CN116348492A - 四面体抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种四面体抗体，其包含第一结构域、第二结构域、第三结构域和第四结构域，其中：a)第一结构域和第二结构域中的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，b)第一结构域和第二结构域中的每一个均包含：ⅰ)第一多肽链，其包含该结构域的第一N‑末端，和ⅱ)第二多肽链，其包含该结构域的第二N‑末端，c)第一结构域的第一N‑末端和第二结构域的第一N‑末端通过非肽基连接(non‑peptidyl linkage)相互连接，其中所述非肽基连接是：ⅰ)共价连接，或ⅱ)在以下两者之间的非共价连接：(1)通过肽键或通过肽接头连接到第一结构域的第一N‑末端的第一二聚化多肽，和(2)通过肽键连接的第二二聚化多肽。

Description

四面体抗体
本申请要求于2021年7月10日提交的第63/050,738号美国临时专利申请的优先权，其公开内容在此通过引用并入本文。
在本申请中，引用了各种出版物，包括在括号中所引用的那些。本申请中提及的所有出版物的公开内容在此通过引用整体并入本申请，以便对本发明所属领域以及可与本发明一起使用的本领域中的特征提供额外描述。
序列表引用
本申请通过引用并入了存在于名为“210712_91300-B-PCT_SequenceListing_DH.txt”的文件中的核苷酸序列，该文件于2021年7月12日以IBM-PC机器可读格式创建，大小为14.4兆字节，具有与MS-Windows的操作系统兼容性，该文件作为本申请的一部分包含在2021年7月12日提交的文本文件中。
背景技术
抗体是脊椎动物蛋白的多样化家族，其包含由两个抗原结合(Fab)结构域和一个效应细胞结合(Fc)结构域组成Y形结构。这三个结构域围绕中心铰链区(central hingeregion)的排列与三角形分子(trigonal molecular)的几何形状有惊人的相似之处，在三角形分子几何结构中，一个中心原子与排列在三角形角上的三个外围原子键合。这种结合域的平面构型足以使抗体实现其正常功能。因此，迄今为止，为设计抗体和类似抗体的分子所做的努力也普遍采用了抗体结合域的天然平面构型。然而，当工程抗体和抗体样分子的结合结构域旨在结合多个靶标时，结合结构域的平面构型并不理想地适合于允许结合结构域同时结合多个靶标。
发明内容
本发明提供一种四面体抗体(tetrahedral antibody)，其包括第一结构域、第二结构域、第三结构域和第四结构域，其中：
a.第一结构域和第二结构域中的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域中的每一个均包含：
i.第一多肽链，所述第一多肽链包括所述结构域的第一N-末端，和
ⅱ.第二多肽链，所述第二多肽链包括所述结构域的第二N-末端，
c.所述第一结构域的第一N-末端和所述第二结构域的第一N-末端通过非肽基连接(non-peptidyl linkage)相互连接，其中所述非肽基连接是：
i.共价连接(covalent linkage)，或
ⅱ.以下两者之间的非共价连接(non-covalent linkage)
1.通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一二聚化多肽(a first dimerizing polypeptide)，和
2.通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二二聚化多肽(a second dimerizing polypeptide)，
其中，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d.所述第三结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i.所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第一二聚化多肽的N-末端，以及
e.所述第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i.所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第二二聚化多肽的N-末端。
本发明还提供一种包括第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域和第六结构域的八面体抗体(octahedral antibody)，其中：
a.所述第一结构域、第二结构域和第三结构域的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b.所述第一结构域、第二结构域和第三结构域中的每一个均包括：
ⅰ.包含所述结构域的第一N-末端的第一多肽链，和
ⅱ.包含所述结构域的第二N-末端的第二多肽链，
c.所述第一结构域的第一N-末端、所述第二结构域的第一N-末端和所述第三结构域的第一N-末端通过非肽基连接相互连接，其中所述非肽基连接是：
ⅰ.支链共价连接(branched covalent linkage)，或
ⅱ.以下的两者之间的非共价连接
1.通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一三聚化多肽，
2.通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二三聚化多肽，
3.通过肽键或通过肽接头与所述第三结构域的第一N-末端连接的第三三聚化多肽，
其中所述第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d.所述第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第一三聚化多肽的N-末端，
e.所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第二三聚化多肽的N-末端，以及
f.所述第六结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第三结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第三三聚化多肽的N-末端。
附图说明
图1：四面体抗体的一般示意性结构，示出了结构域D1、D2、D3、D4(A-D)，和D5以及D6(D)的位置，以及共价连接(A)和非共价连接(B-D)的位置。
图2：图1中的A图(panel)所示的具有共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中(A)D1、D2、D3和D4都不同；(B)D1和D2不同；D3和D4相同；(C)D1和D2相同；D3和D4不同；(D)D1和D2相同；D3和D4相同。
图3：图1中的B图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中(A)D1、D2、D3和D4都不同；(B)D1和D2不同；D3和D4相同；(C)D1和D2相同；D3和D4不同；(D)D1和D2相同；D3和D4相同。一对二聚化多肽在(A-C)中形成异源二聚体对，并且在(D)中形成同源二聚体对。
图4：图1中的C图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中(A)D1、D2、D3和D4都不同；(B)D1和D2不同；D3和D4相同；(C)D1和D2相同；D3和D4不同；(D)D1和D2相同；D3和D4相同。一对二聚化多肽在(A-C)中形成异源二聚体对，并且在(D)中形成同源二聚体对。
图5：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2不同，并且在D3-D6结构域中，(A)D3-D6都不同；(B)D4和D5相同，并且D3和D6不同；(C)D4和D6相同，并且D3和D5不同；(D)D3和D4相同，并且D5和D6不同。在(A-D)中，一对二聚化多肽形成异源二聚体对。
图6：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2不同，并且在D3-D6结构域中，(A)D3和D6相同，并且D4和D6相同；(B)D3和D5相同，并且D4和D5相同；(C)D3和D4相同，并且D5和D6相同；(D)D3-D6相同。在(A-D)中，一对二聚化多肽形成异源二聚体对。
图7：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2不同，没有D6结构域，并且在D3-D5结构域中，(A)D3-D5都不同；(B)D4和D5相同，并且D3不同；(C)D3和D5相同，并且D4不同；(D)D3-D5都相同。在(A-D)中，一对二聚化多肽形成异源二聚体对。
图8A：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2相同，并且在D3-D6结构域中，(A)D3-D6均为相同的第一类；(B)D3-D6均为相同的第二类；(C)D3和D4为第一类，并且D5和D6为第二类，(D)D3和D5为第一类，并且D4和D6为第二类。在(A-D)中，一对二聚化多肽形成同源二聚体对。
图8B：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2相同，并且在D3-D6结构域中，(A)D3-D6均为相同的第一类；(B)D3-D6均为相同的第二类；(C)D3和D4均为第一类，并且D5和D6均为第二类，(D)D3和D4均为第二类，并且D5和D6均为第一类。在(A-D)中，一对二聚化多肽形成同源二聚体对。
图9：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，其中D1和D2相同，并且在D3-D5结构域中，(A)D3-D6均为相同的第一类，(B)D3-D6均为相同的第二类；(C)D4和D5均为第一类，并且D3和D6均为第二类；(D)D3和D6均为第一类，并且D4和D5均为第二类。在(A-D)中，两对二聚化多肽中的每一对形成一个异源二聚体对。
图10：图1中的D图所示的具有非共价连接的四面体抗体的示意性结构，(A-B)其中D1和D2相同，并且在D3-D5结构域中，(A)D3-D6均为相同的第一类，(B)D3-D6均为相同的第二类；(C-D)其中D1和D2不同，并且在D3-D5结构域中，(C)D3和D4是第一类，并且D5和D6是第二类，(D)D3和D5是第一类，并且D4和D6是第二类。在(A-B)中，两对二聚化多肽中的每一对都形成一个同源二聚体对。在(C-D)中，两对不同的二聚化多肽中的每一对都形成单独的同源二聚体对(separate homodimeric pairs)。
图11：四面体抗体的示意性结构(A)Rc6-P4-Rc6，(B)Rc66SIDE-P4-Rc66SIDE，(C)Rc66SIDE-P16-Rc66SIDE，(D)Rc66SIDE-P28-Rc66SIDE，(E)B19c66-P4-Rc6m，(F)Soc66-P28-6Ec66，(G)HA9c66AAC9-P4-HA9c66AAC9，和(H)HA9c66AAC9-P4-IL15c6AAC9。
图12：四面体抗体Rc6-P4-Rc6的制备。
图13：如图1的图B所示的具有非共价连接的四面体抗体的制备。
图14：四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG的制备。
图15：通过SE-HPLC分析四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG。
图16：通过SE-HPLC分析具有不同肽接头的四面体抗体(L-1)ACE2RQ740c60PGRF-ACE2RQ740c60PGRF，(L-185)ACE2RQ740c60PGRF185-ACE2RQ740c60PGRF185，(L-198)ACE2RQ740c60PGRF198-ACE2RQ740c60PGRF198，(L-208)ACE2RQ740c60PGRF208-ACE2RQ740c60PGRF208，(L-212)ACE2RQ740c60PGRF235-ACE2RQ740c60PGRF235，(L-235)ACE2RQ740c60PGRF235-ACE2RQ740c60PGRF235，(L-240)ACE2RQ740c60PGRF240-ACE2RQ740c60PGRF240。
图17：通过SE-HPLC/MALS分析四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG。
图18：四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG和ACE单体ACE2RQ615c60PG的混合物的化学计量结合分析(Stoichiometricbinding analysis)。
图19：四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9的制备。
图20：通过SE-HPLC分析四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9。
图21：通过SE-HPLC/MALS分析四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9。
图22：通过SE-HPLC/MALS分析四面体抗体ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG。
图23：四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2740FcG9的不纯制剂的化学计量结合分析。
图24：四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图25：四面体抗体ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG和ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图26：四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2-615Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图27：ACE2四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG，以及ACE2二聚体ACE2-615Fc-G9和ACE2RQ615FcPG对SARS-CoV-2-VSV假型病毒(pseudotype virus)感染的抑制。
图28：ACE2四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG，以及ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9和ACE2RQ740FcPG对SARS-CoV-2-VSV假型病毒感染的抑制。
图29A：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且D3和D4中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域。
图29B：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，D3和D4中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D5和D6中的每一个均为与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域。
图29C：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，D3和D4中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D7和D8中的每一个均为与第二靶标特异性结合的结构域。D7和D8各自被描述为单链TNFSF融合多肽，但可以是任何结构域。
图29D：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，D3和D4中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D5和D6中的每一个均为与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，并且D7和D8中的每一个均为与第三靶标特异性结合的结构域。D7和D8被描述为单链TNFSF融合多肽，但可以是任何结构域。
图30A：包括形成同源三聚非共价连接的第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽的八面体抗体，其中D1、D2和D3中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且D4、D5和D5中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域。
图30B：包括形成同源三聚非共价连接的第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽的八面体抗体，其中D1、D2和D3中的每一个均为异二聚Fc结构域，D4、D5和D6中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D7、D8和D9中的每一个均为与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域。
图30C：包括形成同源三聚非共价连接的第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽的八面体抗体，其中D1、D2和D3中的每一个均为异二聚Fc结构域，D4、D5和D6中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D10、D11和D12中的每一个均与第二靶标特异性结合。D10、D11和D12各自被描述为单链的TNFSF融合多肽，但可以是任何结构域。
图30D：包括形成同源三聚非共价连接的第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽的八面体抗体，其中D1、D2和D3中的每一个均为异二聚Fc结构域，D4、D5和D6中的每一个均为与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D7、D8和D9中的每一个均为与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，并且D10、D11和D12中的每一个均与第三靶标特异性结合。D10、D11和D12各自被描述为单链的TNFSF融合多肽，但可以是任何结构域。
图31：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3、D4、D5和D6与第一靶标特异性结合(四价，单特异性)，(B)D3和D4与第一靶标特异性结合，并且D5和D6是与第二靶标特异性结合的Fab结构域(四价，2+2双特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D5和D6与第二靶标特异性结合(四价，2+2双特异性)，并且(D)D3、D4、D5和D6是与第一靶标特异性结合的Fab结构域(四价，单特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(B)六条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及(D)八条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]。
图32：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3和D4与第一靶标特异性结合，并且D5和D6与第二靶标特异性结合(四价，2+2双特异性)，(B)D5和D6与第一靶标特异性结合，并且D3和D4与第二靶标特异性结合(四价，2+2双特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D5和D6是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域(四价，2+2双特异性)，以及(D)D5和D6是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D3和D4是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域(四价，2+2双特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(B)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(C)8条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]和第二L2链[D6]，以及(D)八条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]。
图33：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3、D4和D5与第一靶标特异性结合，并且D6与第二靶标特异性结合(四价，3+1双特异性)，(B)D3、D4和D5与第一靶标特异性结合，并且D6是与第二靶标特异性结合的Fab结构域(四价，3+1双特异性)，(C)D3、D4和D5是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D6与第二靶标特异性结合(四价，3+1双特异性)，以及(D)D3、D4和D5是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D6是与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域(四价，3+1双特异性)。A-D的四面体抗体包括：(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，和第一H3链[D2/D6]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，和第一L3链[D6]，(C)七条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，第一L1/L2链[D3]，第二L1/L2链[D4]，和第三L1/L2链[D5]，以及(D)八条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，第一L1/L2链[D3]，第二L1/L2链[D4]，第三L1/L2链[D5]，和第一L3链[D6]。
图34：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3和D4与第一靶标特异性结合，并且D6与第二靶标特异性结合(三价，2+1双特异性)，(B)D3和D4与第一靶标特异性结合，并且D6是与第二靶标特异性结合的Fab结构域(三价，2+1双特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D6与第二靶标特异性结合(三价，2+1双特异性)，以及(D)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D6是与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域(三价，2+1双特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D2/D6]，和第一Fc链[D1]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，和第一L2链[D6]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及(D)七条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，和第一L2链[D6]。
图35：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3和D4与第一靶标特异性结合，D5与第二靶标特异性结合，并且D6与第三靶标特异性结合(四价，2+1+1三特异性)，(B)D3和D4与第一靶标特异性结合，D5与第二靶标特异性结合，并且D6是与第三靶标特异性结合的Fab结构域(四价，2+1+1三特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D5与第二靶标特异性结合，并且D6与第三靶标特异性结合(四价，2+1+1三特异性)，以及(D)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D5与第二靶标特异性结合，并且D6是与第三靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域(四价，2+1+1三特异性)。A-D的四面体抗体包括：(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，和第一H3链[D2/D6]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，和第一L3链[D6]，(C)六个链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及(D)七条链：第一H1链[D1/D3]，第二H1链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一H3链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，和第一L3链[D6]。
图36：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1是异二聚Fc结构域，D2是Fab结构域，并且其中(A)D2是与第一靶标结合的Fab，并且D3、D4和D5与第二靶标特异性结合(四价，3+1双特异性)，(B)D2是与第一靶标结合的Fab，D3和D4与第二靶标特异性结合，并且D5是与第三靶标特异性结合的可变区交换的Fab(四价，2+1+1三特异性)，(C)D2是与第一靶标结合的Fab，D3和D4是与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，并且D5与第三靶标特异性结合(四价，2+1+1三特异性)。(D)D2是与第一靶标特异性结合的Fab，D3、D4和D5是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域(四价，4+1双特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]和第一Fab链[D2]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]和第一L2链[D5]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，(D)七条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]，第一L1/L2链[D3]，第二L1/L2链[D4]，和第三L1/L2链[D5]。
图37：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1是异二聚Fc结构域，并且D2是Fab结构域，并且其中(A)D2是与第一靶标结合的可变区交换的Fab，并且D3、D4和D5与第二靶标特异性结合(四价，3+1双特异性)，(B)D2是与第一靶标结合的可变区交换的Fab，D3和D4与第二靶标特异性结合，并且D5是与第三靶标特异性结合的Fab(四价，2+1+1三特异性)，(C)D2是与第一靶标结合的可变区交换的Fab，D3和D4是与第二靶标特异性结合的Fab结构域，并且D5与第三靶标特异性结合(四价，2+1+1三特异性)，并且(D)D2是与第一靶标结合的可变区交换Fab，D3、D4和D5是与第二靶标特异性结合的Fab结构域(四价，3+1双特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]和第一Fab链[D2]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]和第一L2链[D5]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及(D)七条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一H2链[D1/D5]，第一Fab链[D2]，第一L1/L2链[D3]，第二L1/L2链[D4]，和第三L1/L2链[D5]。
图38：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1是异二聚Fc结构域，D2是Fab结构域，并且其中(A)D2是与第一靶标结合的Fab，并且D3和D4与第二靶标特异性结合(三价，2+1双特异性)，(B)D2是与第一靶标结合的可变区交换Fab，并且D3和D4与第二靶标特异性结合，(C)D2是与第一靶标结合的Fab，并且D3和D4是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域(三价，2+1双特异性)，以及(D)D2是与第一靶标结合的可变区交换Fab，D3和D4是与第二靶标特异性结合的Fab结构域(三价，2+1双特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一Fc链[D1]，和第一Fab链[D2]，(B)四条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一Fc链[D1]，和第一Fab链[D2]；(C)六条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一Fc链[D1]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]和第二L1链[D4]，以及(D)六条链：第一H1链[D1/D3]，第一H1Fab链[D2/D4]，第一Fc链[D1]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]和第二L1链[D4]。
图39：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3、D4、D5和D6与第一靶标特异性结合，并且D7和D8与第二靶标特异性结合(六价，4+2双特异性)，(B)D3和D4与第一靶标特异性结合，D5和D6是与第二靶标结合的Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D5和D6与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)，以及(D)D3、D4、D5和D6是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，并且D7和D8与第二靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(B)六条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L2链[D5]和第二L2链[D6]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及[D]八条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]。D7和D8可以在第一H1链和第二H1链的C-端处连接，或在第一H2链和第二H2链的C-端处连接(如图所示)。D7和D8被描述为单链TNFSF配体融合多肽，但可以是任何结构域。
图40：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3和D4与第一靶标特异性结合，D5和D6与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)，(B)D5和D6与第一靶标特异性结合，D3和D4与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D5和D6是与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异性)，并且(D)D5和D6是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D3和D4是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(六价，2+2+2三特异)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(B)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，和第二H2链[D2/D6]，(C)八条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]，以及(D)八条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D1/D5]，第二H2链[D2/D6]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，第一L2链[D5]，和第二L2链[D6]。D7和D8可以在第一H1链和第二H1链的C-端处连接，或在第一H2链和第二H2链的C-端处连接(如图所示)。D7和D8被描述为单链的TNFSF配体融合多肽，但可以是任何结构域。
图41：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1和D2中的每一个均为异二聚Fc结构域，并且其中(A)D3和D4与第一靶标特异性结合，D6与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，(B)D3和D4与第一靶标特异性结合，D6是与第二靶标特异性结合的Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，(C)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D6与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，(D)D3和D4是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D6是与第二靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D2/D6]和第一Fc链[D1]，(B)五条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D2/D6]，一条Fc链[D1]和一条L2链[D6]，(C)六条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，第一L1链[D3]和第二L1链[D4]，以及(D)七条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，第一L1链[D3]，第二L1链[D4]，和第一L2链[D6]。D7和D8可以在第一H1链和第二H1链的C-端处连接，或在第一H2链和第二H2链的C-端处连接(如图所示)。D7和D8被描述为单链TNFSF配体融合多肽，但可以是任何结构域。
图42：包括形成同源二聚非共价连接的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的四面体抗体，其中D1是异二聚Fc结构域，并且D2是Fab结构域，并且其中(A)D2是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D3和D4与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，(B)D2是与第一靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，D3和D4与第二靶标特异性结合，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，(C)D2是与第一靶标特异性结合的Fab结构域，D3和D4是与第二靶标特异性结合的可变区交换Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)，以及(D)D2是与第一靶标特异性结合的可变区交换的Fab结构域，D3和D4是与第二靶标特异性结合的Fab结构域，并且D7和D8与第三靶标特异性结合(五价，2+2+1三特异性)。A-D的四面体抗体包括(A)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一Fc链[D1]，和第一Fab链[D2]。(B)四条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一Fc链[D1]，和第一Fab链[D2]。(C)六条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一Fc链[D1]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]，以及(D)六条链：第一H1链[D1/D3/D7]，第二H1链[D2/D4/D8]，第一H2链[D2/D6]，第一Fc链[D1]，第一Fab链[D2]，第一L1链[D3]，和第二L1链[D4]。D7和D8可以在第一H1链和第二H1链的C-端处连接，或在第一H2链和第二H2链的C-端处连接(如图所示)。D7和D8被描述为单链TNFSF配体融合多肽，但可以是任何结构域。
图43：ACE2四面体抗体。四种形式的ACE2四面体抗体示出在图43的c、d、e和f中。每个都包括结构域1-4和二聚化多肽。图43的a和b中的结构是标准的Fc二聚体。
图44：ACE2四面体抗体对活病毒的相对中和活性。上图：展示了对SARS-CoV-2活病毒的中和作用。下图：展示了对NL63(α冠状病毒)的中和作用。ACE2超二聚体(6-05SD)对病毒的中和作用比标准Fc融合蛋白(ACE2Fc615)强约3个数量级。还示出了纯化的二聚体(6-05D)和二聚体与超二聚体的不纯的混合物(6-05不纯的)。
图45：构建体13-21和构建体13-22的药代动力学曲线。13-21对应于野生型ACE2-B13超异源二聚体四面体抗体。13-22对应于具有H378A突变的突变体ACE2-B13超异源二聚体四面体抗体。
图46：构建体10-05和构建体13-21的药代动力学曲线。10-05对应于ACE2-ACE2超异源二聚体四面体抗体。13-21对应于野生型ACE2-B13超异源二聚体四面体抗体。
图47：ACE2核心二聚体(10-59)、B-13(12-09)和ACE2-B-13超二聚体(15-16)的相对中和活性。
图48A-图48P：将针对12种不同变异病毒的不同抗体的相对中和活性与ACE2-B13沉默型(silent version)和ACE2-B13活性型(active version)(用菱形和圆形表示)进行比较。
图49：用PBS对照(PBS)、25mg/kg的REGN10933和REG-CoV-2鸡尾酒(Regeneron抗体REGN10933和REG108987，各25mg/kg)以及25mg/kg的Fc沉默型ACE2-B13(HB1516)处理过的感染有南非SARS-CoV-2病毒的仓鼠的体重变化。
图50A-图50C：双特异性抗体中正确配对和错误配对的相对定量。主峰代表正确配对的分子。箭头指向期望的错误配对产物的位置。主峰由两个峰组成，这是由于在去糖基化过程后残留的O-聚糖。
图51A-图51C：针对N439K和南非变体的不同抗体的相对中和活性。表36、37和38中描述了ACE2超异源二聚体(正方形)。
具体实施方式
本发明提供了一种四面体抗体，其包括第一结构域、第二结构域、第三结构域和第四结构域，其中：
a.第一结构域和第二结构域中的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域中的每一个均包含：
i.第一多肽链，所述第一多肽链包括所述结构域的第一N-末端，和
ⅱ.第二多肽链，所述第二多肽链包括所述结构域的第二N-末端，
c.所述第一结构域的第一N-末端和所述第二结构域的第一N-末端通过非肽基连接相互连接，其中所述非肽基连接是：
i.共价连接，或
ⅱ.以下两者之间的非共价连接
1.通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一二聚化多肽，和
2.通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二二聚化多肽，
其中，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d.第三结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i.所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第一二聚化多肽的N-末端，以及
e.第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i.所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第二二聚化多肽的N-末端。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域是Fab结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，
c.所述第一结构域和第二结构域是Fab结构域，
d.所述第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
e.所述第三结构域和/或第四结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，
f.所述第三结构域选自(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，并且所述第四结构域是Fab，
g.所述第三结构域是IL-15，
h.所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是IL-15Rαsushi结构域，
