KR101793195B1 - 바이러스에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

바이러스에 대한 백신으로 사용하기 위한 부분적 글리코실화 바이러스 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화 바이러스 표면 당단백질 및 폴리펩티드를 이용하여 제조한 백신은 균주들을 교차하여서도 바이러스에 대하여 강력하고 광범위한 보호를 제공한다. 모노글리코실화 헤마글루티닌 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 이로부터 제조한 백신 및 이들을 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용하는 방법이 개시된다. 개시된 방법 및 조성물은 인플루엔자 바이러스 HA, NA 및 M2, RSV 단백질 F, G 및 SH, 댕기 바이러스 당단백질 M 또는 E, C형 간염 바이러스 당단백질 E1 또는 E2 및 HIV 당단백질 gp120 및 gp41에 대한 것이다.

Description

바이러스에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST VIRUS}
본 발명은 일반적으로는 바이러스에 대하여 효과적인 강력한 광범위 반응성 면역원성 조성물을 제조하는데 유용한 부분적으로 글리코실화된 바이러스 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 모노글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)을 이용하여 제조되고 인플루엔자 바이러스에 대하여 강력한 활성을 나타내는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 당단백질 및 이로부터 발생한 백신을 포함하는 약학적 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위해 탈글리코실화 HA 폴리펩티드를 이용하는 방법에 관한 것이다.
진핵세포에서, 당(sugar) 잔기는 일반적으로 4 개의 서로 다른 아미노산 잔기에 결합되어 있다. 이러한 아미노산 잔기는 O-결합(세린, 트레오닌 및 히드록시리신) 및 N-결합(아스파라긴)으로 분류된다. O-결합 당은 뉴클레오티드 당으로부터 골지(Golgi) 또는 조면 소포체(ER)에서 합성된다. N-결합 당은 일반적인 전구체로부터 합성된 다음 처리된다. N-결합 탄수화물 사슬을 첨가하는 것은 접힘의 안정화, 소포체에서 분해의 방지, 올리고머화, 생물학적 활성 및 당단백질의 수송에 중요한 것으로 알려져 있다. 특정 Asn 잔기에 N-결합 올리고당을 첨가하는 것은 바이러스의 성숙 단백질의 활성, 안정성 및 항원성을 조절하는데 중요한 역할을 한다(Opdenakker G. 외, FASEB Journal 7, 1330-1337 1993). 또한, N-결합 글리코실화는 접힘, 수송, 세포표면발현, 당단백질의 분비(Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265 1994), 단백질 분해로부터의 보호 및 당단백질 용해도의 강화(Doms et al., Virology 193, 545-562 1993)에 필요한 것으로 제안되어 왔다. 바이러스 표면 당단백질은 올바른 단백질 접힘에 필요할 뿐 아니라 글리칸 보호막(glycan shield)으로서 중화 항체에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 강한 숙주-특이성(host-specific) 선별은 가능한 N-결합 글리코실화의 코돈 위치와 흔히 관련이 있다. 따라서, N-결합 글리코실화 부위는 균주 및 집단(clade)에 걸쳐서 보존되는 경향이 있다.
A형, B형 및 C형의 세 가지의 주요한 형태의 인플루엔자 바이러스가 있다. 인플루엔자 바이러스의 A형 균주는 중병을 유발할 수 있고, 인간 유행병을 유발하는 유일한 형태이다. H5N1 균주는 A형 인플루엔자 바이러스이다. B형 균주는 산발성 인간 질병 및 소규모 발병을 유발한다. C형 균주는 인간 감염을 드물게만 유발하고 대규모 발병은 유발하지 않았다. 인플루엔자 A 바이러스 중에서, H1, H2 및 H3 아형(subtype)만이 인간들 사이에서 쉽게 전염되어 왔다.
인플루엔자 A의 발병은 세계적으로 광범위한 질병률 및 치사율을 계속 유발하고 있다. 미합중국 만의 경우, 인구의 5 내지 20%가 해마다 인플루엔자 A 바이러스에 감염되어 약 200,000명의 입원 및 36,000 명의 사망을 초래하는 것으로 추정된다. 포괄적인 백신접종 정책의 수립이 인플루엔자 질병률을 제한하기 위한 효과적인 방안이었다. 그러나, 백신의 빈번한 유전적 부동화(genetic drifting)는 그 백신의 매년 재제형화(reformulation)를 필요로 하므로, 백신에 존재하는 바이러스 균주와 그 순환 사이의 불일치(mismatch)가 초래될 수 있다. 따라서, 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 요법이 질병 심각성 및 전염 모두를 제한하기 위한 중요한 수단이다.
고병원성 H5N1 인플루엔자 바이러스는 2003년 이후로 가금 및 야생 조류에서 발병을 유발하여 왔다(Li KS 외, (2004) Nature 430:209-213). 2010년 2월에, 이들 바이러스는 조류뿐만 아니라 478명의 사람을 감염시켰는데, 그중 286명의 감염은 치명적인 것으로 확인되었다 (www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html). 고병원성 H5N1 및 2009년의 돼지 유래 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 세계적인 발병을 유발하였고, 그 바이러스의 추가의 변형이 치명적인 유행병을 유발한다는 큰 우려를 불러일으켰다(Garten RJ, 외 (2009) Science 325:197-201, Neumann G 외, (2009) Nature 459:931-939). 인플루엔자 바이러스가 인간들 사이에서 효율적으로 전파하려는 능력을 획득하여 유행성 위협이 된다는 우려가 있다. 따라서, 백신은 임의의 유행성 방어 계획의 일체적인 부분이어야 한다.
인플루엔자 바이러스는 단편화된 음성 가닥의 RNA 바이러스이고 Orthomyxoviridae족에 속한다. 인플루엔자 A 바이러스는 9개의 구조적 단백질로 구성되고 조절 기능을 갖는 하나의 비구조적인 NS1 단백질을 추가로 암호화한다. 상기 비구조적인 NS1 단백질은 재생 주기 동안에 다량으로 합성되고 감염 세포의 세포질(cytosol) 및 핵에 집중된다. 이 바이러스 게놈의 단편화된 특성으로 인해, 여러 가지 바이러스 균주들에 의한 세포의 혼합 감염 동안에 유전자 재배열(게놈 단편들의 교환)의 기작이 일어날 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 그 표면 상에 나타난 여러 가지 헤마글루티닌(HA) 및 뉴로아미니다제(NA) 바이러스 단백질에 따라 여러가지 아형들로 더욱 분류된다. 인플루엔자 A 바이러스 아형은 두 개의 바이러스 당단백질, 즉 헤마글루티닌(HA 또는 H) 및 뉴로아미니다제(NA 또는 N)에 의해 확인된다. 각각의 인플루엔자 바이러스 아형은 H 및 N 단백질의 조합에 의해 확인된다. 16종의 HA 아형 및 9 종의 NA 아형이 알려져 있다. 인플루엔자 A형 바이러스는 사람, 조류, 돼지, 말 및 기타 동물들을 감염시킬 수 있으나, 야생 조류는 이러한 바이러스에 대한 천연 숙주이다. 단지 일부 종의 인플루엔자 A 아형(즉, H1N1, H1N2, 및 H3N2)이 오늘날 사람들 사이에 전파되고 있지만, 16H 및 9 NA 아형들의 모든 조합은 조류, 특히 야생 물새 및 도요새에서 확인되어 왔다. 게다가, H5 및 H7 인플루엔자 바이러스가 인간 질병을 유발할 수도 있다는 증거가 계속 확인되고 있다.
인플루엔자 A 바이러스의 HA는 두 개의 구조적으로 특이한 영역, 즉, 구형 머리 영역 및 줄기 영역을 포함한다. 구형 머리 영역은 표적 세포에의 바이러스 부착을 초래하고 HA의 헤마글루틴화 활성에 관여하는 수용체 결합 부위를 포함한다. 줄기 영역은 바이러스 외피(envelope)와 세포의 엔도솜 막(endosomal membrane) 사이의 막 융합에 필수적이어서 융합 활성에 관여하는 융합 단백질을 포함한다(Wiley 외, Ann. Rev. Biochem., 56:365-394 (1987)).
인플루엔자 감염의 이해에 중요하게 기여한 것은 기도에서 특정 시알릴화 글리칸(sialylated glycan) 수용체에 결합하여 바이러스가 세포에 들어가는 것을 가능하게 하는 바이러스 피막 당단백질인 헤마글루티딘(HA)에 대한 연구이다(Kuiken T 외, (2006) Science 312:394-397; Maines TR 외, (2009) Science 325:484-487; Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Rev Biochem 69:531-569; van Riel D 외, (2006) Science 312:399-399). 종의 장벽을 가로지르고 인간 개체군을 감염시키기 위하여, 조류의 HA는 그의 수용체-결합 선호를 α2,3(조류)-결합을 함유하는 말단 시알릴화 글리칸에서 α2,6(인간)-결합 시알산 모티프로 변화시켜야 하고(Connor RJ 외, (1994) Virology 205:17-23), 이러한 변화는 1918년 유행병의 경우와 같이 두 개의 변이를 통해 발생할 수 있다(Tumpey TM 외, (2007) Science 315:655-659). 따라서, 글리칸 수용체에의 인플루엔자 결합에 영향을 미치는 인자를 이해하는 것은 유행할 가능성이 있는 어떤 미래의 크로스오버(crossover) 인플루엔자 균주를 제어하기 위한 방법을 개발하기 위해 중요하다.
H5N1 인플루엔자의 분기 균주(divergent strain)에 대한 강력한 중화 항체를 유도할 수 있는 후보 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 수요를 해결하기 위하여, 컨센서스 H5N1 헤마글루티닌(HA) 서열에 기반한 백신은 다양한 H5N1 집단 유래의 HA로서 모조타이핑된(pseudotyped) 비리온(virion)의 패널을 중화하는 항체를 유도했다(Chen MW 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:13538-13543).
HA는 구형 머리 및 줄기 영역으로 이루어진 세포외부 도메인(ectodomain)을 갖는 동종삼합체(homotrimeric) 막관통 단백질이다(Kuiken T 외, (2006) Science 312:39-397). 두 영역은 HA의 기능성에 영향을 미치는(Chen ZY 외, (2008) Vaccine 26:361-371; Ohuchi R 외, (1997) J Virol 71:3719-3725) N-결합 올리고당을 갖는다(Keil W 외, (1985) EMBO J 4:2711-2720). 인플루엔자 A 바이러스의 여러 가지 아형들 중에서, 머리 영역의 글리코실화 부위에 대규모의 변이가 있는 반면에, 줄기 올리고당은 보다 보존적이고 융합 활성에 요구된다(Ohuchi R 외, (1997) J Virol 71:3719-3725). 항원 펩티드 에피토프에 인접한 글리칸은 항체 인식을 방해하고(Skehel JJ 외, (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1779-1783), HA의 단백질분해 활성 부위 근처의 글리칸은 분열을 조절하고 인플루엔자 바이러스의 감염성에 영향을 미친다(Deshpande KL 외, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:36-40). HA 글리코실화 부위의 변이성 결실은 바이러스의 수용체 결합에 영향을 미칠 수 있다(Gunther I 외, (1993) Virus Res 27:147-160).
글리코실화 부위 또는 그 근처의 펩티드 서열의 변화는 HA의 3D 구조를 변화시킬 수 있고, 따라서 수용체 결합 특이성 및 친화성을 변화시킬 수 있다. 실제로, 여러 가지 H5N1 아형들로부터의 HA들은 상이한 글리칸-결합 패턴을 갖는다(Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). H1 및 H3 상의 글리코실화 부위의 돌연변이 유발이 전체 바이러스 시스템에서 연구되어 왔다(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Deom CM 외, (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3771-3775). 그러나, 글리코실화의 변화가 특히 대부분의 병원성 H5N1 HA에 있어서 수용체-결합 특이성 및 친화성에 어떻게 영향을 미치는 지는 알려지지 않고 있다.
플루(flu) 백신은 제조될때 해마다 변화되어야 하는데, 이는 헤마글루티닌의 보다 약하게 고도로 글리코실화된 영역 또는 비글리코실화 영역이 계속 돌연변이하여 숙주 면역계로부터 이탈하기 때문이다.
이종 병원균들에 대한 백신 디자인의 목적은 효과적이고 광범위한 보호 항원을 확인 및 디자인하는 것이다. 인플루엔자의 경우, 상당한 역사적인 노력이 별 성공이 없이 보존 선형 서열 및 영역들의 실험적 테스트로만 이어져 왔다. 이러한 실패에 대한 합당한 이유는 항원 실험 재료에 대한 집중된 반응이 실제 감염의 조절에서 병원균에 대한 항원의 중화를 위한 실제의 진실한 생성 부위라는 지식의 부족 때문이다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2009년 3월 27일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/164,385호(명칭: 인플루엔자에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물), 2009년 3월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/164,387호(명칭: 인간 면역결핍 바이러스에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물), 2009년 3월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/164,388(명칭: 플라비바이러스에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물), 2009년 3월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/164,389(명칭: 바이러스 감염에 대한 백신을 제조하기 위한 방법), 2010년 3월 12 일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/313,676호(명칭: 인플루엔자에 대한 면역을 위한 방법 및 조성물)의 우선권을 주장하며, 상기 미국 가특허출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
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구체적으로, 현재 및 미래의 제조된 백신에서 교차 중화 에피토프의 품질 및 항원성을 유지 또는 강화하는 백신 제조 공정의 디자인 및 확인에 사용될 수 있는 교차 중화 단클론 항체가 필요하다. 백신에 결합하는 항체가 구조적 완전성 및 항원능(antigenic potential)을 반영한다고 가정할 때, 이러한 백신 공정 유도체에의 탈글리코실화 HA 폴리펩티드와 같은 교차 중화 항체의 결합을 평가하여 그의 교차 중화능을 정량적으로 평가할 수 있다. 이러한 보편적인 에피토프에 대한 반응을 최대화하기 위하여, 상기의 보편적인 에피토프에 대한 면역원성을 증가시키기 위한 유도체를 만들 수 있다.
본 발명에 따라, 상기의 원리를 이용하는 백신이 개시된다. 항원은 바이러스의 당단백질로부터 당을 부분적으로 제거하여 글리코실화 부위(고도로 보존되고 돌연변이 하지 않거나 격렬하게 돌연변이 하지 않는)를 노출시키는 동시에 충분한 당을 유지하여 상기 당단백질의 3차 구조를 보존함으로써 제조된다. 상기 부분적으로 글리코실화된 바이러스 당단백질은 당단백질을 부분적으로 탈글리코실화하여 특정 글리코실화 부위가 하나, 둘 또는 세 개의 당 단위체를 유지하도록 함으로써 제조된다. 일부 측면들에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 당단백질은 하나 이상의 특정 글리코실화 부위가 비글리코실화된 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하고 그 글리코실화 부위에 단당체, 이당체 또는 삼당체를 결합함으로써 제조될 수 있다.
개시된 백신은 적어도 하나의 부분적으로 글리코실화된 HA, NA 또는 M2 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA 당단백질은 부분적으로 글리코실화된 인플루엔자 바이러스 HI, H3 및 H5로 구성되는 군에서 선택된다. 일부 실시예들에서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA 당단백질은 H5 HA의 위치 39, 127, 170, 181, 302, 495 및 500 중 하나 이상의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된다. 일부 실시예들에서, 상기 아스파라긴 잔기는 위치 177에 있다.
개시된 방법은 적어도 하나의 탈글리코실화된 HA 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신을 인플루엔자에 감염되기 쉬운 개체(subject)에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 탈글리코실화된 HA 당단백질은 HI, H3 및 H5로 구성되는 군에서 선택된다.
일부 실시예들에서, 탈글리코실화는 당단백질 상의 하나 이상의 글리코실화 부위에서 모노글리코실화(1개의 당이 남음)를 남긴다. 일부 실시예들에서, 상기 탈글리코실화는 당단백질 상의 하나 이상의 글리코실화 부위에서 디글리코실화(diglycosylation, 2개의 당이 남음)를 남긴다. 일부 실시예들에서, 탈글리코실화는 당단백질 상의 하나 이상의 글리코실화 부위에서 트리글리코실화(3개의 당이 남음)를 남긴다. 일부 실시예들에서, 탈글리코실화는 당단백질 상의 하나 이상의 글리코실화 부위에서 모노글리코실화, 디글리코실화 및 트리글리코실화 중 적어도 하나를 남긴다.
본 발명은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기타 유래의 병원균에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 면역원성 조성물에 관한 것으로, 그 조성물은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기타 유래의 병원균 유래의 항원 당단백질을 포함하고, 상기 당단백질은 부분적으로 글리코실화된다.
일부 측면들에 있어서, 상기 병원균은 바이러스이고, 상기 부분적으로 글리코실화된 항원은 바이러스, 바이러스 유사 입자, 바이러스 펩티드, 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 바이러스 유래의 단편, 또는 바이러스 단백질 서열을 부분적으로 포함하는 융합 단백질이다.
바이러스는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 클라미디아(chlamydia), 아데노바이러스(adenovirdiae), 마스타데노바이러스(mastadenovirus), 아비아데노바이러스(aviadenovirus), 단순 포진 바이러스(herpesviridae), 단순 포진 바이러스 1(herpes simplex virus 1), 단순 포진 바이러스 2, 단순 포진 바이러스 5, 단순 포진 바이러스 6, 레비바이러스(leviviridae), 레비바이러스(levivirus), 엔테로박테리아 페이즈(enterobacteria phase) MS2, 알로레바이러스(allolevirus), 폭스바이러스(poxviridae), 코르도폭스바이러스(chordopoxvirinae), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(leporiipoxvirus), 쉬폭스바이러스(suipoxvirus), 몰러스시폭스바이러스(molluscipoxvirus), 엔토모폭스바이러스(entomopoxvirinae), 파포바바이러스(papovaviridae), 폴리오마바이러스(polyomavirus), 파필로바이러스(papillomavirus), 파라믹소바이러스(paramyxoviridae), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 파라인플루엔자 바이러스 1, 모빌리바이러스(mobillivirus), 홍역 바이러스(measles virus), 루불라바이러스(rubulavirus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 뉴모노바이러스(pneumonovirinae), 뉴모바이러스(pneumovirus), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 조류 뉴모바이러스(avian pneumovirus), 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus), 피코나바이러스(picornaviridae), 엔테로바이러스(enterovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 헵타노바이러스(hepatovirus), 인간 A형 간염 바이러스(human hepatitis A virus), 카디오바이러스(cardiovirus), 안답토바이러스(andapthovirus), 레오바이러스(reoviridae), 오르토레오바이러스(orthoreovirus), 오르비바이러스(orbivirus), 로타바이러스(rotavirus), 시포바이러스(cypovirus), 피지바이러스(fijivirus), 피토레오바이러스(phytoreovirus), 오리자바이러스(oryzavirus), 레트로바이러스(retroviridae), 포유동물 B형 레트로바이러스(mammalian type B retroviruses), 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스 그룹, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, HTLV-I 및 -II 바이러스, SARS 코로나바이러스(coronavirus), 단순 포진 바이러스, 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus), 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 간염 바이러스(HCV, HAV, HBV, HDV, HEV), 톡소플라스마 곤디 바이러스(toxoplasma gondii virus), 매독 바이러스(treponema pallidium virus), 인간 T-림프구 영양 바이러스(human T-lymphotrophic virus), 뇌염 바이러스(encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 수두 대상포진 바이러스(Varicella Zoster Virus), 루베올라(rubeola), 멈프스(mumps), 루벨라(rubella), 스푸마바이러스(spumavirus), 플라비바이러스(flaviviridae), C형 간염 바이러스, 헤파드나바이러스(hepadnaviridae), B형 간염 바이러스, 토가바이러스(togaviridae), 알파바이러스(alphavirus), 신드비스 바이러스(sindbis virus), 루비바이러스(rubivirus), 루벨라 바이러스(rubella virus), 라브도바이러스(rhabdoviridae), 베시큘로바이러스(vesiculovirus), 리사바이러스(lyssavirus), 에페메로바이러스(ephemerovirus), 시토라브도바이러스(cytorhabdovirus), 뉴클레오라브도바이러스(necleorhabdovirus), 아레나바이러스(arenaviridae, arenavirus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 이피 바이러스(Ippy virus), 라사 바이러스(lassa virus), 코로나바이러스(coronaviridae, coronavirus) 및 토로바이러스로부터 선택된다.
상기 바이러스 펩티드, 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)-바이러스 단백질, RSV F 당단백질, RSV G 당단백질, 단순 포진 바이러스(HSV) 바이러스 단백질, 단순포진 바이러스 당단백질 gB, gC, gD 및 gE, 클라미디아 MOMP 및 PorB 항원, 코어 단백질, 댕기 바이러스의 기질 단백질 및 기타 단백질, 홍역 바이러스 헤마글루티닌, 단순 포진 바이러스 2형 당단백질 gB, 폴리오바이러스 1 VP1, HIV 1의 외피 당단백질, B형 간염 표면 단백질, 디프테리아 독소, 스트렙토코커스 24M 에피토프, 고노코칼 필린(gonococcal pilin), 슈도라비에스 바이러스(pseudorabies virus) g50 (gpD), 슈도라비에스 바이러스 II (gpB), 슈도라비에스 바이러스 III (gpC), 슈도라비에스 바이러스 당단백질 H, 슈도라비에스 바이러스 당단백질 E, 전염성 위장염 당단백질 195, 전염성 위장염 기질 단백질, 돼지 로타바이러스 당단백질 38, 돼지 파보바이러스 캡시드 단백질, Serpulinahydodysenteriae 보호 항원, 소 바이러스 설사 당단백질 55, 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌-뉴로미니다제, 돼지 플루 헤마글루티닌, 돼지 플루 뉴로미니다제, 구제역 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 돼지 인플루엔자 아비러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 미코플라스미 리오뉴티오니에(Mycoplasma liyopneutiioniae), 전염성 비기관염 바이러스, 전염성 비기관염 바이러스 당단백질 E, 당단백질 G, 전염성 후두기관염 바이러스, 전염성 후두기관연 바이러스 당단백질 G 또는 당단백질 I, 라크로스 바이러스의 당단백질, 신생 송아지 설사 바이러스, 베네주엘라 말 열 뇌척수염 바이러스, 펀터 토로 바이러스(punta toro virus), 쥐 백혈병 바이러스, 쥐 유방 종양 바이러스, B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 B형 간염 바이러스 표면 항원 또는 이의 단편 또는 유도체, 말 인플루엔자 바이러스 또는 말 허피스 바이러스의 항원(말 인플루엔자 바이러스 타입 A/Alaska 91 뉴라미니다제, 말 인플루엔자 버이러스 타입 A/Miami 63 뉴라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 타입 A/Kentucky 81 뉴라미니다제, 말 헤르페스 바이러스 타입 1 당단백질 B, 및 말 허피스 바이러스 타입 1 당단백질 D 포함), 소의 호흡기 세포융합 바이러스 또는 소의 파라인플루엔자 바이러스의 항원, 소의 호흡기 세포융합 바이러스 부착 단백질(BRSV G), 소의 호흡기 세포융합 바이러스 융합 단백질(BRSV F), 소의 호흡기 세포융합 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(BRSVN), 소의 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 융합 단백질, 소의 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 헤마글루티닌 뉴라미니다제, 소의 바이러스성 설사 바이러스 당단백질 48 및 당단백질 53, 뎅기 단바이러스의 당단백질 E, 및 인간 C형 간염 바이러스의 당단백질 E1E2로부터 선택된다.
일부 측면들에 있어서, 탈글리코실화 바이러스 항원은 모노-, 디- 또는 트리-클리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 탈글리코실화 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 HI, H3 및 H5로 이루어진 군에서 선택되는 모노-글리코실화 헤마글루티닌이다. 일부 실시예들에 있어서, 모노글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌은 아스파라긴-Xaa-세린 및 아스파리긴-Xaa-트레오닌(여기서 Xaa 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 N-글리코실화 부위를 포함한다. 일부 측면들에 있어서, 글리코실화 부위에서 단일 GlcNAc 당을 포함하는 모노글리코실화 헤마글루티닌은 느슨한(relaxed) 특이성을 나타내지만 HA-수용체 결합에 대하여 강화된 친화성을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 탈글리코실화 바이러스 항원은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및/또는 만노스로 디- 또는 트리-글리코실화된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌이다. 일부 측면들에 있어서, 상기 탈글리코실화 바이러스 항원은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)으로 글리코실화된 모노-글리코실화 바이러스 항원이다.
일부 측면들에 있어서, 모노-글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌은 컨센서스 H5 HA 서열(서열 번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 모노-글리코실화 컨센서스 H5 HA 서열(서열번호 4)은 위치 39, 170, 181, 302 및 495중 하나 이상의 위치의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된다. 다른 측면들에 있어서, 상기 모노-글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌은 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 서열(서열 번호 6), 컨센서스 H1-A(서열번호 8) 및 컨센서스 H1-C(서열번호 10) 서열로 이루어진 군에서 선택되는 H1 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, HA 서열은 적절한 진핵세포에서 발현이 가능하도록 변형된다.
일 실시예에 있어서, 상기 모노-글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌은 계절성 H1(Brisbane) 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화의 상태로 탈글리코실화된 바이러스 당단백질을 포함하는 면역원성 폴리펩티드 및 선택적으로 면역증강제(adjuvant)를 포함하는 백신에 관한 것으로, 상기 백신은 호흡기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 상기 바이러스 당단백질은 헤마글루티닌(HA)이다.
일부 측면들에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스 및 계절성 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 H5N1이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다.
일 측면에 있어서, 상기 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)이고, 부분적으로 글리코실화된 바이러스 항원은 SH(small hydrophobic) 당단백질의 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화 RSV F(fusion, 융합), G(attachment, 부착), 또는 이의 면역원성 단편이다. 일부 실시예들에 있어서, 모노-글리코실화 RSV G 단백질 서열(서열 번호 12)은 표 6에서 나타낸 하나 이상의 가능한 N-글리코실화 부위의 아스파라긴 잔기들에서 부분적으로 글리코실화된다.
일 측면에 있어서, 상기 바이러스는 플라비바이러스이고, 부분적으로 글리코실화된 바이러스 항원은 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화된 댕기 바이러스 외피 당단백질 M, 당단백질 E, 또는 이의 면역원성 단편이다. 일부 실시예들에 있어서, 모노-글리코실화 댕기 바이러스 외피 당단백질 E(서열 번호 13)는 표 7에서 나타낸 하나 이상의 N-글리코실화 부위인 N67 및 N153의 아스파라긴 잔기에서 부분적으로 글리코실화된다.
