3至表6中之不同抗體。

在一些實施例中，該VH包含選自由表3及表5中之任何VH CDR1序列組成之群的VH CDR1胺基酸序列、選自由表3及表5中之任何VH CDR2序列組成之群的VH CDR2胺基酸序列，及選自由表3及表5中之任何VH CDR3序列組成之群的VH CDR3胺基酸序列，及該VL包含選自由表4及表6中之任何VL CDR1序列組成之群的VL CDR1胺基酸序列、選自由表4及表6中之任何VL CDR2序列組成之群的VL CDR2胺基酸序列，及選自由表4及表6中之任何VL CDR3序列組成之群的VL CDR3胺基酸序列。在一個實施例中，CDR來自表3至表6中之相同抗體。在另一實施例中，CDR來自表3至表6中之不同抗體。

在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含選自由表3及表5中之任何VH CDR1序列組成之群的VH CDR1胺基酸序列、選自由表3及表5中之任何VH CDR2序列組成之群的VH CDR2胺基酸序列，及選自由表3及表5中之任何VH CDR3序列組成之群的VH CDR3胺基酸序列，及其中該VL包含選自由表4及表6中之任何VL CDR1序列組成之群的VL CDR1胺基酸序列、選自由表4及表6中之任何VL CDR2序列組成之群的VL CDR2胺基酸序列，及選自由表4及表6中之任何VL CDR3序列組成之群的VL CDR3胺基酸序列。

在一些實施例中，該VH包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表3及表5中任一VH序列組成之群的胺基酸序列，及該VL包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表4及表6中任一VL序列組成之群的胺基酸序列。

在一些實施例中，VH包含ADI-75738之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75738之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75700之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75700之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75859之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75859之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75684之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75684之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75754之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75754之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75648之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75648之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75632之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75632之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75741之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75741之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75725之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75725之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75717之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75717之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75706之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75706之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75699之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75699之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75747之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75747之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75773之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75773之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75696之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75696之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含VYD223 (亦稱為ADI-75865)之VH胺基酸序列，且VL包含VYD223之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含VYD224 (亦稱為ADI-80707)之VH胺基酸序列，且VL包含VYD224之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75864之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75864之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含ADI-75620之VH胺基酸序列，且VL包含ADI-75620之VL胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含VYD225之VH胺基酸序列，且VL包含VYD225之VL胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75738之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75700之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75859之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75684之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75754之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75648之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75632之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75741之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75725之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75717之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75706之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75699之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75747之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75773之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75696之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75864之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含ADI-75620之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含VYD223之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含VYD224之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗體結合片段包含VYD225之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。

在一些實施例中，SARS-CoV-S包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少95%一致性的序列，且其中SARS-CoV-2-S包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列具有至少95%一致性的序列。

在一些實施例中，經分離抗體或其抗原結合片段與SARS-CoV-S及SARS-CoV-2-S交叉反應。

在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段能夠結合至SARS-CoV-2變異體。在一些實施例中，SARS-CoV-2-S為B.1.1.7變異體(α)、B. 1.351變異體(β)、B.1.1.28變異體、B. 1.429變異體、P.1變異體、B.1.617變異體(例如B.1.617.1及B.1.617.2 (δ))、C.37變異體、1.621變異體、AY.1變異體、1.623變異體、C.36變異體、A.27變異體、AV.1變異體、B.1.1.482變異體、B.1.1.523變異體、B.1.427變異體、AY.4變異體、AY.11變異體、D614G變異體或B.1.1.529/BA.1變異體(亦稱為ο變異體)或其子譜系(例如BA1.1、BA.2、BA.2.75、BA.4、BA.5、BA.4.6、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1、XBB.1.5、BJ.1、BM.1.1.1、BA.2.3.20、BF.7、XBC、BN.1或CH.1.1)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與SARS-CoV-S及SARS-CoV-2-S交叉反應。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之受體結合域(RBD)或N端域(NTD)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段結合至來自該B.1.1.529/BA.1變異體、該BA.1.1變異體、該BA.2.75變異體、該BQ.1.1變異體及/或該XBB變異體之CoV-S之受體結合域(RBD)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之S1次單元及/或S2次單元。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之ACE2結合模體。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段與ACE2競爭。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段(a)結合至SARS-CoV及/或SARS-CoV-2之S蛋白；及(b)不結合至HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63及HCoV-OC43之任何S蛋白。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段(a)結合至SARS-CoV及/或SARS-CoV-2之S蛋白；及(b)結合至HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63及HCoV-OC43中之至少一者的S蛋白。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段以以下KD值結合至CoV-S：(i)約100 nM或更低；(ii)約10 nM或更低；(iii)約1 nM或更低；(iv)約100 pM或更低；(v)約10 pM或更低；(vi)約1 pM或更低；或(vii)約0.1 pM或更低。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低、或約10 nM或更低、或約1 nM或更低之KD值，結合至來自B.1.1.529/BA.1變異體、BA.1.1變異體、BA.2.75變異體、BQ.1.1變異體、XBB變異體、B.1351變異體或B.1.617.2變異體之CoV-S之受體結合域(RBD)。

在一些實施例中，解離常數(KD)使用選自由以下組成之群的分析來量測：表面電漿子共振、ELISA、放射免疫分析、西方墨點法(Western blotting)及生物膜層干涉術(BLI)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段中和SARS-CoV及/或SARS-CoV-2。在一些實施例中，中和活性使用基於VSV之假病毒系統來量測。在一些實施例中，中和活性使用基於鼠類白血病病毒(MLV)之假病毒系統來量測。在一些實施例中，中和活性使用PhenoSense SARS-CoV-2假病毒中和分析量測。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以以下活體外中和SARS-CoV及/或SARS-CoV-2：(i)約100 nM或更低、約50 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約500 pM或更低、約200 pM或更低、約100 pM或更低、約50 pM或更低、約20 pM或更低、約10 pM或更低、約5 pM或更低、約2 pM或更低或約1 pM或更低之IC50；及/或(ii)約1 μg/mL或更低、約500 ng/mL或更低、約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以小於約1 μg/mL之中和IC50交叉中和VSV-SARS-CoV-1及VSV-SARS-CoV-2。在一些實施例中，中和活性使用基於VSV之假病毒系統來量測。在一些實施例中，中和活性使用基於鼠類白血病病毒(MLV)之假病毒系統來量測。在一些實施例中，中和活性使用PhenoSense SARS-CoV-2假病毒中和分析量測。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，活體外中和SARS-CoV-2之B.1.1.529/BA.1變異體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約60 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之B.1.1.529/BA.1變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，活體外中和SARS-CoV-2之BA.2.75變異體、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、XBB.1變異體及/或XBB.1.5變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約40 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之BA.2.75變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約30 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之BF.7變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約50 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之BQ.1.1變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約200 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之XBB.1變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，活體外中和SARS-CoV-2之D614G變異體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約20 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之D614G變異體。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為人類、人源化、靈長類化或嵌合抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為雙特異性或多特異性的。在一些實施例中，該雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段包含至少一個第一抗原結合域(「ABD」)及至少一個第二ABD，其中：(i)該第一ABD包含選自表3至表6之第一抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；及(ii)該第二ABD包含選自表3至表6之第二抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中第一抗CoV-S抗體與第二抗CoV-S抗體相同，或其中該第一抗CoV-S抗體與該第二抗CoV-S抗體不同。

在一些實施例中，第一抗CoV-S抗體結合至第一CoV-S，且第二抗CoV-S抗體結合至第二CoV-S。

在一些實施例中，第一抗CoV-S抗體及第二抗CoV-S抗體結合至：(i)相同冠狀病毒物種，視情況其中該第一CoV-S及該第二CoV-S (a)皆屬於SARS-CoV或(b)皆屬於SARS-CoV-2，且視情況其中該第一抗CoV-S抗體及該第二抗CoV-S抗體結合至由該SARS-CoV或SARS-CoV-2表現之CoV-S上的相同或不同抗原決定基；或(ii)不同冠狀病毒物種，視情況其中該第一CoV-S及該第二CoV-S (a)分別屬於SARS-CoV及SARS-CoV-2，或(b)分別屬於SARS-CoV-2及SARS-CoV。

在一些實施例中，該雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段包含至少一個第一抗原結合域(「ABD」)及至少一個第二ABD，其中：(a)該第一ABD包含選自表3至表6之第一抗CoV-S抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；及(b)該第二ABD結合至不為CoV-S之抗原，視情況其中該抗原為細胞介素、細胞介素受體或免疫調節多肽。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含Fab、Fab2或scFv。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含恆定區、Fc區或其至少一個域。

在一些實施例中，恆定區或Fc區包含削弱至少一種效應功能之突變，該至少一種效應功能視情況為FcR結合、補體結合、醣基化、補體依賴性細胞毒性(「CDC」)或抗體依賴性細胞毒性(「ADCC」)。

在一些實施例中，恆定區或Fc區為人類的。在一些實施例中，人類恆定區或Fc區選自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區或Fc區。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段為中和抗體。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段為親和力最佳化抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，其與如本文所描述之經分離抗體或其抗原結合片段競爭結合。

在一些實施例中，結合競爭使用選自由以下組成之群的分析來量測：表面電漿子共振、ELISA、放射免疫分析、西方墨點法及生物膜層干涉術(BLI)。

在一個態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，其與如本文所描述之經分離抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基。

在一些實施例中，抗原決定基定位使用選自由以下組成之群的分析來確定：表面電漿子共振、ELISA、放射免疫分析、西方墨點法及生物膜層干涉術(BLI)。

在另一態樣中，本發明提供一種如本文所描述之經分離抗體或其抗原結合片段中之任一者的親和力成熟變異體。

在一個態樣中，本發明提供一種核酸分子，例如DNA或mRNA分子，其編碼如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種嵌合抗原受體(「CAR」)，其包含至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種抗體藥物結合物(「ADC」)，其包含：(a)至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段；及(b)藥物。

在一些實施例中，藥物為：(i)抗病毒藥，視情況為瑞德西韋(remdesivir)、法匹拉韋(favipiravir)、達盧那韋(darunavir)、奈非那韋(nelfinavir)、沙奎那韋(saquinavir)、洛匹那韋(lopinavir)或利托那韋(ritonavir)；(ii)抗蠕蟲藥，視情況為伊維菌素(ivermectin)；(iii)抗寄生蟲藥，視情況為羥氯喹(hydroxychloroquine)、氯喹(chloroquine)或阿托喹酮(atovaquone)；(iv)抗細菌疫苗，視情況為肺結核疫苗BCG；或(v)消炎藥，視情況為類固醇，諸如環索奈德(ciclesonide)、TNF抑制劑(例如阿達木單抗(adalimumab))、TNF受體抑制劑(例如依那西普(etanercept))、IL-6抑制劑(例如克拉紮珠單抗(clazakizumab))、IL-6受體抑制劑(例如托珠單抗(toclizumab))或安乃近(metamizole)；(vi)抗組織胺藥，視情況為貝他斯汀(bepotastine)；(vii) ACE抑制劑，視情況為莫西普利(moexipril)；(viii)抑制CoV-S之激活的藥物，視情況為絲胺酸蛋白酶抑制劑，進一步視情況為萘莫司他(nafamostat)；或(ix)細胞毒性藥物，視情況為道諾黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、小紅莓(doxorubicin)、葫蘆素(cucurbitacin)、毛殼素(chaetocin)、球毛殼菌素(chaetoglobosin)、克林黴素(chlamydocin)、卡奇黴素(calicheamicin)、奈莫柔黴素(nemorubicin)、念珠藻素(cryptophyscin)、蒙薩卡星(mensacarcin)、安絲菌素(ansamitocin)、絲裂黴素(mitomycin) C、格爾德黴素(geldanamycin)、米徹黴素(mechercharmycin)、蝴蝶黴素(rebeccamycin)、番紅菌素(safracin)、沖酯黴素(okilactomycin)、寡黴素(oligomycin)、放線菌素(actinomycin)、山卓黴素(sandramycin)、寄端黴素(hypothemycin)、聚酮黴素(polyketomycin)、羥基玫瑰樹鹼(hydroxyellipticine)、硫代秋水仙鹼(thiocolchicine)、甲胺喋呤(methotrexate)、雷公藤內酯(triptolide)、他托布林(taltobulin)、乳胞素(lactacystin)、海兔毒素(dolastatin)、奧瑞他汀(auristatin)、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、特羅他汀(telomestatin)、妥巴他汀(tubastatin) A、康普瑞汀(combretastatin)、類美登素(maytansinoid)、MMAD、MMAF、DM1、DM4、DTT、16-GMB-APA-GA、17-DMAP-GA、JW 55、吡咯并苯并二氮呯、SN-38、Ro 5-3335、普瓦那黴素(puwainaphycin)、倍癌黴素(duocarmycin)、巴弗洛黴素(bafilomycin)、類紫杉醇(taxoid)、妥布賴森(tubulysin)、阿魏醇(ferulenol)、魯索爾(lusiol) A、煙黴素(fumagillin)、吸水菌酯素(hygrolidin)、殺粉蝶黴素葡萄糖苷(glucopiericidin)、瓢菌素(amanitin)、安三烯菌素(ansatrienin)、燼灰紅菌素(cinerubin)、類鬼筆環肽(phallacidin)、鬼筆環肽(phalloidin)、植物鞘胺醇(phytosphongosine)、殺粉蝶黴素(piericidin)、普洛尼汀(poronetin)、鬼臼毒素(phodophyllotoxin)、短桿菌素(gramicidin) A、血根鹼(sanguinarine)、西奈芬淨(sinefungin)、荷伯希二烯(herboxidiene)、微鞘藻素(microcolin) B、微囊藻素(microcystin)、黏胞毒素(muscotoxin) A、單歧藻毒素(tolytoxin)、曲普林(tripolin) A、肌基質蛋白(myoseverin)、黴菌毒素(mytoxin) B、諾措林(nocuolin) A、土荊皮酸(psuedolaric acid) B、偽神經素(pseurotin) A、環巴胺(cyclopamine)、紅麴黃素(curvulin)、秋水仙鹼(colchicine)、阿非迪黴素(aphidicolin)、恩格爾林(englerin)、蛹蟲草菌素(cordycepin)、凋亡蛋白(apoptolidin)、埃坡黴素(epothilone) A、利馬醌(limaquinone)、異卓酚酮(isatropolone)、艾索妥拉林(isofistularin)、喹哪朵肽(quinaldopeptin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、艾洛普辛(aeroplysinin)、銅綠菌素(arruginosin)、農桿菌素(agrochelin)或埃坡黴素。

在一個態樣中，本發明提供一種組合物，其包含至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。在一個實施例中，組合物進一步包含另一抗SARS-COV-S抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一個實施例中，醫藥組合物進一步包含另一抗SARS-COV-S抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種治療方法，其在有需要之個體中治療SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，或治療與該感染相關之病狀、症狀、疾病或病症，該方法包含向該個體投與治療有效量之如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一些實施例中，該病狀、症狀、疾病或病症包含以下中之至少一者：支氣管炎、肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸衰竭、器官衰竭、多器官系統衰竭、小兒科發炎性多系統症候群、急性呼吸窘迫症候群、血栓、心臟病狀、心肌損傷、心肌炎、心衰竭、心跳停止、急性心肌梗塞、心律不整、靜脈血栓栓塞、加護後症候群、休克、過敏性休克、細胞介素釋放症候群、敗血性休克、散播性血管內凝血、缺血性中風、腦內出血、微血管病性血栓形成、精神病、癲癇、非驚厥性癲癇持續狀態、創傷性腦損傷、中風、缺氧性腦損傷、腦炎、可逆性後部白質腦病、壞死性腦病、感染後腦炎、自體免疫介導之腦炎、急性散播性腦脊髓炎、急性腎損傷、急性肝損傷、胰損傷、免疫性血小板減少症、亞急性甲狀腺炎、胃腸併發症、麴黴病、對另一病毒或細菌感染之易感性增加及/或妊娠相關併發症。

在一個態樣中，本發明提供一種預防方法，其在有需要之個體中預防SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，該方法包含向該個體投與預防有效量之如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一個態樣中，本發明提供一種誘導方法，其在有需要之個體中誘導針對SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之免疫反應，該方法包含投與至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一些實施例中，免疫反應引發針對SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或另一冠狀病毒之免疫保護。

在一個態樣中，本發明提供一種抑制或阻斷方法，其在有需要之個體中抑制或阻斷易感細胞之SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒感染，該方法包含投與至少一種如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一個態樣中，本文提供一種防止方法，其防止感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體需要戴上呼吸器，或減少感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體戴上呼吸器之時間，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一個態樣中，本文提供一種預防或治療方法，其預防感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體的肺炎發作，或針對感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體治療個體之肺炎及/或肺炎症狀，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如本文所描述之抗體或其抗原結合片段、CAR或ADC。

在一些實施例中，個體為人類個體。

在一些實施例中，個體免疫功能不全。在一些實施例中，個體處於暴露於SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或另一種冠狀病毒的風險下。在一些實施例中，個體具有至少一個使其更易於出現不良臨床結果之風險因素。在一些實施例中，該至少一個風險因素為以下中之一或多者：(i)高齡，諸如超過55歲、60歲或65歲；(ii)糖尿病；(iii)慢性呼吸病狀，諸如哮喘、囊腫性纖維化、另一纖維化病狀及COPD；(iv)肥胖；(iv)高血壓；(v)心臟或心血管病狀，諸如心臟缺陷或異常；(vi)慢性發炎性或自體免疫病狀，諸如狼瘡及多發性硬化；及(vii)免疫功能不全狀態，其可由癌症、正在進行之化學療法、吸菸、骨髓或器官移植、免疫缺乏症、控制不良之HIV感染或AIDS或長期使用皮質類固醇或其他免疫抑制藥品引起。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與另外至少一種抗CoV-S抗體或抗原結合片段組合投與。在一個實施例中，投與係同時的。在一個實施例中，投與係依序的。在一些實施例中，額外的抗CoV-S抗體或抗原結合片段為艾定韋單抗(adintrevimab)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以單次劑量投與。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段係靜脈內投與。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係經由靜脈內(IV)推注(push)投與。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段係經由IV快速推注(bolus)投與。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段係經由IV輸注投與。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段經肌肉內投與。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以以下劑量投與：約100 mg至5000 mg、約100 mg至4500 mg、約100 mg至4000 mg、約100 mg至約3500 mg、約100 mg至約3000 mg、約100 mg至約2500 mg、約100 mg至約2000 mg、約200 mg至約1500 mg、約300 mg至約600 mg、約500 mg至約1200 mg、約300 mg至約1200 mg、約500至約1000 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1500 mg至約2000 mg、約2000 mg至約2500 mg、約2500 mg至約3000 mg、約3000 mg至約3500 mg、約3500 mg至約4000 mg、約4000至約4500 mg或約4500 mg至約5000 mg。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以以下劑量投與：約200 mg、約300 mg、約400 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、約1000 mg、約1100 mg、約1200 mg、約1300 mg、約1400 mg、約1500 mg、約1600 mg、約1700 mg、約1800 mg、約1900 mg、約2000 mg、約2100 mg、約2200 mg、約2300 mg、約2400 mg、約2500 mg、約2600 mg、約2700 mg、約2800 mg、約2900 mg、約3000 mg、約3100 mg、約3200 mg、約3300 mg、約3400 mg、約3500 mg、約3600 mg、約3700 mg、約3800 mg、約3900 mg、約4000 mg、約4100 mg、約4200 mg、約4300 mg、約4400 mg、約4500 mg、約4600 mg、約4700 mg、約4800 mg、約4900 mg或約5000 mg。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係投與一次。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係投與兩次。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係每週投與。在另一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係每天、每週、每兩週、每月或每兩個月投與。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段係每週投與，持續約四週；每週一次投與，持續約一個月；每週投與，持續約5週；每週投與，持續約6週；每週投與，持續約7週；或每週投與，持續約兩個月；或每週投與，持續約三個月。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段每月投與，持續約一個月；每月投與，持續約兩個月；每月投與，持續約三個月；或每月投與，持續約四個月。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段在前一個月、前兩個月、前三個月、前四個月或前五個月內投與一次，或多次，例如兩次、三次、四次或五次。

在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段以每二十六週或更短一次，諸如每十六週或更短一次、每八週或更短一次、每四週或更短一次、每兩週或更短一次、每週或更短一次或每天或更短一次的頻率向接受個體投與。

抗體或其抗原結合片段可每年或更短、每6個月或更短、每三個月或更短、每一個月或更短、每兩週或更短、每週或更短、每天或更短一次、每天多次及/或每幾小時投與。在一個實施例中，每月、每2個月、每3個月、每4個月、每5個月、每6個月、每7個月、每八個月、每9個月、每10個月、每11個月或一年一次投藥。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與一或多種另外抗CoV-S-抗體組合投與。

在一個態樣中，本發明提供一種產生如本文所描述之抗體或其抗原結合部分的方法，該方法包含在重組細胞中表現抗體或其抗原結合部分，及自細胞分離抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，該方法進一步包含將自細胞分離之抗體或其抗原結合部分調配成醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種抗體庫，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)的經分離抗體或其抗原結合片段，其中該等抗體或其抗原結合片段各自包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中各VH由選自由表3及表5中之任一VH序列組成之群的胺基酸序列組成，及其中各VL由選自由表4及表6中之任一VL序列組成之群的胺基酸序列組成。

在一個態樣中，本發明提供一種組合物，其包含兩種或更多種經分離抗體或其抗原結合片段，其中該等抗體或其抗原結合片段各自包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中各VH由選自由表3及表5中之任一VH序列組成之群的胺基酸序列組成，及其中各VL由選自由表4及表6中之任一VL序列組成之群的胺基酸序列組成。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含兩種或更多種選自由VYD223、VYD224及VYD225組成之群的經分離抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，組合物包含VYD224及VYD225。

在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之組合物及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

在另一態樣中，本發明提供一種治療方法，其在有需要之個體中治療SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，或治療與該感染相關之病狀、症狀、疾病或病症，該方法包含向該個體投與治療有效量之如本文所描述之組合物或醫藥組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種預防方法，其在有需要之個體中預防SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，該方法包含向該個體投與預防有效量之如本文所描述之組合物或醫藥組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種誘導方法，其在有需要之個體中誘導針對SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之免疫反應，該方法包含投與如本文所描述之本發明組合物或醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種抑制或阻斷方法，其在有需要之個體中抑制或阻斷易感細胞之SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒感染，該方法包含投與如本文所描述之本發明組合物或醫藥組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種防止方法，其防止感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體需要戴上呼吸器，或減少感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體戴上呼吸器之時間，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如本文所描述之本發明組合物或醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種預防或治療方法，其預防感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體的肺炎發作，或針對感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體治療個體之肺炎及/或肺炎症狀，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如本文所描述之本發明組合物或醫藥組合物。

在一些實施例中，個體為人類個體。

在一些實施例中，個體免疫功能不全。

在一些實施例中，個體處於暴露於SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或另一種冠狀病毒的風險下。

在一些實施例中，個體具有至少一個使其更易於出現不良臨床結果之風險因素。

在一些實施例中，該至少一個風險因素為以下中之一或多者：(i)高齡，諸如超過55歲、60歲或65歲；(ii)糖尿病；(iii)慢性呼吸病狀，諸如哮喘、囊腫性纖維化、另一纖維化病狀及COPD；(iv)肥胖；(iv)高血壓；(v)心臟或心血管病狀，諸如心臟缺陷或異常；(vi)慢性發炎性或自體免疫病狀，諸如狼瘡及多發性硬化；及(vii)免疫功能不全狀態，其可由癌症、正在進行之化學療法、吸菸、骨髓或器官移植、免疫缺乏症、控制不良之HIV感染或AIDS或長期使用皮質類固醇或其他免疫抑制藥品引起。

在一些實施例中，組合物係靜脈內或肌肉內投與。在一個實施例中，組合物經由IV推注投與。在另一實施例中，組合物經由IV快速推注投與。

在一些實施例中，組合物以以下劑量投與：約100 mg至約5000 mg、約100 mg至4500 mg、約100 mg至4000 mg、約100 mg至約3500 mg、約100 mg至約3000 mg、約100 mg至約2500 mg、約100 mg至約2000 mg、約200 mg至約1500 mg、約300 mg至約600 mg、約500 mg至約1200 mg、約300 mg至約1200 mg、約500至約1000 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1500 mg至約2000 mg、約2000 mg至約2500 mg、約2500 mg至約3000 mg、約3000 mg至約3500 mg、約3500 mg至約4000 mg、約4000至約4500 mg或約4500 mg至約5000 mg。

在一些實施例中，組合物以以下劑量投與：約300 mg、約500 mg、約600 mg、約1000 mg、約1200 mg、約1500 mg、約2000 mg、約2500 mg、約300 mg、約3500 mg、約4000 mg、約4500 mg或約5000 mg。

在一些實施例中，組合物投與一次，或每週、每月、每兩個月、每三個月或每六個月投與。

在一些實施例中，投與組合物使得相對風險降低約30%、約40%、約50%、約60%或約70%，例如持續至少2個月、至少4個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月或至少12個月。

在另一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子，例如DNA或mRNA分子，其編碼如本文所描述之本發明之抗體或其抗原結合片段。

在又一態樣中，本發明提供一種經分離mRNA分子，其編碼如本文所描述之本發明之抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明提供一種組合物，其包含如本文所描述之本發明之經分離核酸分子或經分離mRNA分子。

在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含如本文所描述之本發明之抗體或其抗原結合片段、經分離核酸分子或經分離mRNA分子，及使用說明書。

在又一態樣中，本發明提供一種小瓶，其包含如本文所描述之本發明之抗體或其抗原結合片段、經分離核酸分子或經分離mRNA分子。

在一些實施例中，小瓶容積為約1 mL、約2 mL、約4 mL、約8 mL、約12 mL、約16 mL、約20 mL或約24 mL。

在一些實施例中，各小瓶包含約100 mg、約200 mg、約300 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、約1000 mg、約1500 mg、約2000 mg或約2500 mg抗體或其抗原結合片段。

相關申請案

本申請案主張2022年4月1日申請之美國臨時申請案63/326,333；2022年8月8日申請之美國臨時申請案第63/396,003號；2022年9月22日申請之美國臨時申請案第63/408,980號；及2023年3月15日申請之美國臨時申請案第63/452,253號之優先權。此等申請案中之各者的全部內容以引用之方式併入本文中。 序列表

本申請案含有已以XML檔案格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入之序列表。該XML複本創建於2023年3月27日，命名為132280-00720_SL.xml且大小為7,171,527位元組。 A. 定義

應理解，本發明不限於所述特定方法、方案、細胞株、動物物種或屬及試劑，因此可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。除非上下文另外明確指示，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「(一)細胞」包括複數個此類細胞，且提及「(該)蛋白質」包括提及一或多種蛋白質及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。除非另外明確指示，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。

棘蛋白 (S 蛋白 )：如本文所用，除非另外陳述，否則S蛋白包括任何冠狀病毒形式之S蛋白。術語冠狀病毒S蛋白(「CoV-S」)用於描述任何冠狀病毒之S蛋白。特定言之，「SARS-CoV-S」及「SARS-CoV-2-S」涵蓋以下SARS-CoV及SARS-CoV-2胺基酸序列之S蛋白：

SARS-COV-S： MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGSASSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGRSLEVLFQGPGHHHHHHHHSAWSHPQFEKGGGSGGGGSGGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 1) (1288個胺基酸，由SEQ ID NO: 2編碼)，以及此序列之任何突變體、剪接變異體、同功異型物、異種同源物、同源物及變異體。

SARS-COV-2-S： MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO: 5)，(1273個胺基酸，由SEQ ID NO: 6編碼)，以及此序列之任何突變體、剪接變異體、同功異型物、異種同源物、同源物及變異體。在一些實施例中，CoV-S包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之多肽序列。

「CoV感染之有效治療或預防」在本文中係指在投與有效量之根據本發明的抗CoV-S抗體或其抗原結合片段之後，消除個體中之CoV，或預防個體體內CoV之擴增，或消除或減少症狀，諸如發熱、咳嗽、呼吸短促、流鼻涕、鼻塞、結膜炎及/或胃腸症狀。在一些情況下，有效治療可消除對個體戴上呼吸器之需求或減少個體需要戴上呼吸器之時間。治療可以單藥療法或結合諸如抗病毒劑或消炎劑之類另一活性劑實現。

如本文所用，「治療」為用於獲得有益或所要臨床結果之方法。出於本發明之目的，有益或所要臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：諸如發熱或咳嗽之類COV-S相關病狀之任何態樣的改善。舉例而言，在治療CoV感染之情形下，此包括降低嚴重程度；緩解發熱、咳嗽、呼吸短促及其他相關症狀；降低復發頻率；提高罹患CoV相關症狀之個體的生活品質；及降低治療CoV相關症狀所需之其他藥物的劑量。其他相關症狀包括但不限於腹瀉、結膜炎、嗅覺喪失及味覺喪失。可緩解或預防之又其他症狀包括發炎、細胞介素風暴及/或敗血症。

「減少發病率」或「防治」或「預防」意思指降低特定疾病、病狀、症狀或病症(術語疾病、病狀及病症在本申請案通篇可互換使用)之嚴重程度中的任一個。嚴重程度降低包括藉由例如減少對藥物或療法之需求、藥物或療法之量及/或暴露於藥物或療法來減少一般用於該病狀之藥物及/或療法。嚴重程度降低亦包括減少特定病狀、症狀或病症之持續時間及/或頻率(包括例如延遲或增加個體下一次間歇性發作之時間)。此進一步包括消除對個體戴上呼吸器之需求或減少個體需要戴上呼吸器之時間。

「改善」CoV感染相關病狀之一或多種症狀意思指使該病狀之一或多種症狀，例如發熱或咳嗽或呼吸短促相較於未投與抗CoV-S拮抗劑抗體減少或改善。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。同樣，此可包括消除對個體戴上呼吸器之需求或減少個體需要戴上呼吸器之時間。

如本文所用，「控制CoV相關症狀」或「控制」另一種CoV-S相關病狀係指維持或減少該病狀之一或多種症狀的嚴重程度或持續時間(相較於治療前水平)。舉例而言，個體之症狀的持續時間或嚴重程度或頻率相較於治療前水平減小至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一者。症狀之持續時間或嚴重程度或頻率減少可持續任何時間長度，例如2週、4週(1個月)、8週(2個月)、16週(3個月)、4個月、5個月、6個月、9個月、12個月等。

如其中所使用，「延遲」CoV-S相關病狀(諸如呼吸短促、支氣管炎或肺炎，例如間質性肺炎)之發展意思指推遲、阻止、減慢、延緩、穩定及/或延後病狀或疾病之進展。取決於所治療之病狀或疾病及/或個體的病史，此延遲可具有不同時間長度。熟習此項技術者將顯而易見，充分或顯著延遲可實際上涵蓋預防，因為該個體不會發展症狀。「延遲」症狀發展之方法為一種當與不使用該方法相比較時，在給定時間範圍內降低症狀發展之機率及/或在給定時間範圍內減輕症狀程度之方法。此類比較通常基於臨床研究，使用統計顯著數目之個體。

CoV相關病狀(諸如咳嗽或發熱)之「發展」或「進展」意謂該病症之初始表現及/或隨後發生之進展。咳嗽或發熱之發展可為可偵測的且可使用此項技術中熟知的標準臨床技術評估。然而，發展亦指可能偵測不到的進展。出於本發明之目的，發展或進展係指症狀之生物過程。「發展」包括發生、復發及發作。如本文所用，病狀之「發作」或「發生」包括初始發作及/或復發。

如本文所用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」係足以實現有益或所要結果的量。對於預防性用途，有益或所要結果包括諸如以下之結果：消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延遲疾病之發作，該疾病包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。對於治療用途，有益或所要結果包括臨床結果，諸如降低症狀強度、持續時間或頻率；及減少由CoV感染引起之一或多種症狀，包括其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理表型；提高罹患該疾病之個體的生活品質；減少治療該疾病所需之其他藥物的劑量；增強另一藥物之作用；及/或延遲患者之疾病的進展；消除對個體戴上呼吸器之需求或減少個體需要戴上呼吸器之時間。

有效劑量可以一或多種投藥形式投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形下所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或可不結合另一藥物、化合物或醫藥組合物達成。因此，可在投與一或多種治療劑的情形下考慮「有效劑量」，且若結合一或多種其他藥劑，可達成或已達成所期望的結果，則可認為單一藥劑係以有效量給予。

「適合宿主細胞」或「宿主細胞」一般包括可使用易於得到的技術及材料以重組方式產生主題抗CoV-S抗體及其抗原結合片段的任何細胞。舉例而言，可根據習知技術，在基因工程改造之宿主細胞中產生本發明之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段。適合宿主細胞係可用外源DNA轉化或轉染且在培養物中生長之細胞類型，且包括細菌、真菌細胞(例如酵母)及培養之高等真核細胞(包括培養的多細胞生物體之細胞)，尤其培養之哺乳動物細胞，例如人類或非人類哺乳動物細胞。在一個例示性實施例中，此等抗體可在CHO細胞中表現。用於操縱經選殖DNA分子且將外源DNA引入多種宿主細胞中的技術由Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人編輯, New York, NY: Green and Wiley and Sons (1993)揭示。

在一些例示性實施例中，抗體可在交配勝任型酵母，例如可在培養物中生長之任何單倍體、二倍體或四倍體酵母中表現。可用於醱酵表現方法中之酵母可以單倍體、二倍體或其他多倍體形式存在。

「可選標記物」在本文中係指如例如經由轉化事件賦予接受該基因之細胞生長表型(物理生長特徵)的基因或基因片段。可選標記物允許彼細胞在選擇性生長培養基中在不接受彼可選標記物基因之細胞不能生長之條件下存活及生長。可選標記物基因總體上分成若干類型，包括陽性可選標記物基因，諸如賦予細胞對抗生素或其他藥物、溫度(當兩個溫度敏感性(「ts」)突變體雜交或ts突變體轉化時)之抗性的基因；陰性可選標記物基因，諸如賦予細胞在不含不具有彼生物合成基因之所有細胞所需特定養分之培養基中生長之能力的生物合成基因，或藉由不具有野生型基因之細胞賦予細胞無法生長之能力的誘變生物合成基因；及其類似基因。

「表現載體」在本文中係指含有促進操縱以使外來蛋白質在目標宿主細胞內表現之元件的DNA載體，該目標宿主細胞例如為細菌、昆蟲、酵母、植物、兩棲動物、爬行動物、禽類或哺乳動物細胞，例如CHO或HEK細胞。便利地，可首先在例如大腸桿菌之細菌宿主中執行序列操縱及用於轉化之DNA的產生，且載體通常將包括促進此類操縱之序列，包括細菌複製起點及適當細菌選擇標記物。選擇標記物編碼在選擇性培養基中生長之轉化宿主細胞之存活或生長所需的蛋白質。不用含有選擇基因之載體轉化之宿主細胞將無法在該培養基中存活。典型選擇基因編碼此類蛋白質，其(a)賦予針對抗生素或其他毒素之抗性，(b)補充營養缺陷型缺乏，或(c)供應無法自複合培養基獲得之關鍵養分。用於酵母轉化之例示性載體及方法描述於例如Burke, D., Dawson, D.及Stearns, T., Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)中。用於本發明之方法中的表現載體可包括酵母或哺乳動物特異性序列，包括用於鑑別經轉化宿主株系之可選營養缺陷型或藥物標記物。藥物標記物可進一步用於在酵母宿主細胞中擴增載體之複本數。

將所關注之多肽編碼序列可操作地連接至轉錄及轉譯調節序列，其使得該多肽可在所要宿主細胞，例如酵母或哺乳動物細胞中表現。此等載體組分可包括但不限於以下中之一或多者：強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。用於分泌多肽之序列亦可包括例如信號序列及其類似序列。複製起點，例如酵母或哺乳動物複製起點，係視情況選用的，因為表現載體可整合至宿主細胞基因體中。

當核酸置於與另一個核酸序列之功能關係中時，其係「可操作地連接的」。舉例而言，若信號序列之DNA係表現為參與多肽分泌之前蛋白形式，則其可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至該序列。一般而言，「可操作地連接」意謂經連接之DNA序列為連續的，且在分泌性前導子之情況下，其為連續的且在閱讀框架內。然而，強化子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制位點處接合或可替代地經由熟習此項技術者熟悉之PCR/重組方法(GATEWAY ^®Technology (用於選殖DNA之通用方法)；Invitrogen, Carlsbad California)實現。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸接附子或連接子。

啟動子係位於結構基因起始密碼子之上游(5')的非轉譯序列(一般在約100至1000 bp內)，其控制其可操作地連接之特定核酸序列之轉錄及轉譯。此類啟動子分成若干類別：誘導型、組成型及阻遏型啟動子(其回應於不存在阻遏子而增加轉錄量)。誘導型啟動子可回應於培養條件之一些變化(例如存在或缺乏養分或溫度變化)引起自其控制下之DNA之轉錄量增加。

啟動子片段亦可充當表現載體同源重組及整合至宿主細胞(例如酵母或哺乳動物細胞)基因體中相同位點的位點；或者，可選標記物可用作同源重組之位點。用於不同真核及原核細胞中的適合啟動子係熟知的且可商購的。

所關注之多肽不僅可直接以重組方式產生，而且亦可以與異源多肽之融合多肽形式產生，該異源多肽例如為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N端處具有特定裂解位點之其他多肽。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入至載體中之編碼多肽之序列的一部分。選擇的異源信號序列較佳地係經由宿主細胞，例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞內可得到的標準路徑之一識別及加工的信號序列。此外，此等信號肽序列可經工程改造以增強在表現系統中之分泌。所關注之分泌信號亦包括哺乳動物及酵母信號序列，其對於所分泌之蛋白質可為異源的，或可為所分泌蛋白質之原生序列。信號序列包括前肽序列，且在一些情況下可包括原肽序列。諸多該等信號序列在此項技術中為已知的，包括免疫球蛋白鏈上所發現之信號序列，例如K28前毒素原序列、PHA-E、FACE、人類MCP-1、人類血清白蛋白信號序列、人類Ig重鏈、人類Ig輕鏈及其類似信號序列。舉例而言，參見Hashimoto等人， Protein Eng.,11(2):75 (1998)；及Kobayashi等人， Therapeutic Apheresis,2(4):257 (1998))。

可藉由將轉錄活化序列插入至載體中來提高轉錄。此等活化因子為DNA之順式作用元件，通常為約10至300 bp，其作用於啟動子上以提高其轉錄。轉錄強化子係相對定向及位置無關的，見於轉錄單元之5'及3'端、內含子內以及編碼序列本身內。強化子可剪接至表現載體中編碼序列5'或3'端之位置處，但較佳位於啟動子5'端之位點處。

用於真核宿主細胞中之表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此類序列通常可自轉譯終止密碼子之3'端，在真核或病毒DNA或cDNA之非轉譯區中獲得。此等區含有經轉錄為mRNA之非轉譯部分中之聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。

採用標準接合技術或PCR/重組方法來構築含有以上所列組分中之一或多者之適合載體。以產生所需質體所需之形式或經由重組方法裂解、調整且重新接合經分離之質體或DNA片段。為進行分析以證實所構築質體中之正確序列，使用接合混合物以轉化宿主細胞，且適當時，藉由抗生素抗性(例如安比西林(ampicillin)或吉歐黴素(Zeocin))來選擇成功之轉化體。自轉化體製備質體，藉由限制性核酸內切酶消化進行分析及/或定序。

