TWI335920B - Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine and sugar chain and manufacture thereof - Google Patents

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TWI335920B
TWI335920B TW096128509A TW96128509A TWI335920B TW I335920 B TWI335920 B TW I335920B TW 096128509 A TW096128509 A TW 096128509A TW 96128509 A TW96128509 A TW 96128509A TW I335920 B TWI335920 B TW I335920B
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aspartame
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Yasuhiro Kajihara
Kazuaki Kakehi
Kazuhiro Fukae
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Yasuhiro Kajihara
Otsuka Chemical Co Ltd
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

1,335920 第96128509號專利申請案 ， （99年10月25日） 九、發明說明： ' 【發明所屬之技術領域】 * 本發明係關於糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺及 糖鏈與其製造法。 又，本發明系關於含岩藻糖之糖鏈天冬醯胺衍生物及 其製造方法。 【先前技術】 近年來，僅次於核酸（DNA)、蛋白質之第三個受注目 籲之鏈狀生命分子為，糖鏈分子。人體由約60兆個細胞所組 成之大細胞社會，其全部細胞表面由糖鏈分子所覆蓋。如 ABO式A型由細胞表面之糖鏈之不同而決定。 糖鏈，含有關於細胞間之辨認及相互作用之機能，是 構成細胞社會之要點。該細胞社會之混亂，導致癌、慢性 疾患、感染症、老化等。
如細胞癌化時可以看到糖鏈之結構變化。又，霍亂菌 及流感病毒等，係根據與特定糖鏈辨認結合，侵入細胞後 感染而引起之。 糖鏈功能之解析，會帶來根據新原理之醫藥品或食品 之開發等.、預防疾病、貢獻於治療等、期待更廣之應用。 糖鏈，從單糖之排列、結合方式·部位、鏈長·分岐方 式、全體之高級結構等多樣性來看，與核酸或蛋白質之結 構相比非常複雜。因此，由該結構而來之生物學上資訊與 核酸或蛋白質相比更多種多樣。雖然知道對糖鏈研究之重 要性，但因該結構之複雜性及多樣性，研究之推動與核酸 5 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 或蛋白質相比稍慢。 • 上述之存在於細胞膜表面或血清等之蛋白質，多數與 ' 糖鏈結合。糖鏈在蛋白質上有共價結合i分子稱為糖蛋白 質，根據糖和蛋白質之結合方式之不同可以分為2個群 體。1個群體為天冬醯胺（Asn)側鏈之胺基和糖鏈結合之天 冬醯胺結合型糖鏈(N-糖苷結合型）。另1個群體為在絲氨 酸（Ser)或蘇氨酸（Thr)之醇上結合糖鏈之黏蛋白結合型（0-糖苷結合型）。所有之天冬醯胺結合型糖鏈含由5個糖殘基 籲所組成之基本骨架，根據結合糖鏈之非還原末端之糖殘基 之種類不同，分為高甘露糖型、複合型、混合型低糖鏈。 另外，黏蛋白結合型糖鏈根據基本骨架（核（core))不同分為 4個群體。 雖然糖鏈為重要之化合物，也有糖鏈之絕對量之不 足。得到糖鏈之方法有，從存在於生物體内之糖蛋白質中 只游離糖鏈之方法。但從糖蛋白質中切出大量之糖鏈，較 困難，生物體内存在在很多結構類似之糖鏈，很難只得到 $大量之單一糖鏈。又，大量得到不存在生物體内之糖鏈也 較困難。 本發明提供，在非還原末端上，含至少一種以上之唾 ' 液酸或唾液酸衍生物之新穎糖鏈天冬醯胺衍生物，及其製 造方法。 又，本發明提供，在非還原末端上，含至少一種以上 之唾液酸或唾液酸衍生物之新穎糖鏈天冬醯胺，及其製造 方法。 6 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 又，本發明提供，在非還原末端上，含至少一種以上 之唾液酸或唾液酸衍生物之新穎糖鏈，及其製造方法。 本發明提供，由脂溶性保護基保護天冬醯胺之胺基氮 之糖鏈天冬醯胺之非還原末端側之N-乙醯基葡糖胺上，含 至少一個以上岩藻糖之新穎糖鏈天冬醯胺衍生物、及其製 _造方法。 【發明内容】 本發明係有關以下發明。 1.式（1)所示之含11至7糖之α 2,3糖鏈天冬醯胺衍生物及 籲其製造法。
[式中、R1及R2為，氫原子、與式（2)至（5)所表示之基， 可為相同或不同。但R1及R2之一方必須為式（2)所表示之 基。]
R，R，,R”表示以下組合。
(a) R = F、R’ =〇H、R” =〇H
(b) R = OH、R’ =F、R” =〇H
(c) R = 〇H、R’ =〇H、R” =F
(d) R = OH、R’ =〇H、R” =〇H 7 315343D01修正版 L335920
第96128509號專利申請案 (99年10月25曰）
(4) (5) 2.式（6)所表示之含氟之具有11至7糖之α 2,6糖鏈天冬醯 胺衍生物及其製造法。
[式中、Rx及RY為氫原子、式（7)所表示之基、或式（3) 至（5)所表示之基。但Rx及RY之一方必須為式（7)所表示 之基。]
R，R，,R，’表示以下組合。 8 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
(a) R = F、R’ =〇H、R” =〇H
(b) R = OH、R’ =F、R” =OH
(c) R = OH、R’ =OH、R'，=F 3.式（8)所表示之含11至7糖之a 2,3糖鏈天冬醯胺及其製 造法。
[式中、R1及R2為同上述之含義。] 4.式（9)所表示之含氟之具有11至7糖之a 2,6糖鏈天冬醯 胺及其製造法。
[式中、Rx及RY為同上述之含義。] 5.式（10)所表示之含11至7糖之a 2,3糖鏈及其製造法。
[式中、R1及R2為同上述之含義。] 6.式（11)所表示之含氟之具有11至7糖之a 2,6糖鏈及其製 造法。 9 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
[式中、Rx及RY為同上述之含義。] 7.式（22)所表示之含11糖之（α 2,3)(α 2,6)糖鏈天冬醯胺衍 生物。 R\„
Ain-Fjnoc ( 2 2) [式中、R1為式（2)所表示之基、Rx為下式（7)所表示之 基。]
(a) R = F, R' =OH, R'' =OH (b) . R = 〇H、R’.=F、R” =〇H (c.) R = 〇H、R’ =OH、R” =F (d) R = OH，R’ =〇H、R” =OH
R,R’，R”表示以下組合。 8.式（23)所表示之含11糖之（α 2,3)( a 2,6)糖鏈天冬醯胺衍 生物。
[式中、R2為式（2)所表示之基、Rx為下式（7)所表示之 10 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 基。]
(a) R=F、R’.=〇H、R” =OH
(b) R = 〇H、R’ =F、R，’=〇H <c) R = 〇H、R，=〇H、R” =F (d) R = 〇H、R’ =〇H、R’，=OH 本發明係有關，由脂溶性保護基保護天冬醯胺之胺基 氮之糖鏈天冬醯胺之非還原末端侧之N-乙醯基葡糖胺上， 含至少一個以上岩藻糖之糖鏈天冬醯胺衍生物、及其製造 方法。 本發明人，首先根據特願2001-185685號（以下稱為先 申請案），比以往更容易得到大量之各種經單離之糖鏈天冬 醯胺衍生物。而開發糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺、 糖鏈之製造方法，及欠缺任意糖殘基之糖鏈結合成之新穎 糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺、糖鏈。 該先申請案之方法可列舉如， (1)以糖鏈天冬醯胺為起源之糖鏈天冬醯胺衍生物之 製造方法，其包含 (a) 含1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物中，在含 該糖鏈天冬醯胺中引入脂溶性保護基，得到糖鏈天冬醯胺 衍生物混合物之步驟、以及 (b) 將該糖鏈天冬醯胺衍生物混合物或該糖鏈天冬醯 11 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 胺衍生物混合物中所含之糖鏈天冬酿胺衍生物，加水分解 後得到之混合物，用層析法分離各糖鏈天冬醯胺衍生物之 步驟， (2) 上述（1)之糖鏈天冬醯胺衍生物之製造方法，其復包 含 (b，）由步驟（b)中分離之糖鏈天冬醯胺衍生物，用糖加 水分解酶之加水分解步驟， (3) 上述（1)或（2)之糖鏈天冬醯胺衍生物之製造方法， 鲁其中，含1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物為，含下 式（A)之化合物及/或該化合物中欠缺1個以上糖殘基之化 合物者， (4) 上述（1)至（3)中任一項之糖鏈天冬醯胺衍生物之製 造方法，其中，脂溶性保護基為芴基曱氧羰基（Fmoc)， (5) 上述（1)至（3)中任一項之糖鏈天冬醯胺衍生物之製 造方法，其中，步驟（a)為，含1種或2種以上在非還原末 $端中有唾液酸殘基之糖鏈天冬醯胺之混合物中，在含該糖 鏈天冬蕴胺中引入Fmoc基，且在唾液酸殘基中引入苄基， 得到糖鏈天冬醯胺衍生物混合物之步驟， (6) 糖鏈天冬醯胺之製造方法，其包含 (a) 含1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物t，在含 該糖鏈天冬醯胺中引入脂溶性保護基，得到糖鏈天冬醯胺 衍生物混合物之步驟、 (b) 將該糖鏈天冬醯胺衍生物混合物或該糖鏈天冬醯 胺衍生物混合物中所含之糖鏈天冬酿胺衍生物，加水分解 12 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 後得到之混合物，用層析法分離各糖鏈天冬醯胺衍生物之 步驟、以及 (C)除去步驟（b)中經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物之保 護基，得到糖鏈天冬醯胺之步驟， (7)(6)之糖鏈天冬醯胺之製造方法，其復包含 * (b’)在步驟（b)中經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物，用糖 加水分解酶加水分解之步驟、 (C’)在步驟（C)中得到之糖鏈天冬醯胺，用糖加水分解 籲酶加水分解之步驟， (8) 上述（6)或（7)之糖鏈天冬醯胺之製造方法，其中，含 1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物為，含下式（A)之化 合物及/或該化合物中欠缺1個以上糖殘基之化合物者、 (9) 上述（6)至（8)中任一項之糖鏈天冬醯胺之製造方 法，其中，脂溶性保護基為Fmoc基， (10) 上述（6)至（8)中任一項之糖鏈天冬醯胺之製造方 法，其中，步驟（a)為，含1種或2種以上在非還原末端中 ®有唾液酸殘基之糖鏈天冬醯胺之混合物中，在含該糖鏈天 冬酿胺中引入Fmoc基，且在唾液酸殘基中引入苄基，得 到糖鏈天冬醯胺衍生物混合物之步驟。
(A) 13 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 因關於糖鏈天冬醯胺衍生物及糖鏈天冬醯胺之製造， ' 在上述先申請案中已詳細說明，所以引用這些方法。但少 數先申請案之内容中所說明之糖鏈天冬醯胺衍生物之製造 方法中，如，以天然之糖蛋白質為起源之糖鏈天冬醯胺、 其較佳以從天冬醯胺結合型糖鏈得到之糖鏈天冬醯胺之混 合物中所含該糖鏈天冬醯胺中引入（結合）脂溶性保護基， 在得到糖鏈天冬醯胺衍生物之混合物後，將該混合物分離 為各糖鏈天冬醯胺衍生物為其一大特徵。又，本說明書中， 籲「糖鏈天冬醯胺」為結合天冬醯胺狀態之糖鏈。又，「天冬 醯胺結合型糖鏈」為蛋白質之多胜肽中之天冬醯胺（Asn) 之酸胺基中，存在於還原末端之N-乙醯基葡糖胺和N-糖 苷結合之糖鏈群、以 Man(y5 l-4)GlcNac(/3 1-4) GlcNac 為 母核之糖鏈群。「糖鏈天冬醯胺衍生物」為在天冬醯胺殘基 中結合脂溶性保護基之狀態之糖鏈天冬醯胺。又，在化合 物之結構式中，「AcHN」表示為乙醯胺基。 如上述，以天然之糖蛋白質為起源之糖鏈為，欠缺任 意非還原末端之糖殘基之糖鏈之化合物。本發明人，意外 發現以天然之糖蛋白質為起源之糖鏈，具體為在糖鏈天冬 醯胺之混合物所含之該糖鏈天冬醯胺中，引入脂溶性保護 基，將引入該保護基之糖鏈天冬醯胺衍生物之混合物，用 衆所周知之層析法，很容易分離各個糖鏈天冬醯胺衍生 物。根據該方法，可以配製大量之含各種結構之糖鏈天冬 醯胺衍生物。如，可以分離先前很難分離之結構類似之糖 鏈天冬醯胺衍生物、容易配製大量之該化合物。又，將得 14 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 到之糖鏈天冬醯胺衍生物為起源，如，依次用糖加水分解 酶除去糖殘基，可以合成各種糖鏈天冬醯胺衍生物。 如上述，根據在糖鏈天冬醯胺中引入脂溶性保護基之 衍生物化，可以分離各個糖鏈天冬醯胺衍生物，但因引入 脂溶性保護基，糖鏈天冬醯胺衍生物全體之脂溶性提高， 如，因格外提高適合使用之逆相系統管柱之相互作用，使 能靈敏的反映糖鏈結構之差別，而能分離各個糖鏈天冬醯 胺衍生物。 再者，在先申請案中，根據除去得到之糖鏈天冬醯胺 衍生物之保護基，用人工之方法容易得到大量之各種糖鏈 天冬醯胺。 但上述先申請案中得到之糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈 天冬醯胺及糖鏈全部為α2,6結合體。 又，上述先申請案中得到之糖鏈天冬醯胺衍生物、糖 鏈天冬醯胺及糖鏈全部為不結合岩藻糖之糖鏈天冬醯胺衍 生物。 本發明可得到在上述先申請案中未揭示之α 2,3結合 體之糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺及糖鏈、及α 2,6 結合體之含氟之新穎糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬酿胺 及糖鏈。 本發明還可以得到在上述先申請案中未揭示之岩藻糖 結合體之糖鏈天冬醯胺衍生物。 下面，說明有關α 2,3結合體和α 2,6結合體之不同點。 <2 2,3結合體、α 2,6結合體，表示與唾液酸和半乳糖 15 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 之結合方式。前者為，唾液酸之2位之碳和、半乳糖之3 位之碳以0：結合者，後者為，唾液酸之2位之碳和、半乳 糖之6位之碳以α結合者。此處與半乳糖結合之碳不同。 然而該不同點，如，在流感病毒中，以在末端含唾液 酸之糖鏈為受體來辨認。但人和鳥之流感病毒中受體之特 異性不同。前者辨認，唾液酸在半乳糖上α 2,6結合之糖 鏈、後者辨認，唾液酸在半乳糖上α 2,3結合之糖鏈。根 據唾液酸-半乳糖之間之結合方式不同、再加上唾液酸之不 鲁同，而了解完成了流感病毒宿主領域之界限之分派作用。 本發明係有關，在先申請案中未揭示之新穎糖鏈天冬 醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺及糖鏈、與其製造法。 關於本發明之方法，首先，起始化合物之脂溶性保護 基經保護之糖鏈天冬酿胺（9糖-Asn-Fmoc),用唾液酸轉移 酶將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移，將得到之脂溶性保護 基經保護之糖鏈天冬醯胺，用層析法分離，得到脂溶性保 護基經保護之二涎糖鏈天冬醯胺衍生物及2種單涎糖鏈天 冬醯胺衍生物。 其次，將得到之二涎糖鏈天冬醯胺衍生物及2種單涎 糖鏈天冬酿胺衍生物，根據糖加水分解，得到含唾液酸或 唾液酸之衍生物之9至7糖鏈天冬蕴胺衍生物。 又，以上述中得到之11至7糖鏈天冬醯胺衍生物或二 延糖鏈天冬酿胺（a 2,6-11糖-Asn-Fmoc)為起始原料，以糖 加水分解，在得到之10至6糖鏈天冬醯胺衍生物中，由糖 轉移酶將岩藻糖轉移，得到含岩藻糖之13至7糖鏈天冬醯 16 315343D01修正版 1.335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 胺衍生物。 該保護基並無特別之限定，可列舉如，Fmoc基或第三 丁氧羰基（Boc)、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙醯基等碳 酸酯系列或醯胺基系列之保護基。將得到之糖鏈天冬醯胺 衍生物直接用於所要求之糖縮氨酸之合成之觀點來看，保 護基中，Fmoc基或Boc基等為佳、Fmoc基為更佳。Fmoc 基在唾液酸等比較酸性條件中不安定糖在糖鏈中存在時格 外有效。又，保護基之引入可根據衆所周知之方法（如參 照 5 Protecting groups in Organic chemistry,John Wiley & Sons INC.,New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)進行。 例如，使用Fmoc基時，對糖鏈天冬醯胺加入適量之 丙酮後，再加入9-芴曱基-N-琥珀亞醯胺基碳酸酯和碳酸 氫鈉溶解，在25°C下進行天冬醯胺殘基和Fmoc基之結合 反應，可以在該糖鏈天冬醯胺之天冬醯胺殘基中引入Fmoc 基。 根據上述操作，得到引入脂溶性保護基之糖鏈天冬醯 胺衍生物。 唾液酸可使用一般市面上出售之唾液酸或化學合成之 物質。 唾液酸之衍生物可使用一般市面上出售之唾液酸之衍 生物或化學合成之物質。具體可列舉如，將唾液酸之7位、 8位或9位之碳結合之羥基，經以氫原子或鹵原子取代之 物質。鹵原子可列舉如，氟、氯、溴等，其中，氟為佳。 唾液酸轉移酶可使用，一般之市面上出售者、天然得 17 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日') 者、根據基因重組生産之物質，比轉移之唾液酸或唾液酸 之衍生物之種類更適宜選擇。具體可列舉如：α2,3轉移 酶之由Rat Recombinant而來之物質、α2,6轉移酶之由Rat Liver而來之物質。又，根據唾液酶持有之PH調整等而錯 開平衡，亦可轉移唾液酸或唾液酸之衍生物。 上述之糖鏈天冬醯胺衍生物之層析法分離，可將適 宜、衆所周知之層析法，單獨或複數組合使用。 可列舉如，將得到之糖鏈天冬醯胺衍生物混合物用凝 膠過濾管柱層析法純化後，用HPLC(high performance • liquid chromatograph;高效液相層析法）純化。用於HPLC 之管柱以逆相系列管柱為適宜，可列舉如，〇DS(octadecyl-bonded silica ;十八烧鍵結梦谬）、Phenyl系列、腈系列、 陰離子交換系列之管柱、具體可列舉如，Pharmacia公司 製MonoQ管柱、Iatron公司製Intro beads管柱等。分離條 件等可以參照適宜、衆所周知之條件而調整。根據上述操 作.，可以從糖鏈天冬醯胺衍生物混合物中得到所要求之各 糖鏈天冬醯胺衍生物。 $ 根據上述操作，如，當保護基為Fmoc基時，可以將 式（12)、（13)、（17)、（18)、（22)、（23)之糖鏈天冬醯胺衍生 物，以單獨或混合物之形式得到。 再者，上述經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物加水分解 後，可以有效地得到含所要求糖鏈結.構之糖鏈天冬醯胺衍 生物。如，當糖鏈天冬醒胺衍生物分離時，限制混合物中 所含之糖鏈天冬醯胺衍生物之種類，大致分離出糖鏈天冬 醯胺衍生物，之後加水分解，如利用糖加水分解酶進行加 水分解，有效地得到含所要求糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍 18 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 生物。加水分解可以和上述同樣進行。特別是從可以有效 地得到含所要求糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍生物之觀點來 看，使用糖殘基之切斷方式為明確之糖加水分解酶進行加 水分解為佳。 如去半乳糖殘基之除去係將經加水分解之化合物溶解 於緩衝液（如，磷酸緩衝溶液、乙酸缓衝溶液、良好緩衝溶 液等）中，在衆所周知之條件下用半乳糖加水分解酶進行半 乳糖殘基之切斷反應而成之。又，加水分解之化合物可以 _是各個單離之物質也可以是混合物。用於該反應之半乳糖 加水分解酶，使用市面上出售之衆所周知之外切型酶 (exo-euzyme)為佳。又，具同樣活性之物質的話，新單離 之酶，在基因工程學中研究製造之酶亦可。之後同上述， 將反應後得到之反應液（切斷糖殘基之糖鏈天冬醯胺衍生 物之混合物）用層析法，得到各糖鏈天冬蕴胺衍生物。如分 離時用HPLC(ODS管柱、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶 液：乙腈=82 : 18)進行為佳。 N-乙醯基葡糖胺殘基之除去係將經加水分解之化合 物溶解於緩衝液（如，磷酸緩衝溶液、乙酸緩衝溶液、良好 緩衝溶液等）中，在衆所周知之條件下用N-乙醯基葡糖胺 加水分解酶進行N-乙醯基葡糖胺殘基之切斷反應而成 之。又，也可以使用N-乙醯基己糖胺tase加水分解酶。加 水分解之化合物可以是各個單離之物質也可以是混合物。 用於該反應之各酶，使用市面上出售之衆所周知之外切型 酶為佳。又，具同樣活性之物質的話，新單離之酶，在基 19 315343D01修正版 L335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 因工程學中研究製造之酶為亦可。之後同上述，將反應後 得到之反應液（切斷糖殘基之糖鏈天冬醯胺衍车物之混合 物）用層析法，得到各糖鏈天冬醯胺衍生物。如分離時用 HPLC(ODS管柱、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：曱醇 =65 : 35或50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82 : 18)進行為佳。