일 측면에 있어서, 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스이고, 부분적으로 글리코실화된 바이러스 항원은 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화 C형 간염 외피 당단백질 E1, 당단백질 E2, 또는 이의 면역원성 단편이다. 일부 실시예들에 있어서, 모노-글리코실화 C형 간염 외피 당단백질 E1(서열번호 14)은 표 8에서 나타낸 N-글리코실화 부위인 N196, N209, N234, N305 및 N325중 하나 이상의 부위의 아스파라긴 잔기에서 부분적으로 글리코실화된다.
일 측면에 있어서, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이고, 부분적으로 글리코실화된 바이러스 항원은 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화 HIV 외피 당단백질 gp120, 막관통(transmembrane) 당단백질 gp41, 또는 이들의 단편이다. 일 부 실시예들에 있어서, 모노-글리코실화 HIV 외피 당단백질 gp120(서열번호 15)은 표 9에서 나타낸 하나 이상의 가능한 N-글리코실화 부위의 아스파라긴 잔기에서 부분적으로 글리코실화된다.
또한, 본 발명은 모노-글리코실화의 상태로 탈글리코실화된 인플루엔자 HA 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이고, 상기 모노-글리코실화 HA 폴리펩티드의 개체에의 도입시, 상기 폴리펩티드는 상기 개체로 하여금 인플루엔자 바이러스에 결합하는 항체를 생성하도록 한다.
일부 측면들에 있어서, 상기 개체에의 모노-글리코실화 HA 폴리펩티드의 도입에 의해 상기 개체는 계절 및 조류 인플루엔자 모두를 중화하는 항체를 생성한다.
일 실시예에 따르면, 모노-글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌은 계절 H1(Brisbane) HA 폴리펩티드를 포함하고, 상기 모노-글리코실화 HA 폴리펩티드를 개체에 도입하면, H1(Brisbane) HA 폴리펩티드는 상기 개체로 하여금 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 인플루엔자 바이러스를 중화하는 항체를 생성하도록 한다.
다른 실시예에 따르면, 모노-글리코실화 인플루엔자 헤마글루티닌은 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 폴리펩티드를 포함하고, 상기 개체에의 상기 모노-글리코실화 HA 폴리펩티드의 도입시, NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 폴리펩티드는 상기 개체로 하여금 계절 H1(Brisbane) HA 인플루엔자 바이러스를 중화하는 항체를 생성하도록 한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 백신은 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 불완전 프로인트 아주반트(incomplete Freund's adjuvant, IFA), 스쿠알렌, 스쿠알란, 명반 및 MF59로부터 선택될 수 있는 면역증강제(aduvant)를 더 포함한다.
본 발명은 바이러스성 호흡기 감염에 대하여 포유동물을 면역시키는 방법으로서, 모노-, 디- 또는 트리-글리코실화의 상태로 탈글리코실화된 바이러스 당단백질을 포함하는 면역원성 당단백질을 포함하는 백신을 호흡기 바이러스 감염에 걸리기 쉬운 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 백신은 상기 호흡기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 바이러스 당단백질은 헤마글루티닌(HA)이다. 상기 백신은 비경구 투여, 흡입, 비내 및 일부의 경우 예방적으로 투여될 수 있다.
일부 측면들에 있어서, 상기 백신은 탈글리코실화된 바이러스 당단백질이 선택되는 인플루엔자 바이러스 균주와 상이한 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 탈글리코실화 바이러스 당단백질은 모노-탈글리코실화 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)이다.
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 효과적인 백신을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 상기 백신은 본원에서 기재한 분자의 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 백신은 바이러스 항원에 대하여 효과적이고, 본원에서 기재한 분자의 중화 에피토프를 기능적으로 의태(mimicking)하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스, 또는 HIV-1 또는 HIV-2 바이러스, 또는 댕기 바이러스 또는 C형 간염 바이러스와 같은 플라비바이러스로부터 유래한 것이다.
다른 실시예에 있어서, 상기 백신은 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 효과적이며 본원에서 기재한 분자의 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 분자는 항체이다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 항체는 HA 항원을 결합한다. 또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 HA 항원은 H5 아형이다. 또 다른 일 실시예에 있어서, HA 항원은 H1 아형이다. 또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 A 바이러스의 표면에서 발현된다. 또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 중화 항체를 유발하는 항원 결정기를 포함한다.
상술한 본 발명의 측면들 및 다른 측면들은 하기의 도면과 함께 설명하는 바람직한 구체예의 하기의 설명으로부터 명백하게 이해 되지만, 그 변형 및 수정이 본 출원에 개시된 신규한 개념의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 수행될 수 있다.
본 발명에 의해 모노글리코실화 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)을 이용하여 제조되고 인플루엔자 바이러스에 대하여 강력한 활성을 나타내는 백신이 제공될 수 있다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 개시의 특정 측면들을 설명하기 위한 것이다. 본 출원에 개시된 발명은 본원에서 제시한 특정 실시예의 상세한 설명과 함께 이러한 도면들 중 하나 이상을 참조로 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 상이한 글리코실화들을 갖는 HA들의 개략도 및 원형 색성 스펙트럼을 나타낸다. (도 1a) 상이한 글리코실화들을 갖는 HA 단백질들의 네 개의 변이체: HAfg, HA (대표적인 복합 타입 N-글리칸을 갖는 HEK293E 세포에서 발현된 컨센서스 서열(Chen MW 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:13538-13543); HAds, HAfg로부터 시알산(sialic acid)의 제거를 초래하는 NA-처리된 HA; HAhm, 고-만노스-타입 N-글리칸을 갖는 GnTI- HEK293S 세포에서 발현된 HA; 및 HAmg, 그 N-글리코실화 부위에서만 GlcNAc을 갖는 Endo H-처리된 HA. (도 1b) 이들의 N-글리코실화 부위에 부착된 상이한 N-글리칸들을 갖는 HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg의 구조도. 단백질 구조는 회색의 Protein Data Bank ID 코드 2FK0 (Viet04 HA)를 이용하여 얻어지고, N-결합 글리칸은 녹색으로 나타난다. 모든 N-글리칸은 GlyProt (Bohne-Lang A 외, (2005) Nucleic Acids Res 33:W214-W219)에 의해 모델링되고, 그 그래프는 PyMOL (www.pymol.org)를 이용하여 얻어진다. (도 1c) HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg의 원형 색성 스펙트럼은 상이한 글리코실화들을 갖는 네 개의 HA 단백질의 2차 구조가 유사하다는 것을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2b는 상이한 글리코실화들을 갖는 HA의 글리칸 마이크로어레이 분석을 도시한다. (도 2a) HA 변이체인 HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg의 글리칸 마이크로어레이 프로파일링이 도시되어 있다. 글리칸들의 관련 연결이 색으로 그룹지어 지는데, 주로 17 α2,3 시알로시드(황색) 또는 7 α2,6 시알로시드(청색)으로 그룹지어진다. 상기 어레이상의 글리칸의 구조는 도 2b에서 나타낸다. HA 변이체인 HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg 의 회합 상수가 α2,3 시알로시드 1-15에 따른 HA 변이체의 KA , surf의 값으로 도시되어 있다.
도 3은 2000년 이후의 최근의 HA인 H1, H3 및 H5의 브리즈번 H1, 캘리포니아 H1, H3 및 H5의 서열 정렬 분석을 도시한다. 계절 플루 HA는 A/브리즈번/59/2007유래이다. 유행성 플루 HA는 A/캘리포니아/07/2009 유래이다. H5는 A/베트남/1203/2004 유래이다. H3는 A/브리즈번/10/2007 유래이다. H5 HA상의 N-글리코실화 부위가 적색 박스로 도시되어 있다. 비교 결과, 이들의 N-글리코실화 위치에서 H1 및 H5 HA들 사이의 유사성이 입증되지만, H3은 덜 보존된 글리코실화 위치이고 H1 및 H5와 다르다.
도 4a 내지 4f는 상이한 글리코실화들을 갖는 HA들에 따른 HA 글리칸 상호작용의 당 또는 변형에 의한 결합 에너지를 도시한다. 이러한 값들은 나타낸 기준 글리칸(적색 박스로 강조하여 표시됨; 표 S3 참조)의 △G 값을 감해서 얻었다. (도 4a) 글리칸 2, 3, 6 및 8-10은 이당 글리칸 1과 동일한 백본을 갖지만, 제3 당에서 비환원 말단과 차이가 있다. △△G의 값은 제3 당의 변화에 따른 결합 에너지 차이를 설명하기 위하여 계산된다. (도 4b) 글리칸 10-12 및 15는 이당 글리칸 8과 동일한 백본을 갖지만, 당 구조를 선형으로 신장시키거나 측쇄 당을 추가한 것에 차이가 있다. (도 4c) 글리칸 4 및 5는 삼당 글리칸 3과 동일한 백본을 갖지만, 측쇄 푸코오스(fucose) 또는 비환원 말단으로부터의 제3 위치상의 설페이트 기에 차이가 있다. (도 4d) 글리칸 6 및 7은 글리칸 7의 비환원 말단으로부터 제3 위치상의 살페이트 기에 차이가 있다. (도 4e) 글리칸 13 및 14는 α2,3 이중촉각(biantennary) 시알로시드이지만, 내부 당의 변화에 차이가 있다. (도 4f) 글리칸 16 및 17 및 α2,6 시알로시드(21-27 번)는 HA에의 결합을 거의 나타내지 않는다.
도 5a 내지 도 5d는 백신으로서 HAfg와 HAmg의 비교를 도시한다. (도 5a) HAfg 및 HAmg 및 여러 가지 HA들 유래의 항혈청들 사이의 결합이 ELISA를 이용하여 분석된다. HAfg 항혈청과 비교하여, HAmg 항혈청은 H5(베트남 1194/2004 및 CHA5)에 더욱 좋은 결합을 보인다. 개다가, HAmg 항혈청은 H1(캘리포니아 07/2009 및 WSN)에도 결합한다. (도 5b) HAfg 및 HAmg 항혈청에 의한 H5N1 (NIBRG-14) 바이러스의 미세중화(microneutralization). HAfg 항혈청과 비교하여, HAmg 항혈청은 MDCK 세포에의 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 더욱 좋은 중화 활성을 보인다(P < 0.0001). (도 5c) H5N1 바이러스의 치명적 투여량 주입에 대한 백신 보호. BALB/c 마우스를 HA 단백질 백신 HAfg, HAmg 및 대조 PBS로 2회 주사하여 면역시켰다. 면역시킨 마우스에게 치명적 투여량의 H5N1 (NIBRG-14) 바이러스를 비내주입했다. 주입 후, 14일간 생존을 기록했다. (도 5d) ELISA에 의한 상이한 HA들을 이용한 HAmg에 대한 토끼 항혈청의 결합. HAmg에 대한 토끼 항혈청은 H5(CHA5 및 베트남/1194)에 강한 결합을 나타냈다. 게다가, H5(하노이 및 ID5/2005) 및 H1(뉴 캘리포니아/1999)와의 상호작용도 관찰된다.
도 6a 내지 도 6c는 H5 HA 단백질의 구조, 정제, 및 겔-여과 크로마토그래피 분석을 도시한다. (도 6a) 절단 부위가 변경된 HA의 세포외 도메인(ectodomain)을 암호화하는 DNA를 포유동물 발현 벡터인 pTT(Durocher Y 외, (2002) Nucleic Acids Res 30:E9)에 클로닝하여, HEK293 세포 배양액으로부터 HA 단백질의 효율적인 분비를 가능하게 하였다. HA의 본래의 프로테아제 절단 부위를 PQRERG로 돌연변이시켜서 HA1 및 HA2로의 HA0의 처리를 회피했다. HA 단백질의 삽합체 구조를 안정화하기 위하여, 박테리오파지 삼합체화 절편인 "폴돈"(foldon)을 플라스미드 작제물로 조작하고, His-tag를 정제 목적을 위해 COOH 말단에 첨가했다. HA 단백질의 발현을 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켜서 수행했다. (도 6b) 정제된 HA 단백질을 SDS/PAGE.Mindicates 마커로 분석했다. 레인(Lane) 1: HAfg, 293E 세포로부터 정제된 HA; 레인 2: HAds, NA로 절단한 HAfg; 레인 3: HAhm, 293S 세포(Reeves PJ 외, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13419-13424)로부터 정제한 HA; 레인 4: HAmg, Endo H로 절단한 HAhm. (도 6c) HA-정제된 단백질을 겔-여과 크로마토그래피로 분석했다. 용리 피크는 HAfg 삼합체 >200 kDa(적색 선), HAds 삼합체 >200 kDa(흑색 선), HAhm 삼합체 > 200kDa(청색 선), 및 겔 여과 후 HAmg 삼합체 > 180 kDa(녹색 선)을 나타냈다. 이 도면은 단백질 마커가 놓여진 HA 단백질의 포개진 용리 프로파일을 나타낸다(파선).
도 7a 내지 도 7c는 여러 가지 HA 단백질 유래의 과메틸화된 N-글리칸의 질량 분광분석 스펙트럼을 도시한다. 여러 가지 HA 단백질 유래의 과메틸화된 N-글리칸의 MS 분석. (도 7a) MALDI-MS 프로파일은 HEK293E로부터 발현된 HA의 N-글리칸이 표 S1에서 검출 및 나열한 주요 피크에 대하여 주석한 바와 같이, 주로 코어 푸코실화한 이중 촉각모양, 삼중촉각 모양 및 사중촉각모양 복합 형태 N-글리칸 구조를 포함한다. 할당(assignment)은 조성에 기초하는데, 제한된 몇 개만이 MS/MS에 의해 추가로 확인된다. 다양한 정도의 시알릴화가 주요 특징이다. (도 7b) NA 처리의 경우, 시알릴화 N-글리칸으로 할당된 모든 신호(예를 들어, m/z 2605, 3054, 3503, 3864, 4226)는 더 이상 검출되지 않으면서, 비시알릴화 삼중촉각 및 사중촉각 구조에 대한 신호 강도(m/z 2693, 3142)는 증가하였는데, 이는 시알산의 완전한 제거와 완전히 일치한다. GnTI-결핍 HEK293S 균주에서 발현된 HA 유래의 N-글리칸의 MALDI-MS 프로필은 주로 m/z 1579에서 Man5GlcNAc2에 해당하는 신호를 나타내면서, 글리코실화 경로에서 불완전하게 트리밍된 고-만노스-타입 N-글리칸(m/z 1783 내지 2396; Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2)의 마이너 피크를 나타냈다.
도 8a 내지 도 8d는 HA 변이체의 MALDI-TOF 분석을 도시한다. 도 8a의 HAfg의 분자량은 75 186.343이고, 도 8b의 HAds의 분자량은 75290.023이고, 도 8c의 HAhm 의 분자량은 693 14.645이고, 도 8d의 HAmg의 분자량은 63314.761이다.
도 9는 HA 삼합체 유래의 과메틸화 N- 글리칸의 MALDI 스펙트럼에서 관찰된 주요 분자 이온들의 할당을 도시한다. ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
도 10은 α2,3-시알로시드 1-15에 따른 HA 글리코실화 변이체의 △△G를 도시한다. 값은 △△G (kcal/mol)을 나타낸다. 가장 좌측 칼럼의 기재사항은 이전의 HA로부터 나중의 HA의 -G 값을 감해서 얻었다(예를 들어, △△G(HAfg → HAds) = △△G(HAds) - △(HAfg)). ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
도 11은 HA 변이체에 따른 여러 시알로시드 리간드들 사이의 결합 자유 에너지 변화의 차이를 도시한다. 값은 △△G (kcal/mol)을 나타낸다. 가장 좌측 칼럼의 기재사항은 이전의 HA로부터 나중의 HA의 △G 값을 감해서 얻었다(예를 들어, △△G (1→2) = △G(2)-△G(1). ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
도 12는 HEK293 세포로의 베트남 1203 HA 유사타입 바이러스의 형질도입을 억제하기 위한, 완전 글리코실화, 고-만노스 및 모노글리코실화 H5 HA로부터 생성된 항혈청의 능력을 도시한다. 고-만노스 및 모노-글리코실화 HA 항혈청은 바이러스 도입을 억제하지만, 완전 글리코실화 HA 항혈청은 그렇지 않다.
도 13a 내지 도 13b는 토끼의 HAfg 및 HAmg 항혈청을 이용한 헤마글루티닌화 분석의 결과를 도시한다. 도 13a는 H1, H3 및 H5에 대한 헤마글루틴화 분석에서 완전 글리코실화 컨센서스 H5 HA 항혈청을 이용하여 얻은 결과를 도시한다. 도 13b는 모노글리코실화 H5 HA를 이용하여 얻은 결과를 도시한다. 모노글리코실화 H5 HA 항혈청은 H5에 대하여 양호한 헤마글루티닌화 억제 활성을 나타내는 외에도, H1에 대하여도 억제 활성을 나타낸다. H3 헤마글루티닌화는 항혈청에 영향을 받지 않는다.
도 14는 H5 및 H1의 단백질 구조가 H3(2.5의 평균 제곱근 편차(RMSD))보다 서로 더욱 유사함을(0.9의 평균제곱근 편차(RMSD)) 나타낸다.
도 15a 내지 도 15c는 항원으로서 모노-글리코실화 H1(브리스번) HA를 이용하여 생성한 항혈청에 의한 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주)의 억제를 도시한다. 도 15a는 적혈구를 응집시키기 위한 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 15b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 15c는 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 BALB/c 마우스의 보호를 도시한다. 사용된 상기의 항혈청들은 브리스번 HA 단백질(5㎍)으로 면역시켰고, 주입에 사용된 바이러스는 NIBRG-121 (100x LD50)이었다.
도 16a 내지 도 16c는 항원으로서 모노글리코실화 H1(브리스번) HA를 이용하여 얻은 항혈청에 의한 WSN(H1N1)1933의 억제를 도시한다. 도 16a는 적혈구를 응집시키기 위한 WSN(H1N1)1933 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 16b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1)1933 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 16c는 WSN(H1N1)1933 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 BALB/c 마우스의 보호를 도시한다. 사용된 항혈청은 브리스번 HA 단백질(5㎍)로 면역시켰고, 사용된 바이러스는 WSN(H1N1)1933 (100x LD50)였다.
도 17a 내지 도 17c는 항원으로서 모노-글리코실화 H1(브리스번) HA를 이용하여 얻은 항혈청에 의한 A/Puerto Rico/8/34(H1N1):PR8의 억제를 도시한다. 도 17a는 적혈구를 응집시키기 위한 PR8 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 17b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 PR8 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 17c는 PR8 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 BALB/c 마우스의 보호를 도시한다. 사용된 항혈청은 브리스번 HA 단백질(5㎍)로 면역시켰고, 주입에 사용된 바이러스는 PR8 (100x LD50)이었다.
도 18a 내지 도 18b는 모노-글리코실화 H1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주; 도면에서 캘리포니아/2009로 도시함)를 항원으로 이용하여 얻은 항혈청에 의한 WSN (H1N1)의 억제를 도시한다. 도 18a는 적혈구를 응집하기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 18b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 능력의 억제를 도시한다.
도 19는 H1 HA 단백질 상의 글리코실화 부위들의 비교를 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 완전 글리코실화 형태(도 20a) 및 모노-글리코실화 형태(도 20b)에서의 댕기 타입 3 바이러스 외피 당단백질 E 이합체를 도시한다. 모델은 GlyProt 서버를 이용하여 4 개의 가능한 복합체-타입 N-글리칸을 갖는 PDB 코드 1UZG로부터 생성되었다.
도 21a 및 도 21b는 완전 글리코실화 형태(도 21a) 및 모노-글리코실화 형태(도 21b)에서의 인간 면역결핍 바이러스 외피 당단백질 gp120 삼합체를 도시한다. 모델은 단합체당 13개의 가능한 복합체-타입 N-글리칸을 갖는 PDB code 2BF1로부터 생성되었다.
하기의 본 개시의 구체예들의 상세한 설명에서는, 유사한 도면부호는 유사한 구성 요소를 나타내고 본 개시가 실시될 수 있는 특정 실예들을 예시의 목적으로 도시하는 첨부도면을 참조한다. 이러한 실시예들은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 설명되며, 다른 실시예들 역시 이용될 수 있으며, 논리적, 구조적, 기능적 및 다른 변화가 본 출원에 개시된 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 알아야 한다. 따라서, 하기의 상세한 설명은 제한적인 의미로 해석되지 않아야 한다.
인플루엔자 바이러스의 헤마글루틴(HA)은 구형 머리 및 줄기 영역으로 구성되는 세포외 도메인을 갖는 동종단합체성 막관통 단백질이다. 두 영역은 N-결합 올리고당을 수반하는데, 이러한 올리고당의 합성은 N 글리코실화의 일반적인 경로를 따라 이루어진다. HA의 기능적 특성은 특정 부위에서의 글리코실화에 영향을 받는다. 항원 펩티드 에피토프 주위의 탄수화물은 항체의 접근을 방해하고, 이러한 효과는 인플루엔자 바이러스의 항원 소변이를 초래할 수 있다. 또한, HA에 대한 예전의 연구 결과, 글리코실화를 갖는 펩티드 서열은 고도로 보존되고, HA 수용체 결합 특이성은 수용체 결합 부위 근처의 복잡한 글리칸 사슬의 부재에 영향을 받는 것으로 확인되었다. 게다가, HA의 단백질 분해 활성화는 절단 부위 근처의 글리칸에 의해 조절되어 인플루엔자 바이러스의 감염성에 영향을 미쳤다. 머리 영역 상의 글리코실화 부위의 구조 및 갯수의 광범위한 변화가 인플루엔자 A 바이러스의 다양한 아형들 중에서 확인된 반면, 줄기의 올리고당은 더욱 보존되고 융합 활성에 필요했다. 이러한 모든 확인된 사실들은 HA 글리코실화 및 이의 활성의 중요성을 나타냈다.
바이러스 전염은 인플루엔자의 바이러스 피막 상에 존재하는 헤마글루티닌(HA) 당단백질과, 숙주 세포 표면 상에 존재하는 시알산(SA) 함유 글리칸 사이의 중요한 상호작용에서 개시된다. 이러한 중요한 상호작용에서 HA 글리코실화의 역할을 규명하기 위하여, 여러 가지 정의된 단백당형(glycoform)을 제조하고, 그의 결합 친화성 및 특이성을 합성 SA 마이크로어레이를 이용하여 연구했다. HA 상의 N-글리칸 구조를 절단한 결과, SA 결합 친화성이 증가하면서, 이종 SA 리간드에 대한 특이성이 감소했다. SA 리간드 내의 각각의 단당 및 설페이트 기의 HA 결합 에너지에의 공헌을 정량적으로 분석했다. 설페이트 기는 완전 글리코실화 HA에 거의 100배(2.04 kcal/mol)의 결합 에너지를 추가하여 모노글리코실화 HA 단백당형에 이중촉각형 글리칸을 추가한다. 각각의 글리코실화 부위에서 단일 N-결합 GlcNAc만을 갖는 HA 단백질에 대하여 발생한 항체는 유도된 완전 글리코실화 HA보다 더욱 좋은 인플루엔자 아형에 대한 결합 친화성 및 중화 활성을 나타냈다. 따라서, 바이러스 표면 당단백질상의 구조적으로 불필요한 글리칸을 제거하는 것은 인플루엔자 및 기타 인간 바이러스에 대한 백신 디자인을 위해 매우 효과적이고 일반적인 접근방법이다.
달리 정의하지 않는 경우, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. Singleton 외, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)은 당업자에게 본 출원서에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.
당업자는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 본원에서 기재한 것들과 유사 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 수 있을 것이다. 실제로, 본 발명은 어떤 식으로든 기재된 방법 및 물질 만으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, 하기의 용어들이 아래에 정의된다.
용어 "인플루엔자 A 아형" 또는 "인플루엔자 A 바이러스 아형"은 상호교환적으로 사용되고, 헤마글루티닌(H) 바이러스 표면 단백질에 의해 특징지어져서 H1, H3 및 H5와 같은 H 번호로 표시되는 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 의미한다. 또한, 상기 아형은 N1 및 N2와 같은 N 번호로 나타낸 뉴라미니다제(N) 바이러스 표면 단백질에 의해 더욱 특징지어질 수 있다. 이와 같이, 아형은 H1N1, H5N1 및 H5N2와 같은 H 및 N 번호를 사용하여 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 용어는 돌연변이로부터 얻어지고 여러 가지 병원성 프로파일을 나타내는 각 아형 내의 모든 균주(사멸 균주 포함)를 포함한다. 또한, 이러한 균주는 과거, 현재 및 미래의 분리물을 비롯한 바이러스 아형의 "분리물"(isolate)로 지칭된다. 따라서, 본 명세서에서, 용어 "균주"(strain) 및 "분리물"은 상호교환적으로 사용된다. 아형은 인플루엔자 A 바이러스에 기반한 항원을 포함한다. 상기 항원들은 헤마글루티닌 바이러스 표면 항원 단백질에 기반할 수 있고 "HA 항원"으로 나타낼 수 있다. 일부 예들에서, 이러한 항원들은 예를 들어 H1 항원 및 H5 항원으로 각각 지칭할 수 있는 H1 아형 및 H5 아형과 같은 특정 아형의 단백질에 기반한다.
본 개시에서 사용되는 용어 "글리코실화된"(glycosylated) 또는 "부분적으로 글리코실화된" 단백질은 완전히 글리코실화된 단백질의 글리칸 구조로부터 제거한 하나 이상의 당을 갖고 그의 천연 형태/폴딩을 계속 유지하는 단백질을 의미한다. "글리코실화된" 단백질은 탈글리코실화 과정이 당단백질 상의 하나 이상의 글리코실화 부위에 모노글리코실화, 디글리코실화 또는 트리글리코실화를 남기는 부분 글리코실화 단백질을 포함한다.
"부분 글리코실화" 단백질은 하나 이상의 당이 각각의 글리코실화 부위에 그대로 유지되고 각각의 부분 글리코실화 부위가 완전 글리코실화 당단백질의 부위와 비교하여 더욱 작은 글리칸 구조를 함유하는(더욱 작은 수의 당 단위체를 함유함) 단백질이고, 상기 부분 글리코실화 단백질은 그의 천연 형태/폴딩을 실질적으로 그대로 유지한다. "부분 글리코실화" 단백질은 완전 글리코실화 당단백질의 적어도 하나의 글리코실화 부위의 글리칸 구조의 부분적 탈글리코실화를 통해서 얻어진다. 또한, "부분 글리코실화" 단백질은 단백질의 탈글리코실화된 부위에 글리코실화를 도입하여 추가된 글리코실화 서열이 완전 글리코실화 당단백질의 그 부위에서의 글리칸 구조보다 작도록 함으로써 얻어진다. 또한, "부분 글리코실화" 단백질은 바이러스 당단백질 서열 또는 이의 단편을 합성하고, 그 서열의 글리코실화 부위에 글리코실화된 아미노산 단위체(예를 들어, GlcNAc-아르기닌 부분)를 도입하여, 추가된 글리칸 구조가 완전 글리코실화 당단백질의 그 부위에서의 글리칸 구조보다 작도록 함으로써 얻어진다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 단일- 또는 이중 가닥 RNA, DNA 또는 혼합 중합체를 나타내도록 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열, 엑스트라-게놈 및 플라스미드 서열, 및 폴리펩티드를 발현하거나 발현하도록 조절된 더욱 작은 조작된 유전자 단편을 포함할 수 있다.