作為限制且接合片段之替代方案，可使用基於特定附接(「 att」)位點及重組酶之重組方法以將DNA序列插入載體中。此類方法例如由Landy, Ann. Rev. Biochem., 58:913-949 (1989)描述；且為熟習此項技術者所知。此類方法利用藉由λ及大腸桿菌編碼之重組蛋白之混合物介導的分子間DNA重組。重組係在相互作用DNA分子上之 att位點之間發生。關於 att位點之描述，參見Weisberg及Landy, Site-Specific Recombination in Phage Lambda, 在 Lambda II, 第211-250頁, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1983)中。轉換側接重組位點之DNA區段，以使得在重組之後， att位點為包含由各親本載體供給之序列的混合序列。重組可發生於具有任何拓樸之DNA之間。

att位點可藉由以下引入至所關注之序列中：將所關注之序列接合至適當載體中；經由使用特定引子產生含有 attB位點之PCR產物；產生選殖至含有att位點之適當載體中之cDNA庫；及其類似者。

如本文所用，摺疊係指多肽及蛋白質之三維結構，其中胺基酸殘基之間之相互作用用以穩定該結構。雖然非共價相互作用在確定結構方面很重要，但所關注之蛋白質通常將具有藉由兩個半胱胺酸殘基形成之分子內及/或分子間共價二硫鍵。對於天然存在之蛋白質及多肽，或其衍生物及變異體，適當摺疊通常為產生最佳生物活性之佈置，且可便利地藉由針對活性，例如配位體結合、酶活性等之分析來監測。

在一些情況下，例如其中所要產物具有合成來源，基於生物活性之分析將不再那麼有意義。此類分子之適當摺疊可基於物理特性、能量考慮因素、模型化研究及其類似者來確定。

表現宿主可藉由引入編碼一或多種酶之序列進行進一步修飾，該一或多種酶增強摺疊及二硫鍵形成，亦即摺疊酶、伴侶蛋白等。此類序列可使用此項技術中已知之載體、標記物等在宿主細胞中組成性或誘導性表現。較佳地，包括足以滿足所要表現模式之轉錄調節元件的序列經由靶向方法穩定整合於酵母基因體中。

舉例而言，真核蛋白質二硫鍵異構酶(「PDI」)不僅為蛋白質半胱胺酸氧化及二硫鍵異構化之高效催化劑，而且亦展現伴侶蛋白活性。PDI之共表現可促進產生具有多個二硫鍵之活性蛋白質。免疫球蛋白重鏈結合蛋白(「BIP」)；親環蛋白；及其類似物之表現亦值得關注。

培養之哺乳動物細胞係用於產生所揭示之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段的例示性宿主。如所提及，CHO細胞特別適於表現抗體。用於在哺乳動物細胞中製造單株抗體的許多程序係此項技術中已知的。(參見Galfre, G.及Milstein, C., Methods Enzym., 73:3-46, 1981; Basalp等人， Turk. J. Biol., 24:189-196, 2000; Wurm, F.M., Nat. Biotechnol., 22:1393-1398, 2004；及Li等人， mAbs, 2(5):466-477, 2010)。如下文更詳細地提及，用於哺乳動物單株抗體製造流程中之常用宿主細胞株包括但不限於人類胚胎視網膜母細胞細胞株PER.C6® (Crucell N.V., Leiden, The Netherlands)、NS0鼠類骨髓瘤細胞(Medical Research Council, London, UK)、CV1猴腎細胞株、293人類胚胎腎細胞株、BHK幼倉鼠腎細胞株、VERO非洲綠猴腎細胞株、人類子宮頸癌細胞株HELA、MDCK犬腎細胞、BRL布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞、W138人類肺細胞、HepG2人類肝細胞、MMT小鼠乳房腫瘤細胞、TRI細胞、MRC5細胞、Fs4細胞、骨髓瘤或淋巴瘤細胞或中國倉鼠(灰倉鼠( Cricetulus griseus))卵巢(CHO)細胞及類似細胞。此項技術中已知CHO細胞之許多不同次殖株或次細胞株，其係有用的且經最佳化以產生重組單株抗體，諸如DP12 (CHO K1 dhfr-)細胞株，NS0細胞係對氮雜鳥嘌呤具有抗性的NS-1細胞之非Ig分泌性、非輕鏈合成次殖株。其他中國倉鼠及CHO細胞係可商購的(得自ATCC等)，包括CHO-DXB11 (CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO 1-15、CHO DP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745及其類似細胞，其皆經基因改變以針對各種參數最佳化細胞株。單株抗體通常使用分批饋料方法製造，其中單株抗體鏈係在哺乳動物細胞株中表現且分泌至在生物反應器中之組織培養基中。培養基(或進料)連續地供應至生物反應器中以使重組蛋白表現最大化。接著，自收集之培養基純化出重組單株抗體。在一些情況下，需要額外步驟以經由還原二硫鍵等重新組裝抗體。此類產生方法可在單一批次中按比例調整至高達10,000 L或更多。現常規地使用此類細胞株及方法獲得多達20皮克/細胞/天，由此提供高達10 g/L或更高之力價，自10 kL至25 kL之生物反應器總計得到15至100 kg。(Li等人，2010)。以下提供此產生方法之各種詳情，包括將編碼抗體之聚核苷酸選殖至表現載體中、用此等表現載體轉染細胞、選擇經轉染細胞以及自此等細胞表現及純化重組單株抗體。

為了在哺乳動物細胞中重組產生抗CoV-S抗體或抗原結合片段，一般將編碼抗體或其片段之核酸插入可複製載體中用於進一步選殖(擴增DNA)或表現。使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之DNA的寡核苷酸探針)容易地分離或合成編碼抗體之DNA。載體組分一般包括但不限於以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記物基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。啟動子、終止子、可選標記物、載體及其他元件之選擇係在此項技術中之一般技能水平內的常規設計問題。許多此類元件係此項技術中已知的且可經由商業供應商得到。

本發明之抗體不僅可直接以重組方式產生，而且亦可以與異源多肽之融合多肽形式產生，該異源多肽較佳地為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N端處具有特異性裂解位點之其他多肽。所選同源或異源信號序列較佳為經宿主細胞識別及加工(亦即，藉由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹病毒gD信號。

此類表現載體及選殖載體一般將含有使載體能夠在一或多個所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列係使載體能夠獨立於宿主染色體DNA而複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。用於多種細菌、酵母及病毒之此類序列係熟知的，例如來自質體pBR322之複製起點適於大部分革蘭氏陰性細菌，2mu質體起點適於酵母，且各種病毒起點(猿猴病毒40 (「SV40」)、多瘤病毒、腺病毒、水皰性口炎病毒(「VSV」)或牛乳頭狀瘤病毒(「BPV」)可用於哺乳動物細胞中的選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。

此等載體亦通常含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型選擇基因編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素，例如對安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline)的抗性；(b)補充營養缺陷型缺陷；或(c)供應無法獲自複合培養基之關鍵養分，例如編碼桿菌之D-丙胺酸消旋酶的基因。

選擇方案的之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。藥物選擇一般用於選擇已插入外來DNA之經培養乳動物細胞。此類細胞通常稱為「轉染體」。在選擇劑存在下培養且能夠將所關注基因傳到其子代的細胞稱為「穩定轉染體」。此類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。例示性可選標記物係編碼對抗生素新黴素之抗性之基因。選擇係在新黴素型藥物，諸如G-418或其類似物存在下進行。此等經異源基因成功轉化之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。

選擇系統亦可用於增加所關注基因之表現量，此過程稱為「擴增」。轉染體之擴增通常藉由在低含量之選擇劑存在下培養細胞，且隨後增加選擇劑之量以選擇產生高含量的引入基因之產物的細胞來進行。用於哺乳動物細胞之例示性適合可選標記物係能夠鑑別有能力吸收抗體核酸之細胞的標記，諸如二氫葉酸還原酶(「DHFR」)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-l及金屬硫蛋白-II (較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。

舉例而言，用於哺乳動物細胞的可擴增可選標記物係二氫葉酸還原酶，其賦予對甲胺喋呤之抗性。亦可使用其他藥物抗性基因(例如潮黴素抗性、多藥抗性、嘌呤黴素乙醯基轉移酶)。先藉由在含有甲胺喋呤(「MTX」，DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉化體來鑑別經DHFR選擇基因轉化之細胞。當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞係缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞株。

或者，經編碼抗體、野生型DHFR蛋白質及另一種可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(「APH」))之DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(尤其含有內源性DHFR的野生型宿主)可藉由使細胞在含有針對可選標記物(諸如胺基醣苷抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G-418)之選擇劑的培養基中生長來進行選擇。參見美國專利第4,965,199號。

此等載體可包含促進編碼抗體之DNA之轉錄的強化子序列。已知來自哺乳動物基因(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多強化子序列。常用的強化子係衍生自真核細胞病毒之強化子。其實例包括在複製起點之後側(bp 100-270)的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、在複製起點之後側的多瘤病毒強化子及腺病毒強化子(關於用於活化真核啟動子之強化元件，亦參見Yaniv, Nature, 297:17-18(1982))。強化子可剪接至載體中在抗體編碼序列5'或3'端之位置處，但較佳位於啟動子5'端之位點處。

表現載體及選殖載體一般亦包含由宿主生物體識別且與抗體核酸可操作地連接的啟動子。已知真核生物之啟動子序列。幾乎所有的真核基因均具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可為將聚A尾添加至編碼序列之3'端的信號。所有此等序列均適合插入真核表現載體中。

在哺乳動物宿主細胞中利用載體進行的抗體轉錄可例如藉由獲自以下之基因體的啟動子控制：病毒，諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、BPV、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒，且最佳地為SV40；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，其限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。

SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子適宜以HindIII E限制性片段形式獲得。使用BPV作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利第4,601,978號中。關於在小鼠細胞中在得自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下表現人類β-干擾素cDNA，亦參見Reyes等人， Nature, 297:598-601 (1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。

可使用強轉錄啟動子，諸如來自SV40、細胞巨大病毒或骨髓增生性肉瘤病毒之啟動子。參見例如美國專利第4,956,288號及美國專利公開案第20030103986號。其他適合之啟動子包括來自金屬硫蛋白基因之啟動子(美國專利第4,579,821號及第4,601,978號)及腺病毒主要晚期啟動子。用於哺乳動物細胞中之表現載體包括在美國典型培養物寄存中心(American Type Culture Collection), 10801 University Blvd., Manassas, VA. USA分別以寄存編號98669、98668及PTA-5266寄存的pZP-1、pZP-9及pZMP21，及此等載體之衍生物。

真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞、人類細胞或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中使用的表現載體一般亦將含有轉錄終止及使mRNA穩定所需的序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'非轉譯區。此等區域在編碼抗體之mRNA的非轉譯部分中含有以聚腺苷酸化片段形式轉錄的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。

用於選殖或表現主題抗體之適合宿主細胞包括上文所述之原核生物、酵母或高級真核生物細胞。然而，脊椎動物細胞最受關注，且脊椎動物細胞於培養物中之繁殖已成為常規程序。有用哺乳動物宿主細胞株之實例係經SV40轉化之猴腎CV1株(COS-1 (ATCC編號CRL 1650)；及COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(經次選殖以在懸浮培養物中生長之293或293細胞(ATCC編號CRL 1573；Graham等人， J. Gen. Virol.,36:59-72(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10，ATCC編號CRL 1632；BHK 570，ATCC編號CRL 10314)；CHO細胞(CHO-K1，ATCC編號CCL 61；CHO-DG44，Urlaub等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:4216-4220(1980))；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (TM4，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株(Hep G2)。額外的適合細胞株係此項技術中已知的且得自公共寄存庫，諸如美國典型培養物寄存中心, Manassas, VA。

宿主細胞經用於產生抗體之上述表現或選殖載體轉化，且在經改良以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼如前文所論述之所要序列之基因的習知營養培養基中培養。

用於產生本發明之抗體的哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。可商購的培養基，諸如漢氏(Ham's) F10 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、最低必需培養基((「MEM」(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)-1640培養基(「RPMI-1640」，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((「DMEM」，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)，適於培養宿主細胞。另外，可使用以下中所描述之培養基中之任一者作為宿主細胞之培養基：Ham等人， Meth. Enz.58:44 (1979)；Barnes等人， Anal. Biochem.102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國再審專利第30,985號。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健大黴素(Gentamycin)藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者將已知之合適濃度包括任何其他必要的增補劑。培養條件(諸如溫度、pH及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。培養基及培養條件之開發及最佳化方法為此項技術中已知的(參見Gronemeyer等人， Bioengineering, 1(4):188-212, 2014)。

在使培養條件最佳化且選出較佳的細胞株殖株之後，在生物反應器(許多型號係可商購的)中，最通常以分批饋料製程培養此等細胞(黏附細胞或懸浮培養物)，該分批進料製程涉及連續地進料細胞培養物以及培養基及進料，針對選擇且選定用於此目的之特定細胞株最佳化。(參見Butler, M., Appl. Microbiol. Biotechnol., 68:283-291, 2005；及Kelley, B., mAb, 1(5):443-452, 2009)。亦可使用灌注系統，其中將培養基及進料連續地供應至培養物中，同時自生物反應器排出相同體積之培養基。(Wurm, 2004)。合成培養基(亦為可商購的)可用於使細胞在分批饋料之培養物中生長，由此避免由外部來源，諸如使用動物組分，諸如牛血清白蛋白等引起之污染的可能性。然而，亦可商購不含動物組分之水解產物以幫助提高細胞密度、培養物活力及生產力。(Li等人，2010)。已執行許多研究以致力於使細胞培養基最佳化，包括謹慎注意滾瓶中可用的頭部空間、在生長及表現階段期間之氧化還原電位、在產生期間維持二硫鍵之還原劑的存在等。(參見例如Hutterer等人， mAbs, 5(4):608-613, 2013；及Mullan等人， BMC Proceed., 5(增刊8):P110, 2011)。已開發出各種方法來解決在重組單株抗體產生期間發生有害氧化的可能性。(參見例如美國專利第8,574,869號)。可藉由連續地或以分開投與之量進料養分來使培養之細胞生長。通常，在細胞生長期間，藉由使用探針，利用直接連接至校準之分析器在線上監測，或藉由操作人員干預離線監測各種製程參數，諸如細胞濃度、pH、溫度、CO ₂、dO ₂、重量莫耳滲透濃度、代謝物(諸如葡萄糖、乳酸鹽、麩醯胺酸及麩胺酸)之量，及其類似參數。培養步驟亦通常涉及藉由此項技術中已知用於細胞選擇之任何方式確保在培養物中生長之細胞維持轉染之重組基因。

醱酵之後，亦即，在獲得最大細胞生長及重組蛋白表現之後，培養步驟之後通常為收集步驟，藉此自培養基分離出細胞且由此獲得收集之細胞培養基。(參見Liu等人， mAbs, 2(5):480-499, 2010)。通常，在培養後，使用各種純化步驟，涉及管柱層析及其類似方法，將重組單株抗體與細胞組分及細胞培養基組分分離。重組單株抗體產生之此階段所需的確切純化步驟取決於蛋白質表現之位點，亦即細胞本身之細胞溶質中，或將蛋白質排出至細胞培養基中的更常用之較佳途徑。各種細胞組分可使用此項技術中已知之技術分離，諸如差速離心技術、基於重力之細胞沈降及/或尺寸排阻層析/過濾技術，過濾技術可包括切向流微量過濾或深層過濾。(參見Pollock等人， Biotechnol. Bioeng., 110:206-219, 2013，及Liu等人，2010)。可藉由使用連續碟片式離心機，隨後使用深層過濾器及膜過濾器澄清，實現細胞組分之大規模離心。(參見Kelley, 2009)。最通常地，在澄清之後，由於蛋白A對抗體之Fc域具有高親和力，故重組蛋白藉由蛋白A層析進一步純化，且通常使用低pH/酸化溶離步驟進行(通常，將酸化步驟與預防病毒滅活步驟組合)。使用酸性或陽離子型聚電解質進行之凝集及/或沈澱步驟亦可用於將懸浮培養物中之動物細胞與可溶性蛋白質分離。(Liu等人，2010)。最後，通常使用陰離子及陽離子交換層析、疏水相互作用層析(「HIC」)、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、使用陶瓷羥基磷灰石(Ca ₅(PO ₄) ₃OH) ₂之羥基磷灰石層析及此等技術之組合來精製重組單株抗體之溶液。所要單株抗體之最終調配及濃縮可藉由使用超速離心技術來實現。純化產率通常為70至80%。(Kelley, 2009)。

術語「 所要蛋白質」或「 所要抗體」在本文中可互換使用且一般係指對目標(亦即，CoV-S)具特異性之親本抗體，或嵌合抗體或人源化抗體或如本文所描述之自其衍生的其結合部分。術語「抗體」意欲包括具有適合且識別抗原決定基之特定形狀的任何含多肽鏈分子結構，其中一或多種非共價結合相互作用使分子結構與抗原決定基之間的複合物穩定化。原型抗體分子係免疫球蛋白，且來自所有來源之所有類型之免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等均視為「抗體」，該等來源例如人類、嚙齒動物、兔、牛、綿羊、豬、犬、其他哺乳動物、雞、其他禽類等。其實例包括嵌合抗體、人類抗體及其他非人類哺乳動物抗體、人源化抗體、單鏈抗體(諸如scFv)、駱駝抗體、奈米抗體、IgNAR (例如可源自鯊魚之單鏈抗體)、小模組化免疫藥物(small-modular immunopharmaceuticals，「SMIP」)及抗體片段，諸如Fab、Fab'、F(ab') ₂及其類似物(參見Streltsov等人， Protein Sci.,14(11):2901-9 (2005); Greenberg等人， Nature,374(6518):168-73 (1995); Nuttall等人， Mol. Immunol.,38(4):313-26 (2001); Hamers-Casterman等人， Nature,363(6428):446-8 (1993); Gill等人， Curr. Opin. Biotechnol.,(6):653-8 (2006))。

舉例而言，抗體或其抗原結合片段可藉由基因工程產生。在此技術中，如同其他方法一樣，使產生抗體之細胞對所要抗原或免疫原具敏感性。使用自產生抗體之細胞分離之信使RNA用作使用PCR擴增製造cDNA之模板。載體庫(載體各自含有保留最初抗原特異性之一個重鏈基因及一個輕鏈基因)係藉由將擴增免疫球蛋白cDNA之適當部分插入至表現載體中而產生。組合庫係藉由使重鏈基因庫與輕鏈基因庫組合而構築。此產生共表現重鏈及輕鏈(類似於抗體分子之Fab片段或抗原結合片段)之殖株庫。攜帶此等基因之載體經共轉染至宿主細胞中。當在轉染宿主中誘導抗體基因合成時，重鏈及輕鏈蛋白質可自組裝產生活性抗體，其可藉由用抗原或免疫原篩選來偵測。

所關注之編碼抗體之序列包括藉由原生序列編碼者，以及藉助於基因密碼簡併在序列方面與所揭示之核酸不相同之核酸，及其變異體。變異多肽可包括胺基酸(「aa」)取代、添加或缺失。胺基酸取代可為保守胺基酸取代或消除非必需胺基酸之取代，諸如更改醣基化位點，或藉由取代或缺失使並非功能所需之一或多個半胱胺酸殘基而使摺疊異常降至最低。變異體可經設計以便保留或增強蛋白質特定區(例如功能域、催化胺基酸殘基等)之生物活性。變異體亦包括本文中所揭示之多肽之片段，特定言之生物活性片段及/或對應於功能域之片段。活體外突變誘發選殖基因之技術為已知的。本發明亦包括已使用普通分子生物技術修飾以便改善其對蛋白水解降解之抗性或使溶解度特性最佳化或使其更適合作為治療劑的多肽。

嵌合抗體可藉由重組方式，藉由將自一個物種之產抗體細胞獲得的V _L及V _H區與來自另一物種之恆定輕鏈及重鏈區組合來製造。嵌合抗體通常利用嚙齒動物或兔可變區及人類恆定區，以便產生具有主要人類域之抗體。此類嵌合抗體之產生係此項技術中熟知的，且可藉由標準方式(如例如以全文引用的方式併入本文中之美國專利第5,624,659號中所述)來實現。另外，經考慮，本發明嵌合抗體之人類恆定區可選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恆定區。

人源化抗體經工程改造以含有甚至更擬似人類之免疫球蛋白域，且僅併入動物衍生抗體之互補決定區。此係藉由小心地檢查單株抗體可變區之高變環之序列，且使其適合人類抗體鏈之結構來實現。雖然表面上較複雜，但實際上過程簡單明瞭。參見例如以引用的方式全文併入本文中的美國專利第6,187,287號。

除整個免疫球蛋白(或其重組對應物)之外，可合成包含抗原決定基結合位點之免疫球蛋白片段(例如Fab'、F(ab') ₂或其他片段)。「片段」或極小免疫球蛋白可利用重組免疫球蛋白技術進行設計。舉例而言，用於本發明之「Fv」免疫球蛋白可藉由合成融合可變輕鏈區及可變重鏈區產生。亦關注抗體組合，例如包含兩種不同Fv特異性之雙功能抗體。在另一實施例中，免疫球蛋白片段涵蓋小分子免疫藥物(「SMIP」)、駱駝抗體、奈米抗體及IgNAR。

免疫球蛋白及其片段可進行轉譯後修飾，例如以添加可用於本發明之方法及組合物中的效應部分，諸如化學連接子、可偵測部分，諸如螢光染料、酶、毒素、受質、生物發光材料、放射性材料、化學發光部分及其類似物；或特異性結合部分，諸如鏈黴抗生物素蛋白、抗生素蛋白或生物素，及其類似物。另外效應分子之實例提供在下文中。

若聚核苷酸序列根據遺傳密碼轉譯產生多肽序列(亦即，聚核苷酸序列「編碼」多肽序列)，則聚核苷酸序列「對應於」多肽序列；若兩個聚核苷酸序列編碼相同多肽序列，則一個聚核苷酸序列「對應於」另一聚核苷酸序列。

DNA構築體之「異源」區或域為較大DNA分子內之在自然界中未發現與該較大分子相關之可鑑別DNA區段。因此，當異源區編碼哺乳動物基因時，側接該基因之DNA通常不側接源生物體基因體中之哺乳動物基因體DNA。異源區之另一實例為其中編碼序列本身在自然界中尚未發現之構築體(例如cDNA，其中基因體編碼序列含有內含子或密碼子不同於原生基因之合成序列)。對偶基因變異或天然產生之突變事件不會產生如本文所定義之DNA異源區。

「編碼序列」係對應於或編碼蛋白質或肽序列之密碼子的框內序列。若兩個編碼序列或其互補序列編碼相同胺基酸序列，則該等序列彼此對應。編碼序列與適當調節序列聯合可經轉錄且轉譯成多肽。聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'端。「啟動子序列」係能夠起始下游(3'方向)編碼序列轉錄的DNA調節區，且通常含有用於結合影響編碼序列轉錄之調節分子，例如轉錄因子的額外位點。當RNA聚合酶結合細胞中之啟動子序列且將編碼序列轉錄成mRNA，該mRNA隨後又轉譯成藉由編碼序列編碼之蛋白質時，編碼序列為在啟動子序列之「控制下」或「可操作地連接」至啟動子。

現已充分理解脊椎動物中抗體之一般結構。參見Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190:5 (1971)。抗體由分子量約23,000道爾頓之兩條相同的輕多肽鏈(「輕鏈」)及分子量53,000-70,000之兩條相同的重鏈(「重鏈」)組成。四條鏈藉由二硫鍵接合，呈「Y」組態，其中輕鏈支托始於「Y」組態開口處之重鏈。「Y」組態之「分支」部分指定為F _ab區；「Y」組態之主幹部分指定為F _C區。胺基酸序列定向自「Y」組態頂部處之N端末端延伸至各鏈底部之C端末端。N端末端具有可變區，其具有針對引發其之抗原的特異性，且長度為約100個胺基酸，輕鏈與重鏈之間及抗體與抗體之間存在細微差異。

在各鏈中可變區連接至恆定區，該恆定區延伸其餘鏈長且在一個特定類別之抗體內不隨抗體特異性(亦即，引發其之抗原)而變化。主要存在五類已知恆定區，其決定免疫球蛋白分子之類別(IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，對應於γ、μ、α、δ及ε重鏈恆定區)。恆定區或類別決定抗體之後續效應功能，包括補體活化(參見Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 第2版, 第413-436頁, New York, NY: Holt, Rinehart, Winston (1976))，及其他細胞反應(參見Andrews, D. W.等人， Clinical Immunobiology, 第1-18頁, W. B. Sanders, Philadelphia, PA (1980)；Kohl等人， Immunology, 48: 187 (1983))；而可變區決定將與其反應之抗原。輕鏈分類為κ或λ。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈一起製備。輕鏈及重鏈彼此共價鍵結，且當藉由融合瘤或藉由B細胞產生免疫球蛋白時，兩條重鏈之「尾部」部分藉由共價二硫鍵彼此鍵結。

表述「可變區」或「VR」係指抗體中各對輕鏈及重鏈內直接參與抗體與抗原結合之域。每條重鏈在一端具有可變區(VH)，隨後為多個恆定域。各輕鏈在一端具有可變區(VL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。

表述「互補決定區」、「高變區」或「CDR」係指抗體輕鏈或重鏈之可變區中所發現的一或多個高變區或互補決定區(「CDR」) (參見Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987))。此等表現包括如Kabat等人( Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institutes of Health (1983))所定義之高變區或抗體3維結構中之高變環(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987))。每條鏈中之CDR藉由構架區(「FR」)保持緊密靠近，且與來自另一鏈之CDR一起促成抗原結合位點之形成。在CDR內存在被描述為選擇性決定區(「SDR」)之選擇胺基酸，其表示在抗體-抗原相互相用中由CDR使用之關鍵接觸殘基(參見Kashmiri等人， Methods, 36(1):25-34 (2005))。

如本文所用，「經分離抗體」意欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合CoV-S之經分離抗體實質上不含特異性結合除CoV-S外之抗原的抗體)。然而，特異性結合CoV-S之經分離抗體可與其他抗原，諸如來自其他物種之CoV-S分子具有交叉反應性。另外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。

如本文所用，片語「特異性結合至CoV-S」係指抗CoV-S抗體或其抗原結合片段與CoV-S相互作用之能力，其中解離常數(KD)為例如約1,000 nM或更小、約500 nM或更小、約200 nM或更小、約100 nM或更小、約75 nM或更小、約25 nM或更小、約10 nM或更小、約1 nM或更小、約100 pM nM或更小、約10 pM nM或更小、約1 pM或更小或約0.1 pM或更小。在另一實施例中，如本文所用，片語「特異性結合至CoV-S」係指抗CoV-S抗體或其抗原結合片段與CoV-S相互作用之能力，其中解離常數(KD)在約0.1 pM至1,000 nM之間、約1 pM至500 nM之間、約10 pM至100 nM之間、約0.1 nM至50 nM之間或約1 nM至50 nM之間。在一個實施例中，KD係藉由表面電漿子共振、ELISA、放射免疫分析、生物膜層干涉術(BLI)或藉由此項技術中已知之任何其他方法來確定。

「抗原決定基」或「結合位點」為在抗原上由抗原結合肽(諸如抗體)特異性結合之範圍或區域。蛋白質抗原決定基可包含直接涉及結合之胺基酸殘基(亦稱作抗原決定基之免疫顯性組分)及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如可藉由特異性抗原結合肽有效地阻斷之胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基在特異性抗原結合肽之「足跡(footprint)」內)。術語抗原決定基在本文中包括特異性結合至抗CoV-S抗體之CoV-S (例如SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S)之任何特定區域中的兩種類型之胺基酸結合位點。在一些實施例中，抗原決定基為棘蛋白，例如SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S內之保守位點，例如CR3022位點及受體結合域(RBD)中之N343蛋白聚醣位點，或S2域。CoV-S可包含多個不同的抗原決定基，其可包括但不限於(1)線性肽抗原決定子；(2)構形抗原決定子，其由在成熟CoV-S構形中位置彼此靠近的一或多個不連續胺基酸組成；及(3)轉譯後抗原決定子，其整體或部分由共價連接至CoV-S蛋白質之分子結構(諸如碳水化合物基團)組成。特定言之，術語「抗原決定基」包括如藉由已知且公認之方法，諸如丙胺酸掃描技術或使用不同長度之各種S蛋白部分所確定的蛋白質或肽(例如CoV-S)中參與抗體與此類蛋白質或肽之結合的特定殘基。

片語抗體(例如第一抗體)與另一抗體(例如第二抗體)結合「實質上」或「至少部分」相同之抗原決定基意謂，第一抗體之抗原決定基結合位點包含構成第二抗體之抗原決定基結合位點之抗原上的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高百分比的胺基酸殘基。此外，第一抗體與第二抗體結合實質上或部分相同或重疊之抗原決定基意謂第一及第二抗體在與抗原結合方面競爭，如上所述。因此，術語與單株抗體「結合至實質上相同之抗原決定基或決定子」意謂一種抗體與該抗體「競爭」。

片語與所關注之抗體「結合至相同或重疊之抗原決定基或決定子」意謂，抗體與該所關注之抗體「競爭」該所關注之抗體特異性結合之CoV-S上的至少一個(例如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個)或所有殘基。與本文所描述之單株抗體結合至實質上或基本上相同之抗原決定基的一或多種抗體之鑑別可使用丙胺酸掃描容易地確定。另外，可評估抗體競爭的多種免疫篩選分析中之任一者。多種此類分析係此項技術中常規地實踐且熟知的(參見例如1997年8月26日頒予之美國專利第5,660,827號，其以引用之方式特定地併入本文中)。應理解，無論如何都不需要實際上確定本文所描述之抗體所結合之抗原決定基來鑑別與本文所描述之單株抗體結合至相同或實質上相同或重疊之抗原決定基的抗體。

舉例而言，當待檢查之測試抗體係自不同動物來源獲得，或甚至屬於不同Ig同型時，可採用簡單的競爭分析，其中將對照抗體與測試抗體混合，且接著施加至含有CoV-S之樣品。基於ELISA、放射免疫分析、西方墨點法及使用BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析之方案適用於此類簡單競爭研究中。

在某些實施例中，在施加至CoV-S (例如SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S)抗原樣品之前，將對照抗CoV-S抗體與不同量之測試抗體(例如以約1:1、1:2、1:10或約1:100之比)預混合一段時間。在其他實施例中，對照抗體及不同量之測試抗體可在暴露於SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S抗原樣品期間簡單地分開添加且混合。只要結合抗體可區別於游離抗體(例如藉由使用分離或洗滌技術消除未結合抗體)且對照抗體可區別於測試抗體(例如藉由使用物種特異性或同型特異性二級抗體或藉由用可偵測標記特異性標記對照抗體)，即可確定測試抗體是否減少對照抗體與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S抗原之結合，表明測試抗體與對照抗CoV-S抗體識別實質上相同之抗原決定基。(經標記)對照抗體在完全不相關之抗體(不結合CoV-S之抗體)存在下之結合可充當對照高值。低對照值可藉由使經標記之對照抗體與相同但未標記之對照抗體一起培育來獲得，其中將發生競爭且減少標記抗體之結合。在測試分析中，標記抗體反應性在測試抗體存在下顯著降低表明測試抗體識別實質上相同之抗原決定基，亦即該測試抗體與標記對照抗體競爭。舉例而言，在約1:1或1:10與約1:100之間之任何比率的測試抗體下，使對照抗體與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之結合減少至少約50%，諸如至少約60%或更佳至少約70% (例如約65-100%)的任何測試抗體被視為與對照抗體結合至實質上相同或重疊之抗原決定基或決定子的抗體。

較佳地，此類測試抗體使對照抗體與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S (或另一CoV-S)抗原之結合減少在無測試抗體存在下觀測到的對照抗體之結合的較佳至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如約95%)。

亦可有利地採用簡單競爭分析，其中將測試抗體以飽和濃度施加至上面固定有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S (或另一CoV-S)之表面。該簡單競爭分析中之表面較佳地係BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)晶片(或適於表面電漿子共振(「SPR」)分析之其他介質)。量測結合SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之對照抗體與塗有COV-S之表面的結合。將單獨對照抗體與含有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之表面之此結合與對照抗體在測試抗體存在下之結合相比較。對照抗體在測試抗體存在下與含有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之表面的結合顯著減少表明，測試抗體與對照抗體識別實質上相同之抗原決定基，因此測試抗體與對照抗體「競爭」。使對照抗體之結合減少至少約20%或更高百分比、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更高百分比之任何測試抗體均可視為與對照抗體結合至實質上相同之抗原決定基或決定子的抗體。較佳地，此類測試抗體將使對照抗體與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之結合減少至少約50% (例如至少約60%、至少約70%或更高百分比)。應瞭解，對照抗體與測試抗體之次序可逆轉；亦即，在競爭分析中，對照抗體可首先結合至表面，且隨後使測試抗體與表面接觸。較佳地，使用下述「夾心型」結合分析。或者，先使對SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S抗原具有較高親和力的抗體結合至含有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S之表面，因為預期所觀察到的第二抗體(假定該等抗體競爭)之結合減少將具有較大程度。此類分析之其他實例提供在例如Saunal及Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1995)中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

另外，亦可使用基於西方墨點之分析來確定一種抗體是否與另一抗體結合COV-S上之一或多個相同或重疊之抗原決定基或測試抗體所結合之抗原決定基。在此分析中，製備對應於抗體所結合之抗原，亦即CoV-S蛋白的肽庫，其包含蛋白質之重疊部分，通常為10-25個、10-20個或10-15個胺基酸長。合成涵蓋CoV-S序列的此等不同重疊胺基酸肽且使其共價結合至PEPSPOTS ^TM硝化纖維膜(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)。隨後，製備墨點且根據製造商之建議進行探測。

基本上，免疫墨點分析隨後藉由螢光方式偵測庫中哪些肽結合至測試抗體且由此可鑑別抗原，亦即COV-S上之哪些殘基與測試抗體相互作用。(參見美國專利第7,935,340號，其以引用之方式併入本文中)。

此項技術中已知各種抗原決定基定位技術。舉例而言，抗原及抗體之X射線共結晶學；NMR；SPR (例如在25℃或37℃下)；基於陣列之寡肽掃描(或「肽掃描分析」)；定點突變誘發(例如丙胺酸掃描)；突變誘發定位；氫-氘交換；噬菌體呈現；及限制性蛋白水解係此項技術中熟知的所有抗原決定基定位技術(參見例如 Epitope Mapping Protocols: Second Edition, Methods in Molecular Biology,, 編者Mike Schutkowski及Ulrich Reineke, 第2版, New York, NY: Humana Press (2009)及 Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology,編者Glenn Morris, 第1版, New York, NY: Humana Press (1996)，兩者均以全文引用之方式併入本文中)。

鑑別一或多種與本文所述之單株抗體，例如表3至表6中所述之抗體，及例如VYD225、VYD224 (亦稱為ADI-80707)、ADI-75696、VYD223 (亦稱為ADI-75865)、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773，結合至實質上或基本上相同之抗原決定基的抗體，可容易地使用多種其中可評估抗體競爭的免疫篩選分析中之任一者確定。多種此類分析係此項技術中常規地實踐且熟知的(參見例如1997年8月26日頒予之美國專利第5,660,827號，其以引用之方式併入本文中)。應理解，無論如何皆不需要確定本文所描述之抗體所結合之抗原決定基來鑑別與本文所描述之單株抗體結合至相同或實質上相同之抗原決定基的抗體。

舉例而言，當待檢查之測試抗體係自不同動物來源獲得，或甚至屬於不同Ig同型時，可採用簡單的競爭分析，其中將對照抗體(例如表3至表6中所揭示之一種抗體)與測試抗體混合，且隨後施加至含有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S中之任一者或兩者的樣品，已知兩者各自被該等抗體結合。基於ELISA、放射免疫分析、西方墨點法及BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析(如本文實例部分中所描述)之方案適用於此類簡單競爭研究中。

在某些實施例中，該方法包含在施加至CoV-S抗原樣品之前，將對照抗體與不同量之測試抗體(例如以約1:1、1:2、1:10或約1:100之比)預混合一段時間。在其他實施例中，對照抗體及不同量之測試抗體可在暴露於CoV-S抗原樣品期間分開添加且混合。只要結合之抗體可區別於游離抗體(例如藉由使用分離或洗滌技術消除未結合之抗體)且對照抗體可區別於測試抗體(例如藉由使用物種特異性或同型特異性二級抗體或藉由用可偵測標記特異性標記對照抗體)，該方法可用於確定測試抗體減少對照抗體與COV-S抗原之結合，指示測試抗體識別與對照抗體(例如表3至表6中所揭示之抗體中之一者)實質上相同之抗原決定基。(經標記)對照抗體在完全不相關之抗體(不結合CoV-S之抗體)存在下之結合可充當對照高值。低對照值可藉由使經標記之對照抗體與相同但未標記之對照抗體一起培育來獲得，其中將發生競爭且減少標記抗體之結合。在測試分析中，標記抗體反應性在測試抗體存在下顯著降低表明測試抗體識別實質上相同之抗原決定基，亦即該測試抗體與標記對照抗體競爭。舉例而言，在約1:1或1:10與約1:100之間的對照抗體:測試抗體的任何比率下，使表3至表6中所揭示之一或多種抗體與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S抗原兩者之結合減少至少約50%，諸如至少約60%或更佳至少約70% (例如約65-100%)的任何測試抗體，被認為係與該抗體結合至實質上相同抗原決定基或決定子之抗體。較佳地，此類測試抗體使表3至表6中所揭示之抗體中之一或多者與SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S抗原中之至少一者、較佳各者的結合減少在無測試抗體存在下觀測到的表3至表6中所揭示之抗體中之一或多者之結合的較佳至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如約95%)。此等方法可適合於鑑別及/或評價與其他對照抗體競爭之抗體。

亦可有利地採用簡單競爭分析，其中將測試抗體以飽和濃度施加至上面固定有SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S或兩者之表面。該簡單競爭分析中之表面較佳地係適於OCTET®及/或PROTEON®之介質的表面。量測對照抗體(例如表3至表6中所揭示之一或多種抗體)與經CoV-S塗佈之表面的結合。將單獨對照抗體與含有CoV-S之表面之此結合與對照抗體在測試抗體存在下之結合相比較。對照抗體在測試抗體存在下與含有CoV-S之表面的結合顯著減少表明，測試抗體與對照抗體識別實質上相同之抗原決定基，因此測試抗體與對照抗體「競爭」。使對照抗體(例如表3至表6中所揭示之一或多種抗體)與SARS-CoV-S及SARS-CoV-2-S抗原兩者之結合減少至少約20%或更大、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更大的任何測試抗體，可視為與對照抗體(例如表3至表6中所揭示之一或多種抗體)結合至實質上相同之抗原決定基或決定子的抗體。較佳地，此類測試抗體將使對照抗體(例如表3至表6中所揭示之一或多種抗體)與CoV-S抗原之結合減少至少約50% (例如至少約60%、至少約70%或更大)。應瞭解，對照抗體與測試抗體之次序可逆轉；亦即，在競爭分析中，對照抗體可首先結合至表面，且隨後使測試抗體與表面接觸。較佳地，先使對SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S具有較高親和力的抗體結合至含有CoV-S之表面，因為預期所觀察到的第二抗體(假定該等抗體競爭)之結合減少將具有較大程度。此類分析之其他實例提供在例如Saunal及Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1989)中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。

