TWI458492B

TWI458492B - 雙重專一性之抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體

Info

Publication number: TWI458492B
Application number: TW102101832A
Authority: TW
Inventors: Monika Baehner; Ulrich Brinkmann; Guy Georges; Remko Albert Griep; Sabine Imhof-Jung; Anita Kavlie; Hubert Kettenberger; Christian Klein; Joerg Thomas Regula; Wolfgang Schaefer; Juergen Michael Schanzer; Werner Scheuer; Stefan Seeber; Markus Thomas
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2014-11-01
Also published as: BRPI0919663A2; PL2344537T3; AU2009301431A1; MA32712B1; AU2009301431B8; US20210047394A1; WO2010040508A1; CY1115030T1; MX2011003190A; MY178926A; US8703130B2; DK2344537T3; CN102753577B; EP2781526A1; KR101345522B1; RU2011117410A; JP5368570B2; US8268314B2; RU2640253C2; PE20110425A1

Description

雙重專一性之抗-VEGF/抗-ANG-2抗體

本發明係關於針對人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)及針對人類血管生成素-2(ANG-2)之雙重專一性抗體、其製造方法、含有該等抗體之醫藥組合物，及其用途。

血管生成與多種病症之發病機制有關，該等病症包括實體腫瘤、眼內新生血管症候群(諸如增殖性視網膜病變或年齡相關之黃斑部變性(AMD))、類風濕性關節炎及牛皮癬(Folkman,J.等人，J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun,M.等人，Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239；及Garner,A.,Vascular diseases,Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.及Klintworth,G.K.(編)，第2版，Marcel Dekker,New York(1994)，第1625-1710頁)。在實體腫瘤之狀況下，相較於正常細胞而言，新血管生成允許腫瘤細胞獲得生長優勢及增殖自主性。因此，在乳癌以及若干種其他腫瘤之腫瘤切片之微血管密度與患者存活率之間觀測到相關性(Weidner,N.等人，N Engl J Med.324(1991)1-8；Horak,E.R.等人，Lancet 340(1992)1120-1124；及Macchiarini,P.等人，Lancet 340(1992)145-146)。

VEGF及抗VEGF抗體

人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No：105)描述於例如以下之文獻中：Leung,D.W.等人，Science 246(1989)1306-9；Keck,P.J.等人，Science 246(1989)1309-12；及Connolly,D.T.等人，J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF涉及於調節與腫瘤及眼內病症相關之正常及異常血管生成及新血管生成(Ferrara,N.等人，Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.等人，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.等人，Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.等人，Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.等人，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；及Dvorak,H.等人，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF為自若干來源分離得到之同型二聚醣蛋白。VEGF對內皮細胞顯示高度專一的促有絲分裂活性。VEGF在胚胎血管發生期間之新血管形成中及成年期間之血管生成中具有重要調節功能(Carmeliet,P.等人，Nature,380(1996)435-439；Ferrara,N.等人，Nature,380(1996)439-442；綜述於Ferrara及Davis-Smyth,Endocrine Rev.,18(1997)4-25中)。已在顯示單個VEGF等位基因失活導致胚胎由於不能形成維管結構而死亡的研究中證明VEGF所起之作用的重要性(Carmeliet,P.等人，Nature,380(1996)435-439；Ferrara,N.等人，Nature,380(1996)439-442)。此外，VEGF對單核細胞具有強趨化活性，可在內皮細胞中誘導出纖維蛋白溶酶原活化子及纖維蛋白溶酶原活化抑制子，且亦可誘導微血管滲透性。因為誘導微血管滲透性之活性，其有時稱為血管滲透因子(VPF)。對VEGF之分離及特性已有綜述；參見Ferrara,N.等人，J.Cellular Biochem.,47(1991)211-218及Connolly,J.Cellular Biochem.,47(1991)219-223。單個VEGF基因之替代mRNA剪接產生VEGF之5種同功異型物。

抗VEGF中和抗體在小鼠中抑制各種人類腫瘤細胞株之生長(Kim,I.等人，Nature 362(1993)841-844；Warren,S.R.等人，J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797；Borgstrom,P.等人，Cancer Res.56 (1996)4032-4039；及Melnyk,O.等人，Cancer Res.56(1996)921-924)。WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900及WO 00/35956涉及針對VEGF之抗體。人類化單株抗體貝伐單抗(bevacizumab)(以商標名Avastin®出售)為腫瘤治療中所用之一種抗VEGF抗體(WO 98/45331)。

蘭尼單抗(Ranibizumab)(商標名Lucentis®)為一種源自與貝伐單抗(Avastin)相同之親本鼠類抗體的單株抗體片段。其比親本分子小得多且已經親和力成熟而提供與VEGF-A之較強結合(WO 98/45331)。其為一種已獲准用於治療「濕」型年齡相關之黃斑部變性(ARMD)的抗血管生成劑，濕型ARMD為年齡相關之視力損失的常見形式。另一抗VEGF抗體例如為例如US 2007/0141065中所述之HuMab G6-31。

ANG-2及抗ANG-2抗體

人類血管生成素-2(ANG-2)(或者縮寫為ANGPT2或ANG2)(SEQ ID No：106)已描述於Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60及Cheung,A.H.等人，Genomics 48(1998)389-91中。已發現血管生成素-1及-2(ANG-1(SEQ ID No：107)及ANG-2(SEQ ID No：106))為Tie之配位體，Tie為選擇性表現於血管內皮中之酪胺酸激酶家族。Yancopoulos,G.D.等人，Nature 407(2000)242-48。對於血管生成素家族目前存在四個確定的成員。血管生成素-3及-4(Ang-3及Ang-4)可為小鼠及人類中相同基因座上有很大差異之對應物。Kim,I.等人，FEBS Let,443(1999)353-56；Kim,I.等人，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1及ANG-2最初在組織培養實驗中分別被識別為促效劑及拮抗劑(關於ANG-1，參見：Davis,S.等人，Cell 87(1996)1161-69；且關於ANG-2，參見：Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60)。所有已知血管生成素主要結合於Tie2，且Ang-1及-2皆以3 nM(Kd)親和力結合於Tie2。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277 (1997)55-60。已顯示Ang-1支持EC存活且促進內皮完整性，Davis,S.等人，Cell 87(1996)1161-69；Kwak,H.J.等人，FEBS Lett 448(1999)249-53；Suri,C.等人，Science 282(1998)468-71；Thurston,G.等人，Science 286(1999)2511-14；Thurston,G.等人，Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反作用且在無存活因子VEGF或基本纖維母細胞生長因子時促使血管不穩定及退化。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。然而，對於ANG-2功能之許多研究已表明更複雜之情形。ANG-2可能為複雜的血管重塑調節子，其在血管芽生(vessel sprouting)與血管退化方面皆起一定作用。證實ANG-2之該等作用的表現分析揭示在成人芽生式血管生成背景下ANG-2與VEGF一起被迅速誘導，而在血管退化背景下ANG-2在無VEGF時被誘導。Holash,J.等人，Science 284(1999)1994-98；Holash,J.等人，Oncogene 18(1999)5356-62。與環境依賴性作用一致，ANG-2專一地結合於可由Ang-1活化之相同內皮專一性受體Tie-2，但對其活化具有環境依賴性效應。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。

角膜血管生成檢定已顯示ANG-1與ANG-2皆具有類似效應，與VEGF協同地起作用以促進新血管之生長。Asahara,T.等人，Circ.Res.83(1998)233-40。藉由在活體外於高濃度下觀測來提高存在劑量依賴性內皮反應之可能性，ANG-2亦可為促血管生成的。Kim,I.等人，Oncogene 19(2000)4549-52。在高濃度下，ANG-2在血清剝奪細胞凋亡期間藉由經由PI-3激酶及Akt路徑活化Tie2來充當內皮細胞之細胞凋亡存活因子。Kim,I.等人，Oncogene 19(2000)4549-52。

其他活體外實驗表明在持續暴露期間，ANG-2之作用可自Tie2之拮抗劑逐漸變為Tie2之促效劑，且在隨後的時間點，其可能直接促成血管形成及新生血管穩定化。Teichert-Kuliszewska,K.等人， Cardiovasc.Res.49(200I)659-70。此外，若將EC培養於纖維蛋白凝膠上，則亦觀測到Tie2經ANG-2活化，此或許表明ANG-2之作用可能取決於EC分化狀態。Teichert-Kuliszewska,K.等人，Cardiovasc.Res.49(2001)659-70。在培養於三維膠原蛋白凝膠中之微血管EC中，ANG-2亦可誘導Tie2活化且促進毛細管狀結構形成。Mochizuki,Y.等人，J.Cell.Sci.115(2002)175-83。利用3-D球型共培養作為血管成熟之活體外模型已證明EC與間葉細胞之間的直接接觸會消除對VEGF之反應性，而VEGF及ANG-2之存在誘導芽生。Korff,T.等人，Faseb J.15(2001)447-57。Etoh,T.H.等人證明ANG-2在VEGF存在下高度上調組成性表現Tie2之EC，亦即MMP-1、-9及u-PA之表現。Etoh,T.等人，Cancer Res.61(2001)2145-53。使用活體內瞳孔膜模型，Lobov,I.B.等人顯示ANG-2在內源性VEGF存在下促進毛細管直徑迅速增加、基底層重塑、內皮細胞增殖及遷移，且刺激新血管芽生。Lobov,I.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。相比之下，ANG-2在無內源性VEGF之狀況下促進內皮細胞死亡及血管退化。Lobov,I.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。類似地，使用活體內腫瘤模型，Vajkoczy,P.等人證明多細胞聚集體經由由宿主及腫瘤內皮同時表現VEGFR-2及ANG-2以芽生式血管生成方式開始血管生長。Vajkoczy,P.等人，J.Clin.Invest.109(2002)777-85。此模型說明生長中的腫瘤之已建立微維管結構的特徵為假定由VEGF及ANG-2之表現介導的連續重塑。Vajkoczy,P.等人，J Clin.Invest.09(2002)777-85。

Tie-2及血管生成素-1之基因剔除小鼠研究顯示類似表型且表明經血管生成素-1刺激之Tie-2磷酸化介導發育中的血管之重塑及穩定化，從而在血管生成期間促進血管成熟及維持內皮細胞支持細胞黏附(Dumont,J.等人，Genes & Development,8(1994)1897-1909；Sato, T.N.,Nature,376(1995)70-74；Thurston,G.等人，Nature Medicine：6(2000)460-463)。吾人認為血管生成素-1之作用在廣泛且組成性地表現血管生成素-1之成人體內被保留(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50；Zagzag,D.等人，Exp Neurology,159：391-400(1999))。相比之下，血管生成素-2表現主要限於血管重塑部位，吾人認為其於此處阻斷血管生成素-1之組成性穩定化或成熟功能，從而使血管恢復至並保持可能對芽生信號更具反應性之塑性狀態(Hanahan,D.,1997；Holash,J.等人，Orzcogerze 18(199)5356-62；Maisonpierre,P.C.,1997)。對病理性血管生成中血管生成素-2表現之研究已發現許多腫瘤類型顯示血管的血管生成素-2表現(Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60)。在小鼠異種移植模型中，功能性研究表明血管生成素-2涉及於腫瘤血管生成中且將血管生成素-2過表現與增加之腫瘤生長相聯繫(Ahmad,S.A.等人，Cancer Res.,61(2001)1255-1259)。其他研究已將血管生成素-2過表現與腫瘤高血管性(hypervascularity)相聯繫(Etoh,T.等人，Cancer Res.61(2001)2145-53；Tanaka,F.等人，Cancer Res.62(2002)124-29)。

近年來，已提出血管生成素-1、血管生成素-2及/或Tie-2為可能的抗癌治療標靶。舉例而言，US 6,166,185、US 5,650,490及US 5,814,464各自揭示抗Tie-2配位體及受體抗體。已有研究報導，使用可溶性Tie-2可降低齧齒動物體內腫瘤之數目及尺寸(Lin,1997；Lin 1998)。Siemester,G.等人，Siemeister,G.等人，Cancer Res.59(1999)3185-91產生表現Tie-2之胞外域的人類黑素瘤細胞株，將此等細胞株注射至裸小鼠中且報導可溶性Tie-2對腫瘤生長及腫瘤血管生成產生顯著抑制。假定血管生成素-1及血管生成素-2皆結合於Tie-2，根據此等研究，尚不能肯定血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否將為抗癌療法之具吸引力的標靶。然而，吾人認為有效的抗血管生成素-2療法可有益於治療諸如癌症之疾病，在該等疾病中進展取決於異常血管生成，其中阻斷該過程可防止疾病發展(Follunan,J.,Nature Medicine.1(1995)27-31)。

此外，一些團體已報導使用結合於血管生成素-2之抗體及肽。例如參見US 6 166,185及US 2003/10124129。WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134或US 2006/0122370。

對局部表現血管生成素-2之作用的研究已顯示拮抗血管生成素-1/Tie-2信號使緻密血管結構變鬆，從而使EC暴露於來自血管生成誘導子(例如VEGF)之活化信號(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50)。此由抑制血管生成素-1產生之促血管生成效應表明抗血管生成素-1療法將不為有效的抗癌治療。

ANG-2在發育期間表現於發生血管重塑之部位處。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。在成年個體中，ANG-2表現侷限於血管重塑部位以及高度血管化腫瘤內，該等腫瘤包括神經膠質瘤(Osada,H.等人，Int.J.Oncol.18(2001)305-09；Koga,K.等人，Cancer Res.61(2001)6248-54)、肝細胞癌(Tanaka,S.等人，J.Clin.Invest.103(1999)341-45)、胃癌(Etoh,T.等人，Cancer Res.61(2001)2145-53；Lee,J.H.等人，Int.J.Oncol.18(2001)355-61)、甲狀腺瘤(Bunone,G.等人，Am J Pathol 155(1999)1967-76)、非小細胞肺癌(Wong,M.P.等人，Lung Cancer 29(2000)11-22)以及結腸癌(Ahmad,S.A.等人，Cancer 92(2001)1138-43)，及前列腺癌(Wurmbach,J.H.等人，Anticancer Res.20(2000)5217-20)。發現一些腫瘤細胞表現ANG-2。舉例而言，Tanaka,S.等人，J.Clin.Invest.103(1999)341-45在12份人類肝細胞癌(HCC)試樣中之10份中偵測到ANG-2 mRNA。Ellis團體報導ANG-2普遍表現於腫瘤上皮中。Ahmad,S.A.等人，Cancer 92(2001)1138-43。其他研究者報導有類似發現。Chen,L.等人，J.Tongji Med.Univ.21(2001)228-35。藉由偵測歸檔人類乳癌試樣中之ANG-2 mRNA含量，Sfiligoi,C.等人，Int.J.Cancer 103(2003)466-74報導ANG-2 mRNA與附屬淋巴結入侵、無疾病時間短及整體存活不良顯著相關。Tanaka,F.等人，Cancer Res.62(2002)7124-29對總計236名分別處於病理階段I至IIIA之非小細胞肺癌(NSCLC)患者進行檢查。使用免疫組織化學，其發現16.9% NSCLC患者呈ANG-2陽性。ANG-2陽性腫瘤之微血管密度顯著高於ANG-2陰性腫瘤之微血管密度。ANG-2之該類血管生成作用僅在VEGF表現較高時可見。此外，ANG-2之陽性表現為預測不良手術後存活之重要因子。Tanaka,F.等人，Cancer Res.62(2002)7124-29。然而，其發現Ang-1表現與微血管密度之間無顯著相關性。Tanaka,F.等人，Cancer Res.62(2002)7124-29。此等結果表明ANG-2為具有若干種癌症之患者不良預後的指標。

最近，使用ANG-2基因剔除小鼠模型，Yancopoulos團體報導後天血管生成需要ANG-2。Gale,N.W.等人，Dev.Cell 3(2002)411-23。其顯示在ANG-2基因剔除小鼠中未出現眼睛中玻璃樣維管結構之發育漸進式退化，且其視網膜血管未能自視網膜中央動脈出芽。Gale,N.W.等人，Dev.Cell 3(2002)411-23。其亦發現缺失ANG-2導致在淋巴維管結構之模式化及功能方面產生重大缺陷。Gale,N.W.等人，Dev.Cell 3(200)411-23。Ang-1之遺傳拯救校正淋巴缺陷，但不能校正血管生成缺陷。Gale,N.W.等人，Dev.Cell 3(2002)411-23。

Peters及其同事報導可溶性Tie2當以重組蛋白或在病毒表現載體中之形式傳遞時抑制小鼠模型中鼠類乳腺癌及黑素瘤之活體內生長。Lin,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)8829-34；Lin,P.等人，J.Clin.Invest.100(1997)2072-78。經如此處理之腫瘤組織的血管密度大大降低。此外，可溶性Tie2阻斷大鼠角膜中由腫瘤細胞條件培養基刺激之血管生成。Lin,P.等人，J.Clin.Invest.100(1997)2072-78。此外，Isner及其團隊證明向VEGF添加ANG-2促進比單獨之VEGF明顯較長且較多之周圍新生血管形成。Asahara,T.等人，Circ.Res.83(1998)233-40。過量可溶性Tie2受體阻止ANG-2對VEGF誘導之新血管生成的調節。Asahara,T.等人，Circ.Res.83(1998)233-40。Siemeister,G.等人，Cancer Res.59(1999)3185-91使用裸小鼠異種移植物證實，Flt-1抑或Tie2之胞外配位體結合域在異種移植物中過表現導致不能由另一者補償之路徑受到顯著抑制，此表明VEGF受體路徑及Tie2路徑應視作為活體內血管生成過程所必需之兩個獨立介體。Siemeister,G.等人，Cancer Res.59：3(1999)3185-91。此係由最新發表之White,R.,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)5028-33證實。在其研究中展示，在大鼠角膜微囊袋血管生成模型中，專一地結合且抑制ANG-2之核酸酶抗性RNA適體顯著抑制由bFGF誘導之新血管生成。

雙重專一性抗體

近期已開發出多種重組抗體形式，例如藉由融合例如IgG抗體形式與單鏈結構域產生之四價雙重專一性抗體(例如參見Coloma,M.J.等人，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；及Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。

亦已開發出不再保留抗體核心結構(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)且能夠結合兩個或兩個以上抗原之若干其他新型形式，諸如雙功能抗體、三功能或四功能抗體、微型抗體、若干單鏈形式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.等人，Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人，Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74；Wu,C.等人，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

所有該等形式使用連接子來融合抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白(例如scFv)或融合例如兩個Fab片段或scFv(Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。必須記住的是，可能需要藉由保持與天然存在之抗體高度的相似性來保留可經由Fc受體結合介導之效應功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

在WO 2007/024715中報導了作為經工程改造之多價及多重專一性結合蛋白之雙重可變域免疫球蛋白。在US 6,897,044中報導了一種製備生物活性抗體二聚體之方法。在US 7,129,330中報導了具有至少四個經肽連接子彼此連接之可變域的多價F_V 抗體構築體。在US 2005/0079170中報導了二聚及多聚抗原結合結構。在US 6,511,663中報導了包含三個或四個藉由一連接結構彼此共價結合之Fab片段的三價或四價單專一性抗原結合蛋白，該蛋白不為天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導了四價雙重專一性抗體，其可有效地表現於原核及真核細胞中且適用於治療及診斷方法。在US 2005/0163782中報導了一種自包含未經至少一個鏈間雙硫鍵連接之二聚體與經至少一個鏈間雙硫鍵連接之二聚體的混合物使該兩類多肽二聚體彼此分離或優先合成經至少一個鏈間雙硫鍵連接之二聚體的方法。在US 5,959,083中報導了雙重專一性四價受體。在WO 2001/077342中報導了具有三個或三個以上功能抗原結合位點之經工程改造之抗體。