甘露醇殘基時之除去係將經加水分解之化合物溶解於 缓衝液（如，磷酸缓衝溶液、乙酸緩衝溶液、良好緩衝溶液 等）中，在衆所周知之條件下用甘露醇加水分解酶進行甘露 醇殘基之切斷反應而成之。加水分解之化合物可以是各個 單離之物質也可以是混合物。用於該反應之甘露醇加水分 解酶，使用市面上出售之衆所周知之外切型酶為佳。又， 具同樣活性之物質的話，新單離之酶，在基因工程學中研 究製造之酶亦可。之後同上述，將反應後得到之反應液（切 斷糖殘基之糖鏈天冬醯胺衍生物之混合物）用層析.法，得到 各糖鏈天冬酿胺衍生物。如分離時用HPLC(ODS管柱、展 開溶劑為10至200Mm之乙酸銨等緩衝溶液和乙腈、或乙 醇、或曱醇、或丁醇、或丙醇等具脂溶性之水溶性有機溶 劑適宜混合而成。該例子中展開溶劑為，50mM乙酸銨水 溶液：乙腈=82 : 18)進行為佳。 由此得到各糖鏈天冬醯胺衍生物後，根據轉移岩藻 糖，可以製造為本發明之脂溶性保護基之天冬醯胺之胺基 氮經保護之糖鏈天冬醯胺之非還原末端側之N-乙醯基葡 糖胺中至少含1個以上岩藻糖之新穎糖鏈天冬醯胺衍生 物。 20 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 岩藻糖可使用一般用市面上出售之岩藻糖或化學合成 之物質。 岩藻糖轉移酶為，一般之市面上出售者、天然者、根 據基因重組生産之物質，比轉移之岩藻糖之種類更適宜選 擇。具體可列舉如，轉移糖鏈天冬醯胺之非還原末端側之 N-乙醯基葡糖胺中之岩藻糖之酶之岩藻糖基轉移酶 V(FucosyltransferaseV)(人類重組物、血漿起源、血清起 源、乳汁起源、肝臟起源）等。又，用岩藻糖加水分解酶， 籲可根據PH調整等錯開平衡，轉移岩藻糖。 上述糖鏈天冬醯胺衍生物之層析法分離，可將適宜、 衆所周知之層析法，單獨或複數組合使用。 可列舉如，將得到之糖鏈天冬醯胺衍生物混合物用凝 膠過濾管柱層析法純化後，用HPLC純化。用於HPLC之 管柱中逆相系列管柱為適宜，可列舉如，0DS、Phenyl系 列、腈基系列、陰離子交換系列之管柱、具體可列舉如， ^Pharmacia 公司製 MonoQ 管柱、Iatron 公司製 Iatro beads 管柱等。分離條件等可以參照適宜、衆所周知之條件而調 整。根據上述操作，可以從糖鏈天冬醯胺衍生物混合物中 得到所要求之各糖鏈天冬醯胺衍生物。 如上述，得到各糖鏈天冬醯胺衍生物後，用各種糖加 水分解酶，將該衍生物進行加水分解，根據除去糖鏈之非 還原末端之糖殘基，如，可以將糖鏈末端之分岐結構不均 一之各樣之糖鏈天冬醯胺衍生物製得各種單一化合物之物 質。又，用各種糖加水分解酶，改變加水分解之順序及其 21 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 種類，可以製造更多種類之糖鏈天冬醯胺衍生物。 根據習知之方法，得到含極限糖鏈結構冬糖鍵天冬醯 胺衍生物之分析規模，需要膨脹時間和成本，但本發明， 不需要特殊裝置及試劑，使用慣用之凝膠過濾管柱、HPLC 管柱及、至少3種糖加水分解酶（如，半乳糖加水分解酶、 甘露醇加水分解酶、N-乙醯基葡糖胺加水分解酶）等，2周 間可以調製1克左右之含所要求之糖鏈結構之糖鏈天冬醯 胺衍生物。 根據上述操作，如，當保護基為Fmoc基時，可以將 式（14)至（16)、（19)至（21)之糖鏈天冬醯胺衍生物，以單獨 或混合物之形式得到。 本發明提供，可以得到大量之各種單離之糖鏈天冬醯 胺之糖鏈天冬醯胺製造方法。該方法為’繼續根據上述糖_ 鏈天冬醯胺衍生物之製造方法之糖鏈天冬醯胺衍生物之製 造步驟，又，包括從得到之糖鏈天冬醯胺衍生物中除去保 護基之步驟。 從糖鏈天冬醯胺衍生物中除去保護基之步驟’可以根 據衆所周知之方法進行（如參照，Protecting grouPs in Organic chemistry,John Wiley & Sons INC.,New York 1991,ISBN 0-47 卜 62301-6)。如’當保護基為 Fmoc 基時’ 在N，N-二甲基甲酿胺（DMF)中，糖鏈天冬醯胺衍生物中加 入嗎啉進行反應，可以除去Fmoc基。又，Boc基為以弱 酸反應可以除去。將保護基除去後，根據要求而使用適宜、 衆所周知之方法’如’凝膠過滤管柱、離子交換管柱等之 22 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 各種層析法或、HPLC之分離之方法純化，得到糖鏈天冬 醯胺。. 根據上述操作，如，將式（8)、（9)之糖鏈天冬醯胺，以 單獨或混合物之形式得到。 本發明提供，可以得到大量之各種單離之糖鏈之糖鏈 製造方法。該方法為，繼續根據上述糖鏈天冬醯胺之製造 方法之糖鏈天冬醯胺之製造步驟，又，包括從得到之糖鏈 天冬醯胺中除去天冬醯胺殘基之步驟。 1 糖鏈天冬醯胺中天冬醯胺殘基之步驟，可以根據衆所 周知之方法進行。如，可將糖鏈天冬醯胺與無水反應後， 根據乙醯基化除去天冬醯胺殘基得到糖鏈。又，將糖鏈天 冬醯胺在鹼性水溶液中加熱回流後，根據乙醯基化，也可 以除去天冬醯胺殘基得到糖鏈。除去天冬醯胺殘基後，根 據要求而使適宜、衆所周知之方法為，如，根據凝膠過濾 管柱、離子交換管柱等之各種層析法或、HPLC之分離之 方法純化。 I . 根據上述操作，如，將式（10)、（11)之糖鏈，以單獨或 混合物之形式得到。 因此，根據本發明，可以廉價且有效地大量製造，含 所要求之糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺 及糖鏈（以下有時將3者併稱為之糖鏈類）。 糖鏈類在醫藥品開發等領域中非常有用。如，醫藥品 開發之應用例可列舉如，癌之疫苗合成。當細胞癌化時， 可發現體内中沒有之糖鏈。又，在化學上合成該糖鏈時， 23 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 給個體投藥疫苗，發現抑制癌之繁殖。此處，如果通過本 發明製造要求之糖鏈類，可以進行對癌治療有效之疫苗之 合成。再者，本發明中得到之糖鏈類，根據化學上之反應 及糖轉移酶反應等之組合，結合新穎糖殘基使衍生物化， 可以進行新穎疫苗之合成。 【實施方式】 下面列舉參考例、實施例說明本發明，但本發明並不 侷限於此實施例。 籲參考例1 α2,6-二涎糖鏈天冬醯胺之合成 將來自蛋之粗純化之SGP(涎酸糖肽 (sialoglycopeptide))2.6g溶解於三-鹽酸·氯化鉀緩衝溶液 (TRIZMA BASE 0.05moin、氯化鉀 0.01mol/l、PH7.5)100ml 中。加入疊氮化鈉58mg(772#mol)和蛋白分解酶ActinaseE (科研製藥公司製）526mg,於37°C下靜置。65小時後，再加入 ActinaseE 263mg，再於37°C下靜置24小時。將該溶液凍 I結乾燥後，殘留物用凝膠過濾管柱層析法（Sephadex G-25、2.5 φ xlm、展開溶劑為水、流速為1 .Oml/min)純化 2次，得到α 2,6-二涎糖鏈天冬醯胺1.3g(555 /z mol)。得到 之涎糖鏈天冬醯胺之物理資料如下。 ^-NMR (D.o, 3 or)
<5 5.13 (s , 1H, Man 4-H- 1), 5.0 7 (d, 1 H, J = 9. 5 H 24 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） Z) G 1 cNAc 1-H-1), 4. 9 5 (s, 1 Η, M a η 4-Η—1), 4. 7 7 (s , 1 Η, Man 3 ~Η- 1), 4. 6 1 (d, 1 Η, J = 7. 6 Η ζ , G 1 cNAc 2-Η-1), 4.6 0 (d, 2Η, J = 7. 6 Η ζ G 1 c Ν A c 5, 5-H-l), 4.4 4 (d, 2H, J=8.0Hz, Gal6, 6-H- 工），4. 2 5 (b d , 1 Η, M a n 3-H- 2), 4. 2 0 (b d d，1 Hf jvjan4—H-2), 4.12 (bd, 1H, Man4—H-2), 2.94 (dd, 1 H, J =4· 5 Η z , 1 7. 2 , A s π _/3 CH), 2· 8 5 (d d, 1 H, J==7.0Hz, 17.2Hz, Asn-i3CH), 2.6 7, 2.6 6 (dd, 2 H, J=4. 6Hz, 1 2. 4Hz, Ne uAc 7, 7-H- 3 eQ), 2.0 7 (St 3H, Ac), 2.06 (s, 6 H. AcX2), 2.0 2 (s, 6H, Ac 籲 X2)，2.01 (s, 3H, Ac), 1.71 (dd，2H，J = i2.4Hz, 12.4H2, NeuAc7, 7 - H- 3 )
參考例2化合物1 ' 2、3及4之合成 將參考例1中得到之α2,6-二涎糖鏈天冬酿胺 (609mg，261e mol)溶解於水20.7ml中，加入〇 1Ν鹽酸 13 ‘8m卜在70°C下將該溶液加熱35分鐘後迅速用冰冷卻， 加入飽和碳酸氫鈉水溶液使pH達到7。冷凍乾燥後，殘留 物用凝膠過濾管柱層析法（Sephadex G-25、2.5pxlm、展 開溶劑為水、流速為l.〇ml/min)純化，得到α 2,6_二延糖鍵 天冬醯胺、2種α 2,6-單涎糖鏈天冬醯胺及亞涎糖鏈天冬酿 315343D01修正版 25 1335920 第96丨28509號專利申請案 吐々人， （"年1〇月25曰、) 胺之轧合物534mg。該4個成分不用單離用於下面之步驟。 得到之糖鏈混合物之物理資料如下。 'H-NMR (DzO, 3 0ec) 5· 1 3 (s, Man4-Hl), 5.12 (s, Man4-Hl), 5.0 1 (d7 GlcNAcl-Hl), 4.94 (s, Man4J -Hi), 4.9 3 (s,
Man4 -HI), 4.82 (s，Man3-Hl), 4.60 (d, GlcNA c 2-Hi), 4. 5 8 (d, G 1 cNAc 5, 5* -HI), 4. 4 7 (dd.
Gal 6, 6, -HI), 4, 4 4 (d, Gal 6, 6, -HI), 4,2 4 (d,
Man3-H2), 4.19 (d, Man4( -H2), 4. 1 1 (d. Man4-
H2), 2.97 (bdd. ASN-/3CH), 2.72 Cdd, NeuAc7-H 3eq, NeuAc7-H3eq)> 2.6 4 (bdd, AsN-/3CH). 2. 1 5 -Ac), 1.79 (dd, NeuAc7-H3ax, NeuAc 7 ’ ~H3 a x) 將得到之糖鏈混合物429mg溶解於丙酮16 3ml和水 11.2ml中。加入9_芴曱基_N_琥珀亞醯胺基碳酸酯 (155.7mg，461.7/z mol)和碳酸氫鈉（8〇.4mg，957/z mol)，在室 溫下攪拌2小時。該溶液用蒸發器除去丙酮，殘留物用凝 _膠過濾管柱層析法（SephadexG_25、2 5(^xlm、展開溶劑 為水、流速為LOml/min)精制，得到化合物i、化合物2 及3、化合物4之混合物309mg。該混合物用HPLC(ODS 管柱、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：甲醇=65 : 35、 2·0ρ x25cm、流速為3ml/min)純化，51分鐘後溶出化合物 1 67刀鐘後;谷出化合物2及3之混合物、93分鐘後溶出 化合物4^該化合物分開凍結乾燥後，用凝膠過濾管柱層 析法（Sephadex G-25、2.5φ x30cm、展開溶劑為水、流速 為l.Oml/min)進行脱鹽’得到目的化合物2及3之混合物 315343D01修正版 26 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 150mg ° 得到之化合物1之物理資料如下 'H-NMR (D20. 3 0Ό) 0 c), 7.5 5 (4 • 5. 〇 6 (1H, d, 7.99 (2H, d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fm H, m, Fmoc), 5.15 (1H, s, Man4-Hi)
GlcNAci-Hl), 4.95 ClH, s, Man4- r „ 1)，4. 8 2 (1 H，s，Man3-Hl), 4.69 (1H, d, G1Cma ,. NAc 2-H1). 4. 6 7 (2H, d, GIcNAc5,5’ -Hi), 4_53 , d+, Ga 1 6, 6 -HI), 4‘ 3 4 (1H, d, Man 3-H2) 4 ~ , 2 7 (ih, d, Ma n4 -H2), 4.19 (1H, d, Man4-H2) 〇 '3· 〇 3 (1H, bdd,
AsN-0CH), 3. 0 0 (1H, bdd, AsN-Sr^s p 2.7 6 (2H,
dd, NeUAc 7, 7' -H3 e q), 2. 1 5 (1 8H ’ 5 ^ 6 , —Ac), 1· 7 9 (2H, d d, Ne uAc 7，7, -H3 ax) · x’，HRms Calcd for ^103^ 154^8^a<^66 [M + Na+] 2 5 8 ] o 〇1-S8 3 8, foun d, 2581.8821
(1) 上述糖鍵結構之記號表示如下，
NeuAc:魏酸Gal:D-半乳糖GlcNAc:N_乙酿基葡糖胺 Man:D-甘露醇 Asn:天冬醯胺
NeuAc 〇f2-^6Gal β 1—4GlcNAci3 1— 2Mana I>y .X6 Λ -Man /31— 4C1 CNAc 0 1— 4G1 cNAc— A s n-Pmoc
NeuAc a2— 6Gal j8461cNAc β 1— 2Man a / ά C|NAt A5D Fmoc (1 ~ a) 得到之化合物2及3之混合物之物理資料如下。 315343D01修正版 27 1335920 第96128509號專利申請案 . (99 年 10 月.25 日） 'H-NMR (D20, 3 0Ό) . 7.9 9 (d, Fmoc), 7.79 (d, Fmoc), 7.55 (m, Fmoc), 5. 1 4 (s, Man4-Hl), 5.12 (s , Ma n 4 ~H), 5. Q 0 (d, GIcNAcl-Hl), 4.94 (s, Man4’ —HI), 4.93 (s. Ma n4,-Hl), 4.82 (s, Man3-Hl), 4.60 (d, GlcNAc2 — HI), 4.5 8 (d, GJcNAc5, 5’ —HI), 4..46 (dd, Gal 6,6’ —HI), 4.44 (d, Gal 6, 6' —Hi), 4.24 (d, Man3 —H 2), 4.19 (d, Man4' —H2), 4.11 (d, M a n 4 —H 2), 2.9 7 (bdd, A s N-/3 CH), 2. 7 2 (del, NeuAc7-H3eq, Ne uAc 7-H3 e q), 2.6 4 (bdd, AsN-/3CH), 2.15 (sx 5，一Ac)，1. 7 9 (d d, Ne u Ac 7-H3 a x, Ne u Ac 7，一H 3 得到之化合物4之物理資料如下。 :H-NMR (：〇2〇, 3 0-C) 7.9 9 (2H, d, Fmoc), 7.7 9 (2H, d, Fmoc), 7.5 5 (4 H, m, Fmoc), 5.12 (1H, s, Man4-Hl), 5.0 6 (1H, d, GlcNAcl-Hl), 4.9 3 (1H, s, Man4' -Hi), 4.8 2 (1 H, s, Man3-Hl), 4.6 9 (1H, d, GlcNAc2-Hl), 4.6 7 (2H, d, G 1 cNAc 5, 5' -HI), 4. 5 3 (2H, d, Ga 1 6,
6' -HU, 4. 3 4. (1H, d, Man 3-H2). 4. 2 7 (1 H, d, Ma n4' -H2), 4. 19 (1H, d, Man4-H2), 3.0 3 (1 H, b d cl, ASN-/3CH), 3.00 (1H. bdd, AsN-eCH), 2.15 (1 2 H, s X4. -Ac) ; HRMS Calcd for C 8, Η, 2 0 N 6 N a O30 y [M+ Na+] 1 9 9 9. 6 9 3 0, found, 1999.6939
28 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 • (99年10月25日） 上述化合物4之簡單結構式示於表2中。 • 參考例3化合物2、3之合成及單離 . 將參考例2中得到之化合物2、3之混合物（5.0mg，2.2 // mol)溶解於220/z L之水中，加入22mM之碳酸鉋水溶 液100/z L、使pH達到7.0。該溶液進行凍結乾燥。乾燥 後之固形物中加人Ν,Ν-二曱基曱醯胺430#L，再加入6.6 // mol之苄基溴化物/N，N-二曱基甲醯胺溶液20/z L。將該 溶液在氬氣氛下攪拌。48小時後，用TLC(展開溶劑為1M 籲NH4OAc:異丙醇=1 : 2)確認原料消失後，加入4.4mL之二 乙醚使化合物沈澱。將沈澱之糖鏈過濾，殘留之糖鏈溶解 於水中凍結乾燥。將凍結乾燥後之殘留物均分用 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20x250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶
液：乙腈=78 : 22、流速為4.0mL/mm)純化，88分鐘後溶出 化合物3、91分鐘後溶出化合物2。各自分開，再用ODS 管柱（0：〇8111〇81175(：18-0?>1、15)<10〇111111、最初通入：《20 50mL、之後通入25%之乙腈，而溶出）脫鹽，得到目的化 合物2之苄基體1.6mg、化合物3之苄基體1.8mg。 將化合物2之苄基體（10糖、13.6mg、5.8mmol)，冰冷 下溶解於NaOHaq.(pH=12)1.4ml中。逢用HPLC監視反應 邊攪拌約8小時。當反應進行結束時，使反應液用 40mMHCl調整到pH=7.0。將中和後之溶液用膜濾器過濾 後、濃縮、之後用 HPLC(YMC—Pack ODS —AM, SH-343 —5AM, 20x250mm,AN/25mM AcONH4 29 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年1〇月25日') buffer=20/80,7.0ml/min.，wave length;274nm)均分.純化。將 均分液漢縮後’用 ODS 官柱（Cosmosil75C18-OPN，Nacalai tesque公司製）進行脫鹽處理、濃縮、凍結乾燥，得到目的 化合物 2(6.2mg，47.4%)。 付到之化合物之物理賢料如下。化合物2之.簡單結構 式示於表1中。 ，H NMR <4 0 0MHz, DjjO, 30Χ；, H〇D = 4. 81) δ 8.0 0 Cd , 2 H, J = 7. 2，Fm o c )，7· 7 9 (d · 2 H J = 7.2, Fm。。〉，7.59 (dd，2H，J = 7.2, Fmoc), 7.53 (d d, 2H, J = 7.2, Fmoc), 5.22 (s, 1 H, Man4-Hl), 5.0 9 (d, 1H, J = 9.8, GlcNAcl-Hl), 5. 0 1 (s, 1 H,
Man4, —H-l), 4.85 (s，1H), 4.5 8 -4.7 5 (m, 5H), 4.57 (dd, 2H, J = 8.〇), 4.38—4.48 (m, 2H), 4 33 (s，1 H〉，4.28 (b s , 1H，Man4 - H2), 4 19 (b s 1 H) 2.64-2.85 (m, 3H, Asn-/3CHx2, NeuAc7-H3eq), 2. 1 6, 2.13, 2.12 (eachs, 12H, Acx4), 1.98 (s ,
3H, Ac) 1.80 (<3d, 1H, Ja = 12.〇, Jb=. 12,0. NeuA c7—H3ax)· 將化合物3之 > 基體（10糖、5.〇mg、2.1 mmol) *冰冷 下溶解於NaOHaq.(pH=12)2.0ml中。邊用HPLC監視反應 邊攪拌約5小時。當反應進行結束時，使反應液用 40mMHCl調整到pH=7_0。將中和後之溶液用膜濾器過濾 後、濃縮、之後用 HPLC(YMC-Pack ODS-AM，SH-343-5AM， 20x250mm,AN/25mM AcONH4 buffer=20/80,7.0ml/min., wavelength;274nm)均分.純化。將均分液濃縮後，用〇DS 管柱（CosmosilTSCi8-0PN，Nacalai tesque 公司製）進行脫鹽 處理、濃縮、凍結乾燥，得到目的化合物3(2.5mg，52.0%)。 30 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日') 得到之化合物之物理資料如下。化合物3之簡單結構 式示於表1中。 NMR (4 0 0MHz , D20, 3 Ot：, H〇D = 4. 8 1) Q 8.0 1 (d, 2H, J = 7.6, Fmoc), 7.8 0 (d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7.59 (dd, 2H, J = 7.6, Fmoc), 7.5 2 (d d, 2H, J=7.6, Fmoc), 5.2 1 (s, 1H, Man4-Hl),
5.0 9 (d, 1H, J = 9.5, GIcNAcl-Hl), 5.0 3 (s, 1H, Man4’-H-1), 4.58-4.71 (m. 5H〉，4,54 (t, 2H, J = 7.5), 4.4 0 — 4.5 0 (b, 2H), 4.3 4 (s, 1 H), 4.2 8 (b S , 1 H, Man4-H2), 4.19 (bs, 1 H), 2.7 0 - 2.8 5 (m, 2 H, Asn-/3CH, N e uA c 7-H3 e q). 2.5 5 - 2.7 0 (m, 1 H, Asn-/3CH), 2.16, 2.15, 2.13, 2.11 (eachs, 1 2 H,
Acx4), 1.9 8 (s, 3H, Ac) 1.80 (dd, 1 H, Ja=12.4,