確定抗體、其抗原結合片段或抗體衍生物，例如本文中舉例說明之抗CoV-S抗體中之任一者的親和力成熟抗體或抗原結合片段是否結合至以上所定義之抗原決定基區之一內可以熟習此項技術者已知之方式進行。在此類定位/表徵方法中之另一個實例中，抗CoV-S抗體之抗原決定基區可藉由抗原決定基「足跡法」，使用對SARS-CoV-S及SARS-CoV-2-S蛋白中暴露之胺/羧基進行化學修飾來確定。此類足跡技術之一個具體實例係使用藉由質譜法偵測之氫-氘交換(「HXMS」)，其中發生受體與配位體蛋白質醯胺質子之氫/氘交換、結合及換回，其中參與蛋白質結合之主鏈醯胺基團經保護以免於換回且因此將保持氘化。相關區域此時可藉由胃蛋白酶蛋白水解、快速微孔高效液相層析分離及/或電噴霧電離質譜分析來鑑別(參見例如Ehring H., Analytical Biochemistry, 267(2):252-259 (1999)及Engen, J. R. & Smith, D. L., Anal. Chem., 73:256A-265A (2001))。適合抗原決定基鑑別技術之另一實例係核磁共振抗原決定基定位(「NMR」)，其中通常將在游離抗原及與抗原結合肽(諸如抗體)複合之抗原的二維NMR光譜中信號之位置相比較。抗原通常選擇性地經 ¹⁵N同位素標記，使得在NMR-光譜中僅對應於抗原之信號可見且來自抗原結合肽之信號不可見。與游離抗原之光譜比較，源自於涉及與抗原結合肽之相互作用之胺基酸的抗原信號在複合物光譜中通常會移位，且可以該方式鑑別參與結合之胺基酸。參見例如 Ernst Schering Res. Found. Workshop,(44):149-67 (2004); Huang等人， J. Mol. Biol., 281(1):61-67 (1998)；及Saito及Patterson, Methods,9(3):516-24 (1996)。抗原決定基定位/表徵亦可使用質譜分析(「MS」)方法執行(參見例如Downard, J. Mass Spectrom., 35(4):493-503 (2000)及Kiselar及Downard, Anal. Chem., 71(9):1792-801 (1999))。

蛋白酶消化技術亦可用於抗原決定基定位及鑑別之情形。抗原決定子相關區域/序列可藉由蛋白酶消化，例如藉由使用約1:50比率的胰蛋白酶相對於SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S，在37℃及pH 7-8下消化隔夜(「o/n」)，隨後使用質譜(「MS」)分析鑑別肽來確定。隨後，受抗CoV-S抗體保護以免胰蛋白酶裂解的肽可藉由比較經歷胰蛋白酶消化之樣品以及與抗體一起培育且隨後經歷例如胰蛋白酶消化之樣品(由此揭露該抗體之足跡)來鑑別。其他酶，如胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶，亦可用於類似抗原決定基表徵方法中。另外，酶消化可提供一種用於分析在CoV-S結合多肽之情形下潛在抗原決定子序列是否在CoV-S之區內的快速方法。若多肽未經歷表面暴露，則其很可能在免疫原性/抗原性方面不相關(關於類似技術之論述參見例如Manca, Ann. Ist. Super. Sanit à .,27(1):15-9 (1991))。

定點突變誘發係可用於表徵結合抗原決定基之另一種技術。舉例而言，在「丙胺酸掃描」定點突變誘發(例如亦稱為丙胺酸掃描、丙胺酸掃描突變誘發、丙胺酸掃描突變、組合丙胺酸掃描或產生丙胺酸點突變)中，經由諸如直接肽或蛋白質合成、定點突變誘發、GENEART™突變誘發服務(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA U.S.A.)或鳥槍突變誘發之方法，用丙胺酸殘基(或在野生型序列中存在丙胺酸情況下，使用另一殘基，諸如纈胺酸)置換蛋白質區段內的各殘基。由此，使用此技術產生該分子之一系列單點突變體；產生的突變體之數目等於該分子中殘基之數目，各殘基係一次一個地經單一丙胺酸殘基置換。由於丙胺酸的體積不大、具化學惰性之甲基官能基可模擬許多其他胺基酸可能具有的二級結構偏好，故一般使用丙胺酸置換原生(野生型)殘基。隨後，可使用諸如但不限於SPR結合實驗之類方法，量測用丙胺酸置換原生殘基對丙胺酸掃描突變體與其結合搭配物之結合親和力所具有的影響。若突變導致結合親和力顯著降低，則該突變殘基很可能參與結合。對結構抗原決定基具有特異性之單株抗體(亦即，不結合未摺疊蛋白質之抗體)可用作結合親和力實驗之陽性對照以驗證丙胺酸置換不會影響蛋白質之總體三級結構(因為蛋白質總體摺疊之變化可能間接影響結合且由此產生假陽性結果)。參見例如Clackson及Wells, Science, 267:383-386 (1995); Weiss等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16):8950-8954 (2000)；及Wells, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,93:1-6 (1996)。實例5鑑別出CoV-S中與本文所揭示之抗CoV-S抗體特異性相互作用的特定抗原決定基或殘基。

電子顯微法亦可用於抗原決定基「足跡法」。舉例而言，Wang等人， Nature, 355:275-278(1992)使用低溫電子顯微法、三維影像重建及X射線結晶學之協調應用來確定Fab片段在原生豇豆嵌紋病毒(cowpea mosaic virus)之衣殼表面上的物理足跡。

用於抗原決定基評價的其他形式之「無標記」分析包括SPR (在商業上作為BIACORE®系統，GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA出售)及反射量測干涉光譜法(reflectometric interference spectroscopy，「RifS」) (參見例如Fagerstam等人， Journal of Molecular Recognition,3:208-14 (1990); Nice等人， J. Chromatogr., 646:159-168 (1993); Leipert等人， Angew. Chem. Int. Ed., 37:3308-3311 (1998); Kroger等人， Biosensors and Bioelectronics,17:937-944 (2002))。

表述「構架區」或「FR」係指在抗體輕鏈及重鏈之可變區內的一或多個構架區(參見Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987))。此等表述包括插入在抗體輕鏈及重鏈之可變區內之CDR之間的彼等胺基酸序列區。

術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為原生序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自處於位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基端伸展。Fc區中之殘基編號為如在Kabat中EU指數之編號。Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域：CH2及CH3。

術語「Fc受體」或「FcR」描述結合至抗體Fc區之受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的FcR。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有類似的胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域。FcR在Ravetch及Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)；Capel等人， Immunomethods, 4:25-34 (1994)；及de Haas等人， J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)中綜述。「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人， J. Immunol., 117:587 (1976)；及Kim等人， J. Immunol., 24:249 (1994))，且主要用於調節及/或延長循環中抗體之半衰期。就所揭示之抗CoV-S抗體係非醣基化的情況而言，根據表現系統及/或序列，預期主題抗體結合FcRn受體，但不結合(或最低限度地結合) Fcγ受體。

「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之至少一種效應功能。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(「CDC」)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(「ADCC」)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B細胞受體(「BCR」))等。此類效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用此項技術中已知用於評價此類抗體效應功能之各種分析來評估。

「原生序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾而不同於原生序列Fc區，但保留原生序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區，變異Fc區較佳具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代；且在原生序列Fc區中或親本多肽之Fc區中較佳具有約一個至約五個胺基酸取代。本文中之變異Fc區較佳地與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少約90%序列一致性，更佳地與其具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合抗體片段的Fc區可結合至Fc受體(FcR)。FcR可為但不限於Fcγ受體(FcgR)、FcgRI、FcgRIIA、FcgRIIB1、FcgRIIB2、FcgRIIIA、FcgRIIIB、Fcε受體(FceR)、FceRI、FceRII、Fcα受體(FcaR)、FcaRI、Fcα/μ受體(Fca/mR)或新生兒Fc受體(FcRn)。Fc可為IgM、IgD、IgG、IgE或IgA同型。IgG同型可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

已知Fc區中之某些胺基酸修飾可調節Ab效應功能及特性，諸如但不限於抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及半衰期(Wang X.等人，Protein Cell. 2018年1月; 9(1): 63-73; Dall'Acqua W. F.等人，J Biol Chem. 2006年8月18日;281(33):23514-24. 電子版2006年6月21日; Monnet C.等人，Front Immunol. 2015年2月4日;6:39. doi: 10.3389/fimmu.2015.00039. eCollection 2015)。突變可為對稱或不對稱的。在某些情況下，含具有一或多個不對稱突變之Fc區(亦即，兩個Fc區不一致)的抗體可提供較佳的功能，諸如ADCC (Liu Z.等人J Biol Chem. 2014年2月7日; 289(6): 3571-3590)。

本文所揭示之抗體可變區序列中之任一者均可與野生型(WT) Fc或變異Fc組合使用。

IgG1型Fc視情況可包含一或多個胺基酸取代。此類取代可包括例如N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、G236缺失、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y、M428L、N434S、L328F、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據如Kabat中之EU索引) (Dall'Acqua W. F.等人，J Biol Chem. 2006年8月18日;281(33):23514-24. 電子版2006年6月21日; Wang X.等人，Protein Cell. 2018年1月; 9(1): 63-73)或例如N434A、Q438R、S440E、L432D、N434L及/或其任何組合(殘基編號根據EU編號)。Fc區可進一步包含一或多個額外胺基酸取代。此類取代可包括但不限於A330L、L234F、L235E、P3318及/或其任何組合(殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。IgG1型Fc之特定例示性取代組合包括但不限於：M252Y、S254T及T256E (「YTE」變異體)；M428L及N434A (「LA」變異體)、M428L及N434S (「LS」變異體)；M428L、N434A、Q438R及S440E (「LA-RE」變異體)；L432D及N434L (「DEL」變異體)；及L234A、L235A、L432D及N434L (「LALA-DEL」變異體) (殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。

當Ab係IgG2時，Fc區視情況可包含一或多個胺基酸取代。此類取代可包括但不限於P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。Fc區視情況可進一步包含一或多個額外胺基酸取代。此類取代可包括但不限於M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。

IgG3型Fc區視情況可包含一或多個胺基酸取代。此類取代可包括但不限於E235Y (殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。

IgG4型Fc區視情況可包含一或多個胺基酸取代。此類取代可包括但不限於E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合(殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。該取代可例如為S228P (殘基編號係根據如Kabat中之EU索引)。

在一些情況下，人類樣Fc區之聚醣可經工程改造以改變效應功能(例如，參見Li T.等人， Proc Natl Acad Sci U S A.2017年3月28日;114(13):3485-3490. doi: 10.1073/pnas.1702173114. 電子版2017年3月13日)。 B. 對 CoV-S 具有結合活性之抗 CoV-S 抗體及其結合片段

本發明提供抗體或其抗原結合片段，其顯示針對迄今所描述之所有SARS-CoV-2關注變異體(VOC)之廣泛活性(包括BA.1/ο變異體)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段能夠結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)。在一些實施例中，該CoV-S為SARS-CoV棘蛋白(「SARS-CoV-S」)及/或SARS-CoV-2棘蛋白(「SARS-CoV-2-S」)。

在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段能夠結合至SARS-CoV-2變異體。在一些實施例中，SARS-CoV-2-S為B.1.1.7變異體、B. 1.351變異體、B.1.1.28變異體、B. 1.429變異體、P.1變異體、B.1.617變異體(例如B.1.617.1及B.1.617.2)、C.37變異體、1.621變異體、AY.1變異體、1.623變異體、C.36變異體、A.27變異體、AV.1變異體、B.1.1.482變異體、B.1.1.523變異體、B.1.427變異體、AY.4變異體、AY.11變異體、變異體、D614G變異體或B.1.1.529/BA.1變異體(亦稱為ο變異體)及其子譜系(例如BA1.1、BA.2、BA.2.75、BA.4、BA.5、BA.4.6、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1、XBB.1.5、BJ.1、BM.1.1.1、BA.2.3.20、BF.7、XBC、BN.1或CH.1.1)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至CoV-S之受體結合域(RBD)，例如來自B.1.1.529/BA.1變異體、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體、BA.2變異體、B. 1.351變異體、B.1.617變異體或D614G變異體之RBD。

在一些實施例中，可自經歷SARS-CoV-2，例如ο/BA.1突破性感染之個體分離抗體。如本文所用，術語「突破性感染」定義為在接受所有推薦劑量之疫苗之後14天，自個人收集之呼吸系統樣本中偵測到SARS-CoV-2 RNA或抗原。如以下實例中所證實，經歷BA.1突破性感染之個體顯示具有類似之與BA.1及野生型CoV-S及RBD的血清IgG結合效價，而未感染/經疫苗接種之個體展現相對於WT CoV-S及RBD降低之血清IgG BA.1結合。另外，經歷BA.1突破性感染之個體通常具有對BA.1及WT RBD之較高血清IgA結合效價。此外，經顯示，相對於mRNA疫苗接種，對BA.1 RBD抗原，BA.1突破性感染誘導類似IgG+ B細胞反應及較高程度IgA+ B細胞反應。BA.1突破性感染亦優先活化呈現與BA.1及原始Wuhan-1疫苗株系之交叉反應性的B細胞，且似乎將B細胞免疫顯性層級自S2次單元重定向至RBD。如實例中所示，BA.1突破性感染引發具有針對SARS-CoV-2 VOC之廣泛活性的RBD定向抗體。此等抗體代表用於治療性研發之有前景的候選物且提供用於研發誘導廣泛中和抗體反應之疫苗的構架。

抗體能夠結合至冠狀病毒之棘蛋白。CoV-S係指冠狀病毒之S蛋白，其在病毒粒子之表面上作為結構蛋白表現。如先前所提及，S蛋白在冠狀病毒結合至宿主細胞上之受體方面起重要作用且決定宿主趨向性(Zhu Z.等人， Infect Genet Evol. 2018年7月;61:183-184. doi: 10.1016/j.meegid.2018.03.028. 電子版2018年4月4日)。SARS-CoV及SARS-CoV-2經由S蛋白之受體結合域(RBD)結合至宿主細胞之血管收縮素轉化酶2 (ACE2)且使用ACE2作為受體進入宿主細胞(Ge X.Y.等人， Nature. 2013年11月28日;503(7477):535-8. doi: 10.1038/nature12711. 電子版2013年10月30日.; Hoffmann M.等人， Cell. 2020年3月4日. pii: S0092-8674(20)30229-4. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052)。SARS-CoV亦可使用CD209L (亦稱為L-SIGN)作為替代受體(Jeffers S. A.等人， Proc Natl Acad Sci U S A. 2004年11月2日;101(44):15748-53. 電子版2004年10月20日)。MERS-CoV經由S蛋白之不同RBD結合宿主細胞之二肽基肽酶4 (「DPP4」，亦稱為CD26)。冠狀病毒之細胞進入不僅取決於S蛋白質與宿主細胞受體之結合，而且通常亦取決於宿主細胞蛋白酶對S蛋白質之激活，且近來發現，SARS-CoV-2使用絲胺酸蛋白酶TMPRSS2進行S蛋白質之激活且隨後使用ACE2實現進入(Wu A.等人， Cell Host Microbe. 2020年3月11日;27(3):325-328. doi: 10.1016/j.chom.2020.02.001. Epub 2020年2月7日; Hoffmann M.等人， Cell. 2020年3月4日. pii: S0092-8674(20)30229-4. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052)。

SARS-CoV之S蛋白稱為SARS-CoV-S且可例如包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列(1288個胺基酸)。SARS-CoV-2之S蛋白稱為SARS-CoV-2-S且可例如包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列(1273個胺基酸)。

本發明提供結合(例如特異性結合)至CoV之例示性抗體及抗原結合抗體片段，其中此等抗體及抗原結合抗體片段中之至少一些結合至SARS-CoV-2-S及/或SARS-CoV-2-S。歸因於不同CoV物種之間的序列相似性，本發明之此類抗體或抗原結合抗體片段亦可與其他CoV物種之S蛋白交叉反應。

本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的例示性S蛋白質包括例如：蝙蝠SARS CoV (GenBank寄存編號FJ211859)、SARS CoV (GenBank寄存編號FJ211860)、BtSARS.HKU3.1 (GenBank寄存編號DQ022305)、BtSARS.HKU3.2 (GenBank寄存編號DQ084199)、BtSARS.HKU3.3 (GenBank寄存編號DQ084200)、BtSARS.Rm1 (GenBank寄存編號DQ412043)、BtCoV.279.2005 (GenBank寄存編號DQ648857)、BtSARS.Rf1 (GenBank寄存編號DQ412042)、BtCoV.273.2005 (GenBank寄存編號DQ648856)、BtSARS.Rp3 (GenBank寄存編號DQ071615)、SARS CoV.A022 (GenBank寄存編號AY686863)、SARSCoV.CUHK-W1 (GenBank寄存編號AY278554)、SARSCoV.GDO1 (GenBank寄存編號AY278489)、SARSCoV.HC.SZ.61.03 (GenBank寄存編號AY515512)、SARSCoV.SZ16 (GenBank寄存編號AY304488)、SARSCoV.Urbani (GenBank寄存編號AY278741)、SARSCoV.civet010 (GenBank寄存編號AY572035)或SARSCoV.MA.15 (GenBank寄存編號DQ497008)、Rs SHC014 (GenBank®寄存編號KC881005)、Rs3367 (GenBank®寄存編號KC881006)、WiV1 S (GenBank®寄存編號KC881007)。

在一些實施例中，本文所提供之抗體及抗原結合抗體片段亦可結合至且中和現有的蝙蝠CoV或先前出現的蝙蝠CoV。具有此類結合及/或中和能力之抗體及抗原結合抗體片段將特別適用於未來可能由動物儲主(如蝙蝠)溢出引起的大流行病。

或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合(例如特異性結合)之CoV之S蛋白且中和其他物種(例如蝙蝠)之先前出現之冠狀病毒。

仍或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的S蛋白可包括例如：中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Riyadh_2_2012 (GenBank寄存編號KF600652.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_18_2013 (GenBank寄存編號KF600651.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_17_2013 (GenBank寄存編號KF600647.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_15_2013 (GenBank寄存編號KF600645.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_16_2013 (GenBank寄存編號KF600644.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_21_2013 (GenBank寄存編號KF600634)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_19_2013 (GenBank寄存編號KF600632)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Buraidah_1_2013 (GenBank寄存編號KF600630.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Hafr-Al-Batin_1_2013 (GenBank寄存編號KF600628.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_12_2013 (GenBank寄存編號KF600627.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Bisha_1_2012 (GenBank寄存編號KF600620.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Riyadh_3_2013 (GenBank寄存編號KF600613.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Riyadh_1_2012 (GenBank寄存編號KF600612.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_3_2013 (GenBank寄存編號KF186565.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_1_2013 (GenBank寄存編號KF186567.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_2_2013 (GenBank寄存編號KF186566.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒分離株Al-Hasa_4_2013 (GenBank寄存編號KF186564.1)、中東呼吸症候群冠狀病毒(GenBank寄存編號KF192507.1)、β冠狀病毒England 1-N1 (GenBank寄存編號NC_019843)、MERS-CoV_SA-N1 (GenBank寄存編號KC667074)、中東呼吸症候群冠狀病毒的以下分離株(GenBank寄存編號：KF600656.1、GenBank寄存編號：KF600655.1、GenBank寄存編號：KF600654.1、GenBank寄存編號：KF600649.1、GenBank寄存編號：KF600648.1、GenBank寄存編號：KF600646.1、GenBank寄存編號：KF600643.1、GenBank寄存編號：KF600642.1、GenBank寄存編號：KF600640.1、GenBank寄存編號：KF600639.1、GenBank寄存編號：KF600638.1、GenBank寄存編號：KF600637.1、GenBank寄存編號：KF600636.1、GenBank寄存編號：KF600635.1、GenBank寄存編號：KF600631.1、GenBank寄存編號：KF600626.1、GenBank寄存編號：KF600625.1、GenBank寄存編號：KF600624.1、GenBank寄存編號：KF600623.1、GenBank寄存編號：KF600622.1、GenBank寄存編號：KF600621.1、GenBank寄存編號：KF600619.1、GenBank寄存編號：KF600618.1、GenBank寄存編號：KF600616.1、GenBank寄存編號：KF600615.1、GenBank寄存編號：KF600614.1、GenBank寄存編號：KF600641.1、GenBank寄存編號：KF600633.1、GenBank寄存編號：KF600629.1、GenBank寄存編號：KF600617.1)、冠狀病毒棕蝠(Neoromicia)/PML-PHE1/RSA/2011 GenBank寄存編號：KC869678.2、蝙蝠冠狀病毒Taper/CII_KSA_287/Bisha/Saudi Arabia/GenBank寄存編號：KF493885.1、蝙蝠冠狀病毒Rhhar/CII_KSA_003/Bisha/Saudi Arabia/2013 GenBank寄存編號：KF493888.1、蝙蝠冠狀病毒Pikuh/CII_KSA_001/Riyadh/Saudi Arabia/2013 GenBank寄存編號：KF493887.1、蝙蝠冠狀病毒Rhhar/CII_KSA_002/Bisha/Saudi Arabia/2013 GenBank寄存編號：KF493886.1、蝙蝠冠狀病毒Rhhar/CII_KSA_004/Bisha/Saudi Arabia/2013 GenBank寄存編號：KF493884.1、BtCoV.HKU4.2 (GenBank寄存編號EF065506)、BtCoV.HKU4.1 (GenBank寄存編號NC_009019)、BtCoV.HKU4.3 (GenBank寄存編號EF065507)、BtCoV.HKU4.4 (GenBank寄存編號EF065508)、BtCoV 133.2005 (GenBank寄存編號NC 008315)、BtCoV.HKU5.5 (GenBank寄存編號EF065512)；BtCoV.HKU5.1 (GenBank寄存編號NC_009020)、BtCoV.HKU5.2 (GenBank寄存編號EF065510)、BtCoV.HKU5.3 (GenBank寄存編號EF065511)、人類β冠狀病毒2c Jordan-N3/2012 (GenBank寄存編號KC776174.1；人類β冠狀病毒2c EMC/2012 (GenBank寄存編號JX869059.2)、伏翼(Pipistrellus)蝙蝠冠狀病毒HKU5分離株(GenBank寄存編號：KC522089.1、GenBank寄存編號：KC522088.1、GenBank寄存編號：KC522087.1、GenBank寄存編號：KC522086.1、GenBank寄存編號：KC522085.1、GenBank寄存編號：KC522084.1、GenBank寄存編號：KC522083.1、GenBank寄存編號：KC522082.1、GenBank寄存編號：KC522081.1、GenBank寄存編號：KC522080.1、GenBank寄存編號：KC522079.1、GenBank寄存編號：KC522078.1、GenBank寄存編號：KC522077.1、GenBank寄存編號：KC522076.1、GenBank寄存編號：KC522075.1、GenBank寄存編號：KC522104.1、GenBank寄存編號：KC522104.1、GenBank寄存編號：KC522103.1、GenBank寄存編號：KC522102.1、GenBank寄存編號：KC522101.1、GenBank寄存編號：KC522100.1、GenBank寄存編號：KC522099.1、GenBank寄存編號：KC522098.1、GenBank寄存編號：KC522097.1、GenBank寄存編號：KC522096.1、GenBank寄存編號：KC522095.1、GenBank寄存編號：KC522094.1、GenBank寄存編號：KC522093.1、GenBank寄存編號：KC522092.1、GenBank寄存編號：KC522091.1、GenBank寄存編號：KC522090.1、GenBank寄存編號：KC522119.1、GenBank寄存編號：KC522118.1、GenBank寄存編號：KC522117.1、GenBank寄存編號：KC522116.1、GenBank寄存編號：KC522115.1、GenBank寄存編號：KC522114.1、GenBank寄存編號：KC522113.1、GenBank寄存編號：KC522112.1、GenBank寄存編號：KC522111.1、GenBank寄存編號：KC522110.1、GenBank寄存編號：KC522109.1、GenBank寄存編號：KC522108.1、GenBank寄存編號：KC522107.1、GenBank寄存編號：KC522106.1、GenBank寄存編號：KC522105.1)、伏翼蝙蝠冠狀病毒HKU4分離株(GenBank寄存編號：KC522048.1、GenBank寄存編號：KC522047.1、GenBank寄存編號：KC522046.1、GenBank寄存編號：KC522045.1、GenBank寄存編號：KC522044.1、GenBank寄存編號：KC522043.1、GenBank寄存編號：KC522042.1、GenBank寄存編號：KC522041.1、GenBank寄存編號：KC522040.1、GenBank寄存編號：KC522039.1、GenBank寄存編號：KC522038.1、GenBank寄存編號：KC522037.1、GenBank寄存編號：KC522036.1、GenBank寄存編號：KC522048.1、GenBank寄存編號：KC522047.1、GenBank寄存編號：KC522046.1、GenBank寄存編號：KC522045.1、GenBank寄存編號：KC522044.1、GenBank寄存編號：KC522043.1、GenBank寄存編號：KC522042.1、GenBank寄存編號：KC522041.1、GenBank寄存編號：KC522040.1、GenBank寄存編號：KC522039.1、GenBank寄存編號：KC522038.1、GenBank寄存編號：KC522037.1、GenBank寄存編號：KC522036.1、GenBank寄存編號：KC522061.1、GenBank寄存編號：KC522060.1、GenBank寄存編號：KC522059.1、GenBank寄存編號：KC522058.1、GenBank寄存編號：KC522057.1、GenBank寄存編號：KC522056.1、GenBank寄存編號：KC522055.1、GenBank寄存編號：KC522054.1、GenBank寄存編號：KC522053.1、GenBank寄存編號：KC522052.1、GenBank寄存編號：KC522051.1、GenBank寄存編號：KC522050.1、GenBank寄存編號：KC522049.1、GenBank寄存編號：KC522074.1、GenBank寄存編號：KC522073.1、GenBank寄存編號：KC522072.1、GenBank寄存編號：KC522071.1、GenBank寄存編號：KC522070.1、GenBank寄存編號：KC522069.1、GenBank寄存編號：KC522068.1、GenBank寄存編號：KC522067.1、GenBank寄存編號：KC522066.1、GenBank寄存編號：KC522065.1、GenBank寄存編號：KC522064.1、GenBank寄存編號：KC522063.1或GenBank寄存編號：KC522062.1。

或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的S蛋白可包括例如：FCov.FIPV.79.1146.VR.2202 (GenBank寄存編號NV_007025)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV) (GenBank寄存編號NC_002306；GenBank寄存編號Q811789.2；GenBank寄存編號DQ811786.2；GenBank寄存編號DQ811788.1；GenBank寄存編號DQ811785.1；GenBank寄存編號X52157.1；GenBank寄存編號AJ011482.1；GenBank寄存編號KC962433.1；GenBank寄存編號AJ271965.2；GenBank寄存編號JQ693060.1；GenBank寄存編號KC609371.1；GenBank寄存編號JQ693060.1；GenBank寄存編號JQ693059.1；GenBank寄存編號JQ693058.1；GenBank寄存編號JQ693057.1；GenBank寄存編號JQ693052.1；GenBank寄存編號JQ693051.1；GenBank寄存編號JQ693050.1)或豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV) (GenBank寄存編號NC_001961.1；GenBank寄存編號DQ811787)。

或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的S蛋白可包括例如：BtCoV.1A.AFCD62 (GenBank寄存編號NC_010437)、BtCoV.1B.AFCD307 (GenBank寄存編號NC_010436)、BtCov.HKU8.AFCD77 (GenBank寄存編號NC_010438)、BtCoV.512.2005 (GenBank寄存編號DQ648858)、豬流行性下痢病毒PEDV.CV777 (GenBank寄存編號NC_003436、GenBank寄存編號DQ355224.1、GenBank寄存編號DQ355223.1、GenBank寄存編號DQ355221.1、GenBank寄存編號JN601062.1、GenBank寄存編號N601061.1、GenBank寄存編號JN601060.1、GenBank寄存編號JN601059.1、GenBank寄存編號JN601058.1、GenBank寄存編號JN601057.1、GenBank寄存編號JN601056.1、GenBank寄存編號JN601055.1、GenBank寄存編號JN601054.1、GenBank寄存編號JN601053.1、GenBank寄存編號JN601052.1、GenBank寄存編號JN400902.1、GenBank寄存編號JN547395.1、GenBank寄存編號FJ687473.1、GenBank寄存編號FJ687472.1、GenBank寄存編號FJ687471.1、GenBank寄存編號FJ687470.1、GenBank寄存編號FJ687469.1、GenBank寄存編號FJ687468.1、GenBank寄存編號FJ687467.1、GenBank寄存編號FJ687466.1、GenBank寄存編號FJ687465.1、GenBank寄存編號FJ687464.1、GenBank寄存編號FJ687463.1、GenBank寄存編號FJ687462.1、GenBank寄存編號FJ687461.1、GenBank寄存編號FJ687460.1、GenBank寄存編號FJ687459.1、GenBank寄存編號FJ687458.1、GenBank寄存編號FJ687457.1、GenBank寄存編號FJ687456.1、GenBank寄存編號FJ687455.1、GenBank寄存編號FJ687454.1、GenBank寄存編號FJ687453、GenBank寄存編號FJ687452.1、GenBank寄存編號FJ687451.1、GenBank寄存編號FJ687450.1、GenBank寄存編號FJ687449.1、GenBank寄存編號AF500215.1、GenBank寄存編號KF476061.1、GenBank寄存編號KF476060.1、GenBank寄存編號KF476059.1、GenBank寄存編號KF476058.1、GenBank寄存編號KF476057.1、GenBank寄存編號KF476056.1、GenBank寄存編號KF476055.1、GenBank寄存編號KF476054.1、GenBank寄存編號KF476053.1、GenBank寄存編號KF476052.1、GenBank寄存編號KF476051.1、GenBank寄存編號KF476050.1、GenBank寄存編號KF476049.1、GenBank寄存編號KF476048.1、GenBank寄存編號KF177258.1、GenBank寄存編號KF177257.1、GenBank寄存編號KF177256.1、GenBank寄存編號KF177255.1)、HCoV.229E (GenBank寄存編號NC_002645)、HCoV.NL63.Amsterdam.I (GenBank寄存編號NC_005831)、BtCoV.HKU2.HK.298.2006 (GenBank寄存編號EF203066)、BtCoV.HKU2.HK.33.2006 (GenBank寄存編號EF203067)、BtCoV.HKU2.HK.46.2006 (GenBank寄存編號EF203065)或BtCoV.HKU2.GD.430.2006 (GenBank寄存編號EF203064)。

或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的S蛋白可包括例如：HCoV.HKU1.C.N5 (GenBank寄存編號DQ339101)、MHV.A59 (GenBank寄存編號NC 001846)、PHEV.VW572 (GenBank寄存編號NC 007732)、HCoV.OC43.ATCC.VR.759 (GenBank寄存編號NC_005147)或牛腸冠狀病毒(BCoV.ENT) (GenBank寄存編號NC_003045)。

或者，本發明之抗體或抗原結合抗體片段可結合，例如特異性結合之CoV的S蛋白可包括例如：BtCoV.HKU9.2 (GenBank寄存編號EF065514)、BtCoV.HKU9.1 (GenBank寄存編號NC_009021)、BtCoV.HkU9.3 (GenBank寄存編號EF065515)或BtCoV.HKU9.4 (GenBank寄存編號EF065516)薩貝冠狀病毒(sarbecovirus)。

在一些情況下，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段以下述解離常數(KD)結合至CoV-S (例如SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S，及/或上文所列之CoV S蛋白中之任一者)：(i) 100 nM或更低；(ii)約10 nM或更低；(iii)約1 nM或更低；(iv)約100 pM或更低；(v)約10 pM或更低；(vi)約1 pM或更低；或(vii)約0.1 pM或更低。

在一些情況下，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段以下述解離常數(KD)結合至CoV-S (例如SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S，及/或上文所列之CoV S蛋白中之任一者)的RBD：(i) 100 nM或更低；(ii)約10 nM或更低；(iii)約1 nM或更低；(iv)約100 pM或更低；(v)約10 pM或更低；(vi)約1 pM或更低；或(vii)約0.1 pM或更低。

在一些情況下，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段以下述解離常數(KD)結合至B.1.1.529/BA.1變異體、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體、B.1351變異體或B.1.617.2變異體的CoV-S的RBD：(i) 100 nM或更低；(ii)約10 nM或更低；(iii)約1 nM或更低；(iv)約100 pM或更低；(v)約10 pM或更低；(vi)約1 pM或更低；或(vii)約0.1 pM或更低。

本發明提供結合CoV-S (包括人類CoV-S)之例示性抗體或其抗原結合片段，其視情況可為親和力成熟的。結合CoV-S之其他抗體或其抗原結合片段(包括具有不同CDR及抗原決定基特異性之彼等)可使用本說明書之揭示內容且使用此項技術中一般已知的方法獲得。此類抗體及其抗原結合片段在活體內拮抗CoV-S之生物作用且因此可用於治療或預防COV-S相關病狀，包括尤其冠狀病毒感染。在較佳實施例中，根據本發明之抗體或其抗原結合片段包含本文所描述之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段的一或多個CDR、V _L鏈及/或V _H鏈。

在一些實施例中，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段將干擾、阻斷、減弱或調節COV-S與其在宿主細胞上之受體(例如ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4或CD26)或宿主細胞上激活S蛋白之蛋白質(例如TMPRSS2)之間的相互作用。若S蛋白與其受體之結合受阻斷或減少，則可禁止CoV病毒粒子進入細胞，亦即，阻止對其他細胞之感染。另外，若阻止S蛋白結合至激活S蛋白之蛋白質，則S蛋白將不會被活化且因此經由受體進入宿主細胞可減少，亦即，阻止對其他細胞之感染。

在一些情況下，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段係「中和」抗體，例如其實質上或完全阻止CoV-S與宿主受體或激活性蛋白(priming protein)之特異性相互作用。因此，CoV病毒粒子可實質上或完全地被宿主免疫細胞，諸如吞噬細胞，經由例如Fc受體介導之吞噬作用或由於病毒粒子在細胞外部之時間增加引起的單純吞噬作用來清除。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段例如藉由以阻止CoV-S結合至其在宿主細胞上之受體或激活性蛋白的位置及/或方式保持結合至CoV-S來中和CoV-S。因此，可實質上或完全地防止CoV病毒粒子進入細胞，亦即，防止對其他細胞之感染。

在某些實施例中，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段在活體外中和CoV (例如SARS-CoV及/或SARS-CoV-2)之IC50如下：約100 nM或更低、約50 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約500 pM或更低、約200 pM或更低、約100 pM或更低、約50 pM或更低、約20 pM或更低、約10 pM或更低、約5 pM或更低、約2 pM或更低或約1 pM或更低；或約500 ng/mL或更低、約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，其藉由本文實例中所描述之任何中和分析所量測。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，在活體外中和SARS-CoV-2之B.1.1.529/BA.1變異體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約60 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之B.1.1.529/BA.1變異體。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，在活體外中和SARS-CoV-2之BA2.75變異體、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、XBB.1變異體及/或XBB.1.5。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，活體外中和SARS-CoV-2之D614G變異體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段以約20 ng/mL或更低之IC50中和SARS-CoV-2之D614G變異體，

在一些情況下，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段或其混合液當投與感染冠狀病毒之宿主或易感染冠狀病毒者，諸如健康護理工作人員時，可促進宿主中針對冠狀病毒之中和反應，該中和反應足以允許宿主能夠產生有效的細胞介導之針對病毒的免疫反應，例如T細胞介導或細胞介素介導的針對冠狀病毒之免疫反應，及/或使宿主對其他治療方法，諸如藥物、抗病毒劑或其他生物試劑更具反應性。

如所提及，根據本發明之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段具有多種用途。舉例而言，主題抗體及片段可用於防治性或治療性應用，以及在結合分析中用於診斷。主題抗CoV-S抗體或其抗原結合片段可用於CoV-S，尤其人類CoV-S或其配位體之親和純化且可用於篩選分析中以鑑別CoV-S活性之其他拮抗劑。一些抗體或其抗原結合片段可用於抑制CoV-S與其在宿主細胞上之受體(例如ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4或CD26)或宿主細胞上激活S蛋白之蛋白質(例如TMPRSS2)的結合或抑制COV-S介導之活性及/或生物作用。

如本文所用，術語「與COV-S相關之一或多種生物作用」係指由COV-S介導、誘導或以其他方式可歸因於COV-S之任何生物作用，例如結合特性、功能特性及具有生物意義之其他特性。COV-S之非限制性例示性生物作用包括COV-S與其在宿主細胞上之受體(例如ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4或CD26)或宿主細胞上激活S蛋白之蛋白質(例如TMPRSS2)的結合、活化宿主細胞以允許病毒進入、由CoV進入免疫細胞(例如經由一或多個CoV抗原呈現於宿主細胞之MHC分子上)引起之免疫細胞活化及由此引起的發炎。主題抗CoV-S抗體能夠抑制此等例示性CoV-S生物活性中之一種、其組合或全部。舉例而言，本文所提供之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段可中和CoV病毒粒子或降低CoV病毒粒子之感染性。

根據本發明之抗體或其抗原結合片段可用於多種治療性應用。舉例而言，在一些實施例中，抗CoV-S抗體或其抗原結合片段可用於治療與CoV-S相關之病狀，諸如但不限於與CoV感染相關之症狀。CoV可為任何CoV，包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63，且亦可為上文所列CoV物種中之任一者。

CoV感染相關之症狀的具體實例係發熱、咳嗽、乾咳、呼吸短促或呼吸困難、疲勞、疼痛、流鼻涕、鼻塞、喉嚨痛、結膜炎、胸部疼痛、頭痛、肌肉痛、發冷、嗅覺喪失及味覺喪失，以及胃腸症狀，包括腹瀉。與冠狀病毒感染相關之併發症及/或疾病/病症可包括例如支氣管炎、肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸衰竭、器官衰竭、多器官系統衰竭、小兒科發炎性多系統症候群、急性呼吸窘迫症候群(在血液及器官中引起低氧的嚴重肺部病狀)、血栓、心臟病狀、心肌損傷、心肌炎、心臟衰竭、心跳停止、急性心肌梗塞、心律不整、靜脈血栓栓塞、加護後症候群、休克、過敏性休克、細胞介素釋放症候群、敗血性休克、彌漫性血管內凝血、缺血性中風、大腦內出血、微血管病性血栓形成、精神病、癲癇發作、非驚厥性癲癇持續狀態、創傷性腦損傷、中風、缺氧性腦損傷、腦炎、可逆性後部白質腦病、壞死性腦病、感染後腦炎、自體免疫介導之腦炎、急性彌漫性腦脊髓炎、急性腎損傷、急性肝損傷、胰臟損傷、免疫性血小板減少症、亞急性甲狀腺炎、胃腸併發症、麴黴病、對另一病毒或細菌感染之易感性增加及/或妊娠相關併發症。某些疾病及病狀，諸如高血壓、第1型糖尿病、肝病、超重、慢性肺病(包括囊腫性纖維化、肺纖維化及哮喘)，由移植、使用免疫抑制劑或HIV感染引起之免疫系統受損，以及腦及神經系統病狀，可增加CoV感染相關併發症及疾病之風險。