在WO 1997/001580中報導了多重專一性及多價抗原結合多肽。WO 1992/004053報導了通常由結合於相同抗原決定子的IgG類單株抗體製備之共軛對配合物(homoconjugate)，其係藉由合成交聯共價連接。在WO 1991/06305中報導了對抗原具有高親和力之寡聚單株抗體，其中分泌出通常為IgG類之寡聚物，其具有兩個或兩個以上締合在一起之免疫球蛋白單體以形成四價或六價IgG分子。在US 6,350,860中報導了綿羊源性抗體及經工程改造之抗體構築體，其可用於治療干擾素γ活性病原性疾病。在US 2005/0100543中報導了作為雙重專一性抗體之多價載體的可靶向之構築體，亦即可靶向之構築體之各分子可充當兩個或兩個以上雙重專一性抗體之載體。WO 1995/009917報導了經遺傳工程改造之雙重專一性四價抗體。WO 2007/109254報導了由穩定scFv組成或包含穩定scFv之穩定結合分子。

VEGF與ANG-2抑制劑之組合

WO 2007/068895涉及ANG-2拮抗劑與VEGF、KDR及/或FLTL拮抗劑之組合。WO 2007/089445涉及ANG-2與VEGF抑制劑之組合。

本發明之第一態樣為一種雙重專一性抗體，其專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)且包含專一地結合人類VEGF之第一抗原結合位點及專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：i)該等抗原結合位點各為一對抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域；ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：94之CDR3區；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：95之CDR2區；及SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：96之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：97之CDR3區；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：98之CDR2區；及 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：99之CDR1區：iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2區；及SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：28、具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89之CDR3區；SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：i)該等抗原結合位點各為一對抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域；ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區；或該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區；或該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：28或具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：i)該等抗原結合位點各為一對抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域；ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：100作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：101作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：32、具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：94之CDR3區、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：95之CDR2區及SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：96之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：97之CDR3區、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：98之CDR2區及SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：99之CDR1區；iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2區；及SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO： 89之CDR3區；SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：100作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2區；及SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89之CDR3區；SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：46之CDR3區、SEQ ID NO：47之CDR2區及SEQ ID NO：48之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51 之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：52作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：53作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：94之CDR3區、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：95之CDR2區及SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：96之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：97之CDR3區、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：98之CDR2區及SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：99之CDR1區；iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：86之CDR3區、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：87之CDR2區及SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：89之CDR3區、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：90之CDR2區及SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：100作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8或 SEQ ID NO：101作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區；iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：62之CDR3區、SEQ ID NO：63之CDR2區及SEQ ID NO：64之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：65之CDR3區、SEQ ID NO：66之CDR2區及SEQ ID NO：67之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：68作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：69作為輕鏈可變域。

該等雙重專一性抗體至少為二價且可為三價、四價或多價。本發明之雙重專一性抗體較佳為二價、三價或四價。

本發明之另一態樣為一種編碼該雙重專一性抗體之一條鏈的核酸分子。

本發明進一步提供含有本發明之該核酸且能夠在原核或真核宿主細胞中表現該核酸的表現載體，及含有該等載體以用於重組產生本發明抗體之宿主細胞。

本發明進一步包含一種原核或真核宿主細胞，該細胞包含本發明之載體。

本發明進一步包含一種產生本發明之雙重專一性抗體之方法，其特徵在於：在原核或真核宿主細胞中表現本發明之核酸，且自該細胞或細胞培養物上清液回收該雙重專一性抗體。本發明進一步包含藉由該類重組方法獲得之抗體。

本發明之其他態樣為一種包含該雙重專一性抗體之醫藥組合物、用於治療癌症之該組合物、該雙重專一性抗體用於製造用以治療癌症之藥物的用途、一種藉由向罹患癌症之患者投與該雙重專一性抗體來治療該需要治療之患者的方法。

對於需要VEGF及ANG-2靶向療法之人類患者，本發明之雙重專一性抗體顯示益處。本發明抗體具有對罹患該類疾病、尤其罹患癌症之患者產生益處的新穎及發明性特性。令人驚奇的是，已發現本發明之雙重專一性抗體在腫瘤生長及/或腫瘤血管生成抑制方面比各別單專一性親本抗體之組合更有效。

圖1A ：本發明之結合VEGF及ANG-2之雙重專一性抗體的一項四價實施例之示意性結構，其中抗原A或B中之一者為VEGF，而另一者為ANG-2。該結構係基於經由肽連接子連接有結合於抗原B之兩個(視情況經雙硫鍵穩定之)單鏈Fv的結合抗原A之全長抗體。

圖1B ：使用TvAb命名法產生之雙重專一性四價抗體(參見實例)之圖示，其中scFv之雙硫鍵經穩定抑或未經穩定。

圖2A ：雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>雙重專一性四價抗體(=<VEGF-ANG-2>TvAb6；第2331號，參見表3)的圖示。

圖2B ：用於表現雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6的經修飾重鏈及輕鏈載體之質體圖。

圖3 ：在還原及非還原條件下經純化之雙硫鍵穩定<VEGF-ANG-2>TvAb6相較於「標準」人類IgG1抗體G6-31(<VEGF>HuMab G6-31)的SDS-PAGE圖。

圖4 ：經純化之雙硫鍵穩定<VEGF-ANG-2>TvAb6相較於「標準」人類IgG1抗體G6-31之尺寸排阻層析譜圖，其顯示雙硫鍵穩定之TvAb6在純化後不再形成聚集體。

圖5 ：VEGF結合ELISA之示意圖及結果。雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6結合VEGF，與<VEGF>G6-31相當。<ANG-2>Mab536不與VEGF結合。

圖6A ：ANG-2結合ELISA之示意圖及結果。雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6結合ANG-2，與<ANG-2>Mab536相當。

<VEGF>G6-31不與ANG-2結合。

圖6B ：以表面電漿共振(Biacore)進行之ANG-2結合分析的示意圖及結果。雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6以與<ANG-2>Mab536相當之親和力結合ANG-2。

圖7 ：VEGF-ANG-2橋接ELISA之示意圖及結果。雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6同時結合VEGF及ANG-2，而<VEGF>G6-31及<ANG-2>Mab536不能夠同時結合VEGF及ANG-2。

圖8a ：在分階段皮下Colo205異種移植模型中在Scid Beige小鼠中雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6相較於<ANG-2>Mab536、<VEGF>G6-31及Mab536與G6-31之組合的功效(研究ANG2_Pz_Colo205_003)。

圖8b ：在分階段皮下Colo205異種移植模型中在Scid Beige小鼠中雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6相較於<ANG-2>Mab536、<VEGF>G6-31及Mab536與G6-31之組合的功效(研究ANG2_Pz_Colo205_005)。

圖9 ：利用雙重專一性四價抗體<VEGF-ANG-2>TvAb6阻斷VEGF誘導之管形成的結果。

圖10A+B ：利用b雙硫鍵穩定之<VEGF-ANG-2>TvAb6阻斷VEGF誘導之管形成的定量分析結果。

圖11 ：以表面電漿共振(Biacore)進行之VEGF結合分析的示意圖。

圖12 ：兩種<VEGF>抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6及<VEGF>G6-31在Ka-Kd圖中之動力學特徵。

圖13 ：偵測ANGPT2及VEGF與雙重專一性抗體之同時結合的表面電漿共振(Biacore)檢定之示意圖。

圖14 ：表面電漿共振(Biacore)實驗之結果，其顯示TvAb6同時結合於ANGPT2及VEGF。

圖15A+B ：A)<VEGF-ANG-2>雙重專一性抗體之雙重專一性及同時Biacore結合檢定之圖示。B)Biacore資料，其展示ANG-2及VEGF與TvAb-2441-貝伐單抗_LC06同時結合。

圖16A+B ：雙重專一性抗體<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及<VEGF-ANG-2>TvAb-2441相較於抗-Ang2抗體<ANG-2>Ang2i_LC06及<ANG-2>Ang2k_LC08的Tie2磷酸化。

圖17 ：人類血管生成素相互作用ELISA之圖示。

圖18 ：<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-貝伐單抗-LC08及貝伐單抗對VEGF誘導之HUVEC增殖的抑制之比較結果。

圖19 ：在利用經標記之抗CD31抗體及治療期間CD31信號之相對變化監測的Calu3異種移植模型中雙重專一性抗體<VEGF-ANG-2>貝伐單抗-LC06抗體相較於<ANG-2>ANG2i-LC06及<ANG-2>ANG2i-LC06與Avastin(貝伐單抗)之組合的活體內抗血管生成功效。

本發明之一項實施例為一種專一地結合於人類VEGF及人類ANG-2之雙重專一性抗體，其包含專一地結合人類VEGF之第一抗原結合位點及專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點，該抗體特徵在於：i)該等抗原結合位點各為一對抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域；ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：94之CDR3區；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：95之CDR2區；及SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：96之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：97之CDR3區；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：98之CDR2區；及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：99之CDR1區；iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2 區；及SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：28、具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89之CDR3區；SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：94之CDR3區、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：95之CDR2區及SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：96之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：97之CDR3區、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：98之CDR2區及SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：99之CDR1區；iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2區；及SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89之CDR3區；SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7 或SEQ ID NO：100作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86之CDR3區；SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87之CDR2區；及SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89之CDR3區；SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90之CDR2區；及SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：46之CDR3區、SEQ ID NO：47之CDR2區及SEQ ID NO：48之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：100作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：92作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：93作為輕鏈可變域。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：78之CDR3區、SEQ ID NO：79之CDR2區及SEQ ID NO：80之CDR1區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：81之CDR3區、SEQ ID NO：82之CDR2區及SEQ ID NO： 83之CDR1區。

在本發明之一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：7作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：8作為輕鏈可變域；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：84作為重鏈可變域，且包含SEQ ID NO：85作為輕鏈可變域。

本發明之另一項實施例為一種專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之雙重專一性抗體，其特徵在於：親本抗ANG-2抗體並不專一地結合於人類血管生成素1(Angiopoetin-1，ANG-1)。專一地結合於人類ANG-2但不專一地結合於人類ANG-1之典型親本抗體為例如Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07，且較佳為Ang2i_LC10或結合與Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10相同之抗原決定基之抗體，較佳為結合與Ang2i_LC06或Ang2i_LC10相同之抗原決定基之抗體。因此，在本發明之一項實施例中，專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)但不專一地結合於人類ANG-1(或具如下特徵：親本抗ANG-2抗體並不專一地結合於人類血管生成素1(ANG-1))的雙重專一性抗體結合與Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i-LC07、Ang2i_LC10相同之抗原決定基，較佳為結合與Ang2i_LC06或Ang2i_LC10相同之抗原決定基。該等專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)但不專一地結合於人類ANG-1(或具如下特徵：親本抗ANG-2抗體並不專一地結合於人類血管生成素1(ANG-1))的雙重專一性抗體相較於專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)以及人類ANG-1之雙重專一性抗體而言可具有改良之特性，諸如生物活性或藥理學活性、較低毒性或藥物動力學概況。

因此，一項較佳實施例為一種專一地結合於人類VEGF及人類ANG-2之雙重專一性抗體，其包含專一地結合人類VEGF之第一抗原結合位點及專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點，該抗體特徵在於：該第二抗原結合位點並不專一地結合於人類血管生成素1(ANG-1)。

本發明之一項實施例為一種專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之雙重專一性抗體，其包含專一地結合人類VEGF之第一抗原結合位點及專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點，該抗體特徵在於：結合親和力KD(對VEGF具專一性之抗原結合位點)/KD(對ANG-2具專一性之抗原結合位點)之比為1.0-10.0，較佳為1.5-8.0(在一項實施例中為5.0-8.0)，且絕對KD值較佳在10^-8 -10^-13 mol/l範圍內。KD值係以ANG-2/VEGF結合BIACORE測定(參見實例2及圖15A)。當兩種蛋白質人類VEGF及人類ANG-2皆以可溶性受體配位體形式以大致相同之濃度存在於人類血清中時，利用雙重專一性阻斷該兩種受體配位體之特徵在於：結合親和力KD(對VEGF具專一性之抗原結合位點)/KD(對ANG-2具專一性之抗原結合位點)之比為1.0-10.0，較佳為1.5-8.0，且在一項實施例中為5.0-8.0，可使得在以該類雙重專一性抗體治療癌症或血管疾病期間關於抗血管生成效應、腫瘤生長抑制或抗性機制之特性得到改良。較佳的是，該雙重專一性抗體之特徵在於：結合親和力KD(對VEGF具專一性之抗原結合位點)/KD(對ANG-2具專一性之抗原結合位點)之比為1.0-10.0，較佳為1.5-8.0(在一項實施例中為5.0-8.0)，且該雙重專一性抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈可變域及SEQ ID NO：8之輕鏈可變域作為專一地結合VEGF之第一抗原結合位點，且包含a)SEQ ID NO：52之重鏈可變域及SEQ ID NO：53之輕鏈可變域抑或b)SEQ ID NO：84之重鏈可變域及SEQ ID NO：85之輕鏈可變域作為該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點。

本文所用之「抗體」係指包含抗原結合位點之結合蛋白。本文所用之術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示配位體實際上所結合於之抗體分子上的某一(些)區域。術語「抗原結合位點」包括抗體重鏈可變域(VH)及/或抗體輕鏈可變域(VL)，或VH/VL對，且可源自完整抗體或抗體片段，諸如單鏈Fv、VH域及/或VL域、Fab或(Fab)2。在本發明之一項實施例中，抗原結合位點各包含抗體重鏈可變域(VH)及/或抗體輕鏈可變域(VL)，且較佳係由由抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)組成之配對形成。

專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)之抗原結合位點及尤其重鏈可變域(VH)及/或抗體輕鏈可變域(VL)可源自：a)已知抗VEGF抗體(諸如Kim等人，Nature 362(1993)841-844；Warren,R.S.等人，J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797：Borgstrom,P.等人，Cancer Res.56(1996)4032-4039；Melnyk,O.等人，Cancer Res.56(1996)921-924；WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900、WO 00/35956及US 2007/0141065)；或b)藉由重新免疫法尤其使用人類VEGF蛋白或核酸或其片段或藉由噬菌體呈現獲得之新型抗VEGF抗體。

專一地結合於人類血管生成素-2(ANG-2)之抗原結合位點及尤其重鏈可變域(VH)及/或抗體輕鏈可變域(VL)可源自：a)已知抗ANG-2抗體(諸如WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 2006/045049或US 6,166,185)；或b)例如藉由重新免疫法尤其使用人類ANG-2蛋白或核酸或其片段或藉由噬菌體呈現獲得之新型抗ANG-2抗體。

抗體專一性係指抗體對抗原之特定抗原決定基的選擇性識別能力。舉例而言，天然抗體為單專一性抗體。

本發明之「雙重專一性抗體」為具有兩種不同抗原結合專一性之抗體。若抗體具有一種以上專一性，則所識別之抗原決定基可與單種抗原或一種以上抗原締合。本發明抗體對兩種不同抗原(亦即作為第一抗原之VEGF及作為第二抗原之ANG-2)具專一性。

本文所用之術語「單專一性」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該等位點中之任一者與同一抗原之同一抗原決定基結合。

本申請案中所用之術語「價」表示抗體分子中存在規定數目之結合位點。因而，術語「二價」、「四價」及「六價」表示抗體分子中分別存在兩個結合位點，四個結合位點及六個結合位點。本發明之雙重專一性抗體至少為「二價」且可為「三價」或「多價」(例如「四價」或「六價」)。本發明之雙重專一性抗體較佳為二價、三價或四價。在一項實施例中，該雙重專一性抗體為二價抗體。在一項實施例中，該雙重專一性抗體為三價抗體。在一項實施例中，該雙重專一性抗體為四價抗體。

本發明抗體具有兩個或兩個以上結合位點且為雙重專一性的。亦即，抗體可為雙重專一性抗體，即使在其中存在兩個以上結合位點之狀況(亦即抗體為三價抗體或多價抗體)下亦如此。本發明之雙重專一性抗體包括例如多價單鏈抗體、雙功能抗體及三功能抗體，以及經一或多個肽連接子連接有其他抗原結合位點(例如單鏈Fv、VH域及/或VL域、Fab或(Fab)2)之具有全長抗體之恆定域結構的抗體。抗體可為來自單個物種之全長抗體，或為嵌合或人類化抗體。對於具有兩個以上抗原結合位點之抗體，一些結合位點可相同，只要蛋白質具有針對兩個不同抗原之結合位點即可。亦即，鑒於第一結合位點對VEGF具專一性，則第二結合位點對ANG-2具專一性，及鑒於第一結合位點對 ANG-2具專一性，則第二結合位點對VEGF具專一性。

人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No：105)描述於例如Leung,D.W.等人，Science 246(1989)1306-9；Keck,P.J.等人，Science 246(1989)1309-12及Connolly,D.T.等人，J.Biol.Chem.264(1989)20017-24中。VEGF涉及於腫瘤及眼內病症相關之正常及異常血管生成及新血管生成的調節中(Ferrara,N.等人，Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.等人，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.等人，Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.等人，Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.等人，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；及Dvorak,H.等人，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF為已自若干來源分離之同型二聚醣蛋白。VEGF顯示針對內皮細胞之高度專一促有絲分裂活性。

人類血管生成素-2(ANG-2)(或者縮寫為ANGPT2或ANG2)(SEQ ID No：106)描述於Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60及Cheung,A.H.等人，Genomics 48(1998)389-91中。發現血管生成素-1及-2(ANG-1(SEQ ID No：107)及ANG-2(SEQ ID No：106))為Tie之配位體，Tie為選擇性表現於血管內皮中之酪胺酸激酶家族。Yancopoulos,G.D.等人，Nature 407(2000)242-48。血管生成素家族目前存在四個確定成員。血管生成素-3及-4(Ang-3及Ang-4)可表示小鼠及人類中相同基因座之廣泛發散對應物。Kim,I.等人，FEBS Let,443(1999)353-56；Kim,I.等人，J Biol Chem 274(1999)26523-28。最初在組織培養實驗中分別以促效劑及拮抗劑形式識別出ANG-1及ANG-2(參見ANG-1：Davis,S.等人，Cell 87(1996)1161-69；及ANG-2：Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60)。所有已知血管生成素主要結合Tie2，且Ang-1及-2皆以3 nM(Kd)親和力結合Tie2。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。

本發明抗體之抗原結合位點可含有六個以不同程度幫助結合位點對抗原之結合親和力的互補決定區(CDR)。存在三個重鏈可變域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個輕鏈可變域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。藉由與胺基酸序列之經彙編資料庫(其中CDR及FR已根據序列之間的可變性定義)比較來測定CDR及構架區(FR)之範圍。本發明範圍內亦包括由較少CDR組成之功能性抗原結合位點(亦即，其中結合專一性由三個、四個或五個CDR決定)。舉例而言，少於全套6個CDR對結合而言可為足夠的。在一些狀況下，VH或VL域將足夠。

在某些實施例中，本發明抗體進一步包含一或多個免疫球蛋白種類之免疫球蛋白恆定區。免疫球蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE同型，且在IgG及IgA狀況下，包括其亞型。在一項較佳實施例中，本發明抗體具有IgG型抗體之恆定域結構，但具有四個抗原結合位點。此例如藉由使兩個專一地結合VEGF之全抗原結合位點(例如單鏈Fv)與專一地結合ANG-2之完全抗體之N或C端重鏈或輕鏈中之任一者連接來完成。或者，此係藉由使兩個專一地結合ANG-2之全結合肽與專一地結合VEGF之完全抗體之C端重鏈之任一者融合來完成。四個抗原結合位點較佳包含針對兩種不同結合專一性之每一者的兩個抗原結合位點。