i.所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是Fab，
j.所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，
k.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，
l.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，所述第三结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，并且所述第四结构域是Fab，
m.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
n.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，
o.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
p.所述第一结构域是Fc结构域，所述第二结构域是Fab结构域，所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是IL-15Rαsushi结构域，或
q.所述第一结构域是Fc结构域，所述第二结构域是Fab结构域，所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是Fab。
在本发明的一些实施方案中，在所述第一结构域的第一N-末端与所述第二结构域的第一N-末端之间的非肽基连接是共价连接。
在本发明的一些实施方案中，所述共价连接包括以下结构：
Figure BDA0004108496920000201
其中：
a.Xa是选自以下项的化学结构：
i.包含稠合到二氢哒嗪上的环辛烷(cyclooctane)的化学结构，
ⅱ.包含稠合到哒嗪上的环辛烯(cyclooctene)的化学结构，
b.Ra是将Xa与所述第一结构域的第一N-末端连接的键或化学结构，并且
c.Rb是将Xa与所述第二结构域的第一N-末端连接的键或化学结构。
在本发明的一些实施方案中，Xa包括
Figure BDA0004108496920000202
结构，其中Rc是H、烷基或芳基，或它们的互变异构体。
在本发明的一些实施方案中，所述共价连接包括
Figure BDA0004108496920000203
结构，其中Rc是H、烷基或芳基，或它们的互变异构体。
在本发明的一些实施方案中，Ra和Rb独立地为键(bond)，或化学结构，所述化学结构包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上部分(moiety)的链或由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上部分(moiety)的链组成，其中每个部分(moiety)独立地选自下列项：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)(poly(lactic-glycolic acid))、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure BDA0004108496920000211
Figure BDA0004108496920000212
Figure BDA0004108496920000213
其中X1是CH或N，X2是CH2或羰基，并且R5是芳基或烷基，其中[PEG(y)]z是：
Figure BDA0004108496920000221
其中y＝1-100并且z＝1-10。
在本发明的一些实施方案中，Ra和/或Rb各自独立地：
a.包含[PEG(y)]z基团；
b.包含聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)或多糖基团；
c.包含C1-C4烷基；
d.包含琥珀酰亚胺；
e.包含胺；
f.包含琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基或己二酰基；
g.包含丙二酰基；
h.包含氨基酸；
i.包含半胱氨酸；
j.包含赖氨酸；
k.由选自以下项中的三个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure BDA0004108496920000231
Figure BDA0004108496920000232
l.由选自以下项中的四个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure BDA0004108496920000241
Figure BDA0004108496920000242
m.由选自以下项中的五个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure BDA0004108496920000251
Figure BDA0004108496920000252
n.包含键合到赖氨酸上的[PEG(y)]z基团；
o.包含键合到琥珀酰亚胺基团上的C1-C4酰基；
p.包含键合到C1-C4酰基上的赖氨酸
q.包含[PEG(y)]z基团，其键合到戊二酰基上；
r.由选自以下项中的三、四或五个部分的链组成：[PEG(y)]z、C2-C5酰基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、氨基酸、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure BDA0004108496920000261
Figure BDA0004108496920000262
其中X1是CH或N，X2是CH2或羰基，并且R5是芳基或烷基，其中[PEG(y)]z是：
Figure BDA0004108496920000263
其中y＝1-100并且z＝1-10；
s.是键；
t.是半胱氨酸；
u.具有线性结构；或
v.具有支链结构；
w.具有
Figure BDA0004108496920000271
结构；
x.是：
Figure BDA0004108496920000272
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；
y.是：
Figure BDA0004108496920000273
其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50并且z是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；
z.是：
Figure BDA0004108496920000274
其中x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50，并且z是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；或
aa.是
Figure BDA0004108496920000281
其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40、或1-50。
在本发明的一些实施方案中，Ra和/或Rb包含所述
Figure BDA0004108496920000282
Figure BDA0004108496920000283
部分，其中X1是CH或N，并且X2是CH2或羰基。
在本发明的一些实施方案中，所述非肽基连接是连接到所述第一结构域的第一N-末端的第一二聚化多肽和连接到所述第二结构域的第一N-末端的第二二聚化多肽之间的非共价连接。
在本发明的一些实施方案中，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽选自以下项：
a.亮氨酸拉链结构域(zipper domain)，
b.collectrin样结构域(CLD)，和
c.collectrin结构域(CD)。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一二聚化多肽与所述第二二聚化多肽相同，并且
b.所述二聚化多肽形成同源二聚体。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一二聚化多肽不同于所述第二二聚化多肽，并且
b.所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽形成异源二聚体。
在本发明的一些实施方案中，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽在彼此存在时，形成少于30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的同源二聚体。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，并且
b.所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽各自是ACE2 collectrin样结构域(CLD)。
在本发明的一些实施方案中，所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域是第一类Fab结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第三结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，或
d.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第四结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域。
在本发明的一些实施方案中，所述四面体抗体另外包含第五结构域，其中所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
a.所述第一二聚化多肽的N-末端，
b.所述第一结构域的第二N-末端，或
c.第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第五结构域是第一类Fab结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
d.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
e.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
f.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
g.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，或
h.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域、第三类Fab结构域和第四类Fab结构域。
在本发明的一些实施方案中，所述四面体抗体另外还包括第五结构域和/或第六结构域，其中：
a.所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i.所述第一二聚化多肽的N-末端，
ⅱ.所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅲ.第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
b.所述第六结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第二二聚化多肽的N-末端，
ⅱ.所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅲ.第四二聚化多肽的N-末端，其中所述第四二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第五结构域是第一类Fab结构域，
b.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
d.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
e.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
f.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
g.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，或
h.所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域、第三类Fab结构域和第四类Fab结构域。
在本发明的一些实施方案中，所述四面体抗体进一步包括第七结构域和/或第八结构域，其中：
a.所述第七结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第一结构域的第一C-末端，或
ⅱ.所述第一结构域的第二C-末端，
b.所述第八结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第二结构域的第一C-末端，或
ⅱ.所述第二结构域的第二C-末端。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第三结构域、第四结构域、第五结构域和第六结构域各自是所述ACE2 PD，并且所述二聚化多肽各自是所述ACE2 CLD，
b.所述第三结构域和第四结构域各自是所述ACE2 PD，所述第五结构域和第六结构域各自是Fab结构域，并且所述二聚化多肽各自是所述ACE2 CLD，
c.所述第三结构域和第四结构域各自是Fab结构域，所述第五结构域和第六结构域各自是所述ACE2 PD，并且所述二聚化多肽各自是所述ACE2 CLD，或
d.所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，所述第三结构域和第四结构域是所述ACE2 PD，所述第五结构域和第六结构域是Fab结构域，所述二聚化多肽各自是所述ACE2CLD，并且所述第一结构域和第二结构域各自通过肽接头连接到它们各自的二聚化多肽，优选地，其中这些结构域和接头的特征在于以下特征中的一个或多个或全部：
ⅰ.所述Fc结构域的特征在于以下特征中的一个或多个或全部：
1.是异源二聚体，
2.是IgG1 Fc结构域，
3.包含沉默突变，使得所述Fc结构域缺乏Fcγ受体结合活性，优选地，其中这种突变是以下突变的组合：P329G/L234A/L235A(PGLALA)，
4.包含增强FcRn活性的突变，优选地，其中这种突变延长所述四面体抗体的半衰期，优选地，其中所述突变是以下突变的组合：L309D/Q311H/N434S(DHS)，和
5.包含去除它们的蛋白A结合位点的突变，优选地，其中这种突变是H435R/Y436F(HY/RF)，
ⅱ.所述ACE2肽酶结构域包含阻断其血管紧张素转化酶活性的突变，优选地，其中这种突变是H378A突变，
ⅲ.所述Fab结构域是包含鼠可变区的嵌合Fab结构域，
iv.所述肽接头各自具有23个氨基酸的长度，并且衍生自TNF受体的柄区(stalkregion)，优选地，其中所述TNF受体是TNF受体1B，更优选地，其中所述肽接头由SEQ ID NO:4468所示的氨基酸序列组成，
v.此类结构域和肽接头由三种不同类型的多肽链形成，更优选地，其中所述三种不同类型的多肽链表示为H1、L2和H2，所述H1链包含SEQ ID NO:522所示的氨基酸序列，所述L2链包含SEQ ID NO:465所示的氨基酸序列，并且所述H2链包含SEQ ID NO:534所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第三结构域和第四结构域各自是所述ACE2 PD，
b.所述第五结构域，如果存在，在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
c.第六结构域，如果存在，在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到第四二聚化多肽的N-末端，其中所述第四二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端，并且
d.所述第一二聚化多肽、第二二聚化多肽、第三二聚化多肽和第四二聚化多肽各自是所述ACE2 CLD。
在本发明的一些实施方案中，所述ACE2 PD包含所述ACE2蛋白的氨基酸18-615或其一部分或由所述ACE2蛋白的氨基酸18-615或其一部分组成。
在本发明的一些实施方案中，所述ACE2 CLD包含所述ACE2蛋白的氨基酸616-740或其一部分或由所述ACE2蛋白的氨基酸616-740或其一部分组成。
在本发明的一些实施方案中，所述ACE2 PD具有催化活性。
在本发明的一些实施方案中，所述ACE2 PD无催化活性。
在本发明的一些实施方案中，ACE2 PD包含R273Q或H378A突变。
在本发明的一些实施方案中，所述Fc结构域缺乏Fcγ受体结合活性。
在本发明的一些实施方案中，所述Fc结构域包括P329G突变、L234A突变和L235A突变(PGLALA)。
在本发明的一些实施方案中，所述Fc结构域包含增强FcRn活性和/或半衰期的突变。在本发明的一些实施方案中，这种突变选自以下任意突变组合：
a.M252Y/S254T/T256E(YTE)，
b.L309D/Q311H/N434S(DHS)，或
c.M428L/N434S(LS)。
在本发明的一些实施方案中，所述Fc结构域包括去除它们的蛋白A结合位点的突变，优选其中这种突变为H435R/Y436F(HY/RF)。
在本发明的一些实施方案中，所述Fab结构域是包含鼠可变区的嵌合Fab结构域。
在本发明的一些实施方案中：
a.所述第五结构域、第三二聚化多肽和所述第一结构域的第二多肽链是一段连续的氨基酸，
b.所述第三结构域、第一二聚化多肽和所述第一结构域的第一多肽链是一段连续的氨基酸，
c.所述第四结构域、第二二聚化多肽和所述第二结构域的第一多肽链是一段连续的氨基酸，并且
d.所述第六结构域、第四二聚化多肽和所述第二结构域的第二多肽链是一段连续的氨基酸，
其中每段连续的氨基酸由选自SEQ ID NO:74-119的氨基酸序列组成。
八面体抗体
本发明还提供一种八面体抗体，其包含第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域和第六结构域，其中：
a.所述第一结构域、第二结构域和第三结构域的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b.所述第一结构域、第二结构域和第三结构域中的每一个均包括：
ⅰ.包含所述结构域的第一N-末端的第一多肽链，和
ⅱ.包含所述结构域的第二N-末端的第二多肽链，
c.所述第一结构域的第一N-末端、所述第二结构域的第一N-末端和所述第三结构域的第一N-末端通过非肽基连接相互连接，其中所述非肽基连接是：
ⅰ.支链共价连接，或
ⅱ.以下的两者之间的非共价连接
1.通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一三聚化多肽，
2.通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二三聚化多肽，
3.通过肽键或通过肽接头与所述第三结构域的第一N-末端连接的第三三聚化多肽，
其中所述第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d.所述第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第一三聚化多肽的N-末端，
e.所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第二三聚化多肽的N-末端，并且
f.所述第六结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
ⅰ.所述第三结构域的第二N-末端，或
ⅱ.所述第三三聚化多肽的N-末端。
在本发明的八面体抗体的一些实施方案中，所述非肽基连接是以下的两者之间的非共价连接：连接到所述第一结构域的第一N-末端的第一三聚化多肽、连接到所述第二结构域的第一N-末端的第二三聚化多肽、连接到所述第三结构域的第一N-末端的第三三聚化多肽，其中所述第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽选自TNF配体超家族成员OX40L/TNFLSF4、CD40L/TNFLSF5、FASL/TNFLSF6、CD70L/TNFLSF7、CD30L/TNFLSF8、4-1BBL/TNFLSF9、TRAIL/TNFLSF10、RANKL/TNFLSF11、TWEAK/TNFLSF12、APRIL/TNFLSF13、BAFF/TNFLSF13B、LIGHT/TNFLSF14、VEGI/TNFLSF15、GITRL/TNFLSF18、EctodyplasinATNFLSF19、TNF/TNFLSF2、淋巴毒素α/TNFLSF1和淋巴毒素β/TNFLSF3。
在本发明的一些实施方案中，所述八面体抗体进一步包括第七结构域、第八结构域和/或第九结构域，其中：
a.所述第七结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
b.所述第八结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端，和/或
c.所述第九结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第三结构域的第二N-末端。
在本发明的一些实施方案中，所述八面体抗体进一步包括第十结构域、第十一结构域和/或第十二结构域，其中：
a.所述第十结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第一结构域的第一C-末端，或
ⅱ.所述第一结构域的第二C-末端，
b.所述第十一结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第二结构域的第一C-末端，或
ⅱ.所述第二结构域的第二C-末端，
c.所述第十二结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到：
i.所述第三结构域的第一C-末端，或
ⅱ.所述第三结构域的第二C-末端。
在一些实施方案中，本发明所述八面体抗体的第一结构域、第二结构域和第三结构域可以是被本文描述为本发明四面体抗体的第一结构域和第二结构域的任何结构域。在一些实施方案中，本发明八面体抗体的第四结构域、第五结构域和第六结构域可以是被本文描述为本发明四面体抗体的第三结构域和第四结构域的任何结构域。在一些实施方案中，本发明八面体抗体的第七结构域、第八结构域和第九结构域可以是被本文描述为本发明四面体抗体的第五结构域和第六结构域的任何结构域。在一些实施方案中，本发明八面体抗体的第十结构域、第十一结构域和第十二结构域可以是被本文描述为本发明四面体抗体的第七结构域和第八结构域的任何结构域。此外，所有这些结构域可以包含针对本发明四面体抗体的结构域描述的任何特征(如突变)。
四面体抗体和八面体抗体
在本发明的一些实施方案中：
a.所述四面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的所述第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是Fc结构域，其中所述一个或多个Fc结构域独立地选自本文公开的任何Fc结构域，
b.所述四面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是Fab结构域，其中所述一个或多个Fab结构域独立地选自本文公开的任何Fab结构域，
c.所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是分泌蛋白，其中所述一个或多个分泌蛋白独立地选自本文公开的任何分泌蛋白，
d.所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域，或所述八面体抗体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是跨膜蛋白的胞外结构域，其中所述一个或多个跨膜蛋白的胞外结构域独立地选自本文公开的任何跨膜蛋白的胞外结构域，
e.所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个：
i.包括作为被批准用于治疗患有疾病的个体的药物的化合物的结构，
ⅱ.包括分子量小于1000道尔顿的有机化合物、DNA适配体、RNA适配体、寡核苷酸、或具有生物活性的蛋白的结构，
ⅲ.包括伯胺或仲胺，
ⅳ.是阿立哌唑或奥司他韦，
v.是呼吸道药物、平喘剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗心绞痛剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、抗组胺剂、抗感染剂、抗生素、抗炎剂、抗帕金森症药、抗精神病药、退热剂、抗溃疡剂、注意力缺陷多动症(ADHD)药物、中枢神经系统兴奋剂、减充血剂或精神兴奋药，
ⅵ.是阿普洛尔、醋丁洛尔、阿米福林、安咪奈丁、氨磺洛尔、阿莫沙平、安非他尼、阿替洛尔、阿托西汀、巴洛沙星、巴美生、苯呋洛尔、苯那普利、苯氟雷司、苯佐他明、倍他司汀、倍他洛尔、贝凡洛尔、二苯美伦、比索洛尔、布林佐胺、丁苯碘胺、丁胺卡因、卡米罗芬、卡拉洛尔、卡替卡因、卡维地洛、吐根酚碱、环丙沙星、氯氮平、氯苄雷司、氯丙那林、环喷他明、地拉普利、地美替林、地诺帕明、地昔帕明、地氯雷他定、双氯芬酸、二甲福林、地奥沙屈、多巴酚丁胺、多培沙明、多利培南、多佐胺、氢普拉明、度洛西汀、依托拉嗪、依那普利、依诺沙星、肾上腺素、厄他培南、艾沙拉唑、艾司洛尔、乙苯恶啶、法舒地尔、芬地林、苯甲锡林、苯氟拉明、非诺多泮、非诺特罗、芬普雷司、flecamide、氟西汀、福莫特罗、罗曲坦、加波沙朵、加雷沙星、加替沙星、格雷沙星、己双肾上腺素、咪达普利、吲达品、莫地卡尼、盐酸茚洛秦、异克舒令、异丙克兰、拉贝洛尔、兰地洛尔、拉帕替尼、左法哌酯、赖诺普利、洛美沙星、洛曲非班(lotrafiban)、马普替林、美加明、甲氟喹、甲吲洛尔、美罗培南、美他帕明、奥西那林、甲氧非那明、右旋哌醋甲酯、哌醋甲酯、美替洛尔、美托洛尔、米托蒽醌、米伐折醇、莫西卜里、莫普洛尔(moprolol)、莫西沙星、奈必洛尔、硝苯洛尔、尼普洛尔、诺氟沙星、去甲替林、苄丙酚胺、奥氮平、奥沙尼喹、心得平、奥昔非君、帕罗西汀、perhexyline、芬美曲秦、苯肾上腺素、苯丙甲胺、甲羟苯丙胺、匹西雷司、pimethylline、吲哚洛尔、吡哌酸、匹多卡因、心得宁、普多沙星(pradofloxacin)、普拉克索、普拉维林、普瑞特罗、普尼拉明(prenylamine)、prilocalne、丙卡特罗、丙萘洛尔(pronethalol)、普罗帕酮(propafenone)、普萘洛尔(propranolol)、六氢脱氧麻黄碱(propylhexedrine)、胡椒喘定(protokylol)、普罗替林(protriptyline)、伪麻黄碱、瑞波西汀(reboxetine)、雷沙吉兰(rasagiline)、(r)-雷沙吉兰((r)-rasagiline)、瑞匹诺坦(repinotan)、瑞普特罗(reproterol)、瑞米特罗(rimiterol)、利托君、沙芬酰胺(safinamide)、舒喘灵/沙丁胺醇(salbutamol/albuterol)、沙美特罗(salmeterol)、沙立佐坦(sarizotan)、舍曲林(sertraline)、西洛多辛(silodosin)、索他洛尔(sotalol)、索特瑞醇(soterenol)、司帕沙星(sparfloxacin)、螺普利(spirapril)、硫氧洛尔(sulfinalol)、脱氧肾上腺素(synephrine)、坦索罗辛(tamsulosin)、替巴克兰(tebanicline)、噻奈普汀、替罗非班、喘速宁、曲美他嗪、曲昔匹特、伐尼克兰、维达列汀、维洛沙秦、维喹地尔或扎莫特罗；
ⅶ.包含具有生物活性的蛋白，
ⅷ.具有生物活性，从而具有靶结合活性，
ⅸ.是独立折叠的蛋白或其部分，
x.是糖基化蛋白，
xi.包含链内二硫键，
xii.结合细胞因子，
xⅲ.结合细胞因子，其中所述细胞因子是TNFα，
xⅳ.包含心钠素(ANP)、降钙素、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、内皮素、艾塞那肽、胃抑制肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、GLP-1或GLP-2类似物、胰高血糖素血管活性肠肽(GVIP)、生长素释放肽、YY肽或分泌素或它们的一部分，
xv.包含序列HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:4657)中的一段连续氨基酸，
xⅵ.包含至少一段连续氨基酸，其与抗体的Fab或Fab’的重链中存在的一段连续氨基酸相同，
xⅶ.包含至少一段连续氨基酸，其与抗体的Fab或Fab’的轻链中存在的一段连续氨基酸相同，
xⅷ.包含抗体的至少一个Fab或Fab’，或至少一个Fab或Fab’的部分，
xⅸ.包含抗体的Fab-1或Fab’1或其部分，
xx.包含抗体的Fab-2或Fab’2或其部分，
xxi.包含抗体的两个Fab或Fab’手(hand)，
xxⅱ.包含至少一段连续氨基酸，其与单链抗体中存在的一段连续氨基酸相同，或
xxⅲ.包含至少一段连续氨基酸，其与TNFα受体中存在的一段连续氨基酸相同，
f.所述四面体抗体或八面体抗体包含共价连接，其中所述共价连接选自本文公开的任何共价连接，或包含本文公开的任何异双功能交联剂，和/或
g.所述四面体抗体或八面体抗体包含一个或多个肽接头，其中所述一个或多个肽接头独立地选自：
ⅰ.序列TSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD(SEQID NO:3227)，或其中存在的一段连续氨基酸，
ⅱ.序列GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG(SEQ ID NO:3226)，或其中存在的一段连续氨基酸，或
ⅲ.本文公开的任何肽接头。
图1-14和图29A-图42示意性描述了本发明的四面体抗体和八面体抗体的各种非限制性实例。在附图说明中提供了对这些四面体和八面体抗体的各种类型的结构域的描述(由各种颜色和/或图案的椭圆或椭圆组表示)。每幅图均代表本发明的一个实施方案。
本发明还提供一种组合物，其包含至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的本发明的四面体抗体或八面体抗体，作为所述组合物中含肽分子的比例(重量/重量)。
结构域
此处对四面体和八面体抗体的结构域进行编号，以方便描述和识别每个结构域。第一结构域在此可称为“D1”，或“结构域1”。同样的原则适用于本发明的所有其他结构域(即第二结构域在此可称为“D2”或“结构域2”等)。此外，除非另有规定，否则本发明的四面体抗体可以缺少一个或多个结构域而不影响其他结构域的编号。例如，本发明的四面体抗体可以包括结构域1、2、3、4和6而不包括结构域5。作为另一个例子，本发明的四面体抗体可以包括结构域1、2、3、4、7和8，而不包括结构域5和6(参见，例如，图42)。
原则上，本发明的四面体抗体的第一结构域和第二结构域是可以互换的，即在一些实施方案中，被描述为适用于第一结构域的特征可以同样适用于第二结构域。同样地，本发明的四面体抗体的第三结构域和第四结构域是可互换的，本发明的第五结构域和第六结构域是可互换的，并且第七结构域和第八结构域是可互换的。
类似地，关于本发明的八面体抗体，本发明的第一结构域、第二结构域和第三结构域可以互换，第四结构域、第五结构域和第六结构域可以互换，第七结构域、第八结构域和第九结构域可以互换，第十结构域、第十一结构域和第十二结构域可以互换。如上所述，在上下文中，可互换是指本文描述的适用于其中一个结构域的任何特征，也可适用于其他任何结构域。
同样，本领域的技术人员将理解，本发明的四面体抗体的结构域1和2与本发明的八面体抗体的结构域1、2和3具有类似的结构目的，因此就适用于本发明的四面体抗体的结构域1和2的任何描述也可适用于本发明的八面体抗体的结构域1、2和3而言是等效的。类似的等价关系在本发明的四面体抗体的结构域3和4与本发明的八面体抗体的结构域4、5和6之间也适用。此外，本发明的四面体抗体的结构域5和6与本发明的八面体抗体的结构域7、8和9之间具有类似的等价关系。此外，本发明的四面体抗体的结构域7和8与本发明的八面体抗体的结构域10、11和12之间也有类似的等价关系。
链(chain)
本发明的各种实施方案包括由“重链”和“轻链”组成的结构域。本发明的重链在此可称为“H链”或“H1”“H2”“H3”等。同样地，本发明的轻链在此可称为“L链”或“L1”、“L2”、“L3”等。
在本发明的四面体抗体的实施方案中，包括第一重链(“H1”)和第二重链(“H2”)。H1链和H2链可以相互配对，形成结构域1和2。H1链也可以与一条轻链配对形成结构域3和4，而H2链也可以与一条轻链配对形成结构域5和6。H1链和H2链也可以进行同源二聚。在这种情况下，H1链上的二聚化多肽与H2链上的二聚化多肽进行异源二聚。H1链或H2链还可以包括本文所述的额外的结构域7和8。H1链和/或H2链还可以在结构域1和3之间和/或结构域2和4之间包括一个二聚化多肽。在本发明的每个四面体抗体中，H1链和H2链可以包括一个或多个肽接头。如果H1链和/或H2链包括一个二聚化多肽，肽接头可以存在于结构域1或2与二聚化多肽之间，二聚化多肽与结构域3或4之间，或两种情况同时存在。肽接头也可以存在于结构域1或2与二聚化多肽之间，二聚化多肽与结构域5或6之间，或两种情况同时存在。
类似的原则适用于本发明的八面体抗体。H1链和H2链相互配对，形成结构域1、2和3。H1链也可与一条轻链配对形成结构域4、5和6，而H2链可以与一条轻链配对形成结构域7、8和9。如本文所述，H1链或H2链还可包括额外的结构域10、11和12。
本发明的各种实施方案包括Fc融合蛋白。在这样的实施方案中，“Fc融合链”的一部分可以与“Fc链”配对以形成Fc结构域。本发明的Fc结构域通常是本发明的四面体抗体的结构域1和/或2以及本发明的八面体抗体的结构域1、2和/或3。“Fc融合链”通常还包括形成本发明的四面体抗体的结构域3、4、5和/或6以及本发明的八面体抗体的结构域4、5、6、7、8、9、10、11和/或12的部分。
在本发明的四面体抗体中，“Fc融合链”可以包括在形成结构域1和2的部分和形成结构域3和4的部分之间的二聚化多肽。在另一个实施方案中，因为结构域1和2的“Fc链”在其各自的N-端都包括一个二聚化多肽，所以“Fc融合链”可以缺少一个二聚化多肽。在该实施方案的替代方案中，结构域1和2的“Fc链”通过共价连接在它们各自的N-端连接。
本发明特别考虑了四面体抗体和八面体抗体，其中(1)“Fc融合链”包括在形成结构域1和2的部分与形成结构域3和4的部分之间的二聚化多肽，并且(2)结构域3和4不是ACE2肽酶结构域。
在本发明的八面体抗体中，“Fc融合链”可以包括在形成结构域1、2和3的部分和形成结构域4、5和6的部分之间的三聚化多肽。
在本发明的每个四面体抗体中，“Fc融合链”可以在形成结构域1的部分和形成结构域3或5的部分之间包括一个或多个肽接头。如果“Fc融合链”包括二聚化多肽，则肽接头可以存在于结构域1和二聚化多肽之间、二聚化多肽和结构域3或5之间，或两种情况同时存在。同样，“Fc融合链”可以包括在形成结构域2的部分与形成结构域4或6的部分之间的肽接头。如果“Fc融合链”包括二聚化多肽，则肽接头可以存在于结构域2和二聚化多肽之间，二聚化多肽和结构域4或6之间，或两种情况同时存在。
在本发明的每个八面体抗体中，“Fc融合链”可以包括在形成结构域1的部分(part)的部分(portion)和形成结构域4或7的部分(portion)之间、形成结构域2的部分的部分和形成结构域5或8的部分之间、以及形成结构域3的部分的部分和形成结构域6或9的部分之间的肽接头。在每一种情况下，如果“Fc融合链”包括三聚化多肽，那么“Fc融合链”可以包括在形成结构域1、2和3的部分(part)的部分(portion)与三聚化多肽之间、或者三聚化多肽与形成结构域4、5和6的部分之间，或两种情况同时存在的肽接头。
术语
如本文所用，并且除非另有说明，否则以下各术语应具有以下定义。
肽基连接：
Figure BDA0004108496920000451
结构。肽基连接可以是一个肽键。
一段连续的氨基酸序列：排列成链的一组氨基酸，其中每个氨基酸通过肽键与前一个氨基酸连接，除了链中的第一个氨基酸可以选择性地不与前一个氨基酸连接。链上的氨基酸可以是天然的或非天然存在的，或者可以包含它们的混合物。除非另有说明，否则这些氨基酸可以是基因编码的、天然存在但非基因编码的、或非天然存在的，以及它们之间的任何选择。
N-末端氨基酸残基：具有游离的α-氨基(NH2)官能团或α-氨基(NH2)官能团的衍生物的一段两个以上的连续氨基酸的末端残基。
N-末端：N-末端氨基酸残基的游离α-氨基(NH2)(或其衍生物)。
C-末端氨基酸残基：具有游离α-羧基(COOH)官能团或α-羧基(COOH)官能团的衍生物的一段两个以上的连续氨基酸的末端残基。
C-末端：C-末端氨基酸残基的游离α羧基(COOH)(或其衍生物)。
本文所用的“生物活性结构”意指能够在生物环境中(例如在生物体、细胞或其体外模型中)通过执行功能或作用，或刺激或响应功能、作用或反应，来治疗疾病或病症，或将本发明的化合物定位(localizing)或靶向(targeting)到体内的疾病或病症部位的分子或其片段的结构。生物活性结构可以包括多肽、核酸、小分子如小的有机或无机分子中的至少一个的结构。
除非另有说明，或与上下文相反，否则“键”应理解为包括共价键、偶极-偶极相互作用(dipole-dipole interaction)，如氢键，以及分子间相互作用，如范德瓦尔斯力。
“信号序列”是指导多肽翻译后运输的短(3-60个氨基酸长)肽链。
在一个实施方案中，本文所用的“氨基酸”意指基因编码的氨基酸的L或D异构体，即异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天门冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸，并且还包括同型半胱氨酸(homocysteine)和同型硒代半胱氨酸(homoselenocysteine)。
氨基酸的其他实例包括牛磺酸的L或D异构体、γ氨基丁酸(gaba)、多巴胺、羊毛硫氨酸(Lanthionine)、2-氨基丁酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸，以及它们的非天然同源物和合成修饰形式，包括具有缩短或延长最多两个碳原子的亚烷基链的氨基酸、包括任选取代的芳基的氨基酸以及包括卤化基团的氨基酸，包括卤化烷基和芳基以及β或γ氨基酸，以及环状类似物。
由于可电离的氨基和羧基的存在，这些实施方案中的氨基酸可以是酸式盐或碱式盐的形式，也可以是中性形式。单个氨基酸残基也可以通过氧化或还原进行修饰。其他考虑到的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，以及赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化。
共价衍生物可以通过将特定官能团连接至氨基酸侧链或N-或C-末端处来制备。
包含具有R-基团取代的氨基酸的化合物在本发明的范围内。应当理解，本领域普通技术人员可以选择本发明化合物上的取代基和取代模式，以从容易获得的原料中提供化学稳定的化合物。
本文所用的“天然氨基酸”是指遗传编码氨基酸的L或D异构体，即异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸和同型半胱氨酸(homocysteine)以及同型硒代半胱氨酸(homoselenocysteine)。
本文所用的“非天然氨基酸”是指异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、同型半胱氨酸、同型硒代半胱氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸、多巴胺、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸的化学修饰后的L或D异构体，包括在α碳和S或Se之间有C3-C10脂肪族侧链的半胱氨酸和硒代半胱氨酸衍生物。在一个实施方案中，该脂肪族侧链是一个亚烷基。在另一个实施方案中，该脂肪族侧链是亚烯基或亚炔基。
除了本文所述的连续氨基酸序列的片段之外，可以预期通过将适当的核苷酸改变引入编码DNA中，和/或通过合成所需的连续氨基酸序列来制备其变体。本领域技术人员将会理解，当选择表达作为合成方法(而不是例如化学合成)时，氨基酸变化可以改变本文所述的连续氨基酸序列的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚定特性。
本文所述序列的变异可以通过，例如，使用例如美国专利第5364934号中所述的保守和非保守突变的任何技术和指南来进行。变异可以是导致氨基酸序列与天然序列相比发生变化的编码所关注的连续氨基酸序列的一个或多个密码子的取代、缺失或插入。任选地，所述变异是通过在一个或多个结构域中用任何其他氨基酸取代至少一个氨基酸。通过将该序列与同源的已知蛋白分子的序列进行比较，并使高同源性区域中氨基酸序列变化的数量最小化，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指导。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸取代亮氨酸，即保守氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在约1至5个氨基酸的范围内。可以通过系统地在序列中进行氨基酸的插入、缺失或取代，并测试所得变体的全长或成熟天然序列所显示的活性，来确定所允许的变异。应当理解，在此处公开的本发明的范围内可以进行任何末端变异。
结合配偶体(binding partner)的氨基酸序列变体的制备考虑了各种目的，包括增加结合配偶体对其配体的亲和力，促进结合配偶体的稳定性、纯化和制备，改变其血浆半衰期，提高治疗功效，以及减轻结合配偶体治疗应用期间副作用的严重性或发生率。
本文还考虑了这些序列的氨基酸序列变体，包括插入的、取代的或缺失的变体。这些变体通常可以通过对编码靶结合单体的DNA中的核苷酸进行定点诱变来制备，由此获得编码该变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。也可以通过体外合成方便地制备具有高达约100-150个氨基酸残基的片段。这种氨基酸序列变体是预先确定的变体，在自然界中没有发现。变体表现出非变异形式的定性生物活性(包括靶结合)，尽管不一定具有相同的定量值。虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先确定的，但突变本身不需要预先确定。例如，为了优化给定位点突变的性能，在目标密码子进行随机或饱和诱变(其中插入了所有20种可能的残基)，并筛选表达的变体以获得所需活性的最佳组合。这种筛选在本领域普通技术范围内。