主題抗CoV-S抗體及其抗原結合片段可單獨使用或與其他活性劑或藥物(包括其他生物試劑)結合使用，以治療阻斷、抑制或中和CoV-S之活體內作用或者阻斷或抑制CoV-S與其在宿主細胞上之受體(例如ACE2、CD209L、L-SIGN、DPP4或CD26)或宿主細胞上激活S蛋白之蛋白質(例如TMPRSS2)之相互作用在治療上合乎需要的任何個體。

構成本發明之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段對CoV-S，諸如SARS-CoV-S或SARS-CoV-S2具有結合親和力。本發明之一些抗體以類似K _D(M)結合至SARS-CoV-S或SARS-CoV-S2，而本發明之一些抗體以比結合至SARS-CoV-S2低的K _D(M) (亦即，較高親和力)結合至SARS-CoV-S，且本發明之一些抗體以比結合至SARS-CoV-S低的K _D(M) (亦即，較高親和力)結合至SARS-CoV-S-2。

在此部分中鑑別根據本發明之例示性抗CoV抗體及其抗原結合片段，以及其特異性CDR。為方便起見，各舉例說明之抗體或其抗原結合片段及相應序列分別藉由如表 3 至表 6中所示之特定命名法標識。

構成本發明之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段對CoV-S，諸如SARS-CoV-S或SARS-CoV-S2具有結合親和力。本發明之一些抗體以類似K _D(M)結合至SARS-CoV-S或SARS-CoV-S2，而本發明之一些抗體以比結合至SARS-CoV-S2低的K _D(M) (亦即，較高親和力)結合至SARS-CoV-S，且本發明之一些抗體以比結合至SARS-CoV-S低的K _D(M) (亦即，較高親和力)結合至SARS-CoV-S-2。本發明之抗體對不同CoV-S蛋白之親和力提供於表 3 至表 6中。 C. 抗 CoV-S 抗體多肽序列及編碼其之核酸序列 本文所揭示之抗體

本發明具體提供之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段包括如表 3 至表 6中所示之抗體及其抗原結合片段中之任一者。任何Fc變異體可與本文所揭示之可變序列組合使用。

表 3 及表 5( 附錄 A 及 C)及表 4 及表 6( 附錄 B 及 D)顯示(i)個別抗體之VH、VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3、VH FR4、VL、VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3及VL FR4之胺基酸序列，及(ii)個別抗體之VH鏈及VL鏈之DNA序列。在一些實施例中，VH包含抗體之反向VH序列。在一些實施例中，VL序列包含抗體之反向VL序列。反向VH及VL序列包括逆轉生殖系序列之引子誘導之突變，且亦包括已逆轉為生殖系DNA密碼子之緘默胺基酸突變。 所揭示抗體之變化形式及編碼此類變化形式之聚核苷酸序列

在一個實施例中，本發明考慮抗CoV-S抗體或抗原結合抗體片段，其包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的(i) VH CDR3相同之VH CDR，(ii) VH CDR3及VL CDR3兩者相同之VH CDR3及VL CDR3兩者，(iii)對應CDR相同之至少1、2、3、4、5或6個CDR，或(iv) 6個CDR全部相同之6個CDR。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225。

在一些實施例中，本發明考慮抗CoV-S抗體或抗原結合抗體片段，其中(a) VH包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的VH之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列，及(b) VL包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的VL之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225。

在其他實施例中，本發明考慮視情況可為親和力成熟之抗CoV-S抗體或抗原結合抗體片段，其包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的(i) VH CDR3相同之VH CDR，(ii) VH CDR3及VL CDR3兩者相同之VH CDR3及VL CDR3兩者，(iii)對應CDR相同之至少1、2、3、4、5或6個CDR，或(iv) 6個CDR全部相同之6個CDR。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225。

在其他實施例中，本發明考慮視情況可為親和力成熟之抗CoV-S抗體或抗原結合抗體片段，其包含上一段之CDR要求(i)-(iv)之一，此外其中(a) VH包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的VH之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列，及(b) VL包含與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者的VL之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225或其抗原結合部分。

在其他實施例中，本發明包括對COV-S具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其視情況可為親和力成熟的，該等抗體及抗原結合片段與表3至表6中所揭示之抗體中之任一者結合相同抗原決定基。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225或其抗原結合部分。

在其他實施例中，視情況可為親和力成熟之本發明之抗CoV-S抗體及抗原結合片段包含以下或者由以下組成：上文所闡述之FR、CDR、VH及VL序列以及重鏈及輕鏈序列中之一或多者的組合，包括其全部，或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。

在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對COV-S具有結合特異性之Fab片段，或者由其組成。Fab片段較佳包括表3至表6中之抗體的VH及VL序列，或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。本發明之此實施例進一步包括含有此類VH及VL序列之添加、缺失及變異，同時保持對CoV-S之結合特異性的Fab。

在本文所描述之本發明之一些實施例中，Fab片段可藉由親本全抗體之酶消化(例如木瓜酶)產生。在本發明之另一實施例中，抗CoV-S抗體(諸如表3至表6中所揭示之抗體)及其Fab片段可經由在哺乳動物細胞，諸如CHO、NSO或HEK 293細胞；真菌、昆蟲或微生物系統，諸如酵母細胞中表現來產生。

在額外實施例中，本發明進一步關於編碼以下的聚核苷酸：與COV-S具有結合特異性之抗體多肽，包括表3至表6中之抗體之VH及VL，以及片段、變異體，視情況親和力成熟變異體，及上文所闡述之FR、CDR、VH及VL序列以及重鏈及輕鏈序列中之一或多者的組合，包括其全部，或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225或其抗原結合部分。

在其他實施例中，本發明考慮經分離之抗CoV-S抗體及抗原結合片段，其包含(i)與選自表3及表5之一種抗體或其變異體之VH相同的VH；及(ii)與選自表4及表6之另一種抗體或其變異體之VL相同的VL，其中視情況該V _H或V _L多肽中之構架區殘基(「FR殘基」)及/或CDR殘基中之一或多者經另一胺基酸殘基取代，產生結合，例如特異性結合CoV-S之抗CoV-S抗體。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225或其抗原結合部分。

本發明亦包括此等抗體之人源化、靈長類化及其他嵌合形式。該等嵌合抗體及人源化抗體可包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區之Fc。

在本發明之一些實施例中，嵌合抗體或人源化抗體或片段或VH或VL多肽源自於或衍生自一或多種人類抗體，例如自殖株人類B細胞群鑑別的人類抗體。

在一些態樣中，本發明提供載體，其包含編碼如本文所揭示之抗CoV-S抗體或其片段的核酸分子。在一些實施例中，本發明提供宿主細胞，其包含編碼如本文所揭示之抗CoV-S抗體或其片段的核酸分子。

在一些態樣中，本發明提供經分離抗體或其抗原結合片段，其與本文所揭示之抗體或其抗原結合片段競爭結合至CoV-S。

在一些態樣中，本發明提供一種核酸分子，其編碼本文所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。

在一些態樣中，本發明提供一種醫藥或診斷組合物，其包含至少一種如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。

在一些態樣中，本發明提供一種用於治療或預防個體的與CoV-S含量升高相關之病狀的方法，其包含向有需要之個體投與有效量的至少一種如本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段。

在一些態樣中，本發明提供一種抑制COV-S與個體中之其受體(例如ACE2、L-SIGN、CD209L、DPP4、CD26)或激活S蛋白之蛋白質(例如TMPRSS2)之結合的方法，其包含投與有效量的至少一種如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。舉例而言，投與表3至表6中之一或多種抗體可抑制CoV-S與其受體(例如ACE2)之結合。

在一些態樣中，本發明提供一種選擇性結合至CoV-S之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至CoV-S的K _D小於或等於5×10 ^-5M、10 ^-5M、5×10 ^-6M、10 ^-6M、5×10 ^-7M、10 ^-7M、5×10 ^-8M、10 ^-8M、5×10 ^-9M、10 ^-9M、5×10 ^-10M、10 ^-10M、5×10 ^-11M、10 ^-11M、5×10 ^-12M、10 ^-12M、5×10 ^-13M或10 ^-13M；較佳地，其K _D小於或等於5×10 ^-10M、10 ^-10M、5×10 ^-11M、10 ^-11M、5×10 ^-12M或10 ^-12M；更佳地，其K _D小於約100 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約25 pM、小於約1 pM、在約10 pM與約100 pM之間、在約1 pM與約100 pM之間、或在約1 pM與約10 pM之間。較佳地，抗CoV-S抗體或抗原結合片段與除SARS-CoV-S或SARS-CoV-2-S外的CoV之S蛋白具有交叉反應性。

本發明抗體及其抗原結合片段可經轉譯後修飾以添加效應部分，諸如化學連接子；可偵測部分，諸如螢光染料、酶、受質、生物發光材料、放射性材料及化學發光部分；或功能性部分，諸如鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素、細胞毒素、細胞毒性劑及放射性材料。

抗體及其抗原結合片段亦可經化學修飾以提供額外優勢，諸如多肽的增加之溶解度、穩定性及循環時間(活體內半衰期)，或降低之免疫原性(參見美國專利第4,179,337號)。用於衍生化之化學部分可選自水溶性聚合物，諸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇及其類似物。該等抗體及其片段可在該分子內之隨機位置處，或在該分子內的預先確定之位置處修飾，且可包括一個、兩個、三個或更多個連接之化學部分。

聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈。對於聚乙二醇，為處理及製造之簡易性，較佳之分子量在約1 kDa與約100 kDa之間(術語「約」指示在聚乙二醇之製備中，一些分子比所述分子量重，一些分子比所述分子量輕)。取決於所要治療型態(例如所要持續釋放之持續時間、對生物活性之影響(若存在)、處理之簡易性、抗原性之程度或缺乏抗原性及聚乙二醇對治療性蛋白質或類似物之其他已知影響)，可使用其他大小。舉例而言，聚乙二醇之平均分子量可為約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000 kDa。分支聚乙二醇描述於例如美國專利第5,643,575號；Morpurgo等人， Appl. Biochem. Biotechnol., 56:59-72 (1996); Vorobjev等人， Nucleosides and Nucleotides,18:2745-2750 (1999)；及Caliceti等人， Bioconjug. Chem.,10:638-646 (1999)中，其中各者之揭示內容以引用之方式併入本文中。

熟習此項技術者可使用多種連接方法(參見例如以引用的方式併入本文中的EP 0 401 384，揭示一種將PEG與G-CSF偶合之方法；及Malik等人， Exp.Hematol., 20:1028-1035(1992) (報導使用三氟乙烷磺醯氯使GM-CSF聚乙二醇化))。舉例而言，聚乙二醇可經胺基酸殘基經由反應性基團(諸如游離胺基或羧基)共價結合。反應性基團係活化聚乙二醇分子可結合之基團。具有游離胺基之胺基酸殘基可包括離胺酸殘基及N端胺基酸殘基；具有游離羧基之胺基酸殘基可包括天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基及C端胺基酸殘基。硫氫基亦可用作連接聚乙二醇分子之反應性基團。出於治療目的，較佳在胺基處連接，諸如在N端或離胺酸基團處連接。

如上文所描述，聚乙二醇可經由與多個胺基酸殘基中之任一者的鍵聯連接至蛋白質。舉例而言，聚乙二醇可經由與離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸殘基之共價鍵連接至多肽。可採用一或多種反應化學物質將聚乙二醇連接至特定胺基酸殘基(例如離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸)或連接至多於一種類型之胺基酸殘基(例如離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺酸及其組合)。

或者，活體內半衰期延長之抗體或其抗原結合片段可經由與白蛋白(包括但不限於重組人類血清白蛋白或其片段或變異體(參見例如美國專利第5,876,969號、EP 0 413 622及美國專利第5,766,883號，以全文引用之方式併入本文中))或其他循環血液蛋白(諸如運鐵蛋白或鐵蛋白)融合而產生。在一個較佳實施例中，本發明之多肽及/或抗體(包括其片段或變異體)與人類血清白蛋白之成熟形式(亦即，如EP 0 322 094之圖1及圖2中所示之人類血清白蛋白的胺基酸1-585)融合，該專利以全文引用之方式併入本文中。本發明亦涵蓋編碼本發明之融合蛋白的聚核苷酸。

關於可偵測部分，其他例示性酶包括但不限於辣根過氧化酶、乙醯膽鹼酯酶、鹼性磷酸酶、 β-半乳糖苷酶及螢光素酶。其他例示性螢光材料包括但不限於若丹明(rhodamine)、螢光素、異硫氰酸螢光素、傘酮、二氯三𠯤基胺、藻紅素及丹磺醯氯。其他例示性化學發光部分包括但不限於流明諾(luminol)。其他例示性生物發光物質包括但不限於螢光素及水母發光蛋白(aequorin)。其他例示性放射性材料包括但不限於碘125 ( ¹²⁵I)、碳14 ( ¹⁴C)、硫35 ( ³⁵S)、氚( ³H)及磷32 ( ³²P)。

此項技術中已知用於將抗體或其抗原結合片段與可偵測部分及其類似物結合的方法，諸如Hunter等人， Nature, 144:945 (1962)；David等人， Biochemistry, 13:1014 (1974)；Pain等人， J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)所描述之彼等方法。

本文所描述之實施例進一步包括與本文所闡述之抗體、抗體片段、雙功能抗體、SMIP、駱駝抗體、奈米抗體、IgNAR、多肽、可變區及CDR實質上同源之變異體及等效物。此等變異體及等效物可含有例如保守取代突變(亦即，一或多個胺基酸經類似胺基酸取代)。舉例而言，保守取代係指一種胺基酸經相同通用類別內之另一種取代，例如一種酸性胺基酸經另一酸性胺基酸取代，一種鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸取代，或一種中性胺基酸經另一中性胺基酸取代。保守胺基酸取代之意圖係此項技術中熟知的。

在其他實施例中，本發明考慮與本文所闡述之抗原結合片段、可變區及CDR之多肽序列中之任一者或多者具有至少90%或更高序列同源性的多肽序列。更佳地，本發明考慮與本文所闡述之抗原結合片段、可變區及CDR之多肽序列中之任一者或多者具有至少95%或更高序列同源性，甚至更佳地至少98%或更高序列同源性，且仍更佳地至少99%或更高序列同源性的多肽序列。

用於確定核酸與胺基酸序列之間的同源性的方法已為一般技術者所熟知。

在其他實施例中，本發明進一步考慮具有抗CoV-S活性的本文所闡述之抗原結合片段、可變區及CDR之上述之多肽同源物。抗CoV-S活性之非限制性實例闡述於本文中，例如抑制CoV-S與其受體，諸如ACE2或L-SIGN，或激活S蛋白之蛋白質之結合，由此減少進入細胞中之CoV的能力。

在其他實施例中，本發明進一步考慮結合前述序列中之任一者之抗體(包括但不限於抗個體基因型抗體)的產生及用途。在一個例示性實施例中，此類抗個體基因型抗體可向已接受抗CoV-S抗體之個體投與，以調節、降低或中和抗CoV-S抗體之作用。此類抗體亦可用於治療以存在抗CoV-S抗體為特徵之自體免疫疾病。此類抗體(例如抗個體基因型抗體)的另一個例示性用途係用於偵測本發明之抗CoV-S抗體，例如監測個體之血液或其他體液中存在之抗CoV-S抗體之含量。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供一種使用抗個體基因型抗體監測個體體內該抗CoV-S抗體或其抗原結合片段之活體內含量或中和投與該抗CoV-S抗體或其抗原結合片段之個體體內之該抗CoV-S抗體的方法。

本發明亦考慮抗CoV-S抗體，其包含本文所描述之多肽或聚核苷酸序列中之任一者，該等聚核苷酸序列經本文所描述之其他聚核苷酸序列中之任一者取代。舉例而言，本發明考慮包含本文所描述之VL及任一VH序列之組合的抗體，且進一步考慮由本文所描述之CDR序列中之任一者取代為本文所描述之其他CDR序列中之任一者產生的抗體，但不限於此。

本發明之另一個實施例考慮將此等聚核苷酸併入表現載體中以在哺乳動物細胞(諸如CHO、NSO或HEK-293細胞)中或在真菌、昆蟲或微生物系統(諸如酵母細胞)中表現。在本文所描述的本發明之一個實施例中，Fab片段可藉由在適合宿主中表現全長聚核苷酸之後，酶消化(例如番木瓜蛋白酶)表3至表6中之抗體中之任一者來產生。在另一實施例中，抗CoV-S抗體，諸如表3至表6中之任一抗體，或其Fab片段可經由在哺乳動物細胞，諸如CHO、NSO或HEK 293細胞，真菌、昆蟲或微生物系統，諸如酵母細胞中表現編碼表3至表6中之任一抗體之聚核苷酸產生。在一些實施例中，抗體為VYD225、VYD224、VYD223、ADI-75696、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773或其抗原結合部分。在一些實施例中，抗體為VYD224。在一些實施例中，抗體為VYD225或其抗原結合部分。

亦考慮包含該等聚核苷酸之宿主細胞及載體。

本發明進一步考慮包含編碼如本文所闡述之可變重鏈及輕鏈多肽序列以及個別CDR (高變區)之聚核苷酸序列的載體，以及包含該等載體序列之宿主細胞。在本發明之實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在本發明之實施例中，宿主細胞為酵母細胞。 D. 抗體組合

本發明亦提供一種組合物，其包含兩種或更多種如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段之組合。

在一些實施例中，組合物內之兩種或更多種抗體或其抗原結合片段結合至同一抗原決定基。在一些實施例中，組合物內之兩種或更多種抗體或其抗原結合片段結合至不同或非重疊抗原決定基。

在一些實施例中，組合物包含兩種或更多種選自由VYD225、VYD223及VYD224組成之群的經分離抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，組合物包含VYD225及VYD224。

包含兩種或更多種抗體或其抗原結合片段之組合物可調配成醫藥組合物且用於如本文所描述之方法。 E. 包含抗 CoV-S 抗體之抗體 - 藥物結合物

在一些態樣中，本發明進一步關於包含以下之抗體-藥物結合物(ADC)：(a)任何本文所描述之抗體或抗原結合抗體片段；及(b)直接或間接(例如經由連接子)與抗體或抗原結合抗體片段結合之藥物；及抗體-藥物結合物用於本申請案之方法的用途。

在一些態樣中，該藥物可為但不限於細胞毒性藥物、細胞凋亡藥物、免疫刺激藥物、抗微生物藥、抗細菌藥或疫苗、抗病毒藥、抗蠕蟲藥、抗寄生蟲藥、消炎藥、抗組織胺、抗纖維化藥、免疫抑制藥物、類固醇、支氣管擴張劑、β阻斷劑、ACE抑制劑、酶、絲胺酸蛋白酶抑制劑、毒素、放射性同位素、化合物、小分子、小分子抑制劑、蛋白質、肽、載體、質體、病毒粒子、奈米粒子、DNA分子、RNA分子、siRNA、shRNA、微RNA、寡核苷酸及成像藥物。

抗病毒藥可為瑞德西韋、法匹拉韋、達盧那韋、奈非那韋、沙奎那韋、洛匹那韋或利托那韋；抗蠕蟲藥可為伊維菌素；抗寄生蟲藥可為羥氯喹、氯喹或阿托喹酮；抗細菌藥或疫苗可為肺結核疫苗BCG；消炎藥可為環索奈德、TNF抑制劑(例如阿達木單抗)、TNF受體抑制劑(例如依那西普)、IL-6抑制劑(例如克拉紮珠單抗)、IL-6受體抑制劑(例如托珠單抗)或安乃近；抗組胺藥可為貝他斯汀；ACE抑制劑可為莫西普利；且抑制CoV-S之激活的藥物可為絲胺酸蛋白酶抑制劑，諸如萘莫司他。

毒素可為細菌、真菌、植物或動物毒素，或其片段。實例包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α帚麴菌素、油桐( Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白或美洲商陸( Phytolacca Americana)蛋白。

細胞毒性藥物或抗增生藥物可為例如但不限於小紅莓、道諾黴素、葫蘆素、毛殼素、球毛殼菌素、克林黴素、卡奇黴素、奈莫柔黴素、念珠藻素、蒙薩卡星、安絲菌素、絲裂黴素C、格爾德黴素、米徹黴素、蝴蝶黴素、番紅菌素、沖酯黴素、寡黴素、放線菌素、山卓黴素、寄端黴素、聚酮黴素、羥基玫瑰樹鹼、硫代秋水仙鹼、甲胺喋呤、雷公藤內酯、他托布林、乳胞素、海兔毒素、奧瑞他汀、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、特羅他汀、妥巴他汀A、康普瑞汀、類美登素、MMAD、MMAF、DM1、DM4、DTT、16-GMB-APA-GA、17-DMAP-GA、JW 55、吡咯并苯并二氮呯、SN-38、Ro 5-3335、普瓦那黴素、倍癌黴素、巴弗洛黴素、類紫杉醇、妥布賴森、阿魏醇、魯索爾A、煙黴素、吸水菌酯素、殺粉蝶黴素葡萄糖苷、瓢菌素、安三烯菌素、燼灰紅菌素、類鬼筆環肽、鬼筆環肽、植物鞘胺醇、殺粉蝶黴素、普洛尼汀、鬼臼毒素、短桿菌素A、血根鹼、西奈芬淨、荷伯希二烯、微鞘藻素B、微囊藻素、黏胞毒素A、單歧藻毒素、曲普林A、肌基質蛋白、黴菌毒素B、諾措林A、土荊皮丙酸B、偽神經素A、環巴胺、紅麴黃素、秋水仙鹼、阿非迪黴素、恩格爾林、蛹蟲草菌素、凋亡蛋白、埃坡黴素A、利馬醌、異卓酚酮、艾索妥拉林、喹哪朵肽、伊沙匹隆、艾洛普辛、銅綠菌素、農桿菌素、埃坡黴素或其衍生物(例如參見Polakis P.等人， Pharmacol Rev.2016年1月;68(1):3-19. doi: 10.1124/pr.114.009373) (藥物可獲自許多供應商，包括Creative Biolabs®)。

放射性同位素可為例如但不限於At ²¹¹、I ¹³¹、In ¹³¹、I ¹²⁵、Y ⁹⁰、Re ¹⁸⁶、Re ¹⁸⁸、Sm ¹⁵³、Bi ²¹²、P ³²、Pb ²¹²及Lu之放射性同位素。

在某些實施例中，該藥物可為但不限於MMAE或MMAF。

在一些實施例中，Ab或抗原結合Ab片段與藥物直接結合以形成ADC。

在一些實施例中，該抗體或抗原結合抗體片段與藥物間接結合以形成ADC。

可使用任何適當的結合方法來產生ADC (例如Nolting B. Methods Mol Biol.2013;1045:71-100. doi: 10.1007/978-1-62703-541-5_5; Jain N.等人， Pharm Res. 2015年11月;32(11):3526-40. doi: 10.1007/s11095-015-1657-7. 電子版2015年3月11日; Tsuchikama K.等人， Protein Cell.2018年1月;9(1):33-46. doi: 10.1007/s13238-016-0323-0. 電子版2016年10月14日; Polakis P.等人， Pharmacol Rev. 2016年1月;68(1):3-19. doi: 10.1124/pr.114.009373)。可用於執行結合之方法的實例包括但不限於化學結合及酶結合。

化學結合可利用例如但不限於離胺酸醯胺偶合、半胱胺酸偶合及/或藉由基因工程進行之非天然胺基酸併入。酶結合可利用例如但不限於使用轉肽酶進行之肽轉移、使用微生物轉麩醯胺酸酶進行之肽轉移及/或N-聚醣工程改造。

在某些態樣中，可使用一或多個可裂解連接子進行結合。可裂解連接子可能夠在回應於例如但不限於細胞外與細胞內環境(pH、氧化還原電位等)之間的環境差異時或藉由特定溶酶體酶裂解藥物。

可裂解連接子之實例包括但不限於腙連接子；肽連接子，包括組織蛋白酶B反應性連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子；二硫化物連接子，諸如N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基) (SPP)連接子或N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)連接子；及焦磷酸二酯連接子。

或者或同時，可使用一或多個不可裂解連接子。不可裂解連接子之實例包括硫醚連接子，諸如N-琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)及順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)連接子。一般而言，相較於可裂解連接子，不可裂解連接子對蛋白水解降解具有較高抗性且更穩定。 F. 包含抗 CoV-S 抗原結合抗體片段之嵌合抗原受體

本申請案進一步提供包含抗CoV-S抗原結合片段之嵌合抗原受體用於本發明之方法的用途。在一些實施例中，根據本發明之對CoV-S具特異性之化合物可為嵌合抗原受體(CAR)。特定言之，本發明之CAR包含結合至CoV-S之抗原結合(AB)域、跨膜(TM)域及細胞內信號傳導(ICS)域。

在一些實施例中，CAR可包含接合AB域與該TM域的鉸鏈。

在一些實施例中，CAR可包含一或多個協同刺激(CS)域。 AB 域

根據本發明之CAR將包含結合至COV-S之抗原結合(AB)域。在一些實施例中，CAR之AB域可包含本文所揭示之抗COV-S抗原結合抗體片段中之任一者。

在一些實施例中，CAR之AB域可包含本文所揭示之抗COV-S抗體中任一者的抗原結合域中之任一者。

在一些實施例中，CAR之AB域可包含本文所揭示之抗COV-S抗體、抗COV-S抗原結合抗體片段、抗COV-S多特異性Ab、抗COV-S多特異性抗原結合抗體片段及抗COV-S ADC，或其ABD中之任一者。

在一些實施例中，CAR之AB域可包含抗COV-S scFv。

在一些實施例中，AB域可包含與包含表3至表6中所揭示之抗體之VH及VL的scFv至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些態樣中，AB域可與一或多種表3至表6中所揭示之抗體競爭結合至COV-S。鉸鏈

在一些實施例中，CAR可在AB域與TM域之間包含鉸鏈序列。一般熟習此項技術者應瞭解，鉸鏈序列係促進可撓性之短胺基酸序列(參見例如Woof J.M.等人， Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004))。鉸鏈序列可為衍生自或獲自任何適合分子的任何適合序列。

在一些實施例中，鉸鏈序列之長度可基於CAR細胞外部分之所要長度最佳化，其可基於目標分子內抗原決定基之位置。舉例而言，若抗原決定基在目標分子內之近膜區中，則較長的鉸鏈可為最佳的。

在一些實施例中，鉸鏈可衍生自或包括免疫球蛋白Fc區之至少一部分，該免疫球蛋白Fc區例如為IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、IgG4 Fc區、IgE Fc區、IgM Fc區或IgA Fc區。在某些實施例中，鉸鏈包括在CH2及CH3域內的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA免疫球蛋白Fc區之至少一部分。在一些實施例中，鉸鏈亦可包括相應免疫球蛋白鉸鏈區之至少一部分。在一些實施例中，鉸鏈衍生自或包括經修飾之免疫球蛋白Fc區的至少一部分，該經修飾之免疫球蛋白Fc區例如為經修飾之IgG1 Fc區、經修飾之IgG2 Fc區、經修飾之IgG3 Fc區、經修飾之IgG4 Fc區、經修飾之IgE Fc區、經修飾之IgM Fc區或經修飾之IgA Fc區。經修飾之免疫球蛋白Fc區可具有一或多個突變(例如點突變、插入、缺失、複製)，產生使鉸鏈與Fc受體(FcR)之結合減少的一或多個胺基酸取代、修飾或缺失。在一些態樣中，經修飾之免疫球蛋白Fc區可設計成具有一或多個突變，該一或多個突變產生使鉸鏈與一或多個FcR之結合減少的一或多個胺基酸取代、修飾或缺失，該一或多個FcR包括但不限於FcγRI、FcγR2A、FcγR2B1、Fcγ2B2、Fcγ 3A、Fcγ 3B、FcεRI、FcεR2、FcαRI、Fcα/μR或FcRn。

在一些態樣中，免疫球蛋白恆定區之一部分可充當AB域(例如scFv或奈米抗體)與TM域之間的鉸鏈。鉸鏈可具有在抗原結合後使表現CAR之細胞的反應性相較於在不存在鉸鏈之情況下增加的長度。在一些實例中，鉸鏈之長度係或係約12個胺基酸或其長度不超過12個胺基酸。例示性鉸鏈包括具有至少約10至229個胺基酸、約10至200個胺基酸、約10至175個胺基酸、約10至150個胺基酸、約10至125個胺基酸、約10至100個胺基酸、約10至75個胺基酸、約10至50個胺基酸、約10至40個胺基酸、約10至30個胺基酸、約10至20個胺基酸或約10至15個胺基酸且包括在任一所列範圍之端點之間的任何整數的鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈具有約12個或更少胺基酸、約119個或更少胺基酸、或約229個或更少胺基酸。例示性鉸鏈包括CD28鉸鏈、單獨IgG4鉸鏈、連接至CH2及CH3域之IgG4鉸鏈，或連接至CH3域之IgG4鉸鏈。例示性鉸鏈包括但不限於Hudecek M.等人(2013) Clin. CancerRes., 19:3153；國際專利申請公開案第WO2014031687號；美國專利第8,822,647號；或公開之申請案第US2014/0271635號中所描述之鉸鏈。已知鉸鏈序列包括衍生自CD8α分子或CD28分子之鉸鏈序列。跨膜 (TM) 域

關於TM域，CAR可經設計以包含TM域，該TM域與CAR之AB域融合。鉸鏈序列可插入AB域與TM域之間。TM域可衍生自天然或合成來源。在來源為天然時，該域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。通常，TM域表示跨膜蛋白(亦稱為整合蛋白)之單一跨膜α螺旋。TM域可例如來源於CD28、CD3 ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCR α、TCR β或CD3 ζ及/或含有其功能性變異體(諸如保留其大部分結構(例如跨膜)特性者)之TM域(亦即，至少包含其跨膜區)。

或者，TM域可為合成的，在此情況下，TM域將主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。較佳地，將在合成TM域之兩端處發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。TM域一般在膜中具有熱力學穩定性。其可為單一α螺旋、跨膜β桶、短桿菌素A之β螺旋或任何其他結構。跨膜螺旋的長度通常為約20個胺基酸。

常用的TM域包含CD28 (例如人類CD28)之TM區。通常，使用例如長度在2與10個胺基酸之間的短寡肽或多肽間隔子在CAR之TM域與ICS域之間形成鍵聯。 細胞內信號傳導 (ICS) 域及協同刺激 (CS) 域

CAR之ICS域或細胞質域一般觸發或引起置放有CAR之細胞的至少一種正常效應功能的活化。術語「效應功能」係指細胞之特化功能。T細胞之效應功能例如可為溶胞活性或輔助活性，包括分泌細胞激素。因此，術語「細胞內信號傳導域」或「ICS域」係指蛋白質中轉導效應功能信號且引導細胞執行特化功能之部分。儘管通常可採用完整ICS域，但在許多情況下，不必使用完整鏈。至於使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，此類截短部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。因此，術語「細胞內信號傳導域」或「ICS域」意欲包括足以轉導效應功能信號的ICS域之任何截短部分。

已知ICS域之實例包括共同作用以在抗原受體接合之後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及輔助受體之細胞質序列，以及此等序列之任何衍生物或變異體，及具有相同功能能力之任何合成序列。

經由單獨一個ICS域產生之信號可能不足以完全活化細胞，且亦可能需要二級或協同刺激信號。在此類情況下，在CAR之細胞質部分中可包括協同刺激域(CS域)。CS域係轉導此類二級或協同刺激信號之域。在一些情況下，本發明之CAR可包含兩個或更多個CS域。該一或多個CS域可位於ICS域之上游或ICS域之下游。

T細胞活化可由兩個不同種類之細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初級活化的細胞質信號傳導序列(初級細胞質信號傳導序列)；及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或協同刺激信號的細胞質信號傳導序列(二級細胞質信號傳導序列)。初級細胞質信號傳導序列以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合物之初級活化。以刺激方式起作用之一級細胞質信號傳導序列可含有信號傳導基元，其稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM。此類細胞質信號傳導序列可含於本發明之CAR之ICS或CS域中。

含ITAM之初級細胞質信號傳導序列的實例包括衍生自淋巴球受體鏈之ICS域、TCR/CD3複合蛋白、Fc受體次單元、IL-2受體次單元、CD3ζ、FcR γ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66d、CD79a、CD79b、CD278 (ICOS)、Fcε RI、DAP10及DAP12的序列。常用之ICS域包含來源於CD3 ζ之細胞質信號傳導序列。在一些情況下，CD3ζ ICS域可與一或多個其他細胞質域組合。舉例而言，CAR之細胞質域可包含CD3 ζ ICS域及CS域，其中CS區係指包含協同刺激分子之細胞內域的CAR之一部分。協同刺激分子為淋巴球對抗原之有效反應所需的除抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。

協同刺激分子之實例包括I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白質)、活化NK細胞受體、鐸配位體受體(Toll ligand receptor)、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME (SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8 α、CD8 β、CD11a、LFA-1 (CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103、CRTAM、OX40 (CD134)、4-1BB (CD137)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160 (BY55)、SELPLG (CD162)、DNAM1 (CD226)、Ly9 (CD229)、SLAMF4 (CD244、2B4)、ICOS (CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、特異性結合CD83之配位體及其類似物。CAR之一或多個ICS域及CS域可按隨機或指定次序彼此連接，視情況經由短寡肽或多肽連接子，例如長度在2與10個胺基酸之間的連接子彼此連接。 例示性 CAR 構築體

CAR構築體可包含以下形式：「AB域-鉸鏈-TM域-CS域-ICS域」。

本發明之CAR可包含與以下例示性構築體中之任一者至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。在以下例示性構築體中，「抗CoV-S scFv」可為藉由連接表3至表6中揭示之抗CoV-S抗體中之任一者之VH及VL (按VH-連接子-VL或VL-連接子-VH之次序)產生的scFv。

在一些實施例中，前導序列(LS)可置於編碼CAR之聚核苷酸序列的上游。前導序列促進CAR在細胞表面上之表現。 進一步修飾

根據本發明之CAR、編碼其之核苷酸序列、編碼其之載體及包含編碼該等CAR之核苷酸序列的細胞可經進一步修飾、工程改造、最佳化或附接以便提供各種特徵或針對各種特徵選擇。此等特徵可包括但不限於功效、持久性、目標特異性、降低之免疫原性、多重靶向、增強之免疫反應、擴增、生長、降低之脫靶效應、降低之個體毒性、改善之目標細胞毒性、改善的疾病緩解性免疫細胞之引力、偵測、選擇、靶向及其類似特徵。舉例而言，該等細胞可經工程改造以表現另一CAR或具有自殺機制，且可經修飾以移除或改變內源性受體或分子(諸如TCR及/或MHC分子)之表現。

在一些實施例中，編碼CAR之載體或核酸序列進一步編碼其他基因。該載體或核酸序列可經構築以允許使用多種技術，包括共轉染兩個或更多個質體、使用多個啟動子或雙向啟動子或產生雙順反子或多順反子載體來共表現多個基因。多順反子載體之構築可包括編碼IRES元件或2A肽，諸如T2A、P2A、E2A或F2A (例如參見Kim, J.H.等人，「High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice」, PLoS One. 2011;6(4))。表現CAR之細胞可進一步包含一或多個內源性基因之破壞。功效

本發明之CAR及表現此等CAR之細胞可進一步修飾以改善針對表現目標分子之細胞的功效。該等細胞可為表現COV-S之細胞。該等表現COV-S之細胞可為癌細胞、血管細胞或任何其他目標疾病相關細胞。在一些實施例中，功效之改善可藉由增加針對表現目標分子之細胞的細胞毒性，例如針對癌細胞之細胞毒性來量測。在一些實施例中，功效之改善亦可藉由增加細胞毒性介體之產生來量測，該等細胞毒性介體諸如但不限於IFNγ、穿孔素及顆粒酶B。在一些實施例中，功效之改善可由當將表現CAR之細胞投與個體時疾病之標誌細胞介素減少或疾病症狀緩解顯示。可減少之其他細胞介素包括TGF-β、IL-6、IL-4、IL-10及/或IL-13。功效之改善可由COV-S特異性免疫細胞反應，諸如T細胞之細胞毒性顯示。在癌症之情況下，功效之改善可由較佳之腫瘤細胞毒性、腫瘤中較佳之浸潤、免疫抑制介體減少、減少之體重減輕、腹水之減少、腫瘤負荷減小及/或壽命增加顯示。在自體免疫疾病之情況下，自體反應性細胞之反應性降低或自體反應性T細胞、B細胞或Ab之減少可表示改善之功效。在一些實施例中，亦可研究基因表現譜以評價CAR之功效。

在一個態樣中，表現CAR之細胞經進一步修飾以逃脫或中和免疫抑制性介體之活性，該等免疫抑制性介體包括但不限於前列腺素E2 (PGE2)及腺苷。在一些實施例中，此逃脫或中和為直接的。在其他實施例中，此逃脫或中和係經由用一或多種結合搭配物(例如埃茲蛋白(ezrin))抑制蛋白激酶A (PKA)來介導。在一個特定實施例中，表現CAR之細胞進一步表現肽「調節次單元I錨定干擾物」(RIAD)。RIAD被認為可抑制蛋白激酶A (PKA)與埃茲蛋白之結合，由此阻止PKA對TCR活化之抑制(Newick K.等人 Cancer Immunol Res.2016年6月;4(6):541-51. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0263. 電子版2016年4月4日)。

在一些實施例中，本發明之表現CAR之細胞可誘導廣泛免疫反應，與抗原決定基擴展一致。

在一些實施例中，本發明之表現CAR之細胞進一步包含歸巢機制。舉例而言，該細胞可以轉殖基因方式表現一或多種刺激性趨化介素或細胞介素或其受體。在特定實施例中，該等細胞經基因修飾以表現一或多種刺激性細胞介素。在某些實施例中，使用一或多種歸巢機制來幫助本發明細胞更有效地積累於疾病部位。在一些實施例中，表現CAR之細胞經進一步修飾以在CAR活化時釋放誘導性細胞介素，例如以將先天性免疫細胞吸引至目標細胞或活化針對目標細胞之先天性免疫細胞(所謂的第四代CAR或TRUCKS)。在一些實施例中，CAR可共表現歸巢分子，例如CCR4或CCR2b，以增加向疾病部位之運輸。控制 CAR 表現

在一些情況下，調節CAR或表現CAR之細胞CAR之活性可為有利的。舉例而言，使用例如與二聚化域融合之凋亡蛋白酶誘導細胞凋亡(參見例如Di等人， N Engl. J. Med.2011年11月3日; 365(18):1673-1683)可用作本發明之CAR療法中的安全開關。在另一實例中，表現CAR之細胞亦可表現誘導性凋亡蛋白酶-9 (iCaspase-9)分子，該分子在投與二聚體藥物(例如，瑞米杜西(rimiducid) (亦稱為AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187 (Ariad))之後引起凋亡蛋白酶-9活化及細胞之凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介導二聚之二聚化學誘導劑(CID)結合域。此引起表現CAR之細胞之誘導性及選擇性耗乏。在一些情況下，iCaspase-9分子由與CAR編碼載體分離之核酸分子編碼。在一些情況下，iCaspase-9分子由與CAR編碼載體相同之核酸分子編碼。iCaspase-9可提供安全開關以避免表現CAR之細胞之任何毒性。參見例如Song等人 Cancer Gene Ther.2008; 15(10):667-75；臨床試驗Id號NCT02107963；及Di等人 N. Engl. J. Med.2011; 365:1673-83。