本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組份」係指單胺基酸組份之抗體分子製劑。

術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變區(亦即結合區)及自不同來源或物種產生之至少一部分恆定區之抗體，該抗體一般藉由重組DNA技術製備。包含鼠類可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明涵蓋之「嵌合抗體」的其他較佳形式為恆定區已自初始抗體恆定區修飾或改變以產生尤其關於C1q結合及/或Fc受體 (FcR)結合的本發明特性之形式。該等嵌合抗體亦稱為「類別轉換抗體」。嵌合抗體為包含編碼免疫球蛋白可變區之DNA區段及編碼人類免疫球蛋白恆定區之DNA區段的經表現免疫球蛋白基因的產物。此項技術中熟知涉及習知重組DNA及基因轉染技術之製造嵌合抗體之方法。例如參見Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238及US 5,204,244。

術語「人類化抗體」係指構架或「互補決定區」(CDR)已經修飾以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同專一性之免疫球蛋白之CDR的抗體。在一項較佳實施例中，將鼠類CDR移植至人類抗體之構架區中以製備「人類化抗體」。例如參見Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。尤其較佳之CDR對應於呈現識別上文對於嵌合抗體所述之抗原之序列的CDR。本發明涵蓋之「人類化抗體」的其他形式為恆定區已以其他方式自初始抗體恆定區作了修飾或改變以產生本發明之特性(尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合)的形式。

本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有自人類生殖系免疫球蛋白序列產生之可變區及恆定區的抗體。人類抗體為此項技術中熟知(van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人類抗體亦可產生於在無內源性免疫球蛋白產生之狀況下在免疫後能夠產生人類抗體之完全譜系或選擇之轉殖基因動物(例如小鼠)中。在該生殖系突變小鼠中轉移人類生殖系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻毒後產生人類抗體(例如參見Jakobovits,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555：Jakobovits,A.等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人類抗體亦可在噬菌體呈現庫中產生(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人， J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等人及Boerner,P.等人之技術亦適用於製備人類單株抗體(Cole,A.等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.L.，第77頁(1985)；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如已針對本發明之嵌合及人類化抗體所提及，本文所用之術語「人類抗體」亦包含在恆定區中例如藉由「類別轉換」(亦即Fc部分改變或突變(例如自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變))修飾產生尤其關於C1q結合及/或FcR結合的本發明特性之抗體。

本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表現、形成或分離之所有人類抗體，諸如自例如NS0或CHO細胞之宿主細胞或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之人類免疫球蛋白基因或抗體轉殖基因動物(例如小鼠)分離之抗體。該等重組人類抗體具有重排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經受活體內體細胞超突變。因此，重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為以下序列，其雖然自人類生殖系VH及VL序列產生且與其有關，但可能不天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系中。

本文所用之「可變域」(輕鏈(VL)可變域、重鏈(VH)可變區)表示直接涉及於抗體與抗原結合中的各對輕鏈及重鏈。可變人類輕鏈及重鏈之結構域具有相同通用結構，且各結構域包含由3個「高變區」(或互補決定區，CDR)連接之4個構架(FR)區，其序列廣泛保守。構架區採用β折迭構形且CDR可形成連接β折迭結構之環。各鏈中之CDR藉由構架區保持其三維結構且連同來自其他鏈之CDR形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區在本發明抗體之結合專一性/親和力中起尤其重要的作用，且因此提供本發明之另一目的。

當用於本文中時，術語「高變區」或「抗體之抗原結合部分」係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「構架」或「FR」區為除如本文中所定義之高變區殘基之外的可變域區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈自N端至C端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各鏈上之CDR係藉由該等構架胺基酸分離。重鏈之CDR3尤其為最有助於抗原結合之區域。根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之標準定義判定CDR及FR區。

本發明之雙重專一性抗體另外包括具有「保守序列修飾」之該等抗體(其意謂雙重專一性抗體之「變異體」)。此意謂不影響或改變上述本發明抗體特徵之核苷酸及胺基酸序列修飾。可藉由此項技術中已知的諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發之標準技術引入修飾。保守胺基酸取代包括胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，在雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體中所預計之非必需胺基酸殘基較佳可以來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。因此，「變異」雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體在本文中係指與「親本」雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體胺基酸序列相差親本抗體之一或多個可變區或恆定區中的至多10個、較佳約2至約5個添加、缺失及/或取代之分子。可藉由如Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327及Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033所述之基於分子模擬之突變誘發進行胺基酸取代。本發明之「變異」雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體亦包括連接子(若存在)經另一連接子修飾或置換之雙重專一性抗體形式。

本文所用之術語「結合」或「專一地結合」係指在使用經純化野生型抗原之活體外檢定、較佳電漿共振檢定(BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)(實例2)中使抗體與抗原(人類VEGF或人類ANG-2)之抗原決定基結合。結合親和力由術語ka(締合來自抗體/抗原複合物之抗體的速率常數)、k_D (解離常數)及K_D (k_D /ka)定義。結合或專一地結合意謂10^-8 mol/l或更低，較佳10^-9 M至10^-13 mol/l之結合親和力(K_D )。

可藉由BIAcore檢定(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)來研究抗體與FcγRIII之結合。結合親和力由術語ka(締合來自抗體/抗原複合物之抗體的速率常數)、k_D (解離常數)及K_D (k_D /ka)定義。

本文所用之術語「不結合ANG-1」或「不專一地結合ANG-1」表示抗體在活體外ANG-1結合ELISA檢定中具有高於8000 ng/ml之EC50值(根據實例9)。

術語「抗原決定基」包括能夠專一性結合抗體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及或特定電荷特徵。抗原決定基為由抗體結合之抗原區。

在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其標靶抗原時，則稱該抗體專一地結合該抗原。

在本發明之一項實施例中，雙重專一性抗體包含全長親本抗體作為骨架。

術語「全長抗體」表示由兩個「全長抗體重鏈」及兩個「全長抗體輕鏈」組成之抗體。「全長抗體重鏈」為在N端至C端方向中由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定重鏈域1(CH1)、抗體鉸鏈區(HR)、抗體重鏈恆定域2(CH2)及抗體重鏈恆定域3(CH3)(縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3)；及在子類IgE抗體狀況下視情況存在之抗體重鏈恆定域4(CH4)組成之多肽。「全長抗體重鏈」較佳為在N端至C端方向中由VH、CH1、HR、CH2及CH3組成之多肽。「全長抗體輕鏈」為在N端至C端方向中由抗體輕鏈可變域(VL)及抗體輕鏈恆定域(CL)組成之多肽，縮寫為VL-CL。抗體輕鏈恆定域(CL)可為κ或λ。兩個全長抗體鏈在CL域與CH1域之間及全長抗體重鏈的鉸鏈區之間經多肽間雙硫鍵連接在一起。典型全長抗體之實例為天然抗體樣IgG(例如IgG 1及IgG2)、IgM、IgA、IgD及IgE。本發明之全長抗體可來自單獨物種(例如人類)，或其可為嵌合或人類化抗體。本發明之全長抗體包含各由一對VH及VL形成之兩個抗原結合位點，其皆專一地結合同一抗原。因此，包含第一抗原結合位點且由兩個抗體輕鏈及兩個抗體重鏈組成之單專一性二價(=全長)抗體為全長抗體。該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端表示該重鏈或輕鏈之C端的最後胺基酸。該全長抗體之重鏈或輕鏈之N端表示該重鏈或輕鏈之N端的最後胺基酸。

本發明之專一地結合人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之雙重專一性抗體的雙重專一性抗體形式之一項較佳實施例為具有兩種不同專一性之二價抗體，例如a)如WO 2009/080251、WO 2009/080252或WO 2009/080253中所述(結構域交換抗體-參見實例13)，或b)基於scFab-Fc融合抗體，其中一個單鏈Fab片段(最終經雙硫鍵穩定化)對VEGF具專一性且另一單鏈Fab片段(最終經雙硫鍵穩定化)對ANG-2具專一性(參見實例14)，或c)如Ridgway,J.B., Protein Eng.9(1996)617-621；WO 96/027011；Merchant,A.M.等人，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35及EP 1 870 459A1中所述。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123及SEQ ID NO：124或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：128或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131及SEQ ID NO：132或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：133及SEQ ID NO：134或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：135及SEQ ID NO：136或其變異體之胺基酸序列。

此等胺基酸序列係基於作為結合VEGF之第一抗原結合位點的SEQ ID NO：7之重鏈可變域及SEQ ID NO：8之輕鏈可變域(自貝伐單抗(Avastin)產生)，及作為結合ANG-2之第二抗原結合位點的SEQ ID NO：52之重鏈可變域及SEQ ID NO：53之輕鏈可變域(自Ang2i_LC06產生)。

在一項實施例中，該雙重專一性抗體為使用例如基於專一地結合兩個抗原VEGF或ANG-2中之一者的全長抗體之形式的三價抗體，該全長抗體僅在一重鏈之一C端融合scFab片段，該scFab片段專一地結合兩個抗原VEGF或ANG-2中之另一者，包括例如歐洲申請案第09004909.9號中所述之杵臼結構技術(knobs-into holes technology)(參見實例11)；或使用例如基於專一地結合兩個抗原VEGF或ANG-2中之一者的全長抗體之形式的三價抗體，該全長抗體在一重鏈之一C端融合VH或VH-CH1片段且在第二重鏈之另一C端融合VL或VL-CL片段，該等片段專一地結合兩個抗原VEGF或ANG-2之另一者，包括例如歐洲申請案第09005108.7號中所述之杵臼結構技術(參見實例12)。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：117或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119及SEQ ID NO：120或其變異體之胺基酸序列。

此等胺基酸序列係基於作為結合VEGF之第一抗原結合位點的SEQ ID NO：7之重鏈可變域及SEQ ID NO：8之輕鏈可變域(自貝伐單抗(Av astin)產生)，及作為結合ANG-2之第二抗原結合位點的SEQ ID NO：52之重鏈可變域及SEQ ID NO：53之輕鏈可變域(自Ang2i_LC06產生)。

本發明專一地結合人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之雙重專一性抗體的較佳雙重專一性抗體形式為例如WO 2007/024715或WO 2007/109254或歐洲申請案第09004909.9號中所述的具有兩種不同專一性之四價抗體(TvAb)。因此，在一項實施例中，該雙重專一性抗體為使用例如WO 2007/024715或WO 2007/109254或歐洲申請案第09004909.9號中所述之形式的四價抗體(參見實例1或10)。

在本發明之一項實施例中，雙重專一性四價抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06特徵在於：包含SEQ ID No：102之肽及SEQ ID No：62之輕鏈或其變異體。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：112或其變異體之胺基酸序列。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體的特徵在於：包含SEQ ID NO：113及SEQ ID NO：114或其變異體之胺基酸序列。

在本發明之一項實施例中，雙重專一性四價抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC08特徵在於：包含SEQ ID No：103之肽及SEQ ID No：62之輕鏈或其變異體。

本發明抗體中之結合位點可各自由兩個可變域(亦即一重鏈可變域及一輕鏈可變域)之對形成。抗體中之最小結合位點決定子為重鏈CDR3區。

在一項實施例中，本發明之雙重專一性抗體為四價抗體。在另一項實施例中，該四價雙重專一性抗體具有以下特徵：-其由以下組成：a)由兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈組成之單專一性二價親本抗體，其中各鏈僅包含一可變域，b)兩個肽連接子，c)各由抗體重鏈可變域、抗體輕鏈可變域及該抗體重鏈可變域與該抗體輕鏈可變域之間的單鏈連接子組成之兩個單專一性單價單鏈抗體；且該單鏈抗體較佳與單專一性二價抗體重鏈之同一末端(C端及N端)連接，或與單專一性二價抗體輕鏈之同一末端(較佳C端)連接，且更佳與單專一性二價抗體重鏈之同一末端(C端及N端)連接。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體為四價且由以下組成a)包含該抗原結合位點且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體；及b)包含該第二抗原結合位點之兩個相同單鏈Fab片段，其中該等在b)下之單鏈Fab片段與該在a)下之全長抗體經由該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端或N端處的肽連接體融合。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體為四價且由以下組成a)包含該第二抗原結合位點且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體；及b)包含該第一抗原結合位點之兩個相同單鏈Fab片段，其中該等在b)下之單鏈Fab片段與該在a)下之全長抗體經由該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端或N端處的肽連接體融合。

該等在b)下之單鏈Fab片段與該在a)下之全長抗體較佳經由該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端處的肽連接體融合。

在一項實施例中，與第二抗原結合之兩個相同單鏈Fab片段與該全長抗體經由該全長抗體之各重鏈或輕鏈之C端處的肽連接體融合。

在一項實施例中，與第二抗原結合之兩個相同單鏈Fab片段與該全長抗體經由該全長抗體之各重鏈之C端處的肽連接體融合。

在一項實施例中，與第二抗原結合之兩個相同單鏈Fab片段與該全長抗體經由該全長抗體之各氫鏈之C端處的肽連接體融合。

該等包括單鏈Fab片段之實施例更詳細描述於例如歐洲申請案第09004909.9號中，其以引用的方式併入本文中。

本發明所用之術語「肽連接子」表示較佳合成來源的具有胺基酸序列之肽。使用本發明之此等肽連接子將不同抗原結合位點及/或最終包含不同抗原結合位點之抗體片段(例如單鏈Fv、全長抗體、VH域及/或VL域、Fab、(Fab)2、Fc部分)連接在一起形成本發明之雙重專一性抗體。肽連接子可包含以下表1中所列之一或多個胺基酸序列以及其他任意選擇之胺基酸。該等肽連接子為具有長度至少為5個胺基酸，較佳至少10個胺基酸，更佳長度介於10與50個胺基酸之間的胺基酸序列之肽。該等在b)下之肽連接子較佳為具有長度至少為10個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一項實施例中，該肽連接子為(GxS)n，其中G=甘胺酸、S=絲胺酸(x=3且n=3、4、5或6)或(x=4且n=2、3、4或5)，較佳x=4且n=2或3，更佳x=4，n=2((G₄ S)₂ )。向該(GxS)n肽連接子亦可添加其他G=甘胺酸，例如GG或GGG。

本發明所用之術語「單鏈連接子」表示較佳合成來源的具有胺基酸序列之肽。使用此等本發明之單鏈連接子連接VH及VL域以形成單鏈Fv。該c)下之單鏈連接子較佳為具有長度至少為15個胺基酸，更佳長度至少為20個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一項實施例中，該單鏈連接子為(GxS)n，其中G=甘胺酸、S=絲胺酸(x=3且n=4、5或6)或(x=4且n=3、4或5)，較佳x=4、n=4或5，更佳x=4、n=4。

此外，該等單鏈(單鏈Fv)抗體較佳經雙硫鍵穩定化。單鏈抗體之該進一步雙硫鍵穩定化係藉由在單鏈抗體之可變域之間引入雙硫鍵來實現，且描述於例如以下文獻中：WO 94/029350；Rajagopal,V.等人，Prot.Engin.10(12)(1997)1453-59；Kobayashi,H.等人，Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393；或Schmidt,M.等人，Oncogene 18(1999)1711-1721。

在雙硫鍵穩定之單鏈抗體之一項實施例中，本發明抗體中所包含之單鏈抗體之可變域之間的雙硫鍵對各單鏈抗體而言獨立選自： i)重鏈可變域位置44至輕鏈可變域位置100，ii)重鏈可變域位置105至輕鏈可變域位置43，或iii)重鏈可變域位置101至輕鏈可變域位置100。

在一項實施例中，本發明抗體中所包含之單鏈抗體之可變域之間的雙硫鍵在重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100之間。

在一項實施例中，本發明抗體中所包含之單鏈抗體之可變域之間的雙硫鍵在重鏈可變域位置105與輕鏈可變域位置43之間。

本發明之專一地結合VEGF及ANG-2之雙重專一性抗體的此四價實施例之結構，其中抗原A或B中之一者為VEGF，而另一者為ANG-2。該結構係基於專一地結合抗原A之全長抗體，其與專一地結合抗原B之兩個(視情況經雙硫鍵穩定化)單鏈Fv經肽連接子連接，如圖1及2之流程中所例示。

在一項實施例中，在單鏈抗體(單鏈Fv)之可變域VH與VL之間不具有該視情況存在之雙硫鍵穩定化的該等單鏈(單鏈Fv)抗體較佳。

在另一項實施例中，該四價雙重專一性抗體特徵在於：a)下之該單專一性二價抗體部分專一地結合VEGF且c)下之該兩個單價單專一性單鏈抗體結合ANG-2。

在另一項實施例中，該四價雙重專一性抗體特徵在於：a)下之該單專一性二價抗體部分專一地結合ANG-2且c)下之該兩個單價單專一性單鏈抗體結合VEGF。

「單鏈Fab片段」(參見圖11)為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1(CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接子在N端至C端方向具有以下順序之一：a)VH-CH1-連接子-VL-CL、b)VL-CL-連接子-VH-CH1、c)VH-CL-連接子-VL-CH1或d)VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為具有至少30個胺基酸，較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該等單鏈Fab片段a)VH-CH1-連接子-VL-CL、b)VL-CL-連接子-VH-CH1、c)VH-CL-連接子-VL-CH1及d)VL-CH1-連接子-VH-CL經由CL域與CH1域之間的天然雙硫鍵而穩定化。術語「N端」表示N端之最後胺基酸。術語「C端」表示C端之最後胺基酸。

在一項較佳實施例中，該單鏈Fab片段中之該等抗體結構域及該連接子在N端至C端方向中具有以下順序中之一者：a)VH-CH1-連接子-VL-CL，或b)VL-CL-連接子-VH-CH1，更佳VL-CL-連接子-VH-CH1。

在另一項較佳實施例中，該單鏈Fab片段中之該等抗體結構域及該連接子在N端至C端方向中具有以下順序中之一者：a)VH-CL-連接子-VL-CH1或b)VL-CH1-連接子-VH-CL。

本發明中所用之術語「肽連接體」表示較佳來源於合成的具有胺基酸序列之肽。使用此等本發明之肽連接體使單鏈Fab片段與全長抗體之C或N端融合形成本發明之多重專一性抗體。b)下之該肽連接體較佳為具有長度至少為5個胺基酸，較佳長度為5至100個胺基酸，更佳10至50個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一項實施例中，該肽連接體為(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸、S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，較佳x=4且n=2或3，更佳x=4，n=2。在一項實施例中，該肽連接體為(G₄ S)₂ 。

本發明中所用之術語「連接子」表示較佳合成來源的具有胺基酸序列之肽。使用此等本發明之肽連接a)VH-CH1至VL-CL，b)VL-CL至VH-CH1，c)VH-CL至VL-CH1或d)VL-CH1至VH-CL以形成以下本發明之單鏈Fab片段a)VH-CH1-連接子-VL-CL，b)VL-CL-連接子-VH-CH1，c)VH-CL-連接子-VL-CH1或d)VL-CH1-連接子-VH-CL。單鏈Fab片段中之該連接子為具有長度至少為30個胺基酸，較佳長度為32至50個胺基酸之胺基酸序列的肽。在一項實施例中，該連接子為(GxS)n，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸(x=3，n=8、9或10且m=0、1、2或3)或(x=4且n=6、7或8且m=0、1、2或3)，較佳x=4，n=6或7且m=0、1、2或3，更佳x=4，n=7且m=2。在一項實施例中，該連接子為(G₄ S)₆ G₂ 。