"분리된 핵산"은 다른 게놈 DNA 서열뿐 아니라 천연 서열을 자연적으로 수반하는 리보솜 및 폴리머라제와 같은 단백질 또는 복합체로부터 실질적으로 분리되는 핵산이다. 이러한 용어는 천연적으로 발생하는 환경에서 제거된 핵산 서열을 포함하고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종계에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 핵산은 핵산의 분리된 형태를 포함한다. 물론, 이는 최초로 분리된 핵산을 말하는 것으로서, 분리된 핵산에 인위적으로 첨가된 유전자 또는 서열을 제외하는 것이 아니다.
용어 "폴리펩티드"는 이의 통상적인 의미, 즉, 아미노산의 서열로서 사용된다. 폴리펩티드는 특정 길이의 생성물로 제한되지 않는다. 펩티드, 올리고당, 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함되고, 이러한 용어는 달리 특별히 언급하지 않는 경우 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 또한, 이러한 용어는 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 천연 또는 비천연 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 및 당업계에 알려진 다른 변형을 의미하거나 제외하는 것이 아니다. 폴리펩티드는 전체 단백질 또는 이의 서열일 수 있다. 본 발명에서 중요한 특정 폴리펩티드는 CDR을 포함하고 항원 또는 HIV-감염 세포를 결합할 수 있는 아미노산 서열이다,
"분리된 폴리펩티드"는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수한 것이다. 바람직한 실시예에 있어서, 분리된 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정하였을 때 폴리펩티드의 95중량% 이상까지, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기들을 얻는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시에 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제된다. 분리된 폴리펩티드는 재조합 세포내의 원위치(in situ ) 폴리펩티드를 포함하는데, 그 폴리펩티드의 천연 환경의 적어도 하나의 성분은 존재하지 않기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 분리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계를 통해 제조된다.
"천연 서열"(native sequence) 폴리뉴클레오티드는 천연 유래의 폴리펩티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다. "천연 서열" 폴리펩티드는 천연(예를 들어, 임의의 종) 유래의 폴리펩티드(예를 들어, 항체)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 뉴클레오티드는 및 폴리펩티드는 천연에서 분리될 수 있거나 재조합 또는 합성 방법을 통해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오티드 "변이체"(variant)는 본원에서 구체적으로 개시한 폴리뉴클레오티드와 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 일반적으로 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 변이체는 천연 발생일 수 있거나, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 변형시키고 본원에서 기재한 바와 같은 방법 및/또는 당업계에 알려진 다수의 기법들 중 임의의 기법을 이용하여 암호화된 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드 "변이체"는 본원에서 구체적으로 개시한 폴리펩티드와 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이 일반적으로 상이한 폴리펩티드이다. 이러한 변이체는 천연 발생일 수 있거나, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 변형시키고 본원에서 기재한 바와 같은 방법 및/또는 당업계에 알려진 다수의 기법들 중 임의의 기법을 이용하여 암호화 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조를 변형시키고, 원하는 특징을 갖는 변이체 또는 유도체를 암호화하는 기능적 분자를 얻을 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시켜서 본 발명의 폴리펩티드의 동등물 또는 개선된 변이체 또는 부분을 얻는 것이 바람직한 경우, 당업자라면 암호화 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 일반적으로 변화시킬 수 있을 것이다.
예를 들어, 특정 아미노산이 다른 폴리펩티드(예, 항원) 또는 세포를 결합하기 위한 능력을 인지가능하게 손실하지 않고 단백질 구조내의 다른 아미노산을 대신할 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 것은 단백질의 결합능력 및 특성이므로, 단백질 서열 및 이의 하위 DNA 암호화 서열의 특정 아미노산 서열 치환이 이루어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 동일한 특성을 갖는 단백질이 얻어진다. 따라서, 개시된 조성물의 펩티드 서열 또는 상기 펩티드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열의 여러 가지 변화가 그 서열의 생물학적 유용성 또는 활성을 크게 손상시키지 않고 이루어질 수 있다는 것을 알 수 있다.
이러한 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서의 수치 아미노산 지수의 중요성이 당업계에 일반적으로 이해되고 있다(Kyte 및 Doolittle, 1982). 아미노산의 상대 수치 특성은 최종 단백질의 2차 구조에 기여하여, 그 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 규정한다는 것이 인정된다. 각각의 아미노산에는 이의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 수치 지수가 할당되었다(Kyte 및 Doolittle, 1982). 이러한 값들은 다음과 같다: 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알리닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파리긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 유사한 생물학적 활성을 제공할 수 있고, 즉, 생물학적 기능적으로 대등한 단백질을 얻을 수 있다는 것이 알려져 있다. 이러한 변화를 만드는데 있어서, 수치 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 아미노산 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
또한, 동일한 아미노산의 치환이 친수성에 기반으로 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서 이해되고 있다. 미국특허 제 4,554,101호는 그의 인접 아미노산의 친수성에 따른 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 상기 단백질의 생물학적 특성과 관련이 있다는 것을 진술하고 있다. 미국특허 제 4,554,101호에서 기재한 바와 같이, 하기의 친수성 값이 아미노산 잔기들에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루신(-1.8); 이소루신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 것으로 대체되고 생물학적으로 동등한 단백질, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것이 당업계에 이해되고 있다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 아미노산 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
위에서 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환의 상대 유사성, 예를 들어 그의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 상기 여러 가지 특징을 고려하는 예시적인 치환이 당업자에게 알려져 있고 하기의 것들을 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 발린, 루신 및 이소루신.
폴리펩티드는 단백질의 N-말단에서 신호(리더) 서열을 포함할 수 있는데, 상기 신호 서열은 단백질의 전달을 번역과 동시에 또는 번역후에 지시한다. 또한, 상기 폴리펩티드(예, poly-His)는 이의 합성, 정제 또는 식별의 용이성을 위해 또는고체 지지체에의 폴리펩티드의 결합을 강화하기 위해 링커 또는 기타 서열에 접합될 수 있다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 아스파리긴 잔기의 측쇄에의 탄수화물 분자의 부착을 의미한다. "시퀀"(sequon)은 N-결합 글리칸이라 명명되는 다당체(당)에의 부착 부위로서 작용할 수 있는 단백질에서의 세 개의 연속적인 아미노산의 서열이다. 이는 아스파라긴(Asn)의 측쇄에서 질소 원자를 통해 단백질에 결합된 다당체이다. 시퀀은 Asn-Xaa-Ser 또는 Asn-Xaa-Thr (여기서, Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이다. 따라서, 폴리펩티드내에 새 개의 트리펩티드 서열중 어느 하나가 존재하면 가능한 글리코실화 부위가 얻어진다. O-결합 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다. 시퀀인 Asn-X-Ser/Thr은 당단백질에의 N-결합 올리고당의 부착에 절대적으로 필요하지만(Marshall RD, Biochemical Society Symposia 40, 17-26 1974), 이의 존재가 항상 글리코실화를 초래하는 것은 아니고 당단백질내의 일부의 시퀀은 글리코실화되지 않은 상태로 남을 수 있다(Curling EM 외, Biochemical Journal 272, 333-337 1990).
글리칸 마이크로어레이는 탄수화물-단백질 상호작용을 평가하기 위한 강력한 도구이고 인플루엔자 바이러스 서브타이핑을 위한 새로운 플랫폼을 제공한다(Blixt O 외, (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:17033-17038; Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Liang PH 외, (2007) J Am Chem Soc 129:11177-11184; Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). 이러한 마이크로어레이는 세포 표면상의 글리칸을 의태하여 높은 친화성 및 특이성을 갖는 다가 상호작용을 나타낸다. 이러한 기술을 이용하여, 인플루엔자 바이러스 아형을 구별하기 위한 새로운 플랫폼을 제공하는 여러 가지 천연 및 돌연변이 HA의 수용체 특이성의 특성이 규명되었다.
강력한 방법이지만, 글리칸 어레이 분석을 통해 HA-글리칸 상호작용을 이해하는 것은 다음과 같이 두 가지의 문제 때문에 복잡하였다: 첫째, HA 결합 친화성은 배열된 글리칸들의 공간 배열 및 조성, 및 사용되는 결합 검출 방법에 영향을 받는다(Srinivasan A 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:2800-2805). 둘째, 글리코실화 부위 또는 그에 근접한 펩티드 서열의 변화는 HA의 3D 구조를 변화시켜서, 수용체-결합 특이성 및 친화성을 변화시킬 수 있다. 실제로, 여러 가지 H5N1 아형 유래의 HA들은 서로 다른 글리칸-결합 패턴을 갖는다(Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). H1 및 H3 상의 글리코실화 부위의 돌연변이 유발이 전체 바이러스계에서 연구되어 왔다(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Deom CM 외, (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3771-3775). 그러나, 특히 대부분의 병원성 H5N1 HA의 경우 글리코실화의 변화가 수용체-결합 특이성 및 친화성에 얼마나 영향을 미치는 지는 알려져 있지 않다. 이러한 문제를 처리하기 위하여, 정량적인 글리칸 마이크로어레이 분석 방법이 통상적인 HA 결합 실험의 한계를 극복하기 위하여 개발되었다.
예전의 연구는 곤충 세포 발현 유래의 HA를 사용하였다(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113). 그러나, 곤충 세포의 글리코실화는 포유동물 세포와 다른데, 그 두드러진 차이는 갈락토스 및 시알산에서 종결되는 복잡한 형태의 N-글리칸은 곤충 세포에서는 생성되지 않는다는 것이다.
인간 세포로부터 발현된 HA 글리코실화 변이체
글리코실화의 변화가 인간 세포에서 수용체-결합 특이성 및 친화성에 얼마나 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여, HA 결합 리간드의 광범위한 구조적 유사체를 포함하는 글리칸 마이크로어레이 및 HA의 일부의 규정된 단백당형을 정량 결합 분석을 위한 인플루엔자 H5Nl HA 컨센서스 서열을 이용하여 제조했다(Chen MW 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:13538-13543).
인간 코돈을 이용하여 CHA5의 코돈을 발현에 최적화시켰다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 본래의 바이러스 프로테아제 부위인 PQRERRRKKRG(서열번호 1)를 PQRERG (서열번호 2)로 돌연변이 시켜서, 단백질이 효소 절단되어 HA1 및 HA2를 형성하는 것을 방지했다. 막관통 영역(잔기: 533-555)을 HA 작제물의 C 말단에서 추가의 잔기 LVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG HHHHHH(서열번호 3)로 치환하였는데, 서열번호 3에서 트롬빈 절단 부위는 이탤릭체로 표시되고, 박테리오파지 T4 피브리틴 폴돈 삼합체화 서열은 밑줄로 표시되고, His-tag는 굵게 표시되어 있다(Stevens J 외, (2006) Science 312:404-410).
컨센서스 H5 헤마글루티닌 서열
굵은 글씨로 나타낸 컨센서스 H5 HA의 아미노산 서열: 신호 서열; 및 밑줄: 삼합체화 서열 및 His-tag.
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICI GSHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100
PANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASSGVSSA 150
CPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200
AEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250
PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300
INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERGLFGAIAGF 350
IEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKM 400
NTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLD 450
FHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY 500
PQYSEEARLKREEISGVDIRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW 550
VLLSTFLGHHHHHH
(서열번호 4)
컨센서스 H5 HA의 뉴클레오티드 서열
1 ATGGAGAAGA TCGTGCTGCT GTTCGCCATC GTGAGCCTGG TGAAGAGCGA
51 CCAGATCTGC ATCGGATCCC ACGCCAACAA CAGCACCGAG CAGGTGGACA
101 CCATCATGGA GAAGAACGTG ACCGTGACCC ACGCCCAGGA CATCCTGGAG
151 AAGACCCACA ACGGCAAGCT GTGCGACCTG GACGGCGTGA AGCCTCTGAT
201 CCTGAGAGAC TGCAGCGTGG CCGGCTGGCT GCTGGGCAAC CCTATGTGCG
251 ACGAGTTCAT CAACGTGCCT GAGTGGAGCT ACATCGTGGA GAAGGCCAAC
301 CCTGCCAACG ACCTGTGCTA CCCTGGCGAC TTCAACGACT ACGAGGAGCT
351 GAAGCACCTG CTGAGCAGAA TCAACCACTT CGAGAAGATC CAGATCATCC
401 CTAAGAGCAG CTGGAGCAGC CACGAGGCCA GCAGCGGCGT GAGCAGCGCC
451 TGCCCTTACC AGGGCAAGAG CAGCTTCTTC AGAAACGTGG TGTGGCTGAT
501 CAAGAAGAAC AGCACCTACC CTACCATCAA GAGAAGCTAC AACAACACCA
551 ACCAGGAGGA CCTGCTGGTG CTGTGGGGCA TCCACCACCC TAACGACGCC
601 GCCGAGCAGA CCAAGCTGTA CCAGAACCCT ACCACCTACA TCAGCGTGGG
651 CACCAGCACC CTGAACCAGA GACTGGTGCC TAAGATCGCC ACCAGAAGCA
701 AGGTGAACGG CCAGAGCGGC AGAATGGAGT TCTTCTGGAC CATCCTGAAG
751 CCTAACGACG CCATCAACTT CGAGAGCAAC GGCAACTTCA TCGCCCCTGA
801 GTACGCCTAC AAGATCGTGA AGAAGGGCGA CAGCACCATC ATGAAGAGCG
851 AGCTGGAGTA CGGCAACTGC AACACCAAGT GCCAGACCCC TATGGGCGCC
901 ATCAACAGCA GCATGCCTTT CCACAACATC CACCCTCTGA CCATCGGCGA
951 GTGCCCTAAG TACGTGAAGA GCAACAGACT GGTGCTGGCC ACCGGCCTGA
1001 GAAACAGCCC TCAGAGAGAG AGAGGCCTGT TCGGCGCCAT CGCCGGCTTC
1051 ATCGAGGGCG GCTGGCAGGG CATGGTGGAC GGCTGGTACG GCTACCACCA
1101 CAGCAACGAG CAGGGCAGCG GCTACGCCGC CGACAAGGAG AGCACCCAGA
1151 AGGCCATCGA CGGCGTGACC AACAAGGTGA ACAGCATCAT CGACAAGATG
1201 AACACCCAGT TCGAGGCCGT GGGCAGAGAG TTCAACAACC TGGAGAGAAG
1251 AATCGAGAAC CTGAACAAGA AGATGGAGGA CGGCTTCCTG GACGTGTGGA
1301 CCTACAACGC CGAGCTGCTG GTGCTGATGG AGAACGAGAG AACCCTGGAC
1351 TTCCACGACA GCAACGTGAA GAACCTGTAC GACAAGGTGA GACTGCAGCT
1401 GAGAGACAAC GCCAAGGAGC TGGGCAACGG CTGCTTCGAG TTCTACCACA
1451 AGTGCGACAA CGAGTGCATG GAGAGCGTGA GAAACGGCAC CTACGACTAC
1501 CCTCAGTACA GCGAGGAGGC CAGACTGAAG AGAGAGGAGA TCAGCGGCGT
1551 GGATATCAGA TCTCTGGTGC CAAGAGGATC TCCAGGATCT GGATACATCC
1601 CAGAGGCTCC AAGAGATGGA CAAGCTTACG TGAGAAAGGA CGGAGAGTGG
1651 GTGCTGCTGT CTACTTTCCT GGGACACCAC CACCACCACC ACTAA
(서열번호 5)
H5 컨센서스 서열을 이용하여, HEK293 인간 세포로부터 발현된 HA 글리코실화 변이체를 얻었다. 고-만노스-타입 글리코실화(HAhm)를 제조하기 위하여, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I(GnTI-)가 결핍되어 있는 HEK293S 세포를 사용했다. 수용체 결합 친화성 및 특이성에 대한 HA 글리코실화의 영향을 더욱 확인하기 위하여, HA 상의 당을 천연 복합체 타입 N-글리칸으로부터 체계적으로 제거하였다(도 1a). 뉴라미니다제(NA) 처리에 의해 HAfg로부터 시알산을 제거하여 탈시알릴화 HA (HAds)를 생성했다. 엔도글리코시다제 H(Endo H)를 이용하여 모든 글리칸 구조를 단일 GlcNAc 잔기까지 절단하여 모노글리코실화 HA(HAmg)를 생성했다. 따라서, HA의 전체 4 개의 단백당형을 얻었다: HAfg: 인간 HEK293E 세포 유래의 완전 글리코실화 HA; HAds: HAfg의 뉴라미니다제(NA) 처리에 의한 탈시알릴화 HA; HAhm: 인간 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 I 결핍(GnTI-) HEK293S 세포 유래의 고-만노스 타입 HA; 및 HAmg: HAhm의 엔도글리코시다제 H (Endo H) 처리로부터 그 글리코실화 부위에서 단일 N-아세틸 글루코사민 잔기를 갖는 HA(도 1a 및 도 6). 상기 글리칸 구조는 질량 분광 분석을 통해 확인된다(도 7, 도 8, 도 9). 상기 변이체들의 원형 색성(circular dichroism)은 그것의 2차 구조들이 서로 유사하다는 것을 나타냈다(도 1c). 이어서, 이러한 시료의 단백질 3D 구조가 서로 유사하고 분석에서 편향을 유발하지 않는다는 가정하에, 다양한 단백당형의 HA 상의 N-글리칸의 단독 효과를 연구했다(도 1b). 대장균에서 기능적 HA를 발현하기 위한 시도는 글리코실화의 겹핍으로 인해 실패했다는 점에 유의한다.
또한, 질량 분광 분석 결과, (a) HAfg는 복합형 N-글리칸을 우세하게 함유하고(도 7a); (b) 시알산이 HAds 상의 복합체 타입의 N-글리칸으로부터 제거되었고(도 7b); (c) HAhm는 고-만노스 타입 N-글리칸을 우세하게 함유하고 (도 7c); (d) HAmg 는 HA상에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)만을 나타낸 것으로(도 1 및 도 8) 확인되었다.
HA 글리코실화 변이체의 글리칸 마이크로어레이 프로파일링
HA 글리코실화 변이체인 HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg의 글리칸 마이크로어레이 프로파일링을 통상적인 샌드위치 방법을 이용하여 조사했다. 합성 시알산 글리칸 어레이는 인플루엔자 바이러스의 글리칸 특이성을 조사하기 위해 디자인한 17개의 α2,3(글리칸 1-17) 및 7 개의 α2,6(글리칸 21-27) 시알로시드로 구성되었다(도 4 참조). 아민에서 종결된 5개 탄소 링커를 갖는 합성 시알로시드를 제조하고, 실온에서 수용액성 조건하에 아미드 결합을 형성함으로써 NHS-코팅 유리 상에 공유결합적으로 부착했다. 인쇄 과정은 예전에 보고된 바와 같이 표준 마이크로어레이 로보트 인쇄 기술에 기반하여 수행했다(Blixt O 외, (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:17033-17038; Wang CC 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:11661-11666). HA 변이체를 시알산 슬라이드에 도포한 다음, 일차 항체와 혼성화한 다음, Cy3에 접합된 이차 항체를 이용하여 검출했다. 이러한 분석 결과, 예전의 연구 결과에 따라(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394), H5N1 HA 컨센서스 서열은 특이적으로 α2,3 시알러시드에 결합하지만 α2,6 시알로시드에는 결합하지 않은 것으로 확인되었다(도 2A). 놀랍게도, α2,3 시알로시드와의 결합 강도는 상대 형광 강도를 통한 정량적 결합에 의해 확인되는 바와 같이 HAfg, HAds 및 HAhm에서 HAmg로 갈수로 지속적으로 강했다(도 2a).
HA를 인플루엔자 바이러스에 대하여 디자인한 17개의 α2,3(글리칸 1-17) 및 7 개의 α2,6 (글리칸 21-27) 시알로시드를 함유하는 합성 글리칸 어레이와 접촉시킨 다음(도 4), HA 단백질을 표지하지 않은 일차 항체와 혼성화한 다음, Cy3 표지된 이차 항체를 이용하여 검출했다. 그 분석 결과, 컨센서스 서열의 인플루엔자 H5NI 헤마글루티닌은 α2,3 시알로시드에는 결합할 수 있지만 α2,6 시알로시드에는 그렇지 않은 것으로 확인되었다(도 2a). 놀랍게도, 글리칸 어레이 프로파일링의 강도 비교시 α2,3 시일로시드와의 결합력은 HAfg, HAds, HAhm 및 HAmg의 순서로 지속적으로 강했다.
정량적 글리칸 마이크로어레이
글리칸 어레이 프로파일링은 결합 결과 연구에서 정량적 특성으로 제한되었는데, 이는 상대적 형광 강도만을 제공하고, 사용자는 수용체에 대한 결합 친화성을 별개의 실험과 구별할 수 없기 때문이다. 결합 결과를 정확히 확인하기 위하여, 이러한 마이크로어레이 플랫폼을 연장하여 HA-글리칸 상호작용의 해리 상수를 정량적으로 측정했다.
정량적 어레이를 디자인하여 표면 해리 상수를 측정했다(Liang PH 외, (2007) J Am Chem Soc 129:11177-11184). 항체 층에 의한 어떠한 왜곡(skewing)을 피하기 위히여, HA를 형광 염료 Cy3로 직접 표지했다(Srinivasan A 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:2800-2805). Cy3-표지된 HA를 연속 희석하여 직접 결합 분석을 수행하여 상대 결합 강도를 확인했다. 유리 슬라이드 상에 인쇄된 24 개의 시알로시드 각각에 대하여 형광 강도에 대한 HA 농도를 플로팅하여 표면상의 해리 상수를 결정했다. 해리 상수 KD , surf 값은 랭뮤어 등온식(Langmuir isotherm)을 기준으로 계산했다(도 2b). 일가의 HA-시알로시드 결합은 약해서, 밀리몰 범위의 해리상수(KD = 2.5 > 10-3 H)를 나타내지만(Sauter NK 외, (1989) Biochemistry 28:8388-8396); HA는 정량적 어레이 프로파일링에서 확인할 수 있는 바와 같이 숙주 세포 표면상에서 시알로시드와의 다가 상호작용에 관여한다(표 2). 그 KD , surf 값은 HA상의 N-글리칸의 길이가 감소함에 따라 전체적으로, 실질적으로 감소했다(도 2b).
모든 HA 단백당형은 비환원 말단으로부터 3번째 GlcNAc 잔기의 6 위치에서 설페이트 기를 갖는 수용체 글리칸(글리칸 4 및 7)에 강한 결합을 나타냈다. 이러한 설페이트 기는 H5 HA에의 결합에 중요한 것이다(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). 또한, 글리칸 4가 HAfg에 대한 최상의 리간드인 반면에, 글리칸 13-15는 HAmg에 대하여 글리칸 6보다 더욱 좋은 리간드인 것으로 관찰되어서, 리간드 결합 부위 내의 가능한 다가 상호작용, 또는 더욱 큰 이중촉각형 시알로시드(글리칸 13 및 14)에의 더욱 많은 수용체-결합 도메인의 노출을 확인할 수 있다. 흥미롭게도, HA 결합은 N-글리칸 결합 구조가 덜 복잡함에 따라 실질적으로 증가한다(도 2b). 그러나, HAmg에 대한 KD , surf 값이 몇 개의 SA 글리칸에에 대해 더욱 강하고 유사한 결합을 나타내지만, 다른 HA 변이체는 글리칸 리간드에 대하여 더욱 약하고 특이적인 친화성을 나타낸다(도 2b 및 도 10). 따라서, 결합 특이성 및 결합 친화성은 글리칸 구조에 의해 조절되는 역관계를 가질 수 있다. 이러한 조절은 HA 상의 탄수화물이 폐 상피세포상의 글리칸 수용체의 인식을 조절할 수 있다는 점에서 생물학적 중요성을 가질 수 있다.
수용체 시알로시드에 의한 결합 에너지
동적 파라미터를 열역학적 파라미터에 적용하여 분자 수준에서 상호작용의 결과를 설명할 수 있다. HA-글리칸 상호작용의 해리 상수(KD , surf)를 이용하여 결합의 깁스 자유 에너지 변화(△Gmulti)를 계산할 수 있다. △Gmulti에 대한 값은 HA-글리칸 상호작용에 의한 안정화 에너지의 정량적 측정치를 나타낸다. △Gmulti의 연속적인 증가는 HA 상의 N-글리칸 구조의 복잡성/절단의 체계적 감소와 관련이 있었다(표 2).