用於調節本發明之CAR療法之替代性策略包括利用例如藉由使表現CAR之細胞缺失，例如藉由誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)去活化或切斷CAR活性的小分子或抗體。舉例而言，本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現藉由能夠誘導細胞死亡(例如，ADCC或補體誘導之細胞死亡)的分子識別之抗原。舉例而言，本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現能夠由抗體或抗體片段靶向之受體。此類受體之實例包括EpCAM、VEGFR、整合素(例如整合素ανβ3、α4、αI3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族成員(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR，及其截短形式(例如保留一或多個細胞外抗原決定基但缺乏細胞質域內之一或多個區域的形式)。舉例而言，本文所描述之CAR表現細胞亦可表現缺乏信號傳導能力但保留由能夠誘導ADCC之分子(例如西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX®))識別之抗原決定基的截短表皮生長因子受體(EGFR)，使得西妥昔單抗之投與誘導ADCC及後續CAR表現細胞耗乏(參見例如WO2011/056894，及Jonnalagadda等人，「 Gene Ther.2013; 20(8)853-860)。

在一些實施例中，CAR細胞包含編碼自殺多肽(諸如RQR8)之聚核苷酸。參見例如WO2013153391A，其以全文引用之方式併入本文中。在包含聚核苷酸之CAR細胞中，自殺多肽可在CAR細胞之表面處表現。自殺多肽亦可包含胺基端處之信號肽。另一策略包括在本文所描述之表現CAR之細胞中表現組合來自CD32及CD20抗原兩者之目標抗原決定基的高度緊密標記物/自殺基因，其結合利妥昔單抗(rituximab)，例如藉由ADCC引起表現CAR之細胞的選擇性耗乏(參見例如，Philip等人， Blood2014; 124(8)1277-1287)。用於耗盡CAR表現細胞的其他方法包括投與CAMPATH®，其係選擇性結合及靶向成熟淋巴球(例如CAR表現細胞)以例如藉由誘導ADCC進行破壞的一種單株抗CD52抗體。在其他實施例中，表現CAR之細胞可使用CAR配位體(例如，抗個體基因型抗體)進行選擇性靶向。在一些實施例中，抗個體基因型抗體可引起效應細胞活性，例如ADCC或ADC活性，因此減少表現CAR之細胞之數目。在其他實施例中，CAR配位體(例如，抗個體基因型抗體)可偶合至誘導細胞殺死之試劑(例如，毒素)，藉此減少表現CAR之細胞之數目。或者，CAR分子本身可經組態使得活性可調節，例如打開及切斷，如下所述。

在一些實施例中，需要CAR活性可受控制的可調節CAR (RCAR)使CAR療法之安全性及功效最佳。在一些實施例中，RCAR包含一組多肽，在最簡單實施例中通常為兩個多肽，其中本文所描述之標準CAR的組分，例如AB域及ICS域，係分配於分開的多肽或成員上。在一些實施例中，該組多肽包括二聚開關，其在存在二聚分子時可將多肽彼此偶合，例如可將AB域與ICS域偶合。本文及以全文引用的方式併入本文中的國際公開案第WO2015/090229號中提供此類可調節CAR之額外描述及例示性組態。

在一態樣中，RCAR包含兩個多肽或成員：1)細胞內信號傳導成員，其包含ICS域(例如本文所描述之初級ICS域)及第一開關域；2)抗原結合成員，其包含如本文所描述之AB域(例如結合(例如特異性結合)本文所描述之目標分子的AB域)及第二開關域。視情況，RCAR包含本文所描述之TM域。在一實施例中，TM域可安置於細胞內信號傳導成員上、抗原結合成員上或兩者上。除非另外指示，否則當本文描述RCAR之成員或元件時，順序可如所提供，但亦可包括其他順序。換言之，在一實施例中，順序如文字所陳述，但在其他實施例中，順序可不同。例如，在跨膜區一側上之元件的次序可與實例不同，例如開關域相對於ICS域之位置可不同，例如反向。

在一些實施例中，表現CAR之免疫細胞可僅短暫表現CAR。舉例而言，本發明之細胞可用包含編碼本發明CAR之核酸序列的mRNA轉導。在此情形中，本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，以產生構築體，其含有3'及5'非轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、待表現之核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個實施例中，模板包括CAR之序列。在一實施例中，RNA CAR載體藉由電穿孔轉導至細胞中。 目標特異性

本發明之表現CAR之細胞除包含第一CAR外，可進一步包含一或多個CAR。此等額外CAR可對或可不對該第一CAR之目標分子具有特異性。在一些實施例中，該一或多個額外CAR可用作抑制性或活化性CAR。在一些態樣中，一些實施例之CAR係刺激性或活化性CAR；在其他態樣中，其係協同刺激CAR。在一些實施例中，細胞進一步包括抑制性CAR (iCAR，參見Fedorov等人， Sci. Transl. Medicine, 2013年12月; 5(215): 215ra172)，諸如識別除第一CAR之目標分子外之抗原的CAR，其中藉由抑制性CAR與其配位體之結合來減弱或抑制經由第一CAR遞送的活化信號，以例如減少脫靶效應。

在一些實施例中，CAR之AB域係免疫結合物或係免疫結合物之一部分，其中該AB域與一或多種異源分子，諸如但不限於細胞毒性劑、成像劑、可偵測部分、多聚合域或其他異源分子結合。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或酶活性毒素。在一些實施例中，AB域與一或多種細胞毒性劑結合，該一或多種細胞毒性劑諸如為化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。

在一些實施例中，為增強持久性，本發明之細胞可經進一步修飾以過度表現促存活信號，逆轉抗存活信號，過度表現Bcl-xL，過度表現hTERT，缺乏Fas或表現TGF-β顯性負受體。亦可藉由投與細胞介素，例如IL-2、IL-7及IL-15促進持久性。 G. B 細胞篩選及分離

在一個實施例中，本發明考慮可用於分離至少一種CoV-S抗原特異性細胞之抗原特異性B細胞殖株群的製備及分離，該殖株群可用於產生對所要CoV-S抗原具特異性的針對CoV-S之單株抗體，或對應於此類抗體之核酸序列。製備及分離該抗原特異性B細胞殖株群之方法教示於例如Carvalho-Jensen等人之美國專利公開案第US2007/0269868號中，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。製備及分離該抗原特異性B細胞殖株群之方法在本文之實例中亦有教示。依據大小或密度「富集」細胞群之方法係此項技術中已知的。參見例如美國專利第5,627,052號。除藉由抗原特異性富集細胞群之外，亦可使用此等步驟。 H. 產生抗體及其片段之方法

在另一個實施例中，本發明考慮用於產生抗CoV-S抗體及其片段之方法。產生抗體之方法係一般熟習此項技術者所熟知的。舉例而言，產生嵌合抗體之方法現為此項技術中熟知的(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號；Morrison等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:8651-55 (1984)；Neuberger等人， Nature, 314:268-270 (1985)；Boulianne, G.L.等人， Nature, 312:643-46 (1984)，其中各者之揭示內容以全文引用的方式併入本文中)。

如上文所提及，產生人源化抗體之方法現為此項技術中熟知的(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號；Winter之美國專利第5,225,539號及第6,548,640號；Carter等人之美國專利第6,054,297號、第6,407,213號及第6,639,055號；Adair之美國專利第6,632,927號；Jones, P.T.等人， Nature, 321:522-525 (1986)；Reichmann, L.等人， Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen, M.等人， Science, 239:1534-36 (1988)，其中各者之揭示內容以全文引用的方式併入本文中)。

具有CoV-S結合特異性的本發明之抗體多肽亦可藉由使用一般熟習此項技術者熟知之習知技術構築表現載體來產生，該表現載體含有啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及編碼抗體重鏈之DNA序列，其中編碼抗體特異性所需之CDR的DNA序列衍生自非人類細胞來源，例如兔或嚙齒動物B細胞來源，而編碼抗體鏈其餘部分之DNA序列衍生自人類細胞來源。

第二表現載體係使用一般熟習此項技術者熟知之相同習知方式產生，該表現載體含有啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及編碼抗體輕鏈之DNA序列，其中編碼抗體特異性所需CDR之DNA序列衍生自非人類細胞來源，例如兔或嚙齒動物B細胞來源，而編碼該抗體鏈其餘部分之DNA序列衍生自人類細胞來源。

藉由一般技術者眾所周知之習知技術將表現載體轉染至宿主細胞中，從而產生經轉染之宿主細胞，該經轉染之宿主細胞藉由一般技術者眾所周知之習知技術培養，產生該等抗體多肽。

宿主細胞可用以上描述之兩個表現載體共轉染，第一表現載體含有編碼啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及輕鏈衍生多肽的DNA，且第二載體含有編碼啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及重鏈衍生多肽的DNA。兩個載體含有不同可選標記物，但較佳地達成實質上相同之重鏈及輕鏈多肽之表現。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼重鏈及輕鏈多肽兩者之DNA。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA、基因體DNA或兩者。

用於表現抗體多肽之宿主細胞可為細菌細胞，諸如大腸桿菌；或真核細胞，諸如巴斯德畢赤酵母( P. pastoris)。在一個實施例中，出於此目的，可使用明確定義類型之哺乳動物細胞，諸如骨髓瘤細胞、CHO細胞株、NSO細胞株或HEK293細胞株。

可構築載體之通用方法、產生宿主細胞所需之轉染方法及自該等宿主細胞產生抗體多肽所需之培養方法皆包括習知技術。雖然用於產生抗體之細胞株較佳為哺乳動物細胞株，但可替代地使用任何其他適合細胞株，諸如細菌細胞株，諸如大腸桿菌源性之細菌菌株；或酵母細胞株。

類似地，在產生後，即可根據此項技術中之標準程序純化抗體多肽，諸如錯流過濾、硫酸銨沈澱、親和管柱層析、疏水相互作用層析(「HIC」)及其類似方法。

本文所描述之抗體多肽亦可用於設計且合成可用於與本發明之抗體多肽相同之治療應用的肽或非肽模擬物(參見例如Saragobi等人， Science, 253:792-795 (1991)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。

在另一個實施例中，本發明考慮用於使結合至CoV-S之抗體重鏈及輕鏈人源化之方法。可應用於抗CoV-S抗體的用於使抗體重鏈及輕鏈人源化之例示性方法在本文中已鑑別且為此項技術中習知的。 I. 篩選分析

此處所描述之篩選分析可用於鑑別高親和力抗CoV-S Ab，其可用於治療展現CoV-S相關疾病或病症之症狀的個體的與CoV-S相關之疾病及病症。

在一些實施例中，抗體用作診斷工具。該抗體可用於分析樣品及/或個體中存在之CoV-S之量。如熟習此項技術者應瞭解，此類抗體不必為中和抗體。在一些實施例中，診斷抗體並非中和抗體。在一些實施例中，診斷抗體結合至與中和抗體所結合之抗原決定基不同的抗原決定基。在一些實施例中，兩種抗體不彼此競爭。

在一些實施例中，本文所揭示之抗體用於或提供於偵測哺乳動物組織或細胞中之CoV-S的分析套組及/或方法中，以便篩選/診斷與CoV-S含量變化相關之疾病或病症。該套組包含結合CoV-S之抗體以及用於指示抗體與CoV-S結合(若存在)及視情況指示CoV-S蛋白質含量的構件。用於指示抗體之存在的各種構件均可使用。舉例而言，可將螢光團、其他分子探針或酶連接至抗體且可以多種方式觀測抗體之存在。用於篩選此類病症之方法可涉及使用套組，或僅使用一種所揭示之抗體及確定該抗體是否結合至樣品中之CoV-S。熟習此項技術者將瞭解，較高或升高含量之CoV-S將使較大量之抗體結合至樣品中之CoV-S。因此，抗體結合程度可用於確定樣品中CoV-S的量。CoV-S之量超過預定量(例如未患CoV-S相關病症之人類個體將具有的量或範圍)之個體或樣品可表徵為患有CoV-S介導之病症。

本發明進一步提供一種用於偵測本發明之抗CoV-S抗體與CoV-S之結合的套組。特定言之，該套組可用於偵測與本發明之抗CoV-S抗體或其免疫反應性片段具有特異性反應性之CoV-S的存在。該套組亦可包括結合至受質之抗體、可與抗原反應之二級抗體及用於偵測二級抗體與抗原之反應的試劑。此類套組可為ELISA套組且可包含受質、一級及二級抗體(適當時)及任何其他所需試劑，諸如如本文所描述之可偵測部分、酶受質及呈色試劑。診斷套組亦可呈免疫墨點套組形式。診斷套組亦可呈化學發光套組(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)形式。診斷套組亦可為基於鑭系元素之偵測套組(PerkinElmer, San Jose, CA)。

熟練的臨床醫生將瞭解，生物樣品包括但不限於血清、血漿、尿液、糞便樣品、唾液、黏液、胸膜液、滑液及脊髓液。 J. 改善或減少與 CoV-S 相關之疾病及病症的症狀、或者治療或預防與 CoV-S 相關之疾病及病症的方法

本發明提供用於改善或減少與CoV-S相關之疾病及病症之症狀或治療或預防該等疾病及病症的方法。該等方法包含投與顯示針對所有SARS-CoV-2關注變異體(包括ο/BA.1變異體)以及SARS-CoV之廣泛活性的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至CoV-S之受體結合域(RBD)，例如來自B.1.1.529/BA.1變異體、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體、BA.2變異體、B. 1.351變異體、B.1.617變異體或D614G變異體之CoV-S的RBD。

表3至表6中所描述之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段(例如VYD225)以及組合亦可呈如下文更詳細地描述之醫藥組合物形式，以治療有效量投與至需要治療與CoV-S相關之疾病及病症的患者。

CoV感染之症狀可包括發熱、咳嗽、流鼻涕、鼻塞、喉嚨痛、支氣管炎、肺炎、呼吸短促、胸部疼痛、頭痛、肌肉痛、發冷、疲勞、結膜炎、腹瀉、嗅覺喪失及味覺喪失。與冠狀病毒感染相關之併發症及/或疾病/病症可包括例如支氣管炎、肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸衰竭、器官衰竭、多器官系統衰竭、小兒科發炎性多系統症候群、急性呼吸窘迫症候群(在血液及器官中引起低氧的嚴重肺部病狀)、血栓、心臟病狀、心肌損傷、心肌炎、心臟衰竭、心跳停止、急性心肌梗塞、心律不整、靜脈血栓栓塞、加護後症候群、休克、過敏性休克、細胞介素釋放症候群、敗血性休克、彌漫性血管內凝血、缺血性中風、大腦內出血、微血管病性血栓形成、精神病、癲癇發作、非驚厥性癲癇持續狀態、創傷性腦損傷、中風、缺氧性腦損傷、腦炎、可逆性後部白質腦病、壞死性腦病、感染後腦炎、自體免疫介導之腦炎、急性彌漫性腦脊髓炎、急性腎損傷、急性肝損傷、胰臟損傷、免疫性血小板減少症、亞急性甲狀腺炎、胃腸併發症、麴黴病、對另一病毒或細菌感染之易感性增加及/或妊娠相關併發症。某些疾病及病狀，諸如高血壓、第1型糖尿病、肝病、超重、慢性肺病(包括囊腫性纖維化、肺纖維化及哮喘)，由移植、使用免疫抑制劑或HIV感染引起之免疫系統受損，以及腦及神經系統病狀，可增加CoV感染相關併發症及疾病之風險。

另外，主題抗CoV-S抗體及抗原結合片段可單獨使用或與其他活性劑，例如引起鎮痛作用之類鴉片及非類鴉片鎮痛劑(諸如NSAID)結合使用。在一些實施例中，阿司匹靈(Aspirin)及/或乙醯胺苯酚可與主題抗CoV-S抗體或抗原結合片段結合。阿司匹靈係另一類型之非類固醇消炎化合物。

主題抗體潛在地視情況可與以下中之一或多者組合：(i)抗病毒藥，視情況為瑞德西韋、法匹拉韋、達盧那韋、奈非那韋、沙奎那韋、洛匹那韋或利托那韋；(ii)抗蠕蟲藥，視情況為伊維菌素；(iii)抗寄生蟲藥，視情況為羥氯喹、氯喹或阿托喹酮；(iv)抗細菌疫苗，視情況為肺結核疫苗BCG；或(v)消炎藥，視情況為類固醇(諸如環索奈德)、TNF抑制劑(例如阿達木單抗)、TNF受體抑制劑(例如依那西普)、IL-6抑制劑(例如克拉紮珠單抗)、IL-6受體抑制劑(例如托珠單抗)或安乃近；(vi)抗組織胺藥，視情況為貝他斯汀；(vii) ACE抑制劑，其視情況為莫西普利；或(viii)抑制CoV-S之激活的藥物，視情況為絲胺酸蛋白酶抑制劑，進一步視情況為萘莫司他，以便增加或增強疼痛管理。此可允許將此類鎮痛化合物投與較長持續時間，或以減少之劑量投與，由此潛在地緩解與其相關之不良副作用。

在一些實施例中，本文所揭示之抗CoV-S抗體及抗原結合片段與如2021年1月29日申請之美國臨時申請案第63/143,456號中所描述之一或多種抗體組合投與，該申請案之全部內容已以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，待與本文所揭示之抗CoV-S抗體及抗原結合片段組合投與之抗體為ADI-58125，其如美國臨時申請案第63/143,456號中所描述。在一個實施例中，抗體係同時投與的。在另一個實施例中，抗體係依序投與的。

被投與醫藥調配物之個體可例如為需要此類治療、預防及/或改善或將在其他方面得益於CoV-S介導之活性之抑制或衰減的任何人類或非人類動物。舉例而言，個體可為診斷患有前述疾病或病症中之任一者或視為處於罹患前述疾病或病症中之任一者之風險下的個體。在一些情況下，個體可處於晚期Cov感染狀態，例如戴上呼吸器之個體。在一些情況下，個體可為具有一或多個與不良CoV治療或恢復預後相關之風險因素(諸如高齡、肥胖、糖尿病等，及先前鑑別之其他因素)的個體。本發明進一步包括本文所揭示之醫藥調配物中之任一者在製造用於治療、預防及/或改善與CoV或CoV-S活性相關之任何疾病或病症(包括上文所提及之例示性疾病、病症及病狀中之任一者)的藥劑中的用途。 K. 投藥

在一個實施例中，本文所描述之抗CoV-S抗體或其CoV-S結合片段，以及該等抗體或其抗原結合片段之組合係在0.1 mg/ml與約以下任一者之間之濃度投與個體：0.5、1、5、10、15 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/ml，+/-10%誤差。

在另一個實施例中，本文所描述之抗CoV-S抗體及其片段係以在每公斤接受個體之體重約0.01與100.0 mg或200.0 mg之間的劑量投與個體。在某些實施例中，取決於CoV-S相關疾病之類型及嚴重程度，約1 μg/kg至50 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)抗體係投與患者之初始候選劑量，無論例如係分一或多次分開投與抑或藉由連續輸注投與。在另一個實施例中，約1 μg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之抗體係投與患者之初始候選劑量。取決於若干因素，例如所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、遞送藥劑之部位、投與方法、投與時程及醫療從業者已知之其他因素，典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之範圍內。然而，其他給藥方案可為適用的。

舉例而言，除本文所論述之相對劑量(mg/kg)外，可向個體投與絕對劑量(mg)之主題抗CoV-S抗體及其抗原結合片段。因此，在一個實施例中，向個體投與劑量在約1微克與約2000毫克之間的本文所描述之抗CoV-S抗體及其抗原結合片段，不管投與途徑如何。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以以下劑量投與：約100 mg至約5000 mg、約100 mg至4500 mg、約100 mg至4000 mg、約100 mg至約3500 mg、約100 mg至約3000 mg、約100 mg至約2500 mg、約100 mg至約2000 mg、約200 mg至約1500 mg、約300 mg至約600 mg、約500 mg至約1200 mg、約300 mg至約1200 mg、約500至約1000 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1500 mg至約2000 mg、約2000 mg至約2500 mg、約2500 mg至約3000 mg、約3000 mg至約3500 mg、約3500 mg至約4000 mg、約4000至約4500 mg或約4500 mg至約5000 mg。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合係肌肉內投與。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合係靜脈內投與。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段或該等抗體及其抗原結合片段之組合係經由IV推注投與。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段或該等抗體及其抗原結合片段之組合係經由IV快速推注投與。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約500 mg之劑量肌肉內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約600 mg之劑量肌肉內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約1200 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約1500 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約2000 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約2500 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約3000 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約3500 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約4000 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約4500 mg之劑量靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合以約5000 mg之劑量靜脈內投與。

在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合投與一次。在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合每週投與。在另一實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合每天、每週、每兩週、每月、每兩個月或每三個月投與。在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段或該等抗體或其抗原結合片段之組合投與每週投與，持續約四週；每週一次投與，持續約一個月；每週投與，持續約5週；每週投與，持續約6週；每週投與，持續約7週；或每週投與，持續約兩個月。

在另一實施例中，本文所描述之抗CoV-S抗體或其抗CoV-S抗原結合片段，以及該等抗體或其抗原結合片段之組合係以每二十六週或更短時間一次，諸如每十六週或更短時間一次、每八週或更短時間一次、每四週或更短時間一次、每兩週或更短時間一次、每週或更短時間一次或每日或更短時間一次的頻率投與接受個體。

根據較佳實施例，含有抗體之藥劑或醫藥組合物係經由選自以下一或多者之途徑經周邊投與個體：經口、舌下、經頰、表面、經直腸、經由吸入、經皮、皮下、靜脈內、動脈內或肌肉內、經由心內投與、骨內、皮內、腹膜內、經黏膜、經陰道、玻璃體內、經上皮、關節內、關節周圍或局部。

Fab片段可每兩週或更短時間、每週或更短時間、每日或更短時間一次、每天多次及/或每幾個小時投與。在一個實施例中，患者每日接受0.1 mg/kg至40 mg/kg之Fab片段，一天以1至6次之分次劑量或以連續灌注形式給予，由此有效獲得所要結果。

應理解，投與給定患者之抗體或Fab之濃度可高於或低於上述例示性投與濃度。

熟習此項技術者將能夠經由例如藉由本文中之揭示內容及以下中之教示內容所指導之常規實驗來確定投與之有效劑量及頻率： Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Brunton, L.L.等人編, 第11版, New York, New York: McGraw-Hill (2006); Howland, R. D.等人， Pharmacology, Volume 864, Lippincott's illustrated reviews., Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2006)；及Golan, D. E., Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy, Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2007)。

在另一個實施例中，本文所描述之抗CoV-S抗體或其CoV-S結合片段，以及該等抗體或其抗原結合片段之組合係以醫藥調配物形式投與個體。在一較佳實施例中，個體為人類。

「醫藥組合物」或「藥劑」係指適於向個體，較佳地哺乳動物，更佳地人類投與之化學或生物組合物。此類組合物可經特別調配用於經由多種途徑中之一或多者投與，該等途徑包括但不限於經頰、上表皮、硬膜外、吸入、動脈內、心內、腦室內、皮內、肌肉內、鼻內、眼內、腹膜內、脊柱內、鞘內、靜脈內、經口、非經腸、經由灌腸劑或栓劑經直腸、皮下、真皮下、舌下、經皮及經黏膜。此外，可藉助於注射劑、散劑、液體、凝膠、滴劑或其他投藥手段進行投藥。

在一個實施例中，本文所描述之抗CoV-S抗體或其抗原結合片段，以及該等抗體或其抗原結合片段之組合可視情況與一或多種活性劑組合投與。此類活性劑包括(i)抗病毒藥，視情況為瑞德西韋、法匹拉韋、達盧那韋、奈非那韋、沙奎那韋、洛匹那韋或利托那韋；(ii)抗蠕蟲藥，視情況為伊維菌素；(iii)抗寄生蟲藥，視情況為羥氯喹、氯喹或阿托喹酮；(iv)抗細菌疫苗，視情況為肺結核疫苗BCG；或(v)消炎藥，視情況為類固醇(諸如環索奈德)、TNF抑制劑(例如阿達木單抗)、TNF受體抑制劑(例如依那西普)、IL-6抑制劑(例如克拉紮珠單抗)、IL-6受體抑制劑(例如托珠單抗)或安乃近；(vi)抗組織胺藥，視情況為貝他斯汀；(vii) ACE抑制劑，視情況為莫西普利；或(viii)抑制CoV-S之激活的藥物，視情況為絲胺酸蛋白酶抑制劑，進一步視情況為萘莫司他。

抗組織胺可為對抗組織胺之作用或其自細胞(例如肥大細胞)之釋放的任何化合物。抗組織胺包括但不限於阿伐斯丁(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿紮他啶(azatadine)、氮拉斯汀(azelastine)、貝他斯汀(betatastine)、溴苯那敏(brompheniramine)、布克珍(buclizine)、勝克敏(cetirizine)、勝克敏類似物、氯芬尼拉明(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、CS 560、二苯環庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右氯菲安明(dexchlorpheniramine)、依巴司汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、非索非那定(fexofenadine)、HSR 609、羥𠯤(hydroxyzine)、左卡巴司汀(levocabastine)、洛拉他定(loratadine)、甲基東莨菪鹼(methscopolamine)、咪唑司汀(mizolastine)、諾阿斯米唑(norastemizole)、苯茚胺(phenindamine)、普魯米近(promethazine)、吡拉明(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)及曲尼司特(tranilast)。

在CoV感染中，呼吸症狀通常因額外細菌感染而加重。因此，此類活性劑亦可為抗生素，其包括但不限於阿米卡星(amikacin)、胺基糖苷類(aminoglycosides)、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林、安莎黴素(ansamycins)、阿斯凡納明(arsphenamine)、阿奇黴素(azithromycin)、阿洛西林(azlocillin)、安曲南(aztreonam)、桿菌肽(bacitracin)、碳頭孢烯(carbacephem)、碳青黴烯(carbapenems)、卡本西林(carbenicillin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢胺苄(cefalexin)、頭孢菌素(cefalothin)、頭孢噻吩(cefalotin)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢托侖(cefditoren)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢布坦(ceftibuten)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢吡普(ceftobiprole)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢菌素(cephalosporins)、氯黴素(chloramphenicol)、西司他汀(cilastatin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克拉黴素(clarithromycin)、克林達黴素(clindamycin)、氯唑西林(cloxacillin)、黏桿菌素(colistin)、複方磺胺甲㗁唑(co-trimoxazole)、達福普汀(dalfopristin)、地美環素(demeclocycline)、雙氯西林(dicloxacillin)、地紅黴素(dirithromycin)、多尼培南(doripenem)、多西環素(doxycycline)、依諾沙星(enoxacin)、厄他培南(ertapenem)、紅黴素(erythromycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、氟氯西林(flucloxacillin)、磷黴素(fosfomycin)、呋喃唑酮(furazolidone)、梭鏈孢酸(fusidic acid)、加替沙星(gatifloxacin)、格爾德黴素(geldanamycin)、慶大黴素(gentamicin)、醣肽、除莠黴素(herbimycin)、亞胺培南(imipenem)、異菸肼(isoniazid)、康黴素、左氧氟沙星(levofloxacin)、林可黴素(lincomycin)、利奈唑胺(linezolid)、洛美沙星(lomefloxacin)、氯碳頭孢(loracarbef)、大環內酯(macrolides)、磺胺米隆(mafenide)、美羅培南(meropenem)、甲氧西林(methicillin)、甲硝噠唑(metronidazole)、美洛西林(mezlocillin)、二甲胺四環素(minocycline)、單醯胺菌素(monobactams)、莫西沙星(moxifloxacin)、莫匹羅星(mupirocin)、萘夫西林(nafcillin)、新黴素(neomycin)、奈替黴素(netilmicin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、苯唑西林(oxacillin)、土黴素(oxytetracycline)、巴龍黴素(paromomycin)、青黴素(penicillin)、青黴素類、哌拉西林(piperacillin)、平板黴素(platensimycin)、多黏菌素B (polymyxin B)、多肽、百浪多息(prontosil)、吡𠯤甲醯胺(pyrazinamide)、喹啉酮(quinolones)、奎奴普丁(quinupristin)、立複黴素(rifampicin)、利福平(rifampin)、羅紅黴素(roxithromycin)、觀黴素(spectinomycin)、鏈黴素(streptomycin)、磺胺醋醯胺(sulfacetamide)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、對胺基苯磺醯胺(sulfanilamide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺異㗁唑(sulfisoxazole)、磺醯胺(sulfonamides)、替考拉寧(teicoplanin)、泰利黴素(telithromycin)、四環素(tetracycline)、四環素類、替卡西林(ticarcillin)、磺甲硝咪唑(tinidazole)、托普黴素(tobramycin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、甲氧苄啶-磺胺甲㗁唑、醋竹桃黴素(troleandomycin)、曲伐沙星(trovafloxacin)及萬古黴素(vancomycin)。

活性劑亦包括醛固酮(aldosterone)、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、皮質類固醇(corticosteroids)、皮質醇(cortisol)、乙酸可體松(cortisone acetate)、乙酸去氧皮質酮(deoxycorticosterone acetate)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氟可體松(fludrocortisone acetate)、糖皮質激素(glucocorticoid)、羥皮質酮(hydrocortisone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、普賴蘇穠(prednisolone)、普賴松(prednisone)、類固醇(steroid)及曲安西龍(triamcinolone)。亦考慮此等活性劑之任何適合組合。

「醫藥賦形劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」為載劑，通常為液體，在其中調配活性治療劑。在一個實施例中，活性治療劑係本文所描述之人源化抗體或其一或多個片段。賦形劑一般不向調配物提供任何藥理學活性，但其可提供化學及/或生物穩定性及釋放特徵。例示性調配物可見於例如 Remington ' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A.編輯, 第19版, Philadelphia, PA: Williams and Wilkins (1995)中，其以引用之方式併入。

如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」或「賦形劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑。在一個實施例中，載劑適用於非經腸投與。或者，載劑可適用於靜脈內、腹膜內、肌肉內或舌下投與。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。此類介質及試劑在醫藥學活性物質中之用途在此項技術中眾所周知。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於本發明之醫藥組合物中。亦可在組合物中併入補充活性化合物。

醫藥組合物通常必須在製造及儲存條件下為無菌且穩定的。本發明考慮醫藥組合物以凍乾形式存在。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇)及其適合混合物的溶劑或分散介質。本發明進一步考慮在醫藥組合物中包括穩定劑。可例如藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。

在許多情況下，較佳在組合物中包括等張劑，例如糖；多元醇，諸如甘露糖醇及山梨糖醇；或氯化鈉。可藉由包括延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽及明膠來延長可注射組合物之吸收。此外，鹼性多肽可調配成延時釋放調配物形式，例如包括緩釋聚合物之組合物形式。活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑為諸如控釋調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸、聚乳酸與聚乙醇酸共聚物(「PLG」)。製備此類調配物之多種方法為熟習此項技術者所已知。

對於所述實施例中之各者，化合物可藉由多種劑型投與。考慮一般熟習此項技術者已知的任何生物學上可接受之劑型及其組合。此類劑型之實例包括但不限於可復原散劑、酏劑、液體、溶液、懸浮液、乳液、散劑、顆粒、粒子、微粒、可分散顆粒、扁囊劑、吸入劑、氣霧劑吸入劑、貼片、粒子吸入劑、植入物、貯存植入物、可注射劑(包括皮下、肌肉內、靜脈內及皮內)、輸注及其組合。 L. 套組

在某些態樣中，本發明提供套組，其包含如本文所描述之本發明之抗體或其抗原結合片段，或編碼該抗體或其抗原結合片段之經分離核酸分子(例如經分離mRNA分子)，及具有進行本文所描述之方法中之任一者之說明書的包裝插頁。

在一些實施例中，套組包括有關使用套組之說明書。說明書將通常包括關於使用套組治療及/預防SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或另一冠狀病毒感染的資訊。在其他實施例中，說明書包括以下中之至少一者：注意事項；警告；臨床研究；及/或參考文獻。說明書可直接印刷在容器(若存在)上或作為標籤施加於容器上，或作為獨立薄片、小冊子、卡片或資料夾供應於容器中或與容器一起供應。在另一個實施例中，套組可包含呈標籤或單獨插頁(包裝插頁)形式之說明書，以提供適合之操作參數。

在一些實施例中，套組包括醫藥調配物，該醫藥調配物包括抗體或其抗原結合片段，或編碼抗體或其抗原結合片段的經分離核酸分子，例如經分離mRNA分子；額外治療劑；及具有進行本文所描述之方法中之任一者之說明書的包裝插頁。

在一些實施例中，套組可包含用於非經腸、皮下、肌肉內或靜脈內投與，例如以準備好裝載至注射器中且向個體投與之形式密封在小瓶中的調配物組分。在一些實施例中，套組可含有一或多個，例如兩個、三個、四個或五個或更多個小瓶，其中各小瓶含有用於投與個體之單個單位劑量。

小瓶可具有任何大小。在一些實施例中，小瓶容積為約1 mL、約2 mL、約4 mL、約8 mL、約12 mL、約16 mL、約20 mL或約24 mL。

套組可以多種不同組態封裝，諸如一或多個容器在單個盒中。不同組分可例如根據套組提供之說明書組合。組分可根據本文所描述之方法組合，例如用以製備及投與醫藥組合物。

在一些實施例中，套組可包含具有適當陽性及陰性對照物或對照樣品之一或多個容器，其用作偵測、校準或正規化之標準。

套組可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如(無菌)磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液；及其他適合之添加劑，諸如滲透增強劑、載體化合物及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，如本文所描述。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器及具有使用說明書之包裝插頁。套組亦可包括藥物遞送系統，諸如脂質體、微胞、奈米粒子及微球體。套組可進一步包括遞送裝置，諸如針、注射器、泵及具有使用說明書之包裝插頁。

本發明之各種所說明之實施例之以上描述並不意欲為窮盡性的或將本發明限於所揭示之確切形式。雖然本文中出於例示性目的描述本發明之特定實施例及實例，但如熟習相關技術者將認識到，在本發明之範疇內各種等效修改為可能的。本文所提供之本發明教示可適用於除上文所述實例以外之其他目的。

根據以上詳細描述，可對本發明作出此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應理解為將本發明限於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例。因此，本發明不受揭示內容之限制，而實際上本發明之範疇完全由以下申請專利範圍所決定。

本發明可以除以上描述及實例中特定描述之彼等方式以外的方式來實踐。根據以上教示，本發明之諸多修改及變化為可能的，且因此，在所附申請專利範圍之範疇內。

某些抗CoV-S抗體聚核苷酸及多肽揭示於隨附本專利申請案一起提交之序列表中，且該序列表之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

先前技術、實施方式及實例中所引用之各文獻(包括專利、專利申請案、雜誌文章、摘要、手冊、書籍或其他揭示內容)之全部揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

提出以下實例以便進一步提供一般技術者如何製造且使用本發明之完整的揭示內容及描述，且並不意欲限制本發明之範疇。已努力確保所用數字(例如量、溫度、濃度等)之準確性，但亦應允許存在一些實驗誤差及偏差。除非另有指示，否則份數為重量份；分子量為平均分子量；溫度以攝氏度計；且壓力為在大氣壓下或接近大氣壓。實例實例 1 ： ο 突破性感染之後預先存在的交叉反應性 B 細胞記憶的回憶

基於mRNA之COVID-19疫苗在臨床研究中展現顯著較高程度之針對原始SARS-CoV-2 Wuhan-1株系之保護功效( 1 ， 2)。然而，減弱的疫苗誘導免疫性加上持續出現的抗性SARS-CoV-2變異體顯著削弱了疫苗有效性( 3-5)。特定言之，最近出現之ο變異體(B.1.1.529/BA.1)及其子譜系(例如BA1.1及BA.2)顯示驚人之之逃脫抗體程度，因此嚴重限制針對此VOC之疫苗功效且允許其快速替代δ，且驅動COVID-19病例的全球性激增( 6-11)。

理解抗原銘印作用(imprinting)在針對抗原漂移(antigenically drifted)之SARS-CoV-2變異體而塑造B細胞反應中的作用對於研發次世代COVID-19疫苗而言將為關鍵的。先前研究已顯示，δ或ο突破性感染增強對Wuhan-1疫苗株系及感染變異體兩者之血清中和活性，表明交叉反應性疫苗誘導MBC之回憶( 12-14)。然而，介導此反應之抗體之特異性、功能及基因特徵仍定義不充分。為了解決此等問題，在最近經歷BA.1突破性感染之一群接種mRNA疫苗個體中研究S特異性血清學及周邊B細胞反應。

招募2021年12月30日與2022年1月19日之間經歷SARS-CoV-2突破性感染之居住在美國東北部地區的七名接種mRNA (mRNA-1273或BNT162b2)疫苗之個體(表1)。所有供體藉由RT-PCR測試SARS-CoV-2呈陽性且經歷無症狀或輕度疾病。儘管無法獲得病毒樣品進行基因體定序，但SARS-CoV-2變異體監視資料指示BA.1變異體占這段時間美國東北部感染的絕大部分(圖5)。在四個供體中在第二次mRNA疫苗劑量之後5至11個月，且在三個供體中在第三次mRNA劑量之後一個月，發生突破性感染。為研究在突破性感染之後的急性B細胞反應，在PCR確認感染之後14至27天收集血清及周邊血液單核細胞(PBMC)樣品(圖1A)。表 1.BA.1突破性感染供體特徵.

供體 ID	IML4041	IML4042	IML4043	IML4044	IML4045	IML4054	IML4055
年齡	45	19	23	23	24	38	23
性別	F	F	M	F	F	F	F
疫苗史	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2, 1x mRNA-1273	2x mRNA-1273, 1x BNT162b2	3x BNT162b2
第 2 次劑量疫苗接種日期	2021年5月7日	2021年7月22日	2021年5月23日	2021年2月10日	2021年5月15日	2021年5月5日	2021年5月23日
第 3 次劑量疫苗接種日期 ( 若適用 )	-	-	-	-	2021年12月20日	2021年12月11日	2021年12月9日
PCR 確診感染日期	2021年12月31日	2022年1月4日	2021年12月30日	2022年1月2日	2022年1月6日	2022年1月19日	2022年1月6日
突破性感染與樣品收集之間的天數	25	21	26	23	19	14	27

在突破性感染之後評價對重組融合前穩定化Wuhan-1/野生型(WT)及BA.1 S蛋白質及RBD次單元之血清IgG及IgA反應。為了比較，亦在先前未感染個體之個別群組中評估血清抗體反應，該等個體在取樣之前一個月或六個月時接受第二劑量之mRNA疫苗或在取樣之前一個月接受第三mRNA加打劑量(表2)。表 2.未感染/接種mRNA疫苗群組特徵.