視情況而言，在該單鏈Fab片段中，除CL域與CH1域之間的天然雙硫鍵之外，抗體重鏈可變域(VH)及抗體輕鏈可變域(VL)亦藉由在以下位置之間引入雙硫鍵而雙硫鍵穩定化：i)重鏈可變域位置44至輕鏈可變域位置100，ii)重鏈可變域位置105至輕鏈可變域位置43，或iii)重鏈可變域位置101至輕鏈可變域位置100(通常根據Kabat之EU指數編號)。

單鏈Fab片段之該進一步的雙硫鍵穩定化係藉由在單鏈Fab片段之可變域VH與VL之間引入雙硫鍵實現。引入非天然雙硫橋以使單鏈Fv穩定化之技術描述於例如WO 94/029350、Rajagopal,V.等人，Prot.Engin.(1997)1453-59；Kobayashi,H.等人；Nuclear Medicine & Biology，第25卷，(1998)387-393；或Schmidt,M.等人，Oncogene(1999)18,1711-1721中。在一項實施例中，本發明抗體中所包含之單鏈Fab片段之可變域之間的視情況存在之雙硫鍵在重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100之間。在一項實施例中，本發明抗體中所包含之單鏈Fab片段之可變域之間的視情況存在之雙硫鍵在重鏈可變域位置105與輕鏈可變域位置43之間(通常根據Kabat之EU指數編號)。

在一項實施例中，在單鏈Fab片段之可變域VH與VL之間不具有該視情況存在之雙硫鍵穩定化的單鏈Fab片段較佳。

本發明之四價雙重專一性抗體之該第二實施例較佳包含兩個相同單鏈Fab片段(較佳VL-CL-連接子-VH-CH1)，其皆與a)下之該全長抗體的兩個重鏈之兩個C端或兩個輕鏈之兩個C端融合。該融合產生與i)全長抗體之輕鏈或重鏈共表現之兩個相同融合肽(i)重鏈及單鏈Fab片段或ii)輕鏈及單鏈Fab片段)，獲得本發明之雙重專一性抗體。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體特徵在於：人類來源產生之恆定區。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體特徵在於：本發明雙重專一性抗體之恆定區為人類IgG1子類或具有突變L234A及L235A之人類IgG1子類。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體特徵在於：根據本發明抗體之雙重專一性抗體之恆定區為人類IgG2子類。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體特徵在於：根據本發明抗體之雙重專一性抗體之恆定區為人類IgG3子類。

在另一項實施例中，該雙重專一性抗體特徵在於：本發明雙重專一性抗體之恆定區為人類IgG4子類或具有額外突變S228P之人類IgG4子類。

現已發現本發明之針對人類VEGF及人類ANG-2之雙重專一性抗體具有改良之特徵，諸如生物活性或藥理學活性、藥物動力學特性或毒性。其相較於針對VEGF及ANG-2之單專一性親本抗體顯示增加之活體內腫瘤生長抑制及/或腫瘤血管生成抑制(參見實例16、17及18：不同雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體貝伐單抗-ANG2i-LC06與單獨之單專一性抗體Avastin(貝伐單抗)、單獨之ANG2i-LC06或兩者之組合的比較)。

此外，相較於組合應用針對VEGF及ANG-2之兩種相應個別單專一性抗體之較低毒副作用(此由活體內應用期間測試動物之體重得到改良以及測試動物之死亡較少所反映)亦代表本發明之雙重專一性抗體之一項優勢。

此外，本發明之雙重專一性抗體可提供諸如降低投與劑量及/或頻率及伴隨之節約成本的益處。

本申請案中所用之術語「恆定區」表示除可變區之外的抗體結構域的總和。恆定區不直接涉及於抗原結合中，但展現多種效應功能。視其重鏈恆定區之胺基酸序列而定，抗體分為以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中數種可進一步分為諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2的子類。對應於不同類別之抗體的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。所有5種抗體種類中可發現之輕鏈恆定區稱為κ及λ。

本申請案中所用之術語「人類起源產生之恆定區」表示子類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體恆定重鏈區及/或恆定輕鏈κ或λ區。該等恆定區為此項技術中熟知且例如Kabat,E.A.(例如參見Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat,E.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)所述。

儘管IgG4子類抗體顯示降低之Fc受體(FcγRIIIa)結合，但其他IgG子類抗體顯示強結合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435為若經改變亦提供降低之Fc受體結合的殘基(Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。

在一項實施例中，本發明抗體相較於IgG1抗體及單專一性二價(全長)親本抗體具有降低之FcR結合係對於在S228、L234、L235及/或D265具有突變，及/或含有PVA236突變之IgG4子類或IgG1或IgG2子類的FcR結合而言。在一項實施例中，單專一性二價(全長)親本抗體之突變為S228P、L234A、L235A、L235E及/或PVA236。在另一項實施例中，單專一性二價(全長)親本抗體之突變在IgG4中為S228P且在IgG1中為L234A及L235A。恆定重鏈區顯示於SEQ ID NO：35及36中。在一項實施例中，單專一性二價(全長)親本抗體之恆定重鏈區為具有突變L234A及L235A之SEQ ID NO：35。在另一項實施例中，單專一性二價(全長)親本抗體之恆定重鏈區為具有突變S228P之SEQ ID NO：36。在另一項實施例中，單專一性二價(全長)親本抗體之恆定輕鏈區為SEQ ID NO：37的κ輕鏈區或SEQ ID NO：34之λ輕鏈區。單專一性二價(全長)親本抗體之恆定重鏈區較佳為SEQ ID NO：35或具有突變S228P之SEQ ID NO：36。

抗體恆定區直接涉及於ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)中。藉由使補體因子C1q與多數IgG抗體子類之恆定區結合來起始補體活化(CDC)。藉由在所謂結合位點處之經界定蛋白質-蛋白質相互作用引起C1q與抗體的結合。該等恆定區結合位點為此項技術中已知且例如Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.及Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；及EP 0 307 434所描述。該等恆定區結合位點特徵在於例如胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat之EU指數編號)。

術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」係指在效應細胞存在下藉由本發明抗體溶解人類標靶細胞。較佳在效應細胞(諸如自白血球層新鮮分離之PBMC或經純化效應細胞，如單核細胞或自然殺手(NK)細胞或永久生長NK細胞株)存在下以本發明抗體處理表現CCR5之細胞製劑來量測ADCC。

術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」表示藉由使補體因子C1q與多數IgG抗體子類之Fc部分結合啟動之過程。藉由在所謂結合位點處之經界定蛋白質-蛋白質相互作用引起C1q與抗體的結合。此項技術中已知該等Fc部分結合位點(參見上文)。該等Fc部分結合位點特徵在於例如胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat之EU指數編號)。子類IgG1、IgG2及IgG3之抗體一般顯示包括C1q及C3結合之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合C1q及/或C3。

藉由重組方式產生本發明抗體。因此，本發明之一態樣為編碼本發明抗體之核酸，且另一態樣為包含該編碼本發明抗體之核酸的細胞。重組製造法在此項技術中廣泛已知且包含原核及真核細胞中之蛋白質表現，隨後分離抗體且一般純化至醫藥學上可接受之純度。為了在宿主細胞中表現上述抗體，藉由標準方法將編碼各別經修飾輕鏈及重鏈之核酸插入至表現載體中。在適當原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌細胞)中進行表現且自細胞回收抗體(上清液或溶解後之細胞)。重組產生抗體之一般方法為此項技術中熟知且描述於例如Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880之評論文章。

雙重專一性抗體藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白質A瓊脂糖、氫氧磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析或親和力層析法)合適地自培養基分離。編碼單株抗體之DNA及RNA使用習知程序容易地分離及定序。融合瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後，DNA可插入至表現載體中，接著將其轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中以在宿主細胞中合成重組單株抗體。

藉由向抗體DNA中引入適當核苷酸變化或藉由核苷酸合成製備雙重專一性抗體之胺基酸序列變異體(或突變體)。然而，該等修飾僅可在例如上文所述之極有限範圍中進行。舉例而言，修飾不改變上述抗體特徵(諸如IgG同型及抗原結合)，但可改良重組製造之產量、蛋白質穩定性或促進純化。

本申請案中所用之術語「宿主細胞」表示可經工程改造而產生本發明抗體之任何種類之細胞株統。在一項實施例中，使用HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。本文所用之表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等名稱包括子代。因此，短語「轉型體」及「轉型細胞」包括初級個體細胞及自其產生之培養物，與轉移次數無關。亦應瞭解所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不能完全一致。針對原始轉型細胞篩選出的具有相同功能或生物活性之變異子代包括在內。

NS0細胞中之表現由例如Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。短暫表現由例如Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可變域選殖由Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。較佳短暫表現系統(HEK 293)由Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.在Cytotechnology 30(1999)71-83中及由Schlaeger,E.-J.在J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。

適於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、強化子及聚腺苷酸化信號。

當使某一核酸與另一核酸序列功能相關時，該核酸被「可操作地連接」。舉例而言，前序列(pre-sequence)或分泌性前導序列之DNA若其被表現為參與多肽之分泌的前體蛋白質則被可操作地連接於多肽之DNA；啟動子或強化子若其影響編碼序列之轉錄則被可操作地連接於該編碼序列；或核糖體結合位點若其經定位以有助於轉譯則被可操作地連接於編碼序列。一般而言，「可操作連接」意謂所連接之DNA序列為鄰接的，且在分泌性前導序列之狀況下為鄰接且處於閱讀框架中。然而，強化子不必為鄰接的。連接係藉由在適宜的限制性位點處接合來達成。若該等位點不存在，則根據習知作法使用合成性寡核苷酸接合體或連接子。

藉由標準技術(包括鹼性/SDS處理、CsCl分帶技術(CsCl banding)、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術)進行抗體之純化以去除細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)。參見Ausubel,F.等人編，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。不同方法已經充分確立且廣泛用於蛋白質純化，諸如使用微生物蛋白之親和力層析(例如蛋白質A或蛋白質G親和力層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、嗜硫性吸附(例如用β巰基乙醇及其他SH配位體)、疏水性相互作用或芳族吸附層析(例如用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間胺基苯基酸)、金屬螯合物親和力層析(例如用Ni(II)及Cu(II)親和力材料)、尺寸排阻層析及電泳法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

本發明之一態樣為一種包含本發明抗體之醫藥組合物。本發明之另一態樣為本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本發明之另一態樣為一種製造包含本發明抗體之醫藥組合物的方法。在另一態樣中，本發明提供一種含有與醫藥載劑調配在一起之本發明抗體的組合物，例如醫藥組合物。

本發明之一項實施例為一種用於治療癌症之本發明雙重專一性抗體。

本發明之另一態樣為用於治療癌症之該醫藥組合物。

本發明之另一態樣為本發明抗體用於製造用以治療癌症之藥物的用途。

本發明之另一態樣為藉由向需要治療之患者投與本發明抗體來治療罹患癌症之患者的方法。

本文所用之「醫藥載劑」包括生理學相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。載劑較佳適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。

本發明組合物可藉由此項技術中已知的各種方法投與。如熟習此項技術者所瞭解，投與途徑及/或模式將視所要結果而變化。為了藉由特定投與途徑來投與本發明化合物，可能需要將化合物以防止其失活之材料塗覆或將化合物與防止其失活之材料共同投與。舉例而言，化合物可在適當載劑(例如脂質體或稀釋劑)中向個體投與。醫藥學上可接受之稀釋劑包括生理食鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。此項技術中已知用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑的用途。

本文所用之短語「非經腸投與」意謂除經腸及局部投與之外的一般藉由注射投與之模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。

本文所用之術語癌症係指增殖性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括上述任何癌症之難治癒形式或上述一或多種癌症的組合。

本發明之另一態樣為作為抗血管生成劑之本發明雙重專一性抗體或該醫藥組合物。該抗血管生成劑可用於治療癌症，尤其實體腫瘤及其他血管疾病。

本發明之一項實施例為用於治療血管疾病之本發明雙重專一性抗體。

本發明之另一態樣為用於治療血管疾病之該醫藥組合物。

本發明之另一態樣為本發明抗體用於製造用以治療血管疾病之藥物的用途。

本發明之另一態樣為藉由向需要治療之患者投與本發明抗體來治療罹患血管疾病之患者的方法。

術語「血管疾病」包括癌症、發炎疾病、動脈粥樣硬化、局部缺血、外傷、敗血症、COPD、哮喘、糖尿病、AMD、視網膜病變、中風、肥胖症、急性肺損傷、出血、血管滲漏(例如由細胞因子誘發)、過敏症、葛瑞夫茲氏病(Graves' Disease)、橋本氏自體免疫甲狀腺炎(Hashimoto's Autoimmune Thyroiditis)、特發性血小板減少性紫癜、巨細胞動脈炎、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡腎炎、克羅恩氏病(Crohn's Disease)、多發性硬化症、潰瘍性結腸炎(尤其實體腫瘤)、眼內新生血管症候群(諸如增殖性視網膜病變或年齡相關之黃斑部變性(AMD))、類風濕性關節炎及牛皮癬(Folkman,J.等人，J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun,M.等人，Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239；及Garner,A.,Vascular diseases,Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.及Klintworth,G.K.,(編)，第2版，Marcel Dekker,New York(1994)，第1625-1710頁)。

此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由殺菌程序(同上)及藉由納入例如對羥基苯甲酸、氯丁醇、酚、山梨酸及其類似物之各種抗細菌劑及抗真菌劑來確保防止存在微生物。亦可能需要組合物中包括諸如糖、氯化鈉及其類似物之等張劑。另外，可藉由納入延遲吸收之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之延長吸收。

不管所選投與途徑，藉由熟習此項技術者已知之習知方法，將可以適合水合形式使用之本發明化合物及/或本發明醫藥組合物調配成醫藥學上可接受之劑型。

可改變本發明醫藥組合物中之活性成份的實際劑量程度以便獲得在對患者無毒性之狀況下有效實現針對特定患者、組合物及投藥模式的所要治療反應的活性成份之量。所選劑量程度將視多種藥物動力學因素而定，包括本發明所採用特定組合物之活性、投與途徑、投與時間、所採用之特定化合物的排出速率、治療持續時間、與所採用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、待治療患者之年齡、性別、體重、病況、一般健康狀況及先前病史及醫藥技術中熟知的類似因素。

組合物必須為無菌的且在一定程度上為流體以便可藉由注射器傳遞組合物。除水以外，載劑較佳為等張緩衝生理食鹽水溶液。

可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之衣料，藉由在分散液狀況下維持所要粒徑且藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。在許多情況下，較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、諸如甘露糖醇或山梨糖醇之多元醇及氯化鈉。

如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等名稱包括子代。因此，短語「轉型體」及「轉型細胞」包括初級個體細胞及自其產生之培養物，與轉移次數無關。亦應瞭解所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不能完全一致。針對原始轉型細胞篩選出的具有相同功能或生物活性之變異子代包括在內。當意欲使用不同名稱時，根據上下文此應為顯而易見的。

本文所用之術語「轉型」係指將載體/核酸轉移至宿主細胞中之過程。若使用不具有難以對付之細胞壁障壁之細胞作為宿主細胞，則例如藉由如Graham,F.L.,van der Eb,A.J.,Virology 52(1978)546及以下所述之磷酸鈣沈澱法進行轉染。然而，亦可使用諸如藉由細胞核注射或藉由原生質體融合將DNA引入至細胞中之其他方法。若使用原核細胞或含有實質細胞壁構造之細胞，則一種轉染方法例如為如Cohen,S.N.等人，PNAS.69(1972)2110-2114所述之使用氯化鈣的鈣處理。

本文所用之「表現」係指將核酸轉錄成mRNA之過程及/或隨後將經轉錄之mRNA(亦稱為轉錄物)轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及經編碼多肽統稱為基因產物。若聚核苷酸由基因組DNA產生，則真核細胞中之表現可包括mRNA之剪接。

「載體」為一種核酸分子，詳言之為自我複製之核酸分子，其將所插入之核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞之間。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中(例如染色體整合)之載體、主要用於複製DNA或RNA之載體複製及用於轉錄及/或轉譯DNA或RNA之表現載體。亦包括提供一種以上所述功能之載體。

「表現載體」為一種聚核苷酸，其在引入至適當宿主細胞中時可轉錄且轉譯為多肽。「表現系統」通常係指一種由可用於產生所要表現產物之表現載體組成的合適宿主細胞。

胺基酸序列之說明

為幫助瞭解本發明，提供以下實例、序列表及圖式，本發明之真實範疇闡明於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可在不悖離本發明精神之情況下對所闡述之程序進行修改。

實驗程序 實例 材料及一般方法

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊係於以下文獻中給出：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗體鏈之胺基酸係根據EU編號方式(Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991))來編號及提及。

重組DNA技術

如Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述使用標準方法來處理DNA。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。

基因合成

自由化學合成製成之寡核苷酸製備所要基因區段。藉由黏接及接合寡核苷酸(包括PCR擴增)來組裝側接有單限制性核酸內切酶裂解位點之基因區段，且隨後經由指定限制性位點(例如KpnI/SacI或AscI/PacI)選殖至基於pPCRScript(Stratagene)之pGA4選殖載體中。藉由DNA定序來確定次選殖基因片段之DNA序列。根據Geneart(Regensburg,Germany)之既定說明來對基因合成片段排序。合成編碼Ang-2/VEGF雙重專一性抗體之輕鏈及重鏈的所有基因區段，其具有以蛋白質分泌於真核細胞中為目標的編碼前導肽之5'-端DNA 序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)及5'-BamHI與3'-XbaI限制性位點。設計具有雙硫鍵穩定之「杵臼結構」修飾之重鏈的DNA序列，其在「杵狀結構」重鏈中具有S354C及T366W突變且在「臼狀結構」重鏈中具有Y349C、T366S、L368A及Y407V突變。

DNA序列確定

藉由根據MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)進行之雙股定序來確定DNA序列。

DNA及蛋白質序列分析與序列資料管理

將GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)之套裝軟體第10.2版及Infomax之Vector NT1 Advance套件第8.0版用於序列形成、定位、分析、註釋及說明。

表現載體(實例1)

為了表現所述抗體，應用適於基於使用CMV-內含子A啟動子之cDNA組織化抑或使用CMV啟動子之基因組組織化之短暫表現(例如在HEK293 EBNA或HEK293-F細胞中)或穩定表現(例如在CHO細胞中)的表現質體變異體(例如圖2B)。

除了抗體表現卡匣之外，載體亦含有：- 允許在大腸桿菌中複製此質體之複製起點，及- 賦予大腸桿菌安比西林(ampicillin)抗性之β-內醯胺酶基因。

抗體基因之轉錄單元係由以下要素構成：- 5'端之獨特限制性位點；- 來自人類細胞巨大病毒之極早期強化子及啟動子；- 繼之以在cDNA組織化狀況下之內含子A序列；- 人類抗體基因之5'-未轉譯區；- 免疫球蛋白重鏈信號序列；- 在以免疫球蛋白外顯子-內含子組織化cDNA或基因組組織化時的人類抗體鏈(重鏈、經修飾重鏈或輕鏈)；- 具有聚腺苷酸化信號序列之3'未轉譯區；及- 3'端之獨特限制性位點。

藉由PCR及/或基因合成產生如下文所述之包含所選抗體之重鏈序列及C端scFv融合的融合基因，且以已知重組方法及技術藉由在基因組重鏈載體中例如使用獨特NsiI及EcoRI位點連接相符核酸序列來組裝。藉由DNA定序驗證次選殖核酸序列。為了短暫及穩定轉染，藉由質體製備法自經轉型大腸桿菌培養物(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)製備大量質體。

表現載體(實例10-14)