氨基酸插入通常约为1至10个氨基酸残基；取代通常为引入单个残基；缺失约为1至30个残基的范围。缺失或插入优选以相邻对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。从下面的讨论中可以明显看出，引入或组合了取代、缺失、插入或它们的任意组合以形成最终的构建体。
如本文所用，“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或化学连接至蛋白的部分的改变。例如，修饰可以是连接到蛋白上的碳水化合物或PEG结构的改变。如本文所用，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为了清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA形式的密码子的20种氨基酸。
如本文所用，“氨基酸取代”或“替代”意是指用不同的氨基酸取代亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，所述取代是在特定位置处取代为非天然存在的氨基酸，所述非天然存在的氨基酸不是生物体内或任何生物体内天然存在的。例如，E272Y取代指变体多肽，在这种情况下的Fc变体中，272位的谷氨酸被酪氨酸取代。为清楚起见，经工程改造改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)替换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物表达水平)的蛋白不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创造了编码相同蛋白的新基因，但如果该蛋白在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，则不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在233位之后和234位之前插入谷氨酸。此外，-233ADE或A233ADE表示在233位之后和234位之前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置处去除氨基酸序列。例如，E233-或E233#或E233()表示在233位处谷氨酸的缺失。此外，EDA233-或EDA233#表示从233位开始的序列GluAspAla的缺失。
本文使用的术语“变体蛋白”或“蛋白变体”或“变体”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白的蛋白。蛋白变体可以指蛋白本身、包含该蛋白的组合物或编码该蛋白的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白相比，蛋白变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，约1至约70个氨基酸修饰，并且优选约1至约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人类野生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，尽管具有变体的人类序列也可以用作“亲本多肽”，例如图13的IgG1/2杂合体。本文的蛋白变体序列优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的同一性(identity)，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白可以指变体蛋白本身、包含该蛋白变体的组合物或编码该蛋白变体的DNA序列。因此，本文使用的术语“抗体变体”或“变体抗体”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体，本文使用的“IgG变体”或“变体IgG”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG(同样，在许多情况下，不同于人类IgG序列)的抗体，本文使用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白。本发明的Fc变体根据组成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在434位处具有丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S限定了相对于亲本Fc多肽具有M428L和N434S取代的Fc变体。野生型氨基酸的身份(identity)可能是未指定的，在这种情况下，上述变体被称为428L/434S。需要指出的是，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体，等等。对于本发明中讨论的与抗体相关的所有位置，除非另有说明，氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或Kabat或欧盟编号方案中的EU索引指的是EU抗体的编号(Edelman et al.,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85,全部引入本文作为参考)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸，以及在某些情况下，还包括合成氨基酸。实例包括美国专利第6586207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J.W.Chin et al.,(2002),Journal of the American Chemical Society124:9026-9027；J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137；J.W.Chin,et al.,(2002),PICAS United States ofAmerica99:11020-11024；和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.1-10，这些通过引用全部并入本文。
如本文所用，“蛋白”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。术语“蛋白”和“一段连续的氨基酸序列”在本文中可互换使用。肽基可以包括天然存在的氨基酸和肽键，或合成的肽模拟物结构，即“类似物”，如类肽(参见Simon et al.,PNASUSA89(20):9367(1992)，全部引入作为参考)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，不是由DNA编码的氨基酸)；如本领域技术人员所理解的，例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是用于本发明目的的合成氨基酸，并且D-和L-(R或S)构型的氨基酸均可以使用。本发明的变体可以包含包括使用合成氨基酸的修饰，使用例如Schultz及其同事开发的技术引入，所述技术包括但不限于由以下文献所描述的：Cropp&Shultz,2004,TrendsGenet.20(12):625-30,Anderson et al.,2004,Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71,Zhang et al.,2003,303(5656):371-3和Chin et al.,2003,Science 301(5635):964-7，所有文献均通过引用完全并入本文。此外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其他分子的接头、与蛋白或蛋白结构域的融合、以及添加肽标签或标记。
本文使用的术语“残基”意指蛋白中的位置及其相关的氨基酸特性。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或n297)是人抗体IgG1中297位处的残基。
本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的背景下的该区域。本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。
本文所用的“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的、对齐的IgG同种型(aligned IgG isotype)中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1包含一个酪氨酸，IgG2在EU 296位置处包含一个苯丙氨酸，IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
术语“非天然存在的修饰”意指非同种型的氨基酸修饰。例如，因为没有一种IgG在434位处包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)中的434位取代被认为是非天然存在的修饰。
本文使用的术语“效应子功能(effector function)”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
本文所用术语“IgG Fc配体”意指来自任何生物体的分子，优选多肽，其结合IgG抗体的Fc区以形成Fc/Fc配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin)、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同系物(FcRH)，它们是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis et al.,2002,Immunological Reviews 190:123-136，全部通过引用并入)。Fc配体可包括尚未发现的结合Fc的分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文所用的“Fc配体”意指来自任何生物体的分子，优选多肽，其与抗体的Fc区结合形成Fc/Fc配体复合物。
本文所用术语“Fcγ受体”、“FcγR”、“FcgammaR”或“FcgR”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括亚型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括亚型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett82:57-65，全部引入作为参考)，以及任何尚未发现的人类FcγR或FcγR同工型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何尚未发现的小鼠FcγR或FcγR同工型或同种异型。
本文使用的术语“FcRn”或“新生Fc受体(neonatal Fc Receptor)”意指结合IgG抗体Fc区并至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔子和猴子。如本领域已知的，功能性FcRn蛋白包含两种多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白意指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。在图11的图例中示出了用于增加与FcRn受体的结合以及在某些情况下用于增加血清半衰期的各种FcRn变体。
本文使用的术语“亲本多肽”意指起始多肽，其随后被修饰以产生变体。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或者是天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本免疫球蛋白”是指将要进行修饰产生变体的未修饰的免疫球蛋白多肽，而本文所用的“亲本抗体”是指将要进行修饰产生变体抗体的未修饰的抗体。应当注意的是，“亲本抗体”包括如下所述的已知的商业重组产生的抗体。
如本文所用，术语“Fc融合蛋白”或“免疫黏附素(immunoadhesin)”意指包含Fc区的蛋白，通常连接(任选地通过接头部分，如本文所述)至不同的蛋白，例如本文所述的与靶蛋白的结合部分。在一些情况下，异二聚体蛋白的一个单体包含抗体重链(包括scFv或进一步包括轻链)，另一个单体是Fc融合体，包含变体Fc结构域和配体。
本文使用的术语“位置(position)”意指蛋白序列中的位置。位置可以顺序编号，或者根据已建立的格式，例如用于抗体编号的EU索引。
本文所用的术语“靶抗原”意指与给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。下文描述了多种合适的靶抗原。
本文所用的术语“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
本文所用的术语“可变区”意指免疫球蛋白的包含一个或多个Ig结构域的区域，所述Ig结构域基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白遗传位点的任何Vκ、Vλ和/或VH基因编码。
本文所用的术语“野生型或wt”意指自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列未经有意修饰。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”意指已经鉴定并从表达该多肽的细胞或细胞培养物中分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。
“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定抗原或表位意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。例如，可以通过确定分子的结合与对照分子的结合相比较来测量特异性结合，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶的对照分子竞争来确定特异性结合。
对特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如对抗原或表位具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的KD的抗体来表现，其中KD指的是一个特定的抗体-抗原相互作用的解离率。通常，特异性结合抗原的抗体具有对抗原或表位的相对于对照分子的20-、50-、100-、500-、1000-、5000-、10000-倍以上的KD。
此外，对特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如对抗原或表位的KA或Ka相对于对照对表位至少大20、50、100、500、1000、5000、10000倍以上的抗体来表现，其中KA或Ka指特定抗体-抗原相互作用的缔合率。
本文所用的“消融(ablation)”意指活性的降低或消除。因此，例如，“消融FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有少于50％的起始结合，优选活性损失少于70-80-90-95-98％，且一般而言，活性低于Carterra分析中的可检测结合水平。
本文所用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞裂解。ADCC与FcγRIIIa结合相关；增加与FcγRIIIa的结合导致ADCC活性增加。
本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞的吞噬作用。
一方面，本发明提供了一段与本申请的说明书、附图、SEQ序列号或序列表中公开的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性，优选至少约81％序列同一性，更优选至少约82％序列同一性，还更优选至少约83％序列同一性，还更优选至少约84％序列同一性，还更优选至少约85％序列同一性，还更优选至少约86％序列同一性，还更优选至少约87％序列同一性，还更优选至少约88％序列同一性，还更优选至少约89％序列同一性，还更优选至少约90％序列同一性，还更优选至少约91％序列同一性，还更优选至少约92％序列同一性，还更优选至少约93％序列同一性，还更优选至少约94％序列同一性，还更优选至少约95％序列同一性，还更优选至少约96％的序列同一性，还更优选至少约97％的序列同一性，还更优选至少约98％的序列同一性，还更优选至少约99％的序列同一性的连续的氨基酸(即蛋白)。类似地，本发明提供了包含此类蛋白的二聚体和三聚体，包括本发明实施例中所述的那些。
可以使用例如WU-BLAST-2计算机程序容易地获得氨基酸序列同一性％的值(Altschul et al.,Methods in Enzymology 266:460-480(1996))。
本文提供了天然序列的片段。例如，与全长天然蛋白相比，此类片段可能在N-末端或C-末端被截短，或可能缺少内部残基。再次，应当理解，在此处公开的本发明的上下文的范围内可以进行任何末端变异。
某些片段缺失对目的序列的所需生物活性非必需的氨基酸残基。
可以使用许多常规技术中的任何一种。可以化学合成所需的肽片段或连续氨基酸的片段。另一种方法涉及通过酶切产生片段，例如通过用已知在特定氨基酸残基限定的位点切割蛋白的酶处理蛋白，或通过用合适的限制性酶消化DNA并分离所需片段。另一种合适的技术包括通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增编码所需多肽/序列片段的DNA片段。在PCR中，在5’和3’引物处使用限定DNA片段的所需末端的寡核苷酸。
在特定的实施方案中，表A中在优选取代的标题下显示了目的保守取代。如果这种取代导致生物活性的改变，则引入更实质性的改变，命名为表A中的示例性取代，或如下文关于氨基酸类的进一步描述，并筛选产物。
表A-保守氨基酸取代
Figure BDA0004108496920000561
Figure BDA0004108496920000571
序列的功能或免疫特性的实质性修饰是通过选择取代来实现的，所述取代在维持以下方面的效果明显不同：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如片状或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。天然存在的残基根据常见的侧链特性分为以下几组：
a.疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
b.中性亲水的：cys，ser，thr；
c.酸性的：asp，glu；
d.碱性的：asn、gln、his、lys、arg；
e.影响链取向的残基：gly，pro；
f.芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守取代需要将这些类别中的一个成员替换为另一个类别。这种取代的残基也可以被引入保守的取代位点，或者更优选地，被引入其余的(非保守的)位点。
可以使用本领域已知的方法进行变异，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变(Carter et al.,Nucl.Acids Res.,13:4331(1986)；Zoller etal.,Nucl.Acids Res.,10:6487(1987))、盒式诱变(Wells et al.,Gene,34:315(1985))、限制性选择诱变(Wells et al.,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986))或其他已知技术可对克隆的DNA进行操作，以产生变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用于鉴定沿连续序列的一个或多个氨基酸。其中相对较小的中性氨基酸是优选的扫描氨基酸。这些氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是该组中优选的扫描氨基酸，因为它消除了β-碳以外的侧链，并且不太可能改变变体的主链构象(Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085(1989))。丙氨酸也通常是优选的，因为它是最常见的氨基酸。此外，它在掩埋(buried)和暴露位置都经常发现(Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)；Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976))。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，可以使用电子等排的氨基酸(isotericamino acid)。
共价修饰：一段连续的氨基酸可以被共价修饰。一种类型的共价修饰包括使目标氨基酸残基与有机衍生剂反应，该有机衍生剂能够与选定的侧链或不参与–x-x-键的N-或C-末端残基反应。用双功能剂衍生化是有用的，例如，交联到水不溶性支撑基质或表面，用于纯化目的反序列(anti-sequence)抗体的方法，反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸的酯、均双官能亚胺酯(homobifunctional imidoester)，包括二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidylester)，例如3,3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(3,3’-dithiobis(succinimidylpropionate))、双官能马来酰亚胺(bifunctional maleimide)，例如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷(bis-N-maleimido-1,8-octane)和例如甲基-3-((对-叠氮苯基)二硫代)丙酰亚胺酯(methyl-3-((p-azidophenyl)dithio)propioimidate)的交联剂。
其他修饰包括谷氨酰胺基和天冬酰胺基残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸或苏氨酸残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure andMolecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
另一种类型的共价修饰包括改变一段连续的氨基酸的天然糖基化模式。“改变天然糖基化模式”在本文中的目的是意指缺失氨基酸序列中发现的一个或多个碳水化合物部分(通过去除潜在的糖基化位点或通过化学和/或酶促手段去除糖基化)，和/或添加天然序列中不存在的一个或多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化的定性变化，涉及存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
向氨基酸序列中添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列来实现。例如，可以通过在天然序列(对于O-连接的糖基化位点)中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变。氨基酸序列可以任选地通过DNA水平的改变而改变，特别是通过在预选的碱基处使编码氨基酸序列的DNA突变，从而产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
增加氨基酸序列上碳水化合物部分数量的另一种手段是通过糖苷与多肽的化学或酶偶联。此类手段在本领域中有所描述，例如在1987年9月11日公布的WO 87/05330中，以及在Aplin and Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)中。
去除氨基酸序列上存在的碳水化合物部分可以通过化学或酶促或通过对编码作为糖基化目标的氨基酸残基的密码子进行突变取代来实现。化学去糖基化技术是本领域已知的，并且在例如Hakimuddin,et al.,Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)和Edge etal.,Anal.Biochem.,118:131(1981)中描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura et al.,Meth.Enzymol.,138:350(1987)所述。
另一种类型的共价修饰包括以美国专利第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337号中所述的方式将氨基酸序列连接到多种非蛋白类聚合物(nonproteinaceous polymer)中的一种上。
术语“取代”、“取代的”和“取代基”是指这样的官能团，其中与其中所含的氢原子所成的一个或多个键被与非氢原子所成的键取代，前提是保持正常的化合价并且该取代导致稳定的化合物。取代的基团还包括其中一个或多个与碳或氢原子所成的键被一个或多个与杂原子所成的键(包括双键或三键)取代的基团。取代基的实例包括卤素(即F、Cl、Br和I)；烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和三氟甲基；芳基，例如苯基；杂芳基，如三唑、二氢哒嗪和四唑；羟基；烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基；芳氧基，例如苯氧基；芳烷氧基，例如苄氧基(苯甲氧基)和对三氟甲基苄氧基(4-三氟甲基苯甲氧基)；杂芳氧基；磺酰基，如磺酸酯(sulfonate)、三氟甲磺酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基；亚硝基(sulfnitro)，亚硝酰基(nitrosyl)；巯基；磺酰基(sulfanyl group)，例如甲基磺酰基、乙基磺酰基和丙基磺酰基；氰基；氨基，例如氨基、甲氨基、二甲氨基、乙基氨基和二乙基氨基；以及羧基。在公开或要求保护多个取代基部分的情况下，取代的化合物可以独立地被一个或多个公开或要求保护的取代基部分单个或多个取代。独立取代的意指(两个或多个)取代基可以相同或不同。在用于本发明方法的化合物中，烷基、杂烷基、单环、双环、芳基、杂芳基和杂环基团可以通过用可选的非氢基团取代一个或多个氢原子来取代。这些基团包括但不限于卤素、羟基、巯基、氨基、羧基、氰基和氨基甲酰基。
应当理解，本领域普通技术人员可以选择本发明方法中使用的化合物上的取代基和取代模式，以提供化学稳定的化合物，并且该化合物可以通过本领域已知的技术由容易获得的原料容易地合成。如果取代基本身被一个以上的基团取代，应理解这些多个基团可以在相同的碳上或在不同的碳上，只要产生稳定的结构即可。
在选择用于本发明方法的化合物时，本领域普通技术人员将认识到各种取代基，即R1、R2等是根据化学结构连接性的众所周知的原则来选择的。
如本文所用，“烷基”包括具有特定碳原子数的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未取代的或取代的。因此，“C1-Cn烷基”中的C1-Cn被限定为包括具有以线性或支化排列的1、2、....、n-1或n个碳的基团。例如，C1-C6，如“C1-C6烷基”中所限定的，包括具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链排列的结构，具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、戊基和己基。除非另有说明，否则含有1至12个碳。烷基可以是未取代的，也可以被一个或多个取代基取代，包括但不限于卤素、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、二氟甲基、甲氧基和羟基。一个实施方案可以是C1-C12烷基、C2-C12烷基、C3-C12烷基、C4-C12烷基等等。一个实施方案可以是C1-C8烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基、C4-C8烷基等等。烷基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“C1-C4烷基”包括支链和直链C1-C4烷基二者。
如本文所用，术语“环烷烃”是指单环或双环系统，其可以是不饱和的或部分不饱和的，即具有一个或多个双键。单环体系的实例是含有3-8个碳原子的饱和环状烃基。单环系统的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。双环稠环系统的实例是一个环烷基环稠合到另一个环烷基环上。双环稠环系统的实例包括但不限于十氢化萘、1,2,3,7,8,8a-六氢萘等。因此，C3-C10环烷烃包括总共具有3至8个碳原子的烷烃环(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基等)。环烷烃基团可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，包括但不限于卤素、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、二氟甲基、甲氧基和羟基。环烷烃旨在包括单价、二价、三价等的部分。
本文所用的术语“环烯烃”是指具有一个或多个双键的环烷烃。因此，C5-C10环烯烃包括总碳原子数为5-10的烷烃环(cyclic ring)(例如环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环辛烯基或环辛二烯基等)。环烯烃是指单价、二价、三价等的部分。环烯烃旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“烯烃”包括具有一个或多个双键和指定数量的碳原子的支链和直链脂肪族烃基，并且可以是未取代的或取代的。因此，“C2-Cn烯烃”中的C2-Cn被限定为包括具有以线性或支化排列的2，3，....、n-1或n个碳的基团。例如，在“C2-C10烯烃”中，C2-C10被限定为包括具有以线性或支化排列的2，3，4，5...10个碳的基团，并且具体包括乙烯基、烯丙基、1-丁烯、2-丁烯、异-丁烯、1-戊烯、2-戊烯等。烯炔基(alkyene group)可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，包括但不限于卤素、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、二氟甲基、甲氧基和羟基。一个实施方案可以是C2-C3烯烃、C2-C4烯烃、C2-C5烯烃等。烯烃旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“酰基”是指在第一位具有酮的烷基。例如，“酰基”实施方案可以是乙酰基、丙酰基、丁酰基和戊酰基。作为另一个实例，“酰基”实施方案可以是：
Figure BDA0004108496920000621
其中n是1-10。在另一个实施方案中，n是1-4。
因此，“C2-C5酰基”可以是乙酰基、丙酰基、丁酰基或和戊酰基。酰基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
C2-C5酰氨基是如上限定的酰基进一步被胺取代。胺可以连接到酰基的羰基部分以形成酰胺，或者胺可以连接到酰基的非羰基部分。例如，氨基可以位于α-位、β-位、γ-位、δ-位处等。作为进一步的实例，酰氨基包括α-氨基乙酰基和乙酰胺基。酰氨基包括β-氨基丙酰基。
C2-C5酰氧基是如上限定的酰基进一步被氧取代。氧可以连接到酰基的羰基部分以形成酰胺，或者氧可以连接到酰基的非羰基部分。例如，氧基团可以位于α-位、β-位、γ-位、δ-位处等。作为进一步的实例，酰氧基包括α-氧乙酰基和乙酸酯基团。酰氧基包括β-氧丙酰基。
如本文所用，“氨基”包括伯胺、仲胺、叔胺和季胺。因此，氨基包括-NH-基团、-NH2基团、-NR-基团、-NR2 +-基团、-NRH+-基团、-NH2 +-基团、-NH3 +-基团和-NR3 +-基团，其中R是烷基或芳基。氨基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“硫”包括-S-基团和-SH基团。术语硫旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“氧”包括-O-基团和-OH基团。术语硫是指单价和二价的部分。
如本文所用，“琥珀酰基”是通过去除一个或两个羟基而衍生自琥珀酸。一个实施方案可以是-C(O)-CH2-CH2-C(O)-。琥珀酰基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“丙二酰基”通过去除一个或两个羟基而衍生自丙二酸。一个实施方案可以是-C(O)-CH2-C(O)-。丙二酰基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“戊二酰基”是通过去除一个或两个羟基而衍生自戊二酸。一个实施方案可以是-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-。戊二酰基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
如本文所用，“己二酰基”是通过去除一个或两个羟基而衍生自己二酸。一个实施方案可以是-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-。己二酰基旨在包括单价、二价、三价等的部分。
“聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)”是通过去除羟基中的两个氢而衍生自聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)。一个实施方案可以衍生自聚乙二醇、聚丙二醇或聚丁二醇。
“聚亚烷基二醇”的实施方案可以是
Figure BDA0004108496920000631
Figure BDA0004108496920000632
其中n是1-10。
如本文所用，“芳基”意指每个环中至多10个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环，其中至少一个环是芳族的，并且可以是未取代的或取代的。此类芳基元素的实例包括但不限于：苯基、对甲苯基(4-甲基苯基)、萘基、四氢萘基、茚满基、菲基、蒽基或苊基。在芳基取代基为双环且一个环为非芳环的情况下，应理解为通过芳环连接。
如本文所用，术语“杂芳基”表示每个环中至多10个原子的稳定的单环、双环或多环，其中至少一个环是芳族的并且包含1至4个选自O、N和S的杂原子。双环芳族杂芳基包括苯基、吡啶、嘧啶或吡啶嗪环，其(a)稠合到具有一个氮原子的6元芳族(不饱和)杂环上；(b)稠合到具有两个氮原子的5或6元芳族(不饱和)杂环上；(c)稠合到具有一个氮原子和一个氧或一个硫原子的5元芳族(不饱和)杂环上；或(d)稠合到具有一个选自O、N或S的杂原子的5元芳族(不饱和)杂环上。本定义范围内的杂芳基包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋喃氮基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌嗪基(cinnolinyl)、二氢吡啶嗪、呋喃基、二氢吲哚基(indolinyl)、吲哚基(indolyl)、吲哚嗪基(indolazinyl)、吲唑基(indazolyl)、异苯并呋喃基、异吲哚基(isoindolyl)、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基(oxadiazolyl)、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑嘧啶基(tetrazolopyridyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、氮杂环丙烯基、1,4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂环庚烯基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吖啶基、咔唑基、噌嗪基(cinnolinyl)、喹喔啉基、吡唑基(pyrrazolyl)、吲哚基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、异噁唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。在杂芳基取代基为双环且一个环为非芳族的或不含杂原子的情况下，应理解为分别通过芳族环或通过含杂原子的环连接。如果杂芳基含有氮原子，应理解其相应的N-氧化物也包含在该定义中。
术语“苯基”旨在意指含有六个碳的芳族六元环及其任何取代衍生物。
术语“苄基”旨在意指直接连接到苯环上的亚甲基。苄基是其中氢被苯基取代的甲基，及其任何取代的衍生物。
术语“三唑”旨在意指具有含两个碳原子和三个氮原子的五元环的杂芳基及其任何取代衍生物。
二氢哒嗪(dihydropyradizine)任选被取代，包括1,2-二氢哒嗪、
Figure BDA0004108496920000651
1,4-二氢哒嗪、
Figure BDA0004108496920000652
1,6-二氢哒嗪、
Figure BDA0004108496920000653
和4,5-二氢哒嗪、
Figure BDA0004108496920000654
含有与二氢哒嗪稠合的环辛烷的化学结构包括但不限于含有与二氢哒嗪的第3位和第4位稠合的环辛烷的化学结构或含有饱和环辛[d]哒嗪的化学结构，它们中的任何一个任选被取代。例如，含有与二氢哒嗪稠合的环辛烷的化学结构包括但不限于含有2,4a,5,6,7,8,9,10-八氢环辛烷[d]哒嗪、
Figure BDA0004108496920000655
4a,5,6,7,8,9,10,10a-八氢环辛烷[d]哒嗪、
Figure BDA0004108496920000656
2,3,5,6,7,8,9,10-八氢环辛烷[d]哒嗪、
Figure BDA0004108496920000657
或1,2,5,6,7,8,9,10-八氢环辛烷[d]哒嗪、
Figure BDA0004108496920000658
的化学结构，它们各自可以任选被取代。
Figure BDA0004108496920000659
的互变异构体包括但不限于：
Figure BDA00041084969200006510
Figure BDA0004108496920000661
在一些实施方案中，二氢哒嗪被氧化成哒嗪。
在一些实施方案中，二氢哒嗪被还原以产生具有1,4-二羰基化合物的开环结构。
本发明方法中使用的化合物可以通过有机合成中熟知的和本领域普通技术人员熟悉的技术制备。然而，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一方法。
本发明的化合物可转化为前体药物以优化吸收和生物利用度。前药的形成包括，但不限于，游离羟基与羧酸反应形成酯，游离羟基与三氯氧磷(phosphorus oxychloride)反应，随后水解形成磷酸酯(phosphate)，或游离羟基与氨基酸反应形成氨基酸酯，其方法已由Chandran在WO 2005/046575中描述。根据药物和药物化学领域熟知的原则选择取代基并评估所得类似物，例如定量结构-活性关系、优化生物活性和ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)性质。
连接到本文公开的化合物的芳环上的各种R基团可以通过标准方法加成到环上，例如《高级有机化学：B部分：反应和合成》，Francis Carey和Richard Sundberg，(Springer)第5版。(2007)版中所述的方法，其内容引入本文作为参考。
本发明的化合物可以通过以下文献中描述的技术制备：Vogel’s Textbook ofPractical Organic Chemistry,A.I.Vogel,A.R.Tatchell,B.S.Furnis,A.J.Hannaford,P.W.G.Smith,(Prentice Hall)5th Edition(1996),March’s Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,Michael B.Smith,Jerry March,(Wiley-Interscience)5th Edition(2007)，以及其中的参考文献，这些文献通过引用并入本文。然而，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一方法。
本领域普通技术人员将立即理解本文提供的取代基和部分的限定旨在遵守化学化合价的标准规则。例如，在本文提供的结构要求特定取代基或部分是二价的情况下(例如，部分的线性链中的部分)，本领域普通技术人员将立即理解该取代基或部分的限定是二价的，以便遵守化学化合价的标准规则。
本领域普通技术人员将立即理解，本发明中描述的一些二价部分可以以一种以上的方式与其他化学结构连接，例如，当所描述的结构旋转或翻转时，可以与其他化学结构连接。
在本发明的一些实施方案中，化合物包含非蛋白类聚合物。在一些实施方案中，非蛋白类聚合物可以是亲水的合成聚合物，即自然界中没有发现的聚合物。然而，天然存在以及通过重组或体外方法生产的聚合物是有用的，从天然分离的聚合物也是有用的。亲水性聚乙烯聚合物属于本发明的范围，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚亚烷基醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯酯或甲氧基聚乙二醇；聚氧亚烷基类(polyoxyalkylenes)，例如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯，以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支链或非支链多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同型多糖和杂型多糖例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、糊精、糖原糖醇的聚合物，例如聚山梨醇和聚甘露醇；和肝素或类肝素(heparon)。