	2x mRNA (1M)	2x mRNA (6M)	3x mRNA (1M)
樣品大小	12	11	11
年齡中值 ( 範圍 )	31 (21-42)	36 (26-42)	54 (32-58)
疫苗接種方案 (%)	2x mRNA-1273 (75%)	2x mRNA-1273 (82%)	3x mRNA-1273 (64%)
2x BNT162b2 (25%)	2x BNT162b2 (18%)	2x mRNA-1273, 1x BNT162b2 (36%)

經歷BA.1突破性感染之供體展現類似(在兩倍內)的對BA.1及WT S及RBD的血清IgG結合效價(圖1B)。相比之下，未感染/接種mRNA疫苗之供體顯示相對於WT S降低兩倍至四倍之與BA.1之血清IgG結合，及相對於WT降低四倍至九倍之與BA.1 RBD之血清IgG結合效價(圖1B)。此外，相較於未感染/經疫苗接種供體，突破性感染供體對WT及BA.1 RBD展現顯著較高血清IgA抗體效價(圖1C)。因此，BA.1突破性感染誘導先前經疫苗接種之個體中之對WT及BA.1 S抗原之血清IgG及IgA結合反應。

接下來，使用基於MLV之假病毒分析評估樣品針對上代SARS-CoV-2株系(D614G)以及BA.1、δ及β VOC之血清中和活性。與先前研究一致，相對於D614G，獲自未感染/經疫苗接種之供體的血清樣品分別顯示針對β及BA.1之3.5倍至11倍及7倍至22倍更低的中和效價(圖1D-圖1F)。相比之下，來自BA.1突破性感染供體之血清樣品顯示針對D614G及所有測試VOC類似(在兩倍內)的中和效價，表明BA.1突破性感染拓寬血清中和抗體反應(圖1G)。為了判斷此活性廣度是否延伸至更分化的薩貝冠狀病毒，亦測試血清樣品針對SARS-CoV之中和活性。在BA.1突破供體及未感染/經疫苗接種之個體中觀測到類似SARS-CoV中和效價，表明由BA.1突破性感染誘導之血清反應性的廣度可能限於SARS-CoV-2之變異體，而不延伸至抗原更多樣的薩貝冠狀病毒(圖1D-圖1G)。

接下來，在BA.1突破性感染之後評價周邊RBD特異性B細胞反應之程度及交叉反應性。儘管在突破供體中觀測到相對於未感染/接種mRNA疫苗個體之較高BA.1血清中和效價，但兩個群組顯示類似頻率之WT-及BA.1-RBD反應性IgG ⁺B細胞(圖2A及圖6A)。BA.1突破性感染之後循環IgG ⁺B細胞反應之有限程度可歸因於在輕度及無症狀感染期間抗原限制於上呼吸道。為了解決此問題，亦在突破供體及未感染/經疫苗接種個體中比較RBD特異性IgA ⁺B細胞之頻率。在未感染/經疫苗接種供體中，WT及BA.1 RBD反應性B細胞分別呈總IgA ⁺B細胞之0.04-0.087%及0-0.015% (圖2B)。相比之下，突破性感染供體對RBD具有顯著較高程度的IgA反應，其中BA.1 RBD特異性IgA ⁺B細胞佔總IgA ⁺B細胞群體之0.025-0.4% (中值=0.069%) (圖2B)。得出結論，相對於mRNA疫苗接種，對BA.1 RBD抗原，BA.1突破性感染誘導類似IgG ⁺B細胞反應及較高程度IgA ⁺B細胞反應。

為研究預先存在的疫苗誘導免疫性對BA.1突破性感染之B細胞反應的影響，在BA.1突破供體及未感染/接種mRNA疫苗個體中計數顯示WT/BA.1 RBD交叉反應性之B細胞(圖2C，圖6A)。在初級mRNA疫苗接種後一個月，總RBD定向B細胞之僅48%顯示與BA.1之交叉反應性(圖2D)。WT/BA.1 RBD交叉反應性B細胞之比例在初級疫苗接種後6個月增加至57%，且在mRNA加打免疫接種後增加至70%，與抗SARS-CoV-2抗體廣度隨時間推移的演變一致( 15 ， 16) (圖2D)。在突破性感染之後，BA.1/WT RBD交叉反應性B細胞構成總抗RBD B細胞之65-83%且剩餘17-35%僅結合至WT探針(圖2D)。因為WT RBD特異性B細胞可代表疫苗接種誘導但未由BA.1感染活化之休眠MBC，所以此分析亦限於表現活化標記物CD71之B細胞(圖6B)。在最近活化之B細胞中，總RBD反應性殖株之87-98%顯示BA.1/WT交叉反應性，而交叉反應性B細胞之比例在未感染/接種mRNA疫苗個體中保持不變(圖2E)。BA.1特異性B細胞不能在BA.1突破性感染之後在任何供體中偵測到，表明在此時間點從頭( de novo) B細胞反應的誘導有限。因此，得出結論，BA.1突破性感染優先活化顯示與BA.1及原始Wuhan-1疫苗株系之交叉反應性的B細胞。

接著，評價BA.1突破性感染是否修改靶向S三聚體之各子域之B細胞的免疫顯性層級。為計算靶向各子域之全長S反應性B細胞之比例，B細胞用全長S、RBD、NTD及融合前穩定化S2之區別性標記的四聚體染色(圖6C)。在未感染/經疫苗接種群組中，靶向NTD、RBD及S2子域之類型轉換B細胞分別占總S定向反應之18%、25%及37%，且此等比例在疫苗接種後六個月及mRNA加打免疫接種後基本上保持不變(圖2F-圖2H)。相比之下，在具有突破性感染之供體中觀測到顯著較高比例之RBD定向B細胞，在對S之總活化(CD71 ⁺) B細胞反應之35-63%(中值=46%)範圍內(圖2G)。此外，相對於未感染/接種mRNA疫苗個體，突破供體中S2反應性B細胞占S特異性反應之較小分數(中值=16%) (圖2H)。在第二次及第三次劑量mRNA疫苗接種之後，在經歷BA.1突破性感染之供體中觀測到此改變之免疫顯性模式(圖7)。概言之，BA.1突破性感染似乎將B細胞免疫顯性層級自S2次單元重定向至RBD。

為了表徵由BA.1突破性感染引發之抗RBD抗體之分子特徵，自五個突破性感染供體單細胞分選410個類型轉換RBD ⁺B細胞且作為全長IgG表現317個原生配對之抗體(每個供體32至102個抗體) (圖8)。儘管用WT及BA.1 RBD之混合物分選，但絕大部分IgG顯示BA.1 RBD反應性(92-96%)，提供此等供體經歷BA.1感染的有力證據(圖3A)。另外，索引分選分析揭露來源於CD71 ⁺B細胞之所有抗體識別BA.1，表明WT特異性抗體可能來源於由疫苗接種引發之休眠MBC (圖9)。

序列分析揭露BA.1 RBD反應性抗體顯示相對較高水平之殖株多樣性，其中7-45%屬於擴增之殖株譜系(圖3B)。在BA.1突破性感染組庫中觀測到重鏈生殖系基因IGHV3-53、3-66、3-30、1-69、3-9及4-31相對於基線人類組庫( 17)顯著過表現(圖3C)。儘管IGHV3-53、3-66及3-30生殖系基因家族亦已顯示在針對上代SARS-CoV-2株系之抗體反應中過表現，但IGHV1-69、3-9及4-31似乎為BA.1突破性反應獨有的( 18) (圖3C)。BA.1 RBD反應性抗體顯示與基線組庫相比類似的HCDR3長度分佈(圖3D)。來源於各供體之九十五至100%抗體含有體細胞突變，其中中值SHM含量在VH中8至11個核苷酸取代範圍內，支持具有記憶B細胞來源(圖3E)。得出結論，針對突破性感染之早期B細胞反應由與WT及BA.1 RBD交叉反應之高度突變殖株主導。

為了進一步評價BA.1 RBD反應性抗體之結合特性，量測其針對SARS-CoV-2 D614G、BA.1、BA.2、β及δ RBD及SARS-CoV RBD之單價結合親和力。RBD定向抗體之大部分(204/293)以高親和力(K _D＜10 nM)結合至BA.1及WT RBD，支持自親和力成熟B細胞群體進行選擇(圖4A)。然而，相對於BA.1，大約70%抗體對WT RBD展現更高親和力結合(＞2倍)，提供BA.1突破性感染之後預先存在的疫苗誘導MBC再活化的有力證據(圖4A)。與疫苗誘導之抗RBD抗體(其通常顯示降低的針對β VOC之活性)相比，僅少數(＜5%)的來源於BA.1突破供體之抗體相對於WT展現β結合之損失( 10 ， 16) (圖4B)。抗體結合交叉反應性之此差異可能歸因於β及BA.1 RBD內存在共有突變(E484K/A、K417N及N501Y)。總體而言，自突破性感染供體分離之抗RBD抗體之82% (241/293)顯示與WT、β、δ、BA.1及BA.2 RBD之單價結合，表明BA.1突破性感染活化了大比例的具有廣泛SARS-CoV-2 VOC識別之B細胞(圖4B)。與針對SARS-CoV觀測到之較弱血清中和活性一致，小於10%之RBD靶向抗體展現可偵測的與SARS-CoV RBD之單價結合(圖4B)。因此，BA.1突破性感染似乎優先擴增靶向在SARS-CoV-2變異體中保守，而抗原更分化的薩貝冠狀病毒中不保守的抗原決定基的B細胞。

接下來，針對D614G及BA.1的中和活性篩選BA.1 RBD反應性抗體。來自各供體的二十八至56%及34-49%之抗體分別以5 µg/ml之濃度顯示針對D614G及BA.1之＞90%中和活性(圖4C)。針對D614G及BA.1之中和抗體的滴定揭露45% (64/141)在IC ₅₀小於0.1 μg/ml下強力中和兩種病毒(圖4D)。與其相對於BA.1，對WT RBD之整體結合親和力增加一致，相較於BA.1，大部分中和抗體(78%)顯示針對D614G之效能較高(圖4D)。值得注意地，大比例的BA.1中和抗體亦顯示與δ (79%)、β (90%)及BA.2 (86%) RBD之交叉反應性，其親和力在BA.1之10倍內(圖4E)。有限數目之此等VOC交叉反應性抗體(141中5個)亦中和SARS-CoV，其IC ₅₀在0.039至0.35 μg/ml範圍內(圖10)。得出結論，BA.1突破性感染引發具有針對SARS-CoV-2 VOC之廣泛活性的RBD定向抗體。

先前研究已定義由SARS-CoV-2感染及疫苗接種誘導之若干種「公開」類別之中和抗體(1至4類) ( 19, 20)。為了確定BA.1突破性感染是否亦引發再發性中和抗體反應，分析BA.1中和抗體之序列及結合特徵。所有BA.1中和抗體之超過40%利用三個VH生殖系基因之一(IGHV3-53/66、IGHV1-69及IGHV3-9) (圖4F及圖11)。類似於先前所述之自接種mRNA疫苗個體分離之IGHV3-53/66抗體，BA.1中和IGHV3-53/66抗體具有短HCDR3 (11至12個殘基)且與ACE2、1類mAb REGN10933及COVA1-16樣4類mAb ADI-62113顯示競爭性結合( 21) (圖4G及圖12)。然而，不同於疫苗誘導之IGHV3-53/66抗體，其一般缺乏針對含有位置K417處之取代之SARS-CoV-2變異體(例如β、γ及BA.1)的活性，突破性感染源性之IGHV3-53/66抗體與所測試之所有VOC顯示廣泛反應性且強力中和D614G及BA.1假病毒(中值IC ₅₀分別=0.016及0.051 μg/ml) ( 22 ， 23) (圖4E及圖13)。因此，利用此等IGHV3-53/66之抗體似乎識別與先前所描述之由感染及疫苗接種誘導之IGHV3-53/66抗體重疊但不同的抗原位點。

利用IGHV1-69及IGHV3-9生殖系基因之中和抗體亦廣泛識別SARS-CoV-2變異體，包括BA.2 (圖4E)。與IGHV3-53/66相比，此等生殖系基因尚未顯示在自接種mRNA疫苗供體鑑別之RBD定向抗體中過表現(圖3C)。利用IGHV1-69生殖系基因之抗體分成兩組，一組包含靶向ACE2及REGN10933競爭性區域之抗體，且另一組含有識別重疊COV2-2130 (3類)抗原決定基之非ACE2競爭性位點的抗體(圖4G)。值得注意地，＞80%之非ACE2競爭性殖株利用輕鏈IGLV1-40基因且顯示高度類似LCDR3序列，表明趨同之識別模式(圖14)。最後，12/13個IGHV3-9抗體識別ACE2結合位點之外之抗原決定基且與所測試的所有三個3類抗體(S309、REGN10987及COV2-2130)競爭，表明與IGHV1-69抗體不同之結合模式(圖4G)。綜合而言，BA.1突破性感染引發多種再發性類別之具有廣泛SARS-CoV-2 VOC反應性的抗RBD抗體。

深入理解預先存在之SARS-CoV-2免疫性如何針對異質變異體暴露而塑造B細胞反應，對於基於變異體之加打疫苗的研發而言將為重要的。此處，此實例表明對BA.1突破性感染之急性B細胞反應主要由具有較廣SARS-CoV-2 VOC交叉反應性之再活化的疫苗誘導記憶B細胞殖株，而非由上代SARS-CoV-2株系之感染或疫苗接種引發者介導。儘管突破活化之B細胞反應之持久性及動力學仍為未知的，但在BA.1突破性感染之後誘導交叉反應性反應表明，用異源S蛋白質加打免疫接種可為用於引發針對未來出現的VOC之廣泛中和反應的有前景的策略。

儘管S2次單元在初級SARS-CoV-2感染及疫苗接種之情形下呈免疫顯性，但BA.1突破性感染優先增強靶向抗原可變及免疫亞顯性RBD的交叉反應性抗體。B細胞免疫顯性層級之此轉移的分子解釋仍待定，但可能由保守S2次單元相對於更分化RBD之增加的血清抗體掩蔽來驅動，使得B細胞靶向S2抗原決定基的可接近性受限。值得注意地，經由抗原決定基掩蔽之血清抗體回饋先前已顯示可限制B細胞對免疫顯性病毒抗原決定基之反應且允許亞顯性反應擴增( 24)。

最後，鑑別到來自BA.1突破性感染供體之若干單株抗體顯示出對迄今所描述之所有SARS-CoV-2 VOC以及SARS-CoV之廣泛活性。此等抗體代表用於治療性研發之有前景的候選物且提供用於研發誘導廣泛中和抗體反應之疫苗的構架。 方法與材料 人類個體及血液樣品收集 .

突破性感染供體及未感染的接種兩次劑量疫苗之供體，根據Dartmouth-Hitchcock醫院之免疫監測核心(Immune Monitoring Core) (DartLab)實驗室的健康供體方案D10083，知情同意參與。未感染的接種三次劑量疫苗之參與者入選臨床試驗：CoVacc-對Covid-19疫苗接種之免疫反應(CoVacc - Immune response to vaccination against Covid-19)，一項開放多中心IV期研究，由瑞典倫理審查局(Dnr 2021-00055)及瑞典醫療產品局批准。第一個患者入選之前，該研究登記於歐洲臨床試驗資料庫(EUDRACT編號2021-000683-30)。瑞典Umeå大學充當試驗發起人，且瑞典北部大學醫院臨床研究中心(Clinical Research Center, University Hospital of Northern Sweden)監督研究的合規性。個體在知情同意之後納入且根據EU通用資料保護條例儲存資料。

招募具有BA.1突破性感染之七個參與者參與此研究。SARS-CoV-2感染係藉由經由來自唾液樣品之RT-PCR及來自鼻拭子樣品之快速抗原測試兩者的陽性結果確定。所有參與者先前用兩次或三次劑量之mRNA疫苗(BNT162b2或mRNA-1273)免疫接種且在疫苗接種之前無SARS-CoV-2感染記錄病史。突破性感染供體之臨床及人口統計特徵顯示於表1中。參與者在其第一次SARS-CoV-2陽性測試之後14至27天到Dartmouth-Hitchcock醫院(D-HH)抽血。使用具有檸檬酸右旋糖(acid citrate dextrose，ACD)的BD Vacutainer®管收集靜脈血液，且使用Ficoll 1077 (Sigma)梯度分離血漿及PBMC，洗滌，且用抗人類CD45染劑在容積流量細胞計數器上進行計數。將PBMC冷凍於稀釋於RPMI-1040中之12.5%人類血清及10% DMSO中且儲存於液氮中直至使用。分離血漿且在-80℃下冷凍。

在D-HH (對於接種兩次劑量mRNA疫苗之供體)及Umeå大學(對於接種三次劑量mRNA疫苗之供體)募集分開的一組未感染/接種mRNA疫苗之志願者用於血液樣品收集。在第二mRNA劑量之後一個月(n=12)及六個月(n=11)或在第三mRNA劑量之後一個月(n=11)收集樣品。此等參與者之人口統計資料顯示於表2中。接種兩次劑量疫苗之個體的樣品收集及加工方法描述於上文。對於接受第三mRNA劑量之個體，在BD EDTA Vacutainer® CPT™管中收集靜脈血且分離PBMC及血漿。將PBMC冷凍於補充有10% DMSO之90%胎牛血清中且儲存於液氮中直至使用。血漿及血清儲存在-80℃下。重組 SARS-CoV-2 S 產生.

為了產生融合前穩定化WT SARS-CoV-2 HexaPro S，將編碼SARS-CoV-2棘蛋白(Genbank NC NC_045512.2)的殘基1-1208，具有取代F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、位置682-685的「GSAS」突變(SEQ ID NO:7)及C端T4纖維蛋白模體、8X HisTag (SEQ ID NO:8)及TwinStrepTag (SARS-CoV-2 S-2P)的DNA選殖入pcDNA3.4載體。另外將以下突變選殖入ο/BA.1 HexaPro S質體中：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F。按照製造商的指示使用聚伸乙亞胺將質體短暫轉染至FreeStyle HEK 293F細胞(Thermo Fisher)中。在培養一週之後，收集上清液，且離心以移除細胞碎片。S蛋白質製備物藉由Ni親和層析純化，且隨後使用Superose 6管柱(GE Healthcare)進行尺寸排阻層析，隨後濃縮及在-80℃下冷凍。血清 ELISA

用稀釋於PBS中之濃度為5 μg/ml之以下重組抗原塗佈96孔半面積盤(Corning)：SARS-CoV-2 WT Hexapro穩定化S、BA.1 Hexapro穩定化S、WT RBD (Sino Biological，目錄號40592-V08B)、BA.1 RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522e)、WT NTD (Acro Biosystems，目錄號S1D-52H6)、BA.1 NTD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522d)及Hexapro穩定化S2 (Acro Biosystems，目錄號S2N-C52H5)抗原。在4℃下培育隔夜之後，孔用洗滌緩衝液(具有0.05% Tween-20之1×PBS)洗滌且在37℃下用75 μl含3%牛血清白蛋白(BSA)之1×PBS阻斷1小時。經塗佈之孔隨後在37℃下以在1:40至1:1,310,720範圍內之人類血清於0.1% BSA、0.01% Tween-20於1×PBS中之溶液中之連續稀釋液培育1小時，且隨後用洗滌緩衝液洗滌三次。為偵測抗原特異性IgG及IgA，在37℃下孔用抗人類IgG辣根過氧化酶(HRP；Jackson Immunoresearch Laboratories，目錄號109-036-098)於0.1% BSA、0.01% Tween-20、1X PBS中之1:5000稀釋液或抗人類IgA HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories，目錄號109-036-011)於其中之1:10,000稀釋液培育1小時。隨後洗滌盤三次且用25 μl室溫平衡之1-Step™ Ultra TMB受質溶液(Thermo Fisher Scientific)顯影5分鐘。藉由添加25 μl 4 N硫酸終止顯影反應。使用Spectramax微量盤讀取器(Molecular Devices)量測450 nm下之吸光度。GraphPad Prism (版本9.3.1)中經由非線性回歸擬合滴定曲線以確定50%有效濃度(EC50)。 SARS-CoV-2 假病毒產生 .

單週期感染假病毒如先前所描述產生(25)。簡言之，在6孔組織培養盤(Corning)中接種隔夜之HEK293T細胞用以下質體共轉染：1) 0.5 μg pCDNA3.3，其編碼含19殘基C端截短之SARS-CoV-2棘蛋白基因，2) 2 μg基於MLV之螢光素酶報導基因質體(Vector Builder)，及3) 2 μg MLV gag/pol (Vector Builder)。SARS-CoV-2 ο/BA.1相對於Wuhan-1含有以下突變：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493K、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F。按照製造商建議，質體與脂染胺(Lipofectamine) 2000 (ThermoFisher Scientific)組合且轉染。轉染後48小時收集含有SARS-CoV-2 S假型化MLV粒子之培養上清液，等分且在-80℃下冷凍以用於中和分析。 假病毒中和分析.

將HeLa-hACE2報導細胞(BPS Bioscience目錄號79958)以10,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤(Corning)中隔夜。在56℃下對人類血漿及血清樣品進行加熱失活30分鐘。接下來，將單株抗體或加熱失活血清在補充有10% FBS與50 μl MLV病毒儲備液之MEM/EBSS培養基中連續稀釋且在37℃與5%二氧化碳下培育1小時。移除細胞培養基，且用PBS洗滌細胞兩次。隨後將病毒-抗體混合物添加至HeLa-hACE2細胞中且在37℃以及5%二氧化碳下培育48小時。根據製造商的方案，細胞隨後用螢光素酶細胞培養物溶解5×試劑(Promega)溶解，且螢光素酶活性用螢光素酶分析系統(Promega)量測。感染性使用光度計(Perkin Elmer)量測為相對冷光單位(RLU)。中和百分比計算為100* (1- [RLU樣品-RLU背景] / [RLU同型對照mAb-RLU背景])，且50%中和濃度在GraphPad Prism (版本9.3.1)中由四參數非線性回歸擬合曲線內插。 SARS-CoV-2 S 特異性 B 細胞反應 之 FACS 分析 .

使用用螢光團結合之鏈黴抗生物素蛋白(SA)四聚化之重組生物素標記抗原偵測抗原特異性B細胞。對於偵測識別WT及/或BA.1 RBD之周邊B細胞，以以下組合混合4:1莫耳比之生物素標記抗原與SA：WT HexaPro S與SA-AlexaFluor 633 (Invitrogen)、BA.1 HexaPro S與SA-AlexaFluor 633 (Invitrogen)、WT RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C82E8)與SA-BV421 (BioLegend)及BA.1 RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522e)與SA-藻紅素(PE；Invitrogen)。對於確定總S特異性B細胞群體內之子域反應性，將抗原四聚體以以下組合混合：WT HexaPro S與SA-AlexaFluor 633 (Invitrogen)、BA.1 HexaPro S與SA-AlexaFluor 633 (Invitrogen)、WT RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C82E8)與SA-BV421 (BioLegend)、BA.1 RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522e)與SA-BV421、WT NTD (Acro Biosystems，目錄號S1D-52H6)與SA-PE、BA.1 NTD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522d)與SA-PE及HexaPro穩定化WT S2 (Acro Biosystems，目錄號S2N-C52H5)與SA-BV711 (BD BioSciences)。將抗原四聚體在4℃下培育30分鐘，接著使用5 μl 2 μM Pierce生物素(ThermoFisher Scientific)淬滅未結合SA位點。在冰上，PBMC經稀釋於Brilliant染色緩衝液(BD BioSciences)及FACS緩衝液(2% BSA/1 mM EDTA於1X PBS中)之1:1 [v/v]混合物中的彙集四聚化抗原(各25 nM)及抗人類抗體抗CD19 (PE-Cy7；Biolegend)、抗CD3 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD8 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD14 (PerCP-Cy5.5；Invitrogen)及抗CD16 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)染色15分鐘。在一次洗滌之後，將細胞再懸浮於碘化丙錠與抗人類抗體抗IgG (BV605；BD Biosciences)、抗IgA (FITC；Abcam)、抗CD27 (BV510；BD Biosciences)及抗CD71 (APC-Cy7；Biolegend)之混合物中且在冰上培育15分鐘。用FACS緩衝液洗滌兩次之後，使用BD FACS Aria II (BD Biosciences)分析樣品。

藉由BA.1/WT交叉反應性或WT特異性IgG+及IgA+ (swIg+) B細胞之數目除以RBD+ S+ swIg+ B細胞之總數來計算與WT及/或BA.1 RBD反應之類型轉換RBD特異性B細胞比例。識別各子域(NTD、RBD或S2)之S反應性B細胞之比例藉由識別S及子域兩者之IgG+及IgA+ (swIg+) B細胞之數目除以S+ swIg+細胞之總數來計算。單 B 細胞分選 .

在4℃下，生物素標記重組WT (Acro Biosystems，目錄號SPD-C82E8)及BA.1 (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522e) RBD與AlexaFluor 633結合SA (SA-633；Invitrogen)及PE-SA (Invitrogen)以4:1的抗原相對於SA莫耳比分開混合30分鐘。隨後將四個抗原-SA對彙集以形成PE及APC標記之WT及BA.1 RBD四聚體之混合物。在冰上，PBMC經稀釋於FACS緩衝液(2% BSA/1 mM EDTA於1X PBS中)中之四聚化抗原(各25 nM)及抗CD19 (PE-Cy7；Biolegend)、抗CD20 (BV711；Biolegend)、抗CD3 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD8 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD14 (PerCP-Cy5.5；Invitrogen)及抗CD16 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)抗體之混合物染色15分鐘。經染色細胞在400×g下離心10分鐘，用FACS緩衝液洗滌一次，且再次離心以集結細胞。接下來，將細胞再懸浮於稀釋於Brilliant染色緩衝液(BD BioSciences)及FACS緩衝液中之碘化丙錠及抗人類抗體抗IgM (BV421；BD Biosciences)、抗IgG (BV605；BD Biosciences)、抗IgA (FITC；Abcam)、抗CD27 (BV510；BD Biosciences)及抗CD71 (APC-Cy7；Biolegend)中。在冰上培育15分鐘之後，將細胞洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中，且使用BD FACS Aria II (BD Biosciences)分析。定義為CD19+CD3−CD8−CD14−CD16−PI−IgM−及IgG+或IgA+的特異性結合至WT/BA.1 RBD混合物的類型轉換B細胞被單細胞指數分選至含有20 µl溶解緩衝液/孔[5 µl 5X第一股SSIV cDNA緩衝液(Invitrogen)、1.25 µl二硫蘇糖醇(Invitrogen)、0.625 µl NP-40 (Thermo Scientific)、0.25 µl RNaseOUT (Invitrogen)及12.8 µl dH2O]的96孔聚苯乙烯微量盤(Corning)中。盤隨後冷凍在-80℃下，隨後進一步進行後續加工。 抗體可變基因之擴增及選殖 .

抗體可變基因mRNA轉錄物(VH、Vk、Vλ)如先前所述藉由RT-PCR擴增(22)。簡言之，cDNA使用SuperScript IV酶(ThermoFisher Scientific)合成，隨後進行兩輪巢式PCR。巢式PCR之第二循環添加40個鹼基對的5'及3'同源性至限制酶消化之釀酒酵母(S. cerevisiae)表現載體，以使得在轉化期間能夠同源重組。經由乙酸鋰方法將PCR擴增之可變基因DNA化學轉化至勝任型酵母細胞中，且將酵母塗鋪於選擇性胺基酸缺陷型(drop-out)瓊脂盤上(26)。挑取轉化酵母群落進行定序及表徵。 IgG 及 Fab 分子之表現及純化.

抗體經由釀酒酵母培養物表現為人類IgG1，如先前所述(22)。簡言之，酵母細胞經6天生長以表現IgG，且隨後藉由離心收集含IgG上清液。抗體藉由蛋白A-親和層析，用200 mM乙酸/50 mM NaCl (pH 3.5)之溶液溶離來純化。隨後使用1/8體積之2 M Hepes (pH 8.0)中和pH。

Fab片段藉由IgG在30℃下與番木瓜蛋白酶一起培育2小時產生。反應使用碘乙醯胺終止，且含有經消化Fab及Fc之混合物藉由蛋白A瓊脂糖移除Fc片段及未消化IgG來純化。存在於流通物中之Fab使用CaptureSelect™ IgG-CH1親和力樹脂(ThermoFisher Scientific)進一步純化且由使用200 mM乙酸/50 mM NaCl (pH 3.5)之管柱溶離。Fab溶液使用1/8體積的2 M Hepes (pH 8.0)進行pH中和。 藉由生物膜層干涉術進行之結合親和力量測.

結合親和力藉由生物膜層干涉術(BLI)，使用FortéBio Octet HTX儀器(Sartorius)量測。所有步驟均在25℃下且在1000 rpm之環繞式振盪速度下進行。所有試劑均在PBSF緩衝液(含0.1% w/v BSA之PBS)中調配。

重組生物素標記抗原在PBSF中稀釋(100 nM)且負載至鏈黴抗生物素蛋白生物感測器(Sartorius)上達到0.6至1.0 nm之感測器回應，且隨後使其在PBSF中平衡最少30分鐘。PBSF中之60秒基線步驟之後，使裝載抗原之感測器暴露(180秒)於Fab或IgG片段(100 nM)且隨後浸漬(180秒)至PBSF中以量測抗原與生物感測器表面之任何解離。使用FortéBio資料分析軟體版本11.1將具有可偵測結合反應(＞0.1 nm)之Fab結合資料進行對準、步驟間校正(相對於結合步驟)且擬合至1:1結合模型。 藉由生物膜層干涉術進行之抗原決定基分組.

藉由BLI使用ForteBio Octet HTX (Sartorius)測定與重組人類ACE2及比較抗體的結合SARS-CoV-2 RBD之抗體競爭。所有結合步驟均在25℃下且在1000 rpm之環繞式振盪速度下進行。所有試劑均在PBSF (含0.1% w/v BSA之1×PBS)中調配。對於ACE2競爭實驗，測試抗體(100 nM)捕捉於抗人類IgG捕捉(AHC)生物感測器(Molecular Devices)上達到1.0 nm-1.4 nm之感測器回應。隨後在無關IgG1溶液(0.5 mg/ml)中浸泡負載有IgG之感測器(20分鐘)以阻斷剩餘Fc結合位點，接著在PBSF中培育30分鐘。為評估感測器負載之IgG與ACE2之間的任何潛在交叉相互作用，使負載IgG且經阻斷之感測器暴露(90秒)於300 nM ACE2 (Sino Biological，目錄號10108-H08H)。接著使感測器達到基線(60秒)，隨後暴露(180秒)於重組SARS-CoV-2 RBD (100 nM；Acro Biosystems，目錄號SPD-C52H3)，且隨後暴露(180秒)於ACE2 (300 nM)。ACE2暴露後增加之感測器回應表示非ACE2競爭性結合型態，而顯示不變感測器回應之抗體命名為ACE2競爭性。與比較抗體(REGN10933、ADI-62113、COV2-2130、REGN10987及S309)之抗體競爭使用如上文所描述之相同方法進行，但利用不同分析定向：比較抗體捕捉至抗人類IgG捕捉生物感測器(Molecular Devices)，且隨後在溶液中暴露於所關注之抗體(300 nM)。 參考文獻1. T. Pilishvili et al., Effectiveness of mRNA Covid-19 Vaccine among U.S. Health Care Personnel. N Engl J Med 385, e90 (2021). 2. D. R. Feikin et al., Duration of effectiveness of vaccines against SARS-CoV-2 infection and COVID-19 disease: results of a systematic review and meta-regression. Lancet 399, 924-944 (2022). 3. Y. Goldberg et al., Waning Immunity after the BNT162b2 Vaccine in Israel. N Engl J Med 385, e85 (2021). 4. K. B. Pouwels et al., Effect of Delta variant on viral burden and vaccine effectiveness against new SARS-CoV-2 infections in the UK. Nat Med 27, 2127-2135 (2021). 5. L. J. Abu-Raddad, H. Chemaitelly, A. A. Butt, C.-V. National Study Group for, Effectiveness of the BNT162b2 Covid-19 Vaccine against the B.1.1.7 and B.1.351 Variants. N Engl J Med 385, 187-189 (2021). 6. N. Andrews et al., Covid-19 Vaccine Effectiveness against the Omicron (B.1.1.529) Variant. N Engl J Med, (2022). 7. H. Chemaitelly et al., Duration of mRNA vaccine protection against SARS-CoV-2 Omicron BA.1 and BA.2 subvariants in Qatar. medRxiv, 2022.2003.2013.22272308 (2022). 8. W. Dejnirattisai et al., SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leads to widespread escape from neutralizing antibody responses. Cell, (2022). 9. L. Liu et al., Striking antibody evasion manifested by the Omicron variant of SARS-CoV-2. Nature 602, 676-681 (2022). 10. A. Sokal et al., Immune escape of SARS-CoV-2 Omicron variant from mRNA vaccination-elicited RBD-specific memory B cells. bioRxiv, 2021.2012.2021.473528 (2021). 11. S. Iketani et al., Antibody evasion properties of SARS-CoV-2 Omicron sublineages. Nature, (2022). 12. V. Servellita et al., Neutralizing immunity in vaccine breakthrough infections from the SARS-CoV-2 Omicron and Delta variants. medRxiv, 2022.2001.2025.22269794 (2022). 13. S. I. Richardson et al., SARS-CoV-2 Omicron triggers cross-reactive neutralization and Fc effector functions in previously vaccinated, but not unvaccinated individuals. medRxiv, 2022.2002.2010.22270789 (2022). 14. M. S. Seaman et al., Vaccine Breakthrough Infection with the SARS-CoV-2 Delta or Omicron (BA.1) Variant Leads to Distinct Profiles of Neutralizing Antibody Responses. medRxiv, 2022.2003.2002.22271731 (2022). 15. R. R. Goel et al., Efficient recall of Omicron-reactive B cell memory after a third dose of SARS-CoV-2 mRNA vaccine. bioRxiv, 2022.2002.2020.481163 (2022). 16. F. Muecksch et al., Increased Potency and Breadth of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies After a Third mRNA Vaccine Dose. bioRxiv, (2022). 17. B. Briney, A. Inderbitzin, C. Joyce, D. R. Burton, Commonality despite exceptional diversity in the baseline human antibody repertoire. Nature 566, 393-397 (2019). 18. Z. Wang et al., mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature 592, 616-622 (2021). 19. C. O. Barnes et al., SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature 588, 682-687 (2020). 20. M. Yuan et al., Structural and functional ramifications of antigenic drift in recent SARS-CoV-2 variants. Science 373, 818-823 (2021). 21. H. Liu et al., A recurring YYDRxG pattern in broadly neutralizing antibodies to a conserved site on SARS-CoV-2, variants of concern, and related viruses. bioRxiv, 2021.2012.2015.472864 (2021). 22. M. Sakharkar et al., Prolonged evolution of the human B cell response to SARS-CoV-2 infection. Sci Immunol 6, (2021). 23. Q. Zhang et al., Potent and protective IGHV3-53/3-66 public antibodies and their shared escape mutant on the spike of SARS-CoV-2. Nat Commun 12, 4210 (2021). 24. H. A. McNamara et al., Antibody Feedback Limits the Expansion of B Cell Responses to Malaria Vaccination but Drives Diversification of the Humoral Response. Cell Host Microbe 28, 572-585 e577 (2020). 25. T. F. Rogers et al., Isolation of potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and protection from disease in a small animal model. Science 369, 956-963 (2020). 26. R. D. Gietz, R. H. Schiestl, High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2, 31-34 (2007). 實例 2 ： ο BA.1 突破性感染 後之抗體免疫性演變

SARS-CoV-2 ο BA.1變異體在2021年底之出現及全球擴散導致COVID-19病例的迄今最大激增( 1)。儘管當前可用COVID-19疫苗誘導高水平之ο前變異體保護，但ο之廣泛免疫逃脫性使得初級及加打免疫接種之後的疫苗功效及持久性顯著降低( 2- 5)。此外，ο之抗原漂移子譜系(例如BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5、BA.2.75、BA.2.75.2及BA.4.6)繼續出現且取代先前子變異體( 4， 6， 7)。儘管人類中之安全性及免疫原性資料有限，但ο突破性感染之高盛行率引起基於ο變異體之加打mRNA疫苗的研發及緊急使用授權( 2， 8)。因此，迫切需要理解抗原分化變異體，諸如ο之二級暴露是否及如何塑造SARS-CoV-2特異性B細胞記憶。

ο BA.1突破性感染後的急性抗體反應由mRNA疫苗接種誘導的再活化記憶B細胞主導( 9-11)。支持此等發現，評價基於變異體之加打疫苗之免疫原性的臨床試驗之初步資料證明與上代Wuhan-1免疫接種相比，含BA.1之mRNA疫苗誘導峰值血清中和反應之些許改良( 12)。儘管此等研究提供了在ο突破性感染之後早期B細胞反應中「抗原原罪(original antigenic sin)」的證據，但此反應是否及如何隨時間推移演變仍然不明確。為了針對此等問題，SARS-CoV-2特異性血清學及記憶B反應在接種mRNA疫苗供體中縱向剖析直至BA.1突破性感染之後六個月。

最初在BA.1突破性感染之後14至27天(中值=23天)的七個接種mRNA-1273疫苗供體之群組中表徵針對SARS-CoV-2之抗體反應( 9)。為研究此反應之演變，在感染後四至六個月(中值=153天)之約診，自七名參與者中之六名獲得血液樣品( 圖 15A ，表 7)。六個供體中之三者在兩次劑量mRNA-1273疫苗接種之後經歷感染，同時其餘三個供體在第三次加打劑量之後感染。無一供體報導兩個樣品收集時間點之間的第二次突破性感染。表 7. 供體特徵 .