使用由以下要素構成之表現載體：- 作為選擇標記之潮黴素(hygromycin)抗性基因；- 埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)之複製起點oriP；- 允許在大腸桿菌中複製此質體的來自載體pUC18之複製起點；- 賦予大腸桿菌安比西林(ampicillin)抗性之β-內醯胺酶基因；- 來自人類細胞巨大病毒(HCMV)之極早期強化子及啟動子；- 人類1-免疫球蛋白聚腺苷酸(「聚A」)信號序列；及- 獨特BamHI及XbaI限制性位點。

藉由基因合成來製備包含重鏈或輕鏈構築體以及具有C端VH及VL結構域之「杵臼結構」構築體的免疫球蛋白融合基因，且如所述選殖至pGA18(ampR)質體中。以BamHI及XbaI限制酶(Roche Molecular Biochemicals)消化具有合成DNA區段及Roche表現載體之pG18(ampR)質體且經受瓊脂糖凝膠電泳。接著將經純化重鏈及輕鏈編碼DNA區段接合至經分離Roche表現載體BamHI/XbaI片段，從而產生最終表現載體。將最終表現載體轉型至大腸桿菌細胞中，分離出表現質體DNA(Miniprep)且進行限制酶分析及DNA定序。使正確純系生長於150 ml LB-Amp培養基中，再次分離出質體DNA(Maxiprep)，且藉由DNA定序確認序列完整性。

細胞培養技術

如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編)，John Wiley & Sons,Inc.中所述使用標準細胞培養技術。

在HEK293-F系統中短暫轉染(實例1)

根據製造商說明書，使用HEK293-F系統(Invitrogen)，藉由短暫轉染分別編碼重鏈或經修飾重鏈與相應輕鏈的兩種質體來產生抗體。簡言之，在振盪燒瓶或攪拌醱酵器中在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中以兩種各別表現質體及293fectin或fectin(Invitrogen)之混合物轉染生長於懸浮液中之HEK293-F細胞(Invitrogen)。對例如2L振盪燒瓶(Corning)而言，HEK293-F細胞係以每毫升1.0×10⁶ 個細胞之密度接種於600 mL中且在120 rpm、8% CO₂ 下培育。第二天，用A)具有600 μg分別編碼等莫耳比之重鏈或經修飾重鏈與相應輕鏈之總質體DNA(1 μg/mL)的20 mL Opti-MEM(Invitrogen)與B)20 ml Opti-MEM+1.2 mL 293 fectin或fectin(2 μl/mL)之約42 mL混合物以每毫升約1.5×10⁶ 個細胞之細胞密度轉染細胞。在醱酵過程中根據葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。在5-10天之後收集含有所分泌之抗體之上清液，且直接自該上清液中純化分離出抗體或將該上清液冷凍及儲存。

在HEK293-F系統中短暫轉染(實例10-14)

根據製造商說明書(Invitrogen,USA)，使用FreeStyle^TM 293表現系統，藉由短暫轉染人類胚胎腎臟293-F細胞來表現重組免疫球蛋白變異體。簡言之，在37℃/8% CO₂ 下在FreeStyle^TM 293表現培養基中培養懸浮FreeStyle^TM 293-F細胞，且在轉染當天，將細胞以每毫升1-2×10⁶ 個活細胞之密度接種於新鮮培養基中。在Opti-MEM^® I培養基 (Invitrogen,USA)中使用325 μl 293fectin^TM (Invitrogen,Germany)及250 μg重鏈及輕鏈質體DNA(1：1莫耳比)製備DNA-293fectin^TM 複合物，最終轉染體積達250 ml。在Opti-MEM^® I培養基(Invitrogen,USA)中使用325 μl 293fectin^TM (Invitrogen,Germany)及250 μg「杵臼結構」重鏈1與2及輕鏈質體DNA(1：1：2莫耳比)製備具有兩條重鏈及一條輕鏈之「杵臼結構」DNA-293fectin複合物，最終轉染體積達250 ml。在Opti-MEM^® I培養基(Invitrogen,USA)中使用325 μl 293fectin^TM (Invitrogen,Germany)及250 μg「杵臼結構」重鏈1及2DNA(1：1莫耳比)製備具有兩條重鏈之「杵臼結構」DNA-293fectin複合物，最終轉染體積達250 ml。在Opti-MEM^® I培養基(Invitrogen,USA)中使用325 μl 293fectin^TM (Invitrogen,Germany)及250 μg「杵臼結構」重鏈1與2及輕鏈質體DNA(1：1：1：1莫耳比)製備CrossMab DNA-293fectin複合物，最終轉染體積達250 ml最終轉染體積。在轉染後7天，藉由在14000 g下離心30分鐘來收集含有抗體之細胞培養物上清液，且經由無菌過濾器(0.22 μm)過濾。將上清液儲存於-20℃下直至純化。

蛋白質測定

根據Pace等人，Protein Science,1995,4,2411-1423，藉由使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數測定280 nm下的光密度(OD)來測定經純化抗體及衍生物之蛋白質濃度。

上清液中之抗體濃度測定

藉由免疫沈澱法使用蛋白質A瓊脂糖-珠粒(Roche)來估算細胞培養物上清液中之抗體及衍生物濃度。將60 μL蛋白質A瓊脂糖珠粒在TBS-NP40(50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，1% Nonidet-P40)中洗滌3次。隨後，向在TBS-NP40中預平衡之蛋白質A瓊脂糖珠粒上施加1-15 mL細胞培養物上清液。在室溫下培育1小時後，將珠粒在 Ultrafree-MC-過濾器管柱[Amicon]上以0.5 mL TBS-NP40洗滌1次，以0.5 mL 2×磷酸鹽緩衝生理食鹽水(2×PBS,Roche)洗滌2次，且以0.5 mL 100 mM檸檬酸鈉(pH 5.0)簡單洗滌4次。藉由添加35 μl NuPAGE® LDS樣本緩衝液(Invitrogen)溶離所結合之抗體。分別將樣本的一半與NuPAGE®樣本還原劑組合或保持未還原，且在70℃下加熱10分鐘。因此，向4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)施加20 μl(對於非還原性SDS-PAGE使用MOPS緩衝液且對於還原性SDS-PAGE使用具有NuPAGE®抗氧化運行緩衝液添加劑(Invitrogen)之MES緩衝液)且以庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色。

藉由蛋白質A-HPLC層析法量測細胞培養物上清液中之抗體及衍生物濃度。簡言之，向在50 mM K₂ HPO₄ 、300 mM NaCl(pH 7.3)中之HiTrap蛋白質A管柱(GE Healthcare)施加含有結合蛋白質A之抗體及衍生物的細胞培養物上清液且在Dionex HPLC系統上以550 mM乙酸(pH 2.5)自基質溶離。利用UV吸光度及峰面積積分值來定量所溶離之蛋白質。經純化標準IgG1抗體用作標準物。

或者，藉由夾心IgG-ELISA來量測細胞培養物上清液中之抗體及衍生物濃度。簡言之，將StreptaWell高結合鏈黴親和素(Strepatavidin)A-96孔微量滴定板(Roche)用每孔100 μL生物素標記抗人類IgG捕捉分子F(ab')2<h-Fcgamma>BI(Dianova)以0.1 μg/mL在室溫下塗覆1小時或在4℃下塗覆隔夜，且隨後以每孔200 μL PBS、0.05% Tween(PBST,Sigma)洗滌3次。向各孔中添加每孔100 μL各別含抗體細胞培養物上清液於PBS(Sigma)中之連續稀釋液，且在室溫下在微量滴定板振盪器上培育1-2小時。以每孔200 μL PBST洗滌各孔3次，且在室溫下在微量滴定板上以100 μl 0.1 μg/mL之F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)作為偵測抗體偵測所結合之抗體歷時1-2小時。以每孔200 μL PBST洗滌3次洗去未經結合之偵測抗體，且藉由每孔添加100 μL ABTS來偵測所結合之偵測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上在405 nm量測波長下(參考波長492 nm)進行吸光度測定。

蛋白質純化

參考標準方案，自經過濾細胞培養物上清液中純化分離出蛋白質。簡言之，將抗體施加至蛋白質A瓊脂糖管柱(GE Healthcare)上且以PBS洗滌。在酸性pH值下實現抗體之溶離，隨後立即中和樣本。藉由尺寸排阻層析法(Superdex 200,GE Healthcare)在20 mM組胺酸、140 mM NaCl pH 6.0中使聚集蛋白質與單體抗體分離。合併單體抗體溶離份，若需要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)離心濃縮器濃縮且儲存於-80℃下。提供部分樣本以供隨後之蛋白質分析及分析表徵，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析法、質譜法及內毒素測定(參見圖3及4)。

SDS-PAGE

根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。詳言之，使用4-20% NuPAGE® Novex® TRIS-甘胺酸Pre-Cast凝膠及Novex® TRIS-甘胺酸SDS運行緩衝液。(例如參見圖3)。藉由在跑膠之前添加NuPAGE®樣本還原劑來實現樣本之還原。

分析型尺寸排阻層析法

藉由HPLC層析法進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態的尺寸排阻層析。簡言之，將蛋白質A純化抗體施加至在300 mM NaCl、50 mM KH₂ PO₄ /K₂ HPO₄ (pH 7.5)中在Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱上或在2×PBS中在Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。利用UV吸光度及峰面積積分值來定量所溶離之蛋白質。BioRad凝膠過濾標準151-1901用作標準物。(例如參見圖4)。

質譜法

經由電噴霧電離質譜法(ESI-MS)測定及確認交叉抗體之總去糖基化質量。簡言之，在37℃下在100 mM KH₂ PO₄ /K₂ HPO₄ (pH 7)中在達2 mg/ml之蛋白質濃度下用50 mU N-醣苷酶F(PNGaseF,ProZyme)將100 μg經純化抗體去糖基化歷時12-24小時，且隨後經由Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上之HPLC脫鹽。在去糖基化及還原之後藉由ESI-MS測定各別重鏈及輕鏈之質量。簡言之，將115 μl中之50 μg抗體與60 μl 1M TCEP及50 μl 8 M胍鹽酸鹽一起培育，且隨後脫鹽。經由裝備有NanoMate源之Q-Star Elite MS系統上的ESI-MS測定總質量及經還原重鏈及輕鏈之質量。

VEGF結合ELISA

在ELISA檢定中以全長VEGF165-His蛋白(R&D Systems)評估四價抗體(TvAb)之結合特性(圖5)。為此，以100 μl 2 μg/mL於PBS中之重組人類VEGF165(R&D Systems)在室溫下塗覆Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板歷時2小時或在4℃下塗覆隔夜。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下以200 μl 2% BSA 0.1% Tween 20阻斷30分鐘，且隨後以300 μl PBST洗滌3次。向各孔中以每孔100 μL添加經純化<VEGF-ANG-2>TvAb及作為參照之人類抗-ANG-2抗體<ANG-2>抗體Mab536(Oliner等人，Cancer Cell.2004年11月；6(5)：507-16、US 2006/0122370)及抗VEGF抗體<VEGF>抗體G6-31(Liang等人，J Biol Chem.2006年1月13日；281(2)：951-61；US 2007/0141065)於PBS(Sigma)的連續稀釋液(40 pM-0.01 pM)，且在室溫下在微量滴定板振盪器上培育1小時。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下在微量滴定板振盪器上以每孔100 μL 0.1 μg/ml於2% BSA 0.1% Tween 20中之F(ab')<hFcγ>POD(Immuno research)作為偵測抗體偵測所結合之抗體歷時1小時。以每孔300 μL PBST洗滌3次洗去未經結合之偵測抗體，且藉由每孔添加100 μL ABTS來偵測所結合之偵測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上在405 nm量測波長下(參考波長492 nm)進行吸光度測定。

VEGF結合：在37℃下藉由表面電漿共振(Biacore)表徵VEGF結合之動力學特徵

為了進一步證實ELISA發現結果，根據以下方案使用表面電漿共振技術在Biacore T100儀器上定量分析<VEGF>抗體G6-31或Avastin及<VEGF-Ang-2>vAb6或TvAb-2441-貝伐單抗-LC06或TvAb-2441-貝伐單抗-LC08與VEGF之結合且使用T100套裝軟體分析。簡言之，經由與山羊抗人類IgG(JIR 109-005-098)結合將<VEGF>抗體捕捉於CM5晶片上。使用如下標準胺基偶合法藉由胺基偶合固定捕捉抗體：HBS-N緩衝液用作運行緩衝液，針對700 RU配位體密度之目標，以EDC/NHS混合物進行活化。將捕捉抗體稀釋於偶合緩衝液NaAc(pH 5.0，c=2 μg/mL)中，藉由注射1M乙醇胺來阻斷最終仍活化之羧基。在5 μL/min流速及c(Mab<VEGF>)=10 nM下進行Mab<VEGF>抗體捕捉，以運行緩衝液+1 mg/mL BSA稀釋；應達到約30RU之捕捉程度。rhVEGF(rhVEGF,R&D-Systems目錄號293-VE)用作分析物。在37℃下在作為運行緩衝液之PBS+0.005%(v/v)Tween20中進行VEGF結合<VEGF>抗體之動力學表徵。以50 μL/min之流速及80秒締合時間及1200秒解離時間，以300-0.29 nM rhVEGF連續濃度注射樣本。在各分析物循環之後，以10 mM甘胺酸(Glycin)pH 1.5及60秒接觸時間進行游離捕捉抗體表面之再生。藉由使用常用雙重參照法(對照參照：rhVEGF與捕捉分子山羊抗人類IgG之結合，在量測流槽上之空白樣，rhVEGF濃度「0」，模型：朗繆耳(Langmuir)結合1：1，(因為捕捉分子結合，所以Rmax設定為局部))計算動力學常數。圖11顯示Biacore檢定之示意圖。

ANG-2結合ELISA

在ELISA檢定中以全長血管生成素-2-His蛋白(R&D Systems)評估四價抗體(TvAb)之結合特性(圖6a)。為此，以100 μl 1 μg/mL於PBS中之重組人類血管生成素(R&D Systems，無載劑)在室溫下塗覆Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板歷時2小時或在4℃下塗覆隔夜。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下以200 μl 2% BSA 0.1% Tween 20阻斷30分鐘，且隨後以300 μl PBST洗滌3次。向各孔中以每孔100 μL添加經純化<VEGF-ANG-2>TvAb及作為參照之<ANG-2>抗體Mab536及VEGF>抗體G6-31於PBS(Sigma)中的連續稀釋液(40 pM-0.01 pM)，且在室溫下在微量滴定板振盪器上培育1小時。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下在微量滴定板振盪器上以每孔100 μL 0.1 μg/ml於2% BSA 0.1% Tween 20中之F(ab')<hk>POD(Biozol目錄號206005)作為偵測抗體偵測所結合之抗體歷時1小時。以每孔300 μL PBST洗滌3次洗去未經結合之偵測抗體，且藉由每孔添加100 μL ABTS來偵測所結合之偵測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上在405 nm量測波長下(參考波長492 nm)進行吸光度測定。

與ANG-1及ANG-2之比較性結合(ANG-1及ANG-2結合ELISA)

在ELISA檢定中以全長血管生成素-2-His蛋白(R&D Systems #623-AN/CF或內部製得之材料)或血管生成素-1-His(R&D systems #923-AN)評估抗體之結合特性。因此，以100 μl 1 μg/mL於PBS(Sigma)中之重組人類血管生成素-1或血管生成素-2(無載劑)在室溫下塗覆96孔培養板(Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板或Nunc Maxisorb)歷時2小時，或在4℃下塗覆隔夜。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下以200 μl 2% BSA 0.1% Tween 20阻斷30分鐘，且隨後以300 μl PBST洗滌3次。向各孔中以每孔100 μL添加經純化測試抗體於PBS中之連續稀釋液(40 pM-0.01 pM)，且在室溫下在微量滴定板振盪器上培育1小時。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下在微量滴定板振盪器上以每孔100 μL 0.1 μg/ml於2% BSA 0.1% Tween 20中之F(ab')<hk>POD(Biozol目錄號206005)作為偵測抗體偵測所結合之抗體歷時1小時。以每孔300 μL PBST洗滌3次洗去未經結合之偵測抗體，且藉由每孔添加100 μL ABTS來偵測所結合之偵測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上在405 nm量測波長下(參考波長492 nm)進行吸光度測定。

ANG-2結合BIACORE

藉由表面電漿共振使用BIACORE T100儀器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)研究抗體與例如人類ANG-2之抗原的結合。簡言之，為了進行親和力量測，經由胺偶合將山羊<hIgG-Fcγ>多株抗體固定於CM5晶片上，以便呈現針對人類ANG-2之抗體(圖6B)。在25℃下在HBS緩衝液(HBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，ph 7.4))中量測結合。以在溶液中介於6.25 nM與200 nM之間的各種濃度添加經純化ANG-2-His(R&D systems或經內部純化)。藉由ANG-2注射3分鐘來量測締合；藉由以HBS緩衝液洗滌晶片表面3分鐘來量測解離，且使用1：1朗繆耳結合模型(Langmuir binding model)估算KD值。由於ANG-2製劑之不均勻性，因此不能觀測到1：1結合；因此KD值僅為相對估算值。自樣本曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)，以便校正系統固有的基線漂移且減少雜訊。使用Biacore T100評估軟體第1.1.1版分析感測器圖譜及計算親和力資料。或者，可經由PentaHis抗體(PentaHis-Ab，無BSA,Qiagen第34660號)以2000-1700 RU之捕捉程度捕捉Ang-2，該抗體已經由胺偶合固定於CM5晶片上(無BSA)(參見下文)。

對huANG-2與Tie-2之結合的抑制(ELISA)

在室溫下在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，目錄號464718)上進行相互作用ELISA。在各培育步驟之後，以PBST洗滌培養板3次。以0.5 μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems,UK，目錄號313-TI)塗覆ELISA培養板至少2小時。此後，以補充有0.2% Tween-20及2% BSA之PBS(Roche Diagnostics GmbH,DE)阻斷各孔1小時。將經純化抗體於PBS中之稀釋液與0.2 μg/ml hu血管生成素-2(R&D Systems,UK，目錄號623-AN)一起在室溫下培育1小時。洗滌後，添加0.5 μg/ml生物素標記抗血管生成素-2純系BAM0981(R&D Systems,UK)與1：3000稀釋之抗生蛋白鏈菌素HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE，目錄號11089153001)之混合物歷時1小時。此後，以PBST洗滌培養板6次。在室溫下，以新鮮製備之ABTS試劑(Roche Diagnostics GmbH,DE，緩衝液#204 530 001，片劑#11 112 422 001)使培養板顯色30分鐘。在405 nm下量測吸光度。

ANG-2-VEGF橋接ELISA

在ELISA檢定中用經固定全長VEGF165-His蛋白(R&D Systems)及人類ANG-2-His蛋白(R&D Systems)偵測所結合之雙重專一性抗體來評估四價抗體(TvAb)之結合特性(圖7)。僅雙重專一性<VEGF-ANG-2>TvAb能夠同時結合VEGF及ANG-2，且因此橋接兩個抗原，而單專一性「標準」IgG1抗體應不能夠同時結合VEGF及ANG-2(圖7)。