Jb==12.4, N e u A c 7-H 3 a x). 參考例4化合物5及6之合成 將參考例2中得到之化合物2及3之混合物（224mg，97 #mol)和牛血清白蛋白24mg溶解於HEPES[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazine ethane sulfonic acid(2-經乙基α底哄 乙磺酸)]缓衝溶液（50mM，pH6.0)22ml中，再加入Diplococcus pneumoniae而來之方半乳糖苷酶（1.35U)。在37°C下將該溶 液靜置15小時後，凍結乾燥。殘留物用HPLC(ODS管柱、2.0 </)x25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=85 : 15、 流速為3ml/min)純化，129分鐘後溶出化合物5、134分鐘後 溶出化合物6。各自分開，凍結乾燥。之後用HPLC(ODS管 柱、2.0(/) x25cm、展開溶劑為最初之15分鐘為水、16分至 30分鐘為水：乙腈（容量比）=ι〇 : 〇至85 : 15、3.1分至45分 31 315343D01修正版 l33592〇 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 鐘為水：6腈=85: 15至80:20而成之梯度。流速為3.0ml/min) 進行脫鹱處理，得到81mg目的化合物5、75mg目的化合物6。 得到之化合物5之物理資料如下。 1ΗNMR (D 2 〇，3 0Ο 7.9 9 (2Η, d, Fmo c), 7· 7 9 (2 H, d，Fmo c), 7.5 5 (4 H, m, Fmoc), 5.15 (1 H, S, Man4-Hi), 5.0 6 (ι H, d, GlcNAcl-Hl), 4.9 5 ClH, s, Man4* -HI), 4.82 (1 H, s, Man3-Hl), 4.6 9 (1H, d, GlcNAc2-Hl), 4.6 7 (2H. d, GlcNAc5,5，-HI〉，4.S3 (1H, cl, Gal6， _ -HI)，4.34 (1H, d, Man3-H2), 4.27 (1H, d, Man 4* -H2), 4. 1 9 (1H, d, Man4~H2), 2/97 (1H, bdd,
AsN-j3CH), 2.76 (1H, dd, N€uAc7( —H3eQ) 2 61 (1H, bdd, AsN-fiCH), 2.15 (15H, SX5, -Ac), 1.7 9 (1H, dd, NeuAc7’ —H3ax);HRMS Calcd for C86H, 27N7N a053 [M + Na+] 2 1 2 8.7 3 5 6^ found, 21 2 8. 7 3 6 3 得到之化合物6之物理資料如下。 315343D01修正版 32 1335920
第96128509號專利申請案 (99年10月25日J !H-NMR (D2〇, 3 〇〇 7.99 (2H. d, Fmoc), 7.7 9 (2H, d, Fmoc), 7.5 5 (4 H, m, Fmoc), 5.15 (l H, S, Man4-Hl), 5.0 6 (1H, d, GlcNAcl-Hl)f 4.9 5 (1H, s, Man4* -HI), 4.8 2 (1 H, s, Man 3-HI), 4. 6 9 (1 H, d, G 1 cNAc 2-H1), 4. 6 7(2H.d,GlcNAc5,5’-Hl),4.53(lH，d，Gal6-Hl), 4.3 4 C1H, d, Man3-H2), 4.2 7 (l H, d, Man4' -H2), 4.19 (1H, d, Man4-H2), 2.9 7 (1H, bdd, As N-^CH), 2.7 6 (1H, dd, N e u A c 7-H 3 e q), 2.6 0 (1 H, bdd, AsNT-/3CH), 2.15 (15H, sX5, -Ac), 1.79 (1H, φ d d* Ne uAc 7-H3 ax) ; HRMS Calcd for Ca6H125 N7Na3〇53 [M + Na+] 2 1 7 2.6 9 9 5, found, 2172,70 8 4 參考例5化合物7及8之合成 將參考例4中得到之化合物5及6之混合物（90mg，47.3 // mol)不要各自分離，與牛血清白蛋白8mg —起溶解於 HEPES 緩衝溶液（50mM，pH6.0)8.1ml 中，加入牛腎（B〇vine Kidney)而來之β -葡糖胺酶（Nacalai tesque公司製、來自牛 腎）2.8 8U。在37 C下將該溶液靜置18小時後，柬結乾燥， 殘留物用HPLC(ODS管柱、2·0φ x25cm、展開溶劑為5〇mM 乙酸録水溶液：甲醇=65 : 35、流速為3ml/min)純化，in 分鐘後溶出化合物7、127分鐘後溶出化合物8。各自分開’ 殊結乾燥。之後用HPLC(ODS管柱、2.0pX25Cm、展開溶 劑為最初之15分鐘為水、16分至30分鐘為水：乙腈=1〇: 〇至85 : 15、31分至45分鐘為水：乙腈=85 : 15至8〇 : 20而成之梯度。流速為3.0ml/min)進行脫鹽處理，得到 4〇mg目的化合物7、37mg目的化合物8。 得到之化合物7之物理資料如下。 315343D01修正版 33 1335920 第96128509號專剎申請案 (99年10月25曰） 'H-NMR (DzO, 3 0V) 8.0 1 (2H, d, Fmoc), 7.8 0 (2H, d, Fmo c), 7.5 6 (4 H, m, Fmoc), 5.2 2 (1H, s, Man4-Hl), 5.0 8 (1H, d, GlcNAcl-Hl), 4. 94 (1H, s, Man4,-Hl), 4. 84 (1 H, s, Man3 — HI), 4.69 (1H, d, G 1 cNAc 2-H1), 4.6 7 (1H, d, G 1 cNAc 5-H1), 4. 5 5 (1H, d, Ga 1 6 -H 1),
4.3 3 (1H, dd, Man3-H2), 4.2 0 (1H, dd, Man4-H 2), 4. 1 5 (1 H, d d, Ma n 4 ' -H2), 2. 9 7- (1 H, b d d, As Ν-β CH), 2.7 6 (2H, dd, NeuAc7, 7' -H3eq), 2.6 2 (1H, bdd, AsN—jSCH), 2· 1 5 (1 2H, s X4, —Ac), 1.7 9 (2H, dd, NeuAc7, 7' -H3ax);HRMS C a 1 c d f ° r C78H1i4N6Na 048 [M + Na+J 1 9 2 5.6 5 6 2, found, 1 9 2 5.6 5 3 9 得到之化合物8之物理資料如下。 ^I-NMR (D20, 3 Ot：) 7· 9 9 (2H, d, Fmoc), 7.7 9 (2H, d, Fmoc), 7.5 5 (4 H, m, Fm〇c), 5.15 (1 H, S, Man4-Hl), 5.0 6 (1H, d,
GlcNAcl-Hl), 4.9 5 (1H, s, Man4' -HI), 4.8 2 (1
H, s · Man 3 -HI), 4.6 9 (1 H, d, GlcNAc2-Hl). 4.6 7 (2H, d, GlcNAc5,5’ -HI), 4.53 (2H, d, Gal6,
6 4. 34 (1H, d, Man3-H2), 4. 27 (1H. d, Ma n4’ -1、12), 2.97 (1H. bdd, AsN~jSCH2), 2.76 (1H, dd，NeUAc7’ -H3eq), 2.61 (1H, bdd, AsN-jSCH 2)' 2- 1 5 (12H, sX4, 'Ac), 1.79 (1H, dd, NeuAc 7 * 'H3 a x) ; HRMS Calcd for C 7 8H 2,, NeN a 04 8 ^ + Na+] 1 9 2 5.6 5 6 2, found, 1 9 2 5.6 5 3 3 參考例6化合物9之合成 將参考例5中得到之化合物7(30mg，473/zmol)和牛血 '月白蛋白3mg溶解於HEPES缓衝溶液（50mM，pH6.0)6ml 34 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 中，加入洋刀豆（Jack Beans)而來之α _甘露糖；^酶1〇u。 在37 C下將該溶液靜置21小時後，凍結乾燥，之後用 HPLC(ODS管柱、2.0(/>x25Cm、展開溶劑為最初之15分鐘 為水、16分至30分鐘為水：乙腈: 〇至μ: 15、31 分至45分鐘為水：乙腈=85 : 15至80 : 20而成之梯度。 流速為3.0ml/min)純化，得到20mg目的化合物9。 得到之化合物9之物理資料如下。 ^-NMR (D2〇, 3 0Ό)
8.0 1 (2 H, d, Fmoc), 7.8 0 (2H, d, Fm〇c), 7 5 6 (4 H，m, Fmoc), 5. 0 0 (1H. d, GlcNAcl-Hl), 4.9 5 (1 H, s· Man4, -H1), 4. 84 (1H, s, M (1H, d, GlcNAc2-HI), 4.56 (1H, 1), 4.44 (1H, d, Gal6—HI), 4.11 a n 3 -Η 1), 4. 6 7 d, G 1 c NA c 5 -H (1 H, d d, M a n 4 ’ -H2), 4.07 (1H, dd, Man3-H2), 2.9 7 (1 H, bdd. A sN-^CH), 2.76 (1H, dd, NeuAc?' -H3eq) 2 62 an, bdd,AsN-,cH),,15a2H) 9 (2H, dd, NeuAc 7 ' -H3 ax) ； HRMS C a 1 c d ' for
Cr2H104NcNaO43 [M + Na+] 1 7 6 3.6 0 3 4, found, 17 6 3.6 0 7 4 參考例7化合物1 〇之合成 將参考例5中得到之化合物8(40mg 63()/zm〇1)和牛血 清白蛋白5g溶解於HEPES缓衝溶液（50mM,pH6.0)7.8ml 中，加入洋刀豆而來之α_甘露糖苷酶tase38u。在37〇c下 將該溶液靜置63小時後，凍結乾燥，之後用HPLC(〇DS 管柱、2.0 pX25cm、展開溶劑為最初之μ分鐘為水、16 为至30分鐘為水：乙腈= i〇: 〇至μ :丨5、η分至45分 35 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . ("年10月25日） 鐘為水：乙腈=8 5: 15至80·· 20而成之梯度。流速為 3.0ml/min)純化，得到30mg目的化合物10。 得到之化合物1 〇之物理資料如下。 lH-NMR (D20, 3 0^) 8. 0 1 C2H, d. Fmo c). 7.8 0 C2H, d, Fmo c), 7.56 (4 H, m, Fmoc), 5.2 3 (1H, s, Man4-Hl), 5.0 8 (1H, d, GIcNAcl-Hl), 4.5 3 (1H, d, Gal6-Hl), 4.3 2 (1H, dd, Man 3-H2), 4. 2 8 (1 H, dd, Man4-H2), 2.8 1 (1 H, b d d, As N-3 CH), 2.7 6 (1 H, dd, NeuAc7-H3e • Q), 2. 5 9 (1H, bdd, As N-0CH)，2. 1 3 (1 2H, s X 4,-Ac), 1.80 C1H, dd, Ne uAc 7H3 ax) ； HRMS Calcd
CijjHioeNeNaOq [M 十 Na 十]1763.6034, f 〇 u n d, 1 7 6 3.6 0 4 1 參考例8化合物11之合成 將化合物5(28mg，21.3" mol)和牛血清白蛋白1 〇11^溶 解於1^?丑8緩衝溶液（5〇111]^，？115.0,454以[)中，加入神經 氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio • Cholerae，198mU)。在37 C下將該溶液靜置20小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。將反應液用’hplc(ymc .Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=8〇 : 2〇、 流速為4mL/min)純化。之後用〇DS管柱 (C〇m〇sil75C18-OPN、15xlO〇mm、最初通入 h2〇 5〇mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物 ll(17mg、收率70%)。得到之化合物^之物理資料如下。 化合物11之簡單結構式在表2中表示。 315343D01修正版 36 1335920 第96128509號專利申請案 (99年1〇月25日 'H-NMR (3 Ot：) (5 7.9 1 Cd, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7.7 1 (d, 2H, J = 7. 5 H z , Fm o c), 7.5 1 (dd, 2 H, J = 7.5Hz, Fmoc), 7.4 3 (d d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c ), 5.12 (s , 1 H, Man 4-H- 1), 4. 9 9 (d, 1H, J=9.5Hz, G 1 c NA c 1-H-l), 4.9 2 (s , 1H, Man4’ -H-l), 4. 7 6 (s, 1 H, Man 3-H —1), 4. 5 8 (d, 1 H, J = 8. 0Hz, G 1 c NAc 2 -H- 1). 4. 5 5 (d, 1H, J = 8.4Hz, GlcNAc5’—H-l), 4_47 (d, 1 H, J = 7.8Hz, Gal6' —H-l), 4.34 (t, 1H, Fmoc), 4.2 4 (b d, 1H, J = 1.9Hz, Man3-H-2), 4.18 (bdd,
1 H, J = JL, 4H z，3. 3 Hz , M a n 4-H，2), 4. 1 1 (b d d, 1 H, J = 1. 4Hz, 3. 5Hz, Ma n 4 ' -H-2), 2.72 (bdd, 1H, J =3. 0Hz, 1 5. 7H2， AsN-^CH), 2.5 2 (b d d, 1 H, J = 8. 7 H z , 1 5. 7Hz, AsN-j3CH), 2.06， 2.0 5, 2.0 4, 1.89 (each s, each 3H, Ac);HRMS Calcd f 〇 r C7SHll0N6NaO4G [M + Na+] 1 8 3 7.6 4 0 2, found 1 8 3 7.6 4 7 1 參考例9化合物12之合成 將化合物6(20mg，9.4/zmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶 解於11£?丑5緩衝溶液（5〇111]^，？115.0,323#1〇中，加入神經 W . 氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio
Cholerae，141mU)。在37°C下將該溶液靜置18小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20x250mm、 展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、流速為 4mL/min)純化。之後用 〇DS 管柱（Cosmosil75C18-OPN、 15x100mm、最初通入H20 50mL、之後通入25%之乙腈， 使溶出）脫鹽，得到目的化合物12(13mg、收率76%)。確 37 315343D01修正版 1335920 . 第96128509號專利申請案 , , (99 年 10 月 25 日） 認仔到之化合物之結構為1H-NMR與標準。一致。 化合物12之簡單結構式示於表2中。 參考例10化合物13之合成 將化合物7(45mg，24/zmol)和牛血清白蛋白1刀叫溶 解於1^丑8緩衝溶液（5〇!11]\4，1)115.〇,82〇;^)中，加入神經 氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，134mU)。在37°C下將該溶液靜置14小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用hplqymc •Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20χ 250mm、展開溶劑為50mM乙酸铵水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Cosmosil75C18-OPN、15x100mm、最初通入 H20 50mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物 13(28mg、收率74%)。得到之化合物之物理資料如下。 化合物13之簡單結構式示於表2中。
38 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 'H-NMR (3 or) <5 7.9 2 (d, 2H, J = 7,5H2, Fmo c), 7.7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c ), 7.51 (d d, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7. 44 (dd, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5.10 (s, 1H, Man 4-H-l), 4.9 9 (d, 1H, J=9.5Hz, G 1 c NA c 1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4’ 一 H-l), 4. 7 6 (s, 1 H, Man 3-H -1)，4.5 8 (d, 2H, G 1 cNAc 2. 5* -H- 1), 4. 4 7 (d, 1 H, J = 8, 0 Hz, Ga ] 6’ -H- 1), 4- 3 5 (t，1H, Fmo c), 4.24 (bd, 1H, J = 1.9Hz, Man3-H-2), 4.11 (bs, 1 H, Man4* -H-2), 4.0 7 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.72 • (bd, 1H, J = 15.5Hz；AsN-/3CH), 2.52 (bdd, 1 H, J = 8. 7Hz, 1 5, 5Hz, As N-)SCH), 2. 0 6， 2. 0 4, 1.8 9 (each s, each 3 H, A c) ; HRMS Calcd for C 67Hg7NsNa〇4〇 [M 十 Na 十 1634.5608, found, 1634, 5 5 6 4 參考例11化合物14之合成 將化合物8(47mg,25 // mol)和牛血清白蛋白1.9mg溶 解於1^?丑8緩衝溶液（50111]\4，口115.0,840#1^)中，加入神經 馨氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio
Cholerae，369mU)。在37°C下將該溶液靜置37小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLCiYMC： Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 > 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=8〇 : 2〇、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Cosmosil75C18-OPN、15x100mm、最初通入 H2〇 5〇mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物 14(26mg、收率65%)。得到之化合物之物理資料如下。 315343D01修正版 39 1335920 第％1285〇9號專利申請牵 (99年10月25日^ 化合物14之簡單結構式示於在表2中。 jH-NMR (3 0X：) 57.92 (d, 2 H, J = 7. 5 Η z , Fmo c), 7. 7 i (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmoc), 7.5 1 (dd, 2H, J-7.5Hz, Fmoc), 7.4 3 (d d, 2H, J = 7.5H2, Fmo c), 5.12 (s , 1 H, Man 4 -H- 1), 4.9 9 (d, 1 H, J = 9.4Hz, G I c N A c 1 - H—1),
4.9 1 (s, 1H. Man4' -H-l), 4.7 7 (s, ι H, Man3-H —1)，4.57 (bd, 2H, GlcNAc2,5’ -H~l), 4.46 (d, 1H, J=7.5Hz, Gal6,-H-1), 4. 34 (t, 3H, Fmoc), 4.24(bst lH,Man4, -H~2), 4. 1 9 (bs, 1H, Man 4 —H-2), 2.7 2 (bd, 1H, J = 15.5Hz, AsN-/3CH), 2.5 2 (bdd, 1H, J=9.2Hz, 15.5Hz, AsN —j3CH), 2.0 6, 2.0 5, 1.8 9 (each s, each 3 H, Ac); HRMS Calcd for C67HS7N5Na〇40[M + Na 十]1634.5608， found, 1634.5644 參考例12化合物15之合成 將化合物9(32mg，18.4/z mol)和牛血清白蛋白2.5mg溶 解於1^?£8緩衝溶液（5〇111]^，卩115.0,713//1〇中，加入神經 鲁氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio
Cholerae,134mU)。在37°C下將該溶液靜置17小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸鍵水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Comosil75C18-OPN ' 15x100mm、最初通入 H2O50mL、之 後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物 15(13mg、收率52%)。得到之化合物之物理資料如下。 40 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99 年 10 月 25 化合物1 5之簡單結構式示於表2中。 ’ lH-NMR (3 0Ό) • <5 7.9 2 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7.7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 5 1 (dd, 2H, J = 7. 5H2, Fmo c), 7.4 4 (d d, 2 H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 5.0 0 (d, 1 H, J = 9.9Hz，GlcNAc 1-H-l), 4.92 (s, 1H, Man4’ -H-1), 4.7 5 (s, 1H, Man 3-H- 1), 4. 58 (d, 2H, J = 7. 5 Hz , G 1 cNAc 2, 5* -Η- 1), 4. 4 7 (d, 1 H, J = 7. 8Hz, G a 1 6 ’ -Η- 1), 4.34 (t, 1 H, Fmo c ), 4.10 (b d, X H, Man3-H-2), 4.0 7 (bs, 1H, Man4f -H-2), 2.7 2 (b Φ dd, 1H, J=15.5Hz, AsN-/3CH), 2.5 2 (bdd, 1H, J =9. 2Hz, 1 5. 5Hz, As N-j3 CH), 2.0 7, 2. 05, 1.8 9 (each s, each 3H, Ac);MS(Fab)，Calcd for C6iH88N5〇3., [M + H + ] 1 4 5 0.5, found, 1 4 5 0.3 參考例13化合物16之合成 將化合物10(28mg，16；tzmol)和牛血清白蛋白1.7mg溶 解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0,624//L)中，加入神經 氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio 鲁Cholerae，117mU)。在37°C下將該溶液靜置17小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用〇DS管柱 (Comosil75C18-OPN、15x100mm、最初通入 H2O50mL、之 後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物 16(14.6mg、收率68%)。得到之化合物之物理資料如下。 化合物16之簡單結構式示於表2中。 41 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） W-NMR (.3 0C) * (5 7.9 2 (d, 2 H, J = 7.5Hz, Fmoc), 7.7 1 (d, 2H, J = k 7. 5 H z , Fmo c), 7.5 0 (d d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmoc), 7.4 3 (d d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c ), 5.12 (s , 1 H, Man 4—Η—1), 4.9 9 (d, 1H, J = 9.5Hz, GlcNAcl—Η—1), 4. 7 7 (s , 1 H, Man3_H—l), 4.5 7 (d, 2 H, J = 7. 2 H z , GlcNAc2—I-I—1), 4.46 (d, 1H, J = 7.8Hz, Gal6-H -1)，4, 3 4 (t，1 H, Fmo c), 4. 2 2 (b d, 1 H, J = 2. 7 H z ,
Man 3-H-2), 4. 1 9 (b, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 15.5Hz, AsN-/3CH), 2.5 2 (bdd, 1H, J =9. 8 φ Hz, 15.5Hz, AsN-jSCH), 2.0 5 (s, 6 H, AcX2), 1.8 9 (s, 3H, Ac ) ; MS (Fab). C a 1 c d for C61H88Ns03 s [M + H+] 1 4 5 0.5, found, 1 4 5 0.3 參考例14 (5-乙酿胺-3,5,7-三去氧-7-IL-D-甘油-々_d_半 乳糖-2-唾液吡喃苷酸（7-氟唾液酸） 5-Ace tamide-3. 5,7 - t r ideoxy-?~f t uoro-^ycero — ¢-D — galac to — 2 — nonutopyrano sidonic acid 2 5之合成）
G 1 7 1 8 .OPiv
Piv〇J^^^〇Bn (1)化合物17之合成 乙酸酐（60ml)中溶解乙酸鈉（5g，69mmol)，加熱後加入 少里之D-半乳糖（G)(10g，55mm〇1)。加熱回流2小時後用 TLC (甲本.乙酸乙輯=5: 1)確認反應結束。回到室溫後在 反應溶液中，注入冰水3〇〇cc。過濾後收集沈澱物。將沈 澱物溶解於乙醇中（Hml)進行再結晶，得到9.〇g(收率41%) 315343D01修正版 42 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 化合物17。 ' (2)化合物18之合成 將化合物17(4.3g,l 1 mmol)溶解於二氯甲院（120ml) 後，在氬氣流下冷卻至-20°C。之後，在反應液中加入四氯 化錫（3.1g,12mmol)攪拌20分鐘後，加入苯曱醇 (2.3g，22mmol)使反應溫度回到室溫。用TLC(己烷：乙酸 乙酯=1 : 1)確認反應結束後，將反應溶液注入到飽和碳酸 氫鈉水溶液中，用二氯曱烷萃取。將二氯曱烷層用硫酸酐 _鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮。殘渣用乾燥器乾燥後，溶解 於經蒸德之甲醇（80ml)中，加入曱醇納（43 lmg，5.5mmol) 在氬氣流下攪拌。用TLC(乙酸乙酯：曱醇：水=10 : 5 : 1) 確認反應結束後，用陽離子交換樹脂IR-120(+)中和使反應 結束。過濾除去樹脂後，將溶液減壓濃縮。殘渣用乾燥器 乾燥後，溶解於吡啶（44ml)中，反應溶液冷卻至0度。反 應溶液中加入三甲基乙蕴氯（4.6g，38.5mmol)後，回到室 鲁溫後在氬氣流下攪拌1小時。用TLC(己烷：乙酸乙酯=2 : 1)確認反應結束後冷卻至0度後，加入甲醇使反應結束。 將反應溶液照原樣減壓濃縮後，殘渣溶解於乙酸乙酯中， 用飽和食鹽水溶液、水洗淨，用硫酸酐鎮乾燥乙酸乙酯。 過濾除去硫酸鎂後，將溶液減壓濃縮。殘渣用矽膠管柱層 析法（展開溶劑為己烧：乙酸乙酯=2 : 1)純化，得到化合物 18(2.8g，收率 58%)。 43 315343D01修正版 1.335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 化合物1 8
fOPiv PivOV^^^OAc 〇COCH2CI 2 0 (3)化合物19之合成 將化合物18(200mg，0.455mmol)溶解於二氯曱烧 (7.8ml)和吡啶（1.3 ml)中，加入氯乙酸酐（I55mg， 0.91mmol)，在氬氣流、-15°C下，邊擾拌使反應進行15分 鐘。確認反應結束後，用曱醇（5ml)驟冷氣乙酸酐，用甲苯 鲁邊共沸3次邊減壓濃縮。殘渣用乙酸乙酯萃取後，用飽和 食鹽水洗淨。有機層用硫酸酐鎂乾燥、過濾後濃縮。殘渣 用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烷=1: 4)純化，得到化合 物 19(收量 172mg，收率 73.5%)。 — (4 0 0MHz, CDC13) (5 7.3 7 - 7.2 9 (m, 5H, Ph), 5.3 9 (dd, 1H, J 2 = 8,0Hz, J2>3=10.4Hz, H-2), 4.8 9 (dd, 1H, J 3, 4 =
3. 4Hz, H- 3), 4. 8 9, 4. 6 2 (2 d, 2H, J = 1 2. 5Hz, OC H2Ph), 4. 5 3 (d, 1 H, H-l), 4. 3 7 (d d, 1 H, J 6a, 6b = 11.5Hz, J6u.s=6.0Hz, H-6a), 4.3 2 (dd, 1H, Jsbt5 = 6.6Hz, H-6b), 4.0 0 (m, 1 Η, H-4), 3.9 2 (s, 2 H, COC且2C1), 3.75 (dd，1H, H—5), 1·23, 1.19〔2s,
1 8H, COC (CHJ J 13C - NMR (4 0 0MHz, CDC 1 3) <5 1 7 8.3 3, 1 7 7.5 7, 1 6 5.9 2, (C = 0), 1 3 6.6 6, 1 2 8. 4 8, 1 2 8. 0 7, 1 2 7. 8 9 (P.h), 9 9.16 (C- 1), 7 2.8 2 (C- 3), 7 2.3 5 (C- 5), 7 0.9 2 (C-2), 70.49 (OC.H-2Ph), 6 7.2 9 (C-4). 6 2.3 0 (C-6), 4 0.4 0 (CO £H2C 1), 3 8.9 5, 3 8.8 0〔C〇£(CH3)3〕，27.14, 2 6. 9 8 CCOC (_ςΗ3)3〕 44 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 用1H-NMR，13C-NMR Bruker ① AVANCE 400 (書寫成 ' 400MHz)測定。.當溶劑為重氯仿時使用内部標準之三甲基 * 矽烷。使用其他重溶劑時以溶劑峰值為標準。化學位移表 示為6 (PPm)、結合定數表示為J(Hz)。石夕膠管柱層析法使 用 Merck Silicage 160，70-230mesh 或 230-400mesh、球狀 石夕膠使用關東化學公司製造之Silica Gel 60(Spherical)、反 應檢查用（以下為TLC)使用E.Merk公司製造之DC-Platten
Kieselgel60F254(Artl’ 05715)。高速液體層析法（HPLC) •之管柱使用Nacalai tesque公司製造之COSMOSIL 5C18-AR Packed Column($ 4.6x150mm)、分光螢光光度言十 使用 JASCO 公司製造之 FP-210 Spectrofluorometer。 (4)化合物20之合成 將化合物19(300mg ’ 〇.583mmol)溶解於二氣曱烧 (5.8ml)中，在氬氣流、-15°C下，邊攪拌邊加入二乙胺基磺 胺三氟（DASI>DAST加入1〇分鐘後回到室溫使反應進行 鲁1小時。用TLC確認原料消失’用甲醇（3ml)驟冷DAST後 減壓濃縮。殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烧=1 : 6) 純化，得到化合物20(收量211mg ’收率70%)。 45 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日') JH-NMR (4 0 0MHz, CDC13) δ 7.3 7 -7.2 7 (m, 5 Η, Ρ h), 5.31 (ddd, 1 Η, J3.F=1 4. 3Hz, J 3. /1 = 9· 6 9Hz, J 2· 3 = 9. 6 3 Η. ζ , Η-3), 5, 0 4 (dd, 1 Η, J j, 2= 7. 9 3 Η ζ , Η- 2), 4.8 6 (d, 1 Η, J = 1 2. 2Hz, OCH2P h), 4.6 0 (d, 1 Η, Η- 1), 4.59 (d, 1 Η, 〇0旦2?乜}，4.4 4 (d d d, 1 H, J 4. 5-9. 0 4 H 2 , J F = 5 0. 6Hz, H-4), 4. 4 3 (ddd, 1 H, J 6a, 6b= 12. 1Hz, J ea. 5=2. 4 1 H z, J 6a, ,,= 2. 2 3 Hz , H-6a), 4.2 4 (ddd,
1 Hf J6bS=5.67H?;，J6b> F=l. 2 8Hzt H-6 b), 3.9 3 ( s , 2H, OCOCHjCl), 3.7 5 (m, 1 Η, H-5), 1.25, 1.18 〔2 s, 1 8H, OCOC (CH3) 3〕 I3C-NMR (4 0 0MHz. CDC 1 3) (5 1 7 7.9 4, 1 1 7.4 3, 1 6 5.8 8 (C = 0), 1 3 6.3 4, 1 2 8.5 5, 1 3 8.2 3, 1 2 7.9 2 (Ph), 9 8.6 8 (C- 1), 8 7.3 5 (d, J 4, F= 1 8 8. 6 2Hz , C-4), 7 2.6 5 (d, J 2. K = 7.96Hz, C- 2), 7 2.0 5 (d, J 3, F= 2 0. 0 2 H z , C-3), 7 1.49 (d, J Si 1；= 2 3. 0 9 Hz, C- 5), 7 0.8 0 (OjCH2Ph), 6 2. 1 2 (C- 6), 4 0.3 0 (OCOC.H2Cl), 3 8.8 7 COCO£ (CH3)sD, 27.17, 26.92 [OCOC (C.H3) 3 ) •化合物2。一
OH 21 22 (5)化合物21之合成 將化合物 20(625111§，1.21111〇1〇1)溶解於曱醇（24.21111) 中’在氬氣流、-15°C下，邊攪拌邊加入甲醇鈉（13.1mg， 0.6mmol)。30分鐘後用TLC確認原料消失後，用陽離子 交換樹脂IR-120(+)中和（pH6-7)，過濾樹脂後減壓濃縮。 殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烷=1 : 4)純化，得到 46 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 化合物21(收量395mg，收率74%)。 Ή-NMR (4 0 OMHz, CDC13) 8 7.3 8 - 7.2 9 (m. 5H, Ph), 5. 1 8 (ddd, 1H, J 3l F = 14.8Hz, J3.4 = 9.51Hz, J2.3=8.99Hz. H-3), 4.90 (d, 1H, J = 11.7, OCHjPh), 4. 6 3 (d. 1H, OCH8Ph), 4.47 (ddd, 1H, J s. 6a= 2. 4 3 H z , J 6a t；= 2. 2 Η z , H-6a), 4.47 (d, 1H, Jl-2=7.7H2, H-l), 4.3 8 (ddd, 1H, J4,5=8,96Hz, J3i4=9-67Hz, J 4 p= 5 0. 8 H z , H-4), 4.23 (ddd, 1H, J6a,6b=12.〇P{z, JT6b,5=6.05Hz,
Jsb. ρ=1·26Ηζ, H-6b), 3.75 (m, 1H, H-5), 3.54 (m,
1H, J 2_ OH= 2. 7 0 Η z , H- 2), 1.27, 1.26 C2s, 18 Η, O
C〇C (CH3) 3〕 13C-NMR (4 0 0MHz, CDCl,) δ 1 7 8.1 7, 1 7 7. 9 4 (C = 0), 1 3 6.5 4, 1 2 8.54, 128.17, 128.12 (Ph), 10 1.31 (C-l), 8 7. 4 5 (d, J 4. P= 1 8 7. 3 9H2, C-4), 7 4.17 (d, J3 f=18.88Hz, C-3), 7 2,4 5 (d, J2,F=7.56Hz, C-2), 71.45 (d, J 5, F=2 3. 2 6 Hz , C-5), 71.09 (OC_H2Ph)> 6 2.44 (C-6), 3 8.9 0, 3 8.8 5 CO CO C (CH3) 3 ), 2 7.1 4, 2 6.9 9 COCOC (C.H3) 3 ： • (6)化合物22之合成 在〇度下溶解。比咬（22.2 " 1，〇.274mmol)之二氣曱烧 (370 y 1)溶液中滴入三氟甲烷磺酸酐（46/H，0.274mmol)， 15分鐘後，在0度下滴入溶解化合物21之二氯曱烷（lml)。 用TLC確認原料消失，用二氣甲烷將反應混合物稀釋。有 機層依次用碳酸氫納、飽和食鹽水、水洗淨，用硫酸酐鎮 乾燥後濃縮。殘渣再用真空泵乾燥後溶解於苯（lml)中，在 直氣流、室溫下加入豐氮化納（13mg，0.206mmol)、四錄
氯（57mg，0.206mmol)在40度下進行反應。2小時後用TLC 47 315343D01修正版 1335920 第961285〇9號專利申請案 • (99年10月25日） 確認原料消失後減壓濃縮。殘渣用乙酸乙酯萃取，用飽和 • 食鹽水、水洗淨，用硫酸酐鎂乾燥後濃縮。殘渣用矽膠管 柱層析法（乙酸乙酯：己燒=1 : 4)純化，得到化合物22(收 量 30_4mg，收率 95%)。 ^-NMR (4 0 0MHz, CDC13) <5 7.3 9 - 7.3 2 (m, 5H, Ph), 4.9 9 (ddd, 1H, J = 13.18Hz, J3i4=9.27Hz, J 2, 3 = 3. 8 7 Η z , H-3),
4. 9 3 (d, 1H, J = 1 2. 0 7Hz, OCH2Ph), 4. 6 7 (d, 1 H, J i. 2=1. 1 8Hz, H- 1), 4. 6 3 (d. 1 H, OCH2Ph), 4. 5 l Cddd, 1H, J6u, 6b=l 1. 9 5Hz, J 6S( 5= 2. 5 4 H 7,, JBar = 2.08Hz, H—6a), 4.2 3 (ddd, 1H, J6b 5=6. 14Hz, J 6b. f= 1- 1 4Hz, H-6b), 4.08 (m, 1 Η, H-2), 3.64 (m, 1H, H-5), 1.26〔2s, 18H, 〇C〇C (CHS)3〕 13C-NMR (4 0 0MHz, CDC13) <5 1 7 8.0 1, 1 7 7.6 8 (C = 0), 1 3 6.0 6, 1 2 8.6 3, 1 2 8.3 1, 1 2 8.1 4 (Ph), 9 7.2 5 (C- 1), 85.51 (d, J 4, f=1 8 3. 9 7, C-4), 7 2.01 (d, J s. F= 2 3 · 8 9，C - 5), 7 1.73 (d, J 3. P=1 8. 9 8. C~3) 7 0.5 7 (〇C.H2Ph), 6 2.4 2 (C-2, C~ 6), 3 9.0 8, 3 8.9 〇 COCOC. (CHS) j L 2 7.1 8, 2 6. 9 5 COCOC (C.H3) 3 )
(7)化合物23之合成 將化合物22(180mg，0.387mmol)溶解於曱醇（8ml)中’ 加入甲醇納（922mg，9.67mmol) ’在40°C下邊攪拌邊反應。 4.5小時後用TLC確認1斑點結束’用陽離子交換樹脂 315343D01修正版 48 1335920 第％128509號專利申請案 ^ (99年10月25日） IR_12〇( + )中和後，過濾、濃縮。歹h用石夕膠管柱層析法（乙酸 乙醋：己烷=1: 1)純化，得到化合物23(收量105 3mg，收 率 91.6%)。 ^-NMR (4 0 0MHz, CDC13), δ 7.40-7.3 (m, 5Η, Ph), 4, 9 6 (d 1 H, J = 1 2. 13 6a. 6b== 1 2. 1 9Ηε , J βη ¢¢.08=6.2 01-1^, H-6a), 3,8 9-3. 7 7 (m, 2 Η, H-3, H-eb), 3. 3 9 (m, 1 Η, H-5), 1 (d, 1H, ：,a,1.33HZ(H_1)i 4.69 (d, lH,OCH2Ph). 4.49(ddd> χ H> ,4^51 〇 6H,. Us=9.19HZ，J3.4=9‘20h；s，h_4)，4 〇2 (m, 1H, H-2), 3.9 3 (dddd, 1H,
2. 3 2 Hz, J
2. 3 1Hz, J 13C-NMR (4 0 0MHz, CDC13), δ 1 3 6.3 9, 1 2 8.6 2, 1 2 8.2 4, 1 2 7.8 3 (Ph), 98.63 (C-l), 88.19 (d, J4. ,==178. 91H2> C-4), 7 3.95 (d, J 5i P=2 5. 4 8Hz, C-5), 7 1.18 (OC.H2Ph), 71.16 (d, J 3> F= 1 9. 6 9Hz, C- 3), 6 4.4 8 (d, J2,p-8.42H2, C-2), 6 1.39 (C- 6) ’ (8)化合物24之合成 將化合物23(105mg ’ 〇.353mm〇l)溶解於甲醇（7mi)中， 加入乙酸酐（333// 1，3.53mmol)後，在氬氣流下加入催化 劑量之10%之Pd/C，氫取代後於室溫下攪拌。2小時後用 TLC確認原料消失，用活性炭過遽後濃縮。殘潰用石夕膠管 柱層析法（乙酸乙S旨：曱醇=5 : 1)純化，得到化合物24(收 量 57mg，收率 72%)。 49 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 • (99 年 10 月 25 日 ^-I-NMR (4 0 0MHz, D20), δ 5.23 (dd, 1Η, J12=2.69Hz, JJ F=i_44pj2 H —
. 1-a), 4.6 5 (ddd, 1H, J1iF=5 0.9 4Hz, J3,4 = 9.06H 2，J 4· s = 9 · 5 8 Η z，H—4 — a)，4. 4 7 (m, i h, h—2 — ct)， 4.4 3 (d d d, 1 H, 3 3 F=1 4. 2 8Hz, z, 3 = 4, 9 a z , H — 3 -〇;)，4.16 (m, 1H, H-5 — a), 3.95 (m, ‘2H, H—6a_a:, H-6 b-a), 2.14 (s, 3H, NHCOCH3~a) 13C-NMR (4 0 0MHz, D20),
<5 1 7 5. 2 7 (C = 〇-a)，9 3. 4 6 (C — 1 - a), 8 8. 3 0 (d, J • 4, F= 1 7 7. 〇 〇 H z , C — 4 — a), 69.91 (d, JSF=24.41Hz C-5-a), 6 7.6 0 (d, J 3, F= 1 8. 7 4 H z , c-3-a), 6 0.3 6 (C-6), 54.12 (d, J2.f^8.68Hz, C-2-a), 2 2. 3 1 (NHC0C.H3-Q!)