盐
本文公开的化合物的盐在本发明的范围内。如本文所用，“盐”是本发明化合物的盐，其已经通过制备该化合物的酸式盐或碱式盐而被改性。
一段连续的氨基酸
本文提及的一段连续的氨基酸的实例包括但不限于连续的氨基酸，所述连续的氨基酸包括结合域，例如分泌或跨膜蛋白、细胞内结合域和抗体(整体或其部分)以及它们的修饰形式(modififed versions)。以下是一些非限制性的实例。
免疫球蛋白
术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(例如，Fab和/或单臂抗体)即可。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域(constant domain)或恒定区(constant region)的类型。有五个主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“抗体片段”是包含完整抗体的一部分的分子，而不是完整抗体，所述完整抗体的一部分结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体(intact antibody)”和“整个抗体(wholeantibody)”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含本文限定的Fc区域的重链的抗体。
“封闭(blocking)”抗体或“拮抗剂(antagonist)”抗体是指显著抑制(部分或完全)其结合的抗原的生物活性的抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争试验中阻断参照抗体与其抗原结合达50％以上的抗体，反过来，参照抗体在竞争试验中阻断该抗体与其抗原结合达50％以上。本文提供了示例性的竞争试验。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，每个结构域包括四个保守的框架区(FR)和三个超变区(HVR)。(例如，参见Kindt et al.KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合的特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补的VL或VH结构域库来分离。例如，参见Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
本文使用的术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区，这些区在序列上是高变异的和/或形成结构上定义的环(“超变环”)。通常，天然四链抗体包括六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)，并且三个在VL(L1，L2，L3)。HVR通常包括来自超变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的超变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991).)除了VH中的CDR1之外，CDR一般包括形成超变环的氨基酸残基。CDR还包括“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩略-CDR或a-CDR的CDR的区域内。示例性的a-CDRs(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102等氨基酸残基上(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008).)除非另有说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在此根据Kabat等人的文献进行编号，同上。
“框架”或“FR”是指除超变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以以下顺序出现。FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本文所用的短语“N-末端截短的重链”是指包含部分而非全部全长免疫球蛋白重链的多肽，其中缺失的部分是通常位于重链的N端区域上的部分。缺失的部分可以包括但不限于可变结构域、CH1和部分或全部的铰链序列。一般来说，如果野生型铰链序列不存在，N-末端截短的重链中剩余的恒定结构域将包括能够与另一个Fc序列(即本文所述的“第一”Fc多肽)连接的组分。例如，所述组分可以是修饰的残基或添加的能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人类FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其细胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)。(参见，例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在以下文献中综述：例如Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他FcR，包括那些未来将被识别的FcR，都包含在本文的术语“FcR”中。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体(neonatal receptor)，FcRn，其负责将母体IgG转运至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的平衡状态。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie etal.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.)。
可以在例如，表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽在体内与人FcRn的结合和血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了与FcR的结合有所改善或减弱的抗体变体。另请参见，例如，Shields et al.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
本文所用的“铰链区”、“铰链序列”及它们的变化形式包括本领域已知的含义，这在例如Janeway et al.,Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(4th ed.,1999)；Bloom et al.,Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys et al.,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202中得到说明。
除非另有说明，否则在本说明书中使用的表述“多价抗体”用来表示由三个以上抗原结合位点组成的抗体。多价抗体优选被设计成具有三个以上的抗原结合位点，并且通常不是天然序列的IgM或IgA抗体。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其性质可以是共价的，例如在scFv中。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用，在VH-VL二聚体的表面限定了一个抗原结合位点。总的来说，六个HVR或其亚类赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅由三个HVR组成的抗原特异性的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常比整个结合位点的亲和力低。
“Fab”片段包含轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变域第一恒定结构域(CH1)。F(ab’)2抗体片段包括一对Fab片段，这些片段通常在其羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学结合在本领域也是已知的。
本文所用的短语“抗原结合臂”是指抗体片段的具有特异性结合所关注的靶分子的能力的组成部分。通常且优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列的复合物，例如，免疫球蛋白轻链和重链的HVR和/或可变结构域序列。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,Vol 113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含与相同多肽链(VH和VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更全面的描述。
表述“线性抗体”是指在Zapata et al.,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包括一对串联的Fd段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变异抗体，例如，含有自然发生的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对抗原上的一个决定簇的。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得的，而并不能解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。例如，待使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白位点的转基因动物的方法，这种方法和其他用于制造单克隆抗体的示范性方法在本文中有所描述。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分来自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种的抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人类抗体的那些HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人类抗体的那些FR。人源化抗体可以选择性地包括至少一部分来自人类抗体的抗体恒定区。抗体的“人源化形式”，例如非人源抗体，是指经过人源化处理的抗体。
“人抗体”是指具有与人类或人类细胞产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体，或者是从利用人类抗体库(human antibody repertoires)或其他人类抗体编码序列的非人类来源得到的抗体。所述人抗体的定义特别排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
“裸抗体(naked anitbody)”是指未与异源部分(例如，细胞毒性分子)或放射性标签(radiolabel)相缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，并以二硫键连接。从N端到C端，每条重链都有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，后面是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链都有一个可变区(VL)，也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，后面是恒定轻结构域(CL)。根据其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可被指定为两种类型中的一种，称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“亲和力”是指分子(如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则本文所用的“结合亲和力”是指内在的结合亲和力，它反映了结合对(如抗体和抗原)成员之间1:1的相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的普通方法来测量，包括本文所述的方法。用于测量结合亲和力的具体说明性和示范性的实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的(affinity matured)”抗体是指与不具有此类改变(alteration)的母体抗体相比，在一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。
具有指定抗体的“生物特征”的抗体是指具有该抗体的一个或多个生物特征的抗体，这些特征将其与结合相同抗原的其他抗体区分开来。
抗体的“功能性抗原结合位点”是能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不一定与衍生该抗原结合位点的亲本抗体一样强，但是结合抗原的能力必须可以使用已知用于评价抗体与抗原结合的多种方法中的任何一种测量到。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不需要在数量上相同。对于本文的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数量可以使用超速离心分析来评价，如美国专利申请公开第2005/0186208A1号的实施例2中所述。根据这种分析方法，结合不同比例的靶抗原和多聚体抗体，并假设不同数量的功能结合位点来计算复合物的平均分子量。将这些理论值与获得的实际实验值进行比较，以评价功能性结合位点的数量。
“物种依赖性抗体(species-dependent antibody)”是对来自第一种哺乳动物的抗原的结合亲和力强于对来自第二种哺乳动物的该抗原的同源物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”至人类抗原(即具有不超过约1×10-7M的结合亲和力(Kd)值，优选不超过约1×10-8M，最优选不超过约1×10-9M)，但对来自第二种非人哺乳动物物种的抗原同源物的结合亲和力比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上限定的各种类型抗体中的任何一种。在一些实施方案中，物种依赖性抗体是人源化或人类抗体。
“分离的”抗体是从其自然环境的成分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
Fc结构域
本文所用术语“Fc结构域”通常指单体或二聚体复合物，包含免疫球蛋白重链的C-末端多肽序列。Fc结构域可以包含天然的或变异的Fc序列。尽管免疫球蛋白重链Fc结构域的边界可能不同，但人IgG重链Fc结构域通常被限定为从铰链区的氨基酸残基延伸至Fc序列的羧基末端。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定区，CH2区和CH3区，并任选包含CH4区。人Fc结构域可以从任何合适的免疫球蛋白获得，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。
合适的Fc结构域通过前Fc(pre-Fc)嵌合多肽的重组DNA表达来制备，所述前Fc嵌合多肽包含1)从分泌或跨膜蛋白获得的信号肽，其在具有N-末端半胱氨酸残基的成熟多肽前面被切割，其与2)具有N-末端半胱氨酸残基的Fc结构域多肽相连(contiguous)。
信号肽的合适实例是音猬因子(sonic hedgehog,SHH)(GenBank登录号NM000193)、IFNα-2(IFN)(GenBank登录号NP000596)和胆固醇酯转移酶(CETP)(GenBank登录号NM000078)。其他合适的实例包括印度刺猬因子(Indian hedgehog)(Genbank登录号NM002181)、沙漠刺猬因子(Genbank登录号NM021044)、IFNα-1(Genbank登录号NP076918)、IFNα-4(Genbank登录号NM021068)、IFNα-5(Genbank登录号NM002169)、IFNα-6(Genbank登录号NM021002)、IFNα-7(Genbank登录号NM021057)、IFNα-8(Genbank登录号NM002170)、IFNα-10(Genbank登录号NM002171)、IFNα-13(Genbank登录号NM006900)、IFNα-14(Genbank登录号NM002172)、IFNα-16(Genbank登录号NM002173)、IFNα-17(Genbank登录号NM021268)和IFNα-21(Genbank登录号NM002175)。
Fc结构域及其前Fc嵌合多肽的合适实例示于SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:215中。Fc结构域是通过在导致前Fc嵌合多肽分泌和切割信号肽的条件下在细胞中表达前Fc嵌合多肽而获得的。前Fc多肽可以在原核或真核宿主细胞中表达。优选地，用编码前Fc多肽的表达载体转染哺乳动物宿主细胞。
具有N-末端序列CDKTHTCPPCPAPE、CPPCPAPE和CPAPE的人IgG1 Fc结构域分别示于SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:136中，编码它们的DNA序列分别示于SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:137中。SEQ ID NO:120的IgG1结构域是通过分别使用SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:122(SHH信号肽)、SEQ ID NO:124(IFN信号肽)和SEQ ID NO:126(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:128的IgG1结构域是通过分别使用SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:135中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:130(SHH信号肽)、SEQ ID NO:132(IFN信号肽)和SEQ ID NO:134(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:136的IgG1结构域是通过分别使用SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:143中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:138(SHH信号肽)、SEQ ID NO:140(IFN信号肽)和SEQ ID NO:142(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。
具有N-末端序列CCVECPPCPAPE、CVECPPCPAPE、CPPCPAPE和CPAPE的人IgG2 Fc结构域分别示于SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:168中，编码它们的DNA序列分别示于SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:169中。SEQ ID NO:144的IgG2结构域是通过分别使用SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149和SEQ IDNO:151中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:146(SHH信号肽)、SEQ ID NO:148(IFN信号肽)和SEQ ID NO:150(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:152的IgG2结构域是通过分别使用SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:159中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:154(SHH信号肽)、SEQ ID NO:156(IFN信号肽)和SEQ ID NO:158(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:160的IgG2结构域是分别使用SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167所示的DNA序列从SEQ ID NO:162(SHH信号肽)、SEQ IDNO:164(IFN信号肽)和SEQ ID NO:166(CETP信号肽)所示的前Fc嵌合多肽中获得的。SEQ IDNO:168的IgG2结构域是分别使用SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:175所示的DNA序列从SEQ ID NO:170(SHH信号肽)、SEQ ID NO:172(IFN信号肽)和SEQ ID NO:174(CETP信号肽)所示的前Fc嵌合多肽中获得的。
具有N-末端序列(CPRCPEPKSDTPPP)3-CPRCPAPE、CPRCPAPE和CPAPE的人IgG3 Fc结构域分别示于SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:192中，编码它们的DNA序列分别示于SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:193中。SEQ ID NO:176的IgG3结构域是通过分别使用SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:183中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:178(SHH信号肽)、SEQ ID NO:180(IFN信号肽)和SEQ ID NO:182(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:184的IgG3结构域是通过分别使用SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:191中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:186(SHH信号肽)、SEQ ID NO:188(IFN信号肽)和SEQ ID NO:190(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:192的IgG3结构域是通过分别使用SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:199中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:194(SHH信号肽)、SEQ ID NO:196(IFN信号肽)和SEQ ID NO:198(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。
具有N-末端序列CPSCPAPE和CPAPE的人IgG4 Fc结构域的序列分别示于SEQ IDNO:200和SEQ ID NO:208中，编码它们的DNA序列分别示于SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:209中。SEQ ID NO:200的IgG4结构域是通过分别使用SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205和SEQ IDNO:207中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:202(SHH信号肽)、SEQ ID NO:204(IFN信号肽)和SEQ ID NO:206(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:208的IgG4结构域是通过分别使用SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:215中所示的DNA序列表达SEQ ID NO:210(SHH信号肽)、SEQ ID NO:212(IFN信号肽)和SEQ ID NO:214(CETP信号肽)中所示的前Fc嵌合多肽获得的。
通过重组DNA表达前重链嵌合多肽(pre-heavy chain chimeric polypeptides)来制备在其重链N-末端具有半胱氨酸残基的合适抗体变体，所述前重链嵌合多肽包含1)从分泌或跨膜蛋白获得的信号肽，其在具有N-末端半胱氨酸残基的成熟多肽之前被切割，其与2)具有N-末端半胱氨酸残基的抗体重链多肽相连。
通过重组DNA表达前轻链嵌合多肽(pre-light chain chimeric polypeptides)来制备在其轻链N-末端具有半胱氨酸残基的合适抗体变体，所述前轻链嵌合多肽包含1)从分泌或跨膜蛋白获得的信号肽，其在具有N-末端半胱氨酸残基的成熟多肽前面被切割，其与2)具有N-末端半胱氨酸残基的抗体轻链多肽相连。
曲妥珠单抗重链和轻链通过在导致其分泌和切割信号肽的条件下在细胞中表达前重链嵌合多肽和前轻链嵌合多肽(pre-heavy and pre-light chimeric polypeptides)而获得。前重链多肽和前轻链多肽可以在原核或真核宿主细胞中表达。优选地，用编码前重链多肽和前轻链多肽的表达载体转染哺乳动物宿主细胞。
针对重组抗体曲妥珠单抗，添加到前述抗体重链、前重链、轻链和前轻链变体的N-末端的蛋白序列在本文中进行了说明，但通常适用于任何重组抗体。如美国专利第5,821,337号(“免疫球蛋白变体”)中所述，编码曲妥珠单抗及其变体的DNA序列可以通过共转染其重链和轻链及其衍生变体的DNA载体在哺乳动物细胞中构建和表达，该专利通过引用并入本文。野生型曲妥珠单抗轻链和重链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248中。
具有N-末端半胱氨酸残基的曲妥珠单抗轻链及其前Fc嵌合多肽的合适实例示于SEQ ID NO:249至SEQ ID NO:284中。具有N-末端半胱氨酸残基的曲妥珠单抗重链及其前Fc嵌合多肽的合适实例示于SEQ ID NO:285至SEQ ID NO:320中。
具有N-末端序列C、CP、CPP、CPR、CPS、CDKT、CDKTHT、CVE和CDTPPP的曲妥珠单抗轻链分别示于SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:277和SEQ ID NO:281中。SEQ ID NO:249的轻链是通过表达SEQ ID NO:250(SHH信号肽)、SEQ ID NO:251(IFN信号肽)和SEQ ID NO:252(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:253的轻链是通过表达SEQID NO:254(SHH信号肽)、SEQ ID NO:255(IFN信号肽)和SEQ ID NO:256(CETP信号肽)所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:257的轻链是通过表达SEQ ID NO:258(SHH信号肽)、SEQ ID NO:259(IFN信号肽)和SEQ ID NO:260(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:261的轻链是通过表达SEQ ID NO:262(SHH信号肽)、SEQ ID NO:263(IFN信号肽)和SEQ ID NO:264(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:265的轻链是通过表达SEQ ID NO:266(SHH信号肽)、SEQ ID NO:267(IFN信号肽)和SEQ ID NO:268(CETP信号肽)所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:269的轻链是通过表达SEQ IDNO:270(SHH信号肽)、SEQ ID NO:271(IFN信号肽)和SEQ ID NO:272(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:273的轻链是通过表达SEQ ID NO:274(SHH信号肽)、SEQ ID NO:275(IFN信号肽)和SEQ ID NO:276(CETP信号肽)所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:277的轻链是通过表达SEQ ID NO:278(SHH信号肽)、SEQ ID NO:279(IFN信号肽)和SEQ ID NO:280(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:281的轻链是通过表达SEQ ID NO:282(SHH信号肽)、SEQ ID NO:283(IFN信号肽)和SEQ ID NO:284(CETP信号肽)中所示的前轻链嵌合多肽获得的。
具有N-末端序列C、CP、CPP、CPR、CPS、CDKT、CDKTHT、CVE和CDTPPP的曲妥珠单抗重链分别示于SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:317中。SEQ ID NO:285的重链是通过表达SEQ ID NO:286(SHH信号肽)、SEQ ID NO:287(IFN信号肽)和SEQ ID NO:288(CETP信号肽)中所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:289的重链是通过表达SEQID NO:290(SHH信号肽)、SEQ ID NO:291(IFN信号肽)和SEQ ID NO:292(CETP信号肽)中所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:293的重链是从SEQ ID NO:294(SHH信号肽)、SEQID NO:295(IFN信号肽)和SEQ ID NO:296(CETP信号肽)所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQID NO:297的重链是从SEQ ID NO:298(SHH信号肽)、SEQ ID NO:299(IFN信号肽)和SEQ IDNO:300(CETP信号肽)所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:301的重链是通过表达SEQID NO:302(SHH信号肽)、SEQ ID NO:303(IFN信号肽)和SEQ ID NO:304(CETP信号肽)中所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:305的重链是通过表达SEQ ID NO:306(SHH信号肽)、SEQ ID NO:307(IFN信号肽)和SEQ ID NO:308(CETP信号肽)中所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:309的重链是从SEQ ID NO:310(SHH信号肽)、SEQ ID NO:311(IFN信号肽)和SEQ ID NO:312(CETP信号肽)所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:313的重链是从SEQ ID NO:314(SHH信号肽)、SEQ ID NO:315(IFN信号肽)和SEQ ID NO:316(CETP信号肽)所示的前重链嵌合多肽获得的。SEQ ID NO:317的重链是从SEQ ID NO:318(SHH信号肽)、SEQ ID NO:319(IFN信号肽)和SEQ ID NO:320(CETP信号肽)所示的前重链嵌合多肽获得的。
合适的宿主细胞包括获自美国典型培养物保藏中心的293人胚胎细胞(ATCC CRL-1573)和CHO-K1仓鼠卵巢细胞(ATCC CCL-61)(Rockville，Md)。使细胞在37℃下，95％空气、5％二氧化碳的气氛中生长。将293细胞维持在基本必需培养基(Eagle)中，该培养基含有2mM L-谷氨酰胺和Earle’s BSS，并调节至含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠，90％；胎牛血清，10％。CHO-K1细胞维持在含2mM L-谷氨酰胺的Ham's F12K培养基中，该培养基被调节至含1.5g/L碳酸氢钠，90％；胎牛血清，10％。其他合适的宿主细胞包括CV1猴肾细胞(ATCC CCL-70)、COS-7猴肾细胞(ATCC CRL-1651)、VERO-76猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA人宫颈细胞(ATCC CCL-2)、W138人肺细胞(ATCC CCL-75)、MDCK犬肾细胞(ATCC CCL-34)、BRL3A大鼠肝细胞(ATCC CRL-1442)、BHK仓鼠肾细胞(ATCC CCL-10)、MMT060562小鼠乳腺细胞(ATCC CCL-51)，以及人CD8+T淋巴细胞(描述于美国序列号08/258,152中，其全部内容通过引用并入本文)。
合适的表达载体的实例是SEQ ID NO:216中所示的pCDNA3.1(+)和SEQ ID NO:217中所示的pSA。质粒pSA含有下列DNA序列元件：1)pBluescriptIIKS(+)(核苷酸912-2941/1-619，GenBank登录号X52327)，2)人巨细胞病毒启动子、增强子和第一外显子剪接供体(核苷酸63-912，GenBank登录号K03104)，3)人α1-珠蛋白第二外显子剪接受体(核苷酸6808-6919，GenBank登录号J00153)，4)SV40 T抗原多聚腺苷酸化位点(核苷酸2770-2533，Reddyet al.(1978)Science 200,494-502)，以及5)SV40复制起源(核苷酸5725-5578，Reddy etal.,同上)。其他合适的表达载体包括质粒pSVeCD4DHFR和pRKCD4(美国专利第5,336,603号)、质粒pIK.1.1(美国专利第5,359,046号)、质粒pVL-2(美国专利第5,838,464号)、质粒pRT43.2F3(描述于美国序列号08/258,152，其全部内容通过引用并入本文)。
可通过将由SEQ ID NO:217制得的HindIII-PspOM1载体片段与由SEQ ID NO:123、125、127、131、133、135、139、141、143、147、149、151、155、157、159、163、165167、171、173、175、179、181、183、187、189、191、195,197、199、203、205、207、211、213和215制得的HindIII-EagI插入片段连接来构建用于人IgG前Fc多肽的合适表达载体。
合适的选择性标记包括Tn5转座子新霉素磷酸转移酶(NEO)基因(Southern andBerg(1982)J.Mol.Appl.Gen.1,327-341)和二氢叶酸还原酶(DHFR)cDNA(Lucas et al.(1996)Nucl.Acids Res.24,1774-1779)。掺入NEO基因的合适表达载体的一个实例是质粒pSA-NEO，它是通过将用EcoRI和BglII酶切SEQ ID NO:218制得的第一个DNA片段与用EcoRI和BglII酶切SEQ ID NO:217制得的第二个DNA片段连接而构建的。SEQ ID NO:218掺入了一个NEO基因(核苷酸1551-2345，Genbank登录号U00004)，其前面有一个用于翻译起始的序列(Kozak(1991)J.Biol.Chem,266,19867-19870)。掺入NEO基因和DHFR cDNA的合适表达载体的另一个实例是质粒pSVe-NEO-DHFR，它是通过将第一DNA片段(用EcoRI和BglII酶切SEQID NO:218制得)与第二DNA片段(用EcoRI和BglII酶切pSVeCD4DHFR制得)连接而构建的。质粒pSVe-NEO-DHFR使用SV40早期启动子/增强子驱动NEO基因和DHFR cDNA的表达。其他合适的选择标记包括XPGT基因(Mulligan and Berg(1980)Science 209,1422-1427)和潮霉素抗性基因(Sugden et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5,410-413)。
在一个实施方案中，通过Graham et al.(1977)J.Gen.Virol.36,59-74的磷酸钙方法转染细胞。将DNA混合物(10ug)溶解在0.5ml的1mM Tris-HCl、0.1mM的EDTA和227mM的CaCl2中。该DNA混合物含有(比例为10:1:1)表达载体DNA、可选择标记DNA和编码VA RNA基因的DNA(Thimmappaya et al.(1982)Cell 31,543-551)。向该混合物中滴加0.5mL的50mMHepes(pH 7.35)、280mM的NaCl和1.5mM的NaPO4。在25℃下让DNA沉淀物形成10分钟，然后悬浮并加入到在100mm塑料组织培养皿上生长至汇合的细胞中。37℃下4小时后，吸出培养液，并加入2ml含20％甘油的PBS，持续0.5分钟。然后用无血清培养基洗涤细胞，加入新鲜培养基，并将细胞孵育5天。
在另一个实施方案中，通过Somparyrac et al.(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.12,7575-7579的硫酸葡聚糖方法瞬时转染细胞。细胞在旋转烧瓶中生长至最大密度，离心浓缩，用PBS洗涤。将DNA-葡聚糖沉淀物在细胞颗粒上孵育。在37℃下4小时后，吸出DEAE-葡聚糖，并加入PBS中的20％甘油，持续1.5分钟。然后细胞用无血清培养基洗涤，重新引入盛有含有5微克/毫升牛胰岛素和0.1微克/ml牛转铁蛋白(bovine transferring)的新鲜培养基的旋转烧瓶中，并孵育4天。
在用任一方法转染后，将条件培养基离心并过滤以去除宿主细胞和碎片。然后通过任何选定的方法，例如透析和/或柱层析(见下文)，浓缩和纯化含有Fc结构域的样品。为了鉴定细胞培养上清液中的Fc结构域，在转染后24至96小时除去培养基，浓缩，并在存在或不存在还原剂如二硫苏糖醇的情况下通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。
对于未扩增的表达，将质粒转染到人293细胞中(Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59 74(1977))，使用高效程序(Gorman et al.,DNA Prot.Eng.Tech.2:310(1990))。将培养基改为无血清，并每天收获，最多五天。对于未扩增的表达，将质粒转染到人293细胞中(Graham et al.,J.Gen.Virol.36:5974(1977))，使用高效程序(Gorman etal.,DNA Prot.Eng.Tech.2:3 10(1990))。将培养基改为无血清，并每天收获，最多五天。使用HiTrap蛋白A HP(Pharmacia公司)从细胞培养上清液中纯化Fc结构域。使用Centricon-30(Amicon)将洗脱的Fc结构域缓冲交换到PBS中，浓缩至0.5ml，使用Millex-GV(Millipore公司)在4℃下无菌过滤。改变Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
在某些实施方案中，与非工程化Fc结构域相比，Fc结构域被工程化为具有改变的Fc受体结合亲和力和/或改变的效应子功能。在美国专利申请公开号US 20130058937 A1和以下段落中描述了所述修饰的实施方案。
与Fc受体的结合可通过例如ELISA或使用标准仪器如BIAcore仪器(GEHealthcare公司)通过表面等离子共振(SPR)容易地确定，Fc受体例如可通过重组表达获得。本文描述了合适的这种结合测定。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，例如表达FcγIIIa受体的NK细胞，来评价Fc结构域或包含Fc结构域的四面体抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域的效应子功能可通过本领域已知的方法来测量。PCT公开号WO 2006/082515或PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中描述了评价所关注的分子的ADCC活性的合适的体外检测方法，其全部内容通过引用并入本文。用于这种分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，可以在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如在Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的。
在一些实施方案中，Fc结构域与补体成分，特别是与C1q的结合被改变。因此，在一些实施方案中，其中Fc结构域被工程化以具有改变的效应子功能，所述改变的效应子功能包括改变的CDC。可以进行C1q结合测定来确定Fc结构域是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC分析(参见，例如，Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。Fc变体
本发明涉及多特异性，特别是双特异性结合蛋白，特别是多特异性抗体的产生。本发明通常依赖于使用可以在生产细胞中自组装以产生异二聚蛋白的工程改造的或变体Fc结构域，以及产生和纯化这种异二聚蛋白的方法。