為此，以100 μl 2 μg/mL於PBS中之重組人類VEGF165(R&D Systems)在室溫下塗覆Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板歷時2小時或在4℃下塗覆隔夜。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下以200 μl 2% BSA 0.1% Tween 20阻斷30分鐘，且隨後以300 μl PBST洗滌3次。向各孔中以每孔100 μL添加經純化<VEGF-ANG-2>TvAb及作為參照之<ANG-2>抗體Mab536及<VEGF>抗體G6-31於PBS(Sigma)中的連續稀釋液(40 pM-0.01 pM)，且在室溫下在微量滴定板振盪器上培育1小時。以300 μ PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且藉由添加100 μl 0.5 μg/ml於PBS中之人類ANG-2-His(R&D Systems)偵測所結合之抗體。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌各孔3次，且在室溫下以100 μl0.5 μg/mL<ANG-2>mIgG1-生物素抗體(BAM0981,R&D Systems)偵測所結合之ANG-2歷時1小時。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌3次洗去未經結合之偵測抗體，且在室溫下藉由添加100 μl按1：4稀釋於阻斷緩衝液中之1：2000抗生蛋白鏈菌素-POD結合物(Roche Diagnostics GmbH，目錄號11089153)偵測所結合之抗體歷時1小時。以300 μl PBST(0.2% Tween 20)洗滌3-6次洗去未經結合之抗生蛋白鏈菌素-POD結合物，且藉由每孔添加100 μL ABTS來偵測所結合之抗生蛋白鏈菌素-POD結合物。在Tecan Fluor光譜儀上在405 nm量測波長下(參考波長492 nm)進行吸光度測定。

利用Biacore證明雙重專一性四價抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6與VEGF-A及Ang-2之同時結合

為了進一步證實來自橋接ELISA之資料，建立另一檢定以根據以下方案使用表面電漿共振技術在Biacore T100儀器上確認與VEGF及Ang-2之同時結合，且使用T100套裝軟體(T100 Control第2.01版、T100 Evaluation第2.01版、T100 Kinetics Summary第1.01版)分析：經由PentaHis抗體(PentaHis-Ab，無BSA,Qiagen第34660號)以2000-1700RU之捕捉程度捕捉Ang-2於PBS+0.005%(v/v)Tween20運行緩衝液中，該抗體已經由胺偶合固定於CM5晶片上(無BSA)。HBS-N緩衝液在偶合期間用作運行緩衝液，利用混合物EDC/NHS達成活化。將無BSA之PentaHis-Ab捕捉抗體稀釋於偶合緩衝液NaAc(pH 4.5，c=30 μg/mL)中，藉由注射1 M乙醇胺來阻斷最終仍活化之羧基；測出5000及17000 RU之配位體密度。在5 μL/min之流速下以經運行緩衝液+1 mg/mL BSA稀釋之PentaHis-Ab捕捉500 nM濃度之Ang-2。隨後，藉由與rhVEGF一起培育及形成夾心複合物來證明結合Ang-2及VEGF之<Ang-2,VEGF>雙重專一性抗體。為此，在50 μL/min之流速及100 nM之濃度下雙重專一性<VEGF-Ang-2>TvAb6與Ang-2結合，以運行緩衝液+1 mg/mL BSA稀釋，且藉由在PBS+0.005%(v/v)Tween20運行緩衝液中在50 μL/min之流速及150 nM之VEGF濃度下與VEGF(rhVEGF,R&D-Systems目錄號293-VE)一起培育來偵測同時結合。締合時間120秒，解離時間1200秒。在每次循環後在50 μL/min之流速下以2×10 mM Glycin pH 2.0及60秒之接觸時間進行再生。使用常用雙重參照法(對照參照：雙重專一性抗體與rhVEGF結合以捕捉分子PentaHisAb)來校正感測器圖譜。以rhVEGF濃度「0」量測各Ab之空白樣。圖13中顯示Biacore檢定之流程。圖15中顯示替代性Biacore檢定形式。

產生HEK293-Tie2細胞株

為了測定血管生成素-2抗體對ANGPT2刺激之Tie2磷酸化及細胞上ANGPT2與Tie2之結合的干擾，產生重組HEK293-Tie細胞株。簡言之，使用Fugene(Roche Applied Science)作為轉染試劑將編碼在CMV啟動子控制下之全長人類Tie2(SEQ ID 108)及新黴素抗性標記的基於pcDNA3之質體(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)轉染至HEK293細胞(ATCC)中，且在DMEM 10% FCS、500 μg/ml G418中選擇抗性細胞。經由選殖柱分離個別純系，且隨後用FACS分析Tie2表現。純系22被識別為甚至在無G418存在下亦具有高量且穩定之Tie2表現之純系(HEK293-Tie2純系22)。HEK293-Tie2純系22隨後用於細胞檢定：ANGPT2誘導之Tie2磷酸化及ANGPT2細胞配位體結合檢定。

ANGPT2誘導之Tie2磷酸化檢定

根據以下檢定原理量測ANGPT2抗體對ANGPT2誘導之Tie2磷酸化的抑制。在不存在或存在ANGPT2之狀況下以ANGPT2刺激HEK293-Tie2純系22歷時5分鐘，且用夾心ELISA來定量P-Tie2。簡言之，使每孔2×10⁵ 個HEK293-Tie2純系22細胞在聚-D-離胺酸塗覆之96 孔微量滴定盤上在100 μl DMEM、10% FCS、500 μg/ml遺傳黴素(Geneticin)中生長隔夜。第二天，在微量滴定板中準備ANGPT2抗體之滴定列(4倍濃縮，每孔75 μl最終體積，一式兩份)，且與75 μl ANGPT2[R&D systems # 623-AN]稀釋液(3.2 μg/ml作為4倍濃溶液)混合。將抗體及ANGPT2在室溫下預培育15分鐘。向HEK293-Tie2純系22細胞(與1 mM NaV₃ O₄ (Sigma #S6508)一起預培育5分鐘)中添加100 μl混合物，且在37℃下培育5分鐘。隨後，每孔以200 μl冰冷之PBS+1 mM NaV₃ O₄ 洗滌細胞，且藉由每孔添加120 μl溶解緩衝液(20 mM Tris，pH 8.0、137 mM NaCl、1% NP-40、10%丙三醇、2 mM EDTA、1 mM NaV₃ O₄ 、1 mM PMSF及10 μg/ml抑肽酶(Aprotinin))在冰上溶解。在4℃下在微量滴定板振盪器上溶解細胞30分鐘，且在未預先進行離心及總蛋白質測定之狀況下將100 μl溶胞物直接轉移至p-Tie2 ELISA微量滴定板(R&D Systems,R&D #DY990)中。根據製造商說明書定量P-Tie2量，且使用Excel插入式XLfit4分析(一位點劑量反應，205型)測定抑制之IC₅₀ 值。可比較一個實驗內之IC₅₀ 值，但各實驗的IC₅₀ 值可能不同。

VEGF誘導之HUVEC增殖檢定

選擇VEGF誘導之HUVEC(人臍靜脈內皮細胞，Promocell #C-12200)增殖來量測VEGF抗體之細胞功能。簡言之，將每96孔5000個HUVEC細胞(低繼代次數，5次繼代)在膠原蛋白I塗覆之BD Biocoat膠原蛋白I 96孔微量滴定板(BD #354407/35640)中在100 μl饑餓培養基(EBM-2內皮細胞基礎培養基2(Promocell # C-22211)、0.5% FCS、盤尼西林(Penicilline)/鏈黴素(Streptomycine))中培育隔夜。使不同濃度之抗體與rhVEGF(30 ng1/ml最終濃度，BD # 354107)混合，且在室溫下預培育15分鐘。隨後，將混合物添加至HUVEC細胞中，且將其在37℃、5% CO₂ 下培育72小時。在分析當天，使培養板平衡至室溫歷時30分鐘，且根據手冊(Promega,# G7571/2/3)使用CellTiter-GloTM發光細胞活力檢定套組來測定細胞活力/增殖。以分光光度計測定發光。

四價雙重專一性及四價單專一性抗體之設計

本發明之結合VEGF(VEGF-A)及ANG-2(血管生成素-2)之雙重專一性抗體包含結合VEGF之第一抗原結合位點及結合ANG-2之第二抗原結合位點。作為結合VEGF之第一抗原結合位點，可使用各例如自Liang,W.C.等人，J Biol Chem.281(2)(2006)951-61及US 2007/0141065中詳細描述之人類噬菌體呈現庫源性抗VEGF抗體G6-31產生的SEQ ID NO：23之重鏈可變域及SEQ ID NO：24之輕鏈可變域。或者，例如專一地結合VEGF之第二抗原結合位點包含來自抗VEGF抗體<VEGF>貝伐單抗及<VEGF>B20-4.1.、較佳來自<VEGF>貝伐單抗的SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：100之重鏈可變域及SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101之輕鏈可變域。

可使用包含重鏈可變域SEQ ID NO：31及輕鏈可變域SEQ ID NO：32或具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：32(Kabat編號)之第二抗原結合位點，該等重鏈及輕鏈可變域皆自Oliner,J.等人，Cancer Cell.6(5)(2004)507-16及US 2006/0122370中詳細描述之人類抗ANG-2抗體<ANG-2>Mab536產生。或者，例如專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含來自抗ANG-2抗體<ANG-2>Ang2s_R3_LC03、<ANG-2>Ang2i_LC06、<ANG-2>Ang2i_LC07、<ANG-2>Ang2k_LC08、<ANG-2>Ang2s_LC09、<ANG-2>Ang2i_LC10或<ANG-2>Ang2k_LC11、較佳來自<ANG-2>Ang2i_LC06或<ANG-2>Ang2k_LC08的SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92之重鏈可變域，及輕鏈可變域SEQ ID NO：45、 SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：93。

為了產生組合兩種抗體之特徵的試劑，建構新穎四價雙重專一性抗體源性蛋白質實體。在此等分子中，一種抗體之重組單鏈結合分子經由重組蛋白質融合技術與保持於全長IgG1形式之另一抗體連接。此第二抗體具有所要第二結合專一性。

藉由基因合成及重組分子生物技術，各別抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)藉由甘胺酸絲胺酸(G4S)3或(G4S)4單鏈連接子連接以產生單鏈Fv(scFv)，其使用(G)6-或(G4S)3-連接子與另一抗體重鏈之C端連接。

此外，如先前所述將半胱胺酸殘基引入至結合ANG-2或VEGF之scFv的VH(包括Kabat位置44)及VL(包括Kabat位置100)域中(例如WO 94/029350；Reiter,Y.等人，Nature biotechnology(1996)1239-1245；Young,N.M.等人，FEBS Letters(1995)135-139；或Rajagopal,V.等人，Protein Engineering(1997)1453-59)。

以重組方式產生所有此等分子，加以純化及表徵，且評估蛋白質表現、穩定性及生物活性。

表3中給出用於產生四價雙重專一性<VEGF-ANG-2>、<ANG-2-VEGF>抗體及四價單專一性<ANG-2>抗體的雙重專一性抗體設計之概述。對於此研究，使用術語「TvAb」來描述各種四價蛋白質實體。

為了獲得雙重專一性四價抗體<VEGF-ANG-2>TvAb5及TvAb6，使自源自人類抗ANG-2抗體<ANG-2>Mab536的SEQ ID NO：31之重鏈可變域(VH)及具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：32之輕鏈可變域(VL)產生的結合血管生成素-2之單鏈Fv(scFv)與對應於SEQ ID NO：23之人類抗VEGF抗體<VEGF>G6-31的重鏈載體之C端的序列融合且與基於SEQ ID NO：24之各別輕鏈表現載體共表現。經設計之形式的圖示顯示於圖1B中且列於表3中。

為了獲得雙重專一性四價抗體TvAb9及TvAb15，使自源自人類抗VEGF抗體<VEGF>G6-31的SEQ ID NO：23之重鏈可變域(VH)及SEQ ID NO：24之輕鏈可變域(VL)產生的結合VEGF之單鏈Fv(scFv)與對應於SEQ ID NO：31之人類抗ANG-2抗體<ANG-2>Mab536的重鏈載體之C端的序列融合，且與基於SEQ ID NO：32之各別輕鏈表現載體共表現。經設計之形式的圖示顯示於圖1B中且列於表3中。

TvAb形式例如係基於：a)aa)人類抗VEGF抗體<VEGF>G6-31及ab)自SEQ ID NO：31之重鏈可變域(VH)及具有突變T92L、H93Q及W94T之SEQ ID NO：32之輕鏈可變域(VL)產生的兩個結合血管生成素-2之單鏈Fv(scFv)，其連接於抗VEGF抗體<VEGF>G6-31(SEQ ID NO：23)之重鏈的C端；或b)ba)人類抗ANG-2抗體<ANG-2>Mab536及bb)自SEQ ID NO：23之重鏈可變域(VH)及SEQ ID NO：24之輕鏈可變域(VL)產生的兩個結合VEGF之單鏈Fv(scFv)，其連接於抗ANG-2抗體<ANG-2>Mab536(SEQ ID NO：31)之重鏈的C端；或 c)ca)人類抗VEGF抗體<VEGF>貝伐單抗(Avastin)及cb)自SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：68之重鏈可變域(VH)及SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：69之輕鏈可變域(VL)產生的兩個結合血管生成素-2之單鏈Fv(scFv)，其連接於抗VEGF抗體<VEGF>貝伐單抗(Avastin)之重鏈之C端(所得融合肽之序列為與貝伐單抗SEQ ID NO：104之輕鏈共表現的SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103)。(或者，兩個結合血管生成素-2之單鏈Fv(scFv)亦可連接於輕鏈之C端或重鏈之N端)。

除兩個單鏈Fv(scFv)之外，單鏈Fab片段亦可如上文(使用肽連接體與C或N端融合)、歐洲申請案第09004909.9號及實例10中所述來使用。

實例1 雙重專一性四價抗體之表現及純化 <VEGF-ANG-2>TvAb5、TvAb6、TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08

如上文所述在基因組表現載體中建構相應四價雙重專一性抗體TvAb5及TvAb6之輕鏈及重鏈。使質體在大腸桿菌中擴增，加以純化且隨後轉染以便在HEK293-F細胞中短暫表現重組蛋白質(利用Invitrogen之FreeStyle 293系統)。7天後，收集HEK 293-F細胞上清液，過濾，且利用蛋白質A及尺寸排阻層析法純化雙重專一性抗體。藉由非還原及還原條件下之SDS-PAGE及分析型尺寸排阻層析法確認所有雙重專一性抗體構築體之均質性。在還原條件下(圖3)，具有C端scFv融合的<VEGF-ANG-2>TvAb6之多肽重鏈在SDS-PAGE上顯示約75 kDa的表觀分子尺寸，類似於所計算之分子量。質譜分析確認經純化抗體構築體之身分。所有構築體之表現程度係藉由蛋白質A HPLC分析，且類似於「標準」IgG之表現產量。如由蛋白質A HPLC所測定，蛋白質產量達到每公升細胞培養物上清液達150 mg TvAb6<VEGF-ANG-2>。

在重鏈處具有C端融合scFv之經純化非雙硫鍵穩定構築體TvAb5的尺寸排阻層析分析顯示在單體抗體經由尺寸排阻層析純化後相較於「標準」IgG再次聚集之傾向增大(所謂「菊鏈」現象)。此發現已由其他實例證實(Rajagopal,V.等人，Prot.Engin.(1997)1453-1459；Kobayashi,H.等人，Nucl Med Biol.(1998)387-393或Schmidt,M.等人，Oncogene(1999)18,1711-1721)，該等實例顯示含有並非因VH與VL之間的鏈間雙硫鍵而穩定之scFv的分子展現聚集傾向增大及產量降低。應用scFv部分之雙硫鍵穩定化來解決該等雙重專一性抗體聚集的問題。為此，在scFv之VH及VL內在確定位置(根據Kabat編號方案的位置VH44/VL100)處引入單個半胱胺酸置換。此等突變使VH與VL之間能夠形成穩定的鏈間雙硫鍵，此又使所得雙硫鍵穩定scFv模塊穩定。在TvAb6<VEGF-ANG-2>中之Fv的C端處引入scFv中之VH44/VL100雙硫鍵產生穩定四價抗體，該抗體在純化後不再顯示有聚集傾向且保持單體狀態(圖4)。此外，TvAb6<VEGF-ANG-2>顯示在重複凍融循環(例如在活體外及活體內應用之3 mg/kg的濃度下)後聚集傾向無增加。

類似於所述程序製備及以分析方式表徵表3中所述之所有其他TvAb分子(例如TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08)。

實例2 雙重專一性四價抗體<VEGF-ANG-2>TvAb6、TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08與VEGF-A及ANG-2之同時結合

將不同雙重專一性抗體形式之IgG模塊中所保持的Fv及scFv模塊之結合與結合模塊及雙重專一性抗體所源自之「野生型」IgG的結合比較。藉由進行生物化學結合ELISA及應用表面電漿共振(Biacore)在等莫耳濃度下進行此等分析。

對<VEGF-ANG-2>TvAb6而言，如由上文所述之VEGF結合ELISA所示，其在0.625 pM等莫耳濃度下以與親本抗體G6-31相當的程度結合VEGF(圖5)。當TvAb之Fv區與G6-31之Fv區一致時可預期此發現結果。<VEGF-ANG-2>TvAb6與<VEGF>G6-31之間的略微差異係由蛋白質濃度的小差異及C端scFv對<hFc>-POD偵測抗體之結合的輕微空間干擾引起，且可藉由應用<hk>POD(Biozol目錄號206005)偵測抗體(如用於ANG-2結合ELISA)克服。

在37℃下使用典型濃度系列使用Biacore確認此等發現(圖11)。此等資料顯示4.7-4.8 E+6 1/(Ms)之快速Kon速率k(a)，在最高濃度之VEGF下達到飽和。Koff速率達到技術規範之極限(亦即5×E-6(s/s))，此可能仍然係因為在此條件下由於二聚分析物rhVEGF所致之二價結合(親和力效應)，儘管使用極低配位體密度導致10-15 RU之最終VEGF反應亦然。然而，不同<VEGF>抗體之動力學常數可以此方法來比較且在該方法之誤差範圍內，在四價雙重專一性抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6與初始抗體<VEGF>G6-31之動力學常數之間不存在可偵測出之明顯差異。在此等條件下，利用此方法得知，<VEGF-Ang-2>TvAb6與<VEGF>G6-31之動力學常數實質上相同。因此，可推斷出TvAb6完全保留其VEGF結合特性。表4顯示各別動力學常數且圖12顯示Ka-Kd圖中兩種<VEGF>抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6及<VEGF>G6-31的動力學特徵。

在另一實驗中，如上文所述利用ANG-2結合ELISA使用<hk>-POD偵測抗體(Biozol目錄號206005)顯示出<VEGF-ANG-2>TvAb6在0.039 pM之等莫耳濃度下以與Mab536相當之方式結合ANG-2(圖6A)。此顯示TvAb6之scFv模塊保留其在TvAb構築體中之結合特性。

為了進一步證實此發現結果，使<ANG-2>Mab536及<VEGF-ANG-2>TvAb6藉由二次抗體固定於Biacore CM5晶片上且測定與人類ANG-2之結合動力學。由於ANG-2製劑之不均勻性，因此不能觀測到1：1結合；因此KD值僅為相對估算值。Biacore分析顯示<VEGF-ANG-2>TvAb6針對ANG-2之估算KD值為4.4 nM。相較而言，Mab536之估算KD值為1.6 nM。在該方法之誤差範圍內，不能觀測到<ANG-2>Mab536與<VEGF-ANG-2>TvAb6之間的結合模式及親和力之差異(圖6B)。因此，可推斷TvAb6之scFv模塊完全保留其在TvAb構築體中之結合特性。