(9)化合物25之合成 將化合物 24(50mg，0.224mmol)丙酮酸鈉（123mg， 1.12mmol)和牛血清白蛋白（5rng)溶解於填酸納緩衝溶液 (lOOmM ’ pH7.5 ’ 3.4ml)中，之後加入唾液酸醛縮酶（50U) 在室溫下開始反應。24小時後將反應溶液凍結乾燥，溶解 于少量之水中，用陰離子交換樹脂管柱（AG l_X8， 20(MO〇mesli ’甲酸鹽型式）展開。通入300ml水後，用1M 曱酸溶出目的物後減壓濃縮，用凝膠過濾管柱（Sephadex G-15 ’水）純化’得到化合物25(收量40mg，收率58.9%)。 50 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年1〇月25日 !H-NMR (4 0 0MHz, D20), δ 4.6 1 (d d, 1H, J7. 8=8. 9 7Hz, J 7, F = 4 5. 5 6 H 2 , H -7), 4. 18 (dd, 1H, J. 6=10.63Hz, J 6> F= 2 9. 8 6 H z , H-6), 4. 1 5 (m, 1 Η, H-4), 4.0 7 Cm, 1 Η, H - 8), 4. 0 2 (dd, 1H, s=l 0. 1 OHz, H-5), 3.9 0 (d d d, 1 H， J9a9b=l 2. 1 8Hz, J 9ai 8= 2. 7 7H z , J 9 (1i K= 2. 8 6 Η z , H-9a), 3.76 (ddd, 1 H, J 9 b. 8= 5. 3 3 H z , J 9b> Jf= 2. Ο 6H z , H- 9 b), 2. 4 0 (d d, 1 H, J 3ax= 1 3. 0 0 , J 3ca. 4 = 4. 8 8Hz, H-3 e q), 2. 1 5 (s, 3H,〇C〇CH3)，2.00 (dd, 1
H，J3ux. 4=11·70Ηζ，H—3ax), 13C-NMR. (4 0 OMHz. D20), δ 1 7 5.1 7. 1 7 3.6 8 (C = 0), 96.01 (C-l), 89.12 (d J7，f=179. 23Hz, C - 7)，69.67 (d, Jb' C —6), 6 8.31 (d, J 8i F= 2 6. 5 0 H z , C-δ), 6 7 2 6 (C-4), 6 2.7 0 (C-6), 52.17 (C-5), 3 9.19 (〇-3) 2 2.61 (NHC0C.I-I_3), ’ 參考例15(5-乙酿胺-3,5,8-三氧基_8_氣心甘油-点办半乳 糖-2·唾液吼喃苷酸（8-氟唾液酸） 5-Ace tami de-3, 5, 8-t r ide〇x -glycero-0^D-galact〇-.2. n〇nul〇pyranos i d ο n i c acid 2 7 之合成） 根據下述流程圖從唾液酸（2 6 )人 氧基-8-氟-D-甘油-β -D-半乳糖j 成5-乙醯胺_3,5,8- 唾液吨喃苷酸（27) 315343D01修正版 51 1335920 第96128509號專利申請案 (99年1〇月25曰
OjH HO 26
BnO?H 〇Me Bn〇^S^co2rwe ΒπΟ d
C
Bn9JH orv
BnO
BnO C02m〇
27 8-氟唾液酸之NMR資料如下。 ^-NMR (4 00MHz, D20),
$ 4.69 (dddd, 1 H, J 8. ?= 4 8. 7 H z , J e. 9 〇== 5. 〇 H z , J 8. 9b=3. 5Hz, H-8), 4.0 3 (ddd, 1 H, J 4. s = 1 〇. 0 H z , J 3", 4=1 1. 1Hz, J 3e,. 4 = 4- 7Hz, H-4)，3. 9 5 (dd, 1H. J4 5=1 0. 0Hz, J&. $=9.9Hz, H-5), 3.94 (d d d, 1 H, J87=〜0Hz, J 7, 8=6. 8Hz, J 7, F =1 4. 0Hz, H-7), 3.8 8 (ddd, 1H, J 9a9b= 1 3. 3Hz, J9e 8=3.5Hz, J9biF=2 8.0Hz, H-9b), 3.8 6 (d d , 1 H, J 5i 6== 9. 9 H z , Je,7=〜 0Hz, H-6), 3.7 2 (ddd, 1 H, J 9ili 3 b= 5. 3 3 H z , J 9(t. 8 = 5 0 H z , J j a 3 0.6Hz, H—9 a), 2.2 8 (d d, 1 H, J 3«.·«ι,
= 13 00，J3eq,4~^-6Hz-> H-3eq), 2.05 (s, 3H, A 3 a x · c), 1.87 (dd, 1H，J3ax 4=ll.lHz, J3cq.a”=13-00， H- 3 a x) 參考例16 (5-乙醯胺-3，5，9-三氧基-9-氟-D-甘油-石-D-半乳糖_2_唾液吡喃苷酸（9·氟唾液酸）
如《mide-3, 5, 9-t r i deoxy—9-f Iuoro_D 5 - A c e t a ,,〇 — β—D — ga 1 ac to—2—nonu 1 opyr ano s -glycef° cid 28之合成） i d 〇 π i c 述流程圖從唾液酸（26)合成5-乙醯胺-3，5，9- 根據r 52 315343D01修正版 1.335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 三氧基-9-氟-D-甘油-石-D-半乳糖-2-吡喃苷nic酸（28)。
參考例17 CMP-唾液酸之合成
7F：R = F, R' " R"=OH 7F:R = F, R' = R"»OAc 8F：R R'^OH, R' - F 8F：R « ff'-OAc, R' = F 9F：R= R' =〇H, R"«F 9F:R= R' =OACr RU«F R，_ R"*OH OH：R= R' ° R''-ΟΗ
將（a) (1) Dowex 5 0 —X 8 , M e 〇H, (2) A c 2〇，60%1-ICl 〇4 ; (b) (1) ΙΗ-Te t r az o 1 e, CH3CN, (2) t -B uOOH, CH3CN, (3) DBU, CH3CN, (4) NaOMe, McOH, H20 唾液酸（〇.〇74mmol)溶解於蒸餾曱醇（3ml)中，在氬氣流室 溫下邊擾拌邊加入Dowex-50W-X8(65mg)，反應3小時。 確認反應結束後，過濾、減壓濃縮。將殘渣溶解於乙酸酐 (200/zl)中，在-20°C下邊攪拌邊加入乙酸酐：60%高氯酸 =15 : 1溶液（22/z 1)，在10°C下反應40分鐘。確認反應結 束後，將反應液用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫鈉洗淨。 有機層用硫酸酐鎂乾燥，過濾後減壓濃縮，得到含羧基經 保護之唾液酸（29)之殘渣。將殘渣和CMP-5’-亞磷醯胺衍 53 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 生物（30)(0.23mmol)與苯各自共沸3次，各自溶解於蒸餾 之乙腈（100 /z 1)中混合。在氬氣流下，在冰水中邊擾拌邊 加入1H-四0坐（17mg，0.23mmol)。5分鐘後回到室溫，再 反應10分鐘。確認反應驟冷後，用乙酸乙酯將溶液稀釋， 用飽和碳酸氳納、飽和食鹽水洗淨。有機層用硫酸針鎮乾 燥，過濾後在30°C下濃縮，再用曱苯共沸2次除去水。殘 潰中加入經蒸德之乙腈（400 // 1)，在氬氣流下邊用冰冷卻 邊滴入2.5M之t-BuOOH曱苯溶液（290μ 1)。5分鐘後回到 鲁室溫，再攪拌20分鐘。確認反應結束後，滴入二曱基硫（53 # 1)攪拌10分鐘後驟冷t-BuOOH。之後，滴入DBU(18 //1)在室溫下攪拌20分鐘。確認反應結束後，加入甲醇 (0.671111)、水（1.351111)、曱醇納（36〇111§)在室溫下反應16小 時。確認反應結束後用水萃取，用二氯曱烷洗淨。25°C下 將水層減壓濃縮至8ml左右。將該水溶液用Sephadex G-15(1.8(Dx90cm)之凝膠管柱層析法（展開溶劑：20mM氨 鲁水、流速·· 0.3ml/min)純化，得到CMP-唾液酸。 參考例18 CMP-7”-去氧-7”-氟-唾液酸之合成 除了以化合物（25)替代唾液酸之外，以與參考例17 — 樣之方法合成CMP-7”-去氧-7”-氟-唾液酸。NMR資料如 下。 'H-NMR (4 0 OMH z , 50mM ND4DCOa in D2〇）， 54 315343D01修正版 1335920
第96128509號專利申請案 (99年1〇月25曰J s 8.04 (d, 1H, J 5. 6=7. 6Hz, Η- 6), 6.2 0 (d, l'H, J 6, 〇=7. 6Hz , H-5), 6.06 (d, 1H， J 2. =4. 5Hz , H-1 *), 4.5 4 (d d, 1 H, ； 7.； 8- = 9. 5Hz, Jr‘F=45.9H2, H -7”)，4.42〜4,20(m，7H，H-2，，H-3，，H—4’，H-5, a, H—5’.b，H - 6”，H-8”)，4. 16 (ddd’.lH，Jn。。： 4. 7Hz, ：Γ4-,3”0Χ=1 1.3Hz，J4, s=10, 3Hz, H-4”)， 4.03 (dd. 1H, Js_. 4. = J5-‘6· = 1 0. 3Hz, H_S”)，3.9 1 (d d d., 1 H, _12,2Hz, Jg»n,8"=2.8Hz， J 9-a. p=2. 8Hz. H-9t, a), 3. 7 5 (ddd, 1 H, J 9-B> 9-b = 12.2Hz, Je-b, g« = 5，4Hz, Je，b.p:2.1Hz，H_9"b),
2.6 1 (dd, 1H, J 3-CQt 4» = 4. 7Hz, J Rcm= 1 3. 3Hz, H-•3” eQ〉，2. 14 (s. 3H，Ac), 1‘ 7 6 (ddd，1H, J3··" 4. = 11.5Hz, JRcm=13.3Hz, J 3-ex. 5. 6 H z . H-3M ax), 參考例19 CMP-8”-去氧-8’’·氟-唾液酸之合成 除了以化合物（27)替代唾液酸之外，以與參考例17 _ 樣之方法合成CMP-8’’-去氧-8”-氟-唾液酸。NMR資料如 下。 ^-NMR (4 0 0MH2, 5 OmM ND4DC03 i n D2〇), 3 8. 0 8 (d, 1H, JB. β=7. 6Hz, H-6), 6.2 0 (d, 1H, φ J6.5=7.6Hz, H-5), 6.09 (d, 1H, J 2-=4. 1H 2 , H-1’)，4. 9 0 (m. 1H, H—8”)，4. 4 2 (dd, 1H, J 3.· J a·, 4· -4. 9Ηζ·, H-3 '), 4.39 (dd, 1 H, 了 2.. =4, 1Hz , J ·. «·. 3'— 4. 9 Η z , H—2'), 4.31—4.28 (m, 3 H, H-4,, H -5* a, H-5* b), 4. 1 5 (ddd, 1 H, J,··. 3- 4. 4H z , 3*ax=l I- 5Hz, J4t 5^1 0. 5Hz, H~4n), 4. 1 0-3. 9 0 (m, 5Ht H-5”. H-6”，H-7”，H-9” a, H-9” b)，2.6 0 (dd, 1H，J 3- cq. 4-=4. 4Hz, J gein—1 3.1Hz, 1^-3^ eq), 2.13 (sf 3H, Ac), 1.7 7 (ddd, 1H，J 3- ΛΧ. Λ- = 11. 5H z, JeL.m^l 3. 1Hz, J3-8；t_ P=4. 5fiz， H-3” ax), 55 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 參考例20 CMP-9”-去氧-9”-氟-唾液酸之合成 除了以化合物（28)替代唾液酸之外，以與參考例17 — 樣之方法合成CMP-9”-去氧-9”-氟-唾液酸。 實施例1 以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二涎α2,3 糖鏈天冬醢胺（C卜1)及以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮 之2種單涎α 2,3糖鏈天冬醯胺（C1-2及C1-3)之合成 參考例2中得到之Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之 亞延糖鏈天冬酸胺中’用唾液酸轉移酶轉移CMP-唾液酸。 唾液酸轉移酶使用α 2,3轉移酶之市面上出售之大鼠 重組而.來之物質。 將參考例2中得到之亞延9糖（20mg ’ 10.1 μηιοί)溶解於 50mM 卡可基酸（cacodylicacid)緩衝液（pH=6.0，5ml)中後， 加入牛血清白蛋白（BSA ’ 5mg)。該溶液中加入CMP-唾液酸 (26mg，40.4μπιο1)、驗性填酸酶（Alkaline phosphatase)(5pl，
125unit)使均一化。最後，加入α2,3-唾液酸轉移酶（<2 2,3-Sialyltransferase)(CALBIOCHEM 公司製造、100μ1)在 37 °C下靜置48小時。用HPLC監視反應，當原料減少至目的 量時結束反應，用HPLC分取管柱純化時(YMC-PackR5 D ODS，D-ODS-5-A，20x250mm，AN/25mM AcONH4 buffer=18/82，7.5ml/min.，wave length ; 274nm) ’ 25 分鐘後 溶出二涎11糖化合物（Cl-1)，30分鐘、34分鐘後各自溶出 單涎10糖化合物（C1-2)及（C1-3)。各自分取後，脫鹽處理， 之後進行凍結乾燥，化合物卜2、3各自得到0.7mg(2.7%)、 1.9mg(8.3%)、3.5mg(15.3%)。各化合物之 NMR 資料如下。 56 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 化合物（C 1 一 1) ， *H NMR (4 0 0MHz. DsO. 3 0t：, HOD = 4.8 1) ， δ 7.9 0 (d, 2H, Fmo c), 7.6 9 (d, 2 H, Fmo c), 7.4 9 (dd, 2H, Fmoc), 7.4 2 (dd, 2 H, Fmo c). 5.10 (s, 1 H, Man4-Hl), 4.9 7 (d, 1 H, G 1 cNAc 1 -H 1), 4.9 1 (s, 1 H, Man4' —H— 1), 4.5 0 — 4.6 0 (m, 4 H), 4.3 4 (1H, Fmo c), 4. 2 4 (b s , 1 H, Ma n 3 -H2), 4.18 (b s , 1H，Man4-H2), 4_10 (m. 2H), 2.74 (m, 3H, Asn-β CH, NeuAc7, 7* —H3eq), 2.4 0 - 2.6 0 (m7 1H, A s n -/3CH), 2.0 5, 2.0 3, 2.0 2 (each s, Ac), 1.7 7 (dd,
2H, Ne uAc 7 , 7' -H3 a x). 化合物（C 1 一 2) JH NMR (4 0 0MHz, D20, 3 Ot：, HOD = 4.81) 6 7. 9 0 (d, 2H, Fmo c), 7.6 9 (d, 2 H, Fmo c), 7.4 9 (d d, 2 H, Fm o c), 7.42 (dd,-2H, Fmoc), 5.10 (s , 1 H, Ma η 4-I-I 1), 4. 9 7 (d, 1H, G 1 cNAc 1-H1), 4. 9 0 (s, 1 H, Ma n 4’ —H- 1), 4.4 7-4.6 0 (m), 4.43 (d, 1 H), 4.3 2 (1H, Fmo c), 4.2 2 (b s, 2I-I), 4.17 (b s, 1 H, Man4-H2), 4.06-4.13 (m, 2H), 2.7 2 (ra, 2 H, Asn -/3CH, Ne uAc 7-H3 e q), 2.5 0 - 2.6 0 (m, 1 H, Asn-
β CH), 2.0 5, 2,0 3, 2.0 1 (each 1H, NeuAc7-H3ax). s, Ac), 1.7 7 (d d, 57 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請索 . (99年10月25日） 化合物（C 1 一 3) • 'H NMR (4 0 0MHz, D20, 3 0C. HOD = 4. 8 1 ) 6 7.9 0 (d, 2H, Fmo c), 7.6 9 (d, 2H, Fm〇c), 7.4 9 ψ (d d, 2 H, Fmo c), 7.4 2 (d d, 2 H, Fmo c), 5.10 ( s , 1 H, Man4-Hl), 4. 9 7 (d, 1 H, G 1 cNAc 1-H1), 4.9 0 (s. 1H, Man4,-H-1)> 4. 50-4. 60 (m), 4. 45 (d, 1 H), 4. 3 3 (1H, Fmoc), 4. 2 2 (m, 2H), 4. 1 7 (b 5 , 1 H.
Man4-H2), 4.0 9 (m, 2H), 2.74 (m, 2H. Asn-j8CH,
Ne uAc 7-H3 eq), 2.4 5- 2.6 0 (m, 1 H, Asn-jSCH), 2.0 5, 2.0 3, 2.0 2，2.0 0 (each s. Ac), 1.77 (d d, 1 H, Ne uA c 7 -H3 a x)
NeuAc〇f2-^3Gal J3 I-^4GlcNAc0 J*2Manalx
Man)3 l^^lcNAci? l-^4ClcNAc^Asn-Fmoc 3
NeuAc 〇f2-«-3(；a】β 1—-4GlcHAcj? l«^2Man a J〆 (C 1-1)
Gal β 1^401 cNAci3 l-^2Han a lv 6 qManfl l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc"**Asn-Fni〇c
NeuAc a 2-*- 3Ga 1 β 1 4C1 cNAc β 1-*- 2Man a r (Cl-2)
NeuAc «2+3Gal /3 l-MGlcNAcfi l+2Man λ
ManjS l-^4GlcfiAc j8 3-^4G]cNAc-^Asn-Fmoc
Gal β 1-^4G1cNAc0 l-»-2Han a (C 1 - 3) 實施例2 實施例1中得到之化合物（Cl-2)(2mg，0.88/zmol)和牛 血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0) 100 A 1中’加入冷-半乳糖苷酶（生化學工業公司製造、來自Jack
Beans’ 5//L，100mU)。將該溶液在37°C下靜置15小時後， 用膜濾器過濾。濾液用HPLC(ODS管柱、2.0d>X25cm、展 開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82:18、流速7.5ml/min) 58 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 * (99年10月25日） 純化後，濃縮溶劑，之後;東結乾燥。將殘留物溶解於200 // 1水中，用ODS-管柱層析法（Cosmosil75C18-opn、最初用水 ψ 洗淨，之後用25%乙腈水溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目 的化合物（C2)0.5 " g。NMR數據如下。 'H NMR (4 0 0MHz, D20, 3 OX：, H〇D = 4. 81) <5 7.9 0 (d, 2H, Fmo c), 7.6 9 (d. 2 H, Fmo c), 7.4 9 (dd, 2 H, Fmo c), 7.4 2 (d d, 2 H, Fmo c), 5.10 (s, 1 H, Man4-Hl). 4.9 8 (d, 1H, GlcNAcl-Hl), 4.9 0 (s, 1 Η, M a n 4 ’ -H-1)，4. 5 0 — 4. 6 0 (m〉，4.3 3 (1 H,
Fmo c). 4.2 2 (m, 2H), 4.17 (b s , 1 H, Ma n 4 -H2), 鲁 4. 1 0 (m, 2 H), 2.7 4 (m, 2H, A s n - i3 CH, N e u A c 7 - H 3 e q), 2. 4 5 - 2. 6 0 (m, lH,Asn-j3CH), 2.05, 2.03, 2.01 (each s, Ac), 1.7 8 (d d, 1 Η, N e u A c 7 - H 3 a x)
GlcNAc01-^2Man〇ily 3ManjSl-^4GlcNAcfi l-^4GlcNAc-^Asn~Fraoc
NcuAca2-*-3Gal β I-*-4GJcNAc/3 J^-2Man ^ (C2) 實施例3 實施例2中得到之化合物（〇2)(1.8111呂，0.86#111〇1)和牛 血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0)90 中’加入N-乙酿基- /3-葡糖胺酶（Sigma-Aldrich公司製 造、來自Jack Beans)4/z l(250mU)。將該溶液在37。(：下靜 置24小時後，用膜濾器過濾。濾液用hplc(ODS管柱' 2J〇x25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82 : 18、流速7.5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後凍結乾燥。 將殘留物溶解於200// 1水中，用〇DS-管柱層析法 (C〇Sin〇sll75Ci8-〇pn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水溶 液洛出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C3)0.9#g。 59 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年1〇月2S日 NMR (4 0 0MHz, DzO, 3 Ot：, HOD = 4. 8 1) <5 8.0 1 (d, 2H, J = 7. 6, Fmo c). 7.8 0 .(d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7.6 0 (d d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c ), 7.5 3 (d d, 2 H, J = 7. 6, Fmoc), 5.21 (s, 1H, Man4~Hl), 5.09 (d, 1H, J = 8.8, GlcNAcl—HI), 5.00 (s , 1H, Man 4' -H- 1), 4. 8 7 (s, 1 H), 4. 6 0-4. 7 8 (m, 5H), 4.4 0 -4.50 (bm, 2H), 4. 3 4 (s, 1H), 4. 2 8 (b s , 1H, Man 4-H2), 4. 2 0 (d d, 1 H, J a = 3. 0, J b = 9. 9), 2.80-2.95 (m, 2H, A s n -/3 CH,，Ne u A c 7-H 3 e q), 2.65-.2.7 5 (m, 1H, As n-j3CH), 2.16. 2.14, 2.12 (each
s, Ac x 3), 1.9 8 (s , 3H, Ac), 1.89 (dd, 1 H, J a = 12.1, Jb=11.9, Ne uAc 7-H3 a x).
Maxi a lv 6 ^Man β l-^4G]cNAc β I-^-4GlcNAc"^A5n-Finoc NeuAca2-^3Gal β l-^4ClcNAc/3 l-*-2Man a 1X， (C3) 實施例4 實施例3中得到之化合物（匚3)(0.81^，0.42/^111〇1)和牛 春血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0)50 中’加入a-甘露糖苷酶（Sigma-Aldrich公司製造、來 自Jack Βαη8)30#1(2·9υ)。將該溶液在37T：下靜置63小 時後’用膜濾器過濾。濾液用HPLC(ODS管柱、2.0φχ 25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速7.5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後凍結乾燥。將殘 留物溶解於200/zl水中，用〇DS-管柱層析法 (CosmosimCwopn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水溶 液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C4)〇,6eg。 60 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 - (99年10月25日） NMR (4 0 0MH2, Dz〇, 30〇C, HOD = 4.8l) • δ 8.0 0 (d, 2H, J = 7.2, Fmoc), 7.7 9 (d, 2 H, J = , 7.2, Fraoc), 7.59 (dd, 2H, 3=7.2, Fmoc), 7.5 2 (d d, 2H, J = 7.2, Fmoc), 5.2 1 (s. 1H, Man4-Hl), 5.0 9 (d, 1H, J = l〇.〇, GlcNAcl-Hl), 4.60-4.75 (m,), 4.4 0-4.5 0 (m, 2H), 4.32 (bd, 1H, J = 2. 3), 4.28 (bs, 1H), 4.22 Cbdd, 1H, Ja=9.7, Jb = 2.8,
Man4~H2), 2.8Ό-2.95 (m, 2 H, Asn^0CH, NeuAc 7-H3eci), 2.6 0 -2.7 5 (m, 1 H, A s n -/3 CH), 2.14, 2.14, 2.12 (eachs, Acx3), 1.98 (s, 3 H, Ac), 1.8 • 8 (dd, 1H, Ja=12.1, Jb=12.0, N e u Ac 7-H3 a x).
Man0 l-^4GlcNAci3 ]-^-4GlcNAc-^Asn-Fnj〇c
NeuAc o：2—*3Gal 0 l_4GlcNAc 01.2Man a 〆 (C4) 實施例5 實施例1中得到之化合物（(：1-3)(111^，0.44#111〇1)和 牛血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， pH5.0)50/^1中，加入/3·半乳糖苷酶（生化學工業公司製 隹造、來自Jack Beans，5 /z L，100mU)。將該溶液在37°C下 靜置15小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC(ODS管柱、 2.0Φ x25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82 : 18、流速7.5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後凍結乾燥。 將殘留物溶解於200// 1水中，用ODS-管枉層析法 (Cosmosil75C18-opn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水溶 液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C5)0.3/zg。 61 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 * (99年10月25日） JH NMR (4 0 0MHz, D20, 3QV, HOD = 4.81) δ 8. 0 1 (d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 8 1 (d, 2 H, J = ’ 7. 2, Fmo c), 7,60 (d d, 2 H, J = 7. 2, Fmo c), 7.53 (d d, 2 H, J = 7. 2, Fmo c ), 5.2 1 (s, 1 Η, M a n 4 - H 1), 5.0 9 (d, 1H, J = 9.6, GlcNAcl-Hl), 5.0 2 (s, 1H,
Man4* -H-l), 4,5 5-4.7 0 (m), 4.44 (1H, Fmoc), 4.3 0 -4.3 8 (bm, 2 H), 4.2 8 (bd, ll-I, Man4-H2), 4. 1 7-4. 2 5 (m, 2H), 2.7 8 - 2.9 5 (m, 2H, A s η- 0 CH,
NeuAc 7—H3eq), 2. 5 5 — 2. 7 0 (m, 1H, Asn — /3CH), φ 2.16, 2,15，2.14，2.12 (e a c h s , 1 2H, Ac x 4), 1.9 8 (s, 3H, Ac), 1,89 (d d, 1 H, J a= 1 2. 2, J b = 12.0, NeuAc7—H3ax).