供體 ID	IML4041	IML4042	IML4043	IML4044	IML4045	IML4054	IML4055
年齡	45	19	23	23	24	38	23
性別	F	F	M	F	F	F	F
疫苗史	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2	2x BNT162b2, 1x mRNA-1273	3x mRNA-1273	3x BNT162b2
第 2 次疫苗接種劑量日期	2021年5月7日	2021年7月22日	2021年5月23日	2021年2月10日	2021年5月15日	2021年5月5日	2021年5月1日
第 3 次劑量之日期 ( 若適用 )	-	-	-	-	2021年12月20日	2021年12月11日	2021年12月9日
感染日期	2021年12月31日	2022年1月4日	2021年12月30日	2022年1月2日	2022年1月6日	2022年1月19日	2022年1月6日
感染與第一 (T1) 樣品收集之間的天數	25	21	26	23	19	14	27
感染與第二 (T2) 樣品收集之間的天數	N/A；刪失	170	139	139	168	122	168

為評價血清中和廣度及效能，在基於鼠類白血病病毒(MLV)之假病毒分析中，測試血漿樣品針對SARS-CoV-2 D614G、新出現(emergent)之變異體(BA.1、BA.2、BA.4/5、BA.2.75、β及δ)及進化上更分化的薩貝冠狀病毒SARS-CoV之中和活性。各參與者內之配對比較揭露，相對於感染後一個月內觀測到的，針對D614G之血清中和效價在感染後5至6個月下降4.8倍之中值( 圖 15B)。相應地，觀測到相對於早期時間點，5至6個月時間點針對ο子變異體(分別為2.8至3.9倍)、β (1.6倍)、δ (3.8倍)及SARS-CoV (3.1倍)之血清中和效價降低( 圖 15B)。儘管有此隨時間推移的中和抗體效價減弱，但5至6個月時間點時所有供體血清均顯示可偵測的針對所有所測試SARS-CoV-2變異體之中和活性(中值效價在117至552範圍內) ( 圖 15C)。值得注意地，對於除BA.4/5外之所有變異體，效價保持在D614G觀測到之效價的3倍內，BA.4/5顯示自血清中和抗體之最大逃脫程度(自D614G減少5.5倍)，與公開之血清學研究一致( 4， 5)。此外，SARS-CoV-2 VOC之血清中和效價相對於D614G的降低倍數在兩個時間點保持類似，表明隨時間推移維持血清中和廣度( 圖 15D)。在所有供體中觀測到針對SARS-CoV之極小交叉中和活性(中值效價=21)，表明血清中和廣度仍限於SARS-CoV-2變異體( 圖 15C)。得出結論，ο BA.1突破性感染後6個月時程內血清中和效價減弱，但仍然在6個月內在不同範圍之SARS-CoV-2變異體中保持可偵測水平。

接著，抗原特異性B細胞反應之程度及交叉反應性經由用區別性標記之野生型(Wuhan-1；WT)及BA.1 RBD四聚體染色之B細胞之流式細胞量測計數評估( 圖 16A ，圖 19A)。在5至6個月時間點，總RBD反應性B細胞(WT及/或BA.1反應性)及WT/BA.1交叉反應性B細胞分別包含0.44% (在0.12至2.53%範圍內)及0.37% (在0.12至2.53%範圍內)中值之類型轉換(IgG ⁺或IgA ⁺) B細胞( 圖 16B ，圖 16C ，圖 19A)。因此，與感染後1個月75% (範圍為65-81%)相比，感染後5至6個月之所有RBD+類型轉換B細胞之86% (範圍為69-100%)顯示BA.1/WT交叉反應性( 圖 16D ，圖 20)。相應地，WT特異性B細胞自1個月所有RBD+類型轉換B細胞之25%減少至5至6個月之11% ( 圖 16D ，圖 20)。與血清中和效價隨時間推移之減弱一致，亦觀測到WT/BA.1交叉反應性B細胞在5至6個月時相對於1個月時間點之頻率的些許但顯著降低(1.1至3.7倍) ( 圖 16C)。在晚期時間點，在6個個體中之3個中偵測到BA.1特異性B細胞群體之出現(平均=類型轉換B細胞之3%)，但此反應之程度在個體間廣泛變化(範圍為1%至18%) ( 圖 16D ，圖 20)。總之，ο BA.1突破性感染在感染後早期時間點誘導WT/BA.1交叉反應性B細胞反應且此反應在6個月過程內僅些許降低。

為了比較BA.1突破性感染之後的早期及晚期時間點分離之抗體的分子特徵，在突破性感染之後139至170天，自五個先前研究之供體(供體IML4042、IML4043、IML4044、IML4045)中之四者單細胞分選71至110個類型轉換RBD反應性B細胞，且作為全長IgG表現總計363個原生配對之抗體( 圖 19B) ( 9)。與由急性時間點(acute time point)表徵之抗體類似，新經分離抗體主要識別WT及BA.1 RBD抗原(73-97%)，展現高度殖株多樣性，且顯示某些VH生殖系基因之優先使用(在兩個時間點 IGHV1-46 、 1-69 、 3-13 、 3-53 、 3-66 、 3-9 及 4-31生殖系基因) ( 圖 16E 、圖 21A- 圖 21B及圖 22)。交叉反應性抗體中SHM之含量自1個月時9個VH核苷酸取代之中值增加至5至6個月時11個VH核苷酸取代，潛在地表明二級生發中心中之親和力成熟( 圖 16F)。與其較高含量之SHM一致，在5至6個月分離之抗體顯示相對於早期抗體提高1.7倍之BA.1結合(中值KD=1.3 nM)及降低2倍之與WT RBD之結合親和力(中值K _D=1.0 nM)，表明以WT親和力為代價針對ο BA.1之成熟( 圖 17A 及圖 17B)。結合識別之此等變化產生晚期抗體，其顯示出與早期抗體相比更平衡的親和力型態( 圖 17B)。舉例而言，相比於早期抗體的僅24%，在晚期時間點分離之大部分抗體(73%)展現在彼此之兩倍內的WT及BA.1 RBD親和力( 圖 17C)。

為確定BA.1結合親和力的改良是否轉變為增強的中和效能，使用假病毒分析評估抗體針對WT及BA.1之中和活性。自1個月及5至6個月時間點分離之WT/BA.1交叉結合抗體的分別百分之五十一及42%，以＜ 2 μg/ml的IC ₅₀交叉中和D614G及BA.1。總體而言，中和抗體相對於急性時間點在晚期時間點顯示針對D614G之效能降低大約2倍，與WT RBD親和力隨時間推移之觀測到的降低一致( 圖 17D及圖 17E)。此外，與BA.1 RBD親和力隨時間推移之提高一致，在6個月時分離之抗體相對於在1個月時分離之抗體傾向於更有效中和BA.1 ( 圖 17E)。與急性中和抗體之僅7%相比，在6個月分離的中和抗體之百分比四十一展現相對於D614G更有效的針對BA.1之活性( 圖 17F)。概言之，在BA.1突破性感染後誘導之交叉反應性抗體反應朝向BA.1親和力及中和效能增加演變持續至少感染後6個月。

儘管在5至6個月時間點分離之絕大部分抗體顯示WT/BA.1交叉反應性結合，但在所有四個供體中鑑別出有限數目之BA.1特異性抗體，占總RBD特異性抗體之1%至15% (中值=4%) ( 圖 21A- 圖 21B)。相比之下，僅在單一供體中在急性時間點偵測到BA.1特異性抗體( 圖 21A- 圖 21B)。此外，與在早期時間點分離之不含體細胞突變之BA.1特異性抗體不同，在5至6個月鑑別之BA.1特異性抗體顯示類似於交叉反應性抗體之SHM含量(中值=11個VH核苷酸取代) ( 圖 16F)。在晚期時間點分離之BA.1特異性抗體的百分之四十中和BA.1，其中IC ₅₀在0.002至0.089 μg/ml範圍內，且抗體中無一者顯示針對D614G之可偵測中和活性( 圖 23)。因此，BA.1突破性感染誘導隨時間推移經歷親和力成熟之受限且延遲之從頭ο特異性B細胞反應。

為進一步探究WT/BA.1交叉反應性及BA.1特異性中和抗體兩者之廣度，用一組編碼SARS-CoV-2變異體BA.2、BA.4/5、β及δ以及抗原更分化的SARS-CoV中存在之突變的重組RBD評價其結合反應性。相對於早期中和抗體，D614G/BA.1交叉中和抗體顯示WT RBD之親和力降低2.4倍，且BA.1 RBD之親和力提高3.4倍，與所有WT/BA.1交叉結合抗體所觀測到之模式一致( 圖 18A ，圖 17A- 圖 17C)。此外，在6個月時分離之WT/BA.1交叉反應性抗體廣泛地識別除BA.4/5以外之其他SARS-CoV-2變異體，BA.4/5與57% (68/120)之WT/BA.1中和抗體之親和力≥5倍損失相關( 圖 18A ，圖 24)。重要地，5至6個月抗體相對於早期抗體顯示與所有ο子變異體及β之較高親和力結合，表明增加之對BA.1之親和力亦改良對其他變異體之反應性廣度( 圖 18A)。支持此發現，與早期抗體(22%)相比，在6個月分離的中和抗體之顯著較高比例(40%)顯示與所測試之所有五種變異體之高親和力(K _D＜10 nM)結合( 圖 18B)。此外，在晚期時間點分離之抗體顯示相對於早期抗體，針對BA.1、BA.2、BA.4/5及早期β及δ變異體之結合親和力之較小差異( 圖 18C)。與WT/BA.1交叉反應性抗體相比，BA.1特異性中和抗體顯示有限廣度，其中僅50%之此等抗體維持與BA.2之結合且抗體中無一者顯示與WT、BA.4/5、β或δ之反應性( 圖 23)。得出結論，BA.1突破性感染使得抗SARS-CoV-2中和抗體組庫整體拓寬。

在兩個時間點分離之中和抗體當中，觀測到四個IGHV生殖系基因( IGHV1-69 、 IGHV3-53/3-66及 IGHV3-9)之顯著過表現( 9) ( 圖 25A)。在5至6個月時間點，由此等四個生殖系中之一者編碼超過一半(54%)的中和抗體，其中三分之一此等抗體利用 IGHV1-69( 圖 18D ，圖 25A- 圖 25B)。先前發現，自早期時間點分離之BA.1中和 IGHV1-69抗體優先與輕鏈生殖系IGLV1-40配對且靶向與3類抗體COV2-2130重疊且與ACE2結合位點不重疊之抗原位點( 9)。類似地，在5至6個月分離的 IGHV1-69抗體之69%與 IGLV1-40生殖系配對且大部分(80%)未能與ACE2競爭結合( 圖 26A 及圖 26C)。同樣，兩個時間點鑑別出的 IGHV3-9抗體之＞90%識別非ACE2競爭性結合位點，但不同於 IGHV1-69抗體， IGHV3-9抗體識別重疊S309及REGN10987以及COV2-2130的抗原決定基，表明與IGHV1-69抗體不同之結合模式( 圖 26C) ( 9)。最後，自兩個時間點分離之 IGHV3-53/ 66抗體之特徵為相較於基線HCDR3長度(中值=15個取代)之短HCDR3 (中值=11至12個核苷酸取代)且顯示與ACE2受體競爭性結合( 圖 26B 及圖 26C)。因此，趨同抗體類別主導BA.1突破性感染之後早期及晚期時間點之中和抗體反應，表明B細胞免疫顯性層級隨時間推移變化很少或沒有變化。

鑒於BA.1突破性感染供體中此等公開殖株型之主導性，確定其在BA.1背景中之逃脫突變。隨機選擇一至兩種屬於各趨同生殖系之抗體且使用編碼來自BA.1之所有可能胺基酸取代之庫進行深度突變掃描(DMS)分析( 圖 27A) ( 13)。由 IGHV3-53(ADI-75733)及 IGHV3-66(ADI-75732)編碼之抗體展現類似逃脫型態，與其共有序列特徵及競爭性結合型態一致( 圖 18E 及圖 27C) ( 9)。在新出現的變異體中突變之RBD位置N460及F486 (B.2.75、BA.2.75.2、BN.1及BQ.1中之N460K；BA.2.75.2中之F486S；及BA.4/5、BA.4.6及BQ.1.1中之F486V)與逃脫 IGHV3-53/ 66抗體結合相關( 圖 18F 及圖 27C)。 IGHV1-69及 IGHV3-9抗體均顯示與在位置344-349、356、452-453、468及490處併入突變之RBD的結合減少。值得注意地，殘基R346、K356、L452及F490在進化上多樣的ο子譜系，包括BA.4.6 (R346T、L452R)、BA.4/5 (L452R)、BA.2.12.1 (L452Q)、BJ.1 (R346T、F490V)、BN.1 (R346T、K356T、F490S)及BQ.1.1 (R346T、L452R)中突變( 圖 18F及圖 27C) ( 6)。與此等逃脫型態一致，相對於早期ο變異體， IGHV1-69及 IGHV3-9類抗體展現降低之與BA.2.12.1及BA.4/5之結合，可能歸因於與BA.1及BA.2相比存在於此等變異體中之獨特L452Q/R突變( 圖 18G)。與基於DMS之預測一致，BA.2.75及BA.4/5 RBD均顯示對 IGHV3-53/ 66抗體之增加的結合抗性( 圖 18F 及圖 18G)。因此，趨同D614G/BA.1交叉中和抗體識別最近新出現之ο子變異體中通常突變之抗原決定基，提供在近期ο子變異體演變中觀測到之高度抗原彙聚及其相對於BA.1提高之免疫逃脫水平的分子解釋。

概言之，接種mRNA疫苗之個體中之BA.1突破性感染誘導在感染之後持續至少六個月之廣泛中和血清學及MBC反應，支持顯示BA.1突破性感染提供針對症狀性BA.1、BA.2及BA.5感染持續至少5至6個月之保護的現實世界研究( 14-16)。此外，儘管在突破性感染之後急性B細胞反應主要藉由交叉反應性疫苗誘導MBC之回憶介導，但此等MBC殖株累積體細胞突變且在感染後持續至少6個月演變出增加的廣度及效能。儘管此增強之中和廣度及效能未反映於血清抗體反應中，但可能的係，第二異源暴露可藉由活化此等親和力成熟MBC而拓寬血清學組庫，類似於在mRNA加打疫苗接種之後所觀測到的改良之血清中和廣度( 17 ， 18)。無論如何，此等資料指示，用抗原分化SARS-CoV-2變異體感染或疫苗接種可藉由拓寬預先存在的抗SARS-CoV-2 B細胞記憶而提供長期益處。

最後，發現趨同類別之中和抗體在早期及晚期時間點皆主導BA.1突破反應，使人聯想到早期上代SARS-CoV-2株系初級感染或疫苗接種之後引發之抗體反應( 19-21)。靶向時常在新出現的ο子變異體中突變之殘基的公開殖株之持續流行為ο之持續抗原漂移提供分子解釋。因此，與設計用於抗原高度可變病毒(諸如HIV及流感)之通用疫苗，旨在將中和反應集中於有限數目之相對保守抗原決定基的當前方法相比，開發「變異體可靠(variant-proof)」之COVID-19疫苗可能需要不同策略：工程改造針對一組有限的略微可變、非重疊抗原決定基誘導中和抗體反應的基於棘蛋白之免疫原，目標為限制趨同免疫壓力( 22-24)。 材料及方法 人類個體及血液樣品收集 .

招募七個BA.1突破性感染參與者，根據Dartmouth-Hitchcock醫院之免疫監測核心(DartLab)實驗室的健康供體方案D10083，知情同意參與此研究，如先前所描述( 9)。簡言之，參與者在兩劑量或三劑量mRNA疫苗接種之後經歷突破性感染(BNT162b2及/或mRNA-1273)。在兩個時間點收集靜脈血液，其第一次SARS-CoV-2測試之後的14至27天的早期問診(T1)及139至170天的晚期問診(T2)。參與者在疫苗接種之前或在兩個抽血時間點之間無SARS-CoV-2感染之記錄病史。突破性感染供體之臨床及人口統計特徵顯示於表7中。使用Ficoll 1077 (Sigma)梯度分離血漿及周邊血液單核細胞(PBMC)樣品，如先前所述( 9)。 質體設計及構築 .

將表現SARS-CoV-2變異體及SARS-CoV之棘蛋白的質體作為基因塊片段(IDT)排序且選殖入用於基於MLV之假病毒產生之哺乳動物表現載體中，如先前所述( 26)。所有SARS-CoV-2變異體棘蛋白及SARS-CoV棘蛋白C端分別截短19個胺基酸或28個胺基酸以提高感染性效價。SARS-CoV S序列取自ENA (AAP13441)。SARS-CoV-2變異體含有自Wuhan-Hu-1序列(Genbank：NC_045512.2)的以下突變： ●D614G：D614G ●β：D80A、D215G、∆242-244、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V ●δ：T19R、G142D、Δ156-157、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N ●BA.1：A67V、Δ69-70、T95I、G142D/Δ143-145、Δ211/L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F ●BA.2：T19I、L24S、Δ25-27、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K ●BA.4/5：T19I、L24S、Δ25-27、Δ69-70、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、F486V、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K ●BA.2.75：T19I、L24S、Δ25-27、G142D、K147E、W152R、F157L、I210V、V213G、G339H、G257S、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、G446S、N460K、S477N、T478K、E484A、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K SARS-CoV-2 假病毒產生 .

用SARS-CoV-2變異體及SARS-CoV之棘蛋白假型化的單週期感染性MLV如先前所述產生( 26)。簡言之，HEK293T細胞以50萬個細胞/ml之密度接種於6孔組織培養盤中且次日使用脂染胺2000 (ThermoFisher Scientific)用以下質體轉染：1) 0.5 µg/孔的pCDNA3.3，其編碼C端含19胺基酸截斷的SARS-CoV-2棘蛋白，2) 2 µg/孔的基於MLV之螢光素酶報導基因質體(Vector Builder)，及3) 2 µg/孔的MLV gag/pol (Vector Builder)。轉染後48小時收集MLV粒子，等分且在-80℃下儲存用於中和分析。 假病毒中和分析.

用於血清及單株抗體之MLV假病毒中和分析如先前所描述進行( 9)。簡言之，將56℃加熱失活血清或抗體在50 μl補充有10%胎牛血清(FBS)之MEM/EBSS培養基中連續稀釋且在37℃下與50 μl MLV病毒儲備液一起培育1小時。在培育之後，將抗體-病毒混合物添加至先前接種之HeLa-hACE2報導細胞(BPS Bioscience目錄號79958)中。使感染在37℃下發生48小時。根據製造商的方案，感染藉由用螢光素酶細胞培養物溶解試劑(Promega)溶解細胞，且使用螢光素酶分析系統(Promega)偵測螢光素酶活性來量測。感染性藉由相對冷光單位(RLU)定量且中和百分比計算為100*(1-[RLU _樣品- RLU _背景]/[ RLU _同型對照 _mAb-RLU _背景])。中和IC ₅₀在GraphPad Prism (版本9.3.1)中由使用四參數非線性回歸擬合之曲線內插。 SARS-CoV-2 S 特異性 B 細胞反應 之 FACS 分析 .

如先前描述( 9)，使用用螢光團結合之鏈黴抗生物素蛋白(SA)四聚化之重組生物素標記抗原偵測抗原特異性B細胞。簡言之，Avitag生物素標記WT RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C82E8)及Avitag生物素標記BA.1 RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C82E4)分別以4:1莫耳比與SA-BV421 (BioLegend)及SA-藻紅素(PE；Invitrogen)混合，且使其在冰上培育20分鐘。隨後使用5 μl 2 μM Pierce生物素(ThermoFisher Scientific)淬滅未結合SA位點。大約1000萬個PBMC經稀釋於FACS緩衝液(2% BSA/1 mM EDTA於1X PBS中)中的四聚化RBD (各25 nM)；抗人類抗體抗CD19 (PE-Cy7；Biolegend)、抗CD3 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD8 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)、抗CD14 (PerCP-Cy5.5；Invitrogen)及抗CD16 (PerCP-Cy5.5；Biolegend)；及50 µl Brilliant染色緩衝液(BD BioSciences)染色。將200 μl染色試劑添加至各PBMC樣品中且在冰上培育15分鐘。在FACS緩衝液洗滌一次之後，細胞於碘化丙錠與抗人類抗體抗IgG (BV605；BD Biosciences)、抗IgA (FITC；Abcam)、抗CD27 (BV510；BD Biosciences)及抗CD71 (APC-Cy7；Biolegend)之混合物中染色。在冰上培育15分鐘之後，細胞用FACS緩衝液洗滌兩次且使用BD FACS Aria II (BD BioSciences)分析。

為分選RBD特異性類型轉換B細胞、CD19 ⁺CD3 ⁻CD8 ⁻CD14 ⁻CD16 ⁻PI ⁻及IgG ⁺或IgA ⁺細胞當中與WT及/或BA.1 RBD四聚體反應的PBMC被單細胞指數分選至含有20 µl溶解緩衝液/孔[5 µl 5X第一股SSIV cDNA緩衝液(Invitrogen)、1.25 µl二硫蘇糖醇(Invitrogen)、0.625 µl NP-40 (Thermo Scientific)、0.25 µl RNaseOUT (Invitrogen)及12.8 µl dH2O]的96孔聚苯乙烯微量盤(Corning)中。盤短暫離心且隨後冷凍在-80℃下，隨後PCR擴增。 抗體可變基因之擴增及選殖 .

抗體可變基因片段(VH、Vk、Vλ)如先前所述藉由RT-PCR擴增( 27)。簡言之，cDNA係使用隨機化六聚體及SuperScript IV酶(ThermoFisher Scientific)合成。cDNA隨後藉由兩輪巢式PCR擴增，其中巢式PCR之第二循環添加40個鹼基對的側接同源DNA至限制酶消化之釀酒酵母表現載體，以使得在轉化期間能夠同源重組。將經PCR擴增之可變基因DNA與表現載體混合且經由乙酸鋰方法化學轉化為勝任型酵母細胞( 28)。將酵母塗鋪於選擇性胺基酸缺陷型瓊脂盤上且挑取個別酵母群落進行定序及重組抗體表現。 IgG 及 Fab 分子之表現及純化.

抗體經由釀酒酵母培養物表現為人類IgG1，如先前所述( 27)。簡言之，酵母細胞在培養物中生長6天以產生抗體，隨後藉由離心收集含IgG上清液。IgG隨後藉由蛋白A-親和層析純化且使用200 mM乙酸/50 mM NaCl (pH 3.5)溶離。隨後使用1/8體積之2 M Hepes (pH 8.0)中和pH。Fab片段藉由在30℃下與番木瓜蛋白酶一起培育2小時而自全長IgG裂解，隨後使用碘乙醯胺終止反應。使用雙步層析系統自經消化之抗體Fab及Fc片段之混合物純化Fab片段：1)使用蛋白A瓊脂糖移除Fc片段及未消化IgG，及2)流通物中之Fab使用CaptureSelect™ IgG-CH1親和力樹脂(ThermoFisher Scientific)進一步純化且由使用200 mM乙酸/50 mM NaCl (pH 3.5)之管柱溶離。Fab溶液使用1/8體積的2 M Hepes (pH 8.0)進行pH中和。 藉由生物膜層干涉術進行之結合親和力量測.

抗體結合動力學藉由生物膜層干涉術(BLI)，使用FortéBio Octet HTX儀器(Sartorius)量測。所有步驟均在25℃下且在1000 rpm之環繞式振盪速度下進行，且所有試劑均在PBSF緩衝液(含0.1% w/v BSA之PBS)中調配。為了量測針對SARS-CoV-2 RBD變異體及SARS-CoV S之單價結合親和力，根據製造商的建議，使用EZ-Link™磺酸基-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific)生物素標記SARS-CoV-2 WT (Acro Biosystems，目錄號SPD-C52H3)、β (Acro Biosystems，目錄號SPD-C52Hp)、δ (Acro Biosystems，目錄號SPD-C52Hh)、BA.1 (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522f)、BA.2 (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522g)、BA.4/5 (Acro Biosystems，目錄號SPD-C522r)及SARS-CoV (Sino Biological，目錄號40150-V08B2)之重組RBD，以得到平均4個生物素/RBD分子。生物素標記抗原在PBSF中稀釋(100 nM)且負載至鏈黴抗生物素蛋白生物感測器(Sartorius)上達到1.0至1.2 nm之感測器回應，且隨後使其在PBSF中平衡最少30分鐘。PBSF中之60秒基線步驟之後，使裝載抗原之感測器暴露(180秒)於100 nM Fab且隨後浸漬(420秒)至PBSF中以量測抗原與生物感測器表面之任何解離。使用FortéBio資料分析軟體(版本11.1)將具有可偵測結合反應(＞0.1 nm)之Fab結合資料進行對準、步驟間校正(相對於結合步驟)且擬合至1:1結合模型。 根據生物膜層干涉術之 ACE2 競爭性 .

與重組人類ACE2受體(Sino Biological，目錄號10108-H08H)之抗體結合競爭性係藉由BLI，使用ForteBio Octet HTX (Sartorius)測定。所有結合步驟均在25℃下且在1000 rpm之環繞式振盪速度下進行。所有試劑均在PBSF (含0.1% w/v BSA之1×PBS)中調配。在抗人類IgG捕捉(AHC)生物感測器(Molecular Devices)上捕捉IgG (100 nM)至達到1.0 nm-1.4 nm之感測器回應，且隨後在無關IgG1溶液(0.5 mg/ml)中浸泡(20分鐘)以阻斷剩餘Fc結合位點。接著，感測器在PBSF中平衡30分鐘且隨後短暫暴露(90秒)於300 nM ACE2，以評估感測器負載之IgG與ACE2之間的任何潛在交叉相互作用。使感測器在PBSF中達基線(60秒)後，暴露(180秒)於100 nM SARS-CoV-2 RBD (Acro Biosystems，目錄號SPD-C52H3)。最後，使結合RBD之感測器暴露(180秒)於300 nM ACE2以評估競爭性，其中在ACE2暴露之後引起感測器回應增加的抗體表示非ACE2競爭性結合型態，而彼等引起不變回應的抗體表示ACE2競爭性型態。 逃脫抗體結合之深度突變掃描分析.

鑑別逃脫各單株抗體結合的突變之酵母呈現深度突變掃描實驗係採用二重覆之位點飽和突變誘發ο BA.1 RBD庫進行( 13)。酵母庫在SD-CAA培養基(6.7 g/L酵母氮源基礎培養基(Yeast Nitrogen Base)、5.0 g/L酪蛋白胺基酸、2.13 g/L MES及2% w/v右旋糖)中生長且在SG-CAA+0.1%D (SD-CAA，其中以2%半乳糖及0.1%右旋糖替代2%右旋糖)中反稀釋至0.67 OD600，以誘導RBD表現，其在室溫下在溫和攪拌下進行16至18小時。取5 OD細胞在PBS-BSA (0.2 mg/L)中洗滌且在室溫下在1 mL中，以根據前導等基因結合分析確定為EC90的抗體濃度標記一小時。並行地，將0.5 OD表現ο BA.1野生型RBD之酵母在100 μL抗體中依匹配EC90濃度或0.1× FACS閘設定濃度培育。細胞經洗滌，與1:100 FITC結合雞抗Myc抗體(Immunology Consultants CMYC-45F)一起培育以標記RBD表現，及與1:200 PE結合山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch 109-115-098)一起培育以標記結合抗體。洗滌經標記之細胞且再懸浮於PBS中，以用於FACS。

經由FACS，在BD FACSAria II上選擇各庫中之逃脫抗體細胞。選取FACS選擇閘，以捕捉大約50%的表現野生型BA.1 RBD的酵母，其已在降低10×抗體標記濃度下標記(參見圖 27A中之閘)。對於各樣品，在分選器上，以逃脫抗體分組中收集的細胞處理約4百萬個RBD ⁺細胞。分選的細胞在SD-CAA+青黴素-鏈黴素中生長隔夜，純化質體(Zymo D2005)，PCR擴增，且在Illumina NextSeq上進行條碼定序。並行地，自30 OD分選前之庫培養物純化質體樣品且定序，以確立選擇前之條碼頻率。

經解多工Illumina條碼讀數使用dms_variants (版本0.8.9)匹配至條碼-突變體查表中之庫條碼，獲得各分選前及分選後群體中各條碼之計數表。各帶條碼的變異體之逃脫分數係經由下式自分選前及逃脫抗體群體中之定序計數計算：其中 F為逃脫抗體結合之庫之總分數， n _v為添加偽計數0.5之分選前或分選後樣品中變異體 v之計數，且 N為分選前及分選後所有變異體中之總定序計數。此等逃脫分數表示歸入逃脫分組中之表現特定變異體的細胞之估計分數。

應用計算過濾器移除具有低定序計數或具有＜-2之ACE2結合評分或＜-1之表現評分的高度有害突變的突變體，且移除針對保守RBD半胱胺酸殘基的突變。每突變體逃脫分數計算為複本內條碼間平均值，具有圖 27B中所顯示之重複庫選擇之間的相關性。 參考文獻：1. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard | WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard With Vaccination Data, (available at https://covid19.who.int/). 2. H. F. Tseng, B. K. Ackerson, Y. Luo, L. S. Sy, C. A. Talarico, Y. Tian, K. J. Bruxvoort, J. E. Tubert, A. Florea, J. H. Ku, G. S. Lee, S. K. Choi, H. S. Takhar, M. Aragones, L. Qian, Effectiveness of mRNA-1273 against SARS-CoV-2 Omicron and Delta variants. Nat. Med. 28, 1063-1071 (2022). 3. S. Y. Tartof, J. M. Slezak, L. Puzniak, V. Hong, F. Xie, B. K. Ackerson, S. R. Valluri, L. Jodar, J. M. McLaughlin, Durability of BNT162b2 vaccine against hospital and emergency department admissions due to the omicron and delta variants in a large health system in the USA: a test-negative case-control study. Lancet Respir. Med. 10, 689-699 (2022). 4. Q. Wang, Y. Guo, S. Iketani, M. S. Nair, Z. Li, H. Mohri, M. Wang, J. Yu, A. D. 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Walker, Prolonged evolution of the human B cell response to SARS-CoV-2 infection. Sci. Immunol. 6(2021), doi:10.1126/sciimmunol.abg6916. 實例 3. 抗體 VYD223 之重新工程改造

抗體VYD223 (亦稱為ADI-75865)藉由修飾重鏈中之醣基化及去胺基位點來重新工程改造。特定言之，將K74T及N31Q取代引入VYD223之重鏈。所得抗體命名為VYD225。VYD225顯示當以相同製程產生時與親本mAb高度類似之中和效能，但具有改良之可開發性特徵。特定言之，VYD225與VYD223相比具有顯著減少之酸性物種( 圖 28)及糖化物種( 圖 29)。另外，移除醣基化位點(K74T)不顯示對生理學特性( 圖 30A)及結合活性( 圖 30B)之負面影響。VYD225及VYD223之生理學特性亦顯示於圖 33中。圖 34描繪VYD223針對WT SARS-CoV-2及XBB.1.5變異體之中和活性。

為評價VYD225及親本mAb VYD223之結合特性，量測其對野生型SARS-CoV-2株系、BA.1.1變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體之RBD的單價結合親和力。

另外，使用假病毒分析評估VYD225針對野生型SARS-CoV-2株系、BF.7變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體及XBB.1.5變異體之中和活性，且與其他mAb，例如VYD223、VYD224及艾定韋單抗(亦稱為ADI-58125)進行比較。如圖 32中所示，VYD225展現針對所測試之所有變異體，包括XBB.1及XBB1.5的強效及廣泛假病毒中和效能。

此等資料表明VYD225呈現針對SARS-CoV-2 VOC，包括ο變異體之廣泛活性。此抗體代表用於治療性研發之有前景的候選物且提供用於研發誘導廣泛中和抗體反應之疫苗的構架。實例 4. 使用 SARS-CoV-2 棘狀醣蛋白變異體之活體外假病毒中和分析

SARS-CoV-2假病毒中和分析使用PhenoSense SARS-CoV-2中和抗體分析(Monogram Biosciences)，如Huang等人，2021, Sci Rep.11(1):23921中所述進行。簡言之，帶有SARS-CoV-2 D614G或變異體棘蛋白之假病毒藉由用密碼子最佳化之棘蛋白序列表現載體及用螢火蟲螢光素酶報導基因置換HIV包膜基因的HIV基因體載體共轉染HEK293細胞而產生。轉染後48小時收集培養物上清液，過濾且冷凍在＜-70℃下。假病毒效價藉由接種經hACE2及TMPRSS2表現載體短暫轉染之HEK293T細胞及量測在37℃下培育3天之後的螢光素酶活性(以RLU計)確定。基於篩選RLU，針對所有變異體標準化用於分析之病毒接種體。

為測試抗體中和，在37℃下將預定量之假病毒與滴定量之測試mAb一起培育1小時，隨後添加至表現hACE2及TMPRSS2之HEK293細胞中。對於所測試之各變異體，並行測試WT (D614G)參考物。使假病毒感染發生3天，隨後評估細胞之螢光素酶活性。藉由添加Steady Glo (Promega)及使用光度計量測螢光素酶信號(RLU)測定螢光素酶活性。

PhenoSense SARS-CoV-2中和分析中評估VYD224 (亦稱為ADI-80707)針對SARS-CoV-2變異體假病毒的中和效能。如表 8中所示，VYD224展現針對除XBB、XBB.1及XBB.1.5以外之所有假病毒變異體之效能，其針對XBB、XBB.1及XBB.1.5缺乏活性。表 8 ： VYD224 針對 SARS-CoV-2 假病毒之中和活性

Pango 譜系	變異體描述	Monogram假病毒中存在之RBD取代	IC ₅₀(μg/mL)
VYD224
B.1	WT (D614G)		0.0005-0.0011
B.1.617.2	δ	L452R, T478K	0.0010
BA.1	ο	G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y, Y505H	0.0013
BA.4/5	ο	G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, F486V, Q498R, N501Y, Y505H	0.4002
BA.4.6	ο	G339D, R346T, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, F486V, Q498R, N501Y, Y505H	0.2667
BF.7	ο	G339D, R346T, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, F486V, Q498R, N501Y, Y505H	0.2810
BQ.1	ο	G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, K444T, L452R, N460K, S477N, T478K, E484A, F486V, Q498R, N501Y, Y505H	0.4402
BQ.1.1	ο	G339D, R346T, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, K444T, L452R, N460K, S477N, T478K, E484A, F486V, Q498R, N501Y, Y505H	0.8095
BA.2.75	ο	G339H, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, G446S, N460K, S477N, T478K, E484A, Q498R, N501Y, Y505H	0.0040
BN.1	ο	G339H, R346T, K356T, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, G446S, N460K, S477N, T478K, E484A, F490S, Q498R, N501Y, Y505H	0.0015
XBB	ο	G339H, R346T, L368I, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, V445P, G446S, N460K, S477N, T478K, E484A, F486S, F490S, Q493R, Q498R, N501Y, Y505H	＞5
XBB.1	ο	G339H, R346T, L368I, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, V445P, G446S, N460K, S477N, T478K, E484A, F486S, F490S, Q493R, Q498R, N501Y, Y505H	＞5
XBB.1.5	ο	G339H, R346T, L368I, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, V445P, G446S, N460K, S477N, T478K, E484A, F486P, F490S, Q493R, Q498R, N501Y, Y505H	＞5

IC50=半最大抑制濃度；SARS-CoV-2=嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2；WT=野生型。所有資料均使用PhenoSense SARS-CoV-2中和抗體分析(Monogram Biosciences公司)產生。IC50值報導為當資料獲自獨立實驗時的範圍。5 μg/mL為測試之上限濃度。

已完整描述且實現本發明，本發明藉由以下申請專利範圍進一步描述。

專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。

圖 1A- 圖 1G描繪BA.1突破性感染之後的血清結合及中和活性。圖 1A：疫苗接種、感染及抽血時間線。圖 1B- 圖 1C：在BA.1突破性感染之後，血清IgG (圖1B)及(圖1C) IgA與重組WT及BA.1 Hexapro穩定化S蛋白質(左)及RBD (右)之反應性。顯示初級疫苗接種(2×mRNA)後一個月(1M)或六個月(6M)或加打mRNA疫苗接種(3×mRNA)後一個月來自未感染/經疫苗接種供體之血清樣品以供比較。相對於D614G，針對BA.1之中值EC ₅₀之變化倍數顯示於各配對之量測結果集上方。黑色條表示中值結合EC ₅₀效價。虛線表示偵測下限。圖 1D- 圖 1G：使用基於鼠類白血病病毒(MLV)之假病毒中和分析所量測，(圖1D)初級mRNA疫苗接種之後一個月(n=12)、(圖1E)初級mRNA疫苗接種之後六個月(n=10)、(圖1F)加打mRNA疫苗接種之後一個月(n=11)及(圖1G) BA.1突破性感染之後14至27天(n=7)，針對SARS-CoV-2 D614G、β、δ及BA.1及SARS-CoV之血清中和活性。標繪值表示血清中和IC ₅₀效價且資料點上方顯示之值指示中值IC ₅₀效價。各病毒相對於D614G之IC ₅₀效價的變化倍數示於圓括號中。在初級mRNA疫苗接種之後感染之供體顯示為圓形且在加打mRNA疫苗接種之後感染之供體顯示為三角形。統計比較藉由(圖1B-圖1C)雙側克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis test)以及鄧氏(Dunn's)多重比較或(圖1D)弗里德曼氏檢定(Friedman's test)以及多重比較確定。1M，一個月；6M，六個月；EC ₅₀，50%有效濃度；IC ₅₀，50%抑制濃度；WT，野生型。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001。

圖 2A- 圖 2H描繪由BA.1突破性感染誘導之SARS-CoV-2 S特異性B細胞反應。圖 2A- 圖 2B 。藉由流式細胞量測術所量測，初級疫苗接種(2x mRNA)之後一個月或六個月或加打mRNA疫苗接種(3x mRNA)之後一個月，BA.1突破性感染供體及未感染/經疫苗接種供體中，(圖2A) IgG ⁺及(圖2B) IgA ⁺B細胞當中識別重組WT及BA.1 RBD的循環B細胞之頻率。條指示中值頻率。在初級mRNA疫苗接種之後發生突破性感染之供體顯示為圓形，且在加打mRNA疫苗接種之後感染之供體顯示為三角形。圖 2 C 。用於鑑別WT特異性或WT/BA.1交叉反應性的RBD定向B細胞的代表性螢光活化細胞分選(FACS)閘控策略，針對大流行前供體及突破性感染供體顯示。所有RBD反應性細胞中之WT特異性(棕褐)及WT/BA.1交叉反應性(藍綠) B細胞之百分比以圓括號顯示。圖 2D- 圖 2E 。(圖2D)總S ⁺swIg ⁺B細胞或(圖2E) S ⁺swIg ⁺CD71 ⁺B細胞當中結合WT及/或BA.1 RBD的RBD反應性B細胞之平均比例。誤差條表示平均值之標準誤差。mRNA疫苗接種後六個月收集的樣品由於在此時間點低數目之RBD特異性CD71 ⁺細胞而自此分析排除。圖 2F- 圖 2H 。靶向(圖2F) NTD、(圖2G) RBD及(圖2H) Hexapro穩定化S2次單元之S反應性swIg ⁺B細胞的百分比。黑色條表示中值百分比。對於突破性感染供體，此分析捕捉活化反應限於S ⁺swIg ⁺CD71 ⁺B細胞。統計比較藉由(圖2A-圖2B)雙向ANOVA以及後續鄧奈特氏多重比較檢定(Dunnett's multiple comparisons test)或(圖2D-圖2H)雙側克拉斯卡-瓦立斯檢定以及鄧氏多重比較確定。1M，一個月；6M，六個月；swIg，類型轉換免疫球蛋白；WT，野生型。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001。

圖 3A- 圖 3E描繪自BA.1突破性感染供體分離之RBD定向單株抗體之序列特徵。圖 3A 。藉由生物膜層干涉術(BLI)所測定，來自各供體之結合重組WT及/或BA.1 RBD抗原之抗體的比例。自各供體分離之抗體的數目指示在各條形頂部。圖 3B 。殖株譜系分析。殖株擴增之譜系表示為與譜系大小成比例之彩色圖塊，且獨特殖株合併且示為單一灰色區段。抗體的總數在各餅圖之中心顯示。圖 3C 。來源於突破性感染供體之抗RBD抗體當中的生殖系IGHV基因使用頻率。分離自接種mRNA疫苗供體的抗RBD抗體及未選擇(基線)記憶B細胞組庫當中的生殖系基因頻率分佈經包括以供參考( 17)。圖 3DHCDR3胺基酸長度在BA.1反應性抗體中之分佈。虛黑線表示中值，且下部線及上部線分別表示第一及第三四分位數。圖 3E 。自各突破性感染供體分離之抗體中的VH核苷酸取代數目，其中中值由黑色條顯示。統計顯著性相較於基線組庫，藉由費雪精準檢定(Fisher's exact test)來確定。1M，一個月；CDR，互補決定區；IGHV，免疫球蛋白重鏈可變域；VH，可變重鏈；WT，野生型。***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001。