為了證實<VEGF-ANG-2>TvAb6能夠同時結合VEGF及ANG-2，應用如上文所述之橋接ELISA檢定及Biacore檢定。

藉由應用上文所述之VEGF-ANG-2-橋接ELISA，顯示僅<VEGF-ANG-2>TvAb6能夠在0.625 pM之等莫耳濃度下同時結合VEGF及ANG-2，而單專一性「標準」IgG1抗體<ANG-2>Mab536及<VEGF>G6-31不能夠同時結合VEGF及ANG-2(圖7)。

圖14顯示來自Biacore檢定之各別資料。可顯示出四價雙重專一性抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6同時結合兩種抗原Ang-2及VEGF。陰性對照正如所料：單專一性抗體<Ang-2>Mab536顯示僅結合Ang-2，但無VEGF結合。單專一性抗體<VEGF>G6-31顯示結合VEGF，但完全不與Ang-2結合(資料未顯示)。根據結合Ang-2塗覆表面且隨後結合二聚VEGF之四價雙重專一性抗體<VEGF-Ang-2>TvAb6的相對反應單位，可計算出結合化學計量在1：1至1：1.4範圍內。總之，藉由應用所述之ELISA及Biacore檢定，顯示僅<VEGF-Ang-2>TvAb6能夠同時結合VEGF及Ang-2，而單專一性「標準」IgG1抗體<Ang-2>Mab536及<VEGF>G6-31不能夠同時結合VEGF及Ang-2(圖15)。

在圖15A中所示之類似Biacore檢定中，對於構築體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08獲得類似結果。藉由表面電漿共振使用BIACORE T100儀器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)研究抗體與例如人類ANG-2及VEGF之抗原的結合。簡言之，為了進行親和力量測，經由胺偶合將山羊<hIgG-Fcγ>多株抗體固定於CM4晶片上，以便呈現針對人類ANG-2及VEGF之雙重專一性抗體。在25℃下在HBS緩衝液(HBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，ph 7.4))中量測結合。以在溶液中介於6.25 nM與200 nM之間的各種濃度添加經純化ANG-2-His(R&D systems或經內部純化)。藉由ANG-2注射3分鐘來量測締合；藉由以HBS緩衝液洗滌晶片表面3分鐘來量測解離，且使用1：1朗繆耳結合模型(Langmuir binding model)估算KD值。由於ANG-2製劑之不均勻性，因此不能觀測到1：1結合；因此KD值僅為相對估算值。

以在溶液中介於6.25 nM與200 nM之間的各種濃度添加VEGF(R&D systems)。藉由VEGF注射3分鐘來量測締合；藉由以HBS緩衝液洗滌晶片表面3分鐘來量測解離，且使用1：1朗繆耳結合模型估算KD值。

結合搭配物之注射順序可加以轉換，首先VEGF且接著Ang2，或反之亦然。

自樣本曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)，以便校正系統固有的基線漂移且減少雜訊。使用Biacore T100評估軟體第1.1.1版分析感測器圖譜及計算親和力資料。

最終，可藉由與ANGPT2及VEGF一起以連續方式培育來證實TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08之同時結合。如圖15B中所示，ANGPT2及VEGF可同時與雙重專一性抗體結合。

實例3 雙硫鍵穩定之雙重專一性四價抗體<VEGF-ANG-2>TvAb6相較於<ANG-2>Mab536、<VEGF>G6-31及Mab536與G6-31之組合在分階段皮下Colo205異種移植模型中在Scid Beige小鼠中之活體內功效

在兩階段皮下Colo205異種移植模型研究(Ang2_PZ_Colo205_003及Ang2_PZ_Colo205_005)中，在雌性Scid Beige小鼠中，在不同劑量下，比較經純化之雙硫鍵穩定<VEGF-ANG-2>TvAb6(n00.2331，參見表3)與抗體<ANG-2>Mab536、<VEGF>G6-31及<ANG-2>Mab536與<VEGF>G6-31之組合。

提供20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0)中之抗體<ANG-2>Mab536作為冷凍儲備溶液(c=4.5 mg/mL)，提供20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0)中之<VEGF>G6-31作為冷凍溶液(c=0.6 mg/mL)，且提供20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0)中之<VEGF-ANG-2>TvAb6作為冷凍儲備溶液(c=0.5 mg/mL)。若需要，則在注射前將抗體溶液自儲備液適當稀釋於PBS中，且PBS係用作媒劑。

細胞株及培養條件：Colo205人類結腸直腸癌細胞最初獲自ATCC，且在擴展後寄存於Roche Penzberg國際細胞庫中。在37℃下，在水飽和氛圍中，在5% CO₂ 下，在補充有10%胎牛血清(PAA Laboratories,Austria)及2 mM L-麩胺醯胺之RPMI 1640培養基(PAA,Laboratories,Austria)中以常規方式培養腫瘤細胞株。第2-5繼代用於移植。

動物：雌性SCID Beige小鼠；到達時年齡4-5週(購自Charles River Germany)，根據所提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持於12小時光照/12小時黑暗之每日循環的特定無病原體條件下。實驗研究方案係由地方政府評審及批准。到達後，將動物保持在動物設施之隔離部分中歷時一週，以習慣新環境且以供觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。任意地提供膳食(Provimi Kliba 3337)及水(酸化pH 2.5-3)。研究開始時，小鼠年齡為約10週。

監測：每日監控動物之臨床症狀且偵測不利影響。為了在整個實驗期間進行監測，記錄動物體重且在分階段後用測徑規量測腫瘤體積。

腫瘤細胞注射：在注射當天，將Colo205細胞離心，洗滌1次且再懸浮於PBS中。在以PBS作另一次洗滌後，使用細胞計數器及分析器系統(Vi-CELL,Beckman Coulter)測定細胞濃度及細胞尺寸。為了注射Colo205細胞，將最終效價調整至每毫升5.0×10E7個細胞，活力為約90%。隨後，將100 μl此懸浮液(對應於每隻動物2.5×10⁶ 個細胞)皮下注射至小鼠右側腹中。

分別在細胞移植後16天(研究Ang2_PZ_Colo205_003)及細胞移植後14天(研究Ang2_PZ_Colo205_005)的隨機分組當天，在100 mm³ 或150 mm³ 之平均腫瘤體積下開始動物處理。

直至研究Ang2_PZ_Colo205_003第74天之給藥時程(參見圖8A)：

在研究Ang2_PZ_Colo205_003中，<VEGF-ANG-2>TvAb6之等莫耳比率由於出錯而劑量不足。在研究Ang2_PZ_Colo205_005中調整<VEGF-ANG-2>TvAb6之劑量，從而用<VEGF-ANG-2>TvAb6以及<VEGF>G6-31與<ANG-2>Mab536之組合使動物接受等莫耳比之ANG-2及VEGF結合位點。

直至Ang2_PZ_Colo205_003研究第74天之腫瘤生長抑制(參見圖8a)：7 mg/kg劑量下之<VEGF-ANG-2>TvAb6展現與5 mg/kg之<VEGF>G6-31與6 mg/kg之<ANG-2>Mab536的組合及6 mg/kg劑量下作為單獨藥劑之<VEGF>G6-31相當之功效(圖8A)，且優於6 mg/kg劑量下之單獨藥劑<ANG-2>Mab536。由於皮下Colo205模型對能阻斷人類以及鼠類VEGF導致幾乎完全之腫瘤生長抑制的<VEGF>G6-31抗體極具反應性，因此在所選實驗條件下<VEGF-ANG-2>TvAb6不能與作為單獨藥劑之G6-31(6 mg/kg)區分開來，而<VEGF-ANG-2>TvAb6在明顯較低的累積劑量下顯示與<ANG-2>Mab536與<VEGF>G6-31之組合相當之抑制(<VEGF-ANG-2>TvAb6=56 mg/kg抗體，相較於<ANG-2>Mab536與<VEGF>G6-31之組合=40+48=88 mg/kg抗體)。

直至研究Ang2_PZ_Colo205_005第63天之給藥時程：

直至Ang2_PZ_Colo205_005研究第63天之腫瘤生長抑制4 mg/kg劑量下之<VEGF-ANG-2>TvAb6展現與各為3 mg/kg之<VEGF>G6-31與<ANG-2>Mab536之組合相當的功效，且優於3 mg/kg劑量下之單獨藥劑<VEGF>G6-31以及<ANG-2>Mab536(圖8B)。此為第一實例，其顯示靶向VEGF及ANG-2之雙重專一性抗體在較低劑量下(關於抗體之總計濃度-組合之累積劑量為28 mg/kg雙重專一性抗體TvAb6相對於 21+21=42 m/kg)可導致產生與阻斷VEGF及ANG-2的各別單獨藥劑之組合相當的強力抗腫瘤功效，且優於任一單獨藥劑。

實例4 對VEGF誘導之管形成的阻斷

為了確認雙重專一性四價<VEGF-ANG-2>TvAb6中保留有抗VEGF相關活性，在VEGF誘導之管形成檢定AngioKit TCS CellWorks(CellSystems)中顯示<VEGF-ANG-2>TvAb6介導之對管形成的劑量依賴性抑制與單專一性抗體<VEGF>G6-31相當。根據以下程序進行AngioKit TCS CellWorks檢定：在第1天、第4天、第7天及第9天以抗體處理之前，每次以2 ng/ml VEGF刺激細胞。藉由在第11天使用CD31-PE抗體(BD Pharmingen #555446)染色內皮細胞來顯現血管。在4倍放大率下拍照且使用MetaMorph(Molecular Devices)中之血管生成管形成應用模組來定量分析管長度值及分支點數。藉由每試樣4張照片的重複及分析來計算值及標準偏差。圖9顯示各別結果且圖10 A及圖10B顯示定量分析。血管生成素-2對管形成無影響，且因此在此研究中未研究ANG-2的抑制。資料顯示雙重專一性<VEGF-ANG-2>TvAb6及單專一性<VEGF>G6-31抗體對抑制VEGF刺激之管形成同等有效。

實例5 Tie2磷酸化

為了確認雙重專一性四價<VEGF-ANGPT2>抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08中保留有抗ANGPT2相關活性，在如上文所述之ANGPT2刺激之Tie2磷酸化檢定中顯示TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08以與其母純系LC06及LC08相當之方式干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。

在第一實驗中，兩種雙重專一性抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06 及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08顯示以與母純系LC06及LC08相當之IC50值劑量依賴性地干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，如圖16A中所示。TvAb-2441-貝伐單抗-LC06以約721 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，而LC06以約508 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。TvAb-2441-貝伐單抗-LC08以約364 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，而LC08以約499 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。

在第二實驗中，兩種雙重專一性抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08顯示以與母純系LC06及LC08相當之IC50值劑量依賴性地干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，如圖16B中所示。TvAb-2441-貝伐單抗-LC06以約488 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，而LC06以約424 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。TvAb-2441-貝伐單抗-LC08以約490 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化，而LC08以約399 ng/ml之IC50值干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。

總之，此等資料顯示雙重專一性四價<VEGF-ANGPT2>抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08以與其母純系LC06及LC08相當之方式在此細胞檢定之誤差範圍內干擾ANGPT2刺激之Tie2磷酸化。

實例6 對huANG-2與Tie-2之結合的抑制(ELISA)

在室溫下在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，目錄號464718)上進行相互作用ELISA。在各培育步驟之後，以PBST洗滌培養板3次。以0.5 μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems,UK，目錄號313-TI)塗覆ELISA培養板至少2小時。此後，以補充有0.2% Tween-20及2% BSA之PBS(Roche Diagnostics GmbH,DE)阻斷各孔1小時。將經純化抗體於 PBS中之稀釋液與0.2 μg/ml hu血管生成素-2(R&D Systems,UK，目錄號623-AN)一起在室溫下培育1小時。洗滌後，添加0.5 μg/ml生物素標記抗血管生成素-2純系BAM0981(R&D Systems,UK)與1：3000稀釋之抗生蛋白鏈菌素HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE，目錄號11089153001)之混合物歷時1小時。此後，以PBST洗滌培養板6次。在室溫下，以新鮮製備之ABTS試劑(Roche Diagnostics GmbH,DE，緩衝液#204 530 001，片劑#11 112 422 001)使培養板顯色30分鐘。在405 nm下量測吸光度。

Ang2相互作用ELISA之匯總資料：

實例7 對hVEGF與hVEGF受體之結合的抑制(ELISA)

在室溫下在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，目錄號464718)上進行測試。在各培育步驟之後，以PBST洗滌培養板3次。開始時，以0.5 μg/ml hVEGF-R蛋白(R&D Systems,UK，目錄號321-FL)塗覆培養板，持續至少2小時。此後，以補充有0.2% Tween-20及2% BSA之PBS(Roche Diagnostics GmbH,DE)阻斷各孔1小時。將經純化抗體於PBS中之稀釋液與0.15 μg/ml huVEGF121(R&D Systems,UK，目錄號298-VS)一起在室溫下培育1小時。洗滌後，添加0.5 μg/ml抗VEGF純系Mab923(R&D Systems,UK)與1：2000結合辣根過氧化酶(HRP)之F(ab')2抗小鼠IgG(GE Healthcare,UK，目錄號NA9310V)的混合物歷時1小時。此後，以PBST洗滌培養板6次。在室溫下，以新鮮製備之ABTS試劑(Roche Diagnostics GmbH,DE，緩衝液#204 530 001，片劑#11 112 422 001)使培養板顯色30分鐘。在405 nm下量測吸光度。

VEGF相互作用ELISA之匯總資料：

實例8 HUVEC增殖

為了確認雙重專一性四價<VEGF-ANG2>抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08中保留有抗VEGF相關活性，顯示TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08在如上文所述之VEGF誘導之HUVEC增殖檢定中以與其母純系LC06及LC08相當之方式干擾VEGF誘導之HUVEC增殖。

圖18顯示TvAb-2441-貝伐單抗-LC06及TvAb-2441-貝伐單抗-LC08實際上以濃度依賴性方式與親本抗體貝伐單抗相當地干擾VEGF誘導之HUVEC增殖。

實例9 人類ANG-1及人類ANG-2之ELISA結合檢定

在如上文所述之ANG-1或ANG-2結合ELISA中測定親本<ANG-2>抗體Ang2i-LC06、Ang2i-LC07及Ang2k-LC08與人類ANG-1及人類ANG-2之結合(參見與ANG-1及ANG-2之比較性結合(ANG-1及ANG-2結合ELISA))。簡言之，ELISA型檢定係基於人類野生型血管生成素-1或-2在微量滴定板中之固定。經由<人類Fc>(抗IgG)抗體以POD結合物量測針對經固定ANG-1或ANG-2之抗體結合。連續稀釋<ANG-2>抗體允許測定EC₅₀ 濃度。使用人類抗ANG-2抗體<ANG-2>抗體Mab536(Oliner等人，Cancer Cell.2004年11月；6(5)：507-16、US 2006/0122370)作為參照。所測定EC50濃度概示於下表中。

所有抗體均專一地結合於ANG-2。MAb536及Ang2k-LC08亦顯示針對ANG-1之專一性結合，而Ang2i-LC06及Ang2i-LC07並不專一地結合ANG-1，因為其具有高於8000 ng/ml(偵測極限)之EC50值。

實例10 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFAb-Avastin- LC06-2620、scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2640及scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2641之表現及純化

類似於以上實例1及材料與方法中所述之程序，表現及純化雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFAb-Avastin-LC06-2620、scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2640及scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2641(所有三者均基於<VEGF>貝伐單抗及<ANG-2>Ang2i-LC06)。如上文實例中所述測定結合親和力及其他特性。此等雙重專一性抗體之相關(最終經修飾)輕鏈及重鏈胺基酸序列在SEQ ID NO：109-110(scFAb-Avastin-LC06-2620)、SEQ ID NO：111-112(scFAb-Avastin-LC06-2640)及SEQ ID NO：113-114(scFAb-Avastin-LC06-2641)中給出。

實例11 雙重專一性三價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-KiH-C-scFab之表現及純化

類似於以上實例1及材料與方法中所述之程序，表現及純化基於<VEGF>貝伐單抗及<ANG-2>Ang2i-LC06之雙重專一性三價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-KiH-C-scFab。如上文實例中所述測定結合親和力及其他特性。此雙重專一性抗體之相關(最終經修飾)輕鏈及重鏈胺基酸序列在SEQ ID NO：115-117(Avastin-LC06- KiH-C-scFab)中給出。

實例12 雙重專一性三價<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-C-Fab-6CSS之表現及純化

類似於以上實例1及材料與方法中所述之程序(亦參見上文)，表現及純化基於<VEGF>貝伐單抗及<ANG-2>Ang2i-LC06之雙重專一性三價<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-C-Fab-6CSS。如上文實例中所述測定結合親和力及其他特性。此形式之雙重專一性三價抗體分子大體描述於歐洲申請案第09005108.7號中。此雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體之相關(最終經修飾)輕鏈及重鏈胺基酸序列在SEQ ID NO：118-120(Avastin-LC06-C-Fab-6CSS)中給出。

實例13 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL、Avastin-LC06-VH-VL及Avastin-LC06-VH-VL-SS之表現及純化

類似於以上實例1及材料與方法中所述之程序，表現及純化基於<VEGF>貝伐單抗及<ANG-2>Ang2i-LC06之雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL(CH-CL交換係如WO 2009/080253中所述)、Avastin-LC06-VH-VL(VH-VL交換係如WO 2009/080252中所述)及Avastin-LC06-VH-VL-SS(VH-VL交換係如WO 2009/080252中所述，且另外引入VH44 VL100雙硫橋)。如上文實例中所述測定結合親和力及其他特性。此等雙重專一性抗體之相關(最終經修飾)輕鏈及重鏈胺基酸序列在SEQ ID NO：121-124(Avastin-LC06-CH1-CL)、SEQ ID NO：125-128(Avastin-LC06-VH-VL)及SEQ ID NO：129-132(Avastin-LC06-VH-VL-SS)中給出。

實例14 雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFab及Avastin-LC06-N-scFabSS之表現及純化

類似於以上實例1及材料與方法中所述之程序，表現及純化基於 <VEGF>貝伐單抗及<ANG-2>Ang2i-LC06之雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFab及Avastin-LC06-N-scFabSS。如上文實例中所述測定結合親和力及其他特性。此等雙重專一性抗體之相關經修飾重鏈胺基酸序列在SEQ ID NO：133-134(Avastin-LC06-N-scFab)及SEQ ID NO：135-136(Avastin-LC06-N-scFabSS)中給出。

實例15 實例10至14之雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體分子的對hVEGF與hVEGF受體之結合的抑制(ELISA)、對VEGF誘導之管形成的阻斷、對huANG-2與Tie-2之結合的抑制(ELISA)、Tie2磷酸化及HUVEC增殖

可類似於以上材料與方法及實例4至9中所述之程序來測定實例10至14之雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體分子的對hVEGF與hVEGF受體之結合的抑制(ELISA)、對VEGF誘導之管形成的阻斷、對huANG-2與Tie-2之結合的抑制(ELISA)、Tie2磷酸化及HUVEC增殖。

實例16 雙重專一性抗體<VEGF-ANG-2>抗體相較於<ANG-2>ANG2i-LC06及<ANG-2>ANG2i-LC06與Avastin之組合在難治癒Colo205異種移植模型中在Scid Beige小鼠中之活體內功效(在對貝伐單抗(Avastin)治療 具抗性後) 細胞株及培養條件：

Colo205人類結腸直腸癌細胞最初獲自ATCC，且在擴展後寄存於Roche Penzberg國際細胞庫中。在37℃下，在水飽和氛圍中，在5% CO₂ 下，在補充有10%胎牛血清(PAA Laboratories,Austria)及2 mM L-麩胺醯胺之RPMI 1640培養基(PAA,Laboratories,Austria)中以常規方式培養腫瘤細胞株。第2-5繼代用於移植。