NeuAc a 2-^3Gal β ]-^4GlcNAc )3 l-*-2Man o lv 6
Man/31-^-4GlcMAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
GlcMcjS l*^2Manor〆3 (C 5) 實施例6 實施例5中得到之化合物（C5)(1.0mg，0.48//mol)和牛 •血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0)50 //1中’加入N-乙驢基- /3 -葡糖胺酶（Sigma-Aldrich公司製 造、來自Jack Beans)4# l(250mU)。將該溶液在37。(：下靜 置22小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC(ODS管柱、 2.0Ox25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82 : 18、流速7.5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後凍結乾燥。 將殘留物溶解於200/zl水中，用〇DS-管柱層析法 (CosmosiHSCu-opn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水溶 液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C6)0.6/z g。 62 315343D01修正版 1335920 第96128509號粵利申請索 (99年1〇月25日i Ή NMR (4 0 0MHz, D20, 3 0*0, HOD = 4.8l) δ 8.01 (d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7.8 0 (d, 2 H, J = 7.6, Frao c), 7.6 0 Cd d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 7.5 3 (d d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 5. 1 9 (s, 1H, Man 4-HI), 5.0 9 (d, 1 Hf J = 9. 2, G 1 c NA c 1 -H 1), 5.02 (s, 1 H,
Man4’ -H-l), 4. 8 5 (s, 1H) 4. 5 8 -4. 7 5 (m, 5H), 4.38-4.48 (m, 2H, Fmo c), 4. 4 0 (b d, J = 2. 4, 1 H), 4,18-4.25 (m, 2H), 4. 1 5 (ra. 1H), 2.8 0 - 2.9 5 (m, 2H, Asn-j3CH, N e u A c 7-H 3 c q), 2.6 5 - 2.7 5 (m,
1 H, As n-jS CH), 2.16, 2,13, 2.12 (eachs, 9 H, Acx3), 1.98 (s, 3H, Ac), 1.89 (dd, 1 H, Ja = 12,2,
Jb = 12.0, NeuAc 7-H3 ax).
NeuAc o2-^3Gal 0 J-^4GlcNAcj3 J-*-2Manc \
Man0 l*^4GlcNAc 运 l+4GlcNAc+AsiHPinc)c
Man a (C6) 實施例7 實施例6中得到之化合物（〇6)(1.〇1^，0.53以111〇1)和牛 •血清白蛋白lmg溶解於HEPES缓衝溶液（50mM，pH5.0)50 中’加入α-甘露糖脊酶（Sigma-Aldrich公司製造、來 自：Tack Beans)10# l(〇.9U)。將該溶液在37。(：下靜置20小 時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC(ODS管柱、2.0φχ 25cm、展開溶劑為5〇mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速7.5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後束結乾燥。將殘 留物溶解於200// 1水中，用〇DS-管柱層析法 (CosmosimCwopn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水溶 液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C7)〇.5/Zg。 63 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 * (99年10月25日^ lH NMR (4 0 0MHz, D20, 3 0^, H〇D = 4.8l) ί 8.01 (d, 2 H, J = 7. 6, Fmoc), 7. 8 1 (d, 2H, J = 7.6，Fmo c), 7.6 0 (d d, 2H, J =7. 2, Fmo c), 7.5 3 (d d, 2 H, J — 7.6, Fmoc), 5.09 (d, 1H, J = 9.2, GlcNA c 1 -H 1), 5.01 (s , 1H, Man4* —H—1). 4.84 (s , 1 H), 4,5 5 —4.7 0 (m, 5 H), 4.4 4 (t, 1 H, J = 6. 0 , Fmo c ),
4. 3 0- 4· 3 8 (b s, 1H), 4, 1 5 — 4. 2 5 (m, 2 H), 4. 1 7 ( s， 1H), 2.8 0- 2.9 5 (m, 2H, Asn-i3CH, NeuAc7-H3e a), 2.5 5 -2.7 0 (m, 1H, Asn — ^CH), 2. 1 6, 2.13, 2.12 (e a c h s, Ac x 3), 1.9 8 (s , 3 H, Ac) 1.8 9 (d d, 1H. Ja=12.2, Jb=12.3, N e u A c 7-H 3 a x).
NeuAc a: 2. 3Gal β l+4GlcNAc β I«^2Man a 1、 ^Μδΐιβ l'#-4GIcNAcj3 l~^4GlcNAc~^Asn-Fmoc (C 7)
實施例7A 以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二涎（α2,6)(α 2,3)糖鏈天冬醯胺之合成 參考例3中得到之以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮 鲁之單涎糖鏈天冬醯胺（化合物2)中，用唾液酸轉移酶轉移 CMP-唾液酸。 唾液酸轉移酶使用a 2,3轉移酶之市面上出售之大鼠 重組而來之物質。 將參考例3中得到之化合物2(1.7mg，0.75μιηο1)溶解 於50mM卡可基酸緩衝液（ρΗ=5.0，85μ 1)中後，加入牛血 清白蛋白（BSA，lmg)。該溶液中加入CMP-唾液酸（4.8mg， 7.5 # mol)、驗性填酸酶（1 // 1，75unit)使均一化。最後，加 入a -2,3-唾液酸轉移酶（CALBIOCHEM公司製造、75/Z卜 64 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 34mU)在37°C下靜置3.5小時。用HPLC監視反應，當原 料消失時結束反應，反應液用膜濾器過濾。濃縮濾液使液 量減少後，用HPLC分取管柱純化（YMC — Pack R 5 D ODS，D-ODS-5-A， 20x250mm » AN/25mM AcONH4 buffer=l8/82 ’ 7.5ml/min.，wave length ; 274nm)，25 分鐘後 溶出化合物（C7A)。分取後，脫鹽處理，之後進行凍結乾 燥，得到化合物（C7A)1.3mg(67.8%)。化合物之NMR資料 如下。
JH NMR (4 0 OMFU , D20, 3 0*0, HOD = 4. 8 1) <5 8.0 0 (d, 2H, J = 7. 2, Fmoc), 7.7 9 (d, 2H, J = 7.2, Fmo c), 7.60 (dd, 2 H, J = 7. 2, Fm o c ), 7.52 (d d. 2 H. J = 7. 2, Fmo c), 5.2 1 (s, 1H, Man4-Hl), 5.0 9 (d, 1H, J = 8. 8, G 1 cNAc 1 -HI), 5. 0 3 (s, 1 H,
Ma.n4· -H-l), 4. 8 6 (s, 1H), 4. 5 8 -4. 7 2 (m, 5H), 4.5 4 (d, 1H, J = 8. 0), 4.3 8 -4,4 8 (m, 2H) 4.3 4 (b s, 1H), 4.28 (bs, 1H). 4.15-4.25 (m, 2H), 2.80-2.8 6 (dd, 1H, J a = 4. 4, J b = 1 2· 4，N e u A c 7-H 3 e Q), 2.7 3 - 2.8 3 (m, d d, 3 H, J a = 4. 4, J b= 1 2. 4. A s n — )3 CH, NeuAc7—H3eq), 2.6 0 — 2.7 2 (m, 1H, Asn —/3C H), 2.16, 2. 1 5, 2. 1 4, 2. 1 2 (each s, Ac x 5), 1.98 (s, 3H, Ac), 1.89 (dd, 1H, Ja=12.4, J b = 12.0, Ne uAc 7 -H3 ax), 1.81 (d d, 1 H, J a = 1 2. 4, Jb=12. 0, NeuAc7-H3ax).
NeuAc a 2-»-6Gal β I-^4GlcNAc β l-*-2Man α K 6 „ ^Man/3 l-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-*-Asn-Feoc
NeuAc a Z-^3Gal β 1—4C1 cNAc β ]-^2Man a ly
實施例7B 以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二涎（α2,3)(α 2,6)糖鏈天冬醯胺之合成 65 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 參考例3中得到之以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮 之單涎糖鏈天冬醯胺（化合物3)中，用唾液酸轉移酶轉移 CMP-唾液酸。 唾液酸轉移酶使用α2,3轉移酶之市面上出售之大鼠 重組而來之物質。 將參考例3中得到之化合物3(1.2mg，0.53# mol)溶解 於50mM卡可基酸緩衝液（pH=5.0，60 // 1)中後，加入牛jk 清白蛋白（丑8人，1〇1吕）。該溶液中加入€]\4?-唾液酸（3.4111舀， 隹5.3 // mol)、驗性填酸酶（1 /z 1，75unit)使均一化。最後，加 入α 2,3-唾液酸轉移酶（CALBIOCHEM公司製造、52.9#卜 24mU)在37°C下靜置3小時。用HPLC監視反應，當原料 消失時結束反應，反應液用膜遽器過濾。漢縮濾、液使液量 減少後，用HPLC分取管柱純化（YMC _ Pack R (5 D ODS， D-ODS-5-A 5 20x250mm j AN/25mM AcONH4 buffer=18/82 5 7.5ml/min.，wave length ; 274nm)，23 分鐘後溶出化合物 |(C7B)。分取後，脫鹽處理，之後進行凍結乾燥，得到各化 合物（C7B)l.lmg(81.2%)。各化合物之NMR資料如下。 2H NMR· (4 0 0MHz， D20， 3 Ot， H〇D = 4, 8 1 ) 66 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日) a 8.00 (d, 2H, J = 7. 6, Fmoc), 7.7 9 (d, 2 H, J = 7.6, Fmo c), 7.5 9 (d d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c ), 7.5 1 (d d, 2H, J = 7. 6, Fmo c ), 5.2 1 ( s , 1 H, Ma n 4 -H 1), 5.0 8 (d，1 H, J = 1 0. 〇, G 1 c NAc 1 -H 1), 5.0 0 (s , 1 H,
Man4’ -H—l), 4.84 (s, 1H). 4.6 0-4.7 2 (m，5H),
4.52 (d, 1H, J = 7. 6), 4.3 5-4.4 5 (m, 2H), 4. 3 3 (b s, 1H), 4. 2 7 (b s, 1H), 4. 15-4.25 (m, 2H), 2. 8 0-2.86 (dd, 1 H, J a = 4. 8 , Jb==12.4, NeuAc7—H3e q), 2. 7 3 -2. 8 3 (b s, dd, 3H, J a = 4. 8, J b = 1 2. 4, Asn-/3CH, Ne uAc 7-H3 e q), 2.6 0 - 2.7 2 (m, 1H, Asn-j3CH), 2. 1 5. .2. 1 2, 2.10 (each s , Ac x 5), 1.97 (s. 3H, Ac), 1.88 (dd, 1H, Ja=12.4, Jb = 12.4, Ne uAc 7 -H3 ax), 1.80 (dd, 1 H, J a = 1 2. 4,
Jb=12.4, Ne u Ac 7-H3 a x).
KeuAc a 2-^3Gal β l-^4GIcNAc jS l*^-2Man α 1χ 6 ^Man/3 1~^4G]cNAcj3 1-^-401 cNAc-^Asn-Fmoq
NeuAc o；2-^6Cal β l-^4GlcNAc/9 l-^2Man〇! 實施例8以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二7”·去氧 鲁-7”-氟-涎α 2,3糖鏈天冬醯胺（C8-1)及以Fmoc基保護天冬 醯胺之胺基氮之2種單7”-去氧- 7”-氟-延2，3糖鍵天冬酿 胺（C8-2及C8-3)之合成 用參考例18中得到之CMP-7’’-去氧-7”-氟-唾液酸以 外，以與實施例1 一樣之方法’得到下述所表示之以Fmoc 基保護天冬醯胺之胺基氮之二7”-去氧-7”-氟·涎α 2,3糖鏈 天冬醯胺及以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之2種單7，，-脫氧-7”-氟-涎α2,3糖鏈天冬醯胺。 315343D01修正版 67 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 7FNeuAc or2"^3Gal β l~^4GlcNAc β l-^2Mana; ly
Man0 l-^4G]cNAci3 l*^4GIcNAc-^Asn-Fmoc 7FNcuAc 〇f2*^3Gal Θ l-^4GlcNAc β 2Man a 1 (C 8 - 1)
Gai β 1—4GlcNAc β l-^2Man a lx
7FNeuAc a 2-»-3Gal j3 l-^4GIcNAc β l-^2Man α I
Man β J-^4ClcNAc β l-^4ClcNAc-^Asn-Fmoc (C 8 - 2) 7FNeuAca2*3Ga) 0 I-^4GlcNAc^ l-^2ManaIv
Mani31-^4GlcNAci3 l-**4GlcNAc-^Asn-Fnioc
Gal β l-^4G!cNAci9 l-*-2Manal^ (C8-3) •實施例9 以實施例8中得到之化合物（C8-2)替代實施例2之化合 物（C1-2)以外，同實施例2 —樣之方法，得到目的化合物（C9)。
ClcNAc^ l-^2MaDa Jv ' 6
Man/? l-^4GlcNAc/5 l-^4GlcNAc-^Asn-Fjnoc /3 7FNeuAca2-^3Gal β J-^4GlcNAc0 l-^-2Manar (C9) 實施例10 以實施例9中得到之化合物（C9)替代實施例3之化合物 (C2)以外，同實施例3 —樣之方法，得到目的化合物（C10)。
^Man β l~^4GlcNAc β 1-^4G1cNAc-^Ash-Fdioc 7FNeuAc a 2-*-3Ga) β l-^4GlcNAc β J-^2Man a (CIO) • 實施例11 以實施例10中得到之化合物（CIO)替代實施例4之化合 物（C3)以外，同實施例4 一樣之方法，得到目的化合物（C11)。
Man β !-^4GlcNAc β 1*4GIcNAc-^Asq-Piiioc 7FNeuAc o：2-^3Gal β 1^4G)cNAc β l-*-2ilan a r (C 1 1) 實施例12. 68 315343D01 修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25曰） 以實施例8中得到之化合物（C8-3)替代實施例5之化 • 合物（C1-3)以外，同實施例5 —樣之方法，得到目的化合 • 物(C12)。 7FNeuAc a2**~3Gal 5 l+4GlcWAc 卢 ^ManjS 1-*-4G1cNAc0 l-^4GlcNAc-*-Asn-Fmoc .6'lcNAcjS J-*-2Mana Γ (C 1 2) 實施例13 以實施例12中得到之化合物（C12)替代實施例6之化 籲合物（C5)以外，同實施例6 —樣之方法，得到目的化合物 (C13)。 TFNeuAc a2-*"3Gal /3 l-^4GlcNAc β l-^2Man a lv 'Man β 1-*·401〇ΝΑ〇 β 1-^-401 cNAc-^Asn-Fmoc /3
Man a (C 1 3) 實施例14 以實施例13中得到之化合物（C13)替代實施例7之化 鲁合物（C6)以外，同實施例7 —樣之方法，得到目的化合物 (C14) 〇 7FNeuAc tt2-*-3Gal β ]-**-4GlcNAc β l-^2Man a lv
Man β ]-*-4G3cNAc β ]-^4GlcNAc-^Asa-Fmoc (C 1 4) 實施例15以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二8’’-去氧 -8”-氟-涎a 2,3糖鏈天冬醯胺（C15-1)及以Fmoc基保護天 冬醯胺之胺基氮之2種單8”-去氧-8”-氟-涎a 2,3糖鏈天冬 醯胺（C15-2及C15-3)之合成 69 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 用參考例19中得到之CMP-8”-去氧-8”-氟-唾液酸以 外，同實施例1 一樣之方法，得到下述所表示之以Fmoc 基保護天冬醯胺之胺基氮之二8”-去氧-8”-氟-涎α 2,3糖鏈 天冬醯胺及以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之2種單8”-去氧-8”-氟-涎〇: 2,3糖鏈天冬醯胺。 SFNeuAcaZ+SGal 0 丨-MGIcNAc/3 i-^2Maual乂 6
Man0 l-^4GlcNAc B l-^4GlcNAc-^A.sji-Fraoc 8FNeuAca2-^3Gal /3 1^4G!cNAc^ i-^2Mana r (C 1 5 - 1) 該糖鍵天冬酿胺相當於式（1)之R1=R2 =式（2)、R=〇H、 R，，=F、R，，=OH。
Gal β I-*-4GlcNAc β l-^2Man a lv
Manj3 1-*-<1G1cNAc β l-^4GlcNAc-*-Asn-Fnioc 8FNeuAc a 2->-3Cal β 1—4GlcNAc β l-^2Man α Γ (C 1 5 - 2) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1 =式（3)、R2=式（2)、 R=OH、R，=F、R，，=OH。 RFNeuAc a 2-*-3Gal β l-^4GlcNAc β 1^2Man a lv
Man0 I+4GlcNAci3 l~^4GlcNAc+Asn-Fmoc y3
Cal 0 l-^4GlcNAc β l-^2Man a f (Cl 5-3) 該糖鏈天冬蕴胺相當於式（1)之R1=式（2)、R=OH、 R，=F、R，，=OH、R2=式（3)。 實施例16(實施例15之半乳糖加水分解反應） 以實施例15中得到之化合物（C15)替代實施例2之化 合物（C1-2)以外，同實施例2 —樣之方法，得到目的化合 物（C16)。 70 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
GlcNAc/3 l+2Man〇r ly
Man β l-^4GlcNAc β J-^4ClcNAc-^Asn-Fm〇c 8FNeuAc 〇：2^-3Gal β )-*-4GlcNAc/3 1—2Man a / (C 1 6) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1 =式（4)、R2=式（2)、 R=OH、R，=F、R’，=OH。 實施例17 (實施例16之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例16中得到之化合物（C16)替代實施例3之化合 物（C2)以外，同實施例3 —樣之方法，得到目的化合物（C17)。
Man a lv 6 ^Man β )-^4GlcNAc j3 I-^iClcNAc-^Asn-Fmoc 8FNeuAca2-*-3Gal β 1-^4G1cNAcj3 l-^2Man a (C 1 7) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1 =式（5)、R2=式（2)、 R=OH、R，=F、R，，=OH。 實施例18(實施例17之甘露糖加水分解反應）
以實施例17中得到之化合物（C17)替代實施例4之化 合物（C3)以外，同實施例4 一樣之方法，得到目的化合物 (C18)。
Man^ 1-^4GIcNAc0 l-^4GlcNAc-^AsD-Fmoc 8FNeuAca2-^3Gal β l-*^4GlcNAc β l-*-2Mana Γ (C 1 8) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1=H、R2=式（2)、 R=OH、R，=F、R，，=OH。 實施例19(實施例15之半乳糖加水分解反應） 以實施例15中得到之化合物（C15)替代實施例5之化 合物（C1-3)以外，同實施例5 —樣之方法，得到目的化合 71 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 物（C19) 〇 8FNeuAc a2-^3Gal β J-*-4GlcNAc β l-*"2Man a 1χ 6
Man/3 l-*-4GlcNAc)3 J-*-4GlcNAc-^Asn-Fm〇c y 3
GlcNAc/31-*-2Man〇r (C 1 9) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之RL式（2)、R=OH、 R’=F、R，，=〇H、R2=式(4)。 實施例20(實施例19之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例19中得到之化合物（C19)替代實施例6之化合 鲁物（C5)以外，同實施例6 —樣之方法，得到目的化合物（C20)。 8FNeuAco：2-^3Ga] 0 l-^4GlcNAc/3 I-^2Manalv ~ β
Man/3 l~^4G]cNAc β l-^dGlcNAc-^Asn-Finoc
Man a (C 2 0) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1==式（2)、R=OH、 R，=F、R，，=OH、R2=式(5)。 實施例21(實施例20之甘露糖加水分解反應） φ 以實施例20中得到之化合物（C20)替代實施例7之化合 物（C6)以外，同實施例7 —樣之方法，得到目的化合物（C21)。 8FNcuAca2*3Gal β 1-^4G1cNAcj3 l-*-2MaDa ]y 泛 i+4GlcMc jS i+4Gi cNAc+A-sn-Fnioc (C2 1) 該糖鏈天冬醯胺相當於式（1)之R1=式（2)、R=0H、 R’=F、R’，=OH、R2=H。 實施例22以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二9”-去氧 -9”-氟-涎α 2,3糖鏈天冬醯胺（C22-1)及以Fmoc基保護天 冬醯胺之胺基氮之2種單9”-去氧-9”-氟-涎α 2,3糖鏈天冬 72 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 醯胺（C22-2及C22-3)之合成 用參考例20中得到之CMP-9”-去氧-9”-氟-唾液酸以 外，同實施例1 一樣之方法，得到下述所表示之以上述 Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二9”-去氧-9”-氟-涎α 2,3糖鏈天冬醯胺及以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之2 種單9”-去氧-9”-氟-涎α 2,3糖鏈天冬醯胺。 9FNeuAc a2-^3Gal β 1-^-4GIcNAcj3 l-*^2Mana c
Man 0 ]-^4fiJcNAc β l*^461cNAc-^Asn-pjnoc y3 9FNeuAc a2-*-3Gal β 1-^4C1cNAc0 l-^2Mana r (C 2 2 — 1)
Gal 0 I—4GlcNAc W2Mana 9FNeuAc q：2-^3Ga] β l-^4GlcNAc/3 l-^2Mana (C2 2-2) S ManjS 1-^4C1cNAc5 l-^-4GlcNAc-^Asn-Fmoc 9FNeuAc a2-^3Gal $ l-^4GlcNAc β l-*-2Mana lv
Man β l+4GkNAc 0 l+4GlcNAc+Asn-Fnioc
Cal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a Γ (C2 2-3) (C22-1)相當於式（1)之 R1= R2=式（2)、R=OH、R’=OH、 胃R”=F之糖鏈天冬醯胺。 (C22-2)相當於式（1)之 R1 =式（3)、R2=式（2)、R=OH、 R’=OH、R”=F之糖鏈天冬醯胺。 (C22-3)相當於式（1)之 R1 =式（2)、R=OH、R’=OH、 R”=F、R2=式（3)之糖鏈天冬醯胺。 實施例23(實施例22之半乳糖加水分解反應） 以實施例22中得到之化合物（C22-2)替代實施例2之 化合物（C1-2)以外，同實施例2 —樣之方法，得到目的化 73 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 合物（C23)。 (C23)相當於式（1)之 R1 =式（4)、R2=式（2)、R=OH、 R’=OH、R”=F之糖鏈天冬醯胺。 G! cNAc /3 】+2Man a、 gMan<3 1^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^-Asn-Fmoc 9FNeuAc a2-^3Gal β l-*-4GlcNAc j3 l-^2Man a (C2 3) 實施例24(實施例23之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例23中得到之化合物（C23)替代實施例3之化合 籲物（C2)以外，同實施例3 —樣之方法，得到目的化合物（C24)。 (C24)當於式（1)之 R1:式（5)、R2=式（2)、R=0H、 R’=OH、R”=F之糖鏈天冬醯胺。