圖 4A- 圖 4G描繪BA.1突破性感染後分離之抗RBD抗體之結合及中和特性。圖 4A 。藉由BLI所量測，重組WT及BA.1 RBD抗原之Fab結合親和力。排除不具有可偵測結合活性或具有無法擬合至1:1結合模型之結合動力學的Fab。圖 4B 。藉由BLI所量測，對於SARS-CoV-2 VOC RBD及SARS-CoV RBD具有指定結合親和力的BA.1反應性抗體的比例。具有無法擬合至1:1結合模型的弱結合親和力之抗體顯示為＞100 nM。圖 4C 。來自各供體，在5 µg/ml之濃度下針對MLV-SARS-CoV-2 D614G及BA.1具有指定水平的中和活性的抗體比例。圖 4D 。在5 µg/ml之濃度下針對D614G及/或BA.1顯示＞90%中和的抗體的MLV-SARS-CoV-2 D614G及BA.1中和IC ₅₀。圖 4E 。顯示BA.1中和抗體之中和效能及結合廣度的熱圖。底部條顯示趨同IGHV生殖系基因家族。圖 4F 。餅圖顯示BA.1中和抗體(右)相較於基線人類抗體組庫(左)當中之趨同生殖系基因使用( 17)。圖 4G 。藉由BLI夾心競爭分析使用ACE2及指定比較抗體所確定，利用趨同IGHV生殖系基因的BA.1中和抗體之競爭性結合型態。Fab，抗原結合片段；IC ₅₀，50%抑制濃度；IGHV，免疫球蛋白基因重鏈可變；K _D，平衡解離常數；N.B.，非結合；WT，野生型。

圖 5描繪循環SARS-CoV-2變異體之流行率。出現在美國CDC區域1 (康涅狄格州、緬因州、馬薩諸塞州、新罕布什爾州、羅得島州及佛蒙特州)中之SARS-CoV-2感染的基因體定序分析藉由指定Pango譜系著色。

圖 6A- 圖 6C描繪SARS-CoV-2 RBD特異性B細胞染色。圖 6A 。確定IgG ⁺及IgA ⁺B細胞當中WT-及BA.1-RBD反應性B細胞之頻率的代表性FACS閘控策略。圖 6B 。確定WT特異性或BA.1/WT交叉反應性的CD71 ⁺S ⁺RBD ⁺細胞之比例的代表性FACS閘控策略。圖 6C 。用於計算針對NTD、RBD及S2子域之S特異性B細胞比例的代表性FACS閘控策略。FSC-A，正向散射面積；FSC-H，正向散射高度；SSC-A，側向散射面積。

圖 7描繪BA.1突破性感染之後，子域特異性在S特異性B細胞反應內之分佈。藉由流式細胞量測術所測定，在雙劑量或三劑量mRNA疫苗接種之後經歷突破性感染之供體中，識別NTD (左)、RBD (中)或融合前穩定化(prefusion-stabilized) S2 (右)子域之S反應性CD71 ⁺swIg ⁺B細胞的比例。黑色條指示中值。

圖 8描繪單細胞分類RBD特異性swIg ⁺B細胞之代表性FACS閘控策略。所示FACS圖閘控於swIg ⁺CD19 ⁺B細胞。包括大流行前供體作為陰性對照。

圖 9描繪自CD71 ⁺B細胞分離之突破性感染源性之抗體的結合反應性。各條頂部之數字表示抗體之總數。

圖 10A- 圖 10C描繪針對SARS-CoV-2變異體及SARS-CoV之抗體活性廣度。圖 10A 。藉由BLI所測定，BA.1中和抗體對SARS-CoV RBD之Fab結合親和力。圖 10B 。顯示與SARS-CoV之Fab結合的抗體當中針對SARS-CoV及BA.1的中和IC50。圖 10C 。對指定SARS-CoV-2關注變異體及SARS-CoV之中和效能(左)及Fab結合親和力(右)。IC50，50%抑制濃度；KD，平衡解離常數；N.B.，非結合；n.d.，未測定；N.N.，非中和。

圖 11描繪BA.1中和抗體當中之IGHV生殖系基因頻率分佈。分離自突破性感染供體之所有RBD結合抗體及人類基線(未選擇)組庫之頻率分佈經包括以供參考( 17)。統計比較相較於基線組庫，藉由費雪精準檢定進行。IGHV，免疫球蛋白重鏈可變域。**P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001。

圖 12描繪利用IGH3-53/3-66生殖系基因之BA.1中和抗體之HCDR3胺基酸長度，其中基線抗體組庫長度經包括以供比較( 17)。統計比較藉由克拉斯卡-瓦立斯檢定以及後續鄧氏多重比較確定。HCDR3，重鏈互補決定區3。****P＜0.0001。

圖 13描繪使用基於MLV之假病毒分析測定，利用趨同(convergent) IGHV生殖系基因之抗體針對D614G及BA.1之中和活性。黑色條表示中值IC50。統計顯著性藉由雙向ANOVA以及後續鄧奈特氏多重比較檢定確定。IC50，50%抑制濃度。IGHV，免疫球蛋白重鏈可變域。**P ＜ 0.01。

圖 14A- 圖 14B描繪突破性感染源性IGHV1-69中和抗體之序列特徵。圖 14A 。非ACE2競爭性IGHV1-19抗體當中的輕鏈IGLV生殖系基因使用。抗體總數在餅圖之中心顯示。圖 14B 。LCDR3胺基酸一致性之成對比較。各成對比較之一致性百分比顯示在各格中間。LCDR3，輕鏈互補決定區3；IGKV，免疫球蛋白κ可變域。IGLV，免疫球蛋白λ可變域。

圖 15A- 圖 15D描繪在BA.1突破性感染之後誘導之血清中和抗體反應。圖 15A 。疫苗接種、BA.1突破性感染及樣品收集時刻表。圖 15B 。經由基於MLV之假病毒中和分析所測定，在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點，針對SARS-CoV-2 D614G及BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5、β及δ變異體及SARS-CoV (SARS1)血清中和活性之配對分析。經連接之資料點表示各供體之成對樣品，且兩個時間點之間的血清效價之中值變化倍數示於圓括號中。虛線表示分析之偵測下限。圖 15C 。針對各供體之突破性感染後(左) 1個月及(右) 5至6個月收集之樣品中SARS-CoV-2變異體及SARS-CoV之血清中和效價。資料點上方顯示中值效價。虛線表示分析之偵測下限。圖 15D 。指定SARS-CoV-2變異體及SARS-CoV相對於SARS-CoV-2 D614G在早期(T1)及晚期(T2)時間點的血清中和效價的變化倍數。黑色條表示中值變化倍數。虛線指示IC ₅₀無變化。在兩次劑量mRNA疫苗接種之後感染之突破性感染供體(n=4)顯示為圓形且在第三mRNA劑量之後感染之供體(n=3)顯示為三角形。一個接種兩次劑量疫苗之突破供體在第二時間點失訪。統計比較藉由(圖15B)威爾科克森匹配對符號秩檢定(Wilcoxon matched-pairs signed rank test)、(圖15C)弗里德曼氏單向ANOVA以及鄧氏多重比較，或(圖15D)混合模型ANOVA確定。* P＜ 0.05；** P＜ 0.01；**** P＜ 0.0001；ns，不顯著。

圖 16A- 圖 16F描繪BA.1突破性感染後SARS-CoV-2 RBD特異性記憶B細胞反應。圖 16A 。代表性螢光活化細胞分選閘控策略，其用於計數(頂部)類型轉換(IgG ⁺或IgA ⁺) CD19 ⁺B細胞當中之總(WT+BA.1) RBD反應性B細胞，及(底部)總RBD反應性類型轉換(IgG ⁺或IgA ⁺) CD19 ⁺B細胞當中之WT特異性、BA.1特異性及WT/BA.1交叉反應性B細胞之頻率。圖 16B- 圖 16C 。在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點類型轉換CD19 ⁺B細胞當中之(B)總RBD反應性或(C) WT/BA.1 RBD交叉反應性B細胞之頻率。連接之資料點表示各供體之成對樣品。在兩次劑量mRNA疫苗接種之後感染之供體(n=4)顯示為圓形且在第三mRNA劑量之後感染之供體(n=3)顯示為三角形。一個接種兩次劑量疫苗之突破供體在第二時間點刪失(censored)。圖 16D 。在各時間點呈現WT特異性、BA.1特異性或WT/BA.1交叉反應性結合之RBD反應性類型轉換B細胞之平均比例。誤差條指示平均值之標準誤差。圖 16E 。在早期(T1)及晚期(T2)時間點，自四個供體分離之RBD定向抗體的殖株譜系分析。殖株擴增譜系(定義為具有相同重鏈及輕鏈生殖系、相同CDR3長度及≥80% CDRH3序列一致性之抗體)表示為彩色圖塊。各彩色圖塊表示具有與譜系大小成比例之圖塊大小的殖株譜系。獨特殖株合併成單一灰色區段。抗體的數目在各餅圖之中心顯示。三個供體(IML4042、IML4043及IML4044)在兩次劑量mRNA疫苗接種之後經歷BA.1突破性感染且其餘供體(IML4045)在加打免疫接種之後感染。圖 16F 。在WT特異性、WT/BA.1交叉反應性及BA.1特異性抗體當中早期及晚期時間點，藉由可變重鏈(VH)區中之核苷酸取代之數目所確定的體細胞超突變之水平。中值藉由黑色條顯示。統計顯著性由(圖16B及圖16C)威爾科克森匹配對符號秩檢定或(圖16D及圖16F)曼-惠特尼U檢定(Mann-Whitney U test)確定。swIg ⁺，類型轉換免疫球蛋白。PE，藻紅素；* P＜ 0.05；** P＜ 0.01。

圖 17A- 圖 17F描繪由BA.1突破性感染誘導之RBD定向抗體的結合及中和特性。圖 17A- 圖 17B 。藉由BLI所量測之WT/BA.1交叉反應性抗體對重組WT及BA.1 RBD抗原之Fab結合親和力標繪為(A)中之來源於(左) 1個月及(右) 5至6個月時間點之抗體的雙變數，且概述為(B)中之柱點圖(column dot plot)。中值親和力由黑色條指示且顯示於資料點下方。圖 17C 。各時間點顯示相對於WT之BA.1 RBD親和力增加(紅色陰影)或對WT RBD之親和力增加(藍色陰影)的WT/BA.1交叉反應性抗體之比例。值表示屬於指定類別中之各者的抗體之百分比。圖 17D- 圖 17E 。藉由基於MLV之假病毒中和分析所測定，交叉結合抗體針對SARS-CoV-2 D614G及BA.1之中和活性。IC ₅₀值標繪於(D)中作為分離自(左) 1個月及(右) 5至6個月連接點之抗體的雙變數，且概述為(E)中之柱點圖。中值IC ₅₀值由黑色條指示且顯示於資料點下方。圖 17F 。各時間點顯示針對BA.1 (紅色陰影)或D614G (藍色陰影)的增加之中和效能的WT/BA.1交叉中和抗體之比例。值表示屬於指定類別中之各者的抗體之百分比。統計比較藉由(B及E)克拉斯卡-瓦立斯檢定以及後續鄧氏多重比較或(C及F)曼-惠特尼U檢定確定。IC ₅₀，50%抑制濃度；K _D，平衡解離常數；* P＜ 0.05；** P＜ 0.01；**** P＜ 0.0001。

圖 18A- 圖 18G描繪BA.1突破性感染之後早期及晚期時間點D614G/BA.1交叉中和抗體之廣度。圖 18A 。藉由BLI所測定，在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點分離的D614G/BA.1交叉中和抗體對於重組SARS-CoV-2變異體RBD及SARS-CoV RBD之Fab結合親和力。黑色條表示中值。圖 18B 。顯示來源於(左)早期及(右)晚期時間點，以＜10 nM Fab K _D結合指定數目之SARS-CoV-2變異體RBD之抗體比例的餅圖。抗體的總數在各餅圖之中心顯示。圖 18C 。相對於WT RBD對重組SARS-CoV-2變異體RBD之Fab結合親和力之指定變化倍數的D614G/BA.1交叉中和抗體之比例。圖 18D 。顯示早期(T1)及晚期(T2)時間線分離之D614G/BA.1交叉中和抗體當中指定趨同生殖系基因之頻率的餅圖。顯示在基線人類抗體組庫中觀測到的生殖系基因頻率(右上方)用於比較。圖 18E 。使用酵母呈現之SARS-CoV-2 BA.1 RBD突變庫之深度突變掃描分析對於指定趨同抗體確定的逃脫結合突變之結構性投影。RBD表面藉由無逃脫(白色)至強逃脫(紅色)範圍內之梯度在各部位著色。圖 18F 。概述指定SARS-CoV-2 ο子譜系中存在的趨同逃脫抗體突變的熱圖。圖 18G 。藉由BLI所量測，利用指定生殖系基因的趨同抗體對SARS-CoV-2 WT及ο子變異體RBD抗原之Fab結合親和力。黑色條指示中值親和力。統計比較藉由(A及C)克拉斯卡-瓦立斯檢定以及霍爾姆斯校正多對比較(Holms corrected multiple pairwise comparisons)，(B及D)費雪精準檢定，或(G)克拉斯卡-瓦立斯檢定以及後續與WT的鄧氏多重比較確定。K _D，平衡解離常數；* P＜ 0.05；** P＜ 0.01；*** P＜ 0.001；**** P＜ 0.0001。

圖 19A- 圖 19B描繪SARS-CoV-2抗原特異性B細胞染色及分選。圖 19A 。確定類型轉換(IgG ⁺或IgA ⁺) B細胞當中WT及/或BA.1 RBD反應性B細胞之頻率的代表性FACS閘控策略。各閘中相對於母閘之事件頻率在各圖區中顯示為百分比。圖 19B 。在BA.1突破性感染之後5至6個月之4個個體中用於WT及/或ο BA.1 RBD特異性記憶B細胞之單細胞分選的FACS閘，供體IML4042、IML4043及IML4044在兩次劑量mRNA疫苗接種之後經歷突破性感染，且IML4045在第三mRNA劑量之後感染。健康大流行前供體樣品作為對照顯示。FSC-A，正向散射面積；FSC-H，正向散射高度；swIg ⁺，類型轉換免疫球蛋白；SSC-A，側向散射面積。

圖 20描繪BA.1突破性感染之後的早期及晚期時間點之RBD定向B細胞的交叉反應性。藉由流式細胞量測術所測定，在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點(左) WT特異性、(中間) WT/BA.1交叉反應性及(右) BA.1特異性之RBD定向類型轉換B細胞之比例。在兩次劑量mRNA疫苗接種之後感染之供體(n=4)顯示為圓形且在第三mRNA加打劑量之後感染之供體(n=3)顯示為三角形。一個接種兩次劑量疫苗之突破供體在第二時間點刪失。統計比較藉由曼-惠特尼U檢定確定。** P＜ 0.01。

圖 21A- 圖 21B描繪BA.1突破性感染之後1個月及5至6個月分離之RBD定向單株抗體的交叉反應性。圖 21A 。藉由BLI所測定，分離自1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點的突破性感染供體之BA.1特異性、WT特異性及WT/BA.1交叉反應性抗體的比例。圖 21B 。兩個時間點之抗體交叉反應性之概述。連接之資料點表示各供體之成對樣品。在兩次劑量mRNA疫苗接種之後感染之供體(n=4)顯示為圓形且在第三mRNA加打劑量之後感染之供體(n=3)顯示為三角形。一個接種兩次劑量疫苗之突破供體在第二時間點刪失。

圖 22描繪交叉反應性抗體當中的IGHV生殖系使用。在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點WT/BA.1交叉反應性抗體當中人類IGHV生殖系基因使用頻率。來源於接種兩次劑量mRNA疫苗/未感染供體之RBD定向抗體的生殖系基因分佈自CoV-AbDab資料庫獲得( 29)。包括人類基線(未選擇)組庫頻率以供參考。統計比較相較於基線組庫，藉由費雪精準檢定進行。IGHV，免疫球蛋白重鏈可變域。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01，*** P＜ 0.001，**** P＜ 0.0001。

圖 23描繪BA.1特異性抗體之結合及中和特性。顯示BA.1特異性抗體之中和IC ₅₀及SARS-CoV-2變異體RBD結合親和力的熱圖。

圖 24描繪D614G/BA.1交叉中和抗體之結合廣度。顯示BA.1突破性感染之後5至6個月分離的D614G/BA.1交叉中和抗體之中和IC ₅₀及SARS-CoV-2變異體RBD結合親和力的熱圖。利用趨同生殖系之抗體指示於最右柱中。

圖 25A- 圖 25B描繪BA.1突破性感染之後5至6個月分離之D614G/BA.1交叉中和抗體之生殖系基因使用。圖 25A 。在突破性感染之後1個月(T1)及5至6個月(T2)分離的D614G/BA.1交叉中和抗體當中的人類IGHV生殖系分佈頻率，其中顯示人類基線組庫頻率以供比較。圖 25B 。顯示利用趨同生殖系基因之各供體分離之交叉中和抗體之比例的餅圖。自各供體分離之抗體的總數在各餅圖上方指示。IGHV，免疫球蛋白人類可變域；* P＜ 0.05，** P＜ 0.01，*** P＜ 0.001，**** P＜ 0.0001。

圖 26A- 圖 26C描繪利用趨同生殖系基因之抗體的序列及結合特徵。圖 26A 。顯示在1個月(T1)及5至6個月(T2)時間點分離之 IGHV1-69抗體當中之輕鏈生殖系使用的餅圖。自各時間點分析之抗體的數目在各餅圖之中心指示。圖 26B 。BA.1突破性感染之後1個月(T1)及5至6個月(T2)分離之 IGHV3-53及 IGHV3-66交叉中和抗體之HCDR3胺基酸長度分佈。包括在初級D614G感染之後分離之利用 IGHV3-53/ 3-66抗體及基線人類抗體組庫之HCDR3長度以供比較。圖 26C 。藉由BLI競爭分析所測定，與ACE2受體競爭結合之利用指定生殖系基因的交叉中和抗體之比例。分析抗體的數目在各餅圖之中心顯示。統計比較藉由克拉斯卡-瓦立斯檢定以及後續鄧氏多重比較確定。A.A.，胺基酸；* P＜ 0.05；**** P＜ 0.0001。

圖 27A- 圖 27C描繪深度突變掃描分析。圖 27A 。用於在酵母呈現之ο BA.1突變體庫中選擇逃脫抗體突變之代表性FACS閘。選取閘以捕捉約50%之以0.1×選擇濃度的抗體濃度標記的野生型ο BA.1表現酵母。自兩重覆突變體庫，對逃脫抗體分組中之酵母細胞進行分選及定序。將分選後突變體頻率與分選前群體相比較以計算每突變體「逃脫分數」，亦即表現突變的細胞在逃脫抗體分選閘中發現之分數。圖 27B 。對於各抗體，重複庫選擇中之每突變(左)及每位點(右)逃脫分數之相關性。圖 27C 。左側之線圖顯示各RBD位點處之總逐位點逃脫。此度量映射至圖17E中之結構。由粉紅條指示之強逃脫位點係在標誌圖(logoplot)，以突變層級出示在中心。依據突變對ACE2結合之影響而著色(比例尺在右側)。應注意，諸如K356T及I468N之顯著逃脫突變係引入N-連接之醣基化模體。

圖 28描繪藉由毛細管等電聚焦(cIEF)所測定，VYD223 (亦稱為ADI-75865)、中間抗體(VYD223+K74T)及VYD225 (VYD223+K74T+N31Q)之電荷變異型態。

圖 29描繪藉由重鏈之減少去醣基化液體層析-質譜分析(LC-MS)所測定，VYD223、中間抗體(VYD223+K74T)及VYD225 (VYD223+K74T+N31Q)所觀測到之完整質量。

圖 30A描繪VYD223及中間抗體(VYD223+K74T)的根據蛋白A純化之後尺寸排阻層析(SEC)之單體物種之含量、疏水性相互作用(HIC)滯留時間及多特異性試劑(PSR)評分。圖 30B描繪VYD223及中間抗體(VYD223+K74T)針對野生型SARS-CoV-2及BA.2.75變異體之RBD之結合親和力。

圖 31描繪VYD225及VYD223針對SARS-CoV-2變異體(BA.1.1變異體、BA.2.75變異體、BQ.1.1變異體及XBB變異體)之RBD之結合親和力。

圖 32為描繪假病毒中和分析中，VYD225、VYD223、VYD224 (亦稱為ADI-80707)及艾定韋單抗針對野生型SARS-CoV-2株系及ο變異體(亦即BF.7變異體、BQ.1.1變異體、BA.2.75變異體、XBB.1變異體及XBB.1.5變異體)之中和IC ₅₀的熱圖。VYD223-A在VYD223之VH鏈中具有K74T取代。

圖 33描繪VYD223及VYD225之生理學分析。

圖 34描繪針對SARS-CoV-2假病毒的VYD223中和之劑量-反應曲線。

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Claims

一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表3及表5中任一VH序列組成之群的胺基酸序列，及其中該VL包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表4及表6中任一VL序列組成之群的胺基酸序列。
如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含選自由表3及表5中之任何VH CDR1序列組成之群的VH CDR1胺基酸序列、選自由表3及表5中之任何VH CDR2序列組成之群的VH CDR2胺基酸序列，及選自由表3及表5中之任何VH CDR3序列組成之群的VH CDR3胺基酸序列，及其中該VL包含選自由表4及表6中之任何VL CDR1序列組成之群的VL CDR1胺基酸序列、選自由表4及表6中之任何VL CDR2序列組成之群的VL CDR2胺基酸序列，及選自由表4及表6中之任何VL CDR3序列組成之群的VL CDR3胺基酸序列。
一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含選自由表3及表5中之任何VH CDR1序列組成之群的VH CDR1胺基酸序列、選自由表3及表5中之任何VH CDR2序列組成之群的VH CDR2胺基酸序列，及選自由表3及表5中之任何VH CDR3序列組成之群的VH CDR3胺基酸序列，及其中該VL包含選自由表4及表6中之任何VL CDR1序列組成之群的VL CDR1胺基酸序列、選自由表4及表6中之任何VL CDR2序列組成之群的VL CDR2胺基酸序列，及選自由表4及表6中之任何VL CDR3序列組成之群的VL CDR3胺基酸序列。
如請求項3之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表3及表5中任一VH序列組成之群的胺基酸序列，及其中該VL包含與以下具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，包含以下或由以下組成：選自由表4及表6中任一VL序列組成之群的胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該CoV-S為SARS-CoV棘蛋白(「SARS-CoV-S」)及/或SARS-CoV-2棘蛋白(「SARS-CoV-2-S」)。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含VYD225、ADI-80707、ADI-75696、ADI-75865、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773之VH胺基酸序列；及其中該VL包含VYD225、ADI-80707、ADI-75696、ADI-75865、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773之VL胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含VYD225、ADI-80707、ADI-75696、ADI-75865、ADI-75864、ADI-75620、ADI-75738、ADI-75700、ADI-75859、ADI-75684、ADI-75754、ADI-75648、ADI-75632、ADI-75741、ADI-75725、ADI-75717、ADI-75706、ADI-75699、ADI-75747或ADI-75773之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中SARS-CoV-S包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少95%一致性的序列，且其中SARS-CoV-2-S包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列具有至少95%一致性的序列。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該SARS-CoV-2-S為B.1.1.7變異體、B.1.351變異體、B.1.1.28變異體、B.1.429變異體、P.1變異體、B.1.617變異體、B.1.617.2變異體、C.37變異體、1.621變異體、AY.1變異體、1.623變異體、C.36變異體、A.27變異體、AV.1變異體、B.1.1.482變異體、B.1.1.523變異體、B.1.427變異體、AY.4變異體、AY.11變異體、D614G變異體、B.1.1.529/BA.1變異體、BA1.1變異體、BA.2變異體、BA.2.75變異體、BA.4變異體、BA.5變異體、BA.4.6變異體、BQ.1變異體、BQ.1.1變異體、XBB變異體、XBB.1變異體、XBB.1.5變異體、BJ.1變異體、BM.1.1.1變異體、BA.2.3.20變異體、BF.7變異體、XBC變異體、BN.1變異體或CH.1.1變異體。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該經分離抗體或其抗原結合片段與SARS-CoV-S及SARS-CoV-2-S交叉反應。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之受體結合域(RBD)或N端域(NTD)。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至來自該B.1.1.529/BA.1變異體、該BA.1.1變異體、該BA.2.75變異體、該BQ.1.1變異體及/或該XBB變異體之CoV-S之受體結合域(RBD)。
如請求項1至10中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之S1次單元及/或S2次單元。
如請求項1至10中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至SARS-CoV-S及/或SARS-CoV-2-S之ACE2結合模體。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與ACE2競爭結合。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段， (a)結合至SARS-CoV及/或SARS-CoV-2之S蛋白；及 (b)不結合至HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63及HCoV-OC43之任何S蛋白。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段， (a)結合至SARS-CoV及/或SARS-CoV-2之S蛋白；及 (b)結合至HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63及HCoV-OC43中至少一者的S蛋白。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至CoV-S之KD值為： (i)約100 nM或更低； (ii)約10 nM或更低； (iii)約1 nM或更低； (iv)約100 pM或更低； (v)約10 pM或更低； (vi)約1 pM或更低；或 (vii)約0.1 pM或更低。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低、或約10 nM或更低、或約1 nM或更低之KD值，結合至來自該B.1.1.529/BA.1變異體、該BA.1.1變異體、該BA.2.75變異體、該BQ.1.1變異體、該XBB變異體、該B.1351變異體或該B.1.617.2變異體之CoV-S之受體結合域(RBD)。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段中和SARS-CoV及/或SARS-CoV-2。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段於活體外中和SARS-CoV及/或SARS-CoV-2時： (i) IC50為約100 nM或更低、約50 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約500 pM或更低、約200 pM或更低、約100 pM或更低、約50 pM或更低、約20 pM或更低、約10 pM或更低、約5 pM或更低、約2 pM或更低或約1 pM或更低；及/或 (ii) IC50為約1 μg/mL或更低、約500 ng/mL或更低、約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段， (a)其中該抗體或其抗原結合片段以約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，在活體外中和SARS-CoV-2之該B.1.1.529/BA.1變異體；及/或 (b)其中該抗體或其抗原結合片段以約200 ng/mL或更低、約100 ng/mL或更低、約50 ng/mL或更低、約40 ng/mL或更低、約30 ng/mL或更低、約20 ng/mL或更低、約10 mg/mL或更低、約5 ng/mL或更低、約2 ng/mL或更低或約1 ng/mL或更低之IC50，在活體外中和SARS-CoV-2之該BA.2.75變異體、該BF.7變異體、該BQ.1.1變異體、該XBB.1變異體及/或該XBB.1.5變異體。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類、人源化、靈長類化、嵌合、雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項23之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段包含至少一個第一抗原結合域(「ABD」)及至少一個第二ABD，其中： (i)該第一ABD包含選自表3至表6之第一抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；及 (ii)該第二ABD包含選自表3至表6之第二抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中第一抗CoV-S抗體與第二抗CoV-S抗體相同，或其中該第一抗CoV-S抗體與該第二抗CoV-S抗體不同。
如請求項24之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗CoV-S抗體結合至第一CoV-S，且該第二抗CoV-S抗體結合至第二CoV-S。
如請求項25之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗CoV-S抗體及該第二抗CoV-S抗體結合至： (i)相同冠狀病毒物種，視情況其中該第一CoV-S及該第二CoV-S (a)皆屬於SARS-CoV或(b)皆屬於SARS-CoV-2，且視情況其中該第一抗CoV-S抗體及該第二抗CoV-S抗體結合至由該SARS-CoV或SARS-CoV-2表現之CoV-S上的相同或不同抗原決定基；或 (ii)不同冠狀病毒物種，視情況其中該第一CoV-S及該第二CoV-S (a)分別屬於SARS-CoV及SARS-CoV-2，或(b)分別屬於SARS-CoV-2及SARS-CoV。
如請求項23之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段包含至少一個第一抗原結合域(「ABD」)及至少一個第二ABD，其中： (a)該第一ABD包含選自表3至表6之第一抗CoV-S抗體的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；及 (b)該第二ABD結合至不為CoV-S之抗原，視情況其中該抗原為細胞介素、細胞介素受體或免疫調節多肽。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含Fab、Fab2或scFv。
如前述請求項中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含恆定區、Fc區或其至少一個域。
如請求項29之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該恆定區或Fc區包含削弱至少一種效應功能之突變，該至少一種效應功能視情況為FcR結合、補體結合、醣基化、補體依賴性細胞毒性(「CDC」)或抗體依賴性細胞毒性(「ADCC」)。
如請求項29之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該恆定區或Fc區為人類的。
如請求項31之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該人類恆定區或Fc區選自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區或Fc區。
一種經分離抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至32中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段競爭結合。
一種經分離抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至33中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基。
一種如請求項1至34中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段中之任一者的親和力成熟變異體。
一種嵌合抗原受體(「CAR」)，其包含至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種抗體藥物結合物(「ADC」)，其包含：(a)至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段；及(b)藥物。
如請求項37之ADC，其中該藥物為： (i)抗病毒藥，視情況為瑞德西韋(remdesivir)、法匹拉韋(favipiravir)、達盧那韋(darunavir)、奈非那韋(nelfinavir)、沙奎那韋(saquinavir)、洛匹那韋(lopinavir)或利托那韋(ritonavir)； (ii)抗蠕蟲藥，視情況為伊維菌素(ivermectin)； (iii)抗寄生蟲藥，視情況為羥氯喹(hydroxychloroquine)、氯喹(chloroquine)或阿托喹酮(atovaquone)； (iv)抗細菌疫苗，視情況為肺結核疫苗BCG；或 (v)消炎藥，視情況為類固醇，諸如環索奈德(ciclesonide)、TNF抑制劑(例如阿達木單抗(adalimumab))、TNF受體抑制劑(例如依那西普(etanercept))、IL-6抑制劑(例如克拉紮珠單抗(clazakizumab))、IL-6受體抑制劑(例如托珠單抗(toclizumab))或安乃近(metamizole)； (vi)抗組織胺藥，視情況為貝他斯汀(bepotastine)； (vii) ACE抑制劑，視情況為莫西普利(moexipril)； (viii)抑制CoV-S之激活(priming)的藥物，視情況為絲胺酸蛋白酶抑制劑，進一步視情況為萘莫司他(nafamostat)；或 (ix)細胞毒性藥物，視情況為道諾黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、小紅莓(doxorubicin)、葫蘆素(cucurbitacin)、毛殼素(chaetocin)、球毛殼菌素(chaetoglobosin)、克林黴素(chlamydocin)、卡奇黴素(calicheamicin)、奈莫柔黴素(nemorubicin)、念珠藻素(cryptophyscin)、蒙薩卡星(mensacarcin)、安絲菌素(ansamitocin)、絲裂黴素(mitomycin) C、格爾德黴素(geldanamycin)、米徹黴素(mechercharmycin)、蝴蝶黴素(rebeccamycin)、番紅菌素(safracin)、沖酯黴素(okilactomycin)、寡黴素(oligomycin)、放線菌素(actinomycin)、山卓黴素(sandramycin)、寄端黴素(hypothemycin)、聚酮黴素(polyketomycin)、羥基玫瑰樹鹼(hydroxyellipticine)、硫代秋水仙鹼(thiocolchicine)、甲胺喋呤(methotrexate)、雷公藤內酯(triptolide)、他托布林(taltobulin)、乳胞素(lactacystin)、海兔毒素(dolastatin)、奧瑞他汀(auristatin)、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、特羅他汀(telomestatin)、妥巴他汀(tubastatin) A、康普瑞汀(combretastatin)、類美登素(maytansinoid)、MMAD、MMAF、DM1、DM4、DTT、16-GMB-APA-GA、17-DMAP-GA、JW 55、吡咯并苯并二氮呯、SN-38、Ro 5-3335、普瓦那黴素(puwainaphycin)、倍癌黴素(duocarmycin)、巴弗洛黴素(bafilomycin)、類紫杉醇(taxoid)、妥布賴森(tubulysin)、阿魏醇(ferulenol)、魯索爾(lusiol) A、煙黴素(fumagillin)、吸水菌酯素(hygrolidin)、殺粉蝶黴素葡萄糖苷(glucopiericidin)、瓢菌素(amanitin)、安三烯菌素(ansatrienin)、燼灰紅菌素(cinerubin)、類鬼筆環肽(phallacidin)、鬼筆環肽(phalloidin)、植物鞘胺醇(phytosphongosine)、殺粉蝶黴素(piericidin)、普洛尼汀(poronetin)、鬼臼毒素(phodophyllotoxin)、短桿菌素(gramicidin) A、血根鹼(sanguinarine)、西奈芬淨(sinefungin)、荷伯希二烯(herboxidiene)、微鞘藻素(microcolin) B、微囊藻素(microcystin)、黏胞毒素(muscotoxin) A、單歧藻毒素(tolytoxin)、曲普林(tripolin) A、肌基質蛋白(myoseverin)、黴菌毒素(mytoxin) B、諾措林(nocuolin) A、土荊皮酸(psuedolaric acid) B、偽神經素(pseurotin) A、環巴胺(cyclopamine)、紅麴黃素(curvulin)、秋水仙鹼(colchicine)、阿非迪黴素(aphidicolin)、恩格爾林(englerin)、蛹蟲草菌素(cordycepin)、凋亡蛋白(apoptolidin)、埃坡黴素(epothilone) A、利馬醌(limaquinone)、異卓酚酮(isatropolone)、艾索妥拉林(isofistularin)、喹哪朵肽(quinaldopeptin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、艾洛普辛(aeroplysinin)、銅綠菌素(arruginosin)、農桿菌素(agrochelin)或埃坡黴素(epothilone)。
一種組合物，其包含至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
一種治療方法，其在有需要之個體中治療SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，或治療與該感染相關之病狀、症狀、疾病或病症，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
如請求項41之方法，其中該病狀、症狀、疾病或病症包含以下中之至少一者：支氣管炎、肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸衰竭、器官衰竭、多器官系統衰竭、小兒科發炎性多系統症候群、急性呼吸窘迫症候群、血栓、心臟病狀、心肌損傷、心肌炎、心衰竭、心跳停止、急性心肌梗塞、心律不整、靜脈血栓栓塞、加護後症候群、休克、過敏性休克、細胞介素釋放症候群、敗血性休克、散播性血管內凝血、缺血性中風、腦內出血、微血管病性血栓形成、精神病、癲癇、非驚厥性癲癇持續狀態、創傷性腦損傷、中風、缺氧性腦損傷、腦炎、可逆性後部白質腦病、壞死性腦病、感染後腦炎、自體免疫介導之腦炎、急性散播性腦脊髓炎、急性腎損傷、急性肝損傷、胰損傷、免疫性血小板減少症、亞急性甲狀腺炎、胃腸併發症、麴黴病、對另一病毒或細菌感染之易感性增加及/或妊娠相關併發症。
一種預防感染之方法，其在有需要之個體中預防SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群之另一冠狀病毒的感染，該方法包含向該個體投與預防有效量之如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
一種誘導免疫反應之方法，其在有需要之個體中誘導針對SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之免疫反應，該方法包含投與至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
如請求項44之方法，其中該免疫反應引發針對SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或另一冠狀病毒之免疫保護。
一種抑制或阻斷易感細胞感染之方法，其在有需要之個體中抑制或阻斷易感細胞之SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒感染，該方法包含投與至少一種如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
一種方法，其防止感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體戴上呼吸器之需求，或減少感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體戴上呼吸器之時間，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
一種方法，其預防感染SARS-CoV、SARS-CoV-2及/或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體的肺炎發作，或針對感染SARS-CoV或SARS-CoV-2或視情況選自由MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-NL63組成之群的另一冠狀病毒之個體治療個體之肺炎及/或肺炎症狀，該方法包含向該個體投與預防或治療有效量之如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項36之CAR、或如請求項37或請求項38之ADC。
如請求項41至48中任一項之方法，其中該個體為人類個體。
如請求項49之方法，其中該個體具有至少一個使得其更易於出現不良臨床結果之風險因素。
如請求項50之方法，其中該至少一個風險因素為以下中之一或多者：(i)高齡，諸如超過55歲、60歲或65歲；(ii)糖尿病；(iii)慢性呼吸病狀，諸如哮喘、囊腫性纖維化、另一纖維化病狀及COPD；(iv)肥胖；(iv)高血壓；(v)心臟或心血管病狀，諸如心臟缺陷或異常；(vi)慢性發炎性或自體免疫病狀，諸如狼瘡及多發性硬化；及(vii)免疫功能不全狀態，其可由癌症、正在進行之化學療法、吸菸、骨髓或器官移植、免疫缺乏症、控制不良之HIV感染或AIDS或長期使用皮質類固醇或其他免疫抑制藥品引起。
如請求項41至51中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係靜脈內或肌肉內投與。
如請求項41至52中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段依以下劑量投與：約100 mg至約5000 mg、約100 mg至4500 mg、約100 mg至4000 mg、約100 mg至約3500 mg、約100 mg至約3000 mg、約100 mg至約2500 mg、約100 mg至約2000 mg、約200 mg至約1500 mg、約300 mg至約600 mg、約500 mg至約1200 mg、約300 mg至約1200 mg、約500至約1000 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1500 mg至約2000 mg、約2000 mg至約2500 mg、約2500 mg至約3000 mg、約3000 mg至約3500 mg、約3500 mg至約4000 mg、約4000至約4500 mg或約4500 mg至約5000 mg。
如請求項41至53中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段依以下劑量投與：約300 mg、約500 mg、約600 mg、約1000 mg、約1200 mg、約1500 mg、約2000 mg、約2500 mg、約300 mg、約3500 mg、約4000 mg、約4500 mg或約5000 mg。
如請求項41至54中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係投與一次，或每週、每月、每兩個月、每三個月或每六個月投與。
如請求項41至55中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段與一或多種額外抗CoV-S抗體組合投與，視情況其中該一或多種額外抗CoV-S抗體為ADI-58125或其抗原結合片段。
一種產生如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合部分的方法，該方法包含在重組細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
如請求項57之方法，其進一步包含由自該細胞分離之該抗體或其抗原結合部分調配成醫藥組合物。
如請求項57或請求項58之方法，其進一步包含向有需要之個體投與該抗體或其抗原結合部分。
一種抗體庫，其包含至少10種結合至冠狀病毒棘蛋白(CoV-S)的經分離抗體或其抗原結合片段，其中該等抗體或其抗原結合片段各自包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中各VH由選自由表3及表5中之任一VH序列組成之群的胺基酸序列組成，及其中各VL由選自由表4及表6中之任一VL序列組成之群的胺基酸序列組成。
一種組合物，其包含兩種或更多種選自由VYD225、VYD223及VYD224組成之群的經分離抗體或其抗原結合片段。
如請求項61之組合物，其中該組合物包含VYD225及VYD224。
一種經分離核酸分子，其編碼如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種經分離mRNA分子，其編碼如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種組合物，其包含如請求項63之經分離核酸分子或如請求項64之經分離mRNA分子。
一種套組，其包含如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項63之經分離核酸分子、或如請求項64之經分離mRNA分子，及使用說明書。
一種小瓶，其包含如請求項1至35中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項63之經分離核酸分子、或如請求項64之經分離mRNA分子。
如請求項67之小瓶，其中該小瓶為1 mL小瓶、2 mL小瓶、4 mL小瓶、8 mL小瓶、12 mL小瓶、16 mL小瓶、20 mL小瓶或24 mL小瓶。
如請求項67或68之小瓶，其中該小瓶包含約100 mg、約200 mg、約300 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、約1000 mg、約1500 mg、約2000 mg或約2500 mg之該抗體或其抗原結合片段。