此外，如本文所述，可以将额外的氨基酸变体引入本发明的Fc结构域中，以增加额外的功能。例如，可以在Fc区内添加氨基酸变化(添加到一个单体或两个单体)以促进ADCC或CDC的增加(例如，改变与Fcγ受体的结合)；允许或增加添加毒素和药物的产量(例如对于ADC)，以及增加与FcRn的结合和/或增加所得分子的血清半衰期。如本文进一步描述的，并且如本领域技术人员将理解的，本文概述的任何和所有变体可以可选地和独立地与其他变体组合。类似地，另一类功能变体是“Fcγ消融变体(Fcγablation variant)”或“Fcγ沉默变体”。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免额外的作用机制。也就是说，例如，在许多实施方案中，特别是在使用单价结合CD3和另一种肿瘤抗原(例如CD19、her2/neu等)的双特异性抗体时，一般期望去除FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。
用于额外功能的额外Fc变体
因此，可进行许多有用的Fc取代来改变与一种或多种FcγR受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合通常导致增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并随后引起靶细胞的裂解)。类似地，在某些情况下，减少与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合也是有益的。在本发明中使用的氨基酸取代包括在美国序列号11/124,620(特别是图41)、序列号11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的氨基酸取代，所有这些专利的全部内容特别是其中公开的变体通过引用明确地并入本文。发现使用的特定变体包括但不限于Kabat位置236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
此外，还有用于增加与FcRn受体的结合和增加血清半衰期的其他Fc取代，如具体公开于美国序列号12/341,769中的，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/4345、436V/428L和259I/308F/428L，其全部内容通过引用并入本文。
抗原结合结构域
如本领域技术人员将理解的，有两种基本类型的抗原结合结构域，类似于抗体和T细胞抗原结合结构域的那些(例如，包含一组六个CDR，或在单结构域抗体、单结构域T细胞受体等的情况下，三个CDR)，以及可以是“配体结合配偶体”(即，配体或受体、酶或底物，或它们的等价物)的那些，例如，不使用CDR而与靶结合。
Fab结构域
多特异性抗体生产中的一个挑战是除了期望的功能分子之外，各种不期望的副产物的形成。当存在两个以上不同的Fab结构域时，错配通常是由于错误的重链相互配对以及轻链与错误的重链配对或不期望的轻链配对造成的。轻链错配问题尤其具有挑战性，迄今为止，还没有任何一种方法本身被证明在防止轻链与重链的不当结合和/或其他副产物的形成方面是一致的。
在迫使轻链多肽与其正确的重链对应物(counterpart)配对方面，一种方法利用了嵌合的重链和轻链。这种方法最初被描述为“可变区结构域交换的IgG”，或“内向型(io)抗体”，该方法基于重链和轻链之间的结构域内交换，涉及特定Fab结构域内的重链和轻链可变区的交换(Chan et al,Molecular Immunology 421,527-538(2004))。
该方法，也称为“交叉单克隆抗体技术”，已用于在重链和轻链之间进行不同的结构域交换，从而为不同特异性的重链和轻链产生不同的结构域排列。WO 2009/080251、WO2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254涉及具有这种结构域交换的二价双特异性IgG抗体。WO 2010/145792和WO 2010/145792涉及具有这种结构域交换的四价抗原结合蛋白。在WO2009/080252和Schaefer et al,PNAS,108(2011)11187-1191中描述了在一个结合臂中具有这种结构域交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL)。(所有上述引用的全部内容通过引用并入本文)。
可变区结构域交换通常减少但不消除由于针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链错配而产生的副产物。此外，这些制剂并非完全不含其他副产物。主要副产物基于Bence-Jones型相互作用(也参见Schaefer,W.et al,PNAS,108(2011)11187-1191；在补编的图S1I中)。
通过在VH和CL结构域以及CH1和CL结构域的特定氨基酸位置引入带相反电荷的带电荷氨基酸的取代，有助于进一步减少副产物和相关的聚集行为，从而提高这种多特异性抗体的产量。由此产生的“电荷对”修饰介导的静电转向效应(electrostatic steeringeffect)与可变区结构域交换的效应互补，有助于促使轻链与其正确的重链正确配对。
在本发明中用作这种电荷对的成分的氨基酸取代包括Kannan等人在(WO 2014/081955)、Shaefer等人在(WO2015/150447)、Ast等人在(WO 2016/020309)和Carter等人在(WO2016/172485)中所述的那些，其全部内容通过引用并入本文。可用的优选变体包括但不限于κ和λ轻链恒定区中的EU位置E123、Q124和V133，重链恒定区中的K147、S183和K213，轻链可变区中的Q38和重链可变区中的Q39。氨基酸取代的具体实例包括，但不限于，轻链恒定区123或124位处被K、R或H取代，重链恒定区147或213位处被E或D取代，轻链恒定区133位被K、R、H、E或D取代，重链恒定区183位被K、R、H、E或D取代，轻链可变区的38位处被K、R、H、E或D取代，重链可变区的39位处被K、R、H、E或D取代。
本发明提供了包含两类重链和两类轻链的四面体抗体。在这种抗体中，第三结构域和第四结构域可以包含一个或多个电荷对，而第五结构域和第六结构域是“CrossMab”。反过来，第三结构域和第四结构域可以是“CrossMab”，而第五结构域和第六结构域包含一个或多个电荷对。此外，第三结构域和第四结构域可以是“CrossMab”，并且包含一个或多个电荷对，而第五结构域和第六结构域都不包含这类修饰。反过来，第五结构域和第六结构域可以是“CrossMab”，并包含一个或多个电荷对，而第三结构域和第四结构域都不包含这类修饰。在每种情况下，这类修饰都有助于两种类型的重链与其相应的轻链之间的正确配对。这种四面体抗体可以是双特异性的和四价的。
类似地，本发明提供了包含两类重链和两类轻链的八面体抗体。在这种抗体中，第四结构域、第五结构域和第六结构域可以包含一个或多个电荷对，而第七结构域、第八结构域和第九结构域是“CrossMab”。反过来，第四结构域、第五结构域和第六结构域可以是“CrossMab”，而第七结构域、第八结构域和第九结构域包含一个或多个电荷对。此外，第四结构域、第五结构域和第六结构域可以是“CrossMab”并包含一个或多个电荷对，而第七结构域、第八结构域和第九结构域都不包含这类修饰。反过来，第七结构域、第八结构域和第九结构域可以是“CrossMab”并包含一个或多个电荷对，而第四结构域、第五结构域和第六结构域都不包含这类修饰。在每种情况下，这类修饰都有助于两种类型的重链与其相应的轻链之间的正确配对。这种抗体可以是双特异性的和八价的。
胞外蛋白(Extracellular Protein)
胞外蛋白在多细胞生物体的形成、分化和维持等方面发挥重要作用。在2004年4月20日发布的Ashkenazi等人的美国专利第6,723,535号中阐述了对各种所关注的胞内蛋白的讨论，在此引入作为参考。胞外蛋白包括分泌蛋白和跨膜蛋白的胞外结构域。
分泌蛋白
许多单个细胞的命运，例如增殖、迁移、分化或与其他细胞的相互作用，通常由从其他细胞和/或直接环境接收的信息控制。这种信息通常由分泌多肽(例如，促分裂因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽和激素)传递，而这些分泌多肽又被不同的细胞受体或膜结合蛋白接收和解读。这些分泌的多肽或信号分子通常通过细胞分泌途径到达它们在细胞外环境中的作用位点。
分泌蛋白具有各种工业应用，包括作为药物、诊断、生物传感器和生物反应器。目前可用的大多数蛋白药物，如溶栓剂、干扰素、白细胞介素、红细胞生成素、集落刺激因子(colony stimulating factor)和各种其他细胞因子，都是分泌蛋白。它们的受体是膜蛋白，也具有作为治疗剂或诊断剂的潜力。工业界和学术界都在努力鉴定新的天然分泌蛋白。许多努力集中于筛选哺乳动物重组DNA文库，以鉴定新分泌蛋白的编码序列。文献中描述了筛选方法和技术的实例(参见，例如，Klein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.93:7108-7113(1996)；美国专利第5,536,637号))。
白介素-15(IL-15)是γ细胞因子家族的成员，其刺激T、B和自然杀伤(NK)细胞的增殖，并诱导干细胞、中枢和效应记忆CD8 T细胞。IL-15的序列在Grabstein et al.,Science.1994May 13；264(5161):965-8中有所描述。IL-15的生物学及其治疗意义在例如Steel et al.Trends Pharmacol Sci.2012Jan；33(1):35–41,Perera etal.MicrobesInfect.2012March；14(3):247–261，以及Waldmann et al.Nature ReviewsImmunology volume 6,pages 595–601(2006)中进行了讨论。
跨膜蛋白的胞外结构域
膜结合蛋白和受体可在多细胞生物的形成、分化和维持等方面发挥重要作用。许多单个细胞的命运，例如增殖、迁移、分化或与其他细胞的相互作用，通常由从其他细胞和/或直接环境接收的信息控制。这种信息通常由分泌多肽(例如，促分裂因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽和激素)传递，而这些分泌多肽又被不同的细胞受体或膜结合蛋白接收和解读。这种膜结合蛋白和细胞受体包括但不限于细胞因子受体、受体激酶、受体磷酸酶、参与细胞-细胞相互作用的受体和细胞黏附素分子(cellular adhesinmolecule)，如选择素和整合素(integrin)。例如，调节细胞生长和分化的信号转导部分受到各种细胞蛋白磷酸化的调节。蛋白酪氨酸激酶是催化这一过程的酶，也可以作为生长因子受体。实例包括成纤维细胞生长因子受体和神经生长因子受体。
膜结合蛋白和受体分子具有各种工业应用，包括作为药物和诊断剂。例如，受体免疫黏附素可用作阻断受体-配体相互作用的治疗剂。膜结合蛋白也可用于筛选相关受体/配体相互作用的潜在肽或小分子抑制剂。
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)是细胞因子受体的蛋白超家族，其特征在于能够通过胞外富含半胱氨酸的结构域结合肿瘤坏死因子(TNF)。TNFRSF的成员在Locksley etal.,Cell.2001Feb 23；104(4):487-501和下表中有所描述。另见Hehlgans et al.,Immunology.2005May；115(1):1–20。
表B-1-TNFR超家族的成员
Figure BDA0004108496920000901
Figure BDA0004108496920000911
免疫球蛋白超家族(IgSF)是细胞表面和可溶性蛋白的大蛋白超家族，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。IgSF在Natarajan等人(2015年4月)的ImmunoglobulinSuperfamily.In:eLS.John Wiley&Sons,Ltd:Chichester中有所讨论。
血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种附着于肺、动脉、心脏、肾和肠中细胞的细胞膜的酶。ACE2在Donoghue,et al.,2000.Circulation research,87(5),pp.e1-e9中有所讨论。
本发明的胞外蛋白提供于SEQ ID NO:847-890和935-2038中。SEQ ID NO:891-934和2039-3142提供了胞外结构域的序列，也包括信号肽(SP)的序列和前蛋白(PP)序列。
共价连接(Covalent Linkage)
本发明的共价连接可包含或由2017年1月12日公布的美国专利申请公开号US20170008950 A1中描述的任何“非肽基连接”组成，其内容通过引用并入本文。
肽接头
肽接头是连接两个结构域的一段连续的氨基酸。
在一个实施方案中，肽接头的长度为至少5个氨基酸。在一个实施方案中，肽接头的长度为5-100个氨基酸。
在一个实施方案中，肽接头的长度为10-50个氨基酸。
在一个实施方案中，肽接头的长度为23个氨基酸。在一个实施方案中，连接结构域1和二聚化多肽的肽接头以及连接结构域2和二聚化多肽的肽接头各自具有23个氨基酸的长度。在一个实施方案中，这种肽接头各自具有23个氨基酸的长度，并衍生自TNF受体的柄区(stalk region)，优选其中TNF受体是TNF受体1B，更优选其中肽接头由SEQ ID NO:4468中所示的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，肽接头是在免疫球蛋白铰链区或其部分中发现的一段连续的氨基酸。
在一个实施方案中，肽接头是在序列中发现的一段5至57个连续的氨基酸：TSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD(SEQ ID NO:3227)
在一个实施方案中，肽接头是甘氨酸-丝氨酸或甘氨酸-丙氨酸接头。
在一个实施方案中，肽接头是
a.(GxS)n或(GxS)nGm或(GxA)n或(GxA)nGm
b.其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，A＝丙氨酸，以及
c.x＝3，n＝2、3、4、5或6，m＝0、1、2或3；或者
d.x＝4，n＝1、2、3、4或5，m＝0、1、2或3。
本发明的示例性接头在SEQ ID NO:3143-4656中提供。
结构域内的内同二聚化(intra-homodimerization)和内异二聚化(intra-heterodimerization)
促进异二聚化的Fc结构域修饰
本发明提供了四面体抗体，其中第一结构域和第二结构域中的每一个均包含两条多肽链，使得存在两个N-末端和两个C-末端，额外的结构域可直接通过肽键或通过肽接头连接于其上。类似地，本发明提供了八面体抗体，其中第一结构域、第二结构域和第三结构域中的每一个均包含两条多肽链，从而有两个N-末端和两个C-末端，额外的结构域可以直接通过肽键或通过肽接头连接于其上。本发明的其他结构域(例如四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域，以及八面体抗体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域)也可以包含两条多肽链。
在特定的实施方案中，此类结构域为包含促进两种不同Fc结构域亚基缔合，即内异二聚化，的修饰的Fc结构域。修饰可以存在于第一Fc结构域亚基和/或第二Fc结构域亚基中。在美国专利申请公开号US 20130058937 A1和以下段落中描述了所述修改的实施方案。
人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白-蛋白相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“杵臼(knob-into-hole)”修饰，包括Fc结构域的两个亚基之一中的“杵(knob)”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼(hole)”修饰。
杵臼技术在例如美国专利第5,731,168号；美国专利第7,695,936号；Ridgway etal.,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中有所描述。通常，该方法包括在第一种多肽的界面上引入一个突起部分(protuberance)(“杵(knob)”)并且在第二种多肽的界面上引入一个相应的空腔(“臼(hole)”)，使得突起部分可以在空腔中定位，从而促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起部分通过用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建。与突起大小相同或相似的补偿性空穴通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链而在第二种多肽的界面上产生。
因此，在一个特定的实施方案中，在Fc结构域的第一Fc结构域亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起部分，该突起部分可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在第二Fc结构域亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起部分可定位于该空腔内。
突起部分和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成。
在一个具体实施方案中，在Fc结构域第一亚基的CH3结构域中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基取代(T366W)，在Fc结构域第二亚基的CH3结构域中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基取代(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc结构域的第二亚单位中，另外将366位的苏氨酸残基取代为丝氨酸残基(T366S)，368位的亮氨酸残基取代为丙氨酸残基(L368A)。在另一个实施方案中，在Fc结构域的第一亚基中，另外将354位的丝氨酸残基取代为半胱氨酸残基(S354C)，在Fc结构域的第二亚基中，另外将349位的酪氨酸残基取代为半胱氨酸残基(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致Fc结构域的两个亚基之间形成二硫键(disulfide bridge)，进一步稳定了二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在可选的实施方案中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基，从而使同二聚体的形成变得静电不利(electrostatically unfavorable)，而异二聚体的形成(heterodimerization)则静电有利(electrostatically favorable)。
说明性的实例包括但不限于，例如，美国专利申请20030078385Arathoon etal.—Genentech；描述杵臼)；WO2007147901(
Figure BDA0004108496920000941
et al.—Novo Nordisk：描述离子相互作用)；WO 2009089004(Kannan et al.—Amgen：描述静电转向效应)；美国临时专利申请61/243,105(Christensen et al.—Genentech；描述卷曲螺旋(coiled coil))。
在特定的实施方案中，本发明的四面体抗体的结构域1和2，或本发明的八面体抗体的结构域1、2和3是两个或三个不同的异二聚体Fc结构域，其包含促进其各自Fc结构域亚基的内异二聚化的不同修饰组。可用于促进不同Fc异源二聚体优先组装(preferentialassembly)的抗体重链恒定区中不同突变组的说明性实例包括但不限于，例如，美国专利编号(Ser.No)11/533,709、13/494,870、12/875,015、13/289,934、14/773418、12/811,207、13/866,756、14/647,480和14/830,336。例如，可在基于人IgG1的CH3结构域中进行突变，并在第一多肽和第二多肽内掺入不同的氨基酸取代对，从而使这两条链选择性地彼此异二聚化。如下所示的氨基酸取代位置均按照Kabat的EU指数进行编号。
例如，与人IgG1恒定区相比，可以将一个或多个突变掺入恒定区，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性替代包括，例如，Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
可选地，氨基酸取代可以选自下表所示的下列取代组：
表C-1–取代组
Figure BDA0004108496920000951
Figure BDA0004108496920000961
表C-2–取代组
第一多肽 第二多肽
组1 K409W D399V/F405T
组2 Y349S E357W
组3 K360E Q347R
组4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
组5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
组6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
表C-3–取代组
第一多肽 第二多肽
组1 T366K/L351K L351D/L368E
组2 T366K/L351K L351D/Y349E
组3 T366K/L351K L351D/Y349D
组4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
组5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
组6 E356K/D399K K392D/K409D
表C-4–取代组
Figure BDA0004108496920000962
可选地，至少一个氨基酸取代可以选自表C-5中的以下取代组，其中第一多肽栏中所示的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸取代，并且第二多肽栏中所示的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸取代。
表C-5–取代组
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
可选地，至少一个氨基酸取代可以选自表C-6中的下组，其中第一多肽栏中所示的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸取代，并且第二多肽栏中所示的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸取代。
表C-6–取代组
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
可选地，氨基酸取代可以选自表C-7中的以下组。
表C-7–取代组
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A和Y407V T350V、T366L、K392L和T394W
可选地，或另外地，异多聚体蛋白的结构稳定性可通过在第一多肽链或第二多肽链上引入S354C并在相对的多肽链上引入Y349C，在两个多肽的界面内形成人工二硫键来增加。
结构域1和结构域2之间的外同二聚化(extra-homodimerization)和外异二聚化(extra-heterodimerization)
在一个实施方案中，结构域1和结构域2之间的同二聚化(即外同二聚化)通过使用同源二聚化的第一二聚化多肽和第二二聚化多肽来实现。同二聚化结构域的一个实例是ACE2 collectrin样结构域(collectrin-like domain，CLD)。
在一个实施方案中，结构域1和结构域2之间的异二聚化(即外异二聚化)通过使用第一二聚化多肽和第二二聚化多肽来实现，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽相比于同二聚体更有利于异二聚体的形成。任何具有强烈倾向于形成异二聚体而非同二聚体的非免疫球蛋白二聚多肽都在本发明的范围内。
二聚化多肽
亮氨酸拉链结构域(Leucine Zipper domain)
亮氨酸拉链是本领域众所周知的(例如，参见Hakoshima；Encyclopedia of LifeSciences；2005)。亮氨酸拉链是一种超二级结构，可以作为二聚化结构域发挥作用。它的存在会在平行的α螺旋中产生粘附力。一个亮氨酸拉链由大约7个残基间隔的多个亮氨酸残基组成，形成一个两亲性α螺旋，一个疏水区沿一侧延伸。该疏水区域提供了二聚化的区域，允许基序“拉链(zip)”在一起。亮氨酸拉链的长度通常为20至40个氨基酸，例如大约30个氨基酸。也参见Pack,P.&Plueckthun,A.,Biochemistry 31,1579-1584(1992)。
亮氨酸拉链结构域可以使得异二聚体螺旋的形成比同二聚体螺旋的形成更有利。亮氨酸拉链可以是合成的或天然的。合成的亮氨酸可以被设计成具有更高的结合亲和力。可选地，可以使用天然存在的亮氨酸拉链或具有类似结合亲和力的亮氨酸拉链。来自c-jun和c-fos蛋白的亮氨酸拉链是亮氨酸拉链的一个实例。其他亮氨酸拉链包括来自myc和max蛋白的那些(Amati,B.,S.Dalton,et al.(1992).Nature 359(6394):423-6.)。可以设计具有合适性能的其他亮氨酸拉链，例如在O'Shea,E.K.,Lumb,K.J.and Kim,P.S.(1993)Curr.Biol.3:658-667中所述。也参见O'Shea,E.K.,Rutkowski,R.,et al.(1989)Science245:646-648和O'Shea,E.K.,R.Rutkowski,et al.(1992)。Cell 68(4):699-708描述了来自c-jun(α链)和c-fos(β链)亮氨酸拉链。
如在美国专利申请公开号US 20020119149 A1(Jakobsen)中所述，亮氨酸拉链可由本领域技术人员进行设计和工程化，以形成同二聚体、异二聚体或三聚体复合物。参见Lumb,K.J.and P.S.Kim(1995).Biochemistry 34(27):8642-8；Nautiyal,S.,D.N.Woolfson,et al.(1995).Biochemistry 34(37):11645-51；Boice,J.A.,G.R.Dieckmann,et al.(1996).Biochemistry 35(46):14480-5；和Chao,H.,M.E.Houston,Jr.,et al.(1996).Biochemistry 35(37):12175-85。Collectrin样结构域
全长ACE2由N-末端肽酶结构域(PD)和C-末端collectrin样结构域(CLD)组成，以单个跨膜螺旋和大约40个残基的胞内片段结束。CLD(ACE2的616至768位残基)由一个小的胞外结构域、一个长接头和单个跨膜(TM)螺旋组成。CLD包含ACE2的“颈结构域”(残基616至726)，它是ACE2二聚化的主要介体。(Yan et al.,Science 367,1444–1448(2020))
Collectrin结构域
Collectrin是ACE2的同源物，是在肾集合小管中特异性表达的跨膜糖蛋白。基于其与ACE2 CLD的同源性，预计Collectrin结构域可能能够形成同源二聚体(Zhang et al.JBiol.Chem.Vol.276,No.20,Issue of May18,pp.17132–17139,2001)
三聚化结构域
TNF配体超家族成员
TNF配体超家族的成员可用作本发明的三聚化结构域。它们在Locksley et al.,Cell.2001Feb 23；104(4):487-501和下面转载的表中有所描述。
表B-2-TNF超家族成员
Figure BDA0004108496920000991
Figure BDA0004108496920001001
本发明的三聚化多肽的合适实例是TNFSF1(UniProtKB TNFB_HUMAN，GenBank登录号P01374)、TNFSF2(UniProtKB TNFA_HUMAN，GenBank登录号P01375)、TNFSF3(UniProtKBTNFC_HUMAN，GenBank登录号Q06643)、TNFSF4(UniProtKB TNFL4_HUMAN，GenBank登录号P23510)、TNFSF5(UniProtKB TNFSF10(UniProtKB TNF10_HUMAN，GenBank登录号P50591)、TNFSF11(UniProtKB TNF11_HUMAN，GenBank登录号O14788)、TNFSF12(UniProtKB TNF12_HUMAN，GenBank登录号O43508)、TNFSF13(UniProtKB TNF13_HUMAN，GenBank登录号O75888)、TNFSF13B(UniProtKB TN13B_HUMAN，GenBank登录号Q9Y275)、TNFSF13 GenBank登录号O43557)、TNFSF15(UniProtKB TNF15_HUMAN，GenBank登录号O95150)和TNFSF18(UniProtKB TNF18_HUMAN；GenBank登录号Q9UNG2)。
优选的三聚化多肽示于SEQ ID NO:787-790(TNFSF1)、SEQ ID NO:791-792(TNFSF2)、SEQ ID NO:793-795(TNFSF3)、SEQ ID NO:796-798(TNFSF4)、SEQ ID NO:799-802(TNFSF5)、SEQ ID NO:803-806、SEQ ID NO:807-809(TNFSF7)、SEQ ID NO:810-813(TNFSF8)、SEQ ID NO:814-816(TNFSF9)、SEQ ID NO:817-820(TNFSF10)、SEQ ID NO:821-822(TNFSF11)、SEQ ID NO:823-827(TNFSF12)、SEQ ID NO:828-831(TNFSF13)、SEQ ID NO:832-833(TNFSF13B)、SEQ ID NO:834-837(TNFSF14)、SEQ ID NO:838-841(TNFSF15)和SEQID NO:842-843(TNFSF18)。
试剂盒
本发明的另一方面提供了包含本文公开的化合物和包含这些化合物的药物组合物的试剂盒。除了化合物或药物组合物之外，试剂盒可以包括诊断剂或治疗剂。试剂盒还可以包括用于诊断或治疗方法的使用说明书。在诊断实施方案中，试剂盒包括化合物或其药物组合物和诊断剂。在治疗实施方案中，试剂盒包括抗体或其药物组合物和一种或多种治疗剂，如附加的抗肿瘤药(antineoplastic agent)、抗肿瘤剂(anti-tumor agent)或化疗剂。
一般技术
以下描述主要涉及通过培养用含有编码核酸的载体转化或转染的细胞来生产一段连续的氨基酸或所关注的多肽。当然，可以考虑使用本领域公知的替代方法。例如，氨基酸序列或其部分可通过使用固相技术的直接肽合成来产生(参见，例如，Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963))。体外蛋白合成可以使用手工技术或自动化进行。自动化合成可以通过，例如，使用应用生物系统肽合成仪(AppliedBiosystems Peptide Synthesizer)(福斯特城(Foster City),加利福尼亚州(Calif.))，按照制造商的说明书来完成。所关注的一段连续的氨基酸或多肽的不同部分可以分别进行化学合成，并使用化学或酶促方法进行组合以产生所关注的一段连续的氨基酸或多肽的全长片段。
宿主细胞的选择和转化
用本文所述的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞用于生产，并在常规营养培养基中培养，所述培养基经适当改变以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。培养条件，如培养基、温度、pH等，可以由熟练的技术人员选择，无需过多的实验。一般来说，用于最大化细胞培养生产率的原理、方案和实用技术可以参见Mammalian CellBiotechnology:a Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)和Sambrook etal.，同上。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员已知的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导和电穿孔。根据所用的宿主细胞，使用适合这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理(如Sambrook et al.，见上文所述)或电穿孔通常用于原核生物。如Shawet al.,Gene,23:315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859所述，用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行感染用于某些植物细胞的转化。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham and van der Eb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。美国专利4,399,216号描述了哺乳动物细胞宿主系统转染的一般方面。转化入酵母通常根据Van Solingen et al.,J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法进行。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方法，例如通过细胞核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合，或聚阳离子，例如聚凝胺(polybrene)、多鸟氨酸(polyornithine)。关于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537(1990)和Mansour etal.,Nature,336:348-352(1988)。
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核生物细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌(eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科，如大肠杆菌(E.coli.)。各种大肠杆菌菌株可公开获得，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC 53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌(Shigella)，以及杆菌属(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是说明性的，而不是限制性的。菌株W3110是一种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组DNA产物发酵的常见宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以被修饰以在编码宿主内源蛋白的基因中实现基因突变，这种宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整的基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonAptr3 phoAE15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvGkanr，大肠杆菌W3110菌株40B4，其为具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6；和1990年8月7日公布的美国专利号4,946,783中公开的具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。可选地，体外克隆方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反应是合适的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse,Nature,290:140(1981)；1985年5月2日公布的EP 139,383)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主(美国专利第4,943,529；Fleer et al.,Bio/Technology,9:968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574；Louvencourt et al.,J.Bacteriol.,737(1983))、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al.,Bio/Technology,8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070；Sreekrishna et al.,J.Basic Microbiol.,28:265-278(1988))；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(Case et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538，1990年10月31日公布)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，1991年1月10日公布)，和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284-289(1983)；Tilburn et al.,Gene,26:205-221(1983)；Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes,EMBO J.,4:475479(1985))。甲基营养型酵母适用于本文，并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，这些酵母选自汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。在C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)中可以找到这类酵母的典型的具体种类的列表。
用于表达所关注的一段连续的氨基酸或多肽的糖基化片段的合适宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或在悬浮培养物中生长的293细胞亚克隆，Graham et al.,J.Gen Virol.,36:59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠睾丸细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))，人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)。选择合适的宿主细胞被认为是在本领域的技术范围内。
可复制载体的选择和使用
可将编码所关注的一段连续的氨基酸或多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入用于克隆(DNA扩增)或用于表达的可复制载体中。各种载体是公开可用的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将合适的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性内切酶位点。载体成分通常包括但不限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有一种或多种这些元件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
所关注的一段连续的氨基酸或多肽不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特定切割位点的其它多肽。一般来说，信号序列可以是载体的组成部分，或者可以是插入载体的编码DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导序列，后者在美国专利5,010,182中有所描述)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公布的EP 362,179)，或1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可用于指导蛋白的分泌，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
表达载体和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。对于各种细菌、酵母和病毒来说，这种序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2mu质粒起点适用于酵母，各种病毒起点(SV40病毒、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。
表达和克隆载体通常包含选择基因，也称为选择性标志(selectable marker)。典型的选择基因编码具有以下特征的蛋白：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养物质，例如编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶。