Man a ly ^MamS 1-*^4G1cNAcjS 1-*^4G1cNAc-*-Asd-Fhioc /3 9FNeuAca2-^3Gal j3 l-^4GlcNAc/3 l-*-2Man α r (C 2 4) 實施例25(實施例24之甘露糖加水分解反應） ^ 以實施例24中得到之化合物（C24)替代實施例4之化 合物（C3)以外，同實施例4 一樣之方法，得到目的化合物 (C25)。 (C25)相當於式（1)之 RkH、R2=式（2)、R=0H、R’=0H、 R”=F之糖鏈天冬醯胺。
Manj3 l-*^4ClcNAc)3 l-*-4GlcNAc^Asn-fmoc 9FNeuAc a2-^3GaI /3 !-*-4G!cNAcj3 l-»-2Man a (C 2 5) 實施例26(實施例22之半乳糖加水分解反應） 74 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 • (99年10月25曰） 以實施例22中得到之化合物（C22-3)替代實施例5之化合 物（C1-3)以外，同實施例5 —樣之方法，得到目的化合物 (C26)。 (C26)相當於式（1)之 RL 式（2)、R=OH、R’=OH、R”=F、 R2=式（4)之糖鏈天冬醯胺。 9FNeuAc a2"^3Gal β l"^4GlcNAc)S I^2Man a
Man B l*^4GicNAc^ l-^4G]cNAc*^Asn-Fiiioc 61cNAci3 l-^2Man cur (C2 6) 鲁實施例27(實施例26之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例26中得到之化合物（C26)替代實施例6之化 合物（C5)以外，同實施例6 —樣之方法，得到目的化合物 (C27)。 (C27)相當於式（1)之 R1==式（2)、R=OH、R’=OH、R’’=F、 R2=式（5)之糖鏈天冬醯胺。 9FNcuAc 3Cal β I-*^4ClcNAc β l-,,-2Man a
Man/3 ]-^4G]cNAc/3 l-^4GlcNAc-^-Asn-Fm〇c
Man a 1 (C 2 7) 實施例28(實施例27之甘露糖加水分解反應） 以實施例27中得到之化合物（C27)替代實施例7之化 合物（C6)以外，同實施例7 —樣之方法，得到目的化合物 (C28) 〇 (C28)相當於式（1)之 R1 =式（2)、R=OH、R’=OH、R”=F、 R2=H之糖鏈天冬醯胺。 75 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 9FNeuAc«2-*-3〇31 β l-^4GlcNAc/3 l-*^2Manu1v
Man/3 l-*-4GIcNAc/3 l-*^4GlcNAc-*-Asn-Fni〇c (C 2 8) 實施例29以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二7”-去氧 -7”-氟-涎（2-6)糖鏈天冬醯胺（C29-1)及以Fmoc基保護天冬 醯胺之胺基氮之2種單7”-去氧-7”-氟-涎（2-6)糖鏈天冬醯 胺（C29-2及C29-3)之合成 將參考例18中得到之CMP-7”-去氧-7”-氟-唾液酸，用 鲁市面上出售之大鼠肝藏而來之α 2,6轉移酶之唾液酸轉移 酶，除了將卡可基酸缓衝溶液之pH達到6.0以外，同實施 例1 一樣之方法，得到下述所表示之以Fmoc基保護天冬 醯胺之胺基氮之二7”-去氧-7”-氟-涎（2-6)糖鏈天冬醯胺及 以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之2種單7’’-去氧-7”-氟-涎（2-6)糖鏈天冬醯胺。（C29-1)至（C29-3)之化學式如下。 7FNeuAca2-^6Gal β 1~*^4G1cNAc0 J-*^2Mana ly 6Man0 I-*^4GicNAc)3 l-^4GIcNAc-^Asn-fmoc 7FNeuAc ot 2-^6Gal β l'*-4GlcNAc β l-^2Man a • (C2 9-1)
Gal β I-^4GIcNAc 0 l-^2Man a \ l-*^4G)cNAc j3 J-^^GIcNAc-*-Asn-FDioc 3 7FNeuAc a2-^-6Gal β l-^4ClcNAc 0 l-^2Man ct (C 2 9 - 2) 7FNeuAc a2-^6GaI β I^4GlcNAc 0 ]^2Man a ly 6 ^Manβ l*^4GlcNAcβ 1~*"4G1 cNAc~^Asd-Fdidc
Gal 0 l-^4GlcNAc β l"^2Man a (C 2 9 — 3) 實施例30 (實施例29之半乳糖加水分解反應） 76 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 以實施例29中得到之化合物（C29-2)替代實施例2之 化合物（C1 -2)以外，同實施例2 —樣之方法，得到目的化 合物（C30)。（C30)之化學式如下。
GicNAc 占 J+2Man or c
Man 0 l+4GlcNAc jS 〗-*-4GlcNAc—-Asn-Fin〇c 7FNcuAca2-*-6Gal β l-»-4GlcNAci8 l-*-2MaDci! r (C 3 0) 實施例31(實施例30之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例30中得到之化合物（C30)替代實施例3之化 •合物（C2)以外，同實施例3 —樣之方法，得到目的化合物 (C31)。（C31)之化學式如下。
Man a
Man β l-^4GlcNAc fi I-*-4GlcNAc-^Asn-Fnioc 7FNeuAc a 2 6Ga 1 )S 1+4G1 cNAc /3 l+2Man a 1〆 (C 3 1) 實施例32(實施例31之甘露糖加水分解反應） 以實施例31中得到之化合物（C31)替代實施例4之化 春合物（C3)以外，同實施例4 一樣之方法，得到目的化合物 (C32)。（C32)之化學式如下。
Man0 l"*^4GlcNAc^ l-^4GlcNAc-^Asn-Ftnoc 3 - 7FNeuAc〇r2+6Gal β l‘4GlcNAcβ l+2Manα 1〆 (C 3 2) 實施例33(實施例29之半乳糖加水分解反應） 以實施例29中得到之化合物（C29-3)替代實施例5之 化合物（C1-3)以外，同實施例5 —樣之方法，得到目的化 合物（C33)。（C33)之化學式如下。 77 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 7FNeuAc or 6Gal /3 I-MGlcNAc /31+2Man α I乂
Man β l-*^4GlcNAc β !-*-4GlcNAc-*-Asn-Fmoc
GlcNAc /3 I**~2Man a (C 3 3) 實施例34(實施例33之N-乙醯基葡糖胺加水分解反應） 以實施例33中得到之化合物（C33)替代實施例6之化 合物（C5)以外，同實施例6 —樣之方法，得到目的化合物 (C34)。（C34)之化學式如下。 7FNcuAca2-**-6Gal β l-^4GlcNAc/3 l-*"2Mana：Iv (i
Man β l+4GlcMc )3 l_4GlcNAc-*^Asn-Fmoc
Man a r (C 3 4) 實施例35(實施例34之甘露糖加水分解反應） 以實施例34中得到之化合物（C34)替代實施例7之化 合物（C6)以外同實施例7 —樣之方法，得到目的化合物 (C35)。（C35)之化學式如下。 7FNeuAc a2-^6Gal β 1"^4GIcNAcj3 2Man a lv 'c
ManjS l-^4GlcNAcj3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fm〇c (C 3 5) 實施例36至49 下面，根據同樣之方法，合成下述所表示之糖鏈天冬 醯胺衍生物。 78 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 8FNeuAc a2-^*6Gal β 1-^<1G1cNAc /3 l-^2Mana lv 〇
Manj3 l-^4GlcNAc β l-^4GlcNAc-*^Asn-Fraoc y 3 8FNeuAc〇：2-^6Gal β l-^4GIcNAcj3 l-^2Manarr (C 3 6 - 1)
Gal β l-^*4GlcNAcjS l-^ZMana 1\ y3 SFNeuAc a2-^6Gal β 1-^4C1cNAcj3 l-^2Mana r (C3 6 —2〉
4GlcNAcjS 1—^GicNAc+Asn-Fmoc
Man/31 SFNeuAc a2-*-6CaI 5 1-^4G1cNAc0 l-^2Man〇：l\ ^Man/3 l-^-4GlcNAc^ 1*^401 cNAc-^Asn-Fmoc
Cal β l-^4GlcNAci3 ]-^2Mano：l^ (C3 6-3)
GlcNAc^ l-^2Mana\ y3 8FNcuAc〇i2-^6GaI β l-»-4G]cNAc/31-^2Manal
Man J-^4GlcNAci? l-^^ClcNAc-^Asn-Finoc (C 3 7) 79 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
Man or 8FNeuAc〇；2-^6G3l β l-^4C!cNAc)3 ]^-2Mana! Ϋ(C 3 8)
ManjS I-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
Man)3 1-^4G1cNAc0 1^4GlcNAc-^Asn-Fmoc 8FNeuAca2 + 6Gal jS 1+4G1cNAc0 l‘2Mano:J;(C3 9) 8FNeuAca2-^6Gal B I-^4(；IcNAcj3 l-^2Manalx
Man B l-^4GlcNAc β 1-^4G1cNAc-*-Asd-Fdioc
EilcNAc/3 I-*-2Man〇fl·(C 4 0) 8FNeuAc a2*^6G£il 0 ]-*^4GlcNAc^ J-^2Mana 1\ Man a
Man/3 1-^4G1cNAc0 l*^4GIcNA<r^Asn-Fmoc (C4 1) 8FNeuAc 〇r2-^6Gal/3 1-^4G1cNAcj3 l-^2Manal^ ^Μίΐηβ l+4GlcNAc)3 】—4G]cNAc~^Asn-Finoc (C 4 2) 9FNeuAc a2—6Gal /3 l-MGlcNAc/31.2Man a、 c Man β ]-^4CicNAc 0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc y3 9FNeuAca2-^6Ga] β l-^4GlcNAc/3 l-^2Manar (C4 3— 1) 80 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
Gal β l-^4GlcNAc/3 l-^2Man a ly Μδηβ l-*^4GlcNAc/3 1-^4G1cNAc-^Ast)'-Fiu〇c 9FNcuAca2-^6Gal /3 l-^4GlcNAci3 l-^2Manal·^ (C 4 3 - 2) SFNeuAc 〇：2~^6〇31 β I-^4GicNAc0 l-^2Mana
Mane 1-^4G1cNAc5 l~^4GlcMc+Asn-F«i〇c
Gal /3 l-^-4GlcNAc β l-^2Mau a
(C4 3-3)
GJcNAc β l-^2Man a ]y ^Mani3 l-^-dGlcNAc^ i-^4ClcNAc^-Asn-Fin〇c 9FNeuAc a2*6Gal β l-^4ClcNAc/3 l^2Manar (C44)
Man a 1' I 9FNeuAca2-^6Gal β l-^4G]cNAcfi l-^2Mana
Man β l*4GlcNAc β l-^-4GlcNAc~^Asn-Fnioc (C4 5)
Man0 1-^4G1cNAc0 )-*^4CUcNAc"*,-Asn-Fmoc 9FNeuAcaZ-^6Gal β l-^4GlcNAc β 1-^ZMano： r (C4 6)
9FNeuAca2-^6Gal β 4(llcNAcM+2Manal\ I GkNAc β l+2Man a
Men 0 lNAc β l-^4GlcNAc-^-Asn-Fmoc (C4 7) SFNeuAc a 2*^6GaI β l-^4GlcNAc β l-^2Man α K Man a 1’ CC48)
Man 0 1+MGlcNAc β l—^GlcNAC'^Asn-Fnioc 9FNe uAc a 2+6Ga! /3 1+4G1 cNAc/3 a：】、 ^Man0 1-*-4G1cNAc0 l-^4C]cNAc-^Asn-Fn)〇c (C49) 81 315343D01修正版 1335920 第961285〇9號專利申請案 (99年1〇月25曰）
其中，代表例 8Fa -2,6-11 糖-Asn-Fmoc(C36-l)之 NMR 資料如下。 NMR (4 0 0MH2, D20, 3 Ot：, HOD = 4.8l) <5 8.0 1 (d, 2H, J = 7.4, Fmoc), 7.8 0 (d, 2H, J = 7. 4, Fmoc), 7.5 9 (d d, 2 H, J = 7.4, Fmo c), 7.5 2 (b d d, 2H, J = 7. 4, Fmo c), 5.2 2 (s，1H; Man4-Hl), 5.0 8 (d, 1 H. J =9. 4, G 1 c NAc 1 —HI), 5.0 5 (s , 1 H,
Man 4' —H— 1), 4.8 5-4.9 5 (m, 1H). 4.5 5 — 4.7 5 (m), 4. 5 3 (d, 1H, J =7. 9), 4.4 3 (m, 1 H), 4.3 5 (b s , 2H, Φ Ma n 3 -H2), 4.2 8 (b s , 1 H, Ma n 4 -H2), 4. 10-4.25 (m, 2H), 2.7 5-2.8 5 (m, 1H, Asn-j3CH), 2.63-2.7 . 0 (d d, 2 H, J a = 3. 9 , J b = 1 2. 0 , N e u A c 7 , 7’ —H3e q)，2.55 — 2. 65 (m, 11-1，Asn —)3CH), 2.16，2.11, 2.0 8 (e a c h s, 1 5H, Ac x 5), 1.8 4 (s, 3H, Ac), 1. 7 4 (dd, 1 H, J a = l 2. 3, Jb=12.2, N e υ A c 7-H 3 a x). 實施例50(糖鏈天冬醯胺衍生物之Fmoc基之脫保護） 在全部之糖鏈天冬醯胺衍生物中，根據下面之順序進 鲁行Fmoc之脫保護。首先，在糖鏈天冬醯胺Fmoc體每Ιμιηοΐ 中加入240μ1之Ν，Ν-二曱基甲醯胺、160μ1之嗎啉，在室 溫.氬氣氛下進行反應。之後用TLC(展開溶劑為1Μ乙酸 銨：異丙醇=8 : 5)確認反應結束後，用冰水冷卻。在該溶液 中加入反應溶液10倍量之二乙醚，攪拌15分鐘後，將析出 之沈澱物過濾。將得到之殘渣溶解於水中，在35〇c下蒸發 沈積物。再加入3ml曱苯後，反複進行3次蒸發沈積物之 操作。殘留物用逆相管柱層析法（匸〇灿08][175(318-0?]^、15父 100mm、展開溶劑為水）純化，得到對應之糖鏈天冬醯胺。 82 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 實施例51(糖鏈天冬醯胺之天冬醯胺殘基之除去） 將實施例50中得到之糖鏈天冬醯胺與無水肼反應 後，根據乙醯化除去天冬醯胺殘基，得到對應之糖鏈。 實施例52至69 在參考例2、3、8至13、實施例1至7中製造之各 Fmoc-糖鏈天冬酿胺2nmol，溶解於約10ml之Tris-鹽酸緩 衝液中。在該溶液中加入20nmol之GDP-岩蕩糖、0.5mU 之岩藻糖轉移酶（Fucosyltransferase) V (人類’重組物），在 鲁37°C下靜置2小時，進行反應。反應液用20ml之超純水 稀釋後，甩毛細管電氣泳動（fused silica capillary，50mm i.d.，60cm,buffer;100mM Tris-borate，pH=8.3，lOOmM Heptane sulfonate，施加電壓 27KV，溫度 25°C，214mm) 進行分離，得到各目的物。 各實施例之原料及目的物如下。 表1 鲁實施例52 83 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 原料
NeuAc a2-»-6Gal β l-*-4GlcNAc β l-^-2Mana 1·^
Gal β l-^4GlcNAc β l-*-2Man a ](化合物2) y3
ManiS 1-^401 cNAc/31-^4GIcNAc-^Asn-Fmo'c 目的物
Fuc a K 3
NcuAc a2*^6Gal β l-»-4GlcNAc j3 l-^'2Man a lv
Man /3 l-^4GlcNAc β l-*^4G[cNAc"^Asn-Fmoc f
Gal β 1—4GlcNAc)91—2Manar y3
Fuc a v Fuc <x K 3
NeuAc a 2-^6081 β l-^4GlcNAc β l-»-2Man a 1·^ y3
Man)3 I-^4GlcNAc j3 1-^40cNAc-^Asn-Fnjoc
NeuAc a 6Gal B 1^401 cNAc β i-^2Man a
Gal β 1^4GlcNAc β I-*-2Man a 1 Fuc a r /3
Man β J-^4GicNAc β l-*^4G(cNAc-^Asn-Fnioc 實施例53 84 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料
Cal/3 1-*-4GlcNAc01-^2Mana
NeuAc 〇(2-*-6Cal β l-^4GlcNAc β l-»-2Man a
Mani3 l->-4GicNAc i3 }-^4G)cNAc-»-Asn-Fnioc r (化合物3) 目的物
Fuca Κ 3 Ga] j3 】+4GlcNAc /3 l~*-2Mai] a 】、 NeuAc 6Gal /3 l_4GlcNAc j3 l+2Man a 〆 Fuc a r Fuc a 3 Gal j3 l~*^4GlcNAci3 l-^2Man cc \ NeuAc a2-^-6GaI β I-^4GlcNAc/3 l-^2Man a Gal β l-^-4GlcNAc/3 l-^2Man a Jy NcuAca2-*-6Gal β l-*-4G!cNAc/3 I-^2Manttl; Fucar
Man/3 1~^~4G1c;NAcj3 l-^4GlcMc+Asn-Fmoc
Manj3 1-*-4G1cNAc0 l-^4GlcNAc-*-Asn-Fnioc
Man0 l-*-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-**Asn-rraoc 表2 實施例54 85 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料
Gal β 1-^4G1 cNAc β I~^2Man a lv c 3Man/3 l~*-4GlcNAc /3 1^4GIcNAc-^A5n-Fmoc
Gal ii l-*-4GlcNAc /3 l-»-2Man a / (化合物4) 目的物
Fuc α K 3
Cal/31-^4GlcNAc/31-^2Mana h
Manj3 l-^-4GlcNAc β l-^4GlcNAc-*-A$ti-Fin〇c
GaU31-^4GlcNAci3 l—2Mano： y 3 facar
Fuc a lv 3
Gal β J-^4GIcNAc β 1—2Man α lx
Man/31-*-4GlcNAc j3 l-^-4GlcNAc-^Asn-Fmoc 6
A
Gal β l-*-4GlcNAc β l-^2Man α Γ
Gal β 1-^4GJ cNAc β l-^2Man a ly ^Manj3 J-^4GIcNAc5 l-*-4GlcNAc-*-Asn-Fin〇c
Gal /3 l-^4GlcNAc β l-^2Mana 1/3 ✓3
Fuca r
實施例55 86 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料 Gal β J—4G1CNAC β l-^2Mad ci ly $Manj8 1+4G1cNAcj3 1—-4G]cNAc+Asn-Fmoc GlcNAc/3 l-*-2Man〇! 1·^(化合物1 1) 目的物 Fuc a lv 3 Gal β l+4GlcNAc 0 l，2Man ^Man β l-»-4GlcNAc β l-^4GlcNAc-**-Asn-Fmoc ✓3 GlcNAci3 l-*-2Manar•實施例50 原料
GlcNAc )3 】+2Mana、 Gal iS 1—^GlcNAc/31+2Man a 〆
Man4G1 cNAc β 1—4G! cNAc+Asn—Fmoc (化合物1 2 ) 目的物
GlcNAc /3 l-^-2Man a Iy 4 Ga] β l-^4GlcNAc /3 l-^2Wan a Fuc a V
Man /3 ]-^4GlcNAc β l-^4GlcNAc-*-Asn-Fmoc 實施例57 87 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料
GaI/31-^4G]ciWc/31-^ 2Man a Iy Man α 〆
Man)3 1-^4G1cNAc0 l*^4GlcNAc-^Asn-Fm〇c (化合物1 3〉 目的物
Fuc α 1χ 3
GaJ β MGlcNAc β l-*-2Man a lx
Man iS l+4GlcNAc/3 l_4GlcNAc—Asn-Fmoc
Man a 1〆 實施例58 原料
Man a ly
Man/3 l+4GlcNAci3 l-*MGlcNAc~^Asn-Finoc y*·
Gal β 1-^4G1cNAcj3 l-^2Mana 1 (化合物1 4) 目的物
Man α 1、
Man/3 l-*^-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
Ga[ /3 I*MGIcNAc/3 l+2Man a 〆 Fuc a 1’ 實施例59 88 315343D01修正版 81335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料
Gal β l-^4GlcNAc j5 l-^2Man a K
Mani3 l~^4GlcMc/3 l-^^GlcNAc+Asn-Fmoc (化合物1 5) 目的物
Fuc a 1χ
Ga】jS 1+4G1 $NAc /3 l+2Man a 1\
Man jS l-»^4GlcNAc β l-*-4GlcNAc-*-Asn-Fmoc 實施例60 原料
Man J3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc~*~Asn-Fmoc
GaJ /3 1—4GlcNAc β l-^2Man a / (化合物1 6) 目的物
Ga] 3 l—4GlcNAc /3 l，2Man a 1 Fuc a Γ /3
Man/3 l-^-4GlcNAc β l-^4GlcNAc-*-Asn-Fm〇c 表 實施例61 89 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申諳案 (99年10月25曰） 原料
Man/3 l-*-4GlcNAc/3 J-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
NeuAca2-^3Gal β l-*-4GIcNAc/3 l-^2Mana ly NcuAc β l-^4GlcNAc/3 l-^-2Mana (化合物1 7) 目的物
Fuc a 1χ 3
NeuAc a 2-^3Gal β l-^4GlcNAc /31-^-ZMan a 1-y t Man 3 l-^4GlcNAc β l-*~4GlcNAc-^Asn-Fraoc
NeuAc a 2-»-3Gal /3 1->-4G1cNAc β l-^2Man a \/%
✓3
Fuc a Γ
Fuc a lv 3
NeuAc a 2-^- 3Gal β 1^4GIcNAc /31^2Man α 1χ (Man0 l-^4GlcNAc)3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
NeuAc a 2^3Cal β l-^4GlcNAc β l-^2Man cl
NeuAc a 2-*^3GaI β I-»-4Gl cNAc β I^2Man a I-y ^Man 0 1令4GlcNAc )3 l+dGlcNAc-^Asn-Fmoc
NeuAc a 2-^3Gal β l-»-4Gl cNAc β l-*-2Man a /
Fuc a Γ
實施例62 90 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 原料
NeuAc αΖ-^SGal 0 l-**-4GlcNAc β l-^2Man α Ιν
Man 5 l"^4GlcNAci3 l-^-4GlcNAc-^Asn-Fm〇c
Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a Γ (化合物1 8) 目的物
Fuc a K 3
NeuAc a2+3Gal )3 】-^4GlcNAc)3 l+2Man al\ e
Man β 1-^-4GlcNAciS ]-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a r Λ
Fuc a r
Fuc a 】\ 3 NeuAc a2-^3Gal β l-^4GIcNAc β l-^2Mana .Gal β 1-^40cNAc β 1—2Man a Ϋ
MaDj3 I+4GlcNAc/3 ]今4GIcNAc+Asn-Fmoc
NeuAc a2-^3Gal β 1-^4GIcNAc0 l-^-2Manaly Cal β l-^4GlcNAc β 2Man a A Fugar
ManjS 1 命4GlcNAcj3 l-^4GicNAc—^Asn-Fmoc
表4 實施例63 91 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 原料
Gal β l-^-4GlcNAci3 l-*-2Mana 1、
Man0 ]-^4GlcNAc^ l-^4GlcNAc-^-Asn-Fmoc
NeuAc〇：2-^3Ga] )3 1-MG丨cNAc/3 l+2Man a Ϋ (化合物1 9) 目的物
Fuco: 1、
Gal B I-^-4GlcNAc β l-^2Man <x 1·^