α2,3 시알로시드 1-15에 결합할 때 HA 글리코실화 변이체의 해리상수(KD , surf) 및 자유 에너지 변화(△G)
시알로시드 KD , surf, μM ± D ANOVA P* △G, kcal/mol ±SD
HAfg HAfg HAfg HAfg HAfg HAfg HAfg HAfg
1 6.99
±
0.41		 2.86
±
0.93		 2.09
±
0.59		 0.27
±
0.16		 <0.0001 -7.03
±
0.03		 -7.58
±
0.19		 -7.76
±
0.17		 -8.80
±
0.15
2 3.72
±
1.01		 2.47
±
0.21		 1.75
± 0.32		 0.20
±
0.07		 0.0002 -7.41
±
0.16		 -7.66
±
0.06		 -7.86
±
0.11		 -9.03
±
0.07
3 4.55
±
1.85		 2.34
±
0.27		 0.92
±
0.16		 0.26
±
0.06		 0.0002 -7.31
±
0.25		 -7.68
±
0.07		 -8.24
±
0.10		 -8.90
±
0.01
4 0.27
±
0.01		 0.27
±
0.05		 0.33
±
0.09		 0.13
±
0.06		 0.0048 -8.96
±
0.03		 -8.95
±
0.10		 -8.84
±
0.16		 -9.45
±
0.27
5 ND 5.20
±
1.01		 9.40
±
3.20		 0.54
±
0.15		 ND ND -7.21
±
0.11		 -6.88
±
0.21		 -8.49±
0.13
6 20.03
±
4.24		 9.22
±
2.05		 2.71
±
0.53		 0.80
±
0.05		 <0.0001 -6.41
±
0.13		 -6.87
±
0.13		 -7.65
±
0.06		 -8.32±
0.05
7 0.57
±
0.10		 0.77
±
0.08		 0.61
±
0.02		 0.32
±
0.10		 0.0010 -8.46
±
0.06		 -8.36
±
0.04		 -8.47
±
0.02		 -8.78
±
0.14
8 2.49
± 0.58		 2.48
±
0.41		 1.69
±
0.53		 0.36
±
0.13		 0.0008 -7.65
±
0.14		 -7.65
±
0.10		 -7.89
±
0.21		 -8.82
±
0.30
9 ND 15.34
±
5.06		 4.40
±
0.56		 0.86
±
0.34		 ND ND -6.58
±
0.20		 -7.31
±
0.08		 -8.18
±
0.16
10 7.64
±
2.3		 3.61
±
0.61		 1.22
±
0.52		 0.29
±
0.14		 0.0003 -6.99
±
0.18		 -7.43
±
0.10		 -8.09
±
0.24		 -8.77
±
0.03
11 6.02
±
1.04		 2.32
±
0.14		 1.11
±
0.51		 0.33
±
0.08		 <0.0001 -7.12
±
0.10		 -7.68
±
0.04		 -8.15
±
0.25		 -8.91
±
0.18
12 40.23
±
9.77		 ND 2.45
±
0.52		 1.41
±
0.92		 ND -6.00
±
0.15		 ND -7.66
±
0.12		 -7.85
±
0.25
13 3.38
±
1.06		 1.37
±
0.30		 0.31
±
0.06		 0.07
±
0.01		 0.0008 -7.47
±
0.19		 -8.05
±
0.13		 -8.88
±
0.13		 -9.77
±
0.09
14 2.72
±
0.41		 0.97
±
0.41		 0.42
±
0.03		 0.09
±
0.01		 <0.0001 -7.59
±
0.09		 -8.27
±
0.28		 -8.69
±
0.04		 -9.60
±
0.01
15 2.37
±
0.19		 1.32
±
0.16		 0.89
±
0.35		 0.09
±
0.01		 0.0002 -7.67
±
0.05		 -8.02
±
0.07		 -8.29
±
0.27		 -9.62
±
0.08
표 2는 α2,3-시알로시드 1-15에 따른 여러 가지 글리코실화를 갖는 HA의 열역학적 파라미터를 보여준다. HA-글리칸 상호작용의 자유 에너지 변화(△G) 및 KD,surf가 α2,3-시알로시드 1-15에 따라 보여진다. △G 값은 식 △Gmulti = -RT ln(KD , surf -1)를 이용하여 KD , surf 값으로부터 유도할 수 있다. △G 값을 KD , surf 값에 따라 계산하여 HA-글리칸 결합의 자유 에너지 변화치를 얻었다. 글리칸 5 및 9의 △G(HAfg)는 결정되지 않는다. ND는 결정되지 않음을 나타낸다. (*15개의 확인된 HA-결합 시알로시드의 세트로부터, 4 개의 HA 단백당형 사이의 KD , surf 값의 통계적으로 유의한 차이는 one-way ANOVA를 이용하여 나타낸다(P < 0.05는 유의적인 것으로 간주함)).
HA 변이체들 사이의 자유 에너지 변화의 차이(△△G)는 독특한 글리칸 구조에 의한 것이고(도 10), HAfg 및 HAmg 사이에서 최대 차이를 갖는다(△△G HAfg → HAmg; 도 10 참조). 이는 N-글리칸의 대부분을 단일 GlcNAc로 트리밍(trim)하여 얻은 결합 에너지의 최대 차이와 일치한다. △△G의 값들은 글리칸 4 및 7을 제외하고 서로 유사하여(도 10), HA 상의 글리칸들은 설페이트화 α2,3 삼당체와의 결합 친화성에 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다(Chandrasekaran A 외, (2008) Nat Biotechnol 26:107-113).
HA -수용체 결합
HA-수용체 결합의 분자 수준의 사항(즉, 글리칸 수용체를 포함하는 각각의 구조적 성분에 의한 공헌)은 상이한 수용체 시알로시드들 사이의 자유 에너지 변화의 차이(△△G 값)를 비교하여 평가할 수 있다(도 4 및 도 11). HA 결합의 원인이 되는 수용체 시알로시드의 에너지 공헌을 분석하면, 새로운 HA 억제제를 디자인하기 위하여 사용되는 특이성의 중요한 사항이 확인된다. β1,4(Galβ1-4) 연결을 갖는 갈락토오스 잔기에 연결된 시알로시드 α2,3은 Galβ1-3 연결을 갖는 것들보다 더욱 좋은 결합 친화성을 갖는다(Stevens J 외, (2008) J Mol Biol 381:1382-1394). 이는 삼당체 3 및 6이 Gal 및 GlcNAc 사이의 연결에 차이가 있는 경우 Neu5Ac-α2,3-갈락토스(Neu5Acα2,3Gal) 이당체 백본의 비교에 반영된다(도 4a, 글리칸 1, 적색 박스로 강조하여 표시함). 여기서, 모든 HA 변이체에 대한 △△G(1→3)은 음수(HA-수용체 상호작용을 안정화함)인 반면에, 모든 HA 변이체에 대한 △△G(1→6)은 양수(HA-수용체 상호작용을 불안정화함; 도 4a 및 도 11 참조)이다. 이러한 관찰 결과는 Neu5Ac-α2,3Galβ1-4Glc/GlcNAc는 HA-결합 포켓과 상호작용하는 중요한 글리칸 성분인 것을 나타낸다. 또한, 모든 HA 변이체에 대한 △△G(1→9)의 값은 양수이므로, 제 3위치에서 β6-결합 만노스에 의한 음의 섭동(negative perturbation)이 확인된다(도 4a 및 도 11). 따라서, 결합 에너지는 내부의 당 잔기 및 이의 원위 Neu5Ac-α2,3Gal 이당체 리간드에의 결합 패턴에 영향을 받는다(도 4a). 이러한 분석 결과는 제3 위치 에서의 GlcNAc 잔기가 모든 HA 변이체에 대하여 바람직하다는 것을 나타낸다. 그러나, 글리칸 13 및 14에 대한 △△G 값(도 4e 및 도 11)을 글리칸 6과 비교시, 이중촉각형 시알로시드와의 결합부위에서 다가 상호작용이 명백히 확인되고, HAmg의 경우, 이러한 분자내 결합활성은 제3 당에 의한 구조적 효과와 비교하여 결합을 유도하는데 더욱 중요하다.
다음에, 수용체 글리칸 10, 11, 12 및 15를 비교했다. 이들은 동일한 기본 코어 구조(글리칸 8 삼당체)이지만 제3 위치에서 α2,6 시알산의 신장(글리칸 11 및 12) 또는 부가(글리칸 15; 도 4b)에 차이가 있다. 측쇄 α2,6 시알산을 갖는 시알로시드가 HA 결합활성을 크게 증가시킨 반면에, 글리칸 8로부터 연장되는 더욱 긴 α2,3 시알로시드가 HA에 의한 더욱 약한 결합(△△G(8 → 15) > △△G(8 → 11) ∼ △△G (8 → 10) > △△G (8 → 12); 도 4b 및 도 11)을 초래한 것이 흥미롭다.
글리칸 3-5 및 6-7은 동일한 삼당체 백본을 갖지만, 비환원 말단으로부터 제3 GlcNAc에 설페이트 기(글리칸 4) 또는 푸코오스 잔기(글리칸 5)가 추가된 것에 차이가 있다. 설페이트 기는 HA-수용체 상호작용을 두 수용체 시알로시드 사이의 최대 에너지 갭인 2.044 kcal/mol (△△G (6 → 7))까지 안정화시킬 수 있다. 모든 HA 변이체들 중에서, 완전 글리코실화 변이체는 자유 에너지 변화의 가장 유의한 차이를 나타냈고(△△G(3 → 4) HAfg (-1.653 kcal/mol) 및 △△G(6 → 7) HAfg (-2.044 kcal/mol)), 그 자유 에너지 증가의 크기는 글리칸 구조가 더욱 단순화됨에 따라 감소되었다. 즉, HAfg > HAds > HAhm > HAmg. 따라서, 설페이트화 글리칸은 HA 결합을 급격하게 강화시키고, 완전 글리코실화 HA는 H5N1 발병에 중요한 이러한 효과를 최대화한다(도 4c 및 도 4D). 한편, 푸코실화 수용체 유사체는 HA 결합을 크게 불안정정화하는데, 모든 글리코실화 HA 변이체는 양의 △△G(3 → 5)를 나타낸다(도 4c). △△G(3 → 4) 및 △△G(3 → 5)의 이러한 큰 차이는 수용체 결합 포켓에서의 중요한 결합 상호작용 때문일 가능성이 있는데, 설페이트기는 그 상호작용을 최대화하고 푸코오스는 그 상호작용을 입체적으로 차단한다. HAfg의 약한 결합은 시알릴글리칸들의 경쟁 때문일 가능성은 미약한데, 이는 시알산의 제거가 결합에 작은 영향을 미치고, HAfg가 특정의 특이적 시알릴글리칸에 대한 강한 친화성을 여전히 나타내기 때문이다.
모노글리코실화 HA 를 이용한 백신 디자인
모노글리코실화 헤마글루티닌인 HAmg는 이의 완전 글리코실화 대응물과 비교하여 유사한 이차구조 및 숙주 수용체에 대하여 더욱 좋은 결합 친화성을 나타낸다. 또한, 최근의 연구 결과, Asn에 대한 단일 GlcNAc 잔기는 당단백질 접힘 및 안정화에 필요한 N-글리칸의 최소의 성분인 것이 확인되었다(Hanson SR 외, (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:3131-1136). 단백질은 글리칸보다 우수한 면역원이기 때문에, 모노글리코실화 HA를 인플루엔자 바이러스에 대한 단백질 백신으로서 시험했다. HAfg 및 HAmg 면역으로부터의 항혈청을, 천연 HA를 결합하고 H5 바이러스를 중화하는 능력에 대하여 비교했다(도 5). 실제로, HAfg와 대조적으로, HAmg 유래의 항혈청은 더욱 강한 바이러스 중화를 나타냈다. 또한, HAmg 항혈청은 H5 아형인 베트남/1194, H5(하노이) 및 H5(ID5/2005)외에도 H1(뉴 캘리포니아/1999)에도 결합한다(도 5D). 명백히, HAmg 백신은 주입 연구에서 HAfg 백신보다 매우 보호성을 가졌다(도 5c).
인간으로부터 분리한 H1, H3 및 H5의 아미노산 서열을 비교했다(도 3). H1 대 H3 및 H3 대 H5를 비교시, 전체 아미노산 서열의 차이 외에도 N-글리코실화 부위 근처의 것들의 차이가 관찰된다. H1 및 H5는 더욱 높은 전체 아미노산 서열 유사성을 나타내고, N-글리코실화 부위에 인접한 것들은 더욱 보존된다. 계절(A/브리스번/59/2007) 및 유행성(A/캘리포니아/07/2009) H1 균주는 약 79%의 서열 동일성을 나타낸다. 전체 서열 동일성은 H1 및 H5 간에는 약 63%, H3 및 H5 사이 및 H1 및 H3 사이에는 약 40%이다. 또한, N-글리코실화 부위(도 3에서 적색 박스안에 도시함) 및 하위의 펩티드 서열은 H1/H3과 H5의 사이 보다는 H1과 H5의 사이에서 더욱 보존된다.
본 발명은 HA 상의 N-글리칸의 체계적 단순화가 α2,6 시알로시드가 아닌 α2,3 시알로시드에 대한 결합의 연속적인 증가를 제공한다는 것을 나타낸다. 우선, 본 발명자들은 수용체 결합에 대한 HA의 외부 및 내부 글리칸의 영향을 나타내고 HA-수용체 상호작용의 결합 친화성 및 에너지 공헌을 정량적으로 분석한다.
HA 글리코실화는 인플루엔자 HA의 기능에 영향을 미친다(Wagner R 외, (2002) J Gen Virol 83:601-609). 흥미롭게도, 1968년 이후로 인플루엔자 H3N2의 글리코실화 수준이 증가함에 따라, 질병률, 치사율 및 바이러스의 폐 역가가 감소하여왔다(Vigerust DJ 외, (2007) J Virol 81:8593-8600).
이론에 구속되지 않고, 글리코실화 부위에 부착된 단일 GlcNAc를 갖는 HA가 α2,3 시알로시드에 대하여 완화된 특이성을 나타내지만 강화된 친화성을 나타낸다는 확인은 HA 상의 N-글리칸이 HA 수용체 결합 도메인에 근접하여 입체 장애를 유발할 수 있다는 것을 암시한다. 수용체 시알로시드에 대한 높은 특이성은 바이러스가 인간 폐의 상피세포 표면상의 몇몇 다른 특이적 글리칸에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 한편, 절단된 글리칸을 갖는 HA는 더욱 높은 결합 친화성 및 낮은 친화성으로 α2,3 수용체 시알로시드를 인식할 수 있으므로, HA 상의 글리칸의 길이를 감소시키는 것은 조류 플루 감염의 위험을 증가시키게 된다는 것이 암시된다. 그러나, 글리코실화를 통한 HA-수용체 상호작용의 변화가 바이러스 수명 주기에서 바이러스 감염성 및 NA 활성에 얼마나 영향을 미치는 지는 불명확하다.
단일 GlcNAc를 갖는 HA는 인플루엔자 백신에 대한 유망한 후보인데, 이러한 작제물은 HA의 구조를 그대로 유지하고 용이하게 제조(예를 들어, 효모를 통해)될 수 있기 때문이다. 또한, 이는 큰 글리칸에 의해 가려워진 보존된 에피토프를 노출시켜서, 더욱 높은 역가에서 HA 변이체를 인식하는 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 전략은 백신 디자인에 대한 새로운 방향을 열어주고, 다른 여러 가지 백신 전략(Hoffmann E 외, (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:12915-12920; Huleatt JW 외, (2008) Vaccine 26:201-214; Scanlan CN 외, (2007) J Mol Biol 372:16-12; Yang ZY 외, (2007) Science 317:825-828) 및 최근에 발견된 HA 중화 항체(Ekiert DC 외, (2009) Science 324:246-251; Kashyap AK 외, (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:5986-5991; Scheid JF 외, (2009) Nature 458:636-640; Stevens J 외, (2006) Science 312:404-410; Sui JH 외, (2009) Nat Struct Mol Biol 16:265-273)는 인플루엔자, C형 간염 바이러스 및 HIV와 같은 바이러스에 대한 백신의 개발을 촉진헐 수 된다.
따라서, 단일 GlcNAc를 갖는 HA가 인플루엔자 백신에 대한 유망한 후보일 수 있는 지의 여부를 시험했다. 0.2 내지 3개의 시알로시드와의 강한 결합력의 이점과 함께, 단일 GlcNAc를 갖는 HA는 더욱 높은 역가를 갖는 RBD에 근접한 영역을 인식하는 면역 반응을 유발할 수 있으므로, 올리고당을 첨가하는 것은 바이러스 상의 항원 에피토프의 변형 또는 은폐를 통한 면역 회피(immune evasion)의 효과적인 수단일 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 단일 GluNAc를 유지하면서 대부분의 글리칸을 제거하는 전략은 미래의 백신 디자인에 대한 새로운 방향을 제시하고, 이러한 개념은 HCV, HBV 및 HIV와 같은 항바이러스 백신 디자인에 대한 시각을 제공한다. 다른 반복적 실험에서는 본래의 글리칸 사슬의 두개, 세개 혹은 그 이상의 글리칸이 남아다.
백신으로서 부분적 글리코실화 세포-표면 당단백질
바이러스의 세포 표면 당단백질은 바이러스 발생에 대한 좋은 표적이다. 그러나, 이러한 표면 단백질은 흔히 숙주에 의해 고도로 글리코실화되어 숙주의 면역계로부터 바이러스를 보호한다. 게다가, 글리코실화 부위 근처의 바이러스 단백질 서열은 흔히 고도로 보존되므로, 백신 디자인을 위한 양호한 항원이지만, 이러한 고도로 보존된 영역은 이러한 영역을 덮거나 차단하는 글리코실화의 양 때문에 적어도 부분적으로 숙주의 면역계에 쉽게 이용될 수 없다. 예를 들어, 온전한 HIV에 대한 백신의 제조의 성공이 제한되는 한 가지 이유는 바이러스 표면의 gp120이 고도로 글리코실화되기 때문이다.
새로운 백신은 더욱 면역원성이고, 유도되는 항체는 바이러스 및 숙주에 의해 이루어지는 온전한 당단백질에 대하여 더욱 높은 중화 활성을 갖는 것으로 예상된다. 그 항체는 돌연변이할 가능성이 더욱 높은 저글리코실화 또는 비글리코실화 영역(들) 및 돌연변이할 가능성이 낮거나 및/또는 변이에 덜 민감한 고도로 보존되는 글리코실화 영역 모두를 공격할 수 있다. 따라서 생성되는 항체는 탄수화물 보다 단백질에 대하여 더욱 높은 친화성을 가지므로 표적의 단백질 부분과 강하게 상호작용함으로써 글리칸 사슬을 열역학적으로 밀어내서 글리코실화 부위 근처의 고도로 보존된 영역을 결합하게 된다.
O- 및 N-결합 당단백질에서, 첫 번째 당(N-당단백질의 경우의 N-아세틸글루코사민 및 O-당단백질의 경우의 N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)은 당단백질의 3차 구조를 보존하는데 필수적인 반면에, 나머지 당들은 중요하지 않다. N-당단백질을 엔도글리코시다제(endoH)로 처리하면, 당 사슬이 제거되고, N-아세틸 글루코사민이 그 단백질에 부착된 상태로 유지된다. 또한, 만노시다제를 이용하여, N-당단백질을 디- 또는 트리글리칸으로 절단할 수 있는데, 이러한 글리칸은 디-, 트리- 및 더욱 큰 탈글리코실화 부위를 갖는 단백질 상의 보존된 글리코실화 부위에 접근하기 위한 면역계의 능력으로 인해 가능한 백신으로 본원에서 표현되는 것이다. 또한, 다른 글리코시다제를 이용하여, O-당단백질로부터 당 사슬을 제거하고 상기 첫번째 당을 단백질에 부착된 상태로 유지할 수 있다.
인간 세포에서 발현된 조류 플루(H5) 유래의 완전 글리코실화 헤마글루티닌(HA)을 endoH로 처리하여 글리코실화를 모노글리코실화 상태로 감소시키고 토끼의 면역에 사용하는 경우, 발생되는 항혈청은 완전 글리코실화 헤마글루티닌으로부터 발생된 항혈청보다 높은 역가를 갖는다(도 13a 및 도 13b). 또한, 이는 다른 조류 플루 균주 유래의 헤마글루티닌 및 인간 플루 유래의 헤마글루티닌 H1을 중화시킬 수 있는 반면에, 완전 글리코실화 HA 유래의 항혈청은 H1을 중화시킬 수 없고 조류 플루 균주에 더욱 특이적이다.
H1과 H5 사이의 글리코실화 패턴 및 단백질 구조의 유사성은 모노글리코실화 H5 항혈청이 H1과 교차 반응하는 가능한 이유를 제공한다. 토끼 항혈청을 이용하여 데이터를 얻었다(도 13). 도 12 내지 14에서 도시한 바와 같이, H3의 헤마토글루티닌은 H1 HA에 대하여 H5 HA와 동일한 정도의 상동성을 갖지 않는다. 따라서, H1 및 H5로부터 생성한 항혈청은 H3을 중화시키지 않는다. 그러나, H3은 보존된 영역에서는 H1 및 H5와 상동성을 갖기 때문에, 탈글리코실화 헤마글루티닌 H3으로부터 생성된 항혈청은 헤마글루티닌 H3 외에도 헤마토글루티닌 H1 및 헤마토글루티닌 H5를 중화시킨다.
모노글리코실화 헤마글루티닌을 제조하기 위하여, 인간 세포 배지로부터 당단백질을 제조할 필요는 없는데, 처음 세 개의 당(만노스-N-아세틸글루코사민-N-아세틸글루코사민)을 갖거나 단백질(N-아세틸글루코사민-단백질)에 부착된 단당체(N-아세틸글루코사민)만을 갖는 당단백질은 진핵세포에서 고도로 보존되기 때문이다. 따라서, 효모, 바큘로바이러스, 또는 기타 진핵세포 숙주에서 당단백질을 제조하고 그 당단백질 혼합물을 N-결합 당단백질에 대한 endoH 또는 만노시다제와 같은 적절한 글리코시다제로 처리하여 백신으로 사용하기 위한 균질한 모노글리코실화 단백질을 제조할 수 있다.
이론에 구속되지 않고, N-결합 글리칸은 O-결합 글리칸보다 매우 더 길고 N-결합 글리칸은 나머지 당 사슬을 제거하기 위해 트리밍될 필요가 있는 것으로 판단된다. 따라서, O-결합 글리칸은 그대로 보존되는 경우에도 문제를 발생하지 않는다.
면역계에 노출되는 천연 당단백질은 N-결합 측쇄 당단백질을 갖는다. 글리코실화 때문에, 고도로 보존되는 영역은 면역계에 접근할 수 없다. 따라서, 면역계는 고도 가변 영역만을 표적함으로써, 가변 영역이 돌연변이함에 따라 다수의 바이러스 감염에 걸리기 쉬운 개체를 감소시킬 수 있다. 면역계가 고도로 보존된 영역에 접근할 수 있는 경우, 시간에 따라 변화하지 않는 이러한 서열을 표적하는 항체는, 돌연변이하여 당단백질에 대한 기존의 항체를 비효과적으로 만드는 가변 영역을 갖거나 면역계에 접근할 수 없도록 과도하게 글리코실화되는 바이러스에 대한 접종 경로를 제공한다.
따라서, 백신을 통해 단백질이 면역계에 접근할 수 있도록 하기 위하여, 글리코실화가 제거됨으로써, 천연 바이러스 단백질을 면역계에 노출시킨다. 중요한 사항으로서, 단백질로부터 당을 완전히 제거하면, 그 단백질이 변성되는 것으로 확인되었고, 많은 바이러스 당단백질에서, 글리코실화는 당단백질의 삼차 구조에 대한 중요한 성분이다.
단백질이 그 삼차 구조를 잃지 않도록 하면서, 당단백질로부터 처음 하나, 둘, 또는 세 개의 당을 절단하게 되는 endoH 또는 만노시다제와 같은 N-글리코시다제에 분리된 천연 글리코실화 단백질을 노출시키면 당이 제거된다. 다음에, 탈글리코실화 단백질은 백신으로서 적당한 담체와 함께 제형화되고 개체에게 투여된다. 고도로 보존된 글리코실화 영역이 탈글리코실화되어 면역계에 노출되기 때문에,상기 고도로 보존된 영역에 대한 항체가 생성된다.
면역된 개체가 바이러스에 감염되고 바이러스 당단백질이 면역계에 노출되는 경우, 그 단백질의 고도로 보존된 영역에 대한 항체가 상기 개체의 면역계에 존재한다. 따라서, 가변 영역의 돌연변이는 무관하게 되는데, 당단백질의 비돌연변이 보존 영역에 대한 항체가 여전히 존재하기 때문이다.
더욱이, 글리코실화는 고도로 보존된 영역에 대한 항체의 결합을 방해하지 않는데, 이는 상기 항체는 열역학적으로 치우쳐서 단백질을 결합하고 상기 고도로 보존된 영역에의 항체의 결합을 위한 경로의 밖으로 당을 밀어내기 때문이다. 중요한 사항으로서, HIV의 gp120과 같은 바이러스 단백질에서, 이러한 전략은 면역계가 감염에 효과적으로 저항하기에 충분한 항체 역가를 생성하지 못하는 경우에 접종을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
이러한 원리를 실현하는 실시예에 따라, 적어도 하나의 탈글리코실화된 헤마글루티닌 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신이 고려될 수 있다. 상기 백신은 효모 및 바큘로바이러스와 같은 글리코실화 단백질을 발현하는 임의의 계를 이용하여 제조될 수 있다. 단백질이 제조되면, 이는 겔 전기영동, 크로마토그래피, 또는 단백질을 분리할 수 있는 다른 방법과 같은 적당한 방법을 이용하여 분리된다.
글리코실화 부위에서 글리코실화 패턴은 거의 모든 진핵 세포에서 보존된다(GlcNAc-GlcNAc-Man). 따라서, 처음 1 내지 3개(유기체가 접종되는지 및 유기체가 단백질을 생성하는지에 더욱 의존하여)의 당이 남아있는 경우, 하위 글리코실화 패턴이 무엇인지는 문제가 되지 않는다. 따라서, 인간 백신의 경우, 효모를 이용하여 인간 백신접종에서 사용되는 단백질을 제조할 수 있는데, 처음 한 개 내지 세 개의 당이 절단되면, 그 패턴은 당단백질의 인간 버젼에서의 처음 한 개 내지 세 개의 당과 동일하기 때문이다. 따라서, 본 출원은 인플루엔자, HIV 및 플라비바이러스와 같은 바이러스에 대한 백신의 고속 다량 제조를 위한 독특한 플랫폼을 제공한다.
백신을 제조하기 위하여, 글리코실화된 단백질은 분리된 다음 글리코시다제또는 글리코실화를 구성하는 탄수화물을 절단하는 또 다른 효소 또는 방법을 이용하여 (부분적으로) 탈글리코실화한다. 그러나, 당 사슬을 절단하기 위해 어느 방법을 사용하든, 이는 하위 단백질의 삼차 구조에 영향을 미치지 않아야 한다.
또한, 부분적으로 글리코실화된 당단백질 또는 이의 단편은 합성을 통해 제조할 수도 있다. 당단백질의 합성을 위한 두 가지의 전략이 있다. (i) 단계적 방법: 글리코실아미노산이 고체상 합성을 위한 빌딩 블록으로 사용된다. 이러한 접근방법의 이점은 여러 가지 당단백질의 제조에 광범위하게 이용된다는 것이다. 이러한 접근 방법은 일부 올리고당 부분을 갖는 당단백질의 제조를 가능하게 한다. (ii) 수렴적 방법: 올리고당 부분 및 펩티드 부분을 따로따로 제조한 다음, 서로 결합시킨다. 보통, 이러한 접근 방법은 N-당단백질의 제조에 사용된다. 이러한 접근방법은 펩티드 부분에서의 "글리코실화 지점"에 대한 특수한 직각 측쇄 보호기를 필요로 한다.
일 실시예에 있어서, 펩티드의 아스파리긴 잔기에 부착된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 폴리펩티드 단편을 제작하기 위한 티오에스테르 방법(Merrifield RB. J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1983)) 및 당단백질 부분의 혼입을 위한 디메틸포스피노티오산 혼합 무수물(Mpt-MA) 방법(Guo, ZW 외, (1997) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36, 1464-1466)을 이용하여 합성할 수 있다.
모노- 글리코실화 HA 단백질로부터 생성된 교차반응성 인플루엔자 백신
(A) 계절 H1 ( 브리스번 ) 모노- 글리코실화 단백질
헤마글루티닌 억제 분석을 이용하여 H1(브리스번) 백신접종 유래의 항혈청이 적혈구를 응집하기 위한 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스의 능력을 억제할 수 있는지의 여부를 검출했다. 도 15a에 도시한 바와 같이, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)를 이용한 백신접종에 따른 항혈청은 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 적혈구를 응집하기 위한 NIBRG-121 (H1N1/2009) 바이러스의 능력을 억제하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다.