哺乳动物细胞的合适的选择性标志的实例是那些使得能够识别有能力吸收编码核酸的细胞的标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其如Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)中描述的那样进行制备和繁殖。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.,Nature,282:39(1979)；Kingsman et al.,Gene,7:141(1979)；Tschemper et al.,Gene,10:157(1980))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供了选择性标志，例如，ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。
表达和克隆载体通常包含与编码核酸序列可操作连接的启动子，以指导mRNA合成。被多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.,Nature,275:615(1978)；Goeddel et al.,Nature,281:544(1979))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic AcidsRes.,8:4057(1980)；EP 36,776)和杂合启动子如tac启动子(deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子也将包含与编码DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于酵母宿主的合适启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:2073(1980))或其他糖酵解酶的启动子(Hess etal.,J.Adv.Enzyme Re.g.,7:149(1968)；Holland,Biochemistry,17:4900(1978))，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-丙酮酸磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
其他酵母启动子是具有由生长条件控制的转录的额外优势的诱导型启动子，是以下酶的启动子区域：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。用于酵母表达的合适载体和启动子在EP 73,657中有进一步描述。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录受到如下启动子的控制：例如获自以下病毒的基因组中的启动子：例如多瘤病毒、鸡痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)、劳斯肉瘤病毒(avian sarcoma virus)、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SimianVirus 40，SV40)，获自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及获自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容即可。
通过在载体中插入增强子序列，可增加高等真核生物对编码所关注的一段连续的氨基酸或多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，作用于启动子以增加其转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶(elastase)、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地，人们将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在编码序列的5’或3’位置处剪接到载体中，但优选位于启动子的5’位置处。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体也将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区获得，偶尔从它们的3’非翻译区获得。这些区域包含在编码所关注的一段连续的氨基酸或多肽的mRNA的非翻译部分转录为多聚腺苷酸片段的核苷酸片段。
还有其他适合于在重组脊椎动物细胞培养中合成一段连续的氨基酸或多肽的方法、载体和宿主细胞，在Gething et al.,Nature 293:620-625(1981)；Mantei et al.,Nature,281:4046(1979)；EP 117,060和EP 117,058中有所描述。
检测基因扩增/表达
可在样品中直接测量基因扩增和/或表达，例如，通过常规的DNA印迹、RNA印迹来定量mRNA的转录(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980))、斑点印迹(DNA分析)或在原位杂交中，使用适当标记的探针，基于本文提供的序列。另外，可以使用能够识别特定双链体(duplex)的抗体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白双链体。反过来，抗体可以被标记，并且可以在双链体与表面结合的情况下进行测定，从而在表面上形成双链体后，可以检测到与双链体结合的抗体的存在。
另外，可以通过免疫学方法测量基因表达，例如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的分析，以直接定量基因产物的表达。用于免疫组织化学染色和/或样品液检测的抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。方便地，可以针对连续的氨基酸或感兴趣多肽的天然序列段，或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽，或针对与编码所关注的一段连续的氨基酸或多肽并编码特异性抗体表位的DNA融合的外源序列，制备抗体。
多肽的纯化
所关注的一段连续的氨基酸或多肽的形式可从培养基或宿主细胞裂解物中回收。如果是膜结合的，可以使用合适的洗涤剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促裂解将其从膜上释放出来。用于表达所关注的一段连续的氨基酸或多肽的细胞可以通过各种物理或化学手段来破碎，例如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。
可能需要从重组细胞蛋白或多肽中纯化所关注的一段连续的氨基酸或多肽。以下步骤是合适的纯化步骤的示例：通过在离子交换柱上分级(fractionation)；乙醇沉淀；反相高效液相色谱；二氧化硅或阳离子交换树脂如在DEAE上的色谱；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A琼脂糖凝胶柱去除污染物如IgG；和金属螯合柱来结合表位标记的形式。可以使用各种蛋白纯化方法，这些方法是本领域已知的，例如在Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990)；Scopes,ProteinPurification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)中有描述。所选择的纯化步骤将取决于，例如，所使用的生产过程的性质和所生产的关注的特定的一段连续的氨基酸或多肽。
基于内含肽的C-末端合成
例如，如2005年2月1日授权的美国专利第6,849,428号中所述，内含肽是自拼接RNA内含子的蛋白等价物(参见Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127(1994))，其催化自身从前体蛋白中切除，同时融合称为外显肽的侧翼蛋白序列(在Perleret al.,Curr.Opin.Chem.Biol.1:292-299(1997)；Perler,F.B.Cell 92(1):1-4(1998)；Xuet al.,EMBO J.15(19):5146-5153(1996)中综述)。
对内含肽拼接机制的研究导致了一种蛋白纯化系统的开发，该系统利用了在SceVMA内含肽N-末端处的肽键的硫醇诱导的裂解(Chong et al.,Gene 192(2):271-281(1997))。使用这种内含肽介导的系统的纯化产生了细菌表达的具有C-末端硫酯的蛋白(Chong et al.,(1997))。在一个应用中，描述了分离细胞毒性蛋白，然后使用“天然化学连接”中描述的化学方法，将具有C-末端硫酯的细菌表达的蛋白与化学合成的具有N-末端半胱氨酸的肽融合(Evans et al.,Protein Sci.7:2256-2264(1998)；Muir et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6705-6710(1998))。
该技术被称为“内含肽介导的蛋白连接”(intein-mediated protein ligation，IPL)，代表了蛋白半合成技术的重要进步。然而，因为化学合成的大于约100个残基的肽难以获得，IPL的一般应用受到化学合成的肽作为连接配偶体的要求的限制。
例如，如美国专利号6,849,428中所述，当生成具有预定N末端(例如半胱氨酸)的表达蛋白时，IPL技术得到了极大的扩展。这使来自宿主细胞(如细菌、酵母或哺乳动物细胞)的一种或多种表达的蛋白融合。在一个非限制性实例中，使用在C-末端或N-末端裂解的修饰RIR1热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)内含肽，这允许在单柱纯化过程中释放细菌表达的蛋白，因此完全消除了对蛋白酶的需要。
内含肽技术是获得组分的一种途径的一个实例。在一个实施方案中，
本发明化合物的亚基通过转染能够表达和分泌成熟嵌合多肽的合适细胞来获得，其中这种多肽包含例如与可分离的c-末端内含肽结构域邻接的黏附素结构域(参见2005年2月1日授权的Evans等人的美国专利号6,849,428，在此通过引用并入)。使用已知的重组DNA技术转染细胞，例如哺乳动物细胞或细菌细胞。然后可以分离分泌的嵌合多肽，例如在内含肽-壳多糖结合结构域的情况下使用壳多糖衍生的树脂(chitinderivatized resin)(参见2005年5月24日授权的Xu等人的美国专利第6,897,285号，在此通过引用并入)，然后在允许硫醇介导的裂解和释放新的C-末端硫酯封端的亚基的条件下处理。硫酯封端的粘附亚基很容易转化为C-末端半胱氨酸封端的亚基。
例如，在内含肽自动裂解反应后，产生硫酯中间体，其允许通过天然化学连接将半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型半胱氨酸或同型硒代半胱氨酸或半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型半胱氨酸、同型硒代半胱氨酸的衍生物容易地加成到C-末端。在2008年10月16日公布的Capon的美国专利申请第2008/0254512号中描述了通过天然化学连接将半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型半胱氨酸或同型硒代半胱氨酸或半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型半胱氨酸、同型硒代半胱氨酸的衍生物加成到C-末端的方法，这些方法在本发明的方面是有用的，其全部内容通过引用并入本文。
在各种细胞中表达所关注的一段连续的氨基酸或多肽成分的实例
在大肠杆菌中
最初使用选定的PCR引物扩增编码所关注的所需氨基酸序列或多肽的DNA序列。引物应该含有与所选表达载体上的限制性酶位点相对应的限制性酶位点。可以使用多种表达载体。合适载体的实例是pBR322(来源于大肠杆菌；参见Bolivar et al.,Gene,2:95(1977))，其中含有氨苄青霉素和四环素抗性基因。载体用限制性内切酶进行酶切并去磷酸化。然后将PCR扩增得到的序列连接到载体中。载体将优选包括编码抗生素抗性的基因、trp启动子、多组氨酸(polyhis)前导序列(包括前六个STII密码子、多组氨酸序列和肠激酶切割位点)、所关注的特定氨基酸序列/多肽编码区、λ转录终止子和argU基因的序列。
然后使用Sambrook等人，见上文，所述的方法，将连接混合物用于转化选定的大肠杆菌菌株。通过它们在LB平板上生长的能力来鉴定转化体，然后选择抗生素抗性菌落。质粒DNA可以通过限制性分析和DNA测序来分离和确认。
选定的克隆可以在液体培养基中生长过夜，例如补充有抗生素的LB肉汤。过夜培养物可随后用于接种更大规模的培养物。然后使细胞生长到所需的光密度，在此期间表达启动子被开启。
在将细胞再培养数小时后，可通过离心收获细胞。可以使用本领域已知的各种试剂溶解通过离心获得的细胞沉淀，然后可以使用金属螯合柱在允许蛋白紧密结合的条件下纯化溶解的所关注的氨基酸序列或多肽。
引物可以包含对应于所选表达载体上的限制性酶位点的限制性酶位点，以及提供有效和可靠的翻译起始、在金属螯合柱上快速纯化和用肠激酶进行蛋白水解去除的其他有用序列。PCR扩增的多组氨酸标签序列可以连接到用于转化大肠杆菌宿主的表达载体中，所述大肠杆菌基于例如菌株52(W3110 fuhA(tonA)Ion galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)。转化体可以首先在含有50mg/ml羧苄青霉素的LB中生长，于30℃下振荡，直到O.D.600达到3-5。然后将培养物稀释50-100倍至C RAP培养基(通过在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4、0.71g柠檬酸钠-2H2O、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物、5.36g Sheffield hycase SF以及110mM MPOS，pH 7.3，0.55％(重量/体积)葡萄糖和7mM MgSO4制备)中，并使培养物在30℃下振荡生长约20-30小时。取出样品以通过SDS-PAGE分析验证表达，并将大量培养物离心以使细胞沉淀。细胞沉淀被冷冻直到纯化和重折叠(refolding)。
将来自0.5至1L发酵液的大肠杆菌浆(6-10g沉淀)重悬浮于10体积(重量/体积)的7M胍、20mM Tris、pH 8缓冲液中。加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠(sodiumtetrathionate)，使最终浓度分别为0.1M和0.02M，并在4℃下将溶液搅拌过夜。这一步产生了一种变性蛋白，其所有的半胱氨酸残基都被亚硫酸化作用封闭。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mMTris，pH 7.4)稀释，并通过0.22微米过滤器过滤以使澄清。视情况将澄清的提取物装载到5milQiagen Ni-NTA金属螯合柱上，在金属螯合柱缓冲液中平衡。用含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol级)，pH7.4的额外缓冲液洗涤该柱。用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。将含有所需蛋白的级分(fraction)合并并储存在4℃下。使用基于其氨基酸序列计算的消光系数，通过其在280nm处的吸光度来估计蛋白浓度。
在哺乳动物细胞中
该一般实例说明了通过在哺乳动物细胞中重组表达制备糖基化形式的所关注的所需氨基酸序列或多肽组分。
载体pRK5(参见1989年3月15日公布的EP 307,247)可用作表达载体。任选地，用选定的限制性内切酶将编码DNA连接到pRK5中，以允许使用如Sambrook等，见上文，所述的连接方法插入DNA。
在一个实施方案中，所选宿主细胞可以是293细胞。使人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养板中在补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的培养基如DMEM中生长至汇合。将约10μg连接得到的载体DNA与约1μg编码VARNA基因的DNA混合[Thimmappaya etal.,Cell31:543(1982)]并溶解在500μl的1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中。向该混合物中滴加500μl 50mM HEPES(pH 7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4，并在25℃下使沉淀物形成10分钟。将沉淀物悬浮并加入到293细胞中，并在37℃下使静置约4小时。吸出培养基，并加入2ml含20％甘油的PBS，持续30秒。然后用无血清培养基洗涤293细胞，加入新鲜培养基并将细胞孵育约5天。
转染后约24小时，除去培养基，并用培养基(单独)或含有200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml 35S-甲硫氨酸的培养基替换。孵育12小时后，收集条件培养基，在旋转过滤器上浓缩，并装载到15％ SDS凝胶上。可以将处理过的凝胶干燥并暴露于膜一段选定的时间，以显示所关注的氨基酸序列或多肽成分的存在。含有转染细胞的培养物可以进行进一步孵育(在无血清培养基中)，并在选择的生物测定中测试该培养物。
在替代技术中，可使用在Somparyrac et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)中所述的硫酸葡聚糖方法，将所关注的核酸氨基酸序列或多肽组分瞬时引入293细胞。使293细胞在旋转瓶中生长至最大密度，并加入700μg连接后的载体。首先通过离心从旋转瓶中浓缩细胞，并用PBS洗涤。将DNA-葡聚糖沉淀物在细胞沉淀上孵育4小时。用20％甘油处理细胞90秒，用组织培养基洗涤，并重新引入到含有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛转铁蛋白的旋转瓶中。大约四天后，将条件培养基离心并过滤以去除细胞和碎片。然后可以通过任何选定的方法，例如透析和/或柱层析，浓缩和纯化含有表达的所关注的氨基酸序列或多肽组分的样品。
在另一个实施方案中，所关注的氨基酸序列或多肽组分可以在CHO细胞中表达。可以使用已知的试剂如CaPO4或DEAE-葡聚糖将所关注的氨基酸序列或多肽成分转染到CHO细胞中。如上所述，可以孵育细胞培养物，并用培养基(单独)或含有放射性标记如35S-甲硫氨酸的培养基替换培养基。在确定所关注的氨基酸序列或多肽成分的存在后，可以用无血清培养基替换培养基。优选地，将培养物孵育约6天，然后收获条件培养基。然后可以通过任何选定的方法浓缩和纯化含有表达的所关注的氨基酸序列或多肽成分的培养基。
表位标记的所关注的氨基酸序列或多肽成分也可以在宿主CHO细胞中表达。所关注的氨基酸序列或多肽成分可以从pRK5载体中亚克隆出来。亚克隆插入片段可以进行PCR以与选定的表位标签如多组氨酸标签框架内融合到杆状病毒(Baculovirus)表达载体中。然后可以将多组氨酸标记的所关注的氨基酸序列或多肽组分插入片段亚克隆到含有选择标志如DHFR的SV40驱动的载体中，用于选择稳定的克隆。最后，可以用SV40驱动的载体转染CHO细胞(如上所述)。如上所述，可以进行标记来验证表达。然后可以通过任何选定的方法，例如通过Ni2+-螯合亲和层析，浓缩和纯化含有表达的多组氨酸标签的所关注的氨基酸序列或多肽组分的培养基。
在一个实施方案中，所关注的氨基酸序列或多肽组分被表达为IgG构建体(免疫黏附素(immunoadhesin))，其中各种蛋白的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列被融合到包含铰链、CH2和CH2结构域的IgG1恒定区序列，和/或所关注的氨基酸序列或多肽组分为带有多组氨酸标签的形式。
在PCR扩增之后，使用Ausubel et al.,Current Protocols of MolecularBiology,Unit 3.16,John Wiley and Sons(1997)中所述的标准技术，在CHO表达载体中亚克隆各个DNA。CHO表达载体被构建成在目的DNA的5’和3’处具有相容的限制性位点，以使cDNA方便的穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体如Lucas et al.,Nucl.Acids Res.24:9(1774-1779(1996)中所述，并使用SV40早期启动子/增强子来驱动所关注的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允许选择转染后稳定维持的质粒。
在酵母中
以下方法描述了在酵母中重组表达所关注的所需氨基酸序列或多肽成分。
首先，构建酵母表达载体，用于由ADH2/GAPDH启动子胞内生产或分泌一段连续氨基酸。将编码所关注的所需氨基酸序列或多肽组分的DNA、选定的信号肽和启动子插入到选定的质粒中合适的限制性酶位点，以指导所关注的氨基酸序列或多肽组分的细胞内表达。为了分泌，可以将编码所述一段连续的氨基酸的DNA与编码ADH2/GAPDH启动子、酵母α因子分泌信号/前导序列和用于表达所述一段连续的氨基酸的接头序列(如需要)的DNA一起克隆到选定的质粒中。
然后可以用上述表达质粒转化酵母细胞，例如酵母菌株AB110，并在选定的发酵培养基中培养。转化的酵母上清液可以通过用10％三氯乙酸沉淀并通过SDS-PAGE分离，然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色来分析。
随后可以通过离心从发酵培养基中去除酵母细胞，然后使用选定的筒式过滤器浓缩培养基来分离和纯化所关注的重组氨基酸序列或多肽组分。含有所关注的氨基酸序列或多肽成分的浓缩物可以进一步使用选定的柱色谱树脂进行纯化。
在杆状病毒感染的昆虫细胞中
以下方法描述了一段连续的氨基酸在杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。
将所需的编码一段连续的氨基酸的核酸融合到杆状病毒表达载体所含表位标签的上游。此类表位标签包括多组氨酸标签和免疫球蛋白标签(如IgG的Fc区)。可以使用多种质粒，包括来源于市售质粒如pVL1393(Novagen公司)的质粒。简言之，通过使用与5’和3’区互补的引物进行PCR，扩增所关注的氨基酸序列或多肽组分或所关注的氨基酸序列或多肽组分的所需部分(如编码跨膜蛋白胞外结构域的序列)。5’引物可结合侧翼(选定的)限制性酶位点。然后用那些选定的限制性酶酶切产物，并亚克隆到表达载体中。
重组杆状病毒是通过使用脂质体(lipofectin)(可从GIBCO-BRL公司购得)将上述质粒和BaculoGoldTMDNA(Pharmingen公司)共转染到草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)中而产生的。在28℃下孵育4-5天后，收获释放的病毒并用于进一步扩增。病毒感染和蛋白表达按照O'Reilley et al.,Baculovirus expressionvectors:A laboratory Manual,Oxford:Oxford University Press(1994)中的描述进行。
表达的所关注的多组氨酸标记的氨基酸序列或多肽组分然后可以进行纯化，例如通过如下的Ni2+螯合亲和层析。如Rupert et al.,Nature,362:175-179(1993)中所述，从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简言之，清洗Sf9细胞，将其重新悬浮在超声处理缓冲液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％ NP40；0.4M KCl)中，并在冰上进行两次20秒的超声处理。通过离心清除超声物，上清液在上样缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH 7.8)中稀释50倍，并通过0.45μm过滤器过滤。制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen公司购得)，柱床体积为5mL，用25mL水洗涤，并用25mL上样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以每分钟0.5mL的速度装载入柱中。使用上样缓冲液将色谱柱洗涤至基线A280，此时开始收集组分。然后，用二级洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl，10％甘油，pH 6.0)，该二级洗涤缓冲液可洗脱非特异性结合的蛋白。再次达到A280基线后，在二级洗涤缓冲液中以0至500mM咪唑梯度展开色谱柱。收集1mL组分，并通过SDS-PAGE和银染或与碱性磷酸酶(Qiagen公司)缀合的Ni2+-NTA进行蛋白质印迹分析。合并含有洗脱的His10标记序列的组分，并针对上样缓冲液透析。
或者，IgG标记(或Fc标记)的氨基酸序列的纯化可以使用已知的色谱技术，包括例如蛋白A或蛋白G柱色谱法进行。
含Fc的蛋白构建体可按如下方法从条件培养基中纯化。将条件培养基泵入5ml的蛋白A柱(Pharmacia公司)，该柱在pH 6.8的20mM磷酸钠缓冲液中平衡。装载后，在用100mM柠檬酸(pH 3.5)洗脱之前，用平衡缓冲液广泛地清洗该柱。通过将1ml组分收集到含有275mL 1M Tris缓冲液(pH 9)的试管中，立即中和洗脱的蛋白。随后将高度纯化的蛋白脱盐至如上针对多组氨酸标记的蛋白所描述的储存缓冲液中。蛋白的同质性通过SDS聚丙烯酰胺凝胶(PEG)电泳和Edman降解法N-末端氨基酸测序来验证。
药物组合物的实例
此类组合物和剂量的非限制性实例如下所述：
依那西普(Etanercept)和相关组合物
包含四面体或八面体抗体的组合物，其中四面体或八面体抗体的一个或多个结构域包含连续氨基酸，所述连续氨基酸具有依那西普(例如Enbrel)的序列或其一个或多个结构域的序列，可以包含甘露醇、蔗糖和氨丁三醇(tromethamine)。在一个实施方案中，组合物是冻干物的形式。在一个实施方案中，组合物用例如USP(美国药典)注射用无菌抑菌水(Sterile Bacteriostatic Water for Injection,BWFI)(含0.9％苯甲醇)进行重构。在一个实施方案中，向个体施用所述化合物用于减轻中度至重度活动性类风湿性关节炎个体的体征和症状、诱导主要临床反应、抑制结构损伤的进展和改善身体功能。该化合物可与甲氨蝶呤(MTX)联合用药或单独用药。在一个实施方案中，向个体施用所述化合物，以减少对一种或多种DMARD应答不充分的个体中的中度至重度活动性多关节病程(polyarticular-course)幼年类风湿性关节炎的体征和症状。在一个实施方案中，将所述化合物施用于个体以减轻体征和症状，抑制活动性关节炎的结构损伤的进展，并改善银屑病关节炎个体的身体功能。在一个实施方案中，向个体施用所述化合物以减轻患有活动性强直性脊柱炎的个体的体征和症状。在一个实施方案中，向个体施用所述化合物以治疗慢性中度至重度斑块型银屑病。在一个个体患有类风湿性关节炎、银屑病关节炎或强直性脊柱炎的实施方案中，以每周25-75mg的剂量施用所述化合物，以一次或多次皮下(SC)注射施用。在另一个实施方案中，化合物以每周50mg的剂量在单次SC注射中施用。在一个个体患有斑块型银屑病的实施方案中，以25-75mg每周两次或间隔4天施用所述化合物3个月，随后减少至25-75mg每周的维持剂量。在另一个实施方案中，化合物以50mg的剂量每周两次或间隔4天施用3个月，随后减少至每周50mg的维持剂量。在一个实施方案中，剂量比本文所述剂量小2倍至100倍。在个体具有活动性多关节病程JRA的实施方案中，化合物可以以每周0.2-1.2mg/kg(最高每周75mg)的剂量施用。在另一个实施方案中，化合物以每周0.8mg/kg(最高每周50mg)的剂量施用。在一些实施方案中，剂量比上文所述的剂量小2倍至100倍。
英夫利昔单抗、阿达木单抗和相关组合物
包含四面体或八面体抗体的组合物，其中四面体或八面体抗体的一个或多个结构域包含连续的氨基酸，所述连续的氨基酸具有英夫利昔单抗的序列(例如Remicade)或其一个或多个结构域的序列，可以包含蔗糖、聚山梨酯80、一水合磷酸二氢钠和二水合磷酸氢二钠。在一个实施方案中，不存在防腐剂。在一个实施方案中，组合物是冻干物的形式。在一个实施方案中，该组合物用例如USP注射用水(BWFI)进行重构。在一个实施方案中，组合物的pH值为7.2或约为7.2。在一个实施方案中，以2-4mg/kg的剂量向患有类风湿性关节炎的个体施用该化合物，所述剂量作为静脉内输注给药，在第一次输注后2周和6周再追加额外的类似剂量，此后每8周施用一次。在另一个实施方案中，化合物以3mg/kg的剂量静脉输注施用，在第一次输注后2周和6周施用额外的类似剂量，此后每8周施用一次。在一个实施方案中，将剂量调整至最高10mg/kg，或每4周处理一次。在一个实施方案中，该化合物与甲氨蝶呤联合施用。在一个实施方案中，向克罗恩病或造瘘性克罗恩病个体以2-7mg/kg的剂量施用所述化合物，作为0、2和6周的诱导方案，此后每8周施用4-6mg/kg的维持方案，用于治疗中度至重度活动性克罗恩病或造瘘性疾病。在另一个实施方案中，以5mg/kg的剂量施用该化合物，作为0、2和6周的诱导方案，此后每8周施用5mg/kg的维持方案，用于治疗中度至重度活动性克罗恩病或造瘘性疾病。在一个实施方案中，将剂量调整至最高10mg/kg。在一个实施方案中，向患有强直性脊柱炎的个体以2-7mg/kg的剂量作为静脉内输注施用所述化合物，随后在第一次输注后2周和6周施用额外的类似剂量，此后每6周施用一次。在另一个实施方案中，以5mg/kg的剂量静脉输注施用该化合物，随后在第一次输注后2周和6周施用额外的类似剂量，此后每6周施用一次。在一个实施方案中，向银屑病关节炎个体以2-7mg/kg的剂量作为静脉输注施用该化合物，随后在第一次输注后2周和6周施用额外的类似剂量，此后每8周施用一次。在另一个实施方案中，化合物以5mg/kg的剂量静脉输注施用，随后在第一次输注后2周和6周施用额外的类似剂量，此后每8周施用一次。在一个实施方案中，该化合物与甲氨蝶呤一起施用。在一个实施方案中，向患有溃疡性结肠炎的个体以2-7mg/kg的剂量施用所述化合物，所述剂量作为诱导方案在0、2和6周施用，随后每8周施用2-7mg/kg的维持方案，用于治疗中度至重度活动性溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，向溃疡性结肠炎个体以5mg/kg的剂量在0、2和6周作为诱导方案施用所述化合物，此后每8周以5mg/kg的维持方案施用。在一些实施方案中，所述剂量比上文阐述的用于治疗个体疾病的剂量小2倍至100倍。
利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)和相关组合物
包含四面体或八面体抗体的组合物，其中四面体或八面体抗体的一个或多个结构域包含连续的氨基酸，所述连续的氨基酸具有利妥昔单抗、奥瑞珠单抗的序列或其一个或多个结构域的序列，可包含氯化钠、二水合柠檬酸钠(sodium citrate dihydrate)、柠檬酸钠二水合物(sodium citrate dihydrate)和无菌注射用水。在一个实施方案中，组合物以无菌、透明、无色、不含防腐剂的液体浓缩物形式提供，用于静脉内(IV)施用。在一个实施方案中，组合物以10mg/ml的浓度提供。在一个实施方案中，在9.0mg/ml氯化钠、7.35mg/ml柠檬酸钠二水合物、0.7mg/ml聚山梨醇酯80和无菌注射用水中配制用于静脉内施用的产品。在一个实施方案中，组合物的pH为6.5或约6.5。在一个实施方案中，组合物包含在20mM乙酸钠、106mM海藻糖二水合物、0.02％(重量/体积)聚山梨醇酯20中的浓度为30mg/mL的四面体或八面体抗体，pH为5.3。
博纳吐单抗(Blinatumomab)和相关组合物
包含四面体或八面体抗体的组合物，其中四面体或八面体抗体的一个或多个结构域包含连续的氨基酸，所述连续的氨基酸具有博纳吐单抗的序列或其一个或多个结构域的序列，可包含柠檬酸一水合物(E330)、海藻糖二水合物、赖氨酸盐酸盐、聚山梨醇酯80、氢氧化钠(用于pH调节)和注射用水。在一个实施方案中，pH为7或约8。对于复发或难治性B前体ALL的治疗，剂量取决于患者的体重。在4周的治疗周期中连续输注该组合物。每个治疗周期由2周的无治疗间隔(treatment-free interval)分开。在2个周期后没有癌症迹象的患者可以接受最多3个额外周期的治疗。对于微量残留病(minimal residual disease)患者的治疗，剂量取决于患者的体重。在4周的治疗周期中连续输注该组合物。患者可接受最多3个额外治疗周期的治疗，每个周期在2周的无治疗间隔后进行。
ACE2和相关组合物
包含四面体或八面体抗体的组合物，其中四面体或八面体抗体的一个或多个结构域包含连续的氨基酸，所述连续的氨基酸具有ACE2的序列或其部分，可包含已知的赋形剂(excipient)，例如以上章节中讨论的那些赋形剂。这种组合物可以用于例如新型冠状病毒病(SARS-CoV-2)的治疗。
在本文所述组合物的每个实施方案中，组合物以冻干物的形式出现时，可以用例如无菌水溶液、无菌水、注射用无菌水(Sterile Water for Injections)(USP)、注射用无菌抑菌水(Sterile Bacteriostatic Water for Injections)(USP)以及本领域技术人员已知的它们的等效物进行重构。
应当理解，在任何本发明化合物的施用中，该化合物可以单独施用，在载体(carrier)中施用，作为药物组合物的一部分施用，或在任何合适的溶媒(vehicle)中施用。
剂量
应当理解，当本文规定剂量范围时，例如每周1-10mg/kg，在此公开的本发明还涵盖了上限和下限之间的每个整数剂量及其十分位数(tenth thereof)。因此，在给出的上述实例的情况下，本发明涵盖了1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4等mg/kg，直至10mg/kg。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以作为单剂量施用或可以多剂量施用。
一般而言，根据上述方法治疗障碍或病症的日剂量一般将为待治疗个体体重的约0.01至约10.0mg/kg。
基于上述剂量范围的变化可由具有普通技能的医师根据已知的考虑因素进行，例如接受治疗的人的体重、年龄和状况、病痛的严重程度以及所选定的特定给药途径。
还预期所公开的化合物将产生协同结合(cooperative binding)，伴随着对所需有效剂量的影响。
药物
术语“药学上可接受的载体”被理解为包括赋形剂、载体或稀释剂。所用的具体载体、稀释剂或赋形剂将取决于活性成分应用的方式和目的。
对于肠胃外给药，可以使用在无菌水溶液中含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的溶液。如果需要，这种水溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于进行静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。所用的无菌水性介质均可以通过本领域技术人员已知的标准技术容易地获得。
本发明的组合物可以呈多种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、分散体或悬浮液。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。一些组合物呈可注射或可输注溶液的形式。施用方式为胃肠外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，化合物通过静脉内输注或注射施用。在另一个实施方案中，化合物通过肌内或皮下注射施用。在另一个实施方案中，化合物经鼻施用。
对于治疗用途，本文公开的组合物可以以多种方式施用，包括通过快速浓注(bolus injection)、连续输注、从植入物中持续释放、口服法(oral ingestion)、局部注射(例如，心内、肌内)、全身注射的可溶形式，或制药领域中众所周知的其它合适技术。其他药物施用方法包括但不限于口服、皮下、透皮、静脉内、肌内和肠胃外施用方法。通常，可溶性组合物将包含纯化的化合物以及生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这种载体在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。这种组合物的制备需要将化合物与缓冲剂、抗氧化剂、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂相结合。中性缓冲盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水是示例性的合适稀释剂。可以使用合适的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂将该产品配制成冻干物。
其他衍生物包含共价键合到非蛋白类聚合物上的本发明的化合物/组合物。进行与聚合物的结合通常是为了不干扰化合物的优选生物活性，例如化合物与靶的结合活性。非蛋白类聚合物通常是亲水性合成聚合物，即自然界中不存在的聚合物。然而，存在于自然界并通过重组或体外方法产生的聚合物是有用的，从自然界分离的聚合物也是有用的。亲水性聚乙烯聚合物属于本发明的范围，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚亚烷基醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯酯或甲氧基聚乙二醇；聚氧亚烷基类(polyoxyalkylenes)，例如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯，以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支链或非支链多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同型多糖和杂型多糖例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、糊精、糖原糖醇的聚合物，例如聚山梨醇和聚甘露醇；和肝素或类肝素(heparon)。
本发明的药物组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的化合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间内达到所需治疗效果的有效的量。化合物的治疗有效量可以根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。治疗有效量也是化合物的任何毒性或有害作用被治疗上的有益影响所抵消的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到所需预防效果的有效的量。通常，由于预防剂量用于患病前或患病早期的个体，因此预防有效量将低于治疗有效量。
总论
本文公开的各种要素的所有组合均在本发明的范围内。
如本文所用，所有标题仅用于组织，无意以任何方式限制本发明。任何单独章节的内容可能同样适用于所有章节。本文公开的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。
本领域普通技术人员在审查以下实施例后，将会明白本发明的其他目的、优点和新颖特征，但这些实施例并非旨在进行限制。此外，上文描述的和权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方案和方面的每一个均可在以下实施例中找到实验支持。
应当理解，为清晰起见，在单独实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。反过来，为简洁起见，在单独实施方案的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者在本发明的任何其它描述的实施方案中适当提供。在各种实施方案的背景下描述的某些特征不应视为这些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有这些要素的情况下是不可操作的。
通过参考以下实施例，将更好地理解本发明，但本领域技术人员将容易理解，详述的具体实验仅用于说明本发明，如以下权利要求中更全面描述的。
实施例
实施例1-材料与方法
重组蛋白
使用哺乳动物表达载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达重组蛋白，并通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻层析(SEC)纯化。通过在适应无血清悬浮培养的CHO-K1细胞中瞬时表达进行生产(加利福尼亚州贝尔蒙特，LakePharma公司，TunaCHO)。将悬浮CHO细胞接种在摇瓶中，并使用无血清和化学成分确定的培养基进行扩增。在转染当天，将扩增后的细胞接种到具有新鲜培养基的新容器中。在高密度条件下，通过添加与DNA复合的转染试剂进行瞬时转染。转染在0.1至2.0升的培养物中进行。转染后，细胞在摇瓶中保持分批补料培养，直到生产运行结束。7至14天后收获条件细胞培养液，通过离心澄清，并在纯化前进行无菌过滤。
通过将培养物上清液应用于填充有
Figure BDA0004108496920001231
蛋白A亲和树脂(美国，马萨诸塞州，Repligen公司)的柱来进行蛋白A亲和层析，用137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4 pH 7.4(PBS)对
Figure BDA0004108496920001241
蛋白A亲和树脂柱进行预平衡。用PBS缓冲液洗涤柱子，直到OD280值回到基线。然后用pH 3.5的0.25％乙酸缓冲液对靶蛋白进行洗脱。收集级分，用1M HEPES缓冲，并记录每个级分的OD280值。将含有目标蛋白的级分合并，将缓冲液交换到100mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc(pH 6.0)中，通过0.2μm滤膜进行过滤，并在使用前储存在4℃下。由OD280值和计算得出的消光系数计算蛋白浓度。
使用AKTA Avant 25FPLC系统(瑞典，乌普萨拉，GE Healthcare公司)进行制备性SEC。首先使用Amicon Ultra-15，3MWCO，超离心过滤装置，目录号UFC900324(马萨诸塞州伯灵顿，密理博(Millipore)公司)将蛋白浓缩至10-15mg/ml，然后上样到HiLoad 26/600Superdex 200prep grade柱(GE Healthcare公司)上。用含有10mM EDTA的不含钙盐或镁盐的杜氏PBS缓冲液(PBS)(加利福尼亚州，旧金山，UCSF细胞培养设备公司(UCSF CellCulture Facility))进行洗脱。基于分析性SEC和通过还原和非还原SDS-PAGE进行的分析，鉴定对应于所关注的蛋白的级分，并合并，通过超滤浓缩，并储存在4℃下。