Mani5 l-^4GlcNAci3 I^-4G)cNAc^Asn-Fmoc
NeuAca2-^3Gal β 1^4GlcNAci3 l-*-2Mana y3 Fuc a r
Gal β l*^4GlcNAc β l-^2Man a /3 NeuAca2-^3Gal β 1-*-4G1cNAcjS l-^2Mana r 乂3 Fuca r
Mani31-^4GlcNAcj31 4 G1 cNAc-^- A s n -F mo c
Fuc a Jy 3 Gal β l-^4GlcNAci3 l-^2Man a ly Man β l-^4GlcNAc $ 1-^ 3 NeuAc a2-^- 3Gal β cNAc β I^2Man a 4GlcNAc-*-Asn-Fnioc 實施例64 92 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 原料
GlcNAc β l-^2Man a
Man/3 】-^4CllcNAc/3 l-^4GlcMc-^Asn-Fmoc
NeuAc a2-^-3Gal β l-^4GlcNAcj3 I-^2Manal (化合物2 0) 目的物 GJcNAc 0 l+2Mana ly
Man/3 l-^4GlcNAc)3 l-^4GlcNAc-*-Asn~Fmoc
NeuAc o:2+3Gal |3 l+4GlcNAc 万 l-*-2Mana 1' Fuc a Γ •實施例65 原料
Man a lv
Man/3 l~^4GlcNAc/3 1+^GlcNAc令Asn-Fmoc y 3
NeuAca2*^3Cal β I-^4GlcNAc/3 l-*-2Manar (化合物2 1) 目的物
Man a ly
Man0 1-^4G1cNAcj3 l-^4ClcNAc-^Asn-Fnioc
NeuAc a 2-^3Gal j3 ]-^4GlcNAc β l-^2Man a lJ Fucar 實施例6 6 93 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 , (99年10月25日） 原料
Man β l-^4GlcNAc J3 l-^4GlcNAc-*-Asn-Finoc
NcuAc a2-^3Gal β l-^-4GlcNAc β ]-^2Man ο (化合物2 2) 目的物
Man Θ I~*^4GlcNAc/3 I+4GlcNAc+Asji-Fraoc
NeuAc aZ^SGal β l-*-4GlcNAc /31-^-2Man a Γ y 3 Fuc a r
實施例67 原料 NeuAc aZ-^SGal β l*^4GlcNAc/3 l"^2Mana ly ^Man^ l~**4GlcNAc β J-^4GlcNAc-^Asn-Fnioc GlcNAc/31-*-2Manaiy (化合物2 3) 目的物
Fuc a Iv 3 , NeuAc a2+3Gal β 1+4GI cNAc 0 】+2Man a；】、 GlcNAcS I-*-2Hana Ϋ
Man )3 1- 4GlcNAc0 1^4GlcNAc-*^A.')n-Fnioc 實施例68 94 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 原料 NeuAc a2—"SGal β 1—HGlcNAc (3 l+2Manal\^ Man α Γ(化合物2 4)
Man0 l-^4GlcNAc )3 l-*-4GlcNAc-**Asn-Fraoc 目的物 Fuca ly 3 NcuAca2~^3Gal β 1-^4G1cNAcj3 l-^2ManaK Man 〇；l y3
ManS 1*^4G1cNAc5 I-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
實施例69 原料 NeuAca2-*-3Gal /31-*-4GlcNAc)3 l-^2Manalx ^Man.)3 l-*-4GlcNAc/3 )-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc (化合物2 5) 目的物 Fuc α Ιχ3 NeuAc a2~^3Gal /3 丨―~4GlcMAc0 l+2Mana Jy
ManjS )-^-4GlcNAc β l-^4G]cNAc-^-Asn-Fnioc 95 315343D01修正版

Claims (1)

1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 十、申請專利範圍： 1. 一種糖鍵天冬醯胺衍生物，係如下式（1)所示非還原末 端的唾液酸經氟化之含11至7糖之α 2,3糖鏈天冬醯胺 衍生物，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧幾基，AcHN # 為乙醯胺基，R1及R2為，氫原子、與式（2)至（5)所表示 之基，可相同或不同，但R1及R2之一方必須為式（2) 所表示之基]
R,R，,R”表示以下組合 (a) R=F、R’=OH、R”=OH (b) R=OH、R，=F、R”=OH (c) R=OH、R’=OH、R，，=F
96 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日）
⑷. OH
(5) 2. —種糖鏈天冬醯胺衍生物，係如下式（6)所示非還原末 端的唾液酸經氟化之含氟及11至7糖之α2,6糖鏈天冬 醯胺衍生物，
.AeihFlXDC (6) [式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧羰基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY為氫原子、式（7)所表示之基、或 申請專利範圍第1項之式（3)至（5)所表示之基，但Rx及 RY之一方必須為式（7)所表示之基]
(7) 97 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） (a) R^F, R* =OH. Rw «ΟΗ (b) R = OH, R· =F, Ru =OH (c> R = OH、R’ =OH, R” =F 。 3. —種糖鏈天冬醯胺，係如下式（8)所示非還原末端的唾 液酸經氟化之含11至7糖之α 2,3糖鏈天冬醯胺，
[式中，Asn、AcHN、R1及R2為同申請專利範圍第1 項之含義]。 4. 一種糖鏈天冬醯胺，係如下式（9)所示非還原末端的唾 液酸經氟化之含氟及11至7糖之α 2,6糖鏈天冬醯胺’
[式中，Asn、AcHN、Rx及RY為同申請專利範圍第2 項之含義]。 5. —種糖鏈，係如下式（10)所示非還原末端的唾液酸經氟 化之含11至7糖之α2,3糖鏈，
[式中，AcHN、R1及R2為同申請專利範圍第1項之含 98 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 義]。 6. —種糖鏈，係如下式（11)所示非還原末端的唾液酸經氟 化之含氟及11至7糖之α 2,6糖鏈，
[式中，AcHN、Rx及RY為同申請專利範圍第2項之含 義]。
糖之α 2,3二涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使 用唾液酸轉移酶，將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移至經 脂溶性保護基保護之糖鏈天冬醯胺，將所製得之經脂溶 性保護基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法而分離之，
[式中，Asn為天冬蕴胺，Fmoc為芴基曱氧幾基，AcHN 為乙醯胺基，R1及R2同為申請專利範圍第1項之式（2) 所表示之基]。 8. —種下式（13)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含10 糖之α 2,3單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使 用唾液酸轉移酶，將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移至經 脂溶性保護基保護之糖鏈天冬醯胺，將所製得之經脂溶 99 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 性保護基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法分離之，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧幾基，AcHN 為乙醯胺基，R^R2之一方為申請專利範圍第1項之式 (2)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（3)所 表示之基]。 9. 一種下式（14)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含9糖 之α 2,3單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 半乳糖加水分解酶將式申請專利範圍第8項之（13)所示 之單延糖鏈天冬酿胺衍生物加水分解，
[式中，Asn為天冬蕴胺，Fmoc為芴基甲氧幾基，AcHN 為乙醯胺基，Ri'R2之一方為申請專利範圍第1項之式 (2)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（4)所 表示之基]。 10.—種下式（15)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含8糖 之α 2,3單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 Ν-乙醯基葡糖胺加水分解酶將申請專利範圍第9項之 100 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰） 式（1 4)所示之單涎糖鏈天冬醯胺衍生物加水分解
Fmoc (15) [式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧Μ基，AcHN 為乙醯胺基，R1、：^2之一方為申請專利範圍第1項之式 (2)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（5)所 表示之基]。 11.一種下式（16)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含7糖 之α 2,3單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 甘露糖加水分解酶將申請專利範圍第10項之式（15)所 示之單涎糖鏈天冬醯胺衍生物加水分解， R\
(1 6) [式中，Asn為天冬酸胺，Fmoc為芴基曱氧叛基，AcHN 為乙醯胺基，R1、：^2之一方為申請專利範圍第1項之式 (2)所表示之基、其他為氫原子]。 12.—種下式（17)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含11 糖之α 2,6二涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使 用唾液酸轉移酶，將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移至經 脂溶性保護基保護之糖鏈天冬醯胺，將所製得之經脂溶 101 315343D01修正版 1335920 第96128509號專利申請案 , (99年10月25日） 性保護基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法分離之，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基甲氧羰基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY同為申請專利範圍第2項之式（7) 所表示之基]。 鲁13. —種下式（18)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含10 糖之α 2,6單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使 用唾液酸轉移酶，將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移至經 脂溶性保護基保護之糖鏈天冬醯胺，將所製得之經脂溶 性保護基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法分離之，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧羰基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY之一方為申請專利範圍第2項之 式（7)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（3) 所表示之基]。 14.一種下式（19)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含9糖 之α2,6單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 半乳糖加水分解酶將申請專利範圍第13項之式（18)所 102 315343D01修正版 1335920 * 第96128509號專利申請案 . (99年10月25日） 示之單诞糖鏈天冬酸胺衍生物加水分解，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為苗基曱氧幾基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY之一方為申請專利範圍第2項之 式（7)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（4) 所表示之基]。 15.—種下式（20)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含8糖 之α 2,6單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 Ν-乙醯基葡糖胺加水分解酶將申請專利範圍第14項之 式（19)所示之單延糖鏈天冬酿胺衍生物加水分解，
Asn-Pmoc (2 0) [式中，Asn為天冬臨胺，Fmoc為芴基曱氧裁基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY之一方為申請專利範圍第2項之 式（7)所表示之基、其他為申請專利範圍第1項之式（5) 所表示之基]。 16.—種下式（21)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含7糖 之α 2,6單涎糖鏈天冬醯胺衍生物之製造法，其係使用 甘露糖加水分解酶將申請專利範圍第15項之式（20)所 103 315343D01修正版 1335920 • 第96128509號專利申請案 (99年1〇月25日） 示之單延糖鏈天冬醯胺衍生物加水分解，
[式中’ Asn為天冬醯胺’ Fmoc為芴基曱氧羰基，AcHN 為乙醯胺基，Rx及RY之一方為申請專利範圍第2項之 式（7)所表示之基、其他為氫原子]。 種如中請專利範圍第3項之式(8)所示非還原末端的 唾液酸'經氟化之含^ 7糖之α2,3糖鍵天冬酿胺衍生 物之製造法，其係將申請專利範圍第丨項之式（1)所示之 含11至7糖之α2,3糖鏈天冬醯胺衍生物之保護基除去 而得者。 18.:種如申請專利範圍第4項之式⑼所示非還原末端的 ^酸經氟化之含11至7糖之…_天冬酿胺衍生 =之製造法，其係將Μ專利範圍第2項之式⑹所示之 ^至7糖之α2,6糖鏈天冬胺衍生物之保護基除去 向得者。 19 一種如申請專利範圍第5項之式⑽所示非還片末端的 唾液酸經氟化之含11至7糖之…糖鏈之== 係將申請專利範圍第3項之式_示之含u\ 7糖^ 心，3糖鏈天冬_之天冬醢胺殘基除去而得者。 20.—種如申請專利範圍第6項之 向侍者 唾液酸經氟化之含η至7播/()所示非還原末端的 α 2,6糖鏈之製造法，其 315343D01修正版 104 1335920 第96128509號專利申請案 (99年10月25日） 係將申請專利範圍第4項之式（9)所示之含11至7糖之 〇:2,6糖鏈天冬醯胺之天冬醯胺殘基除去而得者。 21.—種糖鏈天冬醯胺衍生物，係如下式（22)所示非還原末 端的唾液酸經氟化之含11糖之（α2,3)(α2,6)糖鏈天冬 醯胺衍生物，
[式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧羰基，AcHN 為乙醯胺基，R1為申請專利範圍第1項之式（2)所表示 之基、RY為申請專利範圍第2項之式（7)所表示之基]
R，R’，R，’，表示以下組合 (a) R=F、R，=OH、R”=OH (b) R=OH、R，=F、R，，=OH (c) R=OH、R，=OH、R，，=F。 22.—種糖鏈天冬醯胺衍生物，係如下式（23)所示非還原末 端的唾液酸經氟化之含11糖之（α 2,3)( α 2,6)糖鏈天冬 醯胺衍生物、 105 315343D01修正版 1335920 ♦ 第96128509號專利申請案 (99年10月25曰）
(2 3) [式中，Asn為天冬醯胺，Fmoc為芴基曱氧裁基，AcHN 為乙醯胺基，R2為申請專利範圍第1項之式（2)所表示 之基、Rx為申請專利範圍第2項之式（7)所表示之基]
R,R’，R”表示以下組合 (a) R=F、R，=OH、R，，=OH (b) R=OH、R，=F、R，，=OH (c) R=OH、R，=OH、R，，=F。 23. —種糖鏈天冬醯胺衍生物，其係在申請專利範圍第1項 之式（1)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含11至7糖 之α 2,3糖鏈天冬醯胺衍生物之非還原末端側之N-乙醯 基葡糖胺含有1個或2個岩藻糖者。 24. —種糖鏈天冬醯胺衍生物，其係在申請專利範圍第2項 之式（6)所示非還原末端的唾液酸經氟化之含11至7糖 之α 2,3糖鏈天冬醯胺衍生物之非還原末端側之Ν-乙醯 基葡糖胺含有1個或2個岩藻糖者。 106 315343D01修正版 1335920 # 第96128509號專利申請案 % (99年10月25日） 25. —種糖鏈天冬醯胺衍生物之製造方法，該糖鏈天冬醯胺 衍生物係在天冬醯胺之胺基氮經脂溶性保護基保護之 ·. 糖鏈天冬醯胺之非還原末端側的N-乙醯基葡糖胺上含 有至少1個岩藻糖，該方法之特徵係使用岩藻糖轉移 酶，將岩藻糖轉移至天冬醯胺之胺基氮經脂溶性保護基 保護之申請專利範圍第1項之式（1)所示非還原末端的 唾液酸經氟化之糖鏈天冬醯胺，所製得之經脂溶性保護 基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法予以分離。 •26.—種糖鏈天冬醯胺衍生物之製造方法，該糖鏈天冬醯胺 衍生物係在天冬醯胺之胺基氮經脂溶性保護基保護之 糖鏈天冬醯胺之非還原末端側的N-乙醯基葡糖胺上含 有至少1個岩藻糖，該方法之特徵係使用岩藻糖轉移 酶，將岩藻糖轉移至天冬醯胺之胺基氮經脂溶性保護基 保護之申請專利範圍第2項之式（6)所示非還原末端的 唾液酸經氟化之α2,6糖鏈天冬醯胺，所製得之經脂溶 赢 性保護基保護之糖鏈天冬醯胺由層析法予以分離。 107 315343D01修正版
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI342880B (en) * 2005-07-19 2011-06-01 Otsuka Chemical Co Ltd Method for producing sugar chain derivatives, and sugar chain derivatives
JP5004464B2 (ja) * 2005-12-02 2012-08-22 大塚化学株式会社 糖鎖修飾リポソーム
JP2009155353A (ja) * 2006-03-30 2009-07-16 Yokohama City Univ 糖鎖化合物の製造方法
JP2007297429A (ja) * 2006-04-27 2007-11-15 Institute Of Physical & Chemical Research 糖鎖ライブラリの作製方法及びその利用
WO2009017154A1 (ja) 2007-07-31 2009-02-05 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドの製造方法
JP5604297B2 (ja) 2008-06-17 2014-10-08 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加ｇｌｐ−１ペプチド
CA2734124C (en) 2008-08-19 2018-06-05 Otsuka Chemical Co., Ltd. Glycoprotein production method and screening method
TW201031749A (en) 2009-02-10 2010-09-01 Otsuka Chemical Co Ltd IgG-Fc fragment and method for manufacturing the same
EP2455396A4 (en) 2009-07-16 2013-05-01 Otsuka Chemical Co Ltd EXTRACELLULAR AILIM DOMAIN PLACED WITH SUGAR CHAINS AND METHOD OF MANUFACTURING THE SAME
JP5566226B2 (ja) * 2009-09-03 2014-08-06 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの製造方法
RU2012122162A (ru) 2009-10-30 2013-12-10 Глитек,Инк. Гликолизированная форма аналога антигенного glp-1
JP5285022B2 (ja) * 2010-04-30 2013-09-11 旭化成株式会社 糖ペプチド誘導体及びその製造方法
JP5680576B2 (ja) * 2011-03-03 2015-03-04 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法
BR112013022941B8 (pt) 2011-03-10 2021-02-23 Glytech Inc método para fabricação de glicopeptídeo tendo cadeia de açúcar sialil e método para a fabricação de um derivado de sialilglicoasparagina
RU2624034C2 (ru) 2011-09-04 2017-06-30 Глитек, Инк. Гликозилированные полипептиды и лекарственные композиции, содержащие данные полипептиды
SG10201601327RA (en) 2011-09-04 2016-03-30 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and drug composition containing said polypeptide
KR102227918B1 (ko) 2012-11-22 2021-03-15 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 함유하는 화합물 또는 그의 염, 및 이들의 제조 방법
JP6219308B2 (ja) 2012-11-30 2017-10-25 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
BR112015024423B1 (pt) 2013-03-29 2023-04-25 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado
JP6460978B2 (ja) 2013-03-30 2019-01-30 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖−ポリペプチド複合体
CN107001528A (zh) 2014-07-09 2017-08-01 米德瑞（美国）有限公司 低聚糖组合物及其制备方法
US10849337B2 (en) 2015-01-26 2020-12-01 Cadena Bio, Inc. Oligosaccharide compositions for use as animal feed and methods of producing thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
JPH06510746A (ja) 1991-06-10 1994-12-01 グライカムド　インコーポレイテッド 免疫抑制性および寛容原性修飾ルイスｘおよびルイスａ化合物
JPH06510745A (ja) 1991-06-10 1994-12-01 グライカムド　インコーポレイテッド 修飾シアリルルイスａ化合物
WO1995032955A1 (fr) * 1994-05-27 1995-12-07 Daikin Industries, Ltd. Acide 7-fluoro-2, 3-didehydrosialique et intermediaire pour la synthese de cet acide
JPH089989A (ja) * 1994-07-04 1996-01-16 Meiji Milk Prod Co Ltd β−マンノシルオリゴ糖の製造方法
JP3124199B2 (ja) * 1994-12-28 2001-01-15 日本たばこ産業株式会社 シアル酸を含む糖類の製造方法
JP4346713B2 (ja) * 1998-12-07 2009-10-21 生化学工業株式会社 シアル酸含有オリゴ糖の製造方法
JP2002045196A (ja) * 2000-08-02 2002-02-12 Toyobo Co Ltd 混成型糖鎖の酵素的合成方法
US7135566B2 (en) * 2001-06-19 2006-11-14 Otsuka Chemical Co., Ltd. Process for producing sugar chain asparagine derivative

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EP1577397A1 (en) 2005-09-21
EP1577397A4 (en) 2011-03-30
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US8158763B2 (en) 2012-04-17
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