미세 중화분석을 이용하여, H1(브리스번) 백신접종에 따른 항혈청이 MDCK 세포를 감염시키기 위한 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스의 능력을 중화하는 지의 여부를 검출했다. 도 15b에 도시한 바와 같이, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)는 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA (HAug)와 비교하여 MDCK 세포를 감염시키기 위한 NIBRG-121(H1N1/2009) 바이러스의 능력을 중화하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다.
바이러스 주입 실험을 수행하여, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA에 의한 백신접종이 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스 주입을 보호할 수 있는 지를 확인했다. 도 15c에 도시한 바와 같이, 백신으로서 모노-글리코실화 HA(브리스번)은 NIBRG-121(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스 주입으로부터 BALB/c 마우스를 보호한다. 이와 대조적으로, 불활성화 바이러스로부터 제조한 통상적인 플루 백신에 존재하는 완전 글리코실화 HA는 H1N1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 바이러스 감염에 대한 교차 보호 능력이 없는 것으로 확인된다.
도 16a 내지 도 16c는 항원으로서 모노글리코실화 H1(브리스번) HA를 이용하여 생성된 항혈청에 의한 WSN(H1N1) 1933의 억제를 도시한다. 도 16a는 적혈구를 응집시키기 위한 WSN(H1N1) 1933 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 16b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1) 1933 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 16c는 WSN(H1N1) 1933 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 BALB/c 마우스의 보호를 도시한다. 사용된 항혈청은 브리스번 HA 단백질(5㎍)로 면역된 마우스ㅇ였, 사용된 바이러스는 WSN(H1N1) 1933 (100x LD50)이었다.
도 16a에 도시한 바와 같이, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA (HAmg)를 이용한 백신접종에 따른 항혈청은 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 적혈구를 응집하기 위한 WSN(H1N1) 1933 바이러스의 능력을 억제하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다. 도 16b에 도시한 바와 같이, H1 (브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)는 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1) 1933 바이러스의 능력을 중화하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다. 도 16c에 도시한 바와 같이, 백신으로서 모노-글리코실화 HA(브리스번)은 WSN(H1N1) 1933 바이러스 주입으로부터 BALB/c 마우스를 보호한다. 이와 대조적으로, 불활성화 바이러스로부터 제조한 통상적인 플루 백신에 존재하는 완전 글리코실화 HA는 WSN(H1N1) 1933 바이러스 감염에 대한 교차 보호 능력이 없는 것으로 확인된다.
도 17a 내지 도 17c는 항원으로서 모노-글리코실화 H1(브리스번) HA를 이용하여 얻은 항혈청에 의한 A/Puerto Rico/8/34(H1N1): PR8의 억제를 도시한다. 도 17a는 적혈구를 응집시키기 위한 PR8 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 17b는 MDCK 세포를 감염시키기 위한 PR8 바이러스의 능력의 억제를 도시한다. 도 17c는 PR8 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 BALB/c 마우스의 보호를 도시한다. 사용된 항혈청은 브리스번 HA 단백질(5㎍)로 면역된 마우스이고, 주입에 사용된 바이러스는 PR8(100x LD50)이었다.
도 17a에서 도시한 바와 같이, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA (HAmg)를 이용한 백신접종에 따른 항혈청은 완전 글리코실화 HA (HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 적혈구를 응집하기 위한 PR8 바이러스의 능력을 억제하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다. 도 17b에서 도시한 바와 같이, H1(브리스번) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)는 완전 글리코실화 HA (HAfg) 및 비글리코실화 HA (HAug)와 비교하여 MDCK 세포를 감염시키기 위한 PR8 바이러스의 능력을 중화하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다. 도 17c에서 도시한 바와 같이, 백신으로서 모노-글리코실화 HA(브리스번)은 PR8 1933 바이러스 주입으로부터 BALB/c 마우스를 보호한다. 이와 대조적으로, 불활성화 바이러스로부터 제조한 통상적인 플루 백신에 존재하는 완전 글리코실화 HA는 PR8 바이러스 감염에 대한 교차 보호 능력이 없는 것으로 확인된다.
(B) 새로운 H1 (유행성 2009 A( H1N1 ) 백신 균주) 모노- 글리코실화 HA 단백질에 의한 백신접종.
인플루엔자 H1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) HA 암호화 서열을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 발현을 위해 분리 및 변형시켰다. 표 3은 변형된 유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주 H1/HA del-TM-FH6의 서열을 보여주는데, 상기 서열에서, 신호 펩티드 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내고, 트롬빈 절단 부위는 이탤릭체로 나타내고, 박테리오파지 T4 피브리틴 폴돈(foldon) 삼합체화 서열 및 His-tag는 밑줄로 나타내고, 링커 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 표시하였다.
인플루엔자 H1 (유행성 2009 A( H1N1 ) 백신 균주) 헤마글루티닌 서열
인플루엔자 유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주 HA del-TM-FH6의 아미노산 서열
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL 50
EDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETP 100
SSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVT 150
AACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPS 200
TSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTL 250
VEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPK 300
GAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAI 350
AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVI 400
EKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER 450
TLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGT 500
YDYPKYSEEAKLNREEIDGV DIRS LVPRGS P GSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550
GEWVLLSTFLGHHHHHH
(서열번호 6)
인플루엔자 유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주 HA del-TM-FH6의 뉴클레오티드 서열
1 ATGGCGCGCC GCTAGCATGA AGGCCATCCT GGTTGTGCTG CTGTACACCT
51 TCGCTACCGC CAACGCCGAT ACCCTGTGCA TCGGCTACCA CGCCAACAAC
101 AGCACCGACA CCGTGGATAC CGTGCTGGAA AAGAACGTGA CCGTGACCCA
151 CAGCGTGAAC CTGCTGGAAG ATAAGCACAA CGGCAAGCTG TGCAAGCTGA
201 GAGGCGTGGC CCCTCTGCAC CTGGGCAAGT GCAATATCGC CGGCTGGATC
251 CTGGGCAACC CCGAGTGCGA GAGCCTGAGC ACCGCCAGCA GCTGGTCCTA
301 CATCGTGGAG ACACCCAGCA GCGACAATGG CACCTGTTAC CCCGGCGACT
351 TCATCGACTA CGAGGAACTG CGGGAGCAGC TGAGCAGCGT GTCCAGCTTC
401 GAGCGGTTCG AGATCTTCCC CAAGACCAGC TCTTGGCCCA ACCACGACAG
451 CAACAAGGGC GTGACCGCCG CCTGTCCTCA CGCTGGCGCC AAGAGCTTCT
501 ACAAGAACCT GATCTGGCTG GTCAAGAAGG GCAACAGCTA CCCCAAACTG
551 AGCAAGAGCT ACATCAACGA CAAGGGCAAA GAAGTGCTGG TGCTGTGGGG
601 CATCCACCAC CCTAGCACCA GCGCCGACCA GCAGAGCCTG TACCAGAACG
651 CCGACGCCTA CGTGTTCGTG GGCAGCAGCC GGTACAGCAA GAAGTTCAAG
701 CCCGAGATCG CCATCAGACC CAAAGTGCGG GACCAAGAGG GCCGGATGAA
751 CTACTACTGG ACCCTGGTGG AGCCCGGCGA CAAGATCACC TTCGAGGCCA
801 CCGGCAATCT GGTCGTGCCC AGATACGCCT TCGCCATGGA AAGAAACGCC
851 GGCAGCGGCA TCATCATCAG CGACACCCCC GTGCACGACT GCAACACCAC
901 CTGTCAGACC CCCAAAGGCG CCATCAACAC CAGCCTGCCC TTCCAGAACA
951 TCCACCCCAT CACCATCGGC AAGTGCCCTA AGTACGTGAA GTCTACCAAG
1001 CTGAGGCTGG CCACAGGCCT GCGGAACATC CCCAGCATCC AGAGCAGAGG
1051 CCTGTTTGGC GCCATTGCCG GCTTTATCGA GGGCGGCTGG ACCGGAATGG
1101 TGGATGGATG GTATGGCTAC CACCACCAGA ATGAGCAGGG AAGCGGCTAC
1151 GCCGCCGACC TGAAGTCCAC ACAGAACGCC ATCGACGAGA TCACCAACAA
1201 AGTGAACTCA GTGATCGAGA AGATGAACAC CCAGTTCACC GCCGTGGGCA
1251 AAGAATTCAA CCACCTGGAA AAGCGGATCG AGAACCTGAA CAAGAAGGTG
1301 GACGACGGCT TCCTGGACAT CTGGACCTAC AACGCCGAGC TGCTCGTGCT
1351 GCTGGAAAAC GAGCGGACCC TGGACTACCA CGACTCCAAC GTGAAGAATC
1401 TGTACGAGAA AGTTCGCTCC CAGCTGAAGA ACAACGCCAA AGAGATCGGC
1451 AACGGCTGCT TCGAGTTCTA CCACAAGTGC GACAACACCT GTATGGAAAG
1501 CGTGAAGAAC GGCACCTACG ACTACCCCAA GTACAGCGAG GAAGCCAAGC
1551 TGAACCGGGA AGAGATCGAC GGCGTGGATA TCAGATCTCT GGTGCCAAGA
1601 GGATCTCCAG GATCTGGATA CATCCCAGAG GCTCCAAGAG ATGGACAAGC
1651 TTACGTGAGA AAGGACGGAG AGTGGGTGCT GCTGTCTACT TTCCTGGGAC
1701 ACCACCACCA CCACCACTAA
(서열번호 7)
헤마글루티닌 억제 분석을 이용하여, H1(유행성 2009 A(H1N1) 백긴 균주) 백신접종에 따른 항혈청이 적혈구를 응집하기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 능력을 억제할 수 있는 지의 여부를 검측하였다. 도 18a에 도시한 바와 같이, H1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)에 의한 백신접종에 따른 항혈청은 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화HA (HAug)와 비교하여 적혈구를 응집하기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 능력을 억제하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다.
미세 중화분석을 이용하여, H1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주) 백신 접종에 따른 항혈청이 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 능력을 중화하는 지의 여부를 검측하였다. 도 18b에 도시한 바와 같이, H1(유행성 2009 A(H1N1) 백긴 균주) 유래의 모노-글리코실화 HA(HAmg)는 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 MDCK 세포를 감염시키기 위한 WSN(H1N1) 바이러스의 중화 능력이 더욱 좋은 것으로 확인되었다.
바이러스 주입 실험을 이용하여, H1(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주)유래의 모노-글리코실화 HA에 의한 백신접종이 WSN(H1N1) 1933 또는 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1): PR8 바이러스 주입으로부터 보호할 수 있는 지의 여부를 확인한다. 백신으로서 모노-글리코실화 HA(유행성 2009 A(H1N1) 백신 균주)는 WSN(H1N1) 또는 PR8 바이러스 주입으로부터 BALB/c 마우스를 보호한다. 이와 대조적으로, 불활성화 바이러스로부터 제조한 통상적인 플루 백신에 존재하는 완전 글리코실화 HA는 WSN (H1N1) 또는 PR8에 대한 교차 보호 능력이 없는 것으로 확인된다.
또한, 인플루엔자 바이러스의 다른 균주 유래의 부분 글리코실화(예, 모노-글리코실화) HA를 이용하여, 인플루엔자 바이러스의 한 종 이상의 균주 또는 아형에 의한 감염을 예방 또는 감소시키는데 활성이 있는 강력한 백신을 제조할 수도 있다. 인플루엔자 HA 암호화 서열은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 발현을 위해 분리 및 변형될 수 있다. 이어서, HA를 진핵세포 발현계에 클로닝 및 발현한 다음, 글리코실화 부위에 하나 내지 세 개의 글리코실화(바람직하게는 모노글리코실화)가 계속 유지되도록 탈글리코실화한다.
표 4는 변형된 H1 A del-TM-FH6의 컨센서스 서열을 나타내는데, 상기 서열에서, 신호 펩티드 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내고, 트롬빈 절단 부위는 이탤릭체로 나타내고, 박테리오파지 T4 피브리틴 폴돈 삼합체화 서열 및 His-tag는 밑줄로 나타내고, 링커 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타낸다.
컨센서스 H1 A del-TM-FH6 헤마글루티닌 서열
인플루엔자 H1 A del-TM-FH6 헤마글루티닌의 컨센서스 아미노산 서열
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL 50
EDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP 100
NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVS 150
ASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPP 200
NIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTL 250
LEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQ 300
GAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAI 350
AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVI 400
EKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER 450
TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGT 500
YDYPKYSEESKLNREKIDGV DIRS LVPRGS P GSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550
GEWVLLSTFLGHHHHHH (서열번호 8)
인플루엔자 H1 A del-TM-FH6 헤마글루티닌의 뉴클레오티드 서열
1 ATGAAGGTGA AACTGCTGGT GCTGCTGTGC ACCTTCACCG CCACCTACGC
51 CGACACCATC TGCATCGGCT ACCACGCCAA CAACAGCACC GACACCGTGG
101 ATACCGTGCT GGAAAAGAAC GTGACCGTGA CCCACAGCGT GAACCTGCTG
151 GAAGATAGCC ACAACGGCAA GCTGTGCCTG CTGAAGGGCA TTGCCCCCCT
201 GCAGCTGGGC AACTGTAGCG TGGCCGGCTG GATTCTGGGC AACCCCGAGT
251 GCGAGCTGCT GATCAGCAAA GAGTCCTGGT CCTACATCGT GGAGACACCC
301 AACCCCGAGA ACGGCACCTG TTACCCCGGC TACTTCGCCG ACTACGAGGA
351 ACTGAGAGAG CAGCTGTCCT CTGTCTCCAG CTTCGAGCGG TTCGAGATCT
401 TCCCCAAAGA GAGCAGCTGG CCCAACCACA CCGTGACAAA GGGCGTGAGC
451 GCCAGCTGCT CCCACAATGG CAAGAGCAGC TTCTACCGGA ACCTGCTGTG
501 GCTGACCGGC AAGAACGGCC TGTACCCCAA CCTGAGCAAG AGCTATGCCA
551 ACAACAAAGA GAAAGAGGTC CTCGTCCTCT GGGGCGTGCA CCACCCCCCC
601 AACATCGGCG ACCAGCGGGC CCTGTACCAC ACCGAGAACG CCTACGTGTC
651 CGTGGTGTCC AGCCACTACA GCAGACGGTT CACCCCCGAG ATCGCCAAGA
701 GGCCCAAAGT GCGGGACCAG GAAGGCCGGA TCAACTACTA CTGGACCCTG
751 CTGGAACCCG GCGACACCAT CATCTTCGAG GCCAACGGCA ACCTGATCGC
801 CCCCAGATAC GCCTTTGCCC TGAGCAGAGG CTTCGGCAGC GGCATCATCA
851 CCAGCAACGC CCCCATGGAC GAGTGCGACG CCAAGTGTCA GACCCCCCAG
901 GGCGCCATCA ACAGCAGCCT GCCCTTCCAG AACGTGCACC CCGTGACCAT
951 CGGCGAGTGC CCTAAGTACG TGCGGAGCAC CAAGCTGAGA ATGGTGACCG
1001 GCCTGCGGAA CATCCCCAGC ATCCAGAGCA GAGGCCTGTT TGGCGCCATT
1051 GCCGGCTTTA TCGAGGGCGG CTGGACCGGA ATGGTGGACG GGTGGTACGG
1101 CTACCACCAC CAGAATGAGC AGGGCAGCGG CTACGCCGCC GATCAGAAGT
1151 CCACCCAGAA CGCTATCAAC GGCATCACCA ACAAAGTGAA CAGCGTGATC
1201 GAGAAGATGA ACACCCAGTT CACCGCCGTG GGCAAAGAGT TCAACAAGCT
1251 GGAACGGCGG ATGGAAAACC TGAACAAGAA GGTGGACGAC GGCTTCCTGG
1301 ACATCTGGAC CTACAACGCC GAGCTGCTGG TCCTGCTGGA AAACGAGCGG
1351 ACCCTGGACT TCCACGACAG CAACGTGAAG AACCTGTACG AGAAAGTGAA
1401 GTCCCAGCTG AAGAACAACG CCAAAGAGAT CGGCAACGGC TGCTTCGAGT
1451 TCTACCACAA GTGCAACGAC GAGTGCATGG AAAGCGTGAA GAACGGCACA
1501 TACGACTACC CCAAGTACAG CGAGGAAAGC AAGCTGAACC GGGAGAAGAT
1551 CGACGGCGTG GATATCAGAT CTCTGGTGCC AAGAGGATCT CCAGGATCTG
1601 GATACATCCC AGAGGCTCCA AGAGATGGAC AAGCTTACGT GAGAAAGGAC
1651 GGAGAGTGGG TGCTGCTGTC TACTTTCCTG GGACACCACC ACCACCACCA
1701 CTAA (서열번호 9)
표 5는 변형된 H1-C del-TM-FH6의 컨센서스 서열을 보여주는데, 상기 서열에서, 신호 펩티드 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타내고, 트롬빈 절단 부위는 이탤릭체로 나타내고, 박테리오파지 T4 피브리틴 폴돈 삼합체화 서열 및 His-tag는 밑줄로 나타내고, 링커 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타낸다.
컨센서스 H1-C del-TM-FH6 헤마글루티닌 서열
인플루엔자 H1-C del-TM-FH6 헤마글루티닌의 컨센서스 아미노산 서열
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL 50
EDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP 100
NPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHDTVTGVS 150
ASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPP 200
NIGDQKALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTL 250
LEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQ 300
GAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAI 350
AGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVI 400
EKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER 450
TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGT 500
YDYPKYSEESKLNREKIDGV DIRS LVPRGS P GSGYIPEAPRDGQAYVRKD 550
GEWVLLSTFLGHHHHHH (서열번호 10)
인플루엔자 H1-C del-TM-FH6 헤마글루티닌의 뉴클레오티드 서열
1 ATGAAGGTGA AACTGCTGGT GCTGCTGTGC ACCTTCACCG CCACCTACGC
51 CGACACCATC TGCATCGGCT ACCACGCCAA CAACAGCACC GACACCGTGG
101 ATACCGTGCT GGAAAAGAAC GTGACCGTGA CCCACAGCGT GAACCTGCTG
151 GAAGATAGCC ACAACGGCAA GCTGTGCCTG CTGAAGGGCA TTGCCCCCCT
201 GCAGCTGGGC AACTGTAGCG TGGCCGGCTG GATTCTGGGC AACCCCGAGT
251 GCGAGCTGCT GATCTCCAAA GAGTCCTGGT CTTACATCGT GGAGACACCC
301 AACCCCGAGA ACGGCACCTG TTACCCCGGC CACTTCGCCG ACTACGAGGA
351 ACTGCGGGAG CAGCTGAGCA GCGTGTCCAG CTTCGAGCGG TTCGAGATCT
401 TCCCCAAAGA GAGCAGCTGG CCCAACCACG ATACCGTGAC CGGCGTGAGC
451 GCCAGCTGTT CCCACAACGG CGAGAGCAGC TTCTACCGGA ACCTGCTGTG
501 GCTGACCGGC AAGAACGGCC TGTACCCCAA CCTGAGCAAG AGCTATGCCA
551 ACAACAAAGA GAAGGAAGTC CTGGTCCTCT GGGGCGTGCA CCACCCCCCC
601 AACATCGGCG ACCAGAAGGC CCTGTACCAC ACCGAGAACG CCTACGTGTC
651 CGTGGTGTCC AGCCACTACA GCCGGAAGTT CACCCCCGAG ATCGCCAAGA
701 GGCCCAAAGT GCGGGACCAG GAAGGCCGGA TCAACTACTA CTGGACCCTG
751 CTGGAACCCG GCGACACCAT CATCTTCGAG GCCAACGGCA ACCTGATCGC
801 CCCCAGATAC GCCTTTGCCC TGAGCAGAGG CTTCGGCAGC GGCATCATCA
851 ACAGCAACGC CCCCATGGAC AAGTGCGACG CCAAGTGCCA GACACCCCAG
901 GGCGCCATCA ACAGCTCCCT GCCCTTCCAG AACGTGCACC CCGTGACCAT
951 CGGCGAGTGC CCTAAGTACG TGCGGAGCGC CAAGCTGAGA ATGGTGACCG
1001 GCCTGCGGAA CATCCCCAGC ATCCAGAGCA GAGGCCTGTT TGGCGCCATT
1051 GCCGGCTTTA TCGAGGGCGG CTGGACCGGA ATGGTGGACG GGTGGTACGG
1101 CTACCACCAC CAGAATGAGC AGGGCAGCGG CTACGCCGCC GATCAGAAGT
1151 CCACCCAGAA CGCCATCAAC GGCATCACCA ACAAAGTGAA CAGCGTGATC
1201 GAGAAGATGA ACACCCAGTT CACCGCCGTG GGCAAAGAGT TCAACAAGCT
1251 GGAACGGCGG ATGGAAAACC TGAACAAGAA GGTGGACGAC GGCTTCCTGG
1301 ACATCTGGAC CTACAACGCC GAGCTGCTGG TGCTGCTGGA AAACGAGCGG
1351 ACCCTGGACT TCCACGACAG CAACGTGAAG AACCTGTACG AGAAAGTGAA
1401 GTCCCAGCTG AAGAACAACG CCAAAGAGAT CGGCAACGGC TGCTTCGAGT
1451 TCTACCACAA GTGCAACGAC GAGTGCATGG AAAGCGTGAA GAACGGCACA
1501 TACGACTACC CCAAGTACAG CGAGGAAAGC AAGCTGAACC GGGAGAAGAT
1551 CGACGGCGTG GATATCAGAT CTCTGGTGCC AAGAGGATCT CCAGGATCTG
1601 GATACATCCC AGAGGCTCCA AGAGATGGAC AAGCTTACGT GAGAAAGGAC
1651 GGAGAGTGGG TGCTGCTGTC TACTTTCCTG GGACACCACC ACCACCACCA
1701 CTAA (서열번호 11)
본 출원에 개시된 탈글리코실화 HA 펩티드로부터 제조한 백신은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B와 같은 여러 가지 형태의 인플루엔자를 비롯한 호흡기 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타낸다. 유리하게는, 본 출원에 개시된 항바이러스 폴리펩티드는 계절, 조류(예, H5N1 균주) 및 돼지 바이러스를 비롯한 다수의 인플루엔자 균주에 대하여 항바이러스 활성을 나타낸다. 또한, 개시된 방법들 중 일부 방법에 따라 상기와 같은 바이러스에 의한 감염에 따른 질병이 예방 또는 치료될 수도 있다.
(C) H1 / HA 단백질 상의 글리코실화 부위
인플루엔자 H1 HA 분자들은 다음과 같이 네 개의 독특한 항원 부위를 갖는다: Sa, Sb, Ca 및 Cb (Luoh SM 외, (1992) J Virol 66:1066-1073). 상기 부위는 1918년에 그 출현 이후로 항체 매개 면역 압력을 받아온 계절 인간 H1N1 바이러스의 HA 분자에서의 대부분의 가변적인 아미노산들로 구성된다.
헤마글루티닌 억제(HI) 분석 및 백신접종/주입 연구를 이용하여, 2009 유행 H1N1 바이러스는 1918년 에서 1943년 동안에 유포된 인간 H1N1 바이러스 및 전형적인 돼지 H1N1 바이러스와 항원적으로 유사한 것으로 확인되었다. 1918-유사 또는 전형적인 돼지 H1N1 백신에 대한 항체는 인플루엔자 A/Netherlands/602/2009 바이러스 주입물에 의한 치사량 주입으로부터 C57B/6 마우스를 완전히 보호하는 것으로 확인되었다. 1918 또는 A/California/04/2009 HA 단백질에 대하여 발생된 교차 반응성 단일클론 항체(mAbs)에 의한 수동 면역은 사망으로부터 완전한 보호를 제공하는 것으로 확인되었다. 이러한 mAbs를 갖는 2009 H1N1 바이러스의 선택에 의해 발생된 mAb 항체 탈출 돌연변이의 분석 결과, 항원 부위 Sa는 보존된 교차보호성 에피토프들 중 하나인 것으로 확인되었다(Manicassamy B. 외, PLoS Pathogens January 2010 | Volume 6 | Issue 1 | e1000745).
HA 구조의 상동성 모델링을 통해, 2009 H1N1 및 1918 유행성 바이러스의 HA들은 알려진 항원 부위에서 상당한 수의 아미노산 잔기들을 공유하므로, 양쪽 HA에 교차 반응성이 있는 항체를 중화하기 위한 보편적인 에피토프가 존재한다는 것이 확인되었다(Igarashi M. 외, PLoS ONE January 2010, Volume 5, Issue 1, e8553). 가능한 글리코실화 부위는 항원적으로 보존된 Sa 영역내에 있는 HA 상의 Asn177 잔기에 존재한다(도 19 참조). 브리스번 H1의 HA 내의 Asn177 글리코실화 부위에서 돌연변이를 갖는 단백질은 마우스 면역에 사용된다. NIBRG-121에 대한 교차 보호를 측정한다.
H1(브리스번) 유래의 Asn177에서 돌연변이를 갖는 모노-글리코실화 HA (HAmg)에 의한 백신접종에 따른 항혈청은 Asn177에서 돌연변이를 갖는 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 적혈구를 응집하기 위한 NIBRG-121 바이러스의 능력을 억제하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인된다. H1(브리스번) 유래의 Asn177에서 돌연변이를 갖는 모노-글리코실화 HA(HAmg)는 Asn177에서 돌연변이를 갖는 완전 글리코실화 HA(HAfg) 및 비글리코실화 HA(HAug)와 비교하여 MDCK 세포를 감염시키기 위한 NIBRG-121 바이러스의 능력을 중화하는 능력이 더욱 좋은 것으로 확인된다. 백신으로서 모노-글리코실화 HA(브리스번)은 NIBRG-121 바이러스 주입으로부터 BALB/c 마우스를 보호한다. 이와 대조적으로, Asn177에서 돌연변이를 갖는 완전 글리코실화 HA는 NIBRG-121 바이러스 감염에 대한 교차 보호 능력이 거의 없는 것으로 확인된다.
본원에서 사용되는 "치료활성" 또는 "활성"은 그 효과가 인간에서의 원하는 치료 결과와 일치하는 활성을 의미하거나 비인간 포유동물 또는 다른 종 또는 유기체에서의 원하는 효과를 의미할 수 있다. 치료 활성은 생체 내 또는 시험관 내에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 원하는 효과를 세포 배지내에서 평가할 수 있다.