异双官能交联剂
表1：异双官能交联剂
Figure BDA0004108496920001242
Figure BDA0004108496920001251
电喷雾电离质谱(ESI-MS)
使用1260型HPLC系统(加利福尼亚州，圣克拉拉，Agilent Technologies公司)和MicroTOF-QII MS系统(马萨诸塞州，比尔里卡，Bruker公司)通过ESI-MS分析完整蛋白。在50℃下使用具有2.7微米粒径、450埃孔径和2.1×100mm尺寸的BioResolve RP单抗聚苯柱(马萨诸塞州，米尔福德，Waters公司)，流速为0.3ml/分钟，注入体积为2-5uL。流动相是0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸乙腈溶液(溶剂B)的梯度，如下所示：0分钟，95％：5％；2分钟，65％：35％；10分钟，54％：46％；11分钟，5％：95％保持3分钟。数据以全扫描MS模式收集，质量范围为600-4000Da。碰撞射频设置为800Vpp。对于去糖基化分析，根据制造商的说明，使用Rapid PNGase F，P0710S(马萨诸塞州，伊普斯威奇，New England BioLabs公司)对样品进行还原和去糖基化。使用Bruker DataAnalysis版本4.0SP4软件进行质谱显示和解卷积。
分析尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)
使用Prominence HPLC系统(日本，京都，Shimadzu公司)进行分析性SE-HPLC。具有3微米粒径、300埃孔径和4.6×300mm尺寸的Zenix-C柱(特拉华州，纽瓦克，SepaxTechnologies公司)被单独使用或作为一对串联的柱使用。流动相、流速、柱温和检测波长分别为50mM磷酸钠(pH7.4)和300mM NaCl(0.2mL/分钟)、25℃和280/214nm。LabSolutionsv5.9软件(Shimadzu公司)用于紫外(UV)数据采集和处理。
多角度光散射分析(MALS)
通过使用Optilab T-rEX RI检测器和Treos MALS检测器在线(加利福尼亚州，戈莱塔，Wyatt Technology公司)将SE-HPLC与折光率(RI)和多角度光散射(SEC-MALS)的测量相结合来确定蛋白的摩尔质量。检测器的温度保持在25℃。从单体形式的牛血清白蛋白(BSA)获得的信号用于归一化检测器并校正检测器之间的谱带增宽。Astra v7.3软件(Wyatt Technology公司)用于光散射和折光率数据采集和处理。蛋白的dn/dc比值采用0.185mL/g。
通过SE-HPLC进行化学计量结合测量
通过使用SE-HPLC的化学计量结合分析来确定两种不同蛋白对共同配体结合配偶体的相对结合亲和力。在含有摩尔比为0.2至2.0的配体结合配偶体的结合反应中，评价两种蛋白的部分纯化混合物或通过组合两种纯化蛋白制得的混合物的成分的相对结合亲和力。在25℃下孵育2小时后，通过SE-HPLC分析结合反应，以确定两种蛋白中每一种的剩余未结合部分。
动力学排除分析(Kinetic Exclusion Assay)
Figure BDA0004108496920001261
使用KinExA 3200仪器(爱达荷州，博伊西，Sapidyne Instruments公司)在溶液中的未修饰分子之间进行平衡结合亲和力和动力学结合测量。对于ACE2与SARS-CoV-2蛋白结合的Kd分析，用重组SARS-CoV-2Spike蛋白(参考号46328(加利福尼亚州，贝尔蒙特，LakePharma公司))吸附包被PMMA珠；然后用作固相来捕获ACE2蛋白(恒定结合配偶体(CBP))。对于每个实验，在ACE2蛋白的背景下滴定S蛋白，并使其达到平衡。然后将结合反应短暂暴露于固相，一部分游离ACE2蛋白被捕获，然后用荧光二级分子检测。与固相短暂的接触时间小于溶液中预先形成的复合物解离所需的时间，因此溶液和固相滴定的结合配偶体之间的竞争被“动力学排除”。由于固相仅用作每个样品中游离CBP的探针，因此在这种KinExA测量过程中溶液平衡不会改变。
八面体(Octet)
对Fcγ受体的动力学分析
使用384孔板在Octet Red384(Satorius公司)上进行抗体结合Fcγ受体的动力学表征。
各种在C-末端含有多组氨酸标签的重组人Fcγ受体购自R&D systems公司。将浓度为5μg/ml的Fcγ受体固定在PBS-B(含1mg/mL BSA的PBS，pH 7.4)中的抗Penta-His生物传感器(Satorius公司)上，在26℃下采用1000rpm的轨道摇动速度(orbital shakespeed)。用PBS-B洗涤后，将捕获Fcγ受体的生物传感器浸没在不同浓度的测试抗体中15秒。然后在解离过程中将生物传感器浸没在PBS-B中60秒。在每个循环结束时，通过用甘氨酸pH 1.5进行剥离而使生物传感器再生。使用标准的1:1结合模型进行数据分析。
实施例2-具有图1(图A)、图2、图11(图A-H)、图12所示结构的四面体抗体
图1的图A、图2和图11的图A-H示出了本实施例的四面体抗体的示意性结构。
图12描述了四面体抗体Rc6-P4-Rc6的制备。
Rc6-Rc6
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:Fc
b.结构域2:Fc
c.结构域3:抗-CD20Fab
d.结构域4:抗-CD20Fab
Rc6-B19
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:Fc
b.结构域2:Fc
c.结构域3:抗-CD20Fab
d.结构域4:抗-CD 19
Rc66SIDE-Rc66SIDE
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:FcSIDE
b.结构域2:FcSIDE
c.结构域3:抗-CD20Fab
d.结构域4:抗-CD20Fab
HA9AAC9-HA9AAC9
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:FcAAC9
b.结构域2:FcAAC9
c.结构域3:抗-CD16Fab
d.结构域4:抗-CD26Fab
6Ec66-Soc66
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:Fc
b.结构域2:Fc
c.结构域3:抗-β淀粉样蛋白Fab
d.结构域4:抗-β淀粉样蛋白Fab
Ace2-Ace2
用以下结构域构建具有图1中图A所示结构的四面体抗体：
a.结构域1:Fc
b.结构域2:Fc
c.结构域3:Ace2-615
d.结构域4:Ace2-615
表2：用于制备四面体抗体的蛋白的SEQ ID
蛋白 轻链1 轻链2 重链 Fc融合链 Fc链
Rc6 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 3
Rc6HYRF SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 3
Rc60 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 6
Rc66 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8
Rc66SIDE SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 10
Rc66AAC9 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 12
HA9c66AAC9 SEQ ID NO 16 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 12
HRc66 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 8
B19c66 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 8
B19c66AAC9 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 12
Blc6AAC9 SEQ ID NO 23 SEQ ID NO 12
Drc66 SEQ ID NO 24 SEQ ID NO 25 SEQ ID NO 8
6Ec66 SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 33 SEQ ID NO 8
Soc66 SEQ ID NO 35 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 8
IL15c6AAC9 SEQ ID NO 26 SEQ ID NO 12
IL15c6AAC9N79Q SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 12
IL15Rc6AAC9 SEQ ID NO 27 SEQ ID NO 12
ObSpc60PG SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 42
Obc60PG SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 42
ObSP41BBLc60PG SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 42
Ob41BBLc60PG SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 42
ObSpc60PG41BBL-RF SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 50
Obc60PG41BBL-RF SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 50
Glc60PG SEQ ID NO 38 SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 40 SEQ ID NO 42
Cic60PG SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 42
ACE2RQ615c60PG SEQ ID NO 62 SEQ ID NO 42
ACE2RQ615c61PG SEQ ID NO 63 SEQ ID NO 64
ACE2RQ106c60PG SEQ ID NO 82 SEQ ID NO 42
ACE2RQ106x6c60PG SEQ ID NO 84 SEQ ID NO 42
CoV2spike680c60PG SEQ ID NO 86 SEQ ID NO 42
SARSspike666c60PG SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 42
RaTG13spike680c60PG SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 42
CD3Ec60PG SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 42
41BBc60PG SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 42
CD19c60PG SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 42
CEACAM5c60PG SEQ ID NO 60 SEQ ID NO 42
表3用于制备四面体抗体的蛋白的特性
Figure BDA0004108496920001301
Figure BDA0004108496920001311
表4：四面体抗体的制备
Figure BDA0004108496920001321
Figure BDA0004108496920001331
Figure BDA0004108496920001341
NA，不适用(只需要两种交联剂)
表5：四面体抗体的产率
Figure BDA0004108496920001351
产率(％)＝(产物)/(产物+未反应的)
表6：用ESI-MS测定的四面体抗体的完整质量
Figure BDA0004108496920001352
*重链和轻链经历了N-末端谷氨酰胺到焦谷氨酸的转化(减少17Da)
表7：预测的四面体抗体的结合结构域
Figure BDA0004108496920001361
Figure BDA0004108496920001371
Figure BDA0004108496920001381
表8：观察到的四面体抗体的ＩgG-FcRγ结合
Figure BDA0004108496920001382
Figure BDA0004108496920001391
表9：观察到的四面体抗体与CD20、CD10和CD16a的结合
Figure BDA0004108496920001392
Figure BDA0004108496920001401
ND，未完成
实施例3-具有图1的图B、图3和图13所示结构的四面体抗体
图1的图B和图3示出了本实施例的四面体抗体的结构示意图。
图13描述了如图1的图B所示的具有非共价连接的四面体抗体的制备。
实施例4——具有图1的图C、图4和图14-图18所示结构的四面体抗体
图1的图C和图4示出了本实施例的四面体抗体的结构示意图。
图14描述了四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG的制备。
图15示出通过SE-HPLC对四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG进行的分析。
图16示出通过SE-HPLC分析具有不同肽接头的四面体抗体(L-1)ACE2RQ740c60PGRF-ACE2RQ740c60PGRF、(L-185)ACE2RQ740c60PGRF185-ACE2RQ740c60PGRF185、(L-198)ACE2RQ740c60PGRF198-ACE2RQ740c60PGRF198、(L-208)ACE2RQ740c60PGRF208-ACE2RQ740c60PGRF208、(L-212)ACE2RQ740c60PGRF235-ACE2RQ740c60PGRF235、(L-235)ACE2RQ740c60PGRF235-ACE2RQ740c60PGRF235、(L-240)ACE2RQ740c60PGRF240-ACE2RQ740c60PGRF240。
图17示出通过SE-HPLC/MALS对四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG进行的分析。
图18描述了四面体抗体ACE2RQ740c60PG-ACE2RQ740c60PG和ACE单体ACE2RQ615c60PG的混合物的化学计量结合分析。
表10：用于制备四面体抗体的蛋白的SEQ ID
Figure BDA0004108496920001411
表11：通过ACE2RQ740c60蛋白的二聚化形成四面体抗体
Figure BDA0004108496920001412
ND；未检测到；HMW，高分子量
表12：通过SE-HPLC/MALS测得的SEC纯化的ACE2RQ740c60四面体抗体的摩尔质量
Figure BDA0004108496920001413
ND；未检测到；HMW，高分子量
表13：通过ACE2RQ740c60蛋白与不同肽接头的非共价连接形成的四面体抗体
Figure BDA0004108496920001421
ND，未检测到；HMW，高分子量
表14：预测的ACE2四面体抗体的结合结构域
Figure BDA0004108496920001431
实施例5-具有图1的图D和图5-图10、图19-图28所示结构的四面体抗体
图1的图D和图5-图10示出本实施例的四面体抗体的结构示意图。
图19描述了四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9的制备。
图20示出通过SE-HPLC对四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9进行的分析。
图21示出通过SE-HPLC/MALS对四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9进行的分析。
图22示出通过SE-HPLC/MALS对四面体抗体ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG进行的分析。
图23示出四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2740FcG9的不纯制剂的化学计量结合分析。
图24示出四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图25示出四面体抗体ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG和ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图26示出四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2二聚体ACE2-615Fc-G9的混合物的化学计量结合分析。
图27示出ACE2四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG，以及ACE2二聚体ACE2-615Fc-G9和ACE2RQ615FcPG对SARS-CoV-2-VSV假型病毒感染的抑制。
图28示出ACE2四面体抗体ACE2740FcG9-ACE2740FcG9和ACE2RQ740FcPG-ACE2RQ740FcPG，以及ACE2二聚体ACE2-740Fc-G9和ACE2RQ740FcPG对SARS-CoV-2-VSV假型病毒感染的抑制。
表15：用于制备四面体抗体的蛋白的SEQ ID
Figure BDA0004108496920001441
Figure BDA0004108496920001451
表16：通过ACE2RQ740c60和ACE2-740Fc-G9蛋白的二聚化形成四面体抗体
Figure BDA0004108496920001461
表17：通过SE-HLPC/MALS测定的SEC纯化的ACE2四面体抗体的摩尔质量
Figure BDA0004108496920001462
表18：四面体抗体的结合结构域
Figure BDA0004108496920001463
Figure BDA0004108496920001471
Figure BDA0004108496920001481
NA，不适用(无明显的形成)
表19：ACE2四面体抗体对SARS-CoV-2-VSV病毒的抑制作用
Figure BDA0004108496920001482
实施例6-超二聚体ACE2四面体抗体的结构研究
图19的实验表明，通过四个相同的ACE2-Fc融合多肽链的超二聚化，构建ACE2-740FcPG-G9(SEQ ID NO:81)，产生了包含四个ACE2结构域的四面体抗体。超二聚化反应需要作为二聚化多肽的collectrin样结构域的存在(图19的图B)；在没有它的情况下，检测不到四面体抗体(图19的图A)。该实验中四面体抗体的产率为27％；此外，ACE2-740FcPG-G9的二聚体形式的产率为64％(图20，表16)。SEC-MALS分析表明超二聚体和二聚体形式的摩尔质量为510kDa和257kDa，与它们预测的分子量438kDa和219kDa很一致，特别是考虑到ACE2分子的广泛糖基化(图21，表17)。
预测的超二聚体ACE2四面体抗体的四级结构示于图43的C部分。该结构的确认是由使用IdeZ蛋白酶进行的片段研究提供的，该蛋白酶在铰链区下方切割IgG1分子。在用IdeZ(瑞典，隆德，Genovis公司)酶切后，再用TCEP还原铰链二硫化物，超二聚体形式(图43的C部分)和二聚体形式(图43的B部分)都产生了预测的ACE2二聚体，而图43的A部分所示的单体ACE2-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：74)只产生了预期的ACE2单体。
ACE2四面体抗体的超二聚体和二聚体形式很容易通过尺寸排阻色谱法(sizeexclusion chromatography)进行分离(图20、21)。纯化后，这两种形式显然是稳定的，在一个月的时间内没有明显的相互转化，这表明这两种物质(species)的相对形成是在从细胞中转移之前发生的。为了确定连接二聚体多肽和Fc结构域的接头是否对从细胞上清液中获得的超二聚体和二聚体形式的相对丰度起作用，使用一系列不同长度的接头制备了一系列四面体抗体(表15)，并确定了超二聚体和二聚体的相对产量。正如表20所总结的，由来自TNF受体1B柄区的23个氨基酸序列组成的201接头产生了最高比例的超二聚体和二聚体形式，即38％，以及最低水平的高分子量(HMW)物质，即5.1％(表20)。
表20
Figure BDA0004108496920001491
Figure BDA0004108496920001501
实施例7-超二聚体ACE2四面体抗体的功能研究
图23-图25的化学计量结合实验表明，当SARS-CoV-2Spike蛋白被添加到ACE2超二聚体和二聚体的混合物中时，基本上所有的超二聚体在二聚体开始结合之前就被消耗了。无论是用细胞产生的超二聚体/二聚体混合物进行实验(图23)，还是用通过尺寸排阻色谱法纯化和分离得到的超二聚体和二聚体制得的混合物进行实验(图24)，都可以看到这种情况。无论在实验中使用野生型ACE2蛋白还是无催化活性的ACE2突变体蛋白(R273Q)，都得到了类似的结合顺序结果(比较图24和25)。这些结果表明，ACE2超二聚体的结合亲和力比二聚体高得多。SARS-CoV-2假型病毒中和实验(图27、28)一致表明，ACE2超二聚体比在超二聚体制剂中发现的ACE2二聚体(图43，图b)或缺乏collectrin样二聚化多肽的ACE2-Fc二聚体(图43，图a)的效力高约两个数量级。
为了证实化学计量结合和假型病毒实验的生物学意义，用活的SARS-CoV-2病毒进行了中和实验。这些实验证实，ACE2在中和病毒方面的效力比ACE2二聚体高约两个数量级，而比ACE2-Fc二聚体高约三个数量级(图44)。用同样通过ACE2受体感染细胞的NL63α冠状病毒进行的中和试验也获得了类似结果。
方法：活SARS-Cov-2中和试验。美国-WA1/2020(NR-52281)和德国/BavPat1/2020(NR-52370)从弗吉尼亚州，马纳萨斯，BEI Resources公司获得，并在Vero/TMPRSS2中使用单通道扩增。在Vero/TMPRSS2中对病毒进行终点滴定，每孔使用100TCID50。将病毒在37℃下与连续稀释的抗体预温育1小时，然后在Vero/TMPRSS2细胞上以8个重复实验的方式进行培养。7天后，对细胞病变效应(cytopathic effect)进行评分。
表21
Figure BDA0004108496920001511
实施例8-工程化ACE2超异源二聚体四面体抗体
由于仅靠接头优化并不能克服限制超二聚体ACE2四面体抗体产率的明显结构限制，因此产生了一系列具有图43的E部分所示预测结构的构建体(表22)。这种结构被称为“超异源二聚体(super-heterodimer)”，与图43中C部分所示的“超同源二聚体(super-homodimer)”不同，它有一对而不是两对二聚化多肽。据推断，超异源二聚体通过将超级二聚化(superdimerization)限制在其中一条重链上，将具有更大的构象灵活性的优势。这一预测得到了证实；通过独立改变H1和H2链上的接头长度，从培养上清液中获得的ACE2超异源二聚体的产率高达98.8％(表23)。
表22：用于制备超异源二聚体四面体抗体的SEQ ID
Figure BDA0004108496920001521
Figure BDA0004108496920001531
表23
Figure BDA0004108496920001532
Figure BDA0004108496920001541
实施例9-ACE2超异源二聚体四面体抗体的病毒中和活性
活病毒中和研究证实，超异源二聚体在中和SARS-CoV-2β冠状病毒和NL63α冠状病毒方面保留了超同源二聚体的极好的效力(表24)。
表24
Figure BDA0004108496920001542
实施例10-ACE2突变体
在这些调查过程中，R273Q突变被评价为使ACE2具有酶活性的一种手段，以避免在SARS Co-V-2患者中临床使用活性酶可能带来的并发症。我们发现，R273Q对ACE2的血浆半衰期有严重影响。因此，产生了五个新的突变，R273A、R293G、R273C、H378A和E402A，并在几个ACE2构建体中进行评价(表25A、25B和26A)。这些突变对羧肽酶的影响在不同的构建体中是一致的。经确定，就半衰期而言，H378A的耐受性最好，并且提供了最大的酶活性降低。
H378A突变使ACE2羧肽酶的活性水平在血管紧张素-II下降低99.95％，在缓激肽下降低99.93％，在apelin-13下降低99.85％(见表26B)。
材料：血管紧张素II肽(AS-20633)、Des-Arg9-缓激肽(AS-65642)(加利福尼亚州，弗里蒙特，AnaSpec公司)、Apelin-13肽(APEL-003)(加利福尼亚州，圣何塞，CPCScientific公司)。重组人ACE2(79200)(加利福尼亚州，圣地亚哥，BioLegend公司)被用作阳性对照。苯丙氨酸检测试剂盒(ab83376)(英国，剑桥，Abcam公司)。
方法：利用苯丙氨酸的存在对ACE2羧肽酶活性进行量化。当在37℃下，在反应缓冲液(含10μM ZnCl2的PBS)的存在下将0.025μg(野生型)或15μg(ACE2突变体)的COVICEPT加入到0.2μM血管紧张素II、缓激肽或apelin-13中时，启动羧肽酶反应。每2分钟从反应混合物中取出20微升等分试样(aliquot)，直至20分钟，并在80℃下热灭活5分钟。使用苯丙氨酸检测试剂盒对热灭活的等分试样中的苯丙氨酸含量进行定量。
表25A
Figure BDA0004108496920001551
Figure BDA0004108496920001561
表25B
Figure BDA0004108496920001571
表26A
Figure BDA0004108496920001581
Figure BDA0004108496920001591
Figure BDA0004108496920001601
Figure BDA0004108496920001611
表26B
Figure BDA0004108496920001612
实施例11-SARS-CoV-2中和抗体
根据表27，生产已获得紧急使用授权或处于试验后期的8种抗体的生物仿制版本(biosimilar version)，即REGN10897、REGN10933、巴尼韦单抗(Bamlanivimab)、埃特司韦单抗(etesevimab)、AZD1061、AZD 8895、VIR-7841和CT-P59，以评价ACE2超二聚体四面体抗体对SARS-CoV-2变体的相对效力。
表27
Figure BDA0004108496920001621
实施例12
为了提供原理证据，证明由两种不同类型的结构域组成的四面体抗体能特异性地结合两个不同的靶标，产生了两个系列的构建体，根据表28和29，具有图31的图B所示预测结构的第一系列，以及根据表30和31，具有图32的图C所示预测结构的第二系列，然后评估它们的结构和功能双特异性。
表28
Figure BDA0004108496920001631
表29
Figure BDA0004108496920001641
Figure BDA0004108496920001651
实施例13
表30
Figure BDA0004108496920001661
表31
Figure BDA0004108496920001671
实施例14-药代动力学
用这两个系列的构建体进行药代动力学研究，旨在评估影响FcgR和FcRn结合的Fc区中的突变的效果。第一系列描述于表28和29，第二系列描述于表33和34。
方法：该研究由位于缅因州巴尔港的杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)进行。6-8周大的雄性B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ小鼠对于人FcRn转基因是纯合的。在每次试验品施用后1天内测量体重。在第0天的0小时，通过静脉内注射以10mg/kg的剂量以5ml/kg的体积施用COVICEPT。在第5分钟、6小时、1天、4天、7天、10天、14天、17天、21天和28天采集每只小鼠的25μL血样。将血样收集到1uL的K3EDTA中，处理成血浆，在PBS中的50％甘油中进行1/10稀释，在专门的96孔储存板(storage pate)中冷冻，并储存在-20℃下。血浆样品通过电化学发光免疫分析法(马里兰州，洛克维尔，玫索尺度诊断有限公司(Meso Scale Diagnostics LLC))进行评估，以检测COVICEPT的水平。
电化学发光免疫测定法：用PBS将野生型Spike蛋白(加利福尼亚州，圣卡洛斯，LakePharma公司)稀释为20nM，并包被在QuickPlex 96孔板(玫索尺度诊断有限公司)上，每孔25μL。将板密封并在4℃下孵育过夜。然后用PBS-B(PBS添加1％ BSA)在室温下将板封闭30分钟。用PBS-B将血浆样品稀释250-4000倍。使用Biomek I5液体处理器(加利福尼亚州，布雷亚，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))将25微升稀释后的血浆样品加入到包被过的MSD板中。血浆样品在室温下振荡(700rpm)孵育60分钟。使用25微升生物素化的山羊抗人Fab抗体(Abcam公司)或生物素化的山羊抗人ACE-2检测抗体(R&D Systems公司)作为检测抗体。检测抗体在室温下振荡(700rpm)孵育60分钟。然后加入25微升磺基标签链霉亲和素(sulfo-tag streptavidin)和Read缓冲液A(马里兰州，洛克维尔，玫索尺度诊断有限公司)以产生电化学发光信号。用MSD发现工作台(MSD discovery workbench)4.0.13(马里兰州，洛克维尔，玫索尺度诊断有限公司)对数据进行分析。使用PKSolver22进行药代动力学分析。
表32A
Figure BDA0004108496920001691
表32C
Figure BDA0004108496920001692
实施例15
根据表33和34产生了一系列构建体，以评估影响FcgR和FcRn结合和药代动力学的Fc区中的突变的效果。
结合测量的结果列于表35A、35B、35C、35D中。
方法：在购自犹他州盐湖城Carterra公司的Carterra LSA仪器上进行表面等离子体共振捕获动力学实验(Surface plasmon resonance capture kinetic experiment)。使用胺偶联将COVICEPT及其对照(5μg/ml)固定在Carterra CMD-P芯片上。用运行缓冲液(含0.05％吐温的PBS)将重组Fcγ受体(R&D Systems公司)稀释至2000nM的浓度，随后用3倍连续稀释7次至0.9nM。在缔合阶段(association phase)将Fcγ受体注入到CMD-P芯片上，进行5分钟，随后在解离阶段(dissociation phase)进行另外5分钟的运行缓冲液注射。在每轮Fc-γ受体注射后，通过使PierceTMIgG洗脱缓冲液流动1分钟(马萨诸塞州，沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))使CMD-P芯片再生。使用Carterra的动力学工具分析数据。
表33
Figure BDA0004108496920001701
Figure BDA0004108496920001711
表34
Figure BDA0004108496920001721
表35A
Figure BDA0004108496920001731
表35B
Figure BDA0004108496920001741
表35C
Figure BDA0004108496920001751
表35D
Figure BDA0004108496920001761
表35E
Figure BDA0004108496920001771
实施例16-SARS-CoV-2变体中和研究
使用假型病毒中和试验(宾夕法尼亚州，费城，Integral Molecular公司)评估了四面体抗体构建体15-15和15-16(ACE2-B13A)、15-23和15-24(ACE2-O24)、15-07和15-53(ACE2-ACE2)以及10-61和10-65(ACE2核心二聚体，如图43所示)对一系列SARS-CoV-2抗体耐药变体的活性。10-61和10-65构建体整合了在Glasgow et al.PNAS 117:28046-28055(2020))中描述的313个亲和力增强突变。每种构建体都针对11种SARS-CoV-2变体和1种SARS-CoV-1毒株进行了评估，并与亲本抗体B13A和O24以及已获得美国美国食品药品监督管理局(FDA)紧急使用授权(EUA)或处于临床试验阶段后期的8种抗体的生物仿制版本进行了并列比较，这8种抗体分别为：REGN10897、REGN10933、巴尼韦单抗、埃特司韦单抗、AZD1061、AZD 8895、VIR-7841和CT-P59。
测试的SARS-CoV-2变体为D614G B.1(RVP-702)、加利福尼亚B.1.427/B.1.429(RVP-713)、印度B.1.617.2(RVP-763)、南非B.1.351(RVP-707)、南非ΔB.1.351(RVP-724)、N439K(RVP-703)、巴西P.1(RVP-708)、尼日利亚/欧洲B.1.525(RVP-723)、纽约B.1.526(RVP-726)、英国B.1.1.7(RVP-706，以及英国带有E484K的B.1.1.7(RVP-717)。所测试的SARS-CoV-1变体为Urbani(RVP-801)。括号内为Integral Molecular公司的目录号。
结果示于图48A-48P中。值得注意的是，四面体抗体构建体HB1515和HB1516针对所有11种新型冠状病毒变体以及SARS-CoV-1均有效。相比之下，观察到所有10种抗体对至少两种SARS-CoV-2变体具有显著的抗病毒性。此外，HB1515和HB1516的效力至少与所有十种测试抗体的效力相同(CT-P59针对D614G变体除外)。
方法：SARS-CoV-2假型病毒中和试验。根据制造商的方案进行中和试验。简而言之，在37℃下，将经过连续稀释的抗体与假型SARS-CoV-2-海肾荧光素酶孵育1小时。对于每种抗体，至少检测了9种浓度。使用无抗体培养基中的假型病毒作为阴性对照，测定100％传染性。然后在96孔板中以2.5×10e5个细胞/ml的浓度将混合物与293T-hsACE2细胞一起培养。在37℃、5％ CO2条件下，感染发生在约72小时内。使用Renilla-Glo荧光素酶分析系统(Promega公司，目录号E2710)测量荧光素酶信号，光度计设置为1ms积分时间。对从阴性对照孔获得的相对发光信号(RLU)进行归一化，并用于计算每种浓度的中和百分比。这些数据由Prism 9(GraphPad)处理，以拟合4PL曲线并计算log IC50。
实施例17-四面体抗体HB1516在仓鼠Covid-19模型中的效力
用于SARS-CoV-2研究的主要动物模型是利用叙利亚金黄地鼠(Golden SyrianHamster)研究致病性并测试治疗剂或疫苗。先前使用此模型的研究发现，仓鼠的SARS-CoV-2感染导致轻度至中度临床体征(呼吸急促、体重减轻、上下呼吸道中的高滴度病毒和肺部的组织学变化)，显示仓鼠与人之间相似的传染性和病理学特征。在该模型的预防性版本(prophylactic version)中评估了HB1516(蛋白15-16)，以确定其提供保护免受SARS-CoV-2的南非变体的攻击的效力，并与REGN-CoV-2(一种由REGN10987(蛋白12-01)和REGN10933(蛋白12-01)组成的中和抗体混合物(新泽西州，塔里敦，Regeneron公司))进行了比较，REGN-CoV-2已获得美国食品药品监督管理局(FDA)的紧急使用授权(EUA)，且之前已在仓鼠中证明了效力(Baum et al,Science 370,1110–1115(2020))。
材料。用于感染的SARS-CoV-2病毒南非变体来自BEI Resources公司，美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州，马纳萨斯)：目录编号NR-54974(hCoV-19/South Africa/KRISP-K005325/2020)。参考Wuhan-1分离病毒株的序列(NCBI参考序列：NC_045512.2)，该SARS-CoV-2变体在其Spike(S)蛋白中具有以下氨基酸突变：L18F、D80A、D215A、L242/A243/L244缺失、K417N、E484K N501Y、D614G、A701V。本研究中使用的REGN10987和REGN10933的生物仿制版本由Lakepharma公司(加利福尼亚州，贝尔蒙特)生产。
方法。本研究在BIOQUAL公司(马里兰州，罗克维尔)进行。将6-8周龄的24只雄性金黄地鼠分配到4组(n＝6)。在研究日的前一日(-1)，通过腹膜内(IP)途径向动物提供适用于其组的材料。在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(ATCC编号30-2020)中制备试验品，并以下列浓度施用：HB1516(25mg/kg)、REGN10933(25mg/kg)和REGN-CoV-2(REGN 10987和REGN10933各25mg/kg)。
在研究的第0天，在挑战前(pre-challenge)对动物放血，然后使用南非SARS-CoV-2毒株进行鼻内挑战(intranasal challenge)。在挑战后(post-challenge)阶段每天观察动物两次，并每日采集它们的体重。
结果。如图49所示，PBS阴性对照组在感染后体重稳步下降，到第7天，体重已下降了约初始体重的18％。在整个研究期间，HB1516处理组的体重保持不变，到第7天，体重增加了约初始体重的3％(HB1516与PBS对照：p值<0.0001)，与REGN-CoV-2处理组的结果(HB1516与REGN-CoV：p值0.9019)相当。相比之下，截至第5天，REGN10933处理组的体重减轻了它们的体重的约7％。
实施例18-包含对SARS-CoV-2Spike蛋白具有两种不同结合特异性的Fab结构域的四面体抗体
为了提供证明包含特异性结合两种不同靶标的两种不同类型Fab结构域的四面体抗体的原理证据，根据表36，使用图32的图C中所示的预测结构产生两个系列的构建体，然后评估它们的结构和功能的双特异性。第一系列构建体使用来自REGN10987(SEQ ID NO:421-422)和REGN10933(SEQ ID NO:423-424)的VH和VL区；第二系列构建体使用了来自B13A(SEQ ID NO:463-464)和O24A(SEQ ID NO:467-468)的VH和VL区(表36和37)。
为了优化正确的VH/VL配对并最小化VH/VL错误配对，将V区交换与静电转向相结合(表38)。采用了三组静电匹配突变。在每个构建体系列中，在两个方向上评估V区交换，例如，REGN10987/REGN10933和REGN10933/REGN10987。在每个方向上，D5/D6结构域的V区互换。H1和H2链的异二聚化是使用杵臼方法(杵：T366W/S354C，臼：T366/L368A/Y407V/Y349C)实现的。为了进一步促进通过蛋白A层析纯化正确配对的产物，H1或H2链整合了H435R/Y436F取代(表37)。
通过完整质谱法评估构建体的结构双特异性。使用蛋白去糖基化MixII(马萨诸塞州，伊普斯维奇，NEB公司)去除N-聚糖和O-聚糖后，通过LS/MS在非还原、变性条件下对样品进行分析，在MaxisIIUHR QTOF仪器上遵循尺寸排阻色谱法(马萨诸塞州，比尔里卡，Bruker公司)。在室温下，将1-5ug的每种样品以20uL的流速注入由10分钟梯度的水和180mM乙酸铵组成的流动相中。使用质量分辨率为10,000的全扫描MS采集方法。
解卷积后，确定正确VH/VL配对的四面体抗体(L1L2H1H2)和两个错误配对的副产物(L1L1H1H2，L2L2H1H2)的信号强度。获得了16种构建体的结果(图50A-50C)。对于H1/H2链，没有检测到明显的错配。计算主要产物和副产物的百分比，并归一化为正确和不正确产物的总产率(表39)。正确配对的VH/VL构建体(L1L2H1H2)的产率范围为98.0-99.7％；四种构建体的正确配对的VH/VL的产率大于99.5％。
表36
Figure BDA0004108496920001821
Figure BDA0004108496920001831
表37
Figure BDA0004108496920001841
Figure BDA0004108496920001851
表38
Figure BDA0004108496920001861
Figure BDA0004108496920001871
表39
Figure BDA0004108496920001872
实施例19-用双特异性四面体抗体中和SARS-CoV-2假型病毒
如实施例18中所述，使用SARS-CoV-2假型病毒中和试验(Integral Molecular，费城，宾夕法尼亚州)评估实施例18的四面体抗体构建体的功能性双特异性。每种构建体都针对以下两种SARS-CoV-2变体进行了评估：对REGN10987(基因型N439K，D614G；目录号RVP-703)高度耐受的N439L变体和对REGN10933(基因型L18F、D80A、D215G、ΔL242/L243/L244、R246I、K417N、N501Y、E484K、A701V；目录号RVP-724)高度耐受的南非Δ3B.1.351变体。每种双特异性构建体的活性直接与亲本抗体REGN10987和REGN10933以及REGN-CoV-2(REGN10987和REGN10933的1:1鸡尾酒(cocktail))进行比较。本研究中使用的REGN10987、REGN10933和REGNCoV-2的生物仿制药版本由Lakepharma公司(加利福尼亚州，贝尔蒙特)生产。
获得了18种构建体的结果(图51A-51C，表40)。关于对照构建体，REGN10987对N439K变体的效力是REGN10933的约1000分之一，REGN10933对南非变体的效力是REGN10987的约3000分之一。REGN-CoV-2鸡尾酒抗N439变体的效力是REGN10933抗N439变体的效力的约1.5倍，与REGB10987抗南非变体的效力大致相当。所有18种四价双特异性四面体抗体构建体有效中和了N439K和南非变体；18种双特异性构建体中的15种至少与REGN-CoV-2鸡尾酒抗N439K变体一样有效，18种双特异性构建体中的14种抗南非变体的效力是REGN-CoV-2鸡尾酒抗南非变体的效力的约2-3倍。