動物：

雌性SCID Beige小鼠；到達時年齡4-5週(購自Charles River Germanyd)，根據所提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持於12小時光照/12小時黑暗之每日循環的特定無病原體條件下。實驗研究方案係由地方政府評審及批准。到達後，將動物保持在動物設施之隔離部分中歷時一週，以習慣新環境且以供觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。任意地提供膳食(Provimi Kliba 3337)及水(酸化pH 2.5-3)。研究開始時，小鼠年齡為約10週。

腫瘤細胞注射：

在注射當天，自培養瓶(Greiner)收集腫瘤細胞(胰蛋白酶-EDTA)且轉移至50 ml培養基中，洗滌1次且再懸浮於PBS中。在使用PBS進行另一洗滌步驟及過濾(細胞過濾器；Falcon Φ100 μm)後，將最終細胞效價調整為2.5×10⁷ /ml。以移液管小心地混合腫瘤細胞懸浮液以避免細胞聚集。此後，使用寬針(1.10×40 mm)將細胞懸浮液填充至1.0 ml結核菌素注射器(Braun Melsungen)中；改變針尺寸(0.45×25 mm)以供注射且每次注射使用新針。使用具有預培育室(塑膠玻璃)、個別小鼠鼻罩(矽)及非可燃性或非爆炸性麻醉化合物異氟醚(cp-pharma)之小動物Stephens吸入單元在封閉循環系統中進行麻醉。在注射之前兩天，剃去動物皮毛且以解剖鉗小心地提起經麻醉動物之皮膚以供細胞注射，且在動物右側腹皮下注射100 μl細胞懸浮液(=2.5×10⁶ 個細胞)。

動物處理 預處理：

在細胞移植後14天(研究Ang2_PZ_Colo205_008)分別在100 mm³ 至150 mm³ 之平均腫瘤體積下開始動物處理。對小鼠每週一次以Avastin(10 mg/kg)處理，歷時5週之時間。

二次處理：

此後，小鼠隨機接受第二次處理且分為四組，每組10隻小鼠。在二次處理開始時在第51天，腫瘤體積在336至341 mm³ 範圍內。對小鼠以下表所示之不同化合物每週一次經腹膜內處理。

監測：

每週兩次監控動物之健康狀況。在細胞注射後每週兩次記錄體重。在分階段之日開始且隨後在整個處理期間每週兩次用測徑規量測腫瘤尺寸。根據NCI方案計算腫瘤體積(腫瘤重量=1/2ab² ，其中「a」及「b」分別為腫瘤之長直徑及短直徑)。終止標準為臨界腫瘤質量 (達1.7 g或>1.5 cm)、體重損失與基線相差超過20%、腫瘤潰爛或動物總體狀況不良。

結果：第91天基於中值之腫瘤生長抑制(以百分比計)

結果顯示，在貝伐單抗(Avastin)抗性異種移植腫瘤模型Colo205中在Scid Beige小鼠中，雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體TvAb-2441-貝伐單抗-LC06相較於以單獨之單專一性抗體ANG2i-LC06或ANG2i-LC06與Avastin之組合處理顯示較高腫瘤生長抑制率(在較低劑量下)。

實例17 在皮下Calu-3 NSCLC異種移植中腫瘤血管生成之活體內抑制-使用經標記之抗CD31經由非侵入式活體內成像偵測血管生成細胞株及培養條件：

自患有肺癌之男性高加索人建立此人類肺腺癌細胞株。自Roche，Kamakura獲得細胞且室內繼代用於處理細胞庫。在37℃下，在水飽和氛圍下，在5% CO₂ 下，在補充有10%胎牛血清(PAN Biotech,Germany)及2 mM L-麩胺醯胺(PAN Biotech,Germany)之RPMI1640培養基(PAN Biotech,Germany)中以常規方式培養腫瘤細胞。以胰蛋白酶/EDTA 1×(PAN)進行培養繼代，每週分裂一次。

動物：

雌性BALB/c裸小鼠；到達時年齡4-5週(購自Charles River Germany)，根據所提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持於12小時光照/12小時黑暗之每日循環的特定無病原體條件下。實驗研究方案係由地方政府評審及批准。到達後，將動物保持在動物設施之隔離部分中歷時一週，以習慣新環境且以供觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。任意地提供膳食(Provimi Kliba 3337)及水(酸化pH 2.5-3)。研究開始時，小鼠年齡為約10週。

腫瘤細胞注射：

在注射當天，自培養瓶(Greiner)收集腫瘤細胞(胰蛋白酶-EDTA)且轉移至50 ml培養基中，洗滌1次且再懸浮於PBS中。在使用PBS進行另一洗滌步驟及過濾(細胞過濾器；Falcon Φ100 μm)後，將最終細胞效價調整為5.0×10⁷ /ml。以移液管小心地混合腫瘤細胞懸浮液以避免細胞聚集。此後，使用寬針(1.10×40 mm)將細胞懸浮液填充至1.0 ml結核菌素注射器(Braun Melsungen)中；改變針尺寸(0.45×25 mm)以供注射且每次注射使用新針。使用具有預培育室(塑膠玻璃)、個別小鼠鼻罩(矽)及非可燃性或非爆炸性麻醉化合物異氟醚(cp-pharma)之小動物Stephens吸入單元在封閉循環系統中進行麻醉。在注射之前兩天，剃去動物皮毛且以解剖鉗小心地提起經麻醉動物之皮膚以供細胞注射，且在動物右側腹皮下注射100 μl細胞懸浮液(=5.0×10⁶ 個細胞)。

動物處理

在研究第35天，將小鼠根據其體重及腫瘤尺寸隨機分為統計學上均勻分布之組。對於以治療性抗體處理而言，各組由10隻小鼠組成且每週一次經腹膜內以治療性抗體進行處理，歷時6週時間段。(參見圖19)。

第1組：媒劑(Xolair)10 mg/kg

第2組：Avastin 10 mg/kg

第3組：單專一性<VEGF>Avastin 10 mg/kg加上單專一性<ANG-2>Ang2i-LC06 10 mg/kg(=Avastin/Ang2i-LC06)的組合

第4組：雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體2441-Avastin-scFv-LC06 13.3 mg/kg

監測：

每週兩次監控動物之健康狀況。在細胞注射後每週兩次記錄體重。在分階段之日開始且隨後在整個處理期間每週兩次用測徑規量測腫瘤尺寸。根據NCI方案計算腫瘤體積(腫瘤重量=1/2ab² ，其中「a」及「b」分別為腫瘤之長直徑及短直徑)。終止標準為臨界腫瘤質量(達1.7 g或>1.5 cm)、體重損失與基線相差超過20%、腫瘤潰爛或動物總體狀況不良。

以經標記抗CD 31抗體監測血管及血管生成

初步研究顯示抗CD31抗體為最適於使腫瘤維管結構成像之藥劑。此藥劑靶向小鼠內皮CD31受體且以低信號背景比顯現單一血管。因此，抗CD31抗體之成像代表一種使腫瘤維管結構成像之可行方式。在第35天、第49天及第79天，對各治療組選擇3隻小鼠且每隻小鼠經靜脈內注射50 μg經有機螢光團Alexa610共價標記之抗CD3抗體。在吸入麻醉下在每次投與經標記抗體後24小時進行近紅外成像。藉由使用MAESTRO系統之影像比較工具來顯現腫瘤維管結構之增加或減少。在以對照mab Xolair及治療性抗體Avastin處理下，自第35天至第79天觀測到腫瘤血管增加。與此相反，以Avastin加上Ang2i-LC06及2441-Avastin-scFv-LC06組合處理展現腫瘤維管結構減少(圖19)。

藉由手工繪出量測區域來定量腫瘤區域，且以強度值評估信號強度(總信號/暴露時間)。第35天至第49天及第49天至第79天的CD31信號之平均變化繪示於圖19中。所有處理組均顯示第35天至第49天腫瘤維管結構有增加。儘管在第1組(Xolair)及第2組(Avastin)中CD31腫瘤信號穩定增加，但第3組(Avastin加上<ANG-2>Ang2i-LC06之組合)及第4組(雙重專一性<VEGF-ANG-2>抗體2441-Avastin-scFv-LC06)中腫瘤維管結構顯著減少，同時第4組顯然顯示最明顯的抗血管生成效應(圖19)。

在最後活體內成像研究後立即對腫瘤進行組織培養(第79天)，固定於福馬林中且嵌埋入石蠟中以供離體研究。螢光顯微法顯示在經對照mab Xolair處理之腫瘤中有許多清晰的毛細管。在以Avastin處理之小鼠中觀測到若干腫瘤血管。與此對比，處理組3及4相較於處理組1及2在腫瘤中具有顯著較少及較不清晰之血管，而第4組顯示最明顯的效應。第4組顯示較低微血管密度，毛細管普遍較小且未結構化，且其展示如第1組、第2組及第3組之較弱抗CD31螢光信號。組織化學HE染色顯示雙重專一性抗體之處理組中腫瘤內壞死區達90%，第4組即顯示出同樣結果。

實例18 在分階段皮下Colo205異種移植模型中在Scid Beige小鼠中雙重專一性抗體<VEGF-ANG-2>之活體內功效且與親本單專一性抗體(單獨或組合)比較 細胞株及培養條件：

動物：

雌性SCID Beige小鼠；到達時年齡4-5週(購自Charles River Germany)，根據所提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持於12小時光照/12小時黑暗之每日循環的特定無病原體條件下。實驗研究方案係由地方政府評審及批准。到達後，將動物保持在動物設施之隔離部分中歷時一週，以習慣新環境且以供觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。任意地提供膳食(Provimi Kliba 3337)及水(酸化pH 2.5-3)。研究開始時，小鼠年齡為約10週。

腫瘤細胞注射：

在注射當天，將Colo205細胞離心，洗滌1次且再懸浮於PBS中。在以PBS作另一次洗滌後，使用細胞計數器及分析器系統(Vi-CELL,Beckman Coulter)測定細胞濃度及細胞尺寸。為了注射Colo205細胞，將最終效價調整至每毫升5.0×10E7個細胞，活力約為90%。隨後，將100 μl此懸浮液(對應於每隻動物2.5×10⁶ 個細胞)皮下注射至小鼠右側腹中。

分別在細胞移植後16天(研究Ang2_PZ_Colo205_009)的隨機分組當天，在100 mm³ 之平均腫瘤體積下開始動物處理。

研究Ang2_PZ_Colo205_009之給藥時程：

監測：

每週兩次監測動物之健康狀況。在細胞注射後每週兩次記錄體重。在分階段之日開始且隨後在整個處理期間每週兩次用測徑規量測腫瘤尺寸。根據NCI方案計算腫瘤體積(腫瘤重量=1/2ab² ，其中「a」及「b」分別為腫瘤之長直徑及短直徑)。終止標準為臨界腫瘤質量(達1.7 g或>1.5 cm)、體重損失與基線相差超過20%、腫瘤潰爛或動物總體狀況不良。

結果：

第61天基於中值之腫瘤生長抑制(TGI)(以百分比計)

結果顯示，所有三種雙重專一性<VEGF-ANG-2>Avastin(貝伐單抗)-ANG2i-LC06抗體(均基於貝伐單抗序列SEQ ID No：7及8且基於ANG2i-LC06序列SEQ ID No：52及53)在異種移植腫瘤模型Colo205中在Scid Beige小鼠中相較於以單獨之單專一性抗體ANG2i-LC06及Avastin或ANG2i-LC06與Avastin之組合處理顯示較高腫瘤生長抑制率。

<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司

<120> 雙重專一性之抗-VEGF/抗-ANG-2抗體

<130> 25401 FT

<140> 098134012

<141> 2009-10-07

<150> EP 08017607.6；EP 08021834.0

<151> 2008-10-08；2008-12-16

<160> 136

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<VEGF>貝伐單抗(bevacizumab)

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<VEGF>貝伐單抗

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<VEGF>貝伐單抗

<400> 3

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<VEGF>貝伐單抗

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<VEGF>貝伐單抗

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<VEGF>貝伐單抗

<400> 6

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<VEGF>貝伐單抗

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<VEGF>貝伐單抗

<400> 8

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<VEGF>蘭尼單抗(ranibizumab)

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<VEGF>蘭尼單抗

<400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<VEGF>蘭尼單抗

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<VEGF>蘭尼單抗

<400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<VEGF>蘭尼單抗

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<VEGF>蘭尼單抗

<400> 14

<210> 15

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<VEGF>蘭尼單抗

<400> 15

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<VEGF>蘭尼單抗

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<VEGF>HuMab G6-31

<400> 22

<210> 23

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<VEGF>HuMab G6-31

<400> 23

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<VEGF>HuMab G6-31

<400> 24

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Mab 536

<400> 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Mab 536

<400> 26

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Mab 536

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Mab 536

<400> 28

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Mab 536

<400> 29

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Mab 536

<400> 30

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Mab 536

<400> 31

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Mab 536

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)4連接子

<400> 33

<210> 34

<211> 104

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

<210> 35

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

<210> 36

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 38

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 40

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 41

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 42

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 43

<210> 44

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 44

<210> 45

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

<400> 45

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 47

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 50

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 51

<210> 52

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 52

<210> 53

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC06

<400> 53

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 54

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 55

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 56

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 57

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 58

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 59

<210> 60

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 60

<210> 61

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC07

<400> 61

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 62

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 63

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 64

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 65

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 66

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 67

<210> 68

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 68

<210> 69

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC08

<400> 69

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 70

<210> 71

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 71

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 72

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 73

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 74

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 75

<210> 76

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 76

<210> 77

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2s_LC09

<400> 77

<210> 78

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 78

<210> 79

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 79

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 80

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 81

<210> 82

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 82

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 83

<210> 84

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 84

<210> 85

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2i_LC10

<400> 85

<210> 86

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 86

<210> 87

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 87

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 88

<210> 89

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 89

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 90

<210> 91

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 91

<210> 92

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC11

<400> 92

<210> 93

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<ANG-2>Ang2k_LC11

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<400> 93

<210> 94

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR3,<VEGF>B20-4.1

<400> 94

<210> 95

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR2,<VEGF>B20-4.1

<400> 95

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈CDR1,<VEGF>B20-4.1

<400> 96

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR3,<VEGF>B20-4.1

<400> 97

<210> 98

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR2,<VEGF>B20-4.1

<400> 98

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈CDR1,<VEGF>B20-4.1

<400> 99

<210> 100

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重鏈可變域，<VEGF>B20-4.1

<400> 100

<210> 101

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 輕鏈可變域，<VEGF>B20-4.1

<400> 101

<210> 102

<211> 730

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> <VEGF-ANG-2>TvAb-2441-貝伐單抗-LC06之貝伐單抗重鏈Ang2i_LC06 scFv融合肽

<400> 102

<210> 103

<211> 727

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> <VEGF-ANG-2>TvAb-2441-貝伐單抗-LC08之貝伐單抗重鏈Ang2i LC08 scFv融合肽

<400> 103

<210> 104

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 貝伐單抗之輕鏈

<400> 104

<210> 105

<211> 191

<212> PRT

<213> 智人

<400> 105

<210> 106

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 具有前導序列及His標籤之人類血管生成素-2(ANG-2)

<400> 106

<210> 107

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 具有前導序列及His標籤之人類血管生成素-1(ANG-1)

<400> 107

<210> 108

<211> 1124

<212> PRT

<213> 智人

<400> 108

<210> 109

<211> 946

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFAb-Avastin-LC06-2620之重鏈1

<400> 109

<210> 110

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFAb-Avastin-LC06-2620之輕鏈

<400> 110

<210> 111

<211> 956

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2640之重鏈1

<400> 111

<210> 112

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2640之輕鏈

<400> 112

210

<210> 113

<211> 956

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2641之重鏈1

<400> 113

<210> 114

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性四價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子scFab-Avastin-Ang2i-LC06-2641之輕鏈

<400> 114

<210> 115

<211> 946

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-KiH-C-scFab之重鏈1

<400> 115

<210> 116

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-KiH-C-scFab之重鏈2

<400> 116

<210> 117

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價單鏈Fab<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-KiH-C-scFab之輕鏈

<400> 117

<210> 118

<211> 698

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-C-Fab-6CSS之重鏈1

<400> 118

<210> 119

<211> 719

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-C-Fab-6CSS之重鏈2

<400> 119

<210> 120

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性三價<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-C-Fab-6CSS之輕鏈

<400> 120

<210> 121

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL之重鏈1

<400> 121

<210> 122

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL之重鏈2

<400> 122

<210> 123

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL之輕鏈1

<400> 123

<210> 124

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-CH1-CL之輕鏈2

<400> 124

<210> 125

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL之重鏈1

<400> 125

<210> 126

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL之重鏈2

<400> 126

<210> 127

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL之輕鏈1

<400> 127

<210> 128

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL之輕鏈2

<400> 128

<210> 129

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL-SS之重鏈1

<400> 129

<210> 130

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL-SS之重鏈2

<400> 130

<210> 131

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL-SS之輕鏈1

<400> 131

<210> 132

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價結構域交換<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-VH-VL-SS之輕鏈2

<400> 132

<210> 133

<211> 706

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFab之重鏈1

<400> 133

<210> 134

<211> 699

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFab之重鏈2

<400> 134

<210> 135

<211> 706

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFabSS之重鏈1

<400> 135

<210> 136

<21> 699

<212> PRT

<213> 人工

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<223> 雙重專一性二價ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗體分子Avastin-LC06-N-scFabSS之重鏈2

<400> 136

Claims

一種雙重專一性抗體，其專一地結合於人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)且包含專一地結合人類VEGF之第一抗原結合位點及專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點，其特徵在於i)該等抗原結合位點各為一對抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域；ii)該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點在該重鏈可變域中包含SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且在該輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區；及iii)該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點在該重鏈可變域中包含SEQ ID NO：78之CDR3區、SEQ ID NO：79之CDR2區及SEQ ID NO：80之CDR1區，且在該輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：81之CDR3區、SEQ ID NO：82之CDR2區及SEQ ID NO：83之CDR1區。
如請求項1之雙重專一性抗體，其特徵在於該專一地結合VEGF之第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：15作為重鏈可變域及包含SEQ ID NO：16作為輕鏈可變域，該專一地結合ANG-2之第二抗原結合位點包含SEQ ID NO：84為重鏈可變域及包含SEQ ID NO：85為輕鏈可變域。
如請求項1或2之雙重專一性抗體，其特徵在於該專一地結合人類ANG-2之第二抗原結合位點並不專一地結合於人類血管生成素1(ANG-1)。
如請求項1或2之雙重專一性抗體，其特徵在於對VEGF具專一性之抗原結合位點之結合親和力KD/對ANG-2具專一性之抗原結合位點之KD之比為1.0-10.0。
如請求項1或2之雙重專一性抗體，其特徵在於該抗體為二價。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體。
如請求項6之醫藥組合物，其係用於治療癌症。
如請求項6之醫藥組合物，其係用於治療血管疾病。
一種如請求項1至5中任一項之抗體之用途，其係用於製造治療癌症之藥物。
一種如請求項1至5中任一項之抗體之用途，其係用於製造治療血管疾病之藥物。
一種核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之雙重專一性抗體。
一種表現載體，其含有如請求項11核酸，其能夠在原核或真核宿主細胞中表現該核酸。
一種原核或真核宿主細胞，其包含如請求項12之載體。
一種產生如請求項1至5中任一項之雙重專一性抗體之方法，其特徵在於：在原核或真核宿主細胞中表現如請求項11之核酸，且自該細胞或細胞培養物上清液回收該雙重專一性抗體。