본 출원에서 개시된 바에 따른 백신의 "항바이러스 활성"은 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스에 의한 감염과 관련이 있는 증상 및/또는 바이러스 감염을 예방, 치료 또는 완화하기에 충분한 면역 반응을 백신이 투여되는 개체내에서 발생시키기 위한 백신의 능력을 나타낸다. 유리하게는, 본 출원에 개시된 탈글리코실화된 HA 펩티드로부터 제조한 백신은 인플루엔자 바이러스에 대하여 충분한 항바이러스 활성을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 "충분한 항바이러스 활성"은 바이러스의 모조 처리 시료(mock treated sample)와 비교하여, 적어도 약 50% 만큼 바이러스 헤마글루틴화(hemagglutination)를 억제하는 백신의 능력에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 항바이러스 펩티드는 바이러스 헤마글루틴화를 바이러스의 모조 처리 시료와 비교하여 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 억제한다.
바이러스 복제에 대한 항바이러스 조성물의 억제 효과를 측정하는 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명의 백신의 항바이러스제로서의 치료 효능은 예를 들어 쥐과동물 모델을 이용하여 실험 동물에서 확인할 수 있다(예를 들어, Jones 외, J. Virol, 2006, Vol. 80, No. 24, pp. 11960-11967 참조). 게다가, 본 발명의 약물학적 활성 펩티드의 치료 효과는 당해 기술분야에 알려진 기법을 통해 인간에서 확인할 수 있다.
본 발명의 중화 항체는 인플루엔자 A 바이러스의 항원 결정기의 에피토프 지도작성(epitope mapping)을 위한 도구로서 추가로 사용될 수 있고 백신 개발에 유용하다. 실제로, 하기의 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 백신 디자인을 위한 가이드로서 사용될 수 있는 몇 가지 광범위 반응성 중화 항체를 확인했다.
따라서, 본 발명의 중화 항체를 이용하여, 항체가 결합하여 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 백신으로 개발될 수 있는 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선별할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 본출원에서 기재된 항체에 의해 결합되는 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 효과적인 백신을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 상기 백신은 헤마글루티닌(HA) 항원을 결합하는 항체에 위해 결합되는 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다, 또 다른 실시예에 있어서, 상기 백신은 합성 백신일 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 백신은 (i) 약화된 인플루엔자 A 바이러스, 또는 이의 일부, 또는 (ii) 사멸 인플루엔자 A 바이러스 또는 이의 일부일 수 있다. 다른 일 실시예에 있어서, 상기 백신은 헤마글루티닌(HA) 항원을 결합하는 항체에 의해 결합된 중화 에피토프를 기능적으로 의태하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 HA 항원은 H5 아형 또는 H1 아형일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 HA 항원은 인플루엔자 A 항원의 표면에서 발현된다,
인플루엔자 바이러스 백신
인플루엔자 H5 HA의 N-글리코실화 부위 서열은 고도로 보존된다. H5 HA는 원형 서열인 N-X-(S/T)를 갖는 전체 15개의 N-글리코실화 부위를 갖는다. 각각의 단량체는 N27, N39, N170, N181 및 N500 위치에서 5 개의 N-글리코실화 부위를 갖는다. 숙주 수용체 결합은 HA 상의 글리칸에 의해 영향을 받는다. H5 HA는 위치 39, 127, 170, 181 및 500에서 글리코실화 부위를 갖는다.
본 발명의 백신은 HA, NA 및 M2를 포함하여, 인플루엔자 바이러스의 임의의 표면 단백질의 부분 글리코실화 버젼을 이용하여 제조할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 뉴라미니다제(NA) 단백질은 이의 표면에서 발현된다. 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질은 18개 내지 23개 아미노산 잔기의 세포외 N-말단 도메인, 약 19개 잔기의 내부 소수성 도메인 및 54개 잔기의 C-말단 세포질 도메인을 갖는 감염 세포의 표면에서 발현되는 97개 아미노산의 일체적인 막 단백질이다(Zebedee SL 외, J. Virol. 1988 Aug; 62(8):2762-2772).
또한, 상기 부분 글리코실화 인플루엔자 단백질은 항원으로 사용되는 단백질의 N- 또는 O-글리코실화 부위에서 글리코실화 패턴을 변경시켜서 제조할 수도 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 백신의 펩티드 또는 폴리펩티드는 인플루엔자 A 바이러스 중화 항체를 발생하는 항원 결정기를 포함한다.
더욱 일반적인 측면들에 따르면, 항체 등을 포함하나 그에 제한되지 않는 중화 분자들은 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 중화 분자는 하나 이상의 이러한 분자를 이용한 수동 면역과 같은 면역요법, 또는 바이러스 항원 표적(들)에 대한 백신의 개발에 유용하다.
본 발명은 조류 인플루엔자 중화 바이러스에 의한 감염의 예방 및 치료를 위한 백신 조성물을 제공한다. 면역 혈청의 수동 투여가 감염을 예방할 수 있다는 것이 80 년 이상 동안 알려져 왔으나(Luke, T. C. 외, Kilbane E M, Jackson J L, & Hoffman S L (2006) Ann Intern Med 145, 599-609), 단일클론 항체를 이용한 최근의 연구도 동기를 부여하고 있다(Hanson, B. J. 외, (2006) Respir Res 7, 126; Huang, C. C. 외, (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101, 2706-2711; Simmons C. P. 외, (2007) PLoS Med 4, e178). 예를 들어, Hanson 등은 H5N1 바이러스에 대한 단일클론 항체는 쥐에 접종 후 3일 후에 투여되는 경우에도 치명적 감염에 대하여 보호를 제공한다는 것이 확인되었다(Hanson, B. J. 외, (2006) Respir Res 7, 126).
비극적인 전염병의 가능성을 가정하여, 정부는 본원에서 보고된 것들과 같은 중화 항체의 비축을 유지하여야 하단고 제안되어 왔다. 항체가 완전 인간화 항체이고 바이러스 감염에 성공적으로 저항한 개체로부터 분리되어 왔다는 사실은 이점들을 제공할 수 있다. 그러나, 이러한 항체가 비축되는 경우에도, 항체가 결합하는 에피토프를 암호화하는 유전자가 변이하게 되는 경우에는, 그 항체는 덜 효과적일 수 있다. 또한, 세포 면역성이 바이러스의 제거를 강화한다는 일부의 증거들이 있다. 그럼에도 불구하고, 수동 면역의 효과가 감염의 심각성을 저하시켜서 다른 면역 작동자가 작용하는데 필요한 시간을 제공하는 경우, 이는 약화된 면역, 심혈관 및 호흡기 계통을 갖는 환자 및 노인의 경우 치사율을 저하시키는데 중요할 수 있다. 수동 면역은 1918 인플루엔자 발병 동안 건강한 젊은 성인에서도 발생한 바와 같은 급속히 증식하는 바이러스에 대한 시토카인 소동(cytokine storm)을 방지할 수 있다.
호흡기 세포융합 바이러스( RSV ) 백신
인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 기도 감염을 유발하는 바이러스이다. 이는 유아 및 어린이의 기도 감염 및 병원 방문의 주요 원인이다. RSV는 Paramyxoviridae과 Pneumovirus속의 외피 RNA 바이러스이며, 이에 대한 백신은 없다.
RSV 비리온은 세 개의 표면 당단백질, 즉 F, G 및 SH (작은 소수성)를 포함한다. 바이러스 표면상의 F 단백질은 주변 세포 상의 세포막들을 합체시켜서 세포융합을 형성한다. F (융합) 및 G (부착) 당단백질은 세포 내로의 바이러스 유입에 필요하고, 또한 이들은 항체 반응을 결정한다. RSV의 구조 및 조성이 규명되어 왔고 문헌,"Fields Virology", ed. Knipe, D. M. et al., Lippincott Williams & Wilkins, NY (2001), in particular, Chapter 45, pp. 1443-1485,"Respiratory Syncytial Virus" by Collins, P., Chanock, R. M. and Murphy, B. R에 상세히 기재되어 있다.
33kDa의 비글리코실화된 RSV G 단백질은 완전 글리코실화되는 경우(N- 및 O-결합 글리코실화) 약 90kDa에서 진행한다. F 및 G 단백질은 RSV-감염 세포의 표면 상에서 단백질 복합체로서 존재한다(Low K-W 외, Biochem. Biophys. Res. Comm. 366(2) 2008, 308-313).
하기 표 6은 밑줄친 가능한 N-글리코실화 부위를 갖는 RSV 당단백질 G의 서열을 나타낸다.
RSV 당단백질 G 폴리펩티드 서열
MSKNKDQRTT KTLEKTWDTL NHLLFISSCL YKLNLKSIAQ ITLSILAMII STSLIIAAII 60
FIASANHKVT LTTAIIQDAT SQIK N TTPTY LTQNPQLGIS FS N LSETTSQ TTTILASTTP 120
SVKSTLQSTT VKTKNTTTTK IQPSKPTTKQ RQNKPPNKPN NDFHFEVFNF VPCSICSNNP 180
TCWAICKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTIKT TKKDLKPQTT KPKEVPTTKP TEKPTI N TTK 240
TNIRTTLLT N N TTGNPEHTS QKGTLHSTSS DGNPSPSQVY TTSEYLSQPP SPS N TTNQ 298
(서열번호: 12)
부분 글리코실화 RSV 당단백질 F 및 G는 더욱 효과적인 RSV 백신으로서 유용할 수 있다.
플라비바이러스 백신
플라비바이러스는 Flaviviridae 과에 속한다. 플라비바이러스는 이의 척추동물 숙주에의 전염에 모기와 같은 절지동물을 이용하는 작은 외피 RNA 바이러스이고, 황열 바이러스(YFV), 웨스트 나일 바이러스(WNV), 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 (JE) 및 뎅기 바이러스 2 바이러스들을 포함한다(Weaver SC, Barrett AD Nat. Rev. Microbiol. 2 789-801 2004). 플라비바이러스는 3 개의 구조적 단백질로 구성된다: 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 외피 당단백질 M 및 E. 당단백질 E는 수용체 결합 및 융합을 매개하는 클래스 II 바이러스 융합 단백질이다. 클래스 II 바이러스 융합 단백질이 플라비바이러스 및 알파바이러스에서 확인된다.
당단백질 E는 세 개의 도메인으로 구성된다: 도메인 I(이합체화 도메인domain)은 8개 가닥의 베타 베럴(barrel)이고, 도메인 II(중심 도메인)은 12 개의 베타 가닥 및 2개의 알파 나선으로 구성되는 기다란 도메인이고, 도메인 III(면역글로불린 유사 도메인)은 10개의 베타 가닥을 갖는 IgC 유사 모듈이다. 도메인 I 및 II는 서로 얽혀있다.
바이러스 표면 상의 495 AA 당단백질 E 이합체들은 엔도좀의 산성 환경에서 확인되는 바와 같이 낮은 pH에 노출시 융합-경쟁 삼합체들로 비가역적으로 뭉친다. 삼합체가 형성되면, 구조가 변화되어 도메인 II의 말단에서 융합 펩티드 루프가 노출되며, 이러한 노출은 세포막에 삽입하여 세포 및 바이러스 막들을 일제히 구동하기 위한 융합 단계에서 필요하다(Modis Y 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 6986-91 2003).
댕기 바이러스 외피 단백질(E)은 Asn-67 및 Asn-153에서 두 개의 주요한 N-결합 글리코실화 부위를 포함한다. 위치 153의 글리코실화 부위는 대부분의 플라비바이러스에서 보존되는 반면에, 위치 67의 부위는 댕기 바이러스에 대하여 독특한 것으로 판단된다. 플라비바이러스 E 단백질 상의 N-결합 올리고당은 바이러스 형태발생, 감염성 및 향성(tropism)과 관련되어왔다. 위치 67에서 N-글리코실화가 결실된 댕기 바이러스는 인간 세포의 감소된 감염을 나타낸다(Mondotte JA 외, J. Virol. 81(3):7136-7148 (2007)).
표 7은 밑줄표시된 N-67 및 N-153에서의 가능한 N-글리코실화 부위를 갖는 댕기 바이러스 당단백질 E의 서열을 나타낸다.
댕기 바이러스 당단백질 E 폴리펩티드 서열
MRCVGIGNRD FVEGLSGATW VDVVLEHGSC VTTMAKNKPT LDIELLKTEV TNPAVLRKLC 60
IEAKIS N TTT DSRCPTQGEA TLVEEQDANF VCRRTFVDRG WGNGCGLFGK GSLLTCAKFK 120
CVTKLEGKIV QYENLKYSVI VTVHTGDQHQ VG N ETTEHGT IATITPQAPM SEIQLTDYGA 180
LTLDCSPRTG LDFNEMVLLT MKEKSWLVHK QWFLDLPLPW TSGASTSQET WNRQDLLVTF 240
KTAHAKKQEV VVLGSQEGAM HTALTGATEI QTSGTTTIFA GHLKCRLKMD KLTLKGVSYV 300
MCTGSFKLEK EVAETQHGTV LVQVKYEGTD APCKIPFSTQ DEKGVTQNGR LITANPIVTD 360
KEKPVNIETE PPFGESYIVI GAGEKALKLS WFKKGSSIGK MFEATARGAR RMAILGDTAW 420
DFGSIGGAFT SVGKLVHQVF GTAYGVLFSG VSWTMKIGIG ILLTWLGLNS RSTSLSMTCI 480
AVGMVTLYLG VVVQA 495
(SEQ ID NO:13)
따라서, 댕기 바이러스의 부분적 글리코실화를 이용하여, 플리비바이러스에 대한 더욱 효과적이고 광범위한 백신을 제조할 수 있다. 댕기 타입 3 바이러스 E 단백질 이합체의 부분적 글리코실화의 결과는 도 21a 내지 21b에 도시한 모델에서 확인된다. 도 21b는 모노글리코실화 댕기 E 단백질을 도시한다.
C형 간염 바이러스(HCV)는 전세계 인구의 1% 정도를 감염시키는 인간 주입후 감염 및 공동체-획득 비A, 비C 간염의 주요한 병인 물질이다. HCV는 플라비바이러스 및 페스티바이러스를 포함하는 Flaviviridae과에 속한다(Miller RH & Purcell RH, Proc. Natl . Acad . Sci ., USA 87, 2057-2061 1990).
C형 간염 바이러스(HCV) 게놈은 상호작용하여 비공유 이종이합체성 복합체를 형성하는 두 개의 막-연관 외피 당단백질(E1 및 E2)을 암호화한다. HCV 당단백질인 E1 및 E2는 N-결합 당단백질에 의해 심하게 변형된다. E1 단백질은 192개 아미노산으로 구성되고 HCV 유전형에 따라 5 개 내지 6개의 N-글리코실화 부위를 함유한다. E2 단백질은 363개 내지 370개 아미노산으로 구성되고 HCV 유전형에 따라 9 개 내지 11개의 N-글리코실화 부위를 포함한다 (Maertens G. and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In: The molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Harrison T. J. and Zuckerman A. J. 1997).
최근의 연구 결과, 엔도글리코시다제 H를 이용한 부분적 탈글리코실화 시, HCV 당단백질 E1의 아미노산 위치 196, 209, 234, 305 및 325에 있는 5 개의 가능한 글리코실화 부위들 중 4개 만이 이용되는 것으로 확인되었다. 위치 N2(196) 및 N3(234)에서의 돌연변이는 E1E2 복합체의 조립에 작은 영향만을 미치는 반면에, 위치 N1(196) 및 주로 위치 N4(305)에서의 돌연변이는 비공유 E1E2 복합체들의 형성의 효율을 크게 감소시킨다(Meunier JC. et al ., J. Gen . Virol . (1999), 80, 887-896.).
하기 표 8은 C형 간염 바이러스 분리물인 HC-J6 외피 당단백질 E1의 서열을 나타내며(Okamoto,H. 외, J. Gen. Virol. 72(11), 2697-2704 (1991)), 위치 196, 209, 234, 305 및 325에서의 가능한 N-글리코실화 부위는 밑줄로 나타내고 있다.
C형 간염 바이러스 외피 당단백질 E1 폴리펩티드 서열
AEVK N ISTGY MVTNDCT N DS ITWQLQAAVL HVPGCVPCEK VG N TSRCWIP VSPNVAVQQP 252
GALTQGLRTH IDMVVMSATL CSALYVGDLC GGVMLAAQMF IVSPQHHWFV QDC N CSIYPG 312
TITGHRMAWD MMM N WSPTAT MILAYAMRVP EVIIDIIGGA HWGVMFGLAY FSMQGAWAKV 372
VVILLLAAGV DA 384
(SEQ ID NO:14)
따라서, HCV 당단백질 E1 및 E2의 부분적 글리코실화를 이용하여, HCV에 대한 더욱 효과적이고 광범위한 백신을 제조할 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스( HIV ) 백신
인간 면역결핍 바이러스 HIV-1 및 HIV-2 및 관련 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)는 이의 숙주에서 CD4+ 임파구의 파괴를 유발하여, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 발생을 초래한다. 숙주내로 HIV의 유입은 바이러스 외피 당단백질에 의해 매개되는데, 이러한 당단백질은 비리온의 표면상에서 발현되는 올리고머, 가능하게는 삼합체 스파이크로 구성된다. 이러한 외피 복합체는 gp41 막관통 외피 당단백질을 통해 바이러스 막에 고정된다. 상기 스파이크의 표면은 삼합체 gp41 당단백질 복합체의 각각의 아단위체와의 비공유 상호작용에 의해 연관되는 외부 외피 당단백질 gp120으로 주로 구성된다.
인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 외피의 gp120 및 gp41 당단백질에 아스파라긴 (N)-결합 다당류 사슬(즉, 글리칸)을 첨가하는 것은 올바른 단백질 접힘에 필요할 뿐만 아니라, "글리칸 차단막"으로서 중화 항체에 대한 보호를 제공할 수 있다(Wei X 외, Nature 422: 307-312, 2003). 바이러스와 숙주 환경 사이의 일차 계면을 나타내는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 외피의 표면 당단백질(gp120)은 현재까지 알려진 가장 심하게 글리코실화된 단백질들 중 하나인데, 그 분자량의 거의 절반은 N-결합 글리칸의 첨가로 인한 것이다(Allan JS 외, Science 228: 1091-1094, 1985.) 또한, HIV-1 외피의 막관통 단백질(gp41)도 또한 보다 작은 정도로 글리코실화된다. N-결합 글리칸을 첨가하는 것은 HIV-1 gp120을 적당한 구조로 접어서 CD4 수용체에 결합시키는데 필수적인 것이고, 대안적인 동시수용체인 CXCR4 및 CCR5의 결합에 영향을 미치는데, 이의 통합 효과는 숙주 세포로의 HIV-1의 융합 및 유입을 매개한다.
많은 N-결합 글리칸은 HIV-1 외피의 고도로 보존된 성분이기 때문에, 이들은 중화 항체에 대한 유망한 표적을 제공할 수 있다. 광범위한 중화성 인간 단일클론 항체 2G12는 gp120 당단백질에 부착되는 N-결합 글리칸을 포함하는 에피토프에 결합한다(Trloka A 외, J Virol 70: 1100-1108, 1996). 글리코실화 부위가 실험적으로 결실 또는 변형되어진 HIV-1의 균주는 중화에 더욱 민감해질 수 있다(Koch 외, 2003 Virology 313: 387-400.).
성숙 gp120은 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr에 의해 인식되는 바와 같이 N-글리코실화를 위한 24개의 가능한 부위를 함유한다(Kornfeld 및 Kornfeld, Ann Rev . Biochem. 54: 631-664, 1985). 표 9는 HIV-1 HXB2 서열에서의 24개의 부위를 나타낸다. 가능한 N-글리코실화 부위는 밑줄표시되어 있다
HIV gp120 당단백질 서열
LWVTVYYGVP VWKEATTTLF CASDAKAYDT EVHNVWATHA CVPTDPNPQE VVLV N VTENF 60
NMWKNDMVEQ MHEDIISLWD QSLKPCVKLT PLCVSLKCTD LK N DTNT N SS SGRMIMEKGE 120
IK N CSF N IST SIRGKVQKEY AFFYKLDIIP ID N DTTSYKL TSC N TSVITQ ACPKVSFEPI 180
PIHYCAPAGF AILKCN N KTF N GTGPCT N VS TVQCTHGIRP VVSTQLLL N G SLAEEEVVIR 240
SV N FTDNAKT IIVQL N TSVE I N CTRPN N NT RKRIRIQRGP GRAFVTIGKI GNMRQAHC N I 300
SRAKW N NTLK QIASKLREQF GN N KTIIFKQ SSGGDPEIVT HSFNCGGEFF YC N STQLF N S 360
TWF N STWSTE GS N NTEGSDT ITLPCRIKQI INMWQKVGKA MYAPPISGQI RCSS N ITGLL 420
LTRDGGNSN N ESEIFRPGGG DMRDNWRSEL YKYKVVKIEP LGVAPTKAKR RVVQREKR478
(SEQ ID NO:15)
HIV-1 막관통 당단백질 gp41에서, 보존된 당단백질 부위는 Asn621, Asn630 및 Asn642이다.
따라서, HIV 외피 단백질 gp120 또는 막관통 단백질 gp41의 부분 탈글리코실화를 이용하여, 플라비바이러스에 대한 더욱 효과적이고 광범위한 백신을 제조할 수 있다. HIV gp120 단백질 삼합체의 부분적 글리코실화의 결과가 도 20a 및 20b에서 도시된 모델에서 확인된다. 도 20b는 모노글리코실화 HIV gp120 단백질 삼합체를 나타낸다.
부분 글리코실화 세포 표면 당단백질을 제조하기 위한 방법
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 단편 또는 변이체는 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 일반적으로 실시되는 바와 같이 예를 들어 화학적 수단을 이용하여 단편을 직접 합성함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 또한, 단편들은 선별된 서열을 재조합 제조를 위한 재조합 벡터내로 도입함으로써 미국특허 제 4,683,202호의 PCRTM 기술과 같은 핵산 재생 기술에 의해 얻어지거나, 분자 생물학 분야의 당업자에게 일반적으로 알려진 다른 재조합 DNA 기법을 이용하여 얻어진다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포외에도, 본 발명의 폴리펩티드의 제조를 위한 재조합 기법을 제공한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 및 미니 염색체를 비롯한, 임의 형태의 세포 또는 유기체에서 복제할 수 있는 것들을 포함한다. 다양한 실시예들에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 폴리뉴클레오티드의 신장 또는 재생에 적합한 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 적당한 벡터이다. 이러한 벡터는 당해 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 이용가능한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전체 또는 부분적으로 합성된 다음 합쳐져서, 예를 들어 상기 폴리뉴클레오티드를 적절한 제한 부위 및 제한 효소를 이용하여 선형화 벡터에 삽입하는 것을 포함하는, 통상적인 분자 및 세포 생물 기법을 이용하여 벡터에 삽입할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 각각의 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 폴리머라제 사슬 반응을 통해 증폭된다. 또한, 이러한 프라이머는 벡터내로의 서브클로닝을 촉진하기 위하여 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 일반적으로 복제가능한 성분으로는 하기의 것들 중 하나 이상이 있으나, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점 및 하나 이상의 마커 또는 선별가능한 유전자.
본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위하여, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 균등물은 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 복제에 필요한 요소를 함유하는 벡터에 삽입된다. 당업자에게 알려진 방법을 이용하여, 관련 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 제작한다. 상기의 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 힙성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 있다. 이러한 기법들은 예를 들어 다음 문헌 [Sambrook, J.외, (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 및 Ausubel, F. M. 외, (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.]에 기재되어 있다.
여러 가지 발현 벡터/숙주계는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유 및 발현하도록 이용된다. 이의 예로는 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물 세포계가 있으나 이에 제한되지 않는다.
여러 가지 프로모터 서열이 진핵세포에 대하여 알려져 있고, 임의의 것이 번 발명에 따라 사용된다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30 개 염기 상류측에 위치한 AT-풍부(rich) 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 개시부로부터 70 내지 80 개 염기 상류측에서 확인되는 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는, 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 첨가하기 위한 신호서열일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이러한 서열들은 진핵세포 발현계에 적당히 삽입된다.
포유동물 세포계에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 포유동물 숙주 세포에서 벡터를 이용한 폴리펩티드 발현은 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예, 이데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스(CMV), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 유인원 바이러스(SV40)과 같은 바이러스로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 바이러스, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열충격 프로모터에 의해 조절되는데, 상기의 프로모터들은 숙주 세포계와 양립가능한 것이다. 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 다중 카피를 함유하는 세포주를 발생하기 위하여 필요한 경우, SV40 또는 EBV에 기반한 벡터는 적절한 선별 마커와 함께 이용되는 것이 바람직하다. 적절한 발현 벡터의 일 예로서 CMV 프로모터를 포함하는 pcDNA-3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 들 수 있다.
다수의 바이러스-기반 발현계가 폴리펩티드의 포유동물 발현에 이용가능하다. 예를 들어, 아데노바이러스가 발현벡터인 경우, 관련 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 프로모터 및 리더 서열로 이루어지는 아데노바이러스 전사/번역 복합체내로 리게이션될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수적 E1 또는 E3 영역에의 삽입을 이용하여, 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존가능한 바이러스를 얻을 수 있다(Logan, J. 및 Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이, 루 육종 바이러스(Rous sacroma virus, RSV) 강화제와 같은 전사 강화제를 이용하여 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
박테리아 계에서, 다수의 발현 벡터들 중 임의의 것이 발현 폴리펩티드에 예정된 용도에 따라 선택된다. 예를 들어, 다량이 바람직한 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 고수준 발현을 지시하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터로는 관련 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 b-갈락토시다제의 아미노 말단 Met 및 후속하는 7개의 잔기에 대한 서열과 함께 벡터에 리게이션되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene)와 같은 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터 및 pIN 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Van Heeke, G. 및 S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509). 또한, pGEX 벡터(Promega, Madison, WI)를 이용하여, 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시킨다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타치온-아가로스 비드에 흡착시킨 다음 유리된 글루타치온의 존재하에 용리시켜서 용해 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 상기의 계에서 제조되는 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인됨으로써, 클로닝된 폴리펩티드는 GST 부분으로부터 쉽게 유리될 수 있다.