表40
Figure BDA0004108496920001881
Figure BDA0004108496920001891
实施例20-包含特异性结合CD38、BCMA、CD16或CD3的两种不同Fab的四价双特异性四面体抗体
四价、双特异性四面体抗体的针对SARS-CoV-2的优越活性表明其在其他领域如癌症中的广泛适用性，其中研究者对多特异性靶向剂的潜力有强烈兴趣。因此，用图31的图D、图32的图C和图34的图D中所示的预测结构产生了三个系列的构建体，然后评估它们的双特异性。
第一系列的构建体采用了来自以下抗体的的VH和VL区：达雷木单抗(daratumumab)(Da)(SEQ ID No 641、686)，其是FDA批准的用于靶向和治疗多发性骨髓瘤的抗CD38抗体；HA9(SEQ ID No 648、688)，其是特异性靶向和结合自然杀伤(NK)细胞的抗CD16抗体，以及SP34(SEQ ID No 657、697)，其是特异性靶向和结合T细胞的抗CD3抗体。第二系列的构建体另外使用了4C8的VH和VL区，4C8(SEQ ID No 663、700)是一种靶向骨髓瘤细胞和某些其他细胞类型的抗BCMA抗体。第三系列的构建体另外使用了来自B34的VH和VL区，B34(SEQ ID No 676、703)是一种靶向骨髓瘤细胞和某些其他细胞类型的抗BCMA抗体(表41、42、43)。
为了优化正确的VH/VL配对并最小化VH/VL错误配对，如实施例18中所述，将V区交换与静电转向相结合(表44)。此外，为了进一步促进通过蛋白A层析纯化正确配对的产物，在一些构建体中，特别是那些具有图31的图D和图32的图C中所示的预测结构的构建体中，H1链整合了H435R/Y436F取代，而H2链具有H435/Y436野生型序列。在其它构建体中，特别是那些具有图34图D所示预测结构的构建体中，H1和H2链整合了H435R/Y436F取代，而Fc链具有H435/Y436野生型序列(表42)。
如实施例18中所述，在去除N-聚糖和O-聚糖后，通过完整质谱评估所述构建体的结构双特异性。获得了18种构建体的结果(表45)。对于H1/H2链，没有检测到明显的错配。计算主要产物和副产物的百分比，并归一化为正确和不正确产物的总产率(表45)。当达雷木单抗与HA9组合时，正确配对的VH/VL的构建体(L1L2H1H2)产率的范围为94.6％至98.2％，当4C8与HA9组合时为94.3％至97.7％，当4C8与达雷木单抗组合时为96.8％至99.5％。对于构建体18-30、18-31和18-32，通过LC/MS检测到两种双特异性产物，如针对图34图D所示的预测结构所预期的那样，并且与所采用的LC/MS方法的变性条件一致。第一个结构对应于四面体抗体的D2/D4/D6部分；第二个结构对应于四面体抗体的D1/D3部分。包含在D2/D4/D6部分(L1L2H1H2)内的正确配对的VH/VL构建体的产率范围为97.1-99.5％；包含在D1/D3部分(L1H1Fc)内的正确配对的VH/VL构建体的产率范围为99.4-99.8％。
表41
Figure BDA0004108496920001911
Figure BDA0004108496920001921
表42
Figure BDA0004108496920001931
Figure BDA0004108496920001941
表43
Figure BDA0004108496920001951
Figure BDA0004108496920001961
表44
Figure BDA0004108496920001971
Figure BDA0004108496920001981
表45
Figure BDA0004108496920001991
实施例21-包含特异性结合CD19、CD20和4-1BB受体的两种不同Fab的六价三特异性四面体抗体
四面体抗体提供了独特的机会，以利用维度的贡献来产生用于治疗癌症和其他疾病的多价、多特异性靶向剂。因此，产生了一系列具有图40的图C所示预测结构的构建体，从而能够评价和应用它们的三特异性。
这一系列的三特异性构建体采用了来自以下抗体的VH和VL区：FMC 63(SEQ ID No734、708)，其是FDA批准的以嵌合抗原受体(CAR-T)的形式用于治疗B细胞癌的抗CD19抗体，以及利妥昔单抗(SEQ ID No739、713)，其是FDA批准的用以治疗B细胞癌和炎性疾病的独立抗CD20抗体。此外，这一系列的三特异性构建体采用了单链4-1BB配体(SEQ ID No 844)(表46、47、48)，并且任选地采用了单链OX40配体(SEQ ID No845)，或单链GITR配体(SEQ ID No846)。通过单一治疗剂靶向CD19和CD20提供了治疗和预防B细胞癌的耐药性以及缓解B细胞癌的重要机会，而同时递送4-1BBL、OX40L或GITRL提供了激活癌附近的NK细胞和T细胞的重要机会。
为了优化正确的VH/VL配对并最小化VH/VL错误配对，如实施例18中所述，将V区交换与静电转向相结合(表49)。此外，为了进一步促进通过蛋白A层析纯化正确配对的产物，H1链整合了H435R/Y436F取代。如实施例18所述，去除N-聚糖和O-聚糖后，通过完整的质谱分析评估构建体的结构三特异性。使用本领域技术人员熟知的各种体外和体内癌细胞靶向和细胞毒性模型，进一步评估这些构建体和实施例20的构建体的功能双特异性和三特异性。
表46
蛋白ID L1链 H1链 L2链 H2链
19-01 SEQ ID NO:733 SEQ ID NO:707 SEQ ID NO:734 SEQ ID NO:708
19-02 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:709 SEQ ID NO:736 SEQ ID NO:710
19-03 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:709 SEQ ID NO:737 SEQ ID NO:711
19-04 SEQ ID NO:738 SEQ ID NO:712 SEQ ID NO:739 SEQ ID NO:713
19-05 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:714 SEQ ID NO:741 SEQ ID NO:715
19-06 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:714 SEQ ID NO:742 SEQ ID NO:716
19-07 SEQ ID NO:733 SEQ ID NO:707 SEQ ID NO:734 SEQ ID NO:717
19-08 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:709 SEQ ID NO:736 SEQ ID NO:718
19-09 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:709 SEQ ID NO:737 SEQ ID NO:719
19-10 SEQ ID NO:738 SEQ ID NO:712 SEQ ID NO:739 SEQ ID NO:720
19-11 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:714 SEQ ID NO:741 SEQ ID NO:721
19-12 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:714 SEQ ID NO:742 SEQ ID NO:722
19-13 SEQ ID NO:733 SEQ ID NO:723 SEQ ID NO:734 SEQ ID NO:724
19-14 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:725 SEQ ID NO:736 SEQ ID NO:726
19-15 SEQ ID NO:735 SEQ ID NO:725 SEQ ID NO:737 SEQ ID NO:727
19-16 SEQ ID NO:738 SEQ ID NO:728 SEQ ID NO:739 SEQ ID NO:729
19-17 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:730 SEQ ID NO:741 SEQ ID NO:731
19-18 SEQ ID NO:740 SEQ ID NO:730 SEQ ID NO:742 SEQ ID NO:732
表47
Figure BDA0004108496920002011
表48
Figure BDA0004108496920002021
表49
Figure BDA0004108496920002031

Claims (38)

1.一种四面体抗体，所述四面体抗体包括第一结构域、第二结构域、第三结构域和第四结构域，其中：
a)所述第一结构域和第二结构域中的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b)所述第一结构域和第二结构域中的每一个均包含：
i)第一多肽链，所述第一多肽链包括所述结构域的第一N-末端，和
ⅱ)第二多肽链，所述第二多肽链包括所述结构域的第二N-末端，
c)所述第一结构域的第一N-末端和所述第二结构域的第一N-末端通过非肽基连接相互连接，其中所述非肽基连接是：
i)共价连接，或
ⅱ)以下两者之间的非共价连接
(1)通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一二聚化多肽，和
(2)通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二二聚化多肽，
其中，所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d)所述第三结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i)所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ)所述第一二聚化多肽的N-末端，以及
e)所述第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
i)所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ)所述第二二聚化多肽的N-末端。
2.根据权利要求1所述的四面体抗体，其中：
a)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域是Fab结构域，
b)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，
c)所述第一结构域和第二结构域是Fab结构域，
d)所述第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
e)所述第三结构域和/或第四结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，
f)所述第三结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，并且所述第四结构域是Fab，
g)所述第三结构域是IL-15，
h)所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是IL-15Rαsushi结构域，
i)所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是Fab，
j)所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，
k)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，
l)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，所述第三结构域选自以下项：(i)分泌蛋白，和(ⅱ)跨膜蛋白的胞外结构域，并且所述第四结构域是Fab，
m)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
n)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，
o)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第四结构域是Fab结构域，
p)所述第一结构域是Fc结构域，所述第二结构域是Fab结构域，所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是IL-15Rαsushi结构域，或
q)所述第一结构域是Fc结构域，所述第二结构域是Fab结构域，所述第三结构域是IL-15，并且所述第四结构域是Fab。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的四面体抗体，其中在所述第一结构域的第一N-末端与所述第二结构域的第一N-末端之间的非肽基连接是共价连接。
4.根据权利要求3所述的四面体抗体，其中所述共价连接包括以下结构：
Figure FDA0004108496910000031
其中：
a)Xa是选自以下项的化学结构：
i)包含稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构，
ⅱ)包含稠合到哒嗪上的环辛烯的化学结构，
b)Ra是将Xa与所述第一结构域的第一N-末端连接的键或化学结构，并且
c)Rb是将Xa与所述第二结构域的第一N-末端连接的键或化学结构。
5.根据权利要求4所述的四面体抗体，其中Xa包括
Figure FDA0004108496910000032
结构，其中Rc是H、烷基或芳基，或它们的互变异构体。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的四面体抗体，其中所述共价连接包括
Figure FDA0004108496910000041
结构，其中Rc是H、烷基或芳基，或它们的互变异构体。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的四面体抗体，其中Ra和Rb独立地为键，或包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上部分的链的化学结构或由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上部分的链组成的化学结构，其中每个部分独立地选自下列项：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure FDA0004108496910000042
Figure FDA0004108496910000043
Figure FDA0004108496910000051
Figure FDA0004108496910000052
其中X1是CH或N，X2是CH2或羰基，并且R5是芳基或烷基，其中[PEG(y)]z是：
Figure FDA0004108496910000053
其中y＝1-100并且z＝1-10。
8.根据权利要求7所述的四面体抗体，其中Ra和/或Rb各自独立地：
a)包含[PEG(y)]z基团；
b)包含聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)或多糖基团；
c)包含C1-C4烷基；
d)包含琥珀酰亚胺；
e)包含胺；
f)包含琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基或己二酰基；
g)包含丙二酰基；
h)包含氨基酸；
i)包含半胱氨酸；
j)包含赖氨酸；
k)由选自以下项中的三个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure FDA0004108496910000061
Figure FDA0004108496910000062
l)由选自以下项中的四个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure FDA0004108496910000071
Figure FDA0004108496910000072
m)由选自以下项中的五个部分的链组成：[PEG(y)]z、聚亚烷基二醇、聚烷氧基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖、支链残基、C1-C10烷基、C3-C10环烷烃、C2-C10烯烃、C5-C10环烯烃、胺、硫、氧、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、甘油、三唑、异噁唑烷、C2-C5酰基、C2-C5酰氨基、C2-C5酰氧基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、邻苯二甲酰基、己二酰基、氨基酸、芳基、杂芳基、氨基甲酸酯、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure FDA0004108496910000081
Figure FDA0004108496910000082
n)包含键合到赖氨酸上的[PEG(y)]z基团；
o)包含键合到琥珀酰亚胺基团上的C1-C4酰基；
p)包含键合到C1-C4酰基上的赖氨酸
q)包含[PEG(y)]z基团，其键合到戊二酰基上；
r)由选自以下项中的三、四或五个部分的链组成：[PEG(y)]z、C2-C5酰基、琥珀酰基、丙二酰基、戊二酰基、氨基酸、含有稠合到二氢哒嗪上的环辛烷的化学结构、含有稠合到三唑上的环辛烯的化学结构、含有稠合到异噁唑烷上的环辛烯的化学结构、二苯并环辛烯、二苯并氮杂环辛烯、
Figure FDA0004108496910000091
Figure FDA0004108496910000092
其中X1是CH或N，X2是CH2或羰基，并且R5是芳基或烷基，其中[PEG(y)]z是：
Figure FDA0004108496910000093
其中y＝1-100并且z＝1-10；
s)是键；
t)是半胱氨酸；
u)具有线性结构；或
v)具有支链结构；
w)具有
Figure FDA0004108496910000101
结构；
x)是：
Figure FDA0004108496910000102
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；
y)是：
Figure FDA0004108496910000103
其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50并且z是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；
z)是：
Figure FDA0004108496910000111
其中x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50，并且z是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40或1-50；或
aa)是
Figure FDA0004108496910000112
其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-30、1-40、或1-50。
9.根据权利要求7或8所述的四面体抗体，其中Ra和/或Rb包含所述
Figure FDA0004108496910000113
部分，其中X1是CH或N，并且X2是CH2或羰基。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的四面体抗体，其中所述非肽基连接是连接到所述第一结构域的第一N-末端的第一二聚化多肽和连接到所述第二结构域的第一N-末端的第二二聚化多肽之间的非共价连接。
11.根据权利要求10所述的四面体抗体，其中所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽选自以下项：
a)亮氨酸拉链结构域，
b)collectrin样结构域(CLD)，和
c)collectrin结构域(CD)。
12.根据权利要求10或11所述的四面体抗体，其中：
a)所述第一二聚化多肽与所述第二二聚化多肽相同，并且
b)所述二聚化多肽形成同源二聚体。
13.根据权利要求10或11所述的四面体抗体，其中：
a)所述第一二聚化多肽不同于所述第二二聚化多肽，并且
b)所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽形成异源二聚体。
14.根据权利要求13所述的四面体抗体，其中所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽在彼此存在时，形成少于30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的同源二聚体。
15.根据权利要求10-12中任一项所述的四面体抗体，其中：
a)所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2肽酶结构域(PD)，并且
b)所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽各自是ACE2 collectrin样结构域(CLD)。
16.根据权利要求15所述的四面体抗体，其中所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域。
17.根据权利要求10-15中任一项所述的四面体抗体，其中：
a)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域是第一类Fab结构域，
b)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第三结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，或
d)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第四结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域。
18.根据权利要求10-14和17中任一项所述的四面体抗体，所述四面体抗体另外包含第五结构域，其中所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接至以下项：
a)所述第一二聚化多肽的N-末端，
b)所述第一结构域的第二N-末端，或
c)第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端。
19.根据权利要求18所述的四面体抗体，其中：
a)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第五结构域是第一类Fab结构域，
b)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
d)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
e)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
f)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
g)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，或
h)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域、第三类Fab结构域和第四类Fab结构域。
20.根据权利要求10-19中任一项所述的四面体抗体，所述四面体抗体另外还包括第五结构域和/或第六结构域，其中：
a)所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第一二聚化多肽的N-末端，
ⅱ)所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅲ)第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
b)所述第六结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第二二聚化多肽的N-末端，
ⅱ)所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅲ)第四二聚化多肽的N-末端，其中所述第四二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端。
21.根据权利要求20所述的四面体抗体，其中
a)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第五结构域是第一类Fab结构域，
b)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
c)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
d)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
e)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域和第二类Fab结构域，
f)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
g)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域和第三类Fab结构域，
h)所述第一结构域是Fc结构域，并且所述第二结构域、第三结构域、第四结构域和第五结构域独立地选自第一类Fab结构域、第二类Fab结构域、第三类Fab结构域和第四类Fab结构域，或
i)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，并且所述第三结构域和第四结构域是ACE2肽酶结构域，并且所述第五结构域和第六结构域是Fab结构域。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的四面体抗体，所述四面体抗体还包括第七结构域和/或第八结构域，其中：
a)所述第七结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第一结构域的第一C-末端，或
ⅱ)所述第一结构域的第二C-末端，
b)所述第八结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第二结构域的第一C-末端，或
ⅱ)所述第二结构域的第二C-末端。
23.根据权利要求20所述的四面体抗体，其中：
a)所述第三结构域、第四结构域、第五结构域和第六结构域各自是ACE2 PD，并且所述二聚化多肽各自是ACE2 CLD，
b)所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2 PD，所述第五结构域和第六结构域各自是Fab结构域，并且所述二聚化多肽各自是ACE2 CLD，
c)所述第三结构域和第四结构域各自是Fab结构域，所述第五结构域和第六结构域各自是ACE2 PD，并且所述二聚化多肽各自是ACE2 CLD，或
d)所述第一结构域和第二结构域是Fc结构域，所述第三结构域和第四结构域是ACE2PD，所述第五结构域和第六结构域是Fab结构域，所述二聚化多肽各自是ACE2 CLD，并且所述第一结构域和第二结构域各自通过肽接头连接到它们各自的二聚化多肽，优选地，其中这些结构域和接头的特征在于以下特征中的一个或多个或全部：
ⅰ)所述Fc结构域的特征在于以下特征中的一个或多个或全部：
(1)是异源二聚体，
(2)是IgG1 Fc结构域，
(3)包含沉默突变，使得所述Fc结构域缺乏Fcγ受体结合活性，优选地，其中这种突变是以下突变的组合：P329G/L234A/L235A(PGLALA)，
(4)包含增强FcRn活性的突变，优选地，其中这种突变延长所述四面体抗体的半衰期，优选地，其中所述突变是以下突变的组合：L309D/Q311H/N434S(DHS)，和
(5)包含去除它们的蛋白A结合位点的突变，优选地，其中这种突变是H435R/Y436F(HY/RF)，
ⅱ)所述ACE2肽酶结构域包含阻断其血管紧张素转化酶活性的突变，优选地，其中这种突变是H378A突变，
ⅲ)所述Fab结构域是包含鼠可变区的嵌合Fab结构域，
iv)所述肽接头各自具有23个氨基酸的长度，并且衍生自TNF受体的柄区，优选地，其中所述TNF受体是TNF受体1B，更优选地，其中所述肽接头由SEQ ID NO:4468中所示的氨基酸序列组成，
v)此类结构域和肽接头由三种不同类型的多肽链形成，更优选地，其中所述三种不同类型的多肽链表示为H1、L2和H2，所述H1链包含SEQ ID NO:522中所示的氨基酸序列，所述L2链包含SEQ ID NO:465中所示的氨基酸序列，并且所述H2链包含SEQ ID NO:534中所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求20所述的四面体抗体，其中：
a)所述第三结构域和第四结构域各自是ACE2 PD，
b)所述第五结构域，如果存在，在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到第三二聚化多肽的N-末端，其中所述第三二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
c)第六结构域，如果存在，在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到第四二聚化多肽的N-末端，其中所述第四二聚化多肽在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端，并且
d)所述第一二聚化多肽、第二二聚化多肽、第三二聚化多肽和第四二聚化多肽各自是ACE2 CLD。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的四面体抗体，其中ACE2 PD包含所述ACE2蛋白的氨基酸18-615或其一部分或由所述ACE2蛋白的氨基酸18-615或其一部分组成。
26.根据权利要求14-24中任一项所述的四面体抗体，其中ACE2 CLD包含所述ACE2蛋白的氨基酸616-740或其一部分或由所述ACE2蛋白的氨基酸616-740或其一部分组成。
27.根据权利要求14-26中任一项所述的四面体抗体，其中ACE2 PD具有催化活性。
28.根据权利要求14-26中任一项所述的四面体抗体，其中ACE2 PD无催化活性。
29.根据权利要求28所述的四面体抗体，其中ACE2 PD包含R273Q或H378A突变。
30.根据权利要求14-29中任一项所述的四面体抗体，其中所述Fc结构域缺乏Fcγ受体结合活性。
31.根据权利要求30所述的四面体抗体，其中所述Fc结构域包括P329G突变、L234A突变和L235A突变。
32.根据权利要求24所述的四面体抗体，其中：
a)所述第五结构域、第三二聚化多肽和所述第一结构域的第二多肽链是一段连续的氨基酸，
b)所述第三结构域、第一二聚化多肽和所述第一结构域的第一多肽链是一段连续的氨基酸，
c)所述第四结构域、第二二聚化多肽和所述第二结构域的第一多肽链是一段连续的氨基酸，并且
d)所述第六结构域、第四二聚化多肽和所述第二结构域的第二多肽链是一段连续的氨基酸，
其中每段连续的氨基酸由选自SEQ ID NO:74-119的氨基酸序列组成。
33.一种八面体抗体，所述八面体抗体包含第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域和第六结构域，其中：
a)所述第一结构域、第二结构域和第三结构域的每一个均选自Fab结构域和Fc结构域，
b)所述第一结构域、第二结构域和第三结构域中的每一个均包括：
ⅰ)包含所述结构域的第一N-末端的第一多肽链，和
ⅱ)包含所述结构域的第二N-末端的第二多肽链，
c)所述第一结构域的第一N-末端、所述第二结构域的第一N-末端和所述第三结构域的第一N-末端通过非肽基连接相互连接，其中所述非肽基连接是：
ⅰ)支链共价连接，或
ⅱ)以下的两者之间的非共价连接
(1)通过肽键或通过肽接头与所述第一结构域的第一N-末端连接的第一三聚化多肽，
(2)通过肽键或通过肽接头与所述第二结构域的第一N-末端连接的第二三聚化多肽，
(3)通过肽键或通过肽接头与所述第三结构域的第一N-末端连接的第三三聚化多肽，
其中所述第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽不是免疫球蛋白多肽，
d)所述第四结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
ⅰ)所述第一结构域的第二N-末端，或
ⅱ)所述第一三聚化多肽的N-末端，
e)所述第五结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
ⅰ)所述第二结构域的第二N-末端，或
ⅱ)所述第二三聚化多肽的N-末端，并且
f)所述第六结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
ⅰ)所述第三结构域的第二N-末端，或
ⅱ)所述第三三聚化多肽的N-末端。
34.根据权利要求33所述的八面体抗体，其中所述非肽基连接是以下的两者之间的非共价连接：连接到所述第一结构域的第一N-末端的第一三聚化多肽、连接到所述第二结构域的第一N-末端的第二三聚化多肽、连接到所述第三结构域的第一N-末端的第三三聚化多肽，其中所述第一三聚化多肽、第二三聚化多肽和第三三聚化多肽选自TNF配体超家族成员OX40L/TNFLSF4、CD40L/TNFLSF5、FASL/TNFLSF6、CD70L/TNFLSF7、CD30L/TNFLSF8、4-1BBL/TNFLSF9、TRAIL/TNFLSF10、RANKL/TNFLSF11、TWEAK/TNFLSF12、APRIL/TNFLSF13、BAFF/TNFLSF13B、LIGHT/TNFLSF14、VEGI/TNFLSF15、GITRL/TNFLSF18、EctodyplasinATNFLSF19、TNF/TNFLSF2、淋巴毒素α/TNFLSF1和淋巴毒素β/TNFLSF3。
35.根据权利要求33或34所述的八面体抗体，所述八面体抗体还包括第七结构域、第八结构域和/或第九结构域，其中：
a)所述第七结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第一结构域的第二N-末端，
b)所述第八结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第二结构域的第二N-末端，和/或
c)所述第九结构域在其C-末端通过肽键或通过肽接头连接到所述第三结构域的第二N-末端。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的八面体抗体，所述八面体抗体还包括第十结构域、第十一结构域和/或第十二结构域，其中：
a)所述第十结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第一结构域的第一C-末端，或
ⅱ)所述第一结构域的第二C-末端，
b)所述第十一结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第二结构域的第一C-末端，或
ⅱ)所述第二结构域的第二C-末端，
c)所述第十二结构域在其N-末端通过肽键或通过肽接头连接到以下项：
i)所述第三结构域的第一C-末端，或
ⅱ)所述第三结构域的第二C-末端。
37.根据权利要求1至36中任何一项所述的四面体抗体或八面体抗体，其中：
a)所述四面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是Fc结构域，其中所述一个或多个Fc结构域独立地选自本文公开的任何Fc结构域，
b)所述四面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第一结构域、第二结构域、第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是Fab结构域，其中所述一个或多个Fab结构域独立地选自本文公开的任何Fab结构域，
c)所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是分泌蛋白，其中所述一个或多个分泌蛋白独立地选自本文公开的任何分泌蛋白，
d)所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体抗体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个是跨膜蛋白的胞外结构域，其中所述一个或多个跨膜蛋白的胞外结构域独立地选自本文公开的任何跨膜蛋白的胞外结构域，
e)所述四面体抗体的第三结构域、第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域和第八结构域中的一个或多个，或所述八面体的第四结构域、第五结构域、第六结构域、第七结构域、第八结构域、第九结构域、第十结构域、第十一结构域和第十二结构域中的一个或多个：
i)包括作为被批准用于治疗患有疾病的个体的药物的化合物的结构，
ⅱ)包括分子量小于1000道尔顿的有机化合物、DNA适配体、RNA适配体、寡核苷酸或具有生物活性的蛋白的结构，
ⅲ)包括伯胺或仲胺，
ⅳ)是阿立哌唑或奥司他韦，
v)是呼吸道药物、平喘剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗心绞痛剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、抗组胺剂、抗感染剂、抗生素、抗炎剂、抗帕金森症药、抗精神病药、退热剂、抗溃疡剂、注意力缺陷多动症(ADHD)药物、中枢神经系统兴奋剂、减充血剂或精神兴奋药，
ⅵ)是阿普洛尔、醋丁洛尔、阿米福林、安咪奈丁、氨磺洛尔、阿莫沙平、安非他尼、阿替洛尔、阿托西汀、巴洛沙星、巴美生、苯呋洛尔、苯那普利、苯氟雷司、苯佐他明、倍他司汀、倍他洛尔、贝凡洛尔、二苯美伦、比索洛尔、布林佐胺、丁苯碘胺、丁胺卡因、卡米罗芬、卡拉洛尔、卡替卡因、卡维地洛、吐根酚碱、环丙沙星、氯氮平、氯苄雷司、氯丙那林、环喷他明、地拉普利、地美替林、地诺帕明、地昔帕明、地氯雷他定、双氯芬酸、二甲福林、地奥沙屈、多巴酚丁胺、多培沙明、多利培南、多佐胺、氢普拉明、度洛西汀、依托拉嗪、依那普利、依诺沙星、肾上腺素、厄他培南、艾沙拉唑、艾司洛尔、乙苯恶啶、法舒地尔、芬地林、苯甲锡林、苯氟拉明、非诺多泮、非诺特罗、芬普雷司、flecamide、氟西汀、福莫特罗、罗曲坦、加波沙朵、加雷沙星、加替沙星、格雷沙星、己双肾上腺素、咪达普利、吲达品、莫地卡尼、盐酸茚洛秦、异克舒令、异丙克兰、拉贝洛尔、兰地洛尔、拉帕替尼、左法哌酯、赖诺普利、洛美沙星、洛曲非班、马普替林、美加明、甲氟喹、甲吲洛尔、美罗培南、美他帕明、奥西那林、甲氧非那明、右旋哌醋甲酯、哌醋甲酯、美替洛尔、美托洛尔、米托蒽醌、米伐折醇、莫西卜里、莫普洛尔、莫西沙星、奈必洛尔、硝苯洛尔、尼普洛尔、诺氟沙星、去甲替林、苄丙酚胺、奥氮平、奥沙尼喹、心得平、奥昔非君、帕罗西汀、perhexyline、芬美曲秦、苯肾上腺素、苯丙甲胺、甲羟苯丙胺、匹西雷司、pimethylline、吲哚洛尔、吡哌酸、匹多卡因、心得宁、普多沙星、普拉克索、普拉维林、普瑞特罗、普尼拉明、prilocalne、丙卡特罗、丙萘洛尔、普罗帕酮、普萘洛尔、六氢脱氧麻黄碱、胡椒喘定、普罗替林、伪麻黄碱、瑞波西汀、雷沙吉兰、(r)-雷沙吉兰、瑞匹诺坦、瑞普特罗、瑞米特罗、利托君、沙芬酰胺、舒喘灵/沙丁胺醇、沙美特罗、沙立佐坦、舍曲林、西洛多辛、索他洛尔、索特瑞醇、司帕沙星、螺普利、硫氧洛尔、脱氧肾上腺素、坦索罗辛、替巴克兰、噻奈普汀、替罗非班、喘速宁、曲美他嗪、曲昔匹特、伐尼克兰、维达列汀、维洛沙秦、维喹地尔或扎莫特罗；
ⅶ)包含具有生物活性的蛋白，
ⅷ)具有生物活性，从而具有靶结合活性，
ⅸ)是独立折叠的蛋白或其部分，
x)是糖基化蛋白，
xi)包含链内二硫键，
xii)结合细胞因子，
xⅲ)结合细胞因子，其中所述细胞因子是TNFα，
xⅳ)包含心钠素(ANP)、降钙素、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、内皮素、艾塞那肽、胃抑制肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、GLP-1或GLP-2的类似物、胰高血糖素血管活性肠肽(GVIP)、生长素释放肽、YY肽或分泌素或它们的一部分，
xv)包含序列HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:4657)中的一段连续氨基酸，
xⅵ)包含至少一段连续氨基酸，其与抗体的Fab或Fab’的重链中存在的一段连续氨基酸相同，
xⅶ)包含至少一段连续氨基酸，其与抗体的Fab或Fab’的轻链中存在的一段连续氨基酸相同，
xⅷ)包含抗体的至少一个Fab或Fab’，或至少一个Fab或Fab’的部分，
xⅸ)包含抗体的Fab-1或Fab’1或其部分，
xx)包含抗体的Fab-2或Fab’2或其部分，
xxi)包含抗体的两个Fab或Fab’手，
xxⅱ)包含至少一段连续氨基酸，其与单链抗体中存在的一段连续氨基酸相同，或
xxⅲ)包含至少一段连续氨基酸，其与TNFα受体中存在的一段连续氨基酸相同，
f)所述四面体抗体或八面体抗体包含共价连接，其中所述共价连接选自本文公开的任何共价连接，或包含本文公开的任何异双功能交联剂，和/或
g)所述四面体抗体或八面体抗体包含一个或多个肽接头，其中所述一个或多个肽接头独立地选自：
ⅰ)序列TSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD(SEQ IDNO:3227)，或其中存在的一段连续氨基酸，
ⅱ)序列GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG(SEQ ID NO:3226)，或其中存在的一段连续氨基酸，或
ⅲ)本文公开的任何肽接头。
38.一种组合物，其包含至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的权利要求1至37中任一项所述的四面体抗体或八面体抗体，作为所述组合物中含肽分子的比例(重量/重量)。
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