효모인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서, 알파 인자, 알코올 옥시다제, 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터가 이용된다. 숙주계에서 사용하기 위한 다른 적당한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜 분해 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트, 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제가 있다. 이에 대하여는 다음 문헌[Ausubel et al . (supra) and Grant et al . (1987) Methods Enzymol. 153:516-544]을 참조한다. 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 디히드로게나아제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사 관련 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토오스 및 갈락토스 활용을 위한 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현계에서 사용하기에 적당한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657호에 더 기재되어 있다. 효모에서 글리코실화 HCV 표면 단백질의 발현이 WO 96/04385호에 기재되어 있다. 또한, 효모 강화제도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 발현은 다수의 프로모터들 중 임의의 것에 의해 구동된다. 예를 들어, CaMV의 35S 및 19S와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV 유래의 오메가 리더 서열과 함께 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 선택적으로, RUBISCO의 작은 아단위체 또는 열충격 프로모터와 같은 식물 프로모터도 사용된다(Coruzzi, G. 외, (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. 외, (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J., 외, (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이러한 작제물들은 직접 DNA 형질전환 또는 병원체-매개 형질감염을 통해 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 기법은 다수의 입수가능한 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Hobbs, S. 또는 Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한, 곤충계를 이용하여 관심 폴리펩티드를 발현시킨다. 예를 들어, 이러한 계에서, Autographa californica 핵다각체병 바이러스(AcNPV)가 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia 유충에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용된다. 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 폴리히드린 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역에 클로닝되고, 폴리히드린 프로모터의 조절하에 위치한다. 폴리펩티드 암호화 서열을 성공적으로 삽입하면, 폴리히드린 유전자가 불활성화되고, 외피 단백질이 결실된 재조합 바이러스가 생성된다. 이어서, 상기 재조합 바이러스는 관심 폴리펩티드가 발현되는, 예를 들어 S. frugiperda 세포 또는 Trichoplusia 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. 외, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).
재조합 표면 당단백질의 부분적 글리코실화는 뉴라미니다제로 처리하여 시알산을 제거하거나, 알파-1-만노시다제(Sigma)로 처리하여 외부 만노스 잔기를 절단하거나, N-결합 만노스 및 복합 글리칸 모두를 효과적으로 절단하는 endo F-N 글리카나제(Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Germany)으로 처리하는 것과 같은 여러 가지 글루코시다제들의 조합을 이용하여 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 HA 펩티드는, 아마노산 잔기 및/또는 펩티드 단편의 전형적인 용액 커플링 및 필요한 경우 고체상 기법과 같은 펩티드 합성에서 일반적으로 사용된 방법을 포함한 과정을 통해 합성할 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 펩티드 합성 방법은 예를 들어 다음 문헌[Schroeder 및 Lubke, in "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, New York, N.Y., pp. 2-128 (1965); "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", (E. Gross et al., Eds.), Academic Press, New York, N.Y., Vol. 1-8, (1979-1987); Stewart and Young, in "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10537 (1992); 및 Rimsky et al., J Virol, 72: 986 (1998); Chan & White in "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", Oxford University Press, (2000)]에 기재되어 있다. 일부 실시예들에 잇어서, 당단백질들은 GlcNAc-Asn(V-Labs, Covington, LA)와 같은 글리코실화 아미노산이 펩티드의 적절한 글리코실화 부위에 병합되도록 글리코실화 아미노산을 이용하여 합성될 수 있다.
본 출원에 개시된 백신은 펩티드를 온혈 동물, 예를 들어 인간, 말, 기타 동물에게 국소적으로, 비내로, 또는 비경구 투여를 통해, 예를 들어, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사, 복막내 주사, 또는 진피내 주사를 통해 투여함으로써 항바이러스제로서 이용될 수 있다. 상기 항바이러스 펩티드는 개별적으로 또는 조합으로 이용될 수 있다. 추가적으로, 상기 항바이러스제는 단독으로 또는 한 종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 일부로서 투여될 수 있는데, 그 비율은 펩티드의 용해도 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로, 표준 생물학적 투여 경로에 의해 결정된다. 본 발명의 펩티드는 바이러스 및/또는 표면상의 단백질을 표적할 수 있기 때문에, 효능을 확보하기 위해 이러한 제제내의 담체는 그 펩티드에 결합하는 단백질이 없거나 실질적으로 없어야 한다(예를 들어, 90, 95, 98, 또는 99 중량% 이상).
약학적 조성물
또 다른 측면에 따르면, 본 출원에 개시된 백신 및 탈글리코실화 단백질은 본 출원으로부터 당업자에 의해 인지될 수 있는 추가의 활성 물질, 담체, 비히클(vehicle), 보조제, 부형제 또는 보조제와 함께 약학적 또는 기능식품 조성물 또는 제제에 포함될 수 있다.
본 출원에 개시된 백신은 유효량의 면역증강제(adjuvant)를 포함하는 것이 유리하다, 당업자에게 명백하게 인식되는 바와 같이, 면역증강제 펩티드(들)의 최적 농도는 사용되는 특정 펩티드(들), 환자의 특징, 사용되는 면역원, 및 치료 또는 예방을 원하는 바이러스 감염의 성질에 필수적으로 의존하게 된다. 상기의 인자들은 본 출원의 개시된 사항을 고려하여 의약 및 제약 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역증강 펩티드는 어떤 유해하거나 해로운 부작용을 유발하지 않고 면역증강 활성을 제공하게 되는 농도로 투여되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 유효 면역증강제 양이 바람직하다. 유효 면역증강제 양은 투여된 면역원에 대한 면역 반응을 촉진할 수 있는 면역증강 펩티드의 양을 말한다.
본 출원에 개시된 조성물에 포함되기에 적절한 면역증강제로는 당업자에게 알려진 것들, 예를 들어, 인간에서는 사용되지 않는 완전 프로인트 아주반트(complete Freund's adjuvant, CFA), 불완전 프로인트 아주반트(IFA), 스쿠알란, 스쿠알렌, 명반, 및 다양한 오일들이 있는데, 이들은 모두는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 Novartis(예를 들어, MF59 adjuvant)와 같은 여러 출처로부터 상업적으로 이용가능하다.
상기 약학적 또는 기능식품 조성물은 적어도 한 종의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 상기의 약학적 조성물에서, 백신 또는 탈글리코실화 단백질은 "활성 물질"(active agent) 이라고도 지칭되는 활성 화합물을 형성한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약제 투여에 허용가능한 용매, 분산매, 피복제, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 및 그 유사체들을 포함한다. 또한, 보조 활성 화합물이 그 조성물에 포함될 수 있다. 약학적 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 구강(예, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 있다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민 테트라이세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장 조절제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 이용하여 조절할 수 있다. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 이루어진 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 투여 바이알에 포함될 수 있다.
펩티드를 함유하는 조성물을 위한 적절한 약학적으로 허용가능한 담체는 표준 제약 텍스트, 예를 들어 다음 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990)]에 기재되어 있다. 적절한 약학적으로 허용가능한 담체의 특정한 비제한적 예로서 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합이 있다. 추가적으로, 필요한 경우, 상기 조성물은 조성물의 항바이러스 효과를 강화하는 보조량의 보조물질, 예를 들어, 습윤 및 유화제, pH 완충제를 추가로 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 개체는 인간 및 비인간 영장류(예, 고릴라, 짧은 꼬리 원숭이, 명주원숭이), 가축(예, 양, 소, 말, 당나귀, 및 돼지), 애완 동물(예, 개, 고양이), 실험용 동물(예, 원숭이, 토끼, 쥐, 기니 피그, 햄스터), 포획된 야생 동물(예, 여우, 사슴), 및 본 개시의 물질로부터 이점을 얻을 수 있는 다른 생명체들을 지칭한다. 본출원에 개시된 물질로부터 이점을 얻을 수 있는 동물의 유형에는 제한이 없다. 인간이건 비인간 생명체이건 개체는 환자, 개체, 동물, 숙주 또는 수령자로 나타내어진다.
비경구 투여의 경우, 본 출원에 개시된 펩티드 또는 이들로부터의 백신은 정맥내, 피하, 근육내, 복막내, 또는 피내 주사의 단독 또는 조합을 통해 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 주사에 의한 투여의 경우, 완충액 또는 보존제 외에도 용액을 등장성으로 만드는 충분한 양의 약학적으로 허용가능한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수용성 비히클에 용해된 용액으로서 항바이러스 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 출원에 개시된 항바이러스 펩티드는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 얻어질 수 있다.
주사용으로 적당한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용액인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉각적 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 주사의 경우, 적당한 담체로는 생리식염수, 정균수, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany. N.J.) 또는 인산염 완충액(PBS)이 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 조성물은 멸균이어야 하고 용이하게 주사될 수 있는 정도까지 유동성이 있어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다.
예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 여러 가지 항균 및 진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 테메로살 및 이의 유서체 등을 이용하여 달성될 수 있다. 많은 경우, 조성물은 등장제, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴과 같은 물질을 포함시킴으로써 달성된다.
멸균 주사용액은 필요량의 활성 조성물을 적절한 용매에 필요한 경우 전술한 상분들 중 하나 이상과 함께 포함시킨 다음 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매 및 전술한 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조하여 활성 성분과 전술한 멸균 여과 용액으로부터의 어떤 추가적인 원하는 성분의 분말을 얻는 것을 포함한다.
또한, 백신은 경구 투여될 수 있다. 일반적으로 경구 투여는 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 투여 치료의 목적을 위하여, 활성 화합물은 부형제와 혼입되고 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용된다. 또한, 경구 조성물은 마우스워시로 사용하기 위한 유체 담체를 이용하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 결합제, 또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환, 캡슐, 트로키 등은 하기의 성분 또는 유사한 성질의 화합물들 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 미소결정성 셀룰로오스와 같은 바인더, 트랜거캔스 검, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘 또는 Sterotes와 같은 활제(lubricant), 아스콜로이달(ascolloidal) 이산화규소와 같은 글리단트(glidant), 수쿠로스 또는 사카린과 같은 감미제, 또는 페파민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향과 같은 향미제.
본 출원에 개시된 펩티드 및 백신은 호흡기 바이러스에 대한 활성을 나타냈기 때문에, 호흡기계, 예를 들어, 코, 누공, 누막 또는 폐에 국소적으로 전달될 수 있다. 펩티드, 백신, 또는 하나 이상의 펩티드 또는 백신을 함유하는 약학적 조성물은 흡입, 구강 또는 비내와 같은 어떤 적당한 방식으로 호흡기계에 전달될 수 있다. 본 발명의 조성물은 분말 또는 액체 스프레이, 현탁액, 비 액, 겔 또는 연고로서 튜브 또는 카테터, 주사기, 펙테일(packtail), 플레젯(pledget), 또는 점막하 주입을 통해 전달될 수 있다. 상기 펩티드 또는 백신은 가압팩 또는 연무기(nebulizer) 및 적당한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 이용하여 에어로졸 스프레이의 형태로 적절히 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계측량을 운반하기 위한 밸브를 제공함으로써 조절될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴으로 이루어진 캡슐 및 카트리지는 락토오스 및 전분과 같은 적당한 분말 기재 및 펩티드의 분말 믹스를 함유하도록 제형화될 수 있다. 비내용 제제 및 투여 방법의 예는 PCT 공개공보 WO 01/41782, WO 00/33813 및 미국 특허 6,180,603; 6,313,093; 및 5,624,898에서 확인할 수 있다. 후자에 언급한 미국 특허들은 본원에 참조로서 포함된다. 에어로졸 제제용 추진제는 압축 공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소계 저비등(low boiling) 용매를 포함할 수 있다. 본 출원에 개시된 펩티드 및 백신은 연무기로부터 에어로졸 스프레이 제제의 형태로 적절히 전달될 수 있다. 일부 측면들에 있어서, 활성 성분들은 건조 분말 제제의 투여시 실질적으로 모든 활성 성분이 폐로 흡입될 수 있도록 적당히 미크론화됨으로써, 상기 활성 성분은 100 미크론 미만, 바람직하게는 20 미크론 미만, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 미크론의 입자 크기를 가지게 된다. 일 실시예에 있어서, 하나 이상의 펩티드 또는 백신은 예정량, 일반적으로는 유효량의 펩티드를 흡입을 통해 전달하는 기구, 예를 들어, 코용 스프레이 또는 흡입기내로 포장된다.
또한, 전신 투여는 경점막 또는 경피를 통해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 장벽에 적절히 투과될수 있는 침투제(penetrant)가 제제에 사용된다. 상기의 침투제는 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들어 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙염, 푸시드산 유도체가 있다. 경점막 투여는 코용 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 성분은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 바와 같이 연고, 고약, 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 화합물들은 직장 전달용 체류 관장약 또는 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제를 이용)의 형태로 제조될 수 있다.
실시예들에 따라, 상기 활성 성분은 이식편 및 미소캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 시스템과 같은 신체로부터의 신속한 배설에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명확히 알려져 있다. 또한, 상기의 물질들은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 얻어질 수도 있다. 또한, 리포좀 현탁액(세포 특이적 항원에 대한 단일클론 항체를 갖는 감염된 세포에 표적된 리포좀을 포함)은 약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 이들은 당해 기술분야에 알려진 방법, 예를 들어, 본원에 참조로서 병합되는 미국 특허 4,522,811호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여의 균일성을 위해 단위 투여의 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 출원에서 사용되는 단위 투여 형태는 투여될 개체에 단위 투여에 적합한 물리적으로 불연속적인 단위체를 의미하고, 각각의 단위체는 필요한 약학적 담체와 연관되어 원하는 치료 효과를 생성하는데 필요한 예정량의 활성 성분을 함유한다.
당업자는 본 출원에서 언급하는 치료는 예방뿐 아니라 수립된 감염 또는 증상의 치료까지 연장된다는 것을 알 수 있다. 본 출원에 개시된 펩티드 또는 백신은 치료 또는 예방적으로 투여될 수 있다. 치료는 바람직하게는 감염전 또는 감염시, 또는 포유동물이 바이러스 호흡기 감염을 유발할 수 있는 바이러스에 노출시 시작되고, 바이러스가 기도에서 더이상 존재하지 않거나 활성이 없어질 때까지 계속된다. 그러나, 상기 치료는 감염후, 포유동물이 바이러스 호흡기 감염을 유발할 수 있는 바이러스에 노출된 후, 또는 정착된 감염 증상의 출현 후에 시작될 수도 있다.
또한, 인플루엔자의 치료 또는 예방에 유용하게 되는 본 개시의 항바이러스 펩티드의 양은 선택되는 특정 펩티드 외에도, 투여 경로, 치료되는 증상의 성질, 환자의 연령 및 상태에 의존하게 되고, 담당 의사 또는 수의사의 판단에 따라 결정된다는 것을 알 수 있다. 그러나, 일반적으로, 적당한 투여량은 하루에 약 0.01 내지 750 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg/day, 가장 바람직하게는 0.5 내지 25 mg/kg/day일 수 있다.
상기 펩티드 또는 백신은 예를 들어 10 내지 1500 mg, 통상적으로는 20 내지 1000 mg, 가장 통상적으로는 50 내지 700 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투여 형태, 예를 들어, 75 mg/75 kg에 해당하는 1 mg/kg의 투여량으로 적절히 투여될 수 있다.
바람직하게는, 백신에 포함하기 위한 각각의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 면역원의 농도는 유의적인 부작용이 없이 면역 반응을 유도하는 양이다. 이러한 양은 사용되는 면역원, 백신에 포함되는 면역증강 펩티드의 형태 및 양에 따라 변화하게 된다. 전형적으로, 백신은 SRD 분석법으로 측정하였을 때, 약 1 내지 약 1000 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 300 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 15 ㎍/ml의 양으로 면역원을 포함하게 된다. 초기 면역 접종 후, 개체는 충분한 기간 후 한번 또는 몇번의 부스터 면역을 받을 수 있다.
이러한 조성물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 투여량)을 결정하기 위해 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약 과정을 통해 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이고, 이는 비율 LD50/ED50으로 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 비감염 세포에 대한 가능한 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물이 감염 부위를 표적하는 전달 시스템을 디자인하는데 주의가 요구된다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 정하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없는 ED50을 포함하는 계산 농도의 범위인 것이 바람직하다. 이러한 범위내에서 투여량은 이용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 변화할 수 있다. 본 출원에 개시된 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료적 유효 투여량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 세포 배양에서 결정한 바와 같이 IC50 (즉, 증상의 50% 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 투여량을 결정할 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 투여량을 정확히 결정하는데 사용할 수 있다. 혈장내 농도는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 측정할 수 있다.
전술한 바와 같이, 활성 화합물의 치료적 유효량(즉, 유효량)은 체중 kg 당 약 0.001 내지 100 g의 범위일 수 있거나, 과도한 실험이 없이 당업자에게 명백하거나 이해되는 다른 범위일 수 있다. 당업자라면 질병 또는 증상의 심각성, 예전의 치료, 개체의 일반 건강 상태 및 연령, 및 기타 존재하는 질병 등을 포함한 특정 인자들이 개체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예
본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 없이, 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 실험 기구, 장치, 방법 및 이의 관련 결과를 하기와 같이 제시한다. 제목 및 부제목이 독자의 편의를 위해 실시예에서 사용될 수 있는데, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 또한, 특정 이론이 본원에 제시 및 개시되지만, 본 발명이 임의의 특정 작용의 이론이나 계획에 상관없이 실시되는 경우, 이들 이론이 옮건 틀리건 상관없이 이들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: HA 발현을 위한 유전자 제작
인플루엔자 H5Nl HA 서열을 컨센서스 H5, CHA5(Chen MW, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:13538-13543)로부터 얻었다. CHA5의 코돈을 인간 코돈을 이용하여 발현에 최적화했다. 최초의 바이러스 프로테아제 절단 부위 PQRERRRKKRG를 PQRERG로 돌연변이시켜서 단백질이 효소 절단되어 HA I 및 HA2를 형성하는 것을 방지하도록 하였다. 막관통 영역(잔기: 533-555)을 HA 작제물의 C 말단에서 추가의 잔기(LVPRGSPGSGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWVLLSTFLG HHHHHH)로 치환했는데, 여기서, 트롬빈 절단 부위는 이탤릭체로 나타내고, 박테리오파지 T4 피브린 폴돈 삼합체화 서열은 밑줄로 나타내고, His-tag는 굵은 글씨로 나타낸다(Stevens J. et al. (2006) Science 312:404-410). 상기 변형된 HA 서열을 단백질 발현을 위한 pTT 벡터에 클로닝했다(Durocher Y, et al. (2002) Nucleic Acids Res 30:E9).
실시예 2: 단백질 발현 및 정제.
분비되는 HA를 암호화하는 플라스미드를 폴리에틸렌이민을 이용하여 HEK293EBNA(ATCC number CRL-10852) 또는 GnTI- HEK293S 세포(Reeves PJ, et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13419-13424)의 인간 배아 신장 세포주에 형질감염시키고 0.5% 우태혈청이 첨가된 Freestyle 293 발현 배지에서 배양했다. 그 상등액을 감염후 72시간에 수집하고 원심분리했다. HA 단백질들을 전술한 바와 같이 (Wei CJ, et al.(2008) J Virol 82:6200-6208) 니켈 킬레이트화 크로마토그래피로 정제하여 완전 글리코실화 HAfg 및 고-만노스 타입 HAhm를 얻었다. 시알릴화(탈시알릴화HAds)가 없는 HA를 얻기 위하여, 정제된 단백질을 20mM Clostridium 뉴라미니다제(NA; Sigma)로 2 시간 동안 37℃에서 처리했다. NA 처리 후, 그 단백질을 다시 정제하여 NA로부터 분리했다. 정제된 HAhm를 Endo H (NEB)로 2 시간 동안 37 ℃에서 처리하여, 글리코실화 부위에서 단일 GlcNAc를 갖는 HA 단백질(모노글리코실화HAmg)을 얻었다. 모든 정제된 HA 단백질을 SDS PAGE, 글리칸 어레이 및 질량 분광분석(MS)으로 분석했다.
실시예 3: MS 분석을 위한 당단백질로부터 N- 글리칸의 방출
정제된 HA 당단백질을 37℃에서 1 시간 동안 10mM 디티오트레이톨(DTT, Sigma)로 환원시켰다. 환원된 시료를 1 시간 동안 암실에서 50 mM 아이오도아세트아미드(IAA, Merck)로 알킬화한 다음, 2차 증류수(ddH20)로 탈염시키고 속도 진공 건조했다. 상기 환원 및 알킬화된 HA 단백질 추출물을 37℃에서 4 시간 동안 50mM 중탄산암모늄 pH 8.3에서 1:20(w/w)의 효소 대 단백질 비율로 트립신(Roche)으로 절단한 다음, 2차 트립신 절단하고, 역상 C18 Sep-Pak 카트리지(Waters Corp)에 로딩했다. 또한, 상기의 시료를 37℃에서 16 시간 동안 50mM 중탄산암모늄 pH 8.3에서 N-글리코시다제 F(Roche)와 함께 배양하고, N-글리코시다제 F와 함께 두 번 더 배양했다. 방출된 N-글리칸을 C 18 Sep-Pak 카트리지 과정을 통해 펩티드/글리코펩티드로부터 분리하면서 관통흐름 분획인 5% 아세트산(AcOH)에서 수집했다. 수득된 펩티드를 5% AcOH의 20%, 40% 및 60% 1-프로판올에서 용리시켰다.
실시예 4: MALDI - MS 및 MS / MS 분석
모든 글리칸 시료를 NaOH/디메틸 설폭사이드 슬러리 방법을 이용하여 과메틸화했다. 상기 NaOH/DMSO 슬러리를 스크류 캐핑된 유리 튜브에서 건조 글리칸 시료와 혼합하고 300㎕ 아이오도메탄(Merck)을 상기 튜브에 첨가하고, 그 튜브를 25 분간 부드럽게 볼텍싱(vortexing)했다. 약 1ml ddH20를 적가하여 반응을 멈추고, 동일 체적의 클로로포름을 첨가했다. 과메틸화된 글리칸을 바닥부 유기층에 추출하고, 추가의 NaOH 및 다른 친수성 오염물을 ddH20로 반복 추출하여 제거했다. 질소 가스로 클로로포름을 증발시켰다. 글리칸 프로파일링을 위하여, 아세토니트릴에 용해된 과메틸화 글리칸을 50% 아세토니트릴에서 10mg/ml의 2,5-디히드록시벤조산(DHB)과 1:1로 혼합하고, 가열 표적판에 스포팅하고, 아세토니트릴을 이용하여 재결정화했다. 데이터 수집은 리플렉트론(reflectron) 모드로 작동하는 ABI 4700Proteomics Analyzer(Applied Biosystems)상에서 수행했다. 레이저 샷(shot)(5 Hz; 스펙트럼당 10 shots)은 만족스러운 신호 대 잡음비가 달성될 때까지 수집되었다. TOF/TOF 기기상에서, 고에너지 CID MS/MS 데이터를 수동으로 획득하였고 5000내지 5500의 레이저 세팅에서 125개 레이저 샷의 전체 40개 서브 스펙트럼을 포함하였다.
실시예 5: 글리칸 마이크로어레이 제작
HA들에 대하여 디자인된 24개의 시알산 함유 글리칸을 화학적으로 제조하고 어레이 제작에 사용했다. 마이크로어레이를, 인쇄 완충액 (300mM 인산염 완충액, pH 8.5, 0.005% 함유 Tween 20)에서 여러 농도의 아민 함유 글리칸의 ~0.7 nL의 로보트 핀(SMP3; TeleChem International) 적층을 통해 384-웰 플레이트로부터 NHS-코팅 유리 슬라이드(Nexterion H slide; SCHOTT North America) 상에 인쇄(BioDot; Cartesian Technologies)했다. 시알로시드용 슬라이드를 100μM 농도의 글리칸 1-17 및 21-27의 용액으로 아래에서 위로 스파팅하면서 12개 복제물들을 수평으로 위치시키고, 각 슬라이드를 추가의 배양 실험을 위해 16 그리드마다 디자인했다. 인쇄된 슬라이드를 80% 습도 분위기에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 밤새 경사분리하고, 사용시까지 경사분리기에서 실온에서 저장했다. 결합 분석에 앞서, 상기 슬라이드를 에탄올아민(붕산염 완충액에서 50mM 에탄올아민, pH 9.2)으로 블로킹한 다음 물 및 PBS 완충액(pH 7.4)으로 2번 세척했다.
실시예 6: Cy3 - NHS 에스테르를 이용한 헤마글루티닌 표지
각각의 HA 단백질 시료를 PBS(pH=7.4)로 1 mg/mL의 최종 농도까지 희석한 다음, Cy3Mono NHS 에스테르(5㎕, 0.2 mg/ml) (GE Healthcare, UK)로 표지했다. 얼음위에서 18 시간 동안 반응시킨 후, PBS에 용해된 20㎕의 500 mM 글리신을 각 튜브에 첨가하여 반응을 멈추었다. 다음에, 상기 용액을 얼음 위에서 추가의 30분간 배양했다. 비반응성 염료 분자를 30kDa의 분자량 컷오프를 갖는 크기 배제 스핀 필터(Microcon YM-30, Millipore, USA)에 용액을 통과시켜서 제거했다. 염료/단백질의 비율을 얻기 위하여, 표지된 단백질의 각 시료를 PBS로 희석하고 280nm (단백질의 경우) 및 552nm (Cy3의 경우; 상기 파장에서 몰 흡광 계수는 150,000 M-1cm)에서 NanoDrop ND-IOO Spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 흡광도를 측정했다. 280nm에서의 CyDye의 흡광도의 계산값(552 nm에서의 흡광도의 약 8%)을 보정한 후, 이중-흡광도 측정의 결과로부터 염료/단백질의 비율을 얻었다.
실시예 7: 간접 결합 분석
HA 글리코실화 변이체를 0.005% Tween 20/PBS 완충액(pH 7.4)에서 제조하고 글리칸 어레이상의 그리드 상에 커버슬립으로 커버했다. 1 시간 동안 교반하면서 습윤 챔버에 정치한 후, 슬라이드를 0.005% Tween 20/PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척했다. 다음에, 토끼 항-H5N1 HA 항체를 상기 슬라이드에 첨가하고, 1 시간 동안 습윤 챔버에서 배양했다. 상기 슬라이드를 0.005% Tween 20/PBS 완충액으로 3회 세척한 후, Cy3-접합 염소 항-토끼 IgG 항체를 슬라이드에 첨가하고 습윤 챔버에서 1 시간 동안 배양했다. 상기 슬라이드를 0.05% Tween 20/PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회, PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회, H2O로 3회 세척한 다음 건조시켰다. 상기 슬라이드를 마이크로어레이 형광 칩 판독기(GenePix Pro 6.0; Molecular Devices)를 이용하여 595nm (Cy3의 경우)에서 스캐닝했다.
실시예 8: 직접 결합 분석
상이한 글리코실화를 갖는 Cy3-표지 HA 단백질을 0.005% Tween 20 IPBS 완충액(pH 7.4)에서 제조하고 글리칸 어레이 상의 그리드에 커버슬립을 덮었다. 1 시간 동안 교반하면서 습윤 챔버에서 배양한 후, 상기 슬라이드를 0.005% Tween 20/ PBS 완충액(pH 7.4)로 3회, PBS 완충액(pH 7.4)로 3회, H20로 3회 세척하고 건조시켰다. 상기 슬라이드를 마이크로어레이 형광 칩 판독기(GenePix Pro 6.0; Molecular Devices)를 이용하여 595nm(Cy3의 경우)에서 스캐닝했다.
실시예 9: 미세중화 분석
새로이 제조한 H5N1(NIBRG-14) 바이러스(National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, U.K.)를 중간 조직 감염성 투여량(TCID50)으로 정량했다. 96-웰 플레이트에서 100배 TCID50의 바이러스를 혈청 원액의 2배 연속 희석액과 동일 체적으로 혼합하고 37℃에서 1 시간 동안 배양했다. 상기의 혼합물을 플레이트 상의 MDCK 세포(1.5 x 104 세포/웰)에 첨가한 다음, 37℃에서 16 내지 20 시간 동안 배양했다. 그 세포를 PBS로 세척하고, 아세톤/메탄올 용액(vol/vol 1:1)에 고정시키고, 5% 탈지유로 블로킹했다. 인플루엔자 A NP를 이용한 간접 ELISA를 통해 바이러스 항원을 검출했다(Sui JH, et al. (2009) Nat Struct Mol Biol 16:265-273).
실시예 10: 마우스, 백신접종 및 주입
암컷의 6- 내지 8-주령의 BALB/c 마우스(n=15)를 50㎕의 PBS(pH 7.4)에 용해된 20㎍의 정제된 HAfg or HAmg로 근육내로 면역시키고, 50㎕의 1 mg/mL 수산화알루미늄(명반; Sigma)과 0주 및 2주에서 혼합했다. 면역 후 14일 후 혈액을 채취하고, 각 마우스로부터 혈청 시료를 수집했다. 면역시킨 마우스를 유전자 변형 H5N1 바이러스 NIBRG-14를 치사량(마우스의 50%에 대한 100배 치사량)으로 비내로 주입했다. 상기 마우스를 주입후 14일간 생존 여부에 대하여 매일 모니터링했다. 모든 실험 동물은 Academia Sinica의 국제 동물 보호 및 사용 위원회의 승인하에 평가했다.
실시예 11: 헤마글루티닌 ( HA ) 분석
다음문헌[Jones, et al., Journal of Virology, 80(24):11960-11967 (2006)]에 기재된 바와 같이 PBS에서 바이러스 시료의 2배 희석액을 제조하여 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 병아리 적혈구(cRBCs, Lampire Biological Laboratories, Pipersville, Pa.)의 헤마글루틴화를 수행한다. 역가는 50㎕(HAU/50 ㎕)의 시료당 헤마글루틴화 단위로 기록한다.
실시예 12: 바이러스 헤마글루티닌의 정제
비리온-연관 헤마글루티닌(HA)을 다음문헌[Johansson, et al., Journal of Virology, 1989, Vol. 63(3), p. 1239-1246]에 기재된 바와 같이 인플루엔자 바이러스 입자로부터 정제 및 변형했다. 간략히 말해서, 바이러스를 감염된 계란의 요막액으로부터 수집하고 전술한 바와 같이 수크로스 정제했다. 펠릿을 0.5mL의 아세트산나트륨 완충액(0.05 M 아세트산나트륨, 2 mM CaCl.sub.2, 0.2 mM EDTA, pH 7.0까지)에 재현탁하고, 18-게이지 니들을 통해 균질화하고, 아세트산 나트륨 완충액에서 동일 체적의 15% 옥틸글루코시드(octyl-β-d-티오글루코시드; Fisher Scientific, Norcross, Ga.)와 혼합한 다음, 5분간 강하게 볼텍싱했다. 이 현탁액을 4℃에서 60분간 18,400xg으로 원심분리하고, 그 상등액을 조심스럽게 제거하고 HA-풍부 분획으로 지정하였다. 2% 수용성 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB, Bio-World, Dublin, Ohio)를 0.1% CTAB의 최종 농도까지 상기 HA 분획에 첨가한다. 상기의 시료를, 미리 팽윤시키고 0.1% 옥틸글루코시드를 함유하는 0.05M Tris-히드로클로라이드(pH 7.5)로 평형시킨 DEAE-Sephadex(A-50; GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 이온 교환 칼럼(bed, 0.7 cm x 6.0 cm)에 가했다. 20 개의 0.5 mL의 분획들을 저염 HA 용리 완충액(0.05 M TrisHCl, 0.1 M NaCl, 0.1% Triton X-100, pH to 7.5) 및 이어서 고염 HA 용리 완충액 (0.05 M TrisHCl, 0.2 M NaCl, 0.1% Triton X-100, pH to 7.5)을 이용하여 중력에 의해 수집했다. 개별 분획에 대해 HA 활성을 평가하고, 비환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 이어서 콜로이드 쿠마시에 염색을 통해 순도를 분석한다. 단백질 농도는 제조사의 지시에 따라 BCA 분석(Pierce, Rockford, Ill.)으로 측정한다.
실시예 13: 어레이 데이터 분석
소프트웨어인 GenePix Pro (Axon Instruments)를 추출 데이터의 형광 분석에 사용했다. 국소적인 배경은 각 스팟의 신호로부터 감했다. 명백한 결함이 있는 스팟, 검출불가능한 신호 또는 100 미만의 순형광은 분석에서 제외했다. 복제 스팟으로부터의 "비율의 중간수"들을 동일 어레이에서 평균했다. 어레이에의 HA 결합의 프로파일링(도 2A) 및 회합 상수의 측정(도 2b)을 데이터가 표준화되도록 동일 어레이상에서 동일 조건하에서 수행했다.
KD , surf 값을 결정하기 위하여, 하나 이상의 독립적인 부위에 결합된 리간드를 가정하고, 상업적인 비선형 회귀 프로그램인 GradPad PRISM (Graph-Pad)를 이용하여 데이터를 랭뮤어 등온선(식 1)에 대입하여 평형 결합 데이터를 분석했다.
Fmax는 표면상의 활성 탄수화물의 양의 척도인 최대 형광 세기이고, (P)는 전체 HA 단백질 농도이고, KD , surf는 표면 탄수화물과 단백질 사이의 평형 해리 상수이다.
각 시료의 KD , surf 값은 최소한 4회 반복하여 계산하여 KD , surf의 평균을 구했다. KD , surf 값을 이용하여, 식 2 및 식 3으로부터 열역학적 파라미터를 도출할 수 있다.
Fobs = Fmax(P)/( KD , surf + (P)) (식 1)
KD , surf = KA , surf -1 (식 2)
△Gmulti = RT ln(KA , surf) (식 3)
KA , surf는 식 1에서 회합 상수를 나타낸다. 식 2에서, R= 1.987 cal mol-1 K-1; T는 절대 온도이고, 실험은 298K에서 수행되었다. 각 시료의 상기의 값들은 Microsoft Excel을 이용하여 계산되었다. 여러 가지 HA 단백당형에서 KD , surf 의 통계적 분석은 GraphPad PRISM (GraphPad)를 이용하여 일원배치 분산분삭(one-way ANOVA)으로 수행되었다.
실시예 14: ELISA 에 의한 HA -특이 항체의 측정
HA 단백질을 HEK293로부터 정제하고 96-웰 플레이트(5㎍/mL)상에 밤새 코팅했다. 마우스 혈청을 100배 희석하여 HA 결합의 측정에 사용했다. 상기 HA-코팅된 플레이트를 2배 희석액의 혈청과 1 시간 동안 배양했다. HRP-접합 항-마우스 항체를 이용하여 HA-특이 IgG를 검출했다. 판독치가 면역전 혈청의 1:50 희석액을 초과하는 희석을 선별함으로써 종말점 희석을 계산했다(Stevens J. et al. (2006) Science 312:404-410). 토끼 유래의 항혈청은 LTK BioLaboratories에 의해 제조되었다. 토끼를 완전 또는 불완전 아쥬반트와 혼합된 약 0.25~0.35 mg의 HA 단백질로 면역시켰다. 6 시간 면역 후 토끼로부터 혈액을 채취하고 2주마다 한 번 면역했다.
실시예 15: HA 에 대한 글리코실화 부위 분석
H1, H3 및 H5 인플루엔자 바이러스 유래의 전체 297개의 전길이 HA 서열을 "the National Center for Biotechnology Information database"로부터 입수하고 EMBL-EBI의 ClustalW2 프로그램을 이용하여 배열했다(Larkin MA, et al. (2007) Bioinformatics 23:2947-2948). 상기 서열들은 1918년 내지 2000년 까지의 것이고 인간으로부터 분리된 것이다. 중복을 감소시키기 위하여, 한 국가의 균주를 한번 선택하여 분석에 사용했다. 배열에 사용된 서열은 다음과 같다: H1 (AAX56530, AAY78939, ABA18037, ABB51962, ABC42750, ABD60867, ABD62061, ABE11690, ABF47869, ABF82830, ABF82852, ABG37362, ABI19015, ABI21211, ABI95294, ABI96103, ABK39995, ABK57092, ABK57093, ABK79970, ABO32948, ABO32970, ABR15885, ABS71664, and ABS76427); H3 (AAT08000, AAT12654, AAX11455, AAY58320, AAZ32943, AAZ43394, ABA26700, ABA26777, ABB51961, ABB71825, ABC42596, ABC42607, ABC42629, ABC43017, ABD15713, ABD59850, ABD61359, ABF17954, ABG37450, and ABG37461); H5 (AAS65618, AAT39065, AAT73273, AAT73274, AAT73275, AAT84153, AAV32636, ABC72655, ABD28180, ABD28182, ABE97624, ABI16504, ABI36144, ABI36439, ABO10181, ABO36644, 및 ABP51968). HA 서열의 N-결합 글리코실화는 생물학적 서열 분석 예측 서버 센터에 의해 예측되었다(www.cbs.dtu.dk/services/). 아스파라긴(Asn)의 글리코실화를 위하여, 상기 서열들은 아미노산 패턴 Asn-Xaa-(Ser/Thr)(여기서, Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)을 함유한 다음 세린 또는 트레오닌을 함유한다(Gavel Y, et al. (1990) Protein Eng 3:433-442). 데이터 분석의 결과는 PRISM 프로그램(GraphPad) 및 Jalview(Waterhouse AM, et al. (2009) Bioinformatics 25:1189-1191)를 이용하여 작성했다.
실시예 16: HA 글리코펩티드의 합성을 위한 화학적 방법
HA 글리코펩티드의 단계적 합성은 디메틸포스피노티오산 혼합 무수물(Mpt-MA) 방법을 통해 수행될 수 있다(Inazu, T., et al. (1997) in Peptide Chemistry 1996 (Kitada, C. ed.) pp.41-44, Protein Research Foundation, Osaka). HA 당단백질은 당 사슬이 없는 N-글리코실화의 경우 컨센서스 서열 "Asn-X-Ser/Thr"을 이용하여 티오에스테르 방법으로 합성될 수 있다. 펩티드 절편은 공급된 Boc-strategy 프로그램을 이용하여 자동 합성기를 통해 제조된다. 커플링 반응은 활성화 시약으로서 DCC/HOBt를 이용하여 수행된다. Asn(GlcNAc) 잔기는 Boc-Asn(GlcNAc)-OH(3 당량)를 이용하여 Mpt-MA 방법을 통해 커플링된다. 커플링 반응은 1 시간 동안 수행되고, 모니터링하면서 반복된다. 10% 애니솔을 함유하는 무수 HF로 처리하고 HPLC 정제한 후, 글리코펩티드 티오에스테르가 얻어진다. 글리코펩티드 티오에스테르 단편은 티오에스테르 단편 축합 방법에 의해 별도로 제조되는 또 다른 펩티드 단편과 커플링된다. 보호기 제거 및 디설파이드 결합 형성 후, GlcNAc-HA 유사체가 얻어진다.
이와는 달리, 펩티딜 Asn의 β-카르복시기를 글루코실아민과 커플링 반응시켜서 HA 글리코펩티드의 수렴적 방법 합성을 수행할 수 있다(See Cohen-Abisfeld, S.T., and Lansbury, P.T. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 10531-10537 참조)
실시예 17: HA 글리코펩티드의 합성을 위한 화학 효소적 방법
복합체 올리고당을 함유하는 글리코펩티드의 제조는 화학적 방법과 함께 효소적 방법을 이용하여 수행될 수 있다. N-글리코펩티드의 합성은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(엔도-β-GlcNAc-ase)의 트랜스글리코실화 활성을 이용하여 수행될 수 있다(Takegawa, K., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 3094-3099). Endo-β-GlcNAc-ase는 N-결합 올리고당의 N,N'-디아세틸키토비오스 부분 사이의 글리코시드 결합을 가수분해하고 방출된 올리고당 단편을 히드록시 화합물로 전달한다. 엔도-β-GlcNAc-ase를 이용한 N-글리코펩티드의 합성은 두 단계로 수행될 수 있다. 우선, GlcNAc-함유 펩티드를 화학적 경로를 통해 제조한다. 다음에, 글리코실 공여체의 올리고당 단편을 엔도-β-GlcNAc-ase의 트랜스글리코실화 반응을 통해 글리코실 수용체로서 글리코펩티드의 GlcNAc 부분에 전달한다.
본 발명의 특정 실시예들이 예시적인 방법으로 본 출원에 기재되었으나, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위에 의한 것을 제외하곤 제한되지 않는다.
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 상술한 상세한 설명은 예시적인 것으로서, 특허청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 다른 측면들, 이점 및 변경이 하기의 특허청구범위에 속한다.
본원에서 나타낸 특허 및 과학 문헌들은 당업자에게 이용가능한 이론을 확립한다. 본원에서 인용된 모든 미국 특허 및 공개 및 미공개 특허 출원은 참조로서 병함된다. 본원에서 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 참조로서 병합된다. 본 출원에서 인용된 수탁 번호로 나타낸 Genbank 및 NCBI 기탁물은 참조로서 병합된다. 본원에 인용된 다른 공개된 참조문헌, 서류, 원고 및 과학 문헌은 참조로서 병합된다.
본 발명은 상술한 바와 같은 바람직한 실시예들을 참조로 특별히 도시 및 설명되었으나, 당업자라면 특허청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 그 형태 및 사항의 여러 가지 변화가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST INFLUENZA <130> OPK-50101 <150> US 61/164,385 <151> 2009-03-27 <150> US 61/164,387 <151> 2009-03-28 <150> US 61/164,388 <151> 2009-03-28 <150> US 61/164,389 <151> 2009-03-28 <150> US 61/313,676 <151> 2010-03-12 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Pro Gln Arg Glu Arg Gly 1 5 <210> 3 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu 20 25 30 Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His 35 40 <210> 4 <211> 564 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Ser His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro 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gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac 300 cctgccaacg acctgtgcta ccctggcgac ttcaacgact acgaggagct gaagcacctg 360 ctgagcagaa tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ctaagagcag ctggagcagc 420 cacgaggcca gcagcggcgt gagcagcgcc tgcccttacc agggcaagag cagcttcttc 480 agaaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ctaccatcaa gagaagctac 540 aacaacacca accaggagga cctgctggtg ctgtggggca tccaccaccc taacgacgcc 600 gccgagcaga ccaagctgta ccagaaccct accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660 ctgaaccaga gactggtgcc taagatcgcc accagaagca aggtgaacgg ccagagcggc 720 agaatggagt tcttctggac catcctgaag cctaacgacg ccatcaactt cgagagcaac 780 ggcaacttca tcgcccctga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840 atgaagagcg agctggagta cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc tatgggcgcc 900 atcaacagca gcatgccttt ccacaacatc caccctctga ccatcggcga gtgccctaag 960 tacgtgaaga gcaacagact ggtgctggcc accggcctga gaaacagccc tcagagagag 1020 agaggcctgt tcggcgccat cgccggcttc atcgagggcg gctggcaggg catggtggac 1080 ggctggtacg gctaccacca cagcaacgag cagggcagcg gctacgccgc cgacaaggag 1140 agcacccaga aggccatcga cggcgtgacc aacaaggtga acagcatcat cgacaagatg 1200 aacacccagt tcgaggccgt gggcagagag ttcaacaacc tggagagaag aatcgagaac 1260 ctgaacaaga agatggagga cggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc cgagctgctg 1320 gtgctgatgg agaacgagag aaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac 1380 gacaaggtga gactgcagct gagagacaac gccaaggagc tgggcaacgg ctgcttcgag 1440 ttctaccaca agtgcgacaa cgagtgcatg gagagcgtga gaaacggcac ctacgactac 1500 cctcagtaca gcgaggaggc cagactgaag agagaggaga tcagcggcgt ggatatcaga 1560 tctctggtgc caagaggatc tccaggatct ggatacatcc cagaggctcc aagagatgga 1620 caagcttacg tgagaaagga cggagagtgg gtgctgctgt ctactttcct gggacaccac 1680 caccaccacc actaa 1695 <210> 6 <211> 567 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 6 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly 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aagcggatcg agaacctgaa caagaaggtg gacgacggct tcctggacat 1320 ctggacctac aacgccgagc tgctcgtgct gctggaaaac gagcggaccc tggactacca 1380 cgactccaac gtgaagaatc tgtacgagaa agttcgctcc cagctgaaga acaacgccaa 1440 agagatcggc aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacacct gtatggaaag 1500 cgtgaagaac ggcacctacg actaccccaa gtacagcgag gaagccaagc tgaaccggga 1560 agagatcgac ggcgtggata tcagatctct ggtgccaaga ggatctccag gatctggata 1620 catcccagag gctccaagag atggacaagc ttacgtgaga aaggacggag agtgggtgct 1680 gctgtctact ttcctgggac accaccacca ccaccactaa 1720 <210> 8 <211> 567 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 8 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser 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acaacaaaga gaaagaggtc ctcgtcctct ggggcgtgca ccaccccccc 600 aacatcggcg accagcgggc cctgtaccac accgagaacg cctacgtgtc cgtggtgtcc 660 agccactaca gcagacggtt cacccccgag atcgccaaga ggcccaaagt gcgggaccag 720 gaaggccgga tcaactacta ctggaccctg ctggaacccg gcgacaccat catcttcgag 780 gccaacggca acctgatcgc ccccagatac gcctttgccc tgagcagagg cttcggcagc 840 ggcatcatca ccagcaacgc ccccatggac gagtgcgacg ccaagtgtca gaccccccag 900 ggcgccatca acagcagcct gcccttccag aacgtgcacc ccgtgaccat cggcgagtgc 960 cctaagtacg tgcggagcac caagctgaga atggtgaccg gcctgcggaa catccccagc 1020 atccagagca gaggcctgtt tggcgccatt gccggcttta tcgagggcgg ctggaccgga 1080 atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac cagaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc 1140 gatcagaagt ccacccagaa cgctatcaac ggcatcacca acaaagtgaa cagcgtgatc 1200 gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaagagt tcaacaagct ggaacggcgg 1260 atggaaaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320 gagctgctgg tcctgctgga aaacgagcgg accctggact tccacgacag caacgtgaag 1380 aacctgtacg agaaagtgaa 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Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Asp Ile Arg Ser Leu Val Pro Arg 515 520 525 Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 530 535 540 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 545 550 555 560 Gly His His His His His His 565 <210> 11 <211> 1704 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 11 atgaaggtga aactgctggt gctgctgtgc accttcaccg ccacctacgc cgacaccatc 60 tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg ataccgtgct ggaaaagaac 120 gtgaccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaagatagcc acaacggcaa gctgtgcctg 180 ctgaagggca ttgcccccct gcagctgggc aactgtagcg tggccggctg gattctgggc 240 aaccccgagt gcgagctgct gatctccaaa gagtcctggt cttacatcgt ggagacaccc 300 aaccccgaga acggcacctg ttaccccggc cacttcgccg actacgagga actgcgggag 360 cagctgagca gcgtgtccag cttcgagcgg ttcgagatct tccccaaaga gagcagctgg 420 cccaaccacg ataccgtgac cggcgtgagc gccagctgtt cccacaacgg cgagagcagc 480 ttctaccgga acctgctgtg gctgaccggc aagaacggcc tgtaccccaa cctgagcaag 540 agctatgcca acaacaaaga gaaggaagtc ctggtcctct ggggcgtgca ccaccccccc 600 aacatcggcg accagaaggc cctgtaccac accgagaacg cctacgtgtc cgtggtgtcc 660 agccactaca gccggaagtt cacccccgag atcgccaaga ggcccaaagt gcgggaccag 720 gaaggccgga tcaactacta ctggaccctg ctggaacccg gcgacaccat catcttcgag 780 gccaacggca acctgatcgc ccccagatac gcctttgccc tgagcagagg cttcggcagc 840 ggcatcatca acagcaacgc ccccatggac aagtgcgacg ccaagtgcca gacaccccag 900 ggcgccatca acagctccct gcccttccag aacgtgcacc ccgtgaccat cggcgagtgc 960 cctaagtacg tgcggagcgc caagctgaga atggtgaccg gcctgcggaa catccccagc 1020 atccagagca gaggcctgtt tggcgccatt gccggcttta tcgagggcgg ctggaccgga 1080 atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac cagaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc 1140 gatcagaagt ccacccagaa cgccatcaac ggcatcacca acaaagtgaa cagcgtgatc 1200 gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaagagt tcaacaagct ggaacggcgg 1260 atggaaaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320 gagctgctgg tgctgctgga aaacgagcgg accctggact tccacgacag caacgtgaag 1380 aacctgtacg agaaagtgaa gtcccagctg aagaacaacg ccaaagagat cggcaacggc 1440 tgcttcgagt tctaccacaa gtgcaacgac gagtgcatgg aaagcgtgaa gaacggcaca 1500 tacgactacc ccaagtacag cgaggaaagc aagctgaacc gggagaagat cgacggcgtg 1560 gatatcagat ctctggtgcc aagaggatct ccaggatctg gatacatccc agaggctcca 1620 agagatggac aagcttacgt gagaaaggac ggagagtggg tgctgctgtc tactttcctg 1680 ggacaccacc accaccacca ctaa 1704 <210> 12 <211> 298 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 12 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Thr Lys Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Thr Thr Ser Gln Thr Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Ser Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Lys Ile Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Ile 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Lys Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Arg Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Glu His Thr Ser Gln Lys Gly Thr Leu His Ser Thr Ser Ser Asp Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Tyr Thr Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gln 275 280 285 Pro Pro Ser Pro Ser Asn Thr Thr Asn Gln 290 295 <210> 13 <211> 495 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 13 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Met Ser Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys 385 390 395 400 Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly 405 410 415 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Ala Phe Thr Ser Val 420 425 430 Gly Lys Leu Val His Gln Val Phe Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe 435 440 445 Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly Ile Leu Leu Thr 450 455 460 Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Met Thr Cys Ile 465 470 475 480 Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Val Val Gln Ala 485 490 495 <210> 14 <211> 192 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 14 Ala Glu Val Lys Asn Ile Ser Thr Gly Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Thr Asn Asp Ser Ile Thr Trp Gln Leu Gln Ala Ala Val Leu His Val 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Glu Lys Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp 35 40 45 Ile Pro Val Ser Pro Asn Val Ala Val Gln Gln Pro Gly Ala Leu Thr 50 55 60 Gln Gly Leu Arg Thr His Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala 85 90 95 Ala Gln Met Phe Ile Val Ser Pro Gln His His Trp Phe Val Gln Asp 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala 130 135 140 Tyr Ala Met Arg Val Pro Glu Val Ile Ile Asp Ile Ile Gly Gly Ala 145 150 155 160 His Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gln Gly Ala 165 170 175 Trp Ala Lys Val Val Val Ile Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala 180 185 190 <210> 15 <211> 478 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 15 Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr 1 5 10 15 Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val 20 25 30 His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro 35 40 45 Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys 50 55 60 Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp 65 70 75 80 Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu 85 90 95 Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser Gly 100 105 110 Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile 115 120 125 Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr 130 135 140 Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys Leu 145 150 155 160 Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser 165 170 175 Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile 180 185 190 Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn 195 200 205 Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr 210 215 220 Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg 225 230 235 240 Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn 245 250 255 Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys 260 265 270 Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly 275 280 285 Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys 290 295 300 Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe 305 310 315 320 Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro 325 330 335 Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys 340 345 350 Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser 355 360 365 Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro 370 375 380 Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala 385 390 395 400 Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile 405 410 415 Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser 420 425 430 Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser 435 440 445 Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 450 455 460 Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 465 470 475

Claims (86)

  1. H1, H3 및 H5로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 균주에서 유래한 부분적으로 글리코실화된 헤마글루티닌(HA) 또는 이의 절편을 포함하며,
    상기 부분적으로 글리코실화된 HA 또는 이의 절편은 글리칸이 결합된 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고,
    상기 글리칸은 하나, 둘 또는 세 개의 당 단위체로 이루어지는, 면역반응을 일으키기 위한 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA는 일 이상의 화학적 또는 효소적 방법들을 사용하는 천연 발생 대응물의 부분 탈글리코실화(deglycosylation)에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA 또는 이의 절편의 상기 적어도 하나의 글리코실화 부위는, 아스파라긴-Xaa-세린 또는 아스파라긴-Xaa-트레오닌의 아미노산 서열을 포함하는 N-글리코실화 부위이고,
    Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리칸 내의 상기 하나, 둘 또는 세 개의 당 단위체는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 만노오스 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA 또는 이의 절편의 상기 적어도 하나의 글리코실화된 부위와 결합된 상기 글리칸은 하나의 당 단위체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나의 당 단위체는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
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  8. 제1항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA 또는 이의 절편의 상기 적어도 하나의 글리코실화된 부위는 서열번호 10의 177 위치에서의 아스파라긴 잔기에 위치하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 4에서 제시된 부분적으로 글리코실화된 컨센서스 H5 HA 서열은, 서열번호 4에서 39, 127, 170, 181, 302, 495 및 500 중 하나 이상의 위치의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA는 진핵 세포 및 이로부터의 분비물 내에서 발현을 가능케 하는 야생형 대응물 내의 트랜스멤브레인 영역의 치환에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA는 계절 H1 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 균주는 조류 인플루엔자 바이러스 균주 또는 인간 인플루엔자 바이러스 균주인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스 균주는 H5N1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  16. 보조제; 및
    H1, H3 및 H5로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 균주에서 유래한 부분적으로 글리코실화된 헤마글루티닌(HA) 또는 이의 절편을 포함하며,
    상기 부분적으로 글리코실화된 HA 또는 이의 절편은 글리칸이 결합된 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고,
    상기 글리칸은 하나, 둘 또는 세 개의 당 단위체로 이루어지는, 바이러스 감염에 대한 포유동물의 면역화를 위한 면역원성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 비경구 투여, 비강내 투여 또는 흡입을 위해 제형된 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 예방적 용도인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 부분적으로 글리코실화된 HA는 서열번호 4, 6, 8 및 10으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  20. 제16항에 있어서, 상기 글리칸은 하나의 당 단위체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나의 당 단위체는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  22. 제16항에 있어서, 상기 글리칸 내의 상기 하나, 둘 또는 세 개의 당 단위체는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 만노오스